特許 7606185 フェノールレッド吸着剤およびフェノールレッドの除去方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-17

(45)【発行日】2024-12-25

(54)【発明の名称】フェノールレッド吸着剤およびフェノールレッドの除去方法

(51)【国際特許分類】

   B01J 20/26 20060101AFI20241218BHJP

   B01D 15/04 20060101ALI20241218BHJP

   C12N 1/00 20060101ALN20241218BHJP

【ＦＩ】

B01J20/26 G

B01D15/04

C12N1/00 F

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020148291

(22)【出願日】2020-09-03

(65)【公開番号】P2022042731

(43)【公開日】2022-03-15

【審査請求日】2023-04-21

(73)【特許権者】

【識別番号】000226242

【氏名又は名称】日機装株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504157024

【氏名又は名称】国立大学法人東北大学

(74)【代理人】

【識別番号】100105924

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 賢樹

(72)【発明者】

【氏名】吉岡 敏明

(72)【発明者】

【氏名】亀田 知人

(72)【発明者】

【氏名】北川 文彦

(72)【発明者】

【氏名】神保 陽一

(72)【発明者】

【氏名】近藤 昌幸

【審査官】小久保 勝伊

(56)【参考文献】

【文献】特開平０７－２５８２８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０２０／０５００６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開平０６－１９２２１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭６１－０３３２３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０３－１３７５６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５３３６６０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｂ０１Ｊ ２０／２６

Ｂ０１Ｄ １５／０４

Ｃ１２Ｎ １／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゲル型強塩基性陰イオン交換樹脂、ポーラス型強塩基性陰イオン交換樹脂、ハイポーラス型強塩基性陰イオン交換樹脂、ＭＲ型強塩基性陰イオン交換樹脂、ハイポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂およびＭＲ型弱塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の陰イオン交換樹脂を含み、
細胞および微生物の少なくとも一方の培養液に接触させられて前記培養液に含まれるフェノールレッドの吸着に用いられるフェノールレッド吸着剤。

【請求項2】

前記フェノールレッド吸着剤は、前記陰イオン交換樹脂のみからなる請求項１に記載のフェノールレッド吸着剤。

【請求項3】

前記強塩基性陰イオン交換樹脂は、トリメチルアンモニウム基またはジメチルエタノールアンモニウム基を有し、
前記弱塩基性陰イオン交換樹脂は、ジメチルアミノ基またはポリアミノ基を有する請求項１または２に記載のフェノールレッド吸着剤。

【請求項4】

フェノールレッドを含有する、細胞および微生物の少なくとも一方の培養液に、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のフェノールレッド吸着剤を接触させることを含むフェノールレッドの除去方法。

【請求項5】

前記フェノールレッド吸着剤は、前記培養液に対する濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上となる量で用いられる請求項４に記載のフェノールレッドの除去方法。

【請求項6】

前記フェノールレッド吸着剤は、前記培養液に対する濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以上となる量で用いられる請求項４に記載のフェノールレッドの除去方法。

【請求項7】

前記陰イオン交換樹脂は、前記ハイポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂および前記ＭＲ型弱塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記フェノールレッド吸着剤は、前記培養液に対する濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ未満となる量で用いられる請求項４に記載のフェノールレッドの除去方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フェノールレッド吸着剤およびフェノールレッドの除去方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞や微生物の培養に用いる培養液（培地）には、ｐＨ指示薬としてフェノールレッドが添加されている。フェノールレッドを培養液に添加することで、培養液におけるｐＨの変化を色の変化として把握することができる。これにより、培養液を交換するタイミングやコンタミネーションの発生を可視化できるといったメリットが得られる。一方で、例えば特許文献１に開示されるように、フェノールレッドは、蛍光を発したり特定波長の光を吸収したりする性質を有する。このため、ＦＡＣＳ（fluorescence-activated cell sorting）等の細胞解析や、培養液の成分解析等に負の影響を与えることが知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】国際公開第２００１／００７９１９号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

一般的に、フェノールレッドを含有する培養液で細胞を培養する場合、ＦＡＣＳ等の解析を実施する際に細胞を培養液からＰＢＳ（Phosphate-buffered saline）に移していた。このため、解析に手間がかかり、また解析中に細胞がダメージを受けやすかった。一方、特許文献１には、フェノールレッドが細胞解析に与える負の影響を回避するために、フェノールレッドを含有しない培養液を選択することが開示されている。しかしながら、この場合は培養液の選択の幅が狭まってしまう。したがって、フェノールレッドを除去する新たな技術が望まれる。

【0005】

本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的の１つは、新規なフェノールレッドの除去技術を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記課題を解決するために、本発明のある態様はフェノールレッド吸着剤である。この吸着剤は、強塩基性陰イオン交換樹脂、ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂、ハイポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂およびＭＲ型弱塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも１種を含む。この態様によれば、新規なフェノールレッドの除去技術を提供することができる。

【0007】

上記態様において、フェノールレッド吸着剤は、細胞および微生物の少なくとも一方の培養液に含まれるフェノールレッドを吸着するものであってもよい。上記態様において、フェノールレッド吸着剤は、強塩基性陰イオン交換樹脂、ハイポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂およびＭＲ型弱塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも１種を含んでもよい。上記態様において、培養液中のフェノールレッド吸着剤の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以上であってもよい。上記態様において、培養液中のフェノールレッド吸着剤の濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ以上であってもよい。上記態様において、フェノールレッド吸着剤は、ハイポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂およびＭＲ型弱塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも１種を含み、培養液中の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ未満であってもよい。

【0008】

本発明の他の態様はフェノールレッドの除去方法である。この除去方法は、フェノールレッドを含有する、細胞および微生物の少なくとも一方の培養液に、上記いずれかの態様のフェノールレッド吸着剤を接触させることを含む。

【0009】

なお、以上の構成要素の任意の組み合わせや、本発明の構成要素や表現を方法、装置、システムなどの間で相互に置換したものもまた、本発明の態様として有効である。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、新規なフェノールレッドの除去技術を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１（Ａ）～図１（Ｄ）は、実施の形態に係るフェノールレッドの除去方法を説明するための模式図である。

【図2】性能を評価した陰イオン交換樹脂を示す図である。

【図3】図３（Ａ）および図３（Ｂ）は、フェノールレッド吸着率を示す図である。

【図4】図４（Ａ）および図４（Ｂ）は、培養液のｐＨを示す図である。

【図5】図５（Ａ）および図５（Ｂ）は、グルコース吸着率を示す図である。

【図6】フェノールレッド吸着剤の候補材料が有する吸着性能を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明を好適な実施の形態をもとに図面を参照しながら説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。各図面に示される同一又は同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、各図に示す各部の縮尺や形状は、説明を容易にするために便宜的に設定されており、特に言及がない限り限定的に解釈されるものではない。また、本明細書または請求項中に「第１」、「第２」等の用語が用いられる場合には、この用語はいかなる順序や重要度を表すものでもなく、ある構成と他の構成とを区別するためのものである。また、各図面において実施の形態を説明する上で重要ではない部材の一部は省略して表示する。

【0013】

本実施の形態に係るフェノールレッド吸着剤は、強塩基性陰イオン交換樹脂、ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂、ハイポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂およびＭＲ（macro-retucilar：巨大網状）型弱塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも１種を含む。また、好ましくは、フェノールレッド吸着剤は、強塩基性陰イオン交換樹脂、ハイポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂およびＭＲ型弱塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも１種を含む。

【0014】

陰イオン交換樹脂は、その形状により、ゲル型、ポーラス型、ハイポーラス型およびＭＲ型に分類される。ゲル型は、樹脂原料（モノマー）を溶媒中で重合させた重合体であり、均一な三次元構造を有する。ゲル型は、ミクロポアのみを有する。ポーラス型やハイポーラス型は、ゲル型の三次元構造に物理的に孔（マクロポア）を設けた多孔質構造で構成される。ハイポーラス型は、ポーラス型よりも高多孔質である。ＭＲ型は、ゲル型を合成する際の重合方法を改良して作製されたものであり、ゲル型よりも比表面積、細孔容積が大きい。

【0015】

強塩基性陰イオン交換樹脂は、弱塩基性陰イオン交換樹脂に比べて吸着性能が高いため、ゲル型、ポーラス型、ハイポーラス型およびＭＲ型のいずれの構造であってもよい。強塩基性陰イオン交換樹脂としては、トリメチルアンモニウム基を有するＩ型強塩基性陰イオン交換樹脂と、ジメチルエタノールアンモニウム基を有するＩＩ型強塩基性陰イオン交換樹脂と、が例示される。

【0016】

Ｉ型強塩基性陰イオン交換樹脂としては、ゲル型のＳＡ１０Ａ、ＳＡ１２Ａ、ＳＡ１１Ａ、ＮＳＡ１００（全て三菱ケミカル社製）；ポーラス型のＰＡ３０６Ｓ、ＰＡ３０８、ＰＡ３１２、ＰＡ３１６、ＰＡ３１８Ｌ（全て三菱ケミカル社製）；ハイポーラス型のＨＰＡ２５（三菱ケミカル社製）等が挙げられる。これらは、スチレン系の強塩基性陰イオン交換樹脂である。

【0017】

ＩＩ型強塩基性陰イオン交換樹脂としては、ゲル型のＳＡ２０Ａ、ＳＡ２１Ａ（全て三菱ケミカル社製）、ＩＲＡ４１０、ＩＲＡ４１１（全てオルガノ社製）；ポーラス型のＰＡ４０８、ＰＡ４１２、ＰＡ４１８（全て三菱ケミカル社製）；ＭＲ型のＩＲＡ９１０ＣＴ（オルガノ社製）等が挙げられる。これらは、スチレン系の強塩基性陰イオン交換樹脂である。

【0018】

弱塩基性陰イオン交換樹脂は、強塩基性陰イオン交換樹脂に比べて吸着性能が低いため、吸着面積の大きいポーラス型、ハイポーラス型およびＭＲ型が好ましく、ハイポーラス型およびＭＲ型がより好ましい。弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、ＷＡ３０（三菱ケミカル社製）等のハイポーラス型でジメチルアミノ基を有するスチレン系弱塩基性陰イオン交換樹脂、ＩＲＡ９６ＳＢ（オルガノ社製）等のＭＲ型でジメチルアミノ基を有するスチレン系弱塩基性陰イオン交換樹脂、ＷＡ２０（三菱ケミカル社製）等のポーラス型でポリアミノ基（－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ）ｎＨで表される官能基（ｎは１以上の自然数））を有するスチレン系弱塩基性陰イオン交換樹脂、ＩＲＡ６７（オルガノ社製）等のゲル型でジメチルアミノ基を有するアクリル系弱塩基性陰イオン交換樹脂等が挙げられる。

【0019】

上記の強塩基性陰イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂は、遊離官能基とフェノールレッドとが電気的に相互作用するか、官能基と相互作用している交換イオンとフェノールレッドとがイオン交換することで、フェノールレッドを吸着することができる。上記のＳＡ１０Ａ、ＳＡ１２Ａ、ＳＡ１１Ａ、ＮＳＡ１００、ＰＡ３０６Ｓ、ＰＡ３０８、ＰＡ３１２、ＰＡ３１６、ＰＡ３１８Ｌ、ＨＰＡ２５、ＳＡ２０Ａ、ＳＡ２１Ａ、ＩＲＡ４１０、ＩＲＡ４１１、ＰＡ４０８、ＰＡ４１２、ＰＡ４１８およびＩＲＡ９１０ＣＴは、交換イオンＣｌ^－とフェノールレッドとのイオン交換により、フェノールレッドを吸着する。ＷＡ３０、ＩＲＡ９６ＳＢ、ＷＡ２０およびＩＲＡ６７は、遊離官能基とフェノールレッドとの電気的相互作用により、フェノールレッドを吸着する。フェノールレッド吸着剤は、上記の強塩基性陰イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂のうちの１種類のみを含有してもよいし、これらの任意の組み合わせを含有してもよい。

【0020】

強塩基性、ポーラス型弱塩基性、ハイポーラス型弱塩基性およびＭＲ型弱塩基性の少なくとも１種の陰イオン交換樹脂を含むフェノールレッド吸着剤をフェノールレッドに接触させることで、フェノールレッドを当該吸着剤に効果的に吸着させることができる。特に、本実施の形態のフェノールレッド吸着剤は、溶液中のフェノールレッドを吸着除去する場合に、好適に用いることができる。この場合、フェノールレッド吸着剤を溶液に接触させることで、溶液中のフェノールレッドを吸着させることができる。

【0021】

また、フェノールレッド吸着剤は、溶液が有用成分としてグルコースを含有する場合に、溶液中に残すべきグルコースに比べて除去対象であるフェノールレッドを高選択的に吸着することができる。グルコースを含有する溶液としては、細胞および微生物の少なくとも一方の培養液（培地）が例示される。つまり、本実施の形態のフェノールレッド吸着剤は、培養液に含まれるフェノールレッドを吸着する場合に、好適に用いることができる。なお、本実施の形態のフェノールレッド吸着剤は、乳酸やアンモニア等の細胞老廃物を吸着する吸着剤と併用してもよい。

【0022】

強塩基性、ポーラス型弱塩基性、ハイポーラス型弱塩基性およびＭＲ型弱塩基性の少なくとも１種の陰イオン交換樹脂を含むフェノールレッド吸着剤を用いることで、添加から２４時間後に８０％以上のフェノールレッド吸着率（除去率）が得られるフェノールレッド吸着処理が実現可能である。フェノールレッド吸着率は、溶液中のフェノールレッドの総量に対する吸着したフェノールレッドの量の割合である。本発明者は、吸着率８０％で培養液がほぼ無色透明になることを確認している。

【0023】

また、フェノールレッド吸着剤が強塩基性、ハイポーラス型弱塩基性およびＭＲ型弱塩基性の少なくとも１種の陰イオン交換樹脂を含む場合、より高いフェノールレッドの吸着率を達成することができる。よって、８０％以上の吸着率を達成しやすくすることができる。また、８０％以上の吸着率を達成するために必要な吸着剤の量を減らすことができる。

【0024】

フェノールレッド吸着剤が強塩基性、ハイポーラス型弱塩基性およびＭＲ型弱塩基性の少なくとも１種の陰イオン交換樹脂を含む場合、培養液中のフェノールレッド吸着剤の濃度は、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１ｍｇ／ｍＬ超であり、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上である。

【0025】

フェノールレッド吸着剤の濃度を１ｍｇ／ｍＬ以上に調整することで、８０％以上のフェノールレッド吸着率をより達成しやすくすることができる。また、フェノールレッド吸着剤の濃度を１ｍｇ／ｍＬ超、さらには１０ｍｇ／ｍＬ以上に調整することで、９５％以上のフェノールレッド吸着率を達成することができる。また、吸着率８０％に到達するまでの時間を短縮することができる。これにより、細胞解析や培養液解析等にフェノールレッドの吸着処理を組み込んだ際に、迅速に解析を実施することができる。

【0026】

また、フェノールレッド吸着剤がハイポーラス型およびＭＲ型の少なくとも１種の弱塩基性陰イオン交換樹脂を含む場合、培養液中のフェノールレッド吸着剤の濃度は、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ未満であり、より好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下である。一般に、培養液のｐＨは７．４±１に維持することが好ましい。これに対し、フェノールレッド吸着剤の濃度を１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ未満、さらには１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下に調整することで、フェノールレッドの効果的な吸着を実現しながら、フェノールレッド吸着剤の添加によって起こる培養液のｐＨの変化を抑制することがでる。この結果、培養液中の成分の変性を抑制でき、細胞が負の影響を受ける可能性を低減することができる。なお、強塩基性陰イオン交換樹脂の場合、いずれの濃度でもｐＨを７．４±１の範囲に維持することが可能である。

【0027】

培養液を用いて培養される細胞および微生物は、特に限定されない。例えば細胞は、ヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞および分化誘導細胞；間葉系幹細胞（ＭＳＣ細胞）、ネフロン前駆細胞等の体性幹細胞；ヒト近位尿細管上皮細胞、ヒト遠位尿細管上皮細胞、ヒト集合管上皮細胞等の組織細胞；ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）等の抗体産生細胞株；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（ＳＦ９細胞）等のヒト以外の動物由来の抗体産生細胞株等が挙げられる。

【0028】

（フェノールレッドの除去方法）
本実施の形態に係るフェノールレッドの除去方法は、フェノールレッドを含有する培養液に、上記のフェノールレッド吸着剤を接触させることを含む。フェノールレッド吸着剤を培養液に接触させる方法は特に限定されないが、以下の態様が例示される。図１（Ａ）～図１（Ｄ）は、実施の形態に係るフェノールレッドの除去方法を説明するための模式図である。以下では、培養液からのフェノールレッド除去を例に挙げて説明するが、他の溶液からのフェノールレッド除去についても同様に実施することができる。また、フェノールレッドの除去処理を施すタイミングは特に限定されず、フェノールレッドの除去処理を施した培養液に細胞を添加して培養してもよいし、細胞培養後の培地から細胞を除去した後にフェノールレッド除去処理を施してもよい。

【0029】

図１（Ａ）に示すように、第１の態様では、カラム等の容器２にフェノールレッド吸着剤４が充填された吸着モジュール６が用意される。容器２は、容器２の内外を連通する入口２ａと出口２ｂとを有する。フェノールレッド吸着剤４は、例えば粒子状である。吸着モジュール６は、循環路８を介して、スピナーフラスコ等の培養容器１０に接続される。循環路８は、培養容器１０と容器２の入口２ａとを接続する往路８ａと、容器２の出口２ｂと培養容器１０とを接続する復路８ｂとを含む。往路８ａの途中には、ポンプ１２が接続される。培養容器１０中には、培養液１４と、細胞１６とが収容される。なお、ポンプ１２は復路８ｂに配置されてもよい。

【0030】

ポンプ１２が駆動すると、培養液１４は培養容器１０から吸引され、往路８ａを介して吸着モジュール６の容器２内に送られる。容器２内に送り込まれた培養液１４は、復路８ｂを介して培養容器１０内に戻される。培養液１４は、培養容器１０と吸着モジュール６との間を循環する過程で、容器２に充填されたフェノールレッド吸着剤４と接触する。このとき、培養液１４中のフェノールレッドはフェノールレッド吸着剤４に吸着される。この結果、培養液１４中のフェノールレッドが除去される。

【0031】

往路８ａにおける培養容器１０に接続される側の端部には、図示しないフィルタが設けられる。これにより、細胞１６が吸着モジュール６側に流れることが抑制される。なお、培養容器１０と吸着モジュール６との間で培養液１４を循環させる過程で、細胞１６の培養に必要なグルコースやタンパク質等の培地成分が培養液１４に補充されてもよい。

【0032】

つまり、第１の態様では、フェノールレッド吸着剤４を有する吸着モジュール６と、細胞１６（微生物であってもよい）および培養液１４が収容される培養容器１０と、培養容器１０および吸着モジュール６をつなぎ培養液１４を循環させる循環路８と、を備える除去装置を用いることで、培養液１４中のフェノールレッドが除去される。

【0033】

図１（Ｂ）に示すように、第２の態様では、培養容器１０の内壁面にフェノールレッド吸着剤４が支持されている。培養容器１０中には、培養液１４と、細胞１６とが収容されている。したがって、培養液１４は、培養容器１０の内壁面において露出するフェノールレッド吸着剤４に接触する。これにより、培養液１４中のフェノールレッドをフェノールレッド吸着剤４に吸着させることができる。培養容器１０としては、スピナーフラスコ、シャーレ、ウェルプレート、セルカルチャーインサート、マイクロスフェア等が例示される。

【0034】

培養容器１０の内壁面にフェノールレッド吸着剤４を支持させる方法としては、例えば、フェノールレッド吸着剤４を培養容器１０の内壁面に接着する方法や、培養容器１０が樹脂製である場合には、予めフェノールレッド吸着剤４を混合した樹脂で培養容器１０を成形する方法等が挙げられる。つまり、第２の態様では、培養容器１０と、培養容器１０の内壁面に支持されるフェノールレッド吸着剤４と、を備える除去装置を用いることで、培養液１４中のフェノールレッドが除去される。

【0035】

図１（Ｃ）に示すように、第３の態様では、培養容器１０は、多孔質膜等の隔膜１８によって容器内部が上段１０ａと下段１０ｂとに区切られた構造を有する。このような培養容器１０としては、セルカルチャーインサートが例示される。上段１０ａには培養液１４と細胞１６とが収容され、下段１０ｂには培養液１４とフェノールレッド吸着剤４とが収容される。培養液１４は、隔膜１８を通過して上段１０ａと下段１０ｂとの間を行き来することができる。一方、細胞１６およびフェノールレッド吸着剤４は、隔膜１８を通過することができない。

【0036】

このような構造において、培養液１４は、下段１０ｂに収容されたフェノールレッド吸着剤４に接触する。これにより、培養液１４中のフェノールレッドをフェノールレッド吸着剤４に吸着させることができる。つまり、第３の態様では、培養容器１０と、フェノールレッド吸着剤４と、培養容器１０内をフェノールレッド吸着剤４が収容される第１空間と細胞１６（微生物でもよい）が収容される第２空間とに区画する隔膜１８と、を備える除去装置を用いることで、培養液１４中のフェノールレッドが除去される。

【0037】

図１（Ｄ）に示すように、第４の態様では、粒子状のフェノールレッド吸着剤４を培養液１４中に分散、沈降あるいは浮遊させる。これにより、培養液１４中のフェノールレッドをフェノールレッド吸着剤４に吸着させることができる。培養液１４に添加したフェノールレッド吸着剤４を回収する場合には、ろ過や遠心分離等の公知の方法で回収することができる。なお、フェノールレッド吸着剤４は、細胞１６に貪食されることを防ぐために、所定サイズ以上、例えば１０μｍ以上の大きさであることが好ましい。つまり、第４の態様では、培養容器１０と、培養容器１０内の培養液１４に添加されるフェノールレッド吸着剤４と、を備える除去装置を用いることで、培養液１４中のフェノールレッドが除去される。

【0038】

好ましくは、フェノールレッド吸着剤４は、ポリビニルアルコールやアルギン酸等の樹脂、コラーゲンやゼラチン等の生体由来ゲル等で被覆される。これにより、細胞１６に影響を与え得る微粒子がフェノールレッド吸着剤４から培養液１４中に流出することを抑制できる。あるいは、フェノールレッド吸着剤４は、セラミックスバインダー、樹脂バインダー、生体由来ゲル等と、上記の陰イオン交換樹脂とを混練して成形される。これによっても、微粒子の流出を抑制することができる。セラミックスバインダーとしては、アルミナバインダー、コロイダルシリカ等が例示される。樹脂バインダーとしては、アルギン酸、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース等が例示される。生体由来ゲルとしては、コラーゲン、ゼラチン等が例示される。

【0039】

以上説明したように、本実施の形態に係るフェノールレッド吸着剤は、強塩基性陰イオン交換樹脂、ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂、ハイポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂およびＭＲ型弱塩基性陰イオン交換樹脂からなる群から選択される少なくとも１種を含む。また、本実施の形態に係るフェノールレッドの除去方法は、このフェノールレッド吸着剤を、フェノールレッドを含有する、細胞および微生物の少なくとも一方の培養液に接触させることを含む。

【0040】

これにより、培養液中からフェノールレッドを効率的に除去することができる新規なフェノールレッドの除去技術を提供することができる。また、培養液からフェノールレッドを除去できることで、吸光やラマン分光等によって細胞や培養液を解析する際に、フェノールレッドが測定結果に負の影響を及ぼすことを回避できる。例えば、細胞死を簡易的に把握する手法として、細胞から放出される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の量を測定することが知られている。ＬＤＨは、細胞質に存在する酵素であり、通常は細胞膜を透過しないが、細胞膜が障害を受けると細胞外、すなわち培養液中に放出される。培養液中でのＬＤＨ量は、例えばCytotoxicity LDH Assay Kit（同仁化学社製）およびプレートリーダーを用いて、培養液の波長４９５ｎｍにおける吸光度を測定することで得られる。一方、フェノールレッドは、ｐＨ７付近では波長４５０ｎｍに吸光ピークを有し、波長４９５ｎｍの光も吸収する。このため、培養液中にフェノールレッドが存在すると、ＬＤＨ量の計測に影響を与えてしまう。

【0041】

これに対し、本実施の形態に係るフェノールレッド吸着剤を用いて培養液中のフェノールレッドを吸着除去することで、細胞や培養液の解析を高精度に実施することができる。これにより、使用する培養液をフェノールレッドを含有しないものに限らずに済むため、培養液の選択の幅を広げることができる。また、ＦＡＣＳ等で細胞を解析する際に、細胞を培養液からＰＢＳに移す必要がないため、細胞等にかかる負荷を軽減でき、また作業の簡素化を図ることができる。また、フェノールレッドはホルモン作用を有し、細胞等に負の影響を与え得ることが知られている。これに対し、フェノールレッド吸着剤でフェノールレッドを吸着除去することで、当該影響も低減することができる。

【0042】

また、フェノールレッド吸着剤を培養液に接触させるだけでフェノールレッドを除去できるため、簡単な構造の除去装置でフェノールレッドを除去することができる。また、本実施の形態のフェノールレッド吸着剤は、有用成分であるグルコースに対してフェノールレッドを高選択的に吸着することができる。

【0043】

好ましくは、フェノールレッド吸着剤は強塩基性、ハイポーラス型弱塩基性およびＭＲ型弱塩基性の少なくとも１種の陰イオン交換樹脂を含む。これにより、フェノールレッドの吸着率をより高めることができる。フェノールレッド吸着剤が強塩基性、ハイポーラス型弱塩基性およびＭＲ型弱塩基性の少なくとも１種の陰イオン交換樹脂を含む場合、培養液中のフェノールレッド吸着剤の濃度は、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上である。これにより、より効果的にフェノールレッドを吸着することができる。また、フェノールレッド吸着剤の濃度は、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上である。これにより、フェノールレッドの吸着率をさらに高めることができる。

【0044】

また、フェノールレッド吸着剤がハイポーラス型およびＭＲ型の少なくとも１種の弱塩基性陰イオン交換樹脂を含む場合、培養液中のフェノールレッド吸着剤の濃度は、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ未満である。これにより、フェノールレッド吸着剤の添加によって起こる培養液のｐＨの変化を抑制でき、細胞が負の影響を受ける可能性を低減することができる。

【0045】

以上、本発明の実施の形態について詳細に説明した。前述した実施の形態は、本発明を実施するにあたっての具体例を示したものにすぎない。実施の形態の内容は、本発明の技術的範囲を限定するものではなく、請求の範囲に規定された発明の思想を逸脱しない範囲において、構成要素の変更、追加、削除等の多くの設計変更が可能である。設計変更が加えられた新たな実施の形態は、組み合わされる実施の形態および変形それぞれの効果をあわせもつ。前述の実施の形態では、このような設計変更が可能な内容に関して、「本実施の形態の」、「本実施の形態では」等の表記を付して強調しているが、そのような表記のない内容でも設計変更が許容される。以上の構成要素の任意の組み合わせも、本発明の態様として有効である。

【実施例】

【0046】

以下、本発明の実施例を説明するが、実施例は本発明を好適に説明するための例示に過ぎず、なんら本発明を限定するものではない。

【0047】

［フェノールレッド吸着剤の性能評価］
フェノールレッド吸着剤の吸着性能を以下の手順で評価した。まず、培養液として、１４．９３ｍｇ／Ｌの濃度でフェノールレッドを含有するＤＭＥＭ（ナカライテスク社製）を用意した。血液ガス分析装置（ＡＢＬ８００ ＦＬＥＸ：ラジオメーター社製）を用いて、この培養液のグルコース濃度およびｐＨを測定したところ、グルコース濃度は４５０ｍｇ／ｄＬであり、ｐＨは７．４であった。

【0048】

また、フェノールレッド吸着剤として各種の陰イオン交換樹脂を用意した。図２は、性能を評価した陰イオン交換樹脂を示す図である。具体的には、強塩基性陰イオン交換樹脂としてＳＡ１０Ａ、ＰＡ３０８、ＳＡ２０Ａ、ＰＡ３１２（全て三菱ケミカル社製）およびＩＲＡ４１０（オレガノ社製）を用意し、弱塩基性陰イオン交換樹脂としてＷＡ３０（三菱ケミカル社製）、ＩＲＡ９６ＳＢ（オレガノ社製）、ＷＡ２０（三菱ケミカル社製）およびＩＲＡ６７（オレガノ社製）を用意した。

【0049】

２０ｍＬの培養液と、所定量の各フェノールレッド吸着剤と、を５０ｍＬチューブに添加した。各フェノールレッド吸着剤の添加量（濃度）は、２０００ｍｇ（１００ｍｇ／ｍＬ）、２００ｍｇ（１０ｍｇ／ｍＬ）、２０ｍｇ（１ｍｇ／ｍＬ）、２ｍｇ（０．１ｍｇ／ｍＬ）とした。各チューブを恒温振とう槽に入れ、温度３７℃、６０回／分の条件で２４時間振とうした。その後、各チューブの内容物を吸引ろ過して培養液とフェノールレッド吸着剤とを分離した。

【0050】

そして、血液ガス分析装置（ＡＢＬ８００ ＦＬＥＸ：ラジオメーター社製）を用いて、フェノールレッド吸着処理後の培養液におけるグルコース濃度およびｐＨを測定した。また、１Ｎ ＮａＯＨを用いて各培養液をｐＨ８．５に調整した。そして、マイクロプレートリーダー（ＡＲＶＯ ＭＸ－ｆｌａ：パーキンエルマー社製）を用いて、各培養液の波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、フェノールレッド吸着処理後の培養液におけるフェノールレッドの濃度を得た。得られた結果と以下の数式とに基づいて、フェノールレッド吸着率と、グルコース吸着率とを算出した。
吸着率（％）＝［吸着前濃度－吸着後濃度］／吸着前濃度×１００

【0051】

図３（Ａ）および図３（Ｂ）は、フェノールレッド吸着率を示す図である。図３（Ａ）および図３（Ｂ）に示すように、強塩基性、ポーラス型弱塩基性、ハイポーラス型弱塩基性およびＭＲ型弱塩基性の陰イオン交換樹脂によれば、フェノールレッドを吸着できることが確認された。また、濃度を調整すれば、８０％以上のフェノールレッド吸着率も達成できることが確認された。また、強塩基性、ハイポーラス型弱塩基性およびＭＲ型弱塩基性の陰イオン交換樹脂によれば、より高いフェノールレッド吸着率を達成できることが確認された。また、強塩基性、ハイポーラス型弱塩基性およびＭＲ型弱塩基性の陰イオン交換樹脂は、培養液中の濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上で８０％以上のフェノールレッド吸着率を達成できることが確認された。また、１０ｍｇ／ｍＬ以上で９５％以上のフェノールレッド吸着率を達成できることが確認された。

【0052】

図４（Ａ）および図４（Ｂ）は、培養液のｐＨを示す図である。図４（Ａ）および図４（Ｂ）に示すように、強塩基性陰イオン交換樹脂を培養液に添加する場合は、いずれの濃度でも培養液のｐＨがほぼ変化しないことが確認された。また、ポーラス型、ハイポーラス型およびＭＲ型の弱塩基性陰イオン交換樹脂を培養液に添加する場合は、培養液中の濃度が１００ｍｇ／ｍＬ未満であるとき、培養液のｐＨの変化を±１の範囲まで抑制できることが確認された。また、図３（Ａ）～図４（Ｂ）に示す結果から、ハイポーラス型およびＭＲ型の弱塩基性陰イオン交換樹脂については、濃度を１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ未満に調整することで、フェノールレッドの効果的な吸着と、培養液のｐＨ変化の抑制との両立が可能であることが確認された。

【0053】

図５（Ａ）および図５（Ｂ）は、グルコース吸着率を示す図である。図５（Ａ）および図５（Ｂ）に示すように、全ての強塩基性陰イオン交換樹脂および弱塩基性陰イオン交換樹脂において、いずれの濃度でもグルコース吸着率は約１０％以下と極めて低い値であることが確認された。よって、本実施の形態に係るフェノールレッド吸着剤が培養液中の有用成分に対してフェノールレッドを高選択的に吸着することが確認された。

【0054】

［フェノールレッド吸着剤として有用な材料の選別］
フェノールレッド吸着剤の候補材料として、以下のものを用意した。
ポーラス型のＨ型強酸性陽イオン交換樹脂（ＰＫ２１６ＬＨ：三菱ケミカル社製）
Ｌ型ゼオライト（５００ＫＯＡ：東ソー社製）
ＺＳＭ－５型ゼオライト（８２２ＨＯＡ：東ソー社製）
プルシアンブルー型錯体（プルシアンブルー：関東化学社製）
シリカ多孔体（ＳｉＯ_２：関東化学社製）
活性炭（富士フィルム和光純薬社製）
酸化金属（ＭｇＯ：関東化学社製）
層状複水酸化物（Ｍｇ－Ａｌ ＬＤＨ）
層状複酸化物（Ｍｇ－Ａｌ ＬＤＯ）

【0055】

２０ｍＬの培養液と、０．５ｇの各候補材料と、を５０ｍＬチューブに添加した。したがって、各候補材料の濃度は、０．０２５ｍｇ／ｍＬである。また、比較対象として、２０ｍＬの培養液と、０．５ｇのＳＡ１０Ａと、を添加した５０ｍＬチューブも用意した。各候補材料の添加から２４時間が経過した後に、各培養液の色の濃さを目視で確認して各候補材料の吸着性能を評価した。具体的には、ＳＡ１０Ａと同程度の吸着性能であった場合、つまり、培養液の色の濃さがＳＡ１０を添加した培養液と同程度であった場合にＡと評価した。また、ＳＡ１０Ａの１／２程度の吸着性能であった場合、つまり、ＳＡ１０Ａを添加したときの濃さの低下量に対して１／２程度の低下量であった場合にＢと評価した。また、ＳＡ１０の１／１０程度の吸着性能であった場合、つまり、ＳＡ１０Ａを添加したときの濃さの低下量に対して１／１０程度の低下量であった場合にＣと評価した。また、培養液の色の濃さに変化が見られなかった場合にＸと評価した。

【0056】

図６は、フェノールレッド吸着剤の候補材料が有する吸着性能を示す図である。図６に示すように、いずれの候補材料もＳＡ１０Ａに比べてフェノールレッドの吸着性能が著しく低かった。よって、強塩基性、ポーラス型弱塩基性、ハイポーラス型弱塩基性およびＭＲ型弱塩基性の各陰イオン交換樹脂がフェノールレッド吸着剤として極めて好適であることが確認された。

【符号の説明】

【0057】

２ 容器、 ４ フェノールレッド吸着剤、 ６ 吸着モジュール、 ８ 循環路、 １０ 培養容器、 １２ ポンプ、 １４ 培養液、 １６ 細胞、 １８ 隔膜。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】