特許 7608351 混合原料を利用する微生物細胞による炭水化物の発酵生産

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-20

(45)【発行日】2025-01-06

(54)【発明の名称】混合原料を利用する微生物細胞による炭水化物の発酵生産

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/00 20060101AFI20241223BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241223BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20241223BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20241223BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20241223BHJP

【ＦＩ】

C12P19/00 ZNA

C12N1/21

C12N15/54

C12N15/52 Z

C12N15/31

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2021551782

(86)(22)【出願日】2020-02-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-18

(86)【国際出願番号】 EP2020055299

(87)【国際公開番号】W WO2020178178

(87)【国際公開日】2020-09-10

【審査請求日】2023-02-27

(31)【優先権主張番号】19160379.4

(32)【優先日】2019-03-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】511149751

【氏名又は名称】クリスチャン．ハンセン・ハー・エム・オー・ゲー・エム・ベー・ハー

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】イェネバイン，シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】ワルテンベルク，ディルク

【審査官】松井 一泰

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５０９３４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５３５９６２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００－ ４１／００

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２’－フコシルラクトースを発酵生産する方法であって、
ａ）２’－フコシルラクトースを産生する遺伝子組換えエシェリキア・コリを提供すること、ここで、前記Ｅ．コリは、野生型細胞と比較して、少なくとも１つの糖リン酸の向上した細胞内の量を生じるための増大した能力を有し、前記Ｅ．コリは、遺伝子型ｐｆｋＡ ^－ 、ｌａｃＺ ^－ 、ｆｕｃＩＫ ^－ 、ｗｃａＪ ^－ 、ｇｌｋ ^－ 、ｇｃｄ ^－ 、ｐｔｓＧ ^－ を示し、ＧＤＰ－フコースのデノボ合成のための酵素ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、及びＷｃａＧ、Ｅ．コリ：Ｏ１２６由来の２’－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｗｂｇＬ、エルシニア・ベルコビエリＡＴＣＣ４３９７０由来の糖流出トランスポーター遺伝子ｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０、ザイモモナス・モビリス由来のグルコース促進遺伝子ｇｌｆ、パスツレラ・ムルトシダ由来のβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ｇａｌＴｐｍ１１４１、並びにＵＤＰ－グルコース４－エピメラーゼをコードするＥ．コリ遺伝子ｇａｌ及びホスホグルコムターゼをコードするＥ．コリ遺伝子ｐｇｍを過剰発現する、
ｂ）前記２’－フコシルラクトースの産生を可能にする培養培地中で前記遺伝子組換えＥ．コリを培養すること、ここで、主な炭素源は、スクロースの加水分解から得られるグルコース及びフルクトースからなる単糖混合物である、及び
ｃ）前記２’－フコシルラクトースを回収すること
を含む、方法。

【請求項2】

２’－フコシルラクトースを産生する遺伝子組換えＥ．コリであって、前記Ｅ．コリは、野生型細胞と比較して、少なくとも１つの糖リン酸の向上した細胞内の量を生じるための増大した能力を有し、前記Ｅ．コリは、遺伝子型ｐｆｋＡ ^－ 、ｌａｃＺ ^－ 、ｆｕｃＩＫ ^－ 、ｗｃａＪ ^－ 、ｇｌｋ ^－ 、ｇｃｄ ^－ 、ｐｔｓＧ ^－ を示し、ＧＤＰ－フコースのデノボ合成のための酵素ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、及びＷｃａＧ、Ｅ．コリ：Ｏ１２６由来の２’－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｗｂｇＬ、エルシニア・ベルコビエリＡＴＣＣ４３９７０由来の糖流出トランスポーター遺伝子ｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０、ザイモモナス・モビリス由来のグルコース促進遺伝子ｇｌｆ、パスツレラ・ムルトシダ由来のβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ｇａｌＴｐｍ１１４１、並びにＵＤＰ－グルコース４－エピメラーゼコードするＥ．コリ遺伝子ｇａｌ及びホスホグルコムターゼをコードするＥ．コリ遺伝子ｐｇｍを過剰発現する、遺伝子組換えＥ．コリ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は目的の糖類の発酵生産に関する。目的の糖類を可能にする微生物細胞が開示されており、前記微生物細胞は発酵の間、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料を利用する。前記微生物細胞を利用することによって目的の糖類を生産するための方法もまた、開示される。

【背景技術】

【0002】

ヒト母乳は、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラル及び微量元素の複合混合物を含む。ヒト母乳の最も主要な画分は炭水化物からなる。ヒト母乳内の炭水化物画分は、（ｉ）ラクトース及び（ｉｉ）オリゴ糖（ヒト母乳オリゴ糖、ＨＭＯ）にさらに分けられ得る。二糖ラクトース（ガラクトース－β１，４－グルコース）が嬰児によってエネルギー源として使用されるのに対して、オリゴ糖は乳児によって代謝されない。

【0003】

オリゴ糖の画分は、最大で炭水化物画分全体の１０分の１を占め、おそらく１５０種を超える構造的に異なるオリゴ糖からなる。これらの複合オリゴ糖の発生及び濃度はヒトに特異的であるため、酪農動物を含む他の哺乳動物の乳に大量に見ることはできない。

【0004】

最も顕著なヒト母乳オリゴ糖は、最大でＨＭＯ画分全体の１／３を一緒に構成し得る２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）及び３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）である。さらなる顕著なＨＭＯは、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）である。これらの中性オリゴ糖以外に、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース、シアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオースなどの酸性ＨＭＯもまた、ヒト母乳に見ることができる。

【0005】

特に、ＨＭＯの大部分は、それらの還元末端にガラクトース－β１，４－グルコース部分を含み、この還元末端は、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び／又はフコース及び／又はガラクトース及び／又はＮ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）などの単糖部分の付加によって伸長される。ＨＭＯの構造は、上皮細胞表面複合糖質のエピトープである、ルイスｘ（ＬｅＸ）などのルイス式血液型抗原と密接に関連している。上皮エピトープに対するＨＭＯの構造類似性は細菌病原体に対するＨＭＯの保護特性を説明する。

【0006】

ヒト母乳中のオリゴ糖の存在は長い間知られており、これらのオリゴ糖の生理的機能は数十年にわたって医学研究の対象であった。より豊富なヒト母乳オリゴ糖の一部については、特定の機能が既に同定されている。

【0007】

本明細書以前に示されるような腸管における局所的作用を引き起こすことに加えて、ＨＭＯはまた、乳児の体循環に入ることにより乳児における全身作用を誘発することが示されている。また、タンパク質－炭水化物相互作用、例えばセレクチン－白血球結合に対するＨＭＯの影響により、免疫反応をモジュレートすることができ、炎症反応を低減させることができる。さらに、ＨＭＯは、乳児の微生物叢の発達のための重要な基質を表すことがますます認識されるようになってきている。

【0008】

一般的に種々の炭水化物、特にプレバイオティックオリゴ糖の十分に研究された有益な特性に起因するが、天然源からのそれらの限定されたアベイラビリティのために、単糖（例えばＬ－フコース、Ｎ－アセチルノイラミン酸）、二糖（例えばラクト－Ｎ－ビオース）及びオリゴ糖（例えば２’－ＦＬ、ＬＮｎＴ）についての効果的かつコスト効率の良い生産プロセスが非常に望ましい。

【0009】

機能的炭水化物の大規模生産を試みようとして、これらの炭水化物の一部に対する化学的経路が開発された。しかし、このような方法は、最終製品を汚染するリスクを負わせる、いくつかの有害化学物質の使用を含む。少なくとも食品用途におけるそれらの使用に十分である機能的炭水化物の大規模な量及び質は、今日まで化学合成によって提供することができない。

【0010】

ヒト母乳オリゴ糖の化学合成に関連する欠点を回避するために、それらの生産のためのいくつかの酵素的方法及び発酵アプローチが開発された。Ｌ－フコース、Ｎ－アセチルノイラミン酸、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、３’－シアリル－ラクトース及び６’－シアリルラクトースなどの、いくつかの炭水化物についての発酵生産プロセスが開発されている。これらの生産プロセスは典型的に、組換えエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの遺伝子操作された細菌細胞を使用する。

【0011】

通常、ＨＭＯを生産するための発酵生産プロセス及び生体触媒反応は、ＨＭＯを生産するための開始アクセプター基質として外部から加えられたラクトースに基づく。１つ以上の単糖がこれらのプロセスにおいてラクトースに加えられる（米国特許第７，５２１，２１２ Ｂ１号明細書；Ａｌｂｅｒｍａｎｎら、（２００１年）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３４（２）９７～１０３頁）。ラクトースへの単糖の添加は、適切な活性化された単糖基質を使用してグリコシルトランスフェラーゼ又はグリコシダーゼのいずれかによって触媒され得る。さらに、さらなる単糖がトランスグリコシダーゼ反応によってラクトースに添加されてもよい。

【0012】

特に、ＨＭＯの発酵生産は効果的であることが証明された。なぜなら、合成することが困難であるが、必要とされるヌクレオチドにより活性化された単糖は、利用される微生物細胞の代謝によって提供されるからである。ヌクレオチドにより活性化された単糖についての生合成経路は通常、グルコース－６－リン酸又はフルクトース－６－リン酸のレベルでの宿主細胞の一次代謝に由来する。ＵＤＰ－ガラクトース（ＵＤＰ－Ｇａｌ）についての生合成経路はグルコース－６－リン酸に由来するのに対して、ＧＤＰ－フコース、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン及びＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸の生合成はフルクトース－６－リン酸に由来する。

【0013】

微生物宿主細胞におけるヌクレオチドにより活性化された単糖の効果的な生合成、及びその結果としての発酵プロセスによる所望の炭水化物の生産は、グルコース－６－リン酸及び／又はフルクトース－６－リン酸などの糖リン酸の連続供給に明らかに依存する。

【0014】

通常、微生物宿主細胞による単純かつ安価な炭素及びエネルギー源（例えばグリセロール、グルコース、スクロース）の消費に基づく、前記発酵プロセスにおける主な問題は、前記宿主細胞におけるこのようなリン酸化／活性化糖類の限られたアベイラビリティ（例えば競合反応に起因する）であり、生産物生合成経路の炭素フラックスを大幅に損ない、それによりこれらのプロセスの生産性を大幅に損なう。

【0015】

上述の欠点を克服するために、ＨＭＯを生産するための改善された手段及び方法が開発された。例えば、国際公開第２０１２／００７４８１ Ａ２号は、糖類、活性化された糖類、ヌクレオシド、グリコシド、糖脂質及び糖タンパク質を生産することができる操作された生物を開示しており、前記操作された生物は、前記生物が、二糖、オリゴ糖、多糖又はそれらの混合物を、活性化糖類及び糖類に分割することができるように、ｉ）炭水化物キナーゼをコードする遺伝子と組み合わせて炭水化物ヒドロラーゼをコードする遺伝子、ｉｉ）炭水化物シンターゼをコードする遺伝子、又はｉｉｉ）炭水化物ホスホリラーゼをコードする遺伝子を発現し、前記生物は、前記の導入遺伝子のいずれか以外の少なくとも１つの他の遺伝子がほとんど機能しなくなる又は全く機能しなくなるように、さらに遺伝子修飾され、前記他の遺伝子は、前記活性化糖類をバイオマス及び／又は生体触媒酵素に変換する酵素をコードする。前記操作された生物は、スクロース、オリゴ糖、多糖又はそれらの混合物などの二糖を利用しながら所望の炭水化物を生成することができる。

【0016】

しかし、唯一の炭素及びエネルギー源としてスクロースを使用して前記操作された生物によって所望の化合物を生産することは、スクロースを滅菌することが困難であるという大きな欠点を有する。滅菌するための最も望ましい方法は加熱滅菌である。しかし、スクロースの加熱滅菌は、国際公開第２０１２／００７４８１ Ａ２号に記載されている方法の適用性に対抗するかなりの程度の加水分解を生じる。

【0017】

加熱滅菌の代替として、スクロース溶液の滅菌濾過が利用され得るが、滅菌濾過は、特に工業規模の発酵において、望ましくない細菌細胞の成長をもたらす汚染の高いリスクを有する。

【0018】

それにもかかわらず、スクロースは、そのアベイラビリティ及び低コストに起因して生物工学的応用のための最も魅力的な炭素源に相当する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0019】

【文献】米国特許第７，５２１，２１２号明細書

【文献】国際公開第２０１２／００７４８１号

【非特許文献】

【0020】

【文献】Ａｌｂｅｒｍａｎｎら、（２００１年） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３４（２）９７～１０３頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0021】

それ故、主な炭素及びエネルギー源として安価な原料の存在下で培養した場合、所望の炭水化物を生産することができる所望の炭水化物の発酵生産のための微生物細胞であって、前記原料は、細胞の代謝によって利用可能であるために微生物細胞によって加水分解される必要がない、微生物細胞、及び主な炭素及びエネルギー源としての前記原料の存在下で前記微生物細胞を培養することによる発酵によって目的の炭水化物を生産するための方法を提供することが望ましい。

【0022】

この目的は、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料で培養した場合、所望の炭水化物を生産することができる、遺伝子操作された微生物細胞であって、前記混合単糖原料は、グルコースとフルクトース及びガラクトースからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる単糖とからなり、微生物細胞は、少なくとも１種の糖リン酸の増大した細胞内アベイラビリティを有する、遺伝子操作された微生物細胞を提供することで解決され、並びに目的の炭水化物を発酵生産するための方法であって、主な炭素及びエネルギー源としての前記混合単糖原料の存在下で前記遺伝子操作された微生物細胞を培養するステップを含む、方法を提供することによって解決される。

【課題を解決するための手段】

【0023】

（要旨）
第１の態様によれば、目的の炭水化物を生産するための遺伝子操作された微生物細胞であって、前記微生物細胞は、少なくとも１種の糖リン酸の増大した細胞内アベイラビリティを有し、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料の存在下で培養される場合、目的の炭水化物を生産することができ、前記混合単糖原料は、グルコースとフルクトース及びガラクトースからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる単糖とからなる、遺伝子操作された微生物細胞が提供される。

【0024】

第２の態様によれば、目的の炭水化物を生産するための本明細書に記載される遺伝子操作された微生物細胞の使用であって、前記微生物細胞は、グルコースとフルクトース及びガラクトースの群からの少なくとも１種のさらなる単糖とからなる単糖混合物の存在下で培養される、使用が提供される。

【0025】

第３の態様によれば、目的の炭水化物を発酵生産するための方法であって、
ａ）目的の炭水化物を生産することができる遺伝子操作された微生物細胞を提供するステップであって、前記微生物細胞は、少なくとも１種の糖リン酸の増大した細胞内アベイラビリティを有する、ステップ、
ｂ）目的の前記炭水化物の生産を可能にする培養培地中で前記遺伝子操作された微生物細胞を培養するステップであって、培養培地は主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料を含み、前記混合単糖原料は、グルコースとフルクトース及びガラクトースからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる単糖とからなる、ステップ、並びに
ｃ）目的の前記炭水化物を回収するステップ
を含む、方法が提供される。

【0026】

第４の態様では、医薬組成物及び／又は栄養組成物を製造するための、本明細書に記載される遺伝子操作された微生物細胞及び／又は方法によって生産されている目的の炭水化物の使用が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】糖リン酸のフルクトース－１－リン酸及びグルコース－６－リン酸に通じ、それらが起源になる、天然に存在する代謝経路を示す、例示的な野生型微生物細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））の概略図を示す図である。

【図2】本発明の例示的な遺伝子修飾された微生物細胞の概略図を示す図であり、細胞内グルコース－６－リン酸のアベイラビリティの増大をもたらす遺伝子修飾を示す。

【図3】本発明の遺伝子操作された微生物細胞の別の例示的な実施形態の概略図を示す図であり、細胞内グルコース－６－リン酸のアベイラビリティの増大をもたらす遺伝子修飾を示す。

【図4】本発明の遺伝子操作された微生物細胞の別の例示的な実施形態の概略図を示す図であり、細胞内グルコース－６－リン酸のアベイラビリティの増大をもたらす遺伝子修飾を示す。

【図5】本発明の遺伝子操作された微生物細胞の別の例示的な実施形態の概略図を示す図であり、細胞内グルコース－６－リン酸のアベイラビリティの増大及び細胞内フルクトース－６－リン酸のアベイラビリティの増大をもたらす遺伝子修飾を示す。

【図6】本発明の遺伝子操作された微生物細胞の別の例示的な実施形態の概略図を示す図であり、細胞内グルコース－６－リン酸のアベイラビリティの増大及び細胞内フルクトース－６－リン酸のアベイラビリティの増大をもたらす遺伝子修飾を示す。

【図7】本発明の遺伝子操作された微生物細胞の別の例示的な実施形態の概略図を示す図であり、細胞内グルコース－６－リン酸のアベイラビリティの増大及び細胞内フルクトース－６－リン酸のアベイラビリティの増大をもたらす遺伝子修飾を示す。

【図8】本発明の遺伝子操作された微生物細胞の別の例示的な実施形態の概略図を示す図であり、細胞内グルコース－６－リン酸のアベイラビリティの増大及び細胞内フルクトース－６－リン酸のアベイラビリティの増大をもたらす遺伝子修飾を示す。

【図9】本発明の遺伝子操作された微生物細胞の別の例示的な実施形態の概略図を示す図であり、細胞内グルコース－６－リン酸のアベイラビリティの増大及び細胞内フルクトース－６－リン酸のアベイラビリティの増大をもたらす遺伝子修飾を示す。

【図10】本発明の遺伝子操作された微生物細胞の別の例示的な実施形態の概略図を示す図であり、グルコース、グルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸の増大した細胞内アベイラビリティをもたらす遺伝子修飾を示す。

【図11】本発明の遺伝子操作された微生物細胞の別の例示的な実施形態の概略図を示す図であり、マンノース及び／又はマンノース－６－リン酸の増大した細胞内アベイラビリティをもたらす遺伝子修飾を示す。

【図12】本発明の遺伝子操作された微生物細胞の別の例示的な実施形態の概略図を示す図であり、ガラクトース－１－リン酸及びフルクトース－６－リン酸の増大した細胞内アベイラビリティをもたらす遺伝子修飾を示す。

【図13】唯一の炭素及びエネルギー源としてのグルコース（Ａ）又はグルコース及びフルクトースからなる混合単糖原料（Ｂ）での培養の間のＥ．コリ株の成長特性を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0028】

第１の態様によれば、目的の炭水化物を生産することができる遺伝子操作された微生物細胞が提供される。追加の実施形態では、目的の炭水化物は遺伝子操作された微生物細胞の野生型祖先において天然に存在しない炭水化物である。

【0029】

微生物細胞は、対応する野生型細胞における前記少なくとも１種の糖リン酸の細胞内アベイラビリティと比較して少なくとも１種の糖リン酸の増大した細胞内アベイラビリティを有する。遺伝子操作された微生物細胞は、目的の前記炭水化物を生産することができ、微生物細胞のための主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料を含む培養培地中で培養される場合、目的の前記炭水化物を生産し、混合単糖原料は、グルコースとフルクトース及びガラクトースからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる単糖とからなる。

【0030】

遺伝子操作された微生物細胞は、遺伝子操作されていることに起因して目的の炭水化物を生産することができる。それ故、遺伝子操作された微生物細胞は１つ以上の異種遺伝子を発現し、前記異種遺伝子によってコードされるポリペプチドの活性により、微生物細胞は目的の炭水化物を合成することができる。

【0031】

本明細書で使用される場合、「機能的遺伝子」という用語は、タンパク質又はポリペプチドをコードし、タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が前記機能的遺伝子を有する微生物細胞において／によって発現され得るように、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列も含有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。したがって、機能的遺伝子の発現を可能にする条件で培養した場合、前記機能的遺伝子が発現され、前記機能的遺伝子を発現する微生物細胞は典型的に、機能的遺伝子のタンパク質コード領域によってコードされるタンパク質又はポリペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかでデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指し、他に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に核酸とハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。他に示されない限り、特定の核酸配列はその相補的配列を含む。

【0032】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列又は転写因子結合部位のアレイなど）と第２の核酸配列との間の機能的連結を意味するものとし、発現制御配列は第２の配列に対応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。したがって、「プロモーター」という用語は、通常、ＤＮＡポリマーにおいて遺伝子に「先行し」、ｍＲＮＡへの転写の開始のための部位を提供するＤＮＡ配列を指す。また、「調節」ＤＮＡ配列も、通常、所与のＤＮＡポリマーにおいて遺伝子の「上流」にあり（すなわち先行し）、転写開始の頻度（又は速度）を決定するタンパク質に結合する。「プロモーター／調節」又は「制御」ＤＮＡ配列と総称される、機能的ＤＮＡポリマーにおいて選択された遺伝子（又は一連の遺伝子）に先行するこれらの配列は、協同して遺伝子の転写（及び最終的な発現）が起こるか否かを決定する。ＤＮＡポリマーにおいて遺伝子に「続き」、ｍＲＮＡへの転写の終結のためにシグナルをもたらすＤＮＡ配列は、転写「終結」配列と称される。

【0033】

細菌宿主細胞に関して本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、細菌細胞が異種核酸を複製する、又は異種核酸（すなわち、「前記細胞にとって外来性の」配列）によってコードされるペプチド若しくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態内に見られない遺伝子を含有することができる。組換え細胞はまた、遺伝子が修飾され、人工的手段によって細胞へと再導入された、細胞のネイティブ形態に見られる遺伝子も含有することができる。この用語はまた、細胞由来の核酸を除去することなく修飾されている、細胞に対して内因性である核酸を含有する細胞も包含し、このような修飾は、遺伝子置き換え、部位特異的突然変異及び関連技法によって得られたものを含む。したがって、「組換えポリペプチド」は、組換え細胞によって生成されているものである。「異種配列」又は「異種核酸」は、本明細書で使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来の供給源（例えば、異なる種）を起源とするか、又は同じ供給源を起源とする場合はその元の形態から修飾されているものである。したがって、プロモーターに作動可能に連結した異種核酸は、プロモーターが得られた供給源と異なる供給源に由来するか、又は同じ供給源に由来する場合はその元の形態から修飾されている。異種配列は、例えば、宿主微生物細胞のゲノムへ、トランスフェクション、形質転換、コンジュゲーション又は形質導入によって安定して導入することができ、その場合、配列が導入される宿主細胞に依存する技法を適用することができる。種々の技法が当業者に知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に開示されている。

【0034】

したがって、「遺伝子操作された宿主細胞」又は「遺伝子操作された微生物細胞」は、形質転換若しくはトランスフェクトされている、又は外因性ポリヌクレオチド配列による形質転換若しくはトランスフェクションが可能である細菌細胞又は酵母細胞として理解される。

【0035】

したがって、本発明において使用される核酸配列は、例えば、安定して形質転換／トランスフェクトされる又はそうでなければ宿主微生物細胞に導入されるベクターに含まれていてもよい。

【0036】

本発明のポリペプチドを生産するために多種多様な発現系が使用され得る。このようなベクターには、とりわけ、染色体、エピソーム及びウイルス由来のベクター、例えば、細菌のプラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス由来のベクター、並びにコスミド及びファージミドなどのプラスミド及びバクテリオファージの遺伝エレメント由来のものなどのこれらの組合せ由来のベクターが含まれる。発現系構築物は、発現を調節及び引き起こす制御領域を含有し得る。一般的に、宿主において、ポリヌクレオチドを維持し、増やし又は発現させ、ポリペプチドを合成するのに適する任意の系又はベクターは、この点での発現に対して使用され得る。適切なＤＮＡ配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）に示されるものなどの様々な周知の及び慣例的な技法のいずれかによって、発現系に挿入され得る。

【0037】

当技術分野には、選択された宿主生物の形質転換において使用するための遺伝材料の単離、合成、精製及び増幅に関する「組換えＤＮＡ」方法論に関する特許及び文献が豊富に存在する。したがって、選択された外因性（すなわち、外来性又は「異種」）ＤＮＡ配列を含む「ハイブリッド」ウイルス又は環状プラスミドＤＮＡを有する宿主生物を形質転換することは常識である。当技術分野において知られている手順は、環状ウイルス又はプラスミドＤＮＡを酵素的に切断して線状ＤＮＡ鎖を形成することによる形質転換ベクターの生成を最初に含む。通常、所望のタンパク質生産物をコードする配列を含む、選択された外来性ＤＮＡ鎖は、同じ／類似の酵素の使用によって線状形態で調製される。線状ウイルス又はプラスミドＤＮＡは、回復プロセスに影響を及ぼすことができるライゲーション酵素の存在下で外来性ＤＮＡとインキュベートされ、ウイルス又は環状ＤＮＡプラスミドに「スプライス」された選択された外来性ＤＮＡセグメントを含む「ハイブリッド」ベクターが形成される。

【0038】

「～をコードするヌクレオチド配列」という用語は、一般的に、修飾されていないＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、一般的に、ある特定のポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子の部分を表す。この用語は、限定することなく、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域又は一本鎖、二本鎖及び三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖若しくはより典型的には二本鎖若しくは三本鎖領域又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。この用語はまた、コーディング配列及び／又は非コーディング配列を含有してもよいさらなる領域と一緒に、ポリペプチドをコードする単一の連続領域又は不連続領域（例えば、組み込まれたファージ又は配列の挿入若しくは編集により分断されたもの）を含むポリヌクレオチドも包含する。

【0039】

本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、それぞれ、基準のポリヌクレオチド又はポリペプチドと異なるが、基準のポリヌクレオチド又はポリペプチドの本質的（酵素の）特性を保持するポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドの典型的なバリアントは、別の、基準のポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。バリアントのヌクレオチド配列の変化は、基準のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更してもしなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で考察するように、基準配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切断を生じる場合がある。ポリペプチドの典型的なバリアントは、別の、基準のポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般的に、基準のポリペプチド及びバリアントの配列が全体として非常に類似し、多くの領域で同一であるように差異が限定される。バリアント及び基準のポリペプチドは、任意の組合せで１つ以上の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なる可能性がある。置換された又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝情報によってコードされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントなどの天然に存在するものであってもよく、又は天然に存在することが知られていないバリアントであってもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発技法によって、直接的合成によって及び当業者に公知の他の組換え方法によって作製されてもよい。

【0040】

本発明の範囲内で、野生型タンパク質によってコードされたポリペプチドに対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００又はそれより多いアミノ酸の領域にわたって、約６０％超のアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％又はそれを超えるアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、核酸／ポリヌクレオチド及びポリペプチド多型バリアント、対立遺伝子、突然変異体並びに種間相同体もこれらの用語に含まれる。

【0041】

したがって、本明細書で開示される遺伝子／タンパク質のいずれかの「機能的バリアント」は、それぞれの断片が由来する遺伝子又はタンパク質と同じ又は幾分劣る活性を依然として保持している遺伝子／タンパク質の配列バリアントを示すことを意味する。

【0042】

遺伝子操作された微生物細胞は、前記微生物細胞が培養されている培養培地からその細胞質に少なくとも１種の単糖を移動させるための少なくとも１種の単糖トランスポーターを有する。前記少なくとも１種の単糖トランスポーターは、グルコース、フルクトース及びガラクトースからなる群から選択される単糖を移動させる。

【0043】

細胞膜を横切って移動した単糖は、細胞の代謝に利用可能になるようにリン酸化される必要がある。細胞膜を横切って単糖を移動させた単糖トランスポーターに応じて、単糖は、直接、すなわち細胞に移動している間に、リン酸化され、又は適切なキナーゼによって後でリン酸化される。ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ依存性輸送（ＰＥＰ－ＰＴＳ）による単糖の移動は直接リン酸化をもたらすのに対して、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性輸送（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）による単糖の移動は細胞内キナーゼによる単糖の後のリン酸化を必要とする。

【0044】

追加の及び／又は代替の実施形態では、微生物細胞は、グルコースを移動させるホスホトランスフェラーゼ系（ＰｔｓＧ）を含む。グルコースを移動させるホスホトランスフェラーゼ系は、細胞膜を横切って移動するのと同時に流入グルコースのリン酸化を触媒する。

【0045】

Ｐｔｓ系の一般的な機構は以下の通りである：ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）由来のホスホリル基はシグナル伝達経路を介して酵素Ｉ（ＥＩ）に転移し、次にこの酵素Ｉはそのホスホリル基をホスホリル担体であるヒスチジンタンパク質（ＨＰｒ）に転移させる。次いでホスホ－ＨＰｒは、糖を細胞に輸送する、酵素２（ＥＩＩ）として知られている膜結合型複合体である糖特異的パーミアーゼにホスホリル基を転移させる。ＥＩＩは、少なくとも３つの構造的に異なるドメインＩＩＡ、ＩＩＢ及びＩＩＣからなる。これらは、単一のポリペプチド鎖において一緒に融合され得る、又は以前に酵素ＩＩ（ＥＩＩ）及びＩＩＩ（ＥＩＩＩ）と呼ばれていた、２つ若しくは３つの相互作用鎖として存在し得る。

【0046】

第１のドメイン（ＩＩＡ又はＥＩＩＡ）は、第１のパーミアーゼ特異的リン酸化部位である、ホスホ－ＨＰｒによってリン酸化されるヒスチジンを有する。第２のドメイン（ＩＩＢ又はＥＩＩＢ）は、輸送される糖に応じて、システイニル又はヒスチジル残基においてホスホ－ＩＩＡによってリン酸化される。最後に、ホスホリル基は、ＩＩＣドメインによって処理された糖の取り込みと同時にＩＩＢドメインから糖基質に転移される。この第３のドメイン（ＩＩＣ又はＥＩＩＣ）は移動チャネル及び特異的基質結合部位を形成する。

【0047】

したがって、ＰｔｓＧ系は外因性グルコースを獲得し、微生物細胞においてグルコース－６－リン酸を提供する。グルコース－６－リン酸は、ＵＤＰ－ガラクトース生合成経路において利用され得る及び／又はフルクトース－６－リン酸に変換され得、次にこのフルクトース－６－リン酸は、中心代謝において及び／又は例えば、ＧＤＰ－フコースなどのヌクレオチドにより活性化された糖類の生合成において高エネルギー三リン酸を生成するために使用され得る。

【0048】

追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、培養培地から微生物細胞の細胞質にフルクトース（Ｆｒｃ）を移動させるためのフルクトーストランスポーターを含む。遊離フルクトースを取り込むための適切なフルクトーストランスポーターは、Ｋｏｒｎｂｅｒｇら、ＰＮＡＳ ９７：１８０８～１８１２（２０００）によって記載されているアイソフォーム（ＰｔｓＧ－Ｆ）である。

【0049】

次いで内在化したフルクトースは、フルクトキナーゼ（ＦｒＫ）によってリン酸化されてフルクトース－６－リン酸（Ｆｒｕ－６－Ｐ）をもたらすことができる。フルクトース－６－リン酸は、ＵＤＰ－ガラクトース生合成経路において及び／又は中心代謝における高エネルギー三リン酸の生成などの他の代謝経路において及び／又は例えば、ＧＤＰ－フコースなどのヌクレオチドにより活性化された糖類の生合成において利用され得る。

【0050】

追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、フルクトースを移動させるホスホトランスフェラーゼ系（ＰｔｓＦ）を含む。フルクトースを移動させるホスホトランスフェラーゼ系は、細胞膜を横切って移動するのと同時に流入フルクトースのリン酸化を触媒する。

【0051】

したがって、ＰｔｓＦ系は外因性フルクトースを獲得し、微生物細胞においてフルクトース－１－リン酸を提供する。ＰｔｓＦ系は、膜貫通タンパク質ＦｒｕＡ、１－ホスホフルクトースキナーゼ（ＦｒｕＫ）及びジホスホリル転移タンパク質ＦｒｕＢを含む。ＦｒｕＡ及びＦｒｕＢによってフルクトースは移動して細胞質においてフルクトース－１－リン酸をもたらすことができる。フルクトース－１－リン酸はホスホフルクトキナーゼ（ＦｒｕＫ）によってさらにリン酸化されてフルクトース－１，６－ビスリン酸を生じることができ、次にこのフルクトース－１，６－ビスリン酸は、中心代謝において高エネルギー三リン酸を生成するために微生物細胞によって使用され得る。

【0052】

別の適切なＰｔｓＦ系は、ＬｅｖＤ、ＬｅｖＥ、ＬｅｖＦ及びＬｅｖＧを含む。ＬｅｖＤはフルクトース特異的ホスホトランスフェラーゼ酵素ＩＩＡ成分である。ＬｅｖＥはフルクトース特異的ホスホトランスフェラーゼ酵素ＩＩＢ成分である。ＬｅｖＦはフルクトースパーミアーゼＩＩＣ成分であり、ＬｅｖＧはフルクトースパーミアーゼＩＩＤ成分である。対応する遺伝子ｌｅｖＤ、ｌｅｖＥ、ｌｅｖＦ及びｌｅｖＧは、例えば、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（株１６８）から知られている。前記ＰｔｓＦ系は細胞内にフルクトース－１－リン酸をもたらす。

【0053】

追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞はＵＤＰ－ガラクトース（ＵＤＰ－Ｇａｌ）の細胞内形成のためのＵＤＰ－ガラクトース生合成経路を有する。ＵＤＰ－ガラクトースはガラクトシルトランスフェラーゼに対する基質として必要とされ、前記ガラクトシルトランスフェラーゼの活性はガラクトシル化二糖又はガラクトシル化オリゴ糖の形成をもたらし得る。

【0054】

ＵＤＰ－ガラクトースは、微生物細胞の自然に発生する代謝によって、すなわち、グルコース１－リン酸及びグルコース６－リン酸の相互変換を触媒するホスホグルコムターゼ、グルコース－１－リン酸及びＵＴＰからＵＤＰ－グルコースの形成を触媒するＵＴＰ－グルコース－１－リン酸－ウリジルトランスフェラーゼ、並びにＵＤＰ－ガラクトースへのＵＤＰ－グルコースの可逆的変換を触媒するＵＤＰ－グルコース－４－エピメラーゼの活性によってもたらされ得る。

【0055】

ＵＤＰ－ガラクトースの細胞内供給は、ホスホグルコムターゼ、ＵＤＰ－グルコース－１－リン酸－ウリジルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ－グルコース－４－エピメラーゼ及びそれらの機能的バリアントをコードする遺伝子の１つ以上が過剰発現されるという点並びに／又はホスホグルコムターゼ、ＵＤＰ－グルコース－１－リン酸－ウリジルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ－グルコース－４－エピメラーゼ及びそれらの機能的バリアントをコードする遺伝子の１つ以上をコードする遺伝子の１つ以上のうちの１つ以上のさらなるコピーが微生物細胞内で発現されるという点で遺伝子操作によって改善され得る。ホスホグルコムターゼをコードする遺伝子の例は、Ｅ．コリＫ－１２に見られるｐｇｍ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１５２１４）であり、ＵＤＰ－グルコース－１－リン酸－ウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の例は、Ｅ．コリＫ－１２に見られるＥ．コリｇａｌＵ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１５７５２）であり、ＵＤＰ－グルコース－４－エピメラーゼをコードする遺伝子の例は、Ｅ．コリＫ－１２に見られるＥ．コリｇａｌＥ遺伝子（ＮＰ＿４１５２８０）である。

【0056】

本明細書で使用される場合、「過剰発現」又は「過剰発現される」という用語は、野生型前駆細胞、すなわち、遺伝子操作された微生物細胞と同じ属種の細胞であり、遺伝子操作されていないその細胞において測定されるものより大きい酵素又はポリペプチド発現のレベルを指す。

【0057】

さらに及び／又は代替として、細胞内ＵＤＰ－ガラクトース供給は、前記微生物細胞が培養される培養培地を介してガラクトースを微生物細胞に供給することによって達成又は改善され得る。外部から供給されるガラクトースは微生物細胞によって取り込まれ、その後、次にＵＤＰ－ガラクトースに変換されるガラクトース－１－リン酸にリン酸化される。このＧＤＰ－ガラクトース生合成経路では、必要とされる酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子は文献（Ｇｒｏｉｓｓｏｉｒｄら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｇａｌＰＭＫＴＥ Ｇｅｎｅｓ，Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｇａｌａｃｔｏｓｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ Ｌｅｌｏｉｒ Ｐａｔｈｗａｙ」（２００３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５（３）８７０～８７８）において知られている。ｇａｌＰ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１７４１８）はガラクトース－プロトン共輸送体をコードする。ｇａｌＭ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１５２７７）はアルドラーゼ１－エピメラーゼをコードし、ｇａｌＫ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１５２７８）はガラクトキナーゼをコードし、ｇａｌＴ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１５２７９）はガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードし、ｇａｌＥ遺伝子はＵＤＰ－ガラクトース－４－エピメラーゼをコードする。

【0058】

それ故、ＵＤＰ－ガラクトース生合成もまた、微生物細胞内でガラクトース－プロトン共輸送体、ガラクトースキナーゼ及びガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現によって供給され得る、又は微生物細胞内でガラクトース－プロトン共輸送体、ガラクトースキナーゼ及びガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現によって改善され得る。

【0059】

別の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞はＧＤＰ－Ｌ－フコース（ＧＤＰ－Ｆｕｃ）の細胞内形成のためのＧＤＰ－フコース生合成経路を有する。ＧＤＰ－Ｆｕｃはフコシルトランスフェラーゼの基質であり、フコシルトランスフェラーゼの酵素活性はフコシル化二糖又はフコシル化オリゴ糖の形成をもたらし得る。

【0060】

追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－リン酸－グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ及びＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼを含むＧＤＰ－Ｌ－フコース生合成経路を有する。

【0061】

ＧＤＰ－Ｌ－フコースの細胞内供給は、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－リン酸－グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ若しくはＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼをコードする１つ以上の遺伝子が過剰発現される及び／又はマンノース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－リン酸－グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ及びＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ若しくはそれらの機能的バリアントをコードする遺伝子の１つ以上のさらなるコピーが微生物細胞内で発現されるという点で遺伝子操作によって改善され得る。マンノース－６－リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の例は、Ｅ．コリＫ－１２に見られるＥ．コリｍａｎＡ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１６１３０）であり、ホスホマンノムターゼをコードする遺伝子についての例は、Ｅ．コリＫ－１２に見られるＥ．コリｍａｎＢ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１６５５２）であり、マンノース－１－リン酸－グアニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子についての例は、Ｅ．コリＫ－１２に見られるＥ．コリｍａｎＣ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１６５５３）であり、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼをコードする遺伝子についての例は、Ｅ．コリＫ－１２に見られるＥ．コリｇｍｄ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１６５５７）であり、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼをコードする遺伝子の例は、Ｅ．コリＫ－１２に見られるＥ．コリｗｃａＧ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１６５５６）である。

【0062】

さらに及び／又は代替として、ＧＤＰ－Ｌ－フコース供給は、前記微生物細胞が培養される培養培地を介してＬ－フコースを微生物細胞に供給することによって達成又は改善され得る。外部から供給されるＬ－フコースは微生物細胞によって取り込まれ、酵素フコースキナーゼによってフコース－１－リン酸に最初にリン酸化される。続いてフコース－１－リン酸は、酵素フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼの酵素活性によってＧＤＰ－Ｌ－フコースに変換される。必要な酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子は当業者に公知である。例として、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）の二機能性Ｌ－フコキナーゼ／Ｌ－フコース１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼをコードするｆｋｐ遺伝子（受託番号ＷＰ＿０１０９９３０８０）が、遺伝子操作された宿主細胞内で過剰発現され得る。

【0063】

別の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミニル化二糖又はオリゴ糖の形成をもたらすＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ反応に必要とされる、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン（ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ）の細胞内形成のためのＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン生合成経路を有する。

【0064】

追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、例えば、Ｌ－グルタミン：Ｄ－フクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ及びＮ－アセチルグルコサミン－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼを含む、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン生合成経路を有する。

【0065】

ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンの細胞内供給は、Ｌ－グルタミン：Ｄ－フクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ活性（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ｇｌｍＳ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１８１８５））、ホスホグルコサミンムターゼ活性（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ｇｌｍＭ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１７６４３））及びＮ－アセチルグルコサミン－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ｇｌｍＵ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１８１８６））を示すポリペプチド、又はそれらのバリアントをコードする遺伝子の１つ以上の発現又は過剰発現などの遺伝子修飾によって改善され得る。

【0066】

別の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、例えば、シアリル化二糖又はオリゴ糖の形成をもたらすシアリルトランスフェラーゼ反応に必要とされる、ＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の細胞内形成のためのＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸／ＣＭＰ－シアル酸生合成経路を有する。

【0067】

追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、例えば、Ｌ－グルタミン：Ｄ－フクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼ、グルコサミン－６－リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸ホスファターゼ（好ましくはＨＡＤ様糖ホスファターゼ）、Ｎ－アセチル－グルコサミン２－エピメラーゼ、シアル酸シンターゼ及びＣＭＰ－シアル酸シンテターゼを含む、ＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸生合成経路を有する。

【0068】

ＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸の細胞内供給は、Ｌ－グルタミン：Ｄ－フクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ活性（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ｇｌｍＳ遺伝子）、ホスホグルコサミンムターゼ活性（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ｇｌｍＭ遺伝子）、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ｇｌｍＵ遺伝子）、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼ活性（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）ｎｅｕＣ遺伝子（受託番号ＡＦ３０５５７１））、グルコサミン－６－リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｇｎａ１遺伝子（受託番号ＮＰ＿１１６６３７））、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸ホスファターゼ活性（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ｙｉｈＸ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１８３２１））、Ｎ－アセチルグルコサミン２－エピメラーゼ活性（例えば、シネコシスティス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３ｓｌｒ１９７５遺伝子（受託番号ＢＡＬ３５７２０））、シアル酸シンターゼ活性（例えば、カンピロバクター・ジェジュニｎｅｕＢ遺伝子（受託番号ＡＦ３０５５７１））及びＣＭＰ－シアル酸シンテターゼ活性（例えば、カンピロバクター・ジェジュニｎｅｕＡ遺伝子）（受託番号ＡＦ３０５５７１）を示すポリペプチド、又はそれらのバリアントをコードする遺伝子の１つ以上の発現又は過剰発現などの遺伝子修飾によって改善され得る。

【0069】

遺伝子操作された微生物細胞はグリコシルトランスフェラーゼをさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、少なくとも１種のグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコサミニルトランスフェラーゼ又はガラクトシルトランスフェラーゼであり、より好ましくは、少なくとも１種のグリコシルトランスフェラーゼは、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ活性、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ活性、β－１，６－ガラクトシルトランスフェラーゼ活性、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ活性、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性、α－１，４－フコシルトランスフェラーゼ活性を示す。適切なグリコシルトランスフェラーゼは当業者に公知である又は文献に見出され得る。

【0070】

一般的に、及び本開示全体を通して、「グリコシルトランスフェラーゼ活性」又は「グリコシルトランスフェラーゼ」という用語は、二糖、オリゴ糖及び多糖の生合成に関与する酵素を指し、それらを包含し、それらは、活性化ヌクレオチド単糖／糖（例えば、ＵＤＰ－Ｇｌｃ、ＵＤＰ－Ｇａｌ、ＧＤＰ－Ｆｕｃ、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）からグリコシルアクセプター分子（例えば、単糖、二糖又はオリゴ糖）への単糖部分の転移を触媒する。

【0071】

追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は細胞の野生型より多くのホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）を合成する。追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、増強されたＰＥＰ生合成経路を有するように遺伝子操作されている。例えば、遺伝子操作された微生物細胞は、例えば、Ｅ．コリＫ－１２ｐｃｋＡ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１７８６２）又はその機能的バリアントを過剰発現することによって、増大したホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ活性を有するように遺伝子操作されている。好ましくは、例えば、ホスホエノールピルベートシンターゼをコードするＥ．コリＫ－１２ｐｐｓＡ遺伝子（受託番号ＮＰ＿４１６２１７）が過剰発現されるという点及び／又は天然に存在しない微生物がホスホエノールピルベートシンターゼ又はその機能的バリアントの発現を可能にするヌクレオチド配列の少なくとも１つのさらなるコピーを含有するという点で、遺伝子操作された宿主細胞は、増大したホスホエノールピルベートシンターゼ活性を有するように遺伝子操作されている。多くのＰＥＰが、例えばシアル酸の生産に利用可能であるように、ｐｃｋＡ又はｐｐｓＡの過剰発現は細胞内ＰＥＰ合成を増強する。

【0072】

追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞の細胞内ＰＥＰアベイラビリティは、炭素及びエネルギー源として使用されるある特定の糖（例えばグルコース）の、培養培地から細胞への移入に必要とされるホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ依存性インポーターの活性を低下及び／又は減少させることによって改善され得る。その結果として、炭素及びエネルギー源として前記ある特定の糖を使用するように遺伝子操作された宿主細胞の能力を維持するために、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性インポーターは、発現される又は過剰発現されることを必要とする。追加の及び／又は代替の実施形態では、前記ある特定の糖をリン酸化することを可能にするキナーゼの発現又は過剰発現は、細胞内の非リン酸化形態における前記糖の代謝又はその蓄積をそれぞれ実現するために必要とされる又は低下及び／若しくは減少する。

【0073】

発現及び／又は活性が遺伝子操作された微生物細胞（例えばＥ．コリＫ－１２）において低下及び／又は減少し得る、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ依存性インポーター又はその成分は、グルコースＰＥＰ－ＰＴＳ遺伝子ｐｔｓＧ（受託番号ＮＰ＿４１５６１９）、ｍａｌＸ（受託番号ＮＰ＿４１６１３８）、ｃｒｒ（受託番号ＮＰ＿４１６９１２）、ｂｇｌＦ（受託番号ＮＰ＿４１８１７８）及び／又はフルクトースＰＥＰ－ＰＴＳ遺伝子ｆｒｕＡ（受託番号＿４１６６７２）、ｆｒｕＢ（受託番号ＮＰ＿４１６６７４）及び／又はマンノースＰＥＰ－ＰＴＳ遺伝子ｍａｎＸ（受託番号ＮＰ＿４１６３３１）、ｍａｎｙ（受託番号ＮＰ＿４１６３３２）、ｍａｎＺ（受託番号ＮＰ＿４１６３３３）及び又はＮ－アセチルグルコサミンＰＥＰ－ＰＴＳ遺伝子ｎａｇＥ（受託番号ＮＰ＿４１５２０５）からなる群から選択される少なくとも１つを含む。

【0074】

単糖（グルコース及び／又はフルクトース及び／又はガラクトース及び／又はＮ－アセチルグルコサミン及び／又はＮ－アセチルノイラミン酸及び／又はフコース）を微生物細胞に移入することを可能にする、適切な非ＰＥＰ－ＰＴＳトランスポーター又はそのバリアントは当業者に公知である。前記非ＰＥＰ－ＰＴＳトランスポーターをコードする遺伝子の非限定的な例は、エシェリキア・コリＫ－１２のｇａｌＰ（配列番号１）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）のｇｌｆ（配列番号２）、エシェリキア・コリＷのｃｓｃＢ（配列番号３）、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のｆｕｐＬ（配列番号４）、エシェリキア・コリＫ－１２のｌａｃＹ（配列番号５）、エシェリキア・コリＫ－１２のｆｕｃＰ（配列番号６）、エシェリキア・コリＫ－１２のｎａｎＴ（配列番号７）、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のｎａｇＰ（配列番号８）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＮＣＣ２７０５のｇｌｃＰ（配列番号９）、バシラス・サチリスのｇｌｃＰ（配列番号１０）、ビブリオ・パラヘモリティクス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）のｓｇｌＳ（配列番号１１）、エシェリキア・コリＫ－１２のｘｙｌＥ（配列番号１２）、バシラス・サチリス１６８のａｒａＥ（配列番号１３）である。したがって、追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞は、上述の遺伝子又はその機能的バリアントのタンパク質コード領域を含む少なくとも１つの遺伝子を含み、発現する。

【0075】

好ましい実施形態では、適切な非ＰＥＰ－ＰＴＳ－グルコーストランスポーターは、糖促進拡散タンパク質（ｓｕｇａｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）及び／又はグルコース移動パーミアーゼである。適切なグルコース促進融合タンパク質はザイモモナス・モビリスのｇｌｆ遺伝子によってコードされる。適切なグルコース移動パーミアーゼはＥ．コリＫ－１２ｇａｌＰ遺伝子によってコードされる。グルコース移動パーミアーゼは、ガラクトース－プロトン共輸送体又はガラクトースパーミアーゼとしても知られているが、細胞膜を横切ってグルコースを取り込みもする。

【0076】

別の好ましい実施形態では、適切な非ＰＥＰ－ＰＴＳ－フルクトーストランスポーターは、糖促進拡散タンパク質及び／又はフルクトース担体タンパク質である。適切なフルクトース促進融合タンパク質は、ザイモモナス・モビリスのｇｌｆ遺伝子によってコードされる。適切なフルクトース担体タンパク質は、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスｆｕｐＬ遺伝子によってコードされる。

【0077】

一般的に、及び本開示全体を通して、「糖リン酸の増大した細胞内アベイラビリティ」又は「糖リン酸の増大した／改善された供給」という用語は、未修飾の微生物細胞と比較して、前記糖リン酸の向上した細胞内の量を生じるように遺伝子修飾された微生物細胞の増大した能力を指し、所望の炭水化物の生合成経路によって向上した炭素フラックスを可能にする。その結果として、前記遺伝子修飾された微生物細胞による前記所望の炭水化物の向上した生産は、前記糖リン酸の向上した細胞内の量の直接的な尺度である。加えて、細胞内代謝産物の定量化及び／又は細胞の炭素フラックスを目標にする方法が当業者に公知の文献に見出され得る（例えば、Ｌａｍｍｅｒｈｏｆｅｒ及びＷｅｃｋｗｅｒｔｈ、「Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｇｅｎｅｒａｔｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄａｔａ」、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ（２０１３））。

【0078】

追加の及び／又は代替の実施形態では、所望の炭水化物の生合成と競合する、遺伝子及び／又はタンパク質の発現及び／又は活性は、それぞれ、遺伝子操作された宿主細胞内で低下及び／又は減少し得る。このような対抗するタンパク質（複数）／タンパク質活性の非限定的な例は、β－ガラクトシダーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ＬａｃＺ（受託番号ＮＰ＿４１４８７８））、ＵＤＰ－グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース－１－リン酸トランスフェラーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ＷｃａＪ（受託番号ＮＰ＿４１６５５１））、Ｌ－フコースイソメラーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２Ｆｕｃｌ）、フクロキナーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ＦｕｃＫ（受託番号ＮＰ＿４１７２８２））、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ＮａｇＡ（受託番号ＮＰ＿４１５２０３））、グルコサミン－６－リン酸デアミナーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ＮａｇＢ（受託番号ＮＰ＿４１５２０４））、Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ＮａｎＫ（受託番号ＮＰ＿４１７６８９））、Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ＮａｎＥ（受託番号ＮＰ＿４１７６９０））、Ｎ－アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ＮａｎＡ（受託番号ＮＰ＿４１７６９２））、シアル酸パーミアーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ＮａｎＴ（受託番号ＮＰ＿４１７６９１））からなる群から選択される少なくとも１つを含む。

【0079】

追加の及び／又は代替の実施形態では、遺伝子操作された微生物細胞は、スクロースを代謝することができるので、（ｉ）異種ＰＴＳ依存性スクロース利用輸送系（例えば、スクロースポーリン（ｓｃｒＹ）、ＰＴＳスクロース特異的トランスポーターサブユニットＩＩ（ｓｃｒＡ）及びスクロース－６－リン酸ヒドロラーゼ（ｓｃｒＢ）からなるクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｓｃｒＹＡＢ遺伝子（配列番号１４）又はサルモネラ・ティフムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｓｃｒＹＡＢ遺伝子（配列番号１５）並びに／又は（ｉｉ）スクロースリン酸シンターゼ遺伝子（例えば、アナベナ属種（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．）ＰＣＣ７１２０ｓｐｓＡ遺伝子（受託番号ＡＪ３０２０７１））と組み合わせた異種ＰＴＳ依存性スクロース輸送系（例えば、クレブシエラ・ニューモニエｓｃｒＹＡ遺伝子又はサルモネラ・ティフムリウムｓｃｒＹＡ遺伝子）並びに／又は（ｉｉｉ）異種ＰＴＳ非依存性スクロース利用系（例えば、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）、スクロースヒドロラーゼ（ｃｓｃＡ）及びスクロースパーミアーゼ（ｃｓｃＢ）からなるＥ．コリＷｃｓｃＢＫＡ遺伝子（配列番号１６）並びに／又は（ｉｖ）スクロースホスホリラーゼ遺伝子（例えば、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスｂａｓＰ遺伝子（受託番号ＷＰ＿０１１７４２６２６））又はスクロースシンターゼ遺伝子（例えば、アナベナ属種ｓｕｓＡ遺伝子（受託番号ＣＡＡ０９２９７））と組み合わせたスクロースパーミアーゼ遺伝子（例えば、Ｅ．コリＷ ｃｓｃＢ）からなる異種スクロース利用系をコードする１つ以上の遺伝子を含む。

【0080】

追加の及び／又は代替の実施形態では、微生物細胞は、目的の炭水化物を細胞から排出するエクスポータータンパク質又はパーミアーゼ、好ましくは糖流出トランスポーターを含む。

【0081】

追加の及び／又は代替の実施形態では、宿主細胞は、微生物細胞、好ましくは、エシェリキア、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バシラス、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の属の細菌からなる群から選択される細菌細胞、好ましくは、エシェリキア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、バシラス・サチリス、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルエッキイー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）及びラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からなる細菌属種の群から選択される細菌細胞である。別の実施形態では、微生物細胞はエシェリキア・コリである。当業者は、本開示を読んでさらなる細菌株を想起するであろう。

【0082】

第２の態様によれば、所望の炭水化物を生産するための本明細書に記載される遺伝子操作された宿主細胞の使用であって、前記宿主細胞は、グルコースとフルクトース及びガラクトースの群の少なくとも第２の単糖とからなる単糖混合物の存在下で培養される、使用が提供される。前記細胞は、所望の炭水化物の生産に関与する少なくとも１種の糖リン酸の増大した細胞内アベイラビリティを示すように遺伝子操作される。前記糖リン酸は、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、ジヒドロキシアセトンリン酸、フルクトース－６－リン酸、フルクトース－１－リン酸、フルクトース－１，６－ビスリン酸、グルコース－６－リン酸、グルコース－１－リン酸、ガラクトース－１－リン酸、マンノース－１－リン酸、マンノース－６－リン酸、グルコサミン－６－リン酸、グルコサミン－１－リン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸、Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトース、ＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、ＧＤＰ－マンノース、ＧＤＰ－フコース及びＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンからなる群から選択され得る。

【0083】

第３の態様によれば、所望の炭水化物を発酵生産するための方法であって、
ａ）所望の炭水化物を生産することができる遺伝子操作された微生物を提供するステップであって、前記微生物は、前記操作された微生物内の前記細胞内糖リン酸の消費をもたらす少なくとも１種のタンパク質の低下及び／又は減少した発現及び／又は活性に起因して少なくとも１種の糖リン酸の増大した細胞内アベイラビリティを示す、ステップ、
ｂ）前記所望の炭水化物の生産を可能にする培養培地中で前記遺伝子操作された微生物を培養するステップであって、主な炭素源は、グルコースとフルクトース及びガラクトースの群の少なくとも第２の単糖とからなる単糖混合物である、ステップ、
ｃ）前記所望の糖類を培養ブロスから回収するステップ
を含む、方法が提供される。

【0084】

追加の及び／又は代替の実施形態では、目的の炭水化物はヒト母乳オリゴ糖又はその構成単位である。本明細書に記載される遺伝子修飾された微生物細胞及び／又は方法を使用することによって生産され得る目的の炭水化物のリストは表１に開示される。好ましくは、所望の炭水化物は、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、２’，３－ジフコシルラクトース、３’－シアリルラクトース、６’－シアリルラクトース、３－フコシル－３’－シアリルラクトース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキソースＩ、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキサオースＩＩ、ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースＬＳＴａ、ＬＳＴｂ、ＬＳＴｃからなる群から選択される。

【0085】

好ましくは、グルコース及び少なくとも１種のさらなる単糖の混合物は、好ましくは、スクロースの加水分解によって得られる、グルコース及びフルクトースの混合原料である。

【0086】

追加の及び／又は代替の実施形態では、スクロース加水分解は、十分な量のスクロースが原料に残存するように不完全である。したがって、加水分解及び／又は加熱滅菌された原料中のスクロースの量は、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超又は８０％超である。

【0087】

追加の及び／又は代替の実施形態では、微生物細胞は、特に目的のオリゴ糖を生産するために培養される場合、アクセプター基質、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン又はラクトースを外部から供給されずに培養される。

【0088】

本発明は、特定の実施形態に関して、また図面を参照して記載されるが、本発明はこれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、詳細な説明及び特許請求の範囲における、第１の、第２のなどという用語は、類似の要素の間を区別するために使用され、時間的な、空間的な、ランクにおける又はあらゆる他の様式における順序の記載を必ずしも必要としているわけではない。このように使用されている用語は適切な状況下で交換可能であること、及び本明細書に記載される発明の実施形態が本明細書に記載又は図示される以外の順序で操作され得ることを理解されたい。

【0089】

特許請求の範囲において使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、その後に列挙される手段に制限されるものと解釈されるべきではないことに留意されたい。この用語は、他の要素又はステップを排除しない。したがって、この用語は、言及された特徴、整数、ステップ又は構成要素が述べられた通りに存在することを特定していると解釈されるが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、若しくは構成要素又はこれらの群の存在又は追加を排除するものではない。したがって、「手段Ａ及びＢを含むデバイス」という表現の範囲は、構成要素Ａ及びＢのみからなるデバイスに限定されてはならない。この表現は、本発明に関して、デバイスの唯一の関連する構成要素がＡ及びＢであることを意味する。

【0090】

本明細書の全体を通して、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又は「実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への参照は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体を通しての様々な箇所における、「一実施形態において（ｉｎ ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又は「実施形態において（ｉｎ ａｎ ｅｍｂｏｄｉｅｎｔ）」という表現の存在は、必ずしもこれらの全てが同一の実施形態を参照しているわけではないが、同一の実施形態を参照していてもよい。さらに、本開示から当業者には明らかであろうが、特定の特徴、構造又は特性は、１つ以上の実施形態において、あらゆる適切な様式で組み合わされ得る。

【0091】

同様に、本発明の代表的な実施形態の記載において、本発明の様々な特徴は、時として、本開示を合理化し、様々な本発明の態様のうちの１つ以上の理解を容易にすることを目的として、単一の実施形態、図面又はその説明にまとめてグループ化されることを理解されたい。しかし、この開示方法は、特許請求の範囲に記載の発明が、各請求項において明示的に言及されているものよりも多くの特徴を要するという意図を反映するものと解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、本発明の態様は、単一の前述の開示された実施形態の特徴の全てにあるわけではない。したがって、詳細な説明に従った特許請求の範囲は、ここで、この詳細な説明に明示的に組み込まれ、各請求項は、本発明の別個の実施形態として、それのみで有効である。

【0092】

さらに、本明細書に記載される一部の実施形態は、他の実施形態に含まれる一部の特徴を含むが、他の実施形態に含まれる他の特徴は含まず、当業者に理解されるであろうように、異なる実施形態の特徴の組合せは、本発明の範囲内にあり、異なる実施形態を形成することを意図する。例えば、以下の特許請求の範囲において、特許請求の範囲に記載の実施形態のいずれも、任意の組合せで使用され得る。

【0093】

さらに、実施形態の一部は、コンピュータシステムのプロセッサによって、又は機能を実行する他の手段によって実装され得る方法として、又は方法の要素の組合せとして、本明細書に記載されている。したがって、このような方法又は方法の要素を実行するための必要な指示を備えたプロセッサは、この方法又は方法の要素を実行するための手段を形成する。さらに、設備の実施形態の、本明細書に記載される要素は、本発明を実行する目的で要素によって行われる機能を実行するための手段の例である。

【0094】

本明細書に提供される詳細な説明及び図面において、多くの具体的な詳細が示されている。しかし、本発明の実施形態がこれらの具体的な詳細を伴わずに実施され得ることが理解される。他の場合において、この記載の理解を曖昧にしないようにするために、周知の方法、構造及び技術は、詳細に示されていない。

【0095】

【表1】

【0096】

本発明をここで、本発明のいくつかの実施形態を詳細に記載することによって記載する。本発明の他の実施形態が、本発明の真の趣旨又は技術的教示から逸脱することなく、当業者の知識に従って構成され得ることは明らかであり、本発明は、添付の特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。

【0097】

一実施形態では、遺伝子型ｎａｇＡＢＥ^－、ｍａｎＸＹＺ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）を使用してＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の効果的な生産者として代謝的に操作される。したがって、アセチル－ＣｏＡからグルコサミン－６－リン酸にアセテートを転移させ、それによってＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸を生成することを可能にするグルコサミン－６－リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の異種発現が必要である。好ましい実施形態では、この生産株は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡ及び／若しくはｐｆｋＢ並びに／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｚｗｆの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに遺伝子操作される。このさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、Ｎ－アセチルグルコサミン生産のための前駆体供給（フルクトース－６－リン酸）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。追加の実施形態では、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸をＮ－アセチルグルコサミンに脱リン酸化することを可能にする、グルタミン－フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子（例えば、Ｅ．コリＧｌｍＳ）及び／又はＨＡＤ様糖リン酸をコードする遺伝子（例えば、Ｅ．コリＹｉｈＸ、ＥコリＹｑａＢ）が、ＧｌｃＮＡｃの合成を促進するために発現／過剰発現される。

【0098】

別の実施形態では、遺伝子型ｌａｃＹ^＋、ｌａｃＺ^－、ｆｕｃＩＫ^－、ｗｃａＪ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）並びにアクセプター基質としてラクトースを使用してＬ－フコースの効果的な生産者として代謝的に操作される。したがって、Ｅ．コリ遺伝子ｍａｎＡ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ、ｇｍｄ及びｗｃａＧのうちの少なくとも１つの過剰発現並びにＧＤＰ－フコースからラクトースにフコースを転移させ、それによって２’－フコシルラクトースを生成することを可能にする異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、及び２’－フコシルラクトースから遊離Ｌ－フコースを放出することを可能にするα－１，２－フコシダーゼの発現が必要である。好ましい実施形態では、この生産株は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡ及び／若しくはｐｆｋＢ並びに／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｚｗｆの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに操作される。このさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、Ｌ－フコース生産のための前駆体供給（フルクトース－６－リン酸）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。

【0099】

別の実施形態では、遺伝子型ｎａｎＫＥＴＡ^－、ｎａｇＡＢ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）を使用してＮ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の効果的な生産者として代謝的に操作される。したがって、（ｉ）グルコサミン－６－リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＮ－アセチルグルコサミン－２エピメラーゼ及びＮ－アセチルノイラミン酸シンテターゼ、又は（ｉｉ）ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン２－エピメラーゼ及びＮ－アセチルノイラミン酸シンテターゼのいずれかをコードする遺伝子のうちの少なくとも１つの過剰発現が必要である。Ｎ－アセチルノイラミン酸合成はホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）依存性プロセスであるので、ＰＥＰ消費をもたらす競合反応が好ましくは回避される。したがって、好ましい実施形態では、この生産株は、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ依存性機構を介する前記炭素及びエネルギー源の取り込みを低下及び／又は減少させることによって、例えば、グルコースＰＥＰパーミアーゼ遺伝子ｐｔｓＧ及び／又はフルクトースＰＥＰパーミアーゼ遺伝子ｆｒｕＡ及び／又はマンノースＰＥＰパーミアーゼ遺伝子ｍａｎＸＹＺの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに操作される。操作された細胞への単糖の移入を可能にするホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）トランスポーター、並びにフルクトースをフルクトース－６－リン酸に活性化し、グルコースをグルコース－６－リン酸に活性化することをそれぞれ可能にする、フルクトースキナーゼ（例えば、Ｅ．コリＷｃｓｃＫ遺伝子）及びグルコースキナーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ｇｌｋ遺伝子）をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現／過剰発現と共に、このさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、Ｎ－アセチルノイラミン酸生産のための前駆体供給（フルクトース－６－リン酸、ホスホエノールピルベート）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。

【0100】

別の実施形態では、遺伝子型ｎａｇＡＢＥ^－、ｍａｎＸＹＺ^－、ｌａｃＺ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）並びにアクセプター基質としてＧｌｃＮＡｃを使用してＮ－アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）の効果的な生産者として代謝的に操作される。したがって、グルコサミン－６－リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチル－グルコサミンを細胞に移入することを可能にするホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性トランスポーター、及びＵＤＰ－Ｇａｌから遊離Ｎ－アセチルグルコサミンにガラクトースを転移させ、それによってＮ－アセチル－ラクトサミンを生成することを可能にするβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現／過剰発現が必要である。好ましい実施形態では、この生産株は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡ及び／若しくはｐｆｋＢ並びに／又はグルコース－６－リン酸イソメラーゼ遺伝子ｐｇｉ及び／若しくはグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｚｗｆの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに遺伝子操作される。このさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、Ｎ－アセチルラクトサミン生産のための前駆体供給（グルコース－６－リン酸）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。追加の実施形態では、Ｅ．コリ遺伝子ｐｇｍ、ｇａｌＵ及びｇａｌＥのうちの少なくとも１つが、ＵＤＰ－Ｇａｌの合成を促進するように過剰発現される。

【0101】

別の実施形態では、遺伝子型ｎａｇＡＢ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）を使用した全発酵によってラクト－Ｎ－ビオース（ＬＮＢ）の効果的な生産者として代謝的に操作される。したがって、アセチル－ＣｏＡからグルコサミン－６－リン酸にアセテートを転移させ、それによってＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸を生成することを可能にするグルコサミン－６－リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸を脱リン酸化し、それによってＮ－アセチルグルコサミンを生成することを可能にするＨＡＤ様糖リン酸、及びＵＤＰ－Ｇａｌから遊離Ｎ－アセチルグルコサミンにガラクトースを転移させ、それによってラクト－Ｎ－ビオースを生成することを可能にするβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現／過剰発現が必要である。好ましい実施形態では、この生産株は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡ及び／若しくはｐｆｋＢ並びに／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｚｗｆの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに遺伝子操作される。このさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、ラクト－Ｎ－ビオース生産のための前駆体供給（フルクトース－６－リン酸及びグルコース－６－リン酸）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。追加の実施形態では、Ｅ．コリ遺伝子ｇｌｍＳ、ｐｇｍ、ｇａｌＵ、ｇａｌＥのうちの少なくとも１つが、ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＵＤＰ－Ｇａｌの合成を促進するように過剰発現される。

【0102】

別の実施形態では、遺伝子型ｌａｃＹ^＋、ｌａｃＺ^－、ｎａｎＫＥＴＡ^－、ｎａｇＡＢ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）並びにアクセプター基質としてラクトースを使用して３’－シアリルラクトースの効果的な生産者として代謝的に操作される。したがって、記載されるＮ－アセチルノイラミン酸生産株は、異種ＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸シンテターゼ、Ｎ－アセチルノイラミン酸シンターゼ及びＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡｃからラクトースにＮ－アセチルノイラミン酸を転移させ、それによって３’－シアリルラクトースを生成することを可能にするα－２，３－シアリルトランスフェラーゼの発現によって遺伝子操作される。Ｎ－アセチルノイラミン酸の合成に関して、３’－ＳＬ生産はホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）依存性プロセスである。したがって、好ましい実施形態では、前記３’－ＳＬ生産株は、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ依存性機構を介する前記炭素及びエネルギー源の取り込みを低下及び／又は減少させることによって、例えば、グルコースＰＥＰパーミアーゼ遺伝子ｐｔｓＧ及び／又はフルクトースＰＥＰパーミアーゼ遺伝子ｆｒｕＡ及び／又はマンノースＰＥＰパーミアーゼ遺伝子ｍａｎＸＹＺの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに操作される。操作された細胞への単糖の移入を可能にするホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）トランスポーター、並びにフルクトースをフルクトース－６－リン酸に活性化し、グルコースをグルコース－６－リン酸に活性化することをそれぞれ可能にする、フルクトースキナーゼ（例えば、Ｅ．コリＷｃｓｃＫ遺伝子）及びグルコースキナーゼ（例えば、ＥコリＫ－１２ｇｌｋ遺伝子）をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現／過剰発現と共に、このさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、３’－シアリルラクトース生産のための前駆体供給（フルクトース－６－リン酸、ホスホエノールピルベート）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。

【0103】

別の実施形態では、遺伝子型ｌａｃＹ^＋、ｌａｃＺ^－、ｆｕｃＩＫ^－、ｗｃａＪ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば加水分解スクロース）並びにアクセプター基質としてラクトースを使用して３－フコシルラクトースの効果的な生産者として代謝的に操作される。したがって、Ｅ．コリ遺伝子ｍａｎＡ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ、ｇｍｄ及びｗｃａＧのうちの少なくとも１つの過剰発現並びにＧＤＰ－フコースからラクトースへフコースを転移させ、それによって３－フコシルラクトースを生成することを可能にする異種α－１，３－フコシルトランスフェラーゼの発現が必要である。好ましい実施形態では、この生産株は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡ及び／若しくはｐｆｋＢ並びに／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｚｗｆの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに遺伝子操作される。このさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、３－フコシルラクトース生産のための前駆体供給（フルクトース－６－リン酸）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。

【0104】

一実施形態では、遺伝子型ｌａｃＹ^＋、ｌａｃＺ^－、ｎａｇＢ^－、ｗｃａＪ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）並びにアクセプター基質としてラクトースを使用してラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）を効果的に生産するように代謝的に操作される。したがって、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃからラクトースにＮ－アセチルグルコサミンを転移させ、それによってラクト－Ｎ－トリオースＩＩを生成することを可能にする異種β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの発現が必要である。好ましい実施形態では、この生産株は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡ及び／若しくはｐｆｋＢ並びに／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｚｗｆの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに遺伝子操作される。このさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ生産のための前駆体供給（フルクトース－６－リン酸）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。追加の実施形態では、Ｅ．コリ遺伝子ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ及びｇｌｍＭのうちの少なくとも１つが、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ合成を促進するように過剰発現される。

【0105】

別の実施形態では、遺伝子型ｌａｃＹ^＋、ｌａｃＺ^－、ｎａｇＢ^－、ｗｃａＪ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）並びにアクセプター基質としてラクトースを使用してラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）の効果的な生産者として代謝的に操作される。したがって、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃからラクトースにＮ－アセチルグルコサミンを転移させることを可能にする異種β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、及びＵＤＰ－ガラクトースからラクト－Ｎ－トリオースＩＩにガラクトースを転移させ、それによってラクト－Ｎ－テトラオースを生成することを可能にするβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が必要である。好ましい実施形態では、この生産株は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡ及び／若しくはｐｆｋＢ並びに／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｚｗｆ並びに／又はグルコース－６－リン酸イソメラーゼ遺伝子ｐｇｉの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに遺伝子操作される。このさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、ラクト－Ｎ－テトラオース生産のための前駆体供給（フルクトース－６－リン酸及びグルコース－６－リン酸）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。追加の実施形態では、Ｅ．コリ遺伝子ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｇｌｍＭ、ｐｇｍ、ｇａｌＵ及びｇａｌＥのうちの少なくとも１つが、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＵＤＰ－Ｇａｌの合成を促進するように過剰発現される。

【0106】

別の実施形態では、遺伝子型ｌａｃＹ^＋、ｌａｃＺ^－、ｎａｇＢ^－、ｗｃａＪ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）を使用した全発酵によってラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）を効果的に生産するように代謝的に操作される。したがって、ＬＮｎＴ生産株は、操作された細胞へのグルコースの移入を可能にするホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）トランスポーターをコードする少なくとも１つの遺伝子を発現しながら、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ依存性機構を介するグルコースの取り込みを低下及び／又は減少させることによって、例えば、グルコースＰＥＰパーミアーゼ遺伝子ｐｔｓＧの発現を低下及び／又は減少させることによって遺伝子操作される。さらに、グルコキナーゼ遺伝子ｇｌｋ及び／又はグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子ｇｃｄの発現は低下及び／又は消滅する。本質的に、ＵＤＰ－ガラクトースからグルコースにガラクトースを転移させ、それによってラクトースを生成することを可能にするβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃからラクトースにＮ－アセチルグルコサミンを転移させ、それによってラクト－Ｎ－トリオースＩＩを生成することを可能にするβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、及びＵＤＰ－ガラクトースからラクト－Ｎ－トリオースＩＩにガラクトースを転移させ、それによってラクト－Ｎ－ネオテトラオースを生成することを可能にするβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの異種発現が必要である。好ましい実施形態では、この生産株は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡ及び／若しくはｐｆｋＢ並びに／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｚｗｆ並びに／又はグルコース－６－リン酸イソメラーゼ遺伝子ｐｇｉの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに操作される。このさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、全発酵によるラクト－Ｎ－ネオテトラオース生産のための前駆体供給（グルコース及びフルクトース－６－リン酸及びグルコース－６－リン酸）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。追加の実施形態では、Ｅ．コリ遺伝子ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｇｌｍＭ、ｐｇｍ、ｇａｌＵ及びｇａｌＥのうちの少なくとも１つが、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＵＤＰ－Ｇａｌの合成を促進するように過剰発現される。

【0107】

別の実施形態では、遺伝子型ｌａｃＹ^－、ｌａｃＺ^－、ｆｕｃＩＫ^－、ｗｃａＪ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）を使用した全発酵によって２’－フコシルラクトースを効果的に生産するように代謝的に操作される。したがって、グルコキナーゼ遺伝子ｇｌｋ及び／又はグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子ｇｃｄの発現並びにホスホエノールピルベート：グルコースホスホトランスフェラーゼ依存性機構の活性は低下及び／又は消滅する。さらに、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）トランスポーター遺伝子は前記Ｅ．コリ株において発現又は過剰発現される。さらに、Ｅ．コリ遺伝子ｍａｎＡ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ、ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｐｇｍ、ｇａｌＵ及びｇａｌＥのうちの少なくとも１つ並びにＵＤＰ－ガラクトースからグルコースにガラクトースを転移させ、それによってラクトースを生成することを可能にする異種β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＧＤＰ－フコースからラクトースにフコースを転移させ、それによって２’－フコシルラクトースを生成することを可能にするα－１，２－フコシルトランスフェラーゼが発現／過剰発現される。好ましい実施形態では、この生産株は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡ及び／若しくはｐｆｋＢ並びに／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｚｗｆ並びに／又はグルコース－６－リン酸イソメラーゼ遺伝子ｐｇｉの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに操作される。このさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、全発酵によって２’－フコシルラクトース生産のための前駆体供給（グルコース及びフルクトース－６－リン酸及びグルコース－６－リン酸）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。

【0108】

別の実施形態では、遺伝子型ｌａｃＹ^＋、ｌａｃＺ^－、ｆｕｃＩＫ^－、ｗｃａＪ^－、ｍａｎＡ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）並びにアクセプター基質としてラクトースを使用して２’，３－ジ－フコシルラクトースの効果的な生産者として代謝的に操作される。したがって、フルクトキナーゼ活性を示す遺伝子（例えば、Ｅ．コリＫ－１２ｍａｋ遺伝子）の発現及びホスホエノールピルベート：フルクトースホスホトランスフェラーゼ依存性機構の活性は低下及び／又は消滅する。この細胞は、操作された細胞へのフルクトースの移入を可能にするホスホエノールピルベート：フルクトースホスホトランスフェラーゼ非依存性（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）トランスポーター、フルクトースからマンノースへの転換を可能にするマンノースイソメラーゼ（例えば、Ｅ．コリＢＬ２１ｙｉｈＳ、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）Ｍ－１ ｍａｎＩ）、マンノースをマンノース－６－リン酸に活性化することを可能にするマンノキナーゼ（例えば、プレボテラ・ブリアンティー（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｙａｎｔｉｉ）Ｂ_１４ ｍａｎＫ、アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）株ＫＭ ｍａｎＫ）、並びにＧＤＰ－フコースからラクトース及び／又は２’－フコシルラクトース及び／又は３－フコシルラクトースにフコースを転移させ、それによって２’３－ジフコシル－ラクトースを生成することを可能にするα－１，２－及び／又はα－１，３－フコシル－トランスフェラーゼ活性を示す少なくとも１つの異種フコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現／過剰発現によってさらに遺伝子操作される。これらのさらなる遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、２’３－ジフコシルラクトース生産のための前駆体供給（マンノース／マンノース－６－リン酸）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース）での操作された生産株の培養が可能となる。追加の実施形態では、Ｅ．コリ遺伝子ｍａｎＣ、ｍａｎＢ、ｇｍｄ及びｗｃａＧのうちの少なくとも１つの過剰発現が、ＧＤＰ－Ｆｕｃの合成を促進するように過剰発現される。

【0109】

マンノースイソメラーゼ（ＭａｎＩ）活性又はマンノキナーゼ（ＭａｎＫ）活性を示す適切なタンパク質についての非限定的な例は文献（Ｈｉｒｏｓｅら、Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１ Ｍａｒ；６５（３）：６５８～６１．；Ｈｉｒｏｓｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．２００３ Ｆｅｂ；２５（４）：３４９～５２．；Ｐａｔｅｌら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ Ｍａｙ；７７（１０）：３３４３～５０．；Ｈｕら、Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌ．２０１６ Ａｕｇ；８９：３２８～３５．；Ｈｕａｎｇら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８ Ｍａｒ；１０２（５）：２０５１～２０６２．；Ｍｕｋａｉら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３ Ｊｕｌ；６９（７）：３８４９～５７．；Ｆｉｅｌｄｓ及びＲｕｓｓｅｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００１ Ａｐｒ；１４７（Ｐｔ ４）：１０３５～４３．；Ｋｒｏｓｃｈｅｗｓｋｉら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２０００ Ｊａｎ ５；１０５（１）：７１～８０．）に見出され得る。

【0110】

別の実施形態では、遺伝子型ｎａｇＡＢ^－、ｆｕｃＩＫ^－、ｗｃａＪ^－を有するＥ．コリ株は、主な炭素及びエネルギー源として混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース及び加水分解ラクトースの混合物）を使用した全発酵によってＨ抗原Ｉ型（ＨＡ－ＴＩ）の効果的な生産者として代謝的に操作される。したがって、生産株は、操作された細胞へのグルコース及び／又はガラクトースの移入並びにこれらの単糖からリン酸化形態への活性化をそれぞれ可能にする、非ＰＥＰ－ＰＴＳトランスポーター並びに単糖キナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を発現／過剰発現させながら、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ依存性機構を介してグルコースの取り込みを低下及び／又は減少させることによって遺伝子操作される。さらに、アセチル－ＣｏＡからグルコサミン－６－リン酸にアセテートを転移させ、それによってＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸を生成することを可能にするグルコサミン－６－リン酸アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸を脱リン酸化し、それによってＮ－アセチルグルコサミンを生成することを可能にするＨＡＤ様糖リン酸、ＵＤＰ－ガラクトースからＮ－アセチルグルコサミンにガラクトースを転移させ、それによってラクト－Ｎ－ビオースを生成することを可能にする異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＧＤＰ－フコースからラクト－Ｎ－ビオースにフコースを転移させ、それによってＨ抗原Ｉ型を生成することを可能にするα－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が発現／過剰発現される。好ましい実施形態では、この生産株は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢの発現を低下及び／又は減少させることによってさらに遺伝子操作される。これらの遺伝子修飾により、株の代謝を妨げることを阻止するが、Ｈ抗原Ｉ型生産のための前駆体供給（Ｎ－アセチルグルコサミン、フルクトース－６－リン酸及びガラクトース－１－リン酸）を増大させながら、主な炭素及びエネルギー源としての混合単糖原料（例えば、加水分解スクロース及び加水分解ラクトースの混合物）での操作された生産株の培養が可能となる。追加の実施形態では、Ｅ．コリ遺伝子ｇｌｍＳ、ｇａｌＴ、ｇａｌＥ、ｍａｎＣ、ｍａｎＢ、ｇｍｄ及びｗｃａＧのうちの少なくとも１つが、ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＵＤＰ－Ｇａｌ及び／又はＧＤＰ－Ｆｕｃの合成を促進するように過剰発現される。

【0111】

図１は、例示的な天然の微生物細胞を概略的に示す。前記微生物細胞は、グルコース及びフルクトースからなる混合原料を消費し、グルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸のわずかな細胞内プールをもたらすことができる。微生物細胞は、細胞へのグルコース及びフルクトース（ＰＴＳ）の取り込みのためのホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系をコードするポリヌクレオチドを発現する。反応生成物は主に解糖系に入る。

【0112】

図２は、グルコース及びフルクトースからなる混合原料で培養された場合、グルコース－６－リン酸を高度に供給することができる本発明の例示的な微生物細胞を概略的に示す。グルコース－６－リン酸イソメラーゼＰｇｉ及び／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼＺｗｆの発現は、ｐｇｉ及び／又はｚｗｆ遺伝子の欠失、機能的不活性化又はサイレンシングによって低下又は減少しているため、細胞へのグルコースの取り込みによって生成されたあらゆるグルコース－６－リン酸は、ＵＤＰ－Ｇｌｃ及び／又はＵＤＰ－Ｇａｌを生成するために微生物細胞によって利用され得る。微生物細胞のバリアントにおいて（図３）、フルクトースについての細胞のホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系が、例えばｆｒｕＡ遺伝子の欠失によって無効になっている。代わりに、フルクトースは、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）トランスポーターを介して細胞に入り、フルクトースキナーゼ（例えば、Ｅ．コリＷＣｓｃＫ）によって活性化されてフルクトース－６－リン酸になっている。微生物細胞のバリアントにおいて（図４）、グルコースについての細胞のホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系もまた、例えばｐｔｓＧ遺伝子の欠失によって無効になっている。代わりに、グルコースは、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）トランスポーターを介して細胞に入り、グルコースキナーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２Ｇｌｋ）によって活性化されてグルコース－６－リン酸になっている。

【0113】

図５は、グルコース及びフルクトースからなる混合原料で培養された場合、グルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸をより高度に供給することができる本発明の例示的な微生物細胞を概略的に示す。フルクトースについての細胞のホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系は、例えばｆｒｕＡ遺伝子の欠失によって無効になっている。代わりに、フルクトースは、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）トランスポーターを介して細胞に入り、フルクトースキナーゼ（例えば、Ｅ．コリＷＣｓｃＫ）によって活性化されてフルクトース－６－リン酸になっている。微生物細胞のバリアントにおいて（図６）、ホスホフルクトキナーゼＰｆｋ及び／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼＺｗｆの発現は、ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ及び／又はｚｗｆ遺伝子の欠失、機能的不活性化又はサイレンシングによって低下又は減少し、グルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸の増大したアベイラビリティを生じ、このグルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸は、ＵＤＰ－Ｇａｌ及び／又はＧＤＰ－Ｆｕｃ及び／又はＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生成するために微生物細胞によって利用され得る。微生物細胞のバリアントにおいて（図７）、細胞は、細胞へのグルコース及びフルクトース（ＰＴＳ）の取り込みのためにホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系をコードするポリヌクレオチドを発現する。ホスホフルクトキナーゼＰｆｋ及び／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼＺｗｆの発現は、ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ及び／又はｚｗｆ遺伝子の欠失、機能的不活性化又はサイレンシングによって低下又は減少し、グルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸の増大したアベイラビリティを生じる。

【0114】

図８は、グルコース及びフルクトースからなる混合原料で培養された場合、グルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸をより高度に供給することができる本発明の例示的な微生物細胞を概略的に示す。細胞は、細胞へのグルコース及びフルクトース（ＰＴＳ）の取り込みのためにホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系をコードするポリヌクレオチドを発現する。ホスホフルクトキナーゼＰｆｋ及び／又はグルコース－６－リン酸イソメラーゼＰｇｉ及び／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼＺｗｆの発現は、ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ及び／又はｐｇｉ及び／又はｚｗｆ遺伝子の欠失、機能的不活性化又はサイレンシングによって低下又は減少している。フルクトース－１，６－ビスリン酸（例えば、ｇｌｐＸ、ｆｂｐ）の過剰発現と共に、グルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸の増大したアベイラビリティが生じ、ＵＤＰ－Ｇａｌ及び／又はＧＤＰ－Ｆｕｃ及び／又はＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生成するために微生物細胞によって利用され得る。

【0115】

図９は、グルコース及びフルクトースからなる混合原料で培養された場合、グルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸及びホスホエノールピルベートの高いアベイラビリティを生じることができる本発明の例示的な微生物細胞を概略的に示す。グルコース及びフルクトースについての細胞のホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系は、それぞれ、例えばｐｔｓＧ及びｆｒｕＡ遺伝子の欠失によって無効になっている。代わりに、フルクトース及びグルコースは、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）トランスポーターを介して細胞に入り、フルクトースキナーゼ（例えば、Ｅ．コリＷＣｓｃＫ）及びグルコースキナーゼ（例えば、Ｅ．コリＫ－１２Ｇｌｋ）によって活性化されて、それぞれフルクトース－６－リン酸及びグルコース－６－リン酸になっている。さらに、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系によるＰＥＰ消費は回避される。ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ及び／又はｚｗｆ遺伝子の欠失、機能的不活性化又はサイレンシングによって実現される、ホスホフルクトキナーゼＰｆｋ及び／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼＺｗｆの低下及び／又は減少した発現と共に、グルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸及びホスホエノールピルベートの増大したアベイラビリティが達成される。これは、ＵＤＰ－Ｇａｌ及び／又はＧＤＰ－Ｆｕｃ及び／又はＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生成するために微生物細胞によって利用され得る。

【0116】

図１０は、グルコース及びフルクトースからなる混合原料で培養された場合、遊離グルコース及びグルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸の増大したアベイラビリティを生じることができる本発明の別の例示的な微生物細胞を概略的に示す。グルコース及びフルクトースについての細胞のホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系は、それぞれ、例えばｐｔｓＧ及びｆｒｕＡ遺伝子の欠失によって無効になっている。代わりに、フルクトース及びグルコースは、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）トランスポーターを介して細胞に入る。ｇｌｋ遺伝子の欠失と共に、遊離グルコースモノマーが細胞内で利用可能になるように微生物細胞は遺伝子操作されている。代わりに、フルクトースはフルクトースキナーゼ（例えば、Ｅ．コリＷＣｓｃＫ）によって活性化されてフルクトース－６－リン酸になっている。ホスホフルクトキナーゼＰｆｋ及び／又はグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼＺｗｆの発現は、ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ及び／又はｚｗｆ遺伝子の欠失、機能的不活性化又はサイレンシングによって低下又は減少している。全体として、これにより、遊離グルコース及びグルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸の改善された細胞内供給が生じる。グルコースは種々のグリコシル化反応のための基質として利用可能になるのに対して、グルコース－６－リン酸及びフルクトース－６－リン酸は、ＵＤＰ－Ｇａｌ及び／又はＧＤＰ－Ｆｕｃ及び／又はＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生成するために微生物細胞によって利用され得る。

【0117】

さらに、ホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系によるＰＥＰ消費が回避される。

【0118】

図１１は、グルコース及びフルクトースからなる混合原料で培養した場合、遊離マンノース及び／又はマンノース－６－リン酸の増大した細胞内アベイラビリティを達成することができる本発明の別の例示的な微生物細胞を概略的に示す。フルクトースについての細胞のホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系は、例えばｆｒｕＡ遺伝子及び／又はｍａｎＸＹＺ遺伝子の欠失によって無効になっている。代わりに、フルクトースは糖パーミアーゼ及び／又はチャネルを介して細胞に入る。フルクトースキナーゼ活性（例えば、ｍａｋ）及び／又はマンノース－６－リン酸イソメラーゼ活性（例えば、ｍａｎＡ）を示す遺伝子の欠失並びに適切なマンノースイソメラーゼ（ＭａｎＩ）及びマンノキナーゼ（ＭａｎＫ）の発現／過剰発現と共に、微生物細胞は、マンノース－６－リン酸が細胞内で利用可能になるように遺伝子操作されている。これは、ＧＤＰ－Ｍａｎ及び／又はＧＤＰ－Ｆｕｃを生成するために微生物細胞によって利用され得る。

【0119】

図１２は、グルコースとフルクトース及びガラクトースからなる混合原料で培養した場合、遊離フルクトース－６－リン酸及び／又はガラクトース－１－リン酸のより高い細胞内アベイラビリティを生じることができる本発明の別の例示的な微生物細胞を概略的に示す。グルコースについての細胞のホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ系は、例えばｐｔｓＧ遺伝子の欠失によって無効になっている。代わりに、グルコースはホスホエノールピルベート：糖ホスホトランスフェラーゼ非依存性（非ＰＥＰ－ＰＴＳ）トランスポーターを介して細胞に入る。ホスホフルクトキナーゼＰｆｋの発現は、ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ遺伝子の欠失、機能的不活性化又はサイレンシングによって低下又は減少している。操作された細胞へのガラクトースの移入並びにガラクトースからガラクトース－１－リン酸への活性化をそれぞれ可能にする、適切な非ＰＥＰ－ＰＴＳトランスポーター及び単糖キナーゼの発現／過剰発現と共に、微生物細胞は、フルクトース－６－リン酸及びガラクトース－１－リン酸が細胞内で利用可能になるように遺伝子操作されている。これらは、ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＧＤＰ－Ｆｕｃ及び／又はＵＤＰ－Ｇａｌ及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生成するために微生物細胞によって利用され得る。

【0120】

第４の態様によれば、医薬組成物及び／又は栄養組成物における所望の炭水化物の使用であって、目的の炭水化物が、好ましくは、本発明による方法又は遺伝子操作された宿主細胞によって生産される、使用が提供される。

【実施例】

【0121】

［実施例１］ 混合単糖原料の調製
５０％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を、５００ｇのスクロースを水中に溶解することによって調製した。溶液の最終容量は１リットルであった。３０℃～３５℃の温度で、９６％（ｖ／ｖ）硫酸を使用することによってｐＨを調整した。その後、溶液を、１２１℃にて４５分間、垂直オートクレーブ（Ｓｙｓｔｅｃ ＶＸ－６５、Ｌｉｎｄｅｎ、ドイツ）において滅菌した。試料を加熱滅菌の前後に採取し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析まで凍結保存した。ＨＰＬＣを、ＲＩＤ－１０Ａ屈折率検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ）及びＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣシステムに接続したＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅ Ｃｏｌｕｍｎ ３．５μｍ（２５０×４．６ｍｍ）（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、ドイツ）を使用して実行した。３０％溶媒Ａ（二重蒸留水中の５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＨ４ＯＨ）及び７０％溶媒Ｂ（二重蒸留水中の８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＨ４ＯＨ）を用いて３５℃及び流速１．４ｍＬ／分で定組成溶離を実行した。イオン交換マトリクス（Ｓｔｒａｔａ ＡＢＷ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で固相抽出により試料を洗浄した。１０マイクロリットルの試料（１：５の希釈）をカラムに適用した。最後に、検出された糖の相対量を決定した。表２に示すように、単糖グルコース及びフルクトースへのスクロース変換は、加熱処理前の溶液のｐＨ値の低下と共に増大した。硫酸で酸性化を実行した場合、完全なスクロース切断をｐＨ値≦３．５０で観察することができた。

【0122】

【表2】

【0123】

［実施例２］ 種々の遺伝子欠失株の原料依存性成長
Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）株（野生型）並びに突然変異株Ｅ．コリｐｆｋＡ^－（ΔｐｆｋＡ）、Ｅ．コリｐｆｋＢ^－（ΔｐｆｋＢ）、Ｅ．コリｐｆｋＡ^－ ｐｆｋＢ^－（ΔｐｆｋＡ ΔｐｆｋＡ）の成長挙動を比較した。Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６６４０～６６４５（２０００））に従ってゲノム欠失を実施した。全ての株は、１ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（５４．４ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム、９．８ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１ｇ／ＬのＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１．９ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３、９ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１．１ｇ／ＬのＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＮａ_２ＳｅＯ_３、１．５ｇ／ＬのＮｉＳＯ_４・６Ｈ_２Ｏ）を補充した、７ｇ／ＬのＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、７ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、２ｇ／ＬのＫＯＨ、０．３ｇ／Ｌのクエン酸、２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ及び０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを含有し、炭素源として２％（ｍ／ｖ）グルコース（Ａ）又は１％（ｗ／ｖ）グルコース／１％（ｗ／ｖ）フルクトース（Ｂ）のいずれかを含有する２０ｍＬの無機塩培地を満たした１００ｍｌ振盪フラスコ中に３０℃で培養した。培養物をＯＤ０．１まで接種し、成長発達をＯＤ_６００測定によって２６時間にわたってモニターした。図２に示すように、Ｅ．コリｐｆｋＡ^－ ｐｆｋＢ^－は、グルコースを唯一の炭素及びエネルギー源として提供した場合、ほとんど成長を示さなかったが、その成長は、混合単糖原料が利用可能であった場合の野生型株及び単一欠失変異体と区別できなかった。

【0124】

［実施例３］ 操作されたＥ．コリ株による２’－フコシルラクトースの生産
遺伝子型ｌａｃＹ^＋、ｌａｃＺ^－、ｆｕｃＩＫ^－、ｗｃａＪ^－、ｐｆｋＡ^－を示すＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を、ＧＤＰ－フコース（ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ）、Ｅ．コリ：Ｏ１２６由来の２’－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｗｂｇＬ、エルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）ＡＴＣＣ ４３９７０由来の糖流出トランスポーターｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０、及びスクロースパーミアーゼ、フルクトキナーゼ、スクロースヒドロラーゼについての遺伝子を含むＥ．コリＷのｃｓｃ遺伝子クラスター（受託番号ＣＰ００２１８５．１）並びに転写リプレッサー（それぞれ、遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲ）のデノボ合成のための酵素を過剰発現することによってさらに遺伝子操作し、株が唯一の炭素源としてスクロースで成長することを可能にした。Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６６４０～６６４５（２０００））に従ってゲノム欠失を実施した。異種遺伝子のゲノム組み込みは転位によって実施した。ＥＺ－Ｔｎ５ＴＭトランスポザーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ＵＳＡ）を使用して線状ＤＮＡ断片を組み込んだ又はマリナートランスポザーゼＨｉｍａｒ１の高活性なＣ９突然変異体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９９、ＵＳＡ ９６：１１４２８～１１４３３）を転位のために利用した。遺伝子をＥ．コリでの発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの協力によって合成して調製した。得られた株を、１ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（５４．４ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム、９．８ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２×４Ｈ_２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＣｏＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ、１ｇ／ＬのＣｕＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ、１．９ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３、９ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、１．１ｇ／ＬのＮａ_２ＭｏＯ_４ ２Ｈ_２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＮａ_２ＳｅＯ_３、１．５ｇ／ＬのＮｉＳＯ_４×６Ｈ_２Ｏ）と共に３ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、１２ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、５ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．３ｇ／Ｌのクエン酸、２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＮａＣｌ及び０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏを含有し、炭素源として２％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｍ／ｖ）滅菌濾過スクロース又は２％スクロース加水分解物を含有する、２０ｍＬの無機塩培地を満たした１００ｍＬ振盪フラスコ中に３０℃で培養した。さらに、１５ｍＭラクトースを加え、２’－フコシルラクトース生産のためのアクセプター基質として得た。培養物をＯＤ０．１まで接種し、培養を２６時間後に中止した。培養ブロス中の２’－ＦＬを定量するために、屈折率検出器（ＲＩＤ－１０Ａ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ）及びＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ）に接続したＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅ Ｃｏｌｕｍｎ３．５μｍ（２５０×４．６ｍｍ）（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、ドイツ）を使用してＨＰＬＣ分析を実施した。溶離を、溶離液としてｄｄＨ_２Ｏ中の３０％Ａ：５０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＨ_４ＯＨ及びｄｄＨ_２Ｏ中の７０％Ｂ：８０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＨ_４ＯＨ（ｖ／ｖ）を用いて、３５℃及び１．４ｍｌ／分の流速で、均一濃度で実施した。培養上清を滅菌濾過し（０．２２μｍ孔径）、イオン交換マトリクス（Ｓｔｒａｔａ ＡＢＷ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上での固相抽出によって洗浄した。１０μｌの試料をカラムに適用し、２’－フコシルラクトース濃度を標準曲線に従って計算した。グリセロールでの成長の間の操作した株の生産性を１００％に設定した。表３に示すように、スクロース加水分解物を炭素及びエネルギー源として提供した場合、２’－ＦＬ生産が最も高かった。

【0125】

【表3】

【0126】

［実施例４］ 混合単糖原料での成長の間の操作されたＥ．コリ株による２’－フコシルラクトースの全発酵
遺伝子型ｐｆｋＡ^－、ｌａｃＺ^－、ｆｕｃＩＫ^－、ｗｃａＪ^－、ｇｌｋ^－、ｇｃｄ^－、ｐｔｓＧ^－を示すＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を、ＧＤＰ－フコース（ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ）、Ｅ．コリ：Ｏ１２６由来の２’－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｗｂｇＬ、エルシニア・ベルコビエリＡＴＣＣ ４３９７０由来の糖流出トランスポーター遺伝子ｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０、ザイモモナス・モビリス由来のグルコース促進遺伝子ｇｌｆ、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＣ０４６８６）由来のβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ｇａｌＴｐｍ１１４１並びにＵＤＰ－グルコース４－エピメラーゼ及びホスホグルコムターゼをそれぞれコードするＥ．コリ遺伝子ｇａｌＥ及びｐｇｍのデノボ合成のための酵素を過剰発現することによってさらに遺伝子操作した。Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６６４０～６６４５（２０００））に従ってゲノム欠失を実施した。異種遺伝子のゲノム組み込みは転位によって実施した。ＥＺ－Ｔｎ５ＴＭトランスポザーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ＵＳＡ）を使用して線状ＤＮＡ断片を組み込んだ又はマリナートランスポザーゼＨｉｍａｒ１の高活性なＣ９突然変異体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９９、ＵＳＡ ９６：１１４２８～１１４３３）を転位のために利用した。遺伝子をＥ．コリでの発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの協力によって合成して調製した。

【0127】

得られたＥ．コリ株を、１ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（５４．４ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム、９．８ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２×４・Ｈ_２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＣｏＣｌ_２×６・Ｈ_２Ｏ、１ｇ／ＬのＣｕＣｌ_２×２・Ｈ_２Ｏ、１．９ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３、９ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４×７・Ｈ_２Ｏ、１．１ｇ／ＬのＮａ_２ＭｏＯ_４×２・Ｈ_２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＮａ_２ＳｅＯ_３、１．５ｇ／ＬのＮｉＳＯ_４×６・Ｈ_２Ｏ）を補充した、７ｇ／ＬのＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、７ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、２ｇ／ＬのＫＯＨ、０．３ｇ／Ｌのクエン酸、２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４×７・Ｈ_２Ｏ及び０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ_２×６・Ｈ_２Ｏを含有し、炭素源として２％（ｍ／ｖ）加水分解スクロースを含有する１０００ｍＬの無機塩培地から開始して３Ｌ発酵槽（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）中で３０℃にて培養した。同じ培地中で成長させたプレ培養物からの２．５％（ｖ／ｖ）接種材料の添加から培養を開始した。バッチ相の終わりを、溶存酸素レベルの上昇によって特徴付けた。２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４×７・Ｈ_２Ｏ、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ_２×６・Ｈ_２Ｏ及び１ｍＬ／Ｌの微量元素溶液を補充した、完全に加水分解したスクロースからなる炭素供給を、バッチ相を離れた直後に適用した。開始容量を参照して、１２．０～１５．０ｍＬ／Ｌ／時の供給速度を適用した。通気を３Ｌ／分で維持した。溶存酸素を、撹拌速度を制御することによって２０～３０％の飽和で維持した。ｐＨを、２５％アンモニア溶液を添加することによって６．７で維持した。培養を８６時間継続し、培養上清中に十分な量の２’－ＦＬを得た。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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