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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-18
(45)【発行日】2024-12-26
(54)【発明の名称】カリックスアレーン化合物およびその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/10 20060101AFI20241219BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241219BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241219BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20241219BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241219BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20241219BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20241219BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20241219BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20241219BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20241219BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20241219BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241219BHJP
A61K 31/439 20060101ALI20241219BHJP
A61K 31/4995 20060101ALI20241219BHJP
A61K 31/407 20060101ALI20241219BHJP
A61K 31/335 20060101ALI20241219BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241219BHJP
A61K 31/403 20060101ALI20241219BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241219BHJP
C07C 309/42 20060101ALN20241219BHJP
C07D 471/08 20060101ALN20241219BHJP
C07D 487/08 20060101ALN20241219BHJP
C07D 209/70 20060101ALN20241219BHJP
C07D 313/00 20060101ALN20241219BHJP
C07D 221/22 20060101ALN20241219BHJP
【ＦＩ】
A61K31/10
A61P29/00
A61P37/06
A61P37/08
A61P11/00
A61P19/02
A61P1/04
A61P11/06
A61P17/06
A61P39/06
A61P3/06
A61P9/10 101
A61K31/439
A61K31/4995
A61K31/407
A61K31/335
A61P43/00 121
A61P29/00 101
A61K31/403
A61K45/00
C07C309/42
C07D471/08
C07D487/08
C07D209/70
C07D313/00
C07D221/22
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021575255
(86)(22)【出願日】2020-06-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-25
(86)【国際出願番号】 EP2020066991
(87)【国際公開番号】W WO2020254507
(87)【国際公開日】2020-12-24
【審査請求日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】19181021.7
(32)【優先日】2019-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】510300382
【氏名又は名称】ウニベルジテート ウィーン
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】ゲゼル，ターニャ
(72)【発明者】
【氏名】コンラット，ロベルト
(72)【発明者】
【氏名】シーリー，カルドナ・マルコ
【審査官】三上 晶子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５３５２７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０５４４１９８３（ＵＳ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／００５２１５４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０８３２９３３６（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２００７－０５６０５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】Iris H. HALL et al.，“Anti-Inflammatory Activity of (Polyphenolic)-Sulfonates and Their Sodium Salts in Rodents”，Metal-Based Drugs，1998年01月01日，Vol. 5, No. 2，p.67-75，DOI: 10.1155/MBD.1998.67
【文献】Benoit-Joseph LAVENTIE et al.，“p-Sulfonato-calix[n]arenes inhibit staphylococcal bicomponent leukotoxins by supramolecular interactions”，Biochemical Journal，2013年02月28日，Vol. 450, No. 3，p.559-571，DOI: 10.1042/BJ20121628
【文献】E． K. STEPHENS et al.，“Structural requirements for anti-oxidant activity of calix[n]arenes and their associated anti-bacterial activity”，Chemical Communications，2015年，Vol. 51, No. 5，p.851-854，DOI: 10.1039/C4CC08576K
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／３３－３３／４４
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ｃ０７Ｃ １／００－４０９／４４
Ｃ０７Ｄ２０１／００－５２１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
カリックスアレーン環を含むカリックスアレーン化合物であって、
（ｉ）ＣＨ ２ リンカーにより連結された４つの同一反復単位であり、該化合物は式（ＩＩＩ）：
【化1】
または、
（ｉｉ）メチレンブリッジにより連結された３つのｐ－スルホン化フェノールの反復単位と、ＣＨ ２ リンカーにより連結された第４の単位であり、該第４の単位は該反復単位と異なり、かつ式（ＩＩ）から構成される、または該第４の単位はＣ１～６アルキルおよび－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－より選択されるリンカーである
【化2】
Ｂはアリール、５～１２員ヘテロアリール、Ｃ３～１０シクロアルキル、３～８員ヘテロシクロアルキルより選択され、そして
Ｒ１およびＲ３は、互いに独立に、水素、ハロゲン、－ＯＲａ、－ＮＲａＲａからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ４は、互いに独立に、水素、ハロゲン、－ＳＯ３Ｒａ、－ＯＲａ、－ＣＯＯＲａからなる群より選択され、そして
各Ｒａは水素またはＣ１～３アルキルであり、
ｎおよびｍは、互いに独立に、０、１、または２を示す；
または、
（ｉｉｉ）前述のいずれかの薬学的に許容されうる塩
である、カリックスアレーン化合物を含む、慢性炎症疾患または障害を有すると診断された被験体の治療において使用するための組成物。
【請求項2】
カリックスアレーン化合物が、５，１１，１７，２３－スルホナト－２５，２６，２７，２８－テトラヒドロキシカリックス［４］アレーン、３－スルホカリックス［４］－ベンゼン－アレーン、３－スルホカリックス［４］－ピリジン－２，６－アレーン、３－スルホカリックス［４］－ピラジン－２，６－アレーン、３－スルホカリックス［４］－ピロール－３，４－アレーン、３－スルホカリックス［４］－ピリジン－３，５－アレーン、３－スルホカリックス［３］－アルキルオキシ－アレーン、３－スルホカリックス［３］－アルキル－アレーン、２５，２６，２７，２８－テトラヒドロキシカリックス（４）アレーン―５，１１，１７，２３－テトラスルホン酸四ナトリウム、カリックス［４］アレーンテトラ－ｐ－スルホン酸四ナトリウム、２５，２６，２７，２８－テトラヒドロキシカリックス（４）アレーン－２３－メチル－５，１１，１７－トリスルホン酸三ナトリウム、２５－メトキシ－２６，２７，２８－トリヒドロキシカリックス（４）アレーン－２３－メチル５，１１，１７－トリスルホン酸三ナトリウム、２５－メトキシ－２６，２７，２８－トリヒドロキシカリックス（４）アレーン－５，１１，１７，２３－テトラスルホン酸四ナトリウム、２５，２６，２７，２８－テトラヒドロキシカリックス（４）アレーン－２３－カルボキシル－５，１１，１７－トリスルホン酸四ナトリウム、２４，２５，２６－トリヒドロキシカリックス［１］ピロール［３］アレーン－５，１１，１７－トリスルホン酸三ナトリウム、または前述のいずれかの薬学的に許容されうる塩のいずれか１つである、請求項１記載の組成物。
【請求項3】
カリックスアレーン化合物が、コルチコステロイド、ヘパリン硫酸、またはヘパラン硫酸のいずれか１つまたはそれより多くの模倣体として作用する、請求項１または２記載の組成物。
【請求項4】
慢性炎症疾患または障害が、アレルギーまたは自己免疫疾患である、請求項１～３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項5】
慢性炎症疾患または障害が、喘息、炎症性腸疾患、関節リウマチ、変形性関節症、慢性閉塞性肺障害、または乾癬のいずれかである、請求項１～４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項6】
カリックスアレーン化合物が、５，１１，１７，２３－スルホナト－２５，２６，２７，２８－テトラヒドロキシカリックス［４］アレーンまたはその薬学的に許容されうる塩である、請求項１～５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項7】
慢性炎症疾患または障害が、アレルギーまたは自己免疫疾患である、請求項６記載の組成物。
【請求項8】
カリックスアレーン化合物が、鏡像異性体、ラセミ化合物、およびその混合物の形である、請求項１～７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項9】
治療が、抗炎症活性を示す、有効量の前記カリックスアレーン化合物の経口、局所、粘膜または非経口投与を含む、請求項１～８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項10】
治療措置が、コルチコステロイド、抗ＴＮＦ－α阻害剤、ＩＬ－１７阻害剤、ＩＬ－２３／ＩＬ－１２阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、フマル酸、ＪＡＫキナーゼ阻害剤、メトトレキセート、レフノミド、ヒドロキシクロロキン（ｈｙｄｒｏｘｃｌｏｒｏｑｕｉｎｉｅ）、スルファサラジン、シクロスポリンまたは解離性ステロイド化合物のいずれかの置換または組み合わせ投与を含む、請求項１～９のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般式（Ｉ）
【0002】
【化1】
【0003】
式中、要素Ａ、Ｌ、Ｒ１およびＲ２は、明細書および請求項に提示する意味を有する
の新規化合物、これらの化合物を調製するためのプロセス、および薬剤としてのその使用、または他の使用に関する。
の新規化合物、これらの化合物を調製するためのプロセス、および薬剤としてのその使用、または他の使用に関する。
【背景技術】
【0004】
炎症プロセスは、多様な病因によって特徴づけられ、そしていくつかのよく確立された療法戦略があり、ステロイド（コルチコステロイドまたはグルココルト（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｏ））療法が、最も有効であり、そして広く用いられるアプローチの１つである。これらはいくつかの疾患領域（例えば炎症性および自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、喘息、潰瘍性大腸炎、クローン病等の治療）で使用されて大きな成功を収めてきた。ステロイド療法によって現在対処されている疾患の大部分は治癒せず、そしてしたがって、典型的には、長期の習慣的な治療が必要である。グルココルチコイド療法が大きな臨床的成功を収めたにもかかわらず、主に、副作用が異なる重症度で現れ、そして長期治療を妨げるため、代替介入戦略に対する、満たされていない医学上の必要性がある。最適有効用量でのコルチコステロイドの習慣的な使用には、高血糖、筋消耗、高血圧、骨粗鬆症および神経学的症状が含まれる。
【0005】
グルココルチコイドの作用様式は、核転位置および遺伝子転写調節を導く受容体活性化であり、その結果、ターゲット遺伝子発現の刺激または抑制を生じる。グルココルチコイドの抗炎症作用は、トランス抑制と呼ばれる機構を通じた、ＮＦ－κＢ転写因子を介するＴＮＦαおよびＩＬ－６などの主要な炎症促進性遺伝子産物の抑制に基づく。グルココルチコイドはまた、副作用に関与する遺伝子の発現にも影響を及ぼす。遺伝子発現の有益な調節および有害な調節が分離された、グルココルチコイド受容体アゴニストに基づく薬剤発見キャンペーンは、これまでのところ、成功してきていない。
【0006】
Ｓａｔｉｓｈ Ｂａｌａｓａｈｅｂ ＮｉｍｓｅおよびＴａｉｓｕｎ Ｋｉｍ（Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． ２０１３（４２）：３６６－３８６）は、官能化カリックスアレーンの生物学的適用を記載し、抗ウイルス、抗細菌、抗真菌、抗結核菌および抗癌活性に触れている。
【0007】
Ｙｏｕｓａｆら（Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ． ２０１５（９）：２８３１－８）は、カリックスアレーンの抗癌潜在能力およびその薬剤積載（ｌｏａｄｉｎｇ）特性を開示する。
【0008】
ＵＳ ５，４８９，６１２は、カリックスアレーン誘導体、その合成および塩化物チャネルブロッカーとしてのその使用を開示する。より正確には、ＵＳ ５，４８９，６１２は、呼吸器障害、骨格筋障害および心臓血管障害の治療におけるいくつかの化合物の使用を開示する。
【0009】
ＷＯ００／０７５８５は、線維性疾患の治療におけるカリックスアレーンの使用を開示する。
ＷＯ２０１７０９３３６３は、神経変性性疾患の治療において使用するための４－スルホカリックス［４］アレーンのナトリウム塩を開示する。
ＷＯ２０１７０９３３６３は、神経変性性疾患の治療において使用するための４－スルホカリックス［４］アレーンのナトリウム塩を開示する。
【0010】
ＷＯ９４０３１６５Ａ１は、誘導体化カリックス［ｎ］アレーン化合物を用いた抗血栓治療を開示する。
Ｈａｌｌら（Ｍｅｔａｌ－Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇｓ １９９８， ５（２）：６７－７５）は、ＬＰＳ誘導性ショックに対する防御効果、制御性サイトカイン（ＴＮＦαおよびＩＬ－１）の放出、ターゲット炎症性細胞上の受容体への結合、ならびにエラスターゼおよびシクロオキシゲナーゼ活性および細胞接着を遮断する効果を持つｆポリフェノール性スルホン化化合物を開示する。
Ｈａｌｌら（Ｍｅｔａｌ－Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇｓ １９９８， ５（２）：６７－７５）は、ＬＰＳ誘導性ショックに対する防御効果、制御性サイトカイン（ＴＮＦαおよびＩＬ－１）の放出、ターゲット炎症性細胞上の受容体への結合、ならびにエラスターゼおよびシクロオキシゲナーゼ活性および細胞接着を遮断する効果を持つｆポリフェノール性スルホン化化合物を開示する。
【0011】
Ｐｉｎｈａｌら（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００１， １０３（１）：３５－４５）は、環状オクタフェノール－オクタスルホン酸ならびにそのメチル化およびアセチル化誘導体、ならびに内皮細胞によって分泌されるヘパラン硫酸プロテオグリカンの合成に対するその効果を記載する。
【0012】
Ｔｙｒｒｅｌｌら（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｈａｙｗａｒｔｈ， ＧＢ， １９９５， １６（６）：１９８－２０４）は、抗凝血剤としての役割を越えた、ヘパリンの療法的使用を開示する。
【0013】
Ｒｏｄｉｋら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００９， １６：１６３０－１６５５）は、酵素模倣体、受容体模倣体、酵素、抗体および酵素阻害剤である誘導体化カリックス［ｎ］アレーン化合物、膜活性性（ｍｅｍｂｒａｎｏａｃｔｉｖｅ）カリックスアレーン、生物活性特性を持つもの、ＤＮＡトランスフェクションおよび磁気共鳴画像化におけるこれらの使用を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【文献】ＵＳ ５，４８９，６１２
【文献】ＷＯ００／０７５８５
【文献】ＷＯ２０１７０９３３６３
【文献】ＷＯ９４０３１６５Ａ１
【非特許文献】
【0015】
【文献】Ｓａｔｉｓｈ Ｂａｌａｓａｈｅｂ ＮｉｍｓｅおよびＴａｉｓｕｎ Ｋｉｍ（Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． ２０１３（４２）：３６６－３８６）
【文献】Ｙｏｕｓａｆら（Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ． ２０１５（９）：２８３１－８）
【文献】Ｈａｌｌら（Ｍｅｔａｌ－Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇｓ １９９８， ５（２）：６７－７５）
【文献】Ｐｉｎｈａｌら（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００１， １０３（１）：３５－４５）
【文献】Ｔｙｒｒｅｌｌら（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｈａｙｗａｒｔｈ， ＧＢ， １９９５， １６（６）：１９８－２０４）
【文献】Ｒｏｄｉｋら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００９， １６：１６３０－１６５５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
新規抗炎症化合物およびこうした化合物を同定する新規アプローチに関する必要性がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでグルココルチコイドまたはヘパラン硫酸を模倣する効果を有し、そして薬剤として用いることを可能にするために適した薬理学的および／または薬物動態学的特性を有する新規化合物を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【0017】
本発明の目的は、抗炎症特性を持つ新規化合物、および抗炎症調製物を提供することである。この目的は、本請求項の、そして本明細書にさらに記載する通りである主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【0018】
驚くべきことに、要素Ａ、Ｌ、Ｒ１およびＲ２が以下に記載する意味を有する、一般式（Ｉ）の化合物は、特異的抗炎症化合物として作用することが見出されてきている。さらに、驚くべきことに、こうした化合物を、抗炎症、抗酸化、抗加齢、または脂質代謝調節療法または予防において用いてもよいことが見出されてきている。予期せぬことに、以前神経変性性疾患の治療に関して記載された４－スルホカリックス［４］アレーンも含まれる一連の化合物の作用様式によって、新規の医学的、美容的または栄養的適用におけるその使用が可能になった。
【0019】
本発明の多様な目的、特徴、側面、および利点は、本発明の態様の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図１は、報告された（コルチゾール）、または実験的に検証された（ＳＣＡ－７４４）遺伝子発現変化に基づいて決定された、コルチゾールおよびＳＣＡ－７４４によって調節される細胞経路の比較を示す。太字：ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析によって実験的に同定された。
【図2-1】図２は、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１０産生に対するＴＨＰ－１マクロファージのＬＰＳ刺激の効果を示す。ＳＣＡ－７４４による、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ－α、ＩＬ－βおよびＩＬ－６の用量依存性阻害。以下の細胞を、ＳＣＡ－７４４の非存在下、ならびに１０、１００および５００μＭの存在下で、［１０ｎｇ／ｍｌ］ＬＰＳで処理した。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭヒト炎症パネルアッセイによって、サイトカインレベルを決定した。バーの高さは、３つ組で行った３回の独立の実験のＬＰＳ単独に比較した濃度平均を示す。
【図2-2】図２は、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１０産生に対するＴＨＰ－１マクロファージのＬＰＳ刺激の効果を示す。ＳＣＡ－７４４による、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ－α、ＩＬ－βおよびＩＬ－６の用量依存性阻害。以下の細胞を、ＳＣＡ－７４４の非存在下、ならびに１０、１００および５００μＭの存在下で、［１０ｎｇ／ｍｌ］ＬＰＳで処理した。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭヒト炎症パネルアッセイによって、サイトカインレベルを決定した。バーの高さは、３つ組で行った３回の独立の実験のＬＰＳ単独に比較した濃度平均を示す。
【図3-1】図３は、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１０産生に対するＴＨＰ－１マクロファージのＬＰＳ刺激の効果を示す。ＳＣＡ－７５４による、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ－α、ＩＬ－βおよびＩＬ－６の用量依存性阻害。以下の細胞を、ＳＣＡ－７５４の非存在下、ならびに３０および１５０μＭの存在下で、［１０ｎｇ／ｍｌ］ＬＰＳで処理した。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭヒト炎症パネルアッセイによって、サイトカインレベルを決定した。バーの高さは、３つ組で行った３回の独立の実験のＬＰＳ単独に比較した濃度平均を示す。
【図3-2】図３は、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１０産生に対するＴＨＰ－１マクロファージのＬＰＳ刺激の効果を示す。ＳＣＡ－７５４による、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ－α、ＩＬ－βおよびＩＬ－６の用量依存性阻害。以下の細胞を、ＳＣＡ－７５４の非存在下、ならびに３０および１５０μＭの存在下で、［１０ｎｇ／ｍｌ］ＬＰＳで処理した。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭヒト炎症パネルアッセイによって、サイトカインレベルを決定した。バーの高さは、３つ組で行った３回の独立の実験のＬＰＳ単独に比較した濃度平均を示す。
【図10-1】表１、２、３および４。表１は、ＳＣＡ－７４４で処理したヒト細胞において示差的に上方制御され、そして細胞性炎症および酸化反応ならびに脂質代謝に関連する、遺伝子を示す。
【図10-2】表２は、ＳＣＡ－７４４で処理したヒト細胞において示差的に下方制御され、そして細胞性炎症および酸化反応ならびに脂質代謝に関連する、遺伝子を示す。
【図10-3】表３は、ＳＣＡ－７４４で処理したヒト細胞において示差的に上方制御され、そして細胞性抗炎症および抗酸化反応ならびに脂質代謝に関連する、ｐ値＜０．０５およびｌｏｇ倍変化（ｌｏｇＦＣ）＞１のすべての注釈付き代謝物を示す。代謝物をｌｏｇＦＣの順に並べる。
【図10-4】表４は、ＳＣＡ－７４４で処理したヒト細胞において示差的に下方制御される、ｐ値＜０．０５およびｌｏｇＦＣ＜－１の、グルコース代謝に関する抜粋した代謝物を示す。代謝物をｌｏｇＦＣの順に並べる。
【図11】図１１は、プレスチモグラフィ測定に基づき、エンドトキシン（ＬＰＳ）への曝露によって損なわれ、そしてＳＣＡ－７４４での処置によって有意に改善された、呼吸性肺機能のパラメータを示す。Ａ：機能的残気量（ＦＲＣ）；Ｂ：呼気時間（Ｔｅ）；Ｃ：Ｔｅに対するピーク呼気流（Ｒｐｅｆ）、Ｄ：呼吸頻度（ｆＢＰＭ）、Ｅ：吸入時間（Ｔｉ）。適用した統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡ後、Ｄｕｎｎｅｔｔの多数比較検定であった。＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．００５、対照（未処置）に対する、ｎ＝５～７／群。
【図12】図１２は、ヘマトキシリンおよびエオジン染色マウス肺組織の顕微鏡写真を示す。Ａ：対照（未処理）；Ｂ：ＬＰＳ＋ビヒクル；Ｃ：ＬＰＳ＋ＳＣＡ－７４４；Ｄ：ＬＰＳ＋ＤＥＸＡ、ＰＯ：血管周囲浮腫、ＰＬ：血管周囲／気管支周囲白血球。
【図13】図１３は、スケール０から３での、顕微鏡スライドの半定量的評価を示す。０：未処理対照に比較して変化なし；１、２および３は、病理重症度の増加に対応する。Ａ：血管周囲浮腫スコア；Ｂ：顆粒球スコア；Ｃ：マクロファージスコア；Ｄ：合成スコア（３つのパラメータすべてを合わせたもの）。適用した統計分析は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ後、Ｄｕｎｎの多数比較検定であった。＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．００５、対照（未処理）に比較、ｎ＝５～７／群。
【図14】図１４、Ａは：陰性対照（偽／ビヒクル）および陽性対照（ＣＦＡ処置）群由来のヘマトキシリンおよびエオジン染色マウス踵関節組織の顕微鏡写真を示す。矢印は滑膜増殖を示す。Ｂは：滑膜増殖スコアに関するデータを用いたグラフであり、０は陰性対照に比較して変化がなく、そして３は、陽性対照群で見られる重度の病理に相当する。適用した統計分析は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定＋Ｄｕｎｎの多数比較検定であった。＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、それぞれの損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）足に比較、ｎ＝５～６マウス／群。
【図15】スルホカリックスアレーン変異体合成の合成スキーム。
【図16】ＳＣＡ－７４４に対する細胞反応に関連する重要な代謝物の同定。絶対ｌｏｇ倍＞１でＳＣＡ－７４４によって影響を受ける、上方制御される、および（抜粋した）下方制御される代謝物をＶｏｌｃａｎｏプロットでラベルする。
【図17】上方および下方制御された代謝物のエンリッチメントプロット。化学的類似性エンリッチメント分析を用いた化学物質群分類によって、２６１の注釈付き代謝物（ＦＤＲ＜０．０５）を分析した。各ノードは、代謝物の有意に改変されたクラスターを反映する。ｐ＜０．０５で有意に異なるエンリッチメントクラスターのみを示す。エンリッチメントｐ値は、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ検定によって提供される。プロットｙ軸は、上部に、最も有意に改変されたクラスターを示す。ｘ軸は、谷本類似性ツリー上のクラスター順によって順序付けられる。ノード色スケールは、対照ヒト細胞に比較した、ＳＣＡ－７４４における増加（黒）または減少（白）化合物の比率を示す。灰色のノードは、増加および減少の両方の場合がある代謝物を有する。
【図18】分子機能に関連する遺伝子オントロジー分析。ＤＥＳｅｑおよびｅｄｇｅＲパッケージの統計検定を適用することによって、示差的に発現されている遺伝子（ＤＥＧ）を同定した。遺伝子オントロジーエンリッチメント分析、および視覚化ツールであるＧｏｒｉｌｌａを用いて、遺伝子オントロジーを生成した。
【図19-1】ＳＣＡ－７４４（Ａ）およびＳＣＡ－７５４（Ｂ）細胞傷害性のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価。ＨＥＫ２９３神経芽細胞腫細胞株を用いて実験を行った。７２時間処理した後、標準ＡＴＰ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイを用いて、細胞生存度に対するＳＣＡ－７４４およびＳＣＡ－７５４の効果を評価した。
【図19-2】ＳＣＡ－７４４（Ａ）およびＳＣＡ－７５４（Ｂ）細胞傷害性のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価。ＨＥＫ２９３神経芽細胞腫細胞株を用いて実験を行った。７２時間処理した後、標準ＡＴＰ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイを用いて、細胞生存度に対するＳＣＡ－７４４およびＳＣＡ－７５４の効果を評価した。
【図19-3】ＳＣＡ－７４４（Ｃ）およびＳＣＡ－７５４（Ｄ）は、哺乳動物細胞において、ＭＰＰ＋誘導性損傷からの酸化ストレスに対して防御する。
【図19-4】ＳＣＡ－７４４（Ｃ）およびＳＣＡ－７５４（Ｄ）は、哺乳動物細胞において、ＭＰＰ＋誘導性損傷からの酸化ストレスに対して防御する。
【図20】ＳＣＡ－７４４は、哺乳動物細胞において、Ｈ２Ｏ２誘導性損傷からの酸化ストレスに対して防御する。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明は、一般式（Ｉ）：
【0022】
【化2】
【0023】
式中、
Ａはアリール、５～１２員ヘテロアリール、Ｃ３～１０シクロアルキル、３～８員ヘテロシクロアルキルより選択され、そして
Ｌは結合、または置換されていてもよいＣ１～６アルキルおよび－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－より選択されるリンカー、または式（ＩＩ）
Ａはアリール、５～１２員ヘテロアリール、Ｃ３～１０シクロアルキル、３～８員ヘテロシクロアルキルより選択され、そして
Ｌは結合、または置換されていてもよいＣ１～６アルキルおよび－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－より選択されるリンカー、または式（ＩＩ）
【0024】
【化3】
【0025】
の化合物であり、
式中、
Ｂはアリール、５～１２員ヘテロアリール、Ｃ３～１０シクロアルキル、３～８員ヘテロシクロアルキルより選択され、そして
Ｒ１およびＲ３は、互いに独立に、水素、ハロゲン、－ＯＲａ、－ＮＲａＲａからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ４は、互いに独立に、水素、ハロゲン、－ＳＯ３Ｒａ、－ＯＲａ、－ＣＯＯＲａからなる群より選択され、そして
各Ｒａは水素またはＣ１～３アルキルであり、
ｎおよびｍは、互いに独立に、０、１、または２を示す；
の、随意に、その薬学的に許容されうる塩、鏡像異性体、ラセミ化合物、および混合物の形の化合物を含む、調製物に関する。
式中、
Ｂはアリール、５～１２員ヘテロアリール、Ｃ３～１０シクロアルキル、３～８員ヘテロシクロアルキルより選択され、そして
Ｒ１およびＲ３は、互いに独立に、水素、ハロゲン、－ＯＲａ、－ＮＲａＲａからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ４は、互いに独立に、水素、ハロゲン、－ＳＯ３Ｒａ、－ＯＲａ、－ＣＯＯＲａからなる群より選択され、そして
各Ｒａは水素またはＣ１～３アルキルであり、
ｎおよびｍは、互いに独立に、０、１、または２を示す；
の、随意に、その薬学的に許容されうる塩、鏡像異性体、ラセミ化合物、および混合物の形の化合物を含む、調製物に関する。
【0026】
本明細書記載の化合物は、その薬学的に許容されうる塩、鏡像異性体、ラセミ化合物、および混合物の形で提供されてもよい。したがって、本明細書にさらに記載されるような用語「化合物」または「本発明の化合物」は、構造式によって決定されるような型、その薬学的に許容されうる塩、鏡像異性体、ラセミ化合物、および混合物のいずれも指すものとする。
【0027】
驚くべきことに、こうした化合物は、抗炎症、抗酸化、抗加齢、または脂質代謝調節特性を有する。
驚くべきことに、要素Ａ、Ｌ、Ｒ１およびＲ２が以下にさらに記載する意味を有し、但し、化合物が５，１１，１７，２３－スルホナト－２５，２６，２７，２８－テトラヒドロキシカリックス［４］アレーン（４－スルホカリックス［４］アレーン、本明細書において、ＳＣＡ－７４４とも称される）ではない、一般式（Ｉ）の化合物は、本明細書にさらに記載する特性を持つ、新規化合物（またはその薬学的に許容されうる塩）として提供されうることが見出されてきている。
驚くべきことに、要素Ａ、Ｌ、Ｒ１およびＲ２が以下にさらに記載する意味を有し、但し、化合物が５，１１，１７，２３－スルホナト－２５，２６，２７，２８－テトラヒドロキシカリックス［４］アレーン（４－スルホカリックス［４］アレーン、本明細書において、ＳＣＡ－７４４とも称される）ではない、一般式（Ｉ）の化合物は、本明細書にさらに記載する特性を持つ、新規化合物（またはその薬学的に許容されうる塩）として提供されうることが見出されてきている。
【0028】
本発明の１つの態様は、Ｌが式（ＩＩ）の化合物である、本明細書に記載するような化合物に関する。
本発明の１つの態様は、Ｌが、（－ＣＨ２－）ｎ、式中、ｎ＝１、２、３、４、５；または（－ＣＦ２－）ｎ、式中、ｎ＝１、２、３、４、５；または（－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－）ｎ、式中、ｎ＝１、２、３、４からなるリンカーである、本明細書に記載するような化合物に関する。
本発明の１つの態様は、Ｌが、（－ＣＨ２－）ｎ、式中、ｎ＝１、２、３、４、５；または（－ＣＦ２－）ｎ、式中、ｎ＝１、２、３、４、５；または（－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－）ｎ、式中、ｎ＝１、２、３、４からなるリンカーである、本明細書に記載するような化合物に関する。
【0029】
特定の側面にしたがって、ヘテロアリールは、Ｎ－またはＯ－複素環、随意に、５または６員Ｎ－またはＯ－複素環である。
特定の側面にしたがって、ハロゲンはＦ、Ｃｌ、またはＢｒの任意の１つである。
特定の側面にしたがって、ハロゲンはＦ、Ｃｌ、またはＢｒの任意の１つである。
【0030】
本発明の１つの態様は、ＡおよびＢが互いに独立にフェニルを示す、本明細書に記載するような化合物に関する。
本発明の１つの態様は、ＲａがＨを示す、本明細書に記載するような化合物に関する。
本発明の１つの態様は、ＲａがＨを示す、本明細書に記載するような化合物に関する。
【0031】
本発明の１つの態様は、各ＣＨ２基が重水素化されている（ＣＤ２）、本明細書に記載するような化合物に関する。
本発明の１つの態様は、Ｌが式（ＩＩ）の化合物であり、そしてＡおよびＢが互いに独立に、５～６員Ｎ－複素環または６員ベンゼン環であり、そしてＲ２およびＲ４の各々が－ＣＯＯＨである、本明細書に記載するような化合物に関する。
本発明の１つの態様は、Ｌが式（ＩＩ）の化合物であり、そしてＡおよびＢが互いに独立に、５～６員Ｎ－複素環または６員ベンゼン環であり、そしてＲ２およびＲ４の各々が－ＣＯＯＨである、本明細書に記載するような化合物に関する。
【0032】
本発明の１つの態様は、多様な（－ＣＨ２－）リンカーセグメントを持つ３－スルホカリックス［３］アレーンである化合物、例えばＬが（－ＣＨ２－）ｎ、式中、ｎ＝１、２、３、４、５からなるリンカーであり；Ａがベンゼンを示し、Ｒ１およびＲ３の各々が－ＯＲａであり；そしてＲ２およびＲ４の各々が－ＳＯ３Ｒａであり、特にＲａが水素である、本明細書に記載するような化合物に関する。
【0033】
１つの態様は、以下の特徴の１つまたはそれより多くによって特徴づけられる化合物に関する：
ａ）Ａがフェニル（置換されていてもよい）である；
ｂ）Ｂがフェニル（置換されていてもよい）、ピラジン、ピリジン、またはピロールである；
ｃ）Ｒ１および／またはＲ３が－Ｈまたは－ＯＨである；
ｄ）Ｒ２および／またはＲ４が－ＳＯ３Ｈである。
ａ）Ａがフェニル（置換されていてもよい）である；
ｂ）Ｂがフェニル（置換されていてもよい）、ピラジン、ピリジン、またはピロールである；
ｃ）Ｒ１および／またはＲ３が－Ｈまたは－ＯＨである；
ｄ）Ｒ２および／またはＲ４が－ＳＯ３Ｈである。
【0034】
カリックスアレーンは、フェノールおよびアルデヒドのヒドロキシアルキル化産物に基づく、大環状分子または環状オリゴマーと一般的に定義される。カリックスアレーンは、三次元バスケット、カップまたはバケツ型により特徴づけられる。カリックス［４］アレーンは環中に４単位を有し、そしてカリックス［３］アレーンは環中に３単位を有する。カリックスアレーン環はまた、本明細書において、「主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」とも称される。
【0035】
環は、同一または同一でない反復単位、および随意にリンカー要素、例えばリンカーが本明細書にさらに記載するようなＬであるもの、特に直鎖リンカーで構成されてもよい。式（ＩＩ）の化合物以外のいずれかであるリンカーＬは、本明細書においてまた、「直鎖リンカー」または「直鎖Ｌ」と称される。特定の態様において、Ｌは、直鎖リンカー、例えば（－ＣＨ２－）リンカーセグメント、例えばＬが（－ＣＨ２－）ｎ、式中、ｎ＝１、２、３、４、５からなる直鎖リンカーであるもの、特にＬがＣＨ２であるもの（「メチレンブリッジ」）である。
【0036】
特定の態様において、カリックスアレーン環は、直鎖Ｌ、特にＬがＣＨ２であるものによって連結される４つの同一反復単位を含むかまたは該反復単位からなる。
特定の態様において、カリックスアレーン環は、直鎖Ｌ、特にＬがＣＨ２であるものによって連結される、３つの同一の反復単位および第四の単位を含むかまたはこうした単位からなり；そして第四の単位は反復単位とは異なり、そして式（ＩＩ）で構成される。
特定の態様において、カリックスアレーン環は、直鎖Ｌ、特にＬがＣＨ２であるものによって連結される、３つの同一の反復単位および第四の単位を含むかまたはこうした単位からなり；そして第四の単位は反復単位とは異なり、そして式（ＩＩ）で構成される。
【0037】
カリックス［４］アレーンにおいて、内部体積はほぼ１０立方オングストロームである。カリックスアレーンは、広い上部縁および狭い下部縁、ならびに中央の輪（ａｎｎｕｌｕｓ）によって特徴づけられる。出発材料としてフェノールを用い、４つのヒドロキシル基は、下部縁上の輪内である。
【0038】
特定の態様は、各々、付着したスルホン酸基を含むフェニル（式（Ｉ）に示す通り）である２つの同一の要素、ならびに本明細書にさらに記載するような、各々、５および／または６員環要素である２つのさらなる要素からなり、それによって４つの環要素からなるカリックスアレーン主鎖を生じる、カリックスアレーン主鎖を含む、本明細書に記載するような化合物（またはその鏡像異性体または薬学的に許容されうる塩）を指す。あるいは、カリックスアレーン主鎖は、本明細書にさらに記載するように、特定の直鎖リンカーによって連結された、各々、５および／または６員環系であり、そのうち少なくとも２つが、各々、スルホン酸基が付着したフェニル（式（Ｉ）に示す通り）である同一の要素である、３つの環要素からなってもよい。
【0039】
特定の態様は、例えば、置換フェノール反復単位および反復単位とは異なる少なくとも１つの置換フェノール単位などの、非同一要素で構成される、非対称カリックスアレーンを指す。特定の態様にしたがって、非対称カリックスアレーン化合物は、メチレンブリッジによって連結された２つまたは３つのｐ－スルホン化フェノール単位、および各々、独立に、ｐ－スルホン化フェノール単位とは異なる１つまたは２つのｐ－置換フェノール単位を含むか、あるいはこれらで構成される。非対称カリックスアレーンは、連結（例えばメチレンブリッジまたは他のリンカー）によって、互いに環状構造になるように連結された要素で構成され、そして他の要素の任意の１つまたはそれより多くと異なる少なくとも１つの要素によって特に特徴づけられる、大環状分子化合物である。
【0040】
特定の態様は、２＋１フラグメント縮合によって得られる３－スルホカリックス［３］アレーン（例えば３つのメチレンブリッジされた環要素および直鎖リンカーからなるカリックスアレーン主鎖を含む）；または３＋１フラグメント縮合によって得られる４－スルホカリックス［４］アレーン（例えば４つのメチレンブリッジされた環要素からなるカリックスアレーン主鎖を含む）を指す。
【0041】
特定の態様は、３－スルホカリックス［３］アレーン、特に２＋１フラグメント縮合によって得られる３－スルホカリックス［３］アレーンを指す。
特定の態様は、４－スルホカリックス［４］アレーン、特に２＋２または３＋１フラグメント縮合によって得られる４－スルホカリックス［４］アレーンを指す。
特定の態様は、４－スルホカリックス［４］アレーン、特に２＋２または３＋１フラグメント縮合によって得られる４－スルホカリックス［４］アレーンを指す。
【0042】
特定の態様は、式（ＩＩＩ）の４－スルホカリックス［４］アレーン、その薬学的に許容されうる塩、例えば４－スルホカリックス［４］アレーンのナトリウム塩、鏡像異性体または誘導体の新規使用を指す。
【0043】
式（ＩＩＩ）：
【0044】
【化4】
【0045】
特定の態様は、以下の表より選択される化合物（またはこうした化合物いずれかの薬学的に許容されうる塩）を指す。式（ＩＶ）および式（Ｖ）は、用いられる命名規則を示す。
【0046】
【化5】
【0047】
表：好ましい化合物
【0048】
【表1-1】
【0049】
【表1-2】
【0050】
【表1-3】
【0051】
【表1-4】
【0052】
【表1-5】
【0053】
本明細書記載の化合物は、カリックスアレーン環を含むと理解される。
疾患における役割
本明細書記載の化合物（またはその薬学的に許容されうる塩）は、抗炎症性疾患、抗酸化疾患、抗加齢疾患、神経変性性疾患または脂質代謝疾患の処置（療法または予防）において新規薬剤としての潜在能力を有する。これには、現在、グルココルチコイドで治療される疾患（例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、変形性関節症、喘息、自己免疫疾患）が含まれる。化合物またはその薬学的に許容されうる塩は、存在するグルココルチコイド治療の置換または付属療法として潜在能力を有する。特に、ＳＣＡ－７４４およびＳＣＡ－７４５は、グルココルチコイド（コルチゾール）の作用に関与するものと重複する抗炎症経路に影響を及ぼすことが示されてきているが、グルココルチコイドの副作用に関与する特定の代謝経路には影響を及ぼさないことが示されてきている。
疾患における役割
本明細書記載の化合物（またはその薬学的に許容されうる塩）は、抗炎症性疾患、抗酸化疾患、抗加齢疾患、神経変性性疾患または脂質代謝疾患の処置（療法または予防）において新規薬剤としての潜在能力を有する。これには、現在、グルココルチコイドで治療される疾患（例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、変形性関節症、喘息、自己免疫疾患）が含まれる。化合物またはその薬学的に許容されうる塩は、存在するグルココルチコイド治療の置換または付属療法として潜在能力を有する。特に、ＳＣＡ－７４４およびＳＣＡ－７４５は、グルココルチコイド（コルチゾール）の作用に関与するものと重複する抗炎症経路に影響を及ぼすことが示されてきているが、グルココルチコイドの副作用に関与する特定の代謝経路には影響を及ぼさないことが示されてきている。
【0054】
さらに、ＳＣＡ－７４４は、コルチゾールと同様に、非敗血症モデルにおいてであっても、炎症促進性遺伝子産物、例えばＩＬ－１β、ＴＮＦαおよびＩＬ－６を抑制することが示されてきている。コルチゾールおよび該化合物によって影響を受ける代謝経路の大部分は共有される。しかし、コルチゾールによって影響を受け、そして副作用に関与するいくつかの代謝経路は、該化合物によって調節されない（例えば糖代謝および神経伝達物質脱活性化経路）。さらに、コルチゾールによっては誘導されないいくつかの有益な効果、例えば強力な酸化防止および細胞防御反応が、該化合物によって誘発される。ＳＣＡ－７４４は、したがって、抗酸化ストレス反応におけるさらなる活性、脂質代謝における好ましい変化、および抗加齢遺伝子活性化を伴う、潜在的に新規の抗炎症産物候補である。
【0055】
ヘパラン硫酸模倣
ＳＣＡ－７４４の１つの潜在的な機構は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）を模倣し、そしてＨＳ相互作用分子に結合することを通じる。ヘパラン硫酸模倣体には、ヘパラン硫酸の少なくとも１つの生物学的機能を実行しうる任意の分子が含まれる。以前のデータは、細胞生存度およびホメオスタシスを維持するために、ヘパラン硫酸模倣体には非常に特異的な構造要件があることを示している（Ｚｉｏｌｋｏｗｓｋｉら； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２０１２， １２２（１）， ｐｐ．１３２－１４１）。ヘパリン、ヘパラン硫酸模倣体の現在の臨床適用に勝る臨床的使用のために用いられうる、活性ＨＳ模倣体である化合物を同定することも可能である。
ＳＣＡ－７４４の１つの潜在的な機構は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）を模倣し、そしてＨＳ相互作用分子に結合することを通じる。ヘパラン硫酸模倣体には、ヘパラン硫酸の少なくとも１つの生物学的機能を実行しうる任意の分子が含まれる。以前のデータは、細胞生存度およびホメオスタシスを維持するために、ヘパラン硫酸模倣体には非常に特異的な構造要件があることを示している（Ｚｉｏｌｋｏｗｓｋｉら； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２０１２， １２２（１）， ｐｐ．１３２－１４１）。ヘパリン、ヘパラン硫酸模倣体の現在の臨床適用に勝る臨床的使用のために用いられうる、活性ＨＳ模倣体である化合物を同定することも可能である。
【0056】
ヘパラン硫酸は、タンパク質に共有結合し、そして大部分の細胞表面上で、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を形成するグリコサミノグリカンである。ヘパラン硫酸は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の重要な構成要素であり、ＥＣＭでは、ＨＳが増殖因子、サイトカインおよびケモカイン、酵素および酵素阻害剤を含む多様な分子に結合し、そしてそれらの活性を促進または阻害可能である。ＨＳはまた、受容体複合体の形成を補助することも見出されてきている。ヘパラン硫酸結合タンパク質（ＨＳＢＰ）は、通常の生理学的条件下で、細胞外プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖と相互作用するタンパク質である。ＨＳＢＰには、血漿タンパク質、細胞外マトリックス構成要素、細胞表面タンパク質、ならびにＷｎｔ、ヘッジホッグ、オステオポンチン、線維芽細胞増殖因子および血管内皮増殖因子ファミリーを含む、主要な増殖因子およびシグナル伝達タンパク質ファミリーのメンバーが含まれる（ＢｉｌｌｉｎｇｓおよびＰａｃｉｆｉｃｉ， Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ２０１５， ５６（４）， ｐｐ．２７２－２８０）。
【0057】
ＥＣＭは、感覚および機械的特性を持つ、コラーゲン、プロテオグリカン／グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンおよびいくつかの他の糖タンパク質で構成される、巨大分子およびポリマーの多次元ネットワークである。ＥＣＭ構成要素は互いに結合し、微小環境を生成するとともに、細胞接着受容体に結合して、細胞および巨大分子の多次元系にあるすべての組織および臓器において、細胞がその中に存在する複雑なネットワークを形成する。この環境は、細胞のふるまいおよび組織ホメオスタシスの基礎であり、そして細胞の構造、ならびに生存、増殖、活性化、遊走および分化などの機能を維持し、そして調節する際に非常に重要な役割を果たす。ＥＣＭは、異なるタイプの細胞表面受容体または共受容体に直接結合し、こうして細胞係留を仲介し、そして細胞内シグナル伝達およびメカノトランスダクションに関与するいくつかの経路もまた、調節することも可能である。プロテオグリカンは、ＥＣＭにおいて必須の構造的および機能的生体巨大分子である。ＥＣＭ組成および構造の調節不全は、いくつかの病的状態、ＥＣＭにおけるＨＳおよびＨＳＰＧの役割と関連するいくつかの機構の発展および進行と関連する（Ｔｈｅｏｃｈａｒｉｓら Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１６， ９７：４－２７）。
【0058】
炎症におけるＨＳ
ＨＳは、炎症においてよく研究された役割を有する（ＣｏｌｌｉｎｓおよびＴｒｏｅｂｅｒｇ； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１８， １０５（１）， ｐｐ．８１－９２）。一方で、ＨＳは、多様なケモカインに結合し、それによって、これらを細胞表面上で濃縮して、そして炎症部位に向かって白血球を誘引する勾配を形成する。他方で、ＥＣＭ ＨＳへのサイトカインの結合は、その作用部位の近くでサイトカインを濃縮し、これらをタンパク質分解的分解から保護し、そして特定のサイトカインのためのリザーバーを形成する機構であると示唆されてきている。ケモカインおよびサイトカインとの相互作用を通じた炎症におけるＨＳの役割に加えて、ＨＳの可溶性断片は、生得的パターン認識受容体、ＴＬＲ４を通じて、直接シグナル伝達することが示された。炎症および疾患におけるＥＣＭ ＨＳの役割に関して提唱されるさらなる機構は、ヘパラナーゼの活性を通じるものである。ヘパラナーゼは、ＨＳを切断し、ＥＣＭの分解および例えば特定のサイトカインを含むＨＳ結合生体分子の放出を促進するｂ－Ｄ－エンドグルクロニダーゼである。
ＨＳは、炎症においてよく研究された役割を有する（ＣｏｌｌｉｎｓおよびＴｒｏｅｂｅｒｇ； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１８， １０５（１）， ｐｐ．８１－９２）。一方で、ＨＳは、多様なケモカインに結合し、それによって、これらを細胞表面上で濃縮して、そして炎症部位に向かって白血球を誘引する勾配を形成する。他方で、ＥＣＭ ＨＳへのサイトカインの結合は、その作用部位の近くでサイトカインを濃縮し、これらをタンパク質分解的分解から保護し、そして特定のサイトカインのためのリザーバーを形成する機構であると示唆されてきている。ケモカインおよびサイトカインとの相互作用を通じた炎症におけるＨＳの役割に加えて、ＨＳの可溶性断片は、生得的パターン認識受容体、ＴＬＲ４を通じて、直接シグナル伝達することが示された。炎症および疾患におけるＥＣＭ ＨＳの役割に関して提唱されるさらなる機構は、ヘパラナーゼの活性を通じるものである。ヘパラナーゼは、ＨＳを切断し、ＥＣＭの分解および例えば特定のサイトカインを含むＨＳ結合生体分子の放出を促進するｂ－Ｄ－エンドグルクロニダーゼである。
【0059】
ＨＳはまた、ＨＳＢＰ、オステオポンチン（ＯＰＮ）との相互作用を通じて炎症に関与する。ＯＰＮは、分泌型でシアル酸リッチなケモカイン様タンパク質であり、そしてＳＩＢＬＩＮＧ（小分子インテグリン結合リガンドＮ－連結糖タンパク質）ファミリーのメンバーである。本発明者らのグループが行った以前の研究によって、溶液ＮＭＲにより、ＯＰＮへのＨＳの結合部位が示された。この研究により、ヘパリン結合部位は、ＲＧＤモチーフを含むＯＰＮの中央インテグリン結合ドメインにマッピングされることが示された。オステオポンチンはいくつかの機能を仲介することが示され；インテグリンとの相互作用およびＴｈ１サイトカインとしての作用を通じて、慢性炎症に関与する。さらに、ＯＰＮはまた、バイオミネラル化の制御因子でもある。
【0060】
その結果、ＨＳは、ＨＳ／ＨＳＰＧおよびその結合タンパク質の間の相互作用を改変することによって、炎症プロセスを制御する大きな潜在能力を有する。
標準的アッセイによって決定されるように、ＬＰＳ刺激後のヒトＴＨＰ１マクロファージにおいて、化合物が、ＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαの１つの産生を減少させることが可能であれば、化合物の特異的抗炎症効果または活性が立証される：ＴＨＰ－１ヒト単球細胞株を、１００ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で４８時間処理して、成熟マクロファージ様状態を誘導する。次いで、細胞を、５００μＭの化合物の非存在下および存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激する。６時間後、処理細胞および未処理細胞の上清を収集し、そしてヒト炎症パネルＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘヒト炎症促進性ケモカインパネル（カタログ番号７４０１１８）を用いて、サイトカインレベルを決定する。化合物が、ＬＰＳ刺激後のヒトＴＨＰ１マクロファージにおいて、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、およびＴＮＦαの産生を減少させるかまたは遮断することが可能であれば、陽性結果と見なす。
標準的アッセイによって決定されるように、ＬＰＳ刺激後のヒトＴＨＰ１マクロファージにおいて、化合物が、ＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαの１つの産生を減少させることが可能であれば、化合物の特異的抗炎症効果または活性が立証される：ＴＨＰ－１ヒト単球細胞株を、１００ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で４８時間処理して、成熟マクロファージ様状態を誘導する。次いで、細胞を、５００μＭの化合物の非存在下および存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激する。６時間後、処理細胞および未処理細胞の上清を収集し、そしてヒト炎症パネルＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘヒト炎症促進性ケモカインパネル（カタログ番号７４０１１８）を用いて、サイトカインレベルを決定する。化合物が、ＬＰＳ刺激後のヒトＴＨＰ１マクロファージにおいて、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、およびＴＮＦαの産生を減少させるかまたは遮断することが可能であれば、陽性結果と見なす。
【0061】
神経変性性疾患におけるＨＳ
タンパク質凝集は、多くの神経変性性疾患を駆動する。凝集するタンパク質は疾患によって多様であるが、これらは、ベータシートリッチなフォールディング、アミロイド原線維形成を含む、構造的類似性を示す。これらの原線維は、自己触媒作用（「シーディング」として知られる）によって、原線維内に単量体タンパク質をさらに取り込み、そして疾患の伝播を誘発する。ＨＳは、限定されるわけではないが、タウオパシー（ｔａｕｐａｔｈｉｅｓ）（アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）およびピック病）（ＮａｉｎｉおよびＳｏｕｓｓｉ－Ｙａｎｉｃｏｓｔａｓ． Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． ２０１８； ６： １６３）、パーキンソン病、レビー小体型認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびプリオン病（Ｍａｉｚａら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１８； ５９２：３８０６－３８１８）を含む、神経変性性疾患の病因形成に多面的な役割を果たすことが立証された。異常なＨＳＰＧ集積は、ダウン症候群関連認知症およびアルツハイマー病のような神経変性性疾患の初期段階にしばしば観察され、そして調べた細胞外アミロイドはすべて、ＨＳを含有することが示された（例えば、アルツハイマー病におけるアミロイド－ベータ（Ａβ）斑および神経原線維タングル（ＮＦＴ）の両方）（Ｓｎｏｗら Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． １９８７； ５６：１２０－３．）。相互作用は、アミロイドタンパク質中の陽性荷電アミノ酸と、ＨＳ中の陰性荷電基を通じて起こり、原線維形成および凝集物の安定化を導くようである。
タンパク質凝集は、多くの神経変性性疾患を駆動する。凝集するタンパク質は疾患によって多様であるが、これらは、ベータシートリッチなフォールディング、アミロイド原線維形成を含む、構造的類似性を示す。これらの原線維は、自己触媒作用（「シーディング」として知られる）によって、原線維内に単量体タンパク質をさらに取り込み、そして疾患の伝播を誘発する。ＨＳは、限定されるわけではないが、タウオパシー（ｔａｕｐａｔｈｉｅｓ）（アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）およびピック病）（ＮａｉｎｉおよびＳｏｕｓｓｉ－Ｙａｎｉｃｏｓｔａｓ． Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． ２０１８； ６： １６３）、パーキンソン病、レビー小体型認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびプリオン病（Ｍａｉｚａら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１８； ５９２：３８０６－３８１８）を含む、神経変性性疾患の病因形成に多面的な役割を果たすことが立証された。異常なＨＳＰＧ集積は、ダウン症候群関連認知症およびアルツハイマー病のような神経変性性疾患の初期段階にしばしば観察され、そして調べた細胞外アミロイドはすべて、ＨＳを含有することが示された（例えば、アルツハイマー病におけるアミロイド－ベータ（Ａβ）斑および神経原線維タングル（ＮＦＴ）の両方）（Ｓｎｏｗら Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． １９８７； ５６：１２０－３．）。相互作用は、アミロイドタンパク質中の陽性荷電アミノ酸と、ＨＳ中の陰性荷電基を通じて起こり、原線維形成および凝集物の安定化を導くようである。
【0062】
タウオパシーにおいて、ヘパリンはまた、異なるプロテインキナーゼによるタウのリン酸化を増進して、タウ過剰リン酸化を導くことも示された（おそらく、それまではマスキングされていたタウのリン酸化部位を曝露するコンホメーション変化が誘導されることを通じて）。重要なことに、細胞表面ＨＳはまた、アミロイドβ（Ａβ）およびタウ凝集物の受容体としても作用し、そして細胞内部移行を増加させる。要約すると、ＨＳは、タウオパシーの開始および伝播において潜在的な役割を果たし、そしてまた、認知症感受性領域において、再生潜在能力を制限する際に役割を果たしている可能性もあり、したがって、ＨＳおよびＨＳＰＧをＨＳ類似体によってターゲティングして、そしてタウオパシーにおけるその機能をブロッキングすることで、疾患を防止し、そして治療するか、または逆転させる可能性がある。
【0063】
パーキンソン病病因形成において、α－シヌクレイン（アミロイド原線維型）の内部移行はＨＳＰＧに依存し、そしてＨＳは、オリゴデンドロサイト細胞におけるシーディングプロセスに重要な役割を有することが示された（Ｉｈｓｅら Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ； ２０１７， ７： ９００８； ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１５９８－０１７－０８７２０－５）。したがって、ＨＳ類似体によって、ＨＳＰＧとα－シヌクレインの相互作用に干渉すると、疾患において、潜在的に有益な活性を有する。
【0064】
ＡＬＳの発展に関与する正確な機構は完全には解明されていないが、ＨＳＰＧは、分泌性Ｉ型ＮＲＧ１を特定の領域に濃縮することに関与する（ＮＲＧ１上の特異的ＨＳ結合部位により）ことが示され、そして異常なシグナル伝達に寄与する可能性もある（Ｓｏｎｇら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１２； ７１：１０４－１１５）。
【0065】
脂質代謝におけるＨＳ
ＨＳおよびＨＳＰＧの相互作用は、ターゲット細胞および組織に対するヘッジホッグ（Ｈｈ）タンパク質の分布および作用を制御することが示されてきている。Ｈｈシグナル伝達は、発生、増殖および幹細胞維持に必須である。Ｈｈタンパク質は、発生中組織および成体組織の細胞の間の長期間コミュニケーションを可能にする、分泌型リガンドである。脂質代謝は、ヘッジホッグシグナル伝達およびリガンド自体の特性の両方に顕著な影響を有し、Ｈｈシグナル伝達の強度および細胞機能の変化を導く。脂質代謝およびＨｈシグナル伝達の間の関連は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）およびＩＮＳＩＧ１発現に関する（Ａｌｉら Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２０１６ Ｊａｎ； ６８（１）： １２７－１３７）。Ｈｈシグナル伝達に関連付けられているＨＳＰＧは、通常、シンデカン－３またはグリピカンのいずれかで構成されるタンパク質コアを有する。これらの巨大分子は、通常、膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーによって、細胞表面の膜に付着する。Ｈｈは、Ｎ末端に見られる非常に保存されたＣａｒｄｉｎ－Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ配列を通じて、ＨＳＰＧと相互作用して、ＨＳＰＧの陰性荷電硫酸塩およびＨｈの間の静電相互作用を生成する。ＨＳＰＧは、Ｈｈとの相互作用を仲介する他の細胞外マトリックス因子、例えばＳｈｆ、ならびに巨大穿刺構造中に保持される脂質修飾Ｈｈともまた相互作用することが見出されてきている（Ｆａｒｚａｎら Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００８， ２９４（４）， ｐｐ．Ｇ８４４－Ｇ８４９）。Ｈｈシグナル伝達の制御を通じて、ＨＳはまた、脂質代謝改変においても役割を演じうる。したがって、ＨＳは、コレステロール代謝に関与するＨｈ制御タンパク質の改変を通じて、脂質血液レベルを減少させる潜在能力を有する。
ＨＳおよびＨＳＰＧの相互作用は、ターゲット細胞および組織に対するヘッジホッグ（Ｈｈ）タンパク質の分布および作用を制御することが示されてきている。Ｈｈシグナル伝達は、発生、増殖および幹細胞維持に必須である。Ｈｈタンパク質は、発生中組織および成体組織の細胞の間の長期間コミュニケーションを可能にする、分泌型リガンドである。脂質代謝は、ヘッジホッグシグナル伝達およびリガンド自体の特性の両方に顕著な影響を有し、Ｈｈシグナル伝達の強度および細胞機能の変化を導く。脂質代謝およびＨｈシグナル伝達の間の関連は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）およびＩＮＳＩＧ１発現に関する（Ａｌｉら Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２０１６ Ｊａｎ； ６８（１）： １２７－１３７）。Ｈｈシグナル伝達に関連付けられているＨＳＰＧは、通常、シンデカン－３またはグリピカンのいずれかで構成されるタンパク質コアを有する。これらの巨大分子は、通常、膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーによって、細胞表面の膜に付着する。Ｈｈは、Ｎ末端に見られる非常に保存されたＣａｒｄｉｎ－Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ配列を通じて、ＨＳＰＧと相互作用して、ＨＳＰＧの陰性荷電硫酸塩およびＨｈの間の静電相互作用を生成する。ＨＳＰＧは、Ｈｈとの相互作用を仲介する他の細胞外マトリックス因子、例えばＳｈｆ、ならびに巨大穿刺構造中に保持される脂質修飾Ｈｈともまた相互作用することが見出されてきている（Ｆａｒｚａｎら Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００８， ２９４（４）， ｐｐ．Ｇ８４４－Ｇ８４９）。Ｈｈシグナル伝達の制御を通じて、ＨＳはまた、脂質代謝改変においても役割を演じうる。したがって、ＨＳは、コレステロール代謝に関与するＨｈ制御タンパク質の改変を通じて、脂質血液レベルを減少させる潜在能力を有する。
【0066】
さらに、ＨＳは、リポタンパク質リパーゼとの相互作用、そして線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－２）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）などの増殖因子との相互作用を通じて、アテローム性動脈硬化症の発展において、複数の役割に関連付けられてきている。
【0067】
標準的アッセイによって決定されるように、化合物が、哺乳動物細胞において、ＬＤＬＲタンパク質の発現を増加させることが可能であれば、該化合物の特異的脂質代謝調節効果または活性が立証される。
【0068】
試験化合物５０、１００および５００［μＭ］での処理後、化合物が、哺乳動物細胞抽出物において、ＬＤＬＲタンパク質の発現を増加させることが可能であれば、該化合物の特異的脂質代謝調節効果または活性が立証される。ＬＤＬＲの発現レベルは：共焦点レーザー走査型顕微鏡およびウェスタンブロット分析によって決定される。対のＬＤＬ－Ｒ抗体（Ｃ７：ｓｃ－１８８２３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＡｌｅｘａＦｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８（Ａ３２７３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の蛍光シグナルによって、全細胞画像および蛍光強度を概算した。化合物が、哺乳動物細胞抽出物におけるＬＤＬＲ発現、および共焦点顕微鏡画像化によるＬＤＲＲシグナル増加を誘導可能であれば、陽性結果と見なされる。
【0069】
加齢におけるＨＳ
ＨＳＢＰとの相互作用を改変する、加齢に関連するＨＳ構造変化があることが示されてきている（Ｆｅｙｚｉら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８， ２７３（２２）， ｐｐ．１３３９５－１３３９８）。これらの変化は、加齢の複雑な病因形成に関与する可能性もある。
ＨＳＢＰとの相互作用を改変する、加齢に関連するＨＳ構造変化があることが示されてきている（Ｆｅｙｚｉら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８， ２７３（２２）， ｐｐ．１３３９５－１３３９８）。これらの変化は、加齢の複雑な病因形成に関与する可能性もある。
【0070】
抗酸化および加齢関連機構
酸化ストレス反応に関与する３つの主な酵素がある；１．酸化ストレスおよびアポトーシスに関連付けられるＣＨＡＣ１（遺伝子ＩＤ：７９０９４；グルタチオン特異的γ－グルタミルシクロトランスフェラーゼ１）、２．解毒経路に関与するＮＱＯ１（遺伝子ＩＤ：１７２８；ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ［キノン］１）、ならびに３．グルタチオン（ＧＳＨ）系とは独立に、細胞外ＣｙＳＳ（システイン酸化の結果）の還元型を産生するＳＬＣ７Ａ１１（遺伝子ＩＤ：２３６５７；システイン／グルタミン酸輸送体；ｘＣＴ、ＣＣＢＲ１）。
酸化ストレス反応に関与する３つの主な酵素がある；１．酸化ストレスおよびアポトーシスに関連付けられるＣＨＡＣ１（遺伝子ＩＤ：７９０９４；グルタチオン特異的γ－グルタミルシクロトランスフェラーゼ１）、２．解毒経路に関与するＮＱＯ１（遺伝子ＩＤ：１７２８；ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ［キノン］１）、ならびに３．グルタチオン（ＧＳＨ）系とは独立に、細胞外ＣｙＳＳ（システイン酸化の結果）の還元型を産生するＳＬＣ７Ａ１１（遺伝子ＩＤ：２３６５７；システイン／グルタミン酸輸送体；ｘＣＴ、ＣＣＢＲ１）。
【0071】
ＮＱＯ１は、酸化ストレスおよび毒性キノンに対して細胞を保護する。ＮＱＯ１は、哺乳動物系における２つの主要なキノンレダクターゼの１つである。ＮＱＯ１は非常に誘導性が高く、そしてストレスに対する細胞適応に多数の役割を果たす。ＮＱＯ１は、細胞質ゾル、ゴルジ複合体、核、ミトコンドリア、細胞膜および小胞体に見られる。ミトコンドリアがアポトーシス制御の中心であることは周知である。ミトコンドリア膜電位の喪失は、細胞には破局的であり、そしてまた、細胞質ゾル内へのチトクロームＣの放出も導く（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＆ Ｃｈａｎｄｅｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５， １１（１）， ｐｐ．９－１５）。
【0072】
ＮＲＦ２は、ＮＱＯ１の強力な誘導を仲介しうる。ＮＲＦ２は、塩基性領域－ロイシンジッパー（ｂＺｉｐ）転写因子であり、核において、抗酸化反応要素（ＡＲＥ）と称されるエンハンサー配列を認識する、ヘテロ二量体を形成する。いくつかの研究によって、ＮＲＦ２が、ＡＲＥを通じた抗炎症プロセス、およびＮＦ－κβ経路とのクロストークに寄与することが立証されてきている（Ａｈｍｅｄら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１７， １８６３（２）， ｐｐ．５８５－５９７）。ＮＲＦ２活性化は、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を増加し、ＮＦ－κβシグナル伝達経路を阻害し、そして炎症促進性サイトカインを抑制することによって、ＨＯ－１遺伝子を誘導する。さらに、炎症は、レドックスシグナル伝達を損ない、酸化ストレスを増加させうる、反応性酸素種（ＲＯＳ）の病的レベルの局所および全身性集積の増加と関連する。この状況は、炎症細胞において、ＲＯＳ産生上昇の主な寄与因子に相当するＮＡＤＰＨオキシダーゼの、ミトコンドリアが生じる制御不能活性化に影響を及ぼす。ミトコンドリアＲＯＳは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の損傷および放出を引き起こし、したがって、さらなるＲＯＳ産生およびインフラマソームの活性化を導く事象の悪循環を生じ、最終的に臓器衰弱を生じる（Ｋｏｖａｃら Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ． ＢＢＡ ２０１５， １８５０（４）， ｐｐ．７９４－８０１）。ＮＲＦ２は、中間代謝に影響を及ぼし、基質の利用可能性を増加させ、ミトコンドリア呼吸鎖に関する同等物を減少させるとともに、ｍｔＤＮＡの完全性を維持する（Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ， Ｋ． Ｍ．， Ｂａｉｒｄ， Ｌ．， Ｚｈａｎｇ， Ｙ．， Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ， Ｉ．， Ｃｈａｌａｓａｎｉ， Ａ．， Ｌａｎｄ， Ｊ． Ｍ．ら（２０１３）．． Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ， ２（８）， ７６１－７７０．）。ＮＲＦ２およびＮＱＯ１発現を増進させる薬剤および薬剤候補は、抗酸化効果を発揮し、そして酸化ストレスから細胞を保護する。
【0073】
ＣＨＡＣ１：グルタチオン特異的ガンマ－グルタミルシクロトランスフェラーゼ１は、グルタチオンレベルおよび酸化バランス制御において、非フォールディングタンパク質応答で役割を果たし、そして神経分化を促進する。
【0074】
細胞外ＣｙＳＳ（システインの酸化型）の還元を導くシステイン／グルタミン酸輸送体は、グルタチオン（ＧＳＨ）系とは独立である。下方制御は、フェロトーシスおよび加齢を促進する（Ｚｈａｎｇら Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１８， ｐｐ．１－１９）。
【0075】
さらに、ＳＥＬＡＤＩＮ１（選択的アルツハイマー病指標１）としてもまた知られるＤＨＣＲ２４（遺伝子ＩＤ：１７１８、３ベータ－ヒドロキシステロール－デルタ２４レダクターゼ）は、酸化ストレスおよびアミロイド－ベータによって誘導されるアポトーシス中、カスパーゼ３活性を減少させることによって、酸化ストレスから細胞を保護する。ＤＨＣＲ２４はまた、コレステロール合成の最後の工程を触媒し、そしてしたがって、脂質代謝にも関与する。
【0076】
ＬＤＬＲ（遺伝子ＩＤ：３９４９）、ＩＮＳＩＧ１（遺伝子ＩＤ：３６３８）およびＤＨＣＲ２４／Ｓｅｌａｄｉｎ－１（遺伝子ＩＤ：１７１８）の遺伝子は、本明細書記載の化合物、特にＳＣＡ－７４４によって調節されることが見出された。
【0077】
標準アッセイ：半定量的ウェスタンブロット分析によって決定されるように、化合物が、哺乳動物細胞において、ビヒクル処理細胞よりもより高いレベルに、好ましくは、化合物を５００μＭで用いた際に～３倍、ＮＱＯ１発現を誘導するならば、該化合物の特異的抗酸化効果または活性が立証される。ＨｅＬａ細胞をビヒクル、５０、１００および５００μＭの化合物で、４８時間処理し、そしてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００抽出緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ ７．４］、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３ｍＭ ＤＴＴおよび完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）中で溶解する。２５μｇの全細胞抽出物を、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にトランスファーした後、標準的イムノブロッティング法の使用によって、タンパク質を検出する。膜を、ＮＱＯ１一次抗体（Ａ－５：ｓｃ－２７１１１６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２００希釈とインキュベーションした後、１：３０００のヤギ抗マウス（ＩｇＧ－ＨＲＰ：ｓｃ－２００５）とインキュベーションする。装填対照には、ＧＡＰＤＨ抗体（０４１１：ｓｃ－４７７２４）を用いる。ＧＡＰＤＨに対して、ＮＱＯ１タンパク質シグナル強度を概算して、用いる化合物が５００μＭである場合、ビヒクル処理細胞に関するシグナルよりも、ＮＱＯ１の少なくとも３倍の増加が示される。タンパク質レベルの分析および定量化には、ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、米国：ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）のゲル分析装置を用いる。
【0078】
抗加齢プロセス
慢性炎症、酸化ストレスおよび好ましくない脂質代謝変化は、加齢の重要な要素である。上述の機構はすべて、こうしたプロセスに寄与し、そしてこれらのプロセスの組み合わせを改変する薬剤および薬剤候補は、抗加齢薬剤としての潜在能力を有しうる。
慢性炎症、酸化ストレスおよび好ましくない脂質代謝変化は、加齢の重要な要素である。上述の機構はすべて、こうしたプロセスに寄与し、そしてこれらのプロセスの組み合わせを改変する薬剤および薬剤候補は、抗加齢薬剤としての潜在能力を有しうる。
【0079】
ＮＲＦ２（遺伝子ＩＤ：４７８０）は、最もよく特徴づけられた抗加齢遺伝子の１つであり、炎症および酸化ストレス、ならびに加齢の間の関係を示す一例である。ＮＲＦ２は、外部からの、あるいは代謝または炎症中に産生されるかいずれかの反応性酸素種レベルの増加に反応して、求電子反応要素の発現を制御する転写因子であり、また抗酸化剤である。活性化剤、例えばスルホラファン（食用化合物）およびより強力な合成類似体が臨床開発中である。例えば、ラパマイシンは、試験したすべての生存生物の寿命を増加させる；ラパマイシンはｍＴＯＲを阻害し、そしてＮＲＦ２の転写を増加させることが示されている。活性化は、典型的には、細胞質中で、結合パートナーＫＥＡＰ１を通じて起こる。ＮＲＦ２活性化は、半減期の増加および核への転位置を伴い、核中で、ＮＲＦはターゲット遺伝子のプロモーターに結合する。
【0080】
標準アッセイ：半定量的ウェスタンブロット分析によって決定されるように、化合物が、以下の遺伝子ＮＱＯ１、ＬＤＬＲの発現を同時に、そして炎症促進性ケモカイン；ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦαの阻害を誘導する場合、化合物の特異的抗加齢効果または活性が立証される。タンパク質レベルの分析および定量化のため、ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、米国：ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）のゲル分析装置を用いる。
【0081】
ＮＱＯ１およびＬＤＬＲの検出のため、ＨｅＬａ細胞をビヒクル、５０、１００および５００μＭの化合物で、４８時間処理し、そしてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００抽出緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ ７．４］、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３ｍＭ ＤＴＴおよび完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）中で溶解する。２５μｇの全細胞抽出物を、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にトランスファーした後、標準的イムノブロッティング法の使用によって、タンパク質を検出する。膜を、ＮＱＯ１（Ａ－５：ｓｃ－２７１１１６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＬＤＬＲ（Ｃ７：ｓｃ－１８８２３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）一次抗体の１：２００希釈とインキュベーションした後、１：３０００のヤギ抗マウス（ＩｇＧ－ＨＲＰ：ｓｃ－２００５）とインキュベーションする。装填対照には、ＧＡＰＤＨ抗体（０４１１：ｓｃ－４７７２４）を用いる。ＧＡＰＤＨに対して、ＮＱＯ１タンパク質シグナル強度を概算して、対照よりも少なくとも３倍多い増加が示されるはずである。同時に、化合物は、ヒトＴＨＰ１マクロファージにおいて、ＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαの産生を減少させることによって、抗炎症活性を有するはずである。ＴＨＰ－１ヒト単球細胞株を、１００ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で４８時間処理して、成熟マクロファージ様状態を誘導する。次いで、細胞を、５００μＭのＳＣＡ－７４４の非存在下および存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激する。６時間後、処理細胞および未処理細胞の上清を収集し、そしてヒト炎症パネルＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘヒト炎症促進性ケモカインパネル（カタログ番号７４０１１８）を用いて、サイトカインレベルを決定する。
【0082】
医学的使用
本発明は、コルチコステロイド、ヘパラン硫酸、またはヘパリン硫酸のいずれか１つまたはそれより多くの特異的模倣体によって治療可能な一連の徴候を持つヒトまたは非ヒト動物被験体の処置（例えば予防または療法のための治療）を意図する。特に、コルチコステロイド、ヘパリン硫酸、またはヘパリン硫酸のいずれか１つまたはそれより多くの模倣体として作用する化合物を選択する。
本発明は、コルチコステロイド、ヘパラン硫酸、またはヘパリン硫酸のいずれか１つまたはそれより多くの特異的模倣体によって治療可能な一連の徴候を持つヒトまたは非ヒト動物被験体の処置（例えば予防または療法のための治療）を意図する。特に、コルチコステロイド、ヘパリン硫酸、またはヘパリン硫酸のいずれか１つまたはそれより多くの模倣体として作用する化合物を選択する。
【0083】
用語「治療」は、本明細書において、被験体の治療に関して、個々にまたはともに、「疾患状態」として理解される、疾患、病的状態、または障害を治癒させるか、寛解させるか、安定化させるか、その発生を減少させるか、または防止することが意図される被験体の医学的管理を指す。該用語には、疾患状態の改善に向けて特異的に指示される能動的治療、疾患状態の防止に向けて特異的に指示される予防が含まれ、そしてまた、関連疾患状態の原因の除去に向けて指示される原因治療が含まれる。さらに、該用語には、疾患状態の治癒よりも症状の軽減のために設計された対症的治療、そして関連疾患状態の発展を最小限にするかあるいは部分的にまたは完全に阻害するよう指示される疾患状態のさらなる治癒、および関連疾患状態の改善に向けて指示される別の特異的療法を補助するために使用される補助治療が含まれる。
【0084】
特に
ａ）好ましくはＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦαからなる群より選択される、１つまたはそれより多くの炎症促進性サイトカイン；あるいはＩＫＺＦ１、ＧＤＦ１０、ＳＰＯＣＫ３、ＭＭＰ１、ＩＬ－１β、ＫＣＮＭＡ１、ＣＣＬ７、ＡＱＰ１、ＩＴＩＨ５、ＡＢＩ３ＢＰおよびＢＭＰ５からなる群より選択される１つまたはそれより多くの炎症促進性遺伝子の発現を減少させるか；
ｂ）好ましくはＣＨＡＣ１、ＳＬＣ７Ａ１１、ＮＱＯ１、ＥＧＲ１、ＳＧＫ１、ＳＬＣ６Ａ９およびＤＨＣＲ２４からなる群より選択される、１つまたはそれより多くの抗酸化遺伝子、好ましくはＮＱＯ１の発現を増加させるか；
ｃ）ＬＤＬＲ、ＩＤ３、ＮＱＯ１、ＳＬＣＧＡ２、またはＤＨＣＲ２４のいずれか１つまたはそれより多くの発現を増加させるか；あるいは
ｄ）コレステロール代謝に関与する酵素、好ましくはＬＤＬＲまたはＤＨＣＲ２４の発現を調節する、
化合物を用いる。
ａ）好ましくはＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦαからなる群より選択される、１つまたはそれより多くの炎症促進性サイトカイン；あるいはＩＫＺＦ１、ＧＤＦ１０、ＳＰＯＣＫ３、ＭＭＰ１、ＩＬ－１β、ＫＣＮＭＡ１、ＣＣＬ７、ＡＱＰ１、ＩＴＩＨ５、ＡＢＩ３ＢＰおよびＢＭＰ５からなる群より選択される１つまたはそれより多くの炎症促進性遺伝子の発現を減少させるか；
ｂ）好ましくはＣＨＡＣ１、ＳＬＣ７Ａ１１、ＮＱＯ１、ＥＧＲ１、ＳＧＫ１、ＳＬＣ６Ａ９およびＤＨＣＲ２４からなる群より選択される、１つまたはそれより多くの抗酸化遺伝子、好ましくはＮＱＯ１の発現を増加させるか；
ｃ）ＬＤＬＲ、ＩＤ３、ＮＱＯ１、ＳＬＣＧＡ２、またはＤＨＣＲ２４のいずれか１つまたはそれより多くの発現を増加させるか；あるいは
ｄ）コレステロール代謝に関与する酵素、好ましくはＬＤＬＲまたはＤＨＣＲ２４の発現を調節する、
化合物を用いる。
【0085】
特に、本明細書記載の治療は、
ａ）好ましくはＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦαからなる群より選択される、１つまたはそれより多くの炎症促進性サイトカイン；あるいはＩＫＺＦ１、ＧＤＦ１０、ＳＰＯＣＫ３、ＭＭＰ１、ＩＬ－１β、ＫＣＮＭＡ１、ＣＣＬ７、ＡＱＰ１、ＩＴＩＨ５、ＡＢＩ３ＢＰおよびＢＭＰ５からなる群より選択される１つまたはそれより多くの炎症促進性遺伝子の発現を減少させるか；
ｂ）好ましくはＣＨＡＣ１、ＳＬＣ７Ａ１１、ＮＱＯ１、ＥＧＲ１、ＳＧＫ１、ＳＬＣ６Ａ９およびＤＨＣＲ２４からなる群より選択される、１つまたはそれより多くの抗酸化遺伝子、好ましくはＮＱＯ１の発現を増加させるか；
ｃ）脂質代謝に関与する遺伝子のいずれか１つまたはそれより多く、好ましくはＬＤＬＲ、ＩＤ３、ＮＱＯ１、ＳＬＣＧＡ２、またはＤＨＣＲ２４のいずれか１つまたはそれより多くの発現を増加させるか；あるいは
ｄ）コレステロール代謝に関与する酵素、好ましくはＬＤＬＲまたはＤＨＣＲ２４の発現を調節する
ために十分な、有効量の化合物またはその薬学的に許容されうる塩を被験体に投与する工程を含む。
ａ）好ましくはＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦαからなる群より選択される、１つまたはそれより多くの炎症促進性サイトカイン；あるいはＩＫＺＦ１、ＧＤＦ１０、ＳＰＯＣＫ３、ＭＭＰ１、ＩＬ－１β、ＫＣＮＭＡ１、ＣＣＬ７、ＡＱＰ１、ＩＴＩＨ５、ＡＢＩ３ＢＰおよびＢＭＰ５からなる群より選択される１つまたはそれより多くの炎症促進性遺伝子の発現を減少させるか；
ｂ）好ましくはＣＨＡＣ１、ＳＬＣ７Ａ１１、ＮＱＯ１、ＥＧＲ１、ＳＧＫ１、ＳＬＣ６Ａ９およびＤＨＣＲ２４からなる群より選択される、１つまたはそれより多くの抗酸化遺伝子、好ましくはＮＱＯ１の発現を増加させるか；
ｃ）脂質代謝に関与する遺伝子のいずれか１つまたはそれより多く、好ましくはＬＤＬＲ、ＩＤ３、ＮＱＯ１、ＳＬＣＧＡ２、またはＤＨＣＲ２４のいずれか１つまたはそれより多くの発現を増加させるか；あるいは
ｄ）コレステロール代謝に関与する酵素、好ましくはＬＤＬＲまたはＤＨＣＲ２４の発現を調節する
ために十分な、有効量の化合物またはその薬学的に許容されうる塩を被験体に投与する工程を含む。
【0086】
特に、本発明は、化合物が抗炎症、抗酸化、抗加齢、または脂質代謝調節特性を有する、疾患および医学的状態を治療するための化合物の使用を提供する。こうした化合物（またはその薬学的に許容されうる塩）またはそれぞれの調製物の使用によって、被験体、例えば炎症性疾患または障害、酸化ストレスまたは酸素ラジカル生成の産生増加と関連する疾患または障害、加齢性疾患または障害、あるいは脂質代謝疾患または障害を有すると診断されたか、あるいはそのリスクがある患者を治療することが可能になる。
【0087】
特に、炎症性疾患は急性または慢性炎症性疾患である。
特定の側面にしたがって、炎症性疾患は肺炎、特に毒物吸入または感染性病原体によって引き起こされる肺炎、例えばウイルス性肺炎、細菌性肺炎、寄生虫性肺炎である。特に、炎症性疾患は、肺炎、例えば急性肺炎、特に血管周囲浮腫、または肺炎における免疫細胞浸潤を治療するためのものである。
特定の側面にしたがって、炎症性疾患は肺炎、特に毒物吸入または感染性病原体によって引き起こされる肺炎、例えばウイルス性肺炎、細菌性肺炎、寄生虫性肺炎である。特に、炎症性疾患は、肺炎、例えば急性肺炎、特に血管周囲浮腫、または肺炎における免疫細胞浸潤を治療するためのものである。
【0088】
特定の側面にしたがって、炎症性疾患は、急性呼吸促迫症候群、例えばウイルスによって引き起こされるもの、または慢性閉塞性肺障害である。
特定の側面にしたがって、炎症性疾患は、自己免疫疾患またはアレルギーを生じる疾患状態、炎症または炎症性症状、例えば関節炎症、炎症性腸疾患、あるいは関節リウマチ、変形性関節症、喘息、または乾癬と関連する任意の炎症性疾患状態である。
特定の側面にしたがって、炎症性疾患は、自己免疫疾患またはアレルギーを生じる疾患状態、炎症または炎症性症状、例えば関節炎症、炎症性腸疾患、あるいは関節リウマチ、変形性関節症、喘息、または乾癬と関連する任意の炎症性疾患状態である。
【0089】
特に、炎症性疾患は、関節炎症または炎症性腸疾患である。
特に、炎症は、敗血症関連ではなく、そして特に敗血症、細菌性敗血症、ＬＰＳ誘導性ショック、敗血症ショックまたは多臓器不全ではない。
特に、炎症は、敗血症関連ではなく、そして特に敗血症、細菌性敗血症、ＬＰＳ誘導性ショック、敗血症ショックまたは多臓器不全ではない。
【0090】
例示的な疾患および状態には、以下が含まれる
ａ）炎症性疾患が、急性または慢性炎症性疾患、自己免疫疾患またはアレルギーで起こる炎症性疾患状態のいずれか；肺炎、毒物吸入または感染性病原体によって引き起こされる肺炎、例えばウイルス性肺炎、細菌性肺炎、寄生虫性肺炎；急性呼吸促迫症候群、関節炎症、炎症性腸疾患、あるいは関節リウマチ、変形性関節症、喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺障害または乾癬と関連する任意の炎症性疾患状態であるもの；
ｂ）抗酸化ストレス疾患が虚血再灌流傷害であるもの；または
ｃ）加齢性疾患が早老症候群であるもの；および
ｄ）脂質代謝疾患が高脂血症またはアテローム性動脈硬化症であるもの。
ａ）炎症性疾患が、急性または慢性炎症性疾患、自己免疫疾患またはアレルギーで起こる炎症性疾患状態のいずれか；肺炎、毒物吸入または感染性病原体によって引き起こされる肺炎、例えばウイルス性肺炎、細菌性肺炎、寄生虫性肺炎；急性呼吸促迫症候群、関節炎症、炎症性腸疾患、あるいは関節リウマチ、変形性関節症、喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺障害または乾癬と関連する任意の炎症性疾患状態であるもの；
ｂ）抗酸化ストレス疾患が虚血再灌流傷害であるもの；または
ｃ）加齢性疾患が早老症候群であるもの；および
ｄ）脂質代謝疾患が高脂血症またはアテローム性動脈硬化症であるもの。
【0091】
別の炎症性疾患には、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、血管炎、（多発性）皮膚筋炎、グレーブス病、多発性硬化症、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、免疫血小板減少症、前部ブドウ膜炎、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、および湿疹が含まれる。
【0092】
別の抗酸化ストレス疾患には、心臓発作、脳卒中、肝臓／腸虚血およびアテローム性動脈硬化症が含まれる。
別の加齢性疾患には、ハッチンソン－ギルフォード症候群およびウェルナー症候群が含まれる。
別の加齢性疾患には、ハッチンソン－ギルフォード症候群およびウェルナー症候群が含まれる。
【0093】
別の徴候には、アルポート症候群、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患、ＩｇＡ腎症、１型糖尿病性ＣＫＤ、巣状分節性糸球体硬化症、フリードライヒ運動失調症が含まれる。
用語「被験体」は、本明細書において、任意の動物を指し、本明細書において、診断、スクリーニング、監視または治療が意図される、好ましくは、任意の哺乳動物、そして特にヒトが含まれる、任意の動物を指す。被験体は、特定の疾患状態のリスクがあってもよく、例えば疾患状態に罹患しているか、または疾患状態を決定しようとしているか、または疾患状態のリスクを決定しようとしている患者である。用語「患者」には、本明細書において、健康な被験体も常に含まれる。
用語「被験体」は、本明細書において、任意の動物を指し、本明細書において、診断、スクリーニング、監視または治療が意図される、好ましくは、任意の哺乳動物、そして特にヒトが含まれる、任意の動物を指す。被験体は、特定の疾患状態のリスクがあってもよく、例えば疾患状態に罹患しているか、または疾患状態を決定しようとしているか、または疾患状態のリスクを決定しようとしている患者である。用語「患者」には、本明細書において、健康な被験体も常に含まれる。
【0094】
用語、特定の疾患状態の「リスクがある」は、こうした疾患状態を、例えば特定の素因によって発展させる可能性があるか、または先天性または後天性状態を含む多様な段階で、こうした疾患状態にすでに罹患している被験体を指し、これらの疾患状態には、特に他の原因疾患状態と関連する一過性疾患、あるいはこうした免疫グロブリン不全の結果として続く他の状態または合併症が含まれる。リスク決定は、特に、疾患がまだ診断されていない被験体において、重要である。したがって、このリスク決定には、予防的療法を可能にする初期診断が含まれる。単一の、好ましくは多数のリスクパラメータ、例えば遺伝子バックグラウンド、ストレスレベル、特定の薬剤の摂取等によって、リスク評価を行ってもよい。特に、高リスクの患者、例えば疾患を発展させる可能性が高い患者において、本発明の調製物を用いる。
【0095】
特に、本明細書記載の調製物であって、前記調製物が、前記抗炎症、抗酸化、抗加齢、または脂質代謝調節活性を示すために有効な量の経口、局所、粘膜または非経口投与を含む、医学的使用のため、およびそれぞれの治療のための前記調製物を提供する。
【0096】
特に、治療措置が、コルチコステロイド、抗ＴＮＦα阻害剤、ＩＬ－１７阻害剤、ＩＬ－２３／ＩＬ－１２阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、フマル酸、ＪＡＫキナーゼ阻害剤、メトトレキセート、レフノミド、ヒドロキシクロロキン（ｈｙｄｒｏｘｃｌｏｒｏｑｕｉｎｉｅ）、スルファサラジン、シクロスポリンまたは解離性ステロイド化合物のいずれかの置換または組み合わせ投与を含む、医学的使用およびそれぞれの治療のための本明細書記載の調製物を提供する。
【0097】
特定の態様にしたがって、調製物は、経口、局所、粘膜または非経口投与のために配合された薬学的組成物である。
用語「配合物」は、本明細書において、特定の方式で、被験体を治療するためのすぐに使える調製物を指す。特に、薬学的組成物は、本明細書にさらに記載される化合物、またはその薬学的に許容されうる塩、および薬学的に許容されうる希釈剤、キャリアーまたは賦形剤を含む。
用語「配合物」は、本明細書において、特定の方式で、被験体を治療するためのすぐに使える調製物を指す。特に、薬学的組成物は、本明細書にさらに記載される化合物、またはその薬学的に許容されうる塩、および薬学的に許容されうる希釈剤、キャリアーまたは賦形剤を含む。
【0098】
特定の側面にしたがって、経口、局所、粘膜または非経口投与のための、薬学的に許容されうるビヒクル中に、本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩、またはそれぞれの調製物を含む、薬学的配合物を提供する。また、本開示には、凍結乾燥され、そして再構成されて、例えば静脈内、筋内、または皮下注射による投与のための薬学的に許容されうる配合物を形成しうる、こうした化合物またはその塩が含まれる。投与はまた、皮内または経皮であってもよい。
【0099】
特定の態様は、固体として、経口投与されるかまたは吸入を通じて投与されるか、あるいは溶液、懸濁物またはエマルジョンとして筋内または静脈内投与してもよい、配合物を指す。あるいは、また、リポソーム懸濁物として、配合物を吸入によるか、静脈内または筋内で投与してもよい。
【0100】
本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩またはそれぞれの調製物を、非経口投与以外の任意の経路によって投与するため、活性剤をその不活性化を防止する材料でコーティングするか、またはこうした材料と活性剤を同時投与することが必要でありうる。例えば、適切なキャリアー、例えばリポソーム、または希釈剤を用いてもよい。
【0101】
薬学的に許容されうる希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液が含まれる。
本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩またはそれぞれの調製物を、例えば不活性希釈剤または同化可能または食用キャリアーと共に、経口投与してもよい。例えば、調製物をハードシェルまたはソフトシェルゼラチンカプセル中に封入するか、錠剤に圧縮するか、あるいは被験体の食餌に直接取り込んでもよい。経口療法投与のため、本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩を、賦形剤とともに取り込んで、そして摂取可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁物、シロップ、ウェーハ等の形で用いてもよい。組成物および調製物中の化合物またはその薬学的に許容されうる塩の割合は、もちろん、多様であってもよい。こうした療法的に有用な組成物中の本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩は、適切な投薬量が得られるようなものである。
本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩またはそれぞれの調製物を、例えば不活性希釈剤または同化可能または食用キャリアーと共に、経口投与してもよい。例えば、調製物をハードシェルまたはソフトシェルゼラチンカプセル中に封入するか、錠剤に圧縮するか、あるいは被験体の食餌に直接取り込んでもよい。経口療法投与のため、本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩を、賦形剤とともに取り込んで、そして摂取可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁物、シロップ、ウェーハ等の形で用いてもよい。組成物および調製物中の化合物またはその薬学的に許容されうる塩の割合は、もちろん、多様であってもよい。こうした療法的に有用な組成物中の本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩は、適切な投薬量が得られるようなものである。
【0102】
用語「粘膜」は、被験体を治療するための調製物またはそれぞれの配合物の投与または適用または他の粘膜使用に関して、全身性または局所投与を含む、粘膜経路を通じた投与を指し、ここで、活性成分は、粘膜表面との接触によって取り込まれる。これには、経口、経口的、鼻、膣、直腸投与ならびに配合物、例えば液体、シロップ、ロゼンジ、錠剤、スプレー、粉末、インスタント粉末、顆粒、カプセル、クリーム、ジェル、ドロップ、懸濁物、エマルジョンまたは食品が含まれる。
【0103】
経口的配合物には、液体溶液、エマルジョン、懸濁物等が含まれてもよい。こうした組成物の調製に適した薬学的に許容されうるビヒクルは、当該技術分野に周知である。シロップ、エリキシル剤、エマルジョンおよび懸濁物のキャリアーの典型的な構成要素には、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、液体スクロース、ソルビトールおよび水が含まれる。懸濁物に関しては、典型的な懸濁剤には、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、トラガカント、およびアルギン酸ナトリウムが含まれ；典型的な湿潤剤には、レシチンおよびポリソルベート８０が含まれ；そして典型的な保存剤には、メチルパラベンおよび安息香酸ナトリウムが含まれる。経口的液体組成物はまた、上に開示する甘味料、フレーバー剤および着色剤などの１つまたはそれより多い構成要素も含有してもよい。
【0104】
また、対象の剤が所望の局所適用の近傍の胃腸管において、または所望の作用を延長するため、多様な時間で放出されるように、慣用法によって、典型的にはｐＨまたは時間依存性コーティングによって薬学的組成物をコーティングしてもよい。こうした投薬型には、典型的には、限定されるわけではないが、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸酢酸ポリビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ワックス、およびシェラックの１つまたはそれより多くが含まれる。
【0105】
本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩またはそれぞれの調製物の全身送達を達成するために有用な他の組成物には、舌下、頬側および鼻投薬型が含まれる。こうした組成物は、典型的には、１つまたはそれより多い可溶性充填物質、例えばスクロース、ソルビトールおよびマンニトール；ならびに結合剤、例えばアラビアゴム、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、または流動促進剤、潤滑剤、甘味料、着色剤、酸化防止剤およびフレーバー剤を含む。
【0106】
また、本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩またはそれぞれの調製物を、例えば、被験体の表皮または上皮組織上にこれらを含有する組成物を直接置くかまたは広げることによって、あるいは「パッチ」を通じて経皮的に、被験体に局所投与してもよい。こうした組成物には、例えば、ローション、クリーム、溶液、ジェルおよび固体が含まれる。これらの局所組成物は、有効量、通常、少なくとも約０．１ｗｔ％、またはさらに約１ｗｔ％～約５ｗｔ％の本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩を含んでもよい。局所投与のための適切なキャリアーは、典型的には、連続フィルムとして皮膚上で適所に留まり、そして発汗または水への浸漬による除去に抵抗する。一般的に、キャリアーは、有機性であり、そして療法剤がその中で分散または溶解されることが可能である。キャリアーには、薬学的に許容されうる皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、溶媒等が含まれてもよい。
【0107】
注射可能使用に適した薬学的組成物には、無菌水性溶液（特に、化合物または薬学的に許容されうる塩が水溶性である場合）または分散物、および無菌注射可能溶液または分散物の即時調製のための無菌粉末が含まれる。特に、組成物は、特に無菌で、そして容易な注射針通過能（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する度合いまで流動性であり；製造および保存の条件下で安定であり、そして細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保持されている。
【0108】
適切な薬学的に許容されうるビヒクルには、限定なしに、経口、非経口、鼻、粘膜、経皮、静脈内（ＩＶ）、動脈内（ＩＡ）、筋内（ＩＭ）、および皮下（ＳＣ）投与経路に適した任意の非免疫原性薬学的アジュバント、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。
【0109】
特定の側面にしたがって、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容されうる塩を、食物または飼料製品、栄養補助食品または美容調製物、例えば栄養補給食品または薬用化粧品として用いてもよい。
【0110】
特定の態様は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容されうる塩を含む、食物、飼料または美容組成物を指す。
用語「食物」または「食品」は、本明細書において、動物（ヒトおよび非ヒト動物を含む）による摂取に適しているかまたはそのために意図される、任意の化合物、調製物、混合物、または組成物を指す。これには、おそらく食餌として用いられる、食品への栄養的または機能的補助として理解される、栄養、栄養補助または食品補充物、ダイエット食品、完全または不完全バランス食餌または補助剤または医学的食物である、任意の化合物が含まれる。特定の機能食品は、シリアルバー、ヨーグルトおよび同様の乳製品、ベーカリー製品、フルーツジュースおよび飲料一般を含む群より選択される。典型的には、機能食品は、毒を含む病原体と関連する疾患状態の防止または予防および／または治療、あるいは体の生理学的不均衡の治療を補助する。該用語はまた、おそらく非ヒト動物に給餌するための食餌として用いられる、飼料または飼料製品も含むものとする。食品は、有機または合成供給源のものであってもよく、乳製品または混合前に適切に精製されている物質の人工的混合物に基づく合成組成物を含む、天然または天然様組成物中に配合されていてもよい。本発明にしたがった食品は、典型的には、食品等級品質で提供される。等級品質は、動物に許容されうる食品の品質特性である。これには、外見（サイズ、形状、色、光沢、およびコンシステンシー）などの外部要因、質感およびフレーバーが含まれる。品質標準はまた、許容されうる最大量の混入物質も提供する。成分品質に加えて、病原体を不活性化するかまたは枯渇させる衛生要件もまたある。消費者のために、ありうる最も安全な食品を産生するため、食品プロセシング環境が可能な限り清潔であることを確実にすることが重要である。
用語「食物」または「食品」は、本明細書において、動物（ヒトおよび非ヒト動物を含む）による摂取に適しているかまたはそのために意図される、任意の化合物、調製物、混合物、または組成物を指す。これには、おそらく食餌として用いられる、食品への栄養的または機能的補助として理解される、栄養、栄養補助または食品補充物、ダイエット食品、完全または不完全バランス食餌または補助剤または医学的食物である、任意の化合物が含まれる。特定の機能食品は、シリアルバー、ヨーグルトおよび同様の乳製品、ベーカリー製品、フルーツジュースおよび飲料一般を含む群より選択される。典型的には、機能食品は、毒を含む病原体と関連する疾患状態の防止または予防および／または治療、あるいは体の生理学的不均衡の治療を補助する。該用語はまた、おそらく非ヒト動物に給餌するための食餌として用いられる、飼料または飼料製品も含むものとする。食品は、有機または合成供給源のものであってもよく、乳製品または混合前に適切に精製されている物質の人工的混合物に基づく合成組成物を含む、天然または天然様組成物中に配合されていてもよい。本発明にしたがった食品は、典型的には、食品等級品質で提供される。等級品質は、動物に許容されうる食品の品質特性である。これには、外見（サイズ、形状、色、光沢、およびコンシステンシー）などの外部要因、質感およびフレーバーが含まれる。品質標準はまた、許容されうる最大量の混入物質も提供する。成分品質に加えて、病原体を不活性化するかまたは枯渇させる衛生要件もまたある。消費者のために、ありうる最も安全な食品を産生するため、食品プロセシング環境が可能な限り清潔であることを確実にすることが重要である。
【0111】
用語「栄養補助」は、本明細書において、例えば植物油／動物油、ビタミン、コレステロール、クレアチン、アミノ酸、ミネラル塩、ベータ－カロテン、フラボノイド、植物または酵母エキス、ヒアルロン酸、イノシトール、ハーブ、およびすべての他の適切な成分などの、特定の食餌またはプロセシングされた食品中に含まれるべき、任意の栄養素、食餌補助剤および製品を指すよう意味される。
【0112】
用語「薬用化粧品」は、本明細書において、例えば、ビタミン、アルファおよびベータ－ヒドロキシル酸、リポ酸、ジメチルアミノエタノール、グリコール酸、サリチル酸、ヒアルロン酸などの、体に対して薬剤と同様に有益である、任意の美容製品を指すよう意味される。
【0113】
特に、適切な調製物は、例えば、それぞれの配合物を提供するための、特定の賦形剤または補助手段を含む、液体、シロップ、ロゼンジ、錠剤、チューイングガム、スプレー、粉末、インスタント粉末、顆粒、カプセル、クリーム、ジェル、ドロップ、懸濁物、エマルジョンまたは食品として提供されてもよい。
【0114】
特定の側面にしたがって、本明細書記載の化合物またはその薬学的に許容されうる塩またはそれぞれの調製物、および美容的に許容されうるビヒクルを含む、適切な美容配合調製物を、局所適用のために提供する。特定の美容配合物は、水和および保存特性を有し、そしてケラチン基質、加齢徴候、環境要因への曝露（ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）による皮膚損傷を治療可能であり、そしてしたがって、皮膚の外見を改善する。
【0115】
ケラチン基質の治療は、皮膚および／または毛髪および／または爪の健康な機能を保持するかまたは回復すること、あるいは外見および／または構造を保持するかまたは改善する手段を提供する任意の治療を目指すよう意味される。こうした治療の例には：皮膚強化、皺減少、加湿、任意の種類の侵害からの保護、特に日光照射および加齢指標からの保護が含まれる。
【0116】
加齢徴候の治療は、加齢および光加齢による皮膚の外見に関するすべての変化を指すよう意味される。これらの変化の例には、皺および細い線、けば立った（ｆｌｏｓｓ）皮膚、やせた皮膚、皮膚弾性および／または色調の喪失、光沢のない皮膚が含まれる。また、外見変化に直接影響しない、内部皮膚修飾もまた含まれる。これらの内部修飾の例は、ＵＶ照射への反復曝露によって、皮膚内部で起こる分解である。
【0117】
皮膚外見の改善のための治療は、皮膚外見の視覚的改善を生じうるすべての現象を指すよう意味される。これらの現象の例は、より美しく引き締まりそして滑らかな皮膚を導く。
【0118】
詳細な説明
本明細書において、別に記載されない限り、以下の定義が適用される：
用語「アルキル」は、単独で、あるいは他の基または原子と組み合わせて用いられた場合、いくつかの水素置換炭素原子のみからなる飽和直鎖または分枝鎖を指し、そしてこれには、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、１－メチルプロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、２，２、－ジメチルブチル、２，２－ジメチルプロピル、ｎ－ペンチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、４－メチルペンチル、ｎ－ヘキシル等が含まれる。
本明細書において、別に記載されない限り、以下の定義が適用される：
用語「アルキル」は、単独で、あるいは他の基または原子と組み合わせて用いられた場合、いくつかの水素置換炭素原子のみからなる飽和直鎖または分枝鎖を指し、そしてこれには、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、１－メチルプロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、２，２、－ジメチルブチル、２，２－ジメチルプロピル、ｎ－ペンチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、４－メチルペンチル、ｎ－ヘキシル等が含まれる。
【0119】
用語「アリール」は、随意に完全にまたは部分的に飽和または不飽和である炭素環と融合していてもよく、そして随意に１つまたはそれより多くの同一のまたは異なる置換基、適切には１～３の置換基で置換されていてもよい、５または６～１４炭素原子、好ましくは６～１０炭素原子を含有する芳香族単環または二環基を指す。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、インダニル等が含まれる。
【0120】
用語「シクロアルキル」は、単独で、あるいは他の基または原子と組み合わせて用いられた場合、各々飽和していてもまたは不飽和（シクロアルケニル）であってもいずれでもよい、単環炭化水素環、二環炭化水素環またはスピロ炭化水素環を指す。用語「不飽和」は、問題の環系において、少なくとも１つの二重結合があるが、芳香族系は形成されないことを意味する。二環炭化水素環において、２つの環は、これらが、少なくとも２つの炭素原子を共通に有するように連結される。スピロ炭化水素環において、１つの炭素原子（スピロ原子）が２つの環に共有される。シクロアルキルが置換される場合、置換は、互いに独立に、すべての水素所持炭素原子で、各場合でモノまたはポリ置換であってもよい。シクロアルキル自体を、環系の任意の適切な位で、置換基として、分子に連結してもよい。
【0121】
用語「ヘテロアリール」は、５または６～１４炭素原子、好ましくは５または６～１２炭素原子を含有し、そのうち１～５がＮ、ＳおよびＯより選択されるヘテロ原子で置換され、随意に非芳香族複素環に還元されてもよく、そして随意に１つまたはそれより多くの同一のまたは異なる置換基で置換されてもよい、芳香族単環または二環基を指す。ヘテロアリール基の例には、ピロリル、ジヒドロピロリル、ピロリジニル、オキソピロリジニル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、イミダゾ（１，２－ａ）ピリジニル、インダゾリル、プリニル、ピロロ（２，３－ｃ）ピリジニル、ピロロ（３，２－ｃ）ピリジニル、ピロロ（２，３－ｂ）ピリジニル、ピラゾロ（１，５－ａ）ピリジニル、１，２，３－トリアゾリル、１，２，４－トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、１，２オキサゾリル、イソキサゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル、１，２，５－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、１，２，３－オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル、１，２，５－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，２，３－チアジアゾリル、フラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、チオフェニル、ジヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾイソチオフェニル、ピリジル、ピペリジニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、キノリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラニル、テトラヒドロピラニル、１，２，３－トリアジニル、１，２，４－トリアジニル、１，３，５－トリアジニル、クロメニル、モルホリニル、ジアゼピニル、ベンゾジアゼピニル等が含まれる。
【0122】
用語「ヘテロシクロアルキル」によって、炭化水素環において、１つまたはそれより多くの－ＣＨ２－基が、互いに独立に、－Ｏ－、－Ｓ－、または－ＮＨ－基によって置換されるか、あるいは１つまたはそれより多くの＝ＣＨ－基が＝Ｎ－基によって置換される一方、総数５を超えないヘテロ原子が存在してもよく、２つの酸素原子間および２つのイオウ原子間または1つの酸素および1つのイオウ原子間に少なくとも1つの炭素原子が存在しなければならず、そして全体として基が化学的に安定でなければならない場合の、先に定義するようなシクロアルキル由来の基を意味する。ヘテロ原子は、すべてのありうる酸化段階（イオウ→スルホキシド－ＳＯ－、スルホン－ＳＯ２－；窒素→Ｎ－オキシド）で同時に存在してもよい。シクロアルキルの間接的な定義／由来から、ヘテロシクロアルキルが、サブグループ、単環複素環、二環複素環およびスピロヘテロ環で構成される一方、各サブグループもまた、飽和および不飽和（ヘテロシクロアルケニル）にさらに細分可能であることが直ちに明らかである。用語「不飽和」は、問題の環系において、少なくとも１つの二重結合があるが、芳香族系は形成されないことを意味する。二環複素環において、２つの環は、これらが、少なくとも２つの炭素原子を共通に有するように連結される。スピロヘテロ環において、１つの炭素原子（スピロ原子）が２つの環に共有される。ヘテロシクロアルキルが置換される場合、置換は、互いに独立に、すべての水素所持炭素原子および／または窒素原子で、各場合でモノまたはポリ置換であってもよい。ヘテロシクロアルキル自体を、環系の任意の適切な位で、置換基として、分子に連結してもよい。
【0123】
用語「複素環基」は、本明細書において、随意に、芳香族アリールまたはヘテロアリール基に融合されていてもよい、ヘテロシクロアルキル基を指す。
個々のサブグループの典型的な例を以下に列挙する：単環複素環（飽和および不飽和）：オキソラン、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、チアゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキシラニル、アジリジニル、アゼチジニル、１，４－ジオキサニル、アゼパニル、ジアゼパニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ホモモルホリニル、ホモピペリジニル、ホモピペラジニル、ホモチオモルホリニル、チオモルホリニル－Ｓ－オキシド、チオモルホリニル－Ｓ，Ｓ－ジオキシド、１，３－ジオキソラニル、オキサン、テトラヒドロチオピラニル、１，４－オキサゼパニル、テトラヒドロチエニル、ホモチオモルホリニル－Ｓ，Ｓ－ジオキシド、オキサゾリジノニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピロリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピリジル、ジヒドロ－ピリミジニル、ジヒドロフリル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチエニル－Ｓ－オキシド、テトラヒドロチエニル－Ｓ，Ｓ－ジオキシド、ホモチオモルホリニル－Ｓ－オキシド、２，３－ジヒドロアゼット、２Ｈ－ピロリル、４Ｈ－ピラニル、１，４－ジヒドロピリジニル等；二環複素環（飽和および不飽和）：８－アザビシクロ［３．２．１］オクチル、８－アザビシクロ［５．１．０］オクチル、２－オキサ－５－アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル、８－オキサ－３－アザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、３，８－ジアザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、２，５－ジアザ－ビシクロ－［２．２．１］ヘプチル、１－アザ－ビシクロ［２．２．２］オクチル、３－８－ジアザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、３，９－ジアザ－ビシクロ［４．２．１］ノニル、２，６－ジアザ－ビシクロ［３．２．２］ノニル、ヘキサヒドロ－フロ［３，２－ｂ］フリル等；スピロヘテロ環（飽和および不飽和）１，４－ジオキサ－スピロ［４．５］デシル；１－オキサ－３，８－ジアザ－スピロ［４．５］デシル；２－オキサスピロ［３．３］ヘプチル、５－アザスピロ［２．４］ヘプチル、２，６－ジアザ－スピロ［３．３］ヘプチル；２，７－ジアザ－スピロ［４．４］ノニル；２，６－ジアザ－スピロ［３．４］オクチル；３，９－ジアザ－スピロ［５．５］ウンデシル；２，８－ジアザ－スピロ［４．５］デシル等。
個々のサブグループの典型的な例を以下に列挙する：単環複素環（飽和および不飽和）：オキソラン、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、チアゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキシラニル、アジリジニル、アゼチジニル、１，４－ジオキサニル、アゼパニル、ジアゼパニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ホモモルホリニル、ホモピペリジニル、ホモピペラジニル、ホモチオモルホリニル、チオモルホリニル－Ｓ－オキシド、チオモルホリニル－Ｓ，Ｓ－ジオキシド、１，３－ジオキソラニル、オキサン、テトラヒドロチオピラニル、１，４－オキサゼパニル、テトラヒドロチエニル、ホモチオモルホリニル－Ｓ，Ｓ－ジオキシド、オキサゾリジノニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピロリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピリジル、ジヒドロ－ピリミジニル、ジヒドロフリル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチエニル－Ｓ－オキシド、テトラヒドロチエニル－Ｓ，Ｓ－ジオキシド、ホモチオモルホリニル－Ｓ－オキシド、２，３－ジヒドロアゼット、２Ｈ－ピロリル、４Ｈ－ピラニル、１，４－ジヒドロピリジニル等；二環複素環（飽和および不飽和）：８－アザビシクロ［３．２．１］オクチル、８－アザビシクロ［５．１．０］オクチル、２－オキサ－５－アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル、８－オキサ－３－アザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、３，８－ジアザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、２，５－ジアザ－ビシクロ－［２．２．１］ヘプチル、１－アザ－ビシクロ［２．２．２］オクチル、３－８－ジアザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、３，９－ジアザ－ビシクロ［４．２．１］ノニル、２，６－ジアザ－ビシクロ［３．２．２］ノニル、ヘキサヒドロ－フロ［３，２－ｂ］フリル等；スピロヘテロ環（飽和および不飽和）１，４－ジオキサ－スピロ［４．５］デシル；１－オキサ－３，８－ジアザ－スピロ［４．５］デシル；２－オキサスピロ［３．３］ヘプチル、５－アザスピロ［２．４］ヘプチル、２，６－ジアザ－スピロ［３．３］ヘプチル；２，７－ジアザ－スピロ［４．４］ノニル；２，６－ジアザ－スピロ［３．４］オクチル；３，９－ジアザ－スピロ［５．５］ウンデシル；２，８－ジアザ－スピロ［４．５］デシル等。
【0124】
用語「適切な置換基」によって、一方ではその価によって適合し、そして他方では化学的安定性を有する系を導く置換基を意味する。
分子中の特定の位置での任意の置換基または変数の定義は、その分子中の別の箇所での定義とは独立であると意図される。本発明の化合物上の置換基および置換パターンは、化学的に安定であり、そして当該技術分野において知られる技術ならびに本明細書に示す方法によって、容易に合成可能である化合物を提供するように、一般の当業者によって選択されうることが理解される。
分子中の特定の位置での任意の置換基または変数の定義は、その分子中の別の箇所での定義とは独立であると意図される。本発明の化合物上の置換基および置換パターンは、化学的に安定であり、そして当該技術分野において知られる技術ならびに本明細書に示す方法によって、容易に合成可能である化合物を提供するように、一般の当業者によって選択されうることが理解される。
【0125】
本明細書に提供するいかなる式または構造も、定義する式の化合物を含めて、化合物の非標識型ならびに同位体標識型に相当することもまた意図される。同位体標識化合物は、選択する原子質量または質量数を有する原子によって、１つまたはそれより多くの原子が置換されていることを除き、本明細書に提供する式によって示される構造を有する。本発明の化合物内に取り込まれてもよい同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、および塩素の同位体が含まれ、限定されるわけではないが、例えば２Ｈ（重水素、Ｄ）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、および１２５Ｊがある。
【0126】
用語「薬学的に許容されうる」はまた、「薬理学的に許容されうる」とも称され、動物、特にヒトの治療と適合することを意味する。用語「薬理学的に許容されうる塩」には、薬理学的に許容されうる酸付加塩および薬理学的に許容されうる塩基付加塩の両方が含まれる。
【0127】
用語「薬理学的に許容されうる酸付加塩」は、本明細書において、本開示の任意の塩基化合物の任意の非毒性有機または無機塩、あるいはその中間体のいずれかを意味する。酸付加塩を形成可能な本開示の塩基性化合物には、例えば、塩基性窒素原子を含有する化合物が含まれる。適切な塩を形成する例示的な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸、ならびに金属塩、例えばオルトリン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムが含まれる。適切な塩を形成する例示的な有機酸には、モノ、ジ、およびトリカルボン酸、例えばグリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸およびサリチル酸、ならびにスルホン酸、例えばｐ－トルエンスルホン酸およびメタンスルホン酸が含まれる。一、二、または三酸塩のいずれを形成してもよく、そしてこうした塩は、水和、溶媒和または実質的に無水の型で存在してもよい。一般的に、本開示の化合物の酸付加塩は、水および多様な親水性有機溶媒中でより可溶性であり、そして一般的に、その遊離塩基型に比較して、より高い融点を示す。適切な塩の選択は当業者に知られるであろう。例えば、本開示の化合物の単離において、実験室使用のため、または薬理学的に許容されうる酸付加塩に続いて変換するため、他の薬理学的に許容されえない酸付加塩、例えばオキサレートを用いてもよい。
【0128】
用語「薬理学的に許容されうる塩基性塩」は、本明細書において、動物、特にヒトの治療に適しているかまたは適合する、本開示の任意の酸化合物の任意の非毒性有機または無機塩基付加塩、あるいはその中間体のいずれかを意味する。塩基付加塩を形成可能な本発明の酸性化合物には、例えば、カルボン酸、スルホン酸、スルフィン酸、スルホンアミド、Ｎ－非置換テトラゾール、リン酸エステル、または硫酸エステルを含有する化合物が含まれる。適切な塩を形成する例示的な無機塩基には、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、または水酸化バリウムが含まれる。適切な塩を形成する例示的な有機塩基には、脂肪族、脂環式または芳香族有機アミン、例えばメチルアミン、トリメチルアミンおよびピコリンまたはアンモニアが含まれる。適切な塩の選択は当業者に知られるであろう。例えば、本発明の化合物の単離において、実験室使用のため、または薬理学的に許容されうる塩基付加塩に続いて変換するため、他の薬理学的に許容されえない塩基付加塩を用いてもよい。標準技術を用いて、望ましい化合物塩の形成を達成する。例えば、中性化合物を、適切な溶媒中、塩基で処理して、そして形成された塩を、濾過、抽出または任意の他の適切な方法によって単離する。
【0129】
用語、本発明の化合物の「療法的有効量」、「有効量」または「十分量」は、哺乳動物を含む被験体、例えばヒトに投与した際、臨床結果を含む、有益なまたは望ましい結果を達成するために十分な量であり、そしてこうしたものとして、有効量またはその同義語は、適用される背景に依存する。
【0130】
こうした有効用量は、特に、本明細書記載の障害に関連する状態の治癒、防止または改善を生じるために十分な化合物の量を指す。有効用量は、治療しようとする個体の健康状態および身体状態、治療しようとする個体の分類上の群、組成物の配合、医学的状況の評価および他の適切な要因に応じて多様であろう。
【0131】
特定の側面にしたがって、本明細書記載の薬学的組成物は、本明細書に定義するような化合物（または薬学的に許容されうる塩）の有効量を含有する。本明細書記載の調製物を、単回または多数回投薬使用のために提供してもよく、特に、ここで、化合物（またはその薬学的に許容されうる塩）を、約０．０１ｍｇ～約５．０ｇ、好ましくは約０．０５ｍｇ～２ｇ、より好ましくは約０．５ｍｇ～１ｇ、さらにより好ましくは約１ｍｇ～５００ｍｇであってもよい用量で投与する。特定の側面にしたがって、化合物（またはその薬学的に許容されうる塩）を、患者に、体重ｋｇあたり、約０．０１ｍｇ～約５ｇ、好ましくは約０．０５ｍｇ～２ｇ、より好ましくは約０．５ｍｇ～１ｇ、さらにより好ましくは約１ｍｇ～約５００ｍｇの量で投与してもよい。
【0132】
用語「単回用量」は、本明細書において、以下のように理解される。単回用量または単回使用のための量は、単一の被験体、例えばヒトまたは動物いずれかの患者における、単一症例／処置／投与に関する使用が意味される投与に意図される量である。単回用量を含むパッケージは、典型的には製造者によってそのように標識される。単回用量量は、有効量を提供するための、個体、例えば小児または成人のための１日用量と特に理解される。
【0133】
適切な投与経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜、または腸投与；筋内、皮下、髄内注射、ならびにクモ膜下、直接心室内、静脈内、腹腔内または鼻内注射を含む、非経口送達が含まれてもよい。化合物（またはその薬学的に許容されうる塩）または本明細書記載の薬学的組成物の投与を、多様な慣用的方法で、例えば経口摂取、吸入、局所適用、あるいは皮膚、皮下、腹腔内、非経口または静脈内注射で行ってもよい。患者への静脈内および経口投与が好ましい。
【0134】
好ましい態様は、０．０１ｍｇ～５．０ｇ／ｋｇ体重の範囲の有効量を指し、好ましくは、投与は静脈内または経口で行われる。
本明細書記載の薬学的組成物は、好ましくは、１つまたはそれより多い薬学的に許容されうる補助剤を含有し、そして活性薬学的化合物を高い生物学的利用能で投与することを可能にする薬学的型である。適切な補助剤は、例えば、シクロデキストリンに基づいてもよい。適切な配合物は、例えば、アクリレート、メタクリレート、シアノアクリレート、アクリルアミド、ポリアセテート、ポリグリコレート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ゼラチン、アルブミン、ポリスチレン、ポリビニル、ポリアクロレイン、ポリグルタルアルデヒド、ならびにその誘導体、コポリマーおよび混合物からなる群より選択されるポリマーで形成される、合成ポリマー性ナノ粒子を取り込んでもよい。
本明細書記載の薬学的組成物は、好ましくは、１つまたはそれより多い薬学的に許容されうる補助剤を含有し、そして活性薬学的化合物を高い生物学的利用能で投与することを可能にする薬学的型である。適切な補助剤は、例えば、シクロデキストリンに基づいてもよい。適切な配合物は、例えば、アクリレート、メタクリレート、シアノアクリレート、アクリルアミド、ポリアセテート、ポリグリコレート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ゼラチン、アルブミン、ポリスチレン、ポリビニル、ポリアクロレイン、ポリグルタルアルデヒド、ならびにその誘導体、コポリマーおよび混合物からなる群より選択されるポリマーで形成される、合成ポリマー性ナノ粒子を取り込んでもよい。
【実施例】
【0135】
以下の実施例は、本発明の理解を補助するために示されるが、本発明の範囲をいかなる意味でも限定するよう意図されず、そしてそのように見なしてはならない。実施例には、慣用法の詳細な説明は含まれない。こうした方法は、一般の当業者には周知である。
【0136】
実施例１． ＳＣＡ－７４４は、ヒト細胞の遺伝子発現、特に炎症および抗酸化反応、ならびに脂質代謝に関与するものにおいて、広範囲の変化を誘導する
ＳＣＡ－７４４（カタログ番号５５５２３－２５０ＭＧ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に対する細胞反応、ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞の処理に際しての遺伝子発現の広範囲の変化を決定するため、ＲＮＡｓｅｑ分析によって、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ（神経芽細胞腫細胞株：ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＴＣＣ－ＣＲＬ－２２６６）を分析した。ＳＨ－ＳＹ５Ｙは、レチノール酸およびホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテートで分化した細胞であった（Ｐｒｅｓｇｒａｖｅｓら Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００４， １９０（１）， ｐｐ．１５７－１７０）。細胞培養を５００μＭのＳＣＡ－７４４またはビヒクル（ＤＰＢＳ）で２４時間処理した。ライブラリーを調製するため、Ｌｅｘｏｇｅｎ ＳＥＮＳＥ ｍＲＮＡキットを用いて、総ＲＮＡを単離して、そして配列決定化学反応ｖ４を用い、５０ｂｐ単回読み取りモードで実行する、ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、配列決定した。ＤＥＳｅｑ（Ａｎｄｅｒｓ ＆ Ｈｕｂｅｒ， Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０， １１（１０）， ｐ．Ｒ１０６）およびｅｄｇｅＲ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００９， ２６（１）， ｐｐ．１３９－１４０．）パッケージの統計検定を適用することによって、示差的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）を同定した。ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）識別子で比較を行った。
ＳＣＡ－７４４（カタログ番号５５５２３－２５０ＭＧ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に対する細胞反応、ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞の処理に際しての遺伝子発現の広範囲の変化を決定するため、ＲＮＡｓｅｑ分析によって、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ（神経芽細胞腫細胞株：ＳＨ－ＳＹ５Ｙ－ＡＴＣＣ－ＣＲＬ－２２６６）を分析した。ＳＨ－ＳＹ５Ｙは、レチノール酸およびホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテートで分化した細胞であった（Ｐｒｅｓｇｒａｖｅｓら Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００４， １９０（１）， ｐｐ．１５７－１７０）。細胞培養を５００μＭのＳＣＡ－７４４またはビヒクル（ＤＰＢＳ）で２４時間処理した。ライブラリーを調製するため、Ｌｅｘｏｇｅｎ ＳＥＮＳＥ ｍＲＮＡキットを用いて、総ＲＮＡを単離して、そして配列決定化学反応ｖ４を用い、５０ｂｐ単回読み取りモードで実行する、ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、配列決定した。ＤＥＳｅｑ（Ａｎｄｅｒｓ ＆ Ｈｕｂｅｒ， Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０， １１（１０）， ｐ．Ｒ１０６）およびｅｄｇｅＲ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００９， ２６（１）， ｐｐ．１３９－１４０．）パッケージの統計検定を適用することによって、示差的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）を同定した。ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）識別子で比較を行った。
【0137】
特に、炎症、抗酸化、抗加齢反応および脂質代謝に関与するいくつかの遺伝子が、ＳＣＡ－７４４において示差的に制御された（表１、表２、図１０）。
ＳＣＡ－７４４誘導性遺伝子発現変化のさらに拡張された分析において、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅに遺伝子セットをインポートし、そして次いで、ＣｌｕｅＧＯプラグインで、遺伝子オントロジー、疾患領域および経路分析に用いた（Ｂｉｎｄｅａら Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００９， ２５（８）， ｐｐ．１０９１－１０９３）。さらに、経路比較のための新規計算アプローチを適用して、実験で決定したＳＣＡ－７４４のプロファイルと、抗炎症化合物コルチゾール（ヒドロコルチゾン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．、米国ミズーリ州セントルイス）に関して報告されたものを比較した。このアプローチは、タンパク質一次構造情報および小分子ケミインフォマティクスを利用して、薬剤のありうるタンパク質ターゲットを同定し、そして（隠れた）薬剤間類似性を明らかにする。
ＳＣＡ－７４４誘導性遺伝子発現変化のさらに拡張された分析において、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅに遺伝子セットをインポートし、そして次いで、ＣｌｕｅＧＯプラグインで、遺伝子オントロジー、疾患領域および経路分析に用いた（Ｂｉｎｄｅａら Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００９， ２５（８）， ｐｐ．１０９１－１０９３）。さらに、経路比較のための新規計算アプローチを適用して、実験で決定したＳＣＡ－７４４のプロファイルと、抗炎症化合物コルチゾール（ヒドロコルチゾン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．、米国ミズーリ州セントルイス）に関して報告されたものを比較した。このアプローチは、タンパク質一次構造情報および小分子ケミインフォマティクスを利用して、薬剤のありうるタンパク質ターゲットを同定し、そして（隠れた）薬剤間類似性を明らかにする。
【0138】
ＳＣＡ－７４４によって影響を受けると予測される経路（その大部分はまた、ＲＮＡＳｅｑ分析によって実験的にも同定された）を、コルチゾールによって調節されると報告されたもの（Ｗａｎら Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１６， ｐｐ．１－１４．）に比較すると、有意な重複が示された（図１）。しかし、コルチゾールによって影響を受け、そしてその副作用に関与するいくつかの代謝経路、例えば糖代謝および神経伝達物質脱活性化経路は、ＳＣＡ－７４４によっては調節されない。
【0139】
他の先行技術はいずれも、このプロファイルを持つ抗炎症薬剤を記述してきていない。これらの知見に基づいて、ＳＣＡ－７４４および本明細書記載の化合物は、新規抗炎症化合物の潜在能力を有する。
【0140】
実施例２． ＳＣＡ－７４４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、炎症促進性サイトカインの産生を減少させる
ｍＲＮＡ発現分析に基づいて、ＳＣＡ－７４４は、炎症促進性反応に関与する重要な遺伝子を下方制御する（表１、図１０）。これらのデータを検証するため、よく性質決定され、そして広く用いられる炎症促進性シグナル伝達のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルであるＬＰＳ刺激ＴＨＰ－１ヒト単球細胞株を使用した（Ｂｏｓｓｈａｒｔ ＆ Ｈｅｉｎｚｅｌｍａｎｎ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１６， ４（２１）， ｐｐ．４３８－４３８）。細胞を、１００ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で４８時間処理して、成熟マクロファージ様状態を誘導した。次いで、細胞を、５００μＭのＳＣＡ－７４４の非存在下および存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した。６時間後、処理細胞および未処理細胞の上清を収集し、そしてＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘマルチ分析物フローアッセイのヒト炎症パネルを用いて、３つの主要な炎症促進性サイトカイン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１βのレベルを決定した。ＳＣＡ－７４４処理ＴＨＰ－１細胞の培養上清において、未処理細胞のものに比較して、有意に減少した炎症促進性サイトカインレベルが測定された（図２）。
ｍＲＮＡ発現分析に基づいて、ＳＣＡ－７４４は、炎症促進性反応に関与する重要な遺伝子を下方制御する（表１、図１０）。これらのデータを検証するため、よく性質決定され、そして広く用いられる炎症促進性シグナル伝達のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルであるＬＰＳ刺激ＴＨＰ－１ヒト単球細胞株を使用した（Ｂｏｓｓｈａｒｔ ＆ Ｈｅｉｎｚｅｌｍａｎｎ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１６， ４（２１）， ｐｐ．４３８－４３８）。細胞を、１００ｎＭのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で４８時間処理して、成熟マクロファージ様状態を誘導した。次いで、細胞を、５００μＭのＳＣＡ－７４４の非存在下および存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した。６時間後、処理細胞および未処理細胞の上清を収集し、そしてＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘマルチ分析物フローアッセイのヒト炎症パネルを用いて、３つの主要な炎症促進性サイトカイン、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１βのレベルを決定した。ＳＣＡ－７４４処理ＴＨＰ－１細胞の培養上清において、未処理細胞のものに比較して、有意に減少した炎症促進性サイトカインレベルが測定された（図２）。
【0141】
直接サイトカイン測定（タンパク質発現レベル）から生じるこれらのデータによって、異なるヒト細胞タイプ（神経芽細胞腫）中で検出されたｍＲＮＡレベルでの遺伝子発現変化（ＲＮＡＳｅｑ）によって予測されるように、細胞が、ＳＣＡ－７４４に反応して、炎症シグナル伝達を減少させることが確認される。したがって、ＳＣＡ－７４４の抗炎症効果が一般的なものであり、そして免疫細胞に限定されないと結論付けることも可能である。
【0142】
第二のセットの実験において、ＳＣＡ－７４４の抗炎症効果を、加齢動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで試験した。加齢プロセスが低等級の炎症と関連することがよく確立されている。１８ヶ月より高齢のマウスは、高齢のヒトの多くの特性を示し、そしてヒト加齢の適切なモデルと見なされる。２０を超えるサイトカインおよびケモカインの濃度を、若年および高齢動物の肺溶解物中で決定し、そしてこれらの大部分が、若い動物に比較して高齢動物において、有意により高いレベルで存在することが見出された（Ｊａｎｅｓｃｈら Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２０１８， １１１， ｐｐ．３８９－３９７）。高齢マウス（５匹のマウス／群）をＳＣＡ－７４４で２週間処置した（２または３日間隔、３０ｍｇ／ｋｇ用量、ｉ．ｐ．）後、マウス肺を採取し、そして溶解物を調製した。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭマウス炎症パネルアッセイによって、サイトカインレベルを決定した。炎症促進性サイトカインＩＬ－６およびＴＮＦ－αならびに炎症マーカー、リポカリン（ＬＣＮ２）が有意に減少した量で検出された（図３）。重要なことに、抗炎症サイトカインＩＬ－１０は、ＳＣＡ－７４４によって影響を受けなかった。
これらのデータに基づいて、ＳＣＡ－７４４は、細胞炎症促進性サイトカインシグナル伝達を下方制御し、そして抗炎症効果を発揮する。
これらのデータに基づいて、ＳＣＡ－７４４は、細胞炎症促進性サイトカインシグナル伝達を下方制御し、そして抗炎症効果を発揮する。
【0143】
実施例３． ＳＣＡ－７４４は、培養ヒト細胞において、抗酸化細胞反応を誘導する
ｍＲＮＡ発現分析（ＲＮＡＳｅｑ）は、異なる酸化ストレス反応経路に関与する３つの主要な抗酸化遺伝子：１．酸化ストレスおよびアポトーシスに関連付けられるＣＨＡＣ１（グルタチオン特異的γ－グルタミルシクロトランスフェラーゼ１）、２．解毒経路に関与するＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ［キノン］１）、ならびに３．グルタチオン（ＧＳＨ）系とは独立に細胞外ＣｙＳＳ（システイン酸化の結果）の還元型を産生するＳＬＣ７Ａ１１（システイン／グルタミン酸輸送体；ｘＣＴ、ＣＣＢＲ１）の有意な上方制御を示した。
ｍＲＮＡ発現分析（ＲＮＡＳｅｑ）は、異なる酸化ストレス反応経路に関与する３つの主要な抗酸化遺伝子：１．酸化ストレスおよびアポトーシスに関連付けられるＣＨＡＣ１（グルタチオン特異的γ－グルタミルシクロトランスフェラーゼ１）、２．解毒経路に関与するＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ［キノン］１）、ならびに３．グルタチオン（ＧＳＨ）系とは独立に細胞外ＣｙＳＳ（システイン酸化の結果）の還元型を産生するＳＬＣ７Ａ１１（システイン／グルタミン酸輸送体；ｘＣＴ、ＣＣＢＲ１）の有意な上方制御を示した。
【0144】
ＳＣＡ－７４４の抗酸化効果を実験的に検証するため、これらの３つの遺伝子のうち１つであり、主要抗酸化酵素であるＮＱＯ１の誘導を調べた。ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部上皮細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）をＳＣＡ－７４４（５０、１００および５００μＭ）で４８時間処理し、そして抗ヒトＮＱＯ１抗体（Ａ－５：ｓｃ－２７１１１６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたイムノブロット分析のため、採取して細胞溶解物を調製した。ＳＣＡ－７４４処理細胞で得たシグナル強度は、ＳＣＡ－７４４濃度依存性方式で、ＮＱＯ１の非常に有意な上方制御を確認した（図４）。実際、適用される実験条件下で、対照細胞においてＮＱＯ１はまったく検出されず、一方、試験したＳＣＡ－７４４の最低濃度である５０μＭであっても顕著なシグナルが誘導され、ＳＣＡ－７４４濃度を増加させると増加した（５００μＭでおよそ３．５倍より高いシグナル）。装填対照（ＳＣＡ－７４４によって改変されるとは予期されないタンパク質；ＧＡＰＤＨ）によって、実験の信頼性を確認した。
【0145】
ミトコンドリアの電子伝達系（ＥＴＣ）が、細胞反応性酸素種（ＲＯＳ）の大部分（８０～９０％）を生じることが広く認められている（Ｊａｒｒｅｔｔ， Ｓ． Ｇ．ら Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８， ２７（６）， ｐｐ．５９６－６０７）。ミトコンドリア機能不全が仲介する酸化ストレスが、いくつかの疾患病理において主要な役割を果たすことを示す証拠が増加している。したがって、酸化ストレス増加に反応する抗酸化酵素の生理学的活性化は、細胞を保護すると考えられる。
【0146】
ＳＣＡ－７４４がミトコンドリア機能不全によって誘導される酸化損傷から細胞をレスキュー可能であるかどうかを試験するため、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を１－メチル－４－フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）（０．５ｍＭ、４８時間）で処理して、ミトコンドリア断片化を誘導した。ＭＰＰ＋は、神経細胞のミトコンドリアにおいて、主に、ラジカル反応性遊離酸素種の形成を促進して、さらなる全体的な細胞損傷を導くことによって、その毒性を発揮する（Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ ２００４， ３６（４）， ｐｐ．３７５－３７９）。ミトコンドリアを視覚化するため、細胞を、ミトコンドリア標識のための、穏やかなチオール反応性クロロメチル部分である、ＭｉｔｏＴａｒｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ ＃９０８２ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とインキュベーションし、固定し、そしてマウントした。ミトコンドリア形態を、レーザー走査型共焦点顕微鏡ＬＳＭ７１０ Ｚｅｉｓｓで画像化した。ＳＣＡ－７４４（５００μＭ）の存在下で、細胞はミトコンドリア完全性を維持し、ＲＯＳの形成が非常に減少したかまたは防止されたことが示唆された（図５）。
２つの独立なｉｎ ｖｉｔｒｏ実験モデルからのこれらのデータに基づいて、ＳＣＡ－７４４は、細胞の抗酸化能を増加させ、そして抗酸化剤として作用する。
２つの独立なｉｎ ｖｉｔｒｏ実験モデルからのこれらのデータに基づいて、ＳＣＡ－７４４は、細胞の抗酸化能を増加させ、そして抗酸化剤として作用する。
【0147】
実施例４． ＳＣＡ－７４４は脂質代謝を調節する
表１（図１０）に例示するように、ＳＣＡ－７４４は、脂質代謝に関与するいくつかの遺伝子、例えば血漿中のコレステロールレベルの主要な決定因子である低密度リポタンパク質受容体、ＬＤＬＲの発現に影響を及ぼす。興味深いことに、これらの遺伝子のいくつかの発現は、Ｗｎｔおよびヘッジホッグシグナル伝達経路によって制御されると報告されている（Ｂａｎｄａｒｉら Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５， １６（１）， ｐｐ．６６－７６； Ａｌｉら Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１５， ６８（１）， ｐｐ．１２７－１３７．）。ＬＤＬ－Ｒ発現レベルに対するＳＣＡ－７４４の影響を直接評価するため、ＨｅＬａ細胞を５０または５００μＭ濃度のＳＣＡ－７４４で、２４または４８時間処理した。細胞を採取し、細胞溶解物を調製し、そして次いで、抗ヒトＬＤＬ－Ｒ抗体（Ｃ７： ｓｃ－１８８２３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたイムノブロッティングによって分析した。
表１（図１０）に例示するように、ＳＣＡ－７４４は、脂質代謝に関与するいくつかの遺伝子、例えば血漿中のコレステロールレベルの主要な決定因子である低密度リポタンパク質受容体、ＬＤＬＲの発現に影響を及ぼす。興味深いことに、これらの遺伝子のいくつかの発現は、Ｗｎｔおよびヘッジホッグシグナル伝達経路によって制御されると報告されている（Ｂａｎｄａｒｉら Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５， １６（１）， ｐｐ．６６－７６； Ａｌｉら Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１５， ６８（１）， ｐｐ．１２７－１３７．）。ＬＤＬ－Ｒ発現レベルに対するＳＣＡ－７４４の影響を直接評価するため、ＨｅＬａ細胞を５０または５００μＭ濃度のＳＣＡ－７４４で、２４または４８時間処理した。細胞を採取し、細胞溶解物を調製し、そして次いで、抗ヒトＬＤＬ－Ｒ抗体（Ｃ７： ｓｃ－１８８２３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたイムノブロッティングによって分析した。
【0148】
対照細胞において（処理なし）、ＬＤＬ－Ｒシグナルは観察されない一方、ＳＣＡ－７４４のどちらの濃度でも、ＬＤＬ－Ｒは細胞溶解物中で検出され、ＳＣＡ－７４４濃度がより高く、そして曝露がより長ければ、ＬＤＬ－Ｒはより高いレベルである傾向があった（４８時間対２４時間）（図６Ａ）。
【0149】
別のセットの実験において、ＨｅＬａ細胞を同じ方式で処理した（５０または５００μＭのＳＣＡ－７４４で４８時間）。細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液で、１０分間室温で固定し、そして０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で、室温で１５分間透過処理し、そしてイムノブロッティングに使用したものと同じ抗ヒトＬＤＬＲ抗体を用いて、免疫蛍光顕微鏡によって分析した。この検出法はより感受性が高く、そして対照細胞においてさえ、ＬＤＬ－Ｒの存在を示した。半定量的分析（いくつかの異なる視野で蛍光ドットの数を比較する）に基づいて、ＳＣＡ－７４４は、濃度依存方式で、ＬＤＬ－Ｒのレベルを有意に増加させた（図６Ｂ）。
【0150】
これらのデータは、タンパク質レベルで、ＲＮＡＳｅｑに基づくＬＤＬ－Ｒの遺伝子発現増加を確認した。これらに基づいて、ＳＣＡ－７４４に曝露された細胞は、これに反応して、ＬＤＬ－Ｒの産生を増加させると結論付けることも可能である。ＬＤＬ－Ｒは、脂質代謝に本質的に関連し、そしてコレステロール合成に関与するいくつかの他の遺伝子は、ｍＲＮＡレベルで、ＳＣＡ－７４４の存在下で示差的に発現された（表１、図１０）。
【0151】
実施例５． ＳＣＡ－７４４は、ヘパラン硫酸結合タンパク質、オステオポンチンに結合し、そしてＨＳと拮抗する
どちらも陰性荷電硫酸化炭水化物である（図８に示す）ヘパラン硫酸（ＨＳ）へのＳＣＡ－７４４の化学的類似性、およびどちらもヘパラン硫酸結合タンパク質を伴う（Ｘｕ ＆ Ｅｓｋｏ， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４， ８３（１）， ｐｐ．１２９－１５７）ヘッジホッグシグナル伝達によって制御されるかまたは炎症促進性シグナル伝達に関与する脂質代謝遺伝子に対するＳＣＡ－７４４の調節効果（表１、図１０、実施例２および４）に基づいて、ＳＣＡ－７４４が、ＨＳ模倣によって、細胞代謝に対する多面的効果を発揮するという仮説を提示した。
どちらも陰性荷電硫酸化炭水化物である（図８に示す）ヘパラン硫酸（ＨＳ）へのＳＣＡ－７４４の化学的類似性、およびどちらもヘパラン硫酸結合タンパク質を伴う（Ｘｕ ＆ Ｅｓｋｏ， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４， ８３（１）， ｐｐ．１２９－１５７）ヘッジホッグシグナル伝達によって制御されるかまたは炎症促進性シグナル伝達に関与する脂質代謝遺伝子に対するＳＣＡ－７４４の調節効果（表１、図１０、実施例２および４）に基づいて、ＳＣＡ－７４４が、ＨＳ模倣によって、細胞代謝に対する多面的効果を発揮するという仮説を提示した。
【0152】
ＳＣＡ－７４４の予測されるヘパラン硫酸模倣活性を検証するため、物理的相互作用を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成要素であるプロトタイプＨＳ結合タンパク質、オステオポンチン（ＯＰＮ）で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。この目的に向け、ＮＭＲ分光法を用いて、タンパク質主鎖に沿って相互作用を直接探査し、そして相互作用部位の位置をマッピングした。実験戦略は以下の通りであった：まず、よく確立された分子生物学テクノロジー技術にしたがって、１５Ｎ標識ＯＰＮを調製した。個々の残基位を、いわゆる１５Ｎ－１Ｈ異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）分光法によって直接監視し、ここで、二次元（２Ｄ）周波数スペクトルの個々の交差ピークは、タンパク質の個々の残基位（アミノ酸）に対応する。リガンド結合は、結合部位に位置する残基の化学環境を変化させ、そしてＨＳＱＣスペクトルの変化を導く。シグナル割り当てが利用可能であるため、リガンド結合によって影響を受けている残基位は、タンパク質のアポ（リガンド不含）およびリガンド結合状態のＨＳＱＣスペクトルを比較することによって、容易に同定可能である（図７Ａ）。リガンド不含およびリガンド結合ＨＳＱＣスペクトルの検査によって、ＯＰＮへのＳＣＡ－７４４結合の明確な証明が提供された。残基位の関数として化学シフト変化（リガンド結合によって誘導される）を分析することが非常に好適である（図７Ｂ、Ｃ）。最大化学シフト変化を示す残基は、典型的には、結合界面の一部である。ＨＳおよびＳＣＡ－７４４はどちらも、重複する結合部位を示すことが明らかに見られうる（同じ残基セグメントが結合プロセスによって影響を受ける）。したがって、ＳＣＡ－７４４およびＨＳは、同じリガンド相互作用部位を共有し、そしてしたがって、結合に関して競合すると結論付けられうる。
【0153】
これらのデータおよび遺伝子発現パターンに基づいて、ＳＣＡ－７４４は、化学的類似性に基づいてヘパラン硫酸を模倣することが見出され、そしてヘパラン硫酸相互作用分子を通じて、細胞外空間からの経路修飾因子として作用する（図９）。このモデルにしたがって、ＳＣＡ－７４４は、多数のＥＣＭタンパク質、例えばヘッジホッグシグナル伝達経路のメンバー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および線維芽細胞増殖因子細胞外受容体（ＦＧＦＲ）相互作用、サイトカインおよびケモカインによるシグナル伝達をターゲティングし、炎症促進反応の減少を生じる。
【0154】
実施例６． 作用様式および標準アッセイを用いた化合物の選択
ヘパラン硫酸（ＨＳ）模倣体として作用するＳＣＡ－７４４
ＨＳ結合タンパク質との拮抗：上述のように、ＳＣＡ－７４４は、ＨＳ結合タンパク質のオステオポンチンと相互作用し、そしてＨＳおよびＳＣＡ－７４４結合部位は共有される。競合拮抗はＮＭＲに基づく測定によって立証される。細胞シグナル伝達に関与するいくつかの他のＨＳ結合タンパク質を試験する（例えばヘッジホッグシグナル伝達に関与するもの）。
ヘパラン硫酸（ＨＳ）模倣体として作用するＳＣＡ－７４４
ＨＳ結合タンパク質との拮抗：上述のように、ＳＣＡ－７４４は、ＨＳ結合タンパク質のオステオポンチンと相互作用し、そしてＨＳおよびＳＣＡ－７４４結合部位は共有される。競合拮抗はＮＭＲに基づく測定によって立証される。細胞シグナル伝達に関与するいくつかの他のＨＳ結合タンパク質を試験する（例えばヘッジホッグシグナル伝達に関与するもの）。
【0155】
ＳＣＡ－７４４仲介効果とＨＳの干渉：
ＳＣＡ－７４４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ＬＰＳによって誘導されるサイトカイン産生を有意に減少させ、そして抗酸化酵素を誘導することが示された。ＨＳとの同時インキュベーションを用いて、ＨＳがＳＣＡ－７４４の効果を減少させるかどうかを試験する。ＨＳは、商業的に入手可能なポリマー糖であるが、異なる調製物のポリマーの長さは非常に異なる。ＨＳ下位種（短鎖、中鎖および長鎖）を精製し、そしてその効果を個々に試験する。小分子量ヘパリン（別の硫酸化ポリマー性炭水化物）は、抗炎症効果を有すると報告されたが、高分子量型はこうした効果を持たなかった。これもまた、平行して試験する。
ＳＣＡ－７４４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ＬＰＳによって誘導されるサイトカイン産生を有意に減少させ、そして抗酸化酵素を誘導することが示された。ＨＳとの同時インキュベーションを用いて、ＨＳがＳＣＡ－７４４の効果を減少させるかどうかを試験する。ＨＳは、商業的に入手可能なポリマー糖であるが、異なる調製物のポリマーの長さは非常に異なる。ＨＳ下位種（短鎖、中鎖および長鎖）を精製し、そしてその効果を個々に試験する。小分子量ヘパリン（別の硫酸化ポリマー性炭水化物）は、抗炎症効果を有すると報告されたが、高分子量型はこうした効果を持たなかった。これもまた、平行して試験する。
【0156】
炎症促進性シグナル伝達に対する効果
ＮＦ－κＢレポーター細胞株を用いて、ＳＣＡ－７４４が炎症促進性反応を遮断する強度および選択性を測定する（ＴＨＰ１－ＬｕｃｉａＴＭ細胞、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路を監視するために特に設計される）。ＳＣＡ－７４４によるＮＦ－κＢ活性の調節を機械的に監視する。ＮＦ－κＢ活性化は、古典的（またはカノニカル）および代替ＮＦ－κＢシグナル伝達経路として知られる、２つの主なシグナル伝達経路に依存する。細胞表面受容体とＳＣＡ－７４４の結合に反応した抗炎症キナーゼシグナル伝達ネットワークに関与するシグナル伝達経路を理解するため、ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎアッセイを行う。このスクリーニングプラットフォームは、新規活性部位特異的競合結合アッセイを使用して、化合物および４５０を超えるキナーゼの間の相互作用を測定する。
ＮＦ－κＢレポーター細胞株を用いて、ＳＣＡ－７４４が炎症促進性反応を遮断する強度および選択性を測定する（ＴＨＰ１－ＬｕｃｉａＴＭ細胞、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路を監視するために特に設計される）。ＳＣＡ－７４４によるＮＦ－κＢ活性の調節を機械的に監視する。ＮＦ－κＢ活性化は、古典的（またはカノニカル）および代替ＮＦ－κＢシグナル伝達経路として知られる、２つの主なシグナル伝達経路に依存する。細胞表面受容体とＳＣＡ－７４４の結合に反応した抗炎症キナーゼシグナル伝達ネットワークに関与するシグナル伝達経路を理解するため、ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎアッセイを行う。このスクリーニングプラットフォームは、新規活性部位特異的競合結合アッセイを使用して、化合物および４５０を超えるキナーゼの間の相互作用を測定する。
【0157】
抗酸化反応
ＳＣＡ－７４４は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の除去に関与するいくつかの遺伝子の発現を誘導することによって、細胞培養において、抗酸化特性を示した。ＮＱＯ１は、核因子（赤血球由来２）様２（ＮＲＦ２）によって制御される、主要な下流抗酸化遺伝子の１つである。ＮＲＦ２は、遍在性に発現され、そして必須なロイシンジッパー転写因子である。ＮＲＦ２は、抗酸化反応要素（ＡＲＥ）への結合に際して、細胞保護、ならびに有害な内因性および生体異物物質の解毒およびクリアランスにおいて、非常に重要な役割を果たすタンパク質をコードする多様な遺伝子の発現を制御する。ヒトＮＲＦ２受容体細胞は、タンデム抗酸化反応要素（ＡＲＥ）を含有するプロモーターに機能的に連結するルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む安定細胞株である。したがって、処理されたレポーター細胞におけるルシフェラーゼ発現の変化を定量化すると、ＮＲＦ２活性の変化の高感度読み取り測定値が提供される。既知のＮＲＦ２アゴニストを陽性対照として用いる。
ＳＣＡ－７４４は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の除去に関与するいくつかの遺伝子の発現を誘導することによって、細胞培養において、抗酸化特性を示した。ＮＱＯ１は、核因子（赤血球由来２）様２（ＮＲＦ２）によって制御される、主要な下流抗酸化遺伝子の１つである。ＮＲＦ２は、遍在性に発現され、そして必須なロイシンジッパー転写因子である。ＮＲＦ２は、抗酸化反応要素（ＡＲＥ）への結合に際して、細胞保護、ならびに有害な内因性および生体異物物質の解毒およびクリアランスにおいて、非常に重要な役割を果たすタンパク質をコードする多様な遺伝子の発現を制御する。ヒトＮＲＦ２受容体細胞は、タンデム抗酸化反応要素（ＡＲＥ）を含有するプロモーターに機能的に連結するルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む安定細胞株である。したがって、処理されたレポーター細胞におけるルシフェラーゼ発現の変化を定量化すると、ＮＲＦ２活性の変化の高感度読み取り測定値が提供される。既知のＮＲＦ２アゴニストを陽性対照として用いる。
【0158】
ヘッジホッグシグナル伝達
細胞培養におけるＲＮＡｓｅｑトランスクリプトーム薬剤プロファイリングは、脂質／コレステロール代謝を制御する主要経路である、ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路に関与する遺伝子の上方制御を示した。Ｈｈシグナル伝達に対するＳＣＡ－７４４の効果を研究するため、既知のＨｈアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、主要陰性制御因子ＩＮＳＧ１および転写制御因子ＳＲＥＢＦ２、ならびにまた、コレステロールのホメオスタシスに関与する遺伝子、例えばヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）、７－デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＤＨＣＲ７）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、およびＡＴＰ結合カセット輸送体（ＡＢＣＡ１）の活性／発現を測定する。
細胞培養におけるＲＮＡｓｅｑトランスクリプトーム薬剤プロファイリングは、脂質／コレステロール代謝を制御する主要経路である、ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路に関与する遺伝子の上方制御を示した。Ｈｈシグナル伝達に対するＳＣＡ－７４４の効果を研究するため、既知のＨｈアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、主要陰性制御因子ＩＮＳＧ１および転写制御因子ＳＲＥＢＦ２、ならびにまた、コレステロールのホメオスタシスに関与する遺伝子、例えばヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）、７－デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＤＨＣＲ７）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、およびＡＴＰ結合カセット輸送体（ＡＢＣＡ１）の活性／発現を測定する。
【0159】
ＳＣＡ－７４４およびコルチゾール誘導性遺伝子発現の比較
ＲＮＡｓｅｑトランスクリプトーム薬剤プロファイリングは、薬剤刺激に際しての遺伝子制御を研究するために適したツールである。示差遺伝子発現に基づく経路レベルでの類似性および相違を分析するため、ＳＣＡ－７４４およびコルチゾールの間の上述のインシリコアプローチによって予測される類似性および相違に基づいて、コルチゾールＲＮＡｓｅｑ薬剤トランスクリプトームを生成する。
ＲＮＡｓｅｑトランスクリプトーム薬剤プロファイリングは、薬剤刺激に際しての遺伝子制御を研究するために適したツールである。示差遺伝子発現に基づく経路レベルでの類似性および相違を分析するため、ＳＣＡ－７４４およびコルチゾールの間の上述のインシリコアプローチによって予測される類似性および相違に基づいて、コルチゾールＲＮＡｓｅｑ薬剤トランスクリプトームを生成する。
【0160】
ＢｉｏＭａｐＴＭ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ（Ｔｈ１炎症駆動性マクロファージ活性化、慢性炎症に関与するＢ細胞のＴ細胞依存性活性化）を用いて、ＳＣＡ－７４４の表現型プロファイリングを行って、ＳＣＡ－７４４の存在下での炎症促進性タンパク質バイオマーカーの変化を監視し、そしてコルチゾールで見られた変化と比較する。
【0161】
グルコース代謝：抗炎症性コルチコステロイドの主要な限界の１つは、その糖尿病誘発性副作用である。上述の知見は、ＳＣＡ－７４４およびコルチゾールの間に、グルコースレベルおよび転写レベルのインスリン代謝で、明らかな相違があることを示唆する。これらの相違は、より高い解像度で確認される。
【0162】
ｉ． ウェスタンブロッティングによって、コルチゾールに比較した、ＳＣＡ－７４４の存在下でのインスリンおよびサイトカインに反応した、Ａｋｔ１およびＩＲＳ１のリン酸化を研究し；そして
ｉｉ． 機能アッセイを行って、ハイスループットアッセイにおいて、高感度検出のために特に設計された蛍光グルコース類似体である２－ＮＢＤＧを用いて、グルコースの細胞取り込みを監視する。ＦＡＣＳおよびハイコンテンツ顕微鏡を用いて、ＳＣＡ－７４４およびコルチゾールの存在下での、インスリンに反応した２－ＮＢＤＧ取り込みの相違を定量化する。
ｉｉ． 機能アッセイを行って、ハイスループットアッセイにおいて、高感度検出のために特に設計された蛍光グルコース類似体である２－ＮＢＤＧを用いて、グルコースの細胞取り込みを監視する。ＦＡＣＳおよびハイコンテンツ顕微鏡を用いて、ＳＣＡ－７４４およびコルチゾールの存在下での、インスリンに反応した２－ＮＢＤＧ取り込みの相違を定量化する。
【0163】
実施例７． ヒト疾患関連モデルにおけるＳＣＡ－７４４の試験
乾癬
ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐ．は、乾癬に関するヒト皮膚同等（ＨＳＥ）３Ｄ組織モデルを開発している。該モデルは、乾癬患者由来の線維芽細胞および自社（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）サイトカイン混合物を用いて、乾癬を誘導する。このモデルを用いて、異なる用量で、炎症性サイトカイン反応を減少させる際のカリックスアレーンの有効性を評価することができる。潜在的に、該モデルには、免疫細胞を補充してもよい。
乾癬
ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐ．は、乾癬に関するヒト皮膚同等（ＨＳＥ）３Ｄ組織モデルを開発している。該モデルは、乾癬患者由来の線維芽細胞および自社（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）サイトカイン混合物を用いて、乾癬を誘導する。このモデルを用いて、異なる用量で、炎症性サイトカイン反応を減少させる際のカリックスアレーンの有効性を評価することができる。潜在的に、該モデルには、免疫細胞を補充してもよい。
【0164】
乾癬は、厳密にはヒト疾患であるが、該疾患に対する候補を試験するため、イミキモド（ＩＭＱ）誘導性乾癬モデルが成功裡に用いられてきている（Ｈｏｒｖａｔｈら； Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１９， ９， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：３６８５］）。ＩＭＱは、マウスにおいて、尋常性乾癬に似た炎症性皮膚病変を迅速に誘導する生得的ＴＬＲ７／８リガンドであり、そしてＩＬ－２３／ＩＬ－１７サイトカイン軸を通じて作用する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｆｉｔｓら； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００９， １８２， ｐｐ．５８３６－５８４）。このモデルを用いて、全身投与したカリックスアレーンの、臨床徴候および病変中で誘導される組織病理学的変化に対する有効性を評価し、同時に、皮膚サイトカイン反応における変化を監視してもよい。リード候補を、異なる用量で、全身投与および局所投与で試験する。
【0165】
関節炎：
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘導性慢性関節炎マウスモデルを使用して、カリックスアレーンが関節炎症を減少させる有効性を試験することができる（Ｈｏｒｖａｔｈら； Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２０１６； １８： ６．）。このモデルにおいて、関節炎は、ＣＦＡの足底内および反復皮下注射によって誘導される。カリックスアレーンを全身にまたは経口で毎日投与してもよい。臨床徴候（例えば踵浮腫）、局所炎症徴候（例えば血漿漏洩）、関節の組織病理的分析および関節中のサイトカインレベルを３週間監視する。
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘導性慢性関節炎マウスモデルを使用して、カリックスアレーンが関節炎症を減少させる有効性を試験することができる（Ｈｏｒｖａｔｈら； Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２０１６； １８： ６．）。このモデルにおいて、関節炎は、ＣＦＡの足底内および反復皮下注射によって誘導される。カリックスアレーンを全身にまたは経口で毎日投与してもよい。臨床徴候（例えば踵浮腫）、局所炎症徴候（例えば血漿漏洩）、関節の組織病理的分析および関節中のサイトカインレベルを３週間監視する。
【0166】
ラットにおけるコラーゲン誘導性関節リウマチモデルで、リード候補分子をさらに試験してもよい。ＣＦＡ関節炎とは異なり、このモデルでは、踵に制限されず、関節の一般的な炎症がある。ウシ・コラーゲンの２回の続く皮内注射によって、関節炎を誘導する。療法設定で（すなわち関節炎発展後）、全身でまたは経口のいずれかで、リード化合物を投与してもよい。陽性対照として、メトトレキセート（ＲＡに対して、クリニックで用いられる免疫抑制剤）を用いて、有効性を比較してもよい。炎症の臨床徴候（関節腫脹および非特異的臨床徴候）および生化学的パラメータを、処置動物およびプラセボ対照動物において評価してもよい。さらに、組織病理検査用に肢を保存してもよく、こうした検査は、他の読み取り値が、処置動物対対照動物の間で有意な相違を示さない場合にのみ行われる。
【0167】
喘息：
喘息患者は、健康な個体に比較して、改変された基底上皮サイトカインレベルを有することが示されてきている（Ｆｒｅｉｓｈｔａｔら； Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１， ４４， ｐｐ．８６３－８６９）。喘息患者由来の細胞を用いた３Ｄ上皮肺組織モデルによって、抗喘息化合物が正常サイトカインレベルを回復する際の有効性を試験することが可能になる。試験の読み取り値を、クリニックで用いられる抗炎症薬剤（コルチコステロイドおよびステロイド類似体）で検証し（Ｄａｍｓｋｅｒら； ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３， ８（５）：ｅ６３８７１）、そしてカリックスアレーンを試験する際の陽性対照として用いてもよい。マウスにおけるオボアルブミン（ＯＶＡ）誘導性肺炎症モデルを用いて、喘息に対するカリックスアレーンの有効性を評価してもよい（Ｅｌｅｋｅｓら； Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００８， ５７８， ｐｐ．３１３－３２２）。このモデルにおいて、動物をｉ．ｐ．投与ＯＶＡでプライミングした後、気道反応性亢進を鼻内投与ＯＶＡで誘導する。カリックスアレーン、プレドニゾンまたはビヒクルを、鼻内ＯＶＡ投与の１日前および投与全体で、マウスに全身投与する。全身プレチスモグラフによって気道反応性を評価し、そして肺中の炎症変化を、組織病理検査で検出する。異なる投与経路（例えば経口）、措置（予防、療法）および用量で、喘息に対して選択したリード候補を試験してもよい。
喘息患者は、健康な個体に比較して、改変された基底上皮サイトカインレベルを有することが示されてきている（Ｆｒｅｉｓｈｔａｔら； Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１， ４４， ｐｐ．８６３－８６９）。喘息患者由来の細胞を用いた３Ｄ上皮肺組織モデルによって、抗喘息化合物が正常サイトカインレベルを回復する際の有効性を試験することが可能になる。試験の読み取り値を、クリニックで用いられる抗炎症薬剤（コルチコステロイドおよびステロイド類似体）で検証し（Ｄａｍｓｋｅｒら； ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３， ８（５）：ｅ６３８７１）、そしてカリックスアレーンを試験する際の陽性対照として用いてもよい。マウスにおけるオボアルブミン（ＯＶＡ）誘導性肺炎症モデルを用いて、喘息に対するカリックスアレーンの有効性を評価してもよい（Ｅｌｅｋｅｓら； Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００８， ５７８， ｐｐ．３１３－３２２）。このモデルにおいて、動物をｉ．ｐ．投与ＯＶＡでプライミングした後、気道反応性亢進を鼻内投与ＯＶＡで誘導する。カリックスアレーン、プレドニゾンまたはビヒクルを、鼻内ＯＶＡ投与の１日前および投与全体で、マウスに全身投与する。全身プレチスモグラフによって気道反応性を評価し、そして肺中の炎症変化を、組織病理検査で検出する。異なる投与経路（例えば経口）、措置（予防、療法）および用量で、喘息に対して選択したリード候補を試験してもよい。
【0168】
ステロイド様副作用研究：
コルチコステロイドの長期使用は、しばしば、有効性ばかりでなく使用すらも制限する、重度の副作用と関連する。こうした副作用は、急性および慢性のインスリン耐性増加（最終的には糖尿病につながる）、骨代謝減少（骨脱ミネラル化および骨折または小児における成長遅延につながる）、抑うつおよび免疫抑制である。免疫毒性および成長関連副作用は、若年マウスを長期間ステロイドで処置する（１５週モデル）と検出されうる。カリックスアレーンをこの長期投与モデルにおいて試験し、そしてデキサメタゾンのものと、成長遅延（全体長および脛骨長）および免疫毒性（脾臓サイズ）副作用を比較してもよい。
コルチコステロイドの長期使用は、しばしば、有効性ばかりでなく使用すらも制限する、重度の副作用と関連する。こうした副作用は、急性および慢性のインスリン耐性増加（最終的には糖尿病につながる）、骨代謝減少（骨脱ミネラル化および骨折または小児における成長遅延につながる）、抑うつおよび免疫抑制である。免疫毒性および成長関連副作用は、若年マウスを長期間ステロイドで処置する（１５週モデル）と検出されうる。カリックスアレーンをこの長期投与モデルにおいて試験し、そしてデキサメタゾンのものと、成長遅延（全体長および脛骨長）および免疫毒性（脾臓サイズ）副作用を比較してもよい。
【0169】
ヘパラン硫酸模倣活性
１． ＮＭＲ：ＮＭＲ分光法を用いて、ＨＳ結合タンパク質オステオポンチン（ＯＰＮ）との物理的相互作用を測定して、相互作用を直接探査し、そしてタンパク質中の相互作用部位の位置をマッピングする。１５Ｎ標識ＯＰＮを用い、ここで、個々の残基位を、いわゆる１５Ｎ－１Ｈ異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）分光法によって直接監視し、ここで、二次元（２Ｄ）周波数スペクトルの個々の交差ピークは、タンパク質の個々の残基位（アミノ酸）に対応する。リガンド結合は、結合部位に位置する残基の化学環境を変化させ、そしてＨＳＱＣスペクトルの変化を導く。リガンド不含およびリガンド結合ＨＳＱＣスペクトルを比較すると、ＯＰＮへのＳＣＡ－７４４結合の明確な証明が提供される。最大化学シフト変化を示す残基は、典型的には、結合界面の一部である。重複結合部位は、結合に関する競合の指標である。
１． ＮＭＲ：ＮＭＲ分光法を用いて、ＨＳ結合タンパク質オステオポンチン（ＯＰＮ）との物理的相互作用を測定して、相互作用を直接探査し、そしてタンパク質中の相互作用部位の位置をマッピングする。１５Ｎ標識ＯＰＮを用い、ここで、個々の残基位を、いわゆる１５Ｎ－１Ｈ異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）分光法によって直接監視し、ここで、二次元（２Ｄ）周波数スペクトルの個々の交差ピークは、タンパク質の個々の残基位（アミノ酸）に対応する。リガンド結合は、結合部位に位置する残基の化学環境を変化させ、そしてＨＳＱＣスペクトルの変化を導く。リガンド不含およびリガンド結合ＨＳＱＣスペクトルを比較すると、ＯＰＮへのＳＣＡ－７４４結合の明確な証明が提供される。最大化学シフト変化を示す残基は、典型的には、結合界面の一部である。重複結合部位は、結合に関する競合の指標である。
【0170】
２． Ｂｉａｃｏｒｅまたはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）－例：オステオポンチンまたは他のＨＳ結合タンパク質をセンサーチップ上にコーティングし（例えば、ストレプトアビジンコーティングチップ上で、ビオチン標識組換えタンパク質を用いる）、ＨＳへの結合は容易に検出され、ＳＣＡ－７４４の添加は、結合シグナルを減少させるかまたは除去すると予期される。
【0171】
３． アフィニティクロマトグラフィ－例：オステオポンチンまたは他のＨＳ結合タンパク質をクロマトグラフィマトリックス上に固定し（例えばストレプトアビジンコーティングクロマトグラフィビーズのビオチン標識タンパク質）、ＨＳを添加し、カラムを洗浄した後、カラムからのＳＣＡ－７４４によるＨＳ溶出を検出する。
【0172】
実施例８： ＳＣＡ－７４４は、急性肺炎症のネズミモデルにおいて、顕著な抗炎症効果を有する
方法：
８～１２週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを４群（５～７動物／群）の実験で用いた：１）ＰＢＳ－陰性対照群、２）ＬＳのみ、３）ＬＰＳ＋ＳＣＡ－７４４および４）ＬＰＳ＋デキサメタゾン。
方法：
８～１２週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを４群（５～７動物／群）の実験で用いた：１）ＰＢＳ－陰性対照群、２）ＬＳのみ、３）ＬＰＳ＋ＳＣＡ－７４４および４）ＬＰＳ＋デキサメタゾン。
【0173】
エンドトキシン（リポ多糖：ＬＰＳ）誘導性急性肺炎症モデル
ケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ ｉｐ．；Ｃａｌｙｐｓｏｌ、Ｇｅｄｅｏｎ Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｐｌｃ．、ハンガリー・ブダペスト）およびキシラジン（６ｍｇ／ｋｇ ｉｐ．；Ｓｅｄａｘｙｌａｎ、Ｅｕｒｏｖｅｔ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｂ．Ｖ．、オランダ・ブラーデル）麻酔下、６０μｌの無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した１００μｇ ＬＰＳ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１１１：Ｂ４；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）の気管内投与によって、急性肺炎症を誘導した。投与２４時間後、呼吸機能パラメータを評価し、そして組織病理学的評価のため、肺試料を採取した。
ケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ ｉｐ．；Ｃａｌｙｐｓｏｌ、Ｇｅｄｅｏｎ Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｐｌｃ．、ハンガリー・ブダペスト）およびキシラジン（６ｍｇ／ｋｇ ｉｐ．；Ｓｅｄａｘｙｌａｎ、Ｅｕｒｏｖｅｔ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｂ．Ｖ．、オランダ・ブラーデル）麻酔下、６０μｌの無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した１００μｇ ＬＰＳ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１１１：Ｂ４；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）の気管内投与によって、急性肺炎症を誘導した。投与２４時間後、呼吸機能パラメータを評価し、そして組織病理学的評価のため、肺試料を採取した。
【0174】
処置および実験設計
ＳＣＡ－７４４（６０ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクルを、ＬＰＳの気管内投与の２４時間前、１２時間前、２０分前、および１２時間後に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。長期作用ステロイド・デキサメタゾン（５ｍｇ／ｋｇ；排除Ｔ１／２：３６～５４時間）をＬＰＳ処置の２４時間前および２０分前に、ｉｐ．投与した。ＬＰＳ投与の２４時間後、呼吸機能測定を行った。
ＳＣＡ－７４４（６０ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクルを、ＬＰＳの気管内投与の２４時間前、１２時間前、２０分前、および１２時間後に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。長期作用ステロイド・デキサメタゾン（５ｍｇ／ｋｇ；排除Ｔ１／２：３６～５４時間）をＬＰＳ処置の２４時間前および２０分前に、ｉｐ．投与した。ＬＰＳ投与の２４時間後、呼吸機能測定を行った。
【0175】
呼吸機能測定
Ｂｕｘｃｏ ＦｉｎｅＰｏｉｎｔ非侵襲性気道力学（ＮＡＭ）二重チャンバープレチスモグラフィ（ＤＳＩ Ｈａｒｖａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を用いて、麻酔を使用せず、覚醒した拘束動物において、換気および気管支収縮パラメータを監視した。プレチスモグラフは、鼻および胸部流を独立に測定する。第－２日（－４２時間）および－１日（－１８時間）に、２ｘ２０分間、動物を順化した後、ＬＰＳ投与の２４時間後に、プレチスモグラフィチャンバーに動物を入れた。１０分間の馴化期間後、頻度、１回換気量、分時換気量、呼気／吸気時間、ピーク呼気／吸気流、および気管支収縮の測定値である特異的気道耐性などの、ベースライン肺機能を評価した。
Ｂｕｘｃｏ ＦｉｎｅＰｏｉｎｔ非侵襲性気道力学（ＮＡＭ）二重チャンバープレチスモグラフィ（ＤＳＩ Ｈａｒｖａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を用いて、麻酔を使用せず、覚醒した拘束動物において、換気および気管支収縮パラメータを監視した。プレチスモグラフは、鼻および胸部流を独立に測定する。第－２日（－４２時間）および－１日（－１８時間）に、２ｘ２０分間、動物を順化した後、ＬＰＳ投与の２４時間後に、プレチスモグラフィチャンバーに動物を入れた。１０分間の馴化期間後、頻度、１回換気量、分時換気量、呼気／吸気時間、ピーク呼気／吸気流、および気管支収縮の測定値である特異的気道耐性などの、ベースライン肺機能を評価した。
【0176】
終結、組織採取
呼吸機能評価後、動物を麻酔し、そして組織病理学的評価のため、その肺を採取した。
組織病理学的評価
切除した肺組織試料をホルマリン固定し（６％）、そしてパラフィン中に包埋し、５μｍ切片を切り、そして組織学的分析のため、ヘマトキシリン－エオジンで染色した。各動物由来の肺の３つの深度からの２つの視野中、０～３の範囲の半定量的スケールで、血管周囲／気管支周囲浮腫、好中球、マクロファージおよびリンパ球炎症細胞浸潤、ならびに杯細胞異形成を評価するため、気道炎症評価をブラインド方式で行った。
呼吸機能評価後、動物を麻酔し、そして組織病理学的評価のため、その肺を採取した。
組織病理学的評価
切除した肺組織試料をホルマリン固定し（６％）、そしてパラフィン中に包埋し、５μｍ切片を切り、そして組織学的分析のため、ヘマトキシリン－エオジンで染色した。各動物由来の肺の３つの深度からの２つの視野中、０～３の範囲の半定量的スケールで、血管周囲／気管支周囲浮腫、好中球、マクロファージおよびリンパ球炎症細胞浸潤、ならびに杯細胞異形成を評価するため、気道炎症評価をブラインド方式で行った。
【0177】
結果：
ＬＰＳで処置したマウスは、有意に改変された呼吸機能、例えば呼吸速度（分あたりの呼吸数、（ｆ）ＢＰＭ）増加、機能的残気量（ＦＲＣ）増加、呼気時間（Ｔｅ）減少、Ｔｅに対するＰＥＦ（Ｒｐｅｆ）の増加、鼻および胸部呼吸の間の時間（Ｋａｔａからのより正確な説明を加える）増加を有した。ＳＣＡ－７４４を投与された動物において、対照動物（ＬＰＳで処置しない）において測定したものと比較して、ＬＰＳ処置は、これらのパラメータに統計的に有意な改変を誘導しなかった（図１１）。デキサメタゾンでの処置は、いくつかの陽性効果を有するが、パラメータは、対照動物に比較して、なお有意に改変された。
ＬＰＳで処置したマウスは、有意に改変された呼吸機能、例えば呼吸速度（分あたりの呼吸数、（ｆ）ＢＰＭ）増加、機能的残気量（ＦＲＣ）増加、呼気時間（Ｔｅ）減少、Ｔｅに対するＰＥＦ（Ｒｐｅｆ）の増加、鼻および胸部呼吸の間の時間（Ｋａｔａからのより正確な説明を加える）増加を有した。ＳＣＡ－７４４を投与された動物において、対照動物（ＬＰＳで処置しない）において測定したものと比較して、ＬＰＳ処置は、これらのパラメータに統計的に有意な改変を誘導しなかった（図１１）。デキサメタゾンでの処置は、いくつかの陽性効果を有するが、パラメータは、対照動物に比較して、なお有意に改変された。
【0178】
組織の組織学的検査は、ＳＣＡ－７４４処置が、血管周囲浮腫、ならびに好中球およびマクロファージによる血管周囲／気管支周囲浸潤を防止するかまたは非常に減少させることを明らかにした（図１２）。染色した組織の半定量的分析によって、ＳＣＡ－７４４処置肺試料は、３つのパラメータおよび複合病理スコアのいずれにおいても、未処置対照とは統計的に有意に異ならず、一方、ＬＰＳ＋ビヒクル処置試料は未処置対照と有意に異なり、ＳＣＡ－７４４が炎症関連改変を防止することが立証された（図１３）。デキサメタゾン処置群において、これらの炎症パラメータは減少する傾向があったが、顆粒球数減少を例外として、統計的有意性には到達しなかった。
【0179】
実施例９： 慢性関節炎マウスモデルにおける、ＳＣＡ－７４４の有益な効果
方法
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘導性慢性関節炎モデル
２０μｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、パラフィンオイル中に懸濁された熱殺菌マイコバクテリウム、１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を右後足内に足底内（ｉ．ｐｌ．）注射し、そして２０μｌを尾の付け根に皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって、慢性関節炎を誘導した。全身効果を増強してヒトの状態を模倣するため、さらなるｓ．ｃ．注射（２０μｌ）を翌日（第１日）、尾の付け根に投与した。
方法
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘導性慢性関節炎モデル
２０μｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、パラフィンオイル中に懸濁された熱殺菌マイコバクテリウム、１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を右後足内に足底内（ｉ．ｐｌ．）注射し、そして２０μｌを尾の付け根に皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって、慢性関節炎を誘導した。全身効果を増強してヒトの状態を模倣するため、さらなるｓ．ｃ．注射（２０μｌ）を翌日（第１日）、尾の付け根に投与した。
【0180】
処置および実験設計
ＳＣＡ－７４４（６０ｍｇ／ｋｇ）または参照化合物デキサメタゾン（６０ｍｇ／ｋｇ）、ならびにＳＣＡ－７４４のビヒクルを、ＣＦＡ投与直前の第０日に始まって、そして２１日間の実験期間全体で、毎日、ｉ．ｐ．注射した。
ＳＣＡ－７４４（６０ｍｇ／ｋｇ）または参照化合物デキサメタゾン（６０ｍｇ／ｋｇ）、ならびにＳＣＡ－７４４のビヒクルを、ＣＦＡ投与直前の第０日に始まって、そして２１日間の実験期間全体で、毎日、ｉ．ｐ．注射した。
【0181】
後足の機械侵害受容的（ｍｅｃｈａｎｏｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ）閾値の測定
力学的足底知覚計（ＤＰＡ、Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ ３７４００、イタリア・コメーリオ）を後足の足底表面の機械的感受性の評価に用いた。マウスをワイヤグリッド床のプレキシガラスの箱に入れ、次いで、順化後、動物が足を引っ込めるまで、増加する上方への力（４ｓ以内に到達する１０ｇが最大力）で持ち上げて、まっすぐな金属フィラメントを足底表面に触れさせた。機械的感受性過敏を、最初の（ＣＦＡ投与前の）引っ込め閾値の減少パーセントとして表す。
力学的足底知覚計（ＤＰＡ、Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ ３７４００、イタリア・コメーリオ）を後足の足底表面の機械的感受性の評価に用いた。マウスをワイヤグリッド床のプレキシガラスの箱に入れ、次いで、順化後、動物が足を引っ込めるまで、増加する上方への力（４ｓ以内に到達する１０ｇが最大力）で持ち上げて、まっすぐな金属フィラメントを足底表面に触れさせた。機械的感受性過敏を、最初の（ＣＦＡ投与前の）引っ込め閾値の減少パーセントとして表す。
【0182】
足体積の測定
体積測定法（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅプレチスモメーター７１４０、イタリア・コメーリオ）によって足体積を決定し、そして立方センチメートル（ｃｍ３）で表し、次いで浮腫を最初の体積の増加パーセントとして表す。
体積測定法（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅプレチスモメーター７１４０、イタリア・コメーリオ）によって足体積を決定し、そして立方センチメートル（ｃｍ３）で表し、次いで浮腫を最初の体積の増加パーセントとして表す。
【0183】
好中球ミエロペルオキシダーゼ活性のｉｎ ｖｉｖｏ生物発光画像化
好中球ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）由来反応性酸素種（ＲＯＳ）産生および酵素活性を、ルミノール由来生物発光で評価した。無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、３０ｍｇ／ｍＬ）に溶解したルミノール（５－アミノ－２，３－ジヒドロ－１，４－フタラジン－ジオン）ナトリウム塩（１５０ｍｇ／ｋｇ、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国ミズーリ州オリベット）を、麻酔したマウスにｉ．ｐ．注射する。ケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ ｉｐ．；Ｃａｌｙｐｓｏｌ、Ｇｅｄｅｏｎ Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｐｌｃ．、ハンガリー・ブダペスト）およびキシラジン（６ｍｇ／ｋｇ ｉｐ．；Ｓｅｄａｘｙｌａｎ、Ｅｕｒｏｖｅｔ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｂ．Ｖ．、オランダ・ブラーデル）でマウスを麻酔した。ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国ウォルサム；１２０ｓ獲得、ビニング＝８、Ｆ／Ｓｔｏｐ＝１）を用いて、注射１０分後に生物発光画像化を行った。同一関心領域（ＲＯＩ）を踵の周囲に適用し、そして発光を総放射輝度（総光子束／ｓ）として表した。
好中球ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）由来反応性酸素種（ＲＯＳ）産生および酵素活性を、ルミノール由来生物発光で評価した。無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、３０ｍｇ／ｍＬ）に溶解したルミノール（５－アミノ－２，３－ジヒドロ－１，４－フタラジン－ジオン）ナトリウム塩（１５０ｍｇ／ｋｇ、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国ミズーリ州オリベット）を、麻酔したマウスにｉ．ｐ．注射する。ケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ ｉｐ．；Ｃａｌｙｐｓｏｌ、Ｇｅｄｅｏｎ Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｐｌｃ．、ハンガリー・ブダペスト）およびキシラジン（６ｍｇ／ｋｇ ｉｐ．；Ｓｅｄａｘｙｌａｎ、Ｅｕｒｏｖｅｔ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｂ．Ｖ．、オランダ・ブラーデル）でマウスを麻酔した。ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国ウォルサム；１２０ｓ獲得、ビニング＝８、Ｆ／Ｓｔｏｐ＝１）を用いて、注射１０分後に生物発光画像化を行った。同一関心領域（ＲＯＩ）を踵の周囲に適用し、そして発光を総放射輝度（総光子束／ｓ）として表した。
【0184】
組織学
切除した脛骨足根骨関節を４％緩衝ホルムアルデヒド中で固定し、脱灰し、そしてパラフィン包埋して、切片（５μｍ）にスライスし、そしてヘマトキシリンおよびエオジンで染色する。１）乳輪組織内への単核細胞浸潤、２）滑膜過形成、３）軟骨破壊、４）骨侵食にしたがって、０～３のスケールを用いて、ブラインド化された観察者によって、関節炎変化をスコア化する。
切除した脛骨足根骨関節を４％緩衝ホルムアルデヒド中で固定し、脱灰し、そしてパラフィン包埋して、切片（５μｍ）にスライスし、そしてヘマトキシリンおよびエオジンで染色する。１）乳輪組織内への単核細胞浸潤、２）滑膜過形成、３）軟骨破壊、４）骨侵食にしたがって、０～３のスケールを用いて、ブラインド化された観察者によって、関節炎変化をスコア化する。
【0185】
結果：
足領域中のＣＦＡ誘導性炎症の効果を踵関節中で検出することができ、そして骨侵食、軟骨破壊、滑膜過形成および単核細胞浸潤として表す（図１４Ａ）。関節炎症プロセスの初期段階では、滑膜過形成が有意な知見である。ＣＦＡ注射によって増加する滑膜過形成スコアは、同時にＳＣＡ－７４４で処置したマウスにおいて有意により低く、そしてこの効果は、デキサメタゾン処置に際して観察されるものに匹敵した（図１４Ｂ）。
足領域中のＣＦＡ誘導性炎症の効果を踵関節中で検出することができ、そして骨侵食、軟骨破壊、滑膜過形成および単核細胞浸潤として表す（図１４Ａ）。関節炎症プロセスの初期段階では、滑膜過形成が有意な知見である。ＣＦＡ注射によって増加する滑膜過形成スコアは、同時にＳＣＡ－７４４で処置したマウスにおいて有意により低く、そしてこの効果は、デキサメタゾン処置に際して観察されるものに匹敵した（図１４Ｂ）。
【0186】
これらのデータは、ＳＣＡ－７４４が、関節炎治療において一般的に用いられる薬剤であるデキサメタゾンと同様に、滑膜組織病理の防止を導く有益な効果を有することを示唆する。
【0187】
実施例１０． 例示的化合物の合成経路
カリックスアレーンの化学合成は、３＋１フラグメント縮合戦略に基づき、そしてよく確立された化学合成法にしたがう（Ｇｕｔｓｃｈｅ， ＣＤ Ｃａｌｉｘａｒｅｎｅｓ Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ ｉｎ “Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ｉｎ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， Ｓｔｏｄｄａｒｄ， ＦＪ監修， Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （ｐｇ－３８－４７））。三環系を含有するフラグメントは、メチレン（－ＣＨ２－）リンカーを通じて連結された－ＯＨおよびｔ－ブチル置換基を所持する。末端（隣接）芳香環は、単一フラグメントへのカップリング反応に用いられる反応基を含有する。単一フラグメントは、一般式に記載される多様な置換または非置換アリール（ヘテロアリールも）系、ならびに三環フラグメントにカップリングするための２つの反応性官能基を含む。例えば、－ＣＨ２－Ｂｒは、２５～３０％収率でカリックス［４］アレーンを生じる、カップリング反応の効率的な官能基と記載されてきている（ＴｉＣｌ４、ジオキサン、８０～１２０時間環流）（Ｇｕｔｓｃｈｅ， ＣＤ Ｃａｌｉｘａｒｅｎｅｓ Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ ｉｎ “Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ｉｎ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， Ｓｔｏｄｄａｒｄ， ＦＪ監修， Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ｐｇ－３８－４７)）。
カリックスアレーンの化学合成は、３＋１フラグメント縮合戦略に基づき、そしてよく確立された化学合成法にしたがう（Ｇｕｔｓｃｈｅ， ＣＤ Ｃａｌｉｘａｒｅｎｅｓ Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ ｉｎ “Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ｉｎ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， Ｓｔｏｄｄａｒｄ， ＦＪ監修， Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （ｐｇ－３８－４７））。三環系を含有するフラグメントは、メチレン（－ＣＨ２－）リンカーを通じて連結された－ＯＨおよびｔ－ブチル置換基を所持する。末端（隣接）芳香環は、単一フラグメントへのカップリング反応に用いられる反応基を含有する。単一フラグメントは、一般式に記載される多様な置換または非置換アリール（ヘテロアリールも）系、ならびに三環フラグメントにカップリングするための２つの反応性官能基を含む。例えば、－ＣＨ２－Ｂｒは、２５～３０％収率でカリックス［４］アレーンを生じる、カップリング反応の効率的な官能基と記載されてきている（ＴｉＣｌ４、ジオキサン、８０～１２０時間環流）（Ｇｕｔｓｃｈｅ， ＣＤ Ｃａｌｉｘａｒｅｎｅｓ Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ ｉｎ “Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ｉｎ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， Ｓｔｏｄｄａｒｄ， ＦＪ監修， Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ｐｇ－３８－４７)）。
【0188】
カリックスアレーン化合物の合成（図１５）
２，６－ビス（ヒドロキシメチル）－４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノール２ １
水性ＮａＯＨ溶液（２７ｍＬ Ｈ２Ｏ中の２．７ｇ）を４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノール１（１０ｇ）に添加した。水性ホルムアルデヒド溶液（３３％；１０ｍＬ）を添加した後、アルゴン大気下、４０℃で３日間、混合物を攪拌した。鹹水（１００ｍＬ）を添加した後、沈殿したナトリウム塩をろ過し、そして鹹水（３０ｍＬ）で洗浄した。次いで、この固形物を３５ｍＬの水に再溶解して、そして希ＨＣｌ（１Ｍ）を用いて、生じた溶液をｐＨ＝１に酸性化した。次いで、混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ３０ｍＬ）で抽出し、そして合わせた有機相を、続いて水（５０ｍＬ）で洗浄し、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の蒸発は、油性残渣を生じ、この残渣を、溶出剤としてヘプタンおよび酢酸エチル（４：３）の混合物を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィを通じて精製した。産物含有分画を、ＵＶランプ下、ＴＬＣ上で同定した。産物分画を合わせ、そして溶媒を蒸発させて、白色固体としての３．４ｇの化合物２を得た。
２，６－ビス（ヒドロキシメチル）－４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノール２ １
水性ＮａＯＨ溶液（２７ｍＬ Ｈ２Ｏ中の２．７ｇ）を４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノール１（１０ｇ）に添加した。水性ホルムアルデヒド溶液（３３％；１０ｍＬ）を添加した後、アルゴン大気下、４０℃で３日間、混合物を攪拌した。鹹水（１００ｍＬ）を添加した後、沈殿したナトリウム塩をろ過し、そして鹹水（３０ｍＬ）で洗浄した。次いで、この固形物を３５ｍＬの水に再溶解して、そして希ＨＣｌ（１Ｍ）を用いて、生じた溶液をｐＨ＝１に酸性化した。次いで、混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ３０ｍＬ）で抽出し、そして合わせた有機相を、続いて水（５０ｍＬ）で洗浄し、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の蒸発は、油性残渣を生じ、この残渣を、溶出剤としてヘプタンおよび酢酸エチル（４：３）の混合物を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィを通じて精製した。産物含有分画を、ＵＶランプ下、ＴＬＣ上で同定した。産物分画を合わせ、そして溶媒を蒸発させて、白色固体としての３．４ｇの化合物２を得た。
【0189】
【化6】
【0190】
２，６－ビス（２－ヒドロキシ－５－ｔｅｒｔ－ブチルベンジル）－４－ｔｅｒｔ－ブチル－フェノール３
２
４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノール１（２．８ｇ）および２，６－ビス（ヒドロキシメチル）－４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノール２（０．５ｇ）の混合物を、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（１２ｍｇ）の存在下、乾燥トルエン（１０ｍＬ）中、１４０℃油槽温度で一晩攪拌した。反応混合物を室温にし、そして減圧下でトルエンを除去した。残渣油を、少量のアセトン中に再溶解し、そして溶液が濁るまで、ヘプタンを添加した。この混合物を冷蔵庫中で保存する間に産物は沈殿した。化合物３を濾過によって単離し、ヘプタンで洗浄し、そして真空中で乾燥させて、４１５ｍｇを得た。
４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノール１（２．８ｇ）および２，６－ビス（ヒドロキシメチル）－４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノール２（０．５ｇ）の混合物を、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（１２ｍｇ）の存在下、乾燥トルエン（１０ｍＬ）中、１４０℃油槽温度で一晩攪拌した。反応混合物を室温にし、そして減圧下でトルエンを除去した。残渣油を、少量のアセトン中に再溶解し、そして溶液が濁るまで、ヘプタンを添加した。この混合物を冷蔵庫中で保存する間に産物は沈殿した。化合物３を濾過によって単離し、ヘプタンで洗浄し、そして真空中で乾燥させて、４１５ｍｇを得た。
【0191】
【化7】
【0192】
２，６－ビス（ブロモメチル）－４－メチルフェノール５
３
パラホルムアルデヒド（１．６９ｇ）をＨＢｒ／酢酸（３３％、１５ｍＬ）中に溶解した。この混合物を氷槽中で冷却した後、滴下漏斗を用いて、クレゾール４（２．７ｇ）を１滴ずつ添加した。０℃でさらに１時間、そして次いで、室温で１．５時間、攪拌を続けた。氷／水混合物内に混合物を注ぎ、そしてＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。減圧下での溶媒の蒸発は、油性残渣を生じ、これを再び、少量のＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。ヘプタンを添加することによって産物の沈殿を誘発し、そして混合物を４℃で保存することによって沈殿を完了させた。固体産物をろ過し、そして真空中で乾燥させて、１．１１ｇの化合物５を得た。
パラホルムアルデヒド（１．６９ｇ）をＨＢｒ／酢酸（３３％、１５ｍＬ）中に溶解した。この混合物を氷槽中で冷却した後、滴下漏斗を用いて、クレゾール４（２．７ｇ）を１滴ずつ添加した。０℃でさらに１時間、そして次いで、室温で１．５時間、攪拌を続けた。氷／水混合物内に混合物を注ぎ、そしてＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。減圧下での溶媒の蒸発は、油性残渣を生じ、これを再び、少量のＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。ヘプタンを添加することによって産物の沈殿を誘発し、そして混合物を４℃で保存することによって沈殿を完了させた。固体産物をろ過し、そして真空中で乾燥させて、１．１１ｇの化合物５を得た。
【0193】
【化8】
【0194】
シクロ－（２－ヒドロキシ－５－メチル－１，３－フェニレン）メチレン－トリス［（２－ヒドロキシ－５－ｔｅｒｔ－ブチル－１，３－フェニレン）メチレン］６
３
２，６－ビス（ブロモメチル）－４－メチルフェノール５（１．５ｇ）および２，６－ビス（２－ヒドロキシ－５－ｔｅｒｔ－ブチルベンジル）－４－ｔｅｒｔ－ブチル－フェノール３（２．３７ｇ）を酢酸（３００ｍＬ）中に溶解し、そして滴下漏斗を用い、１１８℃の温度、６時間以内で、酢酸（３００ｍＬ）にゆっくりと添加した。混合物を同じ温度でさらに４８時間攪拌した後、減圧下で溶媒を除去した。２つの連続シリカゲルクロマトグラフィカラム（溶出剤：ヘプタン／酢酸エチル（４：６）およびヘプタン／トルエン（３：１））を用いて残渣を精製した。ＫＭｎＯ４染色を用いて産物含有分画を同定し、そして真空中で蒸発させて４００ｍｇの産物６を得た。
２，６－ビス（ブロモメチル）－４－メチルフェノール５（１．５ｇ）および２，６－ビス（２－ヒドロキシ－５－ｔｅｒｔ－ブチルベンジル）－４－ｔｅｒｔ－ブチル－フェノール３（２．３７ｇ）を酢酸（３００ｍＬ）中に溶解し、そして滴下漏斗を用い、１１８℃の温度、６時間以内で、酢酸（３００ｍＬ）にゆっくりと添加した。混合物を同じ温度でさらに４８時間攪拌した後、減圧下で溶媒を除去した。２つの連続シリカゲルクロマトグラフィカラム（溶出剤：ヘプタン／酢酸エチル（４：６）およびヘプタン／トルエン（３：１））を用いて残渣を精製した。ＫＭｎＯ４染色を用いて産物含有分画を同定し、そして真空中で蒸発させて４００ｍｇの産物６を得た。
【0195】
【化9】
【0196】
シクロー（２－ヒドロキシ－５－メチル－１，３－フェニレン）メチレン－トリス［（フェニレン）メチレン］７
化合物６（２４８ｍｇ）、フェノール（２２０ｍｇ）およびＡｌＣｌ３（４００ｍｇ）の混合物を、乾燥トルエン（６ｍＬ）中に溶解し、そしてアルゴン大気下、６０℃で５時間攪拌した。反応を室温にし、そして３％ＨＣｌ（５ｍＬ）を添加した後、攪拌を３０分間続けた。溶液をトルエン（３ｘ３０ｍＬ）で抽出し、そして合わせたトルエン相をＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空中で蒸発させ、そして油性残渣にメタノール（２ｍＬ）を添加することによって、産物を沈殿させた。生じた固体を濾過して、そしてＣＨ２Ｃｌ２およびメタノールの混合物から再結晶化した。該反応は、白色固体として化合物７の８０ｍｇを生じた。
化合物６（２４８ｍｇ）、フェノール（２２０ｍｇ）およびＡｌＣｌ３（４００ｍｇ）の混合物を、乾燥トルエン（６ｍＬ）中に溶解し、そしてアルゴン大気下、６０℃で５時間攪拌した。反応を室温にし、そして３％ＨＣｌ（５ｍＬ）を添加した後、攪拌を３０分間続けた。溶液をトルエン（３ｘ３０ｍＬ）で抽出し、そして合わせたトルエン相をＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空中で蒸発させ、そして油性残渣にメタノール（２ｍＬ）を添加することによって、産物を沈殿させた。生じた固体を濾過して、そしてＣＨ２Ｃｌ２およびメタノールの混合物から再結晶化した。該反応は、白色固体として化合物７の８０ｍｇを生じた。
【0197】
【化10】
【0198】
シクロ－（２－ヒドロキシ－５－メチル－１，３－フェニレン）メチレン－トリス［（２－ヒドロキシ－５－スルホナト－１，３－フェニレン）メチレン］８
化合物７（８０ｍｇ）を濃硫酸（０．７ｍＬ）中に溶解し、そして８０℃で４時間攪拌した。熱い溶液を氷槽中の２．５ｍＬの水に一滴ずつ添加した。次いで、鹹水（２．５ｍＬ）を添加し、そして混合物を加熱して、１０分間還流した。減圧下で溶媒を除去し、そして残渣固体にメタノール（１０ｍＬ）を添加した。この不均一な混合物を超音波槽中で３分間照射し、次いで２５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、そして上清を分離した。メタノール添加、超音波処理および遠心分離の同じ処置をさらに２回反復した。合わせた上清から溶媒を蒸発させ、白色固体化合物として、１００ｍｇの化合物８を得た。
化合物７（８０ｍｇ）を濃硫酸（０．７ｍＬ）中に溶解し、そして８０℃で４時間攪拌した。熱い溶液を氷槽中の２．５ｍＬの水に一滴ずつ添加した。次いで、鹹水（２．５ｍＬ）を添加し、そして混合物を加熱して、１０分間還流した。減圧下で溶媒を除去し、そして残渣固体にメタノール（１０ｍＬ）を添加した。この不均一な混合物を超音波槽中で３分間照射し、次いで２５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、そして上清を分離した。メタノール添加、超音波処理および遠心分離の同じ処置をさらに２回反復した。合わせた上清から溶媒を蒸発させ、白色固体化合物として、１００ｍｇの化合物８を得た。
【0199】
【化11】
【0200】
参考文献：
【0201】
【化12】
【0202】
分析
化学合成の成功結果を、生じたスルホカリックスアレーン誘導体のＮＭＲおよび質量分析によってチェックした。ＮＭＲ分光分析は、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ分光法に頼った。個々のプロトンの化学シフトをテキスト中に列挙する。陰性および陽性イオンモードの両方で、質量分析実験を得た。期待される分子式、Ｃ２９Ｈ２６Ｏ１３Ｓ３に基づいて、６７８，０５３６ダルトンの正確な質量が予期されるはずである。
化学合成の成功結果を、生じたスルホカリックスアレーン誘導体のＮＭＲおよび質量分析によってチェックした。ＮＭＲ分光分析は、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ分光法に頼った。個々のプロトンの化学シフトをテキスト中に列挙する。陰性および陽性イオンモードの両方で、質量分析実験を得た。期待される分子式、Ｃ２９Ｈ２６Ｏ１３Ｓ３に基づいて、６７８，０５３６ダルトンの正確な質量が予期されるはずである。
【0203】
スルホカリックスアレーン変異体ＳＣＡ－７５４に関して質量分析結果を得て、陰性および陽性イオンモードスペクトルの両方を示し、そしてｍ／ｚピークを計算した。陰性イオンモードでは、単一のナトリウム付加物のみが観察される一方、陽性モードでは、４つの付加物フラグメントが解像可能であった。実験ＭＳデータによって、化合物の化学的同一性が明らかに示され、そして望ましい変異体分子の完成が成功したことが明確に立証された。
【0204】
質量スペクトル
【0205】
【化13】
【0206】
実施例１１ ＳＣＡ－７４４の代謝分析
ヒト神経芽細胞腫細胞の代謝プロファイリング
ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を分化させ、そして５００μＭ ＳＣＡ－７４４で２４時間処理した。ＭｅＯＨ：ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ（２：２：１、ｖ／ｖ）溶媒混合物を用いて、細胞ペレットを抽出した。高分解度質量分析を使用して、ＶＢＣＦメタボロミック装置（ｗｗｗ．ｖｂｃｆ．ａｃ．ａｔ）で、非ターゲティング代謝プロファイリングを行った。
ヒト神経芽細胞腫細胞の代謝プロファイリング
ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を分化させ、そして５００μＭ ＳＣＡ－７４４で２４時間処理した。ＭｅＯＨ：ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ（２：２：１、ｖ／ｖ）溶媒混合物を用いて、細胞ペレットを抽出した。高分解度質量分析を使用して、ＶＢＣＦメタボロミック装置（ｗｗｗ．ｖｂｃｆ．ａｃ．ａｔ）で、非ターゲティング代謝プロファイリングを行った。
【0207】
重要な代謝物の同定
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒソフトウェア（バージョン３．１）で、非ターゲティングメタボロミックデータを分析した。Ｖｉｅｎｎａ Ｂｉｏｃｅｎｔｅｒコア施設の内部データベースを通じて、最初のセットの代謝物を分析した。化合物の測定保持時間を、以前測定された標準の保持時間に比較した。ＭＳ２スペクトルが利用可能である場合、これもまた、同定のため考慮に入れた。第二のセットの代謝物にｍｚＣｌｏｕｄで注釈をつけた（少なくとも７５％マッチ）。同定は、測定分子量（５ｐｐｍ許容度）およびＭＳ２スペクトルのｍｚＣｌｏｕｄデータベース比較に基づいた。分子量マッチ（最大質量許容度５ｐｐｍ）を通じたＣｈｅｍＳｐｉｄｅｒ同定（ＣＳＩＤ）によって、第三のセットの代謝物に注釈をつけた。生物学的および技術的（Ｔ１－Ｔ２、ＭＳ）複製物から、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒソフトウェアによって、Ｐ値を計算した。さらなる注釈のため、ＫＥＧＧ、ＨＭＤＢ、ＢｉｏＣｙｃ、ＭｅｔａｂｏｌｉｋａおよびＰｕｂＣｈｅｍデータベースを用いた。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒソフトウェア（バージョン３．１）で、非ターゲティングメタボロミックデータを分析した。Ｖｉｅｎｎａ Ｂｉｏｃｅｎｔｅｒコア施設の内部データベースを通じて、最初のセットの代謝物を分析した。化合物の測定保持時間を、以前測定された標準の保持時間に比較した。ＭＳ２スペクトルが利用可能である場合、これもまた、同定のため考慮に入れた。第二のセットの代謝物にｍｚＣｌｏｕｄで注釈をつけた（少なくとも７５％マッチ）。同定は、測定分子量（５ｐｐｍ許容度）およびＭＳ２スペクトルのｍｚＣｌｏｕｄデータベース比較に基づいた。分子量マッチ（最大質量許容度５ｐｐｍ）を通じたＣｈｅｍＳｐｉｄｅｒ同定（ＣＳＩＤ）によって、第三のセットの代謝物に注釈をつけた。生物学的および技術的（Ｔ１－Ｔ２、ＭＳ）複製物から、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒソフトウェアによって、Ｐ値を計算した。さらなる注釈のため、ＫＥＧＧ、ＨＭＤＢ、ＢｉｏＣｙｃ、ＭｅｔａｂｏｌｉｋａおよびＰｕｂＣｈｅｍデータベースを用いた。
【0208】
化学基分類およびエンリッチメント分析
ｐ値および対応する倍変化を伴う、＜０．０５の偽発見率（ＦＤＲ）の代謝物を抽出し、そして化学的および代謝的ネットワークエンリッチメント分析に供した。生化学的経路割り当てとは独立であり、むしろタニモト下位構造類似性係数および医学件名標目表（ｍｅｄｉｃａｌ ｓｕｂｊｅｃｔ ｈｅａｄｉｎｇｓ）オントロジーを利用して、別個の化学クラス内の代謝物の重複しないクラスターを生じる、ＣｈｅｍＲｉｃｈを用いて、化学的類似性に基づくエンリッチメント分析を行った。Ｋｏｌｍｏｇｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ検定によって、統計検定を決定し、そして＜０．０５のＦＤＲ補正Ｐ値は有意と見なされた。
ｐ値および対応する倍変化を伴う、＜０．０５の偽発見率（ＦＤＲ）の代謝物を抽出し、そして化学的および代謝的ネットワークエンリッチメント分析に供した。生化学的経路割り当てとは独立であり、むしろタニモト下位構造類似性係数および医学件名標目表（ｍｅｄｉｃａｌ ｓｕｂｊｅｃｔ ｈｅａｄｉｎｇｓ）オントロジーを利用して、別個の化学クラス内の代謝物の重複しないクラスターを生じる、ＣｈｅｍＲｉｃｈを用いて、化学的類似性に基づくエンリッチメント分析を行った。Ｋｏｌｍｏｇｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ検定によって、統計検定を決定し、そして＜０．０５のＦＤＲ補正Ｐ値は有意と見なされた。
【0209】
代謝分析は、ＳＣＡ－７４４が、定量可能な薬理学的反応、特に、脂質代謝改変、解糖下方制御、およびＮＡＤＨ、ＡＴＰの減少の形の反応を示すことを示す。これは、脂肪細胞－炎症軸１がＳＣＡ－７４４によって影響を受ける、一体化された解釈を導く。この分析は、さらなる反応、例えばヌクレオチドおよびアミノ酸生合成の減少を示す。
【0210】
非対単変数分析によって、対照細胞および処理細胞の間の相対代謝物存在量の比較を決定した。計算したＰ値を０．０５のＦＤＲに基づいて調整し、そして対数倍変化（ｌｏｇＦＣ）分析によってフィルタリングした（表３）。例示的な目的のため、ｖｏｌｃａｎｏプロット上で、ｌｏｇＦＣ＞１ ｌｏｇＦＣ＜－２の代謝物に注釈をつける。総数２６１の注釈付き代謝物はＦＤＲ＜０．０５であることが見出された。絶対ｌｏｇＦＣ＞１である総数７４はＳＣＡ－７４４処理群において有意に異なり；１１代謝物の増加（表３）および６３の代謝物の減少（選択した代謝物を表４に示す）に相当した。
【0211】
上方制御：
ｌｏｇＦＣ＞１より大きい変化および＜０．０５のＦＤＲ補正Ｐ値を有する代謝物のみを、表３に含めた（図１０）。大部分の上方制御代謝物はリゾホスファチジル（ＬＰＩ）である。ＬＰＩは、炎症および神経障害性疼痛の両方の治療に療法的潜在能力を有する、その受容体ＧＰＲ５５を含めて、いくつかの刊行物において、抗炎症効果を有することが示されている２、３。ＬＰＩは、いくつかの細胞種において、細胞増殖、分化および運動性などの多様な機能に影響を及ぼしうる。ＬＰＩの機構は、ヒト肺動脈において弛緩を誘導した。ＬＰＩは、異なる生理学的および病理学的背景において、重要な役割を果たし、これには、代謝およびグルコースホメオスタシスにおける役割が含まれる。エンリッチメント分析は、代替脂質代謝およびイノシトール上方制御を裏付ける（表３）。ＩＬ－６（ＳＣＡ－７４４によって下方制御される）は、ミオイノシトールの主なターゲットである。イノシトールは抗炎症効果を有する。
ｌｏｇＦＣ＞１より大きい変化および＜０．０５のＦＤＲ補正Ｐ値を有する代謝物のみを、表３に含めた（図１０）。大部分の上方制御代謝物はリゾホスファチジル（ＬＰＩ）である。ＬＰＩは、炎症および神経障害性疼痛の両方の治療に療法的潜在能力を有する、その受容体ＧＰＲ５５を含めて、いくつかの刊行物において、抗炎症効果を有することが示されている２、３。ＬＰＩは、いくつかの細胞種において、細胞増殖、分化および運動性などの多様な機能に影響を及ぼしうる。ＬＰＩの機構は、ヒト肺動脈において弛緩を誘導した。ＬＰＩは、異なる生理学的および病理学的背景において、重要な役割を果たし、これには、代謝およびグルコースホメオスタシスにおける役割が含まれる。エンリッチメント分析は、代替脂質代謝およびイノシトール上方制御を裏付ける（表３）。ＩＬ－６（ＳＣＡ－７４４によって下方制御される）は、ミオイノシトールの主なターゲットである。イノシトールは抗炎症効果を有する。
【0212】
上位の１１の上方制御される代謝物にはまた、非常に有意に上方制御されるヒポキサンチンおよびイノシンもまた含まれる。イノシンおよびヒポキサンチンは、抗酸化および抗炎症効果を有することが示された。例えば、イノシンは、炎症促進性サイトカインの過剰産生を防ぐ能力を有する一方、保護性のＩＬ－１０の産生を増進させることも可能である４。
【0213】
表３は、さらなる有意に上方制御される代謝物、ならびに細胞抗炎症および抗酸化反応、ならびに脂質代謝に関連する参考文献を示す。
下方制御：
６３の代謝物が、ｌｏｇＦＣ＜－１で非常に有意に下方制御されるため、表４（図１０）は、選択された代謝物のみを示す。
下方制御：
６３の代謝物が、ｌｏｇＦＣ＜－１で非常に有意に下方制御されるため、表４（図１０）は、選択された代謝物のみを示す。
【0214】
エンリッチメント分析は、代替脂質代謝、ならびに糖酸および糖リン酸の下方制御を裏付ける。これに関連して、図１７は、解糖に関与する主な代謝物を示す。炎症の代謝制御において、解糖は重要な役割を果たす。免疫細胞は、細胞エネルギーおよび生体分子を供給する異なる代謝プログラムを発展させており、次いで、代謝状態の変化および困難な代謝状態に対処することを可能にしている。本発明者らの上位の下方制御代謝物には、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）が含まれる。ＤＨＡＰは、脂質生合成および解糖における非常に重要な中間代謝物である。
【0215】
さらなる代謝物が、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）に含まれ、該経路は、炎症、グルコース、および血管細胞損傷に非常に重要な役割を果たす。ＩＬ－β（ＳＣＡ－７４４において下方制御される）がＰＰＰを活性化することが示されている５。次に、これは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの過剰活性化を導く。ＰＰＰの過剰活性化は、血管損傷および酸化ストレスの非常に重要な機構である。ＳＣＡ－７４４は、解糖およびＮＡＤＨ、ならびにＡＴＰを有意に下方制御した。
【0216】
グリセロリン脂質およびリゾリン脂質を含む脂質代謝の改変は、１３５の代謝物のエンリッチメント分析によって裏付けられる（ＦＤＲ＜０．０５、絶対ｌｏｇＦＣ＜０．５）。２６１の代謝物（ＦＤＲ＜０．０５、図２）を含むエンリッチメント分析は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびプラスミノーゲンなどのクラスのさらなる代謝物が改変され、大部分は上方制御されることを示す。不飽和リゾリン脂質、ならびに不飽和脂肪酸（ＦＡ）はこの分析において、下方制御される。不飽和ＦＡは、炎症性シグナル伝達分子、例えばロイコトリエンの前駆体である６ため、これは特に興味深い。低い度合いの脂肪酸不飽和もまた、より低い脂質過酸化を導く。炎症において、特に、アテローム性動脈硬化症の病因形成において、リポタンパク質過酸化は、非常に重要な役割を果たす７。
【0217】
エンリッチメント分析のさらなる知見は、アミノ酸代謝が減少することである。アミノ酸代謝は、ｍＴＯＲによって制御され、続いてこれは、グリセロ脂質代謝およびオートファジーならびにタンパク質ホメオスタシスに関連する。
【0218】
オートファジーは、ストレス条件；栄養飢餓、タンパク質ホメオスタシスおよび病原体感染下で活性化され、そして癌および神経変性性疾患を含む、多様な病理学的状態において、制御解除される。一般的に、ＲＯＳはオートファジーを誘導し、そしてオートファジーは次に、酸化損傷を減少させるように働くことが認められている１８。
【0219】
これに関連して、ストレスの多数の型が、オートファジーを活性化する。タンパク質、脂質、炭水化物および核酸の分解は、他の代謝物の中でもアミノ酸、脂肪酸を細胞質に遊離させて、再利用のため内部栄養素を提供する。近年、神経変性性疾患および腫瘍抑制におけるオートファジーのありうる役割、ならびに炎症および抗酸化ストレスにおけるその役割がますます調べられてきている。
【0220】
メタボローム分析
代謝物の上方および下方制御は、ＳＣＡ－７４４が脂肪細胞－炎症軸に影響を及ぼし、そして抗炎症および抗酸化効果、ならびに改変された脂質代謝を有することを裏付ける。加えて、チミンおよびアデニンヌクレオチド、ならびにジペプチドおよびアミノ酸が下方制御される。ＳＣＡ－７４４は、ヌクレオチドおよびアミノ酸生合成に影響を及ぼす。
代謝物の上方および下方制御は、ＳＣＡ－７４４が脂肪細胞－炎症軸に影響を及ぼし、そして抗炎症および抗酸化効果、ならびに改変された脂質代謝を有することを裏付ける。加えて、チミンおよびアデニンヌクレオチド、ならびにジペプチドおよびアミノ酸が下方制御される。ＳＣＡ－７４４は、ヌクレオチドおよびアミノ酸生合成に影響を及ぼす。
【0221】
分子機能に関連する遺伝子オントロジー分析
分子機能に関連する遺伝子オントロジー分析は、カルシウム、細胞外マトリックス、グリコサミノグリカン、イオウ化合物、およびヘパリン結合の有意な機能を示す。図１８。
分子機能に関連する遺伝子オントロジー分析は、カルシウム、細胞外マトリックス、グリコサミノグリカン、イオウ化合物、およびヘパリン結合の有意な機能を示す。図１８。
【0222】
実施例１２： 哺乳動物細胞におけるＳＣＡ－７４４およびＳＣＡ－７５４の細胞傷害性
哺乳動物細胞におけるＳＣＡ－７４４およびＳＣＡ－７５４の細胞傷害性のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価。ＳＣＡ－７４４およびＳＣＡ－７５４処理の７２時間後、標準ＡＴＰ法、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイを用いて、細胞生存度を評価した。５０％の有効濃度、ＥＣ５０値を濃度－効果曲線から得た。ＳＣＡ－７４４のＥＣ５０は２ｍＭであり、ＳＣＡ－７５４に関しては１ｍＭであった。図１９。
哺乳動物細胞におけるＳＣＡ－７４４およびＳＣＡ－７５４の細胞傷害性のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価。ＳＣＡ－７４４およびＳＣＡ－７５４処理の７２時間後、標準ＡＴＰ法、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイを用いて、細胞生存度を評価した。５０％の有効濃度、ＥＣ５０値を濃度－効果曲線から得た。ＳＣＡ－７４４のＥＣ５０は２ｍＭであり、ＳＣＡ－７５４に関しては１ｍＭであった。図１９。
【0223】
実施例１３：ＳＣＡ－７４４および変異体（ＳＣＡ－７５４、ＣＡＬ－Ｘとも称される）の酸化性ストレス保護
いくつかのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、ＭＰＰ＋が細胞に対して酸化ストレスを発揮することを見出している２２。ＭＰＰ＋毒性は、ドーパミン作動性ニューロンへのその取り込みに基づく。ＭＰＰ＋は、ミトコンドリア内に集積し、複合体－Ｉを阻害してＡＴＰ枯渇、反応性酸素種（ＲＯＳ）産生の増加、およびアポトーシス細胞死を導く２３。ＭＰＰ＋処理、ならびにＳＣＡ－７４４およびＣＡＬ－Ｘインキュベーションの１２時間後、標準的ＡＴＰ法、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイを用いて、細胞生存度を評価した。０．１～１０００μＭのＳＣＡ－７４４およびＣＡＬ－Ｘでの処理は、ＭＰＰ＋誘導性アポトーシスから、神経芽細胞腫細胞を保護した（図１９Ｃ）。興味深いことに、ＳＣＡ－７４４［１μＭ］に比較して、ＣＡＬ－Ｘ ＭＰＰ＋保護は５倍、より有効であった［０．２μＭ］。総合すると、これらの結果によって、ＳＣＡ－７４４およびＣＡＬ－Ｘが酸化ストレスによって誘導されるミトコンドリア機能不全を保護すると示唆される。図１９Ｄ。
いくつかのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、ＭＰＰ＋が細胞に対して酸化ストレスを発揮することを見出している２２。ＭＰＰ＋毒性は、ドーパミン作動性ニューロンへのその取り込みに基づく。ＭＰＰ＋は、ミトコンドリア内に集積し、複合体－Ｉを阻害してＡＴＰ枯渇、反応性酸素種（ＲＯＳ）産生の増加、およびアポトーシス細胞死を導く２３。ＭＰＰ＋処理、ならびにＳＣＡ－７４４およびＣＡＬ－Ｘインキュベーションの１２時間後、標準的ＡＴＰ法、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイを用いて、細胞生存度を評価した。０．１～１０００μＭのＳＣＡ－７４４およびＣＡＬ－Ｘでの処理は、ＭＰＰ＋誘導性アポトーシスから、神経芽細胞腫細胞を保護した（図１９Ｃ）。興味深いことに、ＳＣＡ－７４４［１μＭ］に比較して、ＣＡＬ－Ｘ ＭＰＰ＋保護は５倍、より有効であった［０．２μＭ］。総合すると、これらの結果によって、ＳＣＡ－７４４およびＣＡＬ－Ｘが酸化ストレスによって誘導されるミトコンドリア機能不全を保護すると示唆される。図１９Ｄ。
【0224】
実施例１４： 哺乳動物細胞における、過酸化水素Ｈ
２
Ｏ
２
誘導性ストレスに対するＳＣＡ－７４４の保護
２４時間のインキュベーション時間を用いると、ＨＥＬＡ細胞におけるＳＣＡ－７４４の毒性およびレスキュー効果を決定するために十分であった。５０％の有効濃度、ＥＣ５０値を濃度－効果曲線から得た。ＳＣＡ－７４４のＥＣ５０は５０ｍＭの毒性Ｈ２Ｏ２濃度に関して、２００ｎＭであった。図２０。
２４時間のインキュベーション時間を用いると、ＨＥＬＡ細胞におけるＳＣＡ－７４４の毒性およびレスキュー効果を決定するために十分であった。５０％の有効濃度、ＥＣ５０値を濃度－効果曲線から得た。ＳＣＡ－７４４のＥＣ５０は５０ｍＭの毒性Ｈ２Ｏ２濃度に関して、２００ｎＭであった。図２０。
【0225】
参考文献：
【0226】
【化14】
【0227】
参考文献（表３および４）
【0228】
【化15-1】
【0229】
【化15-2】
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図10-4】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図19-3】
【図19-4】
【図20】
