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特許7604174血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を含有する水性医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-13
(45)【発行日】2024-12-23
(54)【発明の名称】血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を含有する水性医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/38 20060101AFI20241216BHJP
A61K 38/27 20060101ALI20241216BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20241216BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20241216BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20241216BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20241216BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241216BHJP
A61P 5/06 20060101ALI20241216BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20241216BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20241216BHJP
C07K 14/765 20060101ALN20241216BHJP
C07K 14/61 20060101ALN20241216BHJP
C12N 15/14 20060101ALN20241216BHJP
C12N 15/18 20060101ALN20241216BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20241216BHJP
【ＦＩ】
A61K38/38
A61K38/27
A61K47/64
A61K47/26
A61K47/10
A61K47/02
A61K9/08
A61P5/06 ZNA
A61P3/06
C07K19/00
C07K14/765
C07K14/61
C12N15/14
C12N15/18
C12N15/62 Z
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2020180998
(22)【出願日】2020-10-29
(65)【公開番号】P2021070700
(43)【公開日】2021-05-06
【審査請求日】2023-09-13
(31)【優先権主張番号】P 2019197978
(32)【優先日】2019-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000228545
【氏名又は名称】ＪＣＲファーマ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100225118
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 慧
(74)【代理人】
【識別番号】100128897
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 佳希
(72)【発明者】
【氏名】岡部 真二
(72)【発明者】
【氏名】山口 裕加
(72)【発明者】
【氏名】安川 秀仁
【審査官】田澤 俊樹
(56)【参考文献】
【文献】特表２０００－５０２９０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５００３９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１５９５４０（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
４７／００－４７／６９
９／００－９／７２
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ｃ０７Ｋ １９／００，１４／７６５，１４／６１
Ｃ１２Ｎ １５／１４，１５／１８，１５／６２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト血清アルブミンとヒト成長ホルモンとの融合蛋白質を有効成分として含有してなる水性医薬組成物であって，該融合蛋白質の濃度が１０～１００ｍｇ／ｍＬであり，スクロースの濃度が１０～１５０ｍｇ／ｍＬであり，ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が０．１５～１０ｍｇ／ｍＬであり，フェノールの濃度が３～９ｍｇ／ｍＬであり，リン酸緩衝剤の濃度が１～３０ｍＭであり，ｐＨが５．０～８．０であり，
該融合蛋白質のアミノ酸配列が，配列番号１１で示されるアミノ酸配列と，９０％以上の同一性を有するものである，水性医薬組成物。
【請求項2】
該融合蛋白質の濃度が，１５～７０ｍｇ／ｍＬである，請求項１に記載の水性医薬組成物。
【請求項3】
該スクロースの濃度が，５０～１００ｍｇ／ｍＬである，請求項１又は２に記載の水性医薬組成物。
【請求項4】
該ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が，１．５～４．５ｍｇ／ｍＬである，請求項１乃至３のいずれかに記載の水性医薬組成物。
【請求項5】
該リン酸緩衝剤の濃度が，２～２０ｍＭである，請求項１乃至４のいずれかに記載の水性医薬組成物。
【請求項6】
該ｐＨが，６．０～７．８である，請求項１乃至５のいずれかに記載の水性医薬組成物。
【請求項7】
該ｐＨが，６．５～７．６である，請求項１乃至５のいずれかに記載の水性医薬組成物。
【請求項8】
該融合蛋白質の濃度が１０～１００ｍｇ／ｍＬであり，該スクロースの濃度が７５ｍｇ／ｍＬであり，該ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が３ｍｇ／ｍＬであり，該フェノールの濃度が６ｍｇ／ｍＬであり，該リン酸緩衝剤の濃度が１０ｍＭであり，該ｐＨが７．０～７．４である，請求項１に記載の水性医薬組成物。
【請求項9】
該融合蛋白質の濃度が１５～７０ｍｇ／ｍＬであり，該スクロースの濃度が７５ｍｇ／ｍＬであり，該ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が３ｍｇ／ｍＬであり，該フェノールの濃度が６ｍｇ／ｍＬであり，該リン酸緩衝剤の濃度が１０ｍＭであり，該ｐＨが７．０～７．４である，請求項１に記載の水性医薬組成物。
【請求項10】
該融合蛋白質の濃度が５０ｍｇ／ｍＬであり，該スクロースの濃度が７５ｍｇ／ｍＬであり，該ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が３ｍｇ／ｍＬであり，該フェノールの濃度が６ｍｇ／ｍＬであり，該リン酸緩衝剤の濃度が１０ｍＭであり，該ｐＨが７．０～７．４である，請求項１に記載の水性医薬組成物。
【請求項11】
該融合蛋白質のアミノ酸配列が，配列番号１１で示されるアミノ酸配列と，９５％以上の同一性を有するものである，請求項１乃至１０のいずれかに記載の水性医薬組成物。
【請求項12】
該融合蛋白質のアミノ酸配列が，配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するものである，請求項１乃至１０のいずれかに記載の水性医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は，例えば，血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を有効成分として含有する医薬の，溶液状態で貯蔵安定な水性医薬組成物に関し，より詳しくは，安定化剤として，スクロースと非イオン性界面活性剤を更に含有する水性医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は，視床下部の制御下で下垂体前葉から分泌される蛋白質である。ｈＧＨは，軟骨形成促進，蛋白質同化促進等の成長促進活性を示すほか，体組成及び脂質代謝改善作用を示す。ｈＧＨの分泌が少ない小児は，健常児と比較して低身長を呈する成長ホルモン分泌不全性低身長症を発症する。
【0003】
ｈＧＨ遺伝子を導入した大腸菌を用いて組換え蛋白質として製造された分子量約２２ＫＤのｈＧＨを有効成分として含有する製剤（ｈＧＨ製剤）が，成長ホルモン分泌不全性低身長症，ターナー症候群における低身長，ＳＧＡ（Small-for-Gestational Age）性低身長症，ヌーナン症候群における低身長症，慢性腎不全による低身長症，プラダーウィリー症候群における低身長症，軟骨異栄養症における低身長症の治療剤として広く臨床応用されている。ｈＧＨ製剤は，これら疾患において骨端線閉鎖を伴わない場合において特に効果を奏する。ｈＧＨ製剤は，皮下又は筋肉内に投与されて血中を循環し，その成長促進活性により患者の成長を促す効果を奏する。また，ｈＧＨ製剤は，成人成長ホルモン分泌不全症の治療剤としても広く臨床応用されている。成人成長ホルモン分泌不全症の患者では，脂質代謝異常等種々の異常が認められるが，ｈＧＨ製剤の投与により，患者の脂質代謝が正常化する等，患者のＱＯＬが改善される。成長ホルモン分泌不全性低身長症，成人成長ホルモン分泌不全症等に対するｈＧＨ製剤としては，例えば，グロウジェクト（登録商標）がある。
【0004】
ｈＧＨの血漿中における半減期は２０分未満とされており，患者に投与されたｈＧＨは，速やかに血中から消失する。このため，ｈＧＨの薬効を患者で実質的に発揮させるには，患者にｈＧＨを週に３回筋肉内に又は毎日皮下に投与する必要がある。このような頻繁な投与は患者の負担となっている。従って，ｈＧＨの血漿中における安定性を増加させて半減期を延長させることにより患者へのｈＧＨの投与回数を減らすことができれば，患者の負担を軽減させることができ，好ましい。
【0005】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は，その成熟型が５８５個のアミノ酸からなる蛋白質である。ＨＳＡは，血漿蛋白質の中では最も量の多い成分で，血漿中での半減期が１４～２０日と長い。ＨＳＡは，血漿の浸透圧の調節に寄与するとともに，血中の陽イオン，脂肪酸，ホルモン類，ビリルビンその他の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質と結合してそれらを運搬する機能を有する。一般に，ＨＳＡと結合した物質は，臓器に取り込まれ難くなり，血中をより長時間循環できるようになる。
【0006】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）には，天然のバリアントが複数あることが知られている。ヒト血清アルブミンRedhillはその一つである（非特許文献１，２）。ヒト血清アルブミンRedhillは，５８５個のアミノ酸からなる上記の通常のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列と比べて，そのＮ末端側から３２０番目のアミノ酸残基がアラニンでなくトレオニンであり，且つそのＮ末端にアルギニン残基が一つ付加している点で異なり，５８６個のアミノ酸からなる。上記アラニンのトレオニンへの変化により，アルブミンRedhillではそのアミノ酸配列中にAsn-Tyr-Thrで表される配列が生じ，この配列中のＡｓｎ（アスパラギン）残基がＮ－結合型グリコシド化される。このためアルブミンRedhillは，上記の通常のヒト血清アルブミンと比較して分子量が２．５ｋＤａ程大きく観察される。
【0007】
ｈＧＨの血漿中での安定性を，ｈＧＨにＨＳＡを結合させることによって増加させる方法が報告されている（特許文献１～８）。ｈＧＨにＨＳＡを結合させた蛋白質は，ｈＧＨをコードする遺伝子とＨＳＡをコードする遺伝子とをインフレームに結合させたＤＮＡを組込んだ発現ベクターを導入した形質転換細胞を作製し，この細胞を培養することにより，培地中又は細胞内に組換え蛋白質として作製される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】ＷＯ２０１７／１５４８６９
【文献】ＷＯ２０１７／１５９５４０
【文献】特表２００３－５３０８３８号公報
【文献】特表２００５－５１４０６０号公報
【文献】特表２０００－５０２９０１号公報
【文献】特表２００８－５１８６１５号公報
【文献】特表２０１３－５０１０３６号公報
【文献】特表２０１３－５１８０３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
上記背景の下で，本発明の一目的は，ヒトアルブミンとヒト成長ホルモンの融合蛋白質を有効成分として含有する医薬の，市場に流通させることが可能な程度に安定な，水性医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは，上記目的に向けた研究において検討を重ねた結果，５８５個のアミノ酸からなる通常のヒト血清アルブミンと比較してそのＮ末端から３２０番目のアミノ酸残基であるアラニンがトレオニンで置き換わっているものであるアミノ酸配列よりなる変異体（ヒト血清アルブミン変異体）をヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）と結合させて得た化合物（ヒト血清アルブミン変異体－ｈＧＨ融合蛋白質）が，スクロースと非イオン性界面活性剤とを含有する水性医薬組成物中で安定であることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を含むものである。
１．ヒト血清アルブミンとヒト成長ホルモンとの融合蛋白質を有効成分として含有してなる水性医薬組成物であって，該融合蛋白質の濃度が１０～１００ｍｇ／ｍＬであり，スクロースの濃度が１０～１５０ｍｇ／ｍＬであり，非イオン性界面活性剤の濃度が０．１５～１０ｍｇ／ｍＬであり，防腐剤の濃度が０．５～１２ｍｇ／ｍＬであり，緩衝剤の濃度が１～３０ｍＭであり，ｐＨが５．０～８．０である，水性医薬組成物。
２．該融合蛋白質の濃度が，１５～７０ｍｇ／ｍＬである，上記１に記載の水性医薬組成物。
３．該スクロースの濃度が，５０～１００ｍｇ／ｍＬである，上記１又は２に記載の水性医薬組成物。
４．該非イオン性界面活性剤の濃度が，１．５～４．５ｍｇ／ｍＬである，上記１乃至３のいずれかに記載の水性医薬組成物。
５．該非イオン性界面活性剤が，ポリソルベート又はポロキサマーである，上記１乃至４のいずれかに記載の水性医薬組成物。
６．該非イオン性界面活性剤が，ポリソルベート２０，ポリソルベート８０及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールからなる群から選択されるものである，上記１乃至４のいずれかに記載の水性医薬組成物。
７．該防腐剤がフェノールである，上記１乃至６のいずれかに記載の水性医薬組成物。
８．該フェノールの濃度が，３～９ｍｇ／ｍＬである，上記７に記載の水性医薬組成物。
９．該緩衝剤がリン酸緩衝剤である，上記１乃至８のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１０．該リン酸緩衝剤の濃度が，２～２０ｍＭである，上記９に記載の水性医薬組成物。
１１．該ｐＨが，６．０～７．８である，上記１乃至１０のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１２．該ｐＨが，６．５～７．６である，上記１乃至１０のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１３．該融合蛋白質の濃度が１０～１００ｍｇ／ｍＬであり，該スクロースの濃度が７５ｍｇ／ｍＬであり，該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールであって，該ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が３ｍｇ／ｍＬであり，該防腐剤がフェノールであって，該フェノールの濃度が６ｍｇ／ｍＬであり，該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって，該リン酸緩衝剤の濃度が１０ｍＭであり，該ｐＨが７．０～７．４である，上記１に記載の水性医薬組成物。
１４．該融合蛋白質の濃度が１５～７０ｍｇ／ｍＬであり，該スクロースの濃度が７５ｍｇ／ｍＬであり，該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールであって，該ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が３ｍｇ／ｍＬであり，該防腐剤がフェノールであって，該フェノールの濃度が６ｍｇ／ｍＬであり，該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって，該リン酸緩衝剤の濃度が１０ｍＭであり，該ｐＨが７．０～７．４である，上記１に記載の水性医薬組成物。
１５．該融合蛋白質の濃度が５０ｍｇ／ｍＬであり，該スクロースの濃度が７５ｍｇ／ｍＬであり，該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールであって，該ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が３ｍｇ／ｍＬであり，該防腐剤がフェノールであって，該フェノールの濃度が６ｍｇ／ｍＬであり，該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって，該リン酸緩衝剤の濃度が１０ｍＭであり，該ｐＨが７．０～７．４である，上記１に記載の水性医薬組成物。
１６．該融合蛋白質のアミノ酸配列が，配列番号１１で示されるアミノ酸配列と，８５％以上の同一性を有するものである，上記１乃至１５のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１７．該融合蛋白質のアミノ酸配列が，配列番号１１で示されるアミノ酸配列と，９０％以上の同一性を有するものである，上記１乃至１５のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１８．該融合蛋白質のアミノ酸配列が，配列番号１１で示されるアミノ酸配列と，９５％以上の同一性を有するものである，上記１乃至１５のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１９．該融合蛋白質のアミノ酸配列が，配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するものである，上記１乃至１５のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１．ヒト血清アルブミンとヒト成長ホルモンとの融合蛋白質を有効成分として含有してなる水性医薬組成物であって，該融合蛋白質の濃度が１０～１００ｍｇ／ｍＬであり，スクロースの濃度が１０～１５０ｍｇ／ｍＬであり，非イオン性界面活性剤の濃度が０．１５～１０ｍｇ／ｍＬであり，防腐剤の濃度が０．５～１２ｍｇ／ｍＬであり，緩衝剤の濃度が１～３０ｍＭであり，ｐＨが５．０～８．０である，水性医薬組成物。
２．該融合蛋白質の濃度が，１５～７０ｍｇ／ｍＬである，上記１に記載の水性医薬組成物。
３．該スクロースの濃度が，５０～１００ｍｇ／ｍＬである，上記１又は２に記載の水性医薬組成物。
４．該非イオン性界面活性剤の濃度が，１．５～４．５ｍｇ／ｍＬである，上記１乃至３のいずれかに記載の水性医薬組成物。
５．該非イオン性界面活性剤が，ポリソルベート又はポロキサマーである，上記１乃至４のいずれかに記載の水性医薬組成物。
６．該非イオン性界面活性剤が，ポリソルベート２０，ポリソルベート８０及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールからなる群から選択されるものである，上記１乃至４のいずれかに記載の水性医薬組成物。
７．該防腐剤がフェノールである，上記１乃至６のいずれかに記載の水性医薬組成物。
８．該フェノールの濃度が，３～９ｍｇ／ｍＬである，上記７に記載の水性医薬組成物。
９．該緩衝剤がリン酸緩衝剤である，上記１乃至８のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１０．該リン酸緩衝剤の濃度が，２～２０ｍＭである，上記９に記載の水性医薬組成物。
１１．該ｐＨが，６．０～７．８である，上記１乃至１０のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１２．該ｐＨが，６．５～７．６である，上記１乃至１０のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１３．該融合蛋白質の濃度が１０～１００ｍｇ／ｍＬであり，該スクロースの濃度が７５ｍｇ／ｍＬであり，該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールであって，該ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が３ｍｇ／ｍＬであり，該防腐剤がフェノールであって，該フェノールの濃度が６ｍｇ／ｍＬであり，該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって，該リン酸緩衝剤の濃度が１０ｍＭであり，該ｐＨが７．０～７．４である，上記１に記載の水性医薬組成物。
１４．該融合蛋白質の濃度が１５～７０ｍｇ／ｍＬであり，該スクロースの濃度が７５ｍｇ／ｍＬであり，該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールであって，該ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が３ｍｇ／ｍＬであり，該防腐剤がフェノールであって，該フェノールの濃度が６ｍｇ／ｍＬであり，該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって，該リン酸緩衝剤の濃度が１０ｍＭであり，該ｐＨが７．０～７．４である，上記１に記載の水性医薬組成物。
１５．該融合蛋白質の濃度が５０ｍｇ／ｍＬであり，該スクロースの濃度が７５ｍｇ／ｍＬであり，該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールであって，該ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が３ｍｇ／ｍＬであり，該防腐剤がフェノールであって，該フェノールの濃度が６ｍｇ／ｍＬであり，該緩衝剤がリン酸緩衝剤であって，該リン酸緩衝剤の濃度が１０ｍＭであり，該ｐＨが７．０～７．４である，上記１に記載の水性医薬組成物。
１６．該融合蛋白質のアミノ酸配列が，配列番号１１で示されるアミノ酸配列と，８５％以上の同一性を有するものである，上記１乃至１５のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１７．該融合蛋白質のアミノ酸配列が，配列番号１１で示されるアミノ酸配列と，９０％以上の同一性を有するものである，上記１乃至１５のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１８．該融合蛋白質のアミノ酸配列が，配列番号１１で示されるアミノ酸配列と，９５％以上の同一性を有するものである，上記１乃至１５のいずれかに記載の水性医薬組成物。
１９．該融合蛋白質のアミノ酸配列が，配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するものである，上記１乃至１５のいずれかに記載の水性医薬組成物。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば，例えば，市場に流通させることが可能な程度に，ヒトアルブミンとヒト成長ホルモンが結合した蛋白質を有効成分として含有する医薬を，安定な水性医薬組成物とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
本明細書において，単に「ヒト血清アルブミン」又は「ＨＳＡ」というときは，配列番号１で示される５８５個のアミノ酸残基からなる通常の野生型のヒト血清アルブミンに加え，血中の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質を結合して運搬する機能等の通常の野生型ヒト血清アルブミンとしての機能を有するものである限り，配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，１個又は複数個のアミノ酸残基が，置換，欠失，及び／又は付加（本明細書において，アミノ酸残基の「付加」は，配列の末端又は内部に残基を追加することを意味する。）されたものに相当するＨＳＡの変異体も特に区別することなく包含する。アミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換する場合，置換するアミノ酸残基の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個である。アミノ酸残基を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸残基の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個である。例えば，配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸残基が欠失した，５８４個のアミノ酸残基からなる変異体も，ヒト血清アルブミンに含まれる。また，これらアミノ酸残基の置換と欠失を組み合わせてもよい。更に，通常の野生型のＨＳＡ又はその変異体のアミノ酸配列中に又は当該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであってもよい。このとき付加されるアミノ酸残基の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個である。
【0014】
これらアミノ酸の置換，欠失，及び付加の３種類の変異のうち，少なくとも２種類の変異を組み合わせて導入したＨＳＡの変異体としては，配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，０～１０個のアミノ酸残基の欠失と，０～１０個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０～１０個のアミノ酸残基の付加とを行ってなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。より好ましくは，配列番号１で示されるアミノ酸配列に対するそれら欠失，置換，及び／又は付加されるアミノ酸残基の個数は，好ましくはそれぞれ５個以下，更に好ましくは３個以下である。
【0015】
本発明において，「ヒト血清アルブミンRedhill」（ＨＳＡ-Redhill）の語は，ヒト血清アルブミンのバリアントであって，配列番号２で示される５８６個のアミノ酸残基からなるものを意味する。ヒト血清アルブミンRedhillは，配列番号１で示される５８５個のアミノ酸からなる野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列に対して，Ｎ末端から３２０番目のアミノ酸残基がアラニンでなくトレオニンであり且つＮ末端にアルギニン残基が一つ付加したものに相当する。このアラニンのトレオニンへの置換により，アルブミンRedhillではそのアミノ酸配列中にAsn-Tyr-Thrで表される配列部分が生じ，この配列部分中のＡｓｎ（アスパラギン）残基がＮ－結合型グリコシド化されている。このためアルブミンRedhillは，通常の野生型アルブミン（配列番号１）と比較して分子量が２．５ｋＤａ程大きく観察される。
【0016】
本発明において，「ヒト血清アルブミン変異体」（ＨＳＡ変異体）の語は，通常の野生型ＨＳＡ（配列番号１）に対する上述の変異体であって，但し配列番号２で示されるバリアント（ＨＳＡ-Redhill）以外のものをいう。本発明において好ましいＨＳＡ変異体は，野生型のＨＳＡのアミノ酸配列のＮ末端から３２０番目のアラニンがトレオニンへ置換したものである配列番号３で示されるものに加え，血中の内因性の物質及び薬剤等の外因性の物質を結合して運搬する機能等の通常の野生型ヒト血清アルブミンとしての機能を有するものである限り，配列番号３で示されるアミノ酸配列に対し，１個又は複数個のアミノ酸残基が，他のアミノ酸残基へ置換され，欠失し，或いは付加されたアミノ酸配列であって，但し配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１８番目のアスパラギン残基及び３２０番目のトレオニン残基が，これら２残基の間にプロリン以外の単一のアミノ酸残基（Ｘ）を介してペプチド結合により連結された状態で保存されているものであるアミノ酸配列を有するものを含む。当該アミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換する場合，置換するアミノ酸残基の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個である。アミノ酸残基を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸残基の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個である。例えば，配列番号３で示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸残基が欠失した，５８４個のアミノ酸残基からなる変異体でもよい。また，これらアミノ酸残基の置換と欠失を組み合わせたものであってもよい。更に，それら変異体のアミノ酸配列中に又は当該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであってもよい。即ち，配列番号３で示されるアミノ酸配列に対し，アミノ酸の置換及び欠失，及び付加の３種類の変異のうち，少なくとも２種類の変異を組み合わせて導入したものであって，０～１０個のアミノ酸残基の欠失と，０～１０個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０～１０個のアミノ酸残基の付加とを行ったものであることができる。但し，配列番号３に示されるアミノ酸配列のＮ末端から３１８～３２０番目のアミノ酸残基はアスパラギン－Ｘ－トレオニン（「Ｘ」はプロリン以外のアミノ酸残基）でなければならず，好ましくは，アスパラギン－チロシン－トレオニンである。なお，ヒト血清アルブミン変異体は，ヒト血清アルブミンとしての機能を保持する限り，ヒト血清アルブミンに包含される。ここでヒト血清アルブミン変異体のアミノ酸配列は，配列番号１で示される通常の野生型ＨＳＡのアミノ酸配列と，好ましくは85%以上の同一性を，より好ましくは90%以上の同一性を，更に好ましくは95%以上の同一性を有するものである。
【0017】
本発明において，種々のＨＳＡ変異体における通常の野生型ＨＳＡと比較したときの各変異の位置及びその形式（欠失，置換，付加）は，両ＨＳＡのアミノ酸配列のアラインメントにより，容易に確認することができる。なお，本発明において，野生型ＨＳＡのアミノ酸配列と変異を加えたＨＳＡのアミノ酸配列との同一性は，周知の相同性計算アルゴリズムを用いて容易に算出することができる。例えば，そのようなアルゴリズムとして，BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990))，Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))，Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等がある。
【0018】
上記のＨＳＡのアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸による置換は，例えば，アミノ酸のそれらの側鎖及び化学的性質で関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。このようなアミノ酸ファミリー内での置換は，ＨＳＡの機能に大きな変化をもたらさない（即ち，保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。かかるアミノ酸ファミリーとしては，例えば以下のものがある：
（１）酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸，
（２）塩基性アミノ酸であるヒスチジン，リシン，及びアルギニン
（３）芳香族アミン酸であるフェニルアラニン，チロシン，トリプトファン，
（４）水酸基を有するアミノ酸（ヒドロキシアミノ酸）であるセリンとトレオニン，
（５）疎水性アミノ酸であるメチオニン，アラニン，バリン，ロイシン，及びイソロイシン，
（６）中性の親水性アミノ酸であるシステイン，セリン，トレオニン，アスパラギン，及びグルタミン，
（７）ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン，
（８）アミド型アミノ酸（極性アミノ酸）であるアスパラギンとグルタミン，
（９）脂肪族アミノ酸である，アラニン，ロイシン，イソロイシン，及びバリン，
（１０）側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン，グリシン，セリン，及びトレオニン，
（１１）側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン。
（１）酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸，
（２）塩基性アミノ酸であるヒスチジン，リシン，及びアルギニン
（３）芳香族アミン酸であるフェニルアラニン，チロシン，トリプトファン，
（４）水酸基を有するアミノ酸（ヒドロキシアミノ酸）であるセリンとトレオニン，
（５）疎水性アミノ酸であるメチオニン，アラニン，バリン，ロイシン，及びイソロイシン，
（６）中性の親水性アミノ酸であるシステイン，セリン，トレオニン，アスパラギン，及びグルタミン，
（７）ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン，
（８）アミド型アミノ酸（極性アミノ酸）であるアスパラギンとグルタミン，
（９）脂肪族アミノ酸である，アラニン，ロイシン，イソロイシン，及びバリン，
（１０）側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン，グリシン，セリン，及びトレオニン，
（１１）側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン。
【0019】
後述の実施例においてヒト成長ホルモンとヒト血清アルブミン変異体とを結合させた蛋白質におけるヒト血清アルブミン変異体（ＨＳＡ変異体の典型的一例）は，５８５個のアミノ酸からなる野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列（配列番号１）に対し，Ｎ末端から３２０番目のアミノ酸残基がアラニンでなくトレオニンである点においてのみ異なる（配列番号３）。この相違により，当該ＨＳＡ変異体（「ＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）」という。）ではそのアミノ酸配列中にAsn-Tyr-Thrで表される配列部分が生じ，この配列部分においてAsn（アスパラギン）残基がＮ－結合型グリコシド化されることができる。
【0020】
本明細書において，「ヒト血清アルブミンとヒト成長ホルモンの融合蛋白質」又は「ヒト血清アルブミン－ｈＧＨ融合蛋白質（ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質）」とは，ＨＳＡと成長ホルモンとを結合させた蛋白質のことをいう。ここで，これらの蛋白質を「結合させる」とは，例えば，これらをペプチド結合により連結させることを含むが，これに限られない。また，これらの蛋白質を「結合させる」とは，一方のＮ末端と他方のＣ末端との間を直接にペプチド結合で連結させることのみならず，両蛋白質をリンカーを介して間接的に結合させることをも含む。特に，ヒト血清アルブミンがヒト血清アルブミン変異体であるときは，「ヒト血清アルブミン変異体とヒト成長ホルモンの融合蛋白質」又は「ヒト血清アルブミン変異体－ｈＧＨ融合蛋白質（ＨＳＡ変異体－ｈＧＨ融合蛋白質）」という。つまり，ヒト血清アルブミン変異体－ｈＧＨ融合蛋白質は，ヒト血清アルブミン－ｈＧＨ融合蛋白質に包含される。「ヒト血清アルブミンとヒト成長ホルモンの融合蛋白質」は，ＨＳＡ連結ｈＧＨということもできる。
【0021】
ここに「リンカー」は，上記２つのポリペプチドの間にあって両者を共有結合で結合する構造部分であり，ＨＳＡ（ＨＳＡ変異体を含む）とその結合相手である成長ホルモンの何れの末端にも由来しないものである。リンカーは，両ポリペプチドとペプチド結合した，単一のアミノ酸残基であるか又は２個以上のアミノ酸残基からなるペプチド鎖部分（ペプチドリンカー）であることができ，これら１個以上のアミノ酸残基からなるリンカーを，本明細書において包括的に「ペプチドリンカー」という。また，本明細書において，ＨＳＡと成長ホルモンが「ペプチド結合を介して」結合しているというときは，両者が直接ペプチド結合により結合している場合と両者がペプチドリンカーとの結合により結合している場合とを包含する。なお，本明細書において，ＨＳＡと成長ホルモンとが直接に又はペプチドリンカーを介して結合している場合，当該化合物である「ヒト血清アルブミン－ｈＧＨ融合蛋白質（ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質）」は，「ヒト血清アルブミン融合ｈＧＨ（ＨＳＡ融合ｈＧＨ）」ということもできる。ヒト血清アルブミン変異体－ｈＧＨ融合蛋白質（ＨＳＡ変異体－ｈＧＨ融合蛋白質）についても同様である。
【0022】
本発明において，ＨＳＡと成長ホルモンがペプチドリンカーを介して結合しているとき，そのリンカーは，好ましくは１～５０個，より好ましくは１～１７個，更に好ましくは１～１０個，尚も好ましくは１～６個のアミノ酸残基で構成されており，例えば，２～１７個，２～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個又は２５～２９個のアミノ酸で構成されるものであり，更に例えば，１個のアミノ酸残基のみで，又は２個，３個，５個，６個又は２０個のアミノ酸残基から構成されるものである。ペプチドリンカーで結合されたＨＳＡ部分がＨＳＡとしての機能を保持し且つ成長ホルモンの部分も生理的条件下で成長ホルモンの生理活性を発揮できる限り，ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基又はアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものである。ペプチドリンカーの好適な例として，一つのグリシン，一つのセリン，Gly-Ser，Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号４），Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号５），及びSer-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号６）からなるもの，並びにこれらアミノ酸配列を含んでなるものが挙げられる。これらのアミノ酸配列の何れか一種が２～１０回，あるいは２～５回連続してなる配列を有するものも，ペプチドリンカーとして好適に使用でき，また，これらのアミノ酸配列の何れかニ種以上が組み合わさって１～１０回，あるいは２～５回連続してなる配列を有するものも，ペプチドリンカーとして好適に使用できる。これらのアミノ酸配列の何れかニ種以上が組み合わさったペプチドリンカーの好適なものとして，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号５）が３個連続してなる計２０個のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
【0023】
２つの異なるポリペプチドを結合する方法としては，例えば，一方のポリペプチドをコードする遺伝子の下流に，インフレームで他方のポリペプチドをコードする遺伝子を結合させたＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを作製し，この発現ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞を培養することにより，組換え融合蛋白質として発現させる方法が一般的であり，本発明において利用できる。
【0024】
組換え体として形質転換細胞に発現させることによりＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質を産生させる場合，成長ホルモンのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが，ＨＳＡのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の何れかに結合された形の融合蛋白質が得られる。遺伝子組換え技術を用いて製造されたＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質は，特に，組換えＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質という。
【0025】
ＨＳＡのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのＮ末端側に成長ホルモンのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを結合させる場合，成長ホルモンのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする遺伝子の下流に，ＨＳＡのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで結合させたＤＮＡを組み込んだ発現ベクターが用いられる。ペプチドリンカーを介して２つのポリペプチドを間接的に結合させる場合は，２つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に，当該リンカーをコードするＤＮＡ配列がインフレームで挿入される。
【0026】
ＨＳＡのアミノ酸配列を含むポリペプチドのＣ末端側に成長ホルモンのアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合させる場合，成長ホルモンのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の上流に，ＨＳＡのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで結合させたＤＮＡを組み込んだ発現ベクターが用いられる。ペプチドリンカーを介して２つのポリペプチドを間接的に結合させる場合は，２つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に，当該リンカーをコードするＤＮＡ配列がインフレームで挿入される。
【0027】
ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質を宿主細胞に産生させるには，それらの何れかをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターが宿主細胞に導入される。このために用いることのできる宿主細胞は，そのような発現ベクターを導入することによりＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質を発現させることができるものである限り特に制限はなく，哺乳動物細胞，酵母，植物細胞，昆虫細胞等の真核生物細胞，大腸菌，枯草菌等の原核細胞の何れであってもよいが，哺乳動物細胞が特に好適である。但し，糖鎖修飾された蛋白質として発現させる場合の宿主細胞は，哺乳動物細胞，酵母，植物細胞，昆虫細胞等の真核生物細胞から選択される。通常野生型のＨＳＡの３２０番目のアミノ酸残基がトレオニンとなることにより生じるAsn－Tyr－Thrで表される配列部分のＡｓｎ残基，又はAsn－Ｘ－Thr（「Ｘ」はプロリン以外のアミノ酸残基）で表される配列中のＡｓｎ残基は，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の発現を真核生物細胞で行わせることによりＮ－結合型グリコシド化される。
【0028】
哺乳動物細胞を宿主細胞として使用する場合，該哺乳動物細胞の種類について特に限定はないが，ヒト，マウス，チャイニーズハムスター由来の細胞が好ましく，特にチャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞，又はマウス骨髄腫に由来するＮＳ／０細胞が好ましい。またこのときＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片を組み込んで発現させるために用いる発現ベクターは，哺乳動物細胞内に導入したとき該遺伝子の発現をもたらすものであれば特に限定なく用いることができる。発現ベクターに組み込まれた該遺伝子は，哺乳動物細胞内で遺伝子の転写の頻度を調節することができるＤＮＡ配列（遺伝子発現制御部位）の下流に配置される。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位としては，例えば，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーターが挙げられる。
【0029】
このような発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込まれている蛋白質を発現するようになるが，その発現量は個々の細胞により異なり一様ではない。従って，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質を効率よく生産するためには，発現ベクターが導入された哺乳動物細胞から，これらの発現レベルが高い細胞を選択するステップが必要となる。この選択ステップを行うために，発現ベクターには選択マーカーとして働く遺伝子が組み込まれている。
【0030】
選択マーカーとして最も一般的なものはピューロマイシン，ネオマイシン等の薬剤を分解する酵素（薬剤耐性マーカー）である。哺乳動物細胞は通常一定濃度以上のこれらの薬剤の存在下で死滅する。しかし，薬剤耐性マーカー遺伝子の組み込まれた発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現された薬剤耐性マーカーにより上記薬剤を無毒化又は弱毒化することができるため，上記薬剤存在下でも生存可能となる。選択マーカーとして薬剤耐性マーカーが組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し，その薬剤耐性マーカーに対応する薬剤を含有する選択培地中で，例えば，その薬剤の濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度の薬剤存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では，薬剤耐性マーカーとともに，一般に，発現ベクターに組み込まれた目的の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加し，結果として当該蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。
【0031】
また，選択マーカーとして，グルタミン合成酵素（ＧＳ）を用いることもできる。グルタミン合成酵素は，グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを合成する酵素である。哺乳動物細胞を，グルタミン合成酵素の阻害剤，例えばL-メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有し，且つグルタミンを含有しない選択培地中で培養すると，細胞は通常死滅する。しかし，選択マーカーとしてグルタミン合成酵素が組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入すると，該細胞では，グルタミン合成酵素の発現レベルが上昇するようになるので，より高濃度のＭＳＸ存在下でも増殖可能となる。このとき，ＭＳＸの濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度のＭＳＸ存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では，グルタミン合成酵素とともに，一般に，発現ベクターに組み込んだ目的の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加し，結果として当該蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。
【0032】
また，選択マーカーとして，ジヒドロ葉酸レデクターゼ（ＤＨＦＲ）を用いることもできる。ＤＨＦＲを選択マーカーとして用いる場合，発現ベクターを導入した哺乳動物細胞は，メトトレキセート，アミノプテリン等のＤＨＦＲ阻害剤を含有する選択培地中で培養される。ＤＨＦＲ阻害剤の濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度のＤＨＦＲ阻害剤存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このとき用いられる選択培地は，ヒポキサンチン及びチミジンを含有しないことが好ましい。このようにして選択された細胞では，ＤＨＦＲとともに，一般に，発現ベクターに組み込んだ目的の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加し，結果として当該蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。
【0033】
目的の蛋白質をコードする遺伝子の下流側に内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ：internal ribosome entry site）を介して，選択マーカーとしてグルタミン合成酵素（ＧＳ）を配置した発現ベクターが知られている（国際特許公報ＷＯ２０１２／０６３７９９，ＷＯ２０１３／１６１９５８）。これら文献に記載された発現ベクターは，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の製造に特に好適に使用することができる。
【0034】
例えば，目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，第１の遺伝子発現制御部位，並びに，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流に内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ，上記第１の遺伝子発現制御部位の又はこれとは別の第２の遺伝子発現制御部位の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又は薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる発現ベクターは，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の製造に好適に使用できる。この発現ベクターにおいて，第１の遺伝子発現制御部位又は第２の遺伝子発現制御部位としては，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１αプロモーター（ｈＥＦ－１αプロモーター），ヒトユビキチンＣプロモーターが好適に用いられるが，ｈＥＦ－１αプロモーターが特に好適である。
【0035】
また，内部リボソーム結合部位としては，ピコルナウイルス科のウイルス，口蹄疫ウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，コロナウイルス，ウシ腸内ウイルス，サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス，コクサッキーＢ型ウイルスからなる群より選択されるウイルスのゲノム，又はヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子，ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子，ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択される遺伝子の５’非翻訳領域に由来するものが好適に用いられるが，マウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位が特に好適である。マウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を用いる場合，野生型のもの以外に，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものも好適に使用できる。また，この発現ベクターにおいて，好適に用いられる薬剤耐性遺伝子は，好ましくはピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子であり，より好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子である。
【0036】
また，例えば，目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，ヒト伸長因子－１αプロモーター，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含む発現ベクターであって，該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の製造に好適に使用できる。このような発現ベクターとして，ＷＯ２０１３／１６１９５８に記載された発現ベクターが挙げられる。
【0037】
また，例えば，目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，ヒト伸長因子－１αプロモーター，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含む発現ベクターであって，該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の製造に好適に使用できる。このような発現ベクターとして，ＷＯ２０１２／０６３７９９に記載されたpE-mIRES-GS-puro及びＷＯ２０１３／１６１９５８に記載されたpE-mIRES-GS-mNeoが挙げられる。
【0038】
野生型のマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位の３’末端には，３つの開始コドン（ATG）が存在しており，その３つの開始コドンを含む配列部分は配列番号７（5'-ATGataatATGgccacaaccATG-3'：開始コドンのATGを大文字で示す）で示される。この配列部分中の開始コドンのうちの一部が破壊されたものとして，例えば，配列番号８（5'-atgataagcttgccacaaccatg-3'）で示されるものがあり，上記のpE-mIRES-GS-puro及びpE-mIRES-GS-mNeoは，配列番号８で示される配列を含むIRESを有する発現ベクターである。
【0039】
本発明において，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，これらの発現レベルの高い細胞を選択するために，選択培地中で選択培養される。
【0040】
選択培養において，ＤＨＦＲを選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＤＨＦＲ阻害剤の濃度を段階的に上昇させる。その最大濃度は，ＤＨＦＲ阻害剤がメトトレキセートの場合，好ましくは0.25～5 μMであり，より好ましくは0.5～1.5 μMであり，更に好ましくは約1.0 μMである。
【0041】
ＧＳを選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＧＳ阻害剤の濃度を段階的に上昇させる。その最大濃度は，ＧＳ阻害剤がＭＳＸの場合，好ましくは10～1000 μM等であり，例えば，20～500 μM，20～80 μM，20～30 μMである。またこのとき，一般的にグルタミンを含有しない培地が選択培地として用いられる。
【0042】
ピューロマイシンを分解する酵素を選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるピューロマイシンの最大濃度は，好ましくは3～30 μg/mLであり，より好ましくは5～20 μg/mLであり，更に好ましくは約10 μg/mLである。
【0043】
ネオマイシンを分解する酵素を選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＧ４１８の最大濃度は，好ましくは0.1～2 mg/mLであり，より好ましくは0.5～1.5 mg/mLであり，更に好ましくは約1 mg/mLである。
【0044】
また，哺乳動物細胞の培養のための培地としては，選択培養で用いる培地，後述する組換え蛋白質を生産するために用いる培地（組換え蛋白質生産用培地）ともに，哺乳動物細胞を培養して増殖させることのできるものであれば，特に限定なく用いることができるが，好ましくは無血清培地が用いられる。ＨＳＡは血清中に含まれる成分を吸着する性質を有するため，血清を含有する培地を用いてＨＳＡを生産した場合には，血清中の不純物を吸着したＨＳＡが得られることから，その後の工程でこの不純物を除去する必要が生じる。
【0045】
本発明において，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質は，特に，これらを発現している細胞を無血清培地で培養して得られるものである。無血清培地を用いることにより，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質への不純物の吸着量を低減することができるので，その後の精製工程を簡便化することができる。
【0046】
選択培養により選択されたＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の発現レベルの高い細胞がＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の生産に用いられる（ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質産生細胞）。ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の生産は，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質産生細胞をＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質生産用培地中で培養することにより行われる。この培養を生産培養という。
【0047】
本発明において，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質生産用培地として用いられる無血清培地としては，例えば，アミノ酸を3～700 mg/L，ビタミン類を0.001～50 mg/L，単糖類を0.3～10 g/L，無機塩を0.1～10000 mg/L，微量元素を0.001～0.1 mg/L，ヌクレオシドを0.1～50 mg/L，脂肪酸を0.001～10 mg/L，ビオチンを0.01～1 mg/L，ヒドロコルチゾンを0.1～20 μg/L，インシュリンを0.1～20 mg/L，ビタミンＢ１２を0.1～10 mg/L，プトレッシンを0.01～1 mg/L，ピルビン酸ナトリウムを10～500 mg/L，及び水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により，チミジン，ヒポキサンチン，慣用のｐＨ指示薬及び抗生物質等を培地に添加してもよい。
【0048】
ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質生産用培地として用いられる無血清培地として，ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地）を基本培地として用いてもよく，これら各培地は当業者に周知である。更にまた，無血清培地として，炭酸水素ナトリウム，Ｌ－グルタミン，Ｄ－グルコース，インスリン，ナトリウムセレナイト，ジアミノブタン，ヒドロコルチゾン，硫酸鉄（ＩＩ），アスパラギン，アスパラギン酸，セリン及びポリビニルアルコールを含むものである，ＤＭＥＭ（ＨＧ）ＨＡＭ改良型（Ｒ５）培地を使用してもよい。更には市販の無血清培地，例えば，ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯＴＭ培地，ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ ＩＩ培地又はＣＤ ＣＨＯ培地（Thermo Fisher Scientific社），ＩＳ ｃｈｏ－ＶＴＭ 培地（Irvine Scientific社），ＥＸ－ＣＥＬＬＴＭ３０２培地，ＥＸ－ＣＥＬＬＴＭ Ａｄｖａｎｃｅｄ培地又はＥＸ－ＣＥＬＬＴＭ３２５－ＰＦ培地（SAFC Biosciences社）等を基本培地として使用することもできる。
【0049】
ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質生産用培地には，適宜，ダイズ，小麦，イネ等の植物由来の加水分解物を１～５０ｇ／Ｌ（例えば１～５ｇ／Ｌ）を添加することもできる。最も一般的に用いられるものは，ダイズ由来の蛋白質加水分解物である。但し，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質は，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質生産用培地に，イネ等の植物由来の加水分解物，例えばダイズ由来の蛋白質加水分解物を添加することなく製造することができる。
【0050】
生産培養終了後の培養液は，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の精製のためのクロマトグラフィー工程に供される。但し，クロマトグラフィー工程に供されるものは，培養液から細胞等が除去された培養上清である。培養液から培養上清を得る方法としては，膜フィルターによるろ過，遠心分離等がある。
【0051】
本発明において，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の精製のためのクロマトグラフィー工程の各々は，必要に応じ，蛋白質の非特異的吸着を防止するため，非イオン性界面活性剤の存在下で行われてよい。どの非イオン性界面活性剤を用いるかについて特段の限定はないが，ポリソルベート系界面活性剤が好ましく用いられ，より好ましくはポリソルベート８０又はポリソルベート２０である。そのような非イオン性界面活性剤の濃度は，好ましくは0.005% (w/v)～0.1% (w/v)であり，より好ましくは0.005% (w/v)～0.05% (w/v)であり，例えば0.01% (w/v)，0.05% (w/v)等である。
【0052】
ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の精製工程は，室温又は低温で行うことができるが，好ましくは低温で，特に１～10℃で行うことができる。
【0053】
本発明の一実施形態において，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の精製工程は，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と，リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程と，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程とを含むものである。但し，これらのクロマトグラフィー工程に１又は複数のクロマトグラフィー工程を加えることもできる。かかる追加のクロマトグラフィー工程としては，例えば，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程，リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー工程，疎水性カラムクロマトグラフィー工程，色素親和性カラムクロマトグラフィー工程，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程が挙げられる。
【0054】
本発明の一実施形態において，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の精製工程は，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と，リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程と，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程とを，この順で含むものである。但し，これらのクロマトグラフィー工程に１又は複数のクロマトグラフィー工程を加えることもできる。かかる追加のクロマトグラフィー工程としては，例えば，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程，リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー工程，疎水性カラムクロマトグラフィー工程，色素リガンドカラムクロマトグラフィー工程及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程が挙げられる。追加のクロマトグラフィーは，どの隣接するステップ間に加えても良く，又は，最初のクロマトグラフィー工程，最後のクロマトグラフィー工程として加えても良い。
【0055】
本発明の一実施形態における，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と，リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程と，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程と，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程とを，この順で含む精製工程について以下に詳述する。
【0056】
第一のカラムクロマトグラフィー工程は，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーを用いるものである。ここで，抗体は，ＨＳＡ又はｈＧＨの何れに親和性を有するものであってもよいが，好ましくはｈＧＨに親和性を有するものである。例えば，ヒト成長ホルモンに対する抗体を結合させた担体を含むものである，Capture select Human Growth Hormone Affinity Matrix（Thermo Fisher Scientific社）は，好適に使用することができる。
【0057】
ｈＧＨに親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーカラムを用いる場合，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質は，予め緩衝液で平衡化させたカラムに付される。ここで，緩衝液の種類に特に限定は無いが，Tris-HCl緩衝液が好ましく，その濃度は，好ましくは5～50 mMであり，より好ましくは10～30 mMである。また，そのpHは，好ましくは6.7～7.3，より好ましくは6.9～7.1，更に好ましくは約7.0に調整される。カラムからのＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の溶出は，好ましくはグリシン-塩酸を用いて行われる。グリシン-塩酸の濃度は，好ましくは20～100 mMであり，より好ましくは40～60mMであり，更に好ましくは約50 mMである。また，そのpHは好ましくは2.0～4.0，より好ましくは2.8～3.2，そして更に好ましくは約3.0に調整される。溶出液のpHは，直ちに中性付近，例えばpH 6.4～7.0に調整される。
【0058】
第二のカラムクロマトグラフィー工程は，リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いるものである。リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いるカラムクロマトグラフィーとして好適なものとして，ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーとフルオロアパタイトカラムクロマトグラフィーが挙げられるが，ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーが特に好ましい。これらは，カルシウムイオンによる金属アフィニティと，リン酸基による陽イオン交換の双方による相互作用を利用して，夾雑物を除去するためのものである。
【0059】
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーを用いる場合について，以下に詳述する。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに用いる担体については特段の限定は無く，セラミック性であっても，結晶性であってもよいが，特に好ましい担体の１つとして，ＣＨＴ Ｔｙｐｅ ＩＩ, ４０μｍ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社）が挙げられる。
【0060】
第一のカラムクロマトグラフィー工程で得られた溶出液は，ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムに付される前に，pHと導電率が調整される。このとき，pHは，好ましくは6.5～7.5，より好ましくは6.8～7.2，更に好ましくは6.9～7.1に調整される。また，導電率は，好ましくは0.4～0.8 S/m，より好ましくは0.5～0.7 S/mに調整される。
【0061】
pHと導電率を調整した溶出液は，予め緩衝液で平衡化されたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムに付される。ここで，緩衝液の種類に特に限定は無いが，MES緩衝液が好ましく，その濃度は，好ましくは5～50 mMであり，より好ましくは10～30 mMであり，例えば20 mMである。また，そのpHは，好ましくは6.7～7.3，より好ましくは6.9～7.1，更に好ましくは約7.0に調整される。また，緩衝液はリン酸イオンを含み，その濃度は好ましくは0～3 mMであり，より好ましくは0～2 mMであり，例えば1 mMである。
【0062】
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムからのＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の溶出は，リン酸イオンの濃度を高めた緩衝液を用いて行われる。このときのリン酸イオンの濃度は，好ましくは20～50 mMであり，より好ましくは25～40 mMであり，更に好ましくは25～35 mMであり，例えば30 mMである。
【0063】
第三のカラムクロマトグラフィー工程は，陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いるものであり，夾雑蛋白質を除去するためのものである。陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいてどの陽イオン交換樹脂を用いるかについて特に限定はないが，弱陽イオン交換樹脂が好ましく，より好ましくは，疎水性相互作用及び水素結合形成の双方に基づく選択性を有する弱陽イオン交換樹脂である。例えば，Capto MMC (GE Healthcare)等のような，フェニル基，アミド結合，及びカルボキシル基を有し且つ疎水性相互作用及び水素結合形成に基づく選択性を有する弱陽イオン交換樹脂は好適に用いることができる。
【0064】
第二のカラムクロマトグラフィー工程で得られた溶出液は，陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付される前に，pHと導電率が調整される。このとき，pHは，好ましくは5.3～6.2，より好ましくは5.4～6.1，更に好ましくは5.6～5.8に調整される。また，導電率は，好ましくは0.5～0.9 S/m，より好ましくは0.6～0.8 S/mに調整される。
【0065】
pHと導電率を調整した溶出液は，予め緩衝液で平衡化された陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付される。ここで，緩衝液の種類に特に限定は無いが，MES緩衝液が好ましく，その濃度は，好ましくは30～70 mMであり，より好ましくは40～60 mMであり，例えば50 mMである。また，そのpHは，好ましくは5.4～6.0，より好ましくは5.6～5.8，例えば5.7に調整される。また，緩衝液は塩を含み，塩が中性塩であるときの緩衝液中での濃度は好ましくは30～150 mMであり，より好ましくは50～120 mMであり，更に好ましくは80～120 mMであり，例えば100 mMである。このときの中性塩は，好ましくは塩化ナトリウム，塩化カリウムであるが，特に好ましくは塩化ナトリウムである。
【0066】
陽イオン交換カラムクロマトグラフィーからのＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の溶出は，中性塩の濃度を高めた緩衝液を用いて行われる。このときの中性塩の濃度は，好ましくは400～600 mMであり，より好ましくは500～600 mMであり，更に好ましくは530～570 mMであり，例えば550 mMである。
【0067】
第四のカラムクロマトグラフィー工程は，サイズ排除クロマトグラフィーを用いるものである。サイズ排除クロマトグラフィーは，分子サイズに基づいて，特にエンドトキシン等の低分子の夾雑物，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の多量体や分解物を除去するためのものである。
【0068】
サイズ排除クロマトグラフィー工程において，カラムは予め平衡化される。ここで，緩衝液の種類に特に限定は無いが，リン酸緩衝液が好ましく，その濃度は，好ましくは5～20 mMであり，より好ましくは8～12 mMであり，例えば10 mMである。そのpHは，好ましくは6.6～7.4，より好ましくは7.0～7.4，例えば7.2に調整される。また，緩衝液は医薬品添加物として使用し得る二糖を含有するものであってもよい。かかる二糖は，好ましくはショ糖であり，その濃度は，好ましくは60～90 mg/mLであり，より好ましくは70～80 mg/mLであり，例えば75 mg/mLである。この第一から第四のカラムクロマトグラフィー工程により，実質的に純粋なＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質が得られる。
【0069】
ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の精製工程において，ウイルス不活化工程を所望により追加することもできる。ウイルス不活化工程は，任意の２つのクロマトグラフィー工程の間で実施してもよく，また，最初のクロマトグラフィー工程の前に，又は最後のクロマトグラフィー工程の後に実施しても良い。また，ウイルス不活化工程はＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の精製工程において，１回実施してもよく，２回実施してもよく，又は３回以上実施してもよい。
【0070】
クロマトグラフィー工程が，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質に親和性を有する抗体を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程（第一のカラムクロマトグラフィー工程）と，リン酸基に対する親和性を有する材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー工程（第二のカラムクロマトグラフィー工程）と，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程（第三のカラムクロマトグラフィー工程）と，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー工程（第四のカラムクロマトグラフィー工程）とを，この順で含むものである場合，ウイルス不活化工程は，好ましくは，第一のカラムクロマトグラフィー工程と第二のカラムクロマトグラフィー工程の間において，又は／及び第四のカラムクロマトグラフィー工程の後で実施される。如何なるウイルス不活化工程を適用するかについて特に限定はないが，溶媒－界面活性剤法又はフィルターろ過法が好適に適用できる。溶媒－界面活性剤法は，ウイルスを不活化すべき溶液に，有機溶媒と界面活性剤を添加することにより，ウイルスを不活化させる方法である。溶媒－界面活性剤法が適用される場合，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質を含有する溶液に有機溶媒と非イオン性界面活性剤を添加して混合し，この混合液が，例えば３時間を超えてインキュベートされる。溶媒－界面活性剤法において用いられる溶液は，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質が少なくとも２時間安定に保持されるものである限り特に限定はないが，中性付近にpHが調整されたグリシン緩衝液，リン酸緩衝液，MES緩衝液，Tris-HCl緩衝液，又はこれらの混合物に，有機溶媒と非界面活性剤が混合されたものが好適に使用できる。また，どの非イオン性界面活性剤を用いるかについても特に限定はないが，例えば，ポリソルベート２０，ポリソルベート８０，及びtriton X-100を，単独で又はこれらを任意に組み合わせて用いることができる。ポリソルベート８０は特に好適な非イオン性界面活性剤の一つであり，単独で又は他の非イオン性界面活性剤と組み合わせて用いることができる。また，どの有機溶媒を用いるかについても特に限定はないが，例えば，トリ（ｎ－ブチルホスフェート）を用いることができる。ポリソルベート８０とトリ（ｎ－ブチルホスフェート）とを組み合わせ用いる場合，混合液中のポリソルベート８０の濃度は0.3～2%，例えば1%であり，トリ（ｎ－ブチルホスフェート）の濃度は0.1～0.5%，例えば0.3%であり，混合液は２～５時間，例えば３時間インキュベートされる。
【0071】
フィルターろ過法は，ウイルスを除去すべき溶液を，ウイルスを除去する性能を有するろ過膜（ウイルス除去膜）でろ過して，ウイルスを除去する方法である。フィルターろ過法で用いられるろ過膜は，好ましくは平均孔径が17～21 nmのものであり，その材質は例えば再生セルロースである。フィルターろ過法が適用される場合，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質を含有する溶液をウイルス除去膜に通過させる。例えば，第一のカラムクロマトグラフィー工程と第二のカラムクロマトグラフィー工程の間において溶媒－界面活性剤法によりウイルス不活化を行い，第四のカラムクロマトグラフィー工程の後に，フィルターろ過法によりウイルス不活化を行うことにより，より確実にウイルス除去を行うことができる。
【0072】
なお，ウイルス除去膜による方法は，ウイルス除去工程ということもできるが，本発明においては，ウイルス不活化工程の一手法ということもできる。
【0073】
本発明において，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質は，ＨＳＡが結合していない元の成長ホルモンに比べ，血中での安定性が高まり半減期が長くなる。投与経路や投与量により変動はするが，皮下注射でカニクイザルに投与したときの血中半減期（ｔ１／２β）が例えば５時間以上と，血中で極めて安定になる。例えば，ＨＳＡ変異体－ヒト成長ホルモン融合蛋白質の血中半減期（ｔ１／２β）は，０．５～１０ｍｇ／ｋｇの用量で雄性カニクイザルに単回皮下投与したとき，血中半減期（ｔ１／２β）は，５～４０時間である。
【0074】
本発明において，ＨＳＡ変異体－成長ホルモン融合蛋白質を有効成分として含有してなる医薬は，注射剤として静脈内，筋肉内，腹腔内又は皮下に投与することができる。
【0075】
ヒト成長ホルモンには，主に分子量が22 kDaであるもの（２２ｋＤａヒト成長ホルモン，本明細書において２２Ｋヒト成長ホルモン）と20 kDaであるもの（２０ｋＤａヒト成長ホルモン，本明細書において２０Ｋヒト成長ホルモン）の分子量の異なる２種類がある。２２Ｋ成長ホルモンは，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する，１９１個のアミノ酸から構成される蛋白質である。通常，「ヒト成長ホルモン（又はｈＧＨ）」というときは，この２２Ｋ成長ホルモンのことを意味するが，本明細書において，単に「ヒト成長ホルモン（又はｈＧＨ）」というときは，２２Ｋヒト成長ホルモンと２０Ｋヒト成長ホルモンの双方を包含する。
【0076】
本明細書において，単に「２２Ｋヒト成長ホルモン（又は２２ＫｈＧＨ）」というときは，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する野生型の２２ＫｈＧＨに加え，これに対し１個又は複数個のアミノ酸が，置換，欠失及び／又は付加されたものである２２ＫｈＧＨ変異体であって成長促進活性を有するものも含まれる。置換，欠失及び／又は付加されてよいアミノ酸の個数は，各変異タイプにつき，好ましくは１～８個であり，より好ましくは１～４個であり，更に好ましくは１～２個である。ここで２２ＫｈＧＨ変異体のアミノ酸配列は，配列番号９で示される野生型の２２ＫｈＧＨのアミノ酸配列と，好ましくは85%以上の同一性を，より好ましくは90%以上の同一性を，更に好ましくは95%以上の同一性を有するものである。
【0077】
野生型の２０Ｋヒト成長ホルモンは，野生型の２２Ｋ成長ホルモン（配列番号９）を構成する１９１個のアミノ酸のうちＮ末端から数えて３２番目～４６番目の１５個のアミノ酸が欠失したものに相当し，１７６個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列（配列番号１０）よりなる，成長促進活性を有する蛋白質である。但し，本明細書において，単に「２０Ｋヒト成長ホルモン（又は２０ＫｈＧＨ）」というときは，配列番号１０で示される野生型の２０ＫｈＧＨに加え，当該配列に対し，１個又は複数個のアミノ酸が，置換，欠失及び／又は付加されたものに相当する２０ＫｈＧＨの変異体であって成長促進活性を有するものも含まれる。置換，欠失及び／又は付加されてよいアミノ酸の個数は，各変異タイプにつき，好ましくは１～８個であり，より好ましくは１～４個であり，更に好ましくは１～２個である。ここで２０ＫｈＧＨ変異体のアミノ酸配列は，配列番号１０で示される野生型の２０ＫｈＧＨのアミノ酸配列と，好ましくは85%以上の同一性を，より好ましくは90%以上の同一性を，更に好ましくは95%以上の同一性を有するものである。
【0078】
本発明において，種々のｈＧＨ変異体における通常の野生型ｈＧＨと比較したときの各変異の位置及びその形式（欠失，置換，付加）は，両ｈＧＨのアミノ酸配列のアラインメントにより，容易に確認することができる。なお，本発明において，野生型ｈＧＨのアミノ酸配列と変異を加えたｈＧＨのアミノ酸配列との同一性は，周知の相同性計算アルゴリズムを用いて容易に算出することができる。例えば，そのようなアルゴリズムとして，BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990))，Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))，Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等がある。
【0079】
上記のｈＧＨのアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸による置換は，例えば，アミノ酸のそれらの側鎖及び化学的性質で関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。このようなアミノ酸ファミリー内での置換は，ｈＧＨの機能に大きな変化をもたらさない（即ち，保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。かかるアミノ酸ファミリーとしては，例えば以下のものがある：
（１）酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸，
（２）塩基性アミノ酸であるヒスチジン，リシン，及びアルギニン
（３）芳香族アミン酸であるフェニルアラニン，チロシン，トリプトファン，
（４）水酸基を有するアミノ酸（ヒドロキシアミノ酸）であるセリンとトレオニン，
（５）疎水性アミノ酸であるメチオニン，アラニン，バリン，ロイシン，及びイソロイシン，
（６）中性の親水性アミノ酸であるシステイン，セリン，トレオニン，アスパラギン，及びグルタミン，
（７）ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン，
（８）アミド型アミノ酸（極性アミノ酸）であるアスパラギンとグルタミン，
（９）脂肪族アミノ酸である，アラニン，ロイシン，イソロイシン，及びバリン，
（１０）側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン，グリシン，セリン，及びトレオニン，
（１１）側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン。
（１）酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸，
（２）塩基性アミノ酸であるヒスチジン，リシン，及びアルギニン
（３）芳香族アミン酸であるフェニルアラニン，チロシン，トリプトファン，
（４）水酸基を有するアミノ酸（ヒドロキシアミノ酸）であるセリンとトレオニン，
（５）疎水性アミノ酸であるメチオニン，アラニン，バリン，ロイシン，及びイソロイシン，
（６）中性の親水性アミノ酸であるシステイン，セリン，トレオニン，アスパラギン，及びグルタミン，
（７）ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン，
（８）アミド型アミノ酸（極性アミノ酸）であるアスパラギンとグルタミン，
（９）脂肪族アミノ酸である，アラニン，ロイシン，イソロイシン，及びバリン，
（１０）側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン，グリシン，セリン，及びトレオニン，
（１１）側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン。
【0080】
ｈＧＨ遺伝子を導入した大腸菌を用いて組換え蛋白質として製造された分子量約２２ＫＤのｈＧＨを有効成分として含有する製剤（ｈＧＨ製剤）が，成長ホルモン分泌不全性低身長症，ターナー症候群における低身長，ＳＧＡ性低身長症，ヌーナン症候群における低身長症，慢性腎不全による低身長症，プラダーウィリー症候群における低身長症，及び軟骨異栄養症における低身長症の治療剤として広く臨床使用されている。ｈＧＨ製剤は，これら疾患において骨端線閉鎖を伴わない場合において特に効果を奏する。ｈＧＨ製剤は，皮下又は筋肉内に投与されることで成分のｈＧＨが血中を循環し，その成長促進活性により患者の成長を促進する効果を発揮する。また，ｈＧＨ製剤は，成人成長ホルモン分泌不全症の治療剤としても広く臨床使用されている。成人成長ホルモン分泌不全症の患者では，脂質代謝異常が認められるが，ｈＧＨ製剤の投与により，患者の脂質代謝等が正常化し，患者のＱＯＬが改善される。ＡＩＤＳによる消耗の治療剤としても成長ホルモンは臨床応用されている。成長ホルモン分泌不全性低身長症，成人成長ホルモン分泌不全症等のｈＧＨ製剤としては，例えば，グロウジェクト（登録商標）がある。
【0081】
ＨＳＡ変異体とｈＧＨとの融合蛋白質を作製する場合，ＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドとを結合させる具体的方法としては，例えば，一方のポリペプチドをコードする遺伝子の下流に，インフレームで他方のポリペプチドをコードする遺伝子を結合させたＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターを作製し，この発現ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞を培養することにより，組換え蛋白質として発現させる方法が一般的であり，本発明において利用できる。
【0082】
組換え蛋白質として形質転換細胞に発現させる方法によりＨＳＡ変異体とｈＧＨとの融合蛋白質を作製するとき，ｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドは，ＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＮ末端側又はＣ末端側の何れかに，直接，又はリンカーを介して間接的に結合される。
【0083】
ＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＮ末端側にｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合させる場合，ｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の下流に，ＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで結合させたＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターが用いられる。２つのポリペプチドをペプチドリンカーを介して間接的に結合させる場合は，２つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に，当該リンカーをコードするＤＮＡ配列がインフレームで配置される。
【0084】
ＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＣ末端側にｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合させる場合，ｈＧＨのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の上流に，ＨＳＡ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで結合させたＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターが用いられる。２つのポリペプチドをペプチドリンカーを介して間接的に結合させる場合は，２つのポリペプチドをコードする遺伝子の間に，当該リンカーをコードするＤＮＡ配列がインフレームで配置される。
【0085】
本発明において，ＨＳＡ変異体とｈＧＨの融合蛋白質（ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質の一種）の好適な一例として，配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）のＮ末端に，リンカーを介さずに，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する２２Ｋヒト成長ホルモンのＣ末端をペプチド結合により結合させたものである，配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質が挙げられる。本発明において，この順序でＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）と２２ＫｈＧＨとを結合させたものを，「２２Ｋヒト成長ホルモン－ｍＨＳＡ」又は「２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ」という。同様に，ＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）のＣ末端に，リンカーを介さずに，２２Ｋヒト成長ホルモンのＮ末端がペプチド結合により結合したものを「ｍＨＳＡ－２２Ｋヒト成長ホルモン」又は「ｍＨＳＡ－２２ＫｈＧＨ」という。
【0086】
また，配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミン（Ａ３２０Ｔ）のＮ末端に，リンカーを介さずに，配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する２０Ｋヒト成長ホルモンのＣ末端をペプチド結合により結合させたものである，配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質を，「２０Ｋヒト成長ホルモン－ｍＨＳＡ」又は「２０ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ」という。同様に，ヒト血清アルブミン（Ａ３２０Ｔ）のＣ末端に，リンカーを介さずに，２０Ｋヒト成長ホルモンのＮ末端がペプチド結合により結合したものを「ｍＨＳＡ－２０Ｋヒト成長ホルモン」又は「ｍＨＳＡ－２０ＫｈＧＨ」という。
【0087】
本発明において，ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質は，皮下注射でカニクイザルに投与したときの血中半減期（ｔ1/2β）が概ね５時間以上と血中で極めて安定になることを特徴とする。投与量により変動はするが，例えば，４ｍｇ／ｋｇの用量で雄性カニクイザルに単回皮下投与したときの，ｍＨＳＡ－２２ＫｈＧＨ及び２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの血中半減期（ｔ1/2β）は，２０～３５時間である。
【0088】
本発明におけるＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質は，医薬として使用することができる。ＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質は，ヒト成長ホルモンとＨＳＡの機能を生体内において協働させることができる。
【0089】
本発明におけるＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質は，血中で極めて安定である。従って，本発明によればヒト成長ホルモンを血中で安定化させて長時間に渡って活性を保持した状態で血中に留まらせることができる。従って，当該融合蛋白質は，医薬として用いた場合，ヒト成長ホルモンと比較して投与頻度又は／及び投与量を減じることが可能となる。例えば，ヒト成長ホルモンは毎日投与が必要であるが，当該融合蛋白質であれば，投与頻度を例えば３～３０日毎とすることも可能となる。また，治療期間中の医薬の総投与量を，例えばモル比で１／３以下（例えば１／３～１／１０）にまで減じることも可能となる。
【0090】
本発明におけるＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質は，成長ホルモン分泌不全性低身長症，ターナー症候群における低身長，慢性腎不全による低身長症，プラダーウィリー症候群における低身長症，軟骨異栄養症における低身長症，ＳＧＡ性低身長症，又はヌーナン症候群における低身長症を対象疾患とする医薬として使用することができる。ｈＧＨ製剤は，これら疾患において骨端線閉鎖を伴わない場合において特に効果を奏する。その他，本発明におけるＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質は，成人成長ホルモン分泌不全症，ＡＩＤＳによる消耗，及び拒食症による消耗を対象疾患とする医薬として使用することができるが，これに限らず，成長ホルモンの有する軟骨形成促進，蛋白質同化促進等の成長促進活性，体組成及び脂質代謝改善作用等の生理活性を，長期に渡って作用させることにより症状が改善され得る疾患の治療剤として使用することができる。
【0091】
２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを治療目的でヒトに投与するときの用法用量に，ｈＧＨの薬効が示される限り特に限定はない。２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの用法用量を以下に例示するが，用法用量はこれらに限定されるものではない。
【0092】
２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを，骨端線閉鎖を伴わない成長ホルモン分泌不全性低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は0.01～0.7 mg/Kg体重である。２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを，骨端線閉鎖を伴わないターナー症候群における低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は0.015～1.4 mg/Kg体重である。２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを，骨端線閉鎖を伴わない慢性腎不全による低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は0.01～1.4 mg/Kg体重である。２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを，骨端線閉鎖を伴わないプラダーウィリー症候群における低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は0.012～0.98 mg/Kg体重である。２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを，骨端線閉鎖を伴わない軟骨異栄養症における低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は0.015～1.4 mg/Kg体重である。２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを，骨端線閉鎖を伴わないＳＧＡ性低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は0.012～1.9 mg/Kg体重である。２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを，成人成長ホルモン分泌不全症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は0.001～0.34 mg/Kg体重である。２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを，骨端線閉鎖を伴わないヌーナン症候群における低身長症の患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は0.013～1.8 mg/Kg体重である。２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを，ＡＩＤＳにより消耗した患者に投与する場合，１回当たりの好ましい投与量は0.005～0.4 mg/Kg体重である。但し，投与量は患者の検査所見等によって，適宜変更されるべきものである。また，これら疾患における，好ましい２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの投与間隔は，7～30日毎に１回であり，患者の検査所見等によって，7～14日毎，10～20日毎，又は14～21日毎に１回と適宜変更されるべきものである。また，投与方法は，好ましくは皮下注射，筋肉内注射又は静脈注射であり，より好ましくは皮下注射又は筋肉内注射である。
【0093】
本発明における水性医薬組成物は，有効成分として血清アルブミンと成長ホルモンとを結合させた蛋白質，防腐剤，主に安定化剤としてスクロースと非イオン性界面活性剤，及びｐＨ調整剤として緩衝剤を含有してなるものである。
【0094】
水性医薬組成物に含まれる血清アルブミンと成長ホルモンとを結合させた蛋白質（特に２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ）の濃度は，好ましくは10～100 mg/mLであり，より好ましくは15～70 mg/mLであり，更に好ましくは30～65 mg/mLであり，更により好ましくは40～60 mg/mLであり，例えば，50 mg/mLである。
【0095】
水性医薬組成物に含有される防腐剤としては，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，フェノールが好ましい。防腐剤としてフェノールが使用される場合，水性医薬組成物に含有されるフェノールの濃度は，好ましくは0.5～12 mg/mLであり，より好ましくは3～9 mg/mLであり，更に好ましくは4～8 mg/mLであり，更により好ましくは5～7 mg/mLであり，例えば，6 mg/mLである。
【0096】
水性医薬組成物に含有されるスクロースの濃度は，好ましくは10～150 mg/mLであり，より好ましくは50～100 mg/mLであり，更に好ましくは60～90 mg/mLであり，更により好ましくは70～80 mg/mLであり，例えば，75 mg/mLである。
【0097】
水性医薬組成物に含有される非イオン性界面活性剤としては，ポリソルベートやポロキサマー等を単独で又はこれらを組合わせて使用することができる。ポリソルベートとしてはポリソルベート２０，ポリソルベート８０が，ポロキサマーとしてはポロキサマー１８８（ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール）が特に好適である。また，水性医薬組成物に含有される非イオン性界面活性剤の濃度は，0.15～10 mg/mLであることが好ましく，1.0～4.5 mg/mLであることがより好ましく，1.5～4.5 mg/mLであることが更に好ましく，2～4 mg/mLであることが更により好ましく，2.5～3.5 mg/mLであることが更により好ましく，例えば，3 mg/mLである。
【0098】
水性医薬組成物に含有される緩衝剤は，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，リン酸緩衝剤が好ましい。緩衝剤としてリン酸緩衝剤が使用される場合，水性医薬組成物に含有されるリン酸緩衝剤の濃度は，好ましくは1～30 mMであり，より好ましくは2～20 mMであり，更に好ましくは5～15 mMであり，例えば，約10 mMである。また，緩衝剤によって調整される水性医薬組成物のpHは，好ましくは5.0～8.0であり，より好ましくは6.0～7.8であり，更に好ましくは6.5～7.6であり，更により好ましくは7.0～7.4であり，例えば7.2である。また，水性医薬組成物の生理食塩水に対する浸透圧比は，例えば1.0～1.3に調整される。
【0099】
本発明の水性医薬組成物の好適な組成として，血清アルブミンと成長ホルモンとを結合させた蛋白質（特に２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ）の濃度が10～100 mg/mLであり，防腐剤の濃度が0.5～12 mg/mLであり，スクロースの濃度が10～150 mg/mLであり，非イオン性界面活性剤の濃度が0.15～10 mg/mLであり，防腐剤の濃度が0.5～12 mg/mLであり，緩衝剤の濃度が1～30 mMであり，pHが5.0～8.0であるもの，が挙げられる。
【0100】
更なる本発明の水性医薬組成物の好適な組成として，血清アルブミンと成長ホルモンとを結合させた蛋白質（特に２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ）の濃度が10～100 mg/mLであり，スクロースの濃度が7 5mg/mLであり，ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が3 mg/mLであり，フェノールの濃度が6 mg/mLであり，リン酸緩衝剤の濃度が10 mMであり， pHが7.0～7.4であるもの，が挙げられる。各成分の濃度は，上記の好ましい濃度の何れかにそれぞれ変更することが可能である。
【0101】
更なる本発明の水性医薬組成物の好適な組成として，血清アルブミンと成長ホルモンとを結合させた蛋白質（特に２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ）の濃度が15～70 mg/mLであり，スクロースの濃度が75 mg/mLであり，ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールの濃度が3 mg/mLであり，フェノールの濃度が6 mg/mLであり，リン酸緩衝剤の濃度が10 mMであり，ｐＨが7.0～7.4であるもの，が挙げられる。各成分の濃度は，上記の好ましい濃度の何れかにそれぞれ変更することが可能である。
【0102】
本発明のＨＳＡ－ｈＧＨ融合蛋白質（特に２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ）を有効成分として含有してなる医薬は，注射剤として静脈内，筋肉内，腹腔内，皮下又は脳室内に投与することができる。それらの注射剤は，凍結乾燥製剤又は水性液剤（水性医薬組成物）として供給することができる。水性液剤とする場合，バイアルに充填した形態としてもよく，注射器に予め充填したものであるプレフィルド型の製剤として供給することもできる。凍結乾燥製剤の場合，使用前に水性媒質に溶解し復元して使用する。
【実施例】
【0103】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【0104】
〔実施例１〕２２ＫｈＧＨ－ＨＳＡ発現用ベクターの構築
２２ＫｈＧＨのＣ末端と野生型ＨＳＡ（配列番号１）のＮ末端とを結合させたものである，配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を，２２ＫｈＧＨ－ＨＳＡとした。配列番号１５で示されるアミノ酸配列中，１～１９１番目のアミノ酸残基が２２ＫｈＧＨのアミノ酸配列に相当し，１９２～７７６番目のアミノ酸残基がＨＳＡのアミノ酸配列に相当する。２２ＫｈＧＨ－ＨＳＡをコードする遺伝子（22KhGH-HSA遺伝子）を含む配列番号１６で示される塩基配列を有するDNAを化学的に合成した。この配列において，塩基１１～８８がｈＧＨのリーダーペプチドを，塩基８９～６６１が成熟型ｈＧＨを，塩基６６２～２４１６が成熟型ＨＳＡを，それぞれコードする。このDNAを制限酵素（MluI及びNotI）で消化し，pE-mIRES-GS-puroのMluI部位とNotI部位の間に組み込むことにより，２２ＫｈＧＨ－ＨＳＡ発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)を構築した。なお，pE-mIRES-GS-puroは，国際特許公報WO2012/063799等に作製方法が記載されており周知のものである。
２２ＫｈＧＨのＣ末端と野生型ＨＳＡ（配列番号１）のＮ末端とを結合させたものである，配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を，２２ＫｈＧＨ－ＨＳＡとした。配列番号１５で示されるアミノ酸配列中，１～１９１番目のアミノ酸残基が２２ＫｈＧＨのアミノ酸配列に相当し，１９２～７７６番目のアミノ酸残基がＨＳＡのアミノ酸配列に相当する。２２ＫｈＧＨ－ＨＳＡをコードする遺伝子（22KhGH-HSA遺伝子）を含む配列番号１６で示される塩基配列を有するDNAを化学的に合成した。この配列において，塩基１１～８８がｈＧＨのリーダーペプチドを，塩基８９～６６１が成熟型ｈＧＨを，塩基６６２～２４１６が成熟型ＨＳＡを，それぞれコードする。このDNAを制限酵素（MluI及びNotI）で消化し，pE-mIRES-GS-puroのMluI部位とNotI部位の間に組み込むことにより，２２ＫｈＧＨ－ＨＳＡ発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)を構築した。なお，pE-mIRES-GS-puroは，国際特許公報WO2012/063799等に作製方法が記載されており周知のものである。
【0105】
〔実施例２〕２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現用ベクターの構築
２２ＫｈＧＨ（配列番号９）のＣ末端とＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）（配列番号３）のＮ末端とを結合させたものである，配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡとした。実施例１で作製したpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)を鋳型として，プライマーYA082（配列番号１３）及びプライマーYA083（配列番号１４）を用いて，ＰＣＲにより２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡをコードする遺伝子を含むDNA断片を増幅した。このDNA断片をセルフアニールさせて，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)を構築した。
２２ＫｈＧＨ（配列番号９）のＣ末端とＨＳＡ（Ａ３２０Ｔ）（配列番号３）のＮ末端とを結合させたものである，配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡとした。実施例１で作製したpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-HSA)を鋳型として，プライマーYA082（配列番号１３）及びプライマーYA083（配列番号１４）を用いて，ＰＣＲにより２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡをコードする遺伝子を含むDNA断片を増幅した。このDNA断片をセルフアニールさせて，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)を構築した。
【0106】
〔実施例３〕２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現細胞株の作製
２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを発現させるための細胞を次のようにして作製した。チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるCHO-K1細胞に，Gene Pulser Xcell エレクトロポレーションシステム（Bio Rad社）を用いて，実施例２で作製した，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)を導入した。発現ベクターを導入した細胞を，16 μM チミジン，100 μM ヒポキサンチン，10 mg/L インスリン，L-メチオニンスルホキシミン（SIGMA社）及びピューロマイシン（SIGMA社）を含むCD OptiCHOＴＭ培地（Thermo Fisher Scientific社）を用いて選択培養した。選択培養の際には，L-メチオニンスルホキシミン及びピューロマイシンの濃度を段階的に上昇させて，最終的にL-メチオニンスルホキシミンの濃度を300 μM，ピューロマイシンの濃度を10 μg/mLとして，より高い薬剤耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。次いで，限界希釈法により，１ウェルあたり１個以下の細胞が播種されるように，96ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し，単一細胞由来のコロニーが形成されるまで約10日間培養して，細胞をクローン化した。クローン化した細胞を更に培養して増殖させた後，16 μM チミジン，100 μM ヒポキサンチン，300 μM L-メチオニンスルホキシミン，及び10% (v/v) DMSOを含有するCD OptiCHOTM培地に懸濁させてからクライオチューブに分注し，液体窒素中で保存した。この細胞を２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現細胞株とした。
２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを発現させるための細胞を次のようにして作製した。チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるCHO-K1細胞に，Gene Pulser Xcell エレクトロポレーションシステム（Bio Rad社）を用いて，実施例２で作製した，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(22KhGH-mHSA)を導入した。発現ベクターを導入した細胞を，16 μM チミジン，100 μM ヒポキサンチン，10 mg/L インスリン，L-メチオニンスルホキシミン（SIGMA社）及びピューロマイシン（SIGMA社）を含むCD OptiCHOＴＭ培地（Thermo Fisher Scientific社）を用いて選択培養した。選択培養の際には，L-メチオニンスルホキシミン及びピューロマイシンの濃度を段階的に上昇させて，最終的にL-メチオニンスルホキシミンの濃度を300 μM，ピューロマイシンの濃度を10 μg/mLとして，より高い薬剤耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。次いで，限界希釈法により，１ウェルあたり１個以下の細胞が播種されるように，96ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し，単一細胞由来のコロニーが形成されるまで約10日間培養して，細胞をクローン化した。クローン化した細胞を更に培養して増殖させた後，16 μM チミジン，100 μM ヒポキサンチン，300 μM L-メチオニンスルホキシミン，及び10% (v/v) DMSOを含有するCD OptiCHOTM培地に懸濁させてからクライオチューブに分注し，液体窒素中で保存した。この細胞を２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現細胞株とした。
【0107】
〔実施例４〕２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現細胞の前培養
実施例３で作製した２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現細胞株を，３７℃水浴中で融解し，16 μM チミジン，100 μM ヒポキサンチン及び300 μM L-メチオニンスルホキシミンを含む無血清培地のEX-CELL Advanced培地（前培養用培地，SIGMA社）に懸濁させて遠心して細胞を沈殿させ，上清を除去した。沈殿させた細胞を，2×105 個/mL以上の密度で前培養用培地に懸濁し，37℃，5% CO2存在下で2～4日間培養した。細胞数が少なくとも1.0×1011 個に増殖するまで培養規模を拡大させながら，この培養を繰り返した。
実施例３で作製した２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現細胞株を，３７℃水浴中で融解し，16 μM チミジン，100 μM ヒポキサンチン及び300 μM L-メチオニンスルホキシミンを含む無血清培地のEX-CELL Advanced培地（前培養用培地，SIGMA社）に懸濁させて遠心して細胞を沈殿させ，上清を除去した。沈殿させた細胞を，2×105 個/mL以上の密度で前培養用培地に懸濁し，37℃，5% CO2存在下で2～4日間培養した。細胞数が少なくとも1.0×1011 個に増殖するまで培養規模を拡大させながら，この培養を繰り返した。
【0108】
〔実施例５〕２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ発現細胞の生産培養
前培養で増殖させた細胞を，細胞濃度が4×105 個/mLの密度で，200 Lの容量の16 μMのチミジン及び100 μMのヒポキサンチンを含む無血清培地であるEX-CELL Advanced培地（生産培養用培地，SIGMA社）に懸濁させた。この懸濁液を，Xcellerex200L培養システム（XDR200）のシングルユース培養槽内で，インペラで100 rpmの速度で撹拌しながら，37℃，溶存酸素量40%，pHを6.9に維持して10日間培養した。
前培養で増殖させた細胞を，細胞濃度が4×105 個/mLの密度で，200 Lの容量の16 μMのチミジン及び100 μMのヒポキサンチンを含む無血清培地であるEX-CELL Advanced培地（生産培養用培地，SIGMA社）に懸濁させた。この懸濁液を，Xcellerex200L培養システム（XDR200）のシングルユース培養槽内で，インペラで100 rpmの速度で撹拌しながら，37℃，溶存酸素量40%，pHを6.9に維持して10日間培養した。
【0109】
〔実施例６〕２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの精製
（精製工程１：ハーベスト工程／濃縮１工程）
生産培養終了後，培養液を，Millistak+（登録商標）HCポッドフィルターグレードD0HC（1.1 m2×2，Merck社）を用いてろ過し，次いでMillistak+HCポッドフィルターグレードX0HC（1.1 m2×1，Merck社）を用いてろ過して細胞を除去し，更に，Opticap SHC XL3（孔径：0.5/0.2 μm，Merck社）でろ過して培養上清を得た。得られた培養上清を，予め純水で洗浄した後，PBSで平衡化した分画分子量30 kDaの限外ろ過膜装置（Pellicon3 カセット ウルトラセルPLCTK メンブレン装着 1.14 m2，Merck社）を用いて濃縮した。限外ろ過膜装置から濃縮後の溶液を回収した。更に装置内を，PBSを通して洗浄し，この洗浄液を先に回収した濃縮後の溶液に合わせて重量を約15 kgに調整したものを濃縮培養液とした。次いで，濃縮培養液を，孔径の最大部が0.5 μmであり最小部が0.2 μmである親水性フィルター（Opticap SHC XL600，Merck社）を用いてろ過した。ろ過後，濃縮培養液のpH及び導電率がそれぞれ7.0±0.3，1.2±0.4 S/mであることを確認した。
（精製工程１：ハーベスト工程／濃縮１工程）
生産培養終了後，培養液を，Millistak+（登録商標）HCポッドフィルターグレードD0HC（1.1 m2×2，Merck社）を用いてろ過し，次いでMillistak+HCポッドフィルターグレードX0HC（1.1 m2×1，Merck社）を用いてろ過して細胞を除去し，更に，Opticap SHC XL3（孔径：0.5/0.2 μm，Merck社）でろ過して培養上清を得た。得られた培養上清を，予め純水で洗浄した後，PBSで平衡化した分画分子量30 kDaの限外ろ過膜装置（Pellicon3 カセット ウルトラセルPLCTK メンブレン装着 1.14 m2，Merck社）を用いて濃縮した。限外ろ過膜装置から濃縮後の溶液を回収した。更に装置内を，PBSを通して洗浄し，この洗浄液を先に回収した濃縮後の溶液に合わせて重量を約15 kgに調整したものを濃縮培養液とした。次いで，濃縮培養液を，孔径の最大部が0.5 μmであり最小部が0.2 μmである親水性フィルター（Opticap SHC XL600，Merck社）を用いてろ過した。ろ過後，濃縮培養液のpH及び導電率がそれぞれ7.0±0.3，1.2±0.4 S/mであることを確認した。
【0110】
（精製工程２：第一のクロマトグラフィー工程（アフィニティーカラムクロマトグラフィー工程））
Capture select Human Growth Hormone Affinity Matrix（Thermo Fisher Scientific社）を充填したQSカラム（カラム体積：4.2～5.2 L，ベッド高：15.0±1.5 cm，Merck社）を，カラム体積の1倍容の50 mMグリシン塩酸緩衝液（pH 3.0），更にカラム体積の1倍容の0.01 M 水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した後，カラム体積の4倍容の20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.0）で平衡化した。次いで，精製工程１で得られた濃縮培養液の1/4量をカラムに負荷して，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡをカラムに吸着させた。次いで，カラム体積の5倍容の200 mM アルギニン及び0.05%（w/v） ポリソルベート８０を含有する20 mM Tris-HCl緩衝液（pH7.0），更にカラム体積の5倍容の20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.0）でカラムを洗浄した。次いで，カラム体積の5倍容の50 mMグリシン塩酸緩衝液（pH 3.0）をカラムに供給して，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを溶出させた。溶出液は，溶出液量の1/5容量の250 mM MES緩衝液（pH7.0）を予め入れた容器に回収してpHが6.7±0.3となるよう直ちに中和した。精製工程２は4～8℃の冷温下で実施し，また，精製工程２の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は200 cm/時とした。また1 Lのアフィニティーカラム担体あたりに負荷される２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの上限は7 gとした。
Capture select Human Growth Hormone Affinity Matrix（Thermo Fisher Scientific社）を充填したQSカラム（カラム体積：4.2～5.2 L，ベッド高：15.0±1.5 cm，Merck社）を，カラム体積の1倍容の50 mMグリシン塩酸緩衝液（pH 3.0），更にカラム体積の1倍容の0.01 M 水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した後，カラム体積の4倍容の20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.0）で平衡化した。次いで，精製工程１で得られた濃縮培養液の1/4量をカラムに負荷して，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡをカラムに吸着させた。次いで，カラム体積の5倍容の200 mM アルギニン及び0.05%（w/v） ポリソルベート８０を含有する20 mM Tris-HCl緩衝液（pH7.0），更にカラム体積の5倍容の20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.0）でカラムを洗浄した。次いで，カラム体積の5倍容の50 mMグリシン塩酸緩衝液（pH 3.0）をカラムに供給して，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを溶出させた。溶出液は，溶出液量の1/5容量の250 mM MES緩衝液（pH7.0）を予め入れた容器に回収してpHが6.7±0.3となるよう直ちに中和した。精製工程２は4～8℃の冷温下で実施し，また，精製工程２の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は200 cm/時とした。また1 Lのアフィニティーカラム担体あたりに負荷される２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの上限は7 gとした。
【0111】
（精製工程３：ウイルス不活化工程）
精製工程２で得られた溶出液を25℃に加温し，この溶出液に，その液量の1/19容量の20.0%(w/v) ポリソルベート８０を含有する6.0%(v/v) トリ（ｎーブチル）ホスフェート水溶液を加え，25℃で3時間撹拌した。
精製工程２で得られた溶出液を25℃に加温し，この溶出液に，その液量の1/19容量の20.0%(w/v) ポリソルベート８０を含有する6.0%(v/v) トリ（ｎーブチル）ホスフェート水溶液を加え，25℃で3時間撹拌した。
【0112】
（精製工程４：第二のクロマトグラフィー工程（ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー工程））
精製工程３でウイルス不活化処理を行った画分を8℃に冷却し，1 M Tris-HCl緩衝液（pH8.8）と，4 M NaClを含有する20 mM MES緩衝液（pH7.0）とを適量加えてpH及び導電率をそれぞれ7.0±0.1及び0.6±0.1 S/mに調整し，孔径0.2 μmの親水性フィルター（Merck社）を用いてろ過した。次いで，以下のクロマトグラフィーを冷蔵（線流速：200 cm/時）で実施した。
精製工程３でウイルス不活化処理を行った画分を8℃に冷却し，1 M Tris-HCl緩衝液（pH8.8）と，4 M NaClを含有する20 mM MES緩衝液（pH7.0）とを適量加えてpH及び導電率をそれぞれ7.0±0.1及び0.6±0.1 S/mに調整し，孔径0.2 μmの親水性フィルター（Merck社）を用いてろ過した。次いで，以下のクロマトグラフィーを冷蔵（線流速：200 cm/時）で実施した。
【0113】
ハイドロキシアパタイト担体であるCHT Type II, 40 μm（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社）を充填したQSカラム（カラム体積：8.8～10.8 L，ベッド高：20.0±2.0 cm，Merck社）を，200 mM リン酸緩衝液（pH7.0），次いで，1 M NaOH水溶液，更に200 mM リン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄した後，4倍容の50 mM NaCl及び1 mM リン酸二水素ナトリウムを含有する20 mM MES緩衝液（pH7.0）で平衡化した。次いで，上記のろ液をカラムに負荷し２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡをカラムに吸着させた。次いで，3倍容の50 mM NaCl及び1 mM リン酸二水素ナトリウムを含有する20 mM MES緩衝液（pH7.0）でカラムを洗浄した。次いで，50 mM NaCl及び30 mM リン酸二水素ナトリウムを含有する20 mM MES緩衝液（pH7.0）をカラムに供給して２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを溶出させた。精製工程４は4～8℃の冷温下で実施し，また，精製工程４の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は200 cm/時とした。また1 Lのハイドロキシアパタイト担体あたりに負荷される２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの上限は13 gとした。
【0114】
（精製工程５：第三のクロマトグラフィー工程（マルチモーダル弱陽イオン交換カラムクロマトグラフィー工程））
精製工程４で得られた溶出液に，これと同体積の50 mM NaClを含有する20mM MES緩衝液（pH5.7）を添加した後，希塩酸を添加して，pH及び導電率をそれぞれ5.7±0.1，0.7±0.1 S/mに調整した。その後，孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター（Merck社）を用いてろ過した。
精製工程４で得られた溶出液に，これと同体積の50 mM NaClを含有する20mM MES緩衝液（pH5.7）を添加した後，希塩酸を添加して，pH及び導電率をそれぞれ5.7±0.1，0.7±0.1 S/mに調整した。その後，孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター（Merck社）を用いてろ過した。
【0115】
プレパックカラムRTP Capto MMC 10 L（カラム体積：8.8～10.8 L，ベッド高：20.0±2.0 cm，Merck社）を，1 M NaOH水溶液，次いで1M NaClを含有する50 mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて洗浄した後，4倍容の100 mM NaClを含有する50 mM MES緩衝液（pH5.7）で平衡化した。次いで上記のろ液をカラムに負荷し２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡをカラムに吸着させた。次いで，5倍容の100 mM NaClを含有する50 mM MES緩衝液（pH5.7）でカラムを洗浄した。次いで，550 mM NaClを含有する50 mM MES緩衝液（pH5.7）をカラムに供給して２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを溶出させた。精製工程５は4～8℃の冷温下で実施し，また，精製工程５の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は200 cm/時とした。また1 Lのマルチモーダル弱陽イオン交換担体あたりに負荷される２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの上限は11.5 gとした。
【0116】
（精製工程６：濃縮２工程）
分画分子量30 kDaの限外ろ過膜（Pellicon3 カセット ウルトラセルPLCTK メンブレン1.14 m2，Merck社）に純水を通液して十分に洗浄した後，75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH 7.2）で平衡化した。精製工程５で得られた溶出液を，この限外ろ過膜を用いて濃縮した。濃縮後の溶液に75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH 7.2）を添加して，吸光度（280 nm）を23±3に調整した。この濃縮工程は室温で実施した。
分画分子量30 kDaの限外ろ過膜（Pellicon3 カセット ウルトラセルPLCTK メンブレン1.14 m2，Merck社）に純水を通液して十分に洗浄した後，75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH 7.2）で平衡化した。精製工程５で得られた溶出液を，この限外ろ過膜を用いて濃縮した。濃縮後の溶液に75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH 7.2）を添加して，吸光度（280 nm）を23±3に調整した。この濃縮工程は室温で実施した。
【0117】
（精製工程７：第四のクロマトグラフィー工程（サイズ排除カラムクロマトグラフィー工程））
精製工程６で得られた濃縮液を孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター（Merck社）を用いてろ過した。サイズ排除クロマトグラフィー用の樹脂であるFractogelTM BioSEC樹脂（Merck社）を充填したQSカラム（カラム体積：25.4～31.1 L，ベッド高：40.0±4.0 cm， Merck社）を0.5M NaOH水溶液で洗浄した後，75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH 7.2）で平衡化した。次いで，上記のろ液をカラムに負荷し，引き続き，75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH 7.2）を供給した。このとき，サイズ排除カラムからの溶出液の流路に，溶出液の吸光度を連続的に測定するための吸光光度計を配置して，280 nmの吸光度をモニターし，280 nmで吸収ピークを示した画分を，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含む画分として回収し，これを２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ精製品とした。精製工程７は室温下で実施し，また，精製工程７の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は30 cm/時以下とした。またマルチモーダル弱陽イオン交換担体に負荷される２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含有するろ液の液量は，担体の体積の8%以下とした。
精製工程６で得られた濃縮液を孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター（Merck社）を用いてろ過した。サイズ排除クロマトグラフィー用の樹脂であるFractogelTM BioSEC樹脂（Merck社）を充填したQSカラム（カラム体積：25.4～31.1 L，ベッド高：40.0±4.0 cm， Merck社）を0.5M NaOH水溶液で洗浄した後，75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH 7.2）で平衡化した。次いで，上記のろ液をカラムに負荷し，引き続き，75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH 7.2）を供給した。このとき，サイズ排除カラムからの溶出液の流路に，溶出液の吸光度を連続的に測定するための吸光光度計を配置して，280 nmの吸光度をモニターし，280 nmで吸収ピークを示した画分を，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含む画分として回収し，これを２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ精製品とした。精製工程７は室温下で実施し，また，精製工程７の全体を通じてカラムに供給される溶液の線流速は30 cm/時以下とした。またマルチモーダル弱陽イオン交換担体に負荷される２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含有するろ液の液量は，担体の体積の8%以下とした。
【0118】
（精製工程８：濃縮３工程）
中空糸膜（ReadyToProcess Hollow Fiber Cartridge，分画分子量 30 kDa，ＧＥヘルスケア社）を，75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化した。この中空糸膜を用いて，精製工程７で得られた２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ精製品を濃縮し，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの濃度を85 mg/mLに調整した。得られた濃縮液に，その液量の1/29の容量の90 mg/mL ポロキサマー188と75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH7.2）を添加して混合し，孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター（Merck社）を用いてろ過した。この濃縮工程は室温で実施した。
中空糸膜（ReadyToProcess Hollow Fiber Cartridge，分画分子量 30 kDa，ＧＥヘルスケア社）を，75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化した。この中空糸膜を用いて，精製工程７で得られた２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ精製品を濃縮し，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの濃度を85 mg/mLに調整した。得られた濃縮液に，その液量の1/29の容量の90 mg/mL ポロキサマー188と75 mg/mL スクロースを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH7.2）を添加して混合し，孔径0.5/0.2 μmの親水性フィルター（Merck社）を用いてろ過した。この濃縮工程は室温で実施した。
【0119】
（精製工程９：ウイルス除去工程）
3 mg/mL ポロキサマー188と75 mg/mL スクロースとを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH7.2）を作製した。この緩衝液を用いて，ウイルス除去膜（プラノバ20N，膜面積：0.12 m2，材質：再生セルロース，旭化成メディカル社）を平衡化させた。このウイルス除去膜に，圧力98 kPa以下で，精製工程８で得られたろ液を通じてろ過した。このウイルス除去工程は室温で実施した。
3 mg/mL ポロキサマー188と75 mg/mL スクロースとを含有する10 mM リン酸緩衝液（pH7.2）を作製した。この緩衝液を用いて，ウイルス除去膜（プラノバ20N，膜面積：0.12 m2，材質：再生セルロース，旭化成メディカル社）を平衡化させた。このウイルス除去膜に，圧力98 kPa以下で，精製工程８で得られたろ液を通じてろ過した。このウイルス除去工程は室温で実施した。
【0120】
（精製工程１０：原薬化工程）
室温で，精製工程９で得られたろ液を孔径0.2 μmの親水性フィルター（Merck社）でろ過し，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ原薬とした。
室温で，精製工程９で得られたろ液を孔径0.2 μmの親水性フィルター（Merck社）でろ過し，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ原薬とした。
【0121】
〔実施例７〕２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含有する水性医薬組成物の安定性の検討１
実施例６で得た２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ原薬を用いて，15 mg/mL ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ及び20 mM リン酸緩衝剤を含有し，pHが異なる，表１に示される組成を有する６種類の水性医薬組成物（処方１－１～１－６）を調製した。
実施例６で得た２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ原薬を用いて，15 mg/mL ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ及び20 mM リン酸緩衝剤を含有し，pHが異なる，表１に示される組成を有する６種類の水性医薬組成物（処方１－１～１－６）を調製した。
【0122】
【表1】
【0123】
上記６種類の水性医薬組成物をそれぞれ1.5 mLずつガラス製バイアルに充填し，暗所で，5℃で1週間，又は40℃で1週間静置保存した。静置後，各溶液中に含まれる２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの単量体，その重合体，及びその分解物である低分子体の比率を，実施例１３に示すSE-HPLC分析により測定した。その結果を表２に示す。ここで，暗所で5℃で1週間，及び40℃で1週間静置後の溶液に含まれる重合体及び低分子体の比率が，何れも概ね2％以下であることを，安定な水性医薬組成物の条件と予め定めた。表２の結果は，この測定条件の下では，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの安定な水性医薬組成物を得るためには，pHを6.0以上とすることが好ましく，特にpHを6.5～7.5とすることが好ましいことを示す。
【0124】
【表2】
【0125】
〔実施例８〕２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含有する水性医薬組成物の安定性の検討２
実施例６で得た２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ原薬を用いて，15 mg/mL ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ及び20 mM リン酸緩衝剤を含有し，ショ糖及び塩化ナトリウムの濃度の異なる，表３に示される組成を有する３種類の水性医薬組成物（処方２－１～２－３）を調製した。何れの溶液もpHは7.0に，浸透圧比は約1.0に調整した。蛋白質物性解析装置（Optim1000，AVACTA社）を用い，キュベット（UNi，UNCHAINED LABS社）に測定試料を9 μL入れ，20.0℃から96.0℃まで1℃ずつキュベットを加温して，各温度に対し波長473 nmにおける静的光散乱強度を測定した。
実施例６で得た２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ原薬を用いて，15 mg/mL ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ及び20 mM リン酸緩衝剤を含有し，ショ糖及び塩化ナトリウムの濃度の異なる，表３に示される組成を有する３種類の水性医薬組成物（処方２－１～２－３）を調製した。何れの溶液もpHは7.0に，浸透圧比は約1.0に調整した。蛋白質物性解析装置（Optim1000，AVACTA社）を用い，キュベット（UNi，UNCHAINED LABS社）に測定試料を9 μL入れ，20.0℃から96.0℃まで1℃ずつキュベットを加温して，各温度に対し波長473 nmにおける静的光散乱強度を測定した。
【0126】
【表3】
【0127】
静的光散乱強度の測定結果のグラフを図１に示す。図１において縦軸が静的光散乱強度を示し，この静的光散乱強度と溶液中に含まれる蛋白質が凝集することにより生じる微粒子の濃度との間には正の相関関係にある。凝集が生じ始める温度は処方２－１～２－３でほぼ同じであるが，温度を上昇させることにより生じる微粒子の量は，塩化ナトリウムの濃度が高いほど多い傾向にある。従って，溶液中に含まれる２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの凝集を抑制するためには，水性医薬組成物に添加する賦形剤として塩化ナトリウムよりもショ糖が好ましいといえる。
【0128】
〔実施例９〕２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含有する水性医薬組成物の安定性の検討３
実施例６で得た２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ原薬を用いて，35 mg/mL ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ，20 mM リン酸緩衝剤，及び70 mg/mL ショ糖を含有し，非イオン性界面活性剤（ポロキサマー１８８）の濃度の異なる，表４に示される組成を有する６種類の水性医薬組成物（処方３－１～３－６）を調製した。何れの溶液もpHは7.2に，浸透圧比は約1.0に調整した。
実施例６で得た２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ原薬を用いて，35 mg/mL ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ，20 mM リン酸緩衝剤，及び70 mg/mL ショ糖を含有し，非イオン性界面活性剤（ポロキサマー１８８）の濃度の異なる，表４に示される組成を有する６種類の水性医薬組成物（処方３－１～３－６）を調製した。何れの溶液もpHは7.2に，浸透圧比は約1.0に調整した。
【0129】
【表4】
【0130】
上記６種類の水性医薬組成物をそれぞれ1 mLずつガラス製バイアルに充填し，室温環境下で240 往復/分で24時間振とうした。振とう前及び振とう後における各溶液中に含まれる２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ全体に占める重合体の比率を，実施例１３に示すSE-HPLC分析により測定し，振とう後の重合体含量（％）から振とう前の重合体含量（％）を引いた値を重合体増加量（％）として求めた。その結果を表５に示す。この条件下では，ポロキサマー１８８の濃度を1.0 mg/mL以上にすることにより重合体の生成を抑制することができ，その濃度を1.5 mg/mL以上にすることにより重合体の生成をほとんど抑制することができる。なお，ポロキサマー１８８を含まない処方３－１では，重合体が多量に生成したため測定値が得られなかった。
【0131】
【表5】
【0132】
次いで，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの濃度を130 mg/mLとして，20 mM リン酸緩衝剤及び70 mg/mL ショ糖を含有し，非イオン性界面活性剤（ポロキサマー１８８）の濃度の異なる，表６に示される組成を有する５種類の水性医薬組成物（処方４－１～４－５）を調製した。何れの溶液もpHは7.2に，浸透圧比は約1.0に調整した。
【0133】
【表6】
【0134】
上記５種類の水性医薬組成物をそれぞれ0.8 mLずつガラス製バイアルに充填し，室温環境下で240 往復/分で24時間振とうした。振とう後，各溶液中に含まれる２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ全体に占める重合体及び低分子体の比率を，実施例１３に示すSE-HPLC分析により測定した。その結果を表７に示す。処方４－１～４－５の何れにおいても，重合体含量(%)及び低分子体含量(%)の値は，振とう前の値とほとんど変化はなく（振とう前のデータは示さない），重合体含量(%)及び低分子体含量(%)の値は，全ての処方で同等である。
【0135】
【表7】
【0136】
〔実施例１０〕２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含有する水性医薬組成物の安定性の検討４
実施例６で得た２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ原薬を用いて，35 mg/mL ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ，20 mM リン酸緩衝剤， 70 mg/mL ショ糖，1.0 mg/mL 非イオン性界面活性剤（ポロキサマー１８８）及び防腐剤として3.3 mg/mL フェノールを含有する，表８に示される組成を有する，pHが異なる３種類の水性医薬組成物（処方５－１～５－３）を調製した。
実施例６で得た２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ原薬を用いて，35 mg/mL ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ，20 mM リン酸緩衝剤， 70 mg/mL ショ糖，1.0 mg/mL 非イオン性界面活性剤（ポロキサマー１８８）及び防腐剤として3.3 mg/mL フェノールを含有する，表８に示される組成を有する，pHが異なる３種類の水性医薬組成物（処方５－１～５－３）を調製した。
【0137】
【表8】
【0138】
上記３種類の水性医薬組成物をそれぞれ1 mLずつガラス製バイアルに充填し，暗所で5℃又は25℃で2ヶ月静置保存した。5℃で静置したものについては，2週間後，1ヶ月後及び2ヶ月後に，25℃で静置したものについては1ヶ月後及び2ヶ月後に，実施例１３に記載のSE-HPLC分析，及び実施例１５に記載の微粒子数分析を行った。その結果を表９に示す。
【0139】
SE-HPLC測定による重合体含量についてみると，pH 7.2に調整した処方５－３では5℃で1ヶ月間静置した場合，25℃で2ヶ月間静止した場合の何れにおいてもほとんど変化はない。一方，pH 6.2に調整した処方５－１では，5℃で1ヶ月間静置した場合，25℃で2ヶ月間静置した場合の何れにおいても重合体の含量の継時的な増加が観察される。また，pH 6.7に調整した処方５－２では，5℃で1ヶ月間静置した場合には重合体の含量に変化はないが，25℃で2ヶ月間静止した場合には重合体の継時的な増加が観察される。SE-HPLC測定による低分子体含量についてみると，5℃で1ヶ月間静置した場合には，処方５－１～５－３の何れにおいてもほとんど変化はない。一方，25℃で2ヶ月間静置した場合には，何れの処方においても低分子体含量の増加が観察されるが，その程度は軽微である。微粒子数分析についてみると，pH 7.2に調整した処方５－３では，10 μm以上及び25 μm以上の微粒子数が，処方５－１及び５－２と比較して大幅に減少している。
【0140】
【表9】
【0141】
〔実施例１１〕水性医薬組成物の製剤設計
上記実施例７～１０で示した結果より，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含有する水性医薬組成物の製剤処方の好適なものの一例として，50 mg/mL ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ，10 mM リン酸緩衝剤，75 mg/mL ショ糖，3 mg/mLポロキサマー１８８及び6 mg/mL フェノールを含有し，pHを7.2，浸透圧比を約1.0に調整した，表１０に示される組成を有するもの（処方６）が設計し得る。この水性医薬組成物は，0.5～10 mLの液量で，ガラス製又はプラスチック製のバイアル，アンプル，又は注射器に充填・封入することができる。注射器に予め充填したものはプレフィルド型の製剤として供給することもできる。保存温度は2～10℃，例えば4℃が好ましく，温度記録の可能な冷蔵庫中での保存が想定される。
上記実施例７～１０で示した結果より，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含有する水性医薬組成物の製剤処方の好適なものの一例として，50 mg/mL ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ，10 mM リン酸緩衝剤，75 mg/mL ショ糖，3 mg/mLポロキサマー１８８及び6 mg/mL フェノールを含有し，pHを7.2，浸透圧比を約1.0に調整した，表１０に示される組成を有するもの（処方６）が設計し得る。この水性医薬組成物は，0.5～10 mLの液量で，ガラス製又はプラスチック製のバイアル，アンプル，又は注射器に充填・封入することができる。注射器に予め充填したものはプレフィルド型の製剤として供給することもできる。保存温度は2～10℃，例えば4℃が好ましく，温度記録の可能な冷蔵庫中での保存が想定される。
【0142】
【表10】
【0143】
〔実施例１２〕２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含有する水性医薬組成物の安定性の検討５
表１０に示される組成を有する，処方６の水性医薬組成物を調製し，ほう珪酸ガラス製カートリッジに1.7 mLを充填し，暗所，5℃で12ヶ月静置保存した。3ヶ月後，6ヶ月後，及び12ヶ月後に，実施例１４に記載の性状試験，実施例１６に記載の不溶性異物検査及びpH測定，実施例１３に記載のSE-HPLC分析，実施例１５に記載の微粒子数分析，及び実施例１７に記載の２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ定量を行った。その結果を表１１に示す。何れの検査値にも大きな変化はなく，処方６は２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含有する水性医薬組成物として少なくとも12ヶ月間は安定であることがわかる。なお，表１１中，定量法（対理論値(%)）は，処方６を調製時の２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの量を100%としたときの，実際の定量値(%)を示す。
表１０に示される組成を有する，処方６の水性医薬組成物を調製し，ほう珪酸ガラス製カートリッジに1.7 mLを充填し，暗所，5℃で12ヶ月静置保存した。3ヶ月後，6ヶ月後，及び12ヶ月後に，実施例１４に記載の性状試験，実施例１６に記載の不溶性異物検査及びpH測定，実施例１３に記載のSE-HPLC分析，実施例１５に記載の微粒子数分析，及び実施例１７に記載の２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ定量を行った。その結果を表１１に示す。何れの検査値にも大きな変化はなく，処方６は２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡを含有する水性医薬組成物として少なくとも12ヶ月間は安定であることがわかる。なお，表１１中，定量法（対理論値(%)）は，処方６を調製時の２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの量を100%としたときの，実際の定量値(%)を示す。
【0144】
【表11】
【0145】
〔実施例１３〕SE-HPLC分析（SE-HPLCを用いた２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの重合体，単量体及び低分子体含量の測定）
リン酸二水素ナトリウム二水和物及び塩化ナトリウムを水に溶解し，リン酸を0.1 M，塩化ナトリウムを0.2 M含有するリン酸塩緩衝液を調製した。また，試験対象であるそれぞれの水性医薬組成物と同組成であり，かつ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ及びフェノールを含まない溶液を調製し，これを試料希釈液とした。
リン酸二水素ナトリウム二水和物及び塩化ナトリウムを水に溶解し，リン酸を0.1 M，塩化ナトリウムを0.2 M含有するリン酸塩緩衝液を調製した。また，試験対象であるそれぞれの水性医薬組成物と同組成であり，かつ２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ及びフェノールを含まない溶液を調製し，これを試料希釈液とした。
【0146】
試験の対象である水性医薬組成物を，試料希釈液を用いて蛋白質濃度が2.0 mg/mLになるよう調整し，試料溶液とした。
【0147】
HPLC装置（LC-20A，島津製作所社）及びカラム（TSKgel G3000SWXL，東ソー社）を用い，下記の表１２に示す条件で測定を行った。但し，流量については必ずしも表１２に示した条件に限らず，主ピークの保持時間が12分付近となるよう適宜調整した。代表的なクロマトグラムを図２に示す。試料溶液の測定により得られたクロマトグラム上，保持時間12分付近に検出される主ピークを単量体，主ピークより前に検出されるピークを重合体，主ピークより後に検出されるピークを低分子体とし，各ピークの面積から主ピーク含量(％)，重合体含量(％)，低分子体含量(％)を算出した。なお，23.5分付近に検出されるピークはフェノール由来であるため，解析から除外した。また，試料希釈液の測定により得られたクロマトグラム上に検出されたピークと同じピークについても，試料溶液の解析から除外した。
【0148】
【表12】
【0149】
〔実施例１４〕性状試験
色の比較液として，下記を用いた。
（１）Color Reference Solutions Bセット（褐色，シグマアルドリッチ社）
（２）Color Reference Solutions BYセット（帯褐黄色，シグマアルドリッチ社）
（３）Color Reference Solutions Yセット（黄色，シグマアルドリッチ社）
色の比較液として，下記を用いた。
（１）Color Reference Solutions Bセット（褐色，シグマアルドリッチ社）
（２）Color Reference Solutions BYセット（帯褐黄色，シグマアルドリッチ社）
（３）Color Reference Solutions Yセット（黄色，シグマアルドリッチ社）
【0150】
試験の対象である水性医薬組成物の入った容器（バイアル等）を，黒色及び白色の背景を用いて容器側面から観察し，色調及び澄明性を確認した。色調の判断にあたっては，色の比較液を使用しても良いこととした。
【0151】
〔実施例１５〕微粒子数の測定
測定条件：フローサイト粒子画像解析装置（FlowCam VS-1，FLUID IMAGING TECHNOLOGIES社）を用い，下記の表１３に示す条件で測定を行った。フローセル（FC80FV-5，FLUID IMAGING TECHNOLOGIES社）を使用し，試験の対象である水性医薬組成物に含まれる微粒子数（個/mL）を実施した。微粒子数は，10 μm以上及び25 μm以上の直径を有するものの個数をそれぞれ測定した。
測定条件：フローサイト粒子画像解析装置（FlowCam VS-1，FLUID IMAGING TECHNOLOGIES社）を用い，下記の表１３に示す条件で測定を行った。フローセル（FC80FV-5，FLUID IMAGING TECHNOLOGIES社）を使用し，試験の対象である水性医薬組成物に含まれる微粒子数（個/mL）を実施した。微粒子数は，10 μm以上及び25 μm以上の直径を有するものの個数をそれぞれ測定した。
【0152】
【表13】
【0153】
〔実施例１６〕不溶性異物検査，pHの測定，及び浸透圧比測定の方法
不溶性異物検査，pHの測定，及び浸透圧比測定については，日本薬局方に定める一般的手法により実施した。なお，不溶性異物検査は，容易く検出される不溶性異物の有無を目視により確認する検査法である。
不溶性異物検査，pHの測定，及び浸透圧比測定については，日本薬局方に定める一般的手法により実施した。なお，不溶性異物検査は，容易く検出される不溶性異物の有無を目視により確認する検査法である。
【0154】
〔実施例１７〕２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡの定量（Bradford法）
濃度既知の２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ溶液を水で希釈し，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡをそれぞれ1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 mg/mL含有する溶液を調製し，それぞれ標準溶液１～５とした。試験の対象である水性医薬組成物を，蛋白質濃度が0.4～0.8 mg/mLの範囲に入るように水で希釈し，試料溶液とした。
濃度既知の２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡ溶液を水で希釈し，２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡをそれぞれ1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 mg/mL含有する溶液を調製し，それぞれ標準溶液１～５とした。試験の対象である水性医薬組成物を，蛋白質濃度が0.4～0.8 mg/mLの範囲に入るように水で希釈し，試料溶液とした。
【0155】
クーマシー試液による反応：PierceTM Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit（ThermoFisher SCIENTIFIC社）に含まれるPierce Coomasie Assay Reagentを，15 mL遠心管に5 mLずつ，測定に必要な本数分採取した。次いで，Pierce Coomasie Assay Reagentを採取した15 mL遠心管にそれぞれ水（ブランク用），標準溶液１～５，及び試料溶液を100 μLずつ添加し，転倒混和した後10分間，室温で静置し反応させた。反応後速やかに，分光光度計（UV-2600，島津製作所社）を用い，測定用セル（キュベット，光路長10 mm，光路幅10 mm，ザルスタット社）に測定試料を2 mL以上入れて波長595 nmで吸光度測定を行った。標準溶液１～５の吸光度をY軸，理論蛋白質濃度をX軸にとり，回帰直線（検量線）を作成して，試料溶液の吸光度から蛋白質濃度を算出した。
【産業上の利用可能性】
【0156】
本発明によれば，血清アルブミンと成長ホルモンが連結した蛋白質を有効成分として含有する医薬を，水性医薬組成物の形態で，市場に流通させることができる。
【配列表フリーテキスト】
【0157】
配列番号１：野生型のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列
配列番号２：ヒト血清アルブミンRedhillのアミノ酸配列
配列番号３：ヒト血清アルブミン変異体（Ａ３２０Ｔ）のアミノ酸配列
配列番号４：リンカーのアミノ酸配列の例１
配列番号５：リンカーのアミノ酸配列の例２
配列番号６：リンカーのアミノ酸配列の例３
配列番号７：野生型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位の部分塩基配列
配列番号８：変異型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位の部分塩基配列，合成
配列番号９：２２Ｋヒト成長ホルモンのアミノ酸配列
配列番号１０：２０Ｋヒト成長ホルモンのアミノ酸配列
配列番号１１：２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡのアミノ酸配列
配列番号１２：２０ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡのアミノ酸配列
配列番号１３：プライマーYA082，合成配列
配列番号１４：プライマーYA083，合成配列
配列番号１５：２２ＫｈＧＨ－ＨＳＡのアミノ酸配列
配列番号１６：２２ＫｈＧＨ－ＨＳＡ遺伝子を含む塩基配列，合成配列
配列番号２：ヒト血清アルブミンRedhillのアミノ酸配列
配列番号３：ヒト血清アルブミン変異体（Ａ３２０Ｔ）のアミノ酸配列
配列番号４：リンカーのアミノ酸配列の例１
配列番号５：リンカーのアミノ酸配列の例２
配列番号６：リンカーのアミノ酸配列の例３
配列番号７：野生型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位の部分塩基配列
配列番号８：変異型マウス脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム結合部位の部分塩基配列，合成
配列番号９：２２Ｋヒト成長ホルモンのアミノ酸配列
配列番号１０：２０Ｋヒト成長ホルモンのアミノ酸配列
配列番号１１：２２ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡのアミノ酸配列
配列番号１２：２０ＫｈＧＨ－ｍＨＳＡのアミノ酸配列
配列番号１３：プライマーYA082，合成配列
配列番号１４：プライマーYA083，合成配列
配列番号１５：２２ＫｈＧＨ－ＨＳＡのアミノ酸配列
配列番号１６：２２ＫｈＧＨ－ＨＳＡ遺伝子を含む塩基配列，合成配列
【図1】
【図2】
【配列表】