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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-16
(45)【発行日】2024-12-24
(54)【発明の名称】百日咳ブースターワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/10 20060101AFI20241217BHJP
A61K 39/116 20060101ALI20241217BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20241217BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241217BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241217BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241217BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20241217BHJP
【ＦＩ】
A61K39/10
A61K39/116
A61K39/39
A61P31/04
A61P37/04
A61K47/18
A61K47/02
【請求項の数】
28
(21)【出願番号】P 2021531950
(86)(22)【出願日】2019-11-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-31
(86)【国際出願番号】 US2019063840
(87)【国際公開番号】W WO2020117618
(87)【国際公開日】2020-06-11
【審査請求日】2022-10-31
(31)【優先権主張番号】18306621.6
(32)【優先日】2018-12-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】517055195
【氏名又は名称】サノフィ パスツール インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ニコラ・ビュルダン
(72)【発明者】
【氏名】マルティナ・オクス
(72)【発明者】
【氏名】マリー・ギャリノ
(72)【発明者】
【氏名】マルティーヌ・シャボー－リウー
(72)【発明者】
【氏名】ナタリー・レヴェノー
(72)【発明者】
【氏名】ユアンチン・リウ
(72)【発明者】
【氏名】ノエル・ミストレッタ
【審査官】川合 理恵
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５０９５２２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５０９９６３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以前に百日咳菌抗原に曝露されているヒト対象、ここで、百日咳菌抗原への該曝露は該ヒト対象においてＴｈ２優位の免疫応答を誘導していた、においてＴｈ２優位の免疫応答をＴｈ１優位のまたはＴｈ１／Ｔｈ１７優位の免疫応答に向けて新たに方向付けするのに使用するための無細胞百日咳（ａＰ）ブースターワクチンであって、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、解毒された百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、線毛タイプ２および３、少なくとも１種のトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、およびアルミニウム塩を含み、該少なくとも１種のＴＬＲアゴニストは、該アルミニウム塩と共に製剤化される、前記ａＰブースターワクチン。
【請求項2】
ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４アゴニストおよび／またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項１に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項3】
ＴＬＲ４アゴニストは、Ｅ６０２０を含む、請求項２に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項4】
ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧ１０１８を含む、請求項２に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項5】
破傷風トキソイドは、８～１２Ｌｆ／ｍＬの量で存在する、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項6】
ジフテリアトキソイドは、３～８Ｌｆ／ｍＬの量で存在する、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項7】
解毒された百日咳毒素は、遺伝子的に解毒された百日咳毒素であり、１６～２４μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項8】
線維状赤血球凝集素は、５～１５μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項9】
パータクチンは、５～１５μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項10】
線毛タイプ２および３は、１０～２０μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項11】
ＴＬＲ４アゴニストは、１０μｇ／ｍＬ以下の量で存在する、請求項２～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項12】
ＴＬＲ９アゴニストは、２５０～７５０μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項２～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項13】
さらに、トリス緩衝食塩水を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項14】
０．５～０．７５ｍｇ／ｍＬのアルミニウム濃度を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項15】
破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および解毒された百日咳毒素のうちの少なくとも１つは、アルミニウム塩に吸着され、解毒された百日咳毒素は、遺伝子的に解毒された百日咳毒素である、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項16】
アルミニウム塩は、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムである、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項17】
破傷風トキソイドは、９～１１Ｌｆ／ｍＬの量で存在し、ジフテリアトキソイドは、３～８Ｌｆ／ｍＬの量で存在し、解毒された百日咳毒素は、遺伝子的に解毒された百日咳毒素であり、１６～２４μｇ／ｍＬの量で存在し、線維状赤血球凝集素は、５～１５μｇ／ｍＬの量で存在し、パータクチンは、５～１５μｇ／ｍＬの量で存在し、線毛タイプ２および３は、１０～２０μｇ／ｍＬの量で存在し、アルミニウム塩は、水酸化アルミニウムであり、０．２５～０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４アゴニストおよび／またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項18】
ＴＬＲ４アゴニストは、Ｅ６０２０を含み、２μｇ／ｍＬ以下の量で存在するか、またはＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧ１０１８を含み、４００～６００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１７に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項19】
破傷風トキソイドは、１０Ｌｆ／ｍＬの量で存在し、ジフテリアトキソイドは、４～５Ｌｆ／ｍＬの量で存在し、解毒された百日咳毒素は、遺伝子的に解毒された百日咳毒素であり、２０μｇ／ｍＬの量で存在し、線維状赤血球凝集素は、１０μｇ／ｍＬの量で存在し、パータクチンは、１０μｇ／ｍＬの量で存在し、線毛タイプ２および３は、１５μｇ／ｍＬの量で存在し、アルミニウム塩は、水酸化アルミニウムであり、０．６６ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４アゴニストおよび／またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項１８に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項20】
ＴＬＲ４アゴニストは、Ｅ６０２０を含み、０．５～５μｇ／ｍＬの量で存在するか、またはＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧ１０１８を含み、５００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１９に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項21】
ヒト対象への投与のための０．５ｍＬの単位剤形にあり、破傷風トキソイドは、５Ｌｆの量で存在し、ジフテリアトキソイドは、２～２．５Ｌｆの量で存在し、遺伝子的に解毒された百日咳毒素は、１０μｇの量で存在し、線維状赤血球凝集素は、５μｇの量で存在し、パータクチンは、５μｇの量で存在し、線毛タイプ２および３は、７．５μｇ／ｍＬの量で存在し、水酸化アルミニウムは、０．３３ｍｇの濃度で存在し、Ｅ６０２０は０．２５～２．５μｇの量で存在するか、またはＣｐＧ１０１８は２５０μｇの量で存在する、請求項２０に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項22】
解毒された百日咳毒素は、遺伝子的に解毒された百日咳毒素であり、Ｒ９Ｋ変異およびＥ１２９Ｇ変異を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項23】
さらに、ヘモフィルスインフルエンザタイプｂ糖コンジュゲート、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、および／または不活性化ポリオウイルスを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのａＰブースターワクチン。
【請求項24】
以前に百日咳菌抗原に曝露されているヒト対象は、無細胞百日咳（ａＰ）プライミングワクチンを受けた、請求項１～４のいずれか１項に記載のａＰブースターワクチン。
【請求項25】
ヒト対象は、４歳以上である、請求項１～４のいずれか１項に記載のａＰブースターワクチン。
【請求項26】
ヒト対象は、１０歳以上である、請求項１～４のいずれか１項に記載のａＰブースターワクチン。
【請求項27】
Ｔｈ１優位の免疫応答は、ＴＬＲアゴニストを含有しないａＰプライミングワクチンまたはａＰブースターワクチンによって誘導されるＴｈ２優位の免疫応答と比較したときの、ＩＬ－５保護の減少またはより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比のうちの１つまたはそれ以上によって特徴付けられ、Ｔｈ１／Ｔｈ１７優位の応答は、ＴＬＲアゴニストを含有しないａＰプライミングワクチンまたはａＰブースターワクチンによって誘導されるＴｈ２優位の免疫応答と比較したときの、ＩＬ－１７保護の増加ならびにＩＬ－５保護の減少またはより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比のうちの１つまたはそれ以上によって特徴付けられる、請求項１～４のいずれか１項に記載のａＰブースターワクチン。
【請求項28】
ａＰプライミングワクチンは、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、および線毛タイプ２および３を含むが、ただし、ＴＬＲアゴニストを含有しない、請求項２４に記載のａＰブースターワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１８年１２月５日に出願された欧州特許出願第１８３０６６２１．６号の利益を主張し、その出願日に依拠するものである。
本願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１８年１２月５日に出願された欧州特許出願第１８３０６６２１．６号の利益を主張し、その出願日に依拠するものである。
【0002】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる配列表を含む。２０１９年１１月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０１７１＿００１６－ＰＣＴ＿ＳＬと命名され、１キロバイトのサイズである。
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる配列表を含む。２０１９年１１月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０１７１＿００１６－ＰＣＴ＿ＳＬと命名され、１キロバイトのサイズである。
【0003】
分野
本開示は、無細胞百日咳ワクチンおよびそれを使用する方法に関する。
本開示は、無細胞百日咳ワクチンおよびそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
百日咳（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）は、主に百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）によって引き起こされる、急性の感染力が強い呼吸器疾患である。免疫処置が広く実践される前は、百日咳は、極めて風土病性であった。証拠は、ほとんど全ての子供が、大人になる前に百日咳に感染し、そのほとんどがある程度の臨床疾患を患い、ならびに病原菌における盛んな循環が、感染獲得免疫の自然なブースティングを提供することを示唆しており、それは、７～１０年から２０年継続すると推定される（非特許文献１）。
【0005】
ワクチン接種は、百日咳の症例数を減らすための最も効果的な戦略であった（非特許文献２）。初期の百日咳ワクチンは、化学的に解毒されてジフテリア抗原および破傷風抗原と共に製剤化された、殺された百日咳の全細胞（ｗＰ）を含んでいた。１９９０年代以来、ｗＰワクチンは、多くの国において、無細胞百日咳ワクチンに置き換えられてきた。無細胞百日咳（ａＰ）ワクチンは、発熱、注射部位の反応原性、および（程度は低いが）痙攣の高いリスクに関連しているｗＰワクチンと比較して、比較的副作用を引き起こさない。現在の無細胞ワクチンは、典型的には、以下の病原性因子：百日咳毒素（ＰＴ）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチン（ＰＲＮ）、線毛性凝集原２および線毛性凝集原３（ＦＩＭ２／３またはＦＩＭ）に基づいている。いくつかの無細胞ワクチンは、ＰＴおよびＦＨＡのみまたはＰＴ単独を含むが、一般的に、ＰＴ、ＦＨＡ、ＰＲＮ、およびＦＩＭ２／３成分を含む無細胞百日咳ワクチンは、現在利用可能な最も効果的なａＰワクチンであると考えられている。
【0006】
何十年ものワクチン接種にもかかわらず、百日咳は、世界中において風土病のままであり、２～５年ごとに（典型的には３または４年ごとに）、一貫した季節パターンなしに、局地的に特定の流行のピークまたは大発生が生じる（非特許文献３；非特許文献４）。報告された諸国間での発生率の大きな違いにもかかわらず、今も、百日咳症例の最も高い年齢特異的発症率、入院、合併症は、各国において、１歳未満、主に３か月前の幼児において報告される。幼すぎて一次ワクチンのシリーズを完了していない幼児が、百日咳関連合併症、入院、および死亡の大部分を占める（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。近年の疫学的知見において、若者および成人は、ワクチンスケジュールが十分に確立された国、例えば、米国および英国などにおいて、二番目に高い疾患の発症率と、最も高い発症率増加を示す傾向にある。
【0007】
蓄積された証拠は、観察された再流行および大発生がおそらく、複数の要因、例えば、認識（非特許文献１０）、検査で確認する方法の感度増強（非特許文献１１）、不完全なスケジュールまたは最善には及ばないワクチン適用範囲（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）、生物における遺伝子型および表現型の変化を伴う、ワクチン誘導免疫の性質における弱化および変化（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）、などの複数の要因の複合効果から生じることを示唆している。
【0008】
子供の百日咳の発生率を減少させるため、およそ４～６歳に対するａＰブースターワクチン接種が、多くの国において実践された（非特許文献１９；非特許文献２０）。無細胞百日咳含有ワクチン（Ｔｄａｐ）のブースター投与の有効性が、いくつかの設定において評価された。１９９７年から１９９９年に合衆国において行われたある無作為臨床試験によって、１５歳から６５歳までの若者および成人におけるＴｄａｐワクチンの有効性が評価された。この研究は、Ｔｄａｐワクチン接種が、検査で確認された百日咳に対して９２％のワクチン有効性推定に対して、１年にわたる観察期間における臨床疾患（すなわち、２１日間を超える咳）の発症率の減少および抗百日咳抗体レベルの増加に関連していることを見出した（非特許文献２１）。百日咳抑制におけるＴｄａｐワクチン接種の有効性が、米国およびオーストラリアにおける非大発生設定においてのいくつかの観察的研究に示されており、これは、疾患発症率に対する青年期のＴｄａｐワクチン接種の有意な影響を実証しており、ある研究は、検査で確認された百日咳に対して８５．４％の有効性を推定した（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４）。しかしながら、いくつかの最近のケース（無細胞ワクチンによって主にプライミングされた群における米国での大発生設定において行われた抑制研究）は、一貫して、Ｔｄａｐワクチン接種の有効性を、検査で確認された百日咳に対して約６５％以下の中程度と推定した（非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９）。これらの観察研究のほとんどに存在する固有の方法論的限界にもかかわらず、ウィスコンシン州の研究で観察されたＴｄａｐブースター投与後の全てのブランドの有効性の急速な弱化の証拠は、ワシントン州の大発生設定において行われた研究の観察と一致しており、その研究は、Ｔｄａｐワクチン接種の有効性が、ブースター投与後の最初の年の７５％から２年目以降に４２％へと急速に弱化すると推定した（非特許文献３０；非特許文献３１）。近年の米国およびカナダにおける百日咳症例の疫学的傾向および分布は、ａＰワクチンでプライミングされた個人は百日咳ブースターワクチンにあまりロバストには応答せず、そのような人たちの保護が、ｗＰワクチンでプライミングされた前の群よりも急速に弱まる、との考え方を裏付けるとして解釈されている（非特許文献３２；非特許文献３３）。さらに、２０１０年および２０１２年の米国の大発生ならびに２００８～２０１２年のオーストラリアの大発生において得られたデータを分析するいくつかの研究は、ブースターワクチンによって誘導された保護が、ｗＰワクチンでプライミングされた個人よりもａＰワクチンでプライミングされた個人においてより早く弱まることを示唆している（非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０；非特許文献４１）。これらの研究の結果は、方法論的基礎において何人かの専門家によって挑まれたが、彼らの結論は、米国においてＣＤＣによって報告された経済観察によって支持され、それは、保護の弱化が、ｗＰでプライミングされた群における前の観察と比較して、ａＰでプライミングされた群においてより早く生じることを示していた。（非特許文献４２）。実際に、ａＰまたはｗＰワクチンでプライミングされた若者に関する臨床研究において得られた免疫原性結果の比較は、Ｔｄａｐワクチン投与後の１か月間でのより低い体液または細胞（ＢおよびＴｈ１）免疫応答の一貫した証拠を提供している（非特許文献４３；非特許文献４４；非特許文献４５；非特許文献４６）。
【0009】
スウェーデンの百日咳監視データに基づくモデリング研究は、ａＰワクチン状況における百日咳疫学の群れ効果を示唆しており、その一方で、米国、イタリア、および他の国の監視データを使用するいくつかの他の研究は、観察された疫学的傾向に最もよく合うモデルが、ａＰワクチンがｗＰワクチンと比べてより低いブースター応答、より早い保護の弱化、およびより高い無症候性感染を誘発するとの仮説を立てる傾向にあることを見出している（非特許文献４７；非特許文献４８；非特許文献４９）。
【0010】
Ｗａｒｆｅｌらによる非ヒト霊長類における研究に基づいて、ｗＰワクチンとａＰワクチンでは保護メカニズムがおそらく異なっていることが示唆されている（非特許文献５０）。この研究は、ヒトにおいてではなく、非統計的有意な試料においてではあるが、ａＰワクチンが、臨床疾患を予防するが、明確なコロニー形成についてはｗＰワクチンほどには予防せず、感染しやすい動物への伝染を許容することを見出した（Ｉｄ．）。百日咳のマウスモデルを使用した研究からも、同様の結論に達した（非特許文献５１）。非ヒト霊長類において行われた研究は、ａＰプライミングと比較してｗＰワクチン接種後の相違のある免疫プロファイルを特に指摘している。詳細には、Ｔｈ１または混合Ｔｈ１／Ｔｈ１７の応答プロファイルは、ｗＰワクチンプライミングに関連していたが、その一方で、Ｔｈ２プロファイルは、ａＰワクチンプライミングに関連していた。その結果、ｗＰワクチン接種後に観察された免疫応答のＴｈ１／Ｔｈ１７優位（Ｔｈ１／Ｔｈ１７ ｂｉａｓ）は、ａＰワクチン接種後に観察されるＴｈ２優位よりも、より長い保護期間およびより迅速な感染除去に関連し得る（すなわち、より強い初期保護）との仮説が立てられた。さらに、それぞれｗＰおよびａＰによる初回ワクチン接種によって誘導される初期Ｔｈ１／Ｔｈ１７対Ｔｈ２応答は、初期の初回ワクチン接種の数年後でさえ、ａＰブースターワクチン接種後に維持されることが観察され、このことは、プライミングワクチン接種が、ａＰブースターワクチン接種後のＴｈ１／Ｔｈ１７優位対Ｔｈ２優位に影響を及ぼすことを示唆している（非特許文献５２）。百日咳菌に対する免疫におけるＴｈ１／Ｔｈ１７エフェクタ細胞の重要な役割は、感染のマウスモデルにおいて確認され、この仮説をさらに強化した（非特許文献５３）。この仮説を支持するヒトにおける証拠はまだ開発されていないが、いくつかの研究は、ｗＰワクチンまたはａＰワクチンを接種したヒトにおけるＴヘルパー細胞の反応の違いを示唆している（非特許文献５４）。さらに、ａＰワクチンに対するＴｈ２支配的応答は、異なるＩｇＧアイソタイプ分布に対応するようにも見える。ａＰワクチン接種に対する反応は、主にＩｇＧ１を生じるが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４も生じ、ブースターワクチン接種後のＩｇＧ４の保護が増加する。対照的に、ｗＰワクチンのＴｈ１支配的応答は、主に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体反応を伴う（非特許文献５５；非特許文献５６；非特許文献５７）。
【0011】
百日咳菌の感染に対してより長く継続する保護を有する改良されたブースターａＰワクチンを提供することは有益であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0012】
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【文献】Ｈａｌｐｅｒｉｎ、 Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２００５；３５３：１６１５～７
【文献】Ｅｄｗａｒｄｓら、 Ｗｈｏｏｐｉｎｇ Ｃｏｕｇｈ Ｖａｃｃｉｎｅ． Ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ 第６版． Ｐｌｏｔｋｉｎ Ｓ、 Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ Ｗ、 Ｏｆｆｉｔ Ｐ．編 第６版． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、 ２０１２：４４７～９２
【文献】ＪＤ Ｃｈｅｒｒｙ、 Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ２００５；１１５：１４２２～２７
【文献】Ｂｉｓｇａｒｄら、 Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ． ２００４；２３：９８５～８９
【文献】Ｈａｂｅｒｌｉｎｇら、 Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ． ２００９；２８（３）：１９４～９８
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【文献】Ｉｍｄａｄら、 Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ２０１３；１３２：３７～４３
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【文献】Ｓｋｏｆｆら、 Ａｒｃｈ Ｐｅｄｉａｔｒ Ａｄｏｌｅｓｃ Ｍｅｄ． ２０１２；１６６（４）：３４４～４９
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明者らは、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む新規の改変された無細胞百日咳（ａＰ）ブースターワクチンを開発した。より詳細には、本発明者らは、驚くべきことに、ＴＬＲ４および／またはＴＬＲ９アゴニストを伴うａＰブースターワクチンが、以前に投与されたａＰワクチンによって誘導されるＴｈ２優位の（Ｔｈ２－ｂｉａｓｅｄ）免疫応答を、Ｔｈ１優位の（Ｔｈ１－ｂｉａｓｅｄ）免疫応答へと新たに方向付けることができることを見出した。いかなる理論にも束縛されることを意図するわけではないが、Ｔヘルパー細胞の再偏向および改変されたａＰブースターワクチンによって誘導されるＴｈ１／Ｔｈ２バランスのシフトは、加速された百日咳菌の除去に関連しているように見える。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本開示の第１の態様は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、解毒された百日咳毒素（典型的には、遺伝子改変された百日咳毒素）、線維状赤血球凝集素、パータクチン、線毛タイプ２および３、ＴＬＲアゴニスト、ならびにアルミニウム塩を含むａＰブースターワクチンであって、少なくともＴＬＲアゴニストが、アルミニウム塩と共に製剤化される、ａＰブースターワクチンを対象とする（態様１）。
【0015】
別の態様は、以前に百日咳菌抗原に曝露されているヒト対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象にａＰブースターワクチンを投与する工程を含み、ａＰブースターワクチンが、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、解毒された百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、線毛タイプ２および３、少なくとも１種のＴＬＲアゴニスト、ならびにアルミニウム塩を含み、少なくとも１種のＴＬＲアゴニストが、アルミニウム塩と共に製剤化され、ａＰブースターワクチンを投与する工程が、ヒト対象において、百日咳菌抗原への以前の曝露によって誘導されたＴｈ２優位の免疫応答をＴｈ１優位の免疫応答またはＴｈ１／Ｔｈ１７優位の免疫応答へと新たに方向付ける、方法を対象とする（態様２）。典型的にはａＰプライミングワクチンによって、以前に百日咳菌抗原に曝露されているヒト対象において、Ｔｈ２優位の免疫応答をＴｈ１優位のまたはＴｈ１／Ｔｈ１７優位の免疫応答へと新たに方向付けるためのａＰブースターワクチンの使用も、態様２によって網羅される。
【0016】
典型的には、態様２との関連において、ヒト対象は、ａＰブースターワクチンを投与する前に、無細胞百日咳ワクチン（本明細書においてａＰプライミングワクチンとも呼ばれる）を以前に受けており、この場合、ａＰプライミングワクチンは、Ｔｈ２優位の免疫応答を誘導する。あるいは、ヒト対象は、以前に、ｗＰワクチンを接種することによって、または百日咳菌による自然感染によって、百日咳菌抗原に曝露されている場合もある。典型的には、ａＰプライミングワクチンを接種しているヒト対象が、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標））を含有しないａＰブースターワクチンを接種する場合、非ＴＬＲアゴニストを含むａＰブースターワクチンは、ａＰプライミングワクチンによって誘導されたＴｈ２優位の免疫応答をブーストする。対照的に、本明細書に記載される、ＴＬＲアゴニストを含む改変されたａＰブースターワクチンは、予想外なことに、ａＰプライミングワクチンによって誘導されたＴｈ２優位の免疫応答を、Ｔｈ１優位の免疫応答またはＴｈ１／Ｔｈ１７優位の免疫応答へと新たに方向付ける。
【0017】
態様２のある特定の実施形態では、Ｔｈ１優位の免疫応答は、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標））を含有しないａＰプライミングワクチンまたはａＰブースターワクチンによって誘導される免疫応答と比較したときの、ＩＬ－５保護の減少、ＩＦＮ－γ保護の増加、またはより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比のうちの１つまたは複数によって特徴付けられる。態様２のある特定の実施形態では、Ｔｈ１優位の免疫応答は、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標））を含有しないａＰプライミングワクチンまたはａＰブースターワクチンによって誘導される免疫応答と比較したときの、ＩＬ－５保護の減少および／またはより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比によって特徴付けられる。態様２のある特定の実施形態では、Ｔｈ１／Ｔｈ１７優位の応答は、ＩＬ－１７保護の増加ならびに、ＩＬ－５保護の減少またはより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比のうちの１つまたは複数によって特徴付けられる。態様２のある特定の実施形態では、Ｔｈ１／Ｔｈ１７優位の応答は、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標））を含有しないａＰプライミングワクチンまたはａＰブースターワクチンによって誘導される免疫応答と比較したときの、ＩＬ－１７保護の増加ならびに、ＩＬ－５保護の減少またはより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比のうちの１つまたは複数によって特徴付けられる。
【0018】
態様１および２のある特定の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４アゴニストである。好ましくは、ＴＬＲ４アゴニストは、ヒトＴＬＲ４のアゴニストである。ある特定の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、Ｅ６０２０である。
【0019】
態様１および２の他の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ９アゴニストである。好ましくは、ＴＬＲ９アゴニストは、ヒトＴＬＲ９のアゴニストである。ある特定の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、クラスＡ、クラスＢ、クラスＣ、またはクラスＰのＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＣｐＧ１０１８であり、その場合、配列番号１の全てのヌクレオチドは、ホスホロチオ酸結合で連結されている。
ある特定の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＣｐＧ１０１８であり、その場合、配列番号１の全てのヌクレオチドは、ホスホロチオ酸結合で連結されている。
【0020】
態様１および２のある特定の実施形態では、破傷風トキソイドは、８～１２Ｌｆ／ｍＬ、場合により９～１１Ｌｆ／ｍＬ、または場合により１０Ｌｆ／ｍＬの量で存在する。
【0021】
態様１および２のある特定の実施形態では、ジフテリアトキソイドは、３～８Ｌｆ／ｍＬ、場合により３～６Ｌｆ／ｍＬ、または場合により４～５Ｌｆ／ｍＬの量で存在する。
【0022】
態様１および２のある特定の実施形態では、解毒された百日咳毒素は、遺伝子的に解毒された百日咳毒素（ｇｄＰＴ）である。ある特定の実施形態では、ｇｄＰＴは、Ｒ９における変異を含む。
ある特定の実施形態では、ｇｄＰＴは、Ｒ９Ｋ変異およびＥ１２９Ｇ変異を含む。ある特定の実施形態では、ｇｄＰＴは、４～３０μｇ／ｍＬ、場合により１６～２４μｇ／ｍＬ、場合により１８～２２μｇ／ｍＬ、または場合により２０μｇ／ｍＬの量で存在する。
ある特定の実施形態では、ｇｄＰＴは、Ｒ９Ｋ変異およびＥ１２９Ｇ変異を含む。ある特定の実施形態では、ｇｄＰＴは、４～３０μｇ／ｍＬ、場合により１６～２４μｇ／ｍＬ、場合により１８～２２μｇ／ｍＬ、または場合により２０μｇ／ｍＬの量で存在する。
【0023】
態様１および２のある特定の実施形態では、線維状赤血球凝集素は、５～１５μｇ／ｍＬ、場合により８～１２μｇ／ｍＬ、または場合により１０μｇ／ｍＬの量で存在する。
【0024】
態様１および２のある特定の実施形態では、パータクチンは、５～１５μｇ／ｍＬ、場合により８～１２μｇ／ｍＬ、または場合により１０μｇ／ｍＬの量で存在する。
【0025】
態様１および２のある特定の実施形態では、線毛タイプ２および３は、１０～２０μｇ／ｍＬ、場合により１４～１６μｇ／ｍＬ、または場合により１５μｇ／ｍＬの量で存在する。
【0026】
態様１および２のある特定の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニスト、例えば、Ｅ６０２０などは、１０μｇ／ｍＬ以下、場合により０．５～５μｇ／ｍＬ、または場合により２μｇ／ｍＬ以下の量で存在する。
【0027】
態様１および２のある特定の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニスト、例えば、ＣｐＧ１０１８などは、２５０～７５０μｇ／ｍＬ、場合により４００～６００μｇ／ｍＬ、または場合により５００μｇ／ｍＬの量で存在する。
【0028】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、約８～１２Ｌｆ／ｍＬ、場合により９～１１Ｌｆ／ｍＬの量の破傷風トキソイド；約３～８Ｌｆ／ｍＬ、場合により３～６Ｌｆ／ｍＬの量のジフテリアトキソイド；約１６～２４μｇ／ｍＬ、場合により１８～２２μｇ／ｍＬの量の遺伝子的に解毒された百日咳毒素；約５～１５μｇ／ｍＬ、場合により８～１２μｇ／ｍＬの量の線維状赤血球凝集素；約５～１５μｇ／ｍＬ、場合により８～１２μｇ／ｍＬの量のパータクチン；約１０～２０μｇ／ｍＬ、場合により１４～１６μｇ／ｍＬの量の線毛タイプ２および３；約０．２５～０．７５ｍｇ／ｍＬ、場合により０．６～０．７ｍｇ／ｍＬの量の水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）；ならびに１０μｇ／ｍＬ以下および場合により０．５～５μｇ／ｍＬまたは場合により１～２μｇ／ｍＬの量のＴＬＲ４アゴニスト、例えば、Ｅ６０２０などを含む。あるいは、ａＰブースターワクチンは、ＴＬＲ４アゴニストの代わりに、ＴＬＲ９アゴニスト、例えば、ＣｐＧ１０１８などを、２５０～７５０μｇ／ｍＬ、場合により４００～６００μｇ／ｍＬの量で含み得る。
【0029】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、１０Ｌｆ／ｍＬの量の破傷風トキソイド；４～５Ｌｆ／ｍＬの量のジフテリアトキソイド；２０μｇ／ｍＬの量の遺伝子的に解毒された百日咳毒素；１０μｇ／ｍＬの量の線維状赤血球凝集素；１０μｇ／ｍＬの量のパータクチン；１５μｇ／ｍＬの量の線毛タイプ２および３；０．６６ｍｇ／ｍＬの量の水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）；ならびに２μｇ／ｍＬ以下の量のＴＬＲ４アゴニスト、例えば、Ｅ６０２０などを含む。あるいは、ａＰブースターワクチンは、ＴＬＲ４アゴニストの代わりに、ＴＬＲ９アゴニスト、例えば、ＣｐＧ１０１８などを、５００μｇ／ｍＬの量で含み得る。
【0030】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、０．５ｍＬの用量あたり４～６Ｌｆ、場合により４．５～５．５Ｌｆ、または場合により５Ｌｆの量で破傷風トキソイドを含む。
【0031】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、１～４Ｌｆ、場合により１．５～３Ｌｆ、または場合により２～２．５Ｌｆの量でジフテリアトキソイドを含む。
【0032】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、典型的には０．５ｍＬ用量あたりである、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、２～１２μｇ、場合により８～１２μｇ、または場合により１０μｇの量で遺伝子的に解毒された百日咳毒素を含む。
【0033】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、２．５～７．５μｇ、場合により４～６μｇ、または場合により５μｇの量で線維状赤血球凝集素を含む。
【0034】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、２．５～７．５μｇ、場合により４～６μｇ、または場合により５μｇの量で存在するパータクチンを含む。
【0035】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、５～１０μｇ、場合により７～８μｇ、または場合により７．５μｇの量で線毛タイプ２および３を含む。
【0036】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、５μｇ以下、場合により０．２５～２．５μｇ、または場合により１μｇ以下の量でＴＬＲ４アゴニスト、例えば、Ｅ６０２０などを含む。
【0037】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、１２５～３７５μｇ、場合により２００～３００μｇ、または場合により２５０μｇの量でＴＬＲ９アゴニスト、例えば、ＣｐＧ１０１８などを含む。
【0038】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、０．５ｍＬ用量あたり以下の成分：約４～６Ｌｆ、場合により４．５～５．５Ｌｆの量の破傷風トキソイド；約１～４Ｌｆ、場合により１．５～３Ｌｆの量のジフテリアトキソイド；約２～１２μｇ、場合により８～１２μｇの量の遺伝子的に解毒された百日咳毒素；約２．５～７．５μｇ、場合により４～６μｇの量の線維状赤血球凝集素；約２．５～７．５μｇ、場合により４～６μｇの量のパータクチン；約５～１０μｇ、場合により７～８μｇの量の線毛タイプ２および３；約０．１２５～０．３７５ｍｇ、場合により０．３～０．３５ｍｇの量の水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）；ならびに５μｇ以下、場合により０．２５～２．５μｇの量のＴＬＲ４アゴニスト、例えば、Ｅ６０２０などを含む。あるいは、ａＰブースターワクチンは、ＴＬＲ４アゴニストの代わりに、ＴＬＲ９アゴニスト、例えば、ＣｐＧ１０１８などを、１２５～３７５μｇ、場合により２００～３００μｇの量で含み得る。
【0039】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、０．５ｍＬ用量あたり以下の成分：５Ｌｆの量の破傷風トキソイド；２～３Ｌｆの量のジフテリアトキソイド；１０μｇの量の遺伝子的に解毒された百日咳毒素；５μｇの量の線維状赤血球凝集素；５μｇ／ｍＬの量のパータクチン；約７．５μｇの量の線毛タイプ２および３；０．３３ｍｇの量の水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）；ならびに１μｇ／ｍＬ以下の量のＴＬＲ４アゴニスト、例えば、Ｅ６０２０などを含む。あるいは、ａＰブースターワクチンは、ＴＬＲ４アゴニストの代わりに、ＴＬＲ９アゴニスト、例えば、ＣｐＧ１０１８などを、２５０μｇの量で含み得る。
【0040】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンはさらに、以下の抗原：ヘモフィルスインフルエンザタイプｂオリゴ糖または多糖コンジュゲート（Ｈｉｂ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、および／または不活性化ポリオウイルスタイプ１、２、および３（ＩＰＶ）、のうちの１つまたは複数を含む。
【0041】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンはさらに、トリス緩衝食塩水を含む。
【0042】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、０．２５～０．７５ｍｇ／ｍＬ、場合により０．６～０．７ｍｇ／ｍＬ、または場合により０．６６ｍｇ／ｍＬのアルミニウム濃度を有する。態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、０．１２５～０．３７５ｍｇ、場合により０．３～０．３５ｍｇ、または場合により０．３３ｍｇの量でアルミニウムを含有する。
【0043】
態様１および２のある特定の実施形態では、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および解毒された百日咳毒素のうちの少なくとも１つは、アルミニウム塩に吸着される。ある特定の実施形態では、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、解毒された百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ならびに線毛タイプ２および３は、アルミニウム塩に吸着される。ある特定の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストまたはＴＬＲ９アゴニストは、アルミニウム塩と共に製剤化される。ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンにおける細菌性抗原の全てならびにＴＬＲ４またはＴＬＲ９アゴニストは、アルミニウム塩と共に製剤化される。
【0044】
態様１および２のある特定の実施形態では、アルミニウム塩は、水酸化アルミニウムである。態様１および２のある特定の実施形態では、アルミニウム塩は、リン酸アルミニウムである。
【0045】
態様１および２のある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンはさらに、ヘモフィルスインフルエンザタイプｂ糖（Ｈｉｂ）コンジュゲート、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、および／または不活性化ポリオウイルス（ＩＰＶ）
を含む。
を含む。
【0046】
態様２のある特定の実施形態では、ヒト対象は、ａＰブースターワクチンが投与されるときに４歳以上である。
【0047】
態様２のある特定の実施形態では、ヒト対象は、ａＰブースターワクチンが投与されるときに１０歳以上である。
【0048】
態様２のある特定の実施形態では、Ｔｈ１優位の免疫応答は、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標））を含有しない無細胞百日咳ワクチンまたはａＰブースターワクチンと比較したときの、ＩＬ－５保護の減少、ＩＦＮ－γ保護の増加、ＩＬ－１７保護の増加、またはより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比のうちの１つまたは複数によって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、Ｔｈ１優位の免疫応答は、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標））を含有しない無細胞百日咳ワクチンまたはａＰブースターワクチンと比較したときの、ＩＬ－５保護の減少またはより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比のうちの１つまたは複数によって特徴付けられる。
【0049】
態様２のある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、解毒された百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、およびパータクチンを含むが、ただし、ａＰプライミングワクチンはＴＬＲアゴニストを含有しない。ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、これらに限定されるわけではないが、ＤＡＰＴＡＣＥＬ（登録商標）、ＩＮＦＡＮＲＩＸ（登録商標）、ＩＮＦＡＮＲＩＸ－ＨＥＸＡ（登録商標）、ＰＥＮＴＡＣＥＬ（登録商標）、ＱＵＡＤＲＡＣＥＬ（登録商標）、ＫＩＮＲＩＸ（登録商標）、ＰＥＤＩＡＲＩＸ（登録商標）、またはＶＡＸＥＬＩＳ（登録商標）の１つまたは複数の用量を含む。ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、ＤＡＰＴＡＣＥＬ（登録商標）を含む。ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、ＩＮＦＡＮＲＩＸ（登録商標）またはＩＮＦＡＮＲＩＸ－ＨＥＸＡ（登録商標）を含む。ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、ＰＥＮＴＡＣＥＬ（登録商標）を含む。ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、ＫＩＮＲＩＸ（登録商標）またはＰＥＤＩＡＲＩＸ（登録商標）を含む。ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、ＶＡＸＥＬＩＳ（登録商標）を含む。
【0050】
本開示のさらなる適用範囲は、以下において提供される詳細な説明から明らかとなるであろう。詳細な説明および特定の実施例は、本開示のいくつかの望ましい態様を示すが、例示の目的を意図するものであって、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0051】
【図1】図１Ａ～Ｂは、ＰＴ特異的抗体応答を惹起する点での遺伝子的に解毒されたＰＴ（ｇｄＰＴ）免疫原性と化学的に解毒されたＰＴ（ＰＴｘｄ）の比較を示す図である。図１Ａは、２回の免疫処置後にＥＬＩＳＡにより測定した抗ＰＴ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体力価を示す。図１Ｂは、２回の免疫処置後にＣＨＯアッセイにより測定したときの抗ＰＴ中和力価を示す。マウスを２回、０日目および２１日目に免疫処置した。２回目の免疫処置の１７日後（３８日目）にマウスから採血した。
【図2】図２Ａ～Ｂは、ＰＴｘｄでプライミングされた応答のＰＴｘｄまたはｇｄＰＴでのブースト可能性の比較を示す図である。図２Ａは、ＰＴｘｄまたはｇｄＰＴでのプライミング、その後のＰＴｘｄまたはｇｄＰＴでのブースティングの後の、ＥＬＩＳＡ ＰＴ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧａ２応答を示す。図２Ｂは、ＣＨＯアッセイにより測定したときのＰＴｘｄまたはｇｄＰＴでのプライミング、その後のＰＴｘｄまたはｇｄＰＴでのブースティングの後の、ＰＴ中和力価を示す。マウスを３回、０、２１および４２日目に免疫処置した。２回目の免疫処置の１７日後および３回目の免疫処置の８日後にマウスから採血した。
【図4】図４Ａ～Ｂは、３回の免疫処置後のｇｄＰＴ誘導抗ＰＴ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答ならびに中和抗体応答に対する他のＴｄａｐ抗原による免疫学的干渉の評価を示す。図４Ａは、３回の免疫処置後にＥＬＩＳＡにより測定したときの抗ＰＴ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体力価を示す。図４Ｂは、３回の免疫処置後にＣＨＯアッセイにより測定したときの抗ＰＴ中和力価を示す。
【図5】図５は、長期プライム－ブーストスケジュールを使用して、サイトカイン（ＩＬ－５、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７）レベルを測定することにより、ＤＴａＰ誘導Ｔｈ２免疫記憶応答を下方調節する改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）および改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）製剤の能力を示す図である。サイトカインレベルは、フルオロスポットアッセイにより測定した。
【図6-1】図６Ａ～Ｌは、異なるプライム／ブーストスケジュール後にマウスにおいて誘導された異なる抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのレベルを示す図である。ナイーブ成体ＣＤ１マウスをＤＴｗＰまたはＤＴａＰの筋肉内注射で免疫処置（プライミング）した。４２日後（Ｄ４２）に、ＤＴｗＰでプライミングしたマウスを、ＤＴｗＰワクチンでブーストし、ＤＴａＰでプライミングしたマウスを、改変ＴｄａＰワクチン（ｍＴｄａＰ－ＡｌＯＯＨ、ｍＴｄａＰ－ＣｐＧ－ＡｌＯＯＨまたはｍＴｄａＰ－Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）でブーストした。長期プライム－ブーストスケジュールを使用して、ブーストの４２日後（Ｄ８４）に採取した血清において、およびＤ８４の２回目のブースト後の４２日後（Ｄ１２６）に再度採取した血清において、改良型ＥＬＩＳＡ（ＭＳＤ）によりＦＨＡ特異的およびＦＩＭ２，３特異的、ＰＲＮ特異的、ＰＴ特異的、ＤＴ特異的およびＴＴ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体応答を評定した。図６Ａ～Ｌ中のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａバーの上の数字は、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を表し、数字が小さいほど低い比を表し、または逆に比が低いほど小さい数字を表す。より低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比が、ＴＬＲアゴニスト（ＣｐＧまたはＥ６０２０）を含有する改変Ｔｄａｐワクチンでブーストしたマウスにおいて観察された。図６Ａおよび図６Ｂは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ結果、ならびにＦＨＡについてのＤ８４およびＤ１２６における比をそれぞれ示す。図６Ｃおよび図６Ｄは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ結果、ならびにＦＩＭについてのＤ８４およびＤ１２６における比をそれぞれ示す。図６Ｅおよび図６Ｆは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ結果、ならびにＰＲＮについてのＤ８４およびＤ１２６における比をそれぞれ示す。図６Ｇおよび図６Ｈは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ結果、ならびにｇｄＰＴについてのＤ８４およびＤ１２６における比をそれぞれ示す。図６Ｉおよび図６Ｊは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ結果、ならびにＤＴについてのＤ８４およびＤ１２６における比をそれぞれ示す。図６Ｋおよび図６Ｌは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ結果、ならびにＴＴについてのＤ８４およびＤ１２６における比をそれぞれ示す。
【図8A】図８Ａ～Ｂは、プール血清（ｎ＝４、１プール当たりマウス６～７匹）の平均Ｌｏｇ１０ ＩｇＧ力価±ＳＥＭにより測定したときのマウス養子移入モデルにおけるＰＴ特異的、ＰＲＮ特異的、ＦＨＡ特異的およびＦＩＭ２，３特異的ＩｇＧ抗体の動態を示す図である。図８Ａは、ブースト後のいくつかの時点でのＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）、ＤＴｗＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）、またはＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）に対するＩｇＧ応答を示す。図８Ｂは、ＤＴａＰプライミングワクチン後の、養子移入マウスにおける改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）ブーストおよび改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ブーストの、Ｔｄａｐブーストに対する応答と比較して加速された、より高い抗ＰＴ、ＰＲＮ、ＦＨＡおよびＦＩＭ２，３ ＩｇＧ力価を示す。図８ＡでのＰ値＜０．０５は、次のことを示す：＊ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ＤＴｗＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）；＃ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）；‡ ＤＴｗＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）。
【図8B】図８Ａ～Ｂは、プール血清（ｎ＝４、１プール当たりマウス６～７匹）の平均Ｌｏｇ１０ ＩｇＧ力価±ＳＥＭにより測定したときのマウス養子移入モデルにおけるＰＴ特異的、ＰＲＮ特異的、ＦＨＡ特異的およびＦＩＭ２，３特異的ＩｇＧ抗体の動態を示す図である。図８Ａは、ブースト後のいくつかの時点でのＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）、ＤＴｗＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）、またはＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）に対するＩｇＧ応答を示す。図８Ｂは、ＤＴａＰプライミングワクチン後の、養子移入マウスにおける改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）ブーストおよび改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ブーストの、Ｔｄａｐブーストに対する応答と比較して加速された、より高い抗ＰＴ、ＰＲＮ、ＦＨＡおよびＦＩＭ２，３ ＩｇＧ力価を示す。図８ＡでのＰ値＜０．０５は、次のことを示す：＊ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ＤＴｗＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）；＃ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）；‡ ＤＴｗＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）。
【図9A】図９Ａ～Ｂは、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）および改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）製剤でのブースティングが、百日咳菌の鼻腔内チャレンジ後に早期のおよび／または加速された細菌クリアランスをもたらすことを示す図である。図９Ａは、ＤＴａＰまたはＤＴｗＰでのプライミング、その後のＴｄａｐまたはＤＴｗＰブーストの後の、クリアランスの結果を示す。図９Ｂは、ＤＴａｐでのプライミング、その後のＴｄａｐ、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）または改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８）ブーストの後の、クリアランスの結果を示す。図９ＡおよびＢは、１群あたりマウスｎ＝３～４についての示されている時点での肺１つ当たりのＣＦＵの数のＬｏｇ１０値±ＳＥＭを示す。図９Ｂでの＜０．０５は、次のことを示す：＊ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ＤＴａＰ／ｍＴｄａｐ－ＣＰＧ－ＡｌＯＯＨ（プライム／ブースト）；§ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ＤＴａＰ／ｍＴｄａｐ－ＣＰＧ－ＡｌＯＯＨ（プライム／ブースト）；＋ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ｍＴｄａｐ－Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ（プライムのみ）；＄ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ｍＴｄａｐ－ＣＰＧ－ＡｌＯＯＨ（プライムのみ）；＃ ＤＴａＰ／ｍＴｄａｐ－ＣＰＧ－ＡｌＯＯＨ（プライム／ブースト）対ＤＴａＰ／ｍＴｄａｐ－Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ（プライム／ブースト）。試験した個々のマウス（１時点当たり１群当たり４匹）。統計検定：二元配置ＡＮＯＶＡ。記号は、有意性が見られる時点を示す。
【図9B】図９Ａ～Ｂは、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）および改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）製剤でのブースティングが、百日咳菌の鼻腔内チャレンジ後に早期のおよび／または加速された細菌クリアランスをもたらすことを示す図である。図９Ａは、ＤＴａＰまたはＤＴｗＰでのプライミング、その後のＴｄａｐまたはＤＴｗＰブーストの後の、クリアランスの結果を示す。図９Ｂは、ＤＴａｐでのプライミング、その後のＴｄａｐ、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）または改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８）ブーストの後の、クリアランスの結果を示す。図９ＡおよびＢは、１群あたりマウスｎ＝３～４についての示されている時点での肺１つ当たりのＣＦＵの数のＬｏｇ１０値±ＳＥＭを示す。図９Ｂでの＜０．０５は、次のことを示す：＊ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ＤＴａＰ／ｍＴｄａｐ－ＣＰＧ－ＡｌＯＯＨ（プライム／ブースト）；§ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ＤＴａＰ／ｍＴｄａｐ－ＣＰＧ－ＡｌＯＯＨ（プライム／ブースト）；＋ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ｍＴｄａｐ－Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ（プライムのみ）；＄ ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）対ｍＴｄａｐ－ＣＰＧ－ＡｌＯＯＨ（プライムのみ）；＃ ＤＴａＰ／ｍＴｄａｐ－ＣＰＧ－ＡｌＯＯＨ（プライム／ブースト）対ＤＴａＰ／ｍＴｄａｐ－Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ（プライム／ブースト）。試験した個々のマウス（１時点当たり１群当たり４匹）。統計検定：二元配置ＡＮＯＶＡ。記号は、有意性が見られる時点を示す。
【図10C】図１０Ｃは、ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）およびＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）が、ＩＮＣＡ短期モデルにおいて鼻腔内チャレンジ後にマウスの百日咳菌の肺コロニー形成を防ぐことを示す。
【図11】図１１は、短期プライム－ブーストスケジュールを使用して、マウス鼻腔内チャレンジアッセイ（ＩＮＣＡ）において、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）ブースターが、Ｔｄａｐブースターと比較して百日咳菌クリアランスを有意に加速させることを示す。
【図12A】図１２Ａ～Ｂは、長期プライム－ブーストスケジュールを使用して、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）および改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ブースターワクチンが、ＤＴａＰでプライミングしたマウスの下気道の疾患およびコロニー形成を防ぐことができることを示す図である。図１２Ａは、チャレンジの３日後の全てのワクチン接種群における低減を示し、全ての処置群が７日目にベースライン細菌負荷量に達したことを示す。図１２Ｂは、全ての無細胞百日咳投与スケジュールがＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）投与スケジュールと同様の動態を有したことを示す。
【図12B】図１２Ａ～Ｂは、長期プライム－ブーストスケジュールを使用して、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）および改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ブースターワクチンが、ＤＴａＰでプライミングしたマウスの下気道の疾患およびコロニー形成を防ぐことができることを示す図である。図１２Ａは、チャレンジの３日後の全てのワクチン接種群における低減を示し、全ての処置群が７日目にベースライン細菌負荷量に達したことを示す。図１２Ｂは、全ての無細胞百日咳投与スケジュールがＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）投与スケジュールと同様の動態を有したことを示す。
【図13A】図１３Ａ～Ｂは、フルオロスポットアッセイにより測定して、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤でのＤＴａＰプライミング免疫処置に対するブースティングが、ＩＬ－１７産生をＥ６０２０用量依存的に誘導することを示す図である。ＤＴａＰで免疫処置し、ｍＴｄａｐ－Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨで２回（Ｄ０およびＤ２１）ブーストしたＣＤ１マウスからの脾細胞を単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＴｘ（図１３Ａ）またはＰＴｘ、ＰＲＮおよびＦＩＭからなる百日咳抗原のプール（図１３Ｂ）で再刺激した。
【発明を実施するための形態】
【0052】
様々な望ましい態様についての以下の説明は、本質的に単なる例示であり、いかなる点においても本開示、その用途、または使用を制限することを意図するものではない。
【0053】
全体を通して使用される場合、範囲は、その範囲内のありとあらゆる値を説明するための省略表現として使用される。範囲内の任意の値は、範囲の終点として選択することができる。さらに、本明細書において引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本開示の説明と引用された参考文献の説明が矛盾する場合、本開示が優先される。
【0054】
本明細書において使用される場合、「ａＰ」は、無細胞百日咳菌ワクチンを意味する。現在の無細胞百日咳菌ワクチンは、典型的には、以下の病原性因子：解毒された百日咳毒素（ＰＴ）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチン（ＰＲＮ）、線毛性凝集原２および線毛性凝集原３（ＦＩＭ２／３またはＦＩＭ）に基づいている。いくつかの無細胞百日咳ワクチンは、ＰＴおよびＦＨＡのみあるいはＰＴ、ＦＨＡ、およびＰＲＮを含むが、一般的に、ＰＴ、ＦＨＡ、ＰＲＮ、およびＦＩＭ２／３成分を含む無細胞百日咳ワクチンは、現在利用可能な最も効果的なａＰワクチンであると考えられている。典型的には、無細胞百日咳ワクチンは、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドと共に製剤化される。
【0055】
本明細書において使用される場合、「ｗＰ」は、全細胞百日咳菌ワクチンを意味する。典型的には、全細胞百日咳ワクチンは、化学的に解毒され、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドと共に製剤化された、百日咳菌の全細胞を含む。
【0056】
本明細書において使用される場合、「ＤＴｗＰ」は、初回のワクチン接種として乳幼児において、ならびにブースターとして小児において、ジフテリア、破傷風、および百日咳の予防に適応されるｗＰを意味する。ＤＴｗＰの一例は、Ｄ．Ｔ．ＣＯＱ／Ｄ．Ｔ．Ｐ．に対してであり、これらは、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒによって市販されており、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドと、チオメルサールの存在下において熱によって不活性化された百日咳菌と、リン酸アルミニウムとを含む。
【0057】
本明細書において使用される場合、「ＤＴａＰ」は、乳幼児および小児において、ジフテリア、破傷風、および百日咳に対する能動免疫処置に適応されるａＰを意味する。典型的には、ＤＴａＰは、６週間から６歳までの乳幼児および小児において５回の一連の投薬として、または６週から２～４歳の乳幼児および小児において４回の一連の投薬として投与される。ＤＴａＰの例としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒによって市販され、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドと、下記の無細胞百日咳抗原：ＰＴ（化学的に解毒されたもの）、ＦＨＡ、ＰＲＮ、およびＦＩＭ２／３と、リン酸アルミニウムとを含む、ＤＡＰＴＡＣＥＬ（登録商標）、ＰＥＮＴＡＣＥＬ（登録商標）、ならびにＩＮＦＡＮＲＩＸ（登録商標）またはＩＮＦＡＮＲＩＸ－ＨＥＸＡ（登録商標）、ＤＡＰＴＡＣＥＬ（登録商標）が挙げられる。典型的には、ＤＴａＰは、Ｔｄａｐと比較して、増量されたジフテリアトキソイドおよびＰＴを含む。
【0058】
本明細書において使用される場合、「Ｔｄａｐ」は、破傷風、ジフテリア、および百日咳に対する能動ブースター免疫処置に適応されるａＰを意味する。典型的には、Ｔｄａｐは、１０歳以上の個人において１回用量として投与される。ＴｄａｐＰの例としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒによって市販され、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドと、下記の無細胞百日咳抗原：ＰＴ（化学的に解毒されたもの）、ＦＨＡ、ＰＲＮ、およびＦＩＭ２／３と、リン酸アルミニウムとを含む、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標）およびＢＯＯＳＴＲＩＸ（登録商標）、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標）が挙げられる。典型的には、Ｔｄａｐは、ＤＴａＰと比較して、減量されたジフテリアトキソイドおよびＰＴを含む。
【0059】
本明細書において使用される場合、「改変されたＴｄａｐ」または「ｍＴｄａｐ」は、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドならびに下記の無細胞百日咳抗原：遺伝子改変されたＰＴ、ＦＨＡ、ＰＲＮ、およびＦＩＭ２／３を含む、改変されたバージョンのＴｄａｐワクチンを意味する。改変されたＴｄａｐは、少なくとも改変されたＴｄａｐがＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、Ｅ６０２０）またはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ１０１８））を含むことから、Ｔｄａｐとは異なっている。改変されたＴｄａｐは、場合により、化学的に解毒されたＰＴ（ＰＴｄｘ）の代わりに遺伝子的に解毒されたＰＴ（ｇｄＰＴ）、またはリン酸アルミニウムの代わりに水酸化アルミニウムも含む。ある特定の実施形態では、ｍＴｄａｐは、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、Ｅ６０２０）またはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ１０１８））、遺伝子的に解毒されたＰＴ（ｇｄＰＴ）、および水酸化アルミニウムを含む。
【0060】
本明細書において使用される場合、「ブースター」または「ブースターワクチン」は、プライミングワクチンの後に投与されるワクチンを意味する。ブースターワクチンは、プライミングワクチンに含まれていた抗原を含み、それにより、免疫系は、ブースターワクチンの投与の前に、既にそのような抗原に曝露されている。
【0061】
本明細書において使用される場合、「プライミングワクチン」は、ブースターワクチンの前に投与され、一次免疫応答および免疫学的記憶を誘導する、ワクチン接種スケジュールにおけるワクチンの１回または複数回の投薬を意味する。
【0062】
Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答
抗原に応答するＣＤ４ Ｔヘルパー細胞は、それらが産生するサイトカインに基づいて分類することができる。タイプ１ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）は、優先的に、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、およびＴＮＦ－βなどの炎症性サイトカインを産生する。Ｔｈ１細胞は、マクロファージを活性化し、典型的には、細胞媒介免疫応答および貪食細胞依存性防御応答（例えば、抗体のオプソニン化）に関連している。その一方で、タイプ２ヘルパー細胞（Ｔｈ２）は、優先的に、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１３などのサイトカインを産生する。Ｔｈ２細胞は、Ｂ細胞を活性化し、典型的には、抗原媒介免疫応答に関連している。
抗原に応答するＣＤ４ Ｔヘルパー細胞は、それらが産生するサイトカインに基づいて分類することができる。タイプ１ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）は、優先的に、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、およびＴＮＦ－βなどの炎症性サイトカインを産生する。Ｔｈ１細胞は、マクロファージを活性化し、典型的には、細胞媒介免疫応答および貪食細胞依存性防御応答（例えば、抗体のオプソニン化）に関連している。その一方で、タイプ２ヘルパー細胞（Ｔｈ２）は、優先的に、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１３などのサイトカインを産生する。Ｔｈ２細胞は、Ｂ細胞を活性化し、典型的には、抗原媒介免疫応答に関連している。
【0063】
小児における研究は、ｗＰプライミングワクチンはＴｈ１優位の応答を優先的に誘導するが、その一方で、ａＰプライミングワクチンはＴｈ２優位の応答を優先的に誘導することを示した。Ｒｙａｎら、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 １９９８、 ９３：１～１０； Ａｕｓｉｅｌｌｏら、 Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、 １９９７、 ６５：２１６８～７４。異なるサイトカインプロファイルを誘導することに加えて、ａＰプライミングワクチンは、マウスにおいて、支配的にＩｇＧ１抗原を誘導するが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４も誘導し、ブースターワクチン接種後に増加するＩｇＧ４の割合は、Ｔｈ２優位の応答を反映し（Ｓｔｅｎｇｅｒら、 Ｖａｃｃｉｎｅ、 ２０１０、 ２８：６６３７～４６およびＢｒｕｍｍｅｌｍａｎら、 Ｖａｃｃｉｎｅ、 ２０１５、 ３３：１４８３～１９）、その一方で、ｗＰプライミングワクチンは、マウスにおいて、支配的にＩｇＧ２抗体を誘導し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３も誘導し、（Ｒａｅｖｅｎら、 Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ、 ２０１５、 １４：２９２９～４２）、それは、Ｔｈ１優位の応答に一致する。
【0064】
本明細書において開示されるように、本願に記載される改変されたａＰブースターワクチンは、以前に投与されたａＰワクチンによって誘導されるＴｈ２優位の免疫応答を、Ｔｈ１または混合Ｔｈ１／Ｔｈ１７優位の免疫応答へと新たに方向付けることができる。前節において引用した文献などの関連文献に反映されるように、当業者は、従来技術を使用してサイトカインプロファイルおよび抗体アイソタイプを測定することによって、ａＰワクチンがＴｈ１優位の応答とＴｈ２優位の応答のどちらを誘導するかを容易に特定することができる。典型的には、マウスにおいてａＰワクチンによって誘導されたＴｈ２優位の免疫応答は、ＩＬ－５レベルの増加および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の増加に関連付けられており、その一方で、Ｔｈ１優位の免疫応答は、典型的には、ＩＬ－５レベルの減少、ＩＦＮ－γレベルの増加、またはＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の減少のうちの１つまたはそれ以上に関連付けられている。例えば、以前に投与されたａＰワクチンによって誘導されるＴｈ２優位の免疫応答を、Ｔｈ１優位の免疫応答へと新たに方向付ける、本明細書に記載されるａＰブースターワクチンの能力は、以前に投与された、ＴＬＲアゴニストを含有しないａＰワクチンまたはａＰブースターワクチンによって誘導される免疫応答と比較して、ＩＬ－５レベルの減少および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の減少を示す。Ｔｈ１７応答は、ＩＬ－１７の産生によって測定される。
【0065】
破傷風トキソイド
破傷風トキソイドは、グラム陽性の桿状芽胞形成性桿菌である破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）から産生される。破傷風トキソイドは、約１５０ｋＤａのタンパク質であり、スルフィド結合によって連結された２つのサブユニット（約１００ｋＤａおよび約５０ｋＤａ）からなる。破傷風トキソイドは、典型的には、ホルムアルデヒドによって解毒され、既知の方法、例えば、ＷＯ１９９６／０２５４２５などにおいて開示されるような、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法および／またはクロマトグラフィ技術などを使用して培養ろ液から精製することができる。破傷風菌は、任意の好適な増殖培地、例えば、ビーフハートインフュージョン（ｂｅｅｆ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）を用いないＭｕｅｌｌｅｒ－Ｍｉｌｌｅｒカザミノ酸培地（Ｍｕｅｌｌｅｒら、 Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １９５４、 ６７（３）：２７１～２７７）またはウシカゼイン由来のＬａｔｈａｍ培地などにおいて増殖させることができる。破傷風トキソイドは、遺伝子組換えによる遺伝的手段によっても不活性される。
破傷風トキソイドは、グラム陽性の桿状芽胞形成性桿菌である破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）から産生される。破傷風トキソイドは、約１５０ｋＤａのタンパク質であり、スルフィド結合によって連結された２つのサブユニット（約１００ｋＤａおよび約５０ｋＤａ）からなる。破傷風トキソイドは、典型的には、ホルムアルデヒドによって解毒され、既知の方法、例えば、ＷＯ１９９６／０２５４２５などにおいて開示されるような、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法および／またはクロマトグラフィ技術などを使用して培養ろ液から精製することができる。破傷風菌は、任意の好適な増殖培地、例えば、ビーフハートインフュージョン（ｂｅｅｆ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）を用いないＭｕｅｌｌｅｒ－Ｍｉｌｌｅｒカザミノ酸培地（Ｍｕｅｌｌｅｒら、 Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １９５４、 ６７（３）：２７１～２７７）またはウシカゼイン由来のＬａｔｈａｍ培地などにおいて増殖させることができる。破傷風トキソイドは、遺伝子組換えによる遺伝的手段によっても不活性される。
【0066】
破傷風トキソイドの量は、「Ｌｆ」単位として表現することができ（すなわち、凝集の限界または凝集単位）、それは、１国際単位の抗毒素と混合したときに最適に凝集する混合物を生成するトキソイドの量として定義される。ＷＨＯのＴｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓのモジュール１（Ｇａｌａｚｋａ）を参照されたい。組成物中の破傷風トキソイドの量は、組成物を、凝集アッセイにおいて、参照試薬で較正された参照材料と比較することによって容易に特定することができる。
【0067】
ジフテリアトキソイド
ジフテリアトキソイドは、グラム陽性の非芽胞形成性好気性菌であるジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって産生されるＡＤＰリボシル化外毒素である。破傷風トキソイドと同様に、ジフテリアトキソイドは、非毒性だが依然として抗原性であるトキソイドを得るために、典型的にはホルムアルデヒドを使用して解毒される。ジフテリア菌は、任意の好適な増殖培地、例えば、変性Ｍｕｅｌｌｅｒ増殖培地（Ｓｔａｉｎｅｒ、 ＤＷ、 Ｉｎ： Ｍａｎｃｌａｒｋ ＣＲ、 編集者、 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｆｏｒｍａｌ ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＷＨＯ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、 ｔｅｔａｎｕｓ、 ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ、 Ｕ．Ｓ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ、 ＭＤ． ＤＨＨＳ ９１～１１７４、 １９９１、 ７～１１）またはＦｅｎｔｏｎ培地またはＬｉｎｇｇｏｕｄおよびＦｅｎｔｏｎ培地などにおいて増殖させることができ、それらは、ウシ抽出物を補ってもよい。ジフテリア毒素は、硫酸アンモニウム分画法などの従来技術を使用して精製することができ、ならびに、精製の前もしくは後のどちらかに、ホルムアルデヒド処理などの標準的技術を使用して解毒することができる。
ジフテリアトキソイドは、グラム陽性の非芽胞形成性好気性菌であるジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって産生されるＡＤＰリボシル化外毒素である。破傷風トキソイドと同様に、ジフテリアトキソイドは、非毒性だが依然として抗原性であるトキソイドを得るために、典型的にはホルムアルデヒドを使用して解毒される。ジフテリア菌は、任意の好適な増殖培地、例えば、変性Ｍｕｅｌｌｅｒ増殖培地（Ｓｔａｉｎｅｒ、 ＤＷ、 Ｉｎ： Ｍａｎｃｌａｒｋ ＣＲ、 編集者、 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｆｏｒｍａｌ ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＷＨＯ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、 ｔｅｔａｎｕｓ、 ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ、 Ｕ．Ｓ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ、 ＭＤ． ＤＨＨＳ ９１～１１７４、 １９９１、 ７～１１）またはＦｅｎｔｏｎ培地またはＬｉｎｇｇｏｕｄおよびＦｅｎｔｏｎ培地などにおいて増殖させることができ、それらは、ウシ抽出物を補ってもよい。ジフテリア毒素は、硫酸アンモニウム分画法などの従来技術を使用して精製することができ、ならびに、精製の前もしくは後のどちらかに、ホルムアルデヒド処理などの標準的技術を使用して解毒することができる。
【0068】
破傷風トキソイドと同様に、ジフテリアトキソイドの量は、「Ｌｆ」単位によって表すことができる。組成物中のジフテリアトキソイドの量は、組成物を、凝集アッセイにおいて、参照試薬で較正された参照材料と比較することによって容易に決定することができる。
【0069】
百日咳毒素
百日咳毒素（ＰＴ）は、分泌タンパク質外毒素であり、百日咳菌によって排他的に産生される重要な病原性因子である。百日咳毒素は、およそ３２００の塩基対のオペロンに編成された５つの遺伝子によってコードされる、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４（ｘ２）、およびＳ５と呼ばれる５つのサブユニットで構成される。５つの遺伝子の発現は、Ｓ１をコードする遺伝子の上流に位置されたプロモーターによって調節される。毒素プロモーターの活性化は、ボルデテラ属の病原性遺伝子（ｂｖｇ）系の制御下にあり、それは、百日咳毒素の発現だけでなく、他の既知の病原性因子、例えば、ＦＨＡおよびＰＲＮなども調節する。
百日咳毒素（ＰＴ）は、分泌タンパク質外毒素であり、百日咳菌によって排他的に産生される重要な病原性因子である。百日咳毒素は、およそ３２００の塩基対のオペロンに編成された５つの遺伝子によってコードされる、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４（ｘ２）、およびＳ５と呼ばれる５つのサブユニットで構成される。５つの遺伝子の発現は、Ｓ１をコードする遺伝子の上流に位置されたプロモーターによって調節される。毒素プロモーターの活性化は、ボルデテラ属の病原性遺伝子（ｂｖｇ）系の制御下にあり、それは、百日咳毒素の発現だけでなく、他の既知の病原性因子、例えば、ＦＨＡおよびＰＲＮなども調節する。
【0070】
百日咳毒素は、Ａ／Ｂ立体配置を有する約１０５ｋＤａのタンパク質である。Ａドメインは、Ｓ１サブユニットで構成され、タンパク質のＡＤＰリボシル化活性を担う。それは、宿主細胞膜上のＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）へのＧタンパク質（グアニンヌクレオチド結合タンパク質）の結合を妨げ、したがって、シグナル変換を妨害し、その結果として、ＰＴ活性に関連する多くの生物学的効果、例えば、ヒスタミン感作、白血球増加症、およびインシュリン分泌の変化などを生じる。Ｂオリゴマーは、１：１：２：１の比で会合したサブユニットＳ２、Ｓ３、Ｓ４、およびＳ５で構成される五量体環であり、真核細胞上の受容体への結合を担う。それは、標的細胞の表面上の様々な（しかし、ほとんど未確認の）複合糖質分子に結合する。
【0071】
現在の無細胞ワクチンにおいて使用される百日咳毒素は、典型的には、化学的に解毒されている。本明細書に記載されるａＰブースターワクチンにおいて、解毒された百日咳毒素は、酵素活性および／または毒性を減少させるために、典型的には遺伝子改変される。百日咳毒素の遺伝子改変を含む多くのコンストラクトは、その免疫原生および防御特性を保持しつつタンパク質の酵素活性および／または毒性を減じるように操作されており、その例としては、例えば、百日咳毒素のＳ１サブユニットのアミノ酸１２９における変異を有する変異体百日咳毒素、例えば、Ｅ１２９Ｇ変異体またはＲ９Ｋ／Ｅ１２９Ｇ二重変異体などが挙げられる。例えば、米国特許第５，４３３，９４５号、同第７，１４４，５７６号、同第７，６６６，４３６号、および同第７，４２７，４０４号を参照されたい。したがって、ある特定の実施形態では、遺伝子的に解毒された百日咳毒素は、百日咳毒素のＳ１サブユニットのアミノ酸１２９における変異を含む。ある特定の実施形態では、変異は、Ｅ１２９Ｇ変異である。ある特定の実施形態では、遺伝子的に解毒された百日咳毒素は、Ｒ９Ｋ変異およびＥ１２９Ｇを含む。遺伝子的に解毒された百日咳毒素は好ましいが、遺伝子的に解毒された百日咳毒素の代わりに化学的に解毒された百日咳毒素を使用することも可能である。化学解毒は、例えば、様々な従来の化学的解毒法、例えば、ホルムアルデヒド、過酸化水素、テトラニトロメタン、またはグルタルアルデヒドによる処理などのうちのいずれかによって実行することができる。例えば、米国特許第５，８７７，２９８号を参照されたい。
【0072】
パータクチン
パータクチンは、元々はボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂ． ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）から特定された６９ｋＤａの外膜タンパク質である（Ｍｏｎｔａｒａｚ， Ｊ．Ａ．ら Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９８５；１６１：５８１～５８２）。それは、ボルデテラ・ブロンキセプチカに対する防御抗原であることがわかっており、その後、百日咳菌およびボルデテラ・パラパータシス（Ｂ． ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の両方において同定された。６９ｋＤａタンパク質は、真核細胞に直接結合し（Ｌｅｉｎｉｎｇｅｒ， Ｅ．ら、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９１；８８：３４５～３４９）、百日咳菌による自然感染は、抗パータクチンヒト応答を誘導する（Ｔｈｏｍａｓ， Ｍ．Ｇ．ら Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９８９；１５９：２１１～１８）。パータクチンは、細胞媒介免疫応答も誘導する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｊ．Ｗ．ら、 Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９９２；６０：４５６３～７０； Ｄｅ Ｍａｇｉｓｔｒｉｓ， Ｔ．ら、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９８８；１６８：１３５１～１３６２； Ｓｅｄｄｏｎ， Ｐ．Ｃ．ら、 Ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｉｎｆ． Ｄｉｓ． １９９０；３：３３７～４３）。全細胞または無細胞ワクチンを用いたワクチン接種は、抗パータクチン抗体を誘導し（Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｋ．Ｍ．ら、 Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｒｅｓ． １９９２；３１：９１Ａ； Ｐｏｄｄａ， Ａ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９９１；９：７４１～４５）、無細胞ワクチンは、パータクチン細胞媒介免疫を誘導する（Ｐｏｄｄａ， Ａ．ら、 Ｖａｃｃｉｎｅ １９９１；９：７４１～４５）。パータクチンは、百日咳菌によるエアゾールチャレンジに対してマウスを防御し（Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｍ．ら、 Ｖａｃｃｉｎｅ １９９２；１０：４３～４８）、ＦＨＡとの組み合わせにおいて、 脳内チャレンジ試験において百日咳菌に対して防御する（Ｎｏｖｏｔｎｙ， Ｐ．ら、 Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９９１；１６４：１１４～２２）。ポリクローナルまたはモノクローナル抗パータクチン抗体の受動移入も、エアゾールチャレンジに対してマウスを防御する（Ｓｈａｈｉｎ， Ｒ． Ｄ．ら、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９０；１７１：６３～７３）。
パータクチンは、元々はボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂ． ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）から特定された６９ｋＤａの外膜タンパク質である（Ｍｏｎｔａｒａｚ， Ｊ．Ａ．ら Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９８５；１６１：５８１～５８２）。それは、ボルデテラ・ブロンキセプチカに対する防御抗原であることがわかっており、その後、百日咳菌およびボルデテラ・パラパータシス（Ｂ． ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の両方において同定された。６９ｋＤａタンパク質は、真核細胞に直接結合し（Ｌｅｉｎｉｎｇｅｒ， Ｅ．ら、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９１；８８：３４５～３４９）、百日咳菌による自然感染は、抗パータクチンヒト応答を誘導する（Ｔｈｏｍａｓ， Ｍ．Ｇ．ら Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９８９；１５９：２１１～１８）。パータクチンは、細胞媒介免疫応答も誘導する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｊ．Ｗ．ら、 Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９９２；６０：４５６３～７０； Ｄｅ Ｍａｇｉｓｔｒｉｓ， Ｔ．ら、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９８８；１６８：１３５１～１３６２； Ｓｅｄｄｏｎ， Ｐ．Ｃ．ら、 Ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｉｎｆ． Ｄｉｓ． １９９０；３：３３７～４３）。全細胞または無細胞ワクチンを用いたワクチン接種は、抗パータクチン抗体を誘導し（Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｋ．Ｍ．ら、 Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｒｅｓ． １９９２；３１：９１Ａ； Ｐｏｄｄａ， Ａ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９９１；９：７４１～４５）、無細胞ワクチンは、パータクチン細胞媒介免疫を誘導する（Ｐｏｄｄａ， Ａ．ら、 Ｖａｃｃｉｎｅ １９９１；９：７４１～４５）。パータクチンは、百日咳菌によるエアゾールチャレンジに対してマウスを防御し（Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｍ．ら、 Ｖａｃｃｉｎｅ １９９２；１０：４３～４８）、ＦＨＡとの組み合わせにおいて、 脳内チャレンジ試験において百日咳菌に対して防御する（Ｎｏｖｏｔｎｙ， Ｐ．ら、 Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９９１；１６４：１１４～２２）。ポリクローナルまたはモノクローナル抗パータクチン抗体の受動移入も、エアゾールチャレンジに対してマウスを防御する（Ｓｈａｈｉｎ， Ｒ． Ｄ．ら、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９０；１７１：６３～７３）。
【0073】
線維状赤血球凝集素
線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）は、細菌コロニー形成の際に上部気道の繊毛細胞への百日咳菌の付着を媒介する大きな（２２０ｋＤａ）非毒性ポリペプチドである（Ｔｕｏｍａｎｅｎ， Ｅ． ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ， Ａ．、 Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、 １９８５；１５２：１１８～２５）。全細胞または無細胞百日咳ワクチンを用いたワクチン接種は、抗ＦＨＡ抗体を生じ、ならびにＦＨＡを含む無細胞ワクチンは、ＦＨＡへの細胞媒介免疫応答も誘導する（Ｇｅａｒｉｎｇ， Ａ．ら、 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８９；４７：２０５～１２； Ｔｈｏｍａｓ， Ｍ．Ｇ．ら、 Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９８９；１６０：８３８～４５； Ｄｉ Ｔｏｍｍａｓｏ， Ａ．ら、 Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９９１；５９：３３１３～１５； Ｔｏｍｏｄａ， Ｔ．ら、 Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９９２；１６６：９０８～１０）。
線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）は、細菌コロニー形成の際に上部気道の繊毛細胞への百日咳菌の付着を媒介する大きな（２２０ｋＤａ）非毒性ポリペプチドである（Ｔｕｏｍａｎｅｎ， Ｅ． ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ， Ａ．、 Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、 １９８５；１５２：１１８～２５）。全細胞または無細胞百日咳ワクチンを用いたワクチン接種は、抗ＦＨＡ抗体を生じ、ならびにＦＨＡを含む無細胞ワクチンは、ＦＨＡへの細胞媒介免疫応答も誘導する（Ｇｅａｒｉｎｇ， Ａ．ら、 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８９；４７：２０５～１２； Ｔｈｏｍａｓ， Ｍ．Ｇ．ら、 Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９８９；１６０：８３８～４５； Ｄｉ Ｔｏｍｍａｓｏ， Ａ．ら、 Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９９１；５９：３３１３～１５； Ｔｏｍｏｄａ， Ｔ．ら、 Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９９２；１６６：９０８～１０）。
【0074】
線毛タイプ２および３
百日咳菌の血清型は、それらの凝集性線毛によって決まる。ＷＨＯは、全細胞ワクチンがタイプ１、２、および３の凝集原（Ａｇｇ）を含むことを推奨しており、それは、それらが交差防御ではないためである（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ａ．ら、 Ｖａｃｃｉｎｅ １９８５；３：１１～２２）。Ａｇｇ１は、非海馬采であり、全ての百日咳菌株において見出され、その一方で、血清型２および３のＡｇｇは、海馬采である。自然感染または全細胞または無細胞ワクチンを用いた免疫処置は、抗Ａｇｇ抗体を誘導する（Ｔｈｏｍａｓ， Ｍ．Ｇ．ら、 Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９８９；１６０：８３８～４５； Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｋ．Ｍ．ら、 Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｒｅｓ． １９９２；３１：９１Ａ）。エアゾール感染後、Ａｇｇ２およびＡｇｇ３によってマウスにおいて特異的細胞媒介免疫応答を生じさせることができる（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｊ．Ｗ．ら、 Ｉｍｍｕｎ． １９９２；６０：４５６３～７０）。Ａｇｇ２および３は、呼吸性チャレンジ感染に対し、マウスにおいて防御的であり、抗凝集原を含むヒト初乳も、このアッセイにおいて防御するであろう（Ｏｄａ， Ｍ．ら、 Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９８５；４７：４４１～４５； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ａ．ら、 Ｄｅｖｅｌｏｐ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． １９８５；６１：１６５～７２、 Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ａ．ら、 Ｖａｃｃｉｎｅ １９８９；７：３２１～２４）。
百日咳菌の血清型は、それらの凝集性線毛によって決まる。ＷＨＯは、全細胞ワクチンがタイプ１、２、および３の凝集原（Ａｇｇ）を含むことを推奨しており、それは、それらが交差防御ではないためである（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ａ．ら、 Ｖａｃｃｉｎｅ １９８５；３：１１～２２）。Ａｇｇ１は、非海馬采であり、全ての百日咳菌株において見出され、その一方で、血清型２および３のＡｇｇは、海馬采である。自然感染または全細胞または無細胞ワクチンを用いた免疫処置は、抗Ａｇｇ抗体を誘導する（Ｔｈｏｍａｓ， Ｍ．Ｇ．ら、 Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９８９；１６０：８３８～４５； Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｋ．Ｍ．ら、 Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｒｅｓ． １９９２；３１：９１Ａ）。エアゾール感染後、Ａｇｇ２およびＡｇｇ３によってマウスにおいて特異的細胞媒介免疫応答を生じさせることができる（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｊ．Ｗ．ら、 Ｉｍｍｕｎ． １９９２；６０：４５６３～７０）。Ａｇｇ２および３は、呼吸性チャレンジ感染に対し、マウスにおいて防御的であり、抗凝集原を含むヒト初乳も、このアッセイにおいて防御するであろう（Ｏｄａ， Ｍ．ら、 Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９８５；４７：４４１～４５； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ａ．ら、 Ｄｅｖｅｌｏｐ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． １９８５；６１：１６５～７２、 Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ａ．ら、 Ｖａｃｃｉｎｅ １９８９；７：３２１～２４）。
【0075】
ＴＬＲアゴニスト
本明細書に記載されるａＰブースターワクチンは、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む。ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲを刺激または活性化することができる化合物である。ＴＬＲは、宿主の病原菌検出機構における重要な成分である（Ｊａｎｅｗａｙら、 Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２；２０：１９７～２１６）； Ａｋｉｒａら、 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００４；４：４９９～５１１）。典型的には、ＴＬＲは、それらの位置に基づいて２つのファミリに分類され：ＴＬＲ１、２、および４～６は、細胞表面上に発現され、細菌細胞壁成分を感知し、その一方で、ＴＬＲ３および７～９は、エンドソームにおいて発現され、ウイルスまたは細菌の核酸を感知する（Ｋａｗａｓａｋｉら、 Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１４：５：４６１）。ＴＬＲによって認識される分子構造は、進化的に保存され、様々な感染性微生物によって発現される（Ｊａｎｅｗａｙら、 Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２；２０：１９７～２１６）； Ａｋｉｒａら、 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００４；４：４９９～５１１）。ＴＬＲ活性化によって誘発される先天性免疫応答は、炎症誘発性のサイトカイン、ケモカイン、タイプＩインターフェロン、および抗微生物ペプチドの産生によって特徴付けられる。この先天性応答は、順応性免疫系を促進し調節する。一般的な結果は、高親和性抗体を産生する抗原特異的Ｂ細胞の増殖と、エフェクタフェーズを標的にする細胞傷害機能の増強によってその後の感染症に対して防御する長期持続性メモリー細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞の増殖である（Ｗｉｌｌｅ－Ｒｅｅｃｅら、 Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２００６；２０３：１２４９～５８）； Ｘｉａｏら、 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１３；１９０：５８６６～７３）。ＴＬＲシグナル伝達は、先天性免疫応答の様々な面において重要な役割を果たしているように見える。
本明細書に記載されるａＰブースターワクチンは、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む。ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲを刺激または活性化することができる化合物である。ＴＬＲは、宿主の病原菌検出機構における重要な成分である（Ｊａｎｅｗａｙら、 Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２；２０：１９７～２１６）； Ａｋｉｒａら、 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００４；４：４９９～５１１）。典型的には、ＴＬＲは、それらの位置に基づいて２つのファミリに分類され：ＴＬＲ１、２、および４～６は、細胞表面上に発現され、細菌細胞壁成分を感知し、その一方で、ＴＬＲ３および７～９は、エンドソームにおいて発現され、ウイルスまたは細菌の核酸を感知する（Ｋａｗａｓａｋｉら、 Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１４：５：４６１）。ＴＬＲによって認識される分子構造は、進化的に保存され、様々な感染性微生物によって発現される（Ｊａｎｅｗａｙら、 Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２；２０：１９７～２１６）； Ａｋｉｒａら、 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００４；４：４９９～５１１）。ＴＬＲ活性化によって誘発される先天性免疫応答は、炎症誘発性のサイトカイン、ケモカイン、タイプＩインターフェロン、および抗微生物ペプチドの産生によって特徴付けられる。この先天性応答は、順応性免疫系を促進し調節する。一般的な結果は、高親和性抗体を産生する抗原特異的Ｂ細胞の増殖と、エフェクタフェーズを標的にする細胞傷害機能の増強によってその後の感染症に対して防御する長期持続性メモリー細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞の増殖である（Ｗｉｌｌｅ－Ｒｅｅｃｅら、 Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２００６；２０３：１２４９～５８）； Ｘｉａｏら、 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１３；１９０：５８６６～７３）。ＴＬＲシグナル伝達は、先天性免疫応答の様々な面において重要な役割を果たしているように見える。
【0076】
驚くべきことに、ＴＬＲアゴニストを含ませることにより、ａＰブースターワクチンは、以前に投与されたａＰワクチンによって確立されたＴｈ２優位の免疫応答を、Ｔｈ１優位の免疫応答へとシフトさせることができる。好ましくは、ＴＬＲアゴニストは、ヒトＴＬＲのアゴニストである。
【0077】
ある特定の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４アゴニストであり、好ましくはヒトＴＬＲ４のアゴニストである。一実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、グラム陰性細菌に由来する天然の脂質Ａの理化学的および生物学的性質を模倣する合成リン脂質二量体のＥ６０２０である（Ｉｓｈｉｚａｋａら、 Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． ２００７；（５）：７７３～８４）。Ｅ６０２０は、ドデカン酸の二ナトリウム塩である（１Ｒ、６Ｒ、２２Ｒ、２７Ｒ）－１，２７－ジヘキシル－９，１９－ジヒドロキシ－９，１９－ジオキシド－１４－オキソ－６，２２－ビス［（１，３－ジオキソテトラデシル）アミノ］－４，８，１０、１８、２０、２４－ヘキサオキサ－１３，１５－ジアザ－９，１９－ジホスファヘプタコサン－１，２７－ジイルエステル（Ｃ８３Ｈ１５８Ｎ４Ｏ１９Ｐ２Ｎａ２）である。Ｅ６０２０の化学的合成は、高純度の化合物をもたらす、再現可能でよく制御された製造プロセスである。Ｅ６０２０は、以下の化学構造を有する。
【0078】
【化1】
【0079】
Ｅ６０２０は、ＴＬＲ４と相互作用し、前臨床研究における補助剤として評価されており、エマルション、リポソーム、またはアルミニウム塩と組み合わされる。Ｅ６０２０は、マウスにおいてＴｈ１活性化に関連しているＩｇＧ２ａを増強することが報告されている。Ｅ６０２０は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびマウス脾臓において粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－１、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αを増強することも知られている（Ｉｓｈｉｚａｋａら、 Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． ２００７；（５）：７７３～８４）。
【0080】
他の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ９アゴニストであり、好ましくは、ヒトＴＬＲ９のアゴニストである。例えば、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）であり得る。本明細書において使用される場合、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」または「ＣｐＧ ＯＤＮ」は、特定の隣接領域内に組み入れられた少なくとも１つの中央非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含む一本鎖ＤＮＡ分子である。ＣｐＧ ＯＤＮは、細菌ＤＮＡ中に高い頻度において存在し、免疫活性化作用を有する。
【0081】
ヒトにおいて、ＣｐＧ ＯＤＮは、構造およびそれらが誘導する免疫応答の性質の違いに基づいて、４つの異なるクラスに分類されている。各クラスは、少なくとも１つの中央非メチル化ＣＧジヌクレオチドおよび隣接領域を含み、それらは、構造および免疫学的活性において異なっている。クラスＢのＯＤＮ（「Ｋ」タイプとも呼ばれる）は、典型的にはホスホロチオ酸骨格に１つから５つの ＣｐＧモチーフを含む。ホスホロチオ酸は、天然由来のＤＮＡに見出されるホスホジエステル結合に取って代わる非天然由来のヌクレオチド間結合基であり、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を増強し、インビボにおいて半減期を実質的に延ばす。クラスＢのＯＤＮは、形質細胞様樹状細胞に作用して分化させＴＮＦαを産生させ、ならびにＢ細胞を刺激して増殖させＩｇＭを分泌させる。
【0082】
クラスＡのＯＤＮ（「Ｄ」タイプとも呼ばれる）は、ホスホロチオ酸末端ヌクレオチドが隣接するホスホジエステルコアを有する。それらは、ステムループ構造を形成することができるパリンドローム配列が隣接する単一のＣｐＧモチーフを含む。クラスＡのＯＤＮは、コンカテマー形成を促進する３’および５’末端にポリＧモチーフも有する。クラスＡのＯＤＮは、形質細胞様樹状細胞に作用して成熟させＩＦＮαを分泌させるが、Ｂ細胞に対する効果を有しない。クラスＣのＯＤＮは、ホスホロチオ酸ヌクレオチドで完全に構成されるクラスＢに似ているが、ステムループ構造または二量体を形成することができるパリンドロームＣｐＧモチーフを含む点においてクラスＡに似ている。クラスＣのＯＤＮは、Ｂ細胞を刺激してＩＬ－６を分泌させ、ならびに形質細胞様樹状細胞を刺激してＩＦＮαを産生させる。クラスＰのＣｐＧ ＯＤＮは、二重パリンドロームを含む高度に秩序立った構造であり、それらは、そのＧＣリッチな３’末端においてヘアピンを形成することができ、ならびに５’パリンドロームの存在によりコンカテマー化（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｚｅ）することができる。
【0083】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンにおいて使用されるＣｐＧ ＯＤＮは、クラスＢのＣｐＧ ＯＤＮである。ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンにおいて使用されるＣｐＧ ＯＤＮは、クラスＡのＣｐＧ ＯＤＮである。ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンにおいて使用されるＣｐＧ ＯＤＮは、クラスＣのＣｐＧ ＯＤＮである。ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンにおいて使用されるＣｐＧ ＯＤＮは、クラスＰのＣｐＧ ＯＤＮである。
【0084】
ある特定の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、少なくとも１つのホスホロチオ酸結合を含む。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮにおける全てのヌクレオチドは、ホスホロチオ酸結合で連結されている。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、１～５つのＣＧジヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、１つのＣＧジヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、２つのＣＧジヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、３つのＣＧジヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、４つのＣＧジヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、５つのＣＧジヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、１８～２８ヌクレオチドの長さである。
【0085】
一実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、次のヌクレオチド配列：５’－ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ－３’（配列番号１）を有する２２－ｍｅｒオリゴヌクレオチドであるＩＳＳ１０１８（Ｈｉｇｇｉｎｓら、 Ｅｘｐ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、 ２００７；６（５）：７４７～５９）である。ＩＳＳ１０１８におけるヌクレオチド塩基の全ては、ホスホロチオ酸結合で連結されている。本明細書において使用される場合、「ＣｐＧ１０１８」は、ＩＳＳ１０１８と相互互換的に使用される。
【0086】
アルミニウム塩
様々な抗原に対して免疫応答を増強するために、アルミニウム塩などの補助剤が使用されてきた。補助剤として使用することができるアルミニウム塩としては、これらに限定されるわけではないが、水酸化アルミニウム／オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｕｌｆａｔｅ）（ＡＡＨＳ）、および／または硫酸アルミニウムカリウムが挙げられる。これらのアルミニウム塩は、長年にわたりワクチンにおいて使用されている。
様々な抗原に対して免疫応答を増強するために、アルミニウム塩などの補助剤が使用されてきた。補助剤として使用することができるアルミニウム塩としては、これらに限定されるわけではないが、水酸化アルミニウム／オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｕｌｆａｔｅ）（ＡＡＨＳ）、および／または硫酸アルミニウムカリウムが挙げられる。これらのアルミニウム塩は、長年にわたりワクチンにおいて使用されている。
【0087】
本願の他の場所で論じられるように、ａＰブースターワクチンの破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および無細胞百日咳菌抗原のうちの１つまたはそれ以上は、アルミニウム塩に吸着させることができる。ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンにおけるワクチン抗原の全ては、アルミニウム塩に吸着される。例えば、一実施形態では、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＰＴ、ＦＨＡ、ＰＴ、およびＦＩＭ２，３は、ＡｌＯＯＨに吸着される。別の実施形態では、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＰＴ、ＦＨＡ、ＰＴ、およびＦＩＭ２，３は、ＡｌＰＯ４に吸着される。さらなる別の実施形態では、ａＰブースターワクチンにおけるワクチン抗原の１つまたはそれ以上は、ＡｌＯＯＨに吸着され、ａＰブースターワクチンにおけるワクチン抗原の１つまたはそれ以上は、ＡｌＰＯ４に吸着される。
【0088】
ある特定の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、アルミニウム塩と共に製剤化される。典型的には、ＴＬＲ４アゴニスト、例えば、Ｅ６０２０などは、ＡｌＯＯＨと共に製剤化される。他の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニスト、例えば、Ｅ６０２０などは、ＡｌＰＯ４と共に製剤化される。典型的には、ＴＬＲ９アゴニスト、例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ（例えば、ＣｐＧ１０１８）などは、ＡｌＯＯＨと共に製剤化される。他の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニスト、例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ（例えば、ＣｐＧ１０１８）などは、ＡｌＰＯ４と共に製剤化される。
【0089】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ｇｄＰＴ、ＦＨＡ、ＰＴ、ＦＩＭ２，３、およびＴＬＲ４アゴニスト（例えば、Ｅ６０２０）を含み、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ｇｄＰＴ、ＦＨＡ、ＰＴ、ＦＩＭ２，３のそれぞれは、ＡｌＯＯＨに吸着され、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、Ｅ６０２０）は、ＡｌＯＯＨと共に製剤化される。ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ｇｄＰＴ、ＦＨＡ、ＰＴ、ＦＩＭ２，３，およびＴＬ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ、例えば、ＣｐＧ１０１８など）を含み、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ｇｄＰＴ、ＦＨＡ、ＰＴ、ＦＩＭ２，３のそれぞれは、ＡｌＯＯＨに吸着され、ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ、例えば、ＣｐＧ１０１８など）は、ＡｌＯＯＨと共に製剤化される。
【0090】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ＡｌＯＯＨおよびＡｌＰＯ４の両方を含み、ワクチンにおける抗原は、これらのアルミニウム塩の一方または両方に吸着される。
【0091】
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳抗原をアルミニウム塩、例えば、ＡｌＯＯＨおよびＡｌＰＯ４などに吸着させる方法は、当技術分野において既知である。
【0092】
他の抗原
破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および無細胞百日咳菌抗原に加えて、ａＰブースターワクチンは、１種または複数種の追加の抗原、例えば、これらに限定されるわけではないが、ヘモフィルスインフルエンザタイプｂ糖（Ｈｉｂ）コンジュゲート、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、および／または不活性化ポリオウイルス（ＩＰＶ）などを含むことができる。
破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、および無細胞百日咳菌抗原に加えて、ａＰブースターワクチンは、１種または複数種の追加の抗原、例えば、これらに限定されるわけではないが、ヘモフィルスインフルエンザタイプｂ糖（Ｈｉｂ）コンジュゲート、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、および／または不活性化ポリオウイルス（ＩＰＶ）などを含むことができる。
【0093】
ヘモフィルスインフルエンザタイプｂは、細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｈｉｂワクチンは、典型的には、とりわけ子供において、その免疫原性を高めるためにキャリアタンパク質にコンジュゲートさせたＨｉｂを使用して製剤化される。典型的には、キャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ヘモフィルスインフルエンザタンパク質Ｄ、または血清型Ｂ髄膜炎菌に由来する外膜タンパク質複合体である。しかし、任意の適切なキャリアタンパク質を使用することができる。Ｈｉｂコンジュゲートを作製する方法は、当技術分野において既知である。例えば、ＰＥＮＴＡＣＥＬ（登録商標）は、破傷風トキソイドに共有結合したヘモフィルスインフルエンザタイプｂきょう膜多糖（ポリリボシル－リビトール－２７８ホスフェート［ＰＲＰ］）を含む。Ｈｉｂコンジュゲートは、典型的には、アルミニウム塩（例えば、ＡｌＯＯＨまたはＡｌＰＯ４）に吸着される。
【0094】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、潜在的に生命に危険を及ぼす肝臓感染症であるウイルス性肝炎を引き起こす。感染性ＨＢＶビリオンは、球状の二重コア構造を有し、ウイルスによってコードされたポリメラーゼおよびウイルスＤＮＡゲノムと複合化されたＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）で構成された内側ヌクレオカプシドを囲むＨＢｓＡｇを含む脂質エンベロープからなる。ＨＢｓＡｇは、典型的には２２６のアミノ酸の長さと約２４ｋＤａの分子量を有するポリペプチドである。ＨＢＶワクチンは、典型的には、ＨＢｓＡｇを含む。したがって、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇを含むワクチンを作製する方法は、当技術分野において既知である。ＨＢｓＡｇは、典型的には、アルミニウム塩（例えば、ＡｌＯＯＨまたはＡｌＰＯ４）に吸着される。
【0095】
急性灰白髄炎は、３つのタイプのポリオウイルス；ポリオウイルスタイプ１（例えば、マホニー株）ポリオウイルスタイプ２（例えば、ＭＥＦ－１株）、およびポリオウイルスタイプ３（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ株）、のうちのいずれかによって引き起こされる疾患である。ポリオウイルスは、既知の技術を使用して細胞培養物において増殖させることができ、その後、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、およびクロマトグラフィなどの技術を使用してビリオンの精製が行われる。次に、ビリオンは、例えば、ホルムアルデヒドなどを使用して不活性化される。典型的には、ポリオウイルスの各タイプは、個別に増殖され、細胞培養物から精製され、それらを組み合わせて三価のポリオウイルス組成物を作製する前に不活性化される。典型的には、不活性化されたポリオウイルスは、ワクチンを製剤化する前にアルミニウム塩上に吸着されない。しかしながら、不活性化されたポリオウイルスは、ワクチン中において、別のワクチン抗原に吸着されていない任意のアルミニウム塩上に吸着されるようになり得る。
【0096】
無細胞百日咳ブースターワクチン
ａＰブースターワクチンは、百日咳菌および他の病原体（例えば、ジフテリア菌、破傷風菌など）からの抗原に由来するまたはそれと相同である１つまたはそれ以上の抗原－しかし全ての抗原ではない－を含む免疫原性組成物である。そのようなワクチンは、無傷病原性粒子またはそのような粒子の溶解物を実質的に含まない。したがって、ａＰブースターワクチンを、目的の病原体からの少なくとも部分的に精製されたもしくは実質的に精製された免疫原性ポリペプチドまたはそれらの類似体から調製することができる。ワクチンにおける抗原（単数または複数）を得る方法は、標準的な精製技術、組換え産生、または化学合成を含む。
ａＰブースターワクチンは、百日咳菌および他の病原体（例えば、ジフテリア菌、破傷風菌など）からの抗原に由来するまたはそれと相同である１つまたはそれ以上の抗原－しかし全ての抗原ではない－を含む免疫原性組成物である。そのようなワクチンは、無傷病原性粒子またはそのような粒子の溶解物を実質的に含まない。したがって、ａＰブースターワクチンを、目的の病原体からの少なくとも部分的に精製されたもしくは実質的に精製された免疫原性ポリペプチドまたはそれらの類似体から調製することができる。ワクチンにおける抗原（単数または複数）を得る方法は、標準的な精製技術、組換え産生、または化学合成を含む。
【0097】
様々な実施形態では、１つまたはそれ以上の抗原がａＰブースターワクチンの単一用量に製剤化される。「単一用量」は、本明細書で使用される場合、単回投与で対象に投与されるワクチンの量を指す。典型的には、この量は、０．１～２ミリリットル、例えば、０．２～１ミリリットル、典型的には０．５ミリリットルの体積で存在する。したがって、示された量が、例えば、バルクワクチン０．５ミリリットル当たりのミリグラムの濃度で存在し得る。したがって、ある特定の実施形態では、（単一）単位用量は、０．５ミリリットルに等しい。
【0098】
本明細書に記載されるａＰブースターワクチンは、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ならびに次の無細胞百日咳菌抗原を含む：解毒された百日咳毒素、繊維状赤血球凝集素、パータクチン、ならびに線毛タイプ２および３。ａＰブースターワクチンは、ＴＬＲ４（例えば、Ｅ６０２０）またはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ１０１８）などのＴＬＲアゴニスト、およびＡｌＯＯＨまたはＡｌＰＯ４などのアルミニウム塩も含有する。
【0099】
無細胞百日咳抗原は、典型的には、液体培養培地で増殖させた百日咳菌培養物からの単離により調製される。ボルデテラ属細胞を培養するための当技術分野において公知の任意の液体培養培地を使用することができる。様々な実施形態では、複合培地が使用される。本明細書で使用される場合、「複合培地」は、ペプトン消化物または植物もしくは動物由来の抽出物を含有する培地を指す。本方法での使用に好適な複合培地の例としては、例えば、Ｈｏｒｎｉｂｒｏｏｋ培地、Ｃｏｈｅｎ－Ｗｈｅｅｌｅｒ培地、Ｂ２培地、または他の同様の液体培養培地が挙げられる。ジメチルベータ－シクロデキストリンおよびカザミノ酸も含む変性Ｓｔａｉｎｅｒ ＆ Ｓｃｈｏｌｔｅ培地は、使用に好適なもう１つの例である。Ｓｔａｉｎｅｒら、Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９７０、６３：２１１～２０頁。百日咳毒素、繊維状赤血球凝集素、およびパータクチンは、典型的には、培養培地の上清から別々に単離される。線毛タイプ２および３は、典型的には、細菌細胞から抽出され、共精製される。百日咳抗原は、例えば、連続濾過、塩析沈殿、限外濾過およびクロマトグラフィを含む、任意の従来の方法を使用して、上清および／または細菌細胞から精製することができる。
【0100】
破傷風トキソイド（ＴＴ）は、約８～１２限界フロキュレーション（Ｌｆ）／ｍＬの量でａＰブースターワクチン中に存在する。ある特定の実施形態では、ＴＴは、９～１１Ｌｆ／ｍＬの量で存在する。ある特定の実施形態では、ＴＴは、１０Ｌｆ／ｍＬの量で存在する。単位用量が０．５ｍＬである単位剤形当たりで測定して、ＴＴは、典型的には、約４～６Ｌｆの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＴＴは、４．５～５．５Ｌｆの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＴＴは、５Ｌｆの量で存在する。ａＰブースターワクチンでは、ＴＴは、典型的には、アルミニウム塩に吸着されている。典型的には、ＴＴは、ＡｌＯＯＨ上に吸着されている。他の実施形態では、ＴＴは、ＡｌＰＯ４上に吸着されていることもある。
【0101】
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）は、約３～８Ｌｆ／ｍＬの量でａＰブースターワクチン中に存在する。ある特定の実施形態では、ＤＴは、３～６Ｌｆ／ｍＬの量で存在する。ある特定の実施形態では、ＤＴは、４～５Ｌｆ／ｍＬの量で存在する。ある特定の実施形態では、ＤＴは、４Ｌｆ／ｍＬの量で存在する。単位用量が０．５ｍＬである単位剤形当たりで測定して、ＤＴは、典型的には、約１．５～４Ｌｆの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＤＴは、１．５～３Ｌｆの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＤＴは、２～２．５Ｌｆの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＤＴは、２Ｌｆの量で存在する。ａＰブースターワクチンでは、ＤＴは、典型的には、アルミニウム塩に吸着されている。典型的には、ＤＴは、ＡｌＯＯＨ上に吸着されている。他の実施形態では、ＤＴは、ＡｌＰＯ４上に吸着されていることもある。
【0102】
解毒された百日咳毒素（ＰＴ）は、典型的には、約４～３０μｇ／ｍＬの量でａＰブースターワクチン中に存在する。ある特定の実施形態では、ＰＴは、化学的に解毒されたＰＴであり、４～１０μｇ／ｍＬの量で存在する。ある特定の実施形態では、ＰＴは、遺伝子的に解毒されたＰＴ（ｇｄＰＴ）であり、約１６～２４μｇ／ｍＬの量で存在する。ある特定の実施形態では、ｇｄＰＴは、１８～２２μｇ／ｍＬの量で存在する。ある特定の実施形態では、ｇｄＰＴは、２０μｇ／ｍＬの量で存在する。単位用量が０．５ｍＬである単位剤形当たりで測定して、ＰＴは、典型的には、約２～１５μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＰＴは、２～５μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＰＴは、ｇｄＰＴであり、８～１２μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ｇｄＰＴは、９～１１μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ｇｄＰＴは～１０μｇの量で存在する。他の実施形態では、ＰＴは、単位用量当たり２～５０μｇ、５～４０μｇ、１０～３０μｇ、または２０～２５μｇで存在する。ａＰブースターワクチンでは、ＰＴは、典型的には、アルミニウム塩に吸着されている。ある特定の実施形態では、ＰＴは、ＡｌＯＯＨ上に吸着されている。ある特定の実施形態では、ＰＴは、ＡｌＰＯ４上に吸着されている。
【0103】
繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）は、典型的には、約５～１５μｇ／ｍＬの量でａＰブースターワクチン中に存在する。ある特定の実施形態では、ＦＨＡは、８～１２μｇ／ｍＬの量で存在する。ある特定の実施形態では、ＦＨＡは、１０μｇ／ｍＬの量で存在する。単位用量が０．５ｍＬである単位剤形当たりで測定して、ＦＨＡは、典型的には、約２．５～７．５μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＦＨＡは、４～６μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＦＨＡは、５μｇの量で存在する。他の実施形態では、ＦＨＡは、単位用量当たり２～５０μｇ、５～４０μｇ、１０～３０μｇ、または２０～２５μｇで存在する。ａＰブースターワクチンでは、ＦＨＡは、典型的には、アルミニウム塩に吸着されている。ある特定の実施形態では、ＦＨＡは、ＡｌＯＯＨ上に吸着されている。ある特定の実施形態では、ＦＨＡは、ＡｌＰＯ４上に吸着されている。
【0104】
パータクチン（ＰＲＮ）は、典型的には、約５～１５μｇ／ｍＬの量でａＰブースターワクチン中に存在する。ある特定の実施形態では、ＰＲＮは、８～１２μｇ／ｍＬの量で存在する。ある特定の実施形態では、ＰＲＮは、１０μｇ／ｍＬの量で存在する。単位用量が０．５ｍＬである単位剤形当たりで測定して、ＰＲＮは、典型的には、約２．５～７．５μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＰＲＮは、４～６μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＰＲＮは、５μｇの量で存在する。他の実施形態では、ＰＲＮは、単位用量当たり０．１～１００μｇ、１～５０μｇ、２～２０μｇ、３～３０μｇ、または５～２０μｇで存在する。ａＰブースターワクチンでは、ＰＲＮは、典型的には、アルミニウム塩に吸着されている。ある特定の実施形態では、ＰＲＮは、ＡｌＯＯＨ上に吸着されている。ある特定の実施形態では、ＰＲＮは、ＡｌＰＯ４上に吸着されている。
【0105】
線毛タイプ２および３（ＦＩＭ２，３）は、典型的には、約１０～２０μｇ／ｍＬの量でａＰブースターワクチン中に存在する。ある特定の実施形態では、ＦＩＭ２，３は、１４～１６μｇ／ｍＬの量で存在する。ある特定の実施形態では、ＦＩＭ２，３は、１５μｇ／ｍＬの量で存在する。ある特定の実施形態では、ＦＩＭ ２のＦＩＭ ３に対する重量比は、約１：３～約３：１、例えば、約１：１～約３：１、例えば、約１．５：１～約２：１である。単位用量が０．５ｍＬである単位剤形当たりで測定して、ＦＩＭ２，３は、典型的には、約５～１０μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＦＩＭ２，３は、７～８μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＦＩＭ２，３は、７．５μｇの量で存在する。他の実施形態では、ＦＩＭ２／３は、単位用量当たり１～１００μｇ、例えば、単位用量当たり３～５０μｇ、または３～３０μｇの範囲の量で存在する。ａＰブースターワクチンでは、ＦＩＭ２，３は、典型的には、アルミニウム塩に吸着されている。ある特定の実施形態では、ＦＩＭ２，３は、ＡｌＯＯＨ上に吸着されている。ある特定の実施形態では、ＦＩＭ２，３は、ＡｌＰＯ４上に吸着されている。
【0106】
典型的には、ａＰブースターワクチンは、ワクチン抗原のうちの１つまたはそれ以上を吸着するためにおよび／またはＴＬＲアゴニストを製剤化するために使用される、ＡｌＯＯＨまたはＡｌＰＯ４などの、アルミニウム塩を含む。ある特定の実施形態では、アルミニウム塩は、約０．２５～０．７５ｍｇ／ｍＬ、０．２５～０．３５ｍｇ／ｍＬ、または０．６～０．７ｍｇ／ｍＬの量で存在する。ある特定の実施形態では、アルミニウム塩は、０．６６ｍｇ／ｍＬの量で存在する。単位用量が０．５ｍＬである単位剤形当たりで測定して、アルミニウム塩は、典型的には、０．１２５～０．３７５ｍｇ、０．１２５～０．１７５ｍｇ、または０．３～０．３５ｍｇの量で存在する。ある特定の実施形態では、０．５ｍＬ単位剤形は、アルミニウム塩 ０．３３ｍｇを含有する。ある特定の実施形態では、アルミニウム塩は、ＡｌＯＯＨである。他の実施形態では、アルミニウム塩は、ＡｌＰＯ４である。
【0107】
ＴＬＲ４アゴニストがＥ６０２０である場合、ＴＬＲ４アゴニストは、１０μｇ／ｍｌ以下の量で存在し得る。ある特定の実施形態では、Ｅ６０２０は、０．５～５μｇ／ｍｌの量で存在する。ある特定の実施形態では、Ｅ６０２０は、２μｇ／ｍｌ以下の量で存在する。単位用量が０．５ｍＬである単位剤形当たりで測定して、Ｅ６０２０は、典型的には、５μｇ以下の量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、Ｅ６０２０は、約０．２５～２．５μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、Ｅ６０２０は、１μｇ以下の量で存在する。
【0108】
ある特定の実施形態では、Ｅ６０２０は、アルミニウム塩を用いて製剤化される。典型的には、アルミニウム塩は、ＡｌＯＯＨである。他の実施形態では、アルミニウム塩は、ＡｌＰＯ４であり得る。
【0109】
ＴＬＲ９アゴニストがＣｐＧ１０１８である場合、ＴＬＲ９アゴニストは、約２５０～７５０μｇ／ｍｌの量で存在し得る。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ１０１８は、４００～６００μｇ／ｍｌの量で存在する。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ１０１８は、５００μｇ／ｍｌの量で存在する。単位用量が０．５ｍＬである単位剤形当たりで測定して、ＣｐＧ１０１８は、典型的には、約１２５～３７５μｇの量で存在する。単位用量が０．５ｍＬである単位剤形当たりで測定して、ＣｐＧ１０１８は、２００～３００μｇの量で存在する。０．５ｍＬ剤形についてのある特定の実施形態では、ＣｐＧ１０１８は、２５０μｇの量で存在する。
【0110】
ある特定の実施形態では、ＣｐＧ１０１８は、アルミニウム塩を用いて製剤化される。典型的には、アルミニウム塩は、ＡｌＯＯＨである。他の実施形態では、アルミニウム塩は、ＡｌＰＯ４であり得る。
【0111】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、８～１２Ｌｆ／ｍＬの量のＴＴ、３～８Ｌｆ／ｍＬの量のＤＴ、１６～２４μｇ／ｍＬの量のｇｄＰＴ、５～１５μｇ／ｍＬの量のＦＨＡ、５～１５μｇ／ｍＬの量のＰＲＮ、約１０～２０μｇ／ｍＬの量のＦＩＭ２，３、０．２５～０．７５ｍｇ／ｍＬの量のＡｌＯＯＨ、および１０μｇ／ｍｌ以下の量のＴＬＲ４アゴニスト、例えばＥ６０２０を含む。
【0112】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、８～１２Ｌｆ／ｍＬの量のＴＴ、３～８Ｌｆ／ｍＬの量のＤＴ、１６～２４μｇ／ｍＬの量のｇｄＰＴ、５～１５μｇ／ｍＬの量のＦＨＡ、５～１５μｇ／ｍＬの量のＰＲＮ、約１０～２０μｇ／ｍＬの量のＦＩＭ２，３、０．２５～０．７５ｍｇ／ｍＬの量のＡｌＯＯＨ、および２５０～７５０μｇ／ｍｌ量のＴＬＲ９アゴニスト、例えばＣｐＧ１０１８を含む。
【0113】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、９～１１Ｌｆ／ｍＬの量のＴＴ、４～６Ｌｆ／ｍＬの量のＤＴ、１８～２２μｇ／ｍＬの量のｇｄＰＴ、８～１２μｇ／ｍＬの量のＦＨＡ、８～１２μｇ／ｍＬの量のＰＲＮ、１４～１６μｇ／ｍＬの量のＦＩＭ２，３、０．６～０．７ｍｇ／ｍＬの量のＡｌＯＯＨ、および０．５～５μｇ／ｍｌの量のＴＬＲ４アゴニスト、例えばＥ６０２０を含む。
【0114】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、９～１１Ｌｆ／ｍＬの量のＴＴ、４～６Ｌｆ／ｍＬの量のＤＴ、１８～２２μｇ／ｍＬの量のｇｄＰＴ、８～１２μｇ／ｍＬの量のＦＨＡ、８～１２μｇ／ｍＬの量のＰＲＮ、１４～１６μｇ／ｍＬの量のＦＩＭ２，３、０．６～０．７ｍｇ／ｍＬの量のＡｌＯＯＨ、および４００～６００μｇ／ｍｌ量のＴＬＲ９アゴニスト、例えばＣｐＧ１０１８を含む。
【0115】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、表１に記載の通り、以下の成分を示されている量で含む：
【0116】
【表1】
【0117】
表１に記載のａＰブースターワクチンについてのある特定の実施形態では、ジフテリアトキソイドは、４Ｌｆ／ｍＬの量で存在する。表１に記載のａＰブースターワクチンについてのある特定の実施形態では、ジフテリアトキソイドは、５Ｌｆ／ｍＬの量で存在する。
【0118】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、０．５ｍＬ用量当たり次の成分を含む：４～６Ｌｆの量のＴＴ、１．５～４Ｌｆの量のＤＴ、８～１２μｇの量のｇｄＰＴ、２．５～７．５μｇの量のＦＨＡ、２．５～７．５μｇの量のＰＲＮ、約５～１０μｇの量のＦＩＭ２，３、０．１２５～０．３７５ｍｇの量のＡｌＯＯＨ、および５μｇ以下の量のＴＬＲ４アゴニスト、例えばＥ６０２０を含む。
【0119】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、０．５ｍＬ用量当たり次の成分を含む：４～６Ｌｆの量のＴＴ、１．５～４Ｌｆの量のＤＴ、８～１２μｇの量のｇｄＰＴ、２．５～７．５μｇの量のＦＨＡ、２．５～７．５μｇの量のＰＲＮ、約５～１０μｇの量のＦＩＭ２，３、０．１２５～０．３７５ｍｇの量のＡｌＯＯＨ、および１２５～３７５μｇの量のＴＬＲ９アゴニスト、例えばＣｐＧ１０１８を含む。
【0120】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、０．５ｍＬ用量当たり次の成分を含む：４．５～５．５Ｌｆの量のＴＴ、１．５～３Ｌｆの量のＤＴ、９～１１μｇの量のｇｄＰＴ、４～６μｇの量のＦＨＡ、４～６μｇの量のＰＲＮ、約７～８μｇの量のＦＩＭ２，３、０．３～０．３５ｍｇの量のＡｌＯＯＨ、および０．２５～２．５μｇの量のＴＬＲ４アゴニスト、例えばＥ６０２０を含む。
【0121】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、０．５ｍＬ用量当たり次の成分を含む：４．５～５．５Ｌｆの量のＴＴ、１．５～３Ｌｆの量のＤＴ、９～１１μｇの量のｇｄＰＴ、４～６μｇの量のＦＨＡ、４～６μｇの量のＰＲＮ、約７～８μｇの量のＦＩＭ２，３、０．３～０．３５ｍｇの量のＡｌＯＯＨ、および２００～３００μｇの量のＴＬＲ９アゴニスト、例えばＣｐＧ１０１８を含む。
【0122】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与のための単位剤形にあり、表２に記載の通り、０．５ｍＬ用量当たり以下の成分を含む：
【0123】
【表2】
【0124】
表１に記載のａＰブースターワクチンについてのある特定の実施形態では、ジフテリアトキソイドは、２Ｌｆの量で存在する。表１に記載のａＰブースターワクチンについてのある特定の実施形態では、ジフテリアトキソイドは、２．５Ｌｆの量で存在する。
【0125】
ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたはボルデテラ属抗原以外の抗原を含有するように製剤化される。例えば、ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、次ののうちの１つまたはそれ以上を含む：ヘモフィルスインフルエンザタイプｂオリゴ糖または多糖（Ｈｉｂ）コンジュゲート、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、および／または不活性化ポリオウイルス（ＩＰＶ）。
【0126】
本明細書に記載されるａＰブースターワクチンは、注射可能な溶液または乳濁液として製剤化することができる。例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、およびボルデテラ属抗原を、これらの抗原と適合性である薬学的に許容される賦形剤と混合することができる。そのような賦形剤としては、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せを挙げることができる。ａＰブースターワクチンは、補助物質、例えば、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはその有効性を増強するためのアジュバントをさらに含むことができる。
【0127】
典型的には、ａＰブースターワクチンは、水性形態で製剤化されることになる。典型的には、ａＰブースターワクチンの成分は、所望の最終濃度を得るためにトリス緩衝食塩水で希釈されることになる。あるいは、製剤用の希釈剤は、注射用蒸留水であることもある。
【0128】
ａＰブースターワクチンを投与する方法
本明細書に記載されるａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与に好適である。したがって、一態様は、ヒト対象における免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載されるａＰブースターワクチンをヒト対象に投与することを含む方法に関する。ヒト対象における免疫応答の誘導に使用するためのおよび／またはヒト対象におけるＴｈ２優位の免疫応答をＴｈ－１優位の免疫応答もしくはＴｈ１／Ｔｈ１７優位の免疫応答へと新たに方向付けるための、ａＰブースターワクチンも記載される。
本明細書に記載されるａＰブースターワクチンは、ヒト対象への投与に好適である。したがって、一態様は、ヒト対象における免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載されるａＰブースターワクチンをヒト対象に投与することを含む方法に関する。ヒト対象における免疫応答の誘導に使用するためのおよび／またはヒト対象におけるＴｈ２優位の免疫応答をＴｈ－１優位の免疫応答もしくはＴｈ１／Ｔｈ１７優位の免疫応答へと新たに方向付けるための、ａＰブースターワクチンも記載される。
【0129】
典型的には、ヒト対象に、百日咳ワクチンなしでｗＰワクチンを投与した、またはＴｈ２優位の免疫応答を誘導するａＰプライミングワクチンをａＰブースターワクチンの投与の前に投与した。典型的には、ａＰプライミングワクチンを投与したヒト対象に、ＴＬＲアゴニストを含有しないａＰブースターワクチン（例えば、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標））を投与した場合、非ＴＬＲアゴニスト含有ａＰブースターワクチンは、ａＰプライミングワクチンにより誘導されたＴｈ２優位の免疫応答をブーストして、ａＰプライミングワクチンにより誘導されたＴｈ２優位性を持続させる。対照的に、本明細書に記載されるＴＬＲアゴニスト含有ａＰブースターワクチンは、ａＰプライミングワクチンにより誘導されたＴｈ２優位の免疫応答をＴｈ１優位の免疫応答またはＴｈ１／Ｔｈ１７優位の免疫応答へと予想外に新たに方向付けまたはシフトさせる。
【0130】
ある特定の実施形態では、Ｔｈ１優位の免疫応答は、ＴＬＲアゴニストを含有しないａＰプライミングワクチンまたはａＰブースターワクチン（例えば、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標））により誘導される免疫応答と比較して、ＩＬ－５産生の減少、ＩＦＮ－γ産生の増加、またはより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比のうちの１つまたはそれ以上を特徴とする。ある特定の実施形態では、Ｔｈ１優位の免疫応答は、ＴＬＲアゴニストを含有しないａＰプライミングワクチンまたはａＰブースターワクチン（例えば、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標））により誘導される免疫応答と比較して、ＩＬ－５産生の減少および／またはより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を特徴とする。
【0131】
ある特定の実施形態では、Ｔｈ１／ＴＨ１７優位の免疫応答は、ＴＬＲアゴニストを含有しないａＰプライミングワクチンまたはａＰブースターワクチン（例えば、ＡＤＡＣＥＬ（登録商標））により誘導される免疫応答と比較して、ＩＬ－１７産生の増加と、ＩＬ－５産生の減少および／またはより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比のうちの１つまたはそれ以上とを特徴とする。
【0132】
ａＰプライミングワクチンは、ａＰブースターワクチンを投与する前に単一用量または一連の複数用量（例えば、２、３、４もしくは５用量）として投与することができる。典型的には、ａＰプライミングワクチンは、特に小児については、一連の用量として投与される。例えば、ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、６週齢～６歳の間の乳児および小児の場合、一連の５用量として投与される。６週齢～４歳の間の乳児および小児の場合、ａＰプライミングワクチンを一連の４用量として投与することもできる。典型的には、小児のための一次免疫処置スケジュールは、２月齢、４月齢、６月齢、１５～２０月齢、および４～６歳時のａＰプライミングワクチンの投与を含む。
【0133】
ａＰブースターワクチンは、典型的には、一次免疫処置スケジュールが完了した後に投与される。ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、１０歳以上であるヒト対象に投与される。ある特定の実施形態では、ａＰブースターワクチンは、４歳以上であるヒト対象に投与される。
【0134】
典型的には、ａＰワクチンブースターは、筋肉内注射により投与される。
【0135】
ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、解毒された百日咳毒素、繊維状赤血球凝集素、パータクチン、および場合によりＦＩＭ２，３を含むが、ただし、ａＰプライミングワクチンはＴＬＲアゴニストを含有しない。
【0136】
ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、ＤＡＰＴＡＣＥＬ（登録商標）、ＰＥＮＴＡＣＥＬ（登録商標）、ＱＵＡＤＲＡＣＥＬ（登録商標）、ＩＮＦＡＮＲＩＸ（登録商標）、ＩＮＦＡＮＲＩＸ－ＨＥＸＡ（登録商標）、ＫＩＮＲＩＸ（登録商標）、ＰＥＤＩＡＲＩＸ（登録商標）、またはＶＡＸＥＬＩＳ（登録商標）の１用量またはそれ以上を含む。ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、ＤＡＰＴＡＣＥＬ（登録商標）を含む。ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、ＰＥＮＴＡＣＥＬ（登録商標）またはＱＵＡＤＲＡＣＥＬ（登録商標）を含む。ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、ＩＮＦＡＮＲＩＸ（登録商標）またはＩＮＦＡＮＲＩＸ－ＨＥＸＡ（登録商標）を含む。ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、ＫＩＮＲＩＸ（登録商標）またはＰＥＤＩＡＲＩＸ（登録商標）を含む。ある特定の実施形態では、ａＰプライミングワクチンは、ＶＡＸＥＬＩＳ（登録商標）を含む。
【実施例】
【0137】
材料および方法－一般
百日咳菌チャレンジ
百日咳菌１８３２３を、１％グリセロール、２０％ヒツジ脱線維素血（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ、Ａｌｂａ Ｌａ Ｒｏｍａｉｎｅ）を補充した、ボルデー・ジャング寒天（Ｄｉｆｃｏ）で増殖させた。３６℃で２４時間後、コロニーを１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）緩衝液に移入し、細菌懸濁液の光学密度を測定した。Ｉｍａｌｇｅｎ（ケタミン ６０ｍｇ／ｋｇ；Ｍｅｒｉａｌ ＳＡＳ）およびＲｏｍｐｕｎ（キシラジン ４ｍｇ／ｋｇ；Ｂａｙｅｒ）の筋肉内注射により麻酔したマウスに、３０μｌの体積の５×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）を鼻腔内注入した。次いで、肺内の生百日咳菌ＣＦＵの初期数の定量のために感染の２時間後に、ならびに細菌コロニー形成の判定のために３、７、１４および２１日目または１、２、３、７および１４日目のどちらかに、Ｄｏｌｅｔｈａｌ（ペントバルビタール １８０ｍｇ／ｋｇ；Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ ＳＡ）の腹腔内注射によりマウスを安楽死させた。手短に述べると、肺ホモジネートをボルデー・ジャング寒天プレートに播種し、３６℃での４日間のインキュベーション後にＣＦＵの数を計数した。発症予防効果の測度を、ナイーブ対照と免疫処置マウスとのクリアランス曲線下面積（ＡＵＣ）の比として表した。
百日咳菌チャレンジ
百日咳菌１８３２３を、１％グリセロール、２０％ヒツジ脱線維素血（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ、Ａｌｂａ Ｌａ Ｒｏｍａｉｎｅ）を補充した、ボルデー・ジャング寒天（Ｄｉｆｃｏ）で増殖させた。３６℃で２４時間後、コロニーを１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）緩衝液に移入し、細菌懸濁液の光学密度を測定した。Ｉｍａｌｇｅｎ（ケタミン ６０ｍｇ／ｋｇ；Ｍｅｒｉａｌ ＳＡＳ）およびＲｏｍｐｕｎ（キシラジン ４ｍｇ／ｋｇ；Ｂａｙｅｒ）の筋肉内注射により麻酔したマウスに、３０μｌの体積の５×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）を鼻腔内注入した。次いで、肺内の生百日咳菌ＣＦＵの初期数の定量のために感染の２時間後に、ならびに細菌コロニー形成の判定のために３、７、１４および２１日目または１、２、３、７および１４日目のどちらかに、Ｄｏｌｅｔｈａｌ（ペントバルビタール １８０ｍｇ／ｋｇ；Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ ＳＡ）の腹腔内注射によりマウスを安楽死させた。手短に述べると、肺ホモジネートをボルデー・ジャング寒天プレートに播種し、３６℃での４日間のインキュベーション後にＣＦＵの数を計数した。発症予防効果の測度を、ナイーブ対照と免疫処置マウスとのクリアランス曲線下面積（ＡＵＣ）の比として表した。
【0138】
アジュバント製剤（全ての実施例）
改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ブースターおよび改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）ブースター（マウス用）は、１０Ｌｆ／ｍｌ ＴＴ、４Ｌｆ／ｍｌ ＤＴ、２０μｇ／ｍｌ ｇｄＰＴ、１０μｇ／ｍｌ ＰＲＮ、１５μｇ／ｍｌ ＦＩＭ２／３、１０μｇ／ｍｌ ＦＨＡおよび０．６６ｍｇ／ｍｌ アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）と、５００μｇ／ｍｌ ＣｐＧ１０１８（ＴＬＲ９アゴニスト）または１０μｇ／ｍｌ Ｅ６０２０（ＴＬＲ４アゴニスト）のどちらかを含有した。
改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ブースターおよび改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）ブースター（マウス用）は、１０Ｌｆ／ｍｌ ＴＴ、４Ｌｆ／ｍｌ ＤＴ、２０μｇ／ｍｌ ｇｄＰＴ、１０μｇ／ｍｌ ＰＲＮ、１５μｇ／ｍｌ ＦＩＭ２／３、１０μｇ／ｍｌ ＦＨＡおよび０．６６ｍｇ／ｍｌ アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）と、５００μｇ／ｍｌ ＣｐＧ１０１８（ＴＬＲ９アゴニスト）または１０μｇ／ｍｌ Ｅ６０２０（ＴＬＲ４アゴニスト）のどちらかを含有した。
【0139】
抗原、アジュバントおよび免疫処置（全ての実施例）
破傷風およびジフテリアトキソイドに加えて、１０μｇ化学的解毒ＰＴ、５μｇ ＦＨＡ、３μｇ ＰＲＮおよび５μｇ ＦＩＭ２，３を含有する、小児用ジフテリア－破傷風－無細胞百日咳（ａＰ）ＤＡＰＴＡＣＥＬ（登録商標）ワクチン（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ）（本実施例および図では略してＤＴａＰと呼ぶ）の、またはチオメルサールの存在下で熱により不活性化された百日咳菌 ≧４Ｉ．Ｕ．を含有するジフテリア－破傷風－全細菌－細胞百日咳（ｗＰ）Ｄ．Ｔ．ＣＯＱ／Ｄ．Ｔ．Ｐワクチン（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ）（本実施例および図では略してＤＴｗＰと呼ぶ）の、ヒト用量の１／５（両方の後ろ脚に５０μｌ）の筋肉内注射で、マウスをプライミングした。レシピエントマウスを、ヒト用量の１／５（両方の後ろ脚に５０μｌ）の次の製剤でブーストした：破傷風およびジフテリアトキソイドに加えて２．５μｇ 化学的解毒ＰＴ、５μｇ ＦＨＡ、３μｇ ＰＲＮおよび５μｇ ＦＩＭ２，３を含有する、小児用ジフテリア－破傷風－ａＰ ＡＤＡＣＥＬ（登録商標）ワクチン（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ）（本実施例および図では略してＴｄａｐと呼ぶ）；Ｄ．Ｔ．ＣＯＱ／Ｄ．Ｔ．Ｐワクチン（すなわち、ＤＴｗＰ）；または上記の改変Ｔｄａｐブースター製剤（本実施例および図では略して改変ＴｄａｐまたはｍＴｄａｐと呼ぶ）。
破傷風およびジフテリアトキソイドに加えて、１０μｇ化学的解毒ＰＴ、５μｇ ＦＨＡ、３μｇ ＰＲＮおよび５μｇ ＦＩＭ２，３を含有する、小児用ジフテリア－破傷風－無細胞百日咳（ａＰ）ＤＡＰＴＡＣＥＬ（登録商標）ワクチン（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ）（本実施例および図では略してＤＴａＰと呼ぶ）の、またはチオメルサールの存在下で熱により不活性化された百日咳菌 ≧４Ｉ．Ｕ．を含有するジフテリア－破傷風－全細菌－細胞百日咳（ｗＰ）Ｄ．Ｔ．ＣＯＱ／Ｄ．Ｔ．Ｐワクチン（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ）（本実施例および図では略してＤＴｗＰと呼ぶ）の、ヒト用量の１／５（両方の後ろ脚に５０μｌ）の筋肉内注射で、マウスをプライミングした。レシピエントマウスを、ヒト用量の１／５（両方の後ろ脚に５０μｌ）の次の製剤でブーストした：破傷風およびジフテリアトキソイドに加えて２．５μｇ 化学的解毒ＰＴ、５μｇ ＦＨＡ、３μｇ ＰＲＮおよび５μｇ ＦＩＭ２，３を含有する、小児用ジフテリア－破傷風－ａＰ ＡＤＡＣＥＬ（登録商標）ワクチン（Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ）（本実施例および図では略してＴｄａｐと呼ぶ）；Ｄ．Ｔ．ＣＯＱ／Ｄ．Ｔ．Ｐワクチン（すなわち、ＤＴｗＰ）；または上記の改変Ｔｄａｐブースター製剤（本実施例および図では略して改変ＴｄａｐまたはｍＴｄａｐと呼ぶ）。
【0140】
フルオロスポット（全て）：
フルオロスポットアッセイ（フルオロフォア標識検出試薬を利用するＥＬＩＳＰＯＴ）を使用して、脾臓ＩＦＮ－γ、ＩＬ－５またはＩＬ－１７サイトカイン分泌細胞を検出した。手短に述べると、９６ウェルＩＰＦＬ底マイクロプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を３０秒間、３５％エタノール ５０μＬで予備湿潤させた。次いで、エタノールを除去し、各ウェルを滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、１０μｇ／ｍＬでのラット抗マウスＩＦＮ－γ、ラット抗マウスＩＬ－５またはラット抗マウスＩＬ－１７抗体溶液（ＰｈａｒＭｉｇｅｎ） １００μＬ／ウェルを添加することによりマイクロプレートをコーティングし、一晩、＋４℃でインキュベートした。翌日、プレートを滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、２時間、＋３７℃で、ＲＰＭＩ ＧＳＰβ１０％ＦＢＳ ２００μＬとインキュベートした。プレートを洗浄した後、新鮮に単離した脾細胞１０６個／ウェルを、マウスＩＬ－２（１０Ｕ／ｍＬ）の存在下で、百日咳抗原（ＰＴ ２．５μｇ／ｍｌ；ＰＲＮ ５μｇ／ｍｌ；ＦＩＭ ５μｇ／ｍｌ；ＦＨＡ ５μｇ／ｍｌ）または陽性対照としてのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、２．５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。ＩＦＮγおよびＩＬ－１７については２４時間、ＩＬ－５については４８時間のインキュベーション後、プレートを、０．０５％ＢＳＡを補充したＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で６回洗浄した。洗浄後、ビオチン化抗マウスＩＦＮ－γ（２μｇ／ｍＬ）または抗マウスＩＬ－５（１μｇ／ｍＬ）もしくは抗マウスＩＬ－１７（１μｇ／ｍＬ）抗体 １００μＬ／ウェルを、２時間、室温で、暗所で添加した。次いで、プレートをＰＢＳ－ＢＳＡ ０．０５％（２００μＬ／ウェル）で３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ－ＢＳＡ ０．０５％中の１μｇ／ｍＬのストレプトアビジン－ＰＥ １００μＬ／ウェルを１時間、室温で、暗所でインキュベートした。プレートをＰＢＳ－ＢＳＡ ０．０５％（２００μＬ／ウェル）でさらに６回洗浄した。読み取りまで、＋５℃±３℃で、暗所でプレートを保管した。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－５またはＩＬ－１７分泌細胞に対応する各スポットを自動ＥＬＩＳＰＯＴ蛍光プレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）で数えた。結果を、脾細胞１０６個当たりのＩＦＮ－γ、ＩＬ－５またはＩＬ－１７分泌細胞の数として表した。幾何平均および標準偏差を群ごとに計算した。
フルオロスポットアッセイ（フルオロフォア標識検出試薬を利用するＥＬＩＳＰＯＴ）を使用して、脾臓ＩＦＮ－γ、ＩＬ－５またはＩＬ－１７サイトカイン分泌細胞を検出した。手短に述べると、９６ウェルＩＰＦＬ底マイクロプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を３０秒間、３５％エタノール ５０μＬで予備湿潤させた。次いで、エタノールを除去し、各ウェルを滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、１０μｇ／ｍＬでのラット抗マウスＩＦＮ－γ、ラット抗マウスＩＬ－５またはラット抗マウスＩＬ－１７抗体溶液（ＰｈａｒＭｉｇｅｎ） １００μＬ／ウェルを添加することによりマイクロプレートをコーティングし、一晩、＋４℃でインキュベートした。翌日、プレートを滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、２時間、＋３７℃で、ＲＰＭＩ ＧＳＰβ１０％ＦＢＳ ２００μＬとインキュベートした。プレートを洗浄した後、新鮮に単離した脾細胞１０６個／ウェルを、マウスＩＬ－２（１０Ｕ／ｍＬ）の存在下で、百日咳抗原（ＰＴ ２．５μｇ／ｍｌ；ＰＲＮ ５μｇ／ｍｌ；ＦＩＭ ５μｇ／ｍｌ；ＦＨＡ ５μｇ／ｍｌ）または陽性対照としてのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、２．５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。ＩＦＮγおよびＩＬ－１７については２４時間、ＩＬ－５については４８時間のインキュベーション後、プレートを、０．０５％ＢＳＡを補充したＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で６回洗浄した。洗浄後、ビオチン化抗マウスＩＦＮ－γ（２μｇ／ｍＬ）または抗マウスＩＬ－５（１μｇ／ｍＬ）もしくは抗マウスＩＬ－１７（１μｇ／ｍＬ）抗体 １００μＬ／ウェルを、２時間、室温で、暗所で添加した。次いで、プレートをＰＢＳ－ＢＳＡ ０．０５％（２００μＬ／ウェル）で３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ－ＢＳＡ ０．０５％中の１μｇ／ｍＬのストレプトアビジン－ＰＥ １００μＬ／ウェルを１時間、室温で、暗所でインキュベートした。プレートをＰＢＳ－ＢＳＡ ０．０５％（２００μＬ／ウェル）でさらに６回洗浄した。読み取りまで、＋５℃±３℃で、暗所でプレートを保管した。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－５またはＩＬ－１７分泌細胞に対応する各スポットを自動ＥＬＩＳＰＯＴ蛍光プレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）で数えた。結果を、脾細胞１０６個当たりのＩＦＮ－γ、ＩＬ－５またはＩＬ－１７分泌細胞の数として表した。幾何平均および標準偏差を群ごとに計算した。
【0141】
抗体定量
百日咳抗原（ＦＩＭ、ＰＴ、ＦＨＡ、ＰＲＮ）、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドに特異的な血清ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体を、マルチプレックスＵ－ＰＬＥＸアッセイ（Ｍｅｓｏ－Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で力価測定した。
百日咳抗原（ＦＩＭ、ＰＴ、ＦＨＡ、ＰＲＮ）、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドに特異的な血清ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体を、マルチプレックスＵ－ＰＬＥＸアッセイ（Ｍｅｓｏ－Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で力価測定した。
【0142】
Ｕ－ＰＬＥＸアッセイは、９６ウェルＵ－ＰＬＥＸプレートの５つの個々のスポットに特異的に結合する５つの特有のＵ－ＰＬＥＸリンカーからなる。ビオチンに基づく捕捉連結機構は、次の２工程プロセスを含む：（１）リンカーがビオチン化抗原に結合される、および（２）リンカー連結抗原がプレートに結合される。血清試料、対照および参照血清の段階希釈物を添加し、洗浄工程を行い、コーティングされた抗原に結合したＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ抗体を、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識抗ＩｇＧ１またはＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識抗ＩｇＧ２ａを使用して検出した。
【実施例1】
【0143】
遺伝子的に解毒された（ｇｄＰＴ）免疫原性と化学的に解毒されたＰＴ（ＰＴｘｄ）の比較
遺伝子的に解毒された百日咳毒素（ｇｄＰＴ）の免疫原性と化学的に解毒されたＰＴ（ＰＴｘｄ）の免疫原性を比較するための研究を行った。１マウス用量当たり２．５、０．５、０．１または０．０２μｇのｇｄＰＴまたはＰＴｘｄで２回、各々３週間の間隔を空けて（０日目および２１日目に）、ナイーブＣＤ１マウスの群に免疫処置を投与した。加えて、ＰＴｘｄによりプライミングされた応答をブーストするｇｄＰＴの能力を評価するために、単一０．５μｇ用量のＰＴｘｄ、続いて１用量当たり０．５μｇでの２回のｇｄＰＴ免疫処置を各々３週間の間隔を空けて（０、２１および４２日目に）用いて、１つのマウス群を免疫処置した。全ての製剤は、１００μＬ注射体積中に０．０６６ｍｇ ＡｌＰＯ４を含有した。百日咳毒素特異的ＥＬＩＳＡおよびＰＴ中和抗体力価によるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価の分析のために、２回目の免疫処置の１７日後（３８日目）におよび３回目の免疫処置の８日後（５０日目）に血液試料を採取した。
遺伝子的に解毒された百日咳毒素（ｇｄＰＴ）の免疫原性と化学的に解毒されたＰＴ（ＰＴｘｄ）の免疫原性を比較するための研究を行った。１マウス用量当たり２．５、０．５、０．１または０．０２μｇのｇｄＰＴまたはＰＴｘｄで２回、各々３週間の間隔を空けて（０日目および２１日目に）、ナイーブＣＤ１マウスの群に免疫処置を投与した。加えて、ＰＴｘｄによりプライミングされた応答をブーストするｇｄＰＴの能力を評価するために、単一０．５μｇ用量のＰＴｘｄ、続いて１用量当たり０．５μｇでの２回のｇｄＰＴ免疫処置を各々３週間の間隔を空けて（０、２１および４２日目に）用いて、１つのマウス群を免疫処置した。全ての製剤は、１００μＬ注射体積中に０．０６６ｍｇ ＡｌＰＯ４を含有した。百日咳毒素特異的ＥＬＩＳＡおよびＰＴ中和抗体力価によるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価の分析のために、２回目の免疫処置の１７日後（３８日目）におよび３回目の免疫処置の８日後（５０日目）に血液試料を採取した。
【0144】
ｇｄＰＴを含有する製剤は、ＰＴｘｄの製剤と比べて、強いかつ用量依存的な抗ＰＴ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答を、特に、低い用量で誘導し、ならびに高いＰＴ中和抗体力価を誘導する（図１Ａ～Ｂ）。ｇｄＰＴおよびＰＴｘｄの両方は、ＰＴｘｄによりプライミングされたＰＴ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答を同様にブーストすることができる（図２Ａ）。しかし、ＰＴｘｄでプライミングし、ｇｄＰＴでブーストしたマウスは、ＰＴｘｄでのブースティングよりも高いＰＴ中和抗体力価を生じさせる結果となった（図２Ｂ）。
【0145】
次に、Ｔｄａｐワクチン中のＰＴｘｄのｇｄＰＴでの置換が他のワクチン成分の免疫原性に対して影響を与えるかどうかを評定するための研究を行った。この可能性に取り組むために、ＰＴｘｄを含有する対照Ｔｄａｐワクチン製剤の免疫原性を、ｇｄＰＴを含有するワクチン製剤の免疫原性と比較した。２．０、０．１または０．０２μｇ／用量のｇｄＰＴを含有するワクチンを他のＴｄａｐワクチン抗原（１００μＬで１マウス用量当たり１Ｌｆ 破傷風トキソイド、０．４Ｌｆ ジフテリアトキソイド、１μｇ ＦＨＡ、１μｇ ＰＲＮ、１．５μｇ ＦＩＭ２，３および６６μｇ アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）、または１／５ヒト用量）と組み合わせて製剤化した。化学的に解毒されたＰＴ ２μｇを含有する対照Ｔｄａｐワクチンを、同じＴｄａｐ抗原濃度で比較対照として製剤化した。この研究は、ＡｌＯＯＨ中１用量当たり０．１または０．０２μｇでの単独のｇｄＰＴを投与したマウスの群も含んだ。ＣＤ１マウスにワクチン製剤の３回の免疫処置を３週間の間隔を空けて投与し、最後の免疫処置の７日後にこれらのマウスを屠殺した。２回目の免疫処置の１０日後（図３）ならびにＰＴ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価ならびにＰＴ中和抗体応答の分析のために屠殺時（図４Ａ～Ｂ）に血液試料を採取した。
【0146】
ｇｄＰＴ（１用量当たり２μｇ、およびマウス１匹当たり３回の免疫処置）を含有する改変Ｔｄａｐワクチンは、１用量当たり２μｇのＰＴｘｄを含有する、他の点では同一の対照Ｔｄａｐワクチンよりも、高いＰＴ中和抗体力価を惹起した（図４Ｂ）が、ｇｄＰＴ含有およびＰＴｘｄ含有Ｔｄａｐワクチンは、同等のＰＴ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価を有した（図４Ａ）。さらに、ＦＩＭに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体力価は、ｇｄＰＴ含有Ｔｄａｐ製剤とＰＴｘｄ含有Ｔｄａｐ製剤間で同等であった（図３）。同様のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａプロファイルが、他のワクチン抗原（すなわち、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＦＨＡおよびＰＲＮ）について観察された。したがって、ｇｄＰＴは、他のワクチン抗原により誘導される抗体応答に影響を与えなかった（図３）。しかし、他のＴｄａｐワクチン抗原の存在は、低用量のｇｄＰＴによる誘導されるＰＴ中和抗体力価を低減させるように見えた（図４Ａ、Ｂ）。具体的には、３回目の免疫処置の７日後に０．１μｇ ｇｄＰＴにより誘導された平均対数ＰＴ中和力価は、他のＴｄａｐ抗原の非存在下でＴｄａｐ抗原での力価よりも有意に高かった（０．７倍）（図４Ｂ）が、ＰＴ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価では差は観察されなかった（図４Ａ）。
【0147】
結論として、ｇｄＰＴは、Ｔｄａｐ製剤においてＰＴｄｘよりも免疫原性が高いことが確認された。また、ｇｄＰＴは、ワクチン製剤中の他のＴｄａｐ抗原の免疫原性に干渉しなかった。
【実施例2】
【0148】
ＴＬＲアジュバントは、長期プライム－ブーストスケジュールを使用してＤＴａＰ誘導Ｔｈ２免疫記憶応答をＴｈ１へと新たに方向付ける
以前に確立されたＴｈ２優位の記憶応答をブーストし、再偏向させる、改変Ｔｄａｐ製剤の能力を試験するために、長期免疫スケジュールを適用した。この研究では、ＣＤ１マウス８匹の群をＤＴａＰワクチンの筋肉内注射によりプライミングして、Ｔｈ２優位の記憶応答を確立した。第１の研究では、マウスを６週間後（４２日目）に改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤または改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）製剤でブーストした。第２の研究では、マウスに２用量の改変Ｔｄａｐブースターワクチンを投与し、第１の用量を６週間の時点で（４２日目に）および第２の用量は１２週間を時点で（８４日目に）投与した。免疫記憶応答をＴｈ１へと新たに方向付ける改変Ｔｄａｐブースティング製剤の可能性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原再刺激後の上清における脾臓サイトカイン産生細胞またはサイトカイン産生をｅｘ ｖｉｖｏで測定することによって評価した。破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＰＴ、ＦＨＡ、ＰＲＮおよびＦＩＭに対する抗体力価（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）も、最後の免疫処置の１、３および６日後に採取した血清において決定した。対照として、１つのマウス群を、ＤＴｗＰワクチン（プライム）、その後のＤＴｗＰワクチン（ブースト）によって免疫処置し、別の群を、ＤＴａＰワクチン（プライム）、その後の、ｇｄＰＴ－ＡｌＯＯＨ（２０μｇ／ｍｌ ｇｄＰＴ）を有するがＴＬＲアゴニストを含有しない対照改変Ｔｄａｐワクチン製剤、すなわち、対照改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ－ＡｌＯＯＨ）でのブーストによって免疫処置した。
以前に確立されたＴｈ２優位の記憶応答をブーストし、再偏向させる、改変Ｔｄａｐ製剤の能力を試験するために、長期免疫スケジュールを適用した。この研究では、ＣＤ１マウス８匹の群をＤＴａＰワクチンの筋肉内注射によりプライミングして、Ｔｈ２優位の記憶応答を確立した。第１の研究では、マウスを６週間後（４２日目）に改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤または改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）製剤でブーストした。第２の研究では、マウスに２用量の改変Ｔｄａｐブースターワクチンを投与し、第１の用量を６週間の時点で（４２日目に）および第２の用量は１２週間を時点で（８４日目に）投与した。免疫記憶応答をＴｈ１へと新たに方向付ける改変Ｔｄａｐブースティング製剤の可能性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原再刺激後の上清における脾臓サイトカイン産生細胞またはサイトカイン産生をｅｘ ｖｉｖｏで測定することによって評価した。破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＰＴ、ＦＨＡ、ＰＲＮおよびＦＩＭに対する抗体力価（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）も、最後の免疫処置の１、３および６日後に採取した血清において決定した。対照として、１つのマウス群を、ＤＴｗＰワクチン（プライム）、その後のＤＴｗＰワクチン（ブースト）によって免疫処置し、別の群を、ＤＴａＰワクチン（プライム）、その後の、ｇｄＰＴ－ＡｌＯＯＨ（２０μｇ／ｍｌ ｇｄＰＴ）を有するがＴＬＲアゴニストを含有しない対照改変Ｔｄａｐワクチン製剤、すなわち、対照改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ－ＡｌＯＯＨ）でのブーストによって免疫処置した。
【0149】
ＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）スケジュールは、ＤＴａＰ／改変対照Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ－ＡｌＯＯＨ）（プライム／ブースト）スケジュールと比較して、より弱いＩＬ－５分泌（図５）およびより低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比（図６Ａ～Ｌ）によって証明される通り、Ｔｈ２優位性の低い免疫プロファイルを誘導した。改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）または改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１－ＡｌＯＯＨ）ブースト製剤は、対照改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ－ＡｌＯＯＨ）ブーストワクチンと比較して有意に減少したＩＬ－５産生を誘導した（図５）。しかし、ＴＬＲアゴニストアジュバントを含有するこれらの新規改変Ｔｄａｐ製剤のいずれも、対照改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ－ＡｌＯＯＨ）で観察されたＩＦＮ－γレベルを変更しなかった（図５）。Ｔｈ２優位性の低い応答の方への全体的なサイトカインバランスと一致して、より低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比が、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）または改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ワクチンによりブーストしたマウスで観察された（図６Ａ～Ｌ）。ｍＴｄａｐ－ＣｐＧ－ＡｌＯＯＨでの免疫処置後、抗ＦＨＡについて１回のブースト後および抗ＦＩＭについて２回のブースト後に、ＴＬＲアゴニストを含有しないｍＴｄａｐ－ＡｌＯＯＨで免疫処置したマウスと比較してＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の統計的に有意な減少が観察された（図６Ａおよび６Ｄ）。ｍＴｄａｐ－Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨでの免疫処置後、抗ＦＨＡについて１回のブースト後に、ＴＬＲアゴニストを含有しないｍＴｄａｐ－ＡｌＯＯＨで免疫処置したマウスと比較してＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比の統計的に有意な減少が観察された（図６Ａ）。ＤＴａＰでプライミングしたマウスでは、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）または改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）製剤によるブースト後に、ＴＬＲアゴニストを含有しない対照改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ－ＡｌＯＯＨ）ブーストワクチンと比較してＩＬ－１７分泌について統計的に有意な差は観察されなかった（図５）。
【0150】
結論として、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）および改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ワクチンは、ＤＴａＰでプライミングしたマウスにおいてヘルパーＴ細胞応答をＴｈ２優位性の低い応答に変更することができ、ひいてはヘルパーＴ細胞応答の再偏向およびＴｈ１／Ｔｈ２バランスのシフトを達成することができた。
【実施例3】
【0151】
百日咳免疫の養子移入モデル
改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤および改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）製剤を、ＤＴａＰワクチン接種により誘導された循環抗体の非存在下で百日咳菌防御のためにＤＴａＰ誘導免疫記憶応答を再活性化するそれらの能力について試験した。
改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤および改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）製剤を、ＤＴａＰワクチン接種により誘導された循環抗体の非存在下で百日咳菌防御のためにＤＴａＰ誘導免疫記憶応答を再活性化するそれらの能力について試験した。
【0152】
ヒトとマウスとの１つの相違は、ＤＴａＰプライミングにより誘導される血清抗体の寿命である。これらの抗体は、ヒトでは急速に減少するが、マウスでの長期抗体存続は、ブースター応答の読み出しに干渉し、したがって、改変Ｔｄａｐブースター製剤の評価に干渉する。この相違に対処するために、図７に要約するように、マウス二重移入モデルを使用して、ＤＴａＰワクチン接種により誘導される循環抗体を排除した（Ｇａｖｉｌｌｅｔら ２０１５ Ｖａｃｃｉｎｅ）。この設定で、成体ＢＡＬＢ／ｃマウスをＤＴｗＰまたはＤＴａＰで１回プライミングし、６週間後にそれらの脾細胞を採取し、レシピエント、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに移入した（５０×１０６脾細胞）。レシピエントマウスをＤＴｗＰ（ＤＴｗＰでプライミングするバックグラウンドでのみ）、Ｔｄａｐ、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤または改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）製剤によりブーストした。６週間後、ブーストしたマウスの脾細胞を採取し、新たなレシピエント、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに移入した（５０×１０６脾細胞）。移入の１週間後、この二重養子移入レシピエントマウスに１０６生百日咳菌でチャレンジし、チャレンジ後０、７、１０、１４または２１日目に屠殺した。屠殺したマウスの肺内の細菌数を、ワクチン接種により誘導される循環抗原特異的抗体の非存在下での有効な免疫想起応答の指標として測定した（図９Ａ～Ｂ）。ワクチンにより誘導される応答も、ブーストの７、１４、２１、２８および４２日後に採取した血清におけるＰＴ特異的、ＰＲＮ特異的、ＦＨＡ特異的およびＦＩＭ２，３特異的ＩｇＧ抗体応答の検出によりモニターした（図８Ａ～Ｂ）。加速された、より高いワクチン抗原ＩｇＧ力価は、養子移入マウスにおける想起抗体応答の特徴である。
【0153】
百日咳菌チャレンジ時に循環抗体の非存在下で、ＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）マウスにおける記憶細胞は、早期百日咳菌制御をもたらし、肺からの細菌クリアランスを助長した（図９Ａ）。これは、少なくとも一部分は、ＰＴおよびＰＲＮなどの百日咳ワクチン抗原に特異的な抗体の迅速な生成に起因した（図８Ａ）。対照的に、ＤＴａＰプライミング／Ｔｄａｐブーストは、ナイーブ対照動物と比較して肺における細菌クリアランスを加速しなかった（図９Ａ～Ｂ）。この養子移入モデルでは、ＤＴａｐでプライミングし、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）および改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）ブーストでブーストしたマウスは、Ｔｄａｐブーストを投与したマウスと比較して加速された、より高い抗ＰＴ、ＦＨＡ、ＦＩＭ ＩｇＧ力価を示した（図８Ｂ）。
【0154】
Ｔｄａｐブーストワクチンにおける化学的に解毒されたＰＴのｇｄＰＴでの置換は、ＰＴ特異的ＩｇＧ抗体応答の増強にもかかわらず、百日咳菌の肺クリアランスに影響を与えなかった（データを示さない）。とは言え、抗原特異的記憶応答の強い再活性化が、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ワクチンについて観察された。早期細菌制御および加速された細菌クリアランスが、ＤＴｗＰプライミング／ＤＴｗＰブースト群と同様の動態で、ＤＴａＰプライミング／改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ブースト群で記録された（図９Ａ～Ｂ）。同様に、ＰＴおよびＦＨＡワクチン抗原に特異的な抗体の迅速な生成が、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）製剤で観察された（図８Ｂ）。改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）試験は、一部のａＰ抗原、例えばＰＴおよびＦＨＡ、に対する百日咳特異的抗体応答の早期再活性化を示唆した（図８Ｂ）。しかし、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ブーストと比較して改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）ブーストによる早期百日咳菌制御に対する少ない影響が観察された（図９Ｂ）。結論として、マウスにおけるこの養子移入実験は、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）および改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）ブースター製剤が、百日咳特異的想起抗体応答を向上させることができ、その結果、細菌コロニー形成に対する防御が加速されることになることを実証した。
【0155】
実施例３のための材料および方法
マウス：成体ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、特定の病原体のない条件下で飼育した。６～８週齢のマウスを使用した。全ての動物実験は、スイスおよび欧州のガイドラインに従って行い、Ｇｅｎｅｖａ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｏｆｆｉｃｅにより承認された。
マウス：成体ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、特定の病原体のない条件下で飼育した。６～８週齢のマウスを使用した。全ての動物実験は、スイスおよび欧州のガイドラインに従って行い、Ｇｅｎｅｖａ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｏｆｆｉｃｅにより承認された。
【0156】
養子移入：プライミングまたはブーストの４２日後に脾臓を採取した。臓器の機械的破壊により単個細胞浮遊液を得、赤血球細胞溶解のためにさらに処理した。５０×１０６脾細胞を１００μｌの体積でナイーブレシピエントマウスに静脈内移入した。
【0157】
百日咳菌チャレンジ：ストレプトマイシン耐性百日咳菌Ｔａｈｏｍａ Ｉ派生株ＢＰＳＭを、１％グリセロールと１０％ヒツジ脱線維素血（Ｃｈｅｍｉｅ Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ ＡＧ）と１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンとを補充したボルデー・ジャング寒天（Ｄｉｆｃｏ）で増殖させた。３７℃で２４時間後、コロニーをＰＢＳに移入し、細菌懸濁液の光学密度を測定した。Ｋｅｔａｓｏｌ（１００ｍｇ／ｋｇ；Ｇｒａｅｕｂ）およびＲｏｍｐｕｎ（１０ｍｇ／ｋｇ；Ｂａｙｅｒ）の腹腔内内注射により麻酔したマウスに、２０μｌの体積の１ｘ１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）を鼻腔内注入した。肺内の生百日咳菌ＣＦＵの初期数の定量のために感染の３時間後に、ならびに細菌コロニー形成の判定のために７、１０、１４および２１日目に、マウスを屠殺した。手短に述べると、肺ホモジネートをボルデー・ジャング寒天プレートに播種し、３７℃での４日のインキュベーション後にＣＦＵの数を計数した。発症予防効果の測度をナイーブ対象と免疫処置マウスとのクリアランス曲線下面積（ＡＵＣ）の比として表した。
【0158】
ＥＬＩＳＡ：ＰＴ特異的、ＰＲＮ特異的、ＦＨＡ特異的およびＦＩＭ２，３特異的抗体力価を、示した時点で採取した血清試料において、Ａｇ捕捉ＥＬＩＳＡにより決定した。手短に述べると、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中のＰＴ（１μｇ／ｍｌ）、ＰＲＮ（５μｇ／ｍｌ）、ＦＨＡ（５μｇ／ｍｌ）またはＦＩＭ２，３（２μｇ／ｍｌ）で一晩、４℃でコーティングした。ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０および１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で１時間、３７℃で飽和させた後、個々のまたはプールされたマウス血清の２倍段階希釈物とともにウェルを１時間、３７℃でインキュベートした。二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウスＩｇＧ、抗マウスＩｇＧ２ａ（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）、および抗ＩｇＧ１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１時間、３７℃でインキュベートし、２，２’－アジノビス［３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸］－二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）基質で１時間、顕現させた。各ウェルの光学密度を４０５ｎｍで測定し、データをＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアで解析した。結果を図８に、ＩｇＧおよびＩｇＧ１についてはＷＨＯ／ＮＩＢＳＣ標準試薬百日咳菌抗血清（ＮＩＢＳＣコード：９７／６４２）の段階希釈物を基準にしてならびにＩｇＧ２ａについては免疫処置マウスからの過免疫血清の力価測定されたプールの段階希釈物を基準にして決定したＡｇ特異的力価のＬｏｇ１０として表す。
【0159】
統計解析：値を平均±ＳＥＭとして表す。統計解析は、対応のないｔ検定または一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、２群より多くのマウスを試験する場合にはテューキー多重比較を使用して行った。全ての解析は、ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。ｐ＞０．０５である差は、有意でないと見なした。
【実施例4】
【0160】
マウス鼻腔内チャレンジモデル
使用許諾を得た百日咳ワクチンの臨床的有効性レベルを反映するマウス肺クリアランスモデルが開発され、移植され、評価された（Ｇｕｉｓｏ Ｎ．ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９９；１７：２３６６～７６頁）。このマウス鼻腔内チャレンジアッセイ（ＩＮＣＡ）モデルは、新規ワクチン候補の登録のための非臨床試験のためにＷＨＯにより推奨されており、ワクチン研究および開発に有効な研究モデルとして公知である（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ａｓｓｕｒｅ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１１；ＷＨＯ／ＢＳ／２０１１．２１５８）。さらに、ＷＨＯ顧問団は、ＩＮＣＡが、百日咳ワクチンの製剤および／または製造プロセスを変えることの潜在的影響の評定に有用であることを認めている。
使用許諾を得た百日咳ワクチンの臨床的有効性レベルを反映するマウス肺クリアランスモデルが開発され、移植され、評価された（Ｇｕｉｓｏ Ｎ．ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９９；１７：２３６６～７６頁）。このマウス鼻腔内チャレンジアッセイ（ＩＮＣＡ）モデルは、新規ワクチン候補の登録のための非臨床試験のためにＷＨＯにより推奨されており、ワクチン研究および開発に有効な研究モデルとして公知である（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ａｓｓｕｒｅ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１１；ＷＨＯ／ＢＳ／２０１１．２１５８）。さらに、ＷＨＯ顧問団は、ＩＮＣＡが、百日咳ワクチンの製剤および／または製造プロセスを変えることの潜在的影響の評定に有用であることを認めている。
【0161】
このモデルでは、亜致死用量での鼻腔内チャレンジ後、細菌が気管の線毛上皮に付着し、肺内のマクロファージへ侵入する。疾患は持続し、白血球増加および免疫抑制に伴って４～８週間続く。感染の迅速なクリアランスが、回復期マウスの再チャレンジ後に観察される。ＩＮＣＡモデルは、臨床試験において異なる有効性を示した無細胞百日咳ワクチンを識別することが証明された（Ｇｕｉｓｏ Ｎ．ら １９９９）。
【0162】
ＩＮＣＡマウスモデルを使用して、新規改変Ｔｄａｐブースターワクチン、例えば、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋ＣｐＧ１０１８－ＡｌＯＯＨ）および改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）ワクチンが、ＤＴａＰで初期免疫したマウスにおいてＴｄａｐ対照ブーストワクチンに等しいまたはそれより高い短期間防御レベルを惹起するかどうかを評価した。図１０Ａは、短期スケジュールを使用するマウス鼻腔内チャレンジアッセイ（ＩＮＣＡ）の絵画表示を示し、図１０Ｂは、長期スケジュールを使用するマウスＩＮＣＡの絵画表示を示す。図１０Ｃは、ＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）スケジュールおよびＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）スケジュールが、短期スケジュールを使用してこのモデルにおいて鼻腔内チャレンジ後にマウスの百日咳菌の肺コロニー形成を防ぐことを示す。
【0163】
短期プライム－ブーストスケジュールを使用するマウス鼻腔内チャレンジアッセイ
２週間間隔短期免疫処置スケジュールを、ＷＨＯの調和化プロトコール（ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ、２０１１）に記載されているように適用した。この研究の読み出し情報は、肺内の細菌負荷量（ＣＦＵ／肺）の低減、ならびに血液中の白血球（ＷＣＢ）数に基づく白血球増多であった。
２週間間隔短期免疫処置スケジュールを、ＷＨＯの調和化プロトコール（ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ、２０１１）に記載されているように適用した。この研究の読み出し情報は、肺内の細菌負荷量（ＣＦＵ／肺）の低減、ならびに血液中の白血球（ＷＣＢ）数に基づく白血球増多であった。
【0164】
マウス４０匹の群に、筋肉内経路により１／５ヒト用量のＤＴａＰを注射し、２週間後に、Ｔｄａｐ、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）ワクチンでのまたは化学的に解毒されたＰＴ、ＡｌＯＯＨを用い、ＴＬＲアゴニストを用いずに製剤化した対照Ｔｄａｐワクチン（対照Ｔｄａｐ（ＰＴｘｄ－ＡｌＯＯＨ）での２回目の注射を投与した。ＤＴｗＰの２回の注射（プライム／ブースト）を投与した群も含めた。２つの対照群に、ＰＢＳ（感染対照）、または感染対照と比較してアルミニウム塩およびＥ６０２０がコロニー形成に影響を与えないことを検証するための単独でのＥ６０２０－ＡｌＯＯＨアジュバント、どちらかを投与した。
【0165】
２回目の免疫処置の２週間後、百日咳菌１８３２３の懸濁液の鼻孔への注入によりマウスにチャレンジした。チャレンジ後、各群からのマウス８匹を、チャレンジの２時間後およびチャレンジの３、７、１４および２１日後に屠殺した。肺を無菌で取り出し、個々に均質化して細菌負荷量を測定した。ホモジネートの段階希釈物を播種した後、ボルデー・ジャング寒天プレート上で増殖したコロニーを計数することにより、肺１つ当たりの平均ＣＦＵを決定した。チャレンジ後にも血液試料を採取し、ＷＢＣ計数を行った。
【0166】
図１１に示すように、百日咳菌１８３２３は、チャレンジの３日後、クリアランス期に入る前にＰＢＳ対照マウスの肺内でコロニーを形成し、拡大した。ＰＢＳ対照マウスでは、完全な百日咳菌の肺クリアランスに２１日より長くかかった。単独でのアジュバントは、肺コロニー形成および疾患に何の影響も与えなかった。チャレンジの３日後に全てのワクチン接種群において百日咳菌の肺コロニー形成の低減が観察され、全ての製剤がチャレンジの１４日後にはベースライン細菌負荷量に達した。ＤＴｗＰは、最速の百日咳菌肺クリアランスを生じさせ、チャレンジの７日後にはベースラインに達した。結果は、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤が、感染対照と比較して肺内の細菌負荷量を大幅に低減させた（３日目に４ｌｏｇおよび７日目に５ｌｏｇ）ことを示し、これは、百日咳菌１８３２３での鼻腔内チャレンジ後に下気道のコロニー形成を防止するその能力を実証した。注目すべきことに、このクリアランスプロファイルは、ＤＴｗＰ／ＤＴｗＰ（プライム／ブースト）について得られたプロファイルにより近く、ＤＴａＰ／Ｔｄａｐ（プライム／ブースト）について得られたプロファイルとはよりかけ離れていた。７日目に得られた細菌負荷量の改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤ブーストとＴｄａｐ（化学的に解毒されたＰＴを含有する）ブーストとの差は、有意であった（ｐ値＜０．０００１）。全てのワクチンは、疾患に対して防御性であり（図１１）、白血球増多を防止した。この研究は、短期プライム－ブーストスケジュールを使用してマウスＩＮＣＡにおいて改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤が、Ｔｄａｐ（ＡＤＡＣＥＬ（登録商標））と比較して百日咳菌クリアランスを有意に加速させること実証した。
【0167】
長期プライム－ブーストスケジュールを使用するマウス鼻腔内チャレンジアッセイ
ａＰプライミングでの免疫学的バックグラウンドを事前に確立したマウスにおいて新規改変Ｔｄａｐ製剤の有効性を確認するための研究を行うために、上記で論じた通りの長期プライム－ブーストスケジュールを使用して百日咳菌による肺コロニー形成および疾患を予防する改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）ブースターの能力を評価した。図１０Ｂを参照されたい。この研究において、無細胞百日咳ワクチン対照は、新規改変Ｔｄａｐ製剤におけるｇｄＰＴおよびＴＬＲアゴニストの役割をよりよく理解するために、化学的に解毒されたＰＴを含有するが、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤の場合と同じ用量の抗原およびアルミニウム塩（ＡｌＯＯＨ）を含有するように改変した、Ｔｄａｐワクチン（対照Ｔｄａｐ（ＰＴｘｄ－ＡｌＯＯＨ））であった。
ａＰプライミングでの免疫学的バックグラウンドを事前に確立したマウスにおいて新規改変Ｔｄａｐ製剤の有効性を確認するための研究を行うために、上記で論じた通りの長期プライム－ブーストスケジュールを使用して百日咳菌による肺コロニー形成および疾患を予防する改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）ブースターの能力を評価した。図１０Ｂを参照されたい。この研究において、無細胞百日咳ワクチン対照は、新規改変Ｔｄａｐ製剤におけるｇｄＰＴおよびＴＬＲアゴニストの役割をよりよく理解するために、化学的に解毒されたＰＴを含有するが、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤の場合と同じ用量の抗原およびアルミニウム塩（ＡｌＯＯＨ）を含有するように改変した、Ｔｄａｐワクチン（対照Ｔｄａｐ（ＰＴｘｄ－ＡｌＯＯＨ））であった。
【0168】
マウス４０匹の群に、筋肉内経路により１／５ヒト用量のＤＴａＰを注射し、６週間後に、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）でのまたは対照Ｔｄａｐ（ＰＴｘｄ－ＡｌＯＯＨ）での２回目の注射を投与した。ＤＴｗＰでプライミングし、ＤＴｗＰでブーストした群も含めた。２回目の免疫処置の６週間後、百日咳菌１８３２３の懸濁液の鼻孔への注入によりマウスにチャレンジした。チャレンジ後、各群からのマウス８匹を、チャレンジの２時間後およびチャレンジの１、２、３、７および１４日後に屠殺した。肺を無菌で取り出し、個々に均質化して細菌負荷量を測定した。ホモジネートの段階希釈物を播種した後、ボルデー・ジャング寒天プレート上で増殖したコロニーを計数することにより、肺１つ当たりの平均ＣＦＵを決定した。チャレンジ後にも血液試料を採取し、ＷＢＣ計数を行った。
【0169】
図１２Ｂに示すように、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤は、感染対照と比較して早くも１日目に肺内の細菌負荷量を大幅に低減させた（６ｌｏｇ低減）。改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）と対照Ｔｄａｐ（ＰＴｘｄ－ＡｌＯＯＨ）の間にも、１日目に肺内のＣＦＵ数の７．７分の１への低減を伴う有意な差（ｐ値＝０．００７）が観察された。全てのワクチン接種マウスの細菌負荷量は、７日目までに、肺内に検出可能な細菌がないことを示すベースラインに戻った（図１２Ｂ）。
【0170】
この研究は、改変Ｔｄａｐ（ｇｄＰＴ＋Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）製剤が、長期プライム－ブーストスケジュールで、ｇｄＰＴまたはＴＬＲアゴニストを含有しないＴｄａｐ対照よりも（少なくとも感染初期の間は）肺コロニー形成の防止に効果があったことを実証した。これは、この効果が、改変Ｔｄａｐ製剤に含有されるｇｄＰＴおよび／またはＴＬＲアゴニストに起因することを示唆する。
【実施例5】
【0171】
脾細胞においてフルオロスポットにより測定したＴｈ１７分泌細胞
Ｔｈ２からの免疫応答をよりＴｈ－１７応答へと再偏向させるＴＬＲアジュバントの能力を研究するために、ＩＬ－１７サイトカインを以下の実験で測定した。ＣＤ１マウスをＤＴａＰ組成物でプライミングし、２週間の間隔を空けてＤ０およびＤ２１に、用量効果設計のＴＬＲ４アジュバントを含有するまたは含有しないｍＴｄａｐ－Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨで２回ブーストした。Ｅ６０２０およびＡｌＯＯＨは、ｍＴｄａｐ製剤中にそれぞれ１０μｇおよび６６μｇの量で存在した。ｍＴｄａｐ抗原成分は、０．１ｍＬの用量当たり以下の通りであった：
Ｔｈ２からの免疫応答をよりＴｈ－１７応答へと再偏向させるＴＬＲアジュバントの能力を研究するために、ＩＬ－１７サイトカインを以下の実験で測定した。ＣＤ１マウスをＤＴａＰ組成物でプライミングし、２週間の間隔を空けてＤ０およびＤ２１に、用量効果設計のＴＬＲ４アジュバントを含有するまたは含有しないｍＴｄａｐ－Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨで２回ブーストした。Ｅ６０２０およびＡｌＯＯＨは、ｍＴｄａｐ製剤中にそれぞれ１０μｇおよび６６μｇの量で存在した。ｍＴｄａｐ抗原成分は、０．１ｍＬの用量当たり以下の通りであった：
【0172】
【表3】
【0173】
麻酔（Ｉｍａｌｇｅｎ／Ｒｏｍｐｕｎ ８０ｍｇ／ｋｇ ケタミンおよび１６ｍｇ／ｋｇ キリラジン、１００μＬ／１０ｇまたはイソフルラン）下で全ての群についてＤ２０（２００μＬ）およびＤ３５（瀉血）にマウスから血液試料を採取した。脾臓細胞における細胞免疫応答をｅｘ ｖｉｖｏフルオロスポットアッセイにより分析してＩＬ－１７分泌細胞を測定し、ＭＳＤアッセイにより分析してＩＬ－１７の分泌を測定した。フルオロスポット技術は、上で説明した。ＰＴｘ ２．５μｇ／ｍＬ（図１３Ａ）または百日咳抗原のプール（２．５μｇ／ｍＬ ＰＴｘ、５μｇ／ｍＬ ＰＲＮ、５μｇ／ｍＬ ＦＩＭ）（図１３Ｂ）での３日のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後、フルオロスポットアッセイおよびＭＳＤ Ｕｐｌｅｘキットを使用して脾細胞の上清においてＴｈ１７サイトカイン（ＩＬ－１７）の産生を測定した。
【0174】
図１３Ａ～Ｂに示すように、ＩＬ－１７分泌細胞頻度は、ＴＬＲ４を含有しないｍＴｄａｐワクチン注射後、フルオロスポットアッセイにおいて陽性カットオフ未満（１９スポット／１０６細胞の線より下）であった。ｍＴｄａｐ－Ｅ６０２０製剤は、脾細胞をＰＴトキソイド（ＰＴｘ）（図１３Ａ）または百日咳抗原のプール（図１３Ｂ）で再刺激したとき、０．１μｇ～４μｇ／用量の用量に依存する形でＩＬ－１７分泌細胞量の増加を誘導した。４μｇ Ｅ６０２０／用量を含有するｍＴｄａｐブーストワクチンは、ＰＴｘで再刺激したときＩＬ－１７分泌細胞頻度をフルオロスポットアッセイにおいて陽性カットオフより上に増加させ（図１３Ａ）、その一方で、０．５、１、４および１０μｇ Ｅ６０２０／用量を含有するｍＴｄａｐブーストワクチンは、百日咳抗原のプールで再刺激したときＩＬ－１７分泌細胞頻度をフルオロスポットアッセイにおいて陽性カットオフより上に増加させた（図１３Ｂ）。
【0175】
一般に、ＭＳＤにより測定されたサイトカイン分泌プロファイルは、フルオロスポットにより測定されたサイトカイン分泌細胞頻度と一致した（データを示さない）。Ｅ６０２０を含有するｍＴｄａｐ製剤は、用量効果様式でＩＬ－１７分泌を誘導し、最高効果は０．５μｇ～４μｇ／用量で達成された。
【実施例6】
【0176】
熱安定性
Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８システム（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してｎａｎｏＤＳＦを行った。ｎａｎｏＤＳＦは、自家蛍光を使用して、局所環境の変化によるタンパク質中の芳香族残基（フルオロフォア）の変化を評価する。タンパク質が折り畳まれていないことを示す自家蛍光の変化を用いて、蛍光発光のシフトおよび強度変化をモニターする。タンパク質の半分が折り畳まれていないポイントを示す融解温度（Ｔｍ）を使用して、タンパク質の熱安定性を特徴付ける。ｎａｎｏＤＳＦ法では、これは、３３０ｎｍおよび３５０ｎｍで記録される蛍光の比を使用することにより決定される。この比は、単一波長の使用と比較してＴｍを検出する感度がより高いことが示されている。試料を、さらなる準備を一切せずに毛細管に充填し、１００％出力を用いて２８５ｎｍで励起させた。２℃／分の走査速度で２０から９５℃まで温度プロファイルを記録した。
Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８システム（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してｎａｎｏＤＳＦを行った。ｎａｎｏＤＳＦは、自家蛍光を使用して、局所環境の変化によるタンパク質中の芳香族残基（フルオロフォア）の変化を評価する。タンパク質が折り畳まれていないことを示す自家蛍光の変化を用いて、蛍光発光のシフトおよび強度変化をモニターする。タンパク質の半分が折り畳まれていないポイントを示す融解温度（Ｔｍ）を使用して、タンパク質の熱安定性を特徴付ける。ｎａｎｏＤＳＦ法では、これは、３３０ｎｍおよび３５０ｎｍで記録される蛍光の比を使用することにより決定される。この比は、単一波長の使用と比較してＴｍを検出する感度がより高いことが示されている。試料を、さらなる準備を一切せずに毛細管に充填し、１００％出力を用いて２８５ｎｍで励起させた。２℃／分の走査速度で２０から９５℃まで温度プロファイルを記録した。
【0177】
異なるワクチン製剤の三次構造および熱安定性をｎａｎｏＤＳＦにより評定して、異なるアジュバントを用いてワクチンを製剤化したときに立体構造の何らかの差が検出され得るかどうかを評定することができる。全てのワクチン製剤について、１つの温度遷移が検出された。図１４。ｍＴｄａｐワクチン（ｇｄＰＴ）がＡｌＯＯＨに吸着されていた場合（ｍＴｄａｐ－ＡｌＯＯＨ）、そのｍＴｄａｐワクチンは、７４．６℃の温度遷移を有した。同様に、ｍＴｄａｐ－ＡｌＯＯＨ製剤がＥ６０２０を含有する場合（ｍＴｄａｐ Ｅ６０２０－ＡｌＯＯＨ）、温度遷移は、７４．２℃であった。ｍＴｄａｐ－ＡｌＯＯＨ製剤がＣｐＧを含有する場合（ｍＴｄａｐ ＣｐＧ－ＡｌＯＯＨ）、温度遷移の小規模な増加があり、この場合、７７．０℃で検出された。
【0178】
１つまたはそれ以上の例示的実施形態を本明細書で説明したが、後続の特許請求の範囲により定義される発明概念の趣旨および範囲から逸脱することなく、そのような実施形態に、形態および詳細の様々な変更を加えることができることは、当業者には理解されるであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図6-5】
【図6-6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【配列表】