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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-17
(45)【発行日】2024-12-25
(54)【発明の名称】迅速逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20241218BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2021541470
(86)(22)【出願日】2020-01-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-07
(86)【国際出願番号】 US2020013827
(87)【国際公開番号】W WO2020150442
(87)【国際公開日】2020-07-23
【審査請求日】2023-01-13
(31)【優先権主張番号】62/793,701
(32)【優先日】2019-01-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】513208191
【氏名又は名称】ノースウエスタン ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＲＴＨＷＥＳＴＥＲＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】６３３ Ｃｌａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｅｖａｎｓｔｏｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６０２０８，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】リード，ジェニファー エル．
(72)【発明者】
【氏名】マクフォール，サリー エム．
(72)【発明者】
【氏名】バツラー，マシュー エイ．
【審査官】天野 皓己
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５３８００７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３８５８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５０２４６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５０４３５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５４２７１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－２５３２６３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００ － ３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の標的ＲＮＡの検出方法であって、以下：ａ．（ｉ）前記試料、
（ｉｉ）デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、マグネシウム塩またはマンガン塩から選択される補因子であって、当該補因子は３ｍＭ～８ｍＭの濃度で提供される補因子、及び前記標的ＲＮＡを増幅するように構成されたオリゴヌクレオチドプライマーであって、当該オリゴヌクレオチドプライマーは少なくとも６μＭの濃度で提供されるオリゴヌクレオチドプライマー、を含む、増幅試薬、ならびに
（ｉｉｉ）少なくとも０．４Ｕ／μＬの濃度で提供されるＲＮＡ及びＤＮＡ両依存性ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を含有する反応混合物を用意すること、
ｂ．６４～７２℃の温度で、３０秒以下の逆転写時間の間インキュベートすることにより、前記ＲＮＡをＤＮＡへと逆転写すること、
ｃ．複数の増幅サイクルを含む熱サイクルプロトコルにより前記ＤＮＡを増幅することであって、ただし、各増幅サイクルは、少なくとも、９１～９８℃の温度で、５秒間未満行われる熱変性工程及び、４５～７０℃の温度で、１０秒間未満行われるアニーリング工程を含む、前記増幅すること、
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、１２μＭの濃度で提供される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ポリメラーゼ酵素は、０．８Ｕ／μＬの濃度で提供される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記補因子は、マンガン塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記マンガン塩は、ＭｎＣｌ２である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記補因子は、４ｍＭの濃度で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記逆転写時間は、１２秒以下である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記逆転写時間は、５秒以下である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記逆転写時間は、１秒以下である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記逆転写は、６８℃の温度で起こる、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
各熱変性工程は、９５℃で１秒間行われ、及び各アニーリング工程は６８℃で４秒間行われる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記熱サイクルプロトコルは、少なくとも３０回の増幅サイクルを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記熱サイクルプロトコルは、少なくとも４０回の増幅サイクルを含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月１７日出願の米国仮特許出願番号第６２／７９３，６５７号の優先権を主張し、この出願はそのまま全体が本明細書により参照として援用される。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月１７日出願の米国仮特許出願番号第６２／７９３，６５７号の優先権を主張し、この出願はそのまま全体が本明細書により参照として援用される。
【0002】
本明細書中提供されるのは、試料中のＲＮＡを迅速に増幅及び検出する方法である。特定の実施形態において、開示される方法は、臨床診断、例えば、対象におけるウイルス感染の検出などに使用することができる。
【0003】
〔背景技術〕
感染症は、核酸検査で診断されることが多い。しかしながら、核酸の増幅に最も広く実施されている方法である、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）または定量的ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ）は、時間もエネルギーも大量に必要とする。ＲＮＡの検出は、特にウイルス感染症に関して、臨床診断にも必須となる可能性があるが、ＲＮＡは、ＰＣＲにより直接増幅することができない。ＲＮＡは、逆転写の第一工程を必要とし、この工程で、逆転写酵素と呼ばれる酵素が、酵素作用により、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を作製する。ＲＴ－ｑＰＣＲでは、次いで、このｃＤＮＡが、ＰＣＲ反応で増幅される。
感染症は、核酸検査で診断されることが多い。しかしながら、核酸の増幅に最も広く実施されている方法である、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）または定量的ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ）は、時間もエネルギーも大量に必要とする。ＲＮＡの検出は、特にウイルス感染症に関して、臨床診断にも必須となる可能性があるが、ＲＮＡは、ＰＣＲにより直接増幅することができない。ＲＮＡは、逆転写の第一工程を必要とし、この工程で、逆転写酵素と呼ばれる酵素が、酵素作用により、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を作製する。ＲＴ－ｑＰＣＲでは、次いで、このｃＤＮＡが、ＰＣＲ反応で増幅される。
【0004】
ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイは、１段階または２段階反応いずれかで行うことができる。１段階ＲＴ－ｑＰＣＲでは、ｃＤＮＡ合成及びｑＰＣＲを、単一反応容器において、共通する反応緩衝液中で行う。２段階ＲＴ－ｑＰＣＲでは、ｃＤＮＡを１つの反応で合成し、次いで分割量のｃＤＮＡを、続くｑＰＣＲ実験に使用する。１段階反応は、最小限の試料取り扱い及び密閉管反応を可能にするので、ピペット誤差及び相互汚染の可能性を低下させる。しかしながら、単一管ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイの場合、混合されたＲＴ試薬とＰＣＲ試薬は、それらの反応が１つの試験管中で一緒に進行することを許容するものでなければならない。このため、個々の反応それぞれにとって最適な試薬及び条件を使用することが妨げられ、その結果、潜在的に反応条件を妥協することになり、効率及び収率に悪影響を及ぼす。
【0005】
したがって、高い効率及び収率を可能にする、試料中の標的ＲＮＡを迅速検出する改善された方法が必要とされている。
【0006】
〔発明の概要〕
本明細書中提供されるのは、試料中の標的ＲＮＡを検出する方法である。実施形態によっては、本明細書中提供されるのは、（ａ）試料、増幅試薬、ならびにＲＮＡ及びＤＮＡ両依存性ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を含有する反応混合物を用意すること、（ｂ）５分以下の逆転写時間の間インキュベートすることにより、ＲＮＡからＤＮＡへと逆転写すること、ならびに（ｃ）複数の増幅サイクルを含む熱サイクルプロトコルを行うことによりＤＮＡを増幅させることであって、ただし、各増幅サイクルは、少なくとも熱変性工程及びアニーリング工程を含む、増幅させること、を含む、試料中の標的ＲＮＡを検出する方法である。
本明細書中提供されるのは、試料中の標的ＲＮＡを検出する方法である。実施形態によっては、本明細書中提供されるのは、（ａ）試料、増幅試薬、ならびにＲＮＡ及びＤＮＡ両依存性ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を含有する反応混合物を用意すること、（ｂ）５分以下の逆転写時間の間インキュベートすることにより、ＲＮＡからＤＮＡへと逆転写すること、ならびに（ｃ）複数の増幅サイクルを含む熱サイクルプロトコルを行うことによりＤＮＡを増幅させることであって、ただし、各増幅サイクルは、少なくとも熱変性工程及びアニーリング工程を含む、増幅させること、を含む、試料中の標的ＲＮＡを検出する方法である。
【0007】
実施形態によっては、増幅試薬は、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、補因子、及び試料中の標的ＲＮＡを増幅するように構成されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む。実施形態によっては、オリゴヌクレオチドプライマーは、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。実施形態によっては、オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも６μＭ（例えば、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、またはそれらの間の範囲）の濃度で提供される。
【0008】
実施形態によっては、オリゴヌクレオチドプライマーは、１２μＭの濃度で提供される。実施形態によっては、ポリメラーゼ酵素は、少なくとも０．４Ｕ／μＬ（例えば、０．４Ｕ／μＬ、０．５Ｕ／μＬ、０．６Ｕ／μＬ、０．７Ｕ／μＬ、０．８Ｕ／μＬ、０．９Ｕ／μＬ、１．０Ｕ／μＬ、１．１Ｕ／μＬ、１．２Ｕ／μＬ、またはそれらの間の範囲）の濃度で提供される。実施形態によっては、ポリメラーゼ酵素は、０．８Ｕ／μＬの濃度で提供される。
【0009】
実施形態によっては、補因子は、マグネシウム塩またはマンガン塩である。実施形態によっては、補因子は、マンガン塩である。実施形態によっては、マンガン塩は、ＭｎＣｌ２である。実施形態によっては、補因子は、３ｍＭ～８ｍＭ（例えば、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、またはそれらの間の範囲）の濃度で提供される。実施形態によっては、補因子は、４ｍＭの濃度で提供される。
【0010】
実施形態によっては、逆転写時間は、２分以下である。実施形態によっては、逆転写時間は、３０秒以下である。実施形態によっては、逆転写時間は、１２秒以下である。実施形態によっては、逆転写時間は、５秒以下である。実施形態によっては、逆転写時間は、１秒以下である。
【0011】
実施形態によっては、逆転写工程は、６４～７２℃（例えば、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、またはそれらの間の範囲）の温度で起こる。実施形態によっては、逆転写工程は、６８℃の温度で起こる。実施形態によっては、各熱変性工程は、９１～９９℃（例えば、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、またはそれらの間の範囲）で１秒間行われる。実施形態によっては、各アニーリング工程は、６４～７２℃（例えば、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、またはそれらの間の範囲）で４秒間行われる。実施形態によっては、各熱変性工程は、９５℃で１秒間行われ、各アニーリング工程は、６８℃で４秒間行われる。実施形態によっては、熱サイクルプロトコルは、少なくとも３０回（例えば、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回、５５回、６０回、またはそれ以上、またはそれらの間の範囲）の増幅サイクルを含む。実施形態によっては、熱サイクルプロトコルは、４０回の増幅サイクルを含む。
【0012】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ＭＳ２ＲＴ－ｑＰＣＲのＲＴ時間を変化させた場合のＣｑの箱ひげ図であり、単位は秒である。反復数をグラフに示す。
〔図１〕ＭＳ２ＲＴ－ｑＰＣＲのＲＴ時間を変化させた場合のＣｑの箱ひげ図であり、単位は秒である。反復数をグラフに示す。
【0013】
〔図２〕Ｍｇ２＋補因子またはＭｎ２＋補因子いずれかを用いて増幅させたＭＳ２ＲＮＡの増幅曲線。
【0014】
〔図３〕Ｍｇ２＋補因子またはＭｎ２＋補因子いずれかを用いた、閉じたＨＣＶ ｃＤＮＡ及びプラスミドからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡを含有するプラスミドの増幅曲線。
【0015】
〔発明を実施するための形態〕
定義
本明細書中記載されるものと同様または同等である任意の方法及び材料が、本明細書中記載される実施形態の実施または試験に使用可能であるものの、一部の好適な方法、組成物、装置、及び材料について、本明細書中記載する。しかしながら、本発明の材料及び方法を記載する前に、当然のことながら本発明は、本明細書中記載される特定の分子、組成物、方法、またはプロトコルに限定されず、それらは、常用実験及び最適化に従って変更可能である。同じく当然のことながら、説明で使用される用語は、特定の形態または実施形態を説明することのみを目的とし、本明細書中記載される実施形態の範囲を限定することを意図しない。
定義
本明細書中記載されるものと同様または同等である任意の方法及び材料が、本明細書中記載される実施形態の実施または試験に使用可能であるものの、一部の好適な方法、組成物、装置、及び材料について、本明細書中記載する。しかしながら、本発明の材料及び方法を記載する前に、当然のことながら本発明は、本明細書中記載される特定の分子、組成物、方法、またはプロトコルに限定されず、それらは、常用実験及び最適化に従って変更可能である。同じく当然のことながら、説明で使用される用語は、特定の形態または実施形態を説明することのみを目的とし、本明細書中記載される実施形態の範囲を限定することを意図しない。
【0016】
特に定義されない限り、本明細書中使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先されることになる。したがって、本明細書中記載される実施形態の文脈において、以下の定義が適用される。
【0017】
本明細書及び添付の特許請求の範囲中使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明白に特に指定されない限り、複数についての言及を含む。すなわち、例えば、「１種のペプチド両親媒性物質（ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という言及は、１種または複数のペプチド両親媒性物質及び当業者に既知であるその等価物についての言及であるといった具合である。
【0018】
本明細書中使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語及びそれが変化した語形は、列挙される特長（複数可）、要素（複数可）、方法工程（複数可）などが存在することを示すが、さらなる特長（複数可）、要素（複数可）、方法工程（複数可）などが存在することを排除しない。反対に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語及びそれが変化した語形は、列挙される特長（複数可）、要素（複数可）、方法工程（複数可）などが存在することを示すとともに、通常付随する不純物を除いて、あらゆる列挙されない特長（複数可）、要素（複数可）、方法工程（複数可）などが存在することを排除する。「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語句は、列挙される特長（複数可）、要素（複数可）、方法工程（複数可）などが存在することを示すとともに、組成物、システム、または方法の基本的性質に実質的に影響しない任意のさらなる特長（複数可）、要素（複数可）、方法工程（複数可）などが存在することを示す。本明細書中の多くの実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という非限定語を用いて記載される。そのような実施形態は、複数の限定された「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」実施形態を包含し、これらの限定された実施形態は、代替的に当該言語を用いて特許請求されるまたは記載される場合がある。
【0019】
本明細書中使用される場合、「分析する」という用語及びそれと等価な言語は、試料あるいはその１種または複数の構成要素を特性決定するために取られる任意の工程を示す。分析工程の例として、例えば、試料構成要素（例えば、標的核酸）の定量、試料構成要素の配列決定などが挙げられる。
【0020】
本明細書中使用される場合、「調製する」という用語及びそれと等価な言語は、例えば、その後の分析工程または検出工程で使用するために、試料あるいはその１種または複数の構成要素を改変するために取られる任意の工程を示す。試料調製工程の例として、例えば、試料の希釈または濃縮、試料構成要素の単離または精製、試料の加熱または冷却、試料構成要素（例えば、核酸）の増幅、試料構成要素の標識化などが挙げられる。
【0021】
本明細書中使用される場合、「試料」及び「検体」という用語は、同義で及びそれらの最も広義において使用される。１つの意味において、試料は、生物学的試料及び環境試料だけでなく、任意の試料源から得られた検体または培養物を含むことを意味する。生物学的試料は、動物（ヒトを含む）か得られる場合があり、流体、固体、組織、及び気体を包含する。生物学的試料として、血液産物、例えば、血漿、血清、糞便、尿などが挙げられる。環境試料として、環境物質、例えば、表面物質、土壌、泥、汚泥、バイオフィルム、水、及び産業試料などが挙げられる。しかしながら、これらの例は、本発明を適用することができる試料の種類を限定するものと解釈されるべきではない。
【0022】
「システム」という用語は、本明細書中使用される場合、特定の目的のため任意の適切な様式でひとまとまりにグループ化された（例えば、物理的に会合している；液体的、電子的、またはデータ的に連通している；一緒にパッケージ化されている、など）組成物、装置、物品、材料などの集合を示す。
【0023】
詳細な説明
本明細書中提供されるのは、試料中の標的ＲＮＡを検出する方法である。本明細書中記載される方法は、逆転写用に１種類の酵素及びポリメラーゼ連鎖反応用に１種類の酵素というのではなく、単一酵素を用いた迅速な転写及びポリメラーゼ連鎖反応を可能にする。本方法は、試料、増幅試薬、ならびにＲＮＡ及びＤＮＡ両依存性ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を含有する反応混合物を用意すること；逆転写時間（例えば、５分間以下）の間インキュベートすることにより、ＲＮＡからＤＮＡへと逆転写すること；ならびに複数の増幅サイクルを含む熱サイクルプロトコルを行うことによりＤＮＡを増幅させることであって、ただし、各増幅サイクルは、少なくとも熱変性工程及びアニーリング工程を含む、増幅させること、を含む。
本明細書中提供されるのは、試料中の標的ＲＮＡを検出する方法である。本明細書中記載される方法は、逆転写用に１種類の酵素及びポリメラーゼ連鎖反応用に１種類の酵素というのではなく、単一酵素を用いた迅速な転写及びポリメラーゼ連鎖反応を可能にする。本方法は、試料、増幅試薬、ならびにＲＮＡ及びＤＮＡ両依存性ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を含有する反応混合物を用意すること；逆転写時間（例えば、５分間以下）の間インキュベートすることにより、ＲＮＡからＤＮＡへと逆転写すること；ならびに複数の増幅サイクルを含む熱サイクルプロトコルを行うことによりＤＮＡを増幅させることであって、ただし、各増幅サイクルは、少なくとも熱変性工程及びアニーリング工程を含む、増幅させること、を含む。
【0024】
ａ．反応混合物
任意の適切なＰＣＲ試薬を、反応混合物に使用することができる。適切なＰＣＲ試薬として、水、緩衝液、ｄＮＴＰ、プライマー、対照物、触媒、開始剤、プロモーター、補因子、塩、キレート化剤、プローブ、蛍光色素、及びそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、反応混合物は、増幅試薬を含有することができる。増幅試薬として、ｄＮＴＰ、緩衝液、補因子、及び試料中の標的ＲＮＡを増幅するように構成されたオリゴヌクレオチドプライマーを挙げることができる。
任意の適切なＰＣＲ試薬を、反応混合物に使用することができる。適切なＰＣＲ試薬として、水、緩衝液、ｄＮＴＰ、プライマー、対照物、触媒、開始剤、プロモーター、補因子、塩、キレート化剤、プローブ、蛍光色素、及びそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、反応混合物は、増幅試薬を含有することができる。増幅試薬として、ｄＮＴＰ、緩衝液、補因子、及び試料中の標的ＲＮＡを増幅するように構成されたオリゴヌクレオチドプライマーを挙げることができる。
【0025】
「プライマー」及び「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、本明細書中同義で使用される。一般に、プライマーとは、長いテンプレートと相補的な、それより短い核酸である。複製中、プライマーは、テンプレート配列に基づいて延長され、テンプレートの相補的コピーであるそれより長い核酸を生成することができる。延長は、個別ヌクレオチドの連続付加（例えば、ポリメラーゼの作用により）により起こすことができる。プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体（例えば、人工核酸）、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。プライマーは、任意の適切な長さを有することができる。例えば、プライマーは、少なくとも１０ヌクレオチドである場合がある。例えば、プライマーは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０ヌクレオチドである場合がある。例示プライマーは、化学合成されたものである。
【0026】
オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも１つの核酸標的を増幅するための少なくとも１対のプライマーとして供給することができる。例えば、１対のプライマーは、得られるアンプリコンの対向する末端（したがって、その長さ）を集団で定義するフォワードプライマー（すなわちセンスプライマー）及びリバースプライマー（すなわちアンチセンスプライマー）である場合がある。任意の適切なプライマー濃度を使用することができる。実施形態によっては、オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも６μＭの濃度で提供される。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１１μＭ、または少なくとも１２μＭの濃度で提供される場合がある。実施形態によっては、オリゴヌクレオチドプライマーは、１２μＭの濃度で提供される。
【0027】
ポリメラーゼ酵素は、ＲＮＡ及びＤＮＡ両依存性ポリメラーゼ活性を有する任意の適切な酵素であってもよい。ＲＮＡ及びＤＮＡ両依存性ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素は、市販されているポリメラーゼでもよい（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄ．；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｖｅｒｌｅｙ， Ｍａｓｓ．；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．， Ｎｏｒｗａｌｋ， Ｃｏｎｎ．；Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．；Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， Ｃａｌｉｆ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆ．製）。例えば、ポリメラーゼ酵素は、ＨａｗｋＺ０５ Ｆａｓｔポリメラーゼであってもよい。任意の適切なポリメラーゼ酵素濃度を使用することができる。実施形態によっては、ポリメラーゼ酵素は、少なくとも０．４Ｕ／μＬの濃度で提供される場合がある。例えば、ポリメラーゼ酵素は、少なくとも０．４Ｕ／μＬ、少なくとも０．５Ｕ／μＬ、少なくとも０．６Ｕ／μＬ、少なくとも０．７Ｕ／μＬ、または少なくとも０．８Ｕ／μＬの濃度で提供される場合がある。実施形態によっては、ポリメラーゼ酵素は、０．８Ｕ／μＬの濃度で提供される。
【0028】
実施形態によっては、ポリメラーゼは、ＤＮＡ及びＲＮＡ両依存性ポリメラーゼ活性を有する。実施形態によっては、ポリメラーゼは、ホットスタートＰＣＲに適合性がある。実施形態によっては、ポリメラーゼは、ホットスタートＰＣＲを可能にするアプタマー／酵素システムの一部である（例えば、ポリメラーゼは、域値より低い温度では不活化している）。実施形態によっては、Ｔｈｅｒｍｕｓ属の種Ｚ０５由来のポリメラーゼが提供される。
【0029】
補因子は、使用されるポリメラーゼ酵素に適した任意の補因子であってもよい。例えば、補因子は、マグネシウム塩の場合がある。例えば、マグネシウム塩は、ＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４の場合がある。別の例として、補因子は、マンガン塩の場合がある。例えば、マンガン塩は、ＭｎＣｌ２またはＭｎＳＯ４の場合がある。任意の適切な補因子濃度を使用することができる。実施形態によっては、補因子は、３ｍＭ～８ｍＭの濃度で提供される。例えば、補因子は、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、または８ｍＭの濃度で提供される場合がある。実施形態によっては、補因子は、４ｍＭの濃度で提供される。
【0030】
本明細書中提供される実施形態に従って、ＰＣＲ試薬は、１種または複数のプローブ、または少なくとも１つの標識、例えば少なくとも１種の色素が接続された任意の核酸も含むことができる。プローブは、核酸標的及び／またはアンプリコンの配列特異的結合パートナーである場合がある。プローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づき標的増幅の検出を可能にするように設計されている場合があり、お互いに接近したときに集団で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を呈する１対の色素が接続された１つまたは複数の核酸を含む。１対の色素は、とりわけ、第一エミッター及び第二エミッター、またはエミッター及びクエンチャーを提供する場合がある。１対の色素からの蛍光発光は、プライマー延長中にプローブ切断によるなどして色素がお互いに離れたとき（例えば、ＴＡＱＭＡＮプローブを用いる５’ヌクレアーゼアッセイなど）、またはプローブがアンプリコンとハイブリダイズしたとき（例えば、分子ビーコンプローブ）に変化する。プローブの核酸部分は、任意の適切な構造または起源を有することができ、例えば、この部分は、ロックド核酸、普遍的プローブライブラリーの一員などであることが可能である。他の場合では、プローブとプライマー対のプライマーの一方が、同一分子中で組み合わされている場合がある。例えば、プライマープローブ分子は、その３’末端にプライマー配列を、及び５’末端に分子ビーコン型プローブを有する場合がある。この配置を用いて、異なる色素で標識化された関連プライマープローブ分子を、同一リバースプライマーを用いる多重化アッセイに使用して、１つのヌクレオチドが異なる標的配列（一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ））を定量することができる。
【0031】
ｂ．逆転写
逆転写は、試料中に存在するＲＮＡテンプレートから相補ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を生成させるプロセスを示す。本明細書中記載される方法は、ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡ産物を生成させるのに短いインキュベーション時間を必要とする。詳細には、開示される方法は、逆転写時間（例えば、５分間以下）の間インキュベートすることにより、ＲＮＡからＤＮＡへと逆転写することを含む。例えば、逆転写時間は、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、９０秒以下、６０秒以下、３０秒以下、１５秒以下、１２秒以下、１０秒以下、８秒以下、５秒以下、または１秒以下の場合がある。実施形態によっては、逆転写時間は、０秒である。
逆転写は、試料中に存在するＲＮＡテンプレートから相補ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を生成させるプロセスを示す。本明細書中記載される方法は、ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡ産物を生成させるのに短いインキュベーション時間を必要とする。詳細には、開示される方法は、逆転写時間（例えば、５分間以下）の間インキュベートすることにより、ＲＮＡからＤＮＡへと逆転写することを含む。例えば、逆転写時間は、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、９０秒以下、６０秒以下、３０秒以下、１５秒以下、１２秒以下、１０秒以下、８秒以下、５秒以下、または１秒以下の場合がある。実施形態によっては、逆転写時間は、０秒である。
【0032】
逆転写工程は、使用されるポリメラーゼ酵素に応じて任意の適切な温度で起こすことができる。実施形態によっては、逆転写工程は、逆転写法に典型的に使用される温度に比べて高温で行われる。例えば、ＨａｗｋＺ０５ Ｆａｓｔポリメラーゼは、５５℃未満では酵素活性が阻止されるアプタマーとともに販売されている。したがって、ＨａｗｋＺ０５ Ｆａｓｔポリメラーゼを使用する方法の場合、逆転写工程は、５５℃を超える温度で行われる。実施形態によっては、逆転写工程は、６０～７０℃の温度で行われる場合がある。例えば、逆転写工程は、５５℃超、６０℃超、または６５℃超の温度で起こる場合がある。実施形態によっては、逆転写工程は、６８℃の温度で起こる。他のポリメラーゼは、逆転写工程に代替温度を必要とする場合がある。
【0033】
ある種のＲＮＡ標的は、ＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ反応物に加える前に、ＲＮＡを先行して熱変性させる必要がある。例えば、ロタウイルスの熱変性またはＣ型肝炎ウイルスで見られるＲＮＡ二次構造の熱変性は、一般的に使用される逆転写酵素の最適温度範囲より相当高い融解温度を必要とする。この結果、逆転写ポリメラーゼ酵素の熱変性がもたらされる。例えば、Ｍａｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素またはトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素などの一般的に使用される逆転写酵素は、最適温度範囲が３７～４２℃である。したがって、ロタウイルスまたはＣ型肝炎などの標的は、予備ＲＮＡ熱変性工程、すなわち、１段階密閉カートリッジ設計に適合しないプロセスを必要とする。対照的に、本明細書中記載される方法は、逆転写工程が、６０～７０℃の範囲などの高温範囲で来なわれることを可能にする。これにより、予備ＲＮＡ熱変性を必要とせずに、ＲＮＡ標的の逆転写及び続く検出が可能になる。
【0034】
ｃ．ＤＮＡ増幅
ＰＣＲ反応には、一般に、増幅プロセス、すなわち複製が経時的に繰り返し起こることでテンプレート分子の少なくとも１セグメントのコピーが複数形成される反応も関与する。一般に、増幅は、複製ラウンドを連続して達成するために、加熱と冷却を交互に行うサイクル（すなわち、熱サイクル）に頼る。
ＰＣＲ反応には、一般に、増幅プロセス、すなわち複製が経時的に繰り返し起こることでテンプレート分子の少なくとも１セグメントのコピーが複数形成される反応も関与する。一般に、増幅は、複製ラウンドを連続して達成するために、加熱と冷却を交互に行うサイクル（すなわち、熱サイクル）に頼る。
【0035】
本明細書中開示される方法は、複数の増幅サイクルを含む熱サイクルプロトコルを行うことにより、ＤＮＡを増幅させることを含む。増幅は、上記のとおりの任意の適切な試薬を用いて行うことができる。各増幅サイクルは、少なくとも熱変性工程及びアニーリング工程を含む。例えば、各増幅サイクルは、２つ以上の温度設定点、例えば、高温側の溶融（熱変性）温度及び低温側のアニーリング／延長温度の間を行き来する場合がある。他の実施形態において、各増幅サイクルは、３つ以上の温度設定点、例えば、高温側の溶融温度、低温側のアニーリング温度、及び中間の延長温度の間を行き来する場合がある。
【0036】
増幅サイクルの各工程について任意の適切な温度及び期間を使用することができる。一般に、各熱変性工程は、９１～９８℃の温度で行われる。例えば、各熱変性工程は、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、または９８℃で行われる場合がある。実施形態によっては、各熱変性工程は、９５℃で行われる。実施形態によっては、各熱変性工程は、２０秒間未満行われる場合がある。例えば、各熱変性工程は、２０秒間未満、１０秒間未満、５秒間未満、４秒間未満、３秒間未満、２秒間未満、または１秒間未満行われる場合がある。実施形態によっては、各熱変性工程は、９５℃で１秒間行われる。
【0037】
適切なアニーリング温度は、プライマー対に依存し、一般に４５～７０℃で行われる場合がある。例えば、各アニーリング工程は、４５℃、５０℃、５５℃、５８℃、６０℃、６５℃、または６８℃の温度で行われる場合がある。各アニーリング工程は、２０秒間未満行われる場合がある。例えば、各アニーリング工程は、２０秒間未満、１０秒間未満、５秒間未満行われる場合がある。実施形態によっては、各アニーリング工程は、６８℃で４秒間行われる。
【0038】
実施形態によっては、熱サイクルプロトコルは、複数の増幅サイクルを行う前に、初期高温保持期（例えば９５℃）を含む場合がある。例えば、熱サイクルプロトコルは、９５℃で２分間以下の初期高温保持期を含む場合がある。実施形態によっては、熱サイクルプロトコルは、９５℃で２分間、９０秒間、１分間、３０秒間、または１５秒間の初期保持期を含む場合がある。
【0039】
増幅は、進行するにつれて、コピー数の指数関数的または直線的増加をもたらすことができる。典型的な増幅は、コピー数及び／またはシグナルの１，０００倍を超える増大をもたらす。増幅サイクルを任意の適切な回数行なって、所望のシグナルを生成させることができる。例えば、熱サイクルプロトコルは、少なくとも３０回の増幅サイクルを含む場合がある。実施形態によっては、熱サイクルプロトコルは、４０回の増幅サイクルを含む。
【0040】
ｄ．装置
開示される方法は、任意の適切な装置を用いて行うことができる。例えば、開示されるＲＴ－ｑＰＣＲ法を行うのに適した装置は、試料容器、第一温度帯、第二温度帯、及び輸送機構を備える場合がある。輸送機構は、試料容器を、第一温度帯と第二温度帯の間で物理的に移動させる。試料容器は、液体試料を含有することができるウェルであってもよい。あるいは、試料容器は、液体試料を吸着することができる多孔質材料であってもよい。各温度帯は、温度帯内で固定された温度を維持する温度レギュレータを備える場合がある。実施形態によっては、適切な装置は、さらに、検出帯、例えば、蛍光光度計を備える検出帯を備える。実施形態によっては、温度帯の一方または両方ともが、検出帯である場合がある。装置の例は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３４４４３号に開示されており、この全内容は、本明細書中参照として援用される。
開示される方法は、任意の適切な装置を用いて行うことができる。例えば、開示されるＲＴ－ｑＰＣＲ法を行うのに適した装置は、試料容器、第一温度帯、第二温度帯、及び輸送機構を備える場合がある。輸送機構は、試料容器を、第一温度帯と第二温度帯の間で物理的に移動させる。試料容器は、液体試料を含有することができるウェルであってもよい。あるいは、試料容器は、液体試料を吸着することができる多孔質材料であってもよい。各温度帯は、温度帯内で固定された温度を維持する温度レギュレータを備える場合がある。実施形態によっては、適切な装置は、さらに、検出帯、例えば、蛍光光度計を備える検出帯を備える。実施形態によっては、温度帯の一方または両方ともが、検出帯である場合がある。装置の例は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３４４４３号に開示されており、この全内容は、本明細書中参照として援用される。
【0041】
ｅ．キット
本明細書中記載されるＰＣＲ試薬は、試料中の標的ＲＮＡを迅速検出するためのキットに組み込まれている場合がある。例えば、開示される構成要素は、迅速な臨床診断のための、例えば、試料中のウイルスＲＮＡを検出するための、キットに組み込まれている場合がある。適切なキットは、試料中の任意の所望ＲＮＡを検出するための任意の適切なプライマー及び／またはプローブを含有する場合がある。例えば、キットは、ＲＮＡの熱変性に高温（例えば６０～７０℃）を必要とするウイルスＲＮＡ検出に適切な構成要素を含む場合がある。そのようなキットは、先行するＲＮＡ熱変性工程を必要とせずに、ロタウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスなどのＲＮＡ標的の迅速な逆転写及び増幅を可能にすると思われる。実施形態によっては、キットは、試料中の標的ＲＮＡを検出するための単一密閉カートリッジ中に、適切なＰＣＲ試薬を含むことができる。
本明細書中記載されるＰＣＲ試薬は、試料中の標的ＲＮＡを迅速検出するためのキットに組み込まれている場合がある。例えば、開示される構成要素は、迅速な臨床診断のための、例えば、試料中のウイルスＲＮＡを検出するための、キットに組み込まれている場合がある。適切なキットは、試料中の任意の所望ＲＮＡを検出するための任意の適切なプライマー及び／またはプローブを含有する場合がある。例えば、キットは、ＲＮＡの熱変性に高温（例えば６０～７０℃）を必要とするウイルスＲＮＡ検出に適切な構成要素を含む場合がある。そのようなキットは、先行するＲＮＡ熱変性工程を必要とせずに、ロタウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスなどのＲＮＡ標的の迅速な逆転写及び増幅を可能にすると思われる。実施形態によっては、キットは、試料中の標的ＲＮＡを検出するための単一密閉カートリッジ中に、適切なＰＣＲ試薬を含むことができる。
【0042】
〔実施例〕
実施例１
ファストＲＴ－ｑＰＣＲアッセイ
方法
ＨａｗｋＺ０５ Ｆａｓｔポリメラーゼは、ファストＲＴ－ｑＰＣＲアッセイとして市販されている。製造元は、ＲＴ工程を２～５分間行うことを推奨している（４）。より高いレベルのプライマー及び酵素を含む反応条件がＲＴ－ｑＰＣＲアッセイにどのように影響を及ぼすかを試験した。驚いたことに、ＲＴ時間が、５分、２分、３０秒、１２秒、及び５秒だった場合に非常によく似たＣｑが測定された。Ｂｅｃｋ， ｅｔ ａｌ．（５）を応用したＭＳ２ ＲＴ－ｑＰＣＲプライマー及びプローブを用いて、ＭＳ２バクテリオファージから抽出したＲＮＡを増幅した。ＰＣＲデータは、ＬｉｎＲｅｇＰＣＲ（６、７）を用いて分析した。試作機器を用いて、１５μｌの試料でＲＴ－ｑＰＣＲを行なった。ＲＴ工程は、０秒から５分まで６８℃、９５℃で１５秒保持、次いで９５℃で１秒間及び６８℃で４秒間のサイクルを４０回行った。
実施例１
ファストＲＴ－ｑＰＣＲアッセイ
方法
ＨａｗｋＺ０５ Ｆａｓｔポリメラーゼは、ファストＲＴ－ｑＰＣＲアッセイとして市販されている。製造元は、ＲＴ工程を２～５分間行うことを推奨している（４）。より高いレベルのプライマー及び酵素を含む反応条件がＲＴ－ｑＰＣＲアッセイにどのように影響を及ぼすかを試験した。驚いたことに、ＲＴ時間が、５分、２分、３０秒、１２秒、及び５秒だった場合に非常によく似たＣｑが測定された。Ｂｅｃｋ， ｅｔ ａｌ．（５）を応用したＭＳ２ ＲＴ－ｑＰＣＲプライマー及びプローブを用いて、ＭＳ２バクテリオファージから抽出したＲＮＡを増幅した。ＰＣＲデータは、ＬｉｎＲｅｇＰＣＲ（６、７）を用いて分析した。試作機器を用いて、１５μｌの試料でＲＴ－ｑＰＣＲを行なった。ＲＴ工程は、０秒から５分まで６８℃、９５℃で１５秒保持、次いで９５℃で１秒間及び６８℃で４秒間のサイクルを４０回行った。
【0043】
反応組成物
ＲＴ－ｑＰＣＲ反応組成物は、以下を含むものであった：
１０％グリセロール（ＡＣＲＯＳ）
０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｐｉｅｒｃｅ）
１５０ｍＭのトレハロース（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
６ｍｇ／ｍｌの超純水ＢＳＡ（Ａｍｂｉｏｎ）
６５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
６２．４ｍＭのビシン／ＫＯＨ ｐＨ８．０（ＵＳＢ）
６５ｍＭのグルタミン酸カリウム（Ｓｉｇｍａ）
０．４ｍＭのｄＮＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
４．０ｍＭのＭｎＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）
１２μＭのＭＳ２フォワードプライマー及びリバースプライマー混合物（ＩＤＴ；以下の配列を参照）
５００ｎＭのＭＳ２ ＦＡＭ標識化加水分解プローブ（ＩＤＴ；以下の配列を参照）
０．８Ｕ／μＬのＨａｗｋＺ０５ Ｆａｓｔポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｃｕｓｔｏｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
Ｄｙｎａｌ ＭｙＯｎｅ Ｓｉｌａｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりＭＳ２バクテリオファージ（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ ０８１００６６）から単離されたＭＳ２ ＲＮＡ約５０００コピー
フォワードプライマー：５’－ａｇｇ ｔｃｇ ｇｔａ ｃｔａ ａｃａ ｔｃａ ａｇｔ－３’
リバースプライマー：５’－ｇａｔ ａｔｇ ｔｔｇ ｃａｃ ｇｔｔ ｇｔｃ ｔｇｇ ａ－３’
加水分解プローブ：５’－／５６－ＦＡＭ／ｃｇｔ ｃｔｇ ｔｃｇ／ｚｅｎ／ｔａｔ ｃｃａ ｇｃｔ ｇｃａ ａａｃ ｔ／３ＩＡＢｋＦＱ－３’
結果
ＲＴの長さが５秒から５分（３００秒）までのＲＴ－ｑＰＣＲアッセイで測定されたＣｑに違いはなかった（図１）。６８℃で０秒しか保持しなかった場合でさえも、顕著なＲＴ活性を観察することができる。しかしながら、平均１２秒のＲＴと０秒のＲＴの間の差は、１．４Ｃｑであった。これは、ｃＤＮＡの収率が約２．５～３倍少ないことに相当する。
ＲＴ－ｑＰＣＲ反応組成物は、以下を含むものであった：
１０％グリセロール（ＡＣＲＯＳ）
０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｐｉｅｒｃｅ）
１５０ｍＭのトレハロース（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
６ｍｇ／ｍｌの超純水ＢＳＡ（Ａｍｂｉｏｎ）
６５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
６２．４ｍＭのビシン／ＫＯＨ ｐＨ８．０（ＵＳＢ）
６５ｍＭのグルタミン酸カリウム（Ｓｉｇｍａ）
０．４ｍＭのｄＮＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
４．０ｍＭのＭｎＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）
１２μＭのＭＳ２フォワードプライマー及びリバースプライマー混合物（ＩＤＴ；以下の配列を参照）
５００ｎＭのＭＳ２ ＦＡＭ標識化加水分解プローブ（ＩＤＴ；以下の配列を参照）
０．８Ｕ／μＬのＨａｗｋＺ０５ Ｆａｓｔポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｃｕｓｔｏｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
Ｄｙｎａｌ ＭｙＯｎｅ Ｓｉｌａｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりＭＳ２バクテリオファージ（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ ０８１００６６）から単離されたＭＳ２ ＲＮＡ約５０００コピー
フォワードプライマー：５’－ａｇｇ ｔｃｇ ｇｔａ ｃｔａ ａｃａ ｔｃａ ａｇｔ－３’
リバースプライマー：５’－ｇａｔ ａｔｇ ｔｔｇ ｃａｃ ｇｔｔ ｇｔｃ ｔｇｇ ａ－３’
加水分解プローブ：５’－／５６－ＦＡＭ／ｃｇｔ ｃｔｇ ｔｃｇ／ｚｅｎ／ｔａｔ ｃｃａ ｇｃｔ ｇｃａ ａａｃ ｔ／３ＩＡＢｋＦＱ－３’
結果
ＲＴの長さが５秒から５分（３００秒）までのＲＴ－ｑＰＣＲアッセイで測定されたＣｑに違いはなかった（図１）。６８℃で０秒しか保持しなかった場合でさえも、顕著なＲＴ活性を観察することができる。しかしながら、平均１２秒のＲＴと０秒のＲＴの間の差は、１．４Ｃｑであった。これは、ｃＤＮＡの収率が約２．５～３倍少ないことに相当する。
【0044】
驚いたことに、０秒のＲＴをファストＰＣＲサイクル条件と組み合わせた場合も、生成物をもたらした。Ｚ０５の第一選択補因子は、ＰＣＲにはＭｇ２＋であり、ＲＴ－ＰＣＲにはＭｎ２＋である。したがって、０秒ＲＴで観察されたＣｑの原因が混入ファージＤＮＡであるかどうかを試験するため、ＭＳ２ ＲＮＡを、Ｍｇ２＋補因子を用いて増幅させ、Ｍｎ２＋補因子の結果と比較した。Ｍｎ２＋補因子反応のＰＣＲ曲線は、Ｍｇ２＋補因子反応より約６サイクル早く、バックグラウンドから立ち上がった（図２）。増幅のこの違いは、ＲＴ工程中に生成したｃＤＮＡの量が約２桁異なることに相当する。テンプレートを含まない対照反応（ＮＴＣ）で増幅がなかったことは、試薬にＭＳ２ ＤＮＡが混入していなかったことを実証する。
【0045】
同様な試験を、Ｃ型肝炎ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを用いて行なった。このＲＮＡは、転写プロトコルの一部としてＤＮＡアーゼＩで処理されていた（ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔキット、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＤＮＡ Ｍｎ２＋は、Ｍｎ２＋補因子がＰＣＲアッセイに受け入れ可能であることを実証するための陽性対照である。その他の２つの曲線は、補因子としてＭｎ２＋を用いて増幅させたＲＮＡが、補因子としてＭｇ２＋を用いた反応より非常に早くから視認できるほど増幅すること、及び推定Ｃｑは、補因子としてＭｎ２＋を用いたＲＮＡの収率パーセントの比として８～１０離れていると思われることを示す。
【0046】
当然のことながら、上記の詳細な説明及び付随する実施例は、例示にすぎず、本開示の範囲にかけられる制限として受け取られるべきではない。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物によってのみ定義される。
【0047】
開示される実施形態に対する様々な変更及び修飾が、当業者に明らかである。そのような変更及び修飾は、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成、配合物、または本開示の使用法に関連するものに限定されないが、それらも含めて、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、行うことができる。
【0048】
本明細書中参照されるあらゆる特許及び刊行物は、そのまま全体が、本明細書中参照として援用される。
【0049】
参照
以下の参照は、一部が上記に引用されているが、そのまま全体が、本明細書中参照として援用される。
１． Ｆａｒｒａｒ ＪＳ， Ｗｉｔｔｗｅｒ ＣＴ． Ｅｘｔｒｅｍｅ ＰＣＲ： ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ １５－６０ ｓｅｃｏｎｄｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０１５；６１（１）：１４５－５３．
２． Ｗｉｔｔｗｅｒ ＣＴ， Ｈｏｕｓｋｅｅｐｅｒ ＪＡ， Ｍｙｅｒｓ Ｂｉｇｅｌ ＰＡ， ｉｎｖｅｎｔｏｒｓ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ａｓｓｉｇｎｅｅ． Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ２０１７ １１ Ｍａｙ ２０１７．
３． Ｍｉｊａｔｏｖｉｃ－Ｒｕｓｔｅｍｐａｓｉｃ Ｓ， Ｔａｍ ＫＩ， Ｋｅｒｉｎ ＴＫ， Ｌｅｗｉｓ ＪＭ， Ｇａｕｔａｍ Ｒ， Ｑｕａｙｅ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ Ａ ｂｙ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｔｅｃｅｄｅｎｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ－ＲＮＡ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１３；５１（９）：３０４７－５４．
４． Ｎａｋｅｒａｋａｎｔｉ Ｓ， Ｓａｍｍｅｔａ Ｎ． Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ ＨａｗｋＺ０５ Ｆａｓｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ． Ｉｎ： Ｂｉｏｔｅｃｈ ＲＣ， ｅｄｉｔｏｒ． ２０１８．
５． Ｂｅｃｋ ＥＴ， Ｊｕｒｇｅｎｓ ＬＡ， Ｋｅｈｌ ＳＣ， Ｂｏｓｅ ＭＥ， Ｐａｔｉｔｕｃｃｉ Ｔ， ＬａＧｕｅ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒａｐｉｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ， ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ， ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ Ａ／Ｂ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ２００９ Ｈ１Ｎ１ ｓｗｉｎｅ－ｏｒｉｇｉｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｉｎ Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ： ＪＭＤ． ２０１０；１２（１）：７４－８１．
６． Ｒａｍａｋｅｒｓ Ｃ， Ｒｕｉｊｔｅｒ ＪＭ， Ｄｅｐｒｅｚ ＲＨ， Ｍｏｏｒｍａｎ ＡＦ． Ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＰＣＲ） ｄａｔａ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｌｅｔｔｅｒｓ． ２００３；３３９（１）：６２－６．
７． Ｒｕｉｊｔｅｒ ＪＭ， Ｒａｍａｋｅｒｓ Ｃ， Ｈｏｏｇａａｒｓ ＷＭ， Ｋａｒｌｅｎ Ｙ， Ｂａｋｋｅｒ Ｏ， ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｆｆ ＭＪ， ｅｔ ａｌ． Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ： ｌｉｎｋｉｎｇ ｂａｓｅｌｉｎｅ ａｎｄ ｂｉａｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｄａｔａ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２００９；３７（６）：ｅ４５．
以下の参照は、一部が上記に引用されているが、そのまま全体が、本明細書中参照として援用される。
１． Ｆａｒｒａｒ ＪＳ， Ｗｉｔｔｗｅｒ ＣＴ． Ｅｘｔｒｅｍｅ ＰＣＲ： ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ １５－６０ ｓｅｃｏｎｄｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０１５；６１（１）：１４５－５３．
２． Ｗｉｔｔｗｅｒ ＣＴ， Ｈｏｕｓｋｅｅｐｅｒ ＪＡ， Ｍｙｅｒｓ Ｂｉｇｅｌ ＰＡ， ｉｎｖｅｎｔｏｒｓ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ａｓｓｉｇｎｅｅ． Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ２０１７ １１ Ｍａｙ ２０１７．
３． Ｍｉｊａｔｏｖｉｃ－Ｒｕｓｔｅｍｐａｓｉｃ Ｓ， Ｔａｍ ＫＩ， Ｋｅｒｉｎ ＴＫ， Ｌｅｗｉｓ ＪＭ， Ｇａｕｔａｍ Ｒ， Ｑｕａｙｅ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ Ａ ｂｙ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｔｅｃｅｄｅｎｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ－ＲＮＡ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１３；５１（９）：３０４７－５４．
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５． Ｂｅｃｋ ＥＴ， Ｊｕｒｇｅｎｓ ＬＡ， Ｋｅｈｌ ＳＣ， Ｂｏｓｅ ＭＥ， Ｐａｔｉｔｕｃｃｉ Ｔ， ＬａＧｕｅ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒａｐｉｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ， ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ， ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ Ａ／Ｂ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ２００９ Ｈ１Ｎ１ ｓｗｉｎｅ－ｏｒｉｇｉｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｉｎ Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ： ＪＭＤ． ２０１０；１２（１）：７４－８１．
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【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】ＭＳ２ＲＴ－ｑＰＣＲのＲＴ時間を変化させた場合のＣｑの箱ひげ図であり、単位は秒である。反復数をグラフに示す。
【図2】Ｍｇ２＋補因子またはＭｎ２＋補因子いずれかを用いて増幅させたＭＳ２ＲＮＡの増幅曲線。
【図3】Ｍｇ２＋補因子またはＭｎ２＋補因子いずれかを用いた、閉じたＨＣＶ ｃＤＮＡ及びプラスミドからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡを含有するプラスミドの増幅曲線。
【図1】
【図2】
【図3】
