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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-18
(45)【発行日】2024-12-26
(54)【発明の名称】突然変異体ＶＳＶ細胞外ドメインポリペプチドおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/145 20060101AFI20241219BHJP
C12N 15/47 20060101ALI20241219BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241219BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241219BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241219BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241219BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20241219BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241219BHJP
A61K 35/766 20150101ALI20241219BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20241219BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241219BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241219BHJP
【ＦＩ】
C07K14/145 ZNA
C12N15/47
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K19/00
C12N15/62 Z
A61K38/16
A61K31/7088
A61K35/766
A61K35/12
A61P35/00
A61K48/00
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2022502322
(86)(22)【出願日】2020-03-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-30
(86)【国際出願番号】 EP2020057144
(87)【国際公開番号】W WO2020187850
(87)【国際公開日】2020-09-24
【審査請求日】2022-10-21
(31)【優先権主張番号】19305317.0
(32)【優先日】2019-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】506316557
【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(73)【特許権者】
【識別番号】520179305
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ パリ－サクレー
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ－ＳＡＣＬＡＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】アルベルティーニ オーレリー
(72)【発明者】
【氏名】ロー エレーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ゴーダン イヴ
(72)【発明者】
【氏名】ペレス フランク
【審査官】大西 隆史
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０５０７３８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５０３６６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】AMMAYAPPAN, Arun et al.，Journal of Virology，2013年12月，Vol. 87, No. 24，pp. 13543-13555，DOI: 10.1128/JVI.02240-13
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ａ６１Ｋ ３５／００－５１／１２
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）株の糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む突然変異体ポリペプチドであって、前記細胞外ドメインが、下記：ａ）配列番号２の４２２位および２２位に位置する任意のアミノ酸残基；または
ｂ）配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２位および２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基
からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列、または配列番号４、６、８、又は１０に記載のアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、
前記配列番号２の４２２位に位置する任意のアミノ酸残基、又は配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基の置換は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群から選択される疎水性アミノ酸への置換であり、且つ
前記配列番号２の２２位に位置する任意のアミノ酸残基、又は配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基の置換は、ヒスチジンのアスパラギンへの置換である、
前記突然変異体ポリペプチド。
【請求項2】
配列番号１７～７１からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の突然変異体ポリペプチド。
【請求項3】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）株の糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む突然変異体ポリペプチドであって、前記細胞外ドメインが、下記：
ａ）配列番号２の４２２位および２２位に位置する任意のアミノ酸残基；または
ｂ）配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２位および２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基
からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含み、且つ
配列番号２の８、４７、２０９、および３５４位に位置するアミノ酸残基、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の８、４７、２０９、および３５４位に相当する位置に位置するアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つの置換をさらに含む、
配列番号２に記載のアミノ酸配列、または配列番号４、６、８、又は１０に記載のアミノ酸配列、または配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、
前記配列番号２の４２２位に位置する任意のアミノ酸残基、又は配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基の置換は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群から選択される疎水性アミノ酸への置換であり、且つ
前記配列番号２の２２位に位置する任意のアミノ酸残基、又は配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基の置換は、ヒスチジンのアスパラギンへの置換である、
前記突然変異体ポリペプチド。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチドと、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とを含む融合ポリペプチドであって、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、突然変異体ポリペプチドのＮ末端に挿入されているか、あるいは配列番号２の１９２～２０２、２４０～２５７、３４７～３５３、３６４～３６６、もしくは３７６～３７９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間に挿入されている、融合ポリペプチド。
【請求項5】
前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、細胞受容体のリガンドの少なくとも一部である、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項6】
請求項１～３のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、または請求項４もしくは請求項５に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項7】
少なくとも１つの、請求項６に記載の核酸を含むか、あるいは請求項１～３のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、または請求項４もしくは請求項５に記載の融合ポリペプチドを発現するベクター。
【請求項8】
ウイルスベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項9】
請求項１～３のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、または請求項４もしくは請求項５に記載の融合ポリペプチドを含有するか、またはこれを発現するか、あるいは請求項６に記載の核酸分子を含有するか、あるいは請求項７～８のいずれか１項に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項10】
請求項１～３のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、請求項４もしくは請求項５に記載の融合ポリペプチド、請求項６に記載の核酸分子、請求項７～８のいずれか１項に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、またはこれらの任意の組合せを含む組成物。
【請求項11】
薬物としての使用のための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
がんを処置するための使用、遺伝子治療のための使用、または免疫療法のための使用のための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項13】
カーゴを、選択された細胞型にｉｎ ｖｉｖｏで選択的に送達するための、または対象における前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特にがん細胞などの死滅させられるべき細胞にターゲティングするための使用のための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項14】
カーゴを、選択された細胞型にｉｎ ｖｉｔｒｏで選択的に送達するための、または前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特にがん細胞などの死滅させられるべき細胞にターゲティングするための、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける請求項１０に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特性が改善されたウイルスの分野にあり、より特定すると、特性が改善されたＶＳＶウイルス、特に、腫瘍溶解がん療法、遺伝子治療、免疫療法、およびカーゴの、選び出された細胞型への選択的送達における使用のための分野における発明であり、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）株の糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む突然変異体ポリペプチドであって、前記細胞外ドメインが、下記：
ａ）配列番号２の４２１位～４２９位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基；または
ｂ）配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２９位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基
からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を有する、配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または配列番号２に明示されたアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、突然変異体ポリペプチドに関する。
ａ）配列番号２の４２１位～４２９位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基；または
ｂ）配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２９位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基
からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を有する、配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または配列番号２に明示されたアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、突然変異体ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【0002】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）科のベシクロウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）属に属する、エンベロープ型のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ＶＳＶは、昆虫、ウシ、ウマ、およびブタに感染しうるアルボウイルスである。哺乳動物において、ＶＳＶは、正常細胞を温存しながら、腫瘍細胞に感染し、これらを死滅させるその能力をもつので、がんを処置するために有望な腫瘍溶解性ウイルスである（Barber. Oncogene 24, 7710-7719 (2005)；Fernandez et al. J. Virol. 76, 895-904 (2002)；Hastie et al. Virus Res. 176, 16-32 (2013)）。
ＶＳＶゲノムは、１１ｋｂの一本鎖マイナスセンスＲＮＡからなる（図１Ａ）。ＶＳＶゲノムは、５つの構造タンパク質をコードする、５つの遺伝子を含有し、それらのうちの１つは、特に、膜貫通糖タンパク質である糖タンパク質Ｇをコードする（図１Ａおよび１Ｂ）。糖タンパク質Ｇは、感染早期に、鍵となる役割を果たす（Albertini et al. Viruses 4, 117-139 (2012)）。まず、その細胞受容体（ＬＤＬ－ＲまたはＬＤＬ－Ｒファミリーのメンバー）と相互作用することにより、糖タンパク質Ｇは、ウイルスの付着を可能とする。次いで、ビリオンのエンドサイトーシスの後で、糖タンパク質Ｇは、エンドソームの内部の酸性化により誘導される、融合前形態から融合後形態へのコンフォメーション変化を受ける。この構造的転移は、ウイルス膜とエンドソーム膜との融合を触媒する。
ＶＳＶゲノムは、１１ｋｂの一本鎖マイナスセンスＲＮＡからなる（図１Ａ）。ＶＳＶゲノムは、５つの構造タンパク質をコードする、５つの遺伝子を含有し、それらのうちの１つは、特に、膜貫通糖タンパク質である糖タンパク質Ｇをコードする（図１Ａおよび１Ｂ）。糖タンパク質Ｇは、感染早期に、鍵となる役割を果たす（Albertini et al. Viruses 4, 117-139 (2012)）。まず、その細胞受容体（ＬＤＬ－ＲまたはＬＤＬ－Ｒファミリーのメンバー）と相互作用することにより、糖タンパク質Ｇは、ウイルスの付着を可能とする。次いで、ビリオンのエンドサイトーシスの後で、糖タンパク質Ｇは、エンドソームの内部の酸性化により誘導される、融合前形態から融合後形態へのコンフォメーション変化を受ける。この構造的転移は、ウイルス膜とエンドソーム膜との融合を触媒する。
【0003】
糖タンパク質Ｇは、ＶＳＶの指向性の一因となる唯一のタンパク質である。この指向性は、ＬＤＬ－Ｒファミリーメンバーの遍在的性格に起因して、広範であり、ＶＳＶが、多くの細胞型に侵入することを可能とする。例えば、ＶＳＶ糖タンパク質Ｇが、多くのレトロウイルスベクターを偽型化するのに使用されるのは、このためである。しかしながら、この広範な指向性にもかかわらず、いくつかの細胞型は、ＶＳＶ受容体の発現レベルが低度であるに過ぎないか、またはＶＳＶ受容体を保有しない（休眠Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＣＤ３４１細胞など）（Amirache. Blood 123, 1422-4 (2014)）。
よって、指向性が変更された改変ＶＳＶウイルスが必要とされている。このような改変ＶＳＶウイルスであれば、天然ＶＳＶ受容体を保有しない細胞型に感染するであろう。
この問題を克服するために、本発明者らは、ＶＳＶ糖タンパク質Ｇのアミノ酸配列内に、所与の受容体を特異的に認識するターゲティング部分（ナノボディーなど）の配列の挿入を可能とする部位を同定しようと努めた。特に、この挿入は、糖タンパク質Ｇの膜融合特性に干渉すべきでない。
本発明者らは、いくつかの挿入部位について解析し、アミノ末端部位が、ナノボディーの挿入を許容することを裏付けた。結果として得られる初期キメラ（図２に正確に記載される、ＧＮａｎｏ）は、適正にフォールディングされ、細胞膜へと輸送された。初期キメラは、その融合特性を保持していた（それにもかかわらず、弱毒化されていた）。
よって、指向性が変更された改変ＶＳＶウイルスが必要とされている。このような改変ＶＳＶウイルスであれば、天然ＶＳＶ受容体を保有しない細胞型に感染するであろう。
この問題を克服するために、本発明者らは、ＶＳＶ糖タンパク質Ｇのアミノ酸配列内に、所与の受容体を特異的に認識するターゲティング部分（ナノボディーなど）の配列の挿入を可能とする部位を同定しようと努めた。特に、この挿入は、糖タンパク質Ｇの膜融合特性に干渉すべきでない。
本発明者らは、いくつかの挿入部位について解析し、アミノ末端部位が、ナノボディーの挿入を許容することを裏付けた。結果として得られる初期キメラ（図２に正確に記載される、ＧＮａｎｏ）は、適正にフォールディングされ、細胞膜へと輸送された。初期キメラは、その融合特性を保持していた（それにもかかわらず、弱毒化されていた）。
【発明の概要】
【0004】
本発明の文脈において、次いで、本発明者らは、野生型糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子が、ＧＮａｎｏ（初期キメラ）をコードする遺伝子で置きかえられた、組換えＶＳＶを構築した。しかし、この初期組換えＶＳＶウイルスの増幅は、極めて困難であり、ＢＳＲ細胞内の、２４時間後にわたる増幅の後で、極めて低度の感染力価、約１．８．１０6ｐｆｕ／ｍｌが得られただけであった。このような低力価は、治療を意図するターゲティング型ＶＳＶウイルスの産業的作製に適合しない。
次いで、本発明者らは、その増幅を改善する突然変異を選択するために、この組換えウイルスの、ＢＳＲ細胞上における、何代かにわたる継代を実施した。１０継代の後、ウイルス集団のゲノムに対するシーケンシングは、２２位におけるヒスチジン残基の、アスパラギンへの変化（Ｈ２２Ｎ置換）、および４２２位におけるセリン残基の、イソロイシンへの変化（Ｓ４２２Ｉ置換）を結果としてもたらす、糖タンパク質のヌクレオチド配列内における２つの突然変異を含有する変異体による、この集団への漸進的侵入を示した。この最適化の後に得られる、組換えウイルスの力価は、約１０8ｐｆｕ／ｍｌであった。
次いで、本発明者らは、その増幅を改善する突然変異を選択するために、この組換えウイルスの、ＢＳＲ細胞上における、何代かにわたる継代を実施した。１０継代の後、ウイルス集団のゲノムに対するシーケンシングは、２２位におけるヒスチジン残基の、アスパラギンへの変化（Ｈ２２Ｎ置換）、および４２２位におけるセリン残基の、イソロイシンへの変化（Ｓ４２２Ｉ置換）を結果としてもたらす、糖タンパク質のヌクレオチド配列内における２つの突然変異を含有する変異体による、この集団への漸進的侵入を示した。この最適化の後に得られる、組換えウイルスの力価は、約１０8ｐｆｕ／ｍｌであった。
【0005】
こうして、驚くべきことに、本発明者らは、組換えウイルス（ＧＮａｎｏ Ｈ２２Ｎ Ｓ４２２Ｉまたは改善型キメラ；図２を参照されたい）が、ＢＳＲ細胞内で、２４時間にわたる増幅の後（実施例１を参照されたい）に、約１０8ｐｆｕ／ｍｌで作製されることを、２種の突然変異の組合せ（Ｈ２２ＮおよびＳ４２２Ｉ）が可能とすることを見出した。
さらに、本発明者らはまた、置換Ｓ４２２Ｉが、置換Ｈ４０７Ａにより完全に消失させられるＧ融合特性をレスキューすることが可能であることも見出した。この文脈で、本発明者らは、Ｓ４２２Ｉが、ＬＤＬ－Ｒ ＣＲドメインの認識を改善する（融合後状態への構造的転移は、ＣＲドメイン結合性部位を破壊する）ことを示すことにより、Ｓ４２２Ｉが、Ｇのフォールディングを容易とし、Ｇの融合前形態を安定化させることを裏付けた。
ＧＮａｎｏ Ｈ２２Ｎの文脈では、本発明者らはまた、置換Ｓ４２２Ｆ、Ｓ４２２Ｍ、Ｓ４２２Ｌ、またはＳ４２２Ｖが、Ｓ４２２Ｉと類似の表現型を有することも裏付けた。
さらに、本発明者らはまた、置換Ｓ４２２Ｉが、置換Ｈ４０７Ａにより完全に消失させられるＧ融合特性をレスキューすることが可能であることも見出した。この文脈で、本発明者らは、Ｓ４２２Ｉが、ＬＤＬ－Ｒ ＣＲドメインの認識を改善する（融合後状態への構造的転移は、ＣＲドメイン結合性部位を破壊する）ことを示すことにより、Ｓ４２２Ｉが、Ｇのフォールディングを容易とし、Ｇの融合前形態を安定化させることを裏付けた。
ＧＮａｎｏ Ｈ２２Ｎの文脈では、本発明者らはまた、置換Ｓ４２２Ｆ、Ｓ４２２Ｍ、Ｓ４２２Ｌ、またはＳ４２２Ｖが、Ｓ４２２Ｉと類似の表現型を有することも裏付けた。
【0006】
本発明者らはまた、Ｈ２２Ｎ置換、および／またはＳ４２２Ｉ置換、Ｓ４２２Ｆ置換、Ｓ４２２Ｍ置換、Ｓ４２２Ｌ置換、もしくはＳ４２２Ｖ置換の存在下で、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ Ｇシグナルペプチド、ジペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディー、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）リンカー、ならびに置換Ｓ４２２Ｉ、Ｓ４２２Ｆ、Ｓ４２２Ｍ、Ｓ４２２Ｌ、およびＳ４２２Ｖのうちの１つを伴うＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ Ｇ細胞外ドメインからなる融合ポリペプチドを発現する組換えＶＳＶが、５．５～６．３の間の低ｐＨへ曝露された場合に、野生型ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａと同様に、合胞体を形成することが可能であることも検証した。これはまた、４２２位における疎水性残基の存在が、ｐＨ依存性構造的転移の調節において鍵となり、Ｇのフォールディングを容易とし、Ｎ末端の細胞外ドメインにナノボディーを挿入された、Ｇの融合ポリペプチドの融合前形態を安定化させる（実施例３を参照されたい）ことも示唆する。これはまた、本発明者らにより解明された、ＶＳＶ Ｇ細胞外ドメインの結晶構造によっても確認される。実際、本発明者らは、驚くべきことに、Ｃ末端部分（残基４０７～残基４２９、より特定すると、残基４２１～残基４２９に位置する領域、なおより特定すると、残基４２１～残基４２５の領域）は、大部分が、融合ドメインと相互作用するので、融合前複合体の安定化に寄与することを示した。結晶構造は、Ｓ４２２残基の、疎水性残基（Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、またはＶなど）による補償的置換が、疎水性相互作用を介して、ベータ－ヘアピン構造（したがって、融合前状態）を安定化させる（実施例４を参照されたい）ことを、さらに明らかにした。
【0007】
したがって、第１の態様では、本発明は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）株の糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなり、前記細胞外ドメインが、下記：
ａ）配列番号２の４２１位～４２９位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２の４２１位～４２５位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２の４２２および２２位に位置する任意のアミノ酸残基；または
ｂ）配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２９位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２および２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基
からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を有する、配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または配列番号２に明示されたアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる突然変異体ポリペプチドに関する。
ａ）配列番号２の４２１位～４２９位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２の４２１位～４２５位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２の４２２および２２位に位置する任意のアミノ酸残基；または
ｂ）配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２９位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２および２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基
からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を有する、配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または配列番号２に明示されたアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる突然変異体ポリペプチドに関する。
【0008】
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドと、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる融合ポリペプチドであって、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、
ａ）突然変異体ポリペプチドのＮ末端、
ｂ）配列番号２の１９２～２０２位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｃ）配列番号２の２４０～２５７位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｄ）配列番号２の３４７～３５３位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｅ）配列番号２の３６４～３６６位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｆ）配列番号２の３７６～３７９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間
に挿入されており、
好ましくは、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、突然変異体ポリペプチドのＮ末端に挿入されているか、または配列番号２の３５１および３５２位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置におけるアミノ酸の間に挿入されている、融合ポリペプチドにも関する。
ａ）突然変異体ポリペプチドのＮ末端、
ｂ）配列番号２の１９２～２０２位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｃ）配列番号２の２４０～２５７位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｄ）配列番号２の３４７～３５３位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｅ）配列番号２の３６４～３６６位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｆ）配列番号２の３７６～３７９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間
に挿入されており、
好ましくは、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、突然変異体ポリペプチドのＮ末端に挿入されているか、または配列番号２の３５１および３５２位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置におけるアミノ酸の間に挿入されている、融合ポリペプチドにも関する。
【0009】
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸分子にも関する。
本発明はまた、少なくとも１つの、本発明に従う核酸を含むか、または本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを発現するベクターにも関する。
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを含有するか、またはこれらを発現するか、または本発明に従う核酸分子を含有するか、または本発明に従うベクター（特に、ＶＳＶベクター）を含有する宿主細胞にも関する。
本発明はまた、少なくとも１つの、本発明に従う核酸を含むか、または本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを発現するベクターにも関する。
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを含有するか、またはこれらを発現するか、または本発明に従う核酸分子を含有するか、または本発明に従うベクター（特に、ＶＳＶベクター）を含有する宿主細胞にも関する。
【0010】
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、本発明に従う核酸分子、本発明に従うベクター、本発明に従う宿主細胞、またはこれらの任意の組合せを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物にも関する。
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、本発明に従う核酸分子、本発明に従うベクター、本発明に従う宿主細胞、本発明に従う組成物、またはこれらの任意の組合せの治療的使用にも関する。
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、本発明に従う核酸分子、本発明に従うベクター、本発明に従う宿主細胞、本発明に従う組成物、またはこれらの任意の組合せの治療的使用にも関する。
【0011】
本発明はまた、対象において、前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドにアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特に、がん細胞など、死滅させられる細胞へとターゲティングするための使用のための、本発明に従う突然変異体ポリペプチド、または本発明に従う融合ポリペプチドにも関する。
本発明はまた、前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特に、がん細胞など、死滅させられる細胞へとターゲティングするための、本発明に従う突然変異体ポリペプチド、または本発明に従う融合ポリペプチドの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用にも関する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）株の糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む突然変異体ポリペプチドであって、前記細胞外ドメインが、下記ａ）またはｂ）からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を有する、配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または配列番号２に明示されたアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記突然変異体ポリペプチド：
ａ）配列番号２の４２１位～４２９位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２の４２１位～４２５位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２の４２２位および２２位に位置する任意のアミノ酸残基；または
ｂ）配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置から４２９位に相当する位置までに位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置から２５位に相当する位置までに位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置から４２５位に相当する位置までに位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置から２５位に相当する位置までに位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２位および２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基。
〔２〕ａ）配列番号２の４２１位～４２９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基が、疎水性アミノ酸、好ましくは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、およびトリプトファン（Ｗ）、より好ましくは、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）、さらにより好ましくは、イソロイシン（Ｉ）からなる群から選択される、疎水性アミノ酸により置換され；かつ／または
ｂ）配列番号２の１７位～２５位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基が、極性アミノ酸、好ましくは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、より好ましくは、アスパラギン（Ｎ）からなる群から選択される、極性アミノ酸により置換されている、
前記〔１〕に記載の突然変異体ポリペプチド。
〔３〕配列番号１７～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、前記〔１〕または前記〔２〕に記載の突然変異体ポリペプチド。
〔４〕配列番号２の８、４７、２０９、および３５４位に位置するアミノ酸残基、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の８、４７、２０９、および３５４位に相当する位置に位置するアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換をさらに含み、好ましくは、配列番号２の４７位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換、配列番号２の３５４位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換、または配列番号２の４７および３５４位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における２つの置換をさらに含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド。
〔５〕前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチドと、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とを含む融合ポリペプチドであって、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、突然変異体ポリペプチドのＮ末端に挿入されているか、あるいは配列番号２の１９２～２０２、２４０～２５７、３４７～３５３、３６４～３６６、もしくは３７６～３７９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間に挿入されており、好ましくは、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、突然変異体ポリペプチドのＮ末端に挿入されているか、または配列番号２の３５１および３５２位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置におけるアミノ酸の間に挿入されている、融合ポリペプチド。
〔６〕前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、細胞受容体のリガンドの少なくとも一部、好ましくは、抗体またはナノボディーなどの機能的抗体断片、例えば、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＭＵＣ１８抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、もしくは抗ＣＤ５２抗体、またはナノボディーなどの機能的抗体断片である、前記〔５〕に記載の融合ポリペプチド。
〔７〕前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、または前記〔５〕もしくは前記〔６〕に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
〔８〕少なくとも１つの、前記〔７〕に記載の核酸を含むか、あるいは前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、または前記〔５〕もしくは前記〔６〕に記載の融合ポリペプチドを発現するベクター。
〔９〕ウイルスベクター、好ましくは、ＶＳＶベクターであり、より好ましくは、前記ウイルスベクターが、感染性ウイルス粒子の形態にある、前記〔８〕に記載のベクター。
〔１０〕前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、または前記〔５〕もしくは前記〔６〕に記載の融合ポリペプチドを含有するか、またはこれを発現するか、あるいは前記〔７〕に記載の核酸分子を含有するか、あるいは前記〔８〕～〔９〕のいずれか１項に記載のベクターを含有する宿主細胞。
〔１１〕前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、前記〔５〕もしくは前記〔６〕に記載の融合ポリペプチド、前記〔７〕に記載の核酸分子、前記〔８〕～〔９〕のいずれか１項に記載のベクター、前記〔１０〕に記載の宿主細胞、またはこれらの任意の組合せを含む組成物。
〔１２〕薬物としての使用のための、前記〔１１〕に記載の組成物。
〔１３〕がんを処置するための使用、遺伝子治療のための使用、または免疫療法のための使用のための、前記〔１１〕に記載の組成物。
〔１４〕カーゴを、選択された細胞型にｉｎ ｖｉｖｏで選択的に送達するための、または対象における前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特にがん細胞などの死滅させられるべき細胞にターゲティングするための使用のための、前記〔１１〕に記載の組成物。
〔１５〕カーゴを、選択された細胞型にｉｎ ｖｉｔｒｏで選択的に送達するための、または前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特にがん細胞などの死滅させられるべき細胞にターゲティングするための、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける前記〔１１〕に記載の組成物の使用。
本発明はまた、前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特に、がん細胞など、死滅させられる細胞へとターゲティングするための、本発明に従う突然変異体ポリペプチド、または本発明に従う融合ポリペプチドの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用にも関する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）株の糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む突然変異体ポリペプチドであって、前記細胞外ドメインが、下記ａ）またはｂ）からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を有する、配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または配列番号２に明示されたアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記突然変異体ポリペプチド：
ａ）配列番号２の４２１位～４２９位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２の４２１位～４２５位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２の４２２位および２２位に位置する任意のアミノ酸残基；または
ｂ）配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置から４２９位に相当する位置までに位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置から２５位に相当する位置までに位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置から４２５位に相当する位置までに位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置から２５位に相当する位置までに位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２位および２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基。
〔２〕ａ）配列番号２の４２１位～４２９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基が、疎水性アミノ酸、好ましくは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、およびトリプトファン（Ｗ）、より好ましくは、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）、さらにより好ましくは、イソロイシン（Ｉ）からなる群から選択される、疎水性アミノ酸により置換され；かつ／または
ｂ）配列番号２の１７位～２５位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基が、極性アミノ酸、好ましくは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、より好ましくは、アスパラギン（Ｎ）からなる群から選択される、極性アミノ酸により置換されている、
前記〔１〕に記載の突然変異体ポリペプチド。
〔３〕配列番号１７～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、前記〔１〕または前記〔２〕に記載の突然変異体ポリペプチド。
〔４〕配列番号２の８、４７、２０９、および３５４位に位置するアミノ酸残基、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の８、４７、２０９、および３５４位に相当する位置に位置するアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換をさらに含み、好ましくは、配列番号２の４７位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換、配列番号２の３５４位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換、または配列番号２の４７および３５４位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における２つの置換をさらに含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド。
〔５〕前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチドと、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とを含む融合ポリペプチドであって、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、突然変異体ポリペプチドのＮ末端に挿入されているか、あるいは配列番号２の１９２～２０２、２４０～２５７、３４７～３５３、３６４～３６６、もしくは３７６～３７９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間に挿入されており、好ましくは、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、突然変異体ポリペプチドのＮ末端に挿入されているか、または配列番号２の３５１および３５２位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置におけるアミノ酸の間に挿入されている、融合ポリペプチド。
〔６〕前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、細胞受容体のリガンドの少なくとも一部、好ましくは、抗体またはナノボディーなどの機能的抗体断片、例えば、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＭＵＣ１８抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、もしくは抗ＣＤ５２抗体、またはナノボディーなどの機能的抗体断片である、前記〔５〕に記載の融合ポリペプチド。
〔７〕前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、または前記〔５〕もしくは前記〔６〕に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
〔８〕少なくとも１つの、前記〔７〕に記載の核酸を含むか、あるいは前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、または前記〔５〕もしくは前記〔６〕に記載の融合ポリペプチドを発現するベクター。
〔９〕ウイルスベクター、好ましくは、ＶＳＶベクターであり、より好ましくは、前記ウイルスベクターが、感染性ウイルス粒子の形態にある、前記〔８〕に記載のベクター。
〔１０〕前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、または前記〔５〕もしくは前記〔６〕に記載の融合ポリペプチドを含有するか、またはこれを発現するか、あるいは前記〔７〕に記載の核酸分子を含有するか、あるいは前記〔８〕～〔９〕のいずれか１項に記載のベクターを含有する宿主細胞。
〔１１〕前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の突然変異体ポリペプチド、前記〔５〕もしくは前記〔６〕に記載の融合ポリペプチド、前記〔７〕に記載の核酸分子、前記〔８〕～〔９〕のいずれか１項に記載のベクター、前記〔１０〕に記載の宿主細胞、またはこれらの任意の組合せを含む組成物。
〔１２〕薬物としての使用のための、前記〔１１〕に記載の組成物。
〔１３〕がんを処置するための使用、遺伝子治療のための使用、または免疫療法のための使用のための、前記〔１１〕に記載の組成物。
〔１４〕カーゴを、選択された細胞型にｉｎ ｖｉｖｏで選択的に送達するための、または対象における前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特にがん細胞などの死滅させられるべき細胞にターゲティングするための使用のための、前記〔１１〕に記載の組成物。
〔１５〕カーゴを、選択された細胞型にｉｎ ｖｉｔｒｏで選択的に送達するための、または前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特にがん細胞などの死滅させられるべき細胞にターゲティングするための、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける前記〔１１〕に記載の組成物の使用。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】Ａ．ＶＳＶゲノムが、負の極性を有する、単一のＲＮＡ分子であり、５つの構造タンパク質である、Ｎ（ヌクレオタンパク質）、Ｐ（リンタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）、Ｇ（糖タンパク質）、およびＬ（大型のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）をコードすることを示す図である。Ｂ．ＶＳＶが、エンベロープウイルスであり、糖タンパク質Ｇが、ウイルスの外部にある、唯一のタンパク質であることを示す図である。糖タンパク質Ｇは、ウイルスの侵入（受容体との相互作用および膜との融合）ステップに関与する。
【図2】初期キメラ（ＧＮａｎｏ）および改善型キメラ（ＧＮａｎｏ Ｈ２２Ｎ Ｓ４２２Ｉ）についての概略図である。選択された突然変異を表示する（ＳＰ：ＶＳＶ糖タンパク質Ｇのシグナルペプチド、Ｎａｎｏ：ナノボディー、Ｇ：ＶＳＶの糖タンパク質Ｇ）。さらなるインサート（ジペプチドであるＱＦ、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）の配列を有するリンカー）もまた表示する。
【図3A】Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアを、デフォルトパラメータで使用する、ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株（配列番号２）およびＭａｒａｂａ株（配列番号４）の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列についての、最適グローバルアライメントを示す図である。配列番号２の１７～２５および４２１～４２９位、ならびに相当する配列番号４の位置を（また、１７～２５および４２１～４２９位も）枠囲いする。好ましい置換位置（配列番号２および配列番号４の両方の、２２および４２２位）をさらに枠囲いする。使用されたデフォルトパラメータを表示する。得られた同一性百分率（「同一性」）、類似性百分率（「類似性」）、および類似性スコア（「スコア」）を表示する。
【図3B】Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアを、デフォルトパラメータで使用する、ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株（配列番号２）およびＣｏｃａｌ株（配列番号６）の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列についての、最適グローバルアライメントを示す図である。配列番号２の１７～２５および４２１～４２９位、ならびに相当する配列番号６の位置を（また、１７～２５および４２１～４２９位も）枠囲いする。好ましい置換位置（配列番号２および配列番号６の両方の、２２および４２２位）をさらに枠囲いする。使用されたデフォルトパラメータを表示する。得られた同一性百分率（「同一性」）、類似性百分率（「類似性」）、および類似性スコア（「スコア」）を表示する。
【図3C】Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアを、デフォルトパラメータで使用する、ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株（配列番号２）およびＭｏｒｒｅｔｏｎ株（配列番号８）の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列についての、最適グローバルアライメントを示す図である。配列番号２の１７～２５および４２１～４２９位、ならびに相当する配列番号８の位置を（また、１７～２５および４２１～４２９位も）枠囲いする。好ましい置換位置（配列番号２および配列番号８の両方の、２２および４２２位）をさらに枠囲いする。使用されたデフォルトパラメータを表示する。得られた同一性百分率（「同一性」）、類似性百分率（「類似性」）、および類似性スコア（「スコア」）を表示する。
【図3D】Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアを、デフォルトパラメータで使用する、ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株（配列番号２）およびＡｌａｇｏａ株（配列番号１０）の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列についての、最適グローバルアライメントを示す図である。配列番号２の１７～２５および４２１～４２９位、ならびに相当する配列番号１０の位置を（また、１７～２５および４２１～４２９位も）枠囲いする。好ましい置換位置（配列番号２および配列番号１０の両方の、２２および４２２位）をさらに枠囲いする。使用されたデフォルトパラメータを表示する。得られた同一性百分率（「同一性」）、類似性百分率（「類似性」）、および類似性スコア（「スコア」）を表示する。
【図3E】Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアを、デフォルトパラメータで使用する、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株（配列番号２）およびＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株（配列番号１２）の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列についての、最適グローバルアライメントを示す図である。配列番号２の１７～２５および４２１～４２９位、ならびに相当する配列番号１２の位置（１７～２５および４２８～４３６位）を枠囲いする。好ましい置換位置（配列番号２の２２および４２２位、ならびに配列番号１２の２２および４２９位）をさらに枠囲いする。使用されたデフォルトパラメータを表示する。得られた同一性百分率（「同一性」）、類似性百分率（「類似性」）、および類似性スコア（「スコア」）を表示する。
【図3F】Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアを、デフォルトパラメータで使用する、ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株（配列番号２）およびＣａｒａｊａｓ株（配列番号１４）の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列についての、最適グローバルアライメントを示す図である。配列番号２の１７～２５および４２１～４２９位、ならびに相当する配列番号１４の位置（１７～２５および４２５～４３３位）を枠囲いする。好ましい置換位置（配列番号２の２２および４２２位、ならびに配列番号１４の２２および４２６位）をさらに枠囲いする。使用されたデフォルトパラメータを表示する。得られた同一性百分率（「同一性」）、類似性百分率（「類似性」）、および類似性スコア（「スコア」）を表示する。
【図4】Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、およびＥＳＰｒｉｐｔ（ｈｔｔｐ：／／ｅｓｐｒｉｐｔ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ＥＳＰｒｉｐｔ／ＥＳＰｒｉｐｔ／ｅｓｐ＿ｕｓｅｒｇｕｉｄｅ．ｐｈｐ）を使用して生成した、ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株（配列番号２）、Ｍａｒａｂａ株（配列番号４）、Ｃｏｃａｌ株（配列番号６）、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株（配列番号８）、Ａｌａｇｏａ株（配列番号１０）、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株（配列番号１２）、およびＣａｒａｊａｓ株（配列番号１４）の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインの、アミノ酸配列の多重配列アライメントを示す図である。厳密に保存的なアミノ酸（全ての株について同一である）は、グレーの地に、白色で記載する。枠囲いの領域は、高度に類似する残基に対応する。下方に表示されるコンセンサス配列（類似性スコア＞０．７）は、大文字は、同一配列であり、小文字は、コンセンサスレベルが＞０．５であり、！は、ＩＶのうちのいずれかであり、＄は、ＬＭのうちのいずれかであり、％は、ＦＹのうちのいずれかであり、＃は、ＮＤＱＥＢＺのうちのいずれかである、ＭｕｌｔＡｌｉｎによる基準を使用して生成した。
【図5】ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ Ｇの、融合前プロモーター内のヒスチジンクラスターを示す図である。ヒスチジン４０７の、アラニンへの突然変異は、Ｇの融合特性を消失させる。
【図6】上図：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面における、ＷＴ糖タンパク質および突然変異体糖タンパク質の発現、ならびに蛍光ＧＳＴ－ＣＲ２（アミノ末端にＧＳＴを融合したＣＲ２）への結合についてのフローサイトメトリー解析を示す図である。トランスフェクションの２４時間後に、４℃で、１時間、抗Ｇモノクローナル抗体である、８Ｇ５Ｆ１１を、生細胞上で直接使用して、ＷＴ Ｇおよび突然変異体Ｇの細胞表面発現について評価した。次いで、細胞を、抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、および表示のＧＳＴ－ＣＲ２ATTO550と共に、同時にインキュベートした。ＧＳＴ－ＣＲタンパク質に結合することが、なおも可能なＧ構築物をトランスフェクトされた細胞は、ＡＴＴＯ５５０染料に起因する、赤色の蛍光を呈した。突然変異体である、Ｒ３５４Ａは、ＣＲドメインに結合することが不可能な突然変異体である。下図：突然変異体の糖タンパク質である、Ｇ－Ｈ４０７ＡおよびＧ．Ｈ４０７Ａ／Ｓ４２２Ｉの表面発現についてのフローサイトメトリー解析を示す図である。表面Ｇタンパク質の発現は、モノクローナル抗体である、８Ｇ５Ｆ１１（ＫｅｒａＦＡＳＴ）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８へとコンジュゲートさせた、ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体により検出した。フローサイトメトリーにより、合計１０，０００個の細胞をカウントした。各フレーム内で、黒色の曲線は、非トランスフェクト細胞の蛍光に対応し、青色の曲線は、ＷＴ Ｇをコードする、ｐＣＡＧＧＳプラスミドをトランスフェクトされた細胞の蛍光に対応し、赤色の曲線は、表示の突然変異体をコードする、ｐＣＡＧＧＳプラスミドをトランスフェクトされた細胞の蛍光に対応する。各フレーム内で、突然変異体Ｇの表面発現を、ＷＴ Ｇに対する百分率として表す。
【図7】細胞間融合アッセイ：ＶＳＶ Ｇ Ｉｎｄｉａｎａ ＷＴ、および最適化（すなわち、残基Ｈ２２の、Ｎへの突然変異、および残基Ｓ４２２の、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、またはＶへの突然変異）の後におけるＶＳＶ ＧＮａｎｏの融合活性を示す図である。
【図8】ＶＳＶ Ｇ１－４４０（ＶＳＶ Ｇ Ｉｎｄｉａｎａ ＷＴの残基１～４４０）の結晶構造、および残基Ｓ４２２の環境を示す図である。（Ａ）Ｇ１－４４０の融合前三量体の結晶構造を示す図である。鎖は、残基４３２までトレースされる。残基４１０～４３２は、ダークグレーとする。（Ｂ）セグメント４１０～４３２の構造を示す図である。２つの拡大図による、セグメント４１０～４３２の詳細な構成、および融合ドメインとのその相互作用である。（Ｃ）Ｇの融合前状態における、残基Ｓ４２２の拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の文脈で、本発明者らは、驚くべきことに、シグナルペプチドと、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインとの間に挿入されたナノボディーを含む、組換えＶＳＶウイルスが、その融合特性および感染性を保持する一方で、増幅が極めて困難であり、したがってその産業的使用は可能でないことを見出した。本発明者らは、さらに驚くべきことに、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインの、２２位または４２２位における、少なくとも１つの置換の挿入が、融合特性および感染性を保持しながら、組換えウイルスの増幅を劇的に増大させるので、その産業的使用を可能とすること（実施例１を参照されたい）を見出した。本発明者らはまた、４２２位における疎水性残基の存在が、ｐＨ依存性構造的転移の調節において鍵となり、Ｇのフォールディングを容易とし、Ｎ末端の細胞外ドメインにナノボディーを挿入された、Ｇの融合ポリペプチドの融合前形態を安定化させる（実施例２、３、および４を参照されたい）ことを示す結果も得た。
【0014】
作製が改善された突然変異体ポリペプチド
したがって、まず、本発明は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）株の糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなり、前記細胞外ドメインが、下記：
ａ）配列番号２の４２１位～４２９位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２の４２１位～４２５位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２の４２２および２２位に位置する任意のアミノ酸残基；または
ｂ）配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２９位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２および２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基
からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を有する、配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または配列番号２に明示されたアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる突然変異体ポリペプチドに関する。
好ましい実施形態では、本発明の突然変異体ポリペプチドは、単離ポリペプチド、および／または天然に存在しないポリペプチドである。
したがって、まず、本発明は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）株の糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなり、前記細胞外ドメインが、下記：
ａ）配列番号２の４２１位～４２９位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２の４２１位～４２５位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２の４２２および２２位に位置する任意のアミノ酸残基；または
ｂ）配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２９位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２および２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基
からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を有する、配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または配列番号２に明示されたアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる突然変異体ポリペプチドに関する。
好ましい実施形態では、本発明の突然変異体ポリペプチドは、単離ポリペプチド、および／または天然に存在しないポリペプチドである。
【0015】
参照配列および置換のための位置
突然変異体ポリペプチドは、シグナルペプチドを伴わない、糖タンパク質Ｇのアミノ酸配列に対応する、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）株の糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づく。本記載では、参照ＶＳＶ株は、Ｉｎｄｉａｎａ株である。ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株の、糖タンパク質Ｇのアミノ酸配列は、配列番号１に明示される通りである。ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２に明示される通りであり、配列番号１のアミノ酸１７～５１１に対応し、配列番号１のアミノ酸１～１６は、シグナルペプチドに対応する。好ましい実施形態では、本発明に従う突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインに由来するので、配列番号２の４２１位～４２９位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２の４２１位～４２５位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２の４２２および２２位に位置する任意のアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を伴う、配列番号２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる。
突然変異体ポリペプチドは、シグナルペプチドを伴わない、糖タンパク質Ｇのアミノ酸配列に対応する、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）株の糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づく。本記載では、参照ＶＳＶ株は、Ｉｎｄｉａｎａ株である。ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株の、糖タンパク質Ｇのアミノ酸配列は、配列番号１に明示される通りである。ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２に明示される通りであり、配列番号１のアミノ酸１７～５１１に対応し、配列番号１のアミノ酸１～１６は、シグナルペプチドに対応する。好ましい実施形態では、本発明に従う突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインに由来するので、配列番号２の４２１位～４２９位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２の４２１位～４２５位に位置する任意のアミノ酸残基、および１７位～２５位に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２の４２２および２２位に位置する任意のアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を伴う、配列番号２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる。
【0016】
しかし、本発明に従う突然変異体ポリペプチドはまた、Ｉｎｄｉａｎａ株以外のＶＳＶ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインに由来する場合もあり、それが、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２９位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２および２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を伴う、配列番号２に明示されたアミノ酸配列との、少なくとも５０％の同一性、好ましくは、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、より好ましくは、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも７８％の同一性、少なくとも７９％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８１％の同一性、少なくとも８２％の同一性、少なくとも８３％の同一性、少なくとも８４％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも８６％の同一性、少なくとも８７％の同一性、少なくとも８８％の同一性、少なくとも８９％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、またはなお少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなるという条件下で、さらなる突然変異を含む場合もある。
【0017】
この場合、配列番号２および初期のアミノ酸配列（例えば、この配列が、最適グローバルアライメントの後において、配列番号２と、少なくとも５０％の同一性、または上記で規定された、他の任意の、好ましい、最小の百分率の同一性を有するという条件下における、Ｉｎｄｉａｎａ株以外のＶＳＶ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列）の最適グローバルアライメントがなされ、初期のアミノ酸配列は、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２９位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２１位に相当する位置～４２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、および配列番号２の１７位に相当する位置～２５位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基、より好ましくは、配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の４２２および２２位に相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換を有する。
【0018】
本発明の開示の文脈で言及される同一性パーセントは、比較される配列の最適グローバルアライメントに基づき、すなわち、Needleman and Wunsch (1970)のアルゴリズムなど、当業者に周知の、任意のアルゴリズムを使用して、それらの全長にわたり、それらの全体においてなされた、配列の最適アライメントに基づき決定される。この配列の比較は、当業者に周知の、任意のソフトウェア、例えば、Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアを使用して実施されうる。Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアは、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で入手可能である。このソフトウェアは、２つのインプット配列を読み取り、それらの最適グローバル配列アライメントを、ファイルへと書き出す。Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列の最適アライメント（ギャップを含む）を、それらの全長に沿って見出す。アルゴリズムは、全ての可能なアライメントを探索し、最良のアライメントを選び出すことにより、アライメントが、最適であることを確認するのに、動的プログラミング法を使用する。評定行列は、あらゆる可能な残基またはヌクレオチドのマッチについての値を含有するリードである。Ｎｅｅｄｌｅは、アライメントのスコアが、評定行列から取り出されるマッチの合計であって、アライメントされた配列内の、ギャップの生起および伸長から生じるペナルティーを差し引いたマッチの合計に等しい場合の、可能な最大スコアを伴うアライメントを見出す。置換行列、ならびにギャップの生起および伸長のペナルティーは、ユーザー指定である。本発明の文脈において、最適グローバルアライメントを得るために、Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアは、デフォルトパラメータにより、すなわち、１０．０とした「Ｇａｐ ｏｐｅｎ」パラメータ、０．５とした「Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｄ」パラメータ、「ｆａｌｓｅ」とした「Ｅｎｄ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ」パラメータ、１０．０とした「Ｅｎｄ ｇａｐ ｏｐｅｎ」パラメータ、および「Ｂｌｏｓｕｍ ６２」行列を使用して使用されうる。２つのアミノ酸配列を入力する場合、Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアは、最適グローバルアライメントの他、アライメントを特徴付ける、いくつかの値を出力する。
・「同一性」とは、同一性百分率、すなわち、報告されるアライメント領域（全長中に、任意のギャップを含む）にわたる、２つの配列の間の同一なマッチの百分率であり；
・「類似性」とは、類似性百分率、すなわち、報告されるアライメント領域（全長中に、任意のギャップを含む）にわたる、２つの配列の間のマッチの百分率であり；
・「スコア」とは、ソフトウェアにより、全ての被験グローバルアライメント（すなわち、両方の配列全長にわたる）について得られる、最良のスコアに対応する、アライメントの全スコアである。
このスコアは、アライメントされる同一なアミノ酸だけでなく、また、タンパク質の機能を大きくは変更しないことが予想される保存的置換も考慮して、配列番号２と、別の初期配列との間のスコアの値が高値であるほど、この初期配列と配列番号２との間の類似性が大きいので、「類似性スコア」と称されうる。
・「同一性」とは、同一性百分率、すなわち、報告されるアライメント領域（全長中に、任意のギャップを含む）にわたる、２つの配列の間の同一なマッチの百分率であり；
・「類似性」とは、類似性百分率、すなわち、報告されるアライメント領域（全長中に、任意のギャップを含む）にわたる、２つの配列の間のマッチの百分率であり；
・「スコア」とは、ソフトウェアにより、全ての被験グローバルアライメント（すなわち、両方の配列全長にわたる）について得られる、最良のスコアに対応する、アライメントの全スコアである。
このスコアは、アライメントされる同一なアミノ酸だけでなく、また、タンパク質の機能を大きくは変更しないことが予想される保存的置換も考慮して、配列番号２と、別の初期配列との間のスコアの値が高値であるほど、この初期配列と配列番号２との間の類似性が大きいので、「類似性スコア」と称されうる。
【0019】
配列番号２と、別の初期配列との間で、最適グローバルアライメントが得られると、同一性百分率と、配列番号２の特異的位置に相当する位置とを規定する。特に、配列番号２のＮ位に相当する位置とは、配列番号２のＮ位とアライメントされた、他の初期配列の位置である。
【0020】
Ｉｎｄｉａｎａ株以外のＶＳＶ株の例はまた、Ｍａｒａｂａ株、Ｃｏｃａｌ株、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株、Ａｌａｇｏａ株、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株、およびＣａｒａｊａｓ株など、７種の血清型も含む。これらの株およびＩｎｄｉａｎａ株の、全長糖タンパク質Ｇおよび糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインの、非突然変異（野生型）アミノ酸配列を、下記の表１に提示する。
【0021】
【表1】
【0022】
Ｍａｒａｂａ株、Ｃｏｃａｌ株、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株、Ａｌａｇｏａ株、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株、およびＣａｒａｊａｓ株の各々と対比した、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインの、非突然変異アミノ酸配列の最適グローバルアライメントを、図３Ａ～３Ｆに提示する。これらの最適グローバルアライメントに基づき、同一性百分率、類似性スコア（Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアを、上記で規定されたデフォルトパラメータで使用して得られる）、ならびに配列番号２の１７～２５位、および４２１～４２９位（ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメイン）に相当する、ＶＳＶのＭａｒａｂａ株、Ｃｏｃａｌ株、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株、Ａｌａｇｏａ株、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株、およびＣａｒａｊａｓ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列内の位置が決定されうる。これらを、下記の表２に列挙する。
【0023】
【表2】
【0024】
図３Ａ～３Ｆのアライメントはまた、２つのアミノ酸配列間で同一なアミノ酸に加えて、一部の置換は、保存的であり、細胞外ドメインの機能を確保することも示す。最適グローバルアライメントの後における、２つの配列の類似性スコアを計算する場合に、特に、Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアを、デフォルトパラメータで使用する場合に、このような保存的置換の存在が考慮される。
【0025】
したがって、配列番号２と異なる初期配列が使用される場合、配列番号２との、少なくとも５０％（または上記で規定された、他の任意の、最小の同一性百分率）の同一性に加えて、初期の配列は、配列番号２の、それ自身との類似性スコアが、２６９３であることが既知であるので、好ましくは、少なくとも１４００、より好ましくは、少なくとも１５００、少なくとも１６００、少なくとも１７００、少なくとも１８００、なおより好ましくは、少なくとも１９００、少なくとも２０００、少なくとも２１００、少なくとも２２００、またはなお少なくとも２３００、の最適グローバルアライメントの後における（好ましくは、Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアを、上記で規定されたデフォルトパラメータで使用する）類似性スコアを有する。
【0026】
ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株、Ｍａｒａｂａ株、Ｃｏｃａｌ株、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株、Ａｌａｇｏａ株、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株、およびＣａｒａｊａｓ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインの、アミノ酸の多重配列アライメントを、図４に提示する。図４から明らかな通り、どのような特異的株であれ、ＶＳＶの、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインの、全てのアミノ酸配列は、保存的アミノ酸および保存的ドメイン（すなわち、配列番号２と、他のアライメントされたアミノ酸配列との間で同一なアミノ酸またはドメイン）を含有する。
【0027】
特に、配列番号２の１７～２５位は、１７～１８、２１、および２３～２５位において、保存的アミノ酸を含有する。ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株、Ｍａｒａｂａ株、Ｃｏｃａｌ株、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株、Ａｌａｇｏａ株、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株、およびＣａｒａｊａｓ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列の、１７～２５位のコンセンサス配列は、ＶＰＸ1Ｘ2ＹＸ3ＹＣＰ（配列番号１５）［配列中、
・Ｘ1は、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、およびアラニン（Ａ）から選択され、
・Ｘ2は、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、およびセリン（Ｓ）から選択され、
・Ｘ3は、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、およびグルタミン（Ｑ）から選択される］
として規定されうる。
・Ｘ1は、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、およびアラニン（Ａ）から選択され、
・Ｘ2は、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、およびセリン（Ｓ）から選択され、
・Ｘ3は、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、およびグルタミン（Ｑ）から選択される］
として規定されうる。
【0028】
同様に、配列番号２の４２１～４２９位は、４２１および４２６～４２９位に、保存的アミノ酸を含有する。ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株、Ｍａｒａｂａ株、Ｃｏｃａｌ株、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株、Ａｌａｇｏａ株、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株、およびＣａｒａｊａｓ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列の、４２１～４２９位のコンセンサス配列は、ＥＸ4Ｘ5Ｘ6X7ＧＤＴＧ（配列番号１６）［配列中、
・Ｘ4は、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、およびトレオニン（Ｔ）から選択され、
・Ｘ5は、ロイシン（Ｌ）およびイソロイシン（Ｉ）から選択され、
・Ｘ6は、フェニルアラニン（Ｆ）およびチロシン（Ｙ）から選択され、
・Ｘ7は、フェニルアラニン（Ｆ）およびチロシン（Ｙ）から選択される］
として規定されうる。
・Ｘ4は、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、およびトレオニン（Ｔ）から選択され、
・Ｘ5は、ロイシン（Ｌ）およびイソロイシン（Ｉ）から選択され、
・Ｘ6は、フェニルアラニン（Ｆ）およびチロシン（Ｙ）から選択され、
・Ｘ7は、フェニルアラニン（Ｆ）およびチロシン（Ｙ）から選択される］
として規定されうる。
【0029】
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従う突然変異体ポリペプチドは、
ａ）配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後において、配列番号２に明示されたアミノ酸配列と、少なくとも５０％の同一性を有する配列、ならびに
ｂ）配列である、ＶＰＸ1Ｘ2ＹＸ3ＹＣＰ（配列番号１５）、およびＥＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＧＤＴＧ（配列番号１６）
［配列中、
ｉ）Ｘ4～Ｘ7のうちの１つ（配列番号２の４２２～４２５位に対応する）、好ましくは、Ｘ4（配列番号２の４２２位に対応する）；
ｉｉ）Ｘ1～Ｘ3のうちの１つ（配列番号２の１９～２０および２２位に対応する）、好ましくは、Ｘ3（配列番号２の２２位に対応する）；または
ｉｉｉ）Ｘ1～Ｘ3のうちの１つ（配列番号２の１９～２０および２２位に対応する）、およびＸ4～Ｘ7のうちの１つ（配列番号２の４２２～４２５位に対応する）、好ましくは、Ｘ3およびＸ4（配列番号２の２２２および４２２位に対応する）
が置換されている］
の、２つのドメインを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる。
ａ）配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後において、配列番号２に明示されたアミノ酸配列と、少なくとも５０％の同一性を有する配列、ならびに
ｂ）配列である、ＶＰＸ1Ｘ2ＹＸ3ＹＣＰ（配列番号１５）、およびＥＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7ＧＤＴＧ（配列番号１６）
［配列中、
ｉ）Ｘ4～Ｘ7のうちの１つ（配列番号２の４２２～４２５位に対応する）、好ましくは、Ｘ4（配列番号２の４２２位に対応する）；
ｉｉ）Ｘ1～Ｘ3のうちの１つ（配列番号２の１９～２０および２２位に対応する）、好ましくは、Ｘ3（配列番号２の２２位に対応する）；または
ｉｉｉ）Ｘ1～Ｘ3のうちの１つ（配列番号２の１９～２０および２２位に対応する）、およびＸ4～Ｘ7のうちの１つ（配列番号２の４２２～４２５位に対応する）、好ましくは、Ｘ3およびＸ4（配列番号２の２２２および４２２位に対応する）
が置換されている］
の、２つのドメインを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる。
【0030】
さらに、ＶＳＶの、Ｉｎｄｉａｎａ株、Ｍａｒａｂａ株、Ｃｏｃａｌ株、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株、Ａｌａｇｏａ株、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株、およびＣａｒａｊａｓ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインの、全てのアミノ酸配列内で保存的なアミノ酸は、配列番号２の、１、４、６～７、１２、１４、１７～１８、２１、２３～２５、２７、２９、３１、３３、４６～４７５５～５６、５８～６０、６４、６６～６９、７１～７５、７７、７９、８１～８２、８７、９１～９２、９６、１０２、１０７～１１１、１１４～１１６、１１９、１２１、１２７、１３０、１３２、１３４、１３７～１３９、１４１、１４３、１４５、１５１、１５３、１５８、１６０、１６２～１６５、１６７、１７７、１９９、２０４、２０６～２０８、２１０、２１２、２１９、２２１、２２４、２２８、２３１、２３６～２３７、２４１、２５３、２５９、２６２、２６８、２７１～２７２、２７４～２７７、２７９～２８１、２８３～２８５、２８７～２９０、２９９、３０１、３０４、３０７～３１１、３１３～３１４、３１６～３１８、３２０～３２１、３２３、３２５～３２６、３３０、３３２、３３８、３４５、３４９、３５４、３５６～３５７、３６０、３６２、３６８～３７２、３７４、３７６、３７９、３８１、３８３～３８４、３８８、３９０、３９３、３９５、４０７～４０８、４１３、４２１、４２６～４２９、４３１～４３４、４３６、４３９～４４３、４４５、４４７、４５６、４６７、４８７、および４８９～４９０位に対応する。以下では、これらの位置を、「保存的位置」と称する。
【0031】
したがって、本発明に従う突然変異ポリペプチドについての一部の実施形態では、配列番号２との最適グローバルアライメントの後において、配列番号２に明示されたアミノ酸配列と、少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列は、上記で規定された保存的位置において、配列番号２と同じアミノ酸を有する。
細胞外ドメインが、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）に結合する能力を変更する（下記の「さらなる任意の突然変異」と題する節を参照されたい）ことが所望される場合、保存的な４７および３５４位が例外とされうる。この場合、配列番号２との最適グローバルアライメントの後において、配列番号２に明示されたアミノ酸配列と、少なくとも５０％（または上記で開示された、他の任意の、最小の同一性％）の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２の４７および／または３５４位における、可能なさらなる置換を除き、上記で規定された保存的位置において、配列番号２と同じアミノ酸を有しうる。
細胞外ドメインが、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）に結合する能力を変更する（下記の「さらなる任意の突然変異」と題する節を参照されたい）ことが所望される場合、保存的な４７および３５４位が例外とされうる。この場合、配列番号２との最適グローバルアライメントの後において、配列番号２に明示されたアミノ酸配列と、少なくとも５０％（または上記で開示された、他の任意の、最小の同一性％）の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２の４７および／または３５４位における、可能なさらなる置換を除き、上記で規定された保存的位置において、配列番号２と同じアミノ酸を有しうる。
【0032】
置換のためのアミノ酸の種類
本発明に従う突然変異体ポリペプチド内の置換アミノ酸は、置換の位置に応じて、元のアミノ酸と異なる、任意のアミノ酸から選択されうるが、一部の特定の種類のアミノ酸が好ましい。
特に、本発明に従う突然変異体ポリペプチドが、配列番号２の４２１位～４２９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基における置換を含む場合、元のアミノ酸は、好ましくは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、およびトリプトファン（Ｗ）、より好ましくは、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）、なおより好ましくは、イソロイシン（Ｉ）からなる群から選択される、好ましくは、疎水性アミノ酸により置換されている。実際、本発明者らは、配列番号２の４２１位～４２９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基内の、疎水性アミノ酸の存在が、糖タンパク質Ｇの融合前コンフォメーションの安定化を結果としてもたらすことを示した。
本発明に従う突然変異体ポリペプチド内の置換アミノ酸は、置換の位置に応じて、元のアミノ酸と異なる、任意のアミノ酸から選択されうるが、一部の特定の種類のアミノ酸が好ましい。
特に、本発明に従う突然変異体ポリペプチドが、配列番号２の４２１位～４２９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基における置換を含む場合、元のアミノ酸は、好ましくは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、およびトリプトファン（Ｗ）、より好ましくは、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）、なおより好ましくは、イソロイシン（Ｉ）からなる群から選択される、好ましくは、疎水性アミノ酸により置換されている。実際、本発明者らは、配列番号２の４２１位～４２９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基内の、疎水性アミノ酸の存在が、糖タンパク質Ｇの融合前コンフォメーションの安定化を結果としてもたらすことを示した。
【0033】
本発明に従う突然変異体ポリペプチドが、配列番号２の１７位～２５位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基における置換を含む場合、元のアミノ酸は、好ましくは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、より好ましくは、アスパラギン（Ｎ）からなる群から選択される、好ましくは、極性アミノ酸により置換されている。実際、配列番号２の１７位～２５位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基内の、極性アミノ酸の存在が、糖タンパク質Ｇの融合前コンフォメーションの安定化を結果としてもたらすことが考えられる。
【0034】
本発明に従う突然変異体ポリペプチドが、配列番号２の１７位～２５位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基における置換を含み、また、配列番号２の４２１位～４２９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する任意のアミノ酸残基における置換も含む場合、
ａ）配列番号２の１７位～２５位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する元のアミノ酸は、好ましくは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、より好ましくは、アスパラギン（Ｎ）からなる群から選択される、好ましくは、極性アミノ酸により置換され；
ｂ）配列番号２の４２１位～４２９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する元のアミノ酸は、好ましくは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、およびトリプトファン（Ｗ）、より好ましくは、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）、なおより好ましくは、イソロイシン（Ｉ）からなる群から選択される、好ましくは、疎水性アミノ酸により置換されている（図７）。
ａ）配列番号２の１７位～２５位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する元のアミノ酸は、好ましくは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、より好ましくは、アスパラギン（Ｎ）からなる群から選択される、好ましくは、極性アミノ酸により置換され；
ｂ）配列番号２の４２１位～４２９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に位置する元のアミノ酸は、好ましくは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、およびトリプトファン（Ｗ）、より好ましくは、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）、なおより好ましくは、イソロイシン（Ｉ）からなる群から選択される、好ましくは、疎水性アミノ酸により置換されている（図７）。
【0035】
好ましい突然変異体ポリペプチド
本発明に従う、一部の好ましい突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づき、
ａ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号１７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号１８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号１９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｅ）４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｆ）４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｇ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｈ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｉ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｊ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｋ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｌ）上記のａ）～ｋ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号１の１～１６位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
本発明に従う、一部の好ましい突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づき、
ａ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号１７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号１８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号１９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｅ）４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｆ）４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｇ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｈ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｉ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｊ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｋ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、セリン（Ｓ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号２に対応する、配列番号２７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｌ）上記のａ）～ｋ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号１の１～１６位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
【0036】
ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づく、最も好ましい突然変異体ポリペプチドは、４２２位において、少なくとも１つの置換を含む突然変異体ポリペプチド（配列番号１８～２７、またはこれらのアミノ酸配列のうちの１つを含み、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号１の１～１６位に対応するシグナルペプチドをさらに含む突然変異体ポリペプチド）である。
【0037】
ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインに由来する好ましい突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である、配列番号１７～２７を、下記の表３に提示する。
【表3】
【0038】
本発明に従う、他の好ましい突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ Ｍａｒａｂａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づき、
ａ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号２８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号２９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｅ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｆ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｇ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｈ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｉ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｊ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｋ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｌ）上記のａ）～ｋ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号３の１～１６位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
ａ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号２８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号２９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｅ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｆ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｇ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｈ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｉ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｊ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｋ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号４に対応する、配列番号３８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｌ）上記のａ）～ｋ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号３の１～１６位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
【0039】
ＶＳＶ Ｍａｒａｂａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づく、最も好ましい突然変異体ポリペプチドは、４２２位において、少なくとも１つの置換を含む突然変異体ポリペプチド（配列番号２９～３８、またはこれらのアミノ酸配列のうちの１つを含み、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号３の１～１６位に対応するシグナルペプチドをさらに含む突然変異体ポリペプチド）である。
【0040】
ＶＳＶ Ｍａｒａｂａ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインに由来する好ましい突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である、配列番号２８～３８を、下記の表４に提示する。
【表4】
【0041】
本発明に従う、他の好ましい突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ Ｃｏｃａｌ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づき、
ａ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号３９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｅ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｆ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｇ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｈ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｉ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｊ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｋ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｌ）上記のａ）～ｋ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号５の１～１７位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
ａ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号３９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｅ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｆ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｇ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｈ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｉ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｊ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｋ）２２位における、ヒスチジン（Ｈ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号６に対応する、配列番号４９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｌ）上記のａ）～ｋ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号５の１～１７位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
【0042】
ＶＳＶ Ｃｏｃａｌ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づく、最も好ましい突然変異体ポリペプチドは、４２２位において、少なくとも１つの置換を含む突然変異体ポリペプチド（配列番号４０～４９、またはこれらのアミノ酸配列のうちの１つを含み、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号５の１～１７位に対応するシグナルペプチドをさらに含む突然変異体ポリペプチド）である。
【0043】
ＶＳＶ Ｃｏｃａｌ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインに由来する好ましい突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である、配列番号３９～４９を、下記の表５に提示する。
【表5】
【0044】
本発明に従う、他の好ましい突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づき、
ａ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｅ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｆ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｇ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｈ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｉ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｊ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｋ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号６０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｌ）上記のａ）～ｋ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号７の１～１７位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
ａ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｅ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｆ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｇ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｈ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｉ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｊ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号５９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｋ）２２位における、グルタミン（Ｑ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号８に対応する、配列番号６０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｌ）上記のａ）～ｋ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号７の１～１７位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
【0045】
ＶＳＶ Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づく、最も好ましい突然変異体ポリペプチドは、４２２位において、少なくとも１つの置換を含む突然変異体ポリペプチド（配列番号５１～６０、またはこれらのアミノ酸配列のうちの１つを含み、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号７の１～１７位に対応するシグナルペプチドをさらに含む突然変異体ポリペプチド）である。
【0046】
ＶＳＶ Ｍｏｒｒｅｔｏｎ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインに由来する好ましい突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である、配列番号５０～６０を、下記の表６に提示する。
【表6】
【0047】
本発明に従う、他の好ましい突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ Ａｌａｇｏａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づき、
ａ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｅ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｆ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｇ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｈ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｉ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｊ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号７０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｋ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号７１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｌ）上記のａ）～ｋ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号９の１～１７位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
ａ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｅ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｆ）４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｇ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｈ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｉ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号６９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｊ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号７０に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｋ）２２位における、アルギニン（Ｒ）アミノ酸残基の、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸残基による置換、および４２２位における、トレオニン（Ｔ）アミノ酸残基の、バリン（Ｖ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１０に対応する、配列番号７１に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｌ）上記のａ）～ｋ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号９の１～１７位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
【0048】
ＶＳＶ Ａｌａｇｏａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づく、最も好ましい突然変異体ポリペプチドは、４２２位において、少なくとも１つの置換を含む突然変異体ポリペプチド（配列番号６２～７１、またはこれらのアミノ酸配列のうちの１つを含み、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号９の１～１７位に対応するシグナルペプチドをさらに含む突然変異体ポリペプチド）である。
【0049】
ＶＳＶ Ａｌａｇｏａ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインに由来する好ましい突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である、配列番号６１～７１を、下記の表７に提示する。
【表7】
【0050】
本発明に従う、他の好ましい突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づき、
ａ）４２９位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１２に対応する、配列番号７２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２９位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１２に対応する、配列番号７３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２９位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１２に対応する、配列番号７４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｄ）４２９位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１２に対応する、配列番号７５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｅ）上記のａ）～ｄ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号１１の１～１６位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
ａ）４２９位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１２に対応する、配列番号７２に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２９位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１２に対応する、配列番号７３に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２９位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１２に対応する、配列番号７４に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｄ）４２９位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１２に対応する、配列番号７５に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｅ）上記のａ）～ｄ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号１１の１～１６位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
【0051】
ＶＳＶ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインに由来する好ましい突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である、配列番号号７２～７５を、下記の表８に提示する。
【表8】
【0052】
本発明に従う、他の好ましい突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ Ｃａｒａｊａｓ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に基づき、
ａ）４２６位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１４に対応する、配列番号７６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２６位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１４に対応する、配列番号７７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２６位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１４に対応する、配列番号７８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２６位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１４に対応する、配列番号７９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｅ）上記のａ）～ｄ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号１３の１～２１位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
ａ）４２６位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１４に対応する、配列番号７６に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｂ）４２６位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、ロイシン（Ｌ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１４に対応する、配列番号７７に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｃ）４２６位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１４に対応する、配列番号７８に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；
ｄ）４２６位における、バリン（Ｖ）アミノ酸残基の、メチオニン（Ｍ）アミノ酸残基による置換を伴う、配列番号１４に対応する、配列番号７９に明示されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる、突然変異体ポリペプチド；ならびに
ｅ）上記のａ）～ｄ）のうちのいずれか１つに規定されたアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなり、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、好ましくは、配列番号１３の１～２１位に対応するシグナルペプチドをさらに含む、突然変異体ポリペプチド
から選択されうる。
【0053】
ＶＳＶ Ｃａｒａｊａｓ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインに由来する好ましい突然変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である、配列番号７６～７９を、下記の表９に提示する。
したがって、本発明の突然変異体ポリペプチドは、配列番号１７～７９からなる群から選択され、好ましくは、配列番号１７～７２および配列番号７４～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有利に含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる。
【表9】
したがって、本発明の突然変異体ポリペプチドは、配列番号１７～７９からなる群から選択され、好ましくは、配列番号１７～７２および配列番号７４～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有利に含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる。
【0054】
さらなる任意の突然変異
本発明に従う突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に由来するので、配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または上記で規定されたアミノ酸残基の、少なくとも１つの置換を伴う、配列番号２に明示されたアミノ酸配列との、少なくとも５０％の同一性（もしくは上記で開示された、他の任意の、最小の同一性％）を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる。
本発明に従う突然変異体ポリペプチドは、ＶＳＶ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列に由来するので、配列番号２に明示されたアミノ酸配列、または上記で規定されたアミノ酸残基の、少なくとも１つの置換を伴う、配列番号２に明示されたアミノ酸配列との、少なくとも５０％の同一性（もしくは上記で開示された、他の任意の、最小の同一性％）を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなる。
【0055】
本発明に従う突然変異体ポリペプチドは、配列番号２のさらなる位置、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における相当の位置における、１つまたは複数の（１つ、２つ、またはこれを超える数など）さらなる置換をさらに含有しうる。
細胞外ドメインの機能を変更することが所望される場合に、１つまたは複数の、可能なさらなる置換は、保存的であることが好ましいとは、置換アミノ酸が、元のアミノ酸の構造と同様な構造を有するので、ポリペプチドの生物学的活性を変化させる可能性は小さいことを意味する。このような保存的置換の例を、下記の表１０に提示する。
細胞外ドメインの機能を変更することが所望される場合に、１つまたは複数の、可能なさらなる置換は、保存的であることが好ましいとは、置換アミノ酸が、元のアミノ酸の構造と同様な構造を有するので、ポリペプチドの生物学的活性を変化させる可能性は小さいことを意味する。このような保存的置換の例を、下記の表１０に提示する。
【0056】
【表10】
【0057】
加えて、上記で説明された通り、図４に提示されたアライメントは、配列番号２の、１、４、６～７、１２、１４、１７～１８、２１、２３～２５、２７、２９、３１、３３、４６～４７、５５～５６、５８～６０、６４、６６～６９、７１～７５、７７、７９、８１～８２、８７、９１～９２、９６、１０２、１０７～１１１、１１４～１１６、１１９、１２１、１２７、１３０、１３２、１３４、１３７～１３９、１４１、１４３、１４５、１５１、１５３、１５８、１６０、１６２～１６５、１６７、１７７、１９９、２０４、２０６～２０８、２１０、２１２、２１９、２２１、２２４、２２８、２３１、２３６～２３７、２４１、２５３、２５９、２６２、２６８、２７１～２７２、２７４～２７７、２７９～２８１、２８３～２８５、２８７～２９０、２９９、３０１、３０４、３０７～３１１、３１３～３１４、３１６～３１８、３２０～３２１、３２３、３２５～３２６、３３０、３３２、３３８、３４５、３４９、３５４、３５６～３５７、３６０、３６２、３６８～３７２、３７４、３７６、３７９、３８１、３８３～３８４、３８８、３９０、３９３、３９５、４０７～４０８、４１３、４２１、４２６～４２９、４３１～４３４、４３６、４３９～４４３、４４５、４４７、４５６、４６７、４８７、および４８９～４９０位が、ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株、Ｍａｒａｂａ株、Ｃｏｃａｌ株、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株、Ａｌａｇｏａ株、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株、およびＣａｒａｊａｓ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインのアミノ酸配列内で保存的であることを示す。保存的アミノ酸位置は、機能の保存と関連することが多く、配列番号２との最適グローバルアライメントの後において、配列番号２に明示されたアミノ酸配列と、少なくとも５０％の同一性（または上記で開示された、他の任意の、最小の同一性％）を有するアミノ酸配列を含む、本発明に従う突然変異体ポリペプチドは、細胞外ドメインの機能を変更しないことが所望される場合、上記で規定された、全ての保存的位置など、上記で規定された保存的位置のうちの１つまたは複数において、好ましくは、配列番号２と同じアミノ酸を有する。
【0058】
しかし、場合によって、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０７５８２４号下でなされた出願、およびNikolic et al. Nat Commun. 2018 Mar 12;9(1):1029において記載されている通り、例えば、細胞外ドメインが、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）に結合する能力を変更するために、細胞外ドメインの機能を変更することが所望されることがある。これは、ＬＤＬ膜受容体と相互作用することが不可能な細胞外ドメインを発現するＶＳＶの指向性の変更を可能とする。
したがって、本発明の実施形態では、本発明に従う突然変異体ポリペプチドは、配列番号２の８、４７、２０９、および３５４位に位置するアミノ酸残基、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の８、４７、２０９、および３５４位に相当する位置に位置するアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換をさらに含む。
８位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換のために、元のアミノ酸は、好ましくは、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、またはチロシン（Ｙ）を除き、任意のアミノ酸により置換され、より好ましくは、元のアミノ酸は、アラニン（Ａ）により置換されている。
したがって、本発明の実施形態では、本発明に従う突然変異体ポリペプチドは、配列番号２の８、４７、２０９、および３５４位に位置するアミノ酸残基、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、配列番号２の８、４７、２０９、および３５４位に相当する位置に位置するアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つの置換をさらに含む。
８位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換のために、元のアミノ酸は、好ましくは、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、またはチロシン（Ｙ）を除き、任意のアミノ酸により置換され、より好ましくは、元のアミノ酸は、アラニン（Ａ）により置換されている。
【0059】
配列番号２の４７位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換のために、元のアミノ酸は、好ましくは、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を除き、任意のアミノ酸により置換され、より好ましくは、元のアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）により置換されている。
２０９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換のために、元のアミノ酸は、好ましくは、チロシン（Ｙ）またはヒスチジン（Ｈ）を除き、任意のアミノ酸により置換され、より好ましくは、元のアミノ酸は、アラニン（Ａ）により置換されている。
３５４位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換のために、元のアミノ酸は、好ましくは、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を除き、任意のアミノ酸により置換され、より好ましくは、元のアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）により置換されている。
２０９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換のために、元のアミノ酸は、好ましくは、チロシン（Ｙ）またはヒスチジン（Ｈ）を除き、任意のアミノ酸により置換され、より好ましくは、元のアミノ酸は、アラニン（Ａ）により置換されている。
３５４位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換のために、元のアミノ酸は、好ましくは、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を除き、任意のアミノ酸により置換され、より好ましくは、元のアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）により置換されている。
【0060】
配列番号２の４７および３５４位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置は、ＬＤＬ膜受容体と相互作用することが不可能な細胞外ドメインを得るために好ましい。したがって、本発明に従う突然変異体ポリペプチドが、ＬＤＬ膜受容体と相互作用することが不可能であることが所望される場合、突然変異体ポリペプチドは、好ましくは、配列番号２の４７位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換、配列番号２の３５４位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における置換、または配列番号２の４７および３５４位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置における、２つの置換をさらに含む。より好ましくは、４７および／または３５４位における置換は、好ましくは、上記の通りに規定された置換である。
【0061】
融合ポリペプチド
本発明はまた、本発明の突然変異体ポリペプチドと、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる融合ポリペプチドであって、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、
ａ）突然変異体ポリペプチドのＮ末端、
ｂ）配列番号２の１９２～２０２位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｃ）配列番号２の２４０～２５７位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｄ）配列番号２の３４７～３５３位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｅ）配列番号２の３６４～３６６位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｆ）配列番号２の３７６～３７９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間
に挿入されており、
好ましくは、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、突然変異体ポリペプチドのＮ末端に挿入されているか、または配列番号２の３５１および３５２位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置におけるアミノ酸の間に挿入されている、融合ポリペプチドにも関する。
本発明はまた、本発明の突然変異体ポリペプチドと、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質とを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる融合ポリペプチドであって、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、
ａ）突然変異体ポリペプチドのＮ末端、
ｂ）配列番号２の１９２～２０２位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｃ）配列番号２の２４０～２５７位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｄ）配列番号２の３４７～３５３位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｅ）配列番号２の３６４～３６６位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間、
ｆ）配列番号２の３７６～３７９位、または配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置に対応する領域内に位置する、任意の２つの連続アミノ酸の間
に挿入されており、
好ましくは、前記さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、突然変異体ポリペプチドのＮ末端に挿入されているか、または配列番号２の３５１および３５２位、もしくは配列番号２との最適グローバルアライメントの後における、相当する位置におけるアミノ酸の間に挿入されている、融合ポリペプチドにも関する。
【0062】
さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、多様な機能を有しうるが、とりわけ、組換えＶＳＶウイルスを、特異的標的細胞へとターゲティングするために使用されうる。この場合、標的細胞の細胞外表面に発現される抗原に特異的に結合することが可能な、任意のさらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が使用されうる。特に、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、細胞受容体のリガンドの、少なくとも一部を含みうる。
標的細胞が、その表面において、（受容体－リガンド）対の構成要素のうちの１つを発現する場合（例えば、ＥＧＦ－ＥＧＦＲ、ＴＮＦａ－ＴＮＦａＲ、ＰＤ１－ＰＤＬ１、またはＰＤＬ２など）（細胞表面において発現される分子は、一般に、コグネイトの受容体またはリガンドを有するので、生じることが多い）、（受容体－リガンド）対の第２の構成要素（すなわち、標的細胞表面抗原の、天然の受容体またはリガンド）のうちの少なくとも一部（そのコグネイトの受容体またはリガンドに、なおも結合することが可能であるという条件下で）が使用されうる。
標的細胞が、その表面において、（受容体－リガンド）対の構成要素のうちの１つを発現する場合（例えば、ＥＧＦ－ＥＧＦＲ、ＴＮＦａ－ＴＮＦａＲ、ＰＤ１－ＰＤＬ１、またはＰＤＬ２など）（細胞表面において発現される分子は、一般に、コグネイトの受容体またはリガンドを有するので、生じることが多い）、（受容体－リガンド）対の第２の構成要素（すなわち、標的細胞表面抗原の、天然の受容体またはリガンド）のうちの少なくとも一部（そのコグネイトの受容体またはリガンドに、なおも結合することが可能であるという条件下で）が使用されうる。
【0063】
代替的に、抗体、機能的抗体断片も使用されうる。
「抗体」または「免疫グロブリン」とは、所与の抗原についての、少なくとも１つの結合性ドメインと、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することが可能なＦｃ断片を含む定常ドメインとを含む分子を意味する。ヒトおよびマウスなど、大半の哺乳動物では、抗体は、４つのポリペプチド鎖：分子へと、可撓性をもたらす、変動数のジスルフィド架橋により一体に結合させた、２つの重鎖と、２つの軽鎖とからなる。各軽鎖は、定常ドメイン（ＣＬ）と、可変ドメイン（ＶＬ）とからなり；重鎖は、抗体のアイソタイプに従う、可変ドメイン（ＶＨ）と、３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ１～ＣＨ３またはＣＨ１～ＣＨ４）とからなる。ラクダおよびラマなど、少数の希少な哺乳動物では、抗体は、各重鎖が、可変ドメイン（ＶＨ）と、定常領域とを含む、２つの重鎖だけからなる。
可変ドメインが、抗原認識に関与するのに対し、定常ドメインは、抗体の生物学的特性、薬物動態特性、およびエフェクター特性に関与する。
「抗体」または「免疫グロブリン」とは、所与の抗原についての、少なくとも１つの結合性ドメインと、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することが可能なＦｃ断片を含む定常ドメインとを含む分子を意味する。ヒトおよびマウスなど、大半の哺乳動物では、抗体は、４つのポリペプチド鎖：分子へと、可撓性をもたらす、変動数のジスルフィド架橋により一体に結合させた、２つの重鎖と、２つの軽鎖とからなる。各軽鎖は、定常ドメイン（ＣＬ）と、可変ドメイン（ＶＬ）とからなり；重鎖は、抗体のアイソタイプに従う、可変ドメイン（ＶＨ）と、３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ１～ＣＨ３またはＣＨ１～ＣＨ４）とからなる。ラクダおよびラマなど、少数の希少な哺乳動物では、抗体は、各重鎖が、可変ドメイン（ＶＨ）と、定常領域とを含む、２つの重鎖だけからなる。
可変ドメインが、抗原認識に関与するのに対し、定常ドメインは、抗体の生物学的特性、薬物動態特性、およびエフェクター特性に関与する。
【0064】
「機能的抗体断片」とは、抗原結合性ドメインを保持し、したがって、元の抗体と同じ抗原特異性を有する抗体断片を意味する。大半の哺乳動物では、このような機能的抗体断片は、断片である、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、およびｓｃＦｖ－Ｆｃを含む。抗体が、各重鎖が、可変ドメイン（ＶＨＨと称される）および定常領域を含む、２つの重鎖だけからなる、ラクダおよびラマの場合、このような機能的な抗体は、ナノボディーとしてもまた公知の、ＶＨＨ断片に対応する。
本発明の文脈において、本発明に従う突然変異ポリペプチドの機能を変更しないために、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、好ましくは、ペプチド、または比較的短いポリペプチド（好ましくは、２００アミノ酸未満）であろう。結果として、抗体または機能的抗体断片が、選択された種類の、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である場合、機能的抗体断片が、好ましくは、使用されるであろう。本発明の文脈において、任意の適切な機能的抗体断片が使用されうる場合、その小さなサイズ、球形、およびロバストネスのために、ナノボディー（またはＶＨＨ断片）が、好ましくは、使用されるであろう。
本発明の文脈において、本発明に従う突然変異ポリペプチドの機能を変更しないために、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、好ましくは、ペプチド、または比較的短いポリペプチド（好ましくは、２００アミノ酸未満）であろう。結果として、抗体または機能的抗体断片が、選択された種類の、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である場合、機能的抗体断片が、好ましくは、使用されるであろう。本発明の文脈において、任意の適切な機能的抗体断片が使用されうる場合、その小さなサイズ、球形、およびロバストネスのために、ナノボディー（またはＶＨＨ断片）が、好ましくは、使用されるであろう。
【0065】
ターゲティングされる細胞に応じて、細胞表面においてターゲティングされる抗原は、変動するであろう。例えば、本発明に従う突然変異体ポリペプチドを発現する組換えＶＳＶウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスと共に使用される場合、本発明に従う突然変異ポリペプチドは、上記で記載された通り、Ｇ細胞外ドメインを、がん細胞抗原へとターゲティングする抗体または機能的抗体断片（特に、ナノボディー）と融合されうる。例えば、抗ＨＥＲ２抗体もしくは抗ＭＵＣ１８抗体もしくは抗ＥＧＦＲ抗体もしくは抗ＣＤ２０抗体もしくは抗ＣＤ５２抗体、または機能的抗体断片（特に、ナノボディー）が使用されうる。別の文脈では、このような阻害性免疫チェックポイントを発現する免疫細胞をターゲティングすることが所望される場合、阻害性免疫チェックポイント（ＰＤ１、もしくはそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２、またはＣＴＬＡ４など）をターゲティングする抗体または機能的抗体断片（特に、ナノボディー）が使用されうる。また、このような阻害性免疫チェックポイントを発現する免疫細胞をターゲティングすることが所望される場合にも、阻害性免疫チェックポイント（ＰＤ１、もしくはそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２、またはＣＴＬＡ４など）をターゲティングする抗体または機能的抗体断片（特に、ナノボディー）が使用されうる。同様に、Ｂ細胞をターゲティングすることが所望される場合は、Ｂリンパ球抗原であるＣＤ１９をターゲティングする抗体または機能的抗体断片（特に、ナノボディー）が使用されうる。ＧＦＰへと方向付けられた、例示的なナノボディーは、配列番号８０（ＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＰＶＮＲＹＳＭＲＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＷＶＡＧＭＳＳＡＧＤＲＳＳＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＡＲＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＶＮＶＧＦＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）のアミノ酸配列を有する。
【0066】
さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）を、本発明に従う突然変異体ポリペプチドのＮ末端に挿入する場合、突然変異体ポリペプチドのＮ末端へと、直接融合される場合もあり、リンカーペプチドにより、突然変異体ポリペプチドのＮ末端から隔てられる場合もあり、好ましくは、第１のリンカーペプチドにより、突然変異体ポリペプチドのＮ末端から隔てられる。
典型的に、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、および／またはフェニルアラニン（Ｆ）などのアミノ酸残基から構成される、１～３０アミノ酸長のペプチドである。本発明の文脈において好ましいリンカーは、２～１５のアミノ酸を含むが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸が好ましい。
典型的に、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、および／またはフェニルアラニン（Ｆ）などのアミノ酸残基から構成される、１～３０アミノ酸長のペプチドである。本発明の文脈において好ましいリンカーは、２～１５のアミノ酸を含むが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸が好ましい。
【0067】
さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）と、本発明に従う突然変異ポリペプチドとの間の、第１のリンカーペプチドは、２～１５アミノ酸長、好ましくは、４～１２または６～１０アミノ酸長であり、とりわけ、８アミノ酸長である。代替的に、または組み合わせて、そのアミノ酸配列は、好ましくは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択され、より好ましくは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、およびアラニン（Ａ）、またはグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、およびアラニン（Ａ）から選択され、なおより好ましくは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）から選択されるアミノ酸から構成される。好ましい実施形態では、第１のリンカーペプチドは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）から選択される、６～１０のアミノ酸から構成され、とりわけ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドでありうる。
【0068】
さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）を、本発明に従う突然変異体ポリペプチドのＮ末端に挿入する場合、融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドを、ウイルスエンベロープ（融合ポリペプチドが、ウイルスにより発現される場合）、または細胞膜（融合ポリペプチドが、宿主細胞により発現される場合）へとアドレスするために、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）のＮ末端に、シグナルペプチドをさらに含みうる。
【0069】
この場合、本発明に従う融合ポリペプチドは、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、シグナルペプチド、任意に、第２のリンカーペプチド、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）、任意に、第１のリンカーペプチド、および本発明に従う突然変異ポリペプチドを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる。この融合ポリペプチド内では、第１のリンカーペプチドは、存在する場合、上記で記載された通りである。第２のリンカーペプチド（シグナルペプチドと、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）との間における）は、存在する場合、２～１５アミノ酸長、好ましくは、２～６アミノ酸長、２～４アミノ酸長であり、とりわけ、２または３アミノ酸長である。代替的に、または組み合わせて、そのアミノ酸配列は、好ましくは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）から選択され、より好ましくは、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択され、特に、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、およびグルタミン（Ｑ）、またはグルタミン（Ｑ）およびセリン（Ｓ）、またはグルタミン（Ｑ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択されるアミノ酸から構成される。好ましい実施形態では、第２のリンカーペプチドは、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択され、特に、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、およびグルタミン（Ｑ）、またはグルタミン（Ｑ）およびセリン（Ｓ）、またはグルタミン（Ｑ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択される、２～４のアミノ酸から構成され、とりわけ、アミノ酸配列である、ＱＦまたはＱＳでありうる。
好ましい実施形態では、本発明に従う融合ポリペプチドは、第１のリンカーペプチドまたは第２のリンカーペプチドを含み、より好ましくは、第１のリンカーペプチドおよび第２のリンカーペプチドの両方を含む。
好ましい実施形態では、本発明に従う融合ポリペプチドは、第１のリンカーペプチドまたは第２のリンカーペプチドを含み、より好ましくは、第１のリンカーペプチドおよび第２のリンカーペプチドの両方を含む。
【0070】
本発明に従う融合ポリペプチドが、第１のリンカーペプチドおよび第２のリンカーペプチドの両方を含む場合、
・第１のリンカーペプチド（さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）と、本発明に従う突然変異ポリペプチドとの間における）は、好ましくは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）から選択される、６～１０のアミノ酸から構成され、とりわけ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドであることが可能であり；
・第２のリンカーペプチド（シグナルペプチドと、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）との間における）は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択され、特に、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、およびグルタミン（Ｑ）、またはグルタミン（Ｑ）およびセリン（Ｓ）、またはグルタミン（Ｑ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択される、好ましくは、２～４のアミノ酸から構成され、とりわけ、アミノ酸配列である、ＱＦまたはＱＳを有するリンカーペプチドでありうる。
・第１のリンカーペプチド（さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）と、本発明に従う突然変異ポリペプチドとの間における）は、好ましくは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）から選択される、６～１０のアミノ酸から構成され、とりわけ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドであることが可能であり；
・第２のリンカーペプチド（シグナルペプチドと、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）との間における）は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択され、特に、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、およびグルタミン（Ｑ）、またはグルタミン（Ｑ）およびセリン（Ｓ）、またはグルタミン（Ｑ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択される、好ましくは、２～４のアミノ酸から構成され、とりわけ、アミノ酸配列である、ＱＦまたはＱＳを有するリンカーペプチドでありうる。
【0071】
好ましい実施形態では、本発明に従う融合ポリペプチドが、第１のリンカーペプチドおよび第２のリンカーペプチドの両方を含む場合、第１のリンカーペプチド（さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）と、本発明に従う突然変異ポリペプチドとの間における）は、アミノ酸配列であるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）を有し、第２のリンカーペプチド（シグナルペプチドと、さらなるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（好ましくは、ナノボディーなどの機能的抗体断片）との間における）は、アミノ酸配列である、ＱＦまたはＱＳを有する。
【0072】
例示的な、好ましい融合ポリペプチドは、配列番号８２（ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＩＧＶＮＣＱＳＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＰＶＮＲＹＳＭＲＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＷＶＡＧＭＳＳＡＧＤＲＳＳＹＥＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＡＲＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＶＮＶＧＦＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＦＴＩＶＦＰＨＮＱＫＧＮＷＫＮＶＰＳＮＹＮＹＣＰＳＳＳＤＬＮＷＨＮＤＬＩＧＴＡＬＱＶＫＭＰＫＳＨＫＡＩＱＡＤＧＷＭＣＨＡＳＫＷＶＴＴＣＤＦＲＷＹＧＰＫＹＩＴＨＳＩＲＳＦＴＰＳＶＥＱＣＫＥＳＩＥＱＴＫＱＧＴＷＬＮＰＧＦＰＰＱＳＣＧＹＡＴＶＴＤＡＥＡＶＩＶＱＶＴＰＨＨＶＬＶＤＥＹＴＧＥＷＶＤＳＱＦＩＮＧＫＣＳＮＹＩＣＰＴＶＨＮＳＴＴＷＨＳＤＹＫＶＫＧＬＣＤＳＮＬＩＳＭＤＩＴＦＦＳＥＤＧＥＬＳＳＬＧＫＥＧＴＧＦＲＳＮＹＦＡＹＥＴＧＧＫＡＣＫＭＱＹＣＫＨＷＧＶＲＬＰＳＧＶＷＦＥＭＡＤＫＤＬＦＡＡＡＲＦＰＥＣＰＥＧＳＳＩＳＡＰＳＱＴＳＶＤＶＳＬＩＱＤＶＥＲＩＬＤＹＳＬＣＱＥＴＷＳＫＩＲＡＧＬＰＩＳＰＶＤＬＳＹＬＡＰＫＮＰＧＴＧＰＡＦＴＩＩＮＧＴＬＫＹＦＥＴＲＹＩＲＶＤＩＡＡＰＩＬＳＲＭＶＧＭＩＳＧＴＴＴＥＲＥＬＷＤＤＷＡＰＹＥＤＶＥＩＧＰＮＧＶＬＲＴＳＳＧＹＫＦＰＬＹＭＩＧＨＧＭＬＤＳＤＬＨＬＳＳＫＡＱＶＦＥＨＰＨＩＱＤＡＡＳＱＬＰＤＤＥＩＬＦＦＧＤＴＧＬＳＫＮＰＩＥＬＶＥＧＷＦＳＳＷＫＳＳＩＡＳＦＦＦＩＩＧＬＩＩＧＬＦＬＶＬＲＶＧＩＨＬＣＩＫＬＫＨＴＫＫＲＱＩＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）の配列を有する。
【0073】
核酸分子
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸分子にも関する。
遺伝子コードの縮重のために、特定のアミノ酸配列をコードする、全ての異なる核酸配列は、本発明の範囲内にある。
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸分子にも関する。
遺伝子コードの縮重のために、特定のアミノ酸配列をコードする、全ての異なる核酸配列は、本発明の範囲内にある。
【0074】
特に、本発明に従う核酸の配列は、宿主細胞のまたは任意の他の産生宿主内のその発現を促進するように最適化されうる。実際、一般に、同義コドンと呼ばれる、同じアミノ酸（メチオニンおよびトリプトファンを除く）をコードする、何らかの３のヌクレオチドの組合せが存在する。しかし、これらの組合せのうちの一部は、一般に、細胞または所与の生物により、優先的に使用される（これは、遺伝子コードの使用バイアスと称される）。この優先は、とりわけ、細胞が由来する産生生物に依存する。この帰結として、１種または複数種の生物に由来するタンパク質が、異種生物またはこのような異種生物の細胞において産生される場合、主に、好ましい、異種生物のコドンを使用するように、タンパク質をコードする核酸配列を修飾することが有用でありうる。データは、異なる種による、好ましいコドンの使用に関する文献において入手可能であり、当業者は、所与のタンパク質の、異種生物または異種生物の細胞における発現を、どのようにして最適化するのかについて、熟知している。
【0075】
好ましい核酸分子は、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ株の、糖タンパク質Ｇの細胞外ドメインをコードする、天然のヌクレオチド配列（配列番号８３）、上記で規定された置換を作出するための、１つまたは複数のヌクレオチドにおける突然変異に基づく核酸分子を含む。好ましい核酸分子は、より正確には、下記の表１１で規定される、配列番号８３～配列番号８６から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子を含む。
【0076】
【表11】
本発明に従う核酸分子は、コードされる、本発明に従う突然変異ポリペプチドまたは融合ポリペプチドのクローニングおよび／または発現の他、そのフォールディングおよび安定性を改善することを目的とする、任意の修飾をさらに含有しうる。
【0077】
ベクター
本発明はまた、少なくとも１つの、本発明に従う核酸を含むか、または本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを発現するベクターにも関する。
このようなベクターは、前記核酸配列の発現に必要なエレメントを含み、とりわけ、プロモーター、転写開始コドン、転写終結配列、および適切な転写調節的配列を含む。これらのエレメントは、発現に使用される宿主に従い変動し、当業者により、それらの一般的知見に基づき、容易に選択される。
本発明はまた、少なくとも１つの、本発明に従う核酸を含むか、または本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを発現するベクターにも関する。
このようなベクターは、前記核酸配列の発現に必要なエレメントを含み、とりわけ、プロモーター、転写開始コドン、転写終結配列、および適切な転写調節的配列を含む。これらのエレメントは、発現に使用される宿主に従い変動し、当業者により、それらの一般的知見に基づき、容易に選択される。
【0078】
本発明の文脈において、「ベクター」という用語は、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含むものとして、広義に理解されなければならない。本発明の文脈で適切なベクターは、限定せずに述べると、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＢＣＧ、またはリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ））など、原核宿主細胞内の発現のための、バクテリオファージベクター、プラスミドベクター、またはコスミドベクター；酵母（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））内の発現のためのベクター；昆虫細胞系（例えば、Ｓｆ９細胞）内の発現のための、バキュロウイルスベクターの他；高等真核生物の細胞または対象における発現のための、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含む。典型的に、このようなベクターは、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａなどにおいて）か、またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）などの寄託機関から入手可能であるか、またはそれらの配列、構成、および当業者がそれらを適用することを可能とする作製法について記載する、多数の刊行物の対象となっている。
【0079】
本明細書で使用される、「プラスミドベクター」とは、複製可能なＤＮＡ構築物を指す。通例、プラスミドベクターは、プラスミドベクターを保有する宿主細胞が、対応する選択用薬物の存在下で、陽性選択または陰性選択されることを可能とする、選択用マーカー遺伝子を含有する。当技術分野では、様々な陽性選択用マーカー遺伝子および陰性選択用マーカー遺伝子が公知である。例示を目的として述べると、抗生剤耐性遺伝子が、対応する抗生剤の存在下で、宿主細胞が選択されることを可能とする、陽性選択用マーカー遺伝子として使用されうる。適切なプラスミドベクターが市販されている。
【0080】
本明細書で使用される、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルスゲノムの、少なくとも１つのエレメントを含む核酸ベクターを指し、ウイルス粒子内へと、またはウイルス粒子へとパッケージングされうる。「ウイルス」、「ビリオン」、「ウイルス粒子」、および「ウイルスベクター粒子」という用語は、核酸ベクターが、ウイルス粒子の作出を可能とする、適切な条件に従い、適切な細胞または細胞系へと形質導入される場合に形成されるウイルス粒子を指すように、互換的に使用される。本発明の文脈で、「ウイルスベクター」という用語は、核酸ベクター（例えば、ＤＮＡウイルスベクター）の他、作出される、そのウイルス粒子を含むものとして、広義に理解されなければならない。「感染性」という用語は、ウイルスベクターが、宿主細胞または対象に感染し、これらに侵入する能力を指す。
ウイルスベクターは、好ましくは、少なくとも１つの、本発明に従う核酸を含むか、または本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを発現する水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクターでありうる。
ウイルスベクターは、好ましくは、少なくとも１つの、本発明に従う核酸を含むか、または本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを発現する水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクターでありうる。
【0081】
ＶＳＶは、ラブドウイルス科のベシクロウイルス属に属する、エンベロープ型のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ＶＳＶのマイナス鎖ＲＮＡゲノムは、５つの構造タンパク質をコードし、３’から５’へと、リーダー領域、ヌクレオタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）のための遺伝子、およびトレーラー領域を含む。したがって、本発明に従う、突然変異ＶＳＶベクターは、天然の野生型糖タンパク質Ｇをコードする、天然の野生型配列を、本発明に従う突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする、本発明に従う核酸配列で置きかえることにより得られうる。突然変異ＶＳＶベクターを作出するための標準的技法が、この目的で使用されうる。特に、逆遺伝学が、組換えウイルスの回収に使用されうる。
ＶＳＶゲノムの他の領域（リーダー領域、ヌクレオタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）をコードする遺伝子、およびトレーラー領域）に関して、突然変異ＶＳＶベクターは、任意の適切な天然配列または人工配列を含有しうる。特に、多様なＩｎｄｉａｎａ分離株（Rodriguez et al. J Gen Virol. 2002 Oct;83(Pt 10):2475-83）およびＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ分離株（Velazquez-Salinas et al. Genome Announc. 2017 Sep 14;5(37)）の完全ゲノムの配列は、当技術分野で公知である。加えて、多様なＶＳＶ株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の、参照番号ＶＲ－１２３８、ＶＲ－１２３９、ＶＲ－１５９、およびＶＲ－１４１５～ＶＲ－１４２１の下でも入手可能である。
ＶＳＶゲノムの他の領域（リーダー領域、ヌクレオタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）をコードする遺伝子、およびトレーラー領域）に関して、突然変異ＶＳＶベクターは、任意の適切な天然配列または人工配列を含有しうる。特に、多様なＩｎｄｉａｎａ分離株（Rodriguez et al. J Gen Virol. 2002 Oct;83(Pt 10):2475-83）およびＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ分離株（Velazquez-Salinas et al. Genome Announc. 2017 Sep 14;5(37)）の完全ゲノムの配列は、当技術分野で公知である。加えて、多様なＶＳＶ株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の、参照番号ＶＲ－１２３８、ＶＲ－１２３９、ＶＲ－１５９、およびＶＲ－１４１５～ＶＲ－１４２１の下でも入手可能である。
【0082】
ある実施形態では、ベクター、および、好ましくは、本発明に従うＶＳＶベクターが、好ましくは、腫瘍溶解性でありうることは、それが、がん細胞に優先的に感染し、これらを死滅させることを意味する。前出で列挙された、全てのＶＳＶ株（Ｉｎｄｉａｎａ、Ｍａｒａｂａ、Ｃｏｃａｌ、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ、Ａｌａｇｏａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、およびＣａｒａｊａｓ）は、潜在的に、腫瘍溶解性であり、したがって、使用されうる。
代替的に、または組み合わせて、ベクター、および、好ましくは、本発明に従うＶＳＶベクターはまた、遺伝子治療、免疫療法、およびカーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のためにも使用されうる。
遺伝子治療のために使用される場合、ベクター、および、好ましくは、本発明に従うＶＳＶベクターは、この活性について欠損している細胞内で、この遺伝子の活性を回復させるために、治療目的の遺伝子をさらにコードする。
免疫療法のために使用される場合、ベクター、および、好ましくは、本発明に従うＶＳＶベクターは、少なくとも１つの、目的の抗原、および／またはサイトカイン、アジュバント、免疫チェックポイントモジュレーター、サイトカインをターゲティングする抗体など、免疫応答の調節に関与する分子をさらにコードする。
代替的に、または組み合わせて、ベクター、および、好ましくは、本発明に従うＶＳＶベクターはまた、遺伝子治療、免疫療法、およびカーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のためにも使用されうる。
遺伝子治療のために使用される場合、ベクター、および、好ましくは、本発明に従うＶＳＶベクターは、この活性について欠損している細胞内で、この遺伝子の活性を回復させるために、治療目的の遺伝子をさらにコードする。
免疫療法のために使用される場合、ベクター、および、好ましくは、本発明に従うＶＳＶベクターは、少なくとも１つの、目的の抗原、および／またはサイトカイン、アジュバント、免疫チェックポイントモジュレーター、サイトカインをターゲティングする抗体など、免疫応答の調節に関与する分子をさらにコードする。
【0083】
カーゴの、非刺激のＴ細胞、Ｂ細胞、および造血細胞など、選び出された細胞型への送達が意図される場合、組換え突然変異糖タンパク質は、治療用分子マーカーまたは任意の薬物を含有するＶＬＰの表面に挿入されうる。
好ましい実施形態に従い、本発明に従うウイルスベクター（特に、ＶＳＶベクター）は、感染性ウイルス粒子の形態にある。典型的に、このようなウイルス粒子は、（ｉ）本発明のウイルスベクターを、適切な産生細胞へと導入するステップ、（ｉｉ）前記感染性ウイルス粒子の産生を可能とする、適切な条件下で、前記産生細胞を培養するステップ、（ｉｉｉ）産生されたウイルス粒子を、前記産生細胞の培養物から回収するステップ、および（ｉｖ）任意に、前記回収されたウイルス粒子を精製するステップを含むプロセスにより産生される。
好ましい実施形態に従い、本発明に従うウイルスベクター（特に、ＶＳＶベクター）は、感染性ウイルス粒子の形態にある。典型的に、このようなウイルス粒子は、（ｉ）本発明のウイルスベクターを、適切な産生細胞へと導入するステップ、（ｉｉ）前記感染性ウイルス粒子の産生を可能とする、適切な条件下で、前記産生細胞を培養するステップ、（ｉｉｉ）産生されたウイルス粒子を、前記産生細胞の培養物から回収するステップ、および（ｉｖ）任意に、前記回収されたウイルス粒子を精製するステップを含むプロセスにより産生される。
【0084】
宿主細胞
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを含有するか、またはこれを発現するか、または本発明に従う核酸分子を含有するか、または本発明に従うベクター（特に、ＶＳＶベクター）を含有する宿主細胞にも関する。
宿主細胞が、本発明に従うベクター（特に、ＶＳＶベクター）を含有する場合、宿主細胞は、好ましくは、ＢＳＲ細胞（ＢＨＫ－２１：ベビーハムスター腎臓細胞のクローン；ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）、ＢＨＫ－２１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）、またはＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）など、ＶＳＶの複製に適する真核細胞である。
組成物
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、本発明に従う核酸分子、本発明に従うベクター、本発明に従う宿主細胞、またはこれらの任意の組合せを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物にも関する。
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを含有するか、またはこれを発現するか、または本発明に従う核酸分子を含有するか、または本発明に従うベクター（特に、ＶＳＶベクター）を含有する宿主細胞にも関する。
宿主細胞が、本発明に従うベクター（特に、ＶＳＶベクター）を含有する場合、宿主細胞は、好ましくは、ＢＳＲ細胞（ＢＨＫ－２１：ベビーハムスター腎臓細胞のクローン；ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）、ＢＨＫ－２１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）、またはＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）など、ＶＳＶの複製に適する真核細胞である。
組成物
本発明はまた、本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、本発明に従う核酸分子、本発明に従うベクター、本発明に従う宿主細胞、またはこれらの任意の組合せを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物にも関する。
【0085】
好ましくは、組成物は、治療有効量の活性薬剤（本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、本発明に従う核酸分子、本発明に従うベクター、本発明に従う宿主細胞、またはこれらの任意の組合せ）と、１つまたは複数の、薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物である。
本明細書で使用される、「薬学的に許容されるビヒクル」は、対象における、特に、ヒトにおける投与に適合性である、任意の担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、吸収遅延剤、ならびに全てのこれらなどを含むことが意図される。
本明細書で使用される、「治療有効量」とは、意図される使用に十分な用量である。
組成物は、好ましくは、本発明に従うベクターを含み、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む。
本明細書で使用される、「薬学的に許容されるビヒクル」は、対象における、特に、ヒトにおける投与に適合性である、任意の担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、吸収遅延剤、ならびに全てのこれらなどを含むことが意図される。
本明細書で使用される、「治療有効量」とは、意図される使用に十分な用量である。
組成物は、好ましくは、本発明に従うベクターを含み、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む。
【0086】
治療的使用／ｉｎ ｖｉｖｏにおける使用
本発明はまた、薬物としての使用のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクターを含む組成物）にも関する。
本発明はまた、がんを処置するための使用のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクターを含む組成物）にも関する。
本発明はまた、薬物としての使用のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクターを含む組成物）にも関する。
本発明はまた、がんを処置するための使用のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクターを含む組成物）にも関する。
【0087】
本発明はまた、がんを処置するための薬物の製造のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクターを含む組成物）の使用にも関する。
本発明はまた、がんを処置するための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクターを含む組成物）の使用にも関する。
本発明はまた、それを必要とする対象における、がんを処置するための方法であって、前記対象へと、治療有効量の、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクターを含む組成物）を投与するステップを含む方法にも関する。
本発明はまた、がんを処置するための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクターを含む組成物）の使用にも関する。
本発明はまた、それを必要とする対象における、がんを処置するための方法であって、前記対象へと、治療有効量の、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクター、好ましくは、本発明に従う腫瘍溶解性ＶＳＶベクターを含む組成物）を投与するステップを含む方法にも関する。
【0088】
ＶＳＶウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスであるので、前立腺がん、乳がん、膵臓がん、および黒色腫を含む、多様な種類のがんの処置において使用されうる（Bishnoi. Viruses 10, (2018)）。
本発明はまた、遺伝子治療または免疫療法（特に、ワクチンとしての）における使用のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）にも関する。
本発明はまた、遺伝子治療または免疫療法（特に、ワクチンとしての）のための薬物の製造のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）の使用にも関する。
本発明はまた、遺伝子治療または免疫療法（特に、ワクチンとしての）のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）の使用にも関する。
本発明はまた、遺伝子治療または免疫療法（特に、ワクチンとしての）における使用のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）にも関する。
本発明はまた、遺伝子治療または免疫療法（特に、ワクチンとしての）のための薬物の製造のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）の使用にも関する。
本発明はまた、遺伝子治療または免疫療法（特に、ワクチンとしての）のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）の使用にも関する。
【0089】
本発明はまた、それを必要とする対象における、遺伝子治療法または免疫療法であって、前記対象へと、治療有効量の、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）を投与するステップを含む遺伝子治療法または免疫療法にも関する。
遺伝子治療または免疫療法において使用される、本発明に従うベクター（および、特に、本発明に従うＶＳＶベクター）は、好ましくは、上記の「ベクター」節で開示された通りである。
遺伝子治療は、欠損細胞内の欠損遺伝子活性を補正することが必要であるたびに使用されうる。
免疫療法は、がん、感染性疾患、および炎症性疾患（特に、自己免疫疾患）を含む、多様な種類の疾患の処置のために使用されうる。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、カーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のための使用のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）にも関する。
遺伝子治療または免疫療法において使用される、本発明に従うベクター（および、特に、本発明に従うＶＳＶベクター）は、好ましくは、上記の「ベクター」節で開示された通りである。
遺伝子治療は、欠損細胞内の欠損遺伝子活性を補正することが必要であるたびに使用されうる。
免疫療法は、がん、感染性疾患、および炎症性疾患（特に、自己免疫疾患）を含む、多様な種類の疾患の処置のために使用されうる。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、カーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のための使用のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）にも関する。
【0090】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、カーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のための薬物の製造のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）の使用にも関する。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、カーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）の使用にも関する。
本発明はまた、それを必要とする対象のｉｎ ｖｉｖｏにおける、カーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のための方法であって、前記対象へと、治療有効量の、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）を投与するステップを含む方法にも関する。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、カーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のための、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）の使用にも関する。
本発明はまた、それを必要とする対象のｉｎ ｖｉｖｏにおける、カーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のための方法であって、前記対象へと、治療有効量の、本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、または本発明に従う（医薬）組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）を投与するステップを含む方法にも関する。
【0091】
ｉｎ ｖｉｖｏにおける、カーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のために使用される、本発明に従うベクター（および、特に、本発明に従うＶＳＶベクター）は、好ましくは、上記の「ベクター」節で開示された通りである。
本発明はまた、対象において、前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特に、死滅させられる細胞（がん細胞など）、または非刺激のＴ細胞、Ｂ細胞、および造血細胞へとターゲティングするための使用のための、本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは本発明に従う融合ポリペプチド、または本発明に従うベクター、または本発明に従う宿主細胞、または本発明に従う組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）、またはこれらの組合せにも関する。
本発明はまた、対象において、前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特に、死滅させられる細胞（がん細胞など）、または非刺激のＴ細胞、Ｂ細胞、および造血細胞へとターゲティングするための使用のための、本発明に従う突然変異体ポリペプチドもしくは本発明に従う融合ポリペプチド、または本発明に従うベクター、または本発明に従う宿主細胞、または本発明に従う組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）、またはこれらの組合せにも関する。
【0092】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用
本発明はまた、カーゴの、非刺激のＴ細胞、Ｂ細胞、および造血細胞など、選び出された細胞型への選択的送達のための、本発明に従う突然変異体ポリペプチド、もしくは本発明に従う融合ポリペプチド、もしくは本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、もしくは本発明に従う宿主細胞、もしくは本発明に従う組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）、またはこれらの組合せの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用にも関する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、カーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のために使用される、本発明に従うベクター（および、特に、本発明に従うＶＳＶベクター）は、好ましくは、上記の「ベクター」節で開示された通りである。
本発明はまた、前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特に、死滅させられる細胞（がん細胞など）、または非刺激のＴ細胞、Ｂ細胞、および造血細胞へとターゲティングするための、本発明に従う突然変異体ポリペプチド、もしくは本発明に従う融合ポリペプチド、もしくは本発明に従うベクター、もしくは本発明に従う宿主細胞、もしくは本発明に従う組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）、またはこれらの組合せの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用にも関する。
以下の例は、本発明を例示することだけを意図する。
本発明はまた、カーゴの、非刺激のＴ細胞、Ｂ細胞、および造血細胞など、選び出された細胞型への選択的送達のための、本発明に従う突然変異体ポリペプチド、もしくは本発明に従う融合ポリペプチド、もしくは本発明に従うベクター（特に、本発明に従うＶＳＶベクター）、もしくは本発明に従う宿主細胞、もしくは本発明に従う組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）、またはこれらの組合せの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用にも関する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、カーゴの、選び出された細胞型への選択的送達のために使用される、本発明に従うベクター（および、特に、本発明に従うＶＳＶベクター）は、好ましくは、上記の「ベクター」節で開示された通りである。
本発明はまた、前記突然変異体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドがアンカリングされている脂質膜を、特異的標的、例えば、細胞、特に、死滅させられる細胞（がん細胞など）、または非刺激のＴ細胞、Ｂ細胞、および造血細胞へとターゲティングするための、本発明に従う突然変異体ポリペプチド、もしくは本発明に従う融合ポリペプチド、もしくは本発明に従うベクター、もしくは本発明に従う宿主細胞、もしくは本発明に従う組成物（特に、本発明に従うベクターを含む組成物であり、より特定すると、本発明に従うＶＳＶベクターを含む組成物）、またはこれらの組合せの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用にも関する。
以下の例は、本発明を例示することだけを意図する。
【実施例】
【0093】
（実施例１）
抗ＧＦＰターゲティングＧタンパク質を発現する組換えＶＳＶウイルスを作製するための、Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶ Ｇ内の突然変異であるＨ２２ＮおよびＳ４２２Ｉの選択
材料および方法
ＧＮａｎｏ（初期キメラ）の構築
ＧＮａｎｏ構築物は、ｐＣＡＧＧＳプラスミド内にクローニングされたＶＳＶ Ｇ遺伝子（Ｉｎｄｉａｎａ株）から出発して創出した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー法を使用して、多様な位置にナノボディーを挿入した、所望のＧＮａｎｏコード配列を含有するｐＣＡＧＧＳプラスミドを作出した。ＥｃｏＲＩ制限酵素を使用して、空ベクターであるｐＣＡＧＧＳを直鎖化した。次いで、重複部分を伴う、３種のＰＣＲ産物を作出した。産物Ｉは、ナノボディーの挿入部位の前におけるＧ断片である。産物ＩＩは、ナノボディー遺伝子である。産物ＩＩＩは、挿入部位の後におけるＧ断片である。ＰＣＲ産物と、直鎖化ベクターとを組み合わせ、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を伴うインキュベーションにより接続した。
抗ＧＦＰターゲティングＧタンパク質を発現する組換えＶＳＶウイルスを作製するための、Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶ Ｇ内の突然変異であるＨ２２ＮおよびＳ４２２Ｉの選択
材料および方法
ＧＮａｎｏ（初期キメラ）の構築
ＧＮａｎｏ構築物は、ｐＣＡＧＧＳプラスミド内にクローニングされたＶＳＶ Ｇ遺伝子（Ｉｎｄｉａｎａ株）から出発して創出した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー法を使用して、多様な位置にナノボディーを挿入した、所望のＧＮａｎｏコード配列を含有するｐＣＡＧＧＳプラスミドを作出した。ＥｃｏＲＩ制限酵素を使用して、空ベクターであるｐＣＡＧＧＳを直鎖化した。次いで、重複部分を伴う、３種のＰＣＲ産物を作出した。産物Ｉは、ナノボディーの挿入部位の前におけるＧ断片である。産物ＩＩは、ナノボディー遺伝子である。産物ＩＩＩは、挿入部位の後におけるＧ断片である。ＰＣＲ産物と、直鎖化ベクターとを組み合わせ、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を伴うインキュベーションにより接続した。
【0094】
ＢＳＲ細胞内の、組換えＶＳＶウイルスの獲得および増幅
組換えＶＳＶは、Schnell et al. J. virol. 1996において記載されている通りに得た。ｗｔ ＶＳＶ Ｇの代わりに、突然変異体ＧＮａｎｏを伴う、１１，１６１ヌクレオチド（ｎｔ）のプラス鎖全長ＶＳＶ ＲＮＡ配列を発現するプラスミドである、ｐＶＳＶＦＬ（＋）－ＧＮａｎｏは、ｐＶＳＶＦＬ（＋）上に存在する、２つの固有の制限部位である、Ｇ遺伝子の５’側の非コード配列内のＭｌｕＩと、Ｇ遺伝子と、Ｌ遺伝子との間に導入される配列内に存在するＮｈｅＩとを使用して作出した。ＢＳＲ細胞に、ｍｏｉを１０として、ワクシニアウイルスを感染させた。１時間後に、１０μｇ／ｍｌのＡｒａＣ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、それぞれ、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｌタンパク質、およびＧタンパク質をコードするプラスミドである、ｐＢＳ－Ｎ、ｐＢＳ－Ｐ、ｐＢＳ－Ｌ、およびｐｃＤＮＡ３．１－Ｇに加えて、ｐＶＳＶＦＬ（＋）－ＧＮａｎｏプラスミドを、細胞にトランスフェクトした。プラスミドおよび量は、５μｇのｐＶＳＶＦＬ（＋）＿ＧＮａｎｏ、２．５μｇのｐＢＳ－Ｎ、２μｇのｐＢＳ－Ｐ、１μｇのｐＣＤＮＡ３．１－Ｇ、および０．５μｇのｐＢＳ－Ｌの通りであった。５％のＣＯ２中、３７℃におけるインキュベーションの４８時間後に、トランスフェクトされた細胞からの上清を回収し、細胞溶解物に由来する破砕物を、遠心分離によりペレット化した。上清を、０．２μｍのフィルターを介して濾過して、ワクシニアウイルスを除去し、この濾液２．５ｍｌを、直径３．５ｃｍのプレート内の、ＢＳＲ細胞約１０6個へと添加した。２４時間後、組換えＶＳＶを含有する上清を、遠心分離により清澄化させ、さらなる使用のために、－８０℃で保管した。
組換えＶＳＶは、Schnell et al. J. virol. 1996において記載されている通りに得た。ｗｔ ＶＳＶ Ｇの代わりに、突然変異体ＧＮａｎｏを伴う、１１，１６１ヌクレオチド（ｎｔ）のプラス鎖全長ＶＳＶ ＲＮＡ配列を発現するプラスミドである、ｐＶＳＶＦＬ（＋）－ＧＮａｎｏは、ｐＶＳＶＦＬ（＋）上に存在する、２つの固有の制限部位である、Ｇ遺伝子の５’側の非コード配列内のＭｌｕＩと、Ｇ遺伝子と、Ｌ遺伝子との間に導入される配列内に存在するＮｈｅＩとを使用して作出した。ＢＳＲ細胞に、ｍｏｉを１０として、ワクシニアウイルスを感染させた。１時間後に、１０μｇ／ｍｌのＡｒａＣ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、それぞれ、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｌタンパク質、およびＧタンパク質をコードするプラスミドである、ｐＢＳ－Ｎ、ｐＢＳ－Ｐ、ｐＢＳ－Ｌ、およびｐｃＤＮＡ３．１－Ｇに加えて、ｐＶＳＶＦＬ（＋）－ＧＮａｎｏプラスミドを、細胞にトランスフェクトした。プラスミドおよび量は、５μｇのｐＶＳＶＦＬ（＋）＿ＧＮａｎｏ、２．５μｇのｐＢＳ－Ｎ、２μｇのｐＢＳ－Ｐ、１μｇのｐＣＤＮＡ３．１－Ｇ、および０．５μｇのｐＢＳ－Ｌの通りであった。５％のＣＯ２中、３７℃におけるインキュベーションの４８時間後に、トランスフェクトされた細胞からの上清を回収し、細胞溶解物に由来する破砕物を、遠心分離によりペレット化した。上清を、０．２μｍのフィルターを介して濾過して、ワクシニアウイルスを除去し、この濾液２．５ｍｌを、直径３．５ｃｍのプレート内の、ＢＳＲ細胞約１０6個へと添加した。２４時間後、組換えＶＳＶを含有する上清を、遠心分離により清澄化させ、さらなる使用のために、－８０℃で保管した。
【0095】
得られた組換えＶＳＶ上清の、ｐｆｕ／ｍｌ単位の力価は、結晶バイオレット着色法を使用して、感染の２４時間後に、各ホイール内で、プラークをカウントすることを介する、６ウェルプレート内の、ＢＳＲ細胞上のプラークアッセイにより決定した。
次いで、採取された組換えウイルスを、直径６ｃｍの細胞プレート上で、ＢＳＲ細胞３×１０6個に、ｍｏｉを０．１として感染させることにより増幅した。この新たな上清を、プラークアッセイで滴定し、さらなる使用のために、－８０℃で保管した。
高力価を得るよう、組換えウイルスの増殖速度を増大させやすい突然変異の出現を優先させるために、直径６ｃｍのプレート内のＢＳＲ細胞３×１０6個に、１０，０００ｐｆｕを感染させた。その後、ＢＳＲ細胞上で、ウイルス上清を、１０代にわたり継代培養した。力価は、ここでもまた、プラークアッセイを使用して推定した。
次いで、採取された組換えウイルスを、直径６ｃｍの細胞プレート上で、ＢＳＲ細胞３×１０6個に、ｍｏｉを０．１として感染させることにより増幅した。この新たな上清を、プラークアッセイで滴定し、さらなる使用のために、－８０℃で保管した。
高力価を得るよう、組換えウイルスの増殖速度を増大させやすい突然変異の出現を優先させるために、直径６ｃｍのプレート内のＢＳＲ細胞３×１０6個に、１０，０００ｐｆｕを感染させた。その後、ＢＳＲ細胞上で、ウイルス上清を、１０代にわたり継代培養した。力価は、ここでもまた、プラークアッセイを使用して推定した。
【0096】
プラークアッセイによる滴定
前日に、ＢＳＲ細胞１０6個を、６枚のホイールプレートに播種して、翌日、約９０％のコンフルエンシーの単層を確認した。次いで、細胞に、１０倍の系列希釈液２００μＬを、室温で、１時間にわたり感染させた。感染後、固定化培地を、ホイール内の、０．８％のアガロースを含有する接種物へと直接添加して、細胞を重層化させた。
オーバーレイの添加後、プレートを、５％のＣＯ２中、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。ウイルス力価を決定するために、プラーク５～１００個を含有するウェル内のプラークをカウントする。ウイルス力価は、ｐｆｕ／ｍｌ＝（平均プラーク数）／（希釈率×プレートへと添加される希釈液の容量）の通りに決定される。
ウイルス集団内の、Ｇ遺伝子のシーケンシング
直径６ｃｍのプレート上のＢＳＲ細胞３×１０6個に、ＭＯＩを３として感染させ、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡ抽出を行った。次いで、全ウイルスｍＲＮＡに特異的なプライマーである、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴ（配列番号８７）を使用するＲＴ－ＰＣＲを、全ＲＮＡ抽出物に対して実施した。次いで、ＶＳＶＧ遺伝子を、ＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物を、シーケンシングへと送り、補償的突然変異を同定した。
前日に、ＢＳＲ細胞１０6個を、６枚のホイールプレートに播種して、翌日、約９０％のコンフルエンシーの単層を確認した。次いで、細胞に、１０倍の系列希釈液２００μＬを、室温で、１時間にわたり感染させた。感染後、固定化培地を、ホイール内の、０．８％のアガロースを含有する接種物へと直接添加して、細胞を重層化させた。
オーバーレイの添加後、プレートを、５％のＣＯ２中、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。ウイルス力価を決定するために、プラーク５～１００個を含有するウェル内のプラークをカウントする。ウイルス力価は、ｐｆｕ／ｍｌ＝（平均プラーク数）／（希釈率×プレートへと添加される希釈液の容量）の通りに決定される。
ウイルス集団内の、Ｇ遺伝子のシーケンシング
直径６ｃｍのプレート上のＢＳＲ細胞３×１０6個に、ＭＯＩを３として感染させ、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡ抽出を行った。次いで、全ウイルスｍＲＮＡに特異的なプライマーである、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴ（配列番号８７）を使用するＲＴ－ＰＣＲを、全ＲＮＡ抽出物に対して実施した。次いで、ＶＳＶＧ遺伝子を、ＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物を、シーケンシングへと送り、補償的突然変異を同定した。
【0097】
結果
野生型糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子が、ＧＮａｎｏ（ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ Ｇタンパク質のシグナルペプチド、２アミノ酸のＱＦリンカー、配列番号８０の配列を有する抗ＧＦＰナノボディー、１０アミノ酸のリンカーである、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）、および野生型ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ Ｇタンパク質細胞外ドメイン（配列番号２）、からなる、初期キメラ；図２の上図を参照されたい）をコードする遺伝子で置きかえられた、組換えＶＳＶウイルスを構築した。しかし、この初期組換えＶＳＶウイルスの増幅は、極めて困難であり、ＢＳＲ細胞内の、２４時間にわたる増幅の後で、極めて低度の感染力価、約８．１０4ｐｆｕ／ｍｌが得られただけであった。このような低力価は、治療を意図するターゲティング型ＶＳＶウイルスの、産業的作製に適合しない。
次いで、その増幅を改善する突然変異を選択するために、この組換えウイルスの、ＢＳＲ細胞上における、何代かにわたる継代を実施した。１０継代の後、ウイルス集団のゲノムに対するシーケンシングは、
・２２位におけるヒスチジン残基の、アスパラギンへの変化（Ｈ２２Ｎ置換）、および
・４２２位におけるセリン残基の、イソロイシンへの変化（Ｓ４２２Ｉ置換）
を結果としてもたらす、糖タンパク質のヌクレオチド配列内における２つの突然変異を含有する変異体による、この集団への漸進的侵入を示した。
野生型糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子が、ＧＮａｎｏ（ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ Ｇタンパク質のシグナルペプチド、２アミノ酸のＱＦリンカー、配列番号８０の配列を有する抗ＧＦＰナノボディー、１０アミノ酸のリンカーである、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）、および野生型ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ Ｇタンパク質細胞外ドメイン（配列番号２）、からなる、初期キメラ；図２の上図を参照されたい）をコードする遺伝子で置きかえられた、組換えＶＳＶウイルスを構築した。しかし、この初期組換えＶＳＶウイルスの増幅は、極めて困難であり、ＢＳＲ細胞内の、２４時間にわたる増幅の後で、極めて低度の感染力価、約８．１０4ｐｆｕ／ｍｌが得られただけであった。このような低力価は、治療を意図するターゲティング型ＶＳＶウイルスの、産業的作製に適合しない。
次いで、その増幅を改善する突然変異を選択するために、この組換えウイルスの、ＢＳＲ細胞上における、何代かにわたる継代を実施した。１０継代の後、ウイルス集団のゲノムに対するシーケンシングは、
・２２位におけるヒスチジン残基の、アスパラギンへの変化（Ｈ２２Ｎ置換）、および
・４２２位におけるセリン残基の、イソロイシンへの変化（Ｓ４２２Ｉ置換）
を結果としてもたらす、糖タンパク質のヌクレオチド配列内における２つの突然変異を含有する変異体による、この集団への漸進的侵入を示した。
【0098】
この最適化の後に得られる、組換えウイルスの力価は、約１０8ｐｆｕ／ｍｌであった。
したがって、結果として得られる改善型キメラ（突然変異型ＧＮａｎｏ；図２の下図を参照されたい）は、ＢＳＲ細胞内で、２４時間後に、治療を意図する、ターゲティング型ＶＳＶウイルスの、産業的作製に適合する、高度の増幅を示す。
感染の２４時間後に、ＢＳＲ細胞内で得られた力価を、下記の表１２に提示する。
したがって、結果として得られる改善型キメラ（突然変異型ＧＮａｎｏ；図２の下図を参照されたい）は、ＢＳＲ細胞内で、２４時間後に、治療を意図する、ターゲティング型ＶＳＶウイルスの、産業的作製に適合する、高度の増幅を示す。
感染の２４時間後に、ＢＳＲ細胞内で得られた力価を、下記の表１２に提示する。
【表12】
【0099】
グルタミンおよびフェニルアラニン（ＱＦ）からなり、ＶＳＶ糖タンパク質Ｇのシグナルペプチドと、挿入されているナノボディーとの間に配置されたジペプチドリンカーをコードする配列内では、約５０％の場合において、その後、第３の突然変異が現れたことは、注目に値する。この突然変異は、フェニルアラニンの、セリンへの置きかえ（ＱＦ→ＱＳ；データは示さない）をもたらした。
この第３の突然変異は、動態およびウイルス力価に対して、効果を及ぼさなかったことが重要である（データは示さない）。実際、３つの突然変異を有する、組換えウイルスの力価は、やはり、約１０8ｐｆｕ／ｍｌであった。したがって、この第３の突然変異は、ＢＳＲ細胞内の、組換えウイルスの増幅の改善に影響を及ぼさなかった。
結論
ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメイン内の、突然変異である、Ｈ２２ＮおよびＳ４２２Ｉの挿入は、驚くべきことに、ＧＦＰターゲティング型糖タンパク質Ｇ（抗ＧＦＰナノボディーの挿入による）を含む組換えＶＳＶウイルスを増幅する能力の、劇的な増大を結果としてもたらした。
この第３の突然変異は、動態およびウイルス力価に対して、効果を及ぼさなかったことが重要である（データは示さない）。実際、３つの突然変異を有する、組換えウイルスの力価は、やはり、約１０8ｐｆｕ／ｍｌであった。したがって、この第３の突然変異は、ＢＳＲ細胞内の、組換えウイルスの増幅の改善に影響を及ぼさなかった。
結論
ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ糖タンパク質Ｇの細胞外ドメイン内の、突然変異である、Ｈ２２ＮおよびＳ４２２Ｉの挿入は、驚くべきことに、ＧＦＰターゲティング型糖タンパク質Ｇ（抗ＧＦＰナノボディーの挿入による）を含む組換えＶＳＶウイルスを増幅する能力の、劇的な増大を結果としてもたらした。
【0100】
（実施例２）
その役割を説明する別の文脈では、Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶ Ｇ内の突然変異である、Ｓ４２２Ｉもまた選択した
ｐＨ感受性分子スイッチの役割を果たすヒスチジンを同定しようとする試みにおいて、本発明者らは、Ｇ細胞外ドメインのヒスチジンを、アラニンで置きかえた。
特に、プロモーターの融合前形態にある、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ Ｇ内には、４つのヒスチジン（Ｈ６０、Ｈ１６２、Ｈ４０７）のクラスターが存在する（図５）。本発明者らは、これらのヒスチジンのプロトン化が、陽性電荷のクラスターを創出し、これが、局所的な斥力を誘導し、これが、構造的転移を誘発するという仮説を立てた。
材料および方法
プラスミドおよびクローニング
点突然変異は、ｐＣＡＧＧＳプラスミド内にクローニングされたＶＳＶ Ｇ遺伝子（Ｉｎｄｉａｎａ Ｍｕｄｄ－Ｓｕｍｍｅｒ株）から出発して創出した。略述すると、所望される突然変異を含有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、Ｇ遺伝子を挟むプライマーのうちの１つと、個別に組み合わせて、２つのＰＣＲ産物を作出した。これらの２つＧ遺伝子断片は、突然変異を含有する領域内で重複するが、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー反応キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、これらを、ｐＣＡＧＧＳ直鎖化ベクターへとアセンブルした（ＥｃｏＲＩにより）。
その役割を説明する別の文脈では、Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶ Ｇ内の突然変異である、Ｓ４２２Ｉもまた選択した
ｐＨ感受性分子スイッチの役割を果たすヒスチジンを同定しようとする試みにおいて、本発明者らは、Ｇ細胞外ドメインのヒスチジンを、アラニンで置きかえた。
特に、プロモーターの融合前形態にある、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ Ｇ内には、４つのヒスチジン（Ｈ６０、Ｈ１６２、Ｈ４０７）のクラスターが存在する（図５）。本発明者らは、これらのヒスチジンのプロトン化が、陽性電荷のクラスターを創出し、これが、局所的な斥力を誘導し、これが、構造的転移を誘発するという仮説を立てた。
材料および方法
プラスミドおよびクローニング
点突然変異は、ｐＣＡＧＧＳプラスミド内にクローニングされたＶＳＶ Ｇ遺伝子（Ｉｎｄｉａｎａ Ｍｕｄｄ－Ｓｕｍｍｅｒ株）から出発して創出した。略述すると、所望される突然変異を含有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、Ｇ遺伝子を挟むプライマーのうちの１つと、個別に組み合わせて、２つのＰＣＲ産物を作出した。これらの２つＧ遺伝子断片は、突然変異を含有する領域内で重複するが、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー反応キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、これらを、ｐＣＡＧＧＳ直鎖化ベクターへとアセンブルした（ＥｃｏＲＩにより）。
【0101】
細胞および抗体
ＢＨＫ－２１細胞（ベビーハムスター腎細胞；ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）、およびＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（サルウイルス４０Ｔ抗原［ＳＶ４０Ｔ］を発現するヒト胎児腎細胞；ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）のクローンである、ＢＳＲを、８％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。Ｇ細胞外ドメインに対して方向付けられたマウスモノクローナル抗体は、ＫｅｒａＦＡＳＴ製であった（８Ｇ５Ｆ１１）。
トランスフェクション
融合アッセイおよび間接的免疫蛍光法のために、６ウェルプレート内、７０％コンフルエンシーで増殖させたＢＳＲ細胞に、リン酸カルシウム法（ウェル１つ当たり５μｇの適切なプラスミド）によりトランスフェクトした。偽型ウイルス作製のために、ＨＥＫ－２９３細胞を、１０ｃｍのディッシュ内で増殖させ、これらに、６μｇの適切なプラスミドを介して、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をトランスフェクトした。
ＢＨＫ－２１細胞（ベビーハムスター腎細胞；ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）、およびＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（サルウイルス４０Ｔ抗原［ＳＶ４０Ｔ］を発現するヒト胎児腎細胞；ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）のクローンである、ＢＳＲを、８％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。Ｇ細胞外ドメインに対して方向付けられたマウスモノクローナル抗体は、ＫｅｒａＦＡＳＴ製であった（８Ｇ５Ｆ１１）。
トランスフェクション
融合アッセイおよび間接的免疫蛍光法のために、６ウェルプレート内、７０％コンフルエンシーで増殖させたＢＳＲ細胞に、リン酸カルシウム法（ウェル１つ当たり５μｇの適切なプラスミド）によりトランスフェクトした。偽型ウイルス作製のために、ＨＥＫ－２９３細胞を、１０ｃｍのディッシュ内で増殖させ、これらに、６μｇの適切なプラスミドを介して、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をトランスフェクトした。
【0102】
細胞表面における発現
細胞表面上の、Ｇタンパク質の発現を定量するために、６ウェルディッシュ上に、７０％のコンフルエンシーで播種されたＨＥＫ－２９３細胞に、上記で記載された通りにトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、１ｍＭのＥＤＴＡ－ＰＢＳへと掻爬するのに続き、６００ｇで、５分間にわたる遠心分離により、細胞を回収した。細胞を、ＰＢＳ中に、１：２，０００の希釈率の、マウスモノクローナル抗Ｇ細胞外ドメイン抗体（８Ｇ５Ｆ１１；ＫｅｒａＦＡＳＴ）と共に、氷上で、１時間にわたりインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中で、２回にわたり洗浄し、パラホルムアルデヒド中、４℃で固定し、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の、１：１００希釈液と共に、氷上で、１時間にわたりと共にインキュベートし、ＰＢＳ中ですすいだ。０．５ｍＭのＥＤＴＡ－ＰＢＳ ５００ｍｌ中の再懸濁の後、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６蛍光活性化細胞分取装置（ＦＡＣＳ）を使用するフローサイトメトリーにより、各集団に由来する細胞１０，０００個の蛍光を決定した。フローサイトメトリーにより、Ｇを発現するトランスフェクト細胞の平均値蛍光強度（ＭＦＩ）を定量した。トランスフェクト細胞の相対細胞表面発現は、（突然変異体についてのＭＦＩ）／（ＷＴについてのＭＦＩ）の通りに決定した。各突然変異体について、図６の下図に示される百分率は、３つの独立の実験の平均である。
細胞表面上の、Ｇタンパク質の発現を定量するために、６ウェルディッシュ上に、７０％のコンフルエンシーで播種されたＨＥＫ－２９３細胞に、上記で記載された通りにトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、１ｍＭのＥＤＴＡ－ＰＢＳへと掻爬するのに続き、６００ｇで、５分間にわたる遠心分離により、細胞を回収した。細胞を、ＰＢＳ中に、１：２，０００の希釈率の、マウスモノクローナル抗Ｇ細胞外ドメイン抗体（８Ｇ５Ｆ１１；ＫｅｒａＦＡＳＴ）と共に、氷上で、１時間にわたりインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中で、２回にわたり洗浄し、パラホルムアルデヒド中、４℃で固定し、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の、１：１００希釈液と共に、氷上で、１時間にわたりと共にインキュベートし、ＰＢＳ中ですすいだ。０．５ｍＭのＥＤＴＡ－ＰＢＳ ５００ｍｌ中の再懸濁の後、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６蛍光活性化細胞分取装置（ＦＡＣＳ）を使用するフローサイトメトリーにより、各集団に由来する細胞１０，０００個の蛍光を決定した。フローサイトメトリーにより、Ｇを発現するトランスフェクト細胞の平均値蛍光強度（ＭＦＩ）を定量した。トランスフェクト細胞の相対細胞表面発現は、（突然変異体についてのＭＦＩ）／（ＷＴについてのＭＦＩ）の通りに決定した。各突然変異体について、図６の下図に示される百分率は、３つの独立の実験の平均である。
【0103】
結果
突然変異Ｈ４０７Ａは、Ｇの融合特性を、完全に消失させる。この突然変異は、ウイルスに致死性である。したがって、組換えウイルス（ＶＳＶ Ｇ Ｈ４０７Ａ）を、自発的に発生させることはできない。本発明者らは、その増殖のために、補完性戦略を用いた。
略述すると、組換えＶＳＶの回収は、トランスフェクトされたプラスミドからの、トランスにおける、機能的なＷＴ ＶＳＶ Ｇタンパク質の発現により裏書きされた。ウイルスゲノムから発現される、融合欠損ＶＳＶ Ｇだけを含有するウイルス粒子を作出するために、上清中に存在するウイルスを、トランスにおける補完性ＶＳＶ Ｇプラスミドを欠く細胞内で増幅した。独立クローンについての配列解析は、それらのうちの１つが、セリン４２２のイソロイシンによる置きかえ（二重突然変異体である、ＶＳＶ Ｇ Ｈ４０７Ａ Ｓ４２２Ｉをもたらす）を結果としてもたらす、２つの顕著に異なる補償的突然変異を明らかにした。
結論
ＶＳＶ Ｇ Ｈ４０７Ａの特徴の、ＶＳＶ Ｇ Ｈ４０７Ａ／Ｓ４２２Ｉの特徴との比較は、突然変異である、Ｈ４０７Ａの文脈では、Ｓ４２２Ｉが、ＶＳＶ Ｇの輸送効率、およびＬＤＬ－Ｒ ＣＲ２ドメインの可溶性形態によるＧの認識を改善することを明らかにした（図６）。これは、突然変異である、Ｈ４０７Ａの文脈では、突然変異である、Ｓ４２２Ｉ（あるいはＳ４２２Ｆ、Ｓ４２２Ｍ、Ｓ４２２Ｌ、もしくはＳ４２２Ｖ、または他のＶＳＶ株のＧ細胞外ドメインの相当する位置における、相当の置換などの同様な置換）が、Ｇのフォールディングを容易とし、融合前形態を安定化させる（構造的転移は、ＣＲドメイン結合性部位を破壊するので）ことを強く示唆する。
突然変異Ｈ４０７Ａは、Ｇの融合特性を、完全に消失させる。この突然変異は、ウイルスに致死性である。したがって、組換えウイルス（ＶＳＶ Ｇ Ｈ４０７Ａ）を、自発的に発生させることはできない。本発明者らは、その増殖のために、補完性戦略を用いた。
略述すると、組換えＶＳＶの回収は、トランスフェクトされたプラスミドからの、トランスにおける、機能的なＷＴ ＶＳＶ Ｇタンパク質の発現により裏書きされた。ウイルスゲノムから発現される、融合欠損ＶＳＶ Ｇだけを含有するウイルス粒子を作出するために、上清中に存在するウイルスを、トランスにおける補完性ＶＳＶ Ｇプラスミドを欠く細胞内で増幅した。独立クローンについての配列解析は、それらのうちの１つが、セリン４２２のイソロイシンによる置きかえ（二重突然変異体である、ＶＳＶ Ｇ Ｈ４０７Ａ Ｓ４２２Ｉをもたらす）を結果としてもたらす、２つの顕著に異なる補償的突然変異を明らかにした。
結論
ＶＳＶ Ｇ Ｈ４０７Ａの特徴の、ＶＳＶ Ｇ Ｈ４０７Ａ／Ｓ４２２Ｉの特徴との比較は、突然変異である、Ｈ４０７Ａの文脈では、Ｓ４２２Ｉが、ＶＳＶ Ｇの輸送効率、およびＬＤＬ－Ｒ ＣＲ２ドメインの可溶性形態によるＧの認識を改善することを明らかにした（図６）。これは、突然変異である、Ｈ４０７Ａの文脈では、突然変異である、Ｓ４２２Ｉ（あるいはＳ４２２Ｆ、Ｓ４２２Ｍ、Ｓ４２２Ｌ、もしくはＳ４２２Ｖ、または他のＶＳＶ株のＧ細胞外ドメインの相当する位置における、相当の置換などの同様な置換）が、Ｇのフォールディングを容易とし、融合前形態を安定化させる（構造的転移は、ＣＲドメイン結合性部位を破壊するので）ことを強く示唆する。
【0104】
（実施例３）
細胞間融合アッセイ。ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ ＷＴ Ｇ糖タンパク質の融合特性の、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ ＧＮａｎｏ最適化糖タンパク質との比較
材料および方法
細胞間融合アッセイ
ガラス製のカバースリップ上に、７０％のコンフルエンシーで播種されたＢＳＲ細胞に、野生型（ＷＴ）Ｇまたは突然変異体ＧをコードするｐＣＡＧＧＳプラスミド、およびＧＦＰ（細胞質マーカー）へと融合した、狂犬病ウイルスのリンタンパク質をコードするＰ－ＧＦＰプラスミドを共トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、多様なｐＨ値（５．０～６．５）の融合緩衝液（ＤＭＥＭ＋１０ｍＭのＭＥＳ）と共に、３７℃で、１０分間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、１回洗浄し、ｐＨ７．４に緩衝された、ＤＭＥＭ＋１０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、１％のＢＳＡと共に、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。細胞を、１倍濃度のＰＢＳ中に４％のパラホルムアルデヒドで、１５分間にわたり固定した。細胞核を、ＤＡＰＩで染色し、合胞体の形成を、２０倍のレンズを伴う、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ ｖｅｒｔ ２００蛍光顕微鏡で解析した。
細胞間融合アッセイ。ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ ＷＴ Ｇ糖タンパク質の融合特性の、ＶＳＶ Ｉｎｄｉａｎａ ＧＮａｎｏ最適化糖タンパク質との比較
材料および方法
細胞間融合アッセイ
ガラス製のカバースリップ上に、７０％のコンフルエンシーで播種されたＢＳＲ細胞に、野生型（ＷＴ）Ｇまたは突然変異体ＧをコードするｐＣＡＧＧＳプラスミド、およびＧＦＰ（細胞質マーカー）へと融合した、狂犬病ウイルスのリンタンパク質をコードするＰ－ＧＦＰプラスミドを共トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、多様なｐＨ値（５．０～６．５）の融合緩衝液（ＤＭＥＭ＋１０ｍＭのＭＥＳ）と共に、３７℃で、１０分間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、１回洗浄し、ｐＨ７．４に緩衝された、ＤＭＥＭ＋１０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、１％のＢＳＡと共に、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。細胞を、１倍濃度のＰＢＳ中に４％のパラホルムアルデヒドで、１５分間にわたり固定した。細胞核を、ＤＡＰＩで染色し、合胞体の形成を、２０倍のレンズを伴う、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ ｖｅｒｔ ２００蛍光顕微鏡で解析した。
【0105】
結果
ＶＳＶ Ｇ Ｉｎｄｉａｎａ ＷＴおよびＶＳＶ ＧＮａｎｏの、最適化（すなわち、残基Ｈ２２の、Ｎへの突然変異、および残基Ｓ４２２の、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、またはＶへの突然変異）の後における融合特性を、細胞間融合アッセイにおいて解析した。このために、ＢＳＲ細胞に、ＶＳＶ Ｇ（ＷＴまたは突然変異体）、およびＰ－ＧＦＰ（合胞体の容易な観察を可能とする、もっぱら細胞質内のタンパク質）を発現するｐＣＡＧＧＳプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、１０分間にわたり、表示のｐＨへと調整されたＤＭＥＭへと曝露し、次いで、これを、ｐＨ７．４のＤＭＥＭで置きかえた。次いで、固定の前に、細胞を、３７℃で、１時間にわたり保持した。
野生型Ｇタンパク質を発現する細胞は、５．５～６．３の間の低ｐＨへと曝露したところ、大型の合胞体を形成した（図７）。最適化後のＧＮａｎｏを発現する細胞は、全て、低ｐＨへと曝露したところ、合胞体を形成することが可能であった（図７）。
結論
結果は、４２２位における疎水性残基の存在が、ｐＨ依存性構造的転移の調節において鍵となるという事実と符合する。これは、突然変異である、Ｓ４２２Ｉ（あるいはＳ４２２Ｆ、Ｓ４２２Ｍ、Ｓ４２２Ｌ、もしくはＳ４２２Ｖ、または他のＶＳＶ株のＧ細胞外ドメインに相当する位置における、相当の置換）が、Ｇのフォールディングを容易とし、ＧＮａｎｏの融合前形態を安定化させることを強く示唆する。
ＶＳＶ Ｇ Ｉｎｄｉａｎａ ＷＴおよびＶＳＶ ＧＮａｎｏの、最適化（すなわち、残基Ｈ２２の、Ｎへの突然変異、および残基Ｓ４２２の、Ｉ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、またはＶへの突然変異）の後における融合特性を、細胞間融合アッセイにおいて解析した。このために、ＢＳＲ細胞に、ＶＳＶ Ｇ（ＷＴまたは突然変異体）、およびＰ－ＧＦＰ（合胞体の容易な観察を可能とする、もっぱら細胞質内のタンパク質）を発現するｐＣＡＧＧＳプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、１０分間にわたり、表示のｐＨへと調整されたＤＭＥＭへと曝露し、次いで、これを、ｐＨ７．４のＤＭＥＭで置きかえた。次いで、固定の前に、細胞を、３７℃で、１時間にわたり保持した。
野生型Ｇタンパク質を発現する細胞は、５．５～６．３の間の低ｐＨへと曝露したところ、大型の合胞体を形成した（図７）。最適化後のＧＮａｎｏを発現する細胞は、全て、低ｐＨへと曝露したところ、合胞体を形成することが可能であった（図７）。
結論
結果は、４２２位における疎水性残基の存在が、ｐＨ依存性構造的転移の調節において鍵となるという事実と符合する。これは、突然変異である、Ｓ４２２Ｉ（あるいはＳ４２２Ｆ、Ｓ４２２Ｍ、Ｓ４２２Ｌ、もしくはＳ４２２Ｖ、または他のＶＳＶ株のＧ細胞外ドメインに相当する位置における、相当の置換）が、Ｇのフォールディングを容易とし、ＧＮａｎｏの融合前形態を安定化させることを強く示唆する。
【0106】
（実施例４）
ＶＳＶ ＧのＣ末端部分は、細胞外ドメインの、その融合前状態へのロッキングに寄与する
結果
ＷＴ Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶ Ｇ細胞外ドメイン（残基１～４４０を含むＧ1-440）の構造は、２．１Åの分解能で決定した。細胞外ドメインは、その三量体の融合前コンフォメーションで結晶化させ、その構造を、２．１Åの分解能で決定した（図８）。ポリペプチド鎖は、残基４３２までトレースすることができた。Ｇ1-440のＣ末端部分は、アルファ－ヘリックス（残基４０９～４１６）に続く、Ｐｒｏ ４１８と、Ｇｌｕ ４２１との間のベータ－ターン、および短いベータ－ヘアピン構造（残基４２２～４３２）で終わるキンク領域から作られている。ヘアピン構造は、両方のセグメントの主鎖の間の水素結合、ならびに残基Ｈ８０およびＥ４２１の側鎖の間の水素結合を介して、ＶＳＶ Ｇ融合ドメインのベータ－シートの鎖である、７９～８４と相互作用する。
ＶＳＶ ＧのＣ末端部分は、細胞外ドメインの、その融合前状態へのロッキングに寄与する
結果
ＷＴ Ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶ Ｇ細胞外ドメイン（残基１～４４０を含むＧ1-440）の構造は、２．１Åの分解能で決定した。細胞外ドメインは、その三量体の融合前コンフォメーションで結晶化させ、その構造を、２．１Åの分解能で決定した（図８）。ポリペプチド鎖は、残基４３２までトレースすることができた。Ｇ1-440のＣ末端部分は、アルファ－ヘリックス（残基４０９～４１６）に続く、Ｐｒｏ ４１８と、Ｇｌｕ ４２１との間のベータ－ターン、および短いベータ－ヘアピン構造（残基４２２～４３２）で終わるキンク領域から作られている。ヘアピン構造は、両方のセグメントの主鎖の間の水素結合、ならびに残基Ｈ８０およびＥ４２１の側鎖の間の水素結合を介して、ＶＳＶ Ｇ融合ドメインのベータ－シートの鎖である、７９～８４と相互作用する。
【0107】
結論
ＶＳＶ Ｇ細胞外ドメインの、このＸ線構造は、Ｃ末端部分（残基４０７～残基４２５）は、大部分が、融合ドメインと相互作用するので、融合前複合体の安定化に寄与することを明らかにする。本発明に特に重要であるのは、この融合前構造では、残基Ｓ４２２が、Ｆ４２４およびＬ４３０の方へと向かっているという事実である。したがって、補償的突然変異であるＳ４２２Ｉは、Ｉ４２２と、残基Ｆ４２４およびＬ４３０との疎水性相互作用を介して、ベータ－ヘアピン構造（したがって、融合前状態）を安定化させる。これはまた、Ｓ４２２の、他の疎水性残基（Ｌ、Ｍ、Ｖ、またはＦ）による置きかえが、なぜ、同じ（すなわち、融合前コンフォメーションを安定化させる）効果を有するのかも説明した。
ＶＳＶ Ｇ細胞外ドメインの、このＸ線構造は、Ｃ末端部分（残基４０７～残基４２５）は、大部分が、融合ドメインと相互作用するので、融合前複合体の安定化に寄与することを明らかにする。本発明に特に重要であるのは、この融合前構造では、残基Ｓ４２２が、Ｆ４２４およびＬ４３０の方へと向かっているという事実である。したがって、補償的突然変異であるＳ４２２Ｉは、Ｉ４２２と、残基Ｆ４２４およびＬ４３０との疎水性相互作用を介して、ベータ－ヘアピン構造（したがって、融合前状態）を安定化させる。これはまた、Ｓ４２２の、他の疎水性残基（Ｌ、Ｍ、Ｖ、またはＦ）による置きかえが、なぜ、同じ（すなわち、融合前コンフォメーションを安定化させる）効果を有するのかも説明した。
【0108】
参考文献
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【配列表】