特許 7604379 抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合フラグメントおよびそれらの医薬用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-13

(45)【発行日】2024-12-23

(54)【発明の名称】抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合フラグメントおよびそれらの医薬用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20241216BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20241216BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241216BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241216BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241216BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241216BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241216BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241216BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241216BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241216BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20241216BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20241216BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/13

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P35/02

A61K39/395 D

G01N33/574 A

C12P21/08

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2021544436

(86)(22)【出願日】2020-01-31

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-15

(86)【国際出願番号】 CN2020074098

(87)【国際公開番号】W WO2020156509

(87)【国際公開日】2020-08-06

【審査請求日】2023-01-11

(31)【優先権主張番号】201910108743.3

(32)【優先日】2019-02-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202010052351.2

(32)【優先日】2020-01-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】510166892

【氏名又は名称】ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＨＥＮＧＲＵＩ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．

(73)【特許権者】

【識別番号】508209602

【氏名又は名称】シャンハイ ヘンルイ ファーマスーティカル カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100175477

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 林太郎

(72)【発明者】

【氏名】グ シャオリン

(72)【発明者】

【氏名】イェ シン

(72)【発明者】

【氏名】グォ フー

(72)【発明者】

【氏名】タオ ウェイカン

【審査官】上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５２４３９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５２３２６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５３０７２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－１５８６０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】Current Opinion in Immunology，2015年，Vol.33，pp.23-35

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域の組み合わせは、以下に示される通りである、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号８、配列番号９および配列番号１０にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに配列番号１１、４７、４８、４９、５０、５１または５２に示されるＬＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域。

【請求項2】

以下に示される前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域の組み合わせを含む、請求項１に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント：
（ａ１）配列番号８、配列番号９および配列番号１０にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む前記重鎖可変領域と、
配列番号４９、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む前記軽鎖可変領域。

【請求項3】

マウス抗体もしくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはヒト化抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項１または２に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

請求項３に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗ＰＤ－１抗体はヒト化抗体であり、前記ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域またはそのフレームワーク領域バリアントを含み、
前記フレームワーク領域バリアントは、以下に示す変異を含む：
（ｆ）前記軽鎖可変領域に含まれる２Ｇアミノ酸復帰変異、および／または
以下の（ｆ１）～（ｆ３）の何れか一つから選択される、前記重鎖可変領域に含まれるアミノ酸復帰変異：
（ｆ１）前記重鎖可変領域に含まれる２７Ｙおよび６９Ｌアミノ酸復帰変異；または
（ｆ２）前記重鎖可変領域に含まれる２７Ｙ、４８Ｉ、６７Ｔ、６９Ｌおよび８２Ｆアミノ酸復帰変異；または
（ｆ３）前記重鎖可変領域に含まれる２７Ｙ、４８Ｉ、６７Ｔ、６９Ｌ、８２Ｆおよび９３Ｔアミノ酸復帰変異；
ここで、前記アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔ基準に従って番号付けおよび決定される。

【請求項5】

請求項３に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体の前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域の前記組み合わせは、以下の（ｉ）および（ｌ）：
（ｉ）重鎖可変領域であって、その配列は、配列番号４に示されるとおりである、重鎖可変領域、および
軽鎖可変領域であって、その配列は、配列番号５に示されるとおりである、軽鎖可変領域；
（ｌ）重鎖可変領域であって、その配列は、配列番号２７、３０、３１もしくは３２に示されるとおりである、重鎖可変領域、および
軽鎖可変領域であって、その配列は、配列番号２８、２９、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３もしくは６４に示されるとおりである、軽鎖可変領域；
から選択される、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

請求項５に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域は、以下に示される通りである、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント：
（ｐ）重鎖可変領域であって、その配列は、配列番号２７に示されるとおりである、重鎖可変領域、および
軽鎖可変領域であって、その配列は、配列番号５５に示されるとおりである、軽鎖可変領域。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は抗体定常領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

前記抗体定常領域の前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４定常領域ならびにそれらの従来のバリアントからなる群から選択され、前記抗体定常領域の前記軽鎖定常領域は、ヒト抗体κおよびλ鎖定常領域ならびにそれらの従来のバリアントからなる群から選択される、請求項７に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

前記抗体は、配列番号７２または７９に示される前記重鎖定常領域、および配列番号７３に示される前記軽鎖定常領域を含む、請求項８に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号７５に示される軽鎖および配列番号７４または８０に示される重鎖を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項11】

前記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号７４に示される重鎖および配列番号７５に示される軽鎖を含む、請求項１０に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項12】

前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ダイアボディ）およびジスルフィド結合安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項13】

前記抗体は、二重特異性抗体、多重特異性抗体または抗体融合タンパク質である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項14】

治療有効量の請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメントと、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝液または賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項15】

請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする、核酸分子。

【請求項16】

請求項１５に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。

【請求項17】

請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む、キット。

【請求項18】

ＰＤ－１に関連する疾患を処置するための、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記疾患は腫瘍である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記疾患は、頭頸部扁平上皮癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、頭頸部癌、脳腫瘍、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系癌、神経内分泌腫瘍、咽頭癌、鼻咽頭癌、食道癌、甲状腺癌、悪性胸膜中皮腫、肺癌、乳癌、肝臓癌、ヘパトーマ（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝細胞癌、肝胆道癌、膵臓癌、胃癌、胃腸癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、淡明細胞型腎細胞癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、皮膚癌、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨肉腫、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮癌、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシスおよびメルケル細胞癌からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｔ－ｃｅｌｌ／ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ ｒｉｃｈ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）およびリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群から選択され、前記肺癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌からなる群から選択され、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記疾患は、ＰＤ－Ｌ１陽性黒色腫（ＰＤ－Ｌ１ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｌａｎｏｍａ）、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、腸癌および結腸癌からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、バイオテクノロジーの分野に属する。より具体的には、本開示は、抗ＰＤ－１抗体およびその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

本明細書の記載は、本発明に関連する背景情報を提供するだけであり、必ずしも先行技術を構成するものではない。

【0003】

腫瘍免疫療法は、腫瘍患者のキラーＴ細胞を十分に活用および動員して、腫瘍を殺傷する処置方法である。同時に、腫瘍細胞の回避は、腫瘍免疫療法にとって大きな障害である。腫瘍細胞は、免疫系に対する独自の抑制効果を利用して、腫瘍の急速な成長を促進する。腫瘍の免疫回避メカニズムと腫瘍に対する体の免疫応答との間には、非常に複雑な関係がある。腫瘍免疫療法の初期段階では、腫瘍特異的キラーＴ細胞は生物学的活性を有するが、腫瘍が成長するにつれて、後期段階で殺傷機能を失う。

【0004】

人体におけるＴ細胞の活性化は、２つのシグナル伝達経路システムを採用している。抗原提示細胞によるＭＨＣ－抗原ペプチドの提示によってＴ細胞に提供される最初のシグナルに加えて、一連の共刺激分子によって提供される第二のシグナルも、Ｔ細胞が正常な免疫応答を生成できるようにするために必要である。この二重シグナル伝達経路システムは、体内の免疫系のバランスにおいて重要な役割を果たしている。それは、自己抗原および非自己抗原に対する体の異なる免疫応答を厳密に調節する。共刺激分子によって提供される第２のシグナルが存在しない場合、Ｔ細胞の非応答または持続的な特異的免疫応答を引き起こし、したがって免疫寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）をもたらす。したがって、第２のシグナル伝達経路は、体の免疫応答の全過程において非常に重要な調節的役割を果たしている。

【0005】

Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌ（ＰＤ－ｌ）は、１９９２年に発見されたＴ細胞の表面に発現するタンパク質受容体であり、細胞アポトーシスの過程に関与している。ＰＤ－ｌはＣＤ２８ファミリーに属する。ＰＤ－ｌは細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）と２３％のアミノ酸相同性を有するが、その発現はＣＴＬＡの発現とは異なり、主に活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞に発現している。ＰＤ－１には、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２という２つのリガンドがある。ＰＤ‐Ｌ１は主にＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）で発現し、細胞での発現は活性化された後にアップレギュレーションされ得る。ＰＤ－Ｌ２の発現は比較的制限されており、主に活性化されたマクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞で発現している。

【0006】

ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１およびＢ７－１に結合することによって免疫系を阻害する。腫瘍組織微小環境の多くの腫瘍細胞および免疫細胞はＰＤ－Ｌ１を発現する。新しい研究により、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の高発現が、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、胃癌、腸癌、腎臓癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌および肝臓癌ならびにその他のヒト腫瘍組織で検出され、ＰＤ－Ｌ１の発現レベルが患者の臨床症状および予後と密接に関連していることが明らかになった。

【0007】

抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の結合を遮断することにより、腫瘍に対する患者自身の免疫系の反応を最大限に高めることができ、腫瘍細胞を殺傷するという目的を達成する。現在、抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋキイトルーダ、キイトルーダ、Ｍｅｒｃｋ－Ｐｅｍｂ、Ｍｅｒｃｋ－キイトルーダ、Ｍｅｒｃｋ－ＰＤ－１、ペムブロリズマブとしても知られる）およびノビルマブ（ＢＭＳオプジーボ、オプジーボ、ＢＭＳ－ニボルマブ、ノビルマブとしても知られる）が、黒色腫、ホジキンリンパ腫患者、非小細胞肺癌およびその他の腫瘍の処置用に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。さらに、ＷＯ２００１３９７２２、ＷＯ２００６１２１１６８、ＷＯ２０１００３６９５９、ＷＯ２０１００８９４１１、ＷＯ２０１１１１０６０４、ＷＯ２０１３１７３２２３、ＷＯ２０１３１８１６３４、ＵＳ２０１４３３５０９３、ＵＳ６８０３１９２Ｂ１、ＵＳ８６１７５４６Ｂ２、ＷＯ２０１５０８５８４７などの特許文献も、さまざまな抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を開示している。

【発明の概要】

【0008】

本開示は、新規な抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医学的使用を提供する。

【0009】

いくつかの代替の実施形態では、本開示は、以下のｉ）～ｉｉｉ）のいずれか１つから選択される、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
ｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、その重鎖可変領域は、配列番号８に示されるか配列番号８に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるか配列番号９に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１０に示されるか配列番号１０に対して最大で８、３、２または１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、配列番号１１に示されるか配列番号１１に対して最大で４、３、２または１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるか配列番号１２に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１３に示されるか配列番号１３に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント；
ｉｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、その重鎖可変領域は、配列番号１４に示されるか配列番号１４に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ１、配列番号１５に示されるか配列番号１５に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ２、および配列番号１６に示されるか配列番号１６に対して最大で８、３、２または１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、配列番号１７に示されるか配列番号１７に対して最大で４、３、２または１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるか配列番号１２に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ２、および配列番号１８に示されるか配列番号１８に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント；および
ｉｉｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、その重鎖可変領域は、配列番号２１に示されるか配列番号２１に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ１、配列番号２２に示されるか配列番号２２に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ２、および配列番号２３に示されるか配列番号２３に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、配列番号２４に示されるか配列番号２４に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ１、配列番号２５に示されるか配列番号２５に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ２、および配列番号２６に示されるか配列番号２６に対して最大で３、２または１個のアミノ酸変異を有するＬＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【0010】

いくつかの実施形態では、本開示の前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、１０^－７Ｍ以下の解離平衡定数でヒトＰＤ－１に結合する。いくつかの実施形態では、それは、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍまたは１０^－１１Ｍ以下の解離平衡定数でヒトＰＤ－１に結合する。

【0011】

いくつかの代替の実施形態では、本開示は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、その重鎖可変領域は、配列番号６５に示されるＨＣＤＲ１、配列番号６６に示されるＨＣＤＲ２、および配列番号６７に示されるＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、配列番号６８に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、および配列番号６９に示されるＬＣＤＲ３を含み、それらの配列は以下の表１に示される、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する：

【0012】

【表1】

【0013】

いくつかの代替の実施形態では、前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントにおいて、前記重鎖可変領域は、配列番号８に示されるＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるＨＣＤＲ２、および配列番号１０に示されるＨＣＤＲ３を含み、かつ前記軽鎖可変領域は、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、および一般式ＲＳＳＱＳＸ_１３ＶＨＳＸ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６ＴＹＬＥ（配列番号６８）に示されるＬＣＤＲ１を含み、式中、Ｘ_１３はＬであり、Ｘ_１４はＮ、Ｑ、Ｌ、ＴおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_１５はＧ、ＡおよびＶからなる群から選択され、Ｘ_１６はＮである。

【0014】

いくつかの代替の実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の（ａ）～（ｅ）のいずれか１つから選択される：
（ａ）配列番号８、配列番号９および配列番号１０にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに配列番号１１、４７、４８、４９、５０、５１または５２に示されるＬＣＤＲ１を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｂ）配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号１７、配列番号１２および配列番号１８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｃ）配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｄ）配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに配列番号１１、４７、４８、４９、５０、５１または５２に示されるＬＣＤＲ１を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント；および
（ｅ）配列番号８、配列番号９および配列番号１０にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号１７、配列番号１２および配列番号１８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【0015】

いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号８、配列番号９および配列番号１０にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、当該軽鎖可変領域は、配列番号４９、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、当該軽鎖可変領域は、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

【0017】

いくつかの代替の実施形態では、本開示は、以下のｉｖ）～ｖｉ）のいずれか１つから選択される、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する：
ｉｖ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、その重鎖可変領域は、配列番号４の配列に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と同じ配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、配列番号５の配列に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と同じ配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント；
ｖ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、その重鎖可変領域は、配列番号６の配列に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と同じ配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、配列番号７の配列に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と同じ配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント；および
ｖｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、その重鎖可変領域は、配列番号１９の配列に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と同じ配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域は、配列番号２０の配列に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と同じ配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント。

【0018】

前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体もしくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、完全ヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはヒト化抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。

【0019】

前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0020】

いくつかの実施形態では、前記ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域またはそのフレームワーク領域バリアントを含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、前記フレームワーク領域バリアントは、ヒト抗体の前記軽鎖フレームワーク領域および／または前記重鎖フレームワーク領域のそれぞれに最大１１個のアミノ酸復帰変異を有する。

【0022】

いくつかの実施形態では、前記フレームワーク領域バリアントは、以下の（ｆ）～（ｈ）のいずれか１つから選択される変異を含む：
（ｆ）前記軽鎖可変領域に含まれる２Ｇアミノ酸復帰変異、および／または、前記重鎖可変領域に含まれる２７Ｙ、４８Ｉ、６７Ｔ、６９Ｌ、８２Ｆおよび９３Ｔからなる群から選択される１個以上のアミノ酸復帰変異；
（ｇ）前記軽鎖可変領域に含まれる２Ｖアミノ酸復帰変異、および／または、前記重鎖可変領域に含まれる２６Ｄ、２７Ｆ、３０Ｔ、３８Ｋ、４３Ｈ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌ、８２Ｆおよび９３Ｔからなる群から選択される１個以上のアミノ酸復帰変異；および
（ｈ）前記軽鎖可変領域に含まれる４２Ｇ、４４Ｖおよび７１Ｙからなる群から選択される１個以上のアミノ酸復帰変異、および／または、前記重鎖可変領域に含まれる１Ｋおよび／または９４Ｓアミノ酸復帰変異。

【0023】

前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下からなる群から選択される抗体可変領域を含む：
（ａ２）配列番号８、配列番号９および配列番号１０にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに前記重鎖フレームワーク領域に含まれる２７Ｙ、４８Ｉ、６７Ｔ、６９Ｌ、８２Ｆおよび９３Ｔのうちの１個以上のアミノ酸復帰変異を含む、重鎖可変領域と、
配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに配列番号１１、４７、４８、４９、５０、５１または５２に示されるＬＣＤＲ１、ならびに前記軽鎖フレームワーク領域に含まれる２Ｇアミノ酸復帰変異を含む、軽鎖可変領域；
（ｂ２）配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに前記重鎖可変領域に含まれる２６Ｄ、２７Ｆ、３０Ｔ、３８Ｋ、４３Ｈ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌ、８２Ｆおよび９３Ｔから選択される１個以上のアミノ酸復帰変異を含む、重鎖可変領域と、
配列番号１７、配列番号１２および配列番号１８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに前記軽鎖フレームワーク領域に含まれる２Ｖアミノ酸復帰変異を含む、軽鎖可変領域；
（ｃ２）配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに前記重鎖フレームワーク領域に含まれる１Ｋおよび／または９４Ｓアミノ酸復帰変異を含む、重鎖可変領域と、
配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに前記軽鎖フレームワーク領域に含まれる４２Ｇ、４４Ｖおよび７１Ｙから選択される１個以上のアミノ酸復帰変異を含む、軽鎖可変領域。

【0024】

前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の（ｉ）～（ｏ）のいずれか１つから選択される抗体可変領域を含む：
（ｉ）重鎖可変領域であって、その配列は、配列番号４に示されるとおりであるか、または配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有する、重鎖可変領域、および／または
軽鎖可変領域であって、その配列は、配列番号５に示されるとおりであるか、または配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域；
（ｊ）重鎖可変領域であって、その配列は、配列番号６に示されるとおりであるか、または配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する、重鎖可変領域、および／または
軽鎖可変領域であって、その配列は、配列番号７に示されるとおりであるか、または配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域；
（ｋ）重鎖可変領域であって、その配列は、配列番号１９に示されるとおりであるか、または配列番号１９と少なくとも９０％の配列同一性を有する、重鎖可変領域、および／または
軽鎖可変領域であって、その配列は、配列番号２０に示されるとおりであるか、または配列番号２０と少なくとも９０％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域；
（ｌ）重鎖可変領域であって、その配列は、配列番号２７、３０、３１もしくは３２に示されるとおりであるか、または配列番号２７、３０、３１もしくは３２とそれぞれ少なくとも９０％の配列同一性を有する、重鎖可変領域、および／または
軽鎖可変領域であって、その配列は、配列番号２８、２９、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３もしくは６４に示されるとおりであるか、または配列番号２８、２９、３４、３５、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３もしくは６４とそれぞれ少なくとも９０％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域；
（ｍ）重鎖可変領域であって、その配列は、配列番号３３、３６、３７、３８、３９もしくは４０に示されるとおりであるか、または配列番号３３、３６、３７、３８、３９もしくは４０とそれぞれ少なくとも９０％の配列同一性を有する、重鎖可変領域、および／または
軽鎖可変領域であって、その配列は、配列番号３４、３５、２８、２９、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３もしくは６４に示されるとおりであるか、または配列番号３４、３５、２８、２９、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３もしくは６４とそれぞれ少なくとも９０％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域；
（ｎ）重鎖可変領域であって、その配列は、配列番号４１、４５もしくは４６に示されるとおりであるか、または配列番号４１、４５もしくは４６とそれぞれ少なくとも９０％の配列同一性を有する、重鎖可変領域、および／または
軽鎖可変領域であって、その配列は、配列番号４２、４３もしくは４４に示されるとおりであるか、または配列番号４２、４３もしくは４４とそれぞれ少なくとも９０％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域；
（ｏ）重鎖可変領域であって、その配列は、配列番号７０に示されるとおりであるか、または配列番号７０と少なくとも９０％の配列同一性を有する、重鎖可変領域、および／または
軽鎖可変領域であって、その配列は、配列番号７１に示されるとおりであるか、または配列番号７１と少なくとも９０％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域；および
（ｐ）重鎖可変領域であって、その配列は、配列番号２７、３０、３１もしくは３２に示されるとおりであるか、または配列番号２７、３０、３１もしくは３２とそれぞれ少なくとも９０％の配列同一性を有する、重鎖可変領域、および／または
軽鎖可変領域であって、その配列は、配列番号３４もしくは３５に示されるとおりであるか、または配列番号３４もしくは３５とそれぞれ少なくとも９０％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域；
ここで、配列番号７０および配列番号７１の配列は、表２に示される一般式の配列で表される。

【0025】

【表2】

【0026】

いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体の前記重鎖可変領域は、配列番号２７に示されるとおりであるか、または配列番号２７と少なくとも９０％の同一性を有し、前記抗ＰＤ－１抗体の前記軽鎖可変領域の配列は、配列番号５５に示されるとおりであるか、または配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。

【0027】

いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体の前記重鎖可変領域は、配列番号４６に示されるとおりであるか、または配列番号４６と少なくとも９０％の同一性を有し、前記抗ＰＤ－１抗体の前記軽鎖可変領域の配列は、配列番号４３に示されるとおりであるか、または配列番号４３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。

【0028】

前述の「少なくとも９０％の同一性」には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性が含まれる。

【0029】

前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの他の実施形態では、前記抗体は抗体定常領域をさらに含む；いくつかの他の実施形態では、前記抗体定常領域の前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４定常領域ならびにそれらの従来のバリアントからなる群から選択され、前記抗体定常領域の前記軽鎖定常領域は、ヒト抗体κおよびλ鎖定常領域ならびにそれらの従来のバリアントからなる群から選択される；いくつかの他の実施形態では、前記抗体定常領域は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのうちの１つ以上の変異が導入されるＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、例えば、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａの３つのアミノ酸変異を有するＩｇＧ４重鎖定常領域を含む；いくつかの他の実施形態では、前記抗体は、配列番号７２または７９に示される重鎖定常領域、および配列番号７３に示される軽鎖定常領域を含む。

【0030】

前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号７８に示される軽鎖および配列番号７７もしくは８２に示される重鎖を含むか、または前記抗ＰＤ－１抗体は、配列番号７５に示される軽鎖および配列番号７４、７６、８０もしくは８１に示される重鎖を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、前記抗ＰＤ－１抗体は、
配列番号７４に示される重鎖および配列番号７５に示される軽鎖、または
配列番号７７に示される重鎖および配列番号７８に示される軽鎖
を含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれか１つと競合的にヒトＰＤ－１に結合するまたは同じヒトＰＤ－１エピトープに結合する、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0033】

前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗体は、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。

【0034】

前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ダイアボディ）およびジスルフィド結合安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される。

【0035】

いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、前述のいずれか１つに記載の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントと競合的にヒトＰＤ－１に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが開示される。

【0036】

いくつかの実施形態では、本開示はまた、治療有効量の前述のいずれか１つに記載の抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは治療有効量の前述の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントと、1つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝液または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、前述の治療有効量とは、０．１～３０００ｍｇの前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物の単位用量を指す。

【0037】

いくつかの実施形態では、本開示はまた、前述のいずれか１つに記載の抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードするか、または前述の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントをコードする、核酸分子を提供する。

【0038】

いくつかの実施形態では、本開示はまた、前述の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。

【0039】

いくつかの実施形態では、本開示はまた、前述のいずれか１つに記載の抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメントを使用するステップ、または前述の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントを使用するステップを含む、ＰＤ－１の免疫検出または決定のための方法を提供する。

【0040】

いくつかの実施形態では、本開示はまた、前述の抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは前述の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む、キットを提供する。

【0041】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１関連疾患の診断用薬剤を調製する際の前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントの使用が提供される。

【0042】

いくつかの実施形態では、本開示はまた、治療有効量の前述のいずれか１つに記載の抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または前述の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または前述の医薬組成物、または前述の核酸分子を対象に投与することを含む、疾患を処置するための方法を提供する。

【0043】

いくつかの実施形態では、前記疾患は腫瘍である。

【0044】

いくつかの他の実施形態では、前記疾患は、頭頸部扁平上皮癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、頭頸部癌、脳腫瘍、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系癌、神経内分泌腫瘍、咽頭癌、鼻咽頭癌、食道癌、甲状腺癌、悪性胸膜中皮腫、肺癌、乳癌、肝臓癌、ヘパトーマ（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝細胞癌、肝胆道癌、膵臓癌、胃癌、胃腸癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、淡明細胞型腎細胞癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、皮膚癌、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨肉腫、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮癌、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシスおよびメルケル細胞癌からなる群から選択される；これらの実施形態のいくつかでは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｔ－ｃｅｌｌ／ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ ｒｉｃｈ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）およびリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群から選択され、前記肺癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌からなる群から選択され、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄性白血病からなる群から選択される；いくつかの他の実施形態では、前記疾患は、ＰＤ－Ｌ１陽性黒色腫（ＰＤ－Ｌ１ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｌａｎｏｍａ）、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、腸癌および結腸癌からなる群から選択される。

【0045】

いくつかの実施形態では、本開示はまた、疾患の処置または予防のための薬剤を調製する際の、前述のいずれか１つに記載の抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または前述の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または前述の医薬組成物、または前述の核酸分子の使用を提供する。

【0046】

いくつかの実施形態では、前記疾患は腫瘍である。

【0047】

いくつかの他の実施形態では、前記疾患は、頭頸部扁平上皮癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、頭頸部癌、脳腫瘍、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系癌、神経内分泌腫瘍、咽頭癌、鼻咽頭癌、食道癌、甲状腺癌、悪性胸膜中皮腫、肺癌、乳癌、肝臓癌、ヘパトーマ（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝細胞癌、肝胆道癌、膵臓癌、胃癌、胃腸癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、淡明細胞型腎細胞癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、皮膚癌、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨肉腫、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮癌、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシスおよびメルケル細胞癌からなる群から選択される；これらの実施形態のいくつかでは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｔ－ｃｅｌｌ／ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ ｒｉｃｈ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）およびリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群から選択され、前記肺癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌からなる群から選択され、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄性白血病からなる群から選択される；いくつかの他の実施形態では、前記疾患は、ＰＤ－Ｌ１陽性黒色腫（ＰＤ－Ｌ１ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｌａｎｏｍａ）、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、腸癌および結腸癌からなる群から選択される。

【0048】

いくつかの実施形態では、本開示はまた、薬剤として使用するための、前述のいずれか１つに記載の抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または前述の単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または前述の核酸分子、または前述の医薬組成物を提供する。

【0049】

いくつかの実施形態では、前記薬剤は、ＰＤ－１関連疾患の処置または予防のために使用される。

【0050】

いくつかの実施形態では、前記疾患は腫瘍である。

【0051】

いくつかの他の実施形態では、前記疾患は、頭頸部扁平上皮癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、頭頸部癌、脳腫瘍、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系癌、神経内分泌腫瘍、咽頭癌、鼻咽頭癌、食道癌、甲状腺癌、悪性胸膜中皮腫、肺癌、乳癌、肝臓癌、ヘパトーマ（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝細胞癌、肝胆道癌、膵臓癌、胃癌、胃腸癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、淡明細胞型腎細胞癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、皮膚癌、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨肉腫、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮癌、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシスおよびメルケル細胞癌からなる群から選択される；これらの実施形態のいくつかでは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｔ－ｃｅｌｌ／ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ ｒｉｃｈ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）およびリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群から選択され、前記肺癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌からなる群から選択され、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄性白血病からなる群から選択される；いくつかの他の実施形態では、前記疾患は、ＰＤ－Ｌ１陽性黒色腫（ＰＤ－Ｌ１ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｌａｎｏｍａ）、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、腸癌および結腸癌からなる群から選択される。

【図面の簡単な説明】

【0052】

【図1】ＰＤ－１のそのリガンドへの結合を遮断する抗ＰＤ－１抗体の試験結果。

【図2】ＰＢＭＣ細胞からのＩＦＮγの分泌に対する抗ＰＤ－１抗体の効果。

【図3】マウスにおける結腸癌ＭＣ３８の異種移植腫瘍に対する抗ＰＤ－１抗体の有効性。

【図4】マウスにおける結腸癌ＭＣ３８の腫瘍体積に対する抗ＰＤ－１抗体の効果。

【発明を実施するための形態】

【0053】

＜概要＞
本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の技術的および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書で別に明確に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。

【0054】

「ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １」、「ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １」、「タンパク質ＰＤ－１」、「ＰＤ－１」、「ＰＤＣＤ１」および「ｈＰＤ－１」という用語は互換的に使用され、ヒトＰＤ－１バリアント、アイソタイプ、種ホモログ（ｓｐｅｃｉｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｓ）、およびＰＤ－１と共通の少なくとも一つのエピトープを有する類似体（ａｎａｌｏｇｓ）を含む。完全なＰＤ－１配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）Ｕ６４８６３で見つけることができる。

【0055】

「ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ－１ （ＰＤ－Ｌ１）」という用語は、ＰＤ－１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドの１つ（もう１つはＰＤ－Ｌ２）であり、ＰＤ－１に結合するとＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌をダウンレギュレートする。本明細書で使用される「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）、ｈＰＤ－Ｌ１バリアント、アイソタイプおよび種間ホモログ、ならびにｈＰＤ－１と共通の少なくとも１つのエピトープを有する５つの類似体を含む。完全なｈＰＤ－Ｌ１配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７で見つけることができる。

【0056】

「サイトカイン」という用語は、細胞の集団によって放出され、細胞間メディエーターとして他の細胞に作用するタンパク質の一般的な用語である。このようなサイトカインの例には、リンホカイン、モノカイン、ケモカインおよび従来のポリペプチドホルモンが含まれる。例示的なサイトカインには、ヒトＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＬ－１７およびＩＬ－５が含まれる。

【0057】

本開示で使用されるアミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、Ｊ． ｂｉｏｌ． ｃｈｅｍ， ２４３， ３５５８頁（１９６８年）に記載されるとおりである。

【0058】

本開示に記載される「抗体」は、一般に免疫グロブリンを指す。天然のインタクト抗体は、鎖間ジスルフィド結合によって連結された２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖から構成されるテトラペプチド鎖構造である。免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸組成および配列が異なるため、それらの抗原性も異なる。これにより、免疫グロブリンは５つのクラスに分類されるか、または免疫グロブリンのアイソタイプ、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと命名され得、それらの対応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖およびε鎖である。同じクラスのＩｇは、ヒンジ領域のアミノ酸組成の違いならびに重鎖ジスルフィド結合の数および位置に応じて、異なるサブクラスに分類することができる。例えば、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、定常領域の違いによりκ鎖またはλ鎖に分類される。Ｉｇの５つクラスのそれぞれは、κ鎖またはλ鎖を有し得る。本開示で言及される抗体には、抗体またはその抗原結合フラグメントが含まれ、抗原に結合する能力を保持しながら免疫グロブリンに基づいて改変された抗体またはその抗原結合フラグメントを含み；単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体を含み；一価抗体、二価抗体または多価抗体も含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、少なくとも１つのＶＨ－ＣＨ１および少なくとも１つのＶＬ－ＣＬ構造を含むものであり得、当該ＶＨおよびＶＬ構造は、鎖間相互作用に基づいて互いに接近することができ、抗原結合能力を保持することができる。いくつかの実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは、一価のＦａｂフラグメント（Ｆａｂ１フラグメント）、二価のＦａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ）２）、三価のＦａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ）３）、多価（２価以上）のＦａｂフラグメントであり、少なくとも１つのＦａｂフラグメントを含む他の単一特異性、二重特異性または多重特異性抗原結合フラグメントであり得る。

【0059】

「二重特異性抗体」とは、２つの異なる抗原または同じ抗原の２つの異なるエピトープに特別に結合することができる抗体（抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば一本鎖抗体を含む）を指す。先行技術は、さまざまな構造を有する二重特異性抗体を開示している。ＩｇＧ分子の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に応じて、それらはＩｇＧ様二重特異性抗体と抗体フラグメント型二重特異性抗体に分類することができる。抗原結合領域の数および構成に応じて、それらは二価、三価、四価、またはより多価の二重特異性抗体に分類することができる。構造が対称であるかどうかに応じて、それらは対称構造二重特異性抗体と非対称構造二重特異性抗体に分類することができる。それらの中で、抗体フラグメントベースの二重特異性抗体、例えば、Ｆｃフラグメントを欠くＦａｂフラグメントは、１つの分子内の２つ以上のＦａｂフラグメントに結合することによって二重特異性抗体を形成する。これらの抗体は、免疫原性が低く、分子量が小さく、腫瘍組織透過性が高い。このタイプの典型的な抗体構造は、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ、（ｓｃＦｖ）２－Ｆａｂなどの二重特異性抗体である；ＩｇＧ様二重特異性抗体（例えば、Ｆｃフラグメントを含む）の場合、このタイプの抗体はより大きな分子量を有する。Ｆｃフラグメントは、後の段階での抗体の精製を助け、その溶解性および安定性を向上させる。Ｆｃ部分はまた受容体ＦｃＲｎに結合し、抗体の血清半減期を増加させ得る。典型的な二重特異性抗体構造モデルは、例えば、ＫｉＨ、ＣｒｏｓｓＭＡｂ、Ｔｒｉｏｍａｂ ｑｕａｄｒｏｍａ、ＦｃΔＡｄｐ、ＡＲＴ－Ｉｇ、ＢｉＭＡｂ、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ、ＢＥＡＴ、ＤｕｏＢｏｄｙ、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ、ＸｍＡｂ、２：１ ＴＣＢｓ、１Ｆａｂ－ＩｇＧ ＴＤＢ、ＦｙｎｏｍＡｂ、ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ／ＤＡＦ、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ＩｇＧ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＬＰ－ＤＡＲＴ、ＣＯＤＶ－Ｆａｂ－ＴＬ、ＨＬＥ－ＢｉＴＥ、Ｆ（ａｂ）２－ＣｒｏｓｓＭＡｂ、ＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）２、Ｂｓ４Ａｂ、ＤＶＤ－Ｉｇ、Ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ－ＤＡＲＴ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）４－Ｆｃ、ＣＯＤＶ－Ｉｇ、ｍＡｂ２、Ｆ（ａｂ）４－ＣｒｏｓｓＭＡｂおよび他の二重特異性抗体などである（Ａｒａｎ Ｆ． Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ 第１８巻，５８５－６０８頁（２０１９年）；Ｃｈｅｎ Ｓ１ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ． ２０１９年２月１１日；２０１９年：４５１６０４１頁参照）。

【0060】

「一価」、「二価」、「三価」または「多価」という用語は、抗体またはポリペプチド複合体における特定の数の抗原結合部位の存在を指す。例えば、「一価抗体」は、当該抗体に１つの抗原結合部位があることを意味し、「一価ポリペプチド複合体」は、当該ポリペプチド複合体に１つの抗原結合部位があることを意味する；「二価抗体」は、当該抗体に２つの抗原結合部位があることを意味し、「二価ポリペプチド複合体」は、当該ポリペプチド複合体に２つの抗原結合部位があることを意味する；「三価抗体」は、当該抗体に３つの抗原結合部位があることを意味し、「三価ポリペプチド複合体」は、当該ポリペプチド複合体に３つの抗原結合部位があることを意味する；「多価抗体」は、当該抗体に複数（３つ以上）の抗原結合部位があることを意味し、「多価ポリペプチド複合体」は、当該ポリペプチド複合体に複数（２つ以上）の抗原結合部位があることを意味する。

【0061】

「抗体融合タンパク質」という用語は、目的のタンパク質（ポリペプチド）を免疫グロブリンに連結することによって形成される、生物学的に活性な融合タンパク質を指す。融合タンパク質は、連結されたタンパク質と免疫グロブリンの両方の生物学的活性を有する。

【0062】

抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端付近の約１１０アミノ酸の配列は大きく変化し、可変領域（Ｆｖ領域）である；Ｃ末端付近の残りのアミノ酸配列は比較的安定しており、定常領域である。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と比較的保存的な配列を有する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られている。軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）のそれぞれは、３つのＣＤＲ領域と４つのＦＲ領域からなる。アミノ末端からカルボキシル末端への順序は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４である。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＬ２およびＨＤＲ３を指す。

【0063】

本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、好ましくはヒト化抗体を含む。

【0064】

本開示における「マウス抗体」という用語は、当技術分野の知識および技術に従って調製された、ヒトＰＤ－１に対するモノクローナル抗体である。調製中に、試験対象にＰＤ－１抗原を注射し、次に、所望の配列または機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。本開示の好ましい実施形態では、マウス抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ、λ鎖もしくはそれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含むことができるか、またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはそれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含むことができる。

【0065】

「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによって形成される抗体であり、マウス抗体によって誘導される免疫応答を軽減することができる。キメラ抗体を確立することは、まずマウスの特定のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを確立すること、次にマウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングすること、次に必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングすること、該マウス可変領域遺伝子を該ヒト定常領域遺伝子に連結してキメラ遺伝子を形成すること、該キメラ遺伝子を発現ベクターに挿入すること、および、最後に真核生物システムまたは原核生物システムでキメラ抗体分子を発現させることを必要とする。本開示の好ましい実施形態では、ＰＤ－Ｌ１キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ、λ鎖またはそれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含む。ＰＤ－１キメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含むか、またはアミノ酸変異（例えば、Ｌ２３４Ａおよび／もしくはＬ２３５Ａ変異、ならびに／またはＳ２２８Ｐ変異）を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４バリアントを含む。

【0066】

ＣＤＲ移植抗体としても知られる「ヒト化抗体」という用語は、マウスＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域のフレームワークに移植することによって産生される抗体、すなわち、異なるタイプのヒト生殖細胞系列抗体フレームワーク配列で産生される抗体を指す。ヒト化抗体は、大量のマウスタンパク質成分を保有するため、キメラ抗体によって誘導される異種反応を克服することができる。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から入手することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（インターネットｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能）およびＫａｂａｔ， ＥＡ， ｅｔ ａｌ． １９９１年 Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版に見出すことができる。免疫原性の低下によって同時に引き起こされる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域フレームワーク配列を最小限の逆変異または復帰変異に供して、活性を維持することができる。本開示のヒト化抗体は、酵母ディスプレイによるＣＤＲ親和性成熟をさらに受けたヒト化抗体も含む。

【0067】

抗原と接触している残基のために、ＣＤＲ移植は、抗原と接触しているフレームワーク残基のために、産生された抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原に対する親和性の低下をもたらす可能性がある。このような相互作用は体細胞超変異の結果である可能性がある。したがって、そのようなドナーフレームワークアミノ酸をヒト化抗体のフレームワークに移植することが依然として必要であるかもしれない。抗原結合に関与し、非ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントに由来するアミノ酸残基は、動物のモノクローナル抗体可変領域の配列および構造を調べることによって同定することができる。生殖細胞系列とは異なるＣＤＲドナーフレームワークの残基は、関連していると見なすことができる。最も近い生殖細胞系列を決定することができない場合、その配列は、サブクラスまたは高い類似性パーセンテージを有する動物抗体配列のコンセンサス配列と比較され得る。まれなフレームワーク残基は、体細胞超変異の結果と考えられ、したがって結合において重要な役割を果たしている。

【0068】

本開示の一実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトまたはマウスのκ、λ鎖またはそれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含むことができるか、あるいはヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含むことができ、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４、またはアミノ酸変異（例えば、Ｌ２３４Ａおよび／もしくはＬ２３５Ａ変異、ならびに／またはＳ２２８Ｐ変異）を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４バリアントの重鎖定常領域を含むことができる。

【0069】

本開示に記載されるヒト抗体重鎖定常領域およびヒト抗体軽鎖定常領域の「従来のバリアント」は、先行技術において開示されており、抗体可変領域の構造および機能を変化させない、重鎖定常領域または軽鎖定常領域のバリアントを指す。例示的なバリアントには、重鎖定常領域の部位特異的改変およびアミノ酸置換を伴うＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域バリアントが含まれる。具体的な置換は、ＹＴＥ変異、Ｌ２３４Ａおよび／もしくはＬ２３５Ａ変異、Ｓ２２８Ｐ変異、ならびに／または当技術分野で既知のノブ－イントゥ－ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）構造を得る（抗体重鎖がノブ－Ｆｃおよびホール－Ｆｃの組み合わせを有するようにする）ための変異などである。これらの変異は、抗体に新しい特性をもたらすことが確認されているが、抗体可変領域の機能は変化させない。

【0070】

「ＨｕＭＡｂ」、「ヒト抗体」、「完全ヒト抗体（ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「完全ヒト抗体（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は互換的に使用することができ、ヒト由来の抗体、または抗原刺激に応答して特定のヒト抗体を産生するように「操作」された遺伝子改変生物から得られる抗体を指すことができ、当技術分野で既知の任意の方法によって産生することができる。いくつかの技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の要素が胚性幹細胞株に由来する生物の細胞株に導入され、ここで、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座はこれらの細胞に含まれる当該内因性重鎖および軽鎖遺伝子座を標的とするものによって標的破壊されている。トランスジェニック生物は、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、該生物は、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用することができる。ヒト抗体はまた、重鎖および軽鎖が１つ以上のヒトＤＮＡ供給源に由来するヌクレオチド配列によってコードされる抗体であり得る。完全ヒト抗体はまた、伝子または染色体トランスフェクション法およびファージディスプレイ技術によって構築され得るか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞から構築され得、これらはすべて当技術分野で知られている。

【0071】

「全長抗体（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「インタクト抗体（ｉｎｔａｃｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「完全抗体（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され、以下に定義される抗原結合フラグメントとは区別される、実質的に無傷の形態（ｉｎｔａｃｔ ｆｏｒｍ）の抗体を指す。これらの用語は、具体的には、重鎖がＦｃ領域を含む抗体を指す。

【0072】

抗体の「抗原結合フラグメント」または「機能的フラグメント」という用語は、抗原（例えば、ＰＤ－１）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。全長抗体のフラグメントを使用して、抗体の抗原結合機能を実行できることが示されている。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれる結合フラグメントの例には、以下が含まれる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントの二価フラグメントを含む、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる、Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の片方のアームのＶＨおよびＶＬドメインから構成される、Ｆｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなる、単一ドメインまたはｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６頁）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）任意に合成リンカーによって連結された２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を使用して、合成リンカーによってそれらを連結して、ＶＬおよびＶＨ領域がペアになって一価分子を形成した一本のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３頁を参照）として生成できるようにすることができる。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれることが意図されている。このような抗体フラグメントは、当技術分野で既知の従来技術を使用することによって得られ、フラグメントの機能は、インタクト抗体の機能と同じ方法でスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクト免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生成され得る。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体であり得る。

【0073】

本開示の抗原結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ダイアボディ）、ジスルフィド結合安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、ＣＤＲ含有ペプチドなどが含まれる。

【0074】

Ｆａｂは、約５０，０００の分子量を有し、抗原結合活性を有する抗体フラグメントであり、ＩｇＧ抗体分子をプロテアーゼのパパイン（Ｈ鎖の位置２２４のアミノ酸残基を切断する）で処理することによって得られ、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合によって結合している。

【0075】

本開示のＦａｂは、パパインを使用して、ヒトＰＤ－１を特異的に認識し、細胞外領域のアミノ酸配列またはその三次元構造に結合する本開示のモノクローナル抗体を処理することによって産生され得る。さらに、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入すること、および該ベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂを発現させることによって産生され得る。

【0076】

Ｆ（ａｂ’）２は、約１００，０００の分子量を有し、抗原結合活性を有し、ヒンジ位置で連結された２つのＦａｂ領域を含む抗体フラグメントであり、ＩｇＧのヒンジ領域における２つのジスルフィド結合の下部（ｌｏｗｅｒ ｐａｒｔ）を酵素ペプシンで消化することによって得られる。

【0077】

本開示のＦ（ａｂ’）２は、ペプシンを使用して、ヒトＰＤ－１を特異的に認識し、細胞外領域のアミノ酸配列またはその三次元構造に結合する本開示のモノクローナル抗体を処理することによって産生され得る。さらに、Ｆ（ａｂ’）２は、以下に説明するＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合で連結することによって産生され得る。

【0078】

Ｆａｂ’は、約５０，０００の分子量を有し、抗原結合活性を有する抗体フラグメントであり、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる。本開示のＦａｂ’は、ジチオスレイトールなどの還元剤を使用して、ＰＤ－１を特異的に認識し、細胞外領域のアミノ酸配列またはその立体構造に結合する本開示のＦ（ａｂ’）２を処理することによって産生され得る。

【0079】

さらに、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入すること、および、次いで該ベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂ’を発現させることによって産生され得る。

【0080】

「一本鎖抗体」、「一本鎖Ｆｖ」、または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって連結された抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）を含む分子を指す。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ_２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ_２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨという一般構造を有し得る。先行技術における適切なリンカーは、繰り返しＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアント、例えば１～４個の繰り返し配列を有するバリアントからなる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３年），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９０：６４４４－６４４８頁）。本開示で使用され得る他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５年），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５－７３１頁、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００１年），Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ．３１：９４－１０６頁、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６年），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５－３０６１頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９年），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２９３：４１－５６頁、およびＲｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１年），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．に記載されている。

【0081】

本開示のｓｃＦｖは、以下のステップによって産生され得る：ヒトＰＤ－１を特異的に認識し、細胞外領域のアミノ酸配列またはその三次元構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得するステップ、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築するステップ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ、および、次いで該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してｓｃＦｖを発現させるステップ。

【0082】

ダイアボディは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体フラグメントであり、二価の抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。二価の抗原結合活性において、２つの抗原は同じであっても異なっていてもよい。

【0083】

本開示のダイアボディは、以下のステップによって産生され得る：ヒトＰＤ－１を特異的に認識し、細胞外領域のアミノ酸配列またはその三次元構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得するステップ、ペプチドリンカーの長さが８アミノ残基以下になるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築するステップ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ、および、次いで該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してダイアボディを発現させるステップ。

【0084】

ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬのそれぞれの１つのアミノ酸残基がシステイン残基で置換されたポリペプチドを、それら２つのシステイン残基間のジスルフィド結合を介して連結することによって得られる。システイン残基で置換されるアミノ酸残基は、抗体の三次元構造の予測に基づいて、既知の方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４年））に従って選択することができる。

【0085】

本開示のｄｓＦｖは、以下のステップによって産生され得る：ヒトＰＤ－１を特異的に認識し、細胞外領域のアミノ酸配列またはその三次元構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得するステップ、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築するステップ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ、および、次いで該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してｄｓＦｖを発現させるステップ。

【0086】

ＣＤＲ含有ペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲを含む１つ以上の領域によって構築される。複数のＣＤＲを含有するペプチドは、直接的にまたは適切なペプチドリンカーを介して連結され得る。

【0087】

本開示のＣＤＲ含有ペプチドは、以下のステップによって産生され得る：ヒトＰＤ－１を特異的に認識し、細胞外領域のアミノ酸配列またはその三次元構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築するステップ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ、および、次いで該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してペプチドを発現させるステップ。ＣＤＲ含有ペプチドは、化学合成法、例えばＦｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法によっても産生され得る。

【0088】

「アミノ酸差異」または「アミノ酸変異」という用語は、元のタンパク質またはポリペプチドと比較した、タンパク質またはポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸の変化または変異の存在を指し、元のタンパク質またはポリペプチドに基づいて１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸挿入、欠失または置換を有することを含む。

【0089】

「抗体フレームワーク」または「ＦＲ領域」という用語は、可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のためのスキャフォールドとして機能する、可変ドメインＶＬまたはＶＨの部分を指す。基本的に、それはＣＤＲのない可変ドメインである。

【0090】

「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」または「超可変領域」という用語は、主に抗原結合に寄与する抗体の可変ドメイン内の６つの超可変領域のうちの１つを指す。一般に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）かあり、各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）がある。「Ｋａｂａｔ」番号付け基準（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１年）、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、第５版、アメリカ公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州を参照）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付け基準（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７年）ＪＭＢ ２７３：９２７－９４８頁を参照）およびＩｍｍｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け基準（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ． Ｐ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７、１３２－１３６頁（１９９９年）；Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２７、５５－７７頁（２００３年））などを含む、よく知られたスキームのいずれか１つを使用して、ＣＤＲのアミノ酸配列境界を決定することができる。例えば、古典的なフォーマットの場合、Ｋａｂａｔ基準に従うと、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けは３１－３５（ＨＣＤＲ１）、５０－６５（ＨＣＤＲ２）および９５－１０２（ＨＤＲ３）であり、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けは２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）および８９－９７（ＬＣＤＲ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａ基準に従うと、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基の番号付けは２６－３２（ＨＤＲ１）、５２－５６（ＨＤＲ２）および９５－１０２（ＨＤＲ３）であり、ＶＬのアミノ酸残基の番号付けは２６－３２（ＬＣＤＲ１）、５０－５２（ＬＣＤＲ２）および９１－９６（ＬＣＤＲ３）である。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義の組み合わせによると、ＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６－３５（ＨＣＬ１）、５０－６５（ＨＣＲ２）、および９５－１０２（ＨＤＲ３）と、ヒトＶＬのアミノ酸残基２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）および８９－９７（ＬＣＤＲ３）とからなる。ＩＭＧＴ基準に従うと、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基の番号付けはおよそ２６－３５（ＣＤＲ１）、５１－５７（ＣＤＲ２）および９３－１０２（ＣＤＲ３）であり、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基の番号付けはおよそ２７－３２（ＣＤＲ１）、５０－５２（ＣＤＲ２）および８９－９７（ＣＤＲ３）である。ＩＭＧＴ基準に従って、抗体のＣＤＲ領域は、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎプログラムを使用して決定することができる。

【0091】

「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位（例えば、ＰＤ－Ｌ１分子上の特定の部位）を指す。エピトープは、通常、固有の空間コンホメーション中に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または非連続アミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇ．Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６年）を参照されたい。

【0092】

「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」、「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｉｎｄｓ）」、「選択的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」および「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」という用語は、所定の抗原上のエピトープへの抗体の結合を指す。一般に、抗体は、約１０^－８Ｍ未満、例えば、約１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍもしくは１０^－１１Ｍ未満またはそれ以下の親和性（ＫＤ）で結合する。

【0093】

「ＫＤ」または「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。一般に、本開示の抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用してＢＩＡＣＯＲＥ装置で測定した場合、約１０^－７Ｍ未満、例えば約１０^－８Ｍまたは１０^－９Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）でＰＤ－１に結合する。

【0094】

「競合」という用語が同じエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）との関連において使用される場合、それは抗原結合タンパク質間の競合を指し、以下のアッセイによって決定することができる：当該アッセイでは、試験される抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメント）が、共通抗原（例えば、ＰＤ－１またはそのフラグメント）への参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的結合を防止または阻害する（例えば、低減する）。ある抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合するかどうかを決定するために、多数のタイプの競合結合アッセイを使用することができる。これらのアッセイは、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ， １９８３年， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９： ２４２－２５３頁を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ， １９８６年， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７： ３６１４－３６１９頁）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８年， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）；Ｉ－１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ， １９８８年， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５： ７－１５頁）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９０年， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６： ５４６－５５２頁を参照）；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９０年， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２： ７７－８２頁）である。一般に、アッセイは、試験される非標識抗原結合タンパク質または標識参照抗原結合タンパク質のいずれかを保有する固体表面または細胞に結合した精製抗原を使用することを含む。競合阻害は、試験される抗原結合タンパク質の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を測定することによって測定される。通常、試験されている抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）には、以下のものが含まれる：参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質；および参照抗原結合タンパク質の結合エピトープに十分に近い隣接するエピトープに結合する抗原結合タンパク質（ここで、それら２つのエピトープは互いに立体的に結合を妨げる）。競合的結合を決定するために使用される方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例に提供されている。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、それは、共通抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合を少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％または７５％以上阻害（例えば、低減）する。場合によっては、結合は、少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、または９７％以上阻害される。

【0095】

本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得、好ましくは二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ｍＲＮＡもしくは修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ）である。核酸が別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、その核酸は「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、該プロモーターまたはエンハンサーはそのコード配列に作動可能に連結されている。

【0096】

「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一実施形態では、ベクターは「プラスミド」であり、プラスミドとは、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の実施形態では、ベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得るウイルスベクターである。本明細書に開示されるベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律的に複製することができるか（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）、または宿主細胞に導入された後に宿主細胞のゲノムに組み込まれて、宿主ゲノムと一緒に複製することができる（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）。

【0097】

抗体および抗原結合フラグメントを産生および精製するための方法は、先行技術において周知である。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、第５～８章および第１５章。例えば、マウスをヒトＰＤ－１またはそのフラグメントで免疫化することができ、得られた抗体を再生、精製することができ、アミノ酸配列決定を従来の方法で行うことができる。抗原結合フラグメントも、従来の方法で調製することができる。遺伝子工学的方法を使用することによって、１つ以上のヒトＦＲ領域が、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの非ヒトＣＤＲ領域に付加される。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒから、ＩＭＧＴヒト抗体可変領域生殖細胞系列遺伝子データベースおよびＭＯＥソフトウェアを比較することによって取得され得るか、またはＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ、２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から取得され得る。

【0098】

「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞には、細菌、微生物、植物または動物細胞が含まれ得る。容易に形質転換され得る細菌には、腸内細菌科のメンバー、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはサルモネラ菌株；バチルス科、例えば枯草菌；肺炎球菌；連鎖球菌およびインフルエンザ菌が含まれる。適切な微生物には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。適切な動物宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）およびＮＳ０細胞が含まれる。

【0099】

本開示の操作された抗体または抗原結合フラグメントは、従来の方法によって調製および精製することができる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに組み込むことができる。組換え免疫グロブリン発現ベクターをＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクトすることができる。より推奨される先行技術として、哺乳動物発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端部位において、抗体のグリコシル化をもたらすことができる。安定なクローンは、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体を発現させることによって得られる。陽性クローンをバイオリアクターの無血清培地で増殖させて、抗体を産生する。抗体が分泌された培養培地は、従来の技術により精製することができる。例えば、精製用に調整された緩衝液を含むＡまたはＧセファロースＦＦカラムを使用する。非特異的に結合する成分は洗い流される。次に、結合抗体をｐＨ勾配法で溶出し、抗体フラグメントをＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出して回収する。抗体は、従来の方法によってろ過および濃縮することができる。可溶性混合物およびポリマーは、従来の方法、例えばモレキュラーシーブおよびイオン交換によって除去することもできる。得られた産物は、－７０℃などで直ちに凍結するか、または凍結乾燥する必要がある。

【0100】

「投与する」、「与える」および「処置する」とは、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器または生体液に適用される場合、外因性の薬剤、治療用薬剤、診断用薬剤または組成物と、当該動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器または生体液との接触を指す。「投与する」、「与える」および「処置する」は、例えば、処置、薬物動態、診断、研究および実験方法を指すことができる。細胞の処置（処理）は、試薬と細胞との接触、および試薬と流体との接触を含み、ここで当該流体は細胞と接触している。「投与する」、「与える」および「処置する」はまた、例えば、試薬、診断、結合組成物によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで別の細胞によって、細胞を処置することを指す。「処置する」とは、ヒト、獣医または研究対象に適用される場合、治療的処置、予防または予防的措置（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ）、研究および診断へのアプリケーションを指す。

【0101】

「処置」とは、内部または外部治療用薬剤、例えば本開示の結合化合物のいずれか１つを含む組成物を、該治療用薬剤が治療効果を有することが知られている疾患の１つ以上の症状を有する患者に投与することを指す。一般に、治療用薬剤は、処置された患者または集団における疾患の１つ以上の症状を軽減して、そのような症状の退行を誘発するか、またはそのような症状の発症を任意の臨床的に測定される程度まで抑制するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療用薬剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、さまざまな因子、例えば患者の病状、年齢および体重、ならびに患者において所望の治療効果を生み出す薬物の能力、に応じて変動する可能性がある。疾患症状が軽減されたかどうかは、その症状の重症度または進行を評価するために医師または他の医療従事者によって一般的に使用される任意の臨床試験方法によって評価することができる。本開示の実施形態（例えば、処置方法または製品）は、各標的疾患症状を軽減するのに効果的ではないかもしれないが、スチューデントのｔ検定、カイ２乗検定、マンおよびホイットニー（Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定、クラスカル－ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール－タプストラ（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ）検定およびウィルコクソン検定などの当技術分野で既知の任意の統計的検定によって決定した場合、統計的に有意な数の患者の標的疾患症状を軽減するはずである。

【0102】

「保存的改変」または「保存的置換」とは、タンパク質の生物学的活性を変化させることなく頻繁にその変更を行うことができるように、タンパク質中のアミノ酸を類似の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖コンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸で置換することを指す。当業者は、一般的に言って、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ出版社、２２４頁（第４版）を参照）。さらに、類似の構造または機能を有するアミノ酸の置換が生物学的活性を破壊する可能性は低い。例示的な保存的置換は、以下の表「例示的なアミノ酸保存的置換」に示されている。

【0103】

表３．例示的なアミノ酸保存的置換

【表3】

【0104】

「有効量」または「有効用量」とは、任意の１つ以上の有益なまたは所望の治療結果を得るために必要な薬物、化合物または医薬組成物の量を指す。予防的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、疾患の生化学、組織学および行動症状、その合併症、ならびに疾患の発生過程中に発生する中間の病理学的表現型を含む、リスクの排除または低減、重症度の低減または疾患の発症の遅延が含まれる。治療用途の場合、有益なまたは所望の結果には、臨床結果、例えば、本開示のさまざまな標的抗原関連障害の発生率を低下させることまたは該障害の１つ以上の症状を改善すること、該障害を処置するために必要な他の薬剤（ａｇｅｎｔｓ）の投与量を減少させること、別の薬剤（ａｇｅｎｔ）の効果を増強すること、および／または患者の本開示の標的抗原関連障害の進行を遅らせることが含まれる。

【0105】

「外因性」とは、状況に応じて、生物、細胞または人体の外部で産生される物質を指す。「内因性」とは、状況に応じて、細胞、生物または人体の内部で産生される物質を指す。

【0106】

「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド間の配列類似性を指す。比較される２つの配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各位置がアデニンによって占められている場合、それらの分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性パーセンテージは、２つの配列によって共有される一致したまたは相同な位置の数を、比較した位置の数で割ってから、１００を掛けた（×１００）関数である。例えば、最適な配列アラインメントにおいて、２つの配列中の１０個の位置のうち６個が一致または相同である場合、それらの２つの配列は６０％相同である；２つの配列中の１００個の位置のうち９５個が一致または相同である場合、それらの２つの配列は９５％相同である。一般に、２つの配列がアラインメントされているとき、比較は最大の相同性パーセテージを与えるように行われる。例えば、比較はＢＬＡＳＴアルゴリズムによって行うことができ、当該ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、各参照配列の全長にわたって各配列間の最大の一致を与えるようにアルゴリズムのパラメータが選択される。以下の参考文献は、配列分析によく使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する：ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．，（１９９０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０頁；Ｇｉｓｈ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．，（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２頁；Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．，（１９９６年）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．，（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２頁；Ｚｈａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．，（１９９７年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６頁。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって提供されるような他の従来のＢＬＡＳＴアルゴリズムもまた、当業者によく知られている。

【0107】

本明細書で使用される「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という表現は互換的に使用することができ、そのような名称はすべて子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という用語は、継代数に関係なく、初代試験細胞およびそれに由来する培養物を含む。意図的または非意図的な変異のために、すべての子孫がＤＮＡの内容（ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ）に関して完全に同じであるとは限らないことも理解されるべきである。元の形質転換細胞でスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。別の名称が参照される場合、それは文脈から明確に理解される。

【0108】

本明細書で使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載されるように、核酸、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡの特定部分の微量が増幅される手順または技術を指す。一般的に言えば、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるように、標的領域の末端または外側から配列情報を取得する必要がある；これらのプライマーは、増幅されるテンプレートの対応する鎖と配列が同一または類似である。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅される材料の末端と同一であり得る。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、ファージまたはプラスミド配列などを増幅するために使用され得る。一般的には、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｓｙｍｐ． Ｏｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５１：２６３頁；Ｅｒｌｉｃｈ編（１９８９年）ＰＣＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ出版社、ニューヨーク）を参照されたい。本明細書で使用されるＰＣＲは、核酸試験サンプルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応方法の一例と見なされるが、唯一の例ではなく、当該方法は、プライマーとしての既知の核酸および核酸ポリメラーゼを使用して、核酸の特定の部分を増幅または生成することを含む。

【0109】

「単離された」とは、精製された状態を指し、この場合、指定された分子が他の生体分子（例えば、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物）または他の材料（例えば、細胞残屑および増殖培地）を実質的に含まないことを意味する。一般に、「単離された」という用語は、本明細書に記載の化合物の実験的または治療的使用を著しく妨害する量で存在しない限り、これらの材料が完全に存在しないこと、または水、緩衝液もしくは塩が存在しないことを意味するものではない。

【0110】

「任意の」または「任意に」とは、続いて記載した出来事または状況が発生する可能性があるが、必ずしも発生するとは限らないことを意味し、その記載には、出来事または状況が発生する場合と発生しない場合が含まれる。例えば、「任意に１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在し得るが、存在する必要はないことを意味する。

【0111】

「医薬組成物」とは、本明細書に記載の化合物の１つ以上、またはその生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグと、他の化学成分（例えば、生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤）とを含む混合物を意味する。医薬組成物の目的は、生物への投与を促進することであり、これは、有効成分の吸収を促進し、それによって生物学的活性を発揮する。

【0112】

「薬学的に許容される担体」という用語は、抗体または抗原結合フラグメントの送達のための製剤での使用に適した任意の不活性物質を指す。担体は、接着防止剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、充填剤または希釈剤、防腐剤（抗酸化剤、抗菌剤または抗真菌剤など）、甘味料、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液などであり得る。適切な薬学的に許容される担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロパンジオール、ポリエチレングリコールなど）、デキストロース、植物油（例えば、オリーブ油）、生理食塩水、緩衝液、緩衝生理食塩水（ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、および等張剤（例えば、糖、ポリオール、ソルビトールおよび塩化ナトリウム）が含まれる。

【0113】

さらに、本開示は、標的抗原（例えばＰＤ－１）陽性細胞に関連する疾患を処置するための薬剤であって、本開示の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメントを有効成分として含む、薬剤を含む。

【0114】

本開示におけるＰＤ－１に関連する疾患は、ＰＤ－１に関連する疾患である限り、限定されない。例えば、本開示の分子によって誘導される治療反応は、ヒトＰＤ－１に結合し、次にＰＤ－１ならびにそのリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の結合を阻害すること、またはＰＤ－１を過剰発現する細胞を殺傷することによって達成され得る。したがって、治療用途に適した調製物および製剤において、本開示の分子は、腫瘍または癌、好ましくは黒色腫、結腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎臓癌、非小細胞肺癌、膀胱癌などを有する人々にとって非常に有用である。

【0115】

さらに、本開示は、標的抗原（例えば、ヒトＰＤ－１）を特異的に認識して細胞外領域のアミノ酸配列またはその三次元構造に結合し、有効成分として使用される本開示の抗体または抗体フラグメントを含む、標的抗原（例えばＰＤ－１）の免疫検出または決定のための方法、標的抗原（例えばＰＤ－１）の免疫検出または決定のための試薬、標的抗原（例えばＰＤ－１）を発現する細胞の免疫検出または決定のための方法、および標的抗原（例えばＰＤ－１）陽性細胞に関連する疾患を診断するための診断用薬剤に関する。

【0116】

本開示において、標的抗原（例えばＰＤ－１）の量を検出または測定するために使用される方法は、任意の既知の方法であり得る。例えば、免疫検出または測定方法が挙げられる。

【0117】

免疫検出または測定方法は、標識された抗原または抗体を使用して抗体または抗原の量を検出または測定する方法である。免疫検出または測定方法の例には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発光イムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、物理化学的方法などが含まれる。

【0118】

ＰＤ－１陽性細胞に関連する前述の疾患は、本開示の抗体または抗体フラグメントを使用してＰＤ－１発現細胞を検出または測定することによって診断され得る。

【0119】

ポリペプチドを発現する細胞を検出するために、既知の免疫検出方法が使用され得、好ましくは免疫沈降、蛍光細胞染色、免疫組織化学的染色などが使用される。さらに、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いた蛍光抗体染色法も使用され得る。

【0120】

本開示において、標的抗原（例えばＰＤ－１）の検出または測定に使用されるｉｎ ｖｉｖｏサンプルは、標的抗原（例えばＰＤ－１）を発現する細胞を含む可能性がある限り、特に制限はなく、例えば、組織球、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液または培養液である。

【0121】

必要な診断方法に応じて、本開示のモノクローナル抗体またはその抗体フラグメントを含む診断用薬剤はまた、抗原抗体反応を行うための試薬または当該反応を検出するための試薬を含むことができる。抗原抗体反応を行うために使用される試薬には、緩衝液、塩などが含まれる。検出に使用される試薬には、免疫検出または測定方法で一般的に使用される試薬、例えば、モノクローナル抗体、その抗体フラグメントまたはそのコンジュゲートを認識する標識された二次抗体、および当該標識に対応する基質などが含まれる。

【0122】

＜抗原の調製＞
１．抗原の構築
ヒトＰＤ－１－ＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端にヒトＰＤ－１の細胞外領域の１５０アミノ酸、Ｃ末端にヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメント（ｈＩｇＧ１Ｆｃ）を含むように設計および合成される。高純度の組換えＰＤ－１－Ｆｃタンパク質は、プロテインＡアフィニティーカラムで精製した後に得ることができ、抗原への抗ＰＤ－１抗体の結合を検出するために使用される。

【0123】

ヒトＰＤ－１－ＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号１）：

【化1】

【0124】

注：下線部分はシグナルペプチドであり、通常部分はヒトＰＤ－１の細胞外領域であり、斜体部分はｈＩｇＧ１Ｆｃである（シグナルペプチド＋細胞外領域＋ｈＩｇＧ１Ｆｃ）。

【0125】

ヒトＰＤ－１－ｈｉｓ（配列番号２）：

【化2】

【0126】

細胞にトランスフェクトされた核酸によってコードされるＰＤ－１抗原（配列番号３）：

【化3】

【0127】

＜抗体の調製＞
抗ヒトＰＤ－１抗体は、マウスを免疫化することによって産生することができ、抗ヒトＰＤ－１ファージマウス免疫化ライブラリー（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＰＤ－１ ｐｈａｇｅ ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ）から入手することもできる。

【0128】

マウスを免疫化することによって抗ヒトＰＤ－１抗体を調製する方法は、次のとおりである：

【0129】

１．免疫化：実験用ＳＪＬ白色マウス、雌、６～８週齢、およびＢａｌｂ／ｃ白色マウス、雌、６～８週齢。飼育環境：ＳＰＦレベル。マウスは、購入後、温度２０～２５℃、湿度４０～６０％、１２／１２時間の明／暗サイクルの調整下、実験室環境で１週間飼育された。環境に適応したマウスは、各群に６～１０匹のマウスを使用して、さまざまなプロトコルに従って免疫化された。免疫抗原は、精製された組換えタンパク質ＰＤ－１－ＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号１を参照）、ＰＤ－１－ｈｉｓ（配列番号２を参照）、または抗原としてＰＤ－１をトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ／ＣＨＯ－ＰＤ－１細胞（配列番号３を参照）である可能性がある。異なる免疫アジュバントまたは異なるタイプの免疫原と組み合わせた単一抗原を交差免疫に使用することができる。免疫化部位は、腹腔もしくは背中の皮膚の下であるか、または２つの部位で交互に免疫化を行うことができる。免疫アジュバントＴｉｔｅｒＭａｘ^{（登録商標）}Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（以下、Ｔｉｔｅｒｍａｘと呼ぶ、Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号Ｔ２６８４）およびＩｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ Ａｄｊｕｖａｎｔ（以下、アジュバントと呼ぶ、Ｐｉｅｒｃｅから購入、カタログ番号７７１６１）を交差免疫に使用した。抗原とアジュバント（Ｔｉｔｅｒｍａｘ）の比率は１：１であり、抗原とアジュバント（Ａｌｕｍ）の比率は３：１であり、２５～５０μｇ／動物（最初の免疫化）、５０μｇ／動物（ブースター免疫化）、または１×１０^７Ｊｕｒｋａｔ／ＣＨＯ－ＰＤ－１細胞／動物であった。０日目に２５～５０μｇ／動物の乳化抗原（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）を腹腔内注射し、最初の免疫化後、週に１回または２週間に１回、ＴｉｔｅｒｍａｘとＡｌｕｍを交互に合計５～８回使用した。

【0130】

２．細胞融合：脾臓細胞融合のために、血清中の抗体価が高いマウスを選択した。スプリント免疫化（ｓｐｒｉｎｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）の７２時間後にマウスの眼から出血させた。首を引っ張ってマウスを犠牲にし、消毒のために７５％エタノールに入れた。脾臓リンパ球を骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞（中国科学院）に融合させ、最適化されたＰＥＧを介した融合手順を適用してハイブリドーマ細胞を得た。融合したハイブリドーマ細胞をＨＡＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴおよび１×ＯＰＩを含むＲＰＭＩ－１６４０培地）に再懸濁し、９６ウェル細胞培養プレート（１×１０^５／１５０μｌ／ウェル）に分注し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、合計で約１０～３０枚のプレートに播種した。融合後５日目に、ＨＡＴ完全培地を５０μｌ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。融合後７日目から８日目まで、細胞増殖密度に応じて、培地を２００μｌ／ウェルで完全に交換し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。

【0131】

３．ハイブリドーマ細胞スクリーニング：融合後７～９日目に、細胞増殖密度に応じて、ＰＤ－１への抗体の結合を検出するためにＥＬＩＳＡ法を実施し、ＰＤ－１／ＰＤＬ１結合の遮断を検出するために陽性ウェルの細胞をＥＬＩＳＡでさらに検出した。陽性ウェルの培地を交換し、細胞密度に応じて細胞を２４ウェルプレートに時間内に増殖させた。２４ウェルプレートに移した細胞株を再試験した後、保存して、初めてサブクローン化した。最初のサブクローニングスクリーニングで陽性となったものは保存され、単一細胞クローンが得られるまで２回目または３回目のサブクローニングが実施された。ＰＤ－１とＰＤＬ１の結合を遮断する効果を有するハイブリドーマ細胞は、複数の融合によって得られた。

【0132】

抗ヒトＰＤ－１ファージマウス免疫ライブラリーを介して抗ヒトＰＤ－１抗体を得る方法は、以下のとおりである：

【0133】

１．抗ヒトＰＤ－１ファージマウス免疫ライブラリーの構築：血清中の抗体価が高いマウスの脾臓を選択し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６－０１８）を使用して組織のトータルＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^（商標）ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６２１０Ａ）を逆転写に使用してｃＤＮＡを得た。ライブラリーを構築するためのプライマーは、ＩＭＧＴデータベースに従って設計および合成された。一本鎖抗体フラグメントは、３ラウンドのＰＣＲ反応によって得られた。一本鎖抗体フラグメントと改変ライブラリー構築ベクターｐＣａｎｔａｂ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＧＥ、カタログ番号２７－９４００－０１）をＳｆｉ１（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ０１２３Ｌ）で消化し、電気泳動後にＥ． Ｚ． Ｎ． Ａ．（登録商標）ゲル抽出キット（Ｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｄ２５００－０２）で精製および回収した。次に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）を使用して１６℃で１６～１８時間ライゲーションし、上記のキットを使用して精製および回収を行い、最後に脱イオン水で溶出した。１μｇのライゲーション産物を採取し、エレクトロポレーション用のコンピテントＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２－２）の１バイアルと混合し、エレクトロポレーター（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒ）を使用して、パラメータを２．５ｋＶ，２００Ωおよび２５ｕＦに設定してエレクトロポレーションを行った。トランスフォーメーションを１０回繰り返した。産物をプレート上に広げ、３７℃で１６～１８時間上下逆さまに培養した。次に、すべてのコロニーを分離して混合し、最終濃度１５％のグリセリンを添加し、使用するために－８０℃で保存した。

【0134】

２．抗ヒトＰＤ－１ファージマウス免疫ライブラリーのスクリーニング：パッケージ化された抗ヒトＰＤ－１ファージ免疫ライブラリー（１×１０^１２～１×１０^１３）と１００μｌのストレプトマイシンマイクロビーズ（Ｍｉｌｅｎｖｉ Ｂｉｏｔｅｃ、オーバーン、カリフォルニア州）を、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）を含む１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水に加え、室温で１時間インキュベートし、磁気スタンド上に置き、上清を回収した。１０μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＰＤ－１－ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）を上清に加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ１００μｌ（１ｍｌのＭＰＢＳでプレインキュベートされた）を加え、室温で１時間インキュベートした。そして、これを選別用の磁気スタンドシステムにロードし、上清を吸引した。１ｍｌのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン緩衝液）を加え、数回反転させた。完全に吸引した後に新しい洗浄溶液を加え、これを１１回繰り返して未結合の抗体フラグメントを除去し、０．５ｍｌの溶出溶液（４５０μｌのＰＢＳに５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌトリプシンストック溶液を加えたもの）を加えた。これを室温で１５分間振とうし、磁気スタンド上に置き、上清を新しいＥＰチューブに吸引した。ＴＧ１を２ＹＴ培地に播種し、培養菌密度ＯＤ６００＝０．４になるまで増殖させた。１．７５ｍｌのＴＧ１（ＯＤ６００＝０．４）を各チューブに加え、２５０μｌの溶出ファージ（ファージ）を加え、３７℃の水浴で３０分間インキュベートし、力価を試験するために勾配希釈してプレート上に広げた。残りのＴＧ１溶液を遠心分離し、プレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。

【0135】

ファージマウス免疫ライブラリーは、ＭＡＣＳスクリーニング（ストレプトマイシン磁気ビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にビオチン化ヒトＰＤ－１－ＥＣＤ－ｈｉｓ抗原を使用して２～３ラウンドスクリーニングされ、ＰＤ－１に結合でき且つＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断できるモノクローナル抗体が最終的に得られ、シーケンシングによって検証された。抗体の可変領域配列が得られた。

【0136】

＜組換え抗原タンパク質／抗体の精製＞
１．ハイブリドーマ上清／プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーの分離および精製：
マウスハイブリドーマ上清の精製には、アフィニティークロマトグラフィー用のプロテインＧが最初の選択肢であった。培養したハイブリドーマを遠心分離して上清を回収し、上清の体積に応じて１０～１５％の量の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０～８．５）を添加して、上清のｐＨを調整した。プロテインＧカラムについては、６Ｍ塩酸グアニジンを使用してカラム体積の３～５倍洗浄した後、純水を使用してカラム体積の３～５倍を洗浄した；平衡化緩衝液として１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）などの緩衝液系を使用して、カラム体積の３～５倍でカラムを平衡化した；保持時間が約１分以上になるように制御された低流速を使用して、細胞上清をロードおよび結合させた；１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して、ＵＶ吸収がベースラインに低下するまで、クロマトグラフィーカラムをカラム体積の３～５倍洗浄した；サンプル溶出には０．１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）緩衝液を使用し、ＵＶ検出に従って溶出ピークを収集し、一時保存のために１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用して溶出生成物のｐＨを５～６に素早く調整した。溶出生成物については、限外ろ過および濃縮用の限外ろ過チューブを使用して、溶液を必要な緩衝液系に交換する、またはＧ－２５などの分子排除を使用して脱塩し、必要な緩衝液系に交換する、またはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００などの高分解能分子排除カラムを使用して、溶出生成物中の凝集した成分を除去し、サンプルの純度を向上させるなどの、当業者に周知の方法によって溶液交換が実施され得る。

【0137】

２．タンパク質または抗体のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製：
まず、抗原タンパク質または抗体を発現している細胞培養物の上清を高速で遠心分離して、上清を回収した。プロテインＡアフィニティーカラムについては、６Ｍ塩酸グアニジンを使用してカラム体積の３～５倍洗浄した後、純水を使用してカラム体積の３～５倍を洗浄した。平衡緩衝液として１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）などの緩衝液系を使用して、カラム体積の３～５倍でクロマトグラフィーカラムを平衡化した。保持時間が約１分以上になるように制御された低流速を使用して、細胞上清をロードおよび結合させた。結合が完了した後、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して、ＵＶ吸収がベースラインに低下するまで、クロマトグラフィーカラムをカラム体積の３～５倍洗浄した。サンプル溶出には０．１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０～３．５）緩衝液を使用し、ＵＶ検出に従って溶出ピークを収集し、一時保存のために１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用して溶出生成物のｐＨを５～６に素早く調整した。溶出生成物については、限外ろ過および濃縮用の限外ろ過チューブを使用して、溶液を必要な緩衝液系に交換する、またはＧ－２５などの分子排除を使用して脱塩し、必要な緩衝液系に交換する、またはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００などの高分解能分子排除カラムを使用して、溶出生成物中の凝集した成分を除去し、サンプルの純度を向上させるなどの、当業者に周知の方法によって溶液交換が実施され得る。

【実施例】

【0138】

本開示は実施例と組み合わせて以下にさらに記載されるが、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものではない。本開示の実施例において条件が具体的に示されていない実験方法は、通常、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒなどの従来の条件に従うか、または原材料または製品の製造業者によって推奨される条件に従う。出所が具体的に示されていない試薬は、市販の従来の試薬である。

【0139】

（実施例１）抗ヒトＰＤ－１マウス抗体の取得
前述の方法で得られた抗ヒトＰＤ－１マウス抗体を抗原結合実験に供し、スクリーニングして、良好な活性を有する抗体の複数の株を得た：その中に、Ｍ２３、Ｍ３２およびＭ３３が含まれていた。単一細胞クローンを増殖および培養し、ＲＮＡを抽出し、マウス－Ｉｇの縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ）を使用して逆転写増幅（ＲＴ－ＰＣＲ）を行い、抗体の可変領域配列を得た。マウス抗体の可変領域配列をヒト抗体の定常領域配列に連結した。マウスモノクローナル抗体のキメラ抗体をクローニングし、組換え発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性実験を行って、得られたモノクローナル抗体の可変領域配列が正しいことを確認した。

【0140】

マウス抗体Ｍ２３、Ｍ３２およびＭ３３の可変領域配列は、以下のように決定される：

【0141】

マウス抗体Ｍ２３の重鎖可変領域（配列番号４）：

【化4】

【0142】

マウス抗体Ｍ２３の軽鎖可変領域（配列番号５）：

【化5】

【0143】

マウス抗体Ｍ３２の重鎖可変領域（配列番号６）：

【化6】

【0144】

マウス抗体Ｍ３２の軽鎖可変領域（配列番号７）：

【化7】

【0145】

マウス抗体Ｍ３３の重鎖可変領域（配列番号１９）：

【化8】

【0146】

マウス抗体Ｍ３３の軽鎖可変領域（配列番号２０）：

【化9】

【0147】

注：上記の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列において、下線が引かれているのは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定されたＣＤＲ配列であり、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序である。

【0148】

表４．マウス抗体Ｍ２３、Ｍ３２およびＭ３３の重鎖および軽鎖ＣＤＲ領域配列

【表4】

【0149】

注：表中の抗体ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って決定されている。

【0150】

（実施例２）抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体のヒト化
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子データベースに対してアラインメントすることおよびＭＯＥソフトウェア分析によって、Ｍ２３、Ｍ３２およびＭ３３軽鎖および重鎖配列と高い同一性を有するヒト生殖細胞系列重鎖および軽鎖可変領域の生殖細胞系列遺伝子が、テンプレートとして選択された。これら３つのマウス抗体のＣＤＲを対応するヒト抗体テンプレートに移植して、それぞれ対応するヒト化抗体を構築した。

【0151】

１．マウス抗体Ｍ２３のヒト化
１．１ マウス抗体Ｍ２３のヒト化フレームワークの選択
マウス抗体Ｍ２３のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ２－４０＊０１およびＩＧＫＪ４＊０１であり、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ１－６９＊０２およびＩＧＨＪ６＊０１である。ヒト化後の可変領域の配列は、次のとおりである（下線はＣＤＲ配列である）：

【0152】

Ｈｕ２３ＶＨ－ＣＤＲ移植：（配列番号２７）

【化10】

Ｈｕ２３ＶＬ－ＣＤＲ移植：（配列番号２８）

【化11】

【0153】

１．２ マウス抗体Ｍ２３のヒト化テンプレート選択および復帰変異設計

【0154】

表５．マウス抗体Ｍ２３ヒト化抗体の復帰変異

【表5】

【0155】

注：移植（Ｇｒａｆｔｅｄ）とは、マウス抗体ＣＤＲがヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列に移植されることを意味する。アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定および注釈される。例えば、Ｉ２Ｇは、Ｋａｂａｔ番号付けの位置２のＩがＫａｂａｔ番号付けシステムに従ってＧに戻される（ｍｕｔａｔｅｄ ｂａｃｋ ｔｏ Ｇ）ことを意味する。

【0156】

Ｍ２３のヒト化抗体の軽鎖／重鎖可変領域配列は、次のとおりである：

【化12】

【0157】

１．３ マウス抗体Ｍ２３のヒト化配列の組み合わせ
マウス抗体Ｍ２３のヒト化により得られた抗体およびその可変領域の組み合わせを以下の表に示す。

【0158】

表６．ヒト化Ｈｕ２３抗体可変領域の組み合わせ

【表6】

【0159】

注：例えば、「Ｈｕ２３－１」は、軽鎖可変領域がＨｕ２３ＶＬ１であり、重鎖可変領域がＨｕ２３ＶＨ１である抗体を指し、以下同様である。

【0160】

上記の表において参照される抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ２３－１）は、抗体の軽鎖／重鎖定常領域とそれぞれ連結され、全長抗体を形成することができる；本開示において別段の定めがない限り、全長抗体を形成するとき、軽鎖可変領域は、配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域に連結されて抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は、配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域または配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域に連結されて抗体重鎖を形成し、抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ２３－１）＋接尾語「．ＩｇＧ４ＡＡ」を参照する表中の名称は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味し、＋接尾語「．ＩｇＧ４Ｐ」は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味する。例えば、「Ｈｕ２３－１．ＩｇＧ４ＡＡ」とは、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。「Ｈｕ２３－１．ＩｇＧ４Ｐ」とは、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。

【0161】

２．マウス抗体Ｍ３２のヒト化
２．１ マウス抗体Ｍ３２のヒト化フレームワークの選択
マウス抗体Ｍ３２のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ２－４０＊０１およびＩＧＫＪ４＊０１であり、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ１－６９＊０２およびＩＧＨＪ６＊０１である。ヒト化可変領域の配列は、次のとおりである（下線はＣＤＲ配列である）：

【化13】

【0162】

２．２ マウス抗体Ｍ３２のヒト化テンプレート選択および復帰変異設計

【0163】

表７．マウス抗体Ｍ３２ヒト化抗体の復帰変異

【表7】

【0164】

注：移植（Ｇｒａｆｔｅｄ）とは、マウス抗体ＣＤＲがヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列に移植されることを意味する。アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定および注釈される。例えば、Ｉ２Ｖは、Ｋａｂａｔ番号付けの位置２のＩがＫａｂａｔ番号付けシステムに従ってＶに戻される（ｍｕｔａｔｅｄ ｂａｃｋ ｔｏ Ｖ）ことを意味する。

【0165】

マウス抗体Ｍ３２のヒト化抗体の軽鎖／重鎖可変領域配列は、次のとおりである：

【化14】

【0166】

２．３ マウス抗体Ｍ３２のヒト化配列の組み合わせ
マウス抗体Ｍ３２のヒト化により得られた抗体およびその可変領域の組み合わせ。

【0167】

表８．ヒト化抗体Ｈｕ３２の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ

【表8】

【0168】

注：表中、例えば、「Ｈｕ３２－１」は、Ｈｕ３２ＶＬ１の抗体軽鎖可変領域とＨｕ３２ＶＨ１の重鎖可変領域との組み合わせを有する抗体を指し、以下同様である。

【0169】

上記の表において参照される抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ３２－１）は、抗体の軽鎖／重鎖定常領域とそれぞれ連結され、全長抗体を形成することができる；本開示において別段の定めがない限り、全長抗体を形成するとき、軽鎖可変領域は、配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域に連結されて抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は、配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域または配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域に連結されて抗体重鎖を形成し、抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ３２－１）＋接尾語「．ＩｇＧ４ＡＡ」を参照する表中の名称は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味し、＋接尾語「．ＩｇＧ４Ｐ」は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味する。例えば、「Ｈｕ３２－１．ＩｇＧ４ＡＡ」とは、Ｈｕ３２ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ３２ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。「Ｈｕ３２－１．ＩｇＧ４Ｐ」とは、Ｈｕ３２ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ３２ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。

【0170】

３．マウス抗体Ｍ３３のヒト化
３．１ マウス抗体Ｍ３３のヒト化フレームワークの選択
マウス抗体Ｍ３３のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ１－３９＊０１およびＩＧＫＪ４＊０１であり、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ３－７およびＩＧＨＪ６＊０１である。ヒト化可変領域の配列は、次のとおりである（下線はＣＤＲ配列である）：

【化15】

【0171】

３．２ マウス抗体Ｍ３３のヒト化テンプレート選択および復帰変異設計

【0172】

表９．マウス抗体Ｍ３３ヒト化抗体の復帰変異

【表9】

【0173】

注：移植（Ｇｒａｆｔｅｄ）とは、マウス抗体ＣＤＲがヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列に移植されることを意味する。アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定および注釈される。例えば、Ｆ７１Ｙは、Ｋａｂａｔ番号付けの位置７１のＦがＫａｂａｔ番号付けシステムに従ってＹに戻される（ｍｕｔａｔｅｄ ｂａｃｋ ｔｏ Ｙ）ことを意味する。

【0174】

マウス抗体Ｍ３３のヒト化抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の配列は、次のとおりである：

【化16】

【0175】

３．３ マウス抗体Ｍ３３のヒト化配列の組み合わせ

【0176】

表１０．ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域の組み合わせ

【表10】

【0177】

注：表中、例えば、「Ｈｕ３３－６」は、Ｈｕ３３ＶＬ２の抗体軽鎖可変領域とＨｕ３３ＶＨ３の重鎖可変領域との組み合わせを有する抗体を指し、以下同様である。

【0178】

上記の表において参照される抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ３３－６）は、抗体の軽鎖／重鎖定常領域とそれぞれ連結され、全長抗体を形成することができる；本開示において別段の定めがない限り、全長抗体を形成するとき、軽鎖可変領域は、配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域に連結されて抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は、配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域または配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域に連結されて抗体重鎖を形成し、抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ３３－６）＋接尾語「．ＩｇＧ４ＡＡ」を参照する表中の名称は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味し、＋接尾語「．ＩｇＧ４Ｐ」は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味する。例えば、「Ｈｕ３２－６．ＩｇＧ４ＡＡ」とは、Ｈｕ３３ＶＨ３重鎖可変領域と配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ３３ＶＬ２軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。「Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４Ｐ」とは、Ｈｕ３３ＶＨ３重鎖可変領域と配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ３３ＶＬ２軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。

【0179】

４．ヒト化抗体の変異体
４．１ Ｈｕ２３ヒト化抗体の変異抗体
コンピューターシミュレーションにより、Ｈｕ２３ヒト化抗体の軽鎖ＬＣＤＲ１（配列番号１１）の特定の部位のアミノ酸を部位特異的変異に供し、その特定の変異を表１１に示す。

【0180】

表１１．Ｈｕ２３軽鎖ＬＣＤＲ１の変異配列：

【表11】

【0181】

注：Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｎ２８Ｑ）は、Ｈｕ２３ヒト化抗体軽鎖可変領域Ｈｕ２３ＶＬ１またはＨｕ２３ＶＬ２のＫａｂａｔ番号付け基準による位置２８のＮがＱに変異しているＬＣＤＲ１変異配列を意味し、Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｇ２９Ａ）は、Ｈｕ２３ヒト化抗体軽鎖可変領域Ｈｕ２３ＶＬ１またはＨｕ２３ＶＬ２のＫａｂａｔ番号付け基準による位置２９のＧがＡに変異しているＬＣＤＲ１変異配列を意味する（ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定される）。

【0182】

ＬＣＤＲ１変異後のＨｕ２３ヒト化抗体軽鎖可変領域の配列は、次のとおりである：

【化17-1】

【化17-2】

【0183】

表１２．Ｈｕ２３ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域の組み合わせ

【表12-1】

【表12-2】

【0184】

注：表中、例えば、「Ｈｕ２３－１１」は、Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｔ）の抗体軽鎖可変領域とＨｕ２３ＶＨ１の重鎖可変領域との組み合わせを有する抗体を指し、以下同様である。

【0185】

上記の表において参照される抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ２３－１１）は、抗体の軽鎖／重鎖定常領域とそれぞれ連結され、全長抗体を形成することができる；本開示において別段の定めがない限り、全長抗体を形成するとき、軽鎖可変領域は、配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域に連結されて抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は、配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域または配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域に連結されて抗体重鎖を形成し、抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ２３－１１）＋接尾語「．ＩｇＧ４ＡＡ」を参照する表中の名称は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味し、＋接尾語「．ＩｇＧ４Ｐ」は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味する。例えば、「Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ」とは、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｔ）軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。「Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４Ｐ」とは、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｔ）軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。

【0186】

実験結果は、部位変異後、ヒト化抗体Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｎ２８Ｑ）、Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｎ２８Ｌ）、Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｎ２８Ｔ）、Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｎ２８Ｄ）、Ｈｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｇ２９Ａ）およびＨｕ２３ＬＣＤＲ１（Ｇ２９Ｖ）がいずれもＰＤ－１に結合する能力を維持することを示した（表１６）。

【0187】

４．２ Ｈｕ３２ヒト化抗体の変異抗体
Ｍ２３に由来する一連のヒト化抗体Ｈｕ２３およびＭ３２に由来する一連のヒト化抗体Ｈｕ３２は、配列分析によって高い配列同一性を有していた。Ｈｕ２３軽鎖可変領域およびＨｕ３２重鎖可変領域は、新しい軽鎖および重鎖可変領域の組み合わせに組み合わされた。実験結果は、新しい軽鎖および重鎖可変領域の組み合わせを含むヒト化抗体が、ＰＤ－１抗原に結合する能力を維持することを示した（表１６）。

【0188】

表１３．Ｈｕ３２およびＨｕ２３抗体可変領域コンセンサス配列の一般式

【表13】

【0189】

表１４．Ｈｕ３２重鎖可変領域とＨｕ２３軽鎖可変領域の組み合わせ

【表14】

【0190】

注：表中、例えば、「Ｈｕ３２ａ－８５」は、Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｔ）の抗体軽鎖可変領域およびＨｕ３２ＶＨ６の重鎖可変領域を有する抗体を指し、以下同様である。

【0191】

上記の表において参照される抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ３２ａ－８５）は、抗体の軽鎖／重鎖定常領域とそれぞれ連結され、全長抗体を形成することができる；本開示において別段の定めがない限り、全長抗体を形成するとき、軽鎖可変領域は、配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域に連結されて抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は、配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域または配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域に連結されて抗体重鎖を形成し、抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ３２ａ－８５）＋接尾語「．ＩｇＧ４ＡＡ」を参照する表中の名称は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味し、＋接尾語「．ＩｇＧ４Ｐ」は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味する。例えば、「Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡ」とは、Ｈｕ３２ＶＨ６重鎖可変領域と配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｔ）軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。「Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４Ｐ」とは、Ｈｕ３２ＶＨ６重鎖可変領域と配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ２３ＶＬ１（Ｎ２８Ｔ）軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。

【0192】

表１５．Ｈｕ２３重鎖可変領域とＨｕ３２軽鎖可変領域の組み合わせ

【表15】

【0193】

注：表中、例えば、「Ｈｕ２３ａ－５７」は、Ｈｕ３２ＶＬ１の抗体軽鎖可変領域とＨｕ２３ＶＨ１の重鎖可変領域との組み合わせを有する抗体を指し、以下同様である。

【0194】

上記の表において参照される抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ２３ａ－５７）は、抗体の軽鎖／重鎖定常領域とそれぞれ連結され、全長抗体を形成することができる；本開示において別段の定めがない限り、全長抗体を形成するとき、軽鎖可変領域は、配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域に連結されて抗体軽鎖を形成し、重鎖可変領域は、配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域または配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域に連結されて抗体重鎖を形成し、抗体の軽鎖／重鎖可変領域の組み合わせ（例えば、Ｈｕ３２ａ－８５）＋接尾語「．ＩｇＧ４ＡＡ」を参照する表中の名称は、ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味し、＋接尾語「．ＩｇＧ４Ｐ」は、ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とのライゲーションによって形成された全長抗体を意味する。例えば、「Ｈｕ２３ａ－５７．ＩｇＧ４ＡＡ」とは、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７２に示されるＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ３２ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。「Ｈｕ２３ａ－５７．ＩｇＧ４Ｐ」とは、Ｈｕ２３ＶＨ１重鎖可変領域と配列番号７９に示されるＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域とを連結して形成される重鎖と、Ｈｕ３２ＶＬ１軽鎖可変領域と配列番号７３に示されるカッパ鎖定常領域とを連結して形成される軽鎖とを連結することによって形成される全長抗体を意味する。

【0195】

５．ヒト化抗体のスクリーニング
さまざまなヒト化抗体の親和性検出をＢｉａｃｏｒｅによって行い（方法については試験例３を参照）、その結果を表１６に示した。結果は、さまざまなヒト化抗体がＰＤ－１に結合する能力を維持し、いくつかのヒト化抗体はそのマウス抗体の親和性にさえ実質的に近い親和性を有することを示した。

【0196】

表１６．ヒトＰＤ－１に対するＨｕ２３ヒト化抗体の親和性

【表16】

【0197】

（実施例３）ＰＤ－１ヒト化抗体の構築および発現
各ヒト化抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントは、ＰＣＲを介して設計されたプライマーを用いて構築され、次に発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを含む）との相同組換えにより全長抗体発現ベクターＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＨｒを構築するために使用された。ＩｇＧ４－Ｐは、Ｓ２２８Ｐ（配列番号７２または配列番号７９の位置１０８に対応する）変異を表し、ＩｇＧ４－ＡＡは、Ｆ２３４Ａ（配列番号７２または配列番号７９の配列の位置１１４に対応する）、Ｌ２３５Ａ（配列番号７２または配列番号７９の位置１１５に対応する）およびＳ２２８Ｐ（配列番号７２または配列番号７９の位置１０８に対応する）変異を表す。ＩｇＧ４－ＡＡおよびＩｇＧ４－Ｐ抗体フォーマットは、ＩｇＧ４抗体フォーマットにおける単純な点変異によって得ることができる。

【0198】

ＩｇＧ４－ＡＡ重鎖定常領域の配列は、以下のとおりである（配列番号７２）：

【化18】

【0199】

抗体軽鎖（カッパ鎖）定常領域の配列は、以下のとおりである（配列番号７３）：

【化19】

【0200】

構築されたＩｇＧ４ＡＡ形式の全長抗体の配列は、以下のように例示される：

【化20-1】

【化20-2】

【0201】

ＩｇＧ４－Ｐ重鎖定常領域の配列は、以下のとおりである（配列番号７９）：

【化21】

【0202】

構築されたＩｇＧ４－Ｐフォームの全長抗体の配列は、以下のように例示される：

【化22-1】

【化22-2】

【試験例】

【0203】

（試験例１）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＤ－１リガンドへの抗ＰＤ－１抗体の結合および結合遮断のＥＬＩＳＡ実験
腫瘍細胞表面のＰＤ－Ｌ１はＴ細胞表面のＰＤ－１に結合し、それによってＴ細胞の増殖を抑制する。ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１に結合することによってＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル伝達経路を遮断することができ、それによってＴ細胞の増殖を刺激する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合遮断実験を使用して、シグナル伝達経路に対する抗ＰＤ－１抗体の遮断活性を検出した。

【0204】

この実験では、ＰＤ－１－Ｈｉｓタンパク質（カタログ番号１０３７７Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を９６ウェルプレートにコーティングした後、試験する抗ＰＤ－１抗体（抗体：Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡおよびＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ、ポジティブコントロール抗体：Ｈ００５－１（ＷＯ２０１５０８５８４７のＨ００５－１抗体を参照）を含む）を別々に加え、反応をインキュベートした；その後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（カタログ番号１０９－０３５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の結合量を検出し、リガンドＰＤ－１への抗ＰＤ－１抗体の結合のＥＣ_５０値を算出した。

【0205】

この実験では、細胞外領域でＦｃと融合したＰＤ－１タンパク質（ＰＤ－１－Ｆｃ、配列については配列番号１を参照）を９６ウェルプレートにコーティングした後、試験する抗ＰＤ－１抗体（抗体：Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡおよびＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ、ポジティブコントロール抗体：Ｈ００５－１（ＷＯ２０１５０８５８４７のＨ００５－１抗体を参照）を含む）を別々に加えてインキュベートした；その後、ビオチン標識ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２を加え、インキュベートした。プレートを洗浄した後、ビオチン標識ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２の結合量を検出し、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２へのリガンドの結合を遮断する抗ＰＤ－１抗体のＩＣ_５０値を算出した。

【0206】

ｐＨ９．６のＣＢ緩衝液（１Ｌの蒸留水に１．５９ｇのＮａ_２ＣＯ_３と２．９３ｇのＮａＨＣＯ_３を溶解したもの）を使用してＰＤ－１－Ｆｃを１μｇ／ｍｌに希釈し、これを９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルの容量で添加し、４℃で１６時間～２０時間静置した。ＰＢＳ緩衝液を９６ウェルプレートから吸引し、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）緩衝液で１回洗浄した。１２０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ／１％ミルクを加え、ブロッキングのために室温で１時間インキュベートした。ブロッキング溶液を取り除き、ＰＢＳＴ緩衝液で１回洗浄した。サンプル希釈液（５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）で適切な濃度に希釈した試験対象の抗ＰＤ－１抗体９０μｌを加え、４℃で１時間プレインキュベートした。１０倍濃度のビオチン標識ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ株式会社）（１０μｇ／ｍｌ）を１０μｌ／ウェルの容量で加え、シェーカーで十分に振とうおよび混合し、３７℃で１時間インキュベートした。反応系を取り除き、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。ＰＢＳＴ緩衝液で希釈した１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン－ペルオキシダーゼポリマー１：４００を添加し、室温で５０分間振とうしながらインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＴＭＢを添加し、室温で５～１０分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度値を読み取り、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２へのリガンドの結合を遮断する抗ＰＤ－１抗体のＩＣ_５０値を算出した。データを以下の表１７に詳細に示す。

【0207】

表１７．ＰＤ－１に結合し、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２へのリガンドの結合を遮断する本開示の抗ＰＤ－１抗体のＥＬＩＳＡ

【表17】

【0208】

本開示の例示的な抗ＰＤ－１抗体Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡおよびＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡはいずれも、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２へのＰＤ－１の結合を効果的に遮断することができ、それらの遮断活性は、ポジティブコントロール抗体の遮断活性と類似している。

【0209】

（試験例２）例示的な抗体のリガンド遮断試験
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合に対する抗体の遮断効果を検討した。実験プロセスを以下に簡単に説明する：

【0210】

ＣＨＯＫ１／ＰＤ－Ｌ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を消化し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに入れて２４時間インキュベートした。コントロールおよびサンプルは、ＰＢＳを使用して所望の濃度に希釈された。Ｊｕｒｋａｔ／ＰＤ－１細胞（ＰＤ－１で安定的にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞）をカウントし、ＣＨＯＫ１／ＰＤ－Ｌ１細胞を含む細胞培養プレートに一定の割合（９０μｌ／ウェル）で播種し、１０μｌ／ウェルの希釈抗体（抗体：Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡおよびＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ、ポジティブコントロール抗体：Ｈ００５－１、ネガティブコントロール：ＩｇＧ４タンパク質、抗体勾配希釈濃度：０．３ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ）を添加して、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに入れて５時間インキュベートした。細胞培養プレートを取り出し、室温で５分間置いた。次に、５０μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏ^（商標）試薬を各ウェルに添加し、プレートを読み取る前に室温で５分間インキュベートした。実験結果を図１に示す。

【0211】

結果は、本開示における例示的な抗ＰＤ－１抗体Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡおよびＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡが、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を効果的に遮断できることを示した。

【0212】

（試験例３）例示的な抗体のＢＩＡｃｏｒｅ抗体親和性実験
ＩｇＧは、プロテインＡバイオセンサーチップ（カタログ番号２９１２７５５６、ＧＥ）を使用してアフィニティーキャプチャーされた。ヒトＰＤ－１抗原（カタログ番号１０３７７Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）およびＣｙｎｏ ＰＤ－１抗原（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）がチップの表面を横切って流れ、結合および解離曲線が、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置によるＰＤ－１抗体および抗原ＰＤ－１反応シグナルのリアルタイム検出によって得られた。各実験サイクルの解離が完了した後、バイオセンサーチップを洗浄し、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）緩衝液で再生した。実験用緩衝液系は１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝溶液（カタログ番号ＢＲ－１００１－８８、ＧＥ）であった。実験後、ＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．０ソフトウェアを使用して、データを（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに適合させ、親和性値を取得した。結果を表１８に示す。

【0213】

表１８．ヒトＰＤ１およびサルＰＤ－１に対する抗ＰＤ－１抗体の親和性

【表18】

【0214】

結果は、本開示の例示的な抗ＰＤ－１抗体Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡおよびＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡはいずれも、ヒトＰＤ－１およびサルＰＤ－１に結合できることを示した。

【0215】

（試験例４）ＰＢＭＣ－Ｔリンパ球活性化実験における細胞によるＩＦＮγ分泌に対する抗体の効果
ヒト初代Ｔリンパ球の機能に対する抗ＰＤ－１抗体の効果を検討するために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集および精製し、ツベルクリン（ＴＢ）で５日間刺激し、サイトカインＩＦＮγの分泌レベルを検出した。実験プロセスを以下に簡単に説明する：

【0216】

ＰＢＭＣは密度勾配遠心分離用のＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（１７－５４４２－０２、ＧＥ）を使用して新鮮な血液から得られ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３７℃および５％ＣＯ_２で１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（１００９９－１４１、Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（ＳＨ３０８０９．０１、ＧＥ）培地で培養された。

【0217】

新たに単離および精製されたＰＢＭＣをＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０^６細胞／ｍｌの密度に調整した。４０μｌのツベルクリン（９７－８８００、Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ）を２０ｍＬの細胞懸濁液に加え、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで５日間培養した。５日目に、上記の培養細胞を遠心分離によって収集し、新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、１．１×１０^６細胞／ｍｌの密度に調整し、９６ウェル細胞培養プレートに９０μｌ／ウェルで播種した。同時に、ＰＢＳ（Ｂ３２０、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＢａｓａｌＭｅｄｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社）で勾配希釈した抗体サンプル（本開示の抗体：Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡおよびＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ、ポジティブコントロール抗体Ｈ００５－１、ならびにネガティブコントロールＩｇＧ４タンパク質を含む、抗体勾配希釈濃度０．３ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌおよび３０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ／ウェルで添加した。細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに入れ、３日間インキュベーションした。細胞培養プレートを取り出し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）によって細胞培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡ法（ヒトＩＦＮ－γ検出キット（ＥＨＣ１０２ｇ．９６、Ｎｅｏｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を使用してＩＦＮ－γレベルを検出した。具体的な操作については、試薬の説明書を参照した。

【0218】

試験結果を図２に示す。結果は、本開示の抗ＰＤ－１抗体Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡおよびＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡがいずれも、ＩＦＮ－γ分泌を効果的に活性化できることを示した。

【0219】

（試験例５）トランスジェニックＰＤ－１マウスにおける結腸癌モデルＭＣ３８に対する抗ＰＤ－１抗体の効果
ＭＣ３８細胞を５×１０^５細胞／マウス／１００μｌで９０匹のｈＰＤ－１ ＴＧマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）の右肋骨の皮下に接種した。１０日後、腫瘍が大きすぎるか小さすぎる動物は除外された。約１２０ｍｍの^３の平均腫瘍体積に基づいて、マウスを合計７つの群にランダムに分け、各群には８匹の動物を入れた：ブランクコントロールビヒクル（ＰＢＳ）、ポジティブコントロールＨ００５－１ ３ｍｐｋ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡ １ｍｐｋ、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡ ３ｍｐｋ、Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ １ｍｐｋ、Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡ ３ｍｐｋおよびＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ ３ｍｐｋ。各群の抗体は、０日目から週に３回腹腔内注射された。投与１週目以降、腫瘍は有意に抑制されることが見出された。２週目および３週目には、投与頻度を週１回、合計５回の投与になるよう調整した。腫瘍体積と動物の体重を週に２回モニターし、データを記録した。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えたとき、またはほとんどの腫瘍が潰瘍化したように見えたとき、または体重が２０％減少したとき、担癌動物を実験のエンドポイントとして安楽死させた。
腫瘍体積（ＴＶ）＝１／２×Ｌ_ｌｏｎｇ×Ｌ_{ｓｈｏｒｔ} ^２
腫瘍成長率（Ｔ／Ｃ％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００％
腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ％）＝１－Ｔ／Ｃ％

【0220】

式中、ＴおよびＴ０は、それぞれ、抗体投与群における試験終了時および試験開始時の腫瘍体積を表し、ＣおよびＣ０は、それぞれ、ブランクコントロール群における試験終了時および試験開始時の腫瘍体積を表す。

【0221】

試験結果を表１９と図３に示す。試験結果は、ブランクコントロールと比較して、本開示の抗体がいずれもマウス結腸癌ＭＣ３８異種移植腫瘍の成長を有意に抑制できることを示した。その中で、Ｈｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡ－３ｍｐｋ群が最も高い腫瘍抑制率を示し、最終測定時の腫瘍抑制率は７７．６４％であった。投与頻度が３回の投与で週３回であった場合、７日目の測定において、結果は、本開示の抗体の腫瘍抑制率がいずれもポジティブコントロール抗体Ｈ００５－１の腫瘍抑制率よりも有意に優れていることを示した；その後、投与頻度は週１回に減らされ、２回の投与後（２１日目）、本開示の抗体の有効性の差は徐々に増加し、用量依存的な様式を示し、その中でＨｕ３２ａ－８５．ＩｇＧ４ＡＡは同じ用量のＨ００５－１よりも有意に優れていた（ｐ＜０．０５）。さらに、担癌マウスは、すべての抗ＰＤ－１抗体に十分に耐えることができ、投与プロセス全体を通して体重は着実に増加し、明らかな薬物誘発性の体重減少およびその他の症状は発生しなかった。

【0222】

表１９．マウス結腸癌ＭＣ３８ｓ（ｍｍ^３）の腫瘍成長抑制率に対する抗ＰＤ－１抗体の効果

【表19】

【0223】

（試験例６）トランスジェニックＰＤ－１マウスにおける結腸癌モデルＭＣ３８に対する抗ＰＤ－１抗体の効果
トランスジェニックＰＤ－１マウスは、ＩＳＩＳ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆｆｉｃｅｓ， Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ Ｓｑｕａｒｅ， Ｏｘｆｏｒｄ ＯＸ１ ２ＪＤ， Ｅｎｇｌａｎｄから購入し、Ｃｅｐｈｒｉｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ株式会社で飼育して、第５世代のマウスを得た。ＭＣ３８細胞を５×１０^５細胞／１００μｌ／動物で、ｈＰＤ－１トランスジェニックマウス（半分が雌で半分が雄）の右後肋骨の皮下に接種した。マウスの平均腫瘍体積が８０～１００ｍｍ^３に達したとき、体重または腫瘍が大きすぎるか小さすぎる動物は除外された。腫瘍体積に従って、担癌マウスを５つの群（各群に８匹の動物）にランダムに分けた：ネガティブコントロールｈＩｇＧコントロール ３０ｍｐｋ、Ｈ００５－１ １０ｍｐｋ、Ｈ００５－１ ３０ｍｐｋ、Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ １０ｍｐｋおよびＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ ３０ｍｐｋ。群分けおよび投与の日を０日目に設定した。群分け後、各薬物を２２日間、２日に１回、合計１１回腹腔内投与した。腫瘍体積を週に２回測定し、体重を測定し、データを記録した。各群の動物の体重および腫瘍体積はすべて、平均±標準偏差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）として表され、グラフ化にはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５とＥｘｃｅｌソフトウェアを使用し、統計分析にはスチューデントのｔ検定を使用した。
腫瘍体積（ＴＶ）＝０．５２３６×Ｌ_ｌｏｎｇ×Ｌ_{ｓｈｏｒｔ} ^２
腫瘍成長率Ｔ／Ｃ％＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００％
腫瘍成長抑制率％ＴＧＩ＝１－Ｔ／Ｃ％

【0224】

式中、ＴおよびＴ０は、それぞれ、抗体投与群における試験終了時および試験開始時の腫瘍体積を表し、ＣおよびＣ０は、それぞれ、ブランクコントロール群における試験終了時および試験開始時の腫瘍体積を表す。

【0225】

試験結果を表２０および図４に示す。試験結果は、コントロール群と比較して、本開示の抗体がマウス結腸癌ＭＣ３８の異種移植腫瘍の成長を有意に抑制できることを示した。その中で、Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ－３０ｍｐｋ群が最も高い腫瘍抑制率を示し、２０日目の腫瘍抑制率は８０．４％である。低用量群（１０ｍｐｋ）では、Ｈｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡ－１０ｍｐｋの有効性は、ポジティブコントロールＨ００５－１－１０ｍｐｋの有効性よりも優れている。

【0226】

表２０．マウス結腸癌ＭＣ３８の腫瘍体積に対する抗ＰＤ－１抗体の効果

【表20】

【0227】

注：表中の各群の平均腫瘍体積の単位はｍｍ^３である。

【0228】

（試験例７）カニクイザルにおける抗ＰＤ－１抗体の薬物動態試験
実験に使用したカニクイザルは、広東フロンティアバイオテクノロジー（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）株式会社から購入した２～５歳、２～５ｋｇの雄６匹で、ライセンス番号：ＳＣＸＫ（広東）２０１５－００３７、動物証明書番号：４４６１３９０００００２１９であった。

【0229】

飼育環境：室温は１８℃～２６℃に制御され、相対湿度は４０％～７０％であり、照明は１２時間の明暗を交互にした。絶食が必要な場合を除いて、マウスは食物および水への自由なアクセスが許可された。

【0230】

投与前に動物の体重を測定し、体重は２．８１～３．５２ｋｇであった。前肢または後肢に皮下静脈内注入用の注射ポンプを使用して投与を行った。各群の投与量はいずれも１ｍｇ／ｋｇ（１ｍｐｋ）であり、約３０分の投与期間にわたって０．１ｍＬ／ｋｇ／分の速度で単回静脈内注射によって投与された。投与前と静脈内注入開始後５分、０．２５時間、０．５時間（投与終了直後）、１時間、２時間、４時間、８時間、１日、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、１３日、１４日、２１日および２８日に、動物の全血を後肢静脈で採取し、血清を分離した。このうち、投与前と静注内注入開始後１４日、２１日および２８日に約２ｍＬの全血を採取し、残りの採血時点で約１ｍＬの全血を採取した。血清中の血中薬物濃度をＥＬＩＳＡで検出し、ＰＫ分析を行った。結果を表２１に示す。

【0231】

表２１．カニクイザルにおけるヒト化抗ＰＤ１抗体の薬物動態

【表21】

【0232】

結果は、Ｈｕ２３－１１．ＩｇＧ４ＡＡおよびＨｕ３３－６．ＩｇＧ４ＡＡが良好な薬物動態活性を有することを示した。

【0233】

明確な理解のために、上述の発明は、図面および例の助けを借りて詳細に説明されてきたが、当該説明および例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書で引用されているすべての特許および科学文献の開示は、参照により完全かつ明確に援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

0007604379000001.app