特許 7604704 ポリスチレン系プラスチック分解菌、それを用いた懸濁液および発酵培養液ならびにプラスチック分解方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-13

(45)【発行日】2024-12-23

(54)【発明の名称】ポリスチレン系プラスチック分解菌、それを用いた懸濁液および発酵培養液ならびにプラスチック分解方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20241216BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A ZNA

C12N1/20 F

【請求項の数】 8

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024079899

(22)【出願日】2024-05-16

【審査請求日】2024-05-22

(31)【優先権主張番号】202310784776.6

(32)【優先日】2023-06-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【微生物の受託番号】GDMCC  GDMCC 63428

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】522025488

【氏名又は名称】広東省科学院微生物研究所（広東省微生物分析検測中心）

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100147924

【弁理士】

【氏名又は名称】美恵 英樹

(72)【発明者】

【氏名】許 ▲メイ▼英

(72)【発明者】

【氏名】甘 翠芬

(72)【発明者】

【氏名】周 少鋒

(72)【発明者】

【氏名】梁 銀秀

(72)【発明者】

【氏名】黄 友達

【審査官】天野 皓己

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０２３／２８５７３８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】中国特許出願公開第１１３７１７８９８（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００ － ７／０８

Ｂ０９Ｂ １／００ － ５／００

Ｃ１２Ｐ １／００ － ４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

寄託番号ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６３４２８である、バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２。

【請求項2】

請求項１に記載のバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２を有効成分として含有する、ことを特徴とするポリスチレン系プラスチックを分解するための懸濁液または発酵培養液。

【請求項3】

ポリスチレン系プラスチック分解における、請求項１に記載のバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２または請求項２に記載の懸濁液もしくは発酵培養液の使用。

【請求項4】

前記分解は、ポリスチレン系プラスチックを唯一の炭素源として増殖し、プラスチック表面に定着し、プラスチックを徐々に分解することによって行われる、ことを特徴とする請求項３に記載の使用。

【請求項5】

請求項１に記載のバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２をポリスチレン系プラスチックと共培養する、ことを特徴とするポリスチレン系プラスチックを分解する方法。

【請求項6】

前記ポリスチレン系プラスチックは、ポリスチレンの粒子、または薄膜、または粉末である、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２がポリスチレン系プラスチックを含有する液体に接種され、ＯＤ_６００が１．０～１．８であるバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２発酵培養液を得る、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記共培養は、その培養条件が、温度：２５℃～３７℃、振盪培養回転数：１５０～２２０ｒｐｍである、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物応用の技術分野に関し、具体的には、ポリスチレン系プラスチック分解菌およびそれを用いたプラスチック分解方法に関する。

【背景技術】

【0002】

世界的な工業生産と農業生産の急速な発展及び人間生活の必要性に伴い、プラスチック製品の生産量は年々増加しているが、毎年約１０％しかリサイクルできず、残りは焼却または埋設され、風化分解されて微小な破片となって拡散・移動し、土壌や河川・海洋に広く分布している。プラスチックの大きさが５ｍｍ以下になるとマイクロプラスチックとなり、生物の免疫反応を阻害し、不妊症、肥満、がんなどの病気のリスクを高める難分解性汚染物質として食物連鎖を通じて蓄積される。

【0003】

食品業界やリフォーム業界で広く使用されているポリスチレン（ＰＳ）は、化学的に安定で自然環境からの除去が困難なため、世界的に見ても汚染度の高いプラスチックのひとつである。焼却や熱分解などの処理方法と比較して、微生物によるその場分解法は、温和な条件、簡便さ、環境への優しさから、ポリスチレン系プラスチックの汚染問題を解決する重要な手段となる。ＰＳは微生物によって分解され得るが、ＰＳを分解する機能性細菌株の資源はほとんど同定されておらず、関連する機能性菌株の発見を増やし、ＰＳの新規微生物処理法を確立することが急務である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

プラスチック分解機能性細菌株の資源が少なく、ガバナンス方法が欠如している現状に鑑み、本発明の目的は、ポリスチレン系プラスチック汚染問題を解決するための細菌株資源及び技術手段を提供するための、ポリスチレン系プラスチック分解菌およびそれを用いたプラスチック分解方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明のポリスチレン系プラスチック分解菌は、２０２３年５月８日に広東省微生物菌株寄託センター（ＧＤＭＣＣ、住所：広東省広州市越秀区先烈中路１００号大院５９号ビル、郵便番号：５１００７０）に寄託された、寄託番号ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６３４２８のバチルス・アリャバタイ（Ｐｒｉｅｓｔｉａ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）Ｒｅｄ２２である。

【0006】

本発明の第２目的は、上記バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２を有効成分として含有する、ポリスチレン系プラスチックを分解するバクテリオファージを提供することである。

【0007】

本発明の第３目的は、ポリスチレン系プラスチック分解における、上記バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２の用途を提供することである。

【0008】

好ましくは、前記分解は、ポリスチレン系プラスチックを唯一の炭素源として増殖し、プラスチック表面に定着し、プラスチックを徐々に分解することによって行われる。

【0009】

本発明の第４目的は、上記バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２をポリスチレン系プラスチックと共培養する、ポリスチレン系プラスチックを分解する方法を提供することである。

【0010】

好ましくは、前記分解されるプラスチックは、ポリスチレンの粒子、または薄膜、または粉末である。

【0011】

好ましくは、前記ポリスチレン系プラスチックは異なる水域でバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２によって分解される。

【0012】

好ましくは、前記バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２は、バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２発酵液であり、そのＯＤ_６００は１．０～１．８であり、ポリスチレン系プラスチックを含有する液体に接種される場合、その接種量は１％～１０％ｖ／ｖである。

【0013】

好ましくは、前記共培養は、その培養条件が、温度：２５℃～３７℃、振盪培養回転数：１５０～２２０ｒｐｍである。

【発明の効果】

【0014】

本発明は、環境土壌に埋設されたプラスチック廃棄物からポリスチレン系プラスチック分解菌を篩い分け、単離し、これをプラスチックの分解に利用するものである。微生物は土壌中に広く存在し、培養が簡単で、活性が高く、環境に優しいという特徴を有し、ポリスチレン系プラスチックを分解する際にプラスチック表面に定着し、徐々に分解することができる。一定時間分解培養後、Ｒｅｄ２２によるポリスチレン系プラスチックの重量減少率が７．３％に達し、さらに、走査型電子顕微鏡、フーリエ変換赤外分光法および接触角測定などの分析の結果から分かるように、分解されたポリスチレン系プラスチック表面に明らかな溝とピットが観察され、分解されたポリスチレン系プラスチックの化学構造が変化し、親水基が増加し、分子量が減少し、この細菌の分解効果が明らかであることが証明された。本発明によって提供されるポリスチレン系プラスチック分解菌Ｒｅｄ２２は異なる環境の実際の水域でも明らかな分解能力を有するため、Ｒｅｄ２２菌が良好な環境適応性を有し、ポリスチレン系プラスチックの生物分解に新しい資源を提供し、比較的良好な応用が見込まれる。

【0015】

Ｐｒｉｅｓｔｉａ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ Ｒｅｄ２２は、２０２３年５月８日に広東省微生物菌株寄託センター（ＧＤＭＣＣ、住所：広東省広州市越秀区先烈中路１００号大院５９号ビル、郵便番号：５１００７０、）に寄託され、寄託番号ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６３４２８である。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明の実施例３に記載のＲｅｄ２２菌がポリスチレン系プラスチックシートを４５日間分解した後ポリスチレン系プラスチックシート表面上の増殖状況のレーザ共焦点顕微鏡の比較図である。左図は対照群であり、右図はＲｅｄ２２菌の処理群である。

【図2】本発明の実施例３に記載のポリスチレン系プラスチックシートがＲｅｄ２２菌によって４５日間分解された後の質量減少図である。

【図3】本発明の実施例３に記載のポリスチレン系プラスチックシートがＲｅｄ２２菌によって４５日間分解された後のＳＥＭ比較図である。左図は対照群であり、右図はＲｅｄ２２菌の処理群である。

【図4】本発明の実施例３に記載のポリスチレン系プラスチックシートがＲｅｄ２２菌によって４５日間分解された後のＦＴＩＲ変化図である。

【図5】本発明の実施例３に記載のポリスチレン系プラスチックシートがＲｅｄ２２菌によって４５日間分解された後の接触角変化図である。

【図6】本発明の実施例３に記載のポリスチレン系プラスチックシートがＲｅｄ２２菌によって４５日間分解された後の分子量変化図である。

【図7】本発明の実施例４に記載のポリスチレン系プラスチックが異なる実際の水域でＲｅｄ２２菌によって５０日間分解された後の質量減少図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、実施例に関連して本発明をさらに説明する。実施例は、本発明を例示的に説明するために使用され、本発明を何ら限定するものではない。

【0018】

実施例１
１、ポリスチレン系プラスチック分解株の単離精製と同定：
（１）ポリスチレン系プラスチック分解株の単離精製：土壌に埋設されたプラスチック廃棄物を減菌水で軽く洗浄した後、小片に切断し、減菌三角フラスコに入れ、生理食塩水とガラスビーズを加え、３０℃のシェーカーに置いて２００ｒｐｍ回転数で６時間振盪培養し、菌懸濁液を調製した。菌懸濁液を体積比１０％の接種量で紫外線減菌したポリスチレン粉末（２ｇ／Ｌ）を含有するカーボンフリーミネラル塩培地に移し、１８％のグリセロールを加え、３０℃のシェーカー１８０ｒｐｍ回転数で１５日間振盪培養し、定期的にサンプリングしてＯＤ_６００値を測定し、培養系が濁った後、カーボンフリーのポリスチレン粉末（２ｇ／Ｌ）を含有するミネラル塩培地に移し、培養を３回繰り返した。増殖の速い培養系を選択して勾配希釈（１０^－３～１０^－６）を行い、希釈コートプレート法（ＬＢプレート）により菌株を単離し、数回スクライビング・精製して黄白色の純粋な菌株を単離し、ｒｅｄ２２と命名した。単離した菌株をスラント培地とグリセロールチューブを用いて保存した。

【0019】

前記単離でスクリーニングされたカーボンフリーミネラル塩培地は、Ｎａ_２ＨＰＯ_４：０．５２ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ：０．５０ｇ、ＮＨ_４Ｃｌ：１．５ｇ、ＣａＣｌ_２：０．０３ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．８ｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．０１ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．０２ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ：０．０２ｇ、ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ：０．００６ｇを１Ｌの水に溶解し、均一に混合し、減菌して得た。

【0020】

（２）ポリスチレン系プラスチック分解株の同定：単離したＲｅｄ２２菌株のＤＮＡを抽出し、上海生工生物工程股▲ふん▼有限公司にＤＮＡ塩基配列決定を委託した。１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅はブロードスペクトラムプライマー２７Ｆ：ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ、および１４９２Ｒ：ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＹＧＡＣＴＴを採用した。同定結果から分かるように、Ｒｅｄ２２菌株はバチルス・アリャバタイ（Ｐｒｉｅｓｔｉａ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）であり、バチルス・アリャバタイ（Ｐｒｉｅｓｔｉａ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）Ｒｅｄ２２と命名された。本発明で使用されるポリスチレン系プラスチック分解株は本発明で使用される野外単離株に限定されるものではない。

【0021】

バチルス・アリャバタイ（Ｐｒｉｅｓｔｉａ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）Ｒｅｄ２２は、２０２３年５月８日に広東省微生物菌株寄託センター（ＧＤＭＣＣ、住所：広州市先烈中路１００号大院５９号ビル５楼、広東省科学院微生物研究所、郵便番号：５１００７０）に寄託され、寄託番号：ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６３４２８である。

【0022】

この菌株１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は以下に示される：
ＧＴＡＣＣＴＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＴＣＴＴＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＣＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＡＧＴＧＴＴＡＧＡＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＴＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＴＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＧＴＴＣＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＴＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＧＣＧＡＧＧＴＣＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＴＡＡＡＡＣＣＡＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＴＧＴＡＧＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＧＡＧＴＡＡＣＣＧＴＡＡＧＧＡＧＣＴＡＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴ

【0023】

実施例２
１、ポリスチレン系プラスチック分解菌Ｒｅｄ２２によるポリスチレン系プラスチックシートの分解は、以下のステップを含む：
（１）ポリスチレン系プラスチックシートの調製：プラスチックの特徴評価を容易にし、回収後の秤量を精度よくするために、本実験ではポリスチレン系プラスチックシートを用いて分解実験を行った。購入した純粋なポリスチレン粉末をキシレンに加え（３ｇ／ｍＬ）、機械攪拌した後一晩放置して溶解させ、均一に攪拌した後５ｍＬ透明液体を９０ｍｍのガラスシャーレに平らに広げて３６時間硬化させ、その後成膜したポリスチレン薄膜を０．５×０．５ｍｍの小片に切断し、それぞれ７５％エタノールと減菌水で洗浄して自然乾燥した。

【0024】

（２）菌株の活性化：ポリスチレン系プラスチック分解菌－バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２をＬＢ寒天プレートに接種し、３０℃で２４時間培養し、コロニーを成熟させた。

【0025】

（３）シード培養：活性化後のバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２のシングルコロニーを１０ｍＬのＬＢ液体培地に接種して恒温振盪培養し、３０℃、１８０ｒｐｍ下で１６時間、恒温振盪培養してシード液を得た。

【0026】

（４）発酵培養：シード培養液を体積比２％の接種量でＬＢ液体培地に接種して恒温振盪培養し、３０℃、１８０ｒｐｍ下で１６時間、恒温振盪培養した。発酵培養後で得られた菌懸濁液を６０００×ｇの遠心力で５分間遠心し、菌体沈殿を収集し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。沈殿をカーボンフリーミネラル塩培地に再懸濁し、再懸濁菌液ＯＤ_６００値を１．５に調整した。

【0027】

（５）バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２によるポリスチレンの分解：０．５×０．５ｍｍのポリスチレン系プラスチックシートを秤量した後、ウルトラクリーンベンチ内で７５％エタノールに１時間浸漬して減菌し、取り出してウルトラクリーンベンチ中の減菌気流で表面液体を揮発させた。大きい試験管に１５ｍＬのカーボンフリーミネラル塩培地と表面減菌後のポリスチレン系プラスチックシート（約０．０１ｇ／ｍＬ）を加え、１０％（ｖ／ｖ）の接種量で上記収集したバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２再懸濁液を接種した。非接種処理を対照群とし、各処理について６つの並行サンプルを設定した。上記試験管を３０℃、１８０ｒｐｍの恒温振盪インキュベーターに入れて培養し、定期的にサンプリングしてポリスチレン系プラスチックシートの質量減少、表面形態変化、官能基変化およびその表面の疎水性変化などを分析した。

【0028】

実施例３
バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２によるポリスチレン系プラスチックシートの分解効果：
（１）ポリスチレン系プラスチック表面におけるバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２の増殖状況：バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２でポリスチレン系プラスチックシートを４５日間分解した後、３枚のポリスチレン系プラスチックシートを取り出した直後ＰＢＳ緩衝液で軽く１回洗浄し、その後細菌を死活プローブ色素で染色し、レーザ共焦点顕微鏡でポリスチレン系プラスチックシート表面のＲｅｄ２２菌株の増殖状況を撮影した。図１から分かるように、バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２はポリスチレン系プラスチックシート表面に均一に定着して生物膜を形成した。４５日間培養分解した後でもバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２の活性は比較的良好で、ほとんどの細胞が生きていた。これは、菌株Ｒｅｄ２２が、ポリスチレン系プラスチックが作り出す生存環境に適応し、正常に増殖できることを示す。バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２はポリスチレン系プラスチック表面に付着し、それを炭素源として増殖する同時にポリスチレンを分解することができる。

【0029】

（２）ポリスチレン系プラスチックシートの質量減少試験：バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２でポリスチレンを４５日間分解した後、試験管内のすべてのポリスチレン系プラスチックシートを濾過して収集し、まず２％のＳＤＳ洗浄液で１時間超音波洗浄した後、７５％無水エタノールで２０分間超音波洗浄し、ポリスチレン系プラスチックシート表面の生物膜を除去した後、減菌水で２回洗浄し、最後に洗浄したポリスチレン系プラスチックシートを５０℃の真空オーブンに入れて１２時間乾燥させた。乾燥後のポリスチレン系プラスチックシートを秤量し、その重量減少率を計算した。ポリスチレン系プラスチックシートの重量減少率（％）＝（ポリスチレンの初期質量－分解後質量）÷初期質量×１００％である。図２の重量減少率データから分かるように、菌株Ｒｅｄ２２でポリスチレン系プラスチックシートを４５日間分解した後、プラスチックシートの重量減少率が７．３％に達した。非接種の対照群の重量減少率は２．２％にとどまり、これは、バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２がポリスチレン系プラスチックシートを炭素源としてポリスチレン系プラスチックシートを分解することを示す。

【0030】

（３）バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２によるポリスチレン分解後の表面形態変化：分解されたポリスチレン系プラスチックシートを洗浄および乾燥した後、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）でその表面形態を観察した結果が図３に示されている。Ｒｅｄ２２菌によって４５日間分解された後のポリスチレン系プラスチックシートの表面に明らかな不規則な溝やビットが見られたが、非接種の対照群のポリスチレン系プラスチックシートの表面は比較的平滑であった。表面で増殖中、菌株Ｒｅｄ２２はポリスチレンを唯一の炭素源として、プラスチックシートを侵食し、その表面構造を破壊し、ポリスチレン系プラスチックシートに明らかな分解作用をもたらすことができる。

【0031】

（４）ポリスチレン分解後の表面官能基変化：フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）で菌株Ｒｅｄ２２によるポリスチレン系プラスチックシート分解前後の表面官能基変化を測定した。スペクトル測定範囲は４００～４０００ｃｍ^－１である。結果が図４に示され、分解前のポリスチレン系プラスチックシートと比較すると、バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２によって分解されたポリスチレン系プラスチックシートでは３４００～３７００ｃｍ^－１に新しい特徴ピークが現れ、これはＯ－Ｈ結合の伸縮振動ピークである。分解されたポリスチレン系プラスチックシートでは１７５０ｃｍ^－１に新しい特徴ピークが現れ、これはＣ＝Ｏ結合の伸縮振動ピークである。ポリスチレン系プラスチックシートがＲｅｄ２２菌によって分解・酸化され、水酸基やカルボニル基などの活性官能基が生成されたものと考えられ、ポリスチレン系プラスチックシートがＲｅｄ２２によって処理された後、表面が明らかに分解し、いくつかの高分子が部分的に解重合または鎖切断などを起こし、新しい酸化生成物を生成した。

【0032】

（５）ポリスチレン分解後の表面疎水性変化：バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２によって分解されたポリスチレン系プラスチックシートを洗浄・乾燥した後、光学接触角計でポリスチレン系プラスチックシート表面の水滴の接触角を測定した。測定する際に、両面テープでポリスチレン系プラスチックシートをスライドに平らに貼り付け、マイクロシリンジで１０μＬ滴下し、各試料について３点ずつ試験し、平均値をとった。接触角試験結果は図５に示され、分解前のポリスチレン系プラスチックシートの接触角は８９．６２°±１．５１°であり、バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２によって分解されたポリスチレン系プラスチックシートの水接触角が７７．８４°±１．１３°に減少した。これは、分解後のポリスチレン系プラスチックシートの表面疎水性が顕著に低下したことを示し、ＦＴＩＲの結果と併せて、分解されたポリスチレン系プラスチックシート表面に親水性の官能基が生成し、さらに、バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２はポリスチレンに対して高い分解能力を有することが示された。

【0033】

（６）ポリスチレン分解前後の分子量変化：ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）でバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２によるポリスチレン系プラスチック分解前後の分子量変化を測定した結果が図６に示されている。Ｒｅｄ２２菌によって分解されたポリスチレン系プラスチックの質量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）は、分解前よりも低く、分解された分子量分布指数（ＰＤＩ＝Ｍｗ／Ｍｎ）は分解前よりも高かった。ＰＤＩ値が高いほど、ポリマーの分子量分布が広く、解重合度が高いので、バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２がポリスチレンに対して高い分解能力を有し、ポリスチレンの長鎖を炭素鎖の短い生成物に分解することができることが示された。

【0034】

実施例４
バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２が異なる実際の水域でポリスチレン系プラスチックを分解する効果：
（１）バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２が異なる実際の水域でポリスチレン系プラスチックを分解するステップ：０．５×０．５ｍｍのポリスチレン系プラスチックシートを秤量した後ウルトラクリーンベンチ内で７５％エタノールに１時間浸漬減菌し、取り出してウルトラクリーンベンチ内の減菌気流で表面液体を揮発させた。大きい試験管に１５ｍＬの異なるタイプの実際の水域（浄水場の上流水と汚れた河川の湧水）と表面減菌後のポリスチレン系プラスチックシート（約０．０１ｇ／ｍＬ）を加え、１０％（ｖ／ｖ）の接種量で実施例２のバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２発酵培養液を接種した。Ｒｅｄ２２菌を接種しない処理を対照群とし、各処理について６つの並行サンプルを設定した。上記試験管を３０℃、１８０ｒｐｍの恒温振盪インキュベーターに入れて培養し、定期的にサンプリングしてポリスチレン系プラスチックシートの質量減少、表面形態変化およびその表面の疎水性変化などを分析した。

【0035】

（２）ポリスチレン系プラスチックシートが異なる水域でバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２によって分解された後の質量減少試験：バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２が異なる実際の水域でポリスチレンを５０日間分解した後、試験管中のすべてのポリスチレン系プラスチックシートを濾過して収集し、まず２％のＳＤＳ洗浄液で１時間超音波洗浄した後、７５％無水エタノールで２０分間、超音波洗浄し、ポリスチレン系プラスチックシート表面の生物膜を除去した後、減菌水で２回洗浄し、最後に洗浄したポリスチレン系プラスチックシートを５０℃の真空オーブンに入れて１２時間乾燥させた。乾燥後のポリスチレン系プラスチックシートを秤量し、その重量減少率を計算した。ポリスチレン系プラスチックシートの重量減少率（％）＝（ポリスチレンの初期質量－分解後質量）÷初期質量×１００％である。図６の重量減少率データから分かるように、バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２がきれいな浄水場の上流水においてポリスチレン系プラスチックシートを５０日間分解した後では、プラスチックシートの重量減少率が４．１％に達したのに対し、非接種の対照群の重量減少率は１．７％にとどまった。バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２が汚れた河川の湧水においてポリスチレン系プラスチックシートを５０日間分解した後では、プラスチックシートの重量減少率が４．７％に達したのに対し、非接種の対照群の重量減少率が１．９％にとどまった。これにより、菌株Ｒｅｄ２２が比較的きれいな水でも汚れた水でもポリスチレン系プラスチックを分解できたことが証明され、さらに、菌株Ｒｅｄ２２が良好な環境適応性を有し、異なる実際な環境でポリスチレン系プラスチックを分解できることが示された。

【0036】

（付記）
（付記１）
寄託番号ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６３４２８である、バチルス・アリャバタイ（Ｐｒｉｅｓｔｉａ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）Ｒｅｄ２２。

【0037】

（付記２）
付記１に記載のバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２を有効成分として含有する、ことを特徴とするポリスチレン系プラスチックを分解するバクテリオファージ。

【0038】

（付記３）
ポリスチレン系プラスチック分解における、付記１に記載のバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２または付記２に記載のバクテリオファージの用途。

【0039】

（付記４）
前記分解は、ポリスチレン系プラスチックを唯一の炭素源として増殖し、プラスチック表面に定着し、プラスチックを徐々に分解することによって行われる、ことを特徴とする付記３に記載の用途。

【0040】

（付記５）
付記１に記載のバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２をポリスチレン系プラスチックと共培養する、ことを特徴とするポリスチレン系プラスチックを分解する方法。

【0041】

（付記６）
前記ポリスチレン系プラスチックは、ポリスチレンの粒子、または薄膜、または粉末である、ことを特徴とする付記５に記載の方法。

【0042】

（付記７）
前記ポリスチレン系プラスチックは異なる水域でバチルス・アリャバタイＲｅｄ２２によって分解される、ことを特徴とする付記５に記載の方法。

【0043】

（付記８）
前記バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２は、バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２発酵液であり、そのＯＤ_６００は１．０～１．８であり、ポリスチレン系プラスチックを含有する液体に接種される場合、その接種量は１％～１０％ｖ／ｖである、ことを特徴とする付記５に記載の方法。

【0044】

（付記９）
前記共培養は、その培養条件が、温度：２５℃～３７℃、振盪培養回転数：１５０～２２０ｒｐｍである、ことを特徴とする付記５に記載の方法。

【要約】      （修正有）

【課題】ポリスチレン系プラスチック分解菌およびそれを用いたプラスチック分解方法を提供する。
【解決手段】バチルス・アリャバタイ（Ｐｒｉｅｓｔｉａ ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）Ｒｅｄ２２は、２０２３年５月８日に広東省微生物菌株寄託センターに寄託されており、寄託番号ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６３４２８である。本発明によって提供されるポリスチレン系プラスチック分解菌－バチルス・アリャバタイＲｅｄ２２は、異なる環境の実際の水域でも明らかな分解能力を有するため、Ｒｅｄ２２菌が良好な環境適応性を有し、ポリスチレン系プラスチックの生物分解に新しい資源を提供し、比較的良好な応用が見込まれる。
【選択図】図３

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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