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特許7605829クレブシエラ属細菌の検出のためのプライマーセット及びプローブ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-16
(45)【発行日】2024-12-24
(54)【発明の名称】クレブシエラ属細菌の検出のためのプライマーセット及びプローブ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/689 20180101AFI20241217BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20241217BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241217BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20241217BHJP
C12Q 1/6837 20180101ALI20241217BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20241217BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/689 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6813 Z
C12Q1/6837 Z
C12N15/31
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2022512614
(86)(22)【出願日】2021-03-31
(86)【国際出願番号】 JP2021013800
(87)【国際公開番号】W WO2021201091
(87)【国際公開日】2021-10-07
【審査請求日】2023-07-27
(31)【優先権主張番号】P 2020063986
(32)【優先日】2020-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000003296
【氏名又は名称】デンカ株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】599055382
【氏名又は名称】学校法人東邦大学
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100127247
【弁理士】
【氏名又は名称】赤堀 龍吾
(74)【代理人】
【識別番号】100152331
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 拓
(72)【発明者】
【氏名】舘田 一博
(72)【発明者】
【氏名】宮武 佑弥
(72)【発明者】
【氏名】山内 和明
【審査官】吉門 沙央里
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１１／００７６６７４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】欧州特許出願公開第０１９７５２５３（ＥＰ，Ａ１）
【文献】特開平０７－０６７６５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Sun Zhen et al.，Locked nucleic acid pentamers as universal PCR primers for genomic DNA amplification.，PLoS One，2008年，Vol. 3, No. 11，e3701
【文献】GARZA-RAMOS U., et al.，Development of a Multiplex-PCR probe system for the proper identification of Klebsiella variicola，BMC MICROBIOLOGY，2015年03月13日，Vol. 15, No. 64，pp. 1-14
【文献】HUANG M., et al.，Pathogenicity of Klebsiella pneumonia (KpC4) infecting maize and mice，JOURNAL OF INTEGRATIVE AGRICULTURE，2016年07月，Vol. 15, No. 7，pp. 1510-1520
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／６８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプライマーセットであって、クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーと第二のプライマーとを含み、
クレブシエラ・バリイコーラを検出する場合、第一のプライマーと第二のプライマーがそれぞれ、配列番号７及び８に記載の塩基配列を有しており、
クレブシエラ・ニューモニエを検出する場合、第一のプライマーと第二のプライマーがそれぞれ、配列番号１０及び１１に記載の塩基配列を有している、プライマーセット。
【請求項2】
クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を有し、第二のプライマーが、配列番号８に記載の塩基配列を有する、プライマーセット。
【請求項3】
クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーと第四のプライマーを更に含む、請求項２に記載のプライマーセット。
【請求項4】
第三のプライマーが、配列番号１０に記載の塩基配列を有する、請求項３に記載のプライマーセット。
【請求項5】
第四のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列を有する、請求項３又は４に記載のプライマーセット。
【請求項6】
クレブシエラ・ニューモニエの存在を検出するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号１０に記載の塩基配列を有し、第二のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列を有する、プライマーセット。
【請求項7】
クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーと第四のプライマーを更に含む、請求項６に記載のプライマーセット。
【請求項8】
第三のプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を有する、請求項７に記載のプライマーセット。
【請求項9】
第四のプライマーが、配列番号８に記載の塩基配列を有する、請求項７又は８に記載のプライマーセット。
【請求項10】
プライマーがビオチンで標識されている、請求項１～９のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項11】
検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプローブであって、プローブが、クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とし、
クレブシエラ・バリイコーラを検出する場合、プローブが配列番号９に記載の塩基配列を有しており、
クレブシエラ・ニューモニエを検出する場合、プローブが配列番号１２に記載の塩基配列を有している、プローブ。
【請求項12】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のプライマーセットと、請求項１１に記載のプローブとを含む、キット。
【請求項13】
検体において、クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するための方法であって、請求項２～５のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いる、方法。
【請求項14】
第一及び第二のプライマーを用いてクレブシエラ・バリイコーラとそれ以外のクレブシエラ属細菌とを鑑別する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
請求項１１に記載のプローブを更に用いる、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項16】
クレブシエラ・バリイコーラと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・ニューモニエ；クレブシエラ・ミシガネンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）；クレブシエラ・カシニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；クレブシエラ・アエロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）；クレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）；クレブシエラ・グラヌロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）；クレブシエラ・グリモンティ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）；及びクレブシエラ・オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）から成る群から選択される１種又は２種以上である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
クレブシエラ・バリイコーラと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・ニューモニエであり、クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、第三のプライマーと第四のプライマー及び／又はプローブを更に用いる、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
検体において、クレブシエラ・ニューモニエの存在を検出するための方法であって、請求項６～９のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いる、方法。
【請求項19】
第一及び第二のプライマーを用いてクレブシエラ・ニューモニエとそれ以外のクレブシエラ属細菌とを鑑別する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
請求項１１に記載のプローブを更に用いる、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・バリイコーラ；クレブシエラ・ミシガネンシス；クレブシエラ・カシニューモニエ；クレブシエラ・アエロゲネス；クレブシエラ・プランティコーラ；クレブシエラ・グラヌロマティス；クレブシエラ・グリモンティ；及びクレブシエラ・オキシトカから成る群から選択される１種又は２種以上である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項22】
クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・バリイコーラであり、クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、第三のプライマーと第四のプライマー及び／又はプローブを更に用いる、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、クレブシエラ属細菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）を検出するためのオリゴヌクレオチドに関する。さらに詳しくは、クレブシエラ・バリイコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を検出又はそれらの菌を鑑別するためのオリゴヌクレオチドプローブ又はキット、あるいは方法に関する。
【背景技術】
【0002】
クレブシエラ属細菌は、環境中に広く存在するグラム陰性桿菌である。なかでもクレブシエラ・ニューモニエは、和名で肺炎桿菌と呼ばれ、ヒト腸管および咽頭の常在菌であり、呼吸器感染症、尿路感染症、血流感染症等、ヒトに対して病原性を示す、日和見感染症の代表的な起因菌のひとつで、クレブシエラ属細菌の中で最も高頻度で臨床材料から観測される種である。
【0003】
クレブシエラ・ニューモニエには、基質拡張型βラクタマーゼ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ β－ｌａｃｔａｍａｓｅ：ＥＳＢＬ）という、多種の抗菌薬を分解する酵素を保有する耐性株が存在し、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃａｅ：ＣＲＥ）のうちの一つとして挙げられ、治療の難渋化及びその拡大が国際的な問題となっている。
【0004】
クレブシエラ・ニューモニエのような感染症原因菌の検出方法として、原因菌を分離培養し、その生化学的性状をもとに菌の同定を行う培養同定法等が知られている。これまで、臨床材料から分離されクレブシエラ・ニューモニエとして同定されたうちの一部は、おそらくは１０％から１５％程度の割合で、実はクレブシエラ・バリイコーラという別種である事が判明している（非特許文献１）。クレブシエラ属細菌のクレブシエラ・バリイコーラは、２００４年に新種として登録されたクレブシエラ・ニューモニエの類縁種であり、バナナやサトウキビ等の植物、また、ハキリアリの巣内の菌糸からの分離報告がなされ、ヒトの常在細菌ではないことが知られている（非特許文献１）。本菌は、既存の表現型試験において、いくつかの性状（例えば、アドニトール分解能）がクレブシエラ・ニューモニエと一部異なる傾向が報告されているが、確たる指標は現在なく、鑑別は困難とされている。
【0005】
また、クレブシエラ属細菌は、現在１４種および亜種５種へと分類がなされており、他にヒトに対して病原性を示す種は、クレブシエラ・アエロゲネス、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・プランティコーラ等が知られている。
【0006】
前述の通り、臨床材料中に含まれるクレブシエラ属細菌の鑑別では、多種のクレブシエラ属細菌を考慮しなければならない。これらの鑑別は既存の表現型試験では困難であり、そこで、臨床材料中に含まれるクレブシエラ属細菌の正確な鑑別を目的として、シーケンス解析、Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ）、ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）法等の遺伝子法が採用されてきた。
【0007】
中でも、クレブシエラ・ニューモニエとクレブシエラ・バリイコーラを鑑別する手法としては、例えば、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡ、ｍｄｈ、ｉｎｆＢ、ｐｈｏＥ、ｎｉｆＨ遺伝子の６遺伝子を対象としたＭＬＳＴによる鑑別（非特許文献１）等の、遺伝子の配列情報に基づいて従来鑑別が行われてきた。しかし、これらの手法は、シーケンス解析を行う必要性があるため簡便性に欠け、実際の医療現場でルーチンワークとして採用することは難しい。
【0008】
より簡便な手法としては、すなわち、医療現場でルーチンワークに採用できる程度の労力で、ｂｌａＳＨＶ、ｂｌａＯＫＰ、ｂｌａＬＥＮの３遺伝子のマルチプレックスＰＣＲとゲル電気泳動による判別法が報告された（非特許文献２）。しかし、本法はＰＣＲの産物長が最低でも３４８ｂｐ、長いもので９９５ｂｐと、ゲル電気泳動での解析に焦点を当てており、現在広く普及しているリアルタイムＰＣＲにおいては産物長が長すぎるため、不適である。
【0009】
また他には、リアルタイムＰＣＲとサンガーシーケンスを組み合わせ、１６Ｓ ｒＤＮＡとｒｐｏＢ遺伝子の配列情報をもとに鑑別する手法も報告されている（非特許文献３）。本法もまた、鑑別の為にシーケンス解析を行う必要があり、簡便さに欠ける。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ， ａ ｎｏｖｅｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ． Ｓｙｓｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２７， ２７－３５
【文献】：Ａ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ， Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ， ａｎｄ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｏｕｔｉｎｅ， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｏｌｕｍｅ ８７， Ｉｓｓｕｅ ４， Ａｐｒｉｌ ２０１７， Ｐａｇｅｓ ３１５－３１７
【文献】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌｕｍｅ １５９， Ａｐｒｉｌ ２０１９， Ｐａｇｅｓ １４８－１５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
上記事情に鑑みて、本発明は、クレブシエラ属細菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）を検出、又はそれらの菌を鑑別するためのオリゴヌクレオチド等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、鋭意研究の結果、クレブシエラ・ニューモニエとクレブシエラ・バリイコーラ、さらには他のクレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子の配列に着目し、その中でも、特定の位置に着目することで、既報の手法と比較して、より簡便にクレブシエラ・ニューモニエとクレブシエラ・バリイコーラを鑑別することのできる手法を見出した。
【0013】
即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］ 検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプライマーセットであって、
クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーと第二のプライマーとからなる、プライマーセット。
［２］ ｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードする、［１］に記載のプライマーセット。
［３］ 標的とされるｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の１８８７位から２０６３位までの塩基配列のうちの連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有する、［１］又は［２］に記載のプライマーセット。
［４］ クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［３］のいずれかに記載のプライマーセット。
［５］ クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、第二のプライマーが、配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のプライマーセット。
［６］ クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーと第四のプライマーを更に含む、［１］～［５］のいずれかに記載のプライマーセット。
［７］ 第三のプライマーが、配列番号１０に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１０に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１０に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［６］のいずれかに記載のプライマーセット。
［８］ 第四のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１１に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［７］のいずれかに記載のプライマーセット。
［９］ クレブシエラ・ニューモニエの存在を検出するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号１０に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１０に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１０に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］又は［２］に記載のプライマーセット。
［１０］ 第二のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１１に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］、［２］、［９］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１１］ クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーと第四のプライマーを更に含む、［１］、［２］、［９］、［１０］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１２］ 第三のプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］、［２］、［９］～［１１］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１３］ 第四のプライマーが、配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］、［２］、［９］～［１２］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１４］ プライマーがビオチンで標識されている、［１］～［１３］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１５］ 検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプローブであって、
クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、プローブ。
［１６］ ｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードする、［１５］に記載のプローブ。
［１７］ 標的とされるｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の１８８７位から２０６３位までの塩基配列のうちの連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有する、［１５］又は［１６］に記載のプローブ。
［１８］ 配列番号９に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号９に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも８塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号９に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１５］～［１７］のいずれかに記載のプローブ。
［１９］ ［１］～［１４］のいずれかに記載のプライマーセットと、［１５］～［１８］のいずれかに記載のプローブとを含む、キット。
［２０］ 検体において、クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するための方法であって、［１］～［９］のいずれかに記載のプライマーセットを用いる、方法。
［２１］ 第一及び第二のプライマーを用いてクレブシエラ・バリイコーラとそれ以外のクレブシエラ属細菌とを鑑別する工程を含む、［２０］に記載の方法。
［２２］ ［１５］～［１８］のいずれかに記載のプローブを更に用いる、［２０］又は［２１］に記載の方法。
［２３］ クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・ニューモニエ；クレブシエラ・ミシガネンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）；クレブシエラ・カシニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；クレブシエラ・アエロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）；クレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）；クレブシエラ・グラヌロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）；クレブシエラ・グリモンティ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）；及びクレブシエラ・オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）から成る群から選択される１種又は２種以上である、［２０］～［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］ クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・ニューモニエであり、クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、第四のプライマーと第五のプライマー及び／又はプローブを更に用いる、［２０］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］ 検体において、クレブシエラ・ニューモニエの存在を検出するための方法であって、［１］、［２］、［９］～［１４］のいずれかに記載のプライマーセットを用いる、方法。
［２６］ 第一及び第二のプライマーを用いてクレブシエラ・ニューモニエとそれ以外のクレブシエラ属細菌とを鑑別する工程を含む、［２５］に記載の方法。
［２７］ ［１５］～［１８］のいずれかに記載のプローブを更に用いる、［２６］に記載の方法。
［２８］ クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・バリイコーラ；クレブシエラ・ミシガネンシス；クレブシエラ・カシニューモニエ；クレブシエラ・アエロゲネス；クレブシエラ・プランティコーラ；クレブシエラ・グラヌロマティス；クレブシエラ・グリモンティ；及びクレブシエラ・オキシトカから成る群から選択される１種又は２種以上である、［２５］～［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］ クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・バリイコーラであり、クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、第四のプライマーと第五のプライマー及び／又はプローブを更に用いる、［２５］～［２８］のいずれかに記載の方法。
［１］ 検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプライマーセットであって、
クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーと第二のプライマーとからなる、プライマーセット。
［２］ ｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードする、［１］に記載のプライマーセット。
［３］ 標的とされるｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の１８８７位から２０６３位までの塩基配列のうちの連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有する、［１］又は［２］に記載のプライマーセット。
［４］ クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［３］のいずれかに記載のプライマーセット。
［５］ クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、第二のプライマーが、配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［４］のいずれかに記載のプライマーセット。
［６］ クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するためのプライマーセットであって、クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーと第四のプライマーを更に含む、［１］～［５］のいずれかに記載のプライマーセット。
［７］ 第三のプライマーが、配列番号１０に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１０に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１０に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［６］のいずれかに記載のプライマーセット。
［８］ 第四のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１１に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］～［７］のいずれかに記載のプライマーセット。
［９］ クレブシエラ・ニューモニエの存在を検出するためのプライマーセットであって、第一のプライマーが、配列番号１０に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１０に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１０に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］又は［２］に記載のプライマーセット。
［１０］ 第二のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１１に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］、［２］、［９］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１１］ クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーと第四のプライマーを更に含む、［１］、［２］、［９］、［１０］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１２］ 第三のプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］、［２］、［９］～［１１］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１３］ 第四のプライマーが、配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１］、［２］、［９］～［１２］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１４］ プライマーがビオチンで標識されている、［１］～［１３］のいずれかに記載のプライマーセット。
［１５］ 検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプローブであって、
クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、プローブ。
［１６］ ｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードする、［１５］に記載のプローブ。
［１７］ 標的とされるｇｙｒＢ遺伝子が、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の１８８７位から２０６３位までの塩基配列のうちの連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有する、［１５］又は［１６］に記載のプローブ。
［１８］ 配列番号９に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号９に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも８塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号９に記載の塩基配列と同じ機能を有する、［１５］～［１７］のいずれかに記載のプローブ。
［１９］ ［１］～［１４］のいずれかに記載のプライマーセットと、［１５］～［１８］のいずれかに記載のプローブとを含む、キット。
［２０］ 検体において、クレブシエラ・バリイコーラの存在を検出するための方法であって、［１］～［９］のいずれかに記載のプライマーセットを用いる、方法。
［２１］ 第一及び第二のプライマーを用いてクレブシエラ・バリイコーラとそれ以外のクレブシエラ属細菌とを鑑別する工程を含む、［２０］に記載の方法。
［２２］ ［１５］～［１８］のいずれかに記載のプローブを更に用いる、［２０］又は［２１］に記載の方法。
［２３］ クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・ニューモニエ；クレブシエラ・ミシガネンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）；クレブシエラ・カシニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；クレブシエラ・アエロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）；クレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）；クレブシエラ・グラヌロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）；クレブシエラ・グリモンティ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）；及びクレブシエラ・オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）から成る群から選択される１種又は２種以上である、［２０］～［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］ クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・ニューモニエであり、クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、第四のプライマーと第五のプライマー及び／又はプローブを更に用いる、［２０］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］ 検体において、クレブシエラ・ニューモニエの存在を検出するための方法であって、［１］、［２］、［９］～［１４］のいずれかに記載のプライマーセットを用いる、方法。
［２６］ 第一及び第二のプライマーを用いてクレブシエラ・ニューモニエとそれ以外のクレブシエラ属細菌とを鑑別する工程を含む、［２５］に記載の方法。
［２７］ ［１５］～［１８］のいずれかに記載のプローブを更に用いる、［２６］に記載の方法。
［２８］ クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・バリイコーラ；クレブシエラ・ミシガネンシス；クレブシエラ・カシニューモニエ；クレブシエラ・アエロゲネス；クレブシエラ・プランティコーラ；クレブシエラ・グラヌロマティス；クレブシエラ・グリモンティ；及びクレブシエラ・オキシトカから成る群から選択される１種又は２種以上である、［２５］～［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］ クレブシエラ・ニューモニエと鑑別されるクレブシエラ属細菌がクレブシエラ・バリイコーラであり、クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、第四のプライマーと第五のプライマー及び／又はプローブを更に用いる、［２５］～［２８］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【0014】
本発明のオリゴヌクレオチドによれば、より簡便にクレブシエラ・バリイコーラ及び／又はクレブシエラ・ニューモニエとその他のクレブシエラ属細菌を鑑別することが可能になる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、同じｇｙｒＢ遺伝子を標的とする他のプライマー及びプローブとの比較で優れた鑑別能力を発揮しうる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）、Ｋ．ニューモニエのＮＵ－ＣＲＥ０４７株、ＣＨＳ１０５株、ＫＰＮＩＨ３３株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号４、５、６）のｇｙｒＢ遺伝子の一部の多重整列結果。
【図2】配列番号７及び８、１０及び１１のプライマーセットを用いて得られた増幅産物の融解曲線解析の結果。実線はＫ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株、破線はＫ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株、一点鎖線はコントロール（水）の結果をそれぞれ示す。
【図3】Ｋ．バリイコーラ及びＫ．ニューモニエのゲノムＤＮＡを対象としたＤＮＡプローブを用いた基板上での検出結果。縦軸はｐＣｏｄｅにおいて測定した蛍光強度を示す。
【図5】臨床検体を対象としたＤＮＡプローブを用いた基板上での検出結果。縦軸はｐＣｏｄｅにおいて測定した蛍光強度を示す。
【図6】Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果（１～３０１ｂｐ）。
【図7】Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果（３００～６００ｂｐ）。
【図8】Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果（７０１～１０００ｂｐ）。
【図9】Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果（１６０１～１９００ｂｐ）。
【図10】Ｋ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果（２０５１～２３５０ｂｐ）。
【図11】アッセイセット１～６を用いた蛍光測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について説明するが、本発明の範囲は以下の実施形態に限定して解釈されない。
【0017】
（プライマーセット）
第一の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプライマーセットが提供される。プライマーセットは、クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーと第二のプライマーとからなる。
第一の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプライマーセットが提供される。プライマーセットは、クレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーと第二のプライマーとからなる。
【0018】
ｇｙｒＢ遺伝子は、ＤＮＡジャイレースのサブユニットであるＧｙｒＢタンパク質をコードしている。
【0019】
検体は、クレブシエラ・バリイコーラ又はクレブシエラ・ニューモニエを含むクレブシエラ属菌種の存在が疑われるものであれば特に限定されないが、ヒト又は非ヒト由来の血液、血清、血漿、尿、便、唾液、喀痰、組織液、髄液、ぬぐい液等の体液等又はその希釈物等が挙げられ、血液、血清、血漿、尿、便、髄液又はこれらの希釈物が好ましい。検体は食品、土壌、植物等であってもよい。
【0020】
クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子の例として、配列番号１～３のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号１～３のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードするものが挙げられる。
【0021】
クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子の例として、配列番号４～６のいずれかに示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号４～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、且つＧｙｒＢタンパク質をコードするものが挙げられる。
【0022】
例えば、フォワードプライマーとしての第一のプライマーは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１～のいずれかに示される塩基配列、又は配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、とハイブリダイズすることができるものであればどのような配列を有していてもよい。
【0023】
同様に、リバースプライマーとしての第二のプライマーは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の相補鎖、又は配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の相補鎖において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、とハイブリダイズすることができるものであればどのような配列を有していてもよい。
【0024】
本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えば塩基配列の長さなどの情報を基に適宜決定され得る。例えば、ストリンジェントな条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件とは、相同性（好ましくは同一性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件ともいえる。
【0025】
具体的なストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、及び５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））中に所望の塩基配列に相補的な塩基配列と、クレブシエラ・バリイコーラの存在が疑われる検体とを約４２℃～約５０℃でインキュベーションし、そして０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて約６５℃～約７０℃で洗浄する条件である。
【0026】
プライマー、プローブの設計は、他の類縁種の配列と交差反応を起こさないように行われるが、増幅産物などの検出に使用する系やその他の条件に応じて適宜変更することができる。１００～２００塩基長の長さの増幅産物を生成する場合、例えば、配列番号１～６のいずれかに示される塩基配列の１８８７位から２０６３位までの塩基配列を標的とすることが好ましい。プライマーは、このような標的を構成する塩基配列のうちの連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有するように設計される。プライマーの末端、特に３‘末端において、クレブシエラ・バリイコーラ以外のクレブシエラ属細菌とのミスマッチが存在するように設計を行うことが好ましい。
【0027】
クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーの例として、以下の配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＴＣ－３’（配列番号７）
５’－ＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＴＣ－３’（配列番号７）
【0028】
クレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第二のプライマーの例として、以下の配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＣＧＡＴＡＴＴＣＣＧＧＣＣＣＣＡＴＧ－３’（配列番号８）
５’－ＣＧＡＴＡＴＴＣＣＧＧＣＣＣＣＡＴＧ－３’（配列番号８）
【0029】
クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第一のプライマーの例として、以下の配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＣ－３’（配列番号１０）
５’－ＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＣ－３’（配列番号１０）
【0030】
クレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第二のプライマーの例として、以下の配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＧＡＴＡＴＴＣＣＧＧＣＣＣＣＡＴＡＡＴＧ－３’（配列番号１１）
５’－ＧＡＴＡＴＴＣＣＧＧＣＣＣＣＡＴＡＡＴＧ－３’（配列番号１１）
【0031】
第一及び第二のプライマーの長さは任意であり、例えば約１０塩基～約３５塩基の範囲で適宜設定できるが、少なくとも１０塩基以上であることが好ましい。
【0032】
第一のプライマーと第二のプライマーの比率は特に限定されず、同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。プライマーセットが非対称ＰＣＲ法で使用される場合、一方のプライマーの濃度が他方のプライマーの濃度よりも高くなるように調整され得る。
【0033】
第一と第二のプライマーはクレブシエラ・バリイコーラ又はクレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子の全部又は一部の領域を特異的に増幅することができ、これにより、その他のクレブシエラ属菌種との鑑別が可能になる。あるいは、第一と第二のプライマーの増幅産物を融解曲線解析にかけ、その融解温度を他のプライマーセットによる増幅産物の融解温度と比較することでクレブシエラ・バリイコーラ又はクレブシエラ・ニューモニエとその他のクレブシエラ菌種とを区別することもできる。
【0034】
その他のクレブシエラ属菌種としては、クレブシエラ・ミシガネンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）；クレブシエラ・カシニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；クレブシエラ・アエロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）；クレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）；クレブシエラ・グラヌロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）；クレブシエラ・グリモンティ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）；クレブシエラ・オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）等が挙げられるが、検体に含まれる菌種はこれらに限定されない。また、クレブシエラ属菌種は１種又は２種以上であってもよい。
【0035】
プライマーセットはクレブシエラ・バリイコーラ用の第一及び第二のプライマーとクレブシエラ・ニューモニエ用の第一及び第二のプライマーとを組み合わせてもよいし、これらの第一及び第二のプライマーをそれぞれ又は組み合わせて、これら以外のプライマー、例えば第三、第四、第五、第六等の追加のプライマーを含んでいてもよい。適切な追加のプライマーを使用することで検出感度が向上し得る。そのようなプライマーとしては、例えば、検体中に含まれることが予想されるその他のクレブシエラ菌種を検出するためのプライマー等が想定される。
【0036】
クレブシエラ・バリイコーラを検出又は鑑別するために使用され得るクレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーの例として、配列番号１０に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１０に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１０に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
【0037】
クレブシエラ・バリイコーラを検出又は鑑別するために使用され得るクレブシエラ・ニューモニエのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第四のプライマーの例として、配列番号１１に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１１に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１１に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
【0038】
クレブシエラ・ニューモニエを検出又は鑑別するために使用され得るクレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第三のプライマーの例として、配列番号７に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号７に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号７に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
【0039】
クレブシエラ・ニューモニエを検出又は鑑別するために使用され得るクレブシエラ・バリイコーラのｇｙｒＢ遺伝子を標的とする第四のプライマーの例として、配列番号８に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号８に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも１０塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号８に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
【0040】
上記プライマーを用いる核酸増幅反応により、検体に含まれるクレブシエラ・バリイコーラ及び／又はクレブシエラ・ニューモニエの存在を検出することができる。
【0041】
核酸増幅法としてはＰＣＲ法があり、マルチプレックスＰＣＲ、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を挙げることができる。検体に多数のクレブシエラ属細菌が含まれていると予想される場合、複数の菌を網羅的に同時検出することが可能なマルチプレックスＰＣＲが好ましい。
【0042】
増幅産物の検出方法は、ポリアクリルアミド又はアガロースゲルを用いた電気泳動法など、既知の方法で行うができる。例えば、電気泳動では、分子量が既知のマーカーの移動度に対する増幅産物の移動度から、増幅産物の存在を同定することができる。
【0043】
核酸増幅反応後の増幅産物の検出には、増幅産物を特異的に認識することができる標識体を利用してもよい。そのような標識体としては蛍光色素、ビオチン、ジゴキシゲニン等が挙げられる。標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー等を用いて検出することができる。
【0044】
（プローブ）
第二の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプローブが提供される。プローブはクレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とすることができる。
第二の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプローブが提供される。プローブはクレブシエラ属細菌のｇｙｒＢ遺伝子を標的とすることができる。
【0045】
プローブは、好ましくはその内部がその他のクレブシエラ属細菌に対するミスマッチを含むように設計される。これにより、ハイブリダイズ時のフルマッチ部分の塩基長が短くなり、特異性が向上し、偽陽性が低減し得る。
【0046】
クレブシエラ・バリイコーラを検出又は鑑別するために使用され得るプローブの例として、以下の配列番号９に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号９に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも８塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号９に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＡＧ－３’（配列番号９）
５’－ＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＡＧ－３’（配列番号９）
【0047】
クレブシエラ・ニューモニエを検出又は鑑別するために使用され得るプローブの例として、以下の配列番号１２に記載の塩基配列を有するか、あるいは配列番号１２に記載の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列中、連続する少なくとも８塩基を含む塩基配列を有し、且つ、配列番号１２に記載の塩基配列と同じ機能を有するものが挙げられる。
５’－ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１２）
５’－ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１２）
【0048】
プローブはビーズ等の固相体に結合されてもよい。そのような固相体の例としては、マルチプレックスアッセイに適したビーズ、例えば、ＷＯ２０１８０５２４６４Ａ１に開示されているようなマルチプレックスアッセイについての情報を記憶するための固有のアナログコード識別子を有するビーズが挙げられる。
【0049】
（キット）
第三の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプライマーセットとプローブとを含むキットが提供される。
第三の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するためのプライマーセットとプローブとを含むキットが提供される。
【0050】
キットには、クレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の検出に使用する試薬、例えば増幅反応を行うための試薬を含めてもよい。増幅反応を行う試薬は、例えば緩衝液、塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を含む。キットの内容物や試薬は増幅方法に応じて当業者が適宜決定することができ、キットはプライマーを用いて得られる増幅産物又はプローブとハイブリダイゼーションさせるための固相体を更に含んでいてもよい。
【0051】
キットは更に、検体中に含まれることが予想されるその他のクレブシエラ菌種を検出するためのプライマーやプローブを含んでもよい。
【0052】
（検出方法）
第四の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するための方法が提供される。クレブシエラ・バリイコーラの存在の検出には配列番号７及び８のプライマーセットを、クレブシエラ・ニューモニエの存在の検出には配列番号１０及び１１のプライマーセットを用いることができる。
第四の態様において、検体におけるクレブシエラ・バリイコーラ及びクレブシエラ・ニューモニエから成る群から選択される１又は複数のクレブシエラ属細菌の存在を検出するための方法が提供される。クレブシエラ・バリイコーラの存在の検出には配列番号７及び８のプライマーセットを、クレブシエラ・ニューモニエの存在の検出には配列番号１０及び１１のプライマーセットを用いることができる。
【0053】
プライマーセットにプローブを組み合わせることが好ましい。例えば、配列番号７及び８のプライマーと、配列番号９のプローブを併用することでクレブシエラ・バリイコーラがその他のクレブシエラ属細菌からより高精度に鑑別され得る。クレブシエラ・ニューモニエを検出するためのプライマーセット及びプローブを併用してもよい。
【0054】
クレブシエラ・ニューモニエをその他のクレブシエラ属細菌から高精度に鑑別するためには、例えば、配列番号１０及び１１のプライマーと、配列番号１２のプローブを併用することが好ましい。クレブシエラ・バリイコーラを検出するためのプライマーセット及びプローブを併用してもよい。
【0055】
検体を更に全ゲノム解析、そしてＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）解析にかけることで検出された細菌の異同を判断してもよい。
【0056】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
【実施例】
【0057】
実施例１：ゲノムＤＮＡを対象とするリアルタイムＰＣＲによるＫ．バリイコーラ及びＫ．ニューモニエの検出
【0058】
プライマー・プローブの設計
図１に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）、Ｋ．ニューモニエのＮＵ－ＣＲＥ０４７株、ＣＨＳ１０５株、ＫＰＮＩＨ３３株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号４、５、６）のｇｙｒＢ遺伝子の一部の多重整列結果から、配列番号７～１２のプライマー・プローブを設計した。
図１に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）、Ｋ．ニューモニエのＮＵ－ＣＲＥ０４７株、ＣＨＳ１０５株、ＫＰＮＩＨ３３株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号４、５、６）のｇｙｒＢ遺伝子の一部の多重整列結果から、配列番号７～１２のプライマー・プローブを設計した。
【表1】
【0059】
核酸増幅および融解曲線解析
Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲによる増幅を行った。増幅に用いた試薬はＴａＫａＲａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）、インターカレーター色素にＥｖａＧｒｅｅｎ（ｂｉｏｔｉｕｍ社）を使用した。各プライマーは終濃度０．２μＭ、鋳型のゲノムＤＮＡは１０μｇ／Ｌとなるように添加し、ＴａＫａＲａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２内の２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは１×、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘは１Ｕを使用し、鋳型ＤＮＡ等を混合してＰＣＲ反応液を調製した。測定装置にはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いた。
Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲによる増幅を行った。増幅に用いた試薬はＴａＫａＲａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）、インターカレーター色素にＥｖａＧｒｅｅｎ（ｂｉｏｔｉｕｍ社）を使用した。各プライマーは終濃度０．２μＭ、鋳型のゲノムＤＮＡは１０μｇ／Ｌとなるように添加し、ＴａＫａＲａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２内の２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは１×、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘは１Ｕを使用し、鋳型ＤＮＡ等を混合してＰＣＲ反応液を調製した。測定装置にはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いた。
【0060】
使用した増幅反応条件は以下のとおりである。
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数４５回）
７２℃：６００秒
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数４５回）
７２℃：６００秒
【0061】
更に、増幅産物について融解曲線解析を以下の条件で行った。
９５℃：３０秒
６０℃－＞９５℃：０．１１℃／秒で昇温
９５℃：３０秒
６０℃－＞９５℃：０．１１℃／秒で昇温
【0062】
融解曲線解析の測定結果を図２に示す。Ｋ．バリイコーラとＫ．ニューモニエの増幅産物の融解温度は、それぞれ８４．７℃と８３．８℃と、およそ１℃の差があった。以上から、配列番号７、８、１０、１１のプライマーを用いることで、標的とした核酸成分を増幅させ、さらに、増幅産物の融解温度による識別ができることが分かった。
【0063】
特筆すべき点として、本実施例では、当該領域で発光物質にしばしば用いられる高価なＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅを採用しておらず、安価なインターカレーター色素で識別が可能であり、実験に必要なコストの面で秀でていることが分かった。
【0064】
実施例２：Ｋ．バリイコーラおよびＫ．ニューモニエのゲノムＤＮＡを対象としたＤＮＡプローブを用いた基板上での検出
【0065】
核酸増幅および検出
Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１のプライマーセットを用いて、ＰＣＲによる増幅、および、基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化、蛍光測定を行った。このとき、配列番号８および１１の５’末端に、リンカーを介しビオチン修飾を行ったプライマーを使用した。
Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１のプライマーセットを用いて、ＰＣＲによる増幅、および、基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化、蛍光測定を行った。このとき、配列番号８および１１の５’末端に、リンカーを介しビオチン修飾を行ったプライマーを使用した。
【0066】
増幅にはＴａＫａＲａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を使用した。各プライマーは終濃度０．２μＭ、鋳型のゲノムＤＮＡは１０μｇ／Ｌとなるように添加し、ＴａＫａＲａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２内の２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは１×、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘは１Ｕを使用し、鋳型ＤＮＡ等を混合してＰＣＲ反応液を調製した。核酸増幅装置にはＴ１００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いた。増幅反応終了後、基板上でのハイブリダイゼーション反応に供する前に、熱変性反応を同機器にて行った。
【0067】
基板上でのハイブリダイゼーション反応に用いた試薬は、配列番号９のプローブが固定化された基板１および配列番号１２のプローブが固定化された基板２が含まれた溶液、Ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＳＰＥ－ｂｕｆｆｅｒ）、熱変性を実施したＰＣＲ反応液を混合した。
【0068】
標識化にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を試薬に用いた。基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化は、機器にＩｎｔｅｌｌｉＰｌｅｘ １０００ πＣｏｄｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。蛍光測定装置は、ＰｌｅｘＢｉｏ（登録商標）１００ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｎａｌａｙｚｅｒ （ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。
【0069】
使用した反応条件は以下のとおりである。
増幅反応条件
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数３０回）
７２℃：６００秒
増幅反応条件
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数３０回）
７２℃：６００秒
【0070】
熱変性条件
９５℃：５分－＞４℃へ急冷
９５℃：５分－＞４℃へ急冷
【0071】
ハイブリダイズ条件
３７℃：２０分インキュベート
３７℃：２０分インキュベート
【0072】
標識化条件
３７℃：１０分インキュベート
３７℃：１０分インキュベート
【0073】
測定結果を図３に示す。Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株を鋳型とした場合、基板１においては顕著に蛍光が観測され、基板２ではほとんど蛍光が観測されなかった。また、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株を鋳型とした場合、基板１においては微弱ながら、また、基板２では顕著な蛍光が観測された。また、陰性コントロールとして水を鋳型とした場合では、基板１においては微弱ながら蛍光が観測され、基板２においてはほとんど蛍光が観測されなかった。
【0074】
【0075】
陰性コントロールを差し引くことで、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株を鋳型とした場合、基板１においてはほとんど蛍光が観測されず、また、基板２では顕著な蛍光が観測された。
【0076】
以上から、配列番号７、８、１０、１１のプライマーおよび配列番号９および配列番号１２のプローブを用いることで、従来では鑑別のできなかったＫ．バリイコーラとＫ．ニューモニエの鑑別が可能となることが期待できた。
【0077】
実施例３：臨床検体（血液培養液）５検体を対象としたＤＮＡプローブを用いた基板上での検出
【0078】
核酸増幅および検出
培養同定法において、Ｋ．ニューモニエと同定された検体１および２、Ｋ．アエロゲネスと同定された検体３、Ｋ．オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）と同定された検体４、Ｋ．プランティコーラと同定された検体５に対して、ＱＩＡａｍｐ ＢｉＯｓｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、試薬付属の標準プロトコールに則り抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１のプライマーセットを用いて、ＰＣＲによる増幅、および、基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化、蛍光測定を行った。このとき、配列番号８および１１の５’末端に、リンカーを介しビオチン修飾を行ったプライマーを使用した。
培養同定法において、Ｋ．ニューモニエと同定された検体１および２、Ｋ．アエロゲネスと同定された検体３、Ｋ．オキシトカ（ｏｘｙｔｏｃａ）と同定された検体４、Ｋ．プランティコーラと同定された検体５に対して、ＱＩＡａｍｐ ＢｉＯｓｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、試薬付属の標準プロトコールに則り抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１のプライマーセットを用いて、ＰＣＲによる増幅、および、基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化、蛍光測定を行った。このとき、配列番号８および１１の５’末端に、リンカーを介しビオチン修飾を行ったプライマーを使用した。
【0079】
増幅にはＴａＫａＲａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を使用した。各プライマーは終濃度０．２μＭ、鋳型のゲノムＤＮＡは１０μｇ／Ｌとなるように添加し、ＴａＫａＲａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２内の２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは１×、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘは１Ｕを使用し、鋳型ＤＮＡ等を混合してＰＣＲ反応液を調製した。核酸増幅装置にはＴ１００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いた。増幅反応終了後、基板上でのハイブリダイゼーション反応に供する前に、熱変性反応を同機器にて行った。
【0080】
基板上でのハイブリダイゼーション反応に用いた試薬は、配列番号９のプローブが固定化された基板１および配列番号１２のプローブが固定化された基板２が含まれた溶液、Ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＳＰＥ－ｂｕｆｆｅｒ）、熱変性を実施したＰＣＲ反応液を混合した。
【0081】
標識化にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を試薬に用いた。基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化は、機器にＩｎｔｅｌｌｉＰｌｅｘ １０００ πＣｏｄｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。蛍光測定装置は、ＰｌｅｘＢｉｏ（登録商標）１００ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｎａｌａｙｚｅｒ （ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。
【0082】
使用した反応条件は以下のとおりである。
増幅反応条件
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数３０回）
７２℃：６００秒
増幅反応条件
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数３０回）
７２℃：６００秒
【0083】
熱変性条件
９５℃：５分－＞４℃へ急冷
９５℃：５分－＞４℃へ急冷
【0084】
ハイブリダイズ条件
３７℃：２０分インキュベート
３７℃：２０分インキュベート
【0085】
標識化条件
３７℃：１０分インキュベート
３７℃：１０分インキュベート
【0086】
【0087】
検体１を鋳型とした場合、基板１において蛍光が観測され、また、検体２を鋳型とした場合、基板２において蛍光が観測された。このことから、実施例１の結果に鑑み、検体１はＫ．バリイコーラである可能性が示唆された。後述する検証１にて、検体１について、次世代シーケンサーを用いた全ゲノム解析とＡＮＩによる菌種同定を行った結果、検体１はＫ．バリイコーラとして分類がされることが判明し、実施例１と合わせ、配列番号７、８、１０、１１のプライマーセットを用い、配列番号９および配列番号１２のプローブを用いることで、従来では鑑別のできなかったＫ．バリイコーラとＫ．ニューモニエの鑑別が可能となることが明らかとなった。
【0088】
さらに、検体３、４、５については、どちらの基板からも蛍光が観測されなかったため、配列番号７、８、１０、１１のプライマーセットを用い、配列番号９および配列番号１２のプローブを用いても、他のクレブシエラ属細菌であるＫ．アエロゲネス、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．プランティコーラを誤って検出することはないことが分かった。
【0089】
検証１：検体１の次世代シーケンサーを用いた全ゲノム解析とＡＮＩによる菌種同定
遺伝子の配列情報を用いた菌種同定には、古くはＤＤＨ（ＤＮＡ－ＤＮＡ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法が用いられてきたが、現在では、ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）法が標準的な手法として取って代わってきている。
ＡＮＩとは、解析対象の全ゲノムの配列が、データベース上に登録されているどのリファレンス配列に対して配列類似性が高いかという計算結果をもとにして、菌種の同定を行う手法である。
遺伝子の配列情報を用いた菌種同定には、古くはＤＤＨ（ＤＮＡ－ＤＮＡ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法が用いられてきたが、現在では、ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）法が標準的な手法として取って代わってきている。
ＡＮＩとは、解析対象の全ゲノムの配列が、データベース上に登録されているどのリファレンス配列に対して配列類似性が高いかという計算結果をもとにして、菌種の同定を行う手法である。
【0090】
ｉ）分離コロニーからの釣菌およびゲノム抽出
分離コロニーから釣菌し、Ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ（日本ジェネティクス社）で処理した上清を、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用い、試薬付属の標準プロトコールに則り、ゲノムを抽出した。
分離コロニーから釣菌し、Ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ（日本ジェネティクス社）で処理した上清を、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用い、試薬付属の標準プロトコールに則り、ゲノムを抽出した。
【0091】
ｉｉ）ライブラリー調製
ＱＩＡｓｅｑ ＦＸ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、試薬付属の標準プロトコールに則り、ライブラリーを調製した。
ＱＩＡｓｅｑ ＦＸ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、試薬付属の標準プロトコールに則り、ライブラリーを調製した。
【0092】
ｉｉｉ）シーケンス反応
ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ ｖ３ ６００ ｃｙｃｌｅｓを用い、試薬付属の標準プロトコールに則り、機器にＭｉＳｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて、３００ｂｐ×２のペアエンドシーケンス反応をおこなった。
ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ ｖ３ ６００ ｃｙｃｌｅｓを用い、試薬付属の標準プロトコールに則り、機器にＭｉＳｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて、３００ｂｐ×２のペアエンドシーケンス反応をおこなった。
【0093】
ｉｉｉｉ）ＡＮＩによる菌種同定
機器から取得した生データに対し、トリミングにＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖｅｒｓｉｏｎ ０．３８を用い、ｄｅ ｎｏｖｏアセンブリーにＳＰＡｄｅｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１３．０を用いて全ゲノムの配列を作成した。データベースにＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑを用いて、ＢＢＴｏｏｌｓでＡＮＩによる菌種同定をおこなった。
機器から取得した生データに対し、トリミングにＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖｅｒｓｉｏｎ ０．３８を用い、ｄｅ ｎｏｖｏアセンブリーにＳＰＡｄｅｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１３．０を用いて全ゲノムの配列を作成した。データベースにＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑを用いて、ＢＢＴｏｏｌｓでＡＮＩによる菌種同定をおこなった。
【0094】
検体１は、データベース上のＫ．バリイコーラと最も高い類似性（ＡＮＩ Ｖａｌｕｅ：９９．１５％）を示し、次点はＫ．ニューモニエ（ＡＮＩ Ｖａｌｕｅ：９５．８９％）であった。一般的に、ＡＮＩによる菌種同定における、同一菌種であると判定する閾値は９５～９６％（Ｋｉｍ，Ｍ，ＨＳ Ｏｈ，ＳＣ Ｐａｒｋ，Ｊ Ｃｈｕｎ． ２０１４．Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｖｅｒａｇｅ ｇｙｒＢｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６４：３４６―３５１．）とされており、本閾値を以って、検体１はＫ．バリイコーラとして同定がされた。以上から、全ゲノム解析とＡＮＩによる菌種同定からも、実施例２の結果の妥当性が支持された。
【0095】
Ｋ．バリイコーラおよびＫ．ニューモニエのゲノムＤＮＡを対象としたＤＮＡプローブを用いた基板上での検出
【0096】
プライマーおよびプローブの設計
図１に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の一部の多重整列結果から配列番号７～９、図６に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号１３～１５、図７に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号１６～１８、図８に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号１９～２１、図９に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号２２～２４、図１０に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号２５～２７のプライマー・プローブを設計した。また、それぞれをアッセイセット１～６とした。
図１に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の一部の多重整列結果から配列番号７～９、図６に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号１３～１５、図７に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号１６～１８、図８に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号１９～２１、図９に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号２２～２４、図１０に示すＫ．バリイコーラのＤＳＭ１５９６８株、ＭＧＨ２０株、Ｘ３９株の一部のｇｙｒＢ遺伝子（配列番号１、２、３）の多重整列結果から配列番号２５～２７のプライマー・プローブを設計した。また、それぞれをアッセイセット１～６とした。
【0097】
【表2】
【0098】
核酸増幅および検出
Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１あるいは配列番号１３、１４、１０、１１あるいは配列番号１６、１７、１０、１１あるいは配列番号１９、２０、１０、１１あるいは配列番号２２、２３、１０、１１あるいは配列番号２５、２６、１０、１１のプライマーセットを用いて、ＰＣＲによる増幅、および、基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化、蛍光測定を行った。このとき、配列番号８、１１、１４、１７、２０、２３、２６の５’末端に、リンカーを介しビオチン修飾を行ったプライマーを使用した。
Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８、１０、１１あるいは配列番号１３、１４、１０、１１あるいは配列番号１６、１７、１０、１１あるいは配列番号１９、２０、１０、１１あるいは配列番号２２、２３、１０、１１あるいは配列番号２５、２６、１０、１１のプライマーセットを用いて、ＰＣＲによる増幅、および、基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化、蛍光測定を行った。このとき、配列番号８、１１、１４、１７、２０、２３、２６の５’末端に、リンカーを介しビオチン修飾を行ったプライマーを使用した。
【0099】
増幅にはＴａＫａＲａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を使用した。各プライマーは終濃度０．２μＭ、鋳型のゲノムＤＮＡは１０μｇ／Ｌとなるように添加し、ＴａＫａＲａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２内の２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは１×、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘは１Ｕを使用し、鋳型ＤＮＡ等を混合してＰＣＲ反応液を調製した。核酸増幅装置にはＴ１００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いた。増幅反応終了後、基板上でのハイブリダイゼーション反応に供する前に、熱変性反応を同機器にて行った。
【0100】
基板上でのハイブリダイゼーション反応に用いた試薬は、配列番号９のプローブが固定化された基板１および配列番号１５のプローブが固定化された基板３および配列番号１８のプローブが固定化された基板４および配列番号２１のプローブが固定化された基板５および配列番号２４のプローブが固定化された基板６が含まれた溶液、Ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＳＰＥ－ｂｕｆｆｅｒ）、熱変性を実施したＰＣＲ反応液を混合した。
【0101】
標識化にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を試薬に用いた。基板上でのハイブリダイゼーション反応および標識化は、機器にＩｎｔｅｌｌｉＰｌｅｘ １０００ πＣｏｄｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。蛍光測定装置は、ＰｌｅｘＢｉｏ（登録商標）１００ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｎａｌａｙｚｅｒ （ＰｌｅｘＢｉｏ社）を用いた。
【0102】
使用した反応条件は以下のとおりである。
増幅反応条件
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数３０回）
７２℃：６００秒
増幅反応条件
９４℃：３０秒
６０℃：６０秒－＞９４℃：３０秒（サイクル数３０回）
７２℃：６００秒
【0103】
熱変性条件
９５℃：５分－＞４℃へ急冷
９５℃：５分－＞４℃へ急冷
【0104】
ハイブリダイズ条件
３７℃：２０分インキュベート
３７℃：２０分インキュベート
【0105】
標識化条件
３７℃：１０分インキュベート
３７℃：１０分インキュベート
【0106】
測定結果を図１１に示す。また、Ｋ．バリイコーラＪＣＭ１２４１９株を鋳型とした場合の蛍光値をシグナルとし、Ｋ．ニューモニエＪＣＭ１６６２T株を鋳型とした場合の蛍光値をノイズとしたときの各アッセイセットのシグナル／ノイズを算出した結果を表３に示す。
【0107】
【表3】
【0108】
シグナル／ノイズの値が大きいほど、鑑別能力が高いアッセイセットであると言え、このことから最も鑑別能力が高かったのはアッセイセット１であり、次に鑑別能力が高いのはアッセイセット５、３番目がアッセイセット３であることが分かった。シグナル／ノイズの値が１に近いほど、鑑別能力が低い、あるいは鑑別ができないアッセイセットであると言え、アッセイセット２、４、６は鑑別能力が低いアッセイセットであることが分かった。
【0109】
以上から、ｇｙｒＢ遺伝子内の６つの領域で作成したアッセイセット１～６のうち、アッセイセット１である配列番号７、８のプライマーおよび配列番号９のプローブが、Ｋ．バリイコーラとＫ．ニューモニエの鑑別能力が最も高いことが分かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】