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特許7607556アントラサイクリンを含む結合タンパク質－毒素融合体、および免疫腫瘍学的適用におけるその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-19
(45)【発行日】2024-12-27
(54)【発明の名称】アントラサイクリンを含む結合タンパク質－毒素融合体、および免疫腫瘍学的適用におけるその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20241220BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20241220BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241220BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241220BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241220BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68 ZNA
A61K31/704
A61K39/395 D
A61K39/395 E
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61P35/00
A61P43/00 121
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021519849
(86)(22)【出願日】2019-10-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 EP2019077644
(87)【国際公開番号】W WO2020074724
(87)【国際公開日】2020-04-16
【審査請求日】2022-10-05
(31)【優先権主張番号】18199879.0
(32)【優先日】2018-10-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】515255205
【氏名又は名称】エヌビーイー セラピューティクス アクチェン ゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】グラヴンダー ウルフ
(72)【発明者】
【氏名】ベールリ ロジャー
(72)【発明者】
【氏名】ヴァルトマイアー ローレンツ
(72)【発明者】
【氏名】プレット フランチェスカ
【審査官】春日 淳一
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１２７６６４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０７２３６１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１０２６７９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ，Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患の治療に使用されるための（i）１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含み、結合タンパク質に融合された結合タンパク質－毒素融合体、および、
（ii）免疫チェックポイント阻害剤；
の組合せを含む医薬品であって、
結合タンパク質は、抗体、標的結合能を保持する修飾抗体フォーマット、および／または標的結合能を保持する断片からなる群から選択される少なくとも１つであり、かつ
１つ以上のアントラサイクリン毒素部分は、以下の式（ｉ）を有するアントラサイクリンＰＮＵ－１５９６８２の誘導体であり、
【化1】
免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ２、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＬＡＧ３、抗ＣＤ４０もしくは抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＴＩＭ３、抗ＯＸ４０もしくは抗ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４／ＣＤ１３４Ｌ）、抗ＣＤ１１２、抗ＣＤ１５５、抗Ｂ７－Ｈ３、抗Ｂ７－Ｈ４、抗ＩＤＯ１、抗ＩＤＯ２、抗ＴＤＯ２、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＧＩＴＲ、および／または抗ガレクチン－９からなる群から選択される少なくとも１つであり、
ここで、結合タンパク質－毒素融合体および免疫チェックポイント阻害剤は、同時に、または任意の順序で、連続して患者に投与される、医薬品。
【請求項2】
ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患の治療のための薬剤の製造のための、結合タンパク質に融合された１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体と組み合わせて使用するための免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の使用であって、
結合タンパク質は、抗体、標的結合能を保持する修飾抗体フォーマット、および／または標的結合能を保持する断片からなる群から選択される少なくとも１つであり、かつ
１つ以上のアントラサイクリン毒素部分は、以下の式（ｉ）を有するアントラサイクリンＰＮＵ－１５９６８２の誘導体であり、
【化2】
免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ２、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＬＡＧ３、抗ＣＤ４０もしくは抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＴＩＭ３、抗ＯＸ４０もしくは抗ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４／ＣＤ１３４Ｌ）、抗ＣＤ１１２、抗ＣＤ１５５、抗Ｂ７－Ｈ３、抗Ｂ７－Ｈ４、抗ＩＤＯ１、抗ＩＤＯ２、抗ＴＤＯ２、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＧＩＴＲ、および／または抗ガレクチン－９からなる群から選択される少なくとも１つである、使用。
【請求項3】
ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴付けられる腫瘍性疾患が、不応性であるか、免疫チェックポイント阻害剤治療に抵抗性であるか、または免疫チェックポイント阻害剤治療後に再発性である腫瘍である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項4】
ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴付けられる腫瘍性疾患が、不応性であるか、免疫チェックポイント阻害剤治療に抵抗性であるか、または免疫チェックポイント阻害剤治療後に再発性である腫瘍である、請求項２に記載の使用。
【請求項5】
ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴付けられる腫瘍性疾患が、以下からなる群より選択される、請求項１および３のいずれか１項に記載の医薬品：・黒色腫、
・大腸癌もしくは大腸腫瘍、
・膵臓癌もしくは膵腫瘍
・膠芽腫、
・卵巣癌もしくは腫瘍、および／または
・前立腺癌もしくは腫瘍。
【請求項6】
ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴付けられる腫瘍性疾患が、以下からなる群より選択される、請求項２および４のいずれか１項に記載の使用：・黒色腫、
・大腸癌もしくは大腸腫瘍、
・膵臓癌もしくは膵腫瘍
・膠芽腫、
・卵巣癌もしくは腫瘍、および／または
・前立腺癌もしくは腫瘍。
【請求項7】
結合タンパク質が、以下からなる群から選択される少なくとも１つの標的に結合する、請求項１、３および５のいずれか１項に記載の医薬品：・ＲＯＲ１
・ＣＳ１
・ＨＥＲ２
・メソテリン（ＭＮ）および／または
・ＲＯＲ２。
【請求項8】
結合タンパク質が、以下からなる群から選択される少なくとも１つの標的に結合する、請求項２、４および６のいずれか１項に記載の使用：・ＲＯＲ１
・ＣＳ１
・ＨＥＲ２
・メソテリン（ＭＮ）および／または
・ＲＯＲ２。
【請求項9】
ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴付けられる腫瘍性疾患が、＜１のｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅを有すると特徴付けられる、請求項１、３、５および７のいずれか１項に記載の医薬品。
【請求項10】
ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴付けられる腫瘍性疾患が、＜１のｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅを有すると特徴付けられる、請求項２、４、６および８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項11】
結合タンパク質が、a)配列番号１および２；３および４、５および６ならびに／または２０および２１の対に記載された、重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対に含まれる重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含む抗体；
b)以下の配列番号（ＨＣＤＲ１；ＨＣＤＲ２；ＨＣＤＲ３；ＬＣＤＲ１；ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の順番で）を含む、重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含む抗体；
・２２、２３、２４、２５、２６、および２７、
・２８、２９、３０、３１、３２、および３３、
・３４、３５、３６、３７、３８、および３９、および／または
・４０、４１、４２、４３、４４、および４５；
c)ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つはそれぞれの配列番号に対して３個のアミノ酸までの置換を有する抗体；ならびに／または
d)ｂ）またはｃ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つはそれぞれの配列番号に対して≧６６％の配列同一性を有する抗体；
であって、
ここで、ＣＤＲは、十分な結合親和性でＲＯＲ１に結合することができるように、適切なタンパク質フレームワークに埋め込まれ、
好ましくは、結合タンパク質が、
a)配列番号１および２；３および４、５および６ならびに／または２０および２１の対に記載された重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）対を含む抗体；
b)ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）対を含む抗体であって、ただし、
・ＨＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して≧８０％の配列同一性を有する、および／もしくは
・ＬＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して≧８０％の配列同一性を有する、抗体；ならびに／または
c)ａ）またはｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）対を含む抗体であって、ただし、ＨＣＶＤまたはＬＣＶＤの少なくとも１つが、それぞれの配列番号に対して１０個までのアミノ酸置換を有する、抗体；
であって、
前記結合タンパク質は、依然として十分な結合親和性でＲＯＲ１に結合することができる、
請求項１、３、５、７および９のいずれか１項に記載の医薬品。
【請求項12】
結合タンパク質が、a)配列番号１および２；３および４、５および６ならびに／または２０および２１の対に記載された、重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対に含まれる重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含む抗体；
b)以下の配列番号（ＨＣＤＲ１；ＨＣＤＲ２；ＨＣＤＲ３；ＬＣＤＲ１；ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の順番で）を含む、重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含む抗体；
・２２、２３、２４、２５、２６、および２７、
・２８、２９、３０、３１、３２、および３３、
・３４、３５、３６、３７、３８、および３９、および／または
・４０、４１、４２、４３、４４、および４５；
c)ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つはそれぞれの配列番号に対して３個のアミノ酸までの置換を有する抗体；ならびに／または
d)ｂ）またはｃ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つはそれぞれの配列番号に対して≧６６％の配列同一性を有する抗体；
であって、
ここで、ＣＤＲは、十分な結合親和性でＲＯＲ１に結合することができるように、適切なタンパク質フレームワークに埋め込まれ、
好ましくは、結合タンパク質が、
a)配列番号１および２；３および４、５および６ならびに／または２０および２１の対に記載された重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）対を含む抗体；
b)ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）対を含む抗体であって、ただし、
・ＨＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して≧８０％の配列同一性を有する、および／もしくは
・ＬＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して≧８０％の配列同一性を有する、抗体；ならびに／または
c)ａ）またはｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）対を含む抗体であって、ただし、ＨＣＶＤまたはＬＣＶＤの少なくとも１つが、それぞれの配列番号に対して１０個までのアミノ酸置換を有する、抗体；
であって、
前記結合タンパク質は、依然として十分な結合親和性でＲＯＲ１に結合することができる、
請求項２、４、６、８および１０のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体、および免疫腫瘍学的適用におけるその使用に関する。
本発明は、１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体、および免疫腫瘍学的適用におけるその使用に関する。
【0002】
発明の背景
抗体－薬物－融合体（ＡＤＣ）を最も顕著な代表とする、結合タンパク質－毒素融合体は、癌治療において非常に大きな影響を与え、これまで治療することができなかった腫瘍型に対する新しい治療アプローチを提供した。
抗体－薬物－融合体（ＡＤＣ）を最も顕著な代表とする、結合タンパク質－毒素融合体は、癌治療において非常に大きな影響を与え、これまで治療することができなかった腫瘍型に対する新しい治療アプローチを提供した。
【0003】
一方、免疫チェックポイントの発見や免疫チェックポイント阻害薬の開発は、癌治療における免疫系の役割、および免疫系を刺激する方法、あるいはそれぞれの腫瘍が免疫系の攻撃に対する自己防御に用いる免疫チェックポイントを克服する方法に再び焦点を当ててきた。
【0004】
どちらのアプローチも非常に熱心に議論され、癌の治療において著しい進歩を示してきたが、これらの新しいアプローチでは治療できない腫瘍型が存在することも明らかとなった。
【0005】
例えば、特定の毒素を有するＡＤＣはそれらの抗体によって癌特異的抗原に対処するが、特定の癌型に対して活性ではないことが示されている。また、免疫チェックポイント阻害剤が効力を持たない腫瘍型が存在することも示されている。
【0006】
従って、本発明の１つの目的は、既存の治療法ではこれまで対処できなかった腫瘍型を治療可能にする新たな手法を提供することである。
【0007】
本発明のさらなる目的の１つは、対応する単剤療法の抗腫瘍活性を増加させる併用療法を提供することである。
【0008】
本発明およびさらなる目的は、独立請求項に記載の方法および手段によって達成される。従属請求項は、特定の実施形態に関連する。
【0009】
発明の概要
本発明は、１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体、および免疫腫瘍学的適用におけるその使用を提供する。
本発明及びその特徴の一般的な利点を以下に詳細に説明する。
本発明は、１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体、および免疫腫瘍学的適用におけるその使用を提供する。
本発明及びその特徴の一般的な利点を以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【0011】
【0012】
【0013】
【図4】図４は、ＥＭＴ－６－ＲＯＲ１（クローン１４）乳癌細胞を同所移植した同系マウスにおける腫瘍体積の変化を示す。（Ａ）ベヒクル対照（ＰＢＳ）の注射、または（Ｂ）抗ＣＤ３０抗体ブレンツキシマブ、クローンＡｃ１０を含む、アイソタイプ適合対照ＰＮＵ－ＡＤＣを０．２５ｍｇ／ｋｇ単回投与、または（Ｃ）新規抗ＲＯＲ１抗体ＸＢＲ１－４０２を含む抗ＲＯＲ１ ＰＮＵ－ＡＤＣを、０．２５ｍｇ／ｋｇ単回投与のいずれかであり、これは、図３によれば、マウスにおける同所性ＥＭＴ－６－ＲＯＲ１乳房腫瘍の治療に最適以下の用量であると決定されている。パネル（Ｄ）および（Ｅ）は、示されるように、０．２５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ適合対照ＡＤＣ Ａｃ１０および０．２５ｍｇ／ｋｇの新規抗ＲＯＲ１ ＰＮＵ ＡＤＣを用いた、抗ＣＴＬＡ４免疫チェックポイント阻害剤抗体９Ｄ９による組合せ処置を示す。（Ｆ）は、以下の群についてのメジアン群腫瘍体積変化（Ｍｅｄｉａｎ ｇｒｏｕｐ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｌａｓｔ－Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ－Ｃａｒｒｉｅｄ－Ｆｏｒｗａｒｄ（ＬＯＣＦ）法を適用）を示す。ベヒクル対照、Ａｃ１０－Ｇ５－ＰＮＵアイソタイプ対照およびＸＢＲ１－４０２－Ｇ５－ＰＮＵ；（Ｇ）は、以下の群についてのメジアン群腫瘍体積変化（Ｍｅｄｉａｎ ｇｒｏｕｐ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｌａｓｔ－Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ－Ｃａｒｒｉｅｄ－Ｆｏｒｗａｒｄ（ＬＯＣＦ）法を適用）を示す。ベヒクル対照、Ａｃ１０－Ｇ５－ＰＮＵアイソタイプ対照および抗マウスＣＴＬＡ－４抗体９Ｄ９、ならびに、ＸＢＲ１－４０２－Ｇ５－ＰＮＵおよび抗マウスＣＴＬＡ－４抗体９Ｄ９；
【0014】
【0015】
【図6】図６は、実施例６に従って、ＣＴ－２６－ＲＯＲ１クローン３腫瘍細胞を移植したマウスにおける腫瘍体積変化（Ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を示す。（Ａ）グループ１のベヒクル対照（未処理）、（Ｂ）グループ２のアイソタイプ対照、（Ｃ）グループ３の抗ＲＯＲ１ ＡＤＣ ｈｕＸＢＲ１－４０２－１７、（Ｄ）アイソタイプ対照＋グループ４の免疫チェックポイント阻害剤抗マウスＰＤ－１抗体、（Ｅ）抗ＲＯＲ１ ＡＤＣ ｈｕＸＢＲ１－４０２－１７＋グループ７の免疫チェックポイント阻害剤抗マウスＰＤ－１抗体。パネルＡ～Ｅの挿入図は、各処置群のマウスの数と比較して、腫瘍増殖が阻止されたマウスの数を提供する。結果は、評価された免疫チェックポイント阻害剤と標的化ＰＮＵ誘導体含有ＡＤＣとの間の協力を示唆する。
【0016】
【図7】図７は、実施例７と同様に、ＲＯＲ１過剰発現のＢ１６プールの静脈内適用後、ベヒクル対照で処理後（「ベヒクル」、グループ１）、免疫チェックポイント阻害剤抗マウスＣＴＬＡ－４抗体で処理後（「ＣＴＬＡ－４」、グループ２）、抗ＲＯＲ１ ＡＤＣ ｈｕＸＢＲ１－４０２－１７で処理後（「ＡＤＣ」、グループ３）、および抗ＲＯＲ１ ＡＤＣ ｈｕＸＢＲ１－４０２－１７＋免疫チェックポイント阻害剤抗マウスＣＴＬＡ－４抗体で処理後（「ＡＤＣ＋ＣＴＬＡ－４」、グループ４）の、マウスにおける肺表面コロニー体積を示す。これらの結果は、免疫原性の低い腫瘍において、評価された免疫チェックポイント阻害剤と標的化ＰＮＵ誘導体を含むＡＤＣとの間の強力な相乗作用を示唆する。「ｎ．ｓ．」は、統計的に有意に異ならず、「＊」は統計的に有意に異なることを示す。
【0017】
【0018】
【0019】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、そのようなデバイスおよび方法は変化し得るので、説明されたデバイスの特定の構成要素部分または説明された方法のプロセスステップに限定されないことを理解されたい。
また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことを理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明白に別段の指示をしない限り、単数形および／または複数の言及を含むことに留意しなければならない。さらに、数値で区切られたパラメータ範囲が与えられた場合、その範囲はこれらの制限値を含むものとみなされることも理解されるべきである。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、そのようなデバイスおよび方法は変化し得るので、説明されたデバイスの特定の構成要素部分または説明された方法のプロセスステップに限定されないことを理解されたい。
また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことを理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明白に別段の指示をしない限り、単数形および／または複数の言及を含むことに留意しなければならない。さらに、数値で区切られたパラメータ範囲が与えられた場合、その範囲はこれらの制限値を含むものとみなされることも理解されるべきである。
【0020】
さらに、本明細書に開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されることを意味しないことを理解されたい。
一実施形態で論じられた特徴は、本明細書に示された他の実施形態に関連しても開示されることが意図される。
１つの場合において、特定の特徴が１つの実施形態で開示されず、別の実施形態で開示される場合、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることを意味しないことを必ずしも意味しないことを理解するのであろう。
他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の要旨であるが、明確にするために、および明細書を管理可能なボリュームに保つために、これは行われていないことを、当業者は理解するのであろう。
一実施形態で論じられた特徴は、本明細書に示された他の実施形態に関連しても開示されることが意図される。
１つの場合において、特定の特徴が１つの実施形態で開示されず、別の実施形態で開示される場合、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることを意味しないことを必ずしも意味しないことを理解するのであろう。
他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の要旨であるが、明確にするために、および明細書を管理可能なボリュームに保つために、これは行われていないことを、当業者は理解するのであろう。
【0021】
さらに、本明細書で記載される先行技術文献の内容は、参照により組み込まれる。
これは、特に、標準的または日常的な方法を開示する先行技術文献を指す。
その場合、参照による組み入れは、主に、十分な可能な開示を提供し、長い繰り返しを回避する目的を有する。
これは、特に、標準的または日常的な方法を開示する先行技術文献を指す。
その場合、参照による組み入れは、主に、十分な可能な開示を提供し、長い繰り返しを回避する目的を有する。
【0022】
本発明の一態様によれば、以下の患者の治療のため（の医薬品の製造のため）に、結合タンパク質に融合された１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む、結合タンパク質－毒素融合体が提供される：
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患に罹患している患者、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患を発症する危険性がある患 者、および／または、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患と診断されている患者。
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患に罹患している患者、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患を発症する危険性がある患 者、および／または、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患と診断されている患者。
【0023】
括弧内の「医薬品の製造のため」という上記用語は、所与の化合物の医学的使用を対象とするクレームに関する異なる国内／地域の要件を満たすように選択されていることを強調することが重要である。
この用語がいわゆるスイス型フォーマット（「医薬品の製造のため」という修飾語が必要とされる場合）および、ＥＰＣ２０００に基づくそれぞれのクレーム言語（同じ修飾語は、もはや許されない場合）の両方を特に包含すべきである。
この用語がいわゆるスイス型フォーマット（「医薬品の製造のため」という修飾語が必要とされる場合）および、ＥＰＣ２０００に基づくそれぞれのクレーム言語（同じ修飾語は、もはや許されない場合）の両方を特に包含すべきである。
【0024】
本発明の別の態様によれば、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒであることを特徴とする腫瘍性疾患を治療または予防する方法が提供され、前記方法は、１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体を患者に投与することを含む。
【0025】
本発明の別の態様によれば、以下の組合せが、
(i)１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含み、結合タンパク質に融合された結 合タンパク質－毒素融合体、および、
(ii)免疫チェックポイント阻害剤；
以下の患者の治療のため（の医薬品の製造のため）に提供される
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患に罹患している患者、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患を発症する危険性がある患 者、および／または、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患と診断されている患者。
(i)１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含み、結合タンパク質に融合された結 合タンパク質－毒素融合体、および、
(ii)免疫チェックポイント阻害剤；
以下の患者の治療のため（の医薬品の製造のため）に提供される
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患に罹患している患者、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患を発症する危険性がある患 者、および／または、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患と診断されている患者。
【0026】
ここで、結合タンパク質－毒素融合体および免疫チェックポイント阻害剤は、同時に、または、任意の順序で、連続して患者に投与される。
【0027】
本発明の別の態様によれば、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒであることを特徴とする腫瘍性疾患を治療または予防する方法が提供され、前記方法は、患者に、以下を投与することを含む
(i)１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含み、結合タンパク質に融合された結 合タンパク質－毒素融合体、および
(ii)免疫チェックポイント阻害剤。
(i)１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含み、結合タンパク質に融合された結 合タンパク質－毒素融合体、および
(ii)免疫チェックポイント阻害剤。
【0028】
ここで、結合タンパク質－毒素融合体および免疫チェックポイント阻害剤は、同時に、または任意の順序で、連続して患者に投与される。
【0029】
本発明の別の態様によれば、結合タンパク質に結合された１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体が、以下の患者の治療に使用するため（の医薬品の製造のため）の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用するために提供される。
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患に罹患している患者、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患を発症する危険性がある患 者、および／または、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患と診断されている患者。
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患に罹患している患者、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患を発症する危険性がある患 者、および／または、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患と診断されている患者。
【0030】
本発明の別の態様によれば、下記の患者の治療に使用するため（の医薬品の製造のため）に、結合タンパク質に融合された１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体と組み合わせて使用するための免疫チェックポイント阻害剤である：
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患に罹患している患者、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患を発症する危険性がある患 者、および／または、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患と診断されている患者。
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患に罹患している患者、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患を発症する危険性がある患 者、および／または、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患と診断されている患者。
【0031】
一実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤が、陽性免疫チェックポイントタンパク質を調節する。別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤が陰性の免疫チェックポイントタンパク質を調節する。
【0032】
１つの実施形態において、１つ以上のアントラサイクリン毒素を含む結合タンパク質－毒素融合体は、免疫チェックポイント阻害剤の前に投与される。
【0033】
一実施形態では、患者は、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患に罹患している、および／ または、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患と診断された。
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患に罹患している、および／ または、
・ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる腫瘍性疾患と診断された。
【0034】
「ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ」とは、免疫細胞の浸潤を特徴とする癌性または腫瘍性組織をいう。
免疫浸潤のレベルが、免疫系が腫瘍を認識し、関与しているかどうかを反映する。
「ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ」という用語は、ここでは、「免疫応答性腫瘍」という用語と同義に使用される。
あるいは「ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ」とは、免疫チェックポイント阻害剤による治療に反応する腫瘍と定義され得る。
免疫浸潤のレベルが、免疫系が腫瘍を認識し、関与しているかどうかを反映する。
「ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ」という用語は、ここでは、「免疫応答性腫瘍」という用語と同義に使用される。
あるいは「ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ」とは、免疫チェックポイント阻害剤による治療に反応する腫瘍と定義され得る。
【0035】
本明細書中で使用される場合、「治療に応答する」という語は、比較可能なベヒクルまたはアイソタイプ対照治療と比較して、全身腫瘍組織量または増殖の統計的に有意な減少を手段する。
【0036】
一実施形態では、「ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ」という用語は、免疫細胞浸潤が乏しいか、または免疫細胞浸潤がないことを特徴とする癌性組織または腫瘍性組織を定義する。
「ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ」という用語は、本明細書では、「免疫学的に応答しない腫瘍」という用語と同義的に使用される。
「ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ」という用語は、本明細書では、「免疫学的に応答しない腫瘍」という用語と同義的に使用される。
【0037】
腫瘍が、「ｃｏｌｄ」とみなされるためのひとつの基準は、腫瘍の試料中の２種類のＴ細胞の密度に基づく、いわゆるＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅである。
１つの例は、腫瘍の中心部（ＣＴ）および腫瘍の侵襲性辺縁部（ＩＭ）の両方における２つのリンパ球集団（ＣＤ３／ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ３／ＣＤ８またはＣＤ８／ＣＤ４５ＲＯ）の密度である。
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、両方の細胞型の低密度が両領域に認められる、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ ０（Ｉ０）から、両領域に高密度が認められるＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ ４（Ｉ４）までの範囲のスコアを提供する。
１つの例は、腫瘍の中心部（ＣＴ）および腫瘍の侵襲性辺縁部（ＩＭ）の両方における２つのリンパ球集団（ＣＤ３／ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ３／ＣＤ８またはＣＤ８／ＣＤ４５ＲＯ）の密度である。
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、両方の細胞型の低密度が両領域に認められる、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ ０（Ｉ０）から、両領域に高密度が認められるＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ ４（Ｉ４）までの範囲のスコアを提供する。
【0038】
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅを決定する方法は、例えば、Ｇａｌｏｎら、２０１４、Ｐａｇｅｓら、２００９、Ａｎｇｅｌｌら、２０１３、およびＧａｌｏｎら、２０１３に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0039】
これまで、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅの低い腫瘍（「ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ」）は、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－Ｌ１抗体などの免疫チェックポイント阻害剤による治療にあまり応答しないが、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅの高い腫瘍は、そのような治療に応答することが論じられてきた（Ｂｕら、２０１６参照）。
理論に束縛されることなく、この知見の背景にある根拠は、もしそれぞれの腫瘍に免疫関与がなければ、与えられた阻害剤による免疫チェックポイントの阻害は、良いものに何も変化させることができないということであろう。
理論に束縛されることなく、この知見の背景にある根拠は、もしそれぞれの腫瘍に免疫関与がなければ、与えられた阻害剤による免疫チェックポイントの阻害は、良いものに何も変化させることができないということであろう。
【0040】
本発明者らは、１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む、結合タンパク質－毒素融合体が腫瘍において特に免疫学的有効性を有し、とりわけ、腫瘍再攻撃からの免疫防御をもたらすことを理解した。
この驚くべき知見は、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－Ｌ１抗体のように、免疫チェックポイント阻害剤でなされた知見からは予想できなかった。
後者に適用される理論的根拠は、１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体には適用されない可能性が高い。
この驚くべき知見は、抗ＰＤ－１、抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－Ｌ１抗体のように、免疫チェックポイント阻害剤でなされた知見からは予想できなかった。
後者に適用される理論的根拠は、１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体には適用されない可能性が高い。
【0041】
本発明の一実施形態によれば、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴付けられる腫瘍性疾患は、不応答性であるか、免疫チェックポイント阻害剤治療に抵抗性であるか、または免疫チェックポイント阻害剤治療後に再発する腫瘍である。
【0042】
本明細書中で使用される場合、用語「不応答」は、免疫チェックポイント阻害剤での治療に応答して、腫瘍収縮または安定化もしくは収縮の持続時間の点で、好ましい方法で合理的に応答しないか、または応答しなかった腫瘍をいう。
【0043】
本明細書中で使用される場合、用語「抵抗性」は、免疫チェックポイント阻害剤での３ヶ月以上の間の治療に応答して、腫瘍収縮または安定化もしくは収縮の持続時間の点で、好ましい方法で合理的に応答しないか、または応答しなかった腫瘍をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「再発性」は通常、腫瘍が検出され得ない期間の後に、免疫チェックポイント阻害剤での治療の後に復帰した腫瘍をいう。腫瘍は、対象の体内の同じ場所または別の場所に戻ることがある。
本明細書中で使用される場合、用語「再発性」は通常、腫瘍が検出され得ない期間の後に、免疫チェックポイント阻害剤での治療の後に復帰した腫瘍をいう。腫瘍は、対象の体内の同じ場所または別の場所に戻ることがある。
【0044】
免疫チェックポイント阻害剤によるこのような処置は、好ましくは単剤であった。
【0045】
免疫チェックポイント阻害剤によるこのような処置は、好ましくはそれぞれの薬物能書またはＳＯＰＣにおいて推奨される用量またはレジメンにおいて投与される。
【0046】
本発明の一実施形態によれば、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒであることを特徴とする腫瘍性疾患は、以下からなる群から選択される：
・黒色腫，
・大腸癌または大腸腫瘍、
・膵臓癌や膵腫瘍
・膠芽腫、
・卵巣癌または腫瘍、および／または
・前立腺癌または腫瘍。
・黒色腫，
・大腸癌または大腸腫瘍、
・膵臓癌や膵腫瘍
・膠芽腫、
・卵巣癌または腫瘍、および／または
・前立腺癌または腫瘍。
【0047】
本発明の一実施形態によれば、結合タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの標的に結合する：
・ＲＯＲ１
・ＣＳ１
・ＨＥＲ２
・メソテリン（ＭＮ）および／または
・ＲＯＲ２。
・ＲＯＲ１
・ＣＳ１
・ＨＥＲ２
・メソテリン（ＭＮ）および／または
・ＲＯＲ２。
【0048】
これらの中でも、ＲＯＲ１が好ましい標的である。
【0049】
これらの標的、およびその獲得抗体は、以下の刊行物に記載されている
・ＵＳ２０１９１１２３８５Ａ１（メソテリン）
・ＵＳ２０１９１５３０９２Ａ１、ＷＯ２０１９０１６３８１（ＲＯＲ１）
・ＷＯ２０１９０３０２４０Ａ１（ＣＳ－１）、
・ＵＳ２０１８０２８６８２（ＨＥＲ２）および
・ＷＯ２０１９０１６３９２Ａ１（ＲＯＲ２）、
その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
・ＵＳ２０１９１１２３８５Ａ１（メソテリン）
・ＵＳ２０１９１５３０９２Ａ１、ＷＯ２０１９０１６３８１（ＲＯＲ１）
・ＷＯ２０１９０３０２４０Ａ１（ＣＳ－１）、
・ＵＳ２０１８０２８６８２（ＨＥＲ２）および
・ＷＯ２０１９０１６３９２Ａ１（ＲＯＲ２）、
その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0050】
好ましくは、前記標的は、ヒト由来のものである。特に、ＲＯＲ１は、本明細書中で言及される場合、好ましくはヒトＲＯＲ１を意味する。
【0051】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫チェックポイント阻害剤」は、免疫チェックポイントタンパク質に対して作用するために適切な、任意の結合剤または化合物をいう。
特に、「免疫チェックポイント阻害剤」は、免疫系の活性、特に、癌細胞を認識し、そしてそれらに対して作用する、Ｔ細胞の能力を支持するために、免疫チェックポイントタンパク質の活性を調節するために適切な任意の結合剤または化合物をいう。
免疫チェックポイントタンパク質は、陽性（すなわち、それらはＴ細胞活性および免疫応答を支持する）または陰性（すなわち、それらはＴ細胞活性および免疫応答を制限する）であり得る。
陽性の免疫チェックポイントタンパク質の場合では、免疫チェックポイント阻害剤はこの免疫チェックポイントタンパク質の活性を促進するのに適した結合剤または化合物を意味する。
陰性の免疫チェックポイントタンパク質の場合では、免疫チェックポイント阻害剤は、この免疫チェックポイントタンパク質の活性を阻害するのに適した結合剤または化合物を意味する。
特に、「免疫チェックポイント阻害剤」は、免疫系の活性、特に、癌細胞を認識し、そしてそれらに対して作用する、Ｔ細胞の能力を支持するために、免疫チェックポイントタンパク質の活性を調節するために適切な任意の結合剤または化合物をいう。
免疫チェックポイントタンパク質は、陽性（すなわち、それらはＴ細胞活性および免疫応答を支持する）または陰性（すなわち、それらはＴ細胞活性および免疫応答を制限する）であり得る。
陽性の免疫チェックポイントタンパク質の場合では、免疫チェックポイント阻害剤はこの免疫チェックポイントタンパク質の活性を促進するのに適した結合剤または化合物を意味する。
陰性の免疫チェックポイントタンパク質の場合では、免疫チェックポイント阻害剤は、この免疫チェックポイントタンパク質の活性を阻害するのに適した結合剤または化合物を意味する。
【0052】
免疫チェックポイントは、免疫系を調節するタンパク質であり（Ｐａｒｄｏｌｌ Ｄ．Ｍ．「癌免疫療法における免疫チェックポイントの遮断（Ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｇｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」，Ｎａｔｕｒｅ、２０１２、第１２巻、２５２－２６４頁）、免疫系が細胞を無差別に攻撃するのを妨げる自己寛容にきわめて重要であり、好ましくは、以下の表に開示されている群から選択される：
例えば、Ｔ細胞の表面上に発現されたＰＤ－１チェックポイントタンパク質は、それらのＴ細胞が、体内の他の細胞を攻撃することを阻止するように作用する。
Ｔ細胞ＰＤ－１が、細胞表面のＰＤ－Ｌ１に結合すると、Ｔ細胞はその細胞に対する免疫応答を引き起こさない。
ある種の癌細胞は高レベルのＰＤ－Ｌ１を発現しており、免疫系の攻撃を回避するのに役立っている。
したがって、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１のいずれかと結合し、それらの相互の結合を阻害する抗体は、癌細胞に対する免疫応答を促進するのに役立つ。
ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞上に発現される別のそのような陰性の免疫チェックポイントタンパク質である。
【表1】
Ｔ細胞ＰＤ－１が、細胞表面のＰＤ－Ｌ１に結合すると、Ｔ細胞はその細胞に対する免疫応答を引き起こさない。
ある種の癌細胞は高レベルのＰＤ－Ｌ１を発現しており、免疫系の攻撃を回避するのに役立っている。
したがって、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１のいずれかと結合し、それらの相互の結合を阻害する抗体は、癌細胞に対する免疫応答を促進するのに役立つ。
ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞上に発現される別のそのような陰性の免疫チェックポイントタンパク質である。
【0053】
一群の実施形態によれば、腫瘍性疾患は、Ｉ＜１のＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅを有することを特徴とするｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして特徴づけられる。
【0054】
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、癌に浸潤し周囲を取り巻く免疫細胞をもとに、癌患者の予後診断を推測する手法である。
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、大腸癌において国際的に検証されている。
細胞毒性Ｔ細胞および記憶Ｔ細胞と、大腸癌患者の生存との正の関連を明らかにしたＧａｌｏｎら（２００６）の知見に基づくものである。
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、大腸癌において国際的に検証されている。
細胞毒性Ｔ細胞および記憶Ｔ細胞と、大腸癌患者の生存との正の関連を明らかにしたＧａｌｏｎら（２００６）の知見に基づくものである。
【0055】
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、宿主免疫応答の影響を癌分類に組み込み、予後の正確性を向上させる。
腫瘍の中心部および周辺部における２つのＴリンパ球集団（ＣＤ３／ＣＤ８、ＣＤ３／ＣＤ４５ＲＯまたはＣＤ８／ＣＤ４５ＲＯ）の密度を測定する。
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、両方の細胞型の低密度が両領域に認められる場合には、０（Ｉ０）から、高密度が両領域に認められる場合にはＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ ４（Ｉ４）までの範囲のスコアを提供する。
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、腫瘍の周辺部にある免疫細胞がどのように組織化されているか、または、Ｂ細胞、三次リンパ構造および胚中心の量を測定するものではない。これらはすべて、結腸直腸癌をはじめとする癌に対する免疫応答において重要な役割を果たしている。
腫瘍の中心部および周辺部における２つのＴリンパ球集団（ＣＤ３／ＣＤ８、ＣＤ３／ＣＤ４５ＲＯまたはＣＤ８／ＣＤ４５ＲＯ）の密度を測定する。
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、両方の細胞型の低密度が両領域に認められる場合には、０（Ｉ０）から、高密度が両領域に認められる場合にはＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ ４（Ｉ４）までの範囲のスコアを提供する。
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、腫瘍の周辺部にある免疫細胞がどのように組織化されているか、または、Ｂ細胞、三次リンパ構造および胚中心の量を測定するものではない。これらはすべて、結腸直腸癌をはじめとする癌に対する免疫応答において重要な役割を果たしている。
【0056】
一実施形態では、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、Ｉ０またはＩ１のｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅを有する腫瘍であり、好ましくはＩ１のｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅを有る腫瘍ある。
【0057】
別の実施形態では、「ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ」という用語は、免疫細胞浸潤の欠如または不十分を特徴とする癌性または腫瘍性組織を定義する。
免疫浸潤のレベルは、免疫系が腫瘍を認識しているかどうかを反映する。
免疫浸潤のレベルは、免疫系が腫瘍を認識しているかどうかを反映する。
【0058】
別の実施形態では、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、免疫チェックポイント阻害剤が単独療法としてインビボで投与される場合、免疫チェックポイント阻害剤に応答しない腫瘍である。
この実施形態では、免疫能力のあるマウスモデル（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ）と比較して、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、マウスにおいて確立されると、約１０ｍｇ／ｋｇまで、または２０ｍｇ／ｋｇまで、またはそのマウスモデルにおける最大耐量（ＭＴＤ）までの単剤療法として投与される免疫チェックポイント阻害剤に対して有意に応答しない腫瘍である（ベヒクル対照群と比較して）。
ヒトにおいて、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、別の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤の用法・用量に従って、例えば、１０ｍｇ／ｋｇまで、例えば、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または２００もしくは２４０ｍｇで、任意に２～３週間ごとに投与する単剤療法として投与された免疫チェックポイント阻害剤に有意に応答しない腫瘍である。
この実施形態では、免疫能力のあるマウスモデル（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ）と比較して、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、マウスにおいて確立されると、約１０ｍｇ／ｋｇまで、または２０ｍｇ／ｋｇまで、またはそのマウスモデルにおける最大耐量（ＭＴＤ）までの単剤療法として投与される免疫チェックポイント阻害剤に対して有意に応答しない腫瘍である（ベヒクル対照群と比較して）。
ヒトにおいて、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、別の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤の用法・用量に従って、例えば、１０ｍｇ／ｋｇまで、例えば、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または２００もしくは２４０ｍｇで、任意に２～３週間ごとに投与する単剤療法として投与された免疫チェックポイント阻害剤に有意に応答しない腫瘍である。
【0059】
別の実施形態では、ヒト固形腫瘍と比較して、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、２０００年２月に公表された、ＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ Ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）基準（Ｔｈｅｒａｓｓｅ Ｐ．ら、「Ｎｅｗ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｔｏ Ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｖｏｌ． ９２， Ｎｏ． ３， Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２， ２０００）と比較して定義することができる（２００９年（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ Ｅ．Ａ．ら， “Ｎｅｗ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｕｒｓ： Ｒｅｖｉｓｅｄ ＲＥＣＩＳＴ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ （ｖｅｒｓｉｏｎ １．１）”， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｖｏｌｕｍｅ ４５， Ｉｓｓｕｅ ２， ２２８ - ２４７）にアップデートされた）。
この文脈において、別の実施形態では、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、免疫チェックポイント阻害剤の能書の指示に従って投与された１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤での処置後に、部分応答（「ＰＲ」；すなわち、進行性（「ＰＤ」、進行性疾患）であるか、または安定なままである（「ＳＤ」、安定な疾患））未満に関連する腫瘍である。
別の実施形態では、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、少なくとも６週間、好ましくは少なくとも８週間、より好ましくは少なくとも１２週間にわたって投与された、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤での処置後に、部分応答（「ＰＲ」；すなわち、進行性（「ＰＤ」、進行性疾患）であるか、または安定なままである（「ＳＤ」、安定な疾患））未満に関連する腫瘍である。
別の実施形態では、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、抗ＰＤ－Ｌ１治療後に進行性である乳がん腫瘍である。
この文脈において、別の実施形態では、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、免疫チェックポイント阻害剤の能書の指示に従って投与された１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤での処置後に、部分応答（「ＰＲ」；すなわち、進行性（「ＰＤ」、進行性疾患）であるか、または安定なままである（「ＳＤ」、安定な疾患））未満に関連する腫瘍である。
別の実施形態では、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、少なくとも６週間、好ましくは少なくとも８週間、より好ましくは少なくとも１２週間にわたって投与された、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤での処置後に、部分応答（「ＰＲ」；すなわち、進行性（「ＰＤ」、進行性疾患）であるか、または安定なままである（「ＳＤ」、安定な疾患））未満に関連する腫瘍である。
別の実施形態では、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、抗ＰＤ－Ｌ１治療後に進行性である乳がん腫瘍である。
【0060】
別の実施形態では、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、免疫チェックポイント阻害剤の能書の指示に従って投与された１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤の少なくとも６週間後、好ましくは少なくとも８週間後、より好ましくは少なくとも１２週間後に進行性疾患（「ＰＤ」）に関連する腫瘍である。
【0061】
別の実施形態では、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤に反応しなくなる腫瘍、すなわち、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤による治療に以前に反応したが、反応しなくなった腫瘍である。
【0062】
別の実施形態において、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒはまた、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤に対する初期応答の後に再発する（すなわち、治療に対する減少した応答をする）腫瘍として定義され得、ここで、後者は、免疫チェックポイント阻害剤の能書の指示に従って投薬される。
【0063】
別の実施形態では、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒは、臨床医によってｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして分類された腫瘍である。
ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒの中でも特定非限定的な例として、マイクロサテライト不安定性が低い結腸直腸癌腫瘍が挙げられる（ＭＳＩ－ｌｏｗ； Ｓｉｎｉｃｒｏｐｅ、Ｆ．「結腸直腸癌管理におけるマイクロサテライト不安定性検査の役割」“Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ”、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １４、Ｉｓｓｕｅ ７ Ｊｕｌｙ ２０１６）。
このような腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤に対して非応答性であることが知られている。これらの腫瘍は非応答を確立するために１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤で最初に治療することなしに、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして同定することができる。
ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒの中でも特定非限定的な例として、マイクロサテライト不安定性が低い結腸直腸癌腫瘍が挙げられる（ＭＳＩ－ｌｏｗ； Ｓｉｎｉｃｒｏｐｅ、Ｆ．「結腸直腸癌管理におけるマイクロサテライト不安定性検査の役割」“Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ”、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １４、Ｉｓｓｕｅ ７ Ｊｕｌｙ ２０１６）。
このような腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤に対して非応答性であることが知られている。これらの腫瘍は非応答を確立するために１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤で最初に治療することなしに、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとして同定することができる。
【0064】
上述したように、「ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ」は、抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４抗体のような、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対してあまり応答しない。
この現象の背後にある理論的根拠は、もしそれぞれの腫瘍に免疫系が関与していなければ、所定の阻害剤による免疫チェックポイントの阻害は、より良いものに何も変化させることはできないということであろう。
この現象の背後にある理論的根拠は、もしそれぞれの腫瘍に免疫系が関与していなければ、所定の阻害剤による免疫チェックポイントの阻害は、より良いものに何も変化させることはできないということであろう。
【0065】
特に、黒色腫、結腸直腸癌または腫瘍、膵臓癌または腫瘍、神経膠芽腫、卵巣がんまたは腫瘍および前立腺癌または腫瘍のサブセットは、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒであることが知られている。
【0066】
本発明者らは、
（ｉ）結合タンパク質に融合された１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体、および
（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害剤を含む処置を用いて、このようなｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒが効果的に処置され得ることを示す。
（ｉ）結合タンパク質に融合された１つ以上のアントラサイクリン毒素部分を含む結合タンパク質－毒素融合体、および
（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害剤を含む処置を用いて、このようなｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒが効果的に処置され得ることを示す。
【0067】
この知見は驚くべきものであり、抗ＰＤ－１療法、抗ＣＴＬＡ－４療法または抗ＰＤ－Ｌ１療法のような免疫チェックポイント阻害剤でなされた知見、およびアントラサイクリンを含む結合タンパク質－毒素融合体でなされた知見からは予想できなかった。
理論に束縛されるものではないが、アントラサイクリン含有結合タンパク質－毒素融合体は、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒを、免疫チェックポイント療法に感受性にする、すなわち、それらを、ｈｏｔ ｔｕｍｏｒに形質転換することができ、その結果、それらを免疫チェックポイント阻害剤で効率的に治療することができる。
理論に束縛されるものではないが、アントラサイクリン含有結合タンパク質－毒素融合体は、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒを、免疫チェックポイント療法に感受性にする、すなわち、それらを、ｈｏｔ ｔｕｍｏｒに形質転換することができ、その結果、それらを免疫チェックポイント阻害剤で効率的に治療することができる。
【0068】
好ましくは、２つの異なる薬剤が患者に投与される間隔が最大４週間以下である。
【0069】
１つの実施形態において、１つ以上のアントラサイクリン毒素を含む結合タンパク質－毒素融合体は、免疫チェックポイント阻害剤の前に投与される。
【0070】
一実施形態によれば、少なくとも１つのアントラサイクリン毒素部分は、ＰＮＵ－１５９６８２であり、これは、（Ｑｕｉｎｔｉｅｒｅｉら、２００５）に開示されている。
【0071】
別の実施形態によれば、少なくとも１つのアントラサイクリン毒素部分は、以下の式（ｉ）を有するアントラサイクリンＰＮＵ－１５９６８２の誘導体である
前記毒素は、リンカーを介して、その波状の部分で結合タンパク質に融合されている。
【化1】
【0072】
ＰＮＵ由来アントラサイクリンおよび抗体薬物融合体におけるその使用は、同じ出願人に譲渡されたＷＯ２０１６１０２６７９に可能に開示されている。この刊行物の含有量は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0073】
別の群の実施形態によれば、免疫チェックポイント阻害剤は、以下からなる群から選択される少なくとも１つである。
・抗ＰＤ－１
・抗ＰＤ－Ｌ１
・抗ＰＤ－Ｌ２
・抗ＣＴＬＡ－４
・抗ＬＡＧ３
・抗ＣＤ４０または抗ＣＤ４０Ｌ
・抗ＴＩＭ３、
・抗ＯＸ４０または抗ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４／ＣＤ１３４Ｌ）、
・抗ＣＤ１１２
・抗ＣＤ１５５
・抗Ｂ７－Ｈ３
・抗Ｂ７－Ｈ４
・抗ＩＤＯ１
・抗ＩＤＯ２
・抗ＴＤＯ２
・抗ＴＩＧＩＴ
・抗ＧＩＴＲ、および／または
・抗ガレクチン－９。
・抗ＰＤ－１
・抗ＰＤ－Ｌ１
・抗ＰＤ－Ｌ２
・抗ＣＴＬＡ－４
・抗ＬＡＧ３
・抗ＣＤ４０または抗ＣＤ４０Ｌ
・抗ＴＩＭ３、
・抗ＯＸ４０または抗ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４／ＣＤ１３４Ｌ）、
・抗ＣＤ１１２
・抗ＣＤ１５５
・抗Ｂ７－Ｈ３
・抗Ｂ７－Ｈ４
・抗ＩＤＯ１
・抗ＩＤＯ２
・抗ＴＤＯ２
・抗ＴＩＧＩＴ
・抗ＧＩＴＲ、および／または
・抗ガレクチン－９。
【0074】
【0075】
【0076】
【0077】
【0078】
【0079】
【0080】
【0081】
【0082】
【0083】
【0084】
上記チェックポイント阻害剤の中で、以下に、結合または拮抗する化合物またはモノクローナル抗体
・ＰＤ－１
・ＰＤ－Ｌ１
・ＣＴＬＡ－４、および／または
・Ｂ７
が特に好ましく、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１が最も好ましい標的である。
・ＰＤ－１
・ＰＤ－Ｌ１
・ＣＴＬＡ－４、および／または
・Ｂ７
が特に好ましく、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１が最も好ましい標的である。
【0085】
別の群の実施形態によれば、融合体は、その波線で、リンカー構造Ｘ－Ｌ1－Ｌ2－Ｌ3－Ｙを含み、ここで、Ｌ1－Ｌ3はリンカーを表し、Ｌ1－Ｌ3の２つは必須であり、ここで、ＸおよびＹはさらに、それぞれ１つ以上の任意のリンカーを表す。
【0086】
別の群の実施形態によれば、リンカー構造は、Ｌ2として、直接、または別のリンカーＬ1の手段によって、前記アントラサイクリン誘導体に結合されたオリゴグリシンペプチド（Ｇｌｙ）nを含み、ここで、ｎは、≧１および≦２１、好ましくは２～５の整数である。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは、場合により、オリゴアラニン（Ａｌａ）nまたは混合Ｇｌｙ／Ａｌａペプチドによって置換され得ることを理解することが大切である。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは、場合により、オリゴアラニン（Ａｌａ）nまたは混合Ｇｌｙ／Ａｌａペプチドによって置換され得ることを理解することが大切である。
【0087】
別の群の実施形態によれば、オリゴグリシンペプチド（Ｇｌｙ）nは、Ｌ1と呼ばれるアルキレンジアミノリンカー（ＥＤＡ）の手段によって、式（ｉ）のアントラサイクリン誘導体に結合され、このアルキレンジアミノリンカーは第１のアミド結合の手段によってアントラサイクリン誘導体に結合され、一方、第２のアミド結合の手段によってオリゴグリシンペプチドのカルボキシ末端に結合され、前記アルキレンジアミノリンカーおよびオリゴグリシンペプチドの融合体は以下の式（ｉｉ）を有する
【化2】
【0088】
式中、波線は、式（ｉ）のアントラサイクリン誘導体への結合を示し、
式中、ｍは、１以上１１以下、好ましくは２～５の整数であり、そして、
ｎは、１以上２１以下、好ましくは２～５の整数である。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは、任意に、オリゴアラニン（Ａｌａ）nによって置換され得ることを理解することが大切である。
式中、ｍは、１以上１１以下、好ましくは２～５の整数であり、そして、
ｎは、１以上２１以下、好ましくは２～５の整数である。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは、任意に、オリゴアラニン（Ａｌａ）nによって置換され得ることを理解することが大切である。
【0089】
別の群の実施形態によれば、オリゴグリシンペプチド（Ｇｌｙ）nは、直接、または別のリンカーＬ1の手段によって、式（ｉｉ）のアントラサイクリン誘導体の環Ａに結合される（ここで、アントラサイクリンコアの環Ａは、Ｓｈｉら、２００９に示されるとおりである）。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは、任意に、オリゴアラニン（Ａｌａ）nによって置換され得ることを理解することが大切である。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは、任意に、オリゴアラニン（Ａｌａ）nによって置換され得ることを理解することが大切である。
【0090】
別の群の実施形態によれば、オリゴグリシンペプチド（Ｇｌｙn）は、Ｌ1と呼ばれるアルキレンアミノリンカー（ＥＡ）の手段によって、式（ｉ）のアントラサイクリン誘導体に融合され、このアルキレンアミノリンカーは、アミド結合の手段によってオリゴグリシンペプチドのカルボキシ末端に融合され、アルキレンアミノリンカーとオリゴグリシンペプチドとの前記融合体は以下の式（ｉｉｉ）を有する。
【化3】
【0091】
式中、波線は、式（ｉ）のアントラサイクリン誘導体への結合を示し、
式中、ｍは、１以上１１以下、好ましくは２～５の整数であり、そして、
ｎは、１以上２１以下、好ましくは２～５の整数である。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは、任意に、オリゴアラニン（Ａｌａ）nによって置換され得ることを理解することが大切である。
式中、ｍは、１以上１１以下、好ましくは２～５の整数であり、そして、
ｎは、１以上２１以下、好ましくは２～５の整数である。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは、任意に、オリゴアラニン（Ａｌａ）nによって置換され得ることを理解することが大切である。
【0092】
別の群の実施形態によれば、リンカー構造Ｌ3は、ソルターゼ酵素認識モチーフの特異的切断から生じるペプチドモチーフを含む。
【0093】
ソルターゼ酵素認識モチーフは、いわゆるソルターゼ酵素媒介抗体融合（ＳＭＡＣ技術）のためのタグとして働き、これは、同じ出願人に譲渡されたＷＯ２０１４１４０３１７に実施可能に開示されている。
この刊行物の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
この技術では、一方がそのような認識モチーフを有し、他方がオリゴグリシンペプチド（Ｇｌｙ）nを有する２つの分子を、ソルターゼ酵素が、融合する。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは任意に、オリゴアラニン（Ａｌａ）nによって置換され得ることを理解することが大切である。
この刊行物の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
この技術では、一方がそのような認識モチーフを有し、他方がオリゴグリシンペプチド（Ｇｌｙ）nを有する２つの分子を、ソルターゼ酵素が、融合する。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは任意に、オリゴアラニン（Ａｌａ）nによって置換され得ることを理解することが大切である。
【0094】
別の群の実施形態によれば、前記ソルターゼ酵素認識モチーフは、以下のアミノ酸配列：ＬＰＸＴＧ、ＬＰＸＡＧ、ＬＰＸＳＧ、ＬＡＸＴＧ、ＬＰＸＴＡまたはＮＰＱＴＮのうちの少なくとも１つを含み、Ｘは任意の考えられるアミノ酸配列である。
【0095】
別の一群の実施態様によれば、得られたリンカーは、以下の少なくとも１つの配列を有する：
－ＬＰＸＴＧn－、
－ＬＰＸＡＧn－、
－ＬＰＸＳＧn－、
－ＬＡＸＴＧn－、
－ＬＰＸＴＧn－、
－ＬＰＸＴＡn－、または
－ＮＰＱＴＧn－、
ここで、Ｇnはｎが≧１から≦２１の整数であるオリゴまたはポリグリシンであり、
Ａnはｎが≧１から≦２１の整数であるオリゴまたはポリアラニンであり、そして、
Ｘは任意の考えられるアミノ酸配列である。
－ＬＰＸＴＧn－、
－ＬＰＸＡＧn－、
－ＬＰＸＳＧn－、
－ＬＡＸＴＧn－、
－ＬＰＸＴＧn－、
－ＬＰＸＴＡn－、または
－ＮＰＱＴＧn－、
ここで、Ｇnはｎが≧１から≦２１の整数であるオリゴまたはポリグリシンであり、
Ａnはｎが≧１から≦２１の整数であるオリゴまたはポリアラニンであり、そして、
Ｘは任意の考えられるアミノ酸配列である。
【0096】
別の群の実施形態によれば、アントラサイクリン誘導体は、１つ以上のリンカーの手段によって、結合タンパク質のカルボキシ末端、またはその少なくとも１つのドメインもしくはそのサブユニットのカルボキシ末端に結合される。
【0097】
別の群の実施形態によれば、結合タンパク質は、アミド結合の手段によって、オリゴグリシンペプチド（Ｇｌｙ）nのアミノ末端に結合される。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは任意に、オリゴアラニン（Ａｌａ）nによって置換され得ることを理解することが大切である。
１つの具体的な実施形態（化膿連鎖球菌ソルターゼＡが使用される場合、以下を参照のこと）において、オリゴグリシン（Ｇｌｙ）nは任意に、オリゴアラニン（Ａｌａ）nによって置換され得ることを理解することが大切である。
【0098】
使用されているソルターゼは好ましくはソルターゼＡであり、一実施形態では、化膿連鎖球菌または黄色ブドウ球菌由来のソルターゼＡである。
一実施形態では、ソルターゼＡ認識モチーフを依然として認識する、操作されたソルターゼＡが使用されている。
１つの実施形態において、操作されたソルターゼＡは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡに由来し、１つの他の実施形態において、操作されたソルターゼＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＡに由来する。
一実施形態では、ソルターゼＡ認識モチーフを依然として認識する、操作されたソルターゼＡが使用されている。
１つの実施形態において、操作されたソルターゼＡは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ソルターゼＡに由来し、１つの他の実施形態において、操作されたソルターゼＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＡに由来する。
【0099】
別の群の実施形態によれば、結合タンパク質は、抗体、抗体ベースの結合タンパク質、標的結合能を保持する修飾抗体フォーマット、標的結合能を保持する抗体誘導体または断片、代替足場および／または抗体模倣物からなる群から選択される少なくとも１つである。
【0100】
上記の中でも、抗体が最も好ましいタイプの結合タンパク質である。
【0101】
用語「抗体」、「抗体ベースの結合タンパク質」、「標的結合能を保持する修飾抗体フォーマット」、「標的結合能を保持する抗体誘導体または断片」は、所与の抗原、エピトープまたは複数のエピトープへの強力な一価、二価または多価結合を示すポリペプチド鎖をいう。
本発明において使用される抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片は、任意の適切な技術（例えば、ハイブリドーマ技術、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、遺伝子シャッフリングライブラリー、半合成もしくは完全合成ライブラリー、またはそれらの組合せ）を使用して生成され得る。
本発明の、抗体、抗体ベースの結合タンパク質、および抗原結合断片は、インタクトな抗体および抗体断片、あるいは、インタクトな抗体の抗原結合部分を含み、かつ同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原に結合する能力を保持するまたは抗原結合断片を含む。
本明細書中で特に明記しない限り、全ての抗体および抗原結合断片配列を含む全てのペプチド配列は、Ｎ→Ｃの順序で言及される。
本発明において使用される抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片は、任意の適切な技術（例えば、ハイブリドーマ技術、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、遺伝子シャッフリングライブラリー、半合成もしくは完全合成ライブラリー、またはそれらの組合せ）を使用して生成され得る。
本発明の、抗体、抗体ベースの結合タンパク質、および抗原結合断片は、インタクトな抗体および抗体断片、あるいは、インタクトな抗体の抗原結合部分を含み、かつ同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原に結合する能力を保持するまたは抗原結合断片を含む。
本明細書中で特に明記しない限り、全ての抗体および抗原結合断片配列を含む全てのペプチド配列は、Ｎ→Ｃの順序で言及される。
【0102】
インタクトの抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって相互に連結された、少なくとも２つの重鎖（Ｈ）（約５０～７０ｋＤ）および２つの軽鎖（Ｌ）（約２５ｋＤ）を含む。
抗体鎖をコードする認識された免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。
軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。
重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、そしてこれらは免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ定義する。
抗体のそれぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）および重鎖定常領域から構成される。
ＩｇＧでは、重鎖定常領域は、ＣH1、ＣH2とＣH3の３領域から構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶL）および軽鎖定常領域から構成される。
軽鎖定常領域は、１つのドメインＣLで構成される。
重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同一の抗体分子からなる。
抗体鎖をコードする認識された免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。
軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。
重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、そしてこれらは免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ定義する。
抗体のそれぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）および重鎖定常領域から構成される。
ＩｇＧでは、重鎖定常領域は、ＣH1、ＣH2とＣH3の３領域から構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶL）および軽鎖定常領域から構成される。
軽鎖定常領域は、１つのドメインＣLで構成される。
重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同一の抗体分子からなる。
【0103】
抗体のＶHおよびＶL領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が点在する（ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ）超可変性の領域にさらに細分することができる。
それぞれのＶHおよびＶLは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で、アミノ末端からカルボキシル末端に配列される。
ＣＤＲおよびＦＲ領域の位置、ならびに番号付けシステムは、本明細書中で使用されるように、例えば、ＩＭＧＴシステム（Ｆｅｆｆａｎｅ ＭＰら、２０１５）として定義されている。
それぞれのＶHおよびＶLは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で、アミノ末端からカルボキシル末端に配列される。
ＣＤＲおよびＦＲ領域の位置、ならびに番号付けシステムは、本明細書中で使用されるように、例えば、ＩＭＧＴシステム（Ｆｅｆｆａｎｅ ＭＰら、２０１５）として定義されている。
【0104】
本発明の、抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片はまた、単鎖抗体をも包含する。
「単鎖抗体」という語は、一般にスペーサーペプチドを介して結合された、ポリペプチド結合におけるＶHドメインおよびＶLドメインを含むポリペプチドを指し、そして、アミノ末端および／またはカルボキシル末端にさらなるドメインまたはアミノ酸配列を含み得る。
例えば、単鎖抗体は、コードするポリヌクレオチドに連結するためのテザーセグメント（ｔｅｔｈｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ）を含み得る。
一例として、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は、単鎖抗体である。
別個の遺伝子によってコードされるＦｖ断片のＶLおよびＶHドメインと比較して、ｓｃＦｖは合成リンカーによって（例えば、組換え方法によって）連結された２つのドメインを有する。
これにより、ＶL領域とＶH領域とが対になって一価の分子を形成する単一の蛋白質鎖として生成されることが可能になる。
「単鎖抗体」という語は、一般にスペーサーペプチドを介して結合された、ポリペプチド結合におけるＶHドメインおよびＶLドメインを含むポリペプチドを指し、そして、アミノ末端および／またはカルボキシル末端にさらなるドメインまたはアミノ酸配列を含み得る。
例えば、単鎖抗体は、コードするポリヌクレオチドに連結するためのテザーセグメント（ｔｅｔｈｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ）を含み得る。
一例として、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は、単鎖抗体である。
別個の遺伝子によってコードされるＦｖ断片のＶLおよびＶHドメインと比較して、ｓｃＦｖは合成リンカーによって（例えば、組換え方法によって）連結された２つのドメインを有する。
これにより、ＶL領域とＶH領域とが対になって一価の分子を形成する単一の蛋白質鎖として生成されることが可能になる。
【0105】
抗体ベースの結合タンパク質の例は、抗体の結合ドメインが他のポリペプチドまたはポリペプチドドメインと結合するポリペプチド（例えば、代替的な分子足場）、Ｆｃ領域、他のポリペプチドの他の機能的または結合ドメイン、または追加結合特性を有する分子を生じる抗体（例えば、二重特異性または多重特異性タンパク質または抗体）である。
このようなポリペプチドは、天然に存在する抗体または抗体フラグメントにおいて通常見出されない結合ドメインまたは機能的ドメインの配置を作製し得る。
このようなポリペプチドは、天然に存在する抗体または抗体フラグメントにおいて通常見出されない結合ドメインまたは機能的ドメインの配置を作製し得る。
【0106】
抗原結合断片の例としては、
（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶL、ＶH、ＣLとＣH1ドメインからなる一価の断片；
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2断片、ヒンジ領域のジスルフィド架橋で結ばれた、２つのＦａｂ断片を含む２価の断片；
（ｉｉｉ）ＶHとＣH1ドメインからなるＦｄ断片；
（ｉｖ）インタクトの抗体の単一アームのＶLとＶHドメインからなるＦｖ断片；
（ｖ）構造的に保全されたフレームワーク領域間の操作された鎖間のジスルフィド結合を有する、ジスルフィド安定化Ｆｖｓ（ｄｓＦｖｓ）；
（ｖｉ）ＶHまたはＶL領域からなる単一ドメイン抗体（例えば、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９参照）；および
（ｖｉｉ）線形または環状ペプチドとしての独立した補完性決定領域（ＣＤＲ）；
が挙げられる。
（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶL、ＶH、ＣLとＣH1ドメインからなる一価の断片；
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2断片、ヒンジ領域のジスルフィド架橋で結ばれた、２つのＦａｂ断片を含む２価の断片；
（ｉｉｉ）ＶHとＣH1ドメインからなるＦｄ断片；
（ｉｖ）インタクトの抗体の単一アームのＶLとＶHドメインからなるＦｖ断片；
（ｖ）構造的に保全されたフレームワーク領域間の操作された鎖間のジスルフィド結合を有する、ジスルフィド安定化Ｆｖｓ（ｄｓＦｖｓ）；
（ｖｉ）ＶHまたはＶL領域からなる単一ドメイン抗体（例えば、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９参照）；および
（ｖｉｉ）線形または環状ペプチドとしての独立した補完性決定領域（ＣＤＲ）；
が挙げられる。
【0107】
本発明の抗原結合断片はまた、ラクダ科足場を有する単一ドメイン抗原結合ユニットを包含する。
ラクダ科の動物には、ラクダ、ラマ、およびアルパカが含まれる。ラクダ科動物は、軽鎖を欠く機能的抗体を産生する。
重鎖可変（ＶH）ドメインは、自律的に折り畳まれ、抗原結合ユニットとして独立して機能する。
その結合表面は、古典的な抗原結合分子（Ｆａｂ）または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）における６つのＣＤＲと比較して、３つのＣＤＲのみを含む。
ラクダ科抗体は、従来の抗体の結合親和性に匹敵する結合親和性を達成することができる。
ラクダ科の動物には、ラクダ、ラマ、およびアルパカが含まれる。ラクダ科動物は、軽鎖を欠く機能的抗体を産生する。
重鎖可変（ＶH）ドメインは、自律的に折り畳まれ、抗原結合ユニットとして独立して機能する。
その結合表面は、古典的な抗原結合分子（Ｆａｂ）または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）における６つのＣＤＲと比較して、３つのＣＤＲのみを含む。
ラクダ科抗体は、従来の抗体の結合親和性に匹敵する結合親和性を達成することができる。
【0108】
用語「ヒト抗体」は、実質的にすべてのＣＤＲ領域がヒト起源であるように、ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含有する、抗体、抗体ベースの結合タンパク質、または抗原結合断片を指し、そして、実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものに対応する。
【0109】
「代替足場」や「抗体模倣物」という用語は、免疫グロブリンファミリーに属さない蛋白質、そして、アプタマーなどの非蛋白質でさえ、または合成ポリマーをさす。抗体様βシート構造を有するものもあり、抗体よりも「抗体模倣物」や「代替足場」の潜在的利点は、溶解性がより良く、組織浸透性がより高く、熱や酵素に対する安定性がより高く、そして、生産コストが比較的低いことが挙げられる。
【0110】
いくつかの抗体模倣物は、考えられるあらゆる標的に対して、特異的結合候補を提供する大きなライブラリーにおいて提供することができる。
抗体と同様に、標的特異的抗体模倣物は、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術の使用によって、ならびに、まさに、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母または哺乳動物ディスプレイのような確立されたディスプレイ技術を用いて開発され得る。
現在開発されている抗体模倣物は、例えば、
アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓと呼ばれる）、
Ｃ型レクチン、
黄色ブドウ球菌のＡ－ドメインタンパク質、
トランスフェリン、
リポカリン、
フィブロネクチンの第１０型ＩＩＩドメイン、
クニッツドメインプロテアーゼ阻害剤、
ユビキチン由来バインダー（アフィリンと呼ばれる）、
ガンマクリスタリン由来バインダー、
システインノットまたはノッチン、
チオレドキシンＡ足場ベースのバインダー、
核酸アプタマー、
ポリマーの分子インプリンティングによって産生される人工抗体、
細菌ゲノムからのペプチドライブラリー、
ＳＨ－３ドメイン、
ストレイドボディ、
ジスルフィド結合およびＣａ２＋によって安定化された膜受容体の「Ａドメイン」、
ＣＴＬＡ４ベースの化合物、
Ｆｙｎ ＳＨ３、および
アプタマー（特定の標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子）
を包含する。
抗体と同様に、標的特異的抗体模倣物は、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術の使用によって、ならびに、まさに、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母または哺乳動物ディスプレイのような確立されたディスプレイ技術を用いて開発され得る。
現在開発されている抗体模倣物は、例えば、
アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓと呼ばれる）、
Ｃ型レクチン、
黄色ブドウ球菌のＡ－ドメインタンパク質、
トランスフェリン、
リポカリン、
フィブロネクチンの第１０型ＩＩＩドメイン、
クニッツドメインプロテアーゼ阻害剤、
ユビキチン由来バインダー（アフィリンと呼ばれる）、
ガンマクリスタリン由来バインダー、
システインノットまたはノッチン、
チオレドキシンＡ足場ベースのバインダー、
核酸アプタマー、
ポリマーの分子インプリンティングによって産生される人工抗体、
細菌ゲノムからのペプチドライブラリー、
ＳＨ－３ドメイン、
ストレイドボディ、
ジスルフィド結合およびＣａ２＋によって安定化された膜受容体の「Ａドメイン」、
ＣＴＬＡ４ベースの化合物、
Ｆｙｎ ＳＨ３、および
アプタマー（特定の標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子）
を包含する。
【0111】
本発明の、抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片は、癌細胞上または腫瘍の癌細胞環境内の任意の適切な標的に結合し得る。
１つの実施形態において、本発明の、抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片は、癌細胞表面上の標的に結合する。
好ましい実施形態において、この標的は、癌細胞上で排他的に発現されるか、または健康な組織と比較して癌細胞上で過剰発現される。
本出願人は、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片が癌細胞上に結合し、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片がアントラサイクリン毒素部分とともに細胞内に内在化し、その細胞の免疫原性細胞死および／または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の腫瘍内への浸潤をもたらす任意の標的が、好適な標的であることを示唆する。
当業者は、文献および実験の検討を通して、このような標的を同定することができる。
１つの実施形態において、本発明の、抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片は、癌細胞表面上の標的に結合する。
好ましい実施形態において、この標的は、癌細胞上で排他的に発現されるか、または健康な組織と比較して癌細胞上で過剰発現される。
本出願人は、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片が癌細胞上に結合し、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片がアントラサイクリン毒素部分とともに細胞内に内在化し、その細胞の免疫原性細胞死および／または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の腫瘍内への浸潤をもたらす任意の標的が、好適な標的であることを示唆する。
当業者は、文献および実験の検討を通して、このような標的を同定することができる。
【0112】
１つの実施形態において、適切な標的は、ＲＯＲ１、ＣＳ－１、ＨＥＲ２、メソテリンおよびＲＯＲ２を含む。
１つの実施形態において、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片は、ＲＯＲ１に結合する。
１つの実施形態において、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質および抗原結合断片は、ＲＯＲ１に結合する。
【0113】
本発明のさらなる実施形態によれば、結合タンパク質－毒素融合体に含まれる結合タンパク質は、以下の抗体である
a)配列番号の以下の対に記載される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対に含まれる重 鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含む抗体：
１と２；３と４、５と６および／または２０と２１；
b)以下の配列番号（ＨＣＤＲ１；ＨＣＤＲ２；ＨＣＤＲ３；ＬＣＤＲ１；ＬＣＤ Ｒ２およびＬＣＤＲ３の順番で）を含む重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセ ットを含む抗体：
・２２，２３，２４、２５、２６、および２７、
・２８，２９，３０、３１、３２、および３３、
・３４，３５，３６、３７、３８、および３９、および／または
・４０，４１，４２、４３、４４、および４５；
c)ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、ただし、ＣＤＲの少 なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して、３アミノ酸までの置換を有する抗 体；および／または
a)配列番号の以下の対に記載される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対に含まれる重 鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含む抗体：
１と２；３と４、５と６および／または２０と２１；
b)以下の配列番号（ＨＣＤＲ１；ＨＣＤＲ２；ＨＣＤＲ３；ＬＣＤＲ１；ＬＣＤ Ｒ２およびＬＣＤＲ３の順番で）を含む重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセ ットを含む抗体：
・２２，２３，２４、２５、２６、および２７、
・２８，２９，３０、３１、３２、および３３、
・３４，３５，３６、３７、３８、および３９、および／または
・４０，４１，４２、４３、４４、および４５；
c)ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、ただし、ＣＤＲの少 なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して、３アミノ酸までの置換を有する抗 体；および／または
【0114】
d)ｂ）またはｃ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、ただし、Ｃ ＤＲの少なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して、≧６６％の配列同一性を 有する抗体；
【0115】
ここで、ＣＤＲは、十分な結合親和性でＲＯＲ１に結合することができるように、適切なタンパク質フレームワークに埋め込まれる。
【0116】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重鎖および軽鎖両方のポリペプチドの可変領域内に見出される非連続的な抗原結合部位を意味することが意図される。
これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら（１９７７）、Ｋａｂａｔら（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）およびＭａｃＣａｌｌｕｍら（１９９６）によって記載されており、ここで、前記定義は、互いに対して比較される場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。
それにもかかわらず、抗体または移植された抗体またはその変異体のＣＤＲを指すいずれかの定義の適用は、本明細書中で定義および使用される用語の範囲内であることが意図される。
上記で引用した記載の各々によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基を、比較として以下の表に示す。
ＣＤＲの定義は場合によって異なるため、この番号付けは、同封の配列リストに実際に開示されているＣＤＲとは異なる場合があることに留意されたい。
これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら（１９７７）、Ｋａｂａｔら（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）およびＭａｃＣａｌｌｕｍら（１９９６）によって記載されており、ここで、前記定義は、互いに対して比較される場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。
それにもかかわらず、抗体または移植された抗体またはその変異体のＣＤＲを指すいずれかの定義の適用は、本明細書中で定義および使用される用語の範囲内であることが意図される。
上記で引用した記載の各々によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基を、比較として以下の表に示す。
ＣＤＲの定義は場合によって異なるため、この番号付けは、同封の配列リストに実際に開示されているＣＤＲとは異なる場合があることに留意されたい。
【0117】
【表2】
【0118】
本明細書中で使用される場合、用語「フレームワーク」は、抗体可変領域に関して使用される場合、抗体の可変領域内のＣＤＲ領域外のすべてのアミノ酸残基を意味するように入力される。
したがって、可変領域フレームワークは長さが約１００～１２０アミノ酸の間であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸のみを指すことが意図される。
したがって、可変領域フレームワークは長さが約１００～１２０アミノ酸の間であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸のみを指すことが意図される。
【0119】
本明細書で使用される「充分な結合親和性で標的Ｘに結合することができる」という語は、それぞれの結合ドメインが、標的に、ＫDが１０-4以下で結合することを意味すると理解されなければならない。
ＫDは、タンパク質バインダーとその抗原との間の、Ｋoff／Ｋonの比率である平衡解離定数である。
ＫDと親和性は逆に関連している。
ＫD値はタンパク質バインダーの濃度（特定の実験に必要とされるタンパク質バインダーの量）に関連し、したがって、ＫD値が低くなるほど（濃度が低くなるほど）、したがって、結合ドメインの親和性が高くなる。
以下のテーブルは、典型的なモノクローナル抗体のＫDの範囲を示している。
ＫDは、タンパク質バインダーとその抗原との間の、Ｋoff／Ｋonの比率である平衡解離定数である。
ＫDと親和性は逆に関連している。
ＫD値はタンパク質バインダーの濃度（特定の実験に必要とされるタンパク質バインダーの量）に関連し、したがって、ＫD値が低くなるほど（濃度が低くなるほど）、したがって、結合ドメインの親和性が高くなる。
以下のテーブルは、典型的なモノクローナル抗体のＫDの範囲を示している。
【0120】
【表3】
【0121】
好ましくは、タンパク質バインダーが２個までのアミノ酸置換、より好ましくは１個までのアミノ酸置換を有する。
【0122】
好ましくは、ＣＤＲの少なくとも１つは、≧６７％；≧６８％；≧６９％；≧７０％；
≧７１％；≧７２％；≧７３％；≧７４％；≧７５％；≧７６％；≧７７％；≧７８％；
≧７９％；≧８０％；≧８１％；≧８２％；≧８３％；≧８４％；≧８５％≧８６％；≧８７％；
≧８８％；≧８９％；≧９０％；≧９１％；≧９２％；≧９３％；≧９４％；≧９５％；≧９６％；
≧９７％；≧９８％；≧９９％の配列同一性を有する。最も好ましくはそれぞれの配列番号に対して１００％である。
≧７１％；≧７２％；≧７３％；≧７４％；≧７５％；≧７６％；≧７７％；≧７８％；
≧７９％；≧８０％；≧８１％；≧８２％；≧８３％；≧８４％；≧８５％≧８６％；≧８７％；
≧８８％；≧８９％；≧９０％；≧９１％；≧９２％；≧９３％；≧９４％；≧９５％；≧９６％；
≧９７％；≧９８％；≧９９％の配列同一性を有する。最も好ましくはそれぞれの配列番号に対して１００％である。
【0123】
本明細書中で使用される、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）を通して、２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、比較窓（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、付加または欠失を含まない参照配列（例えば、ポリペプチド）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。
パーセンテージは、一致した位置の数を生じる、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を比較窓における位置の総数で割り、そして配列同一性のパーセンテージを生じるために結果に１００を掛けることによって計算される。
パーセンテージは、一致した位置の数を生じる、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を比較窓における位置の総数で割り、そして配列同一性のパーセンテージを生じるために結果に１００を掛けることによって計算される。
【0124】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」または「同一性」のパーセンテージは、同じ配列である２以上の配列または部分列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を指す。
【0125】
比較窓（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）にわたって、最大対応について、または、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手動アラインメントおよび目視検査によって測定される指定された領域を比較およびアラインメントしたとき、もし、２つの配列が、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、特定の領域にわたって、または特定されない場合、参照配列の全配列にわたって、少なくとも、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する場合、２つの配列が「実質的に同一である」。
【0126】
本開示は、本明細書に例示されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドとそれぞれ実質的に同一であるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供する。
必要に応じて、同一性は、長さが少なくとも約１５、２５もしくは５０ヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは長さが１００～５００もしくは１０００もしくはそれ以上のヌクレオチドである領域にわたって、または参照配列の完全長にわたって存在する。
アミノ酸配列に関して、同一性または実質的同一性は、長さが少なくとも５、１０、１５または２０アミノ酸、任意に、長さが少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００アミノ酸、任意に少なくとも約１５０、２００または２５０アミノ酸、または参照配列の全長である領域にわたって存在し得る。
より短いアミノ酸配列、例えば、２０以下のアミノ酸のアミノ酸配列に関して、本明細書中に定義される保存的置換に従って、１つまたは２つのアミノ酸残基が保存的に置換される場合、実質的な同一性が存在する。
必要に応じて、同一性は、長さが少なくとも約１５、２５もしくは５０ヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは長さが１００～５００もしくは１０００もしくはそれ以上のヌクレオチドである領域にわたって、または参照配列の完全長にわたって存在する。
アミノ酸配列に関して、同一性または実質的同一性は、長さが少なくとも５、１０、１５または２０アミノ酸、任意に、長さが少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００アミノ酸、任意に少なくとも約１５０、２００または２５０アミノ酸、または参照配列の全長である領域にわたって存在し得る。
より短いアミノ酸配列、例えば、２０以下のアミノ酸のアミノ酸配列に関して、本明細書中に定義される保存的置換に従って、１つまたは２つのアミノ酸残基が保存的に置換される場合、実質的な同一性が存在する。
【0127】
好ましくは、ＣＤＲの少なくとも１つは、以下を含むＣＤＲ配列修飾を受けている
・親和性成熟
・免疫原性の減少
・親和性成熟
・免疫原性の減少
【0128】
親和性成熟（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）とは、ある抗体の親和性がｉｎ ｖｉｔｒｏで向上する過程のことである。
天然の対応物と同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの親和性成熟も突然変異と選択の原理に基づいている。
これは、抗体、抗体フラグメント、または抗体模倣物のような他のペプチド分子を最適化するために首尾よく使用されてきた。
ＣＤＲ内部のランダム突然変異は、放射線、化学的突然変異原、またはエラープローンＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）を用いて導入される。
さらに、チェインシャフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）法によって遺伝的多様性を増加させることができる。
ファージディスプレイのようなディスプレイ方法を使用する２または３ラウンドの変異および選択は、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントを生じる。
原理については、Ｅｙｌｅｎｓｔｅｉｎら（２０１６）を参照のこと（その内容は、本明細書中で参照として援用される）。
天然の対応物と同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの親和性成熟も突然変異と選択の原理に基づいている。
これは、抗体、抗体フラグメント、または抗体模倣物のような他のペプチド分子を最適化するために首尾よく使用されてきた。
ＣＤＲ内部のランダム突然変異は、放射線、化学的突然変異原、またはエラープローンＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）を用いて導入される。
さらに、チェインシャフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）法によって遺伝的多様性を増加させることができる。
ファージディスプレイのようなディスプレイ方法を使用する２または３ラウンドの変異および選択は、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントを生じる。
原理については、Ｅｙｌｅｎｓｔｅｉｎら（２０１６）を参照のこと（その内容は、本明細書中で参照として援用される）。
【0129】
操作された抗体は、任意の必要なフレームワーク復帰突然変異と共に、配列由来Ｖ領域に移植されたマウス配列由来ＣＤＲ領域を含む。従って、ヒト化抗体が患者に投与される場合、ＣＤＲ自体が免疫原性反応を引き起こし得る。
ＣＤＲによって引き起こされる免疫原性を減少させる方法はＨａｒｄｉｎｇら（２０１０）に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＣＤＲによって引き起こされる免疫原性を減少させる方法はＨａｒｄｉｎｇら（２０１０）に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0130】
本発明のさらなる実施形態によれば、結合タンパク質－毒素融合体に含まれる結合タンパク質は、以下の抗体である
a)以下の配列番号の対に記載される重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ ）対：
１と２；３と４、５と６、および／または２０と２１；
b)ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）対。ただし、
・ＨＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して≧８０％の配列同一性を有する、および／ または
・ＬＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して≧８０％の配列同一性を有する；
c)ａ）またはｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）対であって、ただし、ＨＣＶ ＤまたはＬＣＶＤの少なくとも１つが、それぞれの配列番号に対して、１０個までの アミノ酸置換を有する；
前記タンパク質バインダーは、依然として十分な結合親和性でＲＯＲ１に結合することができる。
a)以下の配列番号の対に記載される重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ ）対：
１と２；３と４、５と６、および／または２０と２１；
b)ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）対。ただし、
・ＨＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して≧８０％の配列同一性を有する、および／ または
・ＬＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して≧８０％の配列同一性を有する；
c)ａ）またはｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）対であって、ただし、ＨＣＶ ＤまたはＬＣＶＤの少なくとも１つが、それぞれの配列番号に対して、１０個までの アミノ酸置換を有する；
前記タンパク質バインダーは、依然として十分な結合親和性でＲＯＲ１に結合することができる。
【0131】
「可変ドメイン」は、抗体またはその重鎖もしくは軽鎖に関して使用される場合、分子上に抗原結合を付与し、定常領域ではない抗体の部分を意味することが意図される。
この用語は、可変領域全体の結合機能の全てのいくつかを維持するその機能的断片を含むことが意図される。
可変領域結合断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃｆｖ）などの機能的断片が含まれる。
このような機能的断片は、当業者に周知である。従って、異種可変領域の機能的断片を記載する際のこれらの用語の使用は、当業者に周知の定義に対応することが意図される。
そのような用語は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９９３）またはＰｌuｃｋｔｈｕｎおよびＳｋｅｒｒａ（１９９０）に記載されている。
この用語は、可変領域全体の結合機能の全てのいくつかを維持するその機能的断片を含むことが意図される。
可変領域結合断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃｆｖ）などの機能的断片が含まれる。
このような機能的断片は、当業者に周知である。従って、異種可変領域の機能的断片を記載する際のこれらの用語の使用は、当業者に周知の定義に対応することが意図される。
そのような用語は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９９３）またはＰｌuｃｋｔｈｕｎおよびＳｋｅｒｒａ（１９９０）に記載されている。
【0132】
好ましくは、ＨＣＶＤおよび／またはＬＣＶＤがそれぞれの配列番号に対して≧８１％；
≧８２％；≧８３％；≧８４％；≧８５％；≧８６％；≧８７％；≧８８％；≧８９％；
≧９０％；≧９１％；≧９２％；≧９３％；≧９４％；≧９５％；≧９６％；≧９７％；
≧９８％；≧９９％；または最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。
≧８２％；≧８３％；≧８４％；≧８５％；≧８６％；≧８７％；≧８８％；≧８９％；
≧９０％；≧９１％；≧９２％；≧９３％；≧９４％；≧９５％；≧９６％；≧９７％；
≧９８％；≧９９％；または最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【0133】
本発明の別の実施形態によれば、結合タンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）である。
【0134】
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、非保存的置換よりも抗体機能に対する効果が小さい。
アミノ酸を分類する多くの方法があるが、それらはしばしば、それらの構造およびそれらのＲ基の一般的な化学的特徴に基づいて６つの主な基に分類される。
アミノ酸を分類する多くの方法があるが、それらはしばしば、それらの構造およびそれらのＲ基の一般的な化学的特徴に基づいて６つの主な基に分類される。
【0135】
いくつかの実施形態では、「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。
例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。
これらのファミリーには、以下のアミノ酸が含まれる
・塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、
・酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、
・非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミ ン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、
・非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ ン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、
・β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン） および
・芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプト ファン、ヒスチジン）。
例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。
これらのファミリーには、以下のアミノ酸が含まれる
・塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、
・酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、
・非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミ ン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、
・非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ ン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、
・β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン） および
・芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプト ファン、ヒスチジン）。
【0136】
他の保存されたアミノ酸置換は、ペプチドの電荷を修飾するために、アスパラギンをアスパラギン酸で置換する場合のように、アミノ酸側鎖ファミリーにわたって起こり得る。
保存的変化は、化学的に相同な非天然アミノ酸（すなわち、ロイシンの代わりに合成非天然疎水性のアミノ酸、トリプトファンの代わりに合成非天然芳香族アミノ酸）の置換をさらに含み得る。
本発明のさらなる実施形態によれば、結合タンパク質は、上記の記載による抗体のものと比較して少なくとも５０％のＲＯＲ１に対する標的結合親和性を有する。
保存的変化は、化学的に相同な非天然アミノ酸（すなわち、ロイシンの代わりに合成非天然疎水性のアミノ酸、トリプトファンの代わりに合成非天然芳香族アミノ酸）の置換をさらに含み得る。
本発明のさらなる実施形態によれば、結合タンパク質は、上記の記載による抗体のものと比較して少なくとも５０％のＲＯＲ１に対する標的結合親和性を有する。
【0137】
本明細書中で使用される場合、用語「結合親和性」は、結合相互作用の強度を意味することが意図され、したがって、実際の結合親和性ならびに見かけの結合親和性の両方を含む。実際の結合親和性は、解離速度に対する会合速度の比である。
従って、結合親和性を付与または最適化することは、所望のレベルの結合親和性を達成するために、これらの成分のいずれかまたは両方を改変することを包含する。
見かけの親和性は、例えば、相互作用の結合活性を含むことができる。
例えば、二価異種可変領域結合断片はその価数のために、変化したまたは最適化された結合親和性を示し得る。
従って、結合親和性を付与または最適化することは、所望のレベルの結合親和性を達成するために、これらの成分のいずれかまたは両方を改変することを包含する。
見かけの親和性は、例えば、相互作用の結合活性を含むことができる。
例えば、二価異種可変領域結合断片はその価数のために、変化したまたは最適化された結合親和性を示し得る。
【0138】
結合剤の親和性を測定するための適切な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるものである。
この方法は、表面プラズモン波が金属／液体界面で励起されたときに生じる現象に基づいている。光は、試料と接触していない表面の側面に向けられ、反射され、そして、ＳＰＲは、角度と波長の特定の組み合わせで反射光強度の減少を引き起こす。
生体分子結合事象は、表面層における屈折率の変化を引き起こし、これは、ＳＰＲシグナルの変化として検出される。
結合事象は、受容体－リガンド対間の結合会合または解離のいずれかであり得る。
屈折率の変化は本質的に瞬時に測定することができ、したがって、親和定数の個々の構成要素の決定を可能にする。
より具体的には、前記方法は、会合率（ｋon）と解離率（ｋoff）の正確な計測を可能にする。
この方法は、表面プラズモン波が金属／液体界面で励起されたときに生じる現象に基づいている。光は、試料と接触していない表面の側面に向けられ、反射され、そして、ＳＰＲは、角度と波長の特定の組み合わせで反射光強度の減少を引き起こす。
生体分子結合事象は、表面層における屈折率の変化を引き起こし、これは、ＳＰＲシグナルの変化として検出される。
結合事象は、受容体－リガンド対間の結合会合または解離のいずれかであり得る。
屈折率の変化は本質的に瞬時に測定することができ、したがって、親和定数の個々の構成要素の決定を可能にする。
より具体的には、前記方法は、会合率（ｋon）と解離率（ｋoff）の正確な計測を可能にする。
【0139】
ｋonおよびｋoff値を測定すると、治療上より有効な、変更された可変領域または最適化された可変領域を特定できるため、効果的でありうる。
例えば、改変された可変領域またはその異種結合断片（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、例えば、類似の結合親和性を示す可変領域および異種結合断片（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）と比較して、高いｋon 値を有するため、より有効であり得る。
より高いｋon値を有する分子は、より速い速度でそれらの標的に特異的に結合し、そしてそれらの標的を阻害し得るので、増大した効力が付与される。
同様に、本発明の分子は、類似の結合親和性を有する分子と比較してより低いｋoff 値を示すので、より効果的であり得る。
いったん結合されると、その分子がそれらの標的から解離するのがより遅いので、より低いｋoff 速度を有する分子で観察される増加した効力が観察され得る。
本発明の、変化した可変領域および最適化された可変領域（その異種可変領域結合断片を含む）を参照して記載されるが、会合速度および解離速度を測定するための上記の方法は、治療目的または診断目的のためのより有効なバインダーを同定するために、本質的に任意のタンパク質バインダーまたはそのフラグメントに適用可能である。
例えば、改変された可変領域またはその異種結合断片（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、例えば、類似の結合親和性を示す可変領域および異種結合断片（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）と比較して、高いｋon 値を有するため、より有効であり得る。
より高いｋon値を有する分子は、より速い速度でそれらの標的に特異的に結合し、そしてそれらの標的を阻害し得るので、増大した効力が付与される。
同様に、本発明の分子は、類似の結合親和性を有する分子と比較してより低いｋoff 値を示すので、より効果的であり得る。
いったん結合されると、その分子がそれらの標的から解離するのがより遅いので、より低いｋoff 速度を有する分子で観察される増加した効力が観察され得る。
本発明の、変化した可変領域および最適化された可変領域（その異種可変領域結合断片を含む）を参照して記載されるが、会合速度および解離速度を測定するための上記の方法は、治療目的または診断目的のためのより有効なバインダーを同定するために、本質的に任意のタンパク質バインダーまたはそのフラグメントに適用可能である。
【0140】
結合剤の親和性を測定するための別の適切な方法は、表面を通るものであり、ＦＡＣＳ／スキャッチャード分析によるものである。
【0141】
表面プラズモン共鳴を使用する、会合および解離速度を含む親和性を測定するための方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、ＪｏｎｓｓｏｎおよびＭａｌｍｑｕｉｓｔ（１９９２）ならびにＷｕら（１９９８）に記載されているのを理解し得る。
さらに、結合相互作用を測定するための当技術分野で周知の１つの装置は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から市販されているＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置である。
さらに、結合相互作用を測定するための当技術分野で周知の１つの装置は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から市販されているＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置である。
【0142】
好ましくは、前記標的結合親和性は、≧５１％、≧５２％、≧５３％，≧５４％，≧５５％，≧５６％，≧５７％，≧５８％，≧５９％，≧６０％，≧６１％，≧６２％，≧６３％，≧６４％，≧６５％，≧６６％，≧６７％，≧６８％，≧６９％，≧７０％，≧７１％，≧７２％，≧７３％，≧７４％，≧７５％，≧７６％，≧７７％，≧７８％，≧７９％，≧８０％，≧８１％，≧８２％，≧８３％，≧８４％，≧８５％，≧８６％，≧８７％，≧８８％，≧８９％，≧９０％，≧９１％，≧９２％，≧９３％，≧９４％，≧９５％，≧９６％，≧９７％，≧９８％であり、最も好ましくは対照結合剤のそれと比べて≧９９％である。
【0143】
本発明の他の実施形態によれば、結合タンパク質は、上記の記載による抗体と、ＲＯＲ１との結合について競合する。
本発明の他の実施形態によれば、結合タンパク質は、上記の説明による抗体と本質的に同じ、または同じＲＯＲ１上の領域に結合する。
本発明の他の実施形態によれば、結合タンパク質は、上記の説明による抗体と本質的に同じ、または同じＲＯＲ１上の領域に結合する。
【0144】
本明細書中で使用される場合、用語「結合について競合する」は、上記の配列によって定義される抗体の１つを参照して使用され、これは実際のタンパク質バインダーと同じ標的、または標的エピトープもしくはドメインもしくはサブドメインに結合する活性として、後者のバリアントであることを意味する。
結合の効率（例えば、動力学または熱力学）は、後者の効率と同じか、またはそれより大きくても小さくともなる。
例えば、基質への結合のための平衡結合定数は、２つの抗体について異なり得る。
結合の効率（例えば、動力学または熱力学）は、後者の効率と同じか、またはそれより大きくても小さくともなる。
例えば、基質への結合のための平衡結合定数は、２つの抗体について異なり得る。
【0145】
このような結合の競合は、競合結合アッセイを用いて適切に測定することができる。
このようなアッセイは、Ｆｉｎｃｏら、２０１１年に開示されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれ、特許請求の範囲の解釈のためのそれらの意味は、Ｄｅｎｇら、２０１８年に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
このようなアッセイは、Ｆｉｎｃｏら、２０１１年に開示されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれ、特許請求の範囲の解釈のためのそれらの意味は、Ｄｅｎｇら、２０１８年に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0146】
この特性を試験するために、とりわけ、以下を含む適切なエピトープマッピング技術が利用可能である
・Ｘ線共結晶解析と極低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）（Ｘ－ｒａｙ ｃｏ－ｃｒ ｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍ ｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）
・アレイベースのオリゴ－ペプチド走査型（Ａｒｒａｙ－ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏ－ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）
・部位特異的突然変異誘発マッピング（Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅ ｎｅｓｉｓ ｍａｐｐｉｎｇ）
・ハイスループットショットガン突然変異誘発エピトープマッピング（Ｈｉｇｈ－ｔ ｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｈｏｔｇｕｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ）
・水素－重水素交換、および／または
・架橋結合質量分析法（Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）
・Ｘ線共結晶解析と極低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）（Ｘ－ｒａｙ ｃｏ－ｃｒ ｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍ ｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）
・アレイベースのオリゴ－ペプチド走査型（Ａｒｒａｙ－ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏ－ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）
・部位特異的突然変異誘発マッピング（Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅ ｎｅｓｉｓ ｍａｐｐｉｎｇ）
・ハイスループットショットガン突然変異誘発エピトープマッピング（Ｈｉｇｈ－ｔ ｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｈｏｔｇｕｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ）
・水素－重水素交換、および／または
・架橋結合質量分析法（Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）
【0147】
これらの方法はとりわけ、Ｂａｎｉｋら（２０１０）およびＤｅＬｉｓｓｅｒ（１９９９）に開示および議論されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0148】
実施例
【0149】
本発明は、図面および前述の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示的または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。
開示された実施形態に対する他の変形は、図面、開示、および添付の特許請求の範囲の研究から、特許請求された発明を実施する際に当業者によって理解され、実施されることができる。
特許請求の範囲において、単語「有する」は他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は複数を排除するものではない。
特定の手段が相互に異なる従属請求項に記載されているという単なる事実は、これらの手段の組合せが有利に使用されることができないことを示すものではない。
特許請求の範囲におけるいかなる引用符号も、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
開示された実施形態に対する他の変形は、図面、開示、および添付の特許請求の範囲の研究から、特許請求された発明を実施する際に当業者によって理解され、実施されることができる。
特許請求の範囲において、単語「有する」は他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は複数を排除するものではない。
特定の手段が相互に異なる従属請求項に記載されているという単なる事実は、これらの手段の組合せが有利に使用されることができないことを示すものではない。
特許請求の範囲におけるいかなる引用符号も、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0150】
本明細書中に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端へと示され；本明細書中に開示される全ての核酸配列は、５’→３’で示される。
【0151】
実施例１
精製組換え抗ヒトＲＯＲ１およびアイソタイプ対照抗体（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の作製
精製組換え抗ヒトＲＯＲ１およびアイソタイプ対照抗体（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の作製
【0152】
発現ベクター：抗体可変部コード領域（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）は、リーダー配列として、ＭＮＦＧＬＲＬＩＦＬＶＬＴＬＫＧＶＱＣ、を用いて、全遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）により作製し、そして、適用できるように、発現ベクターｐＣＢ１４内で、ヒトＩｇＨ－γ１及びＩｇＬ－κ又はＩｇＬ－λの定常領域を適宜組み合わせた。
このベクターは、エピソーム哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体であり、ＥＢＶ複製起点を持ち、ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ－１）をコードして、染色体外複製を可能にし、そして、元のヒグロマイシンＢ耐性遺伝子の代わりにピューロマイシン選択マーカーを含む。
このベクターは、エピソーム哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体であり、ＥＢＶ複製起点を持ち、ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ－１）をコードして、染色体外複製を可能にし、そして、元のヒグロマイシンＢ耐性遺伝子の代わりにピューロマイシン選択マーカーを含む。
【0153】
発現および精製： ｐＣＢ１４ベースの発現ベクターを、ＰＬＵＳ（商標）試薬を用いたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、１５３８８１００）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした；１日のインキュベーション（３７℃、５％ ＣＯ2、増殖培地：１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅおよび２ｍＭのＬ－グルタミン（すべてＢｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＬ－グルタミンを用いたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（４．５ｇ／Ｌ））後、細胞を選択条件下で増殖させた（２μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｂｕｃｈｓ ＳＧ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， Ｐ８８３３－２５ｍｇ ２ｍｇ／ｍＬで保存））。
細胞を分割し、さらに増殖させた（３７℃、５％ ＣＯ2）；コンフルエンシーに達したら、組織培養皿を２０μｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ１５２４）で３７℃で２時間コーティングし、そして、ＰＢＳで２回洗浄した。
細胞を分割し、さらに増殖させた（３７℃、５％ ＣＯ2）；コンフルエンシーに達したら、組織培養皿を２０μｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ１５２４）で３７℃で２時間コーティングし、そして、ＰＢＳで２回洗浄した。
【0154】
次に、細胞をトリプシン処理し、ポリ－Ｌ－リジン被覆プレート上で１：３に分割した。
再びコンフルエントに達した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、続いて、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８８３３）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）、１６１μｇ／ｍＬのＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ８１９９）および１０μｇ／ｍＬのＬ－グルタチオン還元（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ６５２９）を補充した生産培地（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３１３３０－０３）に培地を置換した。
２週間ごとに回収し、細胞を除去するために濾過した上清（０．２２μｍ）を、精製するまで４℃で保存した。
再びコンフルエントに達した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、続いて、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８８３３）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）、１６１μｇ／ｍＬのＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ８１９９）および１０μｇ／ｍＬのＬ－グルタチオン還元（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ６５２９）を補充した生産培地（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３１３３０－０３）に培地を置換した。
２週間ごとに回収し、細胞を除去するために濾過した上清（０．２２μｍ）を、精製するまで４℃で保存した。
【0155】
精製のために、濾過した上清を、ＰＢＳ平衡化プロテインＡ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１７－０４０５－０１）またはＪＳＲ Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ、ＪＷＴ２０３ＣＥ）に負荷し、ＰＢＳで洗浄し；ＡＥＫＴＡ純粋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、０．１Ｍグリシン（ｐＨ ２．５）を用いて溶出を行った。
画分を、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０）で直ちに中和し、そして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってタンパク質純度および完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）について分析した。
タンパク質含有画分を混合し、Ａｍｉｃｏｎ濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ＵＦＣ９０１００８）を用いて緩衝液交換に供して、ＰＢＳ中で１：１００の希釈に到達させ、次いで低保持フィルター（０．２０μｍ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ＰＡ４９．１）を用いて滅菌濾過した。
画分を、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０）で直ちに中和し、そして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってタンパク質純度および完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）について分析した。
タンパク質含有画分を混合し、Ａｍｉｃｏｎ濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ＵＦＣ９０１００８）を用いて緩衝液交換に供して、ＰＢＳ中で１：１００の希釈に到達させ、次いで低保持フィルター（０．２０μｍ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ＰＡ４９．１）を用いて滅菌濾過した。
【0156】
抗体を、当技術分野で公知の方法によって、ＣＨＯ細胞中で一過性に発現させ、組換え抗体を、当技術分野で公知のように、ＣＨＯ細胞上清からの標準プロテインＡ精製によって精製し、そして、組換え抗体の純度および完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
【0157】
【表4】
【0158】
実施例２
ＳＭＡＣ技術（商標）を用いた、グリシン修飾毒素とｍＡｂの融合によるＡＤＣ形成
ＳＭＡＣ技術（商標）を用いた、グリシン修飾毒素とｍＡｂの融合によるＡＤＣ形成
【0159】
ソルターゼＡ
黄色ブドウ球菌のソルターゼ Ａに基づく組換えおよびアフィニティー精製ソルターゼ Ａ酵素を、ＷＯ２０１４１４０３１７Ａ１に記載の技術に従って、大腸菌中で産生した。
黄色ブドウ球菌のソルターゼ Ａに基づく組換えおよびアフィニティー精製ソルターゼ Ａ酵素を、ＷＯ２０１４１４０３１７Ａ１に記載の技術に従って、大腸菌中で産生した。
【0160】
グリシン修飾毒素の生成
ＳＭＡＣ技術（商標）TM融合ＡＤＣを生成するために、ペンタグリシン－ＥＤＡ－ＰＮＵ誘導体（Ｇ５－ＥＤＡ－ＰＮＵ）を、コンコルチス（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）によって製造した（図１に示す）。
ペンタグリシン修飾毒素の同一性および純度を、それぞれ、質量分析およびＨＰＬＣによって確認した。
Ｇ５－ＥＤＡ－ＰＮＵは、ＨＰＬＣクロマトグラフィーで測定して、＞９５％の純度を示した。
ＳＭＡＣ技術（商標）TM融合ＡＤＣを生成するために、ペンタグリシン－ＥＤＡ－ＰＮＵ誘導体（Ｇ５－ＥＤＡ－ＰＮＵ）を、コンコルチス（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）によって製造した（図１に示す）。
ペンタグリシン修飾毒素の同一性および純度を、それぞれ、質量分析およびＨＰＬＣによって確認した。
Ｇ５－ＥＤＡ－ＰＮＵは、ＨＰＬＣクロマトグラフィーで測定して、＞９５％の純度を示した。
【0161】
ソルターゼ媒介抗体融合体
上記毒素を、ＬＰＥＴＧ標識ｍＡｂｓ［１０μＭ］を、グリシン修飾毒素［２００μＭ］および３μＭソルターゼＡと共に、列挙した融合緩衝液中で、２５℃で、３．５時間インキュベートすることによって、表２の抗体に融合させた。
反応を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＢｉｏＲａｄ）に通すことによって停止させた。結合した融合体を、５カラム容量の溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ ２．５、５０ｎＭ ＮａＣｌ）で溶出し、１カラム容量の画分を、２５％ ｖ／ｖの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８）を含有するチューブに回収して、酸を中和した。
タンパク質含有画分をプールし、ＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩カラムを用いて、表２の処方緩衝液中に製剤化した。
上記毒素を、ＬＰＥＴＧ標識ｍＡｂｓ［１０μＭ］を、グリシン修飾毒素［２００μＭ］および３μＭソルターゼＡと共に、列挙した融合緩衝液中で、２５℃で、３．５時間インキュベートすることによって、表２の抗体に融合させた。
反応を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＢｉｏＲａｄ）に通すことによって停止させた。結合した融合体を、５カラム容量の溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ ２．５、５０ｎＭ ＮａＣｌ）で溶出し、１カラム容量の画分を、２５％ ｖ／ｖの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８）を含有するチューブに回収して、酸を中和した。
タンパク質含有画分をプールし、ＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩カラムを用いて、表２の処方緩衝液中に製剤化した。
【0162】
ＡＤＣ分析
薬物－抗体比率（ＤＡＲ）を、０．０５～０．１％ ＴＦＡ／Ｈ2Ｏと０．０４～０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮとの間の２５分間の線形勾配を用いて、１ｍＬ／分／８０℃で実行されるポリマーラボＰＬＲＰ ２．１ｍｍ×５ｃｍ、５μｍカラム上で行われる逆相クロマトグラフィーによって評価した。
試料を、最初に、３７℃で１５分間、ｐＨ ８．０でＤＴＴとインキュベートすることによって還元した（ｒｅｄｕｃｅｄ）。
薬物－抗体比率（ＤＡＲ）を、０．０５～０．１％ ＴＦＡ／Ｈ2Ｏと０．０４～０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮとの間の２５分間の線形勾配を用いて、１ｍＬ／分／８０℃で実行されるポリマーラボＰＬＲＰ ２．１ｍｍ×５ｃｍ、５μｍカラム上で行われる逆相クロマトグラフィーによって評価した。
試料を、最初に、３７℃で１５分間、ｐＨ ８．０でＤＴＴとインキュベートすることによって還元した（ｒｅｄｕｃｅｄ）。
【0163】
逆相クロマトグラフィーにより測定したＤＡＲを、以下の表２に要約する。
【0164】
【表5】
【0165】
実施例３
ヒトＲＯＲ１を安定に発現するＥＭＴ－６細胞の産生
マウスＥＭＴ－６乳癌細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミン（すべてＢｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＬ－グルタミンを含むＤＭＥＭ完全（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（４．５ｇ／Ｌ））中、３７℃および５％ ＣＯ2で培養した。
細胞を、次のように転位により、ＲＯＲ１を過剰発現するように操作した：
細胞を遠心分離（６分、２９０×ｇ、４℃）し、そして、ＲＰＭＩ－１６４０培地（５×１０6細胞／ｍＬ）に再懸濁した。
次に、４００μＬの細胞懸濁液を、１３．３μｇのいずれかの転移性ベクター（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｖｅｃｔｏｒ） ｐＰＢ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ－ＲＯＲ１（完全長ＲＯＲ１（ＮＰ＿００５００３．２）とピューロマイシン耐性遺伝子の同時発現へ導く）、および６．６μｇの転移酵素含有ベクターｐＣＤＮＡ３．１＿ｈｙ＿ｍＰＢを含有する４００μＬのＲＰＭＩに添加した。
ＤＮＡ／ＥＭＴ－６細胞混合物を、エレクトロポレーションキュベット（０．４ｃｍ－ギャップ、１６５－２０８８、ＢｉｏＲａｄ、Ｃｒｅｓｓｉｅｒ、スイス）に移し、そして、３００Ｖおよび９５０μＦでキャパシタンスエクステンダーを有するＢｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩを使用してエレクトロポレーションした。
次に、細胞を室温で５～１０分間インキュベートした。
インキュベーション後、細胞を、エッペンドルフ５８１０Ｒ遠心分離機中で２９０×ｇで６分間遠心分離し、１回洗浄し、続いて、完全ＤＭＥＭに再懸濁した後、５％ ＣＯ2雰囲気の加湿インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。
エレクトロポレーションの１日後、ヒトＲＯＲ１を安定に発現する細胞プールを、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８８３３）を添加することによって選択した。
ヒトＲＯＲ１を安定に発現するＥＭＴ－６細胞の産生
マウスＥＭＴ－６乳癌細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミン（すべてＢｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＬ－グルタミンを含むＤＭＥＭ完全（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（４．５ｇ／Ｌ））中、３７℃および５％ ＣＯ2で培養した。
細胞を、次のように転位により、ＲＯＲ１を過剰発現するように操作した：
細胞を遠心分離（６分、２９０×ｇ、４℃）し、そして、ＲＰＭＩ－１６４０培地（５×１０6細胞／ｍＬ）に再懸濁した。
次に、４００μＬの細胞懸濁液を、１３．３μｇのいずれかの転移性ベクター（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｖｅｃｔｏｒ） ｐＰＢ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ－ＲＯＲ１（完全長ＲＯＲ１（ＮＰ＿００５００３．２）とピューロマイシン耐性遺伝子の同時発現へ導く）、および６．６μｇの転移酵素含有ベクターｐＣＤＮＡ３．１＿ｈｙ＿ｍＰＢを含有する４００μＬのＲＰＭＩに添加した。
ＤＮＡ／ＥＭＴ－６細胞混合物を、エレクトロポレーションキュベット（０．４ｃｍ－ギャップ、１６５－２０８８、ＢｉｏＲａｄ、Ｃｒｅｓｓｉｅｒ、スイス）に移し、そして、３００Ｖおよび９５０μＦでキャパシタンスエクステンダーを有するＢｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩを使用してエレクトロポレーションした。
次に、細胞を室温で５～１０分間インキュベートした。
インキュベーション後、細胞を、エッペンドルフ５８１０Ｒ遠心分離機中で２９０×ｇで６分間遠心分離し、１回洗浄し、続いて、完全ＤＭＥＭに再懸濁した後、５％ ＣＯ2雰囲気の加湿インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。
エレクトロポレーションの１日後、ヒトＲＯＲ１を安定に発現する細胞プールを、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８８３３）を添加することによって選択した。
【0166】
ＲＯＲ１を発現する単細胞クローンは、抗生物質で選択されたＥＭＴ－６－ＲＯＲ１細胞に由来した。
簡潔には、
トリプシン処理後、１０6細胞をＦＡＣＳチューブ中で遠心分離し、
得られたペレットを、緩衝液（２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＰＢＳ）中に再懸濁した。
次いで、細胞を抗ＲＯＲ１抗体２Ａ２と共に、３０分間インキュベートし（４℃、最終濃度２μｇ／ｍＬ）、続いて、遠心分離および洗浄した。
次いで、細胞を前述のように再懸濁し、そして、暗所（３０分、４℃）で、１：２５０に希釈した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγ特異的）ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ、１２－４９９８－８２）とインキュベートし、緩衝液中で１回洗浄し、そして、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ装置（ＢＤ Ｂｉｏｃｓｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＵＳＡ）を用いた、ＦＡＣＳによる抗原発現細胞の単一細胞選別まで氷上に保持した。
簡潔には、
トリプシン処理後、１０6細胞をＦＡＣＳチューブ中で遠心分離し、
得られたペレットを、緩衝液（２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＰＢＳ）中に再懸濁した。
次いで、細胞を抗ＲＯＲ１抗体２Ａ２と共に、３０分間インキュベートし（４℃、最終濃度２μｇ／ｍＬ）、続いて、遠心分離および洗浄した。
次いで、細胞を前述のように再懸濁し、そして、暗所（３０分、４℃）で、１：２５０に希釈した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγ特異的）ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ、１２－４９９８－８２）とインキュベートし、緩衝液中で１回洗浄し、そして、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ装置（ＢＤ Ｂｉｏｃｓｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＵＳＡ）を用いた、ＦＡＣＳによる抗原発現細胞の単一細胞選別まで氷上に保持した。
【0167】
実施例４
ＥＭＴ－６－ＲＯＲ１同系乳房腫瘍モデルにおける抗ＲＯＲ１ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ評価
１ｘ１０6個のＥＭＴ－６－ＲＯＲ１クローン１４の腫瘍細胞を、１００μｌのＰＢＳに溶解して、それぞれのＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪パッドに同所的に移植した。
ＥＭＴ－６－ＲＯＲ１同系乳房腫瘍モデルにおける抗ＲＯＲ１ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ評価
１ｘ１０6個のＥＭＴ－６－ＲＯＲ１クローン１４の腫瘍細胞を、１００μｌのＰＢＳに溶解して、それぞれのＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪パッドに同所的に移植した。
【0168】
腫瘍の平均体積が、約３０～８０ｍｍ3（ノギスによる）に達した、０日目（Ｄ０）に、マウスを腫瘍の大きさに応じて、８匹ずつのグループにブロックランダムに分けた。
次に、ＡＤＣが、部分的な抗腫瘍反応のみをもたらす準最適用量を決定するために、マウスを異なる用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ）で１回処置した（図３）。
これに続いて、同じモデルを、表３にしたがって、アイソタイプをマッチさせた対照ＡＤＣを含む低用量ＡＤＣと、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４免疫チェックポイント阻害剤ｍＡｂ ９Ｄ９との併用処理または非併用処理に設定した。
マウスを少なくとも４０日間モニターし、過度の腫瘍量または苦痛の徴候の場合に安楽死させた。
免疫チェックポイント阻害剤９Ｄ９はマウスＣＴＬＡ－４の阻害剤であり、ＰＢＳ中に製剤化され、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｕ．Ｓ．から購入した。
次に、ＡＤＣが、部分的な抗腫瘍反応のみをもたらす準最適用量を決定するために、マウスを異なる用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ）で１回処置した（図３）。
これに続いて、同じモデルを、表３にしたがって、アイソタイプをマッチさせた対照ＡＤＣを含む低用量ＡＤＣと、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４免疫チェックポイント阻害剤ｍＡｂ ９Ｄ９との併用処理または非併用処理に設定した。
マウスを少なくとも４０日間モニターし、過度の腫瘍量または苦痛の徴候の場合に安楽死させた。
免疫チェックポイント阻害剤９Ｄ９はマウスＣＴＬＡ－４の阻害剤であり、ＰＢＳ中に製剤化され、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｕ．Ｓ．から購入した。
【0169】
【表6】
群の腫瘍体積中央値の計算には、当該日に生存していた動物の値を考慮した。
さらに、腫瘍量が多いために安楽死させられた動物の腫瘍量は、グループの平均／中央値の腫瘍量が増加する限り、ＬＯＣＦ（Ｌａｓｔ－Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ－Ｃａｒｒｉｅｄ－Ｆｏｒｗａｒｄ）法を用いて繰り越された。
【0170】
図４は、個々のマウスに対する腫瘍体積の変化、ならびに腫瘍体積の変化の中央値を示す。
（Ａ）ベヒクル対照、
（Ｂ）Ａｃ１０－Ｇ５－ＰＮＵアイソタイプ対照、
（Ｃ）ＸＢＲ１－４０２－Ｇ５－ＰＮＵ、
（Ｄ）Ａｃ１０－Ｇ５－ＰＮＵアイソタイプ対照＋抗マウスＣＴＬＡ－４抗体９Ｄ９、
（Ｅ）ＸＢＲ１－４０２－Ｇ５－ＰＮＵ＋抗マウスＣＴＬＡ－４抗体９Ｄ９、
で処置した個々のマウスについての腫瘍体積の変化。
（Ａ）ベヒクル対照、
（Ｂ）Ａｃ１０－Ｇ５－ＰＮＵアイソタイプ対照、
（Ｃ）ＸＢＲ１－４０２－Ｇ５－ＰＮＵ、
（Ｄ）Ａｃ１０－Ｇ５－ＰＮＵアイソタイプ対照＋抗マウスＣＴＬＡ－４抗体９Ｄ９、
（Ｅ）ＸＢＲ１－４０２－Ｇ５－ＰＮＵ＋抗マウスＣＴＬＡ－４抗体９Ｄ９、
で処置した個々のマウスについての腫瘍体積の変化。
【0171】
（Ｆ）ベヒクル対照、Ａｃ１０－Ｇ５－ＰＮＵアイソタイプ対照、およびＸＢＲ１－４０２－Ｇ５－ＰＮＵの群について、群腫瘍体積の変化中央値（Ｌａｓｔ－Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ－Ｃａｒｒｉｅｄ－Ｆｏｒｗａｒｄ（ＬＯＣＦ）法の適用による）。
【0172】
（Ｇ）ベヒクル対照、Ａｃ１０－Ｇ５－ＰＮＵアイソタイプ対照および抗マウスＣＴＬＡ－４抗体９Ｄ９、ならびにＸＢＲ１－４０２－Ｇ５－ＰＮＵおよび抗マウスＣＴＬＡ－４抗体９Ｄ９群についての群腫瘍体積変化の中央値（Ｌａｓｔ－Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ－Ｃａｒｒｉｅｄ－Ｆｏｒｗａｒｄ（ＬＯＣＦ）法の適用を伴う）。
【0173】
図中の結果によって示されるように、ＸＢＲ１－４０２－Ｇ５－ＰＮＵおよび抗マウスＣＴＬＡ－４抗体９Ｄ９の組合せは、０．２５ｍｇ／ｋｇでのＡＤＣ単独での個々の処置と比較して、増強された抗腫瘍応答を提供する。
さらに、パネルＤは、ベヒクル（パネルＡ）およびアイソタイプ対照（パネルＢ）と比較して、抗マウスＣＴＬＡ－４抗体９Ｄ９がいくらかの抗腫瘍効力を示すことを示し、ＥＭＴ－６－ＲＯＲ１腫瘍モデルが、ｈｏｔ ｔｕｍｏｒモデルとして特徴付けられ得ることを支持する。
さらに、パネルＤは、ベヒクル（パネルＡ）およびアイソタイプ対照（パネルＢ）と比較して、抗マウスＣＴＬＡ－４抗体９Ｄ９がいくらかの抗腫瘍効力を示すことを示し、ＥＭＴ－６－ＲＯＲ１腫瘍モデルが、ｈｏｔ ｔｕｍｏｒモデルとして特徴付けられ得ることを支持する。
【0174】
さらに、第１１群の生き残ったマウス（他の群にはない？そして、示すことが多分重要？）はすべて、１×１０6個のＥＭＴ－６－ＲＯＲ１クローン１４腫瘍細胞を事前に注射せずに乳腺脂肪パッドに移植して再チャレンジ（１０２日目）した際に、腫瘍の成長から保護された（図示せず）ことから、ＡＤＣとチェックポイント阻害剤の組み合わせでのみ、防御抗腫瘍免疫反応が生じたと考えられる。
【0175】
実施例５
ヒトＲＯＲ１を安定発現するＣＴ－２６およびＢ１６－Ｆ１０細胞の作製
マウスＣＴ－２６結腸癌細胞およびＢ１６－Ｆ１０（「Ｂ１６」）メラノーマ細胞（両方ともＡＴＣＣ由来）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミン（すべてＢｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＲＰＭＩ培地中、３７℃および５％ ＣＯ2で培養した。
細胞を、以下のように、移植によりＲＯＲ１を過剰表現するように操作した：
細胞をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ遠心分離（６分、２９０×ｇ、４℃）で遠心分離し、ＲＰＭＩ培地（５ｘ１０6セル／ｍｌ）で再度懸濁した。
次に、４００μＬの細胞懸濁液を、１３．３μｇの転移性ベクター ｐＰＢ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ－ＲＯＲ１（完全長ＲＯＲ１（ＮＰ＿００５００３．２）とピューロマイシン耐性遺伝子の同時発現を導く）および６．６μｇの転移酵素含有ベクターｐｃＤＮＡ３．１＿ｈｙ＿ｍＰＢを含有する４００μＬのＲＰＭＩに添加した。
ＤＮＡ／ＣＴ－２６またはＢ１６細胞混合物を、エレクトロポレーションキュベット（０．４ｃｍ－ｇａｐ、１６５－２０８８、ＢｉｏＲａｄ、Ｃｒｅｓｓｉｅｒ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移し、３００Ｖおよび９５０μＦのキャパシタンスエクステンダーを有するＢｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩを用いてエレクトロポレーションした。
次に、細胞を、室温で、５～１０分間インキュベートした。
インキュベーション後、細胞を２９０×ｇで６分間遠心分離し、１回洗浄し、その後、５％ ＣＯ2雰囲気の加湿インキュベーター中で３７℃でインキュベーションする前に、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。
エレクトロポレーションの１日後、ヒトＲＯＲ１を安定に発現する細胞プールを、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８８３３）を添加することによって選択した。
ヒトＲＯＲ１を安定発現するＣＴ－２６およびＢ１６－Ｆ１０細胞の作製
マウスＣＴ－２６結腸癌細胞およびＢ１６－Ｆ１０（「Ｂ１６」）メラノーマ細胞（両方ともＡＴＣＣ由来）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍＬのＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミン（すべてＢｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＲＰＭＩ培地中、３７℃および５％ ＣＯ2で培養した。
細胞を、以下のように、移植によりＲＯＲ１を過剰表現するように操作した：
細胞をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ遠心分離（６分、２９０×ｇ、４℃）で遠心分離し、ＲＰＭＩ培地（５ｘ１０6セル／ｍｌ）で再度懸濁した。
次に、４００μＬの細胞懸濁液を、１３．３μｇの転移性ベクター ｐＰＢ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ－ＲＯＲ１（完全長ＲＯＲ１（ＮＰ＿００５００３．２）とピューロマイシン耐性遺伝子の同時発現を導く）および６．６μｇの転移酵素含有ベクターｐｃＤＮＡ３．１＿ｈｙ＿ｍＰＢを含有する４００μＬのＲＰＭＩに添加した。
ＤＮＡ／ＣＴ－２６またはＢ１６細胞混合物を、エレクトロポレーションキュベット（０．４ｃｍ－ｇａｐ、１６５－２０８８、ＢｉｏＲａｄ、Ｃｒｅｓｓｉｅｒ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移し、３００Ｖおよび９５０μＦのキャパシタンスエクステンダーを有するＢｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩを用いてエレクトロポレーションした。
次に、細胞を、室温で、５～１０分間インキュベートした。
インキュベーション後、細胞を２９０×ｇで６分間遠心分離し、１回洗浄し、その後、５％ ＣＯ2雰囲気の加湿インキュベーター中で３７℃でインキュベーションする前に、完全ＲＰＭＩ中に再懸濁した。
エレクトロポレーションの１日後、ヒトＲＯＲ１を安定に発現する細胞プールを、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８８３３）を添加することによって選択した。
【0176】
ＲＯＲ１を発現するＣＴ－２６の単細胞クローンは、抗生物質によって選択された細胞に由来した。
簡潔には、
トリプシン処理後、１０6細胞を、ＦＡＣＳチューブ中で遠心分離し、
得られたペレットを、緩衝液（２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＰＢＳ）中に再懸濁した。
次いで、細胞を、抗ＲＯＲ１抗体ＸＢＲ１－４０２と共に３０分間インキュベートし（４℃、最終濃度２μｇ／ｍＬ）、
続いて、遠心分離および洗浄した。
次いで、細胞を、以前のように再懸濁し、そして抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγ特異的）ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ，１２－４９９８－８２）と共に、暗所（３０分、４℃）で、１：２５０希釈でインキュベートし、緩衝液中で１回洗浄し、そして、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ装置（ＢＤ Ｂｉｏｃｓｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＵＳＡ）を使用するＦＡＣＳによる抗原発現細胞の単一細胞ソーティングまで氷上に保持した。
図５（Ａ）は、操作されたＣＴ－２６クローン３のＦＡＣＳ染色結果を示す。
以下の実験で使用したＢ１６プールにおけるＲＯＲ１の発現もまた、ＦＡＣＳによって決定した（図５（Ｂ））。
簡潔には、
トリプシン処理後、１０6細胞を、ＦＡＣＳチューブ中で遠心分離し、
得られたペレットを、緩衝液（２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＰＢＳ）中に再懸濁した。
次いで、細胞を、抗ＲＯＲ１抗体ＸＢＲ１－４０２と共に３０分間インキュベートし（４℃、最終濃度２μｇ／ｍＬ）、
続いて、遠心分離および洗浄した。
次いで、細胞を、以前のように再懸濁し、そして抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃγ特異的）ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ，１２－４９９８－８２）と共に、暗所（３０分、４℃）で、１：２５０希釈でインキュベートし、緩衝液中で１回洗浄し、そして、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ装置（ＢＤ Ｂｉｏｃｓｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＵＳＡ）を使用するＦＡＣＳによる抗原発現細胞の単一細胞ソーティングまで氷上に保持した。
図５（Ａ）は、操作されたＣＴ－２６クローン３のＦＡＣＳ染色結果を示す。
以下の実験で使用したＢ１６プールにおけるＲＯＲ１の発現もまた、ＦＡＣＳによって決定した（図５（Ｂ））。
【0177】
実施例６
抗ＲＯＲ１ ＡＤＣおよび免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせで処理した、ｈＲＯＲ１過剰発現ＣＴ２６結腸癌マウスモデル
ＣＴ２６は、マウスモデルにおいて、ｗａｒｍ－ｔｏ－ｈｏｔ腫瘍を確立し、これは、これらが十分に高い投与量では、免疫チェックポイント阻害剤に応答することを意味する（Ｍｏｓｅｌｙ．Ｓら、２０１７）。
表４のように、実験群は、それぞれ８匹の６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを含んでいた。
１００μＬのＰＢＳ中の１ｘ１０6 ＣＴ－２６－ＲＯＲ１クローン３腫瘍細胞（実施例５から）を、各マウスの脇腹の片側に移植した。腫瘍体積中央値が、約３０～１００ｍｍ3（ノギスによる）に達した、０日目（Ｄ０）に、マウスを腫瘍の大きさに従って群に無作為化した。
次いで、表４に従ってマウスを処置し、１週間に３回、４２日間、または腫瘍が１５００ ｍｍ3に達するまで（ノギスにより）モニターした。
ＲＰＭ１－１４（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｕ．Ｓ．）はマウスＰＤ－１の阻害剤であり、ＰＢＳ中に製剤化した。
この免疫チェックポイント阻害剤は、これまでＯｎｃｏｔｅｓｔ（データは示していない）によって判定されていたように、単剤療法としてのその有効用量を下回って投与された。
抗ＲＯＲ１ ＡＤＣおよび免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせで処理した、ｈＲＯＲ１過剰発現ＣＴ２６結腸癌マウスモデル
ＣＴ２６は、マウスモデルにおいて、ｗａｒｍ－ｔｏ－ｈｏｔ腫瘍を確立し、これは、これらが十分に高い投与量では、免疫チェックポイント阻害剤に応答することを意味する（Ｍｏｓｅｌｙ．Ｓら、２０１７）。
表４のように、実験群は、それぞれ８匹の６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを含んでいた。
１００μＬのＰＢＳ中の１ｘ１０6 ＣＴ－２６－ＲＯＲ１クローン３腫瘍細胞（実施例５から）を、各マウスの脇腹の片側に移植した。腫瘍体積中央値が、約３０～１００ｍｍ3（ノギスによる）に達した、０日目（Ｄ０）に、マウスを腫瘍の大きさに従って群に無作為化した。
次いで、表４に従ってマウスを処置し、１週間に３回、４２日間、または腫瘍が１５００ ｍｍ3に達するまで（ノギスにより）モニターした。
ＲＰＭ１－１４（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｕ．Ｓ．）はマウスＰＤ－１の阻害剤であり、ＰＢＳ中に製剤化した。
この免疫チェックポイント阻害剤は、これまでＯｎｃｏｔｅｓｔ（データは示していない）によって判定されていたように、単剤療法としてのその有効用量を下回って投与された。
【0178】
【表7】
（Ａ）第１群のベヒクルコントロール（未処理）、
（Ｂ）第２群のアイソタイプ対照群、
（Ｃ）第３群の抗ＲＯＲ１ ＡＤＣ ｈｕＸＢＲ１－４０２－１７－Ｇ３－ＰＮＵ、
（Ｄ）第４群のアイソタイプ対照＋免疫チェックポイント阻害剤抗マウスＰＤ－１抗体、
（Ｅ）第７群の抗ＲＯＲ１ ＡＤＣ ｈｕＸＢＲ１－４０２－１７－Ｇ３－ＰＮＵ＋免疫チェックポイント阻害剤抗マウスＰＤ－１抗体。
パネルＣに示されるように、標的ＡＤＣは単剤療法としての完全応答に必要とされる用量よりも有意に低い用量で投与されたことが強調される。
結果は、評価された免疫チェックポイント阻害剤と標的ＰＮＵ誘導体含有ＡＤＣとの間の強力な相乗作用を示唆する。
【0179】
実施例７
抗ＲＯＲ１ ＡＤＣおよび免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせで処理した、ｈＲＯＲ１過剰発現Ｂ１６メラノーママウスモデル
Ｂ１６は、マウスモデルにおいて免疫原性の低い（ｃｏｌｄ）腫瘍を確立し（Ｃｅｌｉｋ、Ｃら、１９８３）、これはこれらが、合理的な範囲内、すなわち、約５０～１００μｇ／マウス（Ｇｒｏｓｓｏ、Ｊら、２０１３）までの用量で投与された場合、免疫チェックポイント阻害剤に応答しないことを意味する。
表７による実験群は、それぞれ、８～９週齢の雌ＢＬ６／６ＮＲｊ １０匹を含んでいた。
１００μＬのハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）中の２ｘ１０5 Ｂ１６－ＲＯＲ１腫瘍細胞（実施例５由来）を、０日目（Ｄ０）に各マウスに静脈内注射した。
マウスを単純なランダム割り当てにより群に無作為に割り付け、そして、表５に従って処置し、１２～１９日にわたり週５日モニタリングした。
抗ＲＯＲ１ ＡＤＣおよび免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせで処理した、ｈＲＯＲ１過剰発現Ｂ１６メラノーママウスモデル
Ｂ１６は、マウスモデルにおいて免疫原性の低い（ｃｏｌｄ）腫瘍を確立し（Ｃｅｌｉｋ、Ｃら、１９８３）、これはこれらが、合理的な範囲内、すなわち、約５０～１００μｇ／マウス（Ｇｒｏｓｓｏ、Ｊら、２０１３）までの用量で投与された場合、免疫チェックポイント阻害剤に応答しないことを意味する。
表７による実験群は、それぞれ、８～９週齢の雌ＢＬ６／６ＮＲｊ １０匹を含んでいた。
１００μＬのハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）中の２ｘ１０5 Ｂ１６－ＲＯＲ１腫瘍細胞（実施例５由来）を、０日目（Ｄ０）に各マウスに静脈内注射した。
マウスを単純なランダム割り当てにより群に無作為に割り付け、そして、表５に従って処置し、１２～１９日にわたり週５日モニタリングした。
【0180】
【表8】
実験的に誘導された各肺表面上の転移（Ｓａｘｅｎａ Ｍ．ら、２０１３）（Ｂ１６－ＲＯＲ１コロニーを表す）を視覚的に計数し、そして、盲検条件下で３つのビン（直径＜１ｍｍ、１～２ｍｍ、＞２ｍｍ）のうちの１つへの割り当てについてそれぞれを評価した。
次いで、各肺上のコロニーの体積を、以下の式（各コロニーを球として近似する）に従って決定した：
【0181】
コロニー体積（ｍｍ3）＝カウント（スポット径＜１ｍｍ）×０．００４ｍｍ3＋カウント（スポット径１～２ｍｍ）×０．２１ｍｍ3＋カウント（直径＞２ｍｍスポット）×０．４８５ｍｍ3
【0182】
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍおよび平均の不対Ｔ検定を用いて行った。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意（＊）、ｐ値≧０．５を統計学的に有意でない（ｎ．ｓ．）とした。
【0183】
図７は、表５の異なる処置群のコロニー体積を示す。
これらの結果は、免疫チェックポイント阻害剤の有意な効果を伴わない低免疫原性（「ｃｏｌｄ」）腫瘍において、評価された免疫チェックポイント阻害剤と標的化ＰＮＵ誘導体含有ＡＤＣとの間の強力な相乗作用を示唆する。
これらの結果は、免疫チェックポイント阻害剤の有意な効果を伴わない低免疫原性（「ｃｏｌｄ」）腫瘍において、評価された免疫チェックポイント阻害剤と標的化ＰＮＵ誘導体含有ＡＤＣとの間の強力な相乗作用を示唆する。
【0184】
実施例８
抗ＲＯＲ１ ＡＤＣで処理した、ｈＲＯＲ１過剰発現Ｂ１６メラノーママウスモデル
表６による実験群は、８～９週齢の雌ＢＬ６／６ＮＲｊを含んでいた。
ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）１００μＬ中の１０6 Ｂ１６－ＲＯＲ１腫瘍細胞（実施例５から）を、各マウスの脇腹の片側に移植した。
腫瘍体積中央値が、約２５０ ｍｍ3（ノギスによる）の平均に達した０日目（Ｄ０）に、マウスを、表６の腫瘍の大きさに従って群に無作為化した。次いで、表６に従ってマウスを処置し、投与の２４時間後に安楽死させ、続いて腫瘍抽出を行った。
抗ＲＯＲ１ ＡＤＣで処理した、ｈＲＯＲ１過剰発現Ｂ１６メラノーママウスモデル
表６による実験群は、８～９週齢の雌ＢＬ６／６ＮＲｊを含んでいた。
ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）１００μＬ中の１０6 Ｂ１６－ＲＯＲ１腫瘍細胞（実施例５から）を、各マウスの脇腹の片側に移植した。
腫瘍体積中央値が、約２５０ ｍｍ3（ノギスによる）の平均に達した０日目（Ｄ０）に、マウスを、表６の腫瘍の大きさに従って群に無作為化した。次いで、表６に従ってマウスを処置し、投与の２４時間後に安楽死させ、続いて腫瘍抽出を行った。
【0185】
【表9】
検出は、抗ラット抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２１２０８）を用いて行った。
【0186】
図８は、表６に従って、（Ａ）未処理対照マウス、および（Ｂ）ＡＤＣで処理した３匹のマウス（４ｍｇ／ｋｇで１回）からのｈＲＯＲ１（ヒトＲＯＲ１）過剰発現Ｂ１６腫瘍凍結切片のＣＤ４およびＣＤ８染色の代表的な画像を示す。
図８（Ａ）に従うと、Ｂ１６腫瘍は、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとしてのＢ１６腫瘍の状態を保持して、自然に低レベルのＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を含む。
図８（Ｂ）は、本発明によるＡＤＣによる治療が、腫瘍内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の数を増加させることを示す。
図８（Ａ）に従うと、Ｂ１６腫瘍は、ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒとしてのＢ１６腫瘍の状態を保持して、自然に低レベルのＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を含む。
図８（Ｂ）は、本発明によるＡＤＣによる治療が、腫瘍内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の数を増加させることを示す。
【0187】
さらに、ｈＲＯＲ１（ヒトＲＯＲ１）過剰発現ＣＴ－２６およびＢ－１６腫瘍を、機械的および酵素的に消化し、生存細胞および免疫細胞マーカーについてＦＡＣＳ染色に供して、Ｔ細胞集団を確認した。
表７に報告されたＦＡＣＳ染色スキームを、６３３または６３５ｎｍ励起染色試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）のためのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）固定型近赤外線死細胞染色キットと組み合わせて使用した。
表７に報告されたＦＡＣＳ染色スキームを、６３３または６３５ｎｍ励起染色試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）のためのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）固定型近赤外線死細胞染色キットと組み合わせて使用した。
【0188】
【表10】
【0189】
参照文献
・Galon J et al., J Pathol 2014; 232: 199-209
・Pages F et al., J Clin Oncol 2009; 27: 5944-5951.
・Angell HK, Galon J, Curr Opin Immunol 2013; 25: 261-267.
・Galon et al. Immunity 2013; 39: 11-26.
・Bu X et al., Trends in Molecular Medicine (2016), Volume 22 , Issue 6 , 448 - 451
・Shi et al., Org. Biomol. Chem., 2009,7, 3709-3722
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・MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)
【0190】
配列
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。
ＷＩＰＯ ＳＴ ２５適合性のある電子配列表もまた、この出願と共に提供される。
疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列が正しいものとみなされるものとする。
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。
ＷＩＰＯ ＳＴ ２５適合性のある電子配列表もまた、この出願と共に提供される。
疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列が正しいものとみなされるものとする。
【表11】
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【配列表】