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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-17
(45)【発行日】2024-12-25
(54)【発明の名称】アデノシンデアミナーゼ、並びに関連する生体材料及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/14 20060101AFI20241218BHJP
C07K 14/245 20060101ALI20241218BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20241218BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20241218BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241218BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241218BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241218BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241218BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241218BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20241218BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241218BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241218BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20241218BHJP
【ＦＩ】
C12N9/14
C07K14/245
C12N15/55 ZNA
C12N15/31
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A01H5/00 A
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/09 110
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2023530524
(86)(22)【出願日】2021-06-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-06
(86)【国際出願番号】 CN2021098034
(87)【国際公開番号】W WO2022105190
(87)【国際公開日】2022-05-27
【審査請求日】2023-07-05
(31)【優先権主張番号】202011308944.7
(32)【優先日】2020-11-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】523183530
【氏名又は名称】中国農業科学院植物保護研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】周煥斌
(72)【発明者】
【氏名】厳芳
(72)【発明者】
【氏名】任斌
(72)【発明者】
【氏名】▲いえん▼大▲ちぃ▼
(72)【発明者】
【氏名】柳浪
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／２１９９９０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Nat. Biotechnol.，2020年07月，Vol. 38，p. 883-891
【文献】Science，2020年07月，Vol. 369，p. 566-571
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
Ｃ１２Ｎ ９／００ － ９／９９
Ｃ０７Ｋ １４／００ － １４／８２５
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質のアミノ酸配列が配列表の配列番号２の１～１６７位であることを特徴とするタンパク質。
【請求項2】
請求項１に記載のタンパク質に関する生物材料であって、以下のＢ１）～Ｂ７）の少なくとも１つであることを特徴とする生物材料：Ｂ１）前記タンパク質をコードする核酸分子；
Ｂ２）Ｂ１）における前記核酸分子を含む発現カセット；
Ｂ３）Ｂ１）における核酸分子を含む組換えベクター、またはＢ２）における発現カセットを含む組換えベクター；
Ｂ４）Ｂ１）における核酸分子を含む組換え微生物、Ｂ２）における発現カセットを含む組換え微生物、又はＢ３）における組換えベクターを含む組換え微生物；
Ｂ５）Ｂ１）における核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞系、Ｂ２）における発現カセットを含むトランスジェニック植物細胞系、またはＢ３）における組換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞系；
Ｂ６）Ｂ１）における核酸分子を含むトランスジェニック植物組織、Ｂ２）における発現カセットを含むトランスジェニック植物組織、またはＢ３）における組換えベクターを含むトランスジェニック植物組織；
Ｂ７）Ｂ１）における核酸分子を含むトランスジェニック植物器官、Ｂ２）における発現カセットを含むトランスジェニック植物器官、またはＢ３）における組換えベクターを含むトランスジェニック植物器官。
【請求項3】
Ｂ１）における核酸分子は、以下のＢ１１）又はＢ１２）に示す遺伝子であることを特徴とする、請求項２に記載の生物材料：Ｂ１１）コーディング鎖のコード配列が配列番号１の７～５０７位で示されるｃＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子；
Ｂ１２）Ｂ１１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子。
【請求項4】
Ｃａｓタンパク質とアデノシンデアミナーゼを含むタンパク質であって、前記アデノシンデアミナーゼが、請求項１に記載のタンパク質であることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項5】
前記Ｃａｓタンパク質は、ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）またはＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）であることを特徴とする、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記融合タンパク質は、前記アデノシンデアミナーゼと、前記Ｃａｓタンパク質と、核局在化シグナルとが連結されたタンパク質であることを特徴とする、請求項４または５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記融合タンパク質は、ＴａｄＡ９－ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、ＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）、ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）またはＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）であり、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）はアミノ酸配列が配列番号２であるタンパク質、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）はアミノ酸配列が配列番号４であるタンパク質、前記ＴａｄＡ９－ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）はアミノ酸配列が配列番号６であるタンパク質、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）はアミノ酸配列が配列番号８であるタンパク質であることを特徴とする、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
請求項４～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質に関する生物材料であって、以下のＤ１）～Ｄ７）の少なくとも１つである生物材料：Ｄ１）前記融合タンパク質をコードする核酸分子；
Ｄ２）Ｄ１）における前記核酸分子を含む発現カセット；
Ｄ３）Ｄ１）における核酸分子を含む組換えベクター、またはＤ２）における発現カセットを含む組換えベクター；
Ｄ４）Ｄ１）における核酸分子を含む組換え微生物、Ｄ２）における発現カセットを含む組換え微生物、またはＤ３）における組換えベクターを含む組換え微生物；
Ｄ５）Ｄ１）における核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞系、Ｄ２）における発現カセットを含むトランスジェニック植物細胞系、またはＤ３）における組換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞系；
Ｄ６）Ｄ１）における核酸分子を含むトランスジェニック植物組織、Ｄ２）における発現カセットを含むトランスジェニック植物組織、またはＤ３）における組換えベクターを含むトランスジェニック植物組織；
Ｄ７）Ｄ１）における核酸分子を含むトランスジェニック植物器官、Ｄ２）における発現カセットを含むトランスジェニック植物器官、またはＤ３）における組換えベクターを含むトランスジェニック植物器官。
【請求項9】
Ｄ１）におけるＤＮＡ分子は、請求項７に記載のＴａｄＡ９－ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子、ＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子、ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子、またはＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子であり；前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子は、
Ｄ１３１）コーディング鎖のコード配列が配列番号１の７～４７３７位で示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子；または、
Ｄ１３２）Ｄ１３１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子；のいずれかであり、
前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子は、
Ｄ１４１）コーディング鎖の配列が配列番号３の７～４７３７位で示されるｃＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子；または、
Ｄ１４２）Ｄ１４１）で定義される塩基配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子；のいずれかであり、
前記ＴａｄＡ９－ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子は、
Ｄ１１１）コーディング鎖のコード配列が配列番号５の７～４７５８位で示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子；または、
Ｄ１１２）Ｄ１１１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子；のいずれかであり、
前記ＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子は、
Ｄ１２１）コーディング鎖のコード配列が配列番号７の７～４７３７位で示されるｃＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子；または、
Ｄ１２２）Ｄ１２１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子；のいずれかであることを特徴とする、請求項８に記載の生物材料。
【請求項10】
請求項１に記載のタンパク質、請求項２または３に記載の生物材料、請求項４から７のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項８または９に記載の生物材料の、植物における一塩基編集への使用。
【請求項11】
前記植物の一塩基編集は、植物ゲノムについてＡからＧへの標的変異であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アデノシンデアミナーゼ、それに関連する生体材料及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ゲノム編集技術は、人工のヌクレアーゼを用いて生物のゲノムの特定部位を改変する遺伝子工学技術である。このプロセスは、特定のヌクレアーゼによる標的部位の切断によってＤＮＡ二本鎖切断を生じさせ、その後、非相同末端結合（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ， ＮＨＥＪ）修復または相同組換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ， ＨＤＲ）で塩基の欠失、挿入、ミスマッチの現象を導入し、生物の突然変異の目的を達成する。近年では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲをメインとしての人工ヌクレアーゼ技術の開発に成功した。特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術は、その操作性の良さ、効率の良さ、汎用性の高さから、研究者の注目を集めている。
【0003】
一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ， ＳＮＰ）は作物の農耕形質の遺伝的基盤であり、植物の重要な農耕形質の多くは一塩基の遺伝子座によって決定される。現在、ＳＮＰは次々と発見され、植物の表現型形質のスクリーニングに使用されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術の発展に伴い、これをベースにゲノム上に一塩基の変化を引き起こす一塩基編集技術（シトシン塩基編集システムやアデニン塩基編集システムを含む）が、植物の標的塩基置換を誘導するために利用されている。塩基編集技術は、効率的であること、ＤＮＡの二本鎖切断に依存しないこと、ドナーＤＮＡの存在を必要としないことから、その開発以来、動植物を含む幅広い生物への応用が成功した。植物の塩基編集システムへの適用に成功したシチジンデアミナーゼには、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３、ＡＩＤなどが含まれ、アデノシンデアミナーゼにはＴａｄＡ７．１０が含まれる。
【0004】
アデノシンデアミナーゼに基づくアデニン塩基編集技術は、主に切除酵素Ｃａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）とアデノシンデアミナーゼとを組み合わせた融合タンパク質を用い、ｓｇＲＮＡの誘導下で塩基編集活性ウィンドウ内にある標的塩基Ａを脱アミンしてヒポキサンチンＩとし、ＤＮＡ修復と複製後に徐々にＧに置換させ、最終的にＡからＧへの方向性置換を形成する（Ａ＞Ｇ）。しかし、現在の植物のアデニン塩基編集技術では、主にアデノシンデアミナーゼＴａｄＡ７．１０（Ｙａｎ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ， ２０１８， １１：６３１－６３４）およびＴａｄＡ８ｅ（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ， ２０２１， １４： ３５２－３６０）を使用しているが、一般的に編集効率が低く、様々なＣａｓタンパク質との適合性が低く、さらには、塩基編集活性ウィンドウ内に存在する標的部位が依然として効果的な塩基編集イベントを達成できない。
【発明の概要】
【0005】
本発明が解決しようとする技術的課題は、植物におけるアデニン塩基編集の効率をどのように向上させるか、及び／又は、現在の技術では達成できないものの、期待されるアデニン塩基編集をどのように実現させるかということにある。
【0006】
上記技術的課題を解決するために、本発明は、アデノシンデアミナーゼを提供する。
【0007】
本発明が提供するアデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ９と名付けられ、大腸菌のｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼＴａｄＡの変異体であるＴａｄＡ７．１０を人工変異させて得られる高活性アデノシンデアミナーゼである非天然タンパク質である。アデノシンデアミナーゼは、配列表の配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）の１～１６７位（すなわち、配列表の配列番号１の７～５０７位のヌクレオチド（ＣＤＳ）によりコードされるタンパク質）のアミノ酸配列を有するタンパク質である。また、上記技術的課題を解決するために、本発明は、前記ＴａｄＡ９に関連する生物材料を提供する。
【0008】
本発明により提供される前記ＴａｄＡ９に関連する生体材料は、以下のＢ１）～Ｂ７）のうち少なくとも１つである：
Ｂ１）前記タンパク質をコードする核酸分子；
Ｂ２）Ｂ１）の前記核酸分子を含む発現カセット；
Ｂ３）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む組換えベクター、またはＢ２）に記載の発現カセットを含む組換えベクターを含む組換えベクター；
Ｂ４）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む組換え微生物、Ｂ２）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、またはＢ３）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物；
Ｂ５）Ｂ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞株、Ｂ２）に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物細胞株、またはＢ３）に記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞株；
Ｂ６）Ｂ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物組織、Ｂ２）に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物組織、またはＢ３）に記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植物組織；
Ｂ７）Ｂ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物体、Ｂ２）に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物体、またはＢ３）に記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植物体。
Ｂ１）前記タンパク質をコードする核酸分子；
Ｂ２）Ｂ１）の前記核酸分子を含む発現カセット；
Ｂ３）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む組換えベクター、またはＢ２）に記載の発現カセットを含む組換えベクターを含む組換えベクター；
Ｂ４）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む組換え微生物、Ｂ２）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、またはＢ３）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物；
Ｂ５）Ｂ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞株、Ｂ２）に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物細胞株、またはＢ３）に記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞株；
Ｂ６）Ｂ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物組織、Ｂ２）に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物組織、またはＢ３）に記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植物組織；
Ｂ７）Ｂ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物体、Ｂ２）に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物体、またはＢ３）に記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植物体。
【0009】
上記生体材料において、Ｂ１）に記載の核酸分子は、以下のＢ１１）またはＢ１２）に示す遺伝子であり得る。
Ｂ１１）コーディング鎖のコード配列（ＣＤＳ）が、配列番号１の７～５０７位に示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子である；
Ｂ１２）は、Ｂ１１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子。
Ｂ１１）コーディング鎖のコード配列（ＣＤＳ）が、配列番号１の７～５０７位に示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子である；
Ｂ１２）は、Ｂ１１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子。
【0010】
本発明は、アデニン塩基エディターも提供する。
【0011】
本発明が提供するアデニン塩基エディタでは、前記融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質とアデノシンデアミナーゼを含む融合タンパク質であり、前記アデノシンデアミナーゼは前記ＴａｄＡ９である。
【0012】
前記アデニン塩基エディタにおいて、前記Ｃａｓタンパク質は、ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）、ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）またはＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）であってもよい。
【0013】
上記アデニン塩基エディターにおいて、前記ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）は、アミノ酸配列が配列番号２の２００位～１５６７位であるタンパク質（すなわち、配列表の配列番号１の６０４位～４７０７位のヌクレオチド（ＣＤＳ）にコードされるタンパク質）、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）は、アミノ酸配列が配列番号４の２００位～１５６７位であるタンパク質（すなわち、配列表の配列番号３の６０４－４７０７位のヌクレオチド（ＣＤＳ）にコードされるタンパク質）、ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）はアミノ酸配列が配列番号６の２００－１５７４位であるタンパク質（配列表の配列番号５の６０４－４７２８位のヌクレオチド（ＣＤＳ）にコードされるタンパク質）、そしてＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）はアミノ酸配列が配列番号８の２００－１５６７位であるタンパク質（配列表の配列番号５の６０４－４７２８位のヌクレオチド（ＣＤＳ）にコードされるタンパク質）である。ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）はアミノ酸配列が配列番号８の２００－１５６７位であるタンパク質（すなわち、配列表の配列番号７のヌクレオチド６０４－４７０７（ＣＤＳ）によりコードされるタンパク質）である。
【0014】
上記アデニン塩基エディターにおいて、前記アデニン塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼと、Ｃａｓタンパク質と、核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ， ＮＬＳ）連結体とを連結して形成されるタンパク質であってもよい。
【0015】
上記アデニン塩基エディターにおいて、前記アデニン塩基エディターは、具体的には、ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）、ＴａｄＡ９－ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）またはＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）であってもよく、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）はそのアミノ酸配列が配列番号２であるタンパク質（すなわち、配列表の配列番号１の７～４７３７位のヌクレオチド（ＣＤＳ）によってコードされるタンパク質）、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）はアミノ酸配列が配列番号４であるタンパク質（すなわち、配列表の配列番号３の７～４７３７位のヌクレオチド（ＣＤＳ）によってコードされるタンパク質）、前記ＴａｄＡ９－ＳＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）は、アミノ酸配列が配列番号６であるタンパク質（すなわち、配列表の配列番号５の７～４７５８位のヌクレオチド（ＣＤＳ）によってコードされるタンパク質）であり、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）は、アミノ酸配列が配列番号８であるタンパク質（すなわち、配列表の配列番号７の７～４７３７位のヌクレオチド（ＣＤＳ）によってコードされるタンパク質）である。
【0016】
前記アデニン塩基エディターに関連する生体材料も、本発明の保護範囲に入る。
【0017】
前記アデニン塩基エディターに関連する生体材料は、特に、以下のＤ１）～Ｄ７）のうちの少なくとも１つであり得る：
Ｄ１）前記アデニン塩基エディターをコードする核酸分子；
Ｄ２）Ｄ１）の前記核酸分子を含む発現カセット；
Ｄ３）Ｄ１）に記載の核酸分子を含む組換えベクター、またはＤ２）に記載の発現カセットを含む組換えベクター；
Ｄ４）Ｄ１）に記載の核酸分子を含む組換え微生物、Ｄ２）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、またはＤ３）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物；
Ｄ５）Ｄ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞系、Ｄ２）で規定される発現カセットを含むトランスジェニック植物細胞系、またはＤ３）で規定される組換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞系；
Ｄ６）Ｄ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物組織、Ｄ２）に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物組織、またはＤ３）に記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植物組織；
Ｄ７）Ｄ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物器官、Ｄ２）に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物器官、またはＤ３）に記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植物器官。
Ｄ１）前記アデニン塩基エディターをコードする核酸分子；
Ｄ２）Ｄ１）の前記核酸分子を含む発現カセット；
Ｄ３）Ｄ１）に記載の核酸分子を含む組換えベクター、またはＤ２）に記載の発現カセットを含む組換えベクター；
Ｄ４）Ｄ１）に記載の核酸分子を含む組換え微生物、Ｄ２）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、またはＤ３）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物；
Ｄ５）Ｄ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞系、Ｄ２）で規定される発現カセットを含むトランスジェニック植物細胞系、またはＤ３）で規定される組換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞系；
Ｄ６）Ｄ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物組織、Ｄ２）に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物組織、またはＤ３）に記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植物組織；
Ｄ７）Ｄ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物器官、Ｄ２）に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物器官、またはＤ３）に記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植物器官。
【0018】
（ａ）上記アデニン塩基編集者に関連する生物材料のうち、
Ｄ１）の前記核酸分子は、ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子、ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子、ＴａｄＡ９－ＳａＣＡｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子又はＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子のいずれかであってもよい。
Ｄ１）の前記核酸分子は、ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子、ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子、ＴａｄＡ９－ＳａＣＡｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子又はＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子のいずれかであってもよい。
【0019】
前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子は、以下に示す遺伝子のいずれかであってもよい：
（Ｄ１３１）コーディング鎖のコード配列（ＣＤＳ）が配列番号１の７～４７３７位に示されるｃＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子；
Ｄ１３２）Ｄ１３１）で規定される塩基配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子。
（Ｄ１３１）コーディング鎖のコード配列（ＣＤＳ）が配列番号１の７～４７３７位に示されるｃＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子；
Ｄ１３２）Ｄ１３１）で規定される塩基配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子。
【0020】
前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子は、以下に示す遺伝子のいずれかであってもよい：
Ｄ１４１）コーディング鎖のコーディング配列（ＣＤＳ）が配列番号３の７～４７３７で示されるｃＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子；
Ｄ１４２）Ｄ１４１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子。
前記ＴａｄＡ９－ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子は、以下に示す遺伝子のいずれかであってもよい：
（Ｄ１１１）コーディング鎖のコード配列（ＣＤＳ）が配列番号５の７～４７５８位に示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子；
Ｄ１１２）Ｄ１１１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｃＣａｓ９をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子（Ｄ１０Ａ）。
前記ＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子は、以下のように示される遺伝子のいずれかであってもよい：
Ｄ１２１）コーディング鎖のコード配列（ＣＤＳ）が、配列番号７の７～４７３７位に示されるｃＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子；
Ｄ１２２）Ｄ１２１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子。
Ｄ１４１）コーディング鎖のコーディング配列（ＣＤＳ）が配列番号３の７～４７３７で示されるｃＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子；
Ｄ１４２）Ｄ１４１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子。
前記ＴａｄＡ９－ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子は、以下に示す遺伝子のいずれかであってもよい：
（Ｄ１１１）コーディング鎖のコード配列（ＣＤＳ）が配列番号５の７～４７５８位に示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子；
Ｄ１１２）Ｄ１１１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｃＣａｓ９をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子（Ｄ１０Ａ）。
前記ＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）をコードする遺伝子は、以下のように示される遺伝子のいずれかであってもよい：
Ｄ１２１）コーディング鎖のコード配列（ＣＤＳ）が、配列番号７の７～４７３７位に示されるｃＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子；
Ｄ１２２）Ｄ１２１）で規定されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有し、前記ＴａｄＡ９－ＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）をコードするｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子。
【0021】
上記において、前記発現カセットとは、宿主細胞（例えば、植物細胞など）において前記タンパク質を発現可能なＤＮＡを意味し、ＤＮＡには、前記タンパク質遺伝子の転写を開始させるプロモーターだけではなく、前記タンパク質遺伝子の転写を終了させるターミネーターを含んでいてもよい。さらに、前記発現カセットは、エンハンサー配列を含んでいてもよい。本発明で使用できるプロモーターとしては、構成的プロモーター、組織、器官および発育に特異的なプロモーター、および誘導性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターの例としては、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来の構成的プロモーター３５Ｓ、トマト由来の外傷誘導性プロモーター、ロイシンアミノペプチダーゼ（「ＬＡＰ」、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２０：９７９－９９２）；タバコ由来の化学的に誘導可能なプロモーター、病歴依存タンパク質１（ＰＲ１）（サリチル酸およびＢＴＨ（ベンゾチアジアゾール－７－チオヒドロキサム酸Ｓ－メチル）により誘導されたもの）；トマトプロテアーゼ阻害剤ＩＩプロモーター（ＰＩＮ２）またはＬＡＰプロモーター（両方ともメチルジャスモン酸により誘導可能）；熱ショックプロモーター（米国特許５，１８７，２６７）；テトラサイクリン誘導可能プロモーター（米国特許５，０５７，４２２）；穀物種子特異的プロモーターｐＦ１２８（ＣＮ１０１０６３１３９Ｂ（中国特許２００７ １ ００９９１６９．７））などのような種子特異的プロモーター、種子貯蔵タンパク質に特異的プロモーター（例えば、ファゼオリン、ナピン、オレオシンおよび大豆ベータコングリシンのプロモーター（Ｂｅａｃｈｙ ｅｔ ａｌ．１９８５）ｅｍｂｏＪ．４：３０４７－３０５３））が挙げられる。これらは単独で、または他の植物プロモーターと組み合わせて使用することができる。なお、本明細書において引用された文献は、すべて全文引用するものとする。好適な転写ターミネーターとしては、農桿菌・ノパリンシンターゼターミネーター（ＮＯＳターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、エンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーター、およびノパリン・オクトパミンシンターゼターミネーター（例えば、ｏｄｅｌｌ等（Ｉ９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔｃ． ら（１９８７）Ｇｅｎｅ，５６：１２５；Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（１９９１）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２６２：１４１；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ，６４：６７１；Ｓａｎｆａｃｏｎら．Ｃｅｌｌ，２：１２６１；Ｍｕｎｒｏｅら（１９９０）Ｇｅｎｅ，９１：１５１；Ｂａｌｌａｄら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１；Ｊｏｓｈｉら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：９６２７）を含むが、これらに限らない。
【0022】
本発明の一実施形態において、前記発現カセットは、Ｕｂｉｐプロモーター（ヌクレオチド配列は配列番号９）、前記アデニン塩基エディターをコードする核酸分子およびＮＯＳターミネーター（ヌクレオチド配列は配列番号１０）を連結して構成されているものである。
【0023】
ここで、「同一性」という用語は、核酸配列間の配列類似性を意味する。同一性は、肉眼またはコンピューターソフトウェアによって評価することができる。コンピューターソフトウェアを用いると、２つ以上の配列間の同一性は、当該配列間の同一性を評価するために使用できるパーセント（％）で表すことができる。なお、前記８０％以上の同一性は、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性でもよい。
【0024】
上記において、前記組換え微生物は、具体的には、細菌、酵母、藻類、真菌類であってもよい。
【0025】
また、以下のいずれの用途も、本発明の保護範囲に含まれる：
１）植物の一塩基編集におけるＴａｄＡ９の使用。
２）植物の一塩基編集のためのＴａｄＡ９関連生物材料の使用。
３）植物の一塩基編集における上記アデニン塩基エディターの使用。
４）植物の一塩基編集における上記アデニン塩基エディターに関連する生物材料の使用。
１）植物の一塩基編集におけるＴａｄＡ９の使用。
２）植物の一塩基編集のためのＴａｄＡ９関連生物材料の使用。
３）植物の一塩基編集における上記アデニン塩基エディターの使用。
４）植物の一塩基編集における上記アデニン塩基エディターに関連する生物材料の使用。
【0026】
上記技術的課題を解決するために、本発明は、植物ゲノムについてＡをＧに標的変異させる方法を提供する。
【0027】
本発明が提供する、植物ゲノムについてＡをＧに標的変異させる方法は、前記アデニン塩基エディターおよびｓｇＲＮＡを発現するＤＮＡ分子をレシピエント植物に導入して、ＡがＧに標的変異した目的植物を得るステップを含み、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は５’－Ｎ１９－２０ＰＡＭ－３’であり、前記Ｎ１９－２０は１９－２０個のＮであり、前記ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）は３個のＮであり、前記ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである。
【0028】
前記アデニン塩基エディターおよびｓｇＲＮＡを発現するＤＮＡ分子をレシピエント植物に導入する際に、ＰＥＧ媒介変換の方法を用いてもよいし、遺伝子銃器法又は農桿菌侵染法のうちの１つを用いて前記塩基編集ツールボックスをイネ原形質体又はカルス織に導入する方法を用いることもできる。これは当業者には容易に理解できる。イネゲノムＤＮＡが２本の鎖からなることは当業者によく知られているので、前記標的ヌクレオチド配列はその相補的な任意の鎖上に位置することができる。このシステムは、例えば、前記標的ヌクレオチド配列が機能性遺伝子のセンス鎖に位置し、且つ、機能性遺伝子の特定遺伝子座のＡをＧへ標的変異させた後、その突然変異のうちの１つにより、所望のアミノ酸を含む対応する機能タンパク質を得ことが可能な場合、すなわち、センス鎖上の塩基置換を直接行うことによって三重体コドン中のＡをＧに置換することが可能な場合には、イネ遺伝子の機能に関する「補正」変異体を得るためにこのシステムを利用することができる。或いは、標的ヌクレオチド配列が機能性遺伝子のアンチセンス鎖に位置し、且つ、機能性遺伝子の特定部位におけるＴをＣへの変異の標的とし、変異のうちの１つにより、所望のアミノ酸を含む対応する機能性タンパク質が得られる場合でも、このシステムを使用することができる。すなわち、このシステムによれば、アンチセンス鎖の、ＡからＧへの標的変異により、センス鎖上の前記三重項コドンがコードするアミノ酸を、センス鎖の対応する相補的なＴをＣに置換して変更することができ、これによりイネ遺伝子の機能に関する「補正」変異体を得る。
【0029】
上記では、植物は双子葉植物または単子葉植物であってもよい。単子葉植物は水稲であってもよい。一塩基編集は、アデニンＡをグアニンＧに置き換えることができる。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】ｐＵｂｉ－ｒＢＥのスペクトルである。
【図2】ｐＥＮＴＲ４：ｓｇＲＮＡのスペクトルである。
【図3】ｐＵｂｉ－ｒＢＥ－ｓｇＲＮＡのスペクトルである。
【図4】ｒＢＥ１４、ｒＢＥ４６ｂ及びｒＢＥ４９ｂが媒介するイネ内因性遺伝子Ｏｓｔｍｓ９のアデニン塩基編集の突然変異の効果図である。図中、ｒｅｆはイネの参照ゲノムの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列１４である。ＷＴはベース編集を行っていないイネジャポニカ品種Ｋｉｔａａｋｅの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列１４である。Ｔ＞Ｃは突然変異体株の対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列１５である。
【図5】ｒＢＥ１４、ｒＢＥ４６ｂ及びｒＢＥ４９ｂが媒介するイネ内因性遺伝子ＯｓＷＲＫＹ４５のアデニン塩基編集突然変異の効果図である。図中、ｒｅｆはイネの参照ゲノムの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列１６である。ＷＴは塩基編集を行っていないイネジャポニカ品種Ｋｉｔａａｋｅの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列１６である。Ａ＞Ｇは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列１７である。
【図6】ｒＢＥ２３、ｒＢＥ５０及びｒＢＥ５３が媒介するイネ内因性遺伝子ＯｓＤＥＰ２のアデニン塩基の編集突然変異の効果図である。図中、ｒｅｆはイネの参照ゲノムの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列１８である。ＷＴは塩基編集を行っていないイネジャポニカ品種Ｋｉｔａａｋｅの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列１８である。２Ａ＞２Ｇは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列１９である。
【図7】ｒＢＥ２３、ｒＢＥ５０及びｒＢＥ５３が媒介するイネ内因性遺伝子ＯｓＷＲＫＹ４５のアデニン塩基の編集突然変異の効果図である。図中、ｒｅｆはイネの参照ゲノムの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列２０である。ＷＴは塩基編集が行われていないイネジャポニカ品種Ｋｉｔａａｋｅの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列２０である。Ｔ＞Ｃは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列２１である。
【図8】ｒＢＥ２６、ｒＢＥ５４及びｒＢＥ５７が媒介するイネ内因性遺伝子ＯｓＧＳ１のアデニン塩基編集の突然変異の効果図である。図中、ｒｅｆはイネの参照ゲノムの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列２２である。ＷＴは塩基編集が行われていないイネジャポニカ品種Ｋｉｔａａｋｅの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列２２である。３Ａ＞３Ｇは突然変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列２３である。４Ａ＞４Ｇは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列２４である。
【図9】ｒＢＥ５４とｒＢＥ５７が媒介するイネ内因性遺伝子ＯｓＳＥＲＫ２のアデニン塩基編集の突然変異効果図である。図中、ｒｅｆはイネの参照ゲノムの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列２５である。ＷＴは塩基編集を行っていないイネジャポニカ品種Ｋｉｔａａｋｅの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列２５である。２Ｔ＞２Ｃは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列２６である。
【図10】ｒＢＥ６２とｒＢＥ６５が媒介するイネ内因性遺伝子ＯｓＭＰＫ１３のアデニン塩基編集の突然変異の効果図である。図中、ｒｅｆはイネの参照ゲノムの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列２７である。ＷＴは塩基編集を行っていないイネジャポニカ品種Ｋｉｔａａｋｅの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列２７である。Ａ＞Ｇは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列２８である。２Ａ＞２Ｇは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列２９である。
【図11】ｒＢＥ６２とｒＢＥ６５が媒介するイネ内因性遺伝子ＯｓＧＳＫ ４のアデニン塩基編集の突然変異効果図である。図中、ｒｅｆはイネの参照ゲノムの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列３０である。ＷＴは塩基編集が行われていないイネジャポニカ品種Ｋｉｔａａｋｅの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列３０である。Ｔ＞Ｃは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列３１である。２Ｔ＞２Ｃは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列３２である。４Ｔ＞４Ｃは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列３３である。
【図12】ｒＢＥ６２とｒＢＥ６５が媒介するイネ内因性遺伝子ＯｓＪＡＲ １のアデニン塩基編集の突然変異効果図である。図中、ｒｅｆはイネの参照ゲノムの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列３４である。ＷＴは塩基編集を行っていないイネジャポニカ品種Ｋｉｔａａｋｅの対応する配列を示し、ヌクレオチド配列は配列３４である。２Ｔ＞２Ｃは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列３５である、３Ｔ＞３Ｃは変異株の対応する配列を表し、ヌクレオチド配列は配列３６である。
【図13】各標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列情報である。図中、二本鎖ＤＮＡ断片合成に必要なオリゴヌクレオチド鎖中の大文字はａｔｔＢ１－ｓｇＲＮＡ発現カセット－ａｔｔＢ２のＮ１９に対応し、小文字のｇｔｇｔはＢｓａＩ位に対応し、小文字のｔｇｔｔはＢｔｇＺＩ位に対応する。
【図14】各標的遺伝子の検出プライマーを示す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
以下、具体的な実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。提供される実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を説明するためにのみ提供される。以下に提供される実施例は、本発明の限定を構成するものではなく、当業者による更なる改善のための指針とすることができる。
【0032】
以下の実施例における実験方法は、特に断らない場合、通常に用いられる方法であり、当該技術分野の文献に記載されている技術または条件に従って、または製品仕様書に従って実施される。以下の実施例で使用される材料、試薬等は、特に指定がない場合、市販されている。
【0033】
以下の実施例におけるｐＵｂｉ－Ｃａｓ ９は発明者が所属する実験室によって保存され提供される（Ｈ．Ｚｈｏｕ、Ｂ．Ｌｉｕ、Ｄ．Ｐ．Ｗｅｅｋｓ、Ｍ．Ｈ．Ｓｐａｌｄｉｎｇ＆Ｂ．Ｙａｎｇ．Ｌａｒｇｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｓｍａｌｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ９ ｉｎ ｒｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４、４２（１７）：１０９０３－１０９１４）。生体材料は、発明者の研究室から一般に入手可能であり、本発明に関連する実験を繰り返すためにのみ使用され、それ以外の目的には使用されないものとする。
【0034】
実施例１ イネゲノムにおけるＡからＧへの標的型変異
本実施例は、アデノシンデアミナーゼＴａｄＡ７．１０（以下、ＴａｄＡ７．１０と略称）の人工変異体、すなわちアデノシンデアミナーゼＴａｄＡ９（以下、ＴａｄＡ９と略称）を提供した。ＴａｄＡ７．１０は配列番号１２の塩基番号５９８～１０９５でコードされるタンパク質である。ＴａｄＡ９は、アミノ酸配列が配列表２の１～１６７位であり、ＴａｄＡ７．１０と比較して、アミノ酸配列に以下の変異を有する：
Ｖ８１Ｓ／Ａ１０８Ｓ／Ｔ１１０Ｒ／Ｄ１１８Ｎ／Ｈ１２１Ｎ／Ｙ１４６Ｄ／Ｆ１４８Ｙ／Ｑ１５３Ｒ／Ｔ１６５Ｉ／Ｄ１６６Ｎ．
本実施例は、アデノシンデアミナーゼＴａｄＡ７．１０（以下、ＴａｄＡ７．１０と略称）の人工変異体、すなわちアデノシンデアミナーゼＴａｄＡ９（以下、ＴａｄＡ９と略称）を提供した。ＴａｄＡ７．１０は配列番号１２の塩基番号５９８～１０９５でコードされるタンパク質である。ＴａｄＡ９は、アミノ酸配列が配列表２の１～１６７位であり、ＴａｄＡ７．１０と比較して、アミノ酸配列に以下の変異を有する：
Ｖ８１Ｓ／Ａ１０８Ｓ／Ｔ１１０Ｒ／Ｄ１１８Ｎ／Ｈ１２１Ｎ／Ｙ１４６Ｄ／Ｆ１４８Ｙ／Ｑ１５３Ｒ／Ｔ１６５Ｉ／Ｄ１６６Ｎ．
【0035】
本実施例において、ＴａｄＡ９コントロールとして、ｗｔＴａｄＡ－ＴａｄＡ７．１０（配列番号１２のヌクレオチド１～１０９５でコードされるタンパク質）およびＴａｄＡ－Ｒ（配列番号１３のヌクレオチド１～５０１でコードされるタンパク質）の二つのアデニン塩基編集のためのコントロールアデノシンデアミナーゼを提供する。ｗｔＴａｄＡ－ＴａｄＡ ７．１０は、植物に一般的に使用されている既存のアデノシンデアミナーゼ二量体である。ＴａｄＡ－ＲはＴａｄＡ ９と比較して、アミノ酸配列の変異がＶ ８１ ＳとＱ １５３ Ｒの２つ少なく、ＴａｄＡ ７．１０と比較して、アミノ酸配列上に以下の突然変異が存在する：
Ａ １０８ Ｓ／Ｔ １１０ Ｒ／Ｄ １１８ Ｎ／Ｈ １２１ Ｎ／Ｙ １４６ Ｄ／Ｆ １４８ Ｙ／Ｔ １６５ Ｉ／Ｄ １６６ Ｎ。
Ａ １０８ Ｓ／Ｔ １１０ Ｒ／Ｄ １１８ Ｎ／Ｈ １２１ Ｎ／Ｙ １４６ Ｄ／Ｆ １４８ Ｙ／Ｔ １６５ Ｉ／Ｄ １６６ Ｎ。
【0036】
本実施例は、ＴａｄＡ ９を含む４種類のイネアデニン塩基エディター発現ベクターｐＵｂｉ－ｒＢＥ（図１）を提供する。各イネアデニン塩基エディター発現ベクターの名称はそれぞれｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４９ ｂ、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５３、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５７、およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６５である。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４９ ｂが発現するアデニン塩基エディターは、ｒＢＥ ４９ ｂという名称の融合タンパク質（ＴａｄＡ ９－ＳｐＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）とも呼ばれる）であり、ＴａｄＡ ９という名称のアデノシンデアミナーゼ、ＳｐＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）という名称のＣａｓタンパク質及びＮＬＳという名称の核局在化シグナルを結合してなるタンパク質である。ｒＢＥ ４９ ｂのアミノ酸配列は配列２である。配列２において、１～１６７位はＴａｄＡ ９のアミノ酸配列、１６８～１９９位は結合ペプチドのアミノ酸配列、２００～１５６７位はＳｐＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）のアミノ酸配列、１５６８～１５７６位はＮＬＳのアミノ酸配列である。イネコドン使用の選好性と、異種タンパク質発現コドンの最適化戦略とに基づいてキメラ遺伝子であるｒＢＥ ４９ ｂ遺伝子のヌクレオチド配列をコドン最適化したうえで、バイオテクノロジー（上海）株式会社に４７４３ ｂｐのｒＢＥ ４９ ｂ遺伝子の人工合成を依頼した。ｐＵｂｉ－Ｃａｓ ９のＢａｍＨＩ認識部位とＢｃｕＩ認識部位の間の小断片（Ｃａｓ ９）を、配列１の７－４７３７位に示すｒＢＥ ４９ ｂ遺伝子に置き換え、ｐＵｂｉ－Ｃａｓ ９の他のヌクレオチドを維持し、ｒＢＥ ４９ ｂ遺伝子発現ベクターｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４９ ｂを得た。配列１では、１～６位はＢａｍＨＩ認識部位、７～５０７位はＴａｄＡ ９のＣＤＳ、５０８～６０３位はペプチドを結合するＣＤＳ、６０４～４７０７位はＳｐＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）のＣＤＳ、４７０８～４７３４位はＮＬＳのＣＤＳ、４７３５～４７３７位は終端コドンＴＧＡ、４７３８～４７４３位はＢｃｕＩｎｏの認識部位であった。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４９ ｂにはＬＲ反応のための素子ａｔｔＲ １－ｃｃｄＢ－ａｔｔＲ ２が含まれていた。
【0037】
ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５３が発現するアデニン塩基エディターは、ｒＢＥ ５３という名称の融合タンパク質（ＴａｄＡ ９－ＳｐＣａｓ ９－ＮＧ（Ｄ １０ Ａ）とも呼ばれる）であり、ＴａｄＡ ９という名称のアデノシンデアミナーゼ、ＳｐＣａｓ ９－ＮＧという名称のＣａｓタンパク質及びＮＬＳという名称の核局在化シグナルを結合してなるタンパク質である。ｒＢＥ ５０のアミノ酸配列は配列表中の配列４である。配列４において、１～１６７位はＴａｄＡ ９のアミノ酸配列、１６８～１９９位は結合ペプチドのアミノ酸配列、２００～１５６７位はＳｐＣａｓ ９－ＮＧ（Ｄ １０ Ａ）のアミノ酸配列、１５６８～１５７６位はＮＬＳのアミノ酸配列である。イネのコドン使用の選好性に基づいてキメラ遺伝子ｒＢＥ ５３遺伝子のヌクレオチド配列をコドン最適化したうえで、バイオテクノロジー（上海）株式会社に４７４３ ｂｐのｒＢＥ ５３遺伝子の人工合成を依頼した。ｐＵｂｉ－Ｃａｓ ９のＢａｍＨＩの認識部位とＢｃｕＩ認識部位間の小断片（Ｃａｓ ９）を、配列３の７－４７３７位に示すｒＢＥ ５３遺伝子に置き換え、ｐＵｂｉ－Ｃａｓ ９の他のヌクレオチドを維持し、ｒＢＥ ５３遺伝子発現ベクターｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５３を得た。配列３では、１～６位はＢａｍＨＩ認識部位、７～５０７位はＴａｄＡ ９のＣＤＳ、５０８～６０３位はペプチドを結合するＣＤＳ、６０４～４７０７位はＳｐＣａｓ ９－ＮＧ（Ｄ １０ Ａ）のＣＤＳ、４７０８～４７３４位はＮＬＳのＣＤＳ、４７３５～４７３７位は終端コドンＴＧＡ、４７３８～４７４３位はＢｃｕＩの認識部位であった。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５０にはＬＲ反応のための素子ａｔｔＲ １－ｃｃｄＢ－ａｔｔＲ ２が含まれていた。
【0038】
ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５７が発現するアデニン塩基エディターは、ｒＢＥ ５７という名称の融合タンパク質（ＴａｄＡ ９－ＳｃＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）とも呼ばれる）であり、ＴａｄＡ ９という名称のアデノシンデアミナーゼ、ＳｃＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）という名称のＣａｓタンパク質及びＮＬＳという名称の核局在化シグナルを結合してなるタンパク質である。ｒＢＥ ５７のアミノ酸配列は配列表中の配列６である。配列６において、１～１６７位はＴａｄＡ ９のアミノ酸配列、１６８～１９９位は結合ペプチドのアミノ酸配列、２００～１５７４位はＳｃＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）のアミノ酸配列、１５７５～１５８３位はＮＬＳのアミノ酸配列である。イネのコドン使用の選好性に基づいてキメラ遺伝子ｒＢＥ ５７遺伝子のヌクレオチド配列をコドン最適化したうえで、バイオテクノロジー（上海）株式会社に４７６４ ｂｐのｒＢＥ ５７遺伝子の人工合成を依頼した。ｐＵｂｉ－Ｃａｓ ９のＢａｍＨＩ認識部位とＢｃｕＩ認識部位の間の小断片（Ｃａｓ ９）を配列５の７－４７５８位に示すｒＢＥ ５７遺伝子に置き換え、ｐＵｂｉ－Ｃａｓ９の他のヌクレオチドを変更せずに、ｒＢＥ５７遺伝子発現ベクターｒＢＥ５７を得た。配列５では、１ ～ ６位はＢａｍＨＩ 認識部位、７～５０７位はＴａｄＡ９のＣＤＳ、５０８～６０３位は接続ペプチドのＣＤＳ、６０４～４７２８位はＳｃＣａｓ９ （Ｄ１０Ａ） のＣＤＳ、および６０４－４７２８ 位はＳｃＣａｓ９ （Ｄ１０Ａ） のＣＤＳ、４７２９－４７５５位は ＮＬＳ のＣＤＳ、４７５６－４７５８位はターミネーターコドン ＴＧＡ、４７５９－４７６４位はＢｃｕＩ の認識部位である。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ５７ には、ＬＲのＬＲ反応のための素子ａｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ａｔｔＲ２が含まれていた。
【0039】
ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６５が発現するアデニン塩基エディターは、ｒＢＥ ６５という名称の融合タンパク質（ＴａｄＡ ９－ＳｐＲＹ（Ｄ １０ Ａ）とも呼ばれる）であり、ＴａｄＡ ９という名称のアデノシンデアミナーゼ、ＳｐＲＹ（Ｄ １０ Ａ）という名称のＣａｓタンパク質及びＮＬＳという名称の核局在化シグナルを結合してなるタンパク質である。ｒＢＥ ６５のアミノ酸配列は配列表中の配列８である。配列８において、１～１６７位はＴａｄＡ ９のアミノ酸配列、１６８～１９９位は結合ペプチドのアミノ酸配列、２００～１５６７位はＳｐＲＹ（Ｄ １０ Ａ）のアミノ酸配列、１５６８～１５７６位はＮＬＳのアミノ酸配列である。イネコドン使用の選好性に基づいてキメラ遺伝子ｒＢＥ ６５遺伝子のヌクレオチド配列をコドン最適化したうえで、バイオテクノロジー（上海）株式会社に４７４３ ｂｐのｒＢＥ ６５遺伝子の人工合成を依頼した。ｐＵｂｉ－Ｃａｓ ９のＢａｍＨＩ認識部位とＢｃｕＩ認識部位の間の小断片（Ｃａｓ ９）を配列７の７－４７３７位に示すｒＢＥ ６５遺伝子に置き換え、ｐＵｂｉ－Ｃａｓ ９の他のヌクレオチドを変更せずに、ｒＢＥ ６５遺伝子発現ベクターｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６５を得た。配列７では、１～６位はＢａｍＨＩ認識部位、７～５０７位はＴａｄＡ ９のＣＤＳ、５０８～６０３位はペプチドを連結するＣＤＳ、６０４～４７０７位はＳＰＲＹ（Ｄ １０ Ａ）のＣＤＳ、４７０８～４７３４位はＮＬＳのＣＤＳ、４７３５～４７３７位は終端コドンＴＧＡ、４７３８～４７４３位はＢｃｕＩ認識部位であった。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６５には、ＬＲ反応のための素子ａｔｔＲ １－ｃｃｄＢ－ａｔｔＲ ２が含まれていた。
【0040】
ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４９ ｂ、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５３、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５７及びｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６５は、アデニン塩基エディターｒＢＥのコード遺伝子のみが異なる。ｒＢＥ４９ｂ、ｒＢＥ５３、ｒＢＥ５７およびｒＢＥ６５の４種類のアデニン塩基エディターはＣａｓタンパク質のみ異なる。
【0041】
ベクターのｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４９ ｂ、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５３、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５７及びｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６５の主な構成要素は以下の通りである：ＲＢ Ｔ－ＤＮＡ ｒｅｐｅａｔ配列（ヌクレオチド配列はｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＬＣ ５０６５３０．１の第１３９７３～第１３９９７位、２０２０年３月２０日）、ａｔｔＲ １（ヌクレオチド配列はｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＫＲ ２３３５１８．１の第２０５５～第２１７９位、２０１５年８月８日）、ｃｃｄＢ発現カセット（ヌクレオチド配列はｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＫＲ ２３３５１８．１の第３２８９～第３５９４位、２０１５年８月８日）、ａｔｔＲ ２（ヌクレオチド配列はｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＫＲ ２３３５１８．１の第３６３５～第３７５９位、２０１５年８月８日）、Ｕｂｉｐプロモーター（ヌクレオチド配列は配列９）、イネアデニン塩基エディターｒＢＥ遺伝子（ｒＢＥ ４９ ｂ遺伝子（ヌクレオチド配列は配列１の第７～４７３７位）、ｒＢＥ ５３遺伝子（ヌクレオチド配列は配列３の７－４７３７位）、ｒＢＥ ５７遺伝子（ヌクレオチド配列は配列５の７－４７５８位）またはｒＢＥ ６５遺伝子（ヌクレオチド配列は配列７の７－４７３７位）、ＮＯＳターミネーター（ヌクレオチド配列は配列１０）、ＣａＭＶ ３５ Ｓプロモーター（ヌクレオチド配列はｇｅｎｂａｎｋ登録番号がＦＪ ３６２６００．１の１０４１４から１１０９２位、２００８年１１月２６日）、潮マイシン遺伝子（ヌクレオチド配列はｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＫＹ ４２００８５．１の５１１～１５３６位、２０１７年７月１０日）、ＣａＭＶ ｐｏｌｙ（Ａ）ターミネーター（ヌクレオチド配列はｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＭＫ ８９６９００．１の８６１８～８７９２位、２０１９年９月４日）、ＬＢ Ｔ－ＤＮＡ ｒｅｐｅａｔ（ヌクレオチド配列はｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＬＣ ５０６５３０．１、３６３５～３７９５位、２０２０年３月２０日）。
【0042】
また、本実施例では、コントロールとして７つのイネアデニン塩基エディター発現ベクターを用意した。本発明のｐＵｂｉ－ｒＢＥ４９ｂのコントロールとして用いるコントロールベクターの名称はｐＵｂｉ－ｒＢＥ１４及びｐＵｂｉ－ｒＢＥ４６ｂであり、本発明のｐＵｂｉ－ｒＢＥ５３のコントロールとして用いるコントロールベクターの名称はｐＵｂｉ－ｒＢＥ２３及びｐＵｂｉ－ｒＢＥ５０であり、また本発明のｐＵｂｉ－ｒＢＥ５７のコントロールベクターの名称はｐＵｂｉ－ｒＢＥ２６およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ５４であり、本発明としてのｐＵｂｉ－ｒＢＥ６５のコントロールベクターの名称はｐＵｂｉ－ｒＢＥ６２である。
【0043】
ｐＵｂｉ－ｒＢＥ １４が発現するアデニン塩基エディターは、ｒＢＥ １４という名称の融合タンパク質（ｗｔＴａｄＡ－ＴａｄＡ ７．１０－ＳｐＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）－ＮＬＳとも呼ばれる）であり、ｗｔＴａｄＡという名称の野生型アデノシンデアミナーゼ、ＴａｄＡ ７．１０という名称の突然変異型アデノシンデアミナーゼ、ＳｐＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）という名称のＣａｓタンパク質及びＮＬＳという名称の核局在化シグナルを結合してなるタンパク質である。アミノ酸配列におけるｒＢＥ１４は、ｒＢＥ- ４９ ｂにおけるＴａｄＡ９という名称のアデノシンデアミナーゼを、ｗｔＴａｄＡという名称の野生型アデノシンデアミナーゼとＴａｄＡ７．１０という名称の変異型アデノシンデアミナーゼとを結合したタンパク質ｗｔＴａｄＡ－ＴａｄＡ７．１０に置き換えたという点のみを除き、他のアミノ酸はｒＢＥ４９ｂのアミノ酸配列とは同じである。ｒＢＥ１４遺伝子は、ｒＢＥ ４９ ｂ遺伝子（ヌクレオチド配列は配列１の７～４７３７位）のうち、ＴａｄＡ ９のＣＤＳ（ヌクレオチド配列は配列１の７～５０７位）を、配列１２に示すｗｔＴａｄＡ－ＴａｄＡ ７．１０遺伝子に置き換え、配列１の他のヌクレオチドを変更せずにして得られたＤＮＡ分子である。配列１２はタンパク質ｗｔＴａｄＡ－ＴａｄＡ ７．１０のコード遺伝子であり、そのＣＤＳは配列１２である。配列１２において、１～５０１位はｗｔＴａｄＡのＣＤＳ、５０２～５９７位は結合ペプチドのＣＤＳ、５９８～１０９５位はＴａｄＡ ７．１０のＣＤＳである。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ １４は、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４９ ｂのｒＢＥ ４９ ｂ遺伝子をｒＢＥ １４遺伝子に置き換え、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４９ ｂの他のヌクレオチドを変更せずにして得られたｒＢＥ １４遺伝子発現ベクターである。
【0044】
ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４６ ｂが発現するアデニン塩基エディターは、ｒＢＥ ４６ ｂという名称の融合タンパク質（ＴａｄＡ－Ｒ－ＳｐＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）－ＮＬＳとも呼ばれる）であり、ＴａｄＡ－Ｒという名称の変異型アデノシンデアミナーゼ、ＳｐＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）という名称のＣａｓタンパク質及びＮＬＳという名称の核局在化シグナルを結合してなるタンパク質である。ｒＢＥ ４６ ｂは、ｒＢＥ ４９ ｂにおけるＴａｄＡ ９という名称のアデノシンデアミナーゼを、ＴａｄＡ－Ｒという名称の変異型アデノシンデアミナーゼに置き換えた点を除き、他のアミノ酸はｒＢＥ ４９ ｂのアミノ酸配列とは全く同じである。ｒＢＥ ４６ ｂ遺伝子は、ｒＢＥ ４９ ｂ遺伝子（ヌクレオチド配列は配列１の７～４７３７位）のうち、ＴａｄＡ ９のＣＤＳ（ヌクレオチド配列は配列１の７～５０７位）を、配列１３に示すＴａｄＡ－Ｒ遺伝子配列に置き換え、配列１の他のヌクレオチドを変更せずにして得られたＤＮＡ分子である。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４６ ｂは、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４９ ｂのｒＢＥ ４９ ｂ遺伝子をｒＢＥ ４６ ｂ遺伝子に置き換え、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４９ ｂの他のヌクレオチドを変更せずにして得られたｒＢＥ ４６ ｂ遺伝子発現ベクターである。
【0045】
ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ２３が発現するアデニン塩基エディターは、ｒＢＥ ２３という名称の融合タンパク質（ｗｔＴａｄＡ－Ｔａｄａ ７．１０－ＳｐＣａｓ ９－ＮＧ（Ｄ １０ Ａ）－ＮＬＳ）であり、ｗｔＴａｄＡという名称の野生型アデニンデアミナーゼ、ＴａｄＡ ７．１０という名称の突然変異型アデニンデアミナーゼ、ＳｐＣａｓ ９－ＮＧ（Ｄ １０ Ａ）という名称のＣａｓタンパク質及びＮＬＳという名称の核局在化シグナルが結合してなるタンパク質である。ｒＢＥ ２３は、ｒＢＥ ５３中のＴａｄＡ ９という名称のアデニンデアミナーゼを、ｗｔＴａｄＡという名称の野生型アデニンデアミナーゼとＴａｄＡ ７．１０という名称の突然変異型アデニンデアミナーゼとを結合したタンパク質ｗｔＴａｄＡ－ＴａｄＡ ７．１０に置き換えた点を除き、他のアミノ酸はｒＢＥ ５３のアミノ酸配列とは全く同じである。ｒＢＥ ２３遺伝子は、ｒＢＥ ５３遺伝子（ヌクレオチド配列は配列３の７～４７３７位）のうちＴａｄＡ ９のＣＤＳ（ヌクレオチド配列は配列３の７～５０７位）を、配列番号１２に示すｗｔＴａｄＡ－ＴａｄＡ ７．１０遺伝子に置き換え、配列３の他のヌクレオチドを変更せずにして得られたＤＮＡ分子である。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ２３は、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５３中のｒＢＥ ５３遺伝子をｒＢＥ ２３遺伝子に置き換え、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５３の他のヌクレオチドを変更せずにして得られたｒＢＥ ２３遺伝子発現ベクターである。
【0046】
ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５０で発現するアデニン塩基エディターは、ｒＢＥ ５０という名称の融合タンパク質（ｗｔＴａｄＡ－ＴａｄＡ ７．１０－ＳｐＣａｓ ９－ＮＧ（Ｄ １０ Ａ）－ＮＬＳとも呼ばれる）であり、ＴａｄＡ－Ｒという名称の変異型アデノシンデアミナーゼ、ＳｐＣａｓ ９－ＮＧ（Ｄ １０ Ａ）という名称のＣａｓタンパク質及びＮＬＳという名称の核局在化シグナルを結合してなるタンパク質である。ｒＢＥ ５０は、ｒＢＥ ５３のＴａｄＡ ９という名称のアデノシンデアミナーゼをＴａｄＡ－Ｒという名称の変異型アデノシンデアミナーゼに置き換えた点を除き、他のアミノ酸はｒＢＥ ５３のアミノ酸配列とは全く同じである。ｒＢＥ ５０遺伝子は、ｒＢＥ ５３遺伝子（ヌクレオチド配列は配列３の７～４７３７位）のうちＴａｄＡ ９のＣＤＳ（ヌクレオチド配列は配列１の７～５０７位）を、配列１３に示すＴａｄＡ－Ｒ遺伝子に置き換え、配列３の他のヌクレオチドを変更せずにして得られたＤＮＡ分子である。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５０は、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５３中のｒＢＥ ５３遺伝子をｒＢＥ ５０遺伝子に置き換え、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５３の他のヌクレオチドを変更せずにして得られたｒＢＥ ５０遺伝子発現ベクターである。
【0047】
ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ２６が発現するアデニン塩基エディターは、ｒＢＥ ２６という名称の融合タンパク質（ｗｔＴａｄＡ－Ｔａｄａ ７．１０－ＳｃＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）－ＮＬＳ）であり、ｗｔＴａｄＡという名称の野生型アデニンデアミナーゼ、ＴａｄＡ ７．１０という名称の突然変異型アデニンデアミナーゼ、ＳｃＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）という名称のＣａｓタンパク質及びＮＬＳという名称の核局在化シグナルを結合してなるタンパク質である。ｒＢＥ ２６は、ｒＢＥ ５７のうちＴａｄＡ ９という名称のアデニンデアミナーゼを、ｗｔＴａｄＡという名称の野生型アデニンデアミナーゼとＴａｄＡ ７．１０という名称の突然変異型アデニンデアミナーゼとを結合したタンパク質ｗｔＴａｄＡ－ＴａｄＡ ７．１０に置き換えた点を除き、他のアミノ酸はｒＢＥ ５７のアミノ酸配列とは全く同じである。ｒＢＥ ２６遺伝子は、ｒＢＥ ５７遺伝子（ヌクレオチド配列は配列５の７～４７５８位）のうちＴａｄＡ ９のＣＤＳ（ヌクレオチド配列は配列５の７～５０７位）を、配列１２に示すｗｔＴａｄＡ－ＴａｄＡ ７．１０遺伝子に置き換え、配列５の他のヌクレオチドを変更せずにして得られたＤＮＡ分子である。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ２６は、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５７中のｒＢＥ ５７遺伝子をｒＢＥ ２６遺伝子に置き換え、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５７の他のヌクレオチドを変更せずにして得られたｒＢＥ ２６遺伝子発現ベクターである。
【0048】
ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５４が発現するアデニン塩基エディターは、ｒＢＥ ５４という名称の融合タンパク質（ＴａｄＡ－Ｒ－ＳｃＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）－ＮＬＳとも呼ばれる）であり、ＴａｄＡ－Ｒという名称の突然変異型アデノシンデアミナーゼ、ＳｃＣａｓ ９（Ｄ １０ Ａ）という名称のＣａｓタンパク質及びＮＬＳという名称の核局在化シグナルを結合してなるタンパク質である。ｒＢＥ ５４は、ｒＢＥ ５７におけるＴａｄＡ ９という名称のアデノシンデアミナーゼをＴａｄＡ－Ｒという名称の変異型アデノシンデアミナーゼに置き換えた点を除き、他のアミノ酸はｒＢＥ ５７のアミノ酸配列とは全く同じである。ｒＢＥ ５４遺伝子は、ｒＢＥ ５７遺伝子（ヌクレオチド配列は配列５の７～４７５８位）のうちＴａｄＡ ９のＣＤＳ（ヌクレオチド配列は配列５の７～５０７位）を、配列１３に示すＴａｄＡ－Ｒ遺伝子配列に置き換え、配列５の他のヌクレオチドを変更せずして得られたＤＮＡ分子である。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５４は、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５７中のｒＢＥ ５７遺伝子をｒＢＥ ５４遺伝子に置き換え、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５７の他のヌクレオチドを変更せずにして得られたｒＢＥ ５４遺伝子発現ベクターである。
【0049】
ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６２が発現するアデニン塩基エディターは、ｒＢＥ ６２という名称の融合タンパク質（ＴａｄＡ－Ｒ－ＳｐＲＹ（Ｄ １０ Ａ）－ＮＬＳ）であり、ＴａｄＡ－Ｒという名称の突然変異型アデノシンデアミナーゼ、ＳｐＲＹ（Ｄ １０ Ａ）という名称のＣａｓタンパク質及びＮＬＳという名称の核局在化シグナルを結合してなるタンパク質である。ｒＢＥ ６２は、ｒＢＥ ６５のうちＴａｄＡ ９という名称のアデノシンデアミナーゼをＴａｄＡ－Ｒという名称の変異型アデノシンデアミナーゼに置き換えた点を除き、他のアミノ酸はｒＢＥ ６５のアミノ酸配列とは全く同じである。ｒＢＥ ６２遺伝子は、ｒＢＥ ６５遺伝子（ヌクレオチド配列は配列７の７～４７３７位）のうちＴａｄＡ ９のＣＤＳ（ヌクレオチド配列は配列７の７～５０７位）を、配列１３に示すＴａｄＡ－Ｒ遺伝子配列に置き換えて、配列７の他のヌクレオチドを変更せずにして得られたＤＮＡ分子である。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６２は、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６５中のｒＢＥ ６５遺伝子をｒＢＥ ６２遺伝子に置き換え、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６５の他のヌクレオチドを変更せずにして得られたｒＢＥ ６２遺伝子発現ベクターである。
【0050】
二、イネアデニン塩基エディター発現ベクターによるイネ内因性遺伝子の標的塩基のＡ＞Ｇ置換
１、標的配列に対する塩基編集ベクターｐＵｂｉ－ｒＢＥ－ｓｇＲＮＡの構築
選択された標的遺伝子（図１３を参照）のゲノムＤＮＡ配列は、イネゲノムデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）から取得し、ＰＡＭを識別する要件に応じて、各塩基エディターが対応する標的配列、及びフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチド鎖を設計した。図１３中の各標的配列（５’－Ｎ１９ＰＡＭ－３’）のフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチド鎖（具体的な配列は図１３を参照）の合成を株式会社エヌ・ティ・ティ・ドコモに委託し、人工合成した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてプライマーをリン酸化処理し、アニールして二本鎖ＤＮＡ断片（ｓｇＲＮＡを含む標的配列では、５’－Ｎ１９－３’）とし、二本鎖ＤＮＡフラグメントをそれぞれｐＥＮＴＲ４：ｓｇＲＮＡ（図２、ａｔｔＬ１－ｓｇＲＮＡ発現カセット－ａｔｔＬ２を含む）ベクターの２つのＢｔｇＺＩまたは２つのＢｓａＩ酵素切断部位にクローニングした。プライマーＵ６ｐ－Ｆ１（５’－ＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＴＡＡＧＣＣＧＧＡＣ－３’（配列番号３７）を配列決定して、挿入フラグメントが完全に正確であることを確認した後（挿入フラグメントがｓｇＲＮＡを含む標的配列の５’－Ｎ１９－３’）、得られたプラスミドをＡａｔＩＩ酵素カットにより線形化し、ＧａｔｅｗａｙのＬＲ反応により、ｓｇＲＮＡ発現カセット（ｓｇＲＮＡを含むコードＤＮＡ）を水稲アデニン塩基エディター発現ベクターｐＵｂｉ－ｒＢＥ（図１）のａｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ａｔｔＲ２にそれぞれクローニングし、各標的配列のベース編集ベクターｐＵｂｉ－ｒＢＥ－ｓｇＲＮＡを得た（図３）。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ－ｓｇＲＮＡは、ｐＵｂｉ－ｒＢＥの素子ａｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ａｔｔＲ２をａｔｔＢ１－ｓｇＲＮＡ発現カセット－ａｔｔＢ２に置き換え、ｐＵｂｉ－ｒＢＥの他のヌクレオチドを変更せずにして得られた組換え発現ベクターである。ＯｓＴｍｓ９遺伝子を標的とするｐＵｂｉ－ｒＢＥ４９ｂ－ｓｇＲＮＡ－Ｏｓｔｍｓ９、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ１４－ｓｇＲＮＡ－Ｏｓｔｍｓ９、およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ４６ｂ－ｓｇＲＮＡ－Ｏｓｔｍｓ９という３種類の塩基編集ベクターをそれぞれ得た。ＯｓＷＲＫＹ４５遺伝子の標的配列１（配列７６、ＮＧＧＰＡＭを含む）を標的とする３種類の塩基編集ベクターは、それぞれｐＵｂｉ－ｒＢＥ４９ｂ－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ１４－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５、およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ４６ｂ－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５であった。ＯｓＤＥＰ２遺伝子を標的とするｐＵｂｉ－ｒＢＥ５３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＤＥＰ２、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ２３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＤＥＰ２およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ６２－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＪＡＲ２という３種類の塩基編集ベクターをそれぞれ得た。ＯｓＷＲＫＹ４５遺伝子の標的配列２（配列７９、ＮＧＴ ＰＡＭを含む）を標的とする３種類の塩基編集ベクターは、それぞれｐＵｂｉ－ｒＢＥ５３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ２３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５、およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ５０－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５であった。ＯｓＧＳ１遺伝子を標的とする３種類の塩基編集ベクターは、それぞれｐＵｂｉ－ｒＢＥ５７－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳ１、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ５４－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳ１、およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ２６－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳ１であった。ＯｓｓＥＲＫ２遺伝子を標的とする２種類の塩基編集ベクターは、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ５７－ｓｇＲＮＡ－ＯｓｓＥＲＫ２およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ５４－ｓｇＲＮＡ－ＯｓｓＥＲＫ２であった。ＯｓＭＰＫ１３遺伝子を標的とする２種類の塩基編集ベクターはｐＵｂｉ－ｒＢＥ６５－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＭＰＫ１３とｐＵｂｉ－ｒＢＥ６２－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＭＰＫ１３であった。ＯｓＧＳＫ４遺伝子を標的とする２種類の塩基編集ベクターは、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ６５－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳＫ４とｐＵｂｉ－ｒＢＥ６２－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳＫ４であった。ＯｓＪＡＲ１遺伝子を標的とする２種類の塩基編集ベクターは、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ６５－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＪＡＲ１とｐＵｂｉ－ｒＢＥ６２－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＪＡＲ１であった。
１、標的配列に対する塩基編集ベクターｐＵｂｉ－ｒＢＥ－ｓｇＲＮＡの構築
選択された標的遺伝子（図１３を参照）のゲノムＤＮＡ配列は、イネゲノムデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）から取得し、ＰＡＭを識別する要件に応じて、各塩基エディターが対応する標的配列、及びフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチド鎖を設計した。図１３中の各標的配列（５’－Ｎ１９ＰＡＭ－３’）のフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチド鎖（具体的な配列は図１３を参照）の合成を株式会社エヌ・ティ・ティ・ドコモに委託し、人工合成した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてプライマーをリン酸化処理し、アニールして二本鎖ＤＮＡ断片（ｓｇＲＮＡを含む標的配列では、５’－Ｎ１９－３’）とし、二本鎖ＤＮＡフラグメントをそれぞれｐＥＮＴＲ４：ｓｇＲＮＡ（図２、ａｔｔＬ１－ｓｇＲＮＡ発現カセット－ａｔｔＬ２を含む）ベクターの２つのＢｔｇＺＩまたは２つのＢｓａＩ酵素切断部位にクローニングした。プライマーＵ６ｐ－Ｆ１（５’－ＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＴＡＡＧＣＣＧＧＡＣ－３’（配列番号３７）を配列決定して、挿入フラグメントが完全に正確であることを確認した後（挿入フラグメントがｓｇＲＮＡを含む標的配列の５’－Ｎ１９－３’）、得られたプラスミドをＡａｔＩＩ酵素カットにより線形化し、ＧａｔｅｗａｙのＬＲ反応により、ｓｇＲＮＡ発現カセット（ｓｇＲＮＡを含むコードＤＮＡ）を水稲アデニン塩基エディター発現ベクターｐＵｂｉ－ｒＢＥ（図１）のａｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ａｔｔＲ２にそれぞれクローニングし、各標的配列のベース編集ベクターｐＵｂｉ－ｒＢＥ－ｓｇＲＮＡを得た（図３）。ｐＵｂｉ－ｒＢＥ－ｓｇＲＮＡは、ｐＵｂｉ－ｒＢＥの素子ａｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ａｔｔＲ２をａｔｔＢ１－ｓｇＲＮＡ発現カセット－ａｔｔＢ２に置き換え、ｐＵｂｉ－ｒＢＥの他のヌクレオチドを変更せずにして得られた組換え発現ベクターである。ＯｓＴｍｓ９遺伝子を標的とするｐＵｂｉ－ｒＢＥ４９ｂ－ｓｇＲＮＡ－Ｏｓｔｍｓ９、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ１４－ｓｇＲＮＡ－Ｏｓｔｍｓ９、およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ４６ｂ－ｓｇＲＮＡ－Ｏｓｔｍｓ９という３種類の塩基編集ベクターをそれぞれ得た。ＯｓＷＲＫＹ４５遺伝子の標的配列１（配列７６、ＮＧＧＰＡＭを含む）を標的とする３種類の塩基編集ベクターは、それぞれｐＵｂｉ－ｒＢＥ４９ｂ－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ１４－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５、およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ４６ｂ－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５であった。ＯｓＤＥＰ２遺伝子を標的とするｐＵｂｉ－ｒＢＥ５３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＤＥＰ２、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ２３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＤＥＰ２およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ６２－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＪＡＲ２という３種類の塩基編集ベクターをそれぞれ得た。ＯｓＷＲＫＹ４５遺伝子の標的配列２（配列７９、ＮＧＴ ＰＡＭを含む）を標的とする３種類の塩基編集ベクターは、それぞれｐＵｂｉ－ｒＢＥ５３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ２３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５、およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ５０－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ４５であった。ＯｓＧＳ１遺伝子を標的とする３種類の塩基編集ベクターは、それぞれｐＵｂｉ－ｒＢＥ５７－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳ１、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ５４－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳ１、およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ２６－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳ１であった。ＯｓｓＥＲＫ２遺伝子を標的とする２種類の塩基編集ベクターは、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ５７－ｓｇＲＮＡ－ＯｓｓＥＲＫ２およびｐＵｂｉ－ｒＢＥ５４－ｓｇＲＮＡ－ＯｓｓＥＲＫ２であった。ＯｓＭＰＫ１３遺伝子を標的とする２種類の塩基編集ベクターはｐＵｂｉ－ｒＢＥ６５－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＭＰＫ１３とｐＵｂｉ－ｒＢＥ６２－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＭＰＫ１３であった。ＯｓＧＳＫ４遺伝子を標的とする２種類の塩基編集ベクターは、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ６５－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳＫ４とｐＵｂｉ－ｒＢＥ６２－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳＫ４であった。ＯｓＪＡＲ１遺伝子を標的とする２種類の塩基編集ベクターは、ｐＵｂｉ－ｒＢＥ６５－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＪＡＲ１とｐＵｂｉ－ｒＢＥ６２－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＪＡＲ１であった。
【0051】
ここで、ｐＥＮＴＲ４：ｓｇＲＮＡの構築方法は以下の通りである：
５’末端から３’末端に向かう方向に、Ｕ６プロモーター配列１、２つのＢｔｇＺＩ酵素カット部位を含むヌクレオチド配列、ｓｇＲＮＡＳｃａｆｆｏｌｄ配列、（Ｔ）８ターミネーター配列、Ｕ６プロモーター配列２、２つのＢｓａＩ酵素カット部位を含むヌクレオチド配列、ｓｇＲＮＡ Ｓｃａｆｆｏｌｄ配列、（Ｔ）８ターミネーター配列を順次に結合させ、ｓｇＲＮＡ発現カセットとした。これを、生工生物工程（上海）有限公司に委託し、人工的に合成させた。同社の合成された遺伝子をテンプレートとして、プライマー対（ｓｇＲＮＡ－Ｆ：５’－ＧＣＡＧＧＣＴＧＴＣＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＴＡＡＧＣＣ－３’（配列３８）およびｓｇＲＮＡ－Ｒ：５’－ＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＡＣＣＧ－３’（配列３９））を増幅して１ｋｂのｓｇＲＮＡ発現カセット断片（ヌクレオチド配列は配列表の配列１１）を取得した。ｐＥＮＴＲ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターをテンプレートとして、ｐＥＮＴＲ４－Ｆ１：（５’－ＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＡＡＧＡ－３’（配列４０）とｐＥＮＴＲ４－Ｒ１：（５’－ＣＴＴＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ－３’（配列４１）を増幅し、２．２ｋｂのｐＥＮＴＲ４ベクター骨格（ｐＥＮＴＲ４のｃｃｄＢ遺伝子発現カセットの断片を除去したＤＮＡ断片）を取得した。試薬カセットＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（南京諾唯賛生物科学技術株式会社から購入）を用いて、ｓｇＲＮＡ発現カセット断片とｐＥＮＴＲ ４ベクター骨格とをｉｎｆｕｓｉｏｎ結合し、ベクターｐＥＮＴＲ ４：ｓｇＲＮＡを獲得した（図２）。そのうちの２つのＢｔｇＺＩまたは２つのＢｓａＩ酵素カット部位はクローン中の特定遺伝子の識別配列（ｓｇＲＮＡの標的配列中の５’－Ｎ１９－３’）に使用されている。配列１１において、２７～３４８位はＵ ６プロモーター配列１、３４９～３８９位は２つのＢｔｇＺＩ部位を含むヌクレオチド断片、３９０～４６５位はｓｇＲＮＡ Ｓｃａｆｆｏｌｄ配列、４６６～４７３位は（Ｔ）８ターミネーター配列、４７４～７８２位はＵ ６プロモーター配列２、７８３～８０６位は２つのＢｓａＩ部位を含むヌクレオチド断片、８０７～８８２位はｓｇＲＮＡ Ｓｃａｆｆｏｌｄ配列、８８３～８９０位は（Ｔ）８ターミネーター配列である。
５’末端から３’末端に向かう方向に、Ｕ６プロモーター配列１、２つのＢｔｇＺＩ酵素カット部位を含むヌクレオチド配列、ｓｇＲＮＡＳｃａｆｆｏｌｄ配列、（Ｔ）８ターミネーター配列、Ｕ６プロモーター配列２、２つのＢｓａＩ酵素カット部位を含むヌクレオチド配列、ｓｇＲＮＡ Ｓｃａｆｆｏｌｄ配列、（Ｔ）８ターミネーター配列を順次に結合させ、ｓｇＲＮＡ発現カセットとした。これを、生工生物工程（上海）有限公司に委託し、人工的に合成させた。同社の合成された遺伝子をテンプレートとして、プライマー対（ｓｇＲＮＡ－Ｆ：５’－ＧＣＡＧＧＣＴＧＴＣＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＴＡＡＧＣＣ－３’（配列３８）およびｓｇＲＮＡ－Ｒ：５’－ＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＡＣＣＧ－３’（配列３９））を増幅して１ｋｂのｓｇＲＮＡ発現カセット断片（ヌクレオチド配列は配列表の配列１１）を取得した。ｐＥＮＴＲ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターをテンプレートとして、ｐＥＮＴＲ４－Ｆ１：（５’－ＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＡＡＧＡ－３’（配列４０）とｐＥＮＴＲ４－Ｒ１：（５’－ＣＴＴＡＧＴＴＣＧＴＴＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴ－３’（配列４１）を増幅し、２．２ｋｂのｐＥＮＴＲ４ベクター骨格（ｐＥＮＴＲ４のｃｃｄＢ遺伝子発現カセットの断片を除去したＤＮＡ断片）を取得した。試薬カセットＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（南京諾唯賛生物科学技術株式会社から購入）を用いて、ｓｇＲＮＡ発現カセット断片とｐＥＮＴＲ ４ベクター骨格とをｉｎｆｕｓｉｏｎ結合し、ベクターｐＥＮＴＲ ４：ｓｇＲＮＡを獲得した（図２）。そのうちの２つのＢｔｇＺＩまたは２つのＢｓａＩ酵素カット部位はクローン中の特定遺伝子の識別配列（ｓｇＲＮＡの標的配列中の５’－Ｎ１９－３’）に使用されている。配列１１において、２７～３４８位はＵ ６プロモーター配列１、３４９～３８９位は２つのＢｔｇＺＩ部位を含むヌクレオチド断片、３９０～４６５位はｓｇＲＮＡ Ｓｃａｆｆｏｌｄ配列、４６６～４７３位は（Ｔ）８ターミネーター配列、４７４～７８２位はＵ ６プロモーター配列２、７８３～８０６位は２つのＢｓａＩ部位を含むヌクレオチド断片、８０７～８８２位はｓｇＲＮＡ Ｓｃａｆｆｏｌｄ配列、８８３～８９０位は（Ｔ）８ターミネーター配列である。
【0052】
２、農桿菌は水稲の安定した遺伝転化を媒介する
得られた各標的遺伝子塩基の編集ベクターを電気ショック法により農桿菌ＥＨＡ １０５に形質転換し（ＥＨＡ １０５電気ショック受容細胞は北京博雅遺伝子技術有限公司から購入）、Ｈｉｅｉら（Ｈｉｅｉ Ｙ．、Ｏｈｔａ Ｓ．、Ｋｏｍａｒｉ Ｔ．、ａｎｄ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ．（１９９４）；Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ－ＤＮＡ． Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：２７１－２８２．）に開示された方法を参考にして、イネ農桿菌が介在する遺伝変換を行い、Ｔ０世代の各標的遺伝子塩基編集イネ材料を得た。
得られた各標的遺伝子塩基の編集ベクターを電気ショック法により農桿菌ＥＨＡ １０５に形質転換し（ＥＨＡ １０５電気ショック受容細胞は北京博雅遺伝子技術有限公司から購入）、Ｈｉｅｉら（Ｈｉｅｉ Ｙ．、Ｏｈｔａ Ｓ．、Ｋｏｍａｒｉ Ｔ．、ａｎｄ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ．（１９９４）；Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ－ＤＮＡ． Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：２７１－２８２．）に開示された方法を参考にして、イネ農桿菌が介在する遺伝変換を行い、Ｔ０世代の各標的遺伝子塩基編集イネ材料を得た。
【0053】
３、Ｔ ０世代のトランスジェニックイネ標的遺伝子座の塩基編集効率の測定
通常のＣＴＡＢ法を用いてＴ ０世代トランスジェニックイネ材料のゲノムＤＮＡを抽出した。
通常のＣＴＡＢ法を用いてＴ ０世代トランスジェニックイネ材料のゲノムＤＮＡを抽出した。
【0054】
各標的遺伝子の標的配列情報及びその検出プライマーは図１４に示す通りであり、プライマーは全て、生工生物工程（上海）株式会社に人工合成を委託した。検査時に関わるＰＣＲ反応はすべて、ハイファイ酵素予備混合液Ｉ－５ ＴＭ ２×Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（克労寧（北京）生物科学技術有限公司から購入）を用いてＰＣＲ増幅の目的の断片を行った。ＰＣＲ製品は直接生工生物工程（上海）株式会社にＳａｎｇｅｒシーケンシングを委託した。
【0055】
シーケンシング結果は以下の通りである：
塩基エディターｒＢＥ １４による、Ｏｓｔｍｓ ９のＮＧＧＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は０％、塩基エディターｒＢＥ ４６ ｂによる、Ｏｓｔｍｓ ９のＮＧＧ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は６４．５８％、塩基エディターｒＢＥ ４９ ｂによる、Ｏｓｔｍｓ ９のＮＧＧ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は９７．９２％（表１）。
塩基エディターｒＢＥ １４による、Ｏｓｔｍｓ ９のＮＧＧＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は０％、塩基エディターｒＢＥ ４６ ｂによる、Ｏｓｔｍｓ ９のＮＧＧ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は６４．５８％、塩基エディターｒＢＥ ４９ ｂによる、Ｏｓｔｍｓ ９のＮＧＧ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は９７．９２％（表１）。
【0056】
Ｔ０世代トランス－ｐＵｂｉ－ｒＢＥ１４－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＴｍｓ９イネ５４株のうち、アデニンＡが脱アンモニアによってグアニンＧに置換されたものが０株あった。Ｔ０世代トランス－ｐＵｂｉ－ｒＢＥ４６ｂ－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＴｍｓ９イネ４８株のうち、アデニンＡが脱アンモニアによってグアニンＧに置換されたものが３１株あった。そのいずれも、標的配列の５’から３’の方向における５位のＡ （図４のＴ５に相当）を脱アンモニアによってＧに置換できた。試験したＴ０世代のトランス－ｐＵｂｉ－ｒＢＥ４９ｂ－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＴｍｓ９イネ４８株のうち４７株は、アデニンＡが脱アンモニアによってグアニンＧに置換され、いずれも、標的配列の５’から３’の方向に第５位のＡ（図４のＴ５に相当）を脱アンモニアによって、Ｇに置換できた。
【0057】
塩基エディターｒＢＥ １４による、ＯｓＷＲＫＹ ４５のＮＧＧＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は０．００％、塩基エディターｒＢＥ ４６ ｂによる、ＯｓＷＲＫＹ ４５のＮＧＧ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は０．００％、塩基エディターｒＢＥ ４９ ｂによる、ＯｓＷＲＫＹ ４５のＮＧＧ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は２．８６％（表１）であった。検出された５３株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ １４－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ ４５イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによってグアニンＧに置換されたものが０株あった。検出された４８株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４６ ｂ－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ ４５イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによってグアニンＧに置換されたものが０株あった。検出された３５株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ４９ ｂ－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ ４５イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが１株ありいずれも、標的配列の５’から３’の方向における第４位のＡを脱アンモニアによってＧに置換できた（図５のＡ ４に対応）。
【0058】
塩基エディターｒＢＥ ２３による、ＯｓＤＥＰ ２のＮＧＡ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は０．００％、塩基エディターｒＢＥ ５０による、ＯｓＤＥＰ ２のＮＧＡ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は２７．０８％、塩基エディターｒＢＥ ５３による、ＯｓＤＥＰ ２のＮＧＡ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は７８．７２％（表２）であった。検出された９６株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ２３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＤＥＰ ２イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが０であった。検出された４８株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５０－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＤＥＰ ２イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが１３株あった。標的配列の５’から３’の方向における４位と６位のＡを脱アンモニアによってＧに置換できたもののうち、４位のアデニンＡ（図６のＡ ４に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが１０株、６位のアデニンＡ（図６のＡ ６に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが１３株あった。検出された４７株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＤＥＰ ２イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが３７株あった。標的配列５’から３’の方向における第４位と第６位のＡを脱アンモニアによってＧに置換できたもののうち、４位のアデニンＡ（図６中のＡ ４に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが３７株あり、６位のアデニンＡ（図６中のＡ ６に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが２８株あった。
【0059】
塩基エディターｒＢＥ ２３による、ＯｓＷＲＫＹ ４５のＮＧＰＡＭターゲットに対するターゲット基編集効率は０％、塩基エディターｒＢＥ ５０による、ＯｓＷＲＫＹ ４５のＮＧＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は８９．３６％、塩基エディターｒＢＥ ５３による、ＯｓＷＲＫＹ ４５のＮＧＴ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は９３．７５％（表２）であった。検出された５２株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ２３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ ４５イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが０株あった。検出された４７株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５０－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ ４５イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが４２株あり、いずれも、標的配列の５’から３’の方向における第５位のＡを脱アンモニアによってＧに置換できた（図７のＴ５に対応）。検出された４８株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５３－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＷＲＫＹ ４５イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが４５株あり、いずれも、標的配列の５’から３’の方向における５位のＡを脱アンモニアによりＧに置換できた（図７のＴ５に対応）。
【0060】
塩基エディターｒＢＥ ２６による、ＯｓＧＳ １のＮＡＧ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は０．００％、塩基エディターｒＢＥ ５４による、ＯｓＧＳ １のＮＡＧ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は２５．００％、塩基エディターｒＢＥ ５７による、ＯｓＧＳ １のＮＡＧ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は５４．１７％（表３）であった。検出された３６株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ２６－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳ １イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが０株あった。検出された４８株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５４－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳ １イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが１２株あり、標的配列の５’から３’の方向における第３、６及び９位のＡを脱アンモニアによってＧに置換できたもののうち、第３位のアデニンＡ（図８中のＡ３に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが３株、第６位のアデニンＡ（図８中のＡ６に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたもの１１株、第９位のアデニンＡ（図８中のＡ９に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが１２株あった。検出された４８株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５７－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳ １イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが２３株あり、標的配列の５’から３’の方向における第３、４、６、９及び１１位のＡを脱アンモニアによってＧに置換できたもののうち、第３位のアデニンＡ（図８中のＡ３に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが２６株、第４位のアデニンＡ（図８中のＡ４に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが１３株、第６位のアデニンＡ（図８中のＡ６に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが２６株、第９位のアデニンＡ（図８中のＡ９に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが２６株、１１位のアデニンＡ（図８のＡ１１に対応）が脱アンモニアによりＧに置換されたものが１株あった。
【0061】
塩基エディターｒＢＥ５４による、ＯｓｓＥＲＫ２のＮＡＧ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は２８．２６％、塩基エディターｒＢＥ ５７による、ＯｓｓＥＲＫ２のＮＡＧ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は７２．３４％（表３）であった。検出された４６株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５４－ｓｇＲＮＡ－ＯｓｓＥＲＫ ２イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが１３株あった。標的配列の５’から３’の方向における第４及び６位のＡを脱アンモニアによりＧに置換できたもののうち、第４位のアデニンＡ（図９中のＴ４に対応）が脱アンモニアによりＧに置換されたものが３株、第６位のアデニンＡ（図９中のＴ６に対応）が脱アンモニアによりＧに置換されたものが１３株あった。検出された４７株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ５７－ｓｇＲＮＡ－ＯｓｓＥＲＫ ２イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが３４株あり、標的配列の５’から３’の方向における第４及び６位のＡを脱アンモニアによりＧに置換できたもののうち、第４位のアデニンＡ（図９中のＴ４に対応）が脱アンモニアによりＧに置換されたものが３４株、第６位のアデニンＡ（図９中のＴ６に対応）が脱アンモニアによりＧに置換されたものが３４株あった。
【0062】
塩基エディターｒＢＥ ６２による、ＯｓＭＰＫ １３のＮＡＡ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は２９．１７％、塩基エディターｒＢＥ ６５による、ＯｓＭＰＫ １３のＮＡＡ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は３１．９１％（表４）であった。検出された４８株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６２－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＭＰＫ １３イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが１４株あり、いずれも、標的配列の５’から３’の方向における６位のＡ（図１０のＡ６に対応）が脱アンモニアによりＧに置換された。検出された４７株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６５－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＭＫ １３イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが１５株あり、標的配列の５’から３’の方向における第４及び６位のＡを脱アンモニアによってＧに置換できたもののうち、第４位のアデニンＡ（図１０中のＡ４に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが２株、第６位のアデニンＡ（図１０中のＡ６に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが１５株あった。
【0063】
塩基エディターｒＢＥ ６２による、ＯｓＧＳＫ ４のＮＡＣ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は５１．２８％、塩基エディターｒＢＥ６５による、ＯｓＧＳＫ ４のＮＡＣ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は７３．１７％（表４）であった。検出された３９株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６２－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳＫ ４イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが２０株あり、標的配列の５’から３’の方向における第４及び１１位のＡを脱アンモニアによってＧに置換できたもののうち、第４位のアデニンＡ（図１１のＴ４に対応）が脱アンモニアによりＧに置換されたものが２０株、第１１位のアデニンＡ（図１１のＴ１１に対応）が脱アンモニアによりＧに置換されたものが２株あった。検出された４１株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６５－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＧＳＫ ４イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが３０株、標的配列の５’から３’の方向における第４、８、９及び１１位のＡを脱アンモニアによってＧに置換できたもののうち、第４位のアデニンＡ（図１１中のＴ ４に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが３０株、第８位のアデニンＡ（図１１中のＴ ８に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが１株、第９位のアデニンＡ（図１１中のＴ ９に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが１株、第１１位のアデニンＡ（図１１中のＴ １１に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが９株あった。
【0064】
塩基エディターｒＢＥ ６２による、ＯｓＪＡＲ １のＮＡＴ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は３６．１７％、塩基エディターｒＢＥ ６５による、ＯｓＪＡＲ １のＮＡＴ ＰＡＭターゲットに対するターゲット塩基編集効率は４５．００％（表４）であった。検出された４７株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６２－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＪＡＲ １イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが１７株あり、標的配列の５’から３’の方向における４位と６位のＡを脱アンモニアによってＧに置換できたもののうち、４位のアデニンＡ（図１２中のＴ４に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが１７株、６位のアデニンＡ（図１２中のＴ６に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが９株あった。検出された４０株のＴ ０世代のトランスｐＵｂｉ－ｒＢＥ ６５－ｓｇＲＮＡ－ＯｓＪＡＲ １イネのうち、アデニンＡが脱アンモニアによりグアニンＧに置換されたものが１８株あり、標的配列の５’から３’の方向における第２、４及び６位のＡを脱アンモニアによってＧに置換できたもののうち、第２位のアデニンＡ（図１２中のＴ ２に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが３株、第４位のアデニンＡ（図１２中のＴ ４に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが１８株、第６位のアデニンＡ（図１２中のＴ ６に対応）が脱アンモニアによってＧに置換されたものが１８株あった。
【0065】
上記の結果から、本発明におけるＴａｄＡ ９とＳｐＣａｓ ９ ｎ／ＳｃＣａｓ ９／ＳｐＣａｓ ９－ＮＧ／ＳｐＲＹとの融合後に媒介されるアデニン塩基編集技術の編集効率はＴａｄＡ ７．１０などのＴａｄＡ－Ｒ変異体に媒介されるアデニン塩基編集技術よりはるかに高く、かつその編集活性窓を拡張でき、アデニン塩基編集技術の効率を高め、その応用範囲を広げることができる。
【0066】
【0067】
【0068】
【0069】
【0070】
以上、本発明を詳細に説明した。当業者であれば、本発明を、本発明の目的および範囲から逸脱することなく、また不必要な実験をせずに、広範囲の同等のパラメータ、濃度および条件にて実施することができる。本発明は特定の実施形態が与えられているが、本発明に対してさらなる改良を加えることができることが理解されるべきである。要するに、本発明の原理に従って、本願は、本願の開示範囲外で当技術分野にて既知の従来技術を使用して実施される変更を含む。本発明の任意の変更、使用または改良を含むことが意図されている。添付した特許請求の範囲に従って、本質的な特徴にかかる応用が可能である。
【産業上の利用可能性】
【0071】
本発明は、ＴａｄＡタンパク質を人為に変異させることにより高活性変異体ＴａｄＡ９を取得し、これを用いて新規ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベース編集ツールキットを開発する。ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ（Ｄ１０Ａ）、ＳｃＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＲＹ（Ｄ１０Ａ）との融合を介したアデニン塩基編集技術は、ＴａｄＡ７．１０およびＴａｄＡ－Ｒ変異体を介したアデニン塩基編集技術よりも編集効率が著しく高く、その編集活性の範囲を拡張し、アデニン塩基編集技術の効率を向上させ、その応用範囲を広げることができる。特に、ＴａｄＡ７．１０を介した塩基編集ベクターでは編集できないターゲットでのアデニン塩基編集の問題を解決し、植物ゲノムの標的編集への利用範囲を広げ、植物研究および作物遺伝子改良分野の研究者へ遺伝子機能研究および修正に重要なツールセットを提供することができる。本発明は、アデニン塩基編集の効率を向上させ、標的部位の塩基変異を正確に媒介することができ、イネ、さらには他の植物細胞においても広く応用することが可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】