知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-19
(45)【発行日】2024-12-27
(54)【発明の名称】マクロファージ泡沫細胞化阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/39 20060101AFI20241220BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241220BHJP
C07K 14/78 20060101ALI20241220BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20241220BHJP
【ＦＩ】
A61K38/39
A61P9/10 101
C07K14/78 ZNA
C12N15/09 Z
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2020097565
(22)【出願日】2020-06-04
(65)【公開番号】P2021187813
(43)【公開日】2021-12-13
【審査請求日】2023-06-02
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 第２０回Ｐｈａｒｍａｃｏ－Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙシンポジウム予稿集（令和１年６月８日頒布）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 第２０回Ｐｈａｒｍａｃｏ－Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙシンポジウム（令和１年６月８日開催）にて公開したスライド（題目：細胞外マトリックスによるマクロファージ機能調節と病態形成）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１９年度 第３６回日本薬学会九州支部大会講演要旨集（令和１年１１月５日発行）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１９年度 第３６回日本薬学会九州支部大会（令和１年１１月１７日開催）にて公開したスライド（題目：細胞外マトリックスに起因する貪食細胞機能調節と（動脈硬化）病態形成）
(73)【特許権者】
【識別番号】517018101
【氏名又は名称】公立大学法人山陽小野田市立山口東京理科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106002
【弁理士】
【氏名又は名称】正林 真之
(74)【代理人】
【識別番号】100136939
【弁理士】
【氏名又は名称】岸武 弘樹
(72)【発明者】
【氏名】深井 文雄
(72)【発明者】
【氏名】伊豫田 拓也
【審査官】濱田 光浩
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１０／０９０２７２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１９４６４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】AS1-1 細胞外マトリックス分子由来ペプチドによるマクロファージ機能調節と動脈硬化病態進展，日本薬理学雑誌，Vol. 147, supplement，2016年，p. S69-S126，https://doi.org/10.1254/fpj.147.S69
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／３９
Ａ６１Ｐ ９／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかであるペプチドを有効成分として含有する、マクロファージ泡沫細胞化阻害剤。（ａ）Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｌｅｕ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）ペプチド（ａ）において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつマクロファージ泡沫細胞化阻害作用を有するペプチド。
（ｃ）ペプチド（ａ）とのアミノ酸配列同一性が９０％以上であり、かつマクロファージ泡沫細胞化阻害作用を有するペプチド。
【請求項2】
請求項１に記載のマクロファージ泡沫細胞化阻害剤を有効成分として含有する、マクロファージ泡沫細胞化阻害が有効な疾患の予防又は治療薬。
【請求項3】
マクロファージ泡沫細胞化阻害が有効な疾患がアテローム性動脈硬化関連疾患である、請求項２に記載の予防又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マクロファージ泡沫細胞化阻害剤に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、種々の生活習慣病の根底には慢性炎症病態が存在するとの理解が一般的となっている。炎症の惹起から収束に至るまでの応答にはマクロファージを中心とした調節機構が存在しており、炎症の慢性化を伴う生活習慣病の進行において、マクロファージに異常がもたらされる仕組みが注目されている。
【0003】
生活習慣病の一つであり、かつ異常なマクロファージの蓄積が病態形成の中心的な役割を負う疾患に、アテローム性動脈硬化症がある。アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の内部の局所的な肥厚を特徴とする動脈の慢性炎症性疾患であり、泡沫細胞の形成と蓄積により引き起こされる。
【0004】
泡沫細胞は、細胞質に脂質が過剰に蓄積されたマクロファージであり、動脈壁内部の特定の箇所に泡沫細胞が蓄積するとプラークが形成され、血管の狭窄や閉塞が起こる。また、このプラークに対して何らかの刺激が加わりプラークが破綻すると、血栓が形成され、動脈硬化病態の進行に繋がる。
【0005】
マクロファージ泡沫細胞化の抑制を目的として、例えば特許文献１には、ε－ビニフェリンを有効成分とする動脈硬化組織内マクロファージ泡沫化抑制剤が提案されている。また、特許文献２には、トマチジンを有効成分とする動脈硬化の予防・治療剤が提案されている。
【0006】
マクロファージ泡沫細胞化が引き起こす疾患の更なる改善のため、新規なマクロファージ泡沫細胞化阻害剤の開発が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２０１２－９７０１２号公報
【文献】特開２００９－２０９０９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、上記に鑑みて提案されたものであり、新規なマクロファージ泡沫細胞化阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定のアミノ酸配列からなるペプチドがマクロファージ泡沫細胞化を阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は、以下のものを提供する。
【0010】
＜１＞ 以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかであるペプチドを有効成分として含有する、マクロファージ泡沫細胞化阻害剤。
（ａ）Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｌｅｕ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）ペプチド（ａ）において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつマクロファージ泡沫細胞化阻害作用を有するペプチド。
（ｃ）ペプチド（ａ）とのアミノ酸配列同一性が９０％以上であり、かつマクロファージ泡沫細胞化阻害作用を有するペプチド。
（ａ）Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｌｅｕ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）ペプチド（ａ）において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつマクロファージ泡沫細胞化阻害作用を有するペプチド。
（ｃ）ペプチド（ａ）とのアミノ酸配列同一性が９０％以上であり、かつマクロファージ泡沫細胞化阻害作用を有するペプチド。
【0011】
＜２＞ ＜１＞に記載のマクロファージ泡沫細胞化阻害剤を有効成分として含有する、マクロファージ泡沫細胞化阻害が有効な疾患の予防又は治療薬。
【0012】
＜３＞ マクロファージ泡沫細胞化阻害が有効な疾患がアテローム性動脈硬化関連疾患である、＜２＞に記載の予防又は治療薬。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、新規なマクロファージ泡沫細胞化阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1A】試験例１に係るマクロファージの脂質蓄積を確認した結果を示す染色図である。
【図1B】試験例１に係るマクロファージの脂質蓄積を確認した結果を示すグラフである。
【図1C】試験例１に係るｐ３８阻害剤を添加した場合のマクロファージの脂質蓄積を確認した結果を示す染色図である。
【図2】試験例２に係るマクロファージの貪食作用を確認した結果を示すグラフである。
【図3】試験例３に係るＭＡＰＫファミリの活性化を確認した結果を示す図である。
【図4】試験例４に係る代表的な炎症性メディエーターのｍＲＮＡ発現量を確認した結果を示す図である。
【図5A】試験例５に係るＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ発現量を確認した結果を示す図である。
【図5B】試験例５に係るＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１のタンパク質発現量を確認した結果を示す図である。
【図6】試験例６に係るマクロファージの貪食作用を確認した結果を示すグラフである。
【図7A】試験例７に係るＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現量を確認した結果を示すグラフである。
【図7B】試験例７に係るＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ発現量を確認した結果を示すグラフである。
【図8A】試験例８に係るコントロールペプチドを添加した場合の動脈硬化病態の形成を確認した結果を示す図である。
【図8B】試験例８に係るＦＮＩＩＩ１４ペプチドを添加した場合の動脈硬化病態の形成を確認した結果を示す図である。
【図8C】試験例８に係るＳｕｄａｎ－ｒｅｄ陽性面積の割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【0016】
本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。アミノ酸配列の記載は左側がＮ末端側であり、アミノ酸残基は当該技術分野で周知の三文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇｌｙ」）で表記する場合がある。
【0017】
＜マクロファージ泡沫細胞化阻害剤＞
本実施形態に係るマクロファージ泡沫細胞化阻害剤は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかであるペプチド（以下、特定ペプチドともいう）を有効成分として含有する。
（ａ）Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｌｅｕ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）ペプチド（ａ）において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつマクロファージ泡沫細胞化阻害作用を有するペプチド。
（ｃ）ペプチド（ａ）とのアミノ酸配列同一性が９０％以上であり、かつマクロファージ泡沫細胞化阻害作用を有するペプチド。
本実施形態に係るマクロファージ泡沫細胞化阻害剤は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかであるペプチド（以下、特定ペプチドともいう）を有効成分として含有する。
（ａ）Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｌｅｕ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）ペプチド（ａ）において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつマクロファージ泡沫細胞化阻害作用を有するペプチド。
（ｃ）ペプチド（ａ）とのアミノ酸配列同一性が９０％以上であり、かつマクロファージ泡沫細胞化阻害作用を有するペプチド。
【0018】
特定ペプチドは、化学合成法又は遺伝子組み換え法により製造してもよく、市販品を使用してもよい。化学合成法により特定ペプチドを製造する場合、液相法、固相法、Ｂｏｃ法、Ｆｍｏｃ法等を単独で又は組み合わせて製造すればよい。遺伝子組み換え法により特定ペプチドを製造する場合、例えば、発現ベクターを用いて、大腸菌、酵母等の微生物；植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等に特定ペプチドをコードする遺伝子を導入し、発現させればよい。
【0019】
上記（ａ）であるペプチドのアミノ酸配列は、細胞外マトリックスタンパク質分子の一つであるフィブロネクチンを構成するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに由来するもの（ＦＮＩＩＩ１４）である。
【0020】
特定ペプチドが（ｂ）である場合、欠失、置換、又は付加されるアミノ酸残基の数は特定ペプチドがマクロファージ泡沫細胞化阻害作用を有する範囲であれば特に制限されない。例えば、１個～４個であることが好ましく、１個～３個であることがより好ましく、１個又は２個であることがより好ましい。合成の効率、取扱性、安定性等の観点からは、（ｂ）のペプチドのアミノ酸残基の総数は３０以下であることが好ましく、２８以下であることがより好ましく、２５以下であることが更に好ましい。
【0021】
特定ペプチドが（ｃ）である場合、上記ペプチド（ａ）とのアミノ酸配列同一性が９０％以上であれば特に限定されない。該アミノ酸配列同一性は９３％以上であってもよく、９５％以上であってもよく、９７％以上であってもよい。
【0022】
マクロファージ泡沫細胞化阻害剤によるマクロファージ泡沫細胞化の阻害は、種々の態様で観察されうる。例えば、マクロファージ泡沫細胞化阻害剤を用いる前後におけるマクロファージ細胞内へのコレステロールの取り込みの抑制、減少、消失等によって観察されうる。また、取り込んだＬＤＬ（悪玉コレステロール）をＨＤＬ（善玉コレステロール）に変換し、循環系へと戻す役割を担う、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１の発現の調節によるものであってもよい。なお、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１は、マクロファージにおけるコレステロールの細胞外排出に重要な役割を担う輸送体である。
【0023】
マクロファージ泡沫細胞化阻害剤に含まれる特定ペプチドは、用途に応じて種々の改変を施してもよい。例えば、ポリエチレングリコール等の水溶性ポリマー、硫酸基、水溶性アミノ酸などを特定ペプチドの末端に連結して水溶性を向上させたり、多量体化したりしてもよい。また、特定ペプチドを構成するアミノ酸残基のそれぞれは本発明の効果が達成される限りＬ体又はＤ体のいずれであってもよい。体内での特定ペプチドの分解を抑制する観点からは、アミノ酸配列の少なくとも一部（例えば、第２位のＧｌｕ）をＤ体とすることが好ましい。
【0024】
このように、特定ペプチドは、マクロファージ泡沫細胞化を阻害するように作用する。したがって、特定ペプチドを用いることにより、マクロファージ泡沫細胞化阻害剤を製造することができる。マクロファージ泡沫細胞化阻害剤は、医薬用途に用いることができ、また、医薬以外の用途（研究用途等）に用いることもできる。
【0025】
＜予防又は治療薬＞
本実施形態に係る予防又は治療薬は、上述した本実施形態に係るマクロファージ泡沫細胞化阻害剤を有効成分として含有する。このため、本実施形態に係る予防又は治療薬は、マクロファージ泡沫細胞化阻害が有効な疾患に対して有効である。なお、「予防」には、疾患の発症を防ぐことのほか、発症の時期を遅らせることも含まれる。また、「治療」には、疾患の症状を消失又は軽減させることのほか、症状の進行の度合いを抑制することも含まれる。
本実施形態に係る予防又は治療薬は、上述した本実施形態に係るマクロファージ泡沫細胞化阻害剤を有効成分として含有する。このため、本実施形態に係る予防又は治療薬は、マクロファージ泡沫細胞化阻害が有効な疾患に対して有効である。なお、「予防」には、疾患の発症を防ぐことのほか、発症の時期を遅らせることも含まれる。また、「治療」には、疾患の症状を消失又は軽減させることのほか、症状の進行の度合いを抑制することも含まれる。
【0026】
マクロファージ泡沫細胞化阻害が有効な疾患の一例としては、アテローム性動脈硬化関連疾患が挙げられる。アテローム性動脈硬化関連疾患の具体例としては、冠動脈疾患、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳虚血、閉塞性動脈硬化症、間欠性跛行、壊疽、腸管膜虚血、一過性の動脈炎、腎動脈狭窄等が挙げられる。
【0027】
予防又は治療薬は、医薬品の分野において採用される任意の方法や適当な改良を加えた方法によって製造することができる。
【0028】
予防又は治療薬は、使用態様に応じてマクロファージ泡沫細胞化阻害剤以外の成分を含んでいてもよい。マクロファージ泡沫細胞化阻害剤以外の成分としては、薬剤の調製に一般に用いられる媒質及び製剤用添加物を挙げることができる。媒質及び製剤用添加物の種類は、特に制限されない。媒質としては、固体媒質（例えば、ゼラチン、乳糖等）及び液体媒質（例えば、アルコール、水、生理食塩水等）が挙げられる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等が挙げられる。
【0029】
予防又は治療薬の剤形は特に制限されず、用途に応じて選択できる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤、リモナーデ剤等の経口剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の非経口剤；などが挙げられる。
【0030】
予防又は治療薬の適用対象は特に限定されず、哺乳類等を好ましく挙げることができる。哺乳動物としては、ヒト、及び非ヒト動物（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）のいずれであってもよい。
【0031】
予防又は治療薬の投与量は、投与対象、投与経路、対象疾患、症状等に応じて適宜決定される。
【0032】
予防又は治療薬は、投与目的等に応じて、他の薬剤と併用して投与してもよい。予防又は治療薬とともに併用される薬剤の種類や量等は、得ようとする効果等に基づき適宜選択され、予防又は治療薬とともに投与してもよく、別々に投与してもよい。
【実施例】
【0033】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
【0034】
＜試験例１＞
動脈硬化等の炎症関連領域に特異的かつ一過的に高発現する細胞外マトリックス分子であるテネイシンＣの分子構造内に、ＴＮＩＩＩＡ２領域が存在する。試験例１では、ＴＮＩＩＩＡ２刺激マクロファージの泡沫細胞化における影響を確認した。
動脈硬化等の炎症関連領域に特異的かつ一過的に高発現する細胞外マトリックス分子であるテネイシンＣの分子構造内に、ＴＮＩＩＩＡ２領域が存在する。試験例１では、ＴＮＩＩＩＡ２刺激マクロファージの泡沫細胞化における影響を確認した。
【0035】
以下の試験では、Ｒａｗ２６４．７細胞（マウスマクロファージ細胞株）を用いた。Ｒａｗ２６４．７細胞の培養には、非動化済の牛胎児血清を１０％含むＤＭＥＭ培地を使用した。Ｒａｗ２６４．７細胞は、２５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整して、ＦＢＳでコートされた２４ウェルプレートに播種し、２時間培養した後に、上記培地からＦＢＳを抜いた培地に変更して、更に２時間培養を行った。このように準備した細胞を試験に用いた。
【0036】
ＴＮＩＩＩＡ２領域に対応する、アミノ酸配列Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ（配列番号２）からなるペプチドを、常法により合成した。本明細書において、このペプチドを「ＴＮＩＩＩＡ２ペプチド」ということもある。
【0037】
上記で準備したＲａｗ２６４．７細胞の培地に、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチド（終濃度２．５μｇ／ｍＬ）及びｏｘ－ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）（終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加した。３７℃で２０時間インキュベート後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％ホルミアミドで固定した後に、Ｏｉｌ－Ｒｅｄ－Ｏ染色を行った。
【0038】
【0039】
次に、上記と同様に、培地にＴＮＩＩＩＡ２ペプチド及びｏｘ－ＬＤＬを添加し、更にＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の阻害剤であるＰｏｌｙｍｙｘｉｎ－Ｂ（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を添加した。なお、ＬＰＳは、テネイシンＣによる炎症反応の刺激において重要な役割を果たすＴＬＲ４のアゴニストであり、マクロファージの貪食作用の活性化因子として知られている。３７℃で２０時間インキュベート後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％ホルミアミドで固定した後に、Ｏｉｌ－Ｒｅｄ－Ｏ染色を行った。
【0040】
図１Ａ下段に示されるように、Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ－Ｂを添加した場合でも、ＴＮＩＩＩＡ２刺激を受けたマクロファージにおいて、細胞内への脂質蓄積すなわち泡沫細胞化が有意に亢進していることが確認された。この結果より、ＴＮＩＩＩＡ２による泡沫細胞化作用は、ＴＮＩＩＩＡ２溶液に混入したＬＰＳの効果ではないことが確認された。
【0041】
次に、上記と同様に、培地にＴＮＩＩＩＡ２ペプチド及びｏｘ－ＬＤＬを添加し、更にｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（終濃度１０μＭ）を添加した。３７℃で２０時間インキュベート後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％ホルミアミドで固定した後に、Ｏｉｌ－Ｒｅｄ－Ｏ染色を行った。
【0042】
図１Ｃに示されるように、ＳＢ２０３５８０を添加した場合には、ＴＮＩＩＩＡ２刺激を受けたマクロファージにおける脂質蓄積が確認されなかった。このことより、ＴＮＩＩＩＡ２による泡沫細胞化の促進は、ｐ３８活性化依存的な作用であることが示された。
【0043】
＜試験例２＞
試験例２では、ＴＮＩＩＩＡ２刺激マクロファージの貪食作用を確認した。
試験例２では、ＴＮＩＩＩＡ２刺激マクロファージの貪食作用を確認した。
【0044】
本試験では、播種した容器をＦＢＳでコートされたカバーガラスとした以外は、試験例１と同様の方法で準備したＲａｗ２６４．７細胞を用いた。培地に、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチド（終濃度２．５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）、蛍光ＦＩＴＣ標識ラテックスビーズ（終濃度５０×１０４ ｂｅａｄｓ／ｍＬ）、又はＳＢ２０３５８０（終濃度１０μＭ）を添加した。３７℃で２０分間インキュベート後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後に、蛍光顕微鏡を用いて解析した。結果を図２に示す。なお、図２における「ｖｅｈｉ」は、ＳＢ２０３５８０を添加していないサンプルを示す。また、「＊」は、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチド、ＬＰＳ、及びＳＢ２０３５８０のいずれも添加していないサンプルと比較して、統計学的に有意であることを示す。「＊＊」は、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチドを添加し、ＳＢ２０３５８０を添加していないサンプルと比較して、統計学的に有意であることを示す。
【0045】
図２に示されるように、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチドを添加すると、ＬＰＳを添加した場合と同様に、貪食作用が増強することが示された。これにより、試験例１で観察された脂質の異常蓄積は、許容量を超えた脂質の細胞内取り込みによりもたらされたことが推測される。また、ＬＰＳ刺激マクロファージは、ＳＢ２０３５８０による影響を受けなかったのに対し、ＴＮＩＩＩＡ２刺激マクロファージは、ＳＢ２０３５８０の添加により貪食作用が抑制された。このことより、ＴＮＩＩＩＡ２は、ｐ３８依存的にマクロファージの貪食作用を増強することがわかった。
【0046】
＜試験例３＞
試験例３では、ＴＮＩＩＩＡ２刺激マクロファージにおける、ＭＡＰＫファミリの活性化の確認を行った。
試験例３では、ＴＮＩＩＩＡ２刺激マクロファージにおける、ＭＡＰＫファミリの活性化の確認を行った。
【0047】
本試験では、播種した容器をＦＢＳでコートされた６ウェルプレートとした以外は、試験例１と同様の方法で準備したＲａｗ２６４．７細胞を用いた。培地に、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチド（終濃度２．５μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で０．５、１、３、５、８、２０時間のインキュベートを行った。細胞をＰＢＳで３回洗浄後、プロテアーゼインヒビターカクテルを含むＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ，２％ ＳＤＳ，１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．００５％ ＢＰＢ，５％ ２－ＭＥ）で細胞を溶解し、一定量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、抗ｐ－ＥＲＫ抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、抗ｐ－ｐ３８抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、及び抗ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を一次抗体として、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を二次抗体として用いて、ウェスタンブロッティングによる解析を行った。結果を図３に示す。
【0048】
図３に示されるように、ＴＮＩＩＩＡ２刺激を行うと、マクロファージ内においてｐ３８が活性化することが確認された。他方で、ＥＲＫの活性化は示されなかった。このことより、ＴＮＩＩＩＡ２は、ＥＲＫ活性を伴わずに、ｐ３８活性化を誘導することがわかった。
【0049】
＜試験例４＞
試験例４では、ＴＮＩＩＩＡ２刺激マクロファージの貪食作用の亢進における、代表的な炎症性メディエーターのｍＲＮＡ発現量を確認した。
試験例４では、ＴＮＩＩＩＡ２刺激マクロファージの貪食作用の亢進における、代表的な炎症性メディエーターのｍＲＮＡ発現量を確認した。
【0050】
本試験では、播種した容器をＦＢＳでコートされた６ウェルプレートとした以外は、試験例１と同様の方法で準備したＲａｗ２６４．７細胞を用いた。培地に、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチド（終濃度２．５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）、又はＳＢ２０３５８０（終濃度１０μＭ）を添加した。３７℃で３時間インキュベート後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トータルＲＮＡの抽出を行った後に、ｃＤＮＡの合成を行った。その後、合成したｃＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅を行った。結果を図４に示す。なお、図４における「ｖｅｈｉ」は、ＳＢ２０３５８０を添加していないサンプルを示す。また、使用したプライマーの配列は以下のとおりである。
【0051】
【表1】
【0052】
図４に示されるように、ＭＣＰ－１、ＫＣ、ＭＩＰ－２、ＩＬ－６のいずれにおいても、ＴＮＩＩＩＡ２刺激によるｍＲＮＡ発現量の変化は示されなかった。このことより、ＴＮＩＩＩＡ２によるマクロファージの貪食作用の亢進は、炎症性の貪食亢進とは異なり、代表的な炎症性メディエーターの産生を伴わないものであることがわかった。
【0053】
＜試験例５＞
試験例５では、ＴＮＩＩＩＡ２刺激マクロファージにおける、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ発現量及びタンパク質発現量を確認した。
試験例５では、ＴＮＩＩＩＡ２刺激マクロファージにおける、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ発現量及びタンパク質発現量を確認した。
【0054】
まず、試験例４と同様の方法で、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチド、ＬＰＳ、又はＳＢ２０３５８０の添加を行った後に、ｃＤＮＡの合成を行い、以下に示すプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。ＧＡＰＤＨのプライマーは試験例４で用いたものと同じである。結果を図５Ａに示す。なお、図５Ａにおける「ｖｅｈｉ」は、ＳＢ２０３５８０を添加していないサンプルを示す。
【0055】
【表2】
【0056】
図５Ａに示されるように、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１のいずれにおいても、ＴＮＩＩＩＡ２刺激によりｍＲＮＡ発現量が減少した。また、このｍＲＮＡ発現量の減少は、ＳＢ２０３５８０の添加により回復することが示された。
【0057】
次に、試験例３と同様の方法でＴＮＩＩＩＡ２ペプチドの添加を行い、５時間又は７時間インキュベートした後に、抗ＡＢＣＡ１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗ＡＢＣＧ１抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製）、及び抗ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を一次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）又はＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を二次抗体として用いて、ウェスタンブロッティングによる解析を行った。結果を図５Ｂに示す。
【0058】
図５Ｂに示されるように、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１のいずれにおいても、ＴＮＩＩＩＡ２刺激によりタンパク質発現量が減少した。
【0059】
これらの結果より、試験例１で観察された脂質の異常蓄積は、試験例２で確認した許容量を超えた脂質の細胞内取り込みだけでなく、取り込んだ脂質の排出能の低下によっても発生していることがわかった。
【0060】
＜試験例６＞
試験例６では、ＦＮＩＩＩ１４がマクロファージの貪食作用に及ぼす影響を確認した。
試験例６では、ＦＮＩＩＩ１４がマクロファージの貪食作用に及ぼす影響を確認した。
【0061】
アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｌｅｕ（配列番号１）からなるペプチドを、常法により合成した。本明細書において、このペプチドを「ＦＮＩＩＩ１４ペプチド」ということもある。
【0062】
本試験では、播種した容器をＦＢＳでコートされたカバーガラスとした以外は、試験例１と同様の方法で準備したＲａｗ２６４．７細胞を用いた。培地に、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチド（終濃度２．５μｇ／ｍＬ）、ＦＮＩＩＩ１４ペプチド（終濃度５μｇ／ｍＬ）、蛍光ＦＩＴＣ標識ラテックスビーズ（終濃度５０×１０４ ｂｅａｄｓ／ｍＬ）を添加した。３７℃で２０分間インキュベート後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後に、蛍光顕微鏡を用いて解析した。結果を図６に示す。なお、図６における「ｖｅｈｉ」は、いずれのペプチドも添加していないサンプルを示す。
【0063】
図６に示されるように、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチドの添加により増強したマクロファージの貪食作用は、ＦＮＩＩＩ１４ペプチドを添加することで抑制された。
【0064】
＜試験例７＞
試験例７では、ＦＮＩＩＩ１４ペプチドを添加した場合の、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ発現量を確認した。また、ＴＮＩＩＩＡ２領域はβ１インテグリン活性化能を示すことが知られていることから、他のβ１インテグリン活性化試薬を用いた場合における、これらのｍＲＮＡ発現量の確認も行った。
試験例７では、ＦＮＩＩＩ１４ペプチドを添加した場合の、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ発現量を確認した。また、ＴＮＩＩＩＡ２領域はβ１インテグリン活性化能を示すことが知られていることから、他のβ１インテグリン活性化試薬を用いた場合における、これらのｍＲＮＡ発現量の確認も行った。
【0065】
本試験では、播種した容器をＦＢＳでコートされた６ウェルプレートとした以外は、試験例１と同様の方法で準備したＲａｗ２６４．７細胞を用いた。培地に、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチド（終濃度２．５μｇ／ｍＬ）、ＦＮＩＩＩ１４ペプチド（終濃度５μｇ／ｍＬ）、ＭｇＣｌ２（終濃度１ｍＭ／Ｌ）、抗９ＥＧ７抗体（ＩｇＧ）（終濃度３０μｇ／ｍＬ）、又はコントロールＩｇＧ（終濃度３０μｇ／ｍＬ）を添加した。３７℃で３時間インキュベート後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トータルＲＮＡの抽出を行った後に、ｃＤＮＡの合成を行った。その後、合成したｃＤＮＡを用いてＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｓｙｓｔｅｍによるリアルタイムＰＣＲ増幅を行った。ＡＢＣＡ１の結果を図７Ａに、ＡＢＣＧ１の結果を図７Ｂに示す。なお、図７Ａ及びＢにおける「ｖｅｈｉ」は、いずれのペプチド又は試薬も添加していないサンプルを示す。また、「＊」は、ｖｅｈｉと比較して、統計学的に有意であることを示す。「＊＊」は、コントロールＩｇＧを添加したサンプルと比較して、統計学的に有意であることを示す。「＃」は、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチドを添加したサンプルと比較して、統計学的に有意であることを示す。使用したプライマーは試験例５で用いたものと同じである。
【0066】
図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、ＴＮＩＩＩＡ２ペプチドの添加により減少したＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ発現量は、ＦＮＩＩＩ１４ペプチドを添加することで回復した。また、ＭｇＣｌ２及び抗９ＥＧ７抗体の添加により、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ発現量が減少することも確認された。
【0067】
試験例６及び７の結果より、ＴＮＩＩＩＡ２によるマクロファージ泡沫細胞化の機序と推定される「貪食作用亢進」及び「ＡＢＣＡ１／ＡＢＣＧ１発現抑制」には、β１インテグリンの活性化が関係していること、また、ＦＮＩＩＩ１４ペプチドの添加により、その効果がキャンセルされることがわかった。
【0068】
＜試験例８＞
試験例８では、高脂肪食負荷ＬＤＬＲ－ＫＯマウスを用いて、動脈硬化病態の形成にＦＮＩＩＩ１４が及ぼす影響を確認した。
試験例８では、高脂肪食負荷ＬＤＬＲ－ＫＯマウスを用いて、動脈硬化病態の形成にＦＮＩＩＩ１４が及ぼす影響を確認した。
【0069】
まず、アミノ酸配列Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ（配列番号１７）からなるペプチドを、常法により合成した。該ペプチドは、ＦＮＩＩＩ１４ペプチドの活性部分のアミノ酸配列をシャッフルして活性を喪失させたものである。本明細書において、このペプチドを「コントロールペプチド」ということもある。
【0070】
１０週齢の雄のＬＤＬ－Ｒ ＫＯマウスをランダムに３つのグループに分けて、高脂肪食の投与を開始した。１２週齢の時点から１日おきに、ＦＮＩＩＩ１４ペプチド（１００μｇ）、コントロールペプチド（１００μｇ）、又は生理食塩水を投与した。２０週齢の時点で屠殺し、大動脈を切除した。その後、ＳｕｄａｎＩＶを用いて染色を行った。コントロールペプチドを投与した場合の染色結果を図８Ａに、ＦＮＩＩＩ１４ペプチドを投与した場合の染色結果を図８Ｂに示す。また、Ｓｕｄａｎ－ｒｅｄ陽性面積の割合を図８Ｃに示す。なお、図８Ｃにおける「ｖｅｈｉｃｌｅ」は、生理食塩水を投与した群を示す。また、「＊」は、コントロールペプチドを投与した群と比較して、統計学的に有意であることを示す。
【0071】
図８Ａ～図８Ｃに示されるように、ＦＮＩＩＩ１４ペプチドを投与した群では、生理食塩水やコントロールペプチドを投与した群と比較して、Ｓｕｄａｎ－ｒｅｄ陽性面積の割合が有意に低下した。このことより、ＦＮＩＩＩ１４ペプチドが動脈硬化病態の形成を妨げることが、動物レベルで確認された。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【配列表】