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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-20
(45)【発行日】2025-01-06
(54)【発明の名称】ヒドロキシチロソールの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/22 20060101AFI20241223BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20241223BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241223BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20241223BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20241223BHJP
【ＦＩ】
C12P7/22 ZNA
C12N1/00 B
C12N1/21
C12N15/53
C12N15/31
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2020190484
(22)【出願日】2020-11-16
(65)【公開番号】P2022079337
(43)【公開日】2022-05-26
【審査請求日】2023-09-08
(73)【特許権者】
【識別番号】520449563
【氏名又は名称】マイクロバイオファクトリー株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】517132810
【氏名又は名称】地方独立行政法人大阪産業技術研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】駒 大輔
(72)【発明者】
【氏名】大本 貴士
(72)【発明者】
【氏名】森芳 邦彦
(72)【発明者】
【氏名】山中 勇人
(72)【発明者】
【氏名】大橋 博之
(72)【発明者】
【氏名】清水 雅士
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】特開２０２０－０５８３４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５１０４６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１０／００４７８８７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００７／０３７３００（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－０３２４４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／２３７８２４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Daisuke KOMA et al.，“Chromosome Engineering To Generate Plasmid-Free Phenylalanine- and Tyrosine-OverproducingEscherichia coliStrains That Can Be Applied in the Generation of Aromatic-Compound-Producing Bacteria”，Applied and Environmental Microbiology，2020年07月02日，Vol. 86, No. 14, e00525-20，1-24，DOI: 10.1128/AEM.00525-20
【文献】Xianglai LI et al.，“Establishing an Artificial Pathway for Efficient Biosynthesis of Hydroxytyrosol”，ACS Synthetic Biology，2018年01月10日，Vol. 7, No. 2，p.647-654，DOI: 10.1021/acssynbio.7b00385
【文献】Daeun CHUNG et al.，“Production of three phenylethanoids, tyrosol, hydroxytyrosol, and salidroside, using plant genes expressing in Escherichia coli”，Scientific Reports，2017年05月31日，7:2578，1-8，DOI: 10.1038/s41598-017-02042-2
【文献】Metabolic Engineering ，2020年08月11日，62，10-19
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ ７／２２
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－ １／３８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
チロソールと微生物とを反応させる工程を含み、前記微生物は、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が発現可能に染色体に組み込まれる改変が加えられた微生物であり、
前記微生物が、エシェリヒア コリであり、
前記反応が、チロソールの流加培養である、
ヒドロキシチロソールの製造方法。
【請求項2】
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、二成分型ＦＡＤ依存モノオキシゲナーゼである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、エシェリヒア コリのｈｐａＢＣ遺伝子の遺伝子産物又はそのオーソログの遺伝子産物である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項4】
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が、エシェリヒア コリのｈｐａＢＣ遺伝子又はそのオーソログである、請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項5】
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が、配列表の配列番号９及び１０で表される２つの塩基配列を含む遺伝子、又は、配列表の配列番号９及び１０で表される塩基配列の１又は複数個が欠失、置換、及び／又は付加された塩基配列であって４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼとして機能可能なタンパク質をコードする２つの塩基配列を含む遺伝子である、請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ヒドロキシチロソールの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒドロキシチロソールは高価値の化合物であり、高純度のヒドロキシチロソールの安定かつ持続可能な製造に対する需要が高まっている。ヒドロキシチロソールは、抗腫瘍剤、抗アテローム剤、抗炎症剤及び／又は抗血小板凝集剤としての潜在的な生物学的機能を有する最も強力な抗酸化剤のひとつであり、機能性食品、栄養補助食品、化粧品、及び動物飼料などの産業における広範囲の潜在的用途を有する。
【0003】
ヒドロキシチロソールは、オリーブ抽出物から製造されるほか、微生物や酵素を利用したバイオコンバージョンによる製造も提案されている（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）。
チロソールを原料としてヒドロキシチロソールを製造する方法として、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を利用する方法（非特許文献１）や、青枯病菌（Ralstonia solanacreaum）のチロシナーゼ酵素を利用する方法が報告されている（特許文献１）。
Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ＤＯＰＡ）を原料としてヒドロキシチロソールを製造する方法として、大腸菌（Escherichia coli）の改変体を用いる方法が報告されている（特許文献２、非特許文献２）。
チロソールを原料としてヒドロキシチロソールを製造する方法として、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を利用する方法（非特許文献１）や、青枯病菌（Ralstonia solanacreaum）のチロシナーゼ酵素を利用する方法が報告されている（特許文献１）。
Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ－ＤＯＰＡ）を原料としてヒドロキシチロソールを製造する方法として、大腸菌（Escherichia coli）の改変体を用いる方法が報告されている（特許文献２、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特表２０１７－５３８４３２号公報
【文献】特表２０１９－５２４０７６号公報
【非特許文献】
【0005】
【文献】Z. Bouallagui and S. Sayadi, Bioconversion of of p-Tyrosol into Hydroxytyrosol under Bench-Scale Fermentation, BioMed Research InternationalVolume 2018, Article ID 7390751
【文献】Chaozhi Li et al., Efficient Synthesis of Hydroxytyrosol from l-3,4-Dihydroxyphenylalanine Using Engineered Escherichia coli Whole Cells、J. Agric. Food Chem., 2019, 67, 24, 6867-6873
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
緑膿菌を使う方法（非特許文献１）は、緑膿菌が病原菌であるため、大量培養が好ましくないなどの問題があり、この問題を解消するため、生菌ではなく酵素を利用する方法（特許文献１）が提案された。
しかし、酵素を調製するためには、酵素を作る微生物を増やし、そこから酵素を精製する手間がかかる。特に酵素は精製すればコストが大幅に上がる。また、酵素に補酵素が必要な場合は、反応液に補酵素を添加するか、補酵素の再生系を構築する必要があるが、補酵素は一般的に高価である。また、補酵素の再生系を構築するためには、そのために別の酵素が必要となる。
また、Ｌ－ＤＯＰＡを原料とした生菌を用いる方法が提案されているが（特許文献２及び非特許文献２）、原料のＬ－ＤＯＰＡは非常に高価である。また、Ｌ－ＤＯＰＡを菌に作らせる工程を採用したとしても、この方法でＬ－ＤＯＰＡを大量に生産することは困難が伴う。
しかし、酵素を調製するためには、酵素を作る微生物を増やし、そこから酵素を精製する手間がかかる。特に酵素は精製すればコストが大幅に上がる。また、酵素に補酵素が必要な場合は、反応液に補酵素を添加するか、補酵素の再生系を構築する必要があるが、補酵素は一般的に高価である。また、補酵素の再生系を構築するためには、そのために別の酵素が必要となる。
また、Ｌ－ＤＯＰＡを原料とした生菌を用いる方法が提案されているが（特許文献２及び非特許文献２）、原料のＬ－ＤＯＰＡは非常に高価である。また、Ｌ－ＤＯＰＡを菌に作らせる工程を採用したとしても、この方法でＬ－ＤＯＰＡを大量に生産することは困難が伴う。
【0007】
本開示は、生菌を使用し、生産性が向上するヒドロキシチロソールの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本開示は、チロソールと微生物とを反応させる工程を含み、前記微生物は、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が発現可能に染色体に組み込まれる改変が加えられた微生物である、ヒドロキシチロソールの製造方法に関する。
【発明の効果】
【0009】
本開示によれば、生菌を使用し、生産性が向上したヒドロキシチロソールの製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
本開示は、チロソールからヒドロキシチロソールを製造する際に使用する微生物において、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の導入方法が、プラスミドとして導入する形態に比べ、染色体に組み込む形態の場合に、顕著にヒドロキシチロソールの生産性が向上する、という知見に基づく。
【0012】
［微生物］
本開示において使用される微生物、つまり、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が発現可能に染色体に組み込まれる改変が加えられる宿主の微生物としては、特に制限されない。
前記微生物の一又は複数の実施形態として、酵母及びバクテリアが挙げられる。
本開示において使用される微生物、つまり、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が発現可能に染色体に組み込まれる改変が加えられる宿主の微生物としては、特に制限されない。
前記微生物の一又は複数の実施形態として、酵母及びバクテリアが挙げられる。
【0013】
酵母としては、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍａｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。
バクテリアとしては、エシェリヒア コリ（大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等が挙げられる。
大腸菌としては、大腸菌Ｋ１２株及びＢ株、これらに由来する株が挙げられる。大腸菌Ｋ１２株由来の株としては、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、Ｗ１３３０、ＪＭ１０９、ＨＳＴ０２、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、及びこれらの染色体にラムダＤＥ３遺伝子が組み込まれたＤＥ３株が挙げられる。Ｂ株由来の株としては、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）等が挙げられる。
大腸菌としては、これら菌株から派生した自然変異株でも人為的な遺伝子改変株であってもよい。
バクテリアとしては、エシェリヒア コリ（大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等が挙げられる。
大腸菌としては、大腸菌Ｋ１２株及びＢ株、これらに由来する株が挙げられる。大腸菌Ｋ１２株由来の株としては、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、Ｗ１３３０、ＪＭ１０９、ＨＳＴ０２、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、及びこれらの染色体にラムダＤＥ３遺伝子が組み込まれたＤＥ３株が挙げられる。Ｂ株由来の株としては、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）等が挙げられる。
大腸菌としては、これら菌株から派生した自然変異株でも人為的な遺伝子改変株であってもよい。
【0014】
［４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼ］
本開示において、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－モノオキシゲナーゼとも呼ばれる酵素をいう。
本開示における４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、チロソールがヒドロキシチロソールとなる化学反応を触媒できるものである。
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、上記触媒機能があるものであれば制限されないが、一又は複数の実施形態において、二成分酵素であって、一又は複数の実施形態において、補酵素として還元型のフラビンアデニンヌクレオチド（ＦＡＤ）、すなわち、ＦＡＤＨ2を使用する、二成分型FAD依存モノオキシゲナーゼである。
本開示において、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－モノオキシゲナーゼとも呼ばれる酵素をいう。
本開示における４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、チロソールがヒドロキシチロソールとなる化学反応を触媒できるものである。
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、上記触媒機能があるものであれば制限されないが、一又は複数の実施形態において、二成分酵素であって、一又は複数の実施形態において、補酵素として還元型のフラビンアデニンヌクレオチド（ＦＡＤ）、すなわち、ＦＡＤＨ2を使用する、二成分型FAD依存モノオキシゲナーゼである。
【0015】
本開示における４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、一又は複数の実施形態において、大腸菌のｈｐａＢＣ遺伝子の遺伝子産物若しくはそのオーソログの遺伝子産物、又はこれらに由来する二成分酵素である。
大腸菌のｈｐａＢ遺伝子の産物ＨｐａＢタンパク質のアミノ酸配列は、一又は複数の実施形態において、配列番号１１で表される。
大腸菌のｈｐａＣ遺伝子の産物ＨｐａＣタンパク質のアミノ酸配列は、一又は複数の実施形態において、配列番号１２で表される。
本開示において「オーソログ」とは、異なる生物に存在する相同な機能を有する類縁遺伝子を意味する。
本開示において「由来する酵素」とは、一又は複数の実施形態において、元の酵素のアミノ酸配列に対して同一性が７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸配列である酵素をいう。
本開示において「由来する酵素」とは、一又は複数の実施形態において、「チロソールがヒドロキシチロソールとなる化学反応を触媒できる」機能を、元の酵素と同程度に有する酵素をいう。同程度とは、一又は複数の実施形態において、活性の差が±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、又は±５％以内のことをいう。
大腸菌のｈｐａＢ遺伝子の産物ＨｐａＢタンパク質のアミノ酸配列は、一又は複数の実施形態において、配列番号１１で表される。
大腸菌のｈｐａＣ遺伝子の産物ＨｐａＣタンパク質のアミノ酸配列は、一又は複数の実施形態において、配列番号１２で表される。
本開示において「オーソログ」とは、異なる生物に存在する相同な機能を有する類縁遺伝子を意味する。
本開示において「由来する酵素」とは、一又は複数の実施形態において、元の酵素のアミノ酸配列に対して同一性が７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸配列である酵素をいう。
本開示において「由来する酵素」とは、一又は複数の実施形態において、「チロソールがヒドロキシチロソールとなる化学反応を触媒できる」機能を、元の酵素と同程度に有する酵素をいう。同程度とは、一又は複数の実施形態において、活性の差が±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、又は±５％以内のことをいう。
【0016】
［４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子］
本開示において、宿主微生物に導入される遺伝子は、上述の４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が使用できる。
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼが二成分又はそれ以上の複数の成分から構成される酵素である場合、本開示において「４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子」は、一又は複数の実施形態において、成分の数の遺伝子から構成される。その場合、「４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子」は、複数の遺伝子から構成されるとみなすこともできるし、複数の遺伝子から構成される１つの遺伝子とみなすこともできる。
本開示において、宿主微生物に導入される遺伝子は、上述の４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が使用できる。
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼが二成分又はそれ以上の複数の成分から構成される酵素である場合、本開示において「４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子」は、一又は複数の実施形態において、成分の数の遺伝子から構成される。その場合、「４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子」は、複数の遺伝子から構成されるとみなすこともできるし、複数の遺伝子から構成される１つの遺伝子とみなすこともできる。
【0017】
該遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、大腸菌のｈｐａＢＣ遺伝子又はそのオーソログが挙げられる。
大腸菌のｈｐａＢＣ遺伝子は、野生型のものあるいはデータベース（ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫなど）に本願出願時において登録されているものであってよく、野生型と同等の機能を果たす範囲、又は、野生型と同等のタンパク質をコードする範囲で配列が異なっていてもよく、上述のとおりオーソログの配列であってもよい。また、遺伝子は、宿主微生物での発現のため、コドンが最適化されてもよい。
大腸菌のｈｐａＢＣ遺伝子は、ｈｐａＢ遺伝子とｈｐａＣ遺伝子がオペロンを形成しているものであり、ｈｐａＢ遺伝子は、一又は複数の実施形態において、配列表の配列番号９で表され、ｈｐａＣ遺伝子は、一又は複数の実施形態において、配列表の配列番号１０で表される。
よって、該遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、配列表の配列番号９及び１０で表される２つの塩基配列を含む遺伝子、又は、配列表の配列番号９及び１０で表される塩基配列の１又は複数個が欠失、置換、及び／又は付加された塩基配列であって４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼとして機能可能なタンパク質をコードする２つの塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。
複数個とは、一又は複数の実施形態において、２～１００、２～９０、２～６０、２～５０、２～４０、２～３０、２～２０、２～１５、２～１０、２～７、２～６、２～５、２～４、又は、２～３が挙げられる。
なお、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が複数の遺伝子で構成されている場合、それらは、オペロンとして染色体に導入されてもよく、それぞれ独立してあるいは別々に染色体に導入されてもよい。
大腸菌のｈｐａＢＣ遺伝子は、野生型のものあるいはデータベース（ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫなど）に本願出願時において登録されているものであってよく、野生型と同等の機能を果たす範囲、又は、野生型と同等のタンパク質をコードする範囲で配列が異なっていてもよく、上述のとおりオーソログの配列であってもよい。また、遺伝子は、宿主微生物での発現のため、コドンが最適化されてもよい。
大腸菌のｈｐａＢＣ遺伝子は、ｈｐａＢ遺伝子とｈｐａＣ遺伝子がオペロンを形成しているものであり、ｈｐａＢ遺伝子は、一又は複数の実施形態において、配列表の配列番号９で表され、ｈｐａＣ遺伝子は、一又は複数の実施形態において、配列表の配列番号１０で表される。
よって、該遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、配列表の配列番号９及び１０で表される２つの塩基配列を含む遺伝子、又は、配列表の配列番号９及び１０で表される塩基配列の１又は複数個が欠失、置換、及び／又は付加された塩基配列であって４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼとして機能可能なタンパク質をコードする２つの塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。
複数個とは、一又は複数の実施形態において、２～１００、２～９０、２～６０、２～５０、２～４０、２～３０、２～２０、２～１５、２～１０、２～７、２～６、２～５、２～４、又は、２～３が挙げられる。
なお、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が複数の遺伝子で構成されている場合、それらは、オペロンとして染色体に導入されてもよく、それぞれ独立してあるいは別々に染色体に導入されてもよい。
【0018】
［染色体への組み込み］
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の宿主微生物の染色体への組み込みは、発現可能に導入できる方法であれば、特に制限されない。
染色体への組み込みは、一又は複数の実施形態において、部位特異的な組み換えで行われる。
部位特異的な組み換えは、一又は複数の実施形態において、ＣＲＩＭプラスミドを利用する方法、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムを利用する方法、出芽酵母の組み換え酵素ＦＬＰとＦＲＴ配列を利用する方法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用する方法などが挙げられる。
遺伝子を発現可能に導入する方法としては、遺伝子の発現亢進が誘導可能なプロモーター等の発現調節配列とともに導入する方法が挙げられる。
宿主微生物が大腸菌の場合、遺伝子の発現亢進が誘導可能なプロモーターとしては、一又は複数の実施形態において、Ｔ７プロモーターが挙げられる。発現誘導にＴ７プロモーターを用いる場合、宿主微生物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する株であることが好ましい。宿主微生物としては、一又は複数の実施形態において、λＤＥ３ファージを溶原化したＤＥ３株が挙げられる。
遺伝子の発現亢進が誘導可能なプロモーターとしては、その他の一又は複数の実施形態において、λファージのPLプロモーター（熱で発現誘導されるプロモーター）、アラビノースオペロンのアラビノースプロモーター（アラビノースで発現誘導されるプロモーター）、tetプロモーター（テトラサイクリンで発現誘導されるプロモーター）、tyrRなどの構成タンパク質のプロモーター、及び、構成性の人工プロモーターなどが挙げられる。
本開示において、遺伝子を発現誘導可能なプロモーターとともに染色体に導入する方法は、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、実施例に記載の方法（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９に記載の方法）が挙げられる。
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の宿主微生物の染色体への組み込みは、発現可能に導入できる方法であれば、特に制限されない。
染色体への組み込みは、一又は複数の実施形態において、部位特異的な組み換えで行われる。
部位特異的な組み換えは、一又は複数の実施形態において、ＣＲＩＭプラスミドを利用する方法、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰシステムを利用する方法、出芽酵母の組み換え酵素ＦＬＰとＦＲＴ配列を利用する方法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用する方法などが挙げられる。
遺伝子を発現可能に導入する方法としては、遺伝子の発現亢進が誘導可能なプロモーター等の発現調節配列とともに導入する方法が挙げられる。
宿主微生物が大腸菌の場合、遺伝子の発現亢進が誘導可能なプロモーターとしては、一又は複数の実施形態において、Ｔ７プロモーターが挙げられる。発現誘導にＴ７プロモーターを用いる場合、宿主微生物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する株であることが好ましい。宿主微生物としては、一又は複数の実施形態において、λＤＥ３ファージを溶原化したＤＥ３株が挙げられる。
遺伝子の発現亢進が誘導可能なプロモーターとしては、その他の一又は複数の実施形態において、λファージのPLプロモーター（熱で発現誘導されるプロモーター）、アラビノースオペロンのアラビノースプロモーター（アラビノースで発現誘導されるプロモーター）、tetプロモーター（テトラサイクリンで発現誘導されるプロモーター）、tyrRなどの構成タンパク質のプロモーター、及び、構成性の人工プロモーターなどが挙げられる。
本開示において、遺伝子を発現誘導可能なプロモーターとともに染色体に導入する方法は、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、実施例に記載の方法（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９に記載の方法）が挙げられる。
【0019】
［チロソールと微生物との反応工程］
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が発現可能に染色体に組み込まれた微生物（以下、本開示の微生物ともいう）をチロソールと接触させて反応させることにより、ヒドロキシチロソールが生成する。本開示におけるこの「反応」は、「発酵」ということもできる。
チロソールと本開示の微生物との反応は、一又は複数の実施形態において、所定量まで培養した本開示の微生物に対して４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼの発現誘導を行い、その後、チロソールを添加することで行うことができる。
本開示の微生物の培養は、通常の培養方法の条件で行うことができ、反応工程も、従来の発酵又は反応の条件で行うことができる。培養・反応の培地は、炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、ミネラル、ビタミンなどのその他の成分を含むもので、本開示の微生物が生育できるものなら特に限定されない。
本開示の微生物の培養及び反応は、ヒドロキシチロソールの生産量を向上する点から、ジャーファメンターやバイオリアクター等の大量培養可能な装置で行うことが好ましい。
本開示の微生物の培養及び反応は、ヒドロキシチロソールの生産量を向上する点から、原料であるチロソールを反応中に添加する流加培養が好ましい。
４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が発現可能に染色体に組み込まれた微生物（以下、本開示の微生物ともいう）をチロソールと接触させて反応させることにより、ヒドロキシチロソールが生成する。本開示におけるこの「反応」は、「発酵」ということもできる。
チロソールと本開示の微生物との反応は、一又は複数の実施形態において、所定量まで培養した本開示の微生物に対して４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼの発現誘導を行い、その後、チロソールを添加することで行うことができる。
本開示の微生物の培養は、通常の培養方法の条件で行うことができ、反応工程も、従来の発酵又は反応の条件で行うことができる。培養・反応の培地は、炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、ミネラル、ビタミンなどのその他の成分を含むもので、本開示の微生物が生育できるものなら特に限定されない。
本開示の微生物の培養及び反応は、ヒドロキシチロソールの生産量を向上する点から、ジャーファメンターやバイオリアクター等の大量培養可能な装置で行うことが好ましい。
本開示の微生物の培養及び反応は、ヒドロキシチロソールの生産量を向上する点から、原料であるチロソールを反応中に添加する流加培養が好ましい。
【0020】
チロソールの流加培養によるヒドロキシチロソールの製造方法は、例えば、実施例の方法を参照できる。簡単には、前培養を行い、１％の濃度で最小培地に植菌して培養し、ＯＤ660が０．５～２０に達したら発現誘導（Ｔ７プロモーターであれば、例えば１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加）して２～５時間培養した後、原料であるチロソール溶液を所定の供給スピードで流加して２０～３５時間反応し、反応液及び／又は菌内にヒドロキシチロソールを得る。
【0021】
［培養温度］
微生物が生育できる温度が挙げられる。生育速度の観点から、その生物の至適な培養温度が好ましい。大腸菌であれば、一又は複数の実施形態において、２５℃～４０℃、又は、３０℃～３７℃が挙げられる。
［培養培地］
微生物が生育できる培地であれば制限されない。ＬＢ培地などの天然培地、Ｍ９や実施例のＨＣＦ培地などの合成培地が挙げられる。化合物の精製を考えた場合には合成培地の方が好ましい。
［培養ｐＨ］
培養ｐＨは、一又は複数の実施形態において、６．０～７．５の範囲が挙げられる。大腸菌の場合は、一又は複数の実施形態において、７．０付近、又は、６．２～７．２が挙げられる。
微生物が生育できる温度が挙げられる。生育速度の観点から、その生物の至適な培養温度が好ましい。大腸菌であれば、一又は複数の実施形態において、２５℃～４０℃、又は、３０℃～３７℃が挙げられる。
［培養培地］
微生物が生育できる培地であれば制限されない。ＬＢ培地などの天然培地、Ｍ９や実施例のＨＣＦ培地などの合成培地が挙げられる。化合物の精製を考えた場合には合成培地の方が好ましい。
［培養ｐＨ］
培養ｐＨは、一又は複数の実施形態において、６．０～７．５の範囲が挙げられる。大腸菌の場合は、一又は複数の実施形態において、７．０付近、又は、６．２～７．２が挙げられる。
【0022】
［反応温度］
上記培養温度と同様とすることができる。
［反応培地］
上記培養培地と同様とすることができる。
［反応培地へのチロソール添加量（流加速度）］
チロソール添加量は、菌の種類、菌体量、反応条件に依存して調節する。一又は複数の実施形態において、添加したチロソールが速やかにヒドロキシチロソールに変換されるような速度で、チロソールを流加するのがよい。大腸菌の場合、ＯＤ660が４０程度であれば、５～１００ｍｇ／Ｌ／分、又は、１０～８０ｍｇ／Ｌ／分の速度で添加することが挙げられる。
添加するチロソール総量は、菌の種類によって異なるが、添加したチロソールのほぼすべてがヒドロキシチロソールに変換される量が好ましい。大腸菌の場合には、一又は複数の実施形態において、１０－２５ｇ／Ｌ程度が挙げられる。
［反応ｐＨ］
上記培養ｐＨと同様とすることができる。
［反応時間］
反応時間は、一又は複数の実施形態において、流加したチロソールがなくなるまで反応させるのが好ましい。
但し、培養・反応条件は、これらに限定されない。
上記培養温度と同様とすることができる。
［反応培地］
上記培養培地と同様とすることができる。
［反応培地へのチロソール添加量（流加速度）］
チロソール添加量は、菌の種類、菌体量、反応条件に依存して調節する。一又は複数の実施形態において、添加したチロソールが速やかにヒドロキシチロソールに変換されるような速度で、チロソールを流加するのがよい。大腸菌の場合、ＯＤ660が４０程度であれば、５～１００ｍｇ／Ｌ／分、又は、１０～８０ｍｇ／Ｌ／分の速度で添加することが挙げられる。
添加するチロソール総量は、菌の種類によって異なるが、添加したチロソールのほぼすべてがヒドロキシチロソールに変換される量が好ましい。大腸菌の場合には、一又は複数の実施形態において、１０－２５ｇ／Ｌ程度が挙げられる。
［反応ｐＨ］
上記培養ｐＨと同様とすることができる。
［反応時間］
反応時間は、一又は複数の実施形態において、流加したチロソールがなくなるまで反応させるのが好ましい。
但し、培養・反応条件は、これらに限定されない。
【0023】
本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕 チロソールと微生物とを反応させる工程を含み、
前記微生物は、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が発現可能に染色体に組み込まれる改変が加えられた微生物である、
ヒドロキシチロソールの製造方法。
〔２〕 ４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、二成分型ＦＡＤ依存モノオキシゲナーゼである、〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕 ４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、大腸菌のｈｐａＢＣ遺伝子の遺伝子産物又はそのオーソログの遺伝子産物である、〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕 ４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が、大腸菌のｈｐａＢＣ遺伝子又はそのオーソログある、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔５〕 ４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が、配列表の配列番号９及び１０で表される２つの塩基配列を含む遺伝子、又は、配列表の配列番号９及び１０で表される塩基配列の１又は複数個が欠失、置換、及び／又は付加された塩基配列であって４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼとして機能可能なタンパク質をコードする２つの塩基配列を含む遺伝子である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔６〕 前記微生物が、大腸菌である、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔７〕 前記反応が、チロソールの流加培養である、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１〕 チロソールと微生物とを反応させる工程を含み、
前記微生物は、４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が発現可能に染色体に組み込まれる改変が加えられた微生物である、
ヒドロキシチロソールの製造方法。
〔２〕 ４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、二成分型ＦＡＤ依存モノオキシゲナーゼである、〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕 ４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼは、大腸菌のｈｐａＢＣ遺伝子の遺伝子産物又はそのオーソログの遺伝子産物である、〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕 ４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が、大腸菌のｈｐａＢＣ遺伝子又はそのオーソログある、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔５〕 ４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が、配列表の配列番号９及び１０で表される２つの塩基配列を含む遺伝子、又は、配列表の配列番号９及び１０で表される塩基配列の１又は複数個が欠失、置換、及び／又は付加された塩基配列であって４－ヒドロキシフェニルアセテート－３－ヒドロキシラーゼとして機能可能なタンパク質をコードする２つの塩基配列を含む遺伝子である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔６〕 前記微生物が、大腸菌である、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔７〕 前記反応が、チロソールの流加培養である、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の製造方法。
【実施例】
【0024】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
【0025】
１．プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣの作製
大腸菌ＢＬ２１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ｈｐａＢＣ－Ｆ（GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAACCAGAAGATTTCCGC：配列番号１）とｈｐａＢＣ－Ｒ（GTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAATCGCAGCTTCCATTTC：配列番号２）のプライマーセットを用いて、ｈｐａＢＣオペロンをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ酵素にはＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ２ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、添付の説明書に従って反応を行った。ＰＣＲでの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した後、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化したｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴベクター（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）とＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて反応させた。反応液を大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ＧＭｂｉｏｌａｂ社製）と混ぜて氷上で４０分間静置した後、４２℃で４５秒間ヒートショックを行い、再び氷上で２分間静置した後にＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌ ハイポリペプトン、５ｇ／Ｌ粉末酵母エキスＤ３－Ｈ、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）を９００μＬ加えて３７℃で３０分間恒温した。適量の菌液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（ＬＢ液体培地に寒天を２％となるように添加したもの）に塗布し、３７℃で一晩培養した。
培養後のコロニーから目的とするプラスミドを有するものをコロニーダイレクトＰＣＲで選別した。ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に添付の説明書に従って、反応液にＴ７プロモータープライマー（TAATACGACTCACTATAGGG：配列番号３）とＴ７ターミネータープライマー（ATGCTAGTTATTGCTCAGCGG：配列番号４）を規定量添加し、コロニーを鋳型ＤＮＡとして加えてＰＣＲを行った。反応後に１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｈｐａＢＣのインサートが確認されたものを候補菌株とした。
候補菌株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣを得た。
大腸菌ＢＬ２１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ｈｐａＢＣ－Ｆ（GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAACCAGAAGATTTCCGC：配列番号１）とｈｐａＢＣ－Ｒ（GTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAATCGCAGCTTCCATTTC：配列番号２）のプライマーセットを用いて、ｈｐａＢＣオペロンをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ酵素にはＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ２ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、添付の説明書に従って反応を行った。ＰＣＲでの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した後、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化したｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴベクター（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）とＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて反応させた。反応液を大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ＧＭｂｉｏｌａｂ社製）と混ぜて氷上で４０分間静置した後、４２℃で４５秒間ヒートショックを行い、再び氷上で２分間静置した後にＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌ ハイポリペプトン、５ｇ／Ｌ粉末酵母エキスＤ３－Ｈ、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）を９００μＬ加えて３７℃で３０分間恒温した。適量の菌液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（ＬＢ液体培地に寒天を２％となるように添加したもの）に塗布し、３７℃で一晩培養した。
培養後のコロニーから目的とするプラスミドを有するものをコロニーダイレクトＰＣＲで選別した。ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に添付の説明書に従って、反応液にＴ７プロモータープライマー（TAATACGACTCACTATAGGG：配列番号３）とＴ７ターミネータープライマー（ATGCTAGTTATTGCTCAGCGG：配列番号４）を規定量添加し、コロニーを鋳型ＤＮＡとして加えてＰＣＲを行った。反応後に１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｈｐａＢＣのインサートが確認されたものを候補菌株とした。
候補菌株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣを得た。
【0026】
２．プラスミド菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣ株の作製
５ｍＬのＬＢ液体培地を用いて大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株を３７℃で培養し、ＯＤ660の値が０．５程度に達したら氷中で冷却した。１ｍＬの菌液を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨てて菌体を回収した。菌体を９０μＬのＴＳＳ溶液（ＬＢ液体培地にＰＥＧ４０００を１００ｇ／Ｌ、ＤＭＳＯを５％、ＭｇＣｌ2を２０ｍＭとなるように添加）に懸濁した。１０μＬのＫＣＭ溶液（１Ｍ ＫＣｌ、０．３Ｍ ＣａＣｌ2、０．５Ｍ ＭｇＣｌ2）と１μＬのプラスミド溶液を加え、氷上で４０分間静置した。４２℃で９０秒間ヒートショックを行った後、再び氷上で２分間静置し、ＬＢ液体培地９００μＬを加えて３７℃で３０分間恒温した。適量の菌液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。出現したコロニーを再度５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養し、出現したコロニーをＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣとして用いた。
５ｍＬのＬＢ液体培地を用いて大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株を３７℃で培養し、ＯＤ660の値が０．５程度に達したら氷中で冷却した。１ｍＬの菌液を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨てて菌体を回収した。菌体を９０μＬのＴＳＳ溶液（ＬＢ液体培地にＰＥＧ４０００を１００ｇ／Ｌ、ＤＭＳＯを５％、ＭｇＣｌ2を２０ｍＭとなるように添加）に懸濁した。１０μＬのＫＣＭ溶液（１Ｍ ＫＣｌ、０．３Ｍ ＣａＣｌ2、０．５Ｍ ＭｇＣｌ2）と１μＬのプラスミド溶液を加え、氷上で４０分間静置した。４２℃で９０秒間ヒートショックを行った後、再び氷上で２分間静置し、ＬＢ液体培地９００μＬを加えて３７℃で３０分間恒温した。適量の菌液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。出現したコロニーを再度５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養し、出現したコロニーをＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣとして用いた。
【0027】
３．染色体導入菌株（A株）の作製
ｈｐａＢＣ遺伝子の大腸菌染色体への導入は既報（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）により行った。はじめに染色体へ導入するためのＤＮＡ断片を含む溶液の調製をおこなった。ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣを鋳型ＤＮＡとして、ｄｅｌｔａ－ｐｆｌＢＡ－Ｆ（CGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACATGATTCCGGGGATCCGTCGACC：配列番号５）とｄｅｌｔａ－ｐｆｌＢＡ－ＦＲＴ－Ｒ（CTCAATAAAGTTGCCGCTTTACGGGGAAATTAGAACATTACCTTATGACCATTCGCCAATCCGGATATAG：配列番号６）のプライマーセットを用いて、２つのフリパーゼ認識配列（ＦＲＴ）とカナマイシン耐性遺伝子配列（Ｋｍ）を含むｈｐａＢＣ遺伝子（ＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－ＰT7－ｈｐａＢＣ－ＴT7）をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ酵素にはＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ（タカラバイオ社製）を用い、添付の説明書に従って反応を行った。ＰＣＲでの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した後、制限酵素ＤｐｎＩで一晩消化し、再度、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製したものを染色体導入用のＤＮＡ溶液とした。つぎに、大腸菌のエレクトロポレーションセルの調製を行った。大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＫＤ４６株を１０ｍＭのＬ－アラビノースと１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ液体培地にて、ＯＤ660が０．５程度に達するまで３０℃で培養した。次に、２ｍＬの菌液を５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水１ｍＬに懸濁し、５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。再度、菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水１ｍＬに懸濁し、５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水５０μＬに懸濁してエレクトロポレーションセルとした。つぎに、エレクトロポレーションセルにＤＮＡ断片を１００－２００ｎｇ（１μＬ程度）添加し、溶液をエレクトロポレーションキュベットに移し、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションキュベットに１ｍＬのＬＢ液体培地を加えた後、菌懸濁液を１．５ｍＬチューブに移し、３７℃で２時間程度振とうした。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。出現したコロニーから、ｐｆｌＢＡ座位にｈｐａＢＣ遺伝子を持つ大腸菌をコロニーダイレクトＰＣＲで選別した。ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に添付の説明書に従って、反応液にＫ２（CGGTGCCCTGAATGAACTGC：配列番号７）とＤｏｗｎ－ｐｆｌＢＡ（CGTTATTCTCCAGAGGTTCATCAGC：配列番号８）のプライマーセットを添加し、コロニーを鋳型ＤＮＡとして加えてＰＣＲを行った。反応後に１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｐｆｌＢＡ座位にｈｐａＢＣ遺伝子が挿入された菌株（A株）を確認した。
ｈｐａＢＣ遺伝子の大腸菌染色体への導入は既報（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）により行った。はじめに染色体へ導入するためのＤＮＡ断片を含む溶液の調製をおこなった。ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣを鋳型ＤＮＡとして、ｄｅｌｔａ－ｐｆｌＢＡ－Ｆ（CGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACATGATTCCGGGGATCCGTCGACC：配列番号５）とｄｅｌｔａ－ｐｆｌＢＡ－ＦＲＴ－Ｒ（CTCAATAAAGTTGCCGCTTTACGGGGAAATTAGAACATTACCTTATGACCATTCGCCAATCCGGATATAG：配列番号６）のプライマーセットを用いて、２つのフリパーゼ認識配列（ＦＲＴ）とカナマイシン耐性遺伝子配列（Ｋｍ）を含むｈｐａＢＣ遺伝子（ＦＲＴ－Ｋｍ－ＦＲＴ－ＰT7－ｈｐａＢＣ－ＴT7）をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ酵素にはＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ（タカラバイオ社製）を用い、添付の説明書に従って反応を行った。ＰＣＲでの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した後、制限酵素ＤｐｎＩで一晩消化し、再度、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製したものを染色体導入用のＤＮＡ溶液とした。つぎに、大腸菌のエレクトロポレーションセルの調製を行った。大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＫＤ４６株を１０ｍＭのＬ－アラビノースと１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ液体培地にて、ＯＤ660が０．５程度に達するまで３０℃で培養した。次に、２ｍＬの菌液を５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水１ｍＬに懸濁し、５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。再度、菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水１ｍＬに懸濁し、５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を捨て、菌体を回収した。菌体を氷冷しておいた滅菌蒸留水５０μＬに懸濁してエレクトロポレーションセルとした。つぎに、エレクトロポレーションセルにＤＮＡ断片を１００－２００ｎｇ（１μＬ程度）添加し、溶液をエレクトロポレーションキュベットに移し、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションキュベットに１ｍＬのＬＢ液体培地を加えた後、菌懸濁液を１．５ｍＬチューブに移し、３７℃で２時間程度振とうした。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。出現したコロニーから、ｐｆｌＢＡ座位にｈｐａＢＣ遺伝子を持つ大腸菌をコロニーダイレクトＰＣＲで選別した。ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）に添付の説明書に従って、反応液にＫ２（CGGTGCCCTGAATGAACTGC：配列番号７）とＤｏｗｎ－ｐｆｌＢＡ（CGTTATTCTCCAGAGGTTCATCAGC：配列番号８）のプライマーセットを添加し、コロニーを鋳型ＤＮＡとして加えてＰＣＲを行った。反応後に１％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ｐｆｌＢＡ座位にｈｐａＢＣ遺伝子が挿入された菌株（A株）を確認した。
【0028】
４．チロソール流加培養
ＬＢ液体培地にＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣ又はA株を植菌し、３０℃で一晩培養した。培養液を１．５ＬのＨＣＦ培地を含む３Ｌ容のジャーファメンターに１％植菌して培養を開始した。なお、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣ株を培養する場合には、ＬＢ液体培地およびＨＣＦ培地に５０μｇ／ｍＬとなるようにカナマイシンを添加した。
ジャーファメンターには、丸菱バイオエンジニアリング社製のＢｉｏｎｅｅｒシリーズＭＤＬ－８Ｃを用いた。
ＨＣＦ培地の組成は、１２６８ｍＬの蒸留水に、１５０ｍＬの１０×リン酸／クエン酸緩衝液、３．６ｍＬの５０％硫酸マグネシウム７水和物水溶液、１５ｍＬの１００×微量金属溶液、６３．４ｍＬの７０％グルコース溶液、３４０μＬの２％チアミン塩酸塩溶液を加えたものである。
蒸留水と１０×リン酸／クエン酸緩衝液をジャーファメンターのベッセルに入れてオートクレーブ滅菌しておき、滅菌後の溶液が室温に戻った後に、別でオートクレーブ滅菌しておいた硫酸マグネシウム溶液とグルコース溶液、そしてろ過除菌しておいたチアミン塩酸塩溶液と微量金属溶液を加えた。
１０×リン酸／クエン酸緩衝液の組成は、１３３ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、４０ｇ／Ｌリン酸水素２アンモニウム、１７ｇ／Ｌクエン酸であり、５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを６．３に調整した。１００×微量金属溶液の組成は、１０ｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、０．２５ｇ／Ｌ塩化コバルト６水和物、１．５ｇ／Ｌ塩化マンガン４水和物、０．１５ｇ／Ｌ塩化銅２水和物、０．３ｇ／Ｌホウ酸、０．２５ｇ／Ｌモリブデン酸ナトリウム２水和物、１．３ｇ／Ｌ酢酸亜鉛２水和物、０．８４ｇ／Ｌエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物である。
培養は３０℃で行い、通気量は３Ｌ／分とし、溶存酸素量の値が３０％となるように回転数を自動調整した。ｐＨは最初６．８で制御し、チロソールの流加培養開始後は６．５で制御した。ｐＨの制御には２８％のアンモニア水を用いた。
培養開始後、菌株のＯＤ660の値が１５～２０に達した時にイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭとなるように添加し、さらに３～４時間培養を続けた後にチロソール溶液（１００ｇ／Ｌ）を０．４ｍＬ／分の速度で３００ｍＬ流加した。途中グルコースが枯渇した場合、又は枯渇しそうな場合には、グルコース濃度が１０ｇ／Ｌ程度になるようにフィード溶液を適時添加した。
フィード溶液は、１８６ｍＬの蒸留水に２８０ｇのグルコースを加えてオートクレーブ滅菌し、溶液が室温程度に冷えた後に別滅菌しておいた５０％硫酸マグネシウム７水和物水溶液を１６ｍＬ、ろ過除菌しておいた１００×微量金属溶液を４ｍＬ、ろ過除菌しておいた２％チアミン塩酸塩溶液を９００μＬ加えることで調製した。
反応液は適時サンプリングし、分光光度計によるＯＤ660の値の測定、ＨＰＬＣによるチロソール及びヒドロキシチロソールの定量を行った。
ＨＰＬＣによる定量は既報（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）にある芳香族化合物の定量方法を用い、検量線の作製にはヒドロキシチロソール及びチロソールの標品（東京化成工業株式会社製）を用いた。
ＬＢ液体培地にＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣ又はA株を植菌し、３０℃で一晩培養した。培養液を１．５ＬのＨＣＦ培地を含む３Ｌ容のジャーファメンターに１％植菌して培養を開始した。なお、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣ株を培養する場合には、ＬＢ液体培地およびＨＣＦ培地に５０μｇ／ｍＬとなるようにカナマイシンを添加した。
ジャーファメンターには、丸菱バイオエンジニアリング社製のＢｉｏｎｅｅｒシリーズＭＤＬ－８Ｃを用いた。
ＨＣＦ培地の組成は、１２６８ｍＬの蒸留水に、１５０ｍＬの１０×リン酸／クエン酸緩衝液、３．６ｍＬの５０％硫酸マグネシウム７水和物水溶液、１５ｍＬの１００×微量金属溶液、６３．４ｍＬの７０％グルコース溶液、３４０μＬの２％チアミン塩酸塩溶液を加えたものである。
蒸留水と１０×リン酸／クエン酸緩衝液をジャーファメンターのベッセルに入れてオートクレーブ滅菌しておき、滅菌後の溶液が室温に戻った後に、別でオートクレーブ滅菌しておいた硫酸マグネシウム溶液とグルコース溶液、そしてろ過除菌しておいたチアミン塩酸塩溶液と微量金属溶液を加えた。
１０×リン酸／クエン酸緩衝液の組成は、１３３ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、４０ｇ／Ｌリン酸水素２アンモニウム、１７ｇ／Ｌクエン酸であり、５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを６．３に調整した。１００×微量金属溶液の組成は、１０ｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、０．２５ｇ／Ｌ塩化コバルト６水和物、１．５ｇ／Ｌ塩化マンガン４水和物、０．１５ｇ／Ｌ塩化銅２水和物、０．３ｇ／Ｌホウ酸、０．２５ｇ／Ｌモリブデン酸ナトリウム２水和物、１．３ｇ／Ｌ酢酸亜鉛２水和物、０．８４ｇ／Ｌエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物である。
培養は３０℃で行い、通気量は３Ｌ／分とし、溶存酸素量の値が３０％となるように回転数を自動調整した。ｐＨは最初６．８で制御し、チロソールの流加培養開始後は６．５で制御した。ｐＨの制御には２８％のアンモニア水を用いた。
培養開始後、菌株のＯＤ660の値が１５～２０に達した時にイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭとなるように添加し、さらに３～４時間培養を続けた後にチロソール溶液（１００ｇ／Ｌ）を０．４ｍＬ／分の速度で３００ｍＬ流加した。途中グルコースが枯渇した場合、又は枯渇しそうな場合には、グルコース濃度が１０ｇ／Ｌ程度になるようにフィード溶液を適時添加した。
フィード溶液は、１８６ｍＬの蒸留水に２８０ｇのグルコースを加えてオートクレーブ滅菌し、溶液が室温程度に冷えた後に別滅菌しておいた５０％硫酸マグネシウム７水和物水溶液を１６ｍＬ、ろ過除菌しておいた１００×微量金属溶液を４ｍＬ、ろ過除菌しておいた２％チアミン塩酸塩溶液を９００μＬ加えることで調製した。
反応液は適時サンプリングし、分光光度計によるＯＤ660の値の測定、ＨＰＬＣによるチロソール及びヒドロキシチロソールの定量を行った。
ＨＰＬＣによる定量は既報（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：８１５－８２９）にある芳香族化合物の定量方法を用い、検量線の作製にはヒドロキシチロソール及びチロソールの標品（東京化成工業株式会社製）を用いた。
【0029】
５．結果
ｈｐａＢＣ遺伝子が大腸菌染色体へ導入されたＡ株のチロソール流加培養によるヒドロキシチロソールの製造の結果を図１に示す。
ｈｐａＢＣ遺伝子をプラスミドで保持する大腸菌：ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣ株のチロソール流加培養によるヒドロキシチロソールの製造の結果を図２に示す。
図１及び２の横軸は、ジャーファメンターで培養を開始してからの時間（ｈ）である。縦軸左は、吸光度（ＯＤ660）であり、縦軸右は、チロソール（Ｔｙｒｏｓｏｌ）及びヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）の濃度（ｇ／Ｌ）である。
ｈｐａＢＣ遺伝子が大腸菌染色体へ導入されたＡ株とｈｐａＢＣ遺伝子をプラスミドで保持する大腸菌は、共に、同じプロモーター（Ｔ７プロモーター）から発現誘導されるにもかかわらず、ヒドロキシチロソールの生産に関し顕著な差があった（図１及び図２）。
ｈｐａＢＣ遺伝子が大腸菌染色体へ導入されたＡ株は、添加したチロソールが残存しないほど効率よくチロソールをヒドロキシチロソールに変換した（図１）。一方、ｈｐａＢＣ遺伝子をプラスミドで保持する大腸菌は、チロソールが残存した（図２）。
そして、ｈｐａＢＣ遺伝子が大腸菌染色体へ導入されたＡ株は、ｈｐａＢＣ遺伝子をプラスミドで保持する大腸菌よりも、２倍のヒドロキシチロソールの生産量を示した（図１及び２）。
生菌を用いたヒドロキシチロソールの製造方法では、病原菌である緑膿菌を用いて、チロソールから５．８ｇ／Ｌの濃度で生産されたのがこれまでの最高値であった（非特許文献１）。また、非病原菌(大腸菌）では、非常に高価な原料であるＬ－ＤＯＰＡを利用しても５．６ｇ／Ｌのヒドロキシチロソールしかできていなかった（非特許文献２）。
これらに対し、本実施例では、図１に示すように、１６ｇ／Ｌという格別顕著な生産性を示すことができた。
ｈｐａＢＣ遺伝子が大腸菌染色体へ導入されたＡ株のチロソール流加培養によるヒドロキシチロソールの製造の結果を図１に示す。
ｈｐａＢＣ遺伝子をプラスミドで保持する大腸菌：ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ－ＦＲＴ－ｈｐａＢＣ株のチロソール流加培養によるヒドロキシチロソールの製造の結果を図２に示す。
図１及び２の横軸は、ジャーファメンターで培養を開始してからの時間（ｈ）である。縦軸左は、吸光度（ＯＤ660）であり、縦軸右は、チロソール（Ｔｙｒｏｓｏｌ）及びヒドロキシチロソール（ＨＴＹ）の濃度（ｇ／Ｌ）である。
ｈｐａＢＣ遺伝子が大腸菌染色体へ導入されたＡ株とｈｐａＢＣ遺伝子をプラスミドで保持する大腸菌は、共に、同じプロモーター（Ｔ７プロモーター）から発現誘導されるにもかかわらず、ヒドロキシチロソールの生産に関し顕著な差があった（図１及び図２）。
ｈｐａＢＣ遺伝子が大腸菌染色体へ導入されたＡ株は、添加したチロソールが残存しないほど効率よくチロソールをヒドロキシチロソールに変換した（図１）。一方、ｈｐａＢＣ遺伝子をプラスミドで保持する大腸菌は、チロソールが残存した（図２）。
そして、ｈｐａＢＣ遺伝子が大腸菌染色体へ導入されたＡ株は、ｈｐａＢＣ遺伝子をプラスミドで保持する大腸菌よりも、２倍のヒドロキシチロソールの生産量を示した（図１及び２）。
生菌を用いたヒドロキシチロソールの製造方法では、病原菌である緑膿菌を用いて、チロソールから５．８ｇ／Ｌの濃度で生産されたのがこれまでの最高値であった（非特許文献１）。また、非病原菌(大腸菌）では、非常に高価な原料であるＬ－ＤＯＰＡを利用しても５．６ｇ／Ｌのヒドロキシチロソールしかできていなかった（非特許文献２）。
これらに対し、本実施例では、図１に示すように、１６ｇ／Ｌという格別顕著な生産性を示すことができた。
【図1】
【図2】
【配列表】