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特許7605930神経学的障害を診断または予測する方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-16

(45)【発行日】2024-12-24

(54)【発明の名称】神経学的障害を診断または予測する方法

(51)【国際特許分類】

G01N 33/53 20060101AFI20241217BHJP

G01N 33/50 20060101ALI20241217BHJP

C12Q 1/6851 20180101ALI20241217BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 D

G01N33/50 P

C12Q1/6851 ZNA

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2023172563

(22)【出願日】2023-10-04

(62)【分割の表示】P 2020561746の分割

【原出願日】2019-05-01

(65)【公開番号】P2024009871

(43)【公開日】2024-01-23

【審査請求日】2023-11-02

(31)【優先権主張番号】1807178.7

(32)【優先日】2018-05-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】524194403

【氏名又は名称】イノベーションアルスターリミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮＵＬＳＴＥＲＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋香元

(72)【発明者】

【氏名】ドゥグエズ，ステファニー

(72)【発明者】

【氏名】ダディー，ウィリアム

【審査官】松田芳子

(56)【参考文献】

【文献】特表２００７－５２５２１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】PLoS ONE，2011年，Vol.6, No.10，e25545

【文献】Gene，2015年，Vol.566, No.2，p.158-165

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ１／６８

Ｇ０１Ｎ３３／５０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象における神経学的障害を同定するインビトロの方法であって、以下のステップ：
（ａ）前記対象からの生物学的サンプル中のバイオマーカーの定量的または定性的レベルを決定することと；
（ｂ）前記対象からの前記生物学的サンプル中の前記バイオマーカーの定量的または定性的レベルを、正常サンプル中の個別のバイオマーカーの定量的または定性的レベルと比較すること；を含み、
正常サンプル中の前記個別のバイオマーカーの前記定量的または定性的レベルよりも大きい前記対象からの前記生物学的サンプル中の前記バイオマーカーの定量的または定性的レベルが、神経学的障害の定量的または定性的な存在を示し、かつ
前記バイオマーカーが、ＤＡＧ１である、方法。

【請求項2】

前記バイオマーカーが、遺伝子である、請求項１に記載のインビトロの方法。

【請求項3】

前記バイオマーカーが、ＤＡＧ１遺伝子によりコードされるタンパク質である、請求項１に記載のインビトロの方法。

【請求項4】

前記バイオマーカーが、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ１４１１８を有するタンパク質である、請求項１に記載のインビトロの方法。

【請求項5】

前記神経学的障害が、神経変性障害である、請求項１～４のいずれか一項に記載のインビトロの方法。

【請求項6】

前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルーゲーリック病；運動ニューロン疾患；ＭＮＤ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、偽球麻痺、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、および脊髄性筋萎縮症から選択される、請求項５に記載のインビトロの方法。

【請求項7】

前記生物学的サンプルが、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のインビトロの方法。

【請求項8】

前記生物学的サンプルが、全血である、請求項１～７のいずれか一項に記載のインビトロの方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、対象における神経学的障害を診断または予測する方法に関する。この方法は、対象の生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーの定量的または定性的レベルを決定することと、生物学的サンプル中のバイオマーカーまたは各バイオマーカーの定量的または定性的レベルに基づいて、対象の神経学的障害を診断または予測すること、を含む。

【背景技術】

【0002】

運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）としても公知である筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンの進行性変性および死、タンパク質の凝集、重度の筋萎縮、ならびに呼吸不全を引き起こす致命的な運動ニューロン障害である。生存期間の中央値は、症状の発症から２～５年である。ＡＬＳは、家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ；－症例の１０％）または散発性ＡＬＳ（ＳＡＬＳ；－症例の９０％）のいずれかとして現れる。ＡＬＳの発生率は、１０万人あたり０．３～２．６例と推定されている（欧州では、１０万人あたり２．１６／年、アイルランドでは１０万人あたり２．０／年）。

【0003】

動物モデルおよびＡＬＳ患者における研究は、運動ニューロンの変性が神経筋接合部から始まり、シナプス後の筋肉の変化が積極的な役割を果たし得ることを示している。研究は、骨格筋には機能的な分泌活性があることを示している。筋肉のセクレトームは、機能性タンパク質、ｍＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡの細胞間輸送を行う小胞であるエクソソームを含む。エクソソームは、筋肉細胞または他のタイプの細胞にオートクリン／パラクリン様式で作用し、筋肉の成長および再生、全身における代謝、および他の機能に寄与し得る。

【0004】

影響を受けたニューロンおよび隣接するグリアにおけるＳＯＤ１、ＴＤＰ－４３、またはＦＵＳタンパク質などのミスフォールドタンパク質の病理学的凝集は、ＡＬＳの特徴と見なされ得る。いくつかの近年の研究は、これらの細胞内タンパク質が小胞媒介エキソサイトーシスを介して放出され、次いで隣接する細胞によって貪食され、これが隣接する運動ニューロンへの自己永続的な伝達を可能にすることを示した。さらに、家族性ＡＬＳでは、オートファジー経路および多小胞生合成に関与する遺伝子（ＡＬＳＩＮ、ＶＡＰＢ、ＣＨＭＰ２Ｂ、およびＶＣＰなど）の変異が確認されている。総合すると、これらのデータは、散発性および家族性ＡＬＳ患者におけるエンドソームおよびリソソーム経路の破壊を強く示唆し、－これらの経路は双方とも、エクソソームの発生に関与している。

【0005】

診断には時間を要し、多くの場合、患者は数ヶ月の期間にわたって複数の専門家に診てもらう必要があり、症状の発症から診断の確認までの平均時間は１３～１８ヶ月である。したがって、問題／必要性は、ＡＬＳをより迅速に診断することである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の第１の態様によれば、対象における神経学的障害を診断または予測する方法が提供され、この方法は、以下のステップ：
（ａ）対象からの生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーの定量的または定性的レベルを決定することと；
（ｂ）生物学的サンプル中のバイオマーカーまたは各バイオマーカーの定量的または定性的レベルに基づいて、対象における神経学的障害を診断または予測すること、を含み、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、ＰＤＩＡ３；ＣＣＤＣ８０；ＨＳＰＡ８；ＳＥＲＰＩＮＥ２；ＰＬＥＣ；ＨＳＰＡ５；ＮＣＬ；ＴＰＭ１；ＴＮＣ；ＩＧＦＢＰ３；ＣＯＬ５Ａ１；ＣＬＥＣ１１Ａ；ＭＡＰ１Ｂ；ＮＡＣＡ；ＰＳＭＡ２；ＲＰＬ５；ＭＹＬ６；ＣＴＳＢ；ＨＳＰＤ１；ＰＴＲＦ；ＮＵＣＢ１；ＰＤＩＡ４；Ｐ４ＨＢ；ＡＣＴＮ４；ＥＥＦ１Ｄ；ＴＰＩ１；ＳＳＢＰ１；ＰＳＭＢ８；ＰＳＡＰ；ＰＳＭＢ７；ＣＡＰＺＡ１；ＰＲＤＸ１；ＰＯＤＮ；ＭＭＰ１；ＮＵＣＢ２；ＨＭＧＢ１；ＡＨＮＡＫ；ＦＮＤＣ１；ＤＥＮＲ；ＰＥＮＫ；Ｓ１００Ａ１１；ＲＰＬ２９；ＲＰＬ２７；ＲＰＬ８；ＳＲＳＦ２；ＳＦ３Ｂ４；ＳＢＳＮ；ＬＹＡＲ；ＮＵＤＣ；ＣＲＬＦ１；ＴＧＦＢ１；ＣＡＴ；ＣＴＳＤ；ＤＬＤ；ＥＰＢ４１Ｌ２；ＰＳＭＢ９；ＲＰＳ１４；ＲＰＬ７Ａ；ＣＯＬＥＣ１２；ＳＭＡＲＣＣ２；ＴＡＧＬＮ２；ＣＣＴ４；ＡＳＰＨ；ＧＰＳ１；ＣＤＫ１３；ＳＨ３ＧＬ２；ＨＢＡ１；ＡＰＥＸ１；ＰＳＭＢ５；ＴＸＮ；ＡＸＬ；ＲＰＳ８；ＳＥＴ；ＲＰＳ１８；ＣＦＬ１；ＤＭＫＮ；ＲＰＬ２２；ＲＰＬ６；ＦＫＢＰ１０；ＰＡＦＡＨ１Ｂ１；Ｓ１００Ａ１３；ＰＳＭＡ６；ＳＥＲＰＩＮＥ１；ＣＡＰＲＩＮ１；ＳＥＰＴ７；ＶＴＮ；ＥＮＰＰ２；ＮＥＯ１；ＤＫＣ１；ＣＨＩ３Ｌ１；ＳＫＯＲ１；ＳＳＲＰ１；ＣＯＬ４Ａ２；ＮＭＥ１；ＣＦＢ；ＥＩＦ２Ｓ３；ＤＰＹＳＬ２；ＮＵＭＡ１；ＫＴＮ１；ＣＨＩＤ１；ＥＦＥＭＰ１；ＹＷＨＡＺ；ＬＤＨＢ；ＳＤＣＢＰ；ＴＬＮ１；ＤＥＳ；ＡＰＰ；およびＤＡＧ１から選択される。

【0007】

好ましくは、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、ＰＤＩＡ３；ＣＣＤＣ８０；ＨＳＰＡ８；ＳＥＲＰＩＮＥ２；ＰＬＥＣ；ＨＳＰＡ５；ＮＣＬ；ＴＰＭ１；ＴＮＣ；ＩＧＦＢＰ３；ＣＯＬ５Ａ１；ＣＬＥＣ１１Ａ；ＭＡＰ１Ｂ；ＮＡＣＡ；ＰＳＭＡ２；ＲＰＬ５；ＭＹＬ６；ＣＴＳＢ；ＨＳＰＤ１；ＰＴＲＦ；ＮＵＣＢ１；ＰＤＩＡ４；Ｐ４ＨＢ；ＡＣＴＮ４；およびＣＡＰＲＩＮ１から選択される。

【0008】

さらに好ましくは、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、ＰＤＩＡ３；ＣＣＤＣ８０；ＨＳＰＡ８；ＳＥＲＰＩＮＥ２；ＰＬＥＣ；ＨＳＰＡ５；ＮＣＬ；ＴＰＭ１；ＴＮＣ；ＩＧＦＢＰ３；ＣＯＬ５Ａ１；ＣＬＥＣ１１Ａ；ＭＡＰ１Ｂ；ＮＡＣＡ；ＰＳＭＡ２；ＲＰＬ５；ＭＹＬ６；ＣＴＳＢ；ＨＳＰＤ１；ＰＴＲＦ；ＮＵＣＢ１；ＰＤＩＡ４；Ｐ４ＨＢ；ＡＣＴＮ４；ＣＡＰＲＩＮ１；ＤＥＳ；ＡＰＰ；およびＤＡＧ１から選択される。

【0009】

さらに好ましくは、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、ＰＤＩＡ３；ＣＣＤＣ８０；ＨＳＰＡ８；ＳＥＲＰＩＮＥ２；ＰＬＥＣ；ＤＥＳ；ＡＰＰ；およびＤＡＧ１から選択される。

【0010】

任意により、決定するステップ（ａ）は、対象からの生物学的サンプル中の２つ以上のバイオマーカーの定量的または定性的レベルを決定することを含む。

【0011】

さらに任意により、決定するステップ（ａ）は、対象からの生物学的サンプル中の３、４、５、８、１０、２０、２５、２８、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれより多いバイオマーカーの定量的または定性的レベルを決定することを含む。

【0012】

任意により、決定するステップ（ａ）は、対象からの生物学的サンプル中のバイオマーカーのすべての定量的または定性的レベルを決定することを含む。

【0013】

任意により、または追加として、決定するステップ（ａ）は、対象からの生物学的サンプル中のバイオマーカーの各々の定量的または定性的レベルを決定することを含む。

【0014】

任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、遺伝子である。さらに任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、核酸である。さらに任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、デオキシリボ核酸である。

【0015】

任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、遺伝子の翻訳産物である。

【0016】

任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、ＰＤＩＡ３；ＣＣＤＣ８０；ＨＳＰＡ８；ＳＥＲＰＩＮＥ２；ＰＬＥＣ；ＨＳＰＡ５；ＮＣＬ；ＴＰＭ１；ＴＮＣ；ＩＧＦＢＰ３；ＣＯＬ５Ａ１；ＣＬＥＣ１１Ａ；ＭＡＰ１Ｂ；ＮＡＣＡ；ＰＳＭＡ２；ＲＰＬ５；ＭＹＬ６；ＣＴＳＢ；ＨＳＰＤ１；ＰＴＲＦ；ＮＵＣＢ１；ＰＤＩＡ４；Ｐ４ＨＢ；ＡＣＴＮ４；ＥＥＦ１Ｄ；ＴＰＩ１；ＳＳＢＰ１；ＰＳＭＢ８；ＰＳＡＰ；ＰＳＭＢ７；ＣＡＰＺＡ１；ＰＲＤＸ１；ＰＯＤＮ；ＭＭＰ１；ＮＵＣＢ２；ＨＭＧＢ１；ＡＨＮＡＫ；ＦＮＤＣ１；ＤＥＮＲ；ＰＥＮＫ；Ｓ１００Ａ１１；ＲＰＬ２９；ＲＰＬ２７；ＲＰＬ８；ＳＲＳＦ２；ＳＦ３Ｂ４；ＳＢＳＮ；ＬＹＡＲ；ＮＵＤＣ；ＣＲＬＦ１；ＴＧＦＢ１；ＣＡＴ；ＣＴＳＤ；ＤＬＤ；ＥＰＢ４１Ｌ２；ＰＳＭＢ９；ＲＰＳ１４；ＲＰＬ７Ａ；ＣＯＬＥＣ１２；ＳＭＡＲＣＣ２；ＴＡＧＬＮ２；ＣＣＴ４；ＡＳＰＨ；ＧＰＳ１；ＣＤＫ１３；ＳＨ３ＧＬ２；ＨＢＡ１；ＡＰＥＸ１；ＰＳＭＢ５；ＴＸＮ；ＡＸＬ；ＲＰＳ８；ＳＥＴ；ＲＰＳ１８；ＣＦＬ１；ＤＭＫＮ；ＲＰＬ２２；ＲＰＬ６；ＦＫＢＰ１０；ＰＡＦＡＨ１Ｂ１；Ｓ１００Ａ１３；ＰＳＭＡ６；ＳＥＲＰＩＮＥ１；ＣＡＰＲＩＮ１；ＳＥＰＴ７；ＶＴＮ；ＥＮＰＰ２；ＮＥＯ１；ＤＫＣ１；ＣＨＩ３Ｌ１；ＳＫＯＲ１；ＳＳＲＰ１；ＣＯＬ４Ａ２；ＮＭＥ１；ＣＦＢ；ＥＩＦ２Ｓ３；ＤＰＹＳＬ２；ＮＵＭＡ１；ＫＴＮ１；ＣＨＩＤ１；ＥＦＥＭＰ１；ＹＷＨＡＺ；ＬＤＨＢ；ＳＤＣＢＰ；ＴＬＮ１；ＤＥＳ；ＡＰＰ；およびＤＡＧ１から選択される遺伝子の翻訳産物である。

【0017】

【0018】

【0019】

さらに好ましくは、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、ＰＤＩＡ３；ＣＣＤＣ８０；ＨＳＰＡ８；ＳＥＲＰＩＮＥ２；ＰＬＥＣ；ＤＥＳ；ＡＰＰ；およびＤＡＧ１から選択される遺伝子の翻訳産物である。

【0020】

任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、リボ核酸である。

【0021】

任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、ＭＩＭＡＴ００００２４４；ＥＮＳＧ０００００２３９１２６；ＭＩＭＡＴ００１６８６５；ＭＩＭＡＴ０００２８１３；ＭＩＭＡＴ０００４６９７；ＭＩＭＡＴ００００２４５；ＭＩＭＡＴ００００７３７；ＭＩＭＡＴ０００００８８；ＭＩＭＡＴ００００４１４；ＭＩＭＡＴ０００４９５５；ＭＩＭＡＴ０００００７６；ＭＩＭＡＴ０００００６７；ＭＩＭＡＴ００１８０８４；およびＭＩＭＡＴ０００４８１３から選択されるｍｉＲＢａｓｅアクセッション番号を有するリボ核酸である。

【0022】

任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、配列番号１０９～１２２のいずれか１つ以上から選択される核酸配列を有するリボ核酸である。

【0023】

任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、タンパク質である。さらに任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、ペプチドである。さらに任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、ポリペプチドである。

【0024】

【0025】

【0026】

【0027】

さらに好ましくは、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、ＰＤＩＡ３；ＣＣＤＣ８０；ＨＳＰＡ８；ＳＥＲＰＩＮＥ２；ＰＬＥＣ；ＤＥＳ；ＡＰＰ；およびＤＡＧ１から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質である。

【0028】

任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、Ｐ３０１０１；Ｑ７６Ｍ９６；Ｐ１１１４２；Ｐ０７０９３；Ｑ１５１４９；Ｐ１１０２１；Ｐ１９３３８；Ｐ０９４９３；Ｐ２４８２１；Ｐ１７９３６；Ｐ２０９０８；Ｑ９Ｙ２４０；Ｐ４６８２１；Ｑ１３７６５；Ｐ２５７８７；Ｐ４６７７７；Ｐ６０６６０；Ｐ０７８５８；Ｐ１０８０９；Ｑ６ＮＺＩ２；Ｑ０２８１８；Ｐ１３６６７；Ｐ０７２３７；Ｏ４３７０７；Ｐ２９６９２；Ｐ６０１７４；Ｑ０４８３７；Ｐ２８０６２；Ｐ０７６０２；Ｑ９９４３６；Ｐ５２９０７；Ｑ０６８３０；Ｑ７Ｚ５Ｌ７；Ｐ０３９５６；Ｐ８０３０３；Ｐ０９４２９；Ｑ０９６６６；Ｑ４ＺＨＧ４；Ｏ４３５８３；Ｐ０１２１０；Ｐ３１９４９；Ｐ４７９１４；Ｐ６１３５３；Ｐ６２９１７；Ｑ０１１３０；Ｑ１５４２７；Ｑ６ＵＷＰ８；Ｑ９ＮＸ５８；Ｑ９Ｙ２６６；Ｏ７５４６２；Ｐ０１１３７；Ｐ０４０４０；Ｐ０７３３９；Ｐ０９６２２；Ｏ４３４９１；Ｐ２８０６５；Ｐ６２２６３；Ｐ６２４２４；Ｑ５ＫＵ２６；Ｑ８ＴＡＱ２；Ｐ３７８０２；Ｐ５０９９１；Ｑ１２７９７；Ｑ１３０９８；Ｑ１４００４；Ｑ９９９６２；Ｐ６９９０５；Ｐ２７６９５；Ｐ２８０７４；Ｐ１０５９９；Ｐ３０５３０；Ｐ６２２４１；Ｑ０１１０５；Ｐ６２２６９；Ｐ２３５２８；Ｑ６Ｅ０Ｕ４；Ｐ３５２６８；Ｑ０２８７８；Ｑ９６ＡＹ３；Ｐ４３０３４；Ｑ９９５８４；Ｐ６０９００；Ｐ０５１２１；Ｑ１４４４４；Ｑ１６１８１；Ｐ０４００４；Ｑ１３８２２；Ｑ９２８５９；Ｏ６０８３２；Ｐ３６２２２；Ｐ８４５５０；Ｑ０８９４５；Ｐ０８５７２；Ｐ１５５３１；Ｐ００７５１；Ｐ４１０９１；Ｑ１６５５５；Ｑ１４９８０；Ｑ８６ＵＰ２；Ｑ９ＢＷＳ９；Ｑ１２８０５；Ｐ６３１０４；Ｐ０７１９５；Ｏ００５６０；Ｑ９Ｙ４９０；Ｐ１７６６１；Ｐ０５０６７；およびＱ１４１１８から選択される、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号を有するタンパク質である。

【0029】

好ましくは、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、Ｐ３０１０１；Ｑ７６Ｍ９６；Ｐ１１１４２；Ｐ０７０９３；Ｑ１５１４９；Ｐ１１０２１；Ｐ１９３３８；Ｐ０９４９３；Ｐ２４８２１；Ｐ１７９３６；Ｐ２０９０８；Ｑ９Ｙ２４０；Ｐ４６８２１；Ｑ１３７６５；Ｐ２５７８７；Ｐ４６７７７；Ｐ６０６６０；Ｐ０７８５８；Ｐ１０８０９；Ｑ６ＮＺＩ２；Ｑ０２８１８；Ｐ１３６６７；Ｐ０７２３７；Ｏ４３７０７；およびＱ１４４４４から選択される、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号を有するタンパク質である。

【0030】

さらに好ましくは、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、Ｐ３０１０１；Ｑ７６Ｍ９６；Ｐ１１１４２；Ｐ０７０９３；Ｑ１５１４９；Ｐ１１０２１；Ｐ１９３３８；Ｐ０９４９３；Ｐ２４８２１；Ｐ１７９３６；Ｐ２０９０８；Ｑ９Ｙ２４０；Ｐ４６８２１；Ｑ１３７６５；Ｐ２５７８７；Ｐ４６７７７；Ｐ６０６６０；Ｐ０７８５８；Ｐ１０８０９；Ｑ６ＮＺＩ２；Ｑ０２８１８；Ｐ１３６６７；Ｐ０７２３７；Ｏ４３７０７；Ｑ１４４４４；Ｐ１７６６１；Ｐ０５０６７；およびＱ１４１１８から選択される、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号を有するタンパク質である。

【0031】

さらに好ましくは、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、Ｐ３０１０１；Ｑ７６Ｍ９６；Ｐ１１１４２；Ｐ０７０９３；Ｑ１５１４９；Ｐ１７６６１；Ｐ０５０６７；およびＱ１４１１８から選択される、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号を有するタンパク質である。

【0032】

任意により、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、配列番号１～１０８のいずれか１つ以上から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。

【0033】

任意により、神経学的障害は神経変性障害である。

【0034】

任意により、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルーゲーリック病；運動ニューロン疾患；ＭＮＤ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、偽球麻痺、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、および脊髄性筋萎縮症から選択される。

【0035】

任意により、診断または予測するステップ（ｂ）は、対象からの生物学的サンプル中のバイオマーカーまたは各バイオマーカーの定量的または定性的レベルを、正常サンプル中のバイオマーカーまたは各個別のバイオマーカーの定量的または定性的レベルと比較することを含む。

【0036】

任意により、正常サンプルは、神経学的障害、任意により神経変性障害、さらに任意により筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルーゲーリック病；運動ニューロン疾患；ＭＮＤ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、偽球麻痺、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、および脊髄性筋萎縮症から選択される神経変性障害を患っていない対象からの生物学的サンプルである。

【0037】

任意により、正常サンプル中のバイオマーカーまたは各個別のバイオマーカーの定量的または定性的レベルよりも大きい対象からの生物学的サンプル中のバイオマーカーまたは各バイオマーカーの定量的または定性的レベルは、神経学的障害、任意により神経変性障害、さらに任意により筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルーゲーリック病；運動ニューロン疾患；ＭＮＤ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、偽球麻痺、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、および脊髄性筋萎縮症から選択される神経変性障害の定量的または定性的なレベルを示す。

【0038】

【0039】

任意により、決定するステップ（ａ）は、対象からの生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーの１つ以上のサブセットの定量的または定性的レベルを決定することを含む。

【0040】

任意により、決定するステップ（ａ）は、対象からの生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーの２つ以上のサブセットの定量的または定性的レベルを決定することを含む。

【0041】

任意により、決定するステップ（ａ）は、生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーの３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４のサブセットの定量的または定性的レベルを決定することを含む。

【0042】

任意により、決定するステップ（ａ）は、対象からの生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーの１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、または１４番目のサブセットの１つ以上の定量的または定性的レベルを決定することを含む。

【0043】

任意により、１番目のサブセットは、ＰＤＩＡ３；およびＣＣＤＣ８０から選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0044】

任意により、２番目のサブセットは、ＨＳＰＡ８を含む。

【0045】

任意により、３番目のサブセットは、ＳＥＲＰＩＮＥ２；およびＰＬＥＣから選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0046】

任意により、４番目のサブセットは、ＨＳＰＡ５；およびＮＣＬから選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0047】

任意により、５番目のサブセットは、ＴＰＭ１；およびＴＮＣから選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0048】

任意により、６番目のサブセットは、ＩＧＦＢＰ３を含む。

【0049】

任意により、７番目のサブセットは、ＣＯＬ５Ａ１；ＣＬＥＣ１１Ａ；ＭＡＰ１Ｂ；ＮＡＣＡ；およびＰＳＭＡ２から選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0050】

任意により、８番目のサブセットは、ＲＰＬ５；ＭＹＬ６；ＣＴＳＢ；ＨＳＰＤ１；ＰＴＲＦ；ＮＵＣＢ１；ＰＤＩＡ４；Ｐ４ＨＢ；およびＡＣＴＮ４から選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0051】

任意により、９番目のサブセットは、ＥＥＦ１Ｄ；ＴＰ１１；ＳＳＢＰ１；ＰＳＭＢ８；ＰＳＡＰ；ＰＳＭＢ７；ＣＡＰＺＡ１；ＰＲＤＸ１；ＰＯＤＮ；ＭＭＰ１；ＮＵＣＢ２；ＨＭＧＢ１；ＡＨＮＡＫ；およびＦＮＤＣ１から選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0052】

任意により、１０番目のサブセットは、ＤＥＮＲ；ＰＥＮＫ；Ｓ１００Ａ１１；ＲＰＬ２９；ＲＰＬ２７；ＲＰＬ８；ＳＲＳＦ２；ＳＦ３Ｂ４；ＳＢＳＮ；ＬＹＡＲ；ＮＵＤＣ；ＣＲＬＦ１；ＴＧＦＢ１；ＣＡＴ；ＣＴＳＤ；ＤＬＤ；ＥＰＢ４１Ｌ２；ＰＳＭＢ９；ＲＰＳ１４；ＲＰＬ７Ａ；ＣＯＬＥＣ１２；ＳＭＡＲＣＣ２；ＴＡＧＬＮ２；ＣＣＴ４；ＡＳＰＨ；ＧＰＳ１；ＣＤＫ１３；ＳＨ３ＧＬ２；ＨＢＡ１；ＡＰＥＸ１；ＰＳＭＢ５；ＴＸＮ；ＡＸＬ；ＲＰＳ８；ＳＥＴ；ＲＰＳ１８；ＣＦＬ１；ＤＭＫＮ；ＲＰＬ２２；ＲＰＬ６；ＦＫＢＰ１０；ＰＡＦＡＨ１Ｂ１；Ｓ１００Ａ１３；ＰＳＭＡ６；ＳＥＲＰＩＮＥ１；ＣＡＰＲＩＮ１；ＳＥＰＴ７；ＶＴＮ；ＥＮＰＰ２；ＮＥＯ１；ＤＫＣ１；ＣＨＩ３Ｌ１；ＳＫＯＲ１；ＳＳＲＰ１；ＣＯＬ４Ａ２；ＮＭＥ１；ＣＦＢ；ＥＩＦ２Ｓ３；ＤＰＹＳＬ２；ＮＵＭＡ１；ＫＴＮ１；ＣＨＩＤ１；ＥＦＥＭＰ１；ＹＷＨＡＺ；ＬＤＨＢ；ＳＤＣＢＰ；およびＴＬＮ１から選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0053】

任意により、１１番目のサブセットは、ＤＥＳ；ＡＰＰ；およびＤＡＧ１から選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0054】

任意により、１２番目のサブセットは、ＰＤＩＡ３；ＣＣＤＣ８０；ＨＳＰＡ８；ＳＥＲＰＩＮＥ２；ＰＬＥＣ；ＨＳＰＡ５；ＮＣＬ；ＴＰＭ１；ＴＮＣ；ＩＧＦＢＰ３；ＣＯＬ５Ａ１；ＣＬＥＣ１１Ａ；ＭＡＰ１Ｂ；ＮＡＣＡ；ＰＳＭＡ２；ＲＰＬ５；ＭＹＬ６；ＣＴＳＢ；ＨＳＰＤ１；ＰＴＲＦ；ＮＵＣＢ１；ＰＤＩＡ４；Ｐ４ＨＢ；ＡＣＴＮ４；およびＣＡＰＲＩＮ１から選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0055】

任意により、１３番目のサブセットは、ＰＤＩＡ３；ＣＣＤＣ８０；ＨＳＰＡ８；ＳＥＲＰＩＮＥ２；ＰＬＥＣ；ＨＳＰＡ５；ＮＣＬ；ＴＰＭ１；ＴＮＣ；ＩＧＦＢＰ３；ＣＯＬ５Ａ１；ＣＬＥＣ１１Ａ；ＭＡＰ１Ｂ；ＮＡＣＡ；ＰＳＭＡ２；ＲＰＬ５；ＭＹＬ６；ＣＴＳＢ；ＨＳＰＤ１；ＰＴＲＦ；ＮＵＣＢ１；ＰＤＩＡ４；Ｐ４ＨＢ；ＡＣＴＮ４；ＣＡＰＲＩＮ１；ＤＥＳ；ＡＰＰ；およびＤＡＧ１から選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0056】

任意により、１４番目のサブセットは、ＰＤＩＡ３；ＣＣＤＣ８０；ＨＳＰＡ８；ＳＥＲＰＩＮＥ２；ＰＬＥＣ；ＤＥＳ；ＡＰＰ；およびＤＡＧ１から選択される１つ以上のバイオマーカーを含む。

【0057】

任意により、決定するステップ（ａ）は、１つ以上の１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、または１４番目のサブセットの１つ以上におけるバイオマーカーのすべての定量的または定性的レベルを決定することを含む。

【0058】

任意により、決定するステップ（ａ）は、１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、または１４番目のサブセットの１つ以上におけるバイオマーカーの各々の定量的または定性的レベルを決定することを含む。

【0059】

任意により、診断または予測するステップ（ｂ）は、対象からの生物学的サンプル中のサブセットまたは各サブセット中のバイオマーカーまたは各バイオマーカーの定量的または定性的レベルを、正常サンプル中のバイオマーカーまたは各個別のバイオマーカーの定量的または定性的レベルと比較することを含む。

【0060】

【0061】

任意により、正常サンプル中のバイオマーカーまたは各個別のバイオマーカーの定量的または定性的レベルよりも大きい対象からの生物学的サンプル中のサブセットまたは各サブセット中のバイオマーカーまたは各バイオマーカーの定量的または定性的レベルは、神経学的障害、任意により神経変性障害、さらに任意により筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルーゲーリック病；運動ニューロン疾患；ＭＮＤ）、遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、偽球麻痺、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、および脊髄性筋萎縮症から選択される神経変性障害の定量的または定性的レベルを示す。

【0062】

【0063】

任意によりまたは追加的に、決定するステップ（ａ）は、対象からの生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーの定量的または定性的レベルを決定する追加のステップをさらに含み、バイオマーカーまたは各バイオマーカーは、ＭＩＭＡＴ００００２４４；ＥＮＳＧ０００００２３９１２６；ＭＩＭＡＴ００１６８６５；ＭＩＭＡＴ０００２８１３；ＭＩＭＡＴ０００４６９７；ＭＩＭＡＴ００００２４５；ＭＩＭＡＴ００００７３７；ＭＩＭＡＴ０００００８８；ＭＩＭＡＴ００００４１４；ＭＩＭＡＴ０００４９５５；ＭＩＭＡＴ０００００７６；ＭＩＭＡＴ０００００６７；ＭＩＭＡＴ００１８０８４；およびＭＩＭＡＴ０００４８１３から選択されるｍｉＲＢａｓｅアクセッション番号を有するリボ核酸である。

【0064】

任意により、生物学的サンプルは、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液から選択される。

【0065】

さらに任意により、生物学的サンプルは、全血、血清、および血漿から選択される。

【0066】

さらに任意により、生物学的サンプルは、全血である。

【0067】

ＰＤＩＡ３は、Ｅｒｐ５７と同義である。
次に、本発明の実施形態を、以下の非限定的な例および添付の図面を参照して説明する。

【図面の簡単な説明】

【0068】

【図1】筋幹細胞におけるＡＬＳシグネチャーの概略図である。

【図2】（Ａ）分化した筋幹細胞のエクソソームマーカーの免疫染色を示す。（Ｂ）筋肉細胞によるエクソソームの分泌を示す。（Ｃ）ＡＬＳ筋細胞の多小胞体は、対照よりも多くのエクソソームを含むことを示す。

【図3】ＡＬＳまたは対照エクソソームにより処置された健康な筋管の代表的な画像を示す。ここでＡＬＳエクソソームは、細胞ストレスを誘発する。

【図4】非コーディングＲＮＡマイクロアレイの発現値を示す箱ひげ図である（生：左パネル；バックグラウンド補正：中央パネル；バックグラウンド補正および正規化：右パネル）。

【図5】非コーディングＲＮＡマイクロアレイのＲＬＥ値を示す箱ひげ図である（０パス品質対照に近い平均値）。

【図6】非コーディングＲＮＡマイクロアレイのＮＵＳＥ値を示す箱ひげ図である（＜１．０５パス品質対照の平均値）。

【図7】抗ＤＡＧ抗体を使用した、循環血清エクソソームにおけるＤＡＧ１発現レベルを示す。値は平均±ＳＤである。８名のＡＬＳ患者（診断後１ヶ月）、１１名の健康な対象および９名のパーキンソン患者からの血清。ＡＮＯＶＡ１因子およびその後にＴｕｋｅｙ事後検定を実行した。＊＊、健康な値と有意に異なる、Ｐ＜０．０１；

【図8】循環血清エクソソームにおけるＨＳＰＡ８発現レベルを示す。値は平均±ＳＤである。５名のＡＬＳ患者（診断後１ヶ月）、９名の健康な対象および７名のパーキンソン患者からの血清。ＡＮＯＶＡ１因子およびその後にＴｕｋｅｙ事後検定を実行した。＊、＊＊、ＡＬＳ値と有意に異なる、それぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１、

【図9】総血清エクソソーム（ＣＤ６３）の量に対して正規化し、病理の進行速度に対しプロットした、ＡＬＳ患者の血清から単離したエクソソーム中の各バイオマーカーのレベルを示す（デルタＡＬＳＦＲＳ－Ｒ）。実施例材料＆方法登録者および倫理的承認

【0069】

開放生検を、ＭｏｔｏｒＮｅｕｒｏｎＤｉｓｅａｓｅｓｃｅｎｔｅｒ（ＰｉｔｉｅＳａｌｐｅｔｒｉｅｒｅ，Ｐａｒｉｓ）に通院した１８名のＡＬＳ患者の三角筋で実施した。年齢および性別が一致する健康な対象からの２１の三角筋生検を、欧州の推奨事項およびフランスの法律に従って、ＢＴＲ（ＢａｎｋｏｆＴｉｓｓｕｅｓｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵｎｅｔｗｏｒｋＥｕｒｏＢｉｏＢａｎｋのパートナー）から得た。プロトコル（ＮＣＴ０１９８４９５７）は、地域の倫理委員会によって承認され、すべての対象は、施設のガイドラインに従ってインフォームドコンセントを完了した。
筋幹細胞の抽出および培養

【0070】

筋肉生検体を機械的に分離し、前述のとおり増殖培地にプレーティングした（Ｍａｍｃｈａｏｕｉら、Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ，２０１１，ＰＭＩＤ：２２０４０６０８）。ＣＤ５６磁気ビーズソーティングシステム（ＭＡＣＳ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して、製造業者の指示に従い筋原性細胞集団を選別した。細胞培養物の筋原性を、抗デスミン抗体を使用する免疫標識により細胞を選別する前後に確認し、細胞をダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３日間分化させた。細胞集団の最低８０％が、デスミン陽性であった。
培養培地からのエクソソーム抽出

【0071】

簡潔に説明すると、１，０００万個の筋幹細胞（ＡＬＳおよび健康な多少、ｎ＝３／群）をＤＭＥＭ中で３日間分化させた。３日後、馴化培地を回収し、３００ｘｇで５分間、室温（ＲＴ）で遠心分離し、４０００ｇで２０分間、４℃で遠心分離して、あらゆる死細胞および細胞破片を除去した。上清を０．２２μｍフィルターで濾過して微粒子を除去した。サンプルを、タンパク質およびｍｉＲＮＡの抽出に使用し、－８０℃で保存した。
エクソソームからのタンパク質抽出

【0072】

ある容量の細胞培養培地を、細胞培養培地（ｌｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））からの０．５容量のＴｏｔａｌＥｘｏｓｏｍｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔと混合し、４℃で一晩インキュベートした。サンプルを次に、１０，０００ｘｇで１時間４℃で遠心分離した。エクソソームペレットを２５μｌの８Ｍ尿素、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８．５に再懸濁し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で、４℃で１時間還元した。タンパク質濃度を次に、ＰｉｅｒｃｅＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））を使用して定量した。エクソソームタンパク質を、－８０℃で維持した。
質量分析により決定されたプロテオームプロファイル

【0073】

約２０μｇのエクソソームタンパク質を、製造業者の指示に従い７０℃および１４００ｒｐｍで２時間ＳｍａｒｔＤｉｇｅｓｔカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してトリプシン消化した。ペプチドを次に、製造業者の指示に従い高ｐＨ逆相スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して８つの分画に分画した。分画したペプチドを真空乾燥し、再懸濁し、以下のパラメーターでＱＥｘａｃｔｉｖｅＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ）でのデータ依存型質量分析により分析した：正極性、ｍ／ｚ４００～２０００ＭＳ分解能７０，０００、ＡＧＣ３ｅ６、１００ｍｓＩＴ、ＭＳ／ＭＳ分解能１７，５００、ＡＧＣ５ｅ５、５０ｍｓＩＴ、分離幅３ｍ／ｚ、およびＮＣＥ３０、サイクル数１５。
データベースの検索および定量化

【0074】

得られた質量スペクトルファイルを、セミトリプシンペプチドのＵｎｉｐｒｏｔヒトデータベースに対しＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してタンパク質同定のために検索し、１％未満の誤検出率に基づいてフィルタリングした。
プロテオームプロファイル分析

【0075】

タンパク質を、３つのＡＬＳ複製の観察された存在量の範囲が３つの健康な対照複製の範囲と重複しなかった場合、候補として選択した。これらの候補を、３つのＡＬＳ複製の中央値と健複製の中央値の差に基づいてランク付けした。
エクソソームからのｍｉＲＮＡ抽出

【0076】

ある容量の細胞培養培地を、細胞培養培地（ｌｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））からの０．５容量のＴｏｔａｌＥｘｏｓｏｍｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔと混合し、４℃で一晩インキュベートした。次に、サンプルを１０，０００ｘｇで１時間４℃で遠心分離した。エクソソームペレットを１ｍｌのトリゾールで再懸濁した。０．２ｍＬのクロロホルムを添加後、サンプルを室温で３分間インキュベートし、次に４℃で１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。水性上相を次に、１／３容量の１００％エタノールと混合し、完全に混合した。サンプルを次に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））の全ＲＮＡおよびタンパク質分離キットの収集チューブへのフィルターカートリッジに入れた。ｍｉＲＮＡ抽出を、製造業者の指示に従い実行した。ＲＮＡの品質を、ＥｕｋａｒｙｏｔｅＴｏｔａｌＲＮＡＮａｎｏ２．６（Ａｇｉｌｅｎｔ）および２１００バイオアナライザーを使用して決定した。ＲＮＡ量を、それぞれ製造業者の指示に従い、ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して決定した。
ｍｉＲＮＡプロファイルおよび分析

【0077】

全ＲＮＡ（１５０ｎｇ）をポリ（Ａ）テール化し、ＦｌａｓｈＴａｇＢｉｏｔｉｎＨＳＲＲＮＡラベリングキットを使用してビオチン標識し、製造業者の指示（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ）に従って、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐｍｉＲＮＡ４．０アレイに１６時間（４８℃）ハイブリダイズさせた。次に、ハイブリダイゼーションカクテルを除去し、アレイを洗浄し、ｍｉＲＮＡ４．０アレイ用のフルイディクススクリプトを使用してＦｌｕｉｄｉｃｓＳｔａｔｉｏｎ４５０で染色した。最後に、アレイをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧＣＳ３０００７Ｇスキャナーでスキャンし、初期品質管理データを、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｏｎｓｏｌｅソフトウェア（両方ともＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を使用して評価した。
ｍｉＲＮｏｍｅプロファイル分析

【0078】

生データのさらなる品質管理を、Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージｏｌｉｇｏおよびｐｄ．ｍｉｒｎａ．４．０を使用して実行した。これらのパッケージを使用して、発現値、相対対数発現量（ＲＬＥ）値、および正規化しスケール化されていない標準誤差（ＮＵＳＥ）の各サンプルの分布を評価した。これらはすべて、高品質と一致していた。発現マトリックスを次に、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｏｎｓｏｌｅｖ１．４．１．４６を使用して、分位数の正規化およびバックグラウンドを超える検出により正規化した。差次的に発現するｍｉＲＮＡ（ＡＬＳ対健康）を次に、絶対倍率変化が２を超え、一元配置の対応のないＡＮＯＶＡｐ値が０．０５未満であると特定した。
患者からの血清サンプル

【0079】

血液サンプルを、シリカバキュテイナーを使用して収集し、８～１０回穏やかに逆さにした。氷上で２時間インキュベートして凝固させた後、サンプルを１，５００ｇで１５分間遠心分離した。１００μｌの血清のアリコートをクライオバイアルに移し、－８０℃で保存した。年齢と性別が一致する８名のＡＬＳ患者、１１名の健康な対象、および９名のパーキンソン患者を対象とした（ＮＣＴ０１３０２６００およびＮＣＴ０２３０５１４７）。
血清からのエクソソーム抽出

【0080】

エクソソームを、６μｌのＴｏｔａｌＥｘｏｓｏｍｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔを添加し、ボルテックスし、氷上で３０分間インキュベートすることにより沈殿させた。次に、サンプルを室温で１０，０００ｇにて１０分間遠心分離した。ペレットを１３．５μｌの尿素４Ｍ／ＲＩＰＡに再懸濁し、氷上で保持した。並行して、６．３μｌのＴｏｔａｌＥｘｏｓｏｍｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔを残りの上清に加え、ボルテックスし、氷上で３０分間インキュベートした。次に、これらの２番目の混合物をＲＴ、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。２番目のエクソソームペレットを１３．５μｌの尿素４Ｍ／ＲＩＰＡに再懸濁した。次に、２つのエクソソームタンパク質抽出物を共に混合し、ドットブロット分析に使用した。エクソソームタンパク質抽出物を、－８０℃で保存した。
ドットブロット用のサンプルの調製

【0081】

５μｌのエクソソームタンパク質抽出物に１ｘＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を添加した。これらの非還元サンプルを、ＣＤ６３分析に使用した。エクソソームタンパク質抽出物の残りの２２μｌに、１ｘ還元試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を補充した１ｘＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を添加した。次に、すべてのサンプルを７０℃で１０分間加熱した。
ドットブロット分析

【0082】

１μｌの還元または非還元サンプルを、メタノールで事前に活性化した０．２μｍＰＶＤＦ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））に添加した。室温で５分間乾燥させた後、メンブレンをメタノールで迅速に再活性化し、ＰｏｎｃｅａｕＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で染色して、添加を制御した。メンブレンを次に、５％ミルクを補充したＴＢＳ－０．０１％ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ－Ｔ）中で４℃にて一晩ブロックした。

【0083】

ＣＤ６３（ＴＳ６３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、ベータジストログリカン（ＭＡＮＤＡＧ２、７Ｄ１１、ＤＳＨＢ）、およびＨＳＰＡ８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））に対する一次抗体を、製造業者の指示に従いＺｅｎｏｎ（商標）ＢｉｏｔｉｎＸＸマウスｌｇＧ１ラベリングキットを使用して、ビオチンと即座に結合させた。簡単に説明すると、１μｇの抗体に最初に５μｌの複合体を加え、次に５μｌのブロッキングバッファーを加えた。抗ＣＤ６３、抗ベータジストログリカン、および抗ＨＳＰＡ８を、ＴＢＳ－Ｔ－５％ミルクでそれぞれ１／１０００、１／１３３、および１／５００に希釈した。

【0084】

ＳｅｒｐｉｎＥ２（ＴＳ６３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、ＥＲＰ５７（ＰＤＩＡ３、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））、デスミン（Ｙ６６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、アミロイド前駆体タンパク質（ａｂｅａｍ）、ＣＣＤＣ８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、およびＰｌｅｃｔｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））に対する一次抗体を、製造業者の指示に従いＺｅｎｏｎ（商標）ＢｉｏｔｉｎＸＸウサギＩｇＧラベリングキットを使用して、即座にビオチンと結合させた。簡単に説明すると、１μｇの抗体に最初に５μｌの複合体を加え、次に５μｌのブロッキングバッファーを加えた。抗ＳｅｒｐｉｎＥ２抗ＥＲＰ５７、抗デスミン、抗アミロイド前駆体タンパク質、抗ＣＣＤＣ８０、および抗Ｐｌｅｃｔｉｎを、ＴＢＳ－Ｔ－５％ミルクで１／１０００に希釈した。

【0085】

メンブレンを、希釈した一次ビオチン結合抗体と共にＲＴで４５分間インキュベートした。
メンブレンを次に、ＴＢＳ－Ｔで５分間３回すすいだ。メンブレンを次に、ＴＢＳ－Ｔ－５％ミルクで１／２５０に希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））と共にＲＴで４５分間インキュベートした。メンブレンを次に、ＴＢＳ－Ｔで５分間３回すすいだ。メンブレンを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）ＷｅｓｔＰｉｃｏＰＬＵＳ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を使用して明らかにした。画像を、ＵＶＰ／ＣｈｅｍｉＤｏｃ－ｌｔ（登録商標）２Ｉｍａｇｅｒを使用して１５分間、１５秒ごとに得た。画像を次に、ＦＩＪＩソフトウェアを使用して分析した。
統計分析

【0086】

値は平均±ＳＤである。ＡＮＯＶＡ１因子およびその後にＴｕｋｅｙ事後検定を実行して、ＡＬＳ、健康な対象者、およびパーキンソン対象の間のバイオマーカーレベルの差を評価した。バイオマーカーレベルとＡＬＳＦＲＳの進行との相関を、ピアソン相関分析を使用して検査した。有意差のカットオフをＰ＜０．０５に設定した。
実施例１－筋幹細胞におけるＡＬＳシグネチャーの同定

【0087】

筋幹細胞を、患者および健康対照（すべて男性、３０～６７歳、一群あたりｎ＝５／６）の筋生検から抽出し、精製し（＞８０％筋形成細胞）、３日間筋管に分化させた。サンプルを、ＧｅｎｅＣｈｉｐＨｕｍａｎＥｘｏｎ１．０ＳＴａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を使用して分析した；（Ａ）は、２番目のコンポーネント（ｙ軸）でＡＬＳ患者の明確な分離を示すＰＣＡプロットを示す。ＡＬＳ：青、ＳＢＭＡ：ピンク、ＳＭＡ－ＩＩＩ／ＩＶ：赤、対照：緑。（Ｂ）は、ＣｅｌｌＷｈｅｒｅツールによる分析による、多くがエキソソームに関連する細胞内局在において観察される、ＡＬＳに最も強く特異的な発現シグネチャーを有する３０の遺伝子を示す。
実施例２－ＡＬＳ筋幹細胞は、対照よりも多くのエクソソームを蓄積し分泌する

【0088】

図２（Ａ）を参照して、分化した筋幹細胞のエクソソームマーカーの免疫染色が示されている。左パネル：エクソソームマーカー（ＴＳＧ１０１、ＣＤ６３）で標識されたＡＬＳおよびＳＭＡ－ＩＩＩ／ＩＶ患者、ならびに健康な対照または除神経された対象の培養筋幹細胞の代表的な画像。右パネル：筋核ごとに正規化されたＣＤ６３蛍光シグナルの定量化。（異なるＡＬＳ、ＳＭＡ－ＩＩＩ／ＩＶ、多発性神経炎および対照者のｎ＝８、４、２、５の細胞培養）。＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【0089】

図２（Ｂ）は、エクソソームがＡＬＳ筋細胞によって過剰分泌されることを示す。左パネル：培養培地からのエクソソームペレットの代表的な画像。エクソソームを、ＡＬＳおよび対照者からの８００，０００個の細胞の培養培地から抽出した。実験を、ＡＬＳ患者および対照者からの筋肉細胞の異なる培養物で８回繰り返した。右パネル：ペレット中のエクソソーム（カップ型ベシクル）の存在を確認する電子顕微鏡検査。エクソソームは、ＡＬＳペレット中により多く存在した。注目すべきことに、これらの小胞に対して行った免疫染色は、それらがＣＤ６３およびＣＤ８２に対して陽性であるため、それらがエクソソームであることを確認した。

【0090】

図２（Ｃ）は、ＡＬＳ筋細胞の多小胞体が対照よりも多くのエクソソームを含むことを示す。左パネル：対照と比較した、ＡＬＳ筋細胞の多小胞体（ＭＶＢ、緑およびオレンジで強調表示）におけるエクソソームの蓄積を示す代表的な電子顕微鏡画像。スケールバー＝１μｍ。右パネル：ＭＶＢ中のエクソソーム様小胞の数の定量化。２つのサンプルのコルモゴロフ－スミルノフ検定は、ＡＬＳ筋細胞のＭＶＢが対照と比較して、より多くのエクソソーム様小胞を含むという視覚的印象を確認した（Ｐ＜０．０５）。
実施例３－ＡＬＳ筋細胞からのエクソソームは、健康な筋管および運動ニューロンに対し毒性である

【0091】

図３（Ａ）を参照して、ＡＬＳエクソソームが筋細胞の萎縮を誘発することが示されている。左パネル：ＡＬＳまたは対照エクソソームにより処置された健康な筋管の代表的な画像。筋管は、ミオシン重鎖（緑色）で染色される。右パネル：筋核ドメインサイズの定量化（核の数で割ったミオシン重鎖染色の面積）。ＡＬＳ－エクソソームにより処置された筋管は、より小さい筋核ドメインを有する（＊Ｐ＜０．０５；ｎ＝６／群）。

【0092】

図３（Ｂ）は、ＡＬＳエクソソームが細胞ストレスを誘発することを示す。ＡＬＳまたは対照エクソソームにより処置された健康な筋管あたりのブレブ数の経時的な定量化（ｎ＝６／群）。ＡＮＯＶＡ２因子交互作用、時間および処置Ｐ＜０．００１。

【0093】

図３（Ｃ）は、ＡＬＳエクソソームが細胞死を誘導することを示す。左パネル：ＡＬＳまたは対照エクソソームにより処置された健康な筋管のＨ２－Ａｘ免疫染色の代表的な免疫染色。中央パネル：核あたりのＨ２－Ａｘシグナルの定量化。右パネル：培養中の運動ニューロン核の喪失の定量化。
実施例４－ＡＬＳのバイオマーカーとしての特定のエクソソーム内容物の同定

【0094】

エクソソームの内容物は、様々な種類の生体分子を含み、そのうちシグナル伝達の役割に関与する可能性のあるものとしては、タンパク質およびそのペプチド、ならびに非コードＲＮＡが挙げられる。筋幹細胞（一次筋芽細胞）を、ＡＬＳ患者と健康な対照の三角筋から得て、分化した筋管を形成させるために培養した。エクソソームを、ｔｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を使用して、３日間の培養後に１，０００万個の筋肉細胞の培養培地から精製した。エクソソームの内容物を特定するために、精製されたエクソソームのプロテオミクスおよび非コードＲＮＡプロファイリングを実行した。
タンパク質バイオマーカー

【0095】

プロテオミクス質量分析データは、健康な対照筋肉エクソソーム（ｎ＝３）と比較してＡＬＳ筋肉エクソソーム（ｎ＝３）で一貫して増加したレベルを有する１０５のタンパク質（表１）のペプチドを同定した。

【0096】

プロテオミクスサンプルはタンパク質濃度に対して正規化されたため、ＡＬＳおよび健康な筋肉のエクソソームの両方において一貫して高レベルのタンパク質は優れたバイオマーカーでもあり得ることも留意され、なぜならこれらは、筋肉のエクソソームが健康な対照よりもＡＬＳ筋管から大量に分泌されるという本発明者らの観察により、体積あたりのＡＬＳ血液中で依然として上昇され得るからである。このようにして、ＡＬＳと健康な筋肉のエクソソームの両方で一貫して高レベルであり、かつ機械的に興味深い他の特徴を有した、さらなる３つの候補を特定した。すなわち、これらはＤＥＳ、ＡＰＰ、およびＤＡＧ１であった。ＡＰＰは、アルツハイマー病におけるアミロイド斑の主要な構成要素である。ＤＥＳは、すべての筋肉組織タイプにおいて高レベルで観察されたが、他の組織にはまったく存在しない。ＤＡＧ１は、ジストログリカン複合体の主要な構成要素であり、複数の筋ジストロフィーに関係している。

【表1】

【表2】

非コーディングＲＮＡバイオマーカー

【0097】

非コードＲＮＡ種のプロファイリングを、健康な対照（ｎ＝５）と比較した、ＡＬＳエクソソーム（ｎ＝５）でのマイクロアレイ（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ｍｉＲＮＡ４．０アレイを使用する）により実行した。品質管理および正規化（図４～６を参照）の後、一元配置の対応のないＡＮＯＶＡは、１４個の非コードＲＮＡがＡＬＳ対健康な対照において有意に調節不全であることを特定した（表３：１２個がＡＬＳにおいて上方制御され、２個がＡＬＳにおいて下方制御される）。これらのうち、１３個はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＢａｓｅＩＤｈｓａ－＊＊＊およびアクセッション番号ＭＩＭＡＴ＊＊＊で示される）であり、１個は核小体低分子ＲＮＡｓｎｏＵ１３（ＥＮＳＧ０００００２３９１２６）である。

【表3】

実施例６－様々な疾患群に対する様々なバイオマーカーの比較

【0098】

血液サンプルを、８名のＡＬＳ患者、１１名の健康な対照、および９名のパーキンソン病患者から収集した。選択した患者の患者特性を表４に示す。エクソソームを、血清から抽出し、ドットブロット分析に使用した。ＡＬＳ病、パーキンソン病（疾患対照）の患者の血清から、または健康な対象から単離したエクソソーム中のＤＡＧ１のレベルを図７に示し、ＡＬＳ疾患の患者、パーキンソン病（疾患対照）の患者、または健康な対象の血清から単離したエクソソーム中のＨＳＰＡ８のレベルを図８に示す。全血清エクソソーム（ＣＤ６３）の量に対して正規化した、ＡＬＳ患者の血清から単離したエクソソーム中の各バイオマーカーのレベルを、病状の進行速度（デルタＡＬＳＦＲＳ－Ｒ）に対してプロットし、図９に示す。

【表4】

【0099】

本発明は、強力なＡＬＳ遺伝子発現シグネチャー、ならびにＡＬＳ患者における筋肉細胞および筋肉－運動ニューロン相互作用における毒性の新しい駆動体をもたらす。散発性ＡＬＳ患者の筋肉生検からの分化した筋肉（筋管）細胞を研究することにより、本発明は以下を示す：
（１）ＡＬＳ患者から単離した筋管の遺伝子発現プロファイルは、健康な対照者のみでなく、ＳＢＭＡおよびＳＭＡ－ＩＩＩ／ＩＶ疾患対照からも完全に分離してクラスター化する（図１Ａを参照）。このＡＬＳ特異的シグネチャーに最も強く寄与する３０の遺伝子としては、エクソソームに分泌されるかまたは局在化するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる（図１Ｂを参照）。（２）細胞内エクソソーム生合成および細胞外エクソソーム分泌の両方は、ＡＬＳ筋管において劇的に増加され（図２ＡおよびＢを参照）、エクソソームに富む多小胞体が、ＡＬＳ患者の筋生検体内電子顕微鏡検査により観察される（図２Ｃ）；（３）エクソソームの生合成および分泌の増加は、筋肉が除神経されたヒト対象（健康、ＳＢＭＡ、ＳＭＡ－ＩＩＩ／ＩＶのいずれでもない）または筋肉が除神経された健康なマウス筋肉の筋管では観察されず（図１、２Ａおよび図示されていない他のデータを参照）、エクソソーム分泌が疾患の単純な下流の結果ではないことを示す。

【図1】