特許 7606254 ヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法及びこれにより製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-17

(45)【発行日】2024-12-25

(54)【発明の名称】ヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法及びこれにより製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイド

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20241218BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20241218BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241218BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12N5/0735

C12N5/10

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2023506066

(86)(22)【出願日】2022-03-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-23

(86)【国際出願番号】 KR2022004329

(87)【国際公開番号】W WO2022239959

(87)【国際公開日】2022-11-17

【審査請求日】2023-01-27

(31)【優先権主張番号】10-2021-0060265

(32)【優先日】2021-05-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】518160702

【氏名又は名称】ネクセル カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100082418

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 朔生

(74)【代理人】

【識別番号】100167601

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 信之

(74)【代理人】

【識別番号】100201329

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 真二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100220917

【弁理士】

【氏名又は名称】松本 忠大

(72)【発明者】

【氏名】ウ、ドンフン

(72)【発明者】

【氏名】キム、へジ

(72)【発明者】

【氏名】キム、ミジン

(72)【発明者】

【氏名】イ、ハンビョル

(72)【発明者】

【氏名】イム、ジョンスク

【審査官】戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０６６０５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／１７４８７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Biomaterials，2017年，vol. 142，pp. 112-123

【文献】bioRxiv preprint，2020年，pp.1-25，doi:https://doi.org/10.1101/2020.06.25.171611

【文献】Cells，2020年，vol.9, no.1733，pp.1-19

【文献】Stem Cell Res. Ther.，2021年05月06日，vol.12, no.272，pp.1-10

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８

Ｇｏｏｇｌｅ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ：ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）を培養して直径１００～１３０μｍの胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｂｏｄｙ）を形成するステップＡと、
前記ステップＡで得られた胚様体を直径２００～２５０μｍになるまで培養するステップＢと、
前記ステップＢで得られた直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を、中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体に分化させるステップＣと、
前記ステップＣで分化した中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体を、心筋細胞（Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）、線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）及び血管内皮細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）を含むように自己組織化された心臓オルガノイドに分化させるステップＤと、
前記ステップＤで分化して自己組織化された心臓オルガノイドを培養して成熟化させるステップＥと、を含み、
前記ステップＥの成熟化過程を経て得られた心臓オルガノイドは、心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞が５５～６５：１５～３０：１５の細胞数比で自己組織化され、
前記ステップＣは、
前記ステップＢで得られた直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を、インスリンを含まないＢ－２７サプリメント、ＣＨＩＲ９９０２１、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４：Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－４）及びアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養するステップＣ－１と、
前記ステップＣ－１で培養されたヒト多能性幹細胞由来胚様体を、インスリンを含まないＢ－２７サプリメント、ＸＡＶ９３９、Ｌ－アスコルビン酸（Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養して、中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体に分化させるステップＣ－２と、を含み、
前記ステップＤは、
前記ステップＣで分化した中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体を、インスリンを含まないＢ－２７サプリメント及び濃度４０～６０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養して心筋細胞の分化を誘導するステップＤ－１と、
前記ステップＤ－１で心筋細胞の分化誘導が行われた構成体を、前記ステップＤ－１で用いられたＲＰＭＩ１６４０培地に、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及び濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２）を加えて２日間培養し、線維芽細胞及び血管内皮細胞の分化を誘導するステップＤ－２と、
前記ステップＤ－２で心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞の分化誘導が行われた構成体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度４０～６０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養するステップＤ－３と、
前記ステップＤ－３で培養された構成体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、及び濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養して、分化による心臓オルガノイドの自己組織化を行うステップＤ－４と、を含み、
前記ステップＥは、前記ステップＤ－４で分化して心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞を含むように自己組織化された心臓オルガノイドを、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及びＴＧＦ－βシグナル阻害のための成分として濃度１０～１５ｎｇ／ｍｌのＳＢ４３１５４２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で１０～２０日間培養して成熟化させるステップであることを特徴とする、
ヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法。

【請求項2】

前記ステップＡのヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ：Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）またはヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ：Ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）のうちの少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１に記載のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法。

【請求項3】

前記ステップＡは、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤（Ｙ－２７６３２）が添加されたｍＴｅＳＲ（登録商標）培養液で、ヒト多能性幹細胞をプレーティングして１日間培養し、直径１００～１３０μｍの胚様体を形成するステップであることを特徴とする、請求項２に記載のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法。

【請求項4】

前記ステップＢは、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）が添加されていないｍＴｅＳＲ培養液で、前記ステップＡで得られた直径１００～１３０μｍの胚様体を２～３日間培養して、直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を形成するステップであることを特徴とする、請求項３に記載のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法。

【請求項5】

前記ステップＣ－１は、前記ステップＢで得られた直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を、インスリンを含まないＢ－２７サプリメント、Ｗｎｔシグナル活性化のためのグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ－３β：Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ－３β）阻害剤として濃度６～８μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＢＭＰシグナル活性化のための成分として濃度９～１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、及びトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β）シグナル活性化のための成分として濃度８～１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養するステップであることを特徴とする、請求項１に記載のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法。

【請求項6】

前記ステップＣ－２は、前記ステップＣ－１で培養されたヒト多能性幹細胞由来胚様体を、インスリンを含まないＢ－２７サプリメント、Ｗｎｔシグナル阻害のための成分として濃度８～１２μＭのＸＡＶ９３９、及びＢＭＰシグナル活性化のための成分として濃度４０～６０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養するステップであることを特徴とする、請求項５に記載のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法及びこれにより製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドに関する。

【背景技術】

【0002】

最近の技術の継続的な発展により、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ、ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）からヒトを構成するほとんどの細胞を分化する方法が開発されてきたが、２次元培養により分化させた細胞の場合、成熟度が大幅に低下して実際のヒト細胞に比べて機能が劣るため、これを用いて薬物毒性評価、薬物スクリーニングまたは細胞治療などに活用するには明確な限界がある。

【0003】

そのため、実際のヒトを構成する細胞の成熟度に達して十分な機能を有する細胞を製造するために、様々な細胞分化及び培養関連技術が研究されており、特に、実際の臓器に細胞が単一に存在するのではなく、様々な細胞が集合して存在する形態を再現し、これとともに機能的にも十分に対応できる臓器オルガノイド（Ｏｒｇａｎｏｉｄ）の開発及び研究が世界中で行われている。

【0004】

実際のヒト臓器の構造及び機能を模倣できるオルガノイドの製造は、臓器特異的な幹細胞があるとされる腸や脳などの臓器幹細胞から継続的な細胞分裂及び分化により可能であるが、臓器特異的な幹細胞が存在しない心臓の場合、そのような方法を適用する余地がないため、心臓を構成する様々な細胞をそれぞれ別々に分化させた後に混合して製造する方法が唯一提案されている。

【0005】

これに関連して、心臓オルガノイドを製造するための従来技術に対応する先行文献には、米国公開特許第２０２０－０２８３７３５号公報の「Ｏｒｇａｎｏｉｄ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ」（以下、「従来技術」という）がある。

【0006】

しかし、従来技術を含む既存の心臓オルガノイドの製造方法の場合、分化した心臓構成細胞を単純に混合したり、特定の成分からなる細胞外基質（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）に依存して培養したりする方法にすぎないため、心臓を構成する様々な細胞が発達初期ステップから互いに相互作用しながら発達する特性が、心臓の機能に影響を与える点を見逃すという限界が存在した。

【0007】

結果として、心臓を構成する様々な細胞が同時に分化し、発達初期から相互作用による自己組織化ができていないと、実際の心臓の構造及び機能を再現するには不十分な状態になるため、新薬を開発する際、それを用いて疾患モデリングによる薬物スクリーニング及び心臓毒性評価を行い、有意な結果を導き出すにはかなり不十分であるという問題があった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、ヒト多能性幹細胞から心臓を構成する様々な細胞が同時に分化し、発達初期から相互作用により自己組織化し、培養分化して実際の心臓の構造及び機能を再現するのに十分な状態を備える心臓オルガノイドの製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記目的を達成するために、本発明に係るヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ：ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）を培養して直径１００～１３０μｍの胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｂｏｄｙ）を形成するステップＡと、前記ステップＡで得られた胚様体を直径２００～２５０μｍになるまで培養するステップＢと、前記ステップＢで得られた直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を、中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体に分化させるステップＣと、前記ステップＣで分化した中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体を、心筋細胞（Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）、線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）及び血管内皮細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）を含むように自己組織化された心臓オルガノイドに分化させるステップＤと、前記ステップＤで分化して自己組織化された心臓オルガノイドを培養して成熟化させるステップＥと、を含み、前記ステップＥの成熟化過程を経て得られた心臓オルガノイドは、心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞が５５～６５：１５～３０：１５の細胞数比で自己組織化されたことを特徴とする。

【0010】

ここで、前記ステップＡのヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ：Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）またはヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ：Ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）のうちの少なくとも１つである。

【0011】

また、前記ステップＡは、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤（Ｙ－２７６３２）が添加されたｍＴｅＳＲ培養液で、ヒト多能性幹細胞をプレーティングして１日間培養し、直径１００～１３０μｍの胚様体を形成するステップである。

【0012】

さらに、前記ステップＢは、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）が添加されていないｍＴｅＳＲ培養液で、前記ステップＡで得られた直径１００～１３０μｍの胚様体を２～３日間培養して、直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を形成するステップである。

【0013】

さらにまた、前記ステップＣは、前記ステップＢで得られた直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）、ＣＨＩＲ９９０２１、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４：Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－４）及びアクチビンＡが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養するステップＣ－１と、前記ステップＣ－１で培養されたヒト多能性幹細胞由来胚様体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）、ＸＡＶ９３９、Ｌ－アスコルビン酸（Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養して、中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体に分化させるステップＣ－２と、を含む。

【0014】

ここで、前記ステップＣ－１は、前記ステップＢで得られた直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）、Ｗｎｔシグナル活性化のためのグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ－３β：Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ－３β）阻害剤として濃度６～８μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＢＭＰシグナル活性化のための成分として濃度９～１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、及びトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β）シグナル活性化のための成分として濃度８～１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養するステップである。

【0015】

また、前記ステップＣ－２は、前記ステップＣ－１で培養されたヒト多能性幹細胞由来胚様体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）、Ｗｎｔシグナル阻害のための成分として濃度８～１２μＭのＸＡＶ９３９、及びＢＭＰシグナル活性化のための成分として濃度４０～６０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養するステップである。

【0016】

さらに、前記ステップＤは、前記ステップＣで分化した中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）及び濃度４０～６０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養して心筋細胞の分化を誘導するステップＤ－１と、前記ステップＤ－１で心筋細胞の分化誘導が行われた構成体を、前記ステップＤ－１で用いられたＲＰＭＩ１６４０培地に、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及び濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２）を加えて２日間培養し、線維芽細胞及び血管内皮細胞の分化を誘導するステップＤ－２と、前記ステップＤ－２で心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞の分化誘導が行われた構成体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度４０～６０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養するステップＤ－３と、前記ステップＤ－３で培養された構成体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養して、分化による心臓オルガノイドの自己組織化を行うステップＤ－４と、を含む。

【0017】

さらにまた、前記ステップＥは、前記ステップＤ－４で分化して心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞を含むように自己組織化された心臓オルガノイドを、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及びＴＧＦ－βシグナル阻害のための成分として濃度１０～１５ｎｇ／ｍｌのＳＢ４３１５４２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で１０～２０日間培養して成熟化させるステップである。

【0018】

一方、上記目的を達成するために、本発明に係るヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドは、上述したヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造される。

【発明の効果】

【0019】

本発明によれば、次のような効果がある。

【0020】

第一に、心臓幹細胞が存在しないという限界を克服し、ヒト多能性幹細胞から心臓を構成する心筋細胞、心臓線維芽細胞、血管内皮細胞が同時に分化し、発達初期から相互作用により自己組織化し、培養分化して実際の心臓の構造及び機能を再現するのに十分な状態を備える心臓オルガノイドを製造することができる。

【0021】

第二に、心臓の構造及び機能を再現するのに十分な状態を備える心臓オルガノイドを、新薬開発時に疾患モデリングによる薬物スクリーニング及び心臓毒性評価を行うのに用いて、新薬開発の効率性を画期的に高めることができる。

【0022】

第三に、ヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドを、心臓関連疾患機序の研究の代替モデルとして用いて疾患研究分野の技術的発展に資することができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法のフローチャートである。

【図2】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法における胚様体準備ステップ及び培養ステップによる胚様体の大きさ及び構成細胞数の変化を観察した結果を説明するための写真である。

【図3】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法における胚様体準備ステップ及び培養ステップによる胚様体の大きさ及び構成細胞数の変化を観察した結果を説明するための写真である。

【図4】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により、ヒト多能性幹細胞から胚様体を経て心臓オルガノイドに分化する過程における期間別状態を顕微鏡で観察した写真である。

【図5】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイド製造方法により、ヒト多能性幹細胞から胚様体を経て心臓オルガノイドに分化する過程における期間別直径サイズの変化を示すグラフである。

【図6】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により、ヒト多能性幹細胞から胚様体を経て心臓オルガノイドに分化する過程における期間別拍動比の変化を示すグラフである。

【図7】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの蛍光染色写真である。

【図8】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイド製造方法による各実験群のステップ別培養条件及び期間をまとめた模式図である。

【図9】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの実験群別流細胞分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）結果を示すグラフである。

【図10】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの実験群別流細胞分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）結果を示すグラフである。

【図11】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの実験群別遺伝子発現結果を示すグラフである。

【図12】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの実験群別遺伝子発現結果を示すグラフである。

【図13】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの実験群別遺伝子発現結果を示すグラフである。

【図14】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの実験群別蛍光染色結果を比較した写真である。

【図15】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの実験群別蛍光染色結果を比較した写真である。

【図16】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの実験群別カルシウムイメージング結果を比較した写真及びグラフである。

【図17】本発明のヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの実験群別カルシウムイメージング結果を比較した写真及びグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下、添付図面を参照して本発明の好適な実施形態についてより具体的に説明するが、説明を簡潔にするために、既に周知の技術的部分については省略または簡略化する。

【0025】

１．ヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法に関する説明
以下、図１を参照して、本発明に係るヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法の過程について詳細に説明する。

【0026】

（１）胚様体準備ステップ＜Ｓ１１０、ステップＡ＞
このステップ（Ｓ１１０）では、ヒト多能性幹細胞を培養して直径１００～１３０μｍの胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｂｏｄｙ）を形成する過程が行われる。

【0027】

ここで、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ：ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）そのものを指すこともあるが、より具体的には、ヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞：ｈＥＳＣ：Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）またはヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉｐｓ細胞：ｈｉＰＳＣ、Ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）のうち少なくとも１つからなる細胞と解釈することもできる。

【0028】

具体的に、胚様体準備ステップ（Ｓ１１０）では、培養中のヒト多能性幹細胞を抽出（ｈａｒｖｅｓｔ）した後、６ウェルプレート（Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ）に１．５×１０^６個／ウェル単位で１０μＭの濃度のＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（Ｙ－２７６３２、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国）が添加されたｍＴｅＳＲ培養液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ）を用いてプレーティングする。

【0029】

ここで、６ウェルプレートにヒト多能性幹細胞をプレーティングする際には、細胞接着のためのコーティングをせず、一般的なオルガノイド培養に用いられるマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）も使用しないことが重要であり、ローアタッチメント（Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）プレートで代替使用も可能である。

【0030】

また、図２に示すように１日間培養すると、各ウェルは約２００～５００個の細胞からなり、直径１００～１３０μｍの胚様体が得られる。

【0031】

したがって、６ウェルプレートの各ウェルに１．５×１０^６個のヒト多能性幹細胞をプレーティングする場合、培養１日後に直径１００～１３０μｍの胚様体が約３０００～７５００個生成される。

【0032】

（２）胚様体培養ステップ＜Ｓ１２０、ステップＢ＞
このステップ（Ｓ１２０）では、先の胚様体準備ステップ（Ｓ１１０）で形成された胚様体を、直径２００～２５０μｍになるまで追加培養する過程を行う。

【0033】

具体的に、胚様体培養ステップ（Ｓ１２０）では、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）が添加されていない（無添加）ｍＴｅＳＲ培養液で、胚様体準備ステップ（Ｓ１１０）で形成された直径１００～１３０μｍの胚様体を２～３日間培養して、直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を得る。

【0034】

ここで、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）が添加されていない（無添加）ｍＴｅＳＲ培養液を用いた培養過程は、２日～３日間行われるにあたり、毎日培養液を新しいものに交換して行うことが好ましい。

【0035】

したがって、図３に示すように、胚様体準備ステップ（Ｓ１１０）における培養１日目には、「Ｄａｙ－３」と記した部分の写真のように直径１００～１３０μｍの胚様体が得られ、続いて胚様培養ステップ（Ｓ１２０）により培養液の条件を変えて２～３日間追加培養すると、「Ｄａｙ０」と記した部分の写真のように徐々に直径が大きくなり、直径２００～２５０μｍになる。

【0036】

（３）中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ＜Ｓ１３０、ステップＣ＞
このステップ（Ｓ１３０）では、胚様体培養ステップ（Ｓ１２０）で得られた直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を、中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体に分化させる過程が行われる。

【0037】

このような中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ（Ｓ１３０）は、より具体的に細分化され、２つのステップにわたって順次行われる。まず、胚様培養ステップ（Ｓ１２０）で得られた直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）、ＣＨＩＲ９９０２１、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びアクチビンＡが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養する１次分化過程（ステップＣ－１）が行われる。

【0038】

具体的に、胚様体培養ステップ（Ｓ１２０）で得られた直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体の１次培養が２日間行われる培地は、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン；サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）、濃度６～８μＭのＣＨＩＲ９９０２１、濃度９～１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び濃度８～１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に該当するものとする。

【0039】

ここで、中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ（Ｓ１３０）の１次分化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＣＨＩＲ９９０２１は、Ｗｎｔシグナル活性化のためのグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ－３β）阻害剤であり、濃度６μＭを有することが最も好ましい。

【0040】

また、中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ（Ｓ１３０）の１次分化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＢＭＰ－４は、ＢＭＰシグナル活性化のための成分であり、濃度１０ｎｇ／ｍｌを有することが最も好ましい。

【0041】

次に、中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ（Ｓ１３０）の１次分化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるアクチビンＡは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）シグナル活性化のための成分であり、濃度１０ｎｇ／ｍｌを有することが最も好ましい。

【0042】

その後、中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ（Ｓ１３０）の１次分化過程で培養されたヒト多能性幹細胞由来胚様体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）、ＸＡＶ９３９、Ｌ－アスコルビン酸が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地でさらに２日間培養して中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体に分化させる２次分化過程（ステップＣ－２）が行われる。

【0043】

具体的に、中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ（Ｓ１３０）の１次分化過程で培養されたヒト多能性幹細胞由来胚様体が２日間２次培養される培地は、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン；サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）、濃度８～１２μＭのＸＡＶ９３９及び濃度４０～６０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に該当する。

【0044】

ここで、中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ（Ｓ１３０）の２次分化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＸＡＶ９３９は、Ｗｎｔシグナル阻害のための成分であり、濃度１０μＭを有することが最も好ましい。

【0045】

また、中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ（Ｓ１３０）の２次分化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＸＡＶ９３９は、実施に応じてＷｎｔ産生の阻害剤－２，３，４（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｗｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ－２、３、４：ＩＷＰ－２，３，４）であり、ＩＷＰ－２，３，４を等濃度で代替実施することができる。

【0046】

さらに、中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ（Ｓ１３０）の２次分化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＬ－アスコルビン酸は、Ｗｎｔシグナル阻害のための成分であり、濃度５０μｇ／ｍｌを有することが最も好ましい。

【0047】

（４）心臓オルガノイド自己組織化ステップ＜Ｓ１４０、ステップＤ＞
このステップ（Ｓ１４０）では、中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ（Ｓ１３０）で分化した中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体を、心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞を含むように自己組織化された心臓オルガノイド（Ｈｅａｒｔ Ｏｒｇａｎｏｉｄ）に分化させる過程が行われる。

【0048】

このような心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）は、より具体的に細分化され、４つのステップにわたって順次行われる。まず、中胚葉及び内胚葉細胞分化ステップ（Ｓ１３０）で分化した中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）及び濃度４０～６０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養することで心筋細胞への分化を誘導する１次組織化過程（ステップＤ－１）が行われる。

【0049】

ここで、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）の１次組織化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＬ－アスコルビン酸は、濃度５０μｇ／ｍｌを有することが最も好ましい。

【0050】

その後、１次組織化過程（ステップＤ－１）で心筋細胞の分化誘導が行われた構成体を、１次組織化過程（ステップＤ－１）に用いたＲＰＭＩ１６４０培地に濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）をさらに加えて２日間培養することにより、繊維芽細胞及び血管内皮細胞の分化を誘導する２次組織化過程（ステップＤ－２）が行われる。

【0051】

ここで、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）の２次組織化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地にさらに添加されるＢＭＰ４は、ＢＭＰシグナル活性化のための成分であり、濃度３０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0052】

また、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）の２次組織化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地にさらに添加されるＶＥＧＦは、血管分化及び形成に関与する成分であり、濃度３０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0053】

さらに、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）の２次組織化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地にさらに添加されるＦＧＦ２は、ＦＧＦシグナル活性化のための成分であり、濃度３０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0054】

次に、２次組織化過程（ステップＤ－２）で心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞の分化誘導が行われた構成体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度４０～６０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養する３次組織化過程（ステップＤ－３）が行われる。

【0055】

ここで、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）の３次組織化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＬ－アスコルビン酸は、濃度５０μｇ／ｍｌを有することが最も好ましい。

【0056】

また、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）の３次組織化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＢＭＰ４は、ＢＭＰシグナル活性化のための成分であり、濃度３０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0057】

さらに、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）の３次組織化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地にさらに添加されるＶＥＧＦは、血管分化及び形成に関与する成分であり、濃度３０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0058】

さらにまた、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）の３次組織化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地にさらに添加されるＦＧＦ２は、ＦＧＦシグナル活性化のための成分であり、濃度３０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0059】

最後に、３次組織化過程（ステップＤ－３）で培養された構成体を、Ｌ－アスコルビン酸を除いて、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養することで、分化による心臓オルガノイドの自己組織化を達成する４次組織化過程（ステップＤ－４）が行われる。

【0060】

ここで、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）の４次組織化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＢＭＰ４は、ＢＭＰシグナル活性化のための成分であり、濃度３０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0061】

また、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）の４次組織化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地にさらに添加されるＶＥＧＦは、血管分化及び形成に関与する成分であり、濃度３０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0062】

さらに、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）の４次組織化過程に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地にさらに添加されるＦＧＦ２は、ＦＧＦシグナル活性化のための成分であり、濃度３０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0063】

このような一連の詳細過程を経て心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）が完了すると、分化を通じて心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞が自己組織化された心臓オルガノイドが得られる。

【0064】

（５）心臓オルガノイド成熟化ステップ＜Ｓ１５０、ステップＥ＞
このステップ（Ｓ１５０）では、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）で分化して自己組織化された心臓オルガノイドを培養して成熟化させる過程が行われる。

【0065】

具体的に、心臓オルガノイド成熟化ステップ（Ｓ１５０）では、心臓オルガノイド自己組織化ステップ（Ｓ１４０）で心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞を含むように自己組織化された心臓オルガノイドを、成熟化用培地で１０～２０日間培養して成熟化を行う。

【0066】

ここで、心臓オルガノイドの成熟化用培地は、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、濃度２０～４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及びＴＧＦ－βシグナル阻害のための成分であり、濃度１０～１５ｎｇ／ｍｌのＳＢ４３１５４２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に該当する。

【0067】

また、心臓オルガノイド成熟化ステップ（Ｓ１５０）に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＶＥＧＦは、血管分化及び形成に関与する成分であり、濃度３０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0068】

さらに、心臓オルガノイド成熟ステップ（Ｓ１５０）に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＦＧＦ２は、ＦＧＦシグナル活性化のための成分であり、濃度３０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0069】

さらにまた、心臓オルガノイド成熟化ステップ（Ｓ１５０）に使用されるＲＰＭＩ１６４０培地に添加されるＳＢ４３１５４２は、ＴＧＦ－βシグナル阻害のための成分であり、濃度１０ｎｇ／ｍｌを有することが好ましい。

【0070】

結果として、図４に示すように、ヒト人工多能性幹細胞に由来して胚様体（ＥＢ）を経て、６日目（Ｄａｙ６）の中胚葉及び内胚葉細胞に分化した状態を経た後、１０日目（Ｄａｙ１０）の心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞が自己組織化された心臓オルガノイド状態に分化し、その後、最終的に２４日目（Ｄａｙ２４）の成熟化した心臓オルガノイド状態を確認することができる。

【0071】

このような各ステップ別の直径の変化過程では、図５に示すように、直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体から、最終的に２５日目（Ｄａｙ２５）の直径３００～４００μｍの成熟化した心臓オルガノイドが得られることが確認できる。

【0072】

また、各ステップ別の拍動比の変化過程では、図６に示すように、直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体状態に該当する０日目（Ｄａｙ０）から、最終的に２１日目（Ｄａｙ２１）～３０日目（Ｄａｙ３０）の成熟化した心臓オルガノイドの場合、９６％以上の個体で拍動を示すことが確認できる。

【0073】

とりわけ、このような一連の詳細過程を経て心臓オルガノイド成熟化ステップ（Ｓ１５０）が完了すると、分化により心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞が５５～６５：１５～３０：１５の細胞数比に応じて自己組織化された心臓オルガノイドが得られ、これは、実際のヒトの心臓を構成する心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞の６：２：１．５の細胞数比に非常に近いものである。

【0074】

これに関連して、ヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの蛍光染色を行い、心筋細胞のマーカー（ｃＴｎＴ）及び心室型心筋細胞のマーカー（ＭＹＬ２）の発現を画像（イメージ）解析で確認し、その結果を図７に示した。

【0075】

このように実際の心臓と類似した心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞の構成細胞の細胞数の比率が類似または同一に対応し、同時分化して発達初期から相互作用を経て自己組織化及び成熟化された心臓オルガノイドは、実際の心臓の構造及び機能を再現するのに十分な状態を持つ。それを用いて新薬開発時に疾患モデリングによる薬物スクリーニング及び心臓毒性評価を行うことにより、新薬開発の効率性を画期的に高めることができる。

【0076】

２．ヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により得られたヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの機能性確認実験についての説明
まず、上述したヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されるヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドを一つの実験群として設定し、これに対して別の実験群を設定して、相互構造性及び機能性の観点から、実際の心臓との適合度を比較した結果を以下に説明する。

【0077】

（１）ヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの実験群製造
図８に示すように、異なる培養条件で分化したヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドをそれぞれ実験群１及び実験群２として設定した。

【0078】

実験群１及び実験群２の場合、胚様体準備ステップ（Ｓ１１０）及び胚様体培養ステップ（Ｓ１２０）を経てヒト多能性幹細胞由来胚様体を形成する過程は、共通して同様に行われる。

【0079】

また、直径２００～２５０μｍのヒト多能性幹細胞由来胚様体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）、濃度６μＭのＣＨＩＲ９９０２１、濃度１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び濃度１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間１次培養した後、１次培養を経たヒト多能性幹細胞由来胚様体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）、濃度１０μＭのＸＡＶ９３９、濃度５０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養して中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体に分化させる過程も同様に行われ、その後に進む過程は他の培養条件下で行われる。

【0080】

－実験群１
実験群１では、図８に示すように、分化した中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）及び濃度５０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養して心筋細胞の分化を誘導する過程を行った後、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度５０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養し、その後、Ｌ－アスコルビン酸を除き、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養して心臓オルガノイドの自己組織化を行った。

【0081】

次に、実験群１に該当する自己組織化された心臓オルガノイドは、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で１０～３０日間培養して成熟化させる過程を経て実験群１を完成した。

【0082】

－実験群２
実験群２では、図８に示すように、分化した中胚葉細胞及び内胚葉細胞を含む構成体を、Ｂ－２７サプリメント（マイナスインスリン）及び濃度５０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養して心筋細胞の分化を誘導する過程を行った後、先に使用したＲＰＭＩ１６４０培地に濃度３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、濃度３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を加えて２日間培養し、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度３０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸、濃度３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び濃度３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養した。その後、Ｌ－アスコルビン酸を除き、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、濃度３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び濃度３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養することで心臓オルガノイドの自己組織化を行った。

【0083】

次に、実験群２に該当する自己組織化された心臓オルガノイドは、Ｂ－２７サプリメント（マイナスビタミンＡ）、濃度３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、濃度３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及び濃度１０ｎｇ／ｍｌのＳＢ４３１５４２が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で１０～２０日間培養して成熟化させる過程を経て実験群２を完成した。

【0084】

（２）実験群別の心臓オルガノイド細胞構成の比較実験
前述の方法により得られた実験群１と実験群２を用いて、様々な実験により心臓オルガノイドの細胞構成の比較分析を行った。

【0085】

まず、心筋細胞のマーカーとしてｃＴｎＴ、線維芽細胞のマーカーとしてＣＤ９０、血管内皮細胞マーカーとしてＶＥ－カドヘリン（Ｃａｄｈｅｒｉｎ）またはＣＤ３１を用いて流細胞分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を行い、その結果を図９及び図１０に示した。

【0086】

実験群１の場合、図９及び図１０に示すように、心筋細胞マーカー９２％、線維芽細胞マーカー６％、血管内皮細胞マーカー４％で分析され、実験群２の場合、心筋細胞マーカー５１％、線維芽細胞マーカー２４％。内皮細胞マーカー１４％で分析された。

【0087】

具体的に、各実験結果を百分率に換算すると、実験群１では心筋細胞９０％、線維芽細胞６％、内皮細胞４％の構成比率を示し、実験群２では心筋細胞５８％、線維芽細胞２７％、内皮細胞１５％の構成比を示した。

【0088】

次に、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を用いて各実験群別心臓オルガノイドにおけるマーカー遺伝子の相対的な発現を分析し、心筋細胞マーカーとしてＮＫＸ２．５、ＴＮＮＴ２、ＭＹＬ２、ＭＹＬ７を用いた。

【0089】

その結果、図１１～図１３に示すように、実験群１に比べて実験群２で発現量の減少を示していることがわかり、心臓線維芽細胞マーカーであるＣＤ９０、ＰＤＧＦＲ、Ｖｉｍｅｔｉｎ、ＴＣＦ２１、及び内胚葉（Ｅｎｄｏｄｅｒｍ）マーカーであるＣＤ３４、ＰＥＣＡＭ１、Ｓｏｘ１７、ＦＯＸＡ２は、実験群２の心臓オルガノイドで発現量の増加を示していることがわかる。

【0090】

より具体的に、上述した方法により得られた実験群１及び実験群２の心臓オルガノイドのそれぞれについて免疫蛍光染色試験を行った結果、図１４及び図１５に示すように、実験群２の心臓オルガノイドにおいて、血管内皮細胞マーカー（ＶＥ－カドヘリン：ＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ）及び線維芽細胞マーカー（ビメンチン：Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）は、発現が増加する分布を示し、心筋細胞マーカー（ｃＴｎＴ）は、発現が全体的に減少する分布を示すことがわかる。

【0091】

特に実験群２の心臓オルガノイドでは、実験群１に比べて血管内皮細胞マーカーであるＶＥ－カドヘリンが、心臓オルガノイドの最外部を包むような形で分布されていることが分かる。

【0092】

（３）実験群別心臓オルガノイドのカルシウムイオンチャネル機能性の比較実験
上述した方法により得られた実験群１と実験群２を用いて、心臓オルガノイドのカルシウムイオンチャネル機能性を測定し、比較分析した。

【0093】

まず、生細胞内のカルシウム濃度を測定するために、細胞透過性のあるＦｌｕｏ－４、ＡＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州、米国）を用いて実験群別心臓オルガノイドのカルシウムイオン濃度変化を観察した。

【0094】

その結果、図１６及び図１７に示すように、９２％以上の心筋細胞からなる実験群１よりも、心筋細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞が同時に分化した実験群２では、カルシウムイオン移動と拍動が比較的遅いことが確認された。

【0095】

以上をまとめると、実験群２のように製造された心臓オルガノイドは、心臓幹細胞が存在しないという限界を克服し、ヒト多能性幹細胞から心臓を構成する心筋細胞、心臓線維芽細胞血管内皮細胞が同時に分化し、発達初期から相互作用により自己組織化し、培養分化して、実際の心臓の構造及び機能を再現するのに十分な状態を備えるようになる。

【0096】

それにより、上述したヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの製造方法により製造されるヒト多能性幹細胞由来心臓オルガノイドの好適な実施形態に該当する実験群２の、心臓の構造及び機能を再現するのに十分な状態を備える心臓オルガノイドを、新薬開発時に疾患モデリングによる薬物スクリーニング及び心臓毒性評価を行うのに用いて、新薬開発の効率性を画期的に高めることができるだけでなく、心臓関連疾患機序の研究の代替モデルとして用いるには適している。

【0097】

本発明に開示された実施形態は本発明の技術思想を限定するためのものではなく、単に説明するためのものであり、このような実施形態によって本発明の技術思想の範囲が限定されるわけではない。本発明の保護範囲は下記の請求範囲によって解釈されるべきであり、それと同等な範囲内にあるあらゆる技術思想は本発明の権利範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】