知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-23
(45)【発行日】2025-01-07
(54)【発明の名称】新規リガンドアッセイ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6897 20180101AFI20241224BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241224BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20241224BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6897 Z ZNA
C12N15/12
C12N15/115 Z
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021565946
(86)(22)【出願日】2020-05-07
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-08
(86)【国際出願番号】 NZ2020050046
(87)【国際公開番号】W WO2020226513
(87)【国際公開日】2020-11-12
【審査請求日】2023-05-02
(31)【優先権主張番号】753245
(32)【優先日】2019-05-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】NZ
(73)【特許権者】
【識別番号】521330482
【氏名又は名称】インサイチュジェン・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＩＴＵＧＥＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ヘザー，アリソン・ケイ
(72)【発明者】
【氏名】サワビー，スティーブン・ジョン
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】米国特許第０５９４５２７９（ＵＳ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／１９８０１３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Amy B. Cadwallader et al.，Journal of Analytical Toxicology，2011年，Vol. 35, No.9，pp. 594-607
【文献】Elliot R. Cooper et al.，Sensors，2013年，Vol. 13, No. 2，pp. 2148-2163
【文献】Khalid K. Alam et al.，bioRxiv [online]，2019年05月02日，インターネット＜ＵＲＬ：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/619296v2.full.pdf＞, ［検索日2024年4月25日］
【文献】Sukanya Iyer et al.，ACS Synth. Biol.，2014年，Vol. 3，pp. 340-346
【文献】Steven Lukman et al.，ACS Appl. Mater. Interfaces，2013年，Vol. 5，pp. 12725-12734
【文献】Mary Szatkowski Ozers et al.，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，1997年，Vol. 272, No. 48，pp. 30405-30411
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、試料中のリガンドを検出するためのアッセイ方法であって、（ｉ）試料を、
（ａ）前記試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成するステロイドホルモン受容体、
（ｂ）核酸分子であって、
（１）ポリメラーゼプロモーター配列、
（２）前記リガンド－受容体複合体によって結合される応答要素、および
（３）レポーター構築物を含み、
前記応答要素（２）が、前記プロモーター配列（１）と前記レポーター構築物（３）との間に位置し、（１）、（２）、および（３）が、操作可能に連結されている、核酸分子、
（ｃ）単一のポリペプチドからなるポリメラーゼ、
（ｄ）ヌクレオシド三リン酸、と接触させるステップと、
（ｉｉ）前記リガンド－受容体複合体が前記応答要素に結合することによって引き起こされる前記レポーター構築物の転写の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
前記レポーター構築物の転写の測定された低減または阻害が、前記試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法。
【請求項2】
熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子を試料と接触させることをさらに含む、請求項１に記載のアッセイ方法。
【請求項3】
ステロイドホルモン受容体に対するＨＳＰ９０の比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）が、ｘ：１であり、ｘが、ＨＳＰ９０の量であり、［１．０≦ｘ≦５．０］として定義される、請求項２に記載のアッセイ方法。
【請求項4】
核酸分子に対するステロイドホルモン受容体の比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）が、ｙ：１であり、ｙが、ステロイドホルモン受容体の量であり、［７．０≦ｙ≦１０．０］として定義される、請求項１～３のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項5】
前記ポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項6】
前記ポリメラーゼプロモーター配列が、配列番号１によって定義される、請求項５に記載のアッセイ方法。
【請求項7】
前記レポーター構築物が、フルオロフォアに結合することが可能であるＲＮＡアプタマーをコードする配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項8】
前記ＲＮＡアプタマーが、Ｍａｎｇｏ Ｉ、Ｍａｎｇｏ ＩＩ、Ｍａｎｇｏ ＩＩＩ及びＭａｎｇｏ ＩＶ、Ｓｐｉｎａｃｈ、ｉＳｐｉｎａｃｈ、ベビーＳｐｉｎａｃｈ、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ及びＭａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎから選択される、請求項７に記載のアッセイ方法。
【請求項9】
前記ＲＮＡアプタマーが、Ｍａｎｇｏ ＩＩであって、Ｆ３０足場を含む、請求項７に記載のアッセイ方法。
【請求項10】
前記ステロイドホルモン受容体が、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、エストロゲン受容体アルファ（ＥＲ－α）およびエストロゲン受容体ベータ（ＥＲ－β）、プロゲステロン受容体Ａ（ＰＲＡ）およびプロゲステロン受容体Ｂ（ＰＲＢ）、鉱質コルチコイド受容体（ＭＲ）、ならびにグルココルチコイド受容体（ＧＲ）からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項11】
前記応答要素が、ａ．５’－ＡＧＡＡＣＡｎｎｎＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号４）（ｎが、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）の配列を含む、アンドロゲン応答要素（ＡＲＥ）、
ｂ．５’－ＡＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣＴ－３’（配列番号８）（ｎが、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）の配列を含む、エストロゲン応答要素（ＥＲＥ）、
ｃ．５’－ＧＧＴＡＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１０）の配列を含む、プロゲステロン応答要素（ＰＲＥ）、
ｄ．５’－ＡＧＡＡＣＡｎＡＡＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１２）（ｎが、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）の配列を含む、鉱質コルチコイド応答要素（ＭＲＥ）、及び／又は
ｅ．５’－ＡＧＡＡＣＡｎＡＡＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１２）（ｎが、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）の配列を含む、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項12】
（ｉ）アンドロゲン受容体に結合するリガンドを検出するように構成され、前記核酸分子が、配列番号１４によって定義される配列を含むか；（ｉｉ）エストロゲン受容体に結合するリガンドを検出するように構成され、前記核酸分子が、配列番号１５によって定義される配列を含むか；
（ｉｉｉ）プロゲステロン受容体に結合するリガンドを検出するように構成され、前記核酸分子が、配列番号１６によって定義される配列を含むか；
（ｉｖ）鉱質コルチコイド受容体に結合するリガンドを検出するように構成され、前記核酸分子が、配列番号１７によって定義される配列を含むか；又は
（ｖ）グルココルチコイド受容体に結合するリガンドを検出するように構成され、前記核酸分子が、配列番号１８によって定義される配列を含む、
請求項１～１１のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項13】
核酸分子が、配列番号１９～７３によって定義される配列のいずれかを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
【請求項14】
アスリートのドーピング状態を決定するための方法であって、前記アスリートから得た試料に、請求項１～１３のいずれか一項に記載のアッセイ方法を実施して、前記試料が、ステロイドホルモン受容体に結合し、かつそれを活性化し、かつ前記レポーター構築物の転写における低減又は阻害を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、前記レポーター構築物の転写における低減又は阻害が、前記アスリートの前記ドーピング状態についての情報を提供する、方法。
【請求項15】
前記アスリートが、ヒトアスリート、ウマアスリート、イヌアスリート、およびラクダアスリートから選択される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、試料中のリガンドを検出するためのアッセイ、方法、および試験キットに関する。特に、本発明は、ステロイドホルモン受容体と複合体を形成して、ステロイドホルモン特異的ゲノム応答を誘発する能力を特徴とするリガンドの存在について試験試料をスクリーニングするためのアッセイ、方法、および試験キットを提供する。
【背景技術】
【0002】
ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの検出は、生化学、分子生物学、および医学の多くの分野で重要である。そのようなリガンドとしては、内因性ステロイド、外因性ステロイド、非ステロイド分子、および合成分子が挙げられる。例えば、血清または血漿中の総ホルモン生理活性の決定は、加齢、閉経周辺期、閉経、低アンドロゲン症、高アンドロゲン症、ホルモン補充療法、乳がんおよび前立腺がんを含む内分泌がんを含むヒトの健康関連状態、骨粗鬆症および肝臓毒性、不規則な月経、多嚢胞性卵巣症候群、性的発達の障害および不妊症を含む他のホルモン関連状態を監視するのに重要である。アンドロゲン／エストロゲンおよび抗アンドロゲン／抗エストロゲン分子の従来の検出方法では、ホルモンの生物学的活性についての情報は提供されない。ホルモンの生物学的活性は、適切な治療／介入を実施することができるように、健康状態を推進している根本的なメカニズムを理解するための重要な測定値である。
【0003】
試料中のホルモン生理活性の検出はまた、違法なヒトおよび動物のパフォーマンス向上、怪我の隠蔽、補助食品および食品の偽和、乳業における成長促進剤、ならびに環境汚染物質の監視に重要である。ホルモン生理活性を測定することによって、体内の内分泌経路を調節し、それによってヒトの健康に影響を与える可能性がある汚染物質および／または偽和物についての情報が提供される。
【0004】
ステロイドホルモンゲノム応答を誘発するリガンドは、まず、真核生物細胞の細胞質または核内でステロイドホルモン受容体タンパク質と複合体を形成して活性化受容体タンパク質を形成することによって、ステロイドホルモン受容体タンパク質を活性化する。リガンドは、受容体タンパク質の補因子を移動させ、次いでＤＮＡ結合モチーフを露出させる。活性化受容体タンパク質は、第２の活性化受容体タンパク質と二量体化し、ＤＮＡと相互作用する必要がある場合は、応答要素と呼ばれる特定のヌクレオチド配列に結合することによって核に移行する。通常の生物学的機能では、応答要素に結合したリガンド活性化ステロイドホルモン受容体タンパク質の集合体は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが媒介する転写の開始を向上または抑止することによって遺伝子発現を調節する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、ＤＮＡテンプレートに対してヌクレオチド三リン酸を重合することによるＲＮＡ転写を触媒するために集合する、マルチサブユニットホロ酵素である。
【0005】
ステロイドホルモンゲノム応答は、ステロイドホルモン受容体タンパク質および受容体特異的応答要素、例えばアンドロゲン受容体（ＡＲ）およびアンドロゲン応答要素（ＡＲＥ）、エストロゲン受容体－α（ＥＲ－α）、エストロゲン受容体－β（ＥＲ－β）およびエストロゲン応答要素（ＥＲＥ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）およびグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）、鉱質コルチコイド受容体（ＭＲ）および鉱質コルチコイド応答要素（ＭＲＥ）、プロゲステロン受容体－Ａ（ＰＲ－Ａ）、プロゲステロン受容体－Ｂ（ＰＲ－Ｂ）、およびプロゲステロン応答要素（ＰＲＥ）に結合するリガンドによって誘導される。
【0006】
しかしながら、ステロイドホルモン受容体タンパク質に結合するすべてのリガンドが、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発するわけではない。一部のリガンドは、Ｇタンパク質の活性化などの、セカンドメッセンジャーのシグナル伝達を特徴とする非ゲノム応答を誘発する。そのような非ゲノム応答は、リガンド結合から数秒から数分以内に生じ、典型的なステロイドホルモン応答ではない。
【0007】
試料中のリガンドの存在を検出する一般的な方法は、その試料内で直接リガンドを測定することである。しかしながら、試料は、分子の複雑な混合物であることが多く、典型的には、分析のための準備の複雑なプロセスを必要とする。試料中のリガンド（複数可）の存在の検出は、典型的には、分子種を複雑な混合物から比較的純粋な組成の画分に分離し、次いで、質量分析法などの構造に感受性の高い方法を用いて各画分を分析する、液体またはガスクロマトグラフィーなどのプロセスに依存している。このアプローチを使用すると、任意の１つの試料で１００超のリガンドを試験することができる。自動精製システム、ガスまたは液体クロマトグラム、および質量分析計は、費用がかかり、技術的に複雑な実験機器であり、信頼できる結果を生じるには、訓練を受けた技術者が継続的に較正および操作する必要がある。別の欠点は、性ホルモン結合グロブリンまたは血清アルブミンなどのタンパク質との相互作用によって、一部のリガンドが生物学的に不活性になる場合があり、この手法では、リガンドの生物学的に活性な画分と不活性な画分とが区別されないことである。また、イオン化のプロセスは、いくつかのステロイド分子の崩壊をもたらし得るので、そのような手法を使用して測定することができない。加えて、この手法では、すべての既知のリガンドを特定することができないとき、複数のリガンドから試料の総生物学的活性についての情報が提供されないか、またはリガンドを特定することができる場合、活性が相加的、相乗的、もしくはさらには競合的であるかどうかは不明である。さらに、試料中のリガンド（複数可）の存在の信頼できる同定を達成するには、、リガンド（複数可）およびリガンド（複数可）の生物学的代謝に起因するその関連代謝産物（複数可）の分子構造に関する事前の知識が必要とされる。
【0008】
試料中のステロイドホルモンリガンドの存在を検出する別の一般的な方式は、ラジオイムノアッセイおよび酵素結合免疫吸着測定アッセイなどの免疫学的技法に基づく生物学的アッセイを使用することである。免疫学的技法の制限は、リガンドを直接検出するか、または性ホルモン結合グロブリンに結合したリガンドを検出するための抗体分子が要件であることである。免疫学的アッセイは、アッセイの異なる製造業者によって生成された抗体分子の高度な変動性に起因して、再現性に欠ける。
【0009】
試料中のリガンドの検出に関する制限を克服するために、リガンドがステロイドホルモン受容体タンパク質に結合し、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発する、細胞に基づくステロイドホルモンアッセイが開発された。これらのアッセイでは、ステロイドホルモン受容体が活性化され、レポーター遺伝子のＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写が増加され、次いで、これがタンパク質に翻訳された後に、試料中のリガンドの存在が検出される。最も一般的には、レポーター遺伝子は、特定の基質の存在下で光または比色反応を誘発するであろう蛍光タンパク質（ＧＦＰなど）または酵素をコードする。
【0010】
しかしながら、これらの細胞に基づくアッセイには、生細胞培養を維持するための特殊な設備および専門知識を必要とするという点で、関連する顕著な制限がある。これは、細胞に基づく試験の費用を増加させ、これらの方法のハイスループットな適用を低減する。加えて、生細胞の分子の複雑さが高レベルであることによって試験が困難になり、特異性および再現性の両方が低減される。
【0011】
細胞に基づくアッセイを使用して試料中のリガンドを検出することの限界を克服するために、リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、試料中のリガンドを検出する無細胞システムが開発された。
【0012】
しかしながら、無細胞アッセイの制限は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩなどのマルチサブユニットホロ酵素ポリメラーゼの使用を要件とすることである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩの組み換え産生は、再現性が変動し達成するのが非常に困難であり、その結果、ホロ酵素は、典型的には、すべての構成要素が存在し、プロモーター配列で一緒になる核抽出物を使用することによって利用可能になる。しかしながら、真核細胞から核抽出物を調製することは、高価な細胞増殖培地、および核の材料を濃縮するために必要な技術的専門知識の必要性が理由で、製造に費用がかかる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
具体的には、本発明は、単一のポリペプチドポリメラーゼ、ステロイドホルモン受容体タンパク質に結合するリガンドによって活性化されるのではなく低減または阻害されるその活性に関与する、試験キット、アッセイ、および方法を提供する。
【0014】
［発明の概要］
本明細書に記載および特許請求される発明は、限定されないが、この発明の概要に記載または説明または参照されるものを含む、多くの属性および例を有する。これは包括的であることを意図するものではなく、本明細書に記載および請求される発明は、制限ではなく説明のみを目的として含まれる、この発明の概要に特定された特色または例に限定されない。
本明細書に記載および特許請求される発明は、限定されないが、この発明の概要に記載または説明または参照されるものを含む、多くの属性および例を有する。これは包括的であることを意図するものではなく、本明細書に記載および請求される発明は、制限ではなく説明のみを目的として含まれる、この発明の概要に特定された特色または例に限定されない。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明の一態様では、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）ポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）ポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0016】
本発明のさらなる態様では、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0017】
本発明のさらなる態様では、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）単一のポリペプチドＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）単一のポリペプチドＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0018】
本発明のなおさらなる態様では、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0019】
本発明のなおさらなる態様では、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｉｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）配列番号１によって定義されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｖ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｉｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）配列番号１によって定義されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｖ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0020】
本発明のなおさらなる態様では、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｉｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）配列番号１によって定義されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）フルオロフォアに結合することが可能であるＲＮＡアプタマーを含むレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｖ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｉｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）配列番号１によって定義されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）フルオロフォアに結合することが可能であるＲＮＡアプタマーを含むレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｖ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0021】
本発明のなおさらなる態様では、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｉｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）配列番号１によって定義されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）フルオロフォアに結合することが可能であるＲＮＡアプタマーを含むレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｖ）ＲＮＡアプタマーに結合することが可能であるフルオロフォアと、
（ｖ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｉｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）配列番号１によって定義されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）フルオロフォアに結合することが可能であるＲＮＡアプタマーを含むレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｖ）ＲＮＡアプタマーに結合することが可能であるフルオロフォアと、
（ｖ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0022】
本発明のなおさらなる態様では、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｉｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）配列番号１によって定義されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅに結合することが可能であるＭａｎｇｏアプタマーを含むレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｖ）ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅと、
（ｖ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試料からのリガンドと受容体－リガンド複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｉｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）配列番号１によって定義されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅに結合することが可能であるＭａｎｇｏアプタマーを含むレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｖ）ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅと、
（ｖ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0023】
本発明のなお別の態様では、リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、試料中のリガンドを検出するためのアッセイ方法であって、
（ｉ）試料を、
（ａ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成するステロイドホルモン受容体、ならびに
（ｂ）核酸分子であって、
（１）ポリメラーゼプロモーター配列、
（２）リガンド－受容体複合体によって結合される応答要素、および
（３）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子、
（ｃ）単一のポリペプチドポリメラーゼ、ならびに
（ｄ）ヌクレオシド三リン酸、と接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の転写の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
（ｉ）試料を、
（ａ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成するステロイドホルモン受容体、ならびに
（ｂ）核酸分子であって、
（１）ポリメラーゼプロモーター配列、
（２）リガンド－受容体複合体によって結合される応答要素、および
（３）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子、
（ｃ）単一のポリペプチドポリメラーゼ、ならびに
（ｄ）ヌクレオシド三リン酸、と接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の転写の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
【0024】
本発明のなお別の態様では、リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、試料中のリガンドを検出するためのアッセイ方法であって、
（ｉ）試料を、
（ａ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成するステロイドホルモン受容体、ならびに
（ｂ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子、
（ｃ）核酸分子であって、
（１）ポリメラーゼプロモーター配列、
（２）リガンド－受容体複合体によって結合される応答要素、および
（３）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子、
（ｄ）単一のポリペプチドポリメラーゼ、ならびに
（ｅ）ヌクレオシド三リン酸、と接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の転写の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
（ｉ）試料を、
（ａ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成するステロイドホルモン受容体、ならびに
（ｂ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子、
（ｃ）核酸分子であって、
（１）ポリメラーゼプロモーター配列、
（２）リガンド－受容体複合体によって結合される応答要素、および
（３）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子、
（ｄ）単一のポリペプチドポリメラーゼ、ならびに
（ｅ）ヌクレオシド三リン酸、と接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の転写の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
【0025】
本発明のなお別の態様では、リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、試料中のリガンドを検出するためのアッセイ方法であって、
（ｉ）試料を本明細書に記載の試験キットと接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の転写の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
（ｉ）試料を本明細書に記載の試験キットと接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の転写の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
【0026】
本発明のなお別の態様では、リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、試料中のリガンドを検出するためのアッセイ方法であって、
（ｉ）試料を、
（ａ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成するステロイドホルモン受容体、ならびに
（ｂ）核酸分子であって、
（１）ポリメラーゼプロモーター配列、
（２）リガンド－受容体複合体によって結合される応答要素、および
（３）蛍光に基づくレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子、
（ｃ）単一のポリペプチドポリメラーゼ、ならびに
（ｄ）ヌクレオシド三リン酸、と接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の蛍光の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
（ｉ）試料を、
（ａ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成するステロイドホルモン受容体、ならびに
（ｂ）核酸分子であって、
（１）ポリメラーゼプロモーター配列、
（２）リガンド－受容体複合体によって結合される応答要素、および
（３）蛍光に基づくレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子、
（ｃ）単一のポリペプチドポリメラーゼ、ならびに
（ｄ）ヌクレオシド三リン酸、と接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の蛍光の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
【0027】
本発明のなお別の態様では、リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、試料中のリガンドを検出するためのアッセイ方法であって、
（ｉ）試料を、
（ａ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成するステロイドホルモン受容体、ならびに
（ｂ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子、
（ｃ）核酸分子であって、
（１）ポリメラーゼプロモーター配列、
（２）リガンド－受容体複合体によって結合される応答要素、および
（３）蛍光に基づくレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子、
（ｄ）単一のポリペプチドポリメラーゼ、ならびに
（ｅ）ヌクレオシド三リン酸、と接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の蛍光の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
（ｉ）試料を、
（ａ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成するステロイドホルモン受容体、ならびに
（ｂ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子、
（ｃ）核酸分子であって、
（１）ポリメラーゼプロモーター配列、
（２）リガンド－受容体複合体によって結合される応答要素、および
（３）蛍光に基づくレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子、
（ｄ）単一のポリペプチドポリメラーゼ、ならびに
（ｅ）ヌクレオシド三リン酸、と接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の蛍光の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
【0028】
本発明のなお別の態様では、リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、試料中のリガンドを検出するためのアッセイ方法であって、
（ｉ）試料を本明細書に記載の蛍光に基づくレポーター構築物を含む試験キットと接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の蛍光の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
（ｉ）試料を本明細書に記載の蛍光に基づくレポーター構築物を含む試験キットと接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の蛍光の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の蛍光の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
【0029】
本発明のさらなる態様では、試料のステロイドホルモン生理活性を決定するための方法であって、試料を本明細書に記載の試験キットと組み合わせて、試料が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、試料のステロイドホルモン生理活性についての情報を提供する、方法が提供される。
【0030】
本発明のさらなる態様では、生物学的試料のステロイドホルモン生理活性を決定するための方法であって、生物学的試料を本明細書に記載の試験キットと組み合わせて、試料が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、生物学的試料のステロイドホルモン生理活性についての情報を提供する、方法が提供される。
【0031】
本発明のさらなる態様では、臨床検体のステロイドホルモン生理活性を決定するための方法であって、臨床検体から得た試料を本明細書に記載の試験キットと組み合わせて、試料が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、臨床検体のステロイドホルモン生理活性についての情報を提供する、方法が提供される。
【0032】
本発明のさらなる態様では、食品または栄養補助食品のステロイドホルモン生理活性を決定するための方法であって、食品もしくは栄養補助食品または食品もしくは栄養補助食品の抽出物を本明細書に記載の試験キットと組み合わせて、試料が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、食品または栄養補助食品のステロイドホルモン生理活性についての情報を提供する、方法が提供される。
【0033】
本発明のさらなる態様では、環境源に由来する試料のステロイドホルモン生理活性を決定するための方法であって、環境源から得た試料を本明細書に記載の試験キットと組み合わせて、試料が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、環境試料のステロイドホルモン生理活性についての情報を提供する、方法が提供される。
【0034】
本発明のさらなる態様では、アスリートのドーピング状態を決定するための方法であって、アスリートから得た試料を本明細書に記載の試験キットと組み合わせて、試料が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、アスリートのドーピング状態についての情報を提供する、方法が提供される。
【0035】
本発明のさらなる態様では、試料のステロイドホルモン生理活性を決定するための方法であって、試料に本明細書に記載のアッセイ方法を実施して、試料が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、試料のステロイドホルモン生理活性についての情報を提供する、方法が提供される。
【0036】
本発明のさらなる態様では、生物学的試料のステロイドホルモン生理活性を決定するための方法であって、試料に本明細書に記載のアッセイ方法を実施して、試料が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、生物学的試料のステロイドホルモン生理活性についての情報を提供する、方法が提供される。
【0037】
本発明のさらなる態様では、食品または栄養補助食品のステロイドホルモン生理活性を決定するための方法であって、食品もしくは栄養補助食品または食品もしくは栄養補助食品からの抽出物に本明細書に記載のアッセイ方法を実施して、食品または栄養補助食品が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、食品または栄養補助食品のステロイドホルモン生理活性についての情報を提供する、方法が提供される。
【0038】
本発明のさらなる態様では、臨床検体のステロイドホルモン生理活性を決定するための方法であって、臨床検体に本明細書に記載のアッセイ方法を実施して、試料が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、臨床検体のステロイドホルモン生理活性についての情報を提供する、方法が提供される。
【0039】
本発明のさらなる態様では、環境源に由来する試料のステロイドホルモン生理活性を決定するための方法であって、環境試料に本明細書に記載のアッセイ方法を実施して、試料が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、ステロイドホルモン生理活性についての情報を提供する、方法が提供される。
【0040】
本発明のさらなる態様では、アスリートのドーピング状態を決定するための方法であって、アスリートから得た試料に本明細書に記載のアッセイ方法を実施して、試料が、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつレポーター構築物の物理的特性の変化を引き起こすのに十分なリガンドを含むかどうかを確認することを含み、レポーター構築物の物理的特性の変化が、アスリートのドーピング状態についての情報を提供する、方法が提供される。
【0041】
本発明のさらなる態様では、リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、リガンドの存在について試料をスクリーニングするための製造物品であって、試料中のリガンドの存在を検出する方法についての説明書と一緒に本明細書に記載の試験キットを含む、製造物品が提供される。
【0042】
本発明のさらなる態様では、リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、リガンドの存在について生物学的試料をスクリーニングするための製造物品であって、生物学的試料中のリガンドの存在を検出する方法についての説明書と一緒に本明細書に記載の試験キットを含む、製造物品が提供される。
【0043】
本発明のさらなる態様では、リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、リガンドの存在について食品または栄養補助食品をスクリーニングするための製造物品であって、食品または栄養補助食品中のリガンドの存在を検出する方法についての説明書と一緒に本明細書に記載の試験キットを含む、製造物品が提供される。
【0044】
本発明のなおさらなる態様では、試料のステロイドホルモン生理活性を決定するための製造物品であって、試料中のステロイドホルモン生理活性を検出するための説明書と一緒に本明細書に記載の試験キットを含み、試料中の生理活性リガンドの存在が、試料のステロイドホルモン生理活性を示す、製造物品が提供される。
【0045】
本発明のなおさらなる態様では、臨床検体のステロイドホルモン生理活性を決定するための製造物品であって、臨床検体中のステロイドホルモン生理活性を検出するための説明書と一緒に本明細書に記載の試験キットを含み、臨床検体中の生理活性リガンドの存在が、臨床検体のステロイドホルモン生理活性を示す、製造物品が提供される。
【0046】
本発明のなおさらなる態様では、環境試料のステロイドホルモン生理活性を決定するための製造物品であって、環境試料中のステロイドホルモン生理活性を検出するための説明書と一緒に本明細書に記載の試験キットを含み、環境試料中の生理活性リガンドの存在が、環境試料のステロイドホルモン生理活性を示す、製造物品が提供される。
【0047】
本発明のなおさらなる態様では、アスリートのドーピングを決定するための製造物品であって、アスリートに由来する試料中のリガンドの存在を検出するための説明書と一緒に本明細書に記載の試験キットを含み、試料中のリガンドの存在が、アスリートのドーピングを示す、製造物品が提供される。
【0048】
一般定義
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、（例えば、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、分子遺伝学、合成生物学、および生化学における）当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、（例えば、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、分子遺伝学、合成生物学、および生化学における）当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
【0049】
本明細書に開示の数値範囲（例えば、１～１０）についての言及はまた、その範囲内のすべての関連する数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９、および１０）、またその範囲内の有理数の任意の範囲（例えば、２～８、１．５～５．５、および３．１～４．７）についての言及を組み込み、したがって、本明細書に明示的に開示のすべての範囲のすべてのサブ範囲が明示的に開示されていることを意図する。これらは、具体的に意図されるものの単なる例であり、列挙された最小値と最大値との間の数値のすべての可能な組み合わせは、同様の様式で本出願に明示的に記載されていると見なされるものである。
【0050】
「および／または」という用語、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解されるものとし、両方の意味またはいずれかの意味の明示的な支持を提供すると解釈されるものとする。
【0051】
「ａ」または「ａｎ」という用語は、指定された実体のうちの１つまたは２つ以上を指し、例えば、「１つの受容体」または「１つの核酸分子」は、１つ以上の受容体もしくは核酸分子、または少なくとも１つの受容体もしくは核酸分子を指し得る。したがって、「ａ」または「ａｎ」、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
【0052】
本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を含むことを意味すると理解されるが、任意の他の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群は除外されないであろう。
【0053】
本明細書全体を通して、特に明記しない限り、または特に文脈が要求しない限り、単一のステップ、物質の組成、ステップの群、または物質の組成の群についての言及は、それらのステップ、物質の組成、ステップの群、または物質の組成の群のうちの１つおよび複数（すなわち１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。
【0054】
選択される定義
本発明の目的のために、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
本発明の目的のために、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【0055】
本明細書で使用される「試験キット」という用語は、本明細書に記載の発明によるアッセイおよび方法を実施するための様々な構成要素を含む製造物品を指す。
【0056】
本明細書で使用される「ステロイドホルモン受容体」または「ＳＨＲ」という用語は、リガンドに選択的に結合するタンパク質または組み換えポリペプチドを含むポリペプチドを指し、リガンドは、ステロイドホルモン受容体を活性化することが可能であり、限定されないが、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、鉱質コルチコイド受容体、およびグルココルチコイド受容体が挙げられる。典型的には、ステロイドホルモン受容体は、リガンド結合ドメイン、活性化ドメイン、およびデオキシリボ核酸結合ドメインを含む。この定義によれば、「ステロイドホルモン受容体」は、リガンドによる活性化のために、ステロイドホルモン受容体を折り畳まれた状態およびホルモンにすぐに応答する状態に保持するのを助ける（例えば）熱ショックタンパク質などを含む、他の補因子を任意選択的に含み得る。
【0057】
本明細書で使用される「ステロイドホルモン受容体補因子」という用語は、ステロイドホルモン受容体が活性化された時点でリガンドによって移動されるまで、ステロイドホルモン受容体を不活性状態に保持する１つ以上の補因子を指す。本発明によるステロイドホルモン受容体補因子の例としては、限定されないが、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体が挙げられる。
【0058】
「リガンド」という用語は、一般に、受容体に結合する任意の分子を指し、限定されないが、ステロイド、ポリペプチド、タンパク質、ビタミン、炭水化物、糖タンパク質、治療剤、薬物、グリコサミノグリカン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。本明細書で使用される場合、「リガンド」としては、限定されないが、エストロゲン、プロゲスターゲン、アンドロゲンなどを含む性ホルモンなどのステロイドホルモン、ならびにそれらの天然および合成誘導体および類似体および代謝産物、デザイナーステロイドホルモン、アナボリックアンドロゲンステロイド、ならびに選択的アンドロゲン受容体モジュレーター、プロゲスターゲン受容体モジュレーター、およびエストロゲン受容体モジュレーター、現在既知のもの、ならびに開発されるか、または生物学的試料中で天然に見出されると予想されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0059】
本明細書で互換的に使用される「受容体－リガンド複合体」および「活性化ステロイドホルモン受容体」という用語は、リガンド結合ステロイドホルモン受容体を指し、ステロイドホルモン受容体が、リガンドに結合すると構造的に形質転換を受け、次いで活性化された形態であることを指すこと。本明細書に記載の受容体－リガンド複合体としては、限定されないが、リガンド結合ホルモン受容体の二量体（すなわち、（ＨＲ－Ｌ）２が挙げられる。
【0060】
本明細書で使用される「ゲノム応答」という用語は、活性化ステロイドホルモン受容体（または受容体－リガンド複合体）がその対応する核酸応答要素に選択的に結合し、下流遺伝子の転写を活性化または抑制する能力を指す。細胞環境では、リガンド結合受容体は核酸応答要素に結合し、外的刺激（すなわちリガンドの存在）に応答して遺伝子をオンまたはオフに切り替える。本発明による試験キット、アッセイ、および方法は、細胞に基づく系の態様を模倣するレポーターに基づくフレームワークを提供することによって、細胞環境で、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発するであろうリガンドを同定するために開発された。
【0061】
本明細書で使用される「ステロイド代謝機構」という用語は、任意の酵素を指し、リガンドを生理学的に不活性な形態から生理学的に活性な形態に、または生理学的に活性な形態からより生理学的に活性な形態に、または生理学的に活性な形態から生理学的により活性でない形態に、または生理学的に活性な形態から生理学的に不活性な形態に変換するのに十分な酵素の組み合わせを含む。
【0062】
本明細書で使用される「検出手段」という用語は、活性化ステロイドホルモン受容体と核酸応答要素との間の結合相互作用を検出するように適合された任意の装置、設備、または構成を指す。検出手段の例としては、限定されないが、光学的方法、分光法、可視分光法、ラマン分光法、ＵＶ分光法、表面プラズモン共鳴、電気化学的方法、インピーダンス、抵抗、キャパシタンス、質量の変化による機械的感知、機械的共鳴の変化、電気泳動、ゲル電気泳動、ゲルシフト（ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）、撮像、蛍光および蛍光共鳴エネルギー移動、ポリメラーゼ連鎖反応などが挙げられる。
【0063】
本明細書で使用される「核酸配列」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列、リボ核酸配列（ＲＮＡ）、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）、および相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を指し、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとも称される、２つ以上のヌクレオチドの連続的な配列で構成される。核酸配列は、一本鎖または二本鎖であり得る。
【0064】
本明細書で使用される「レポーター構築物」という用語は、その発現がアッセイされ得るＲＮＡをコードするレポーター分子をコードする核酸配列を指し、そのようなＲＮＡとしては、限定されないが、フルオロフォア結合アプタマー、または合成ＲＮＡもしくはｍＲＮＡが挙げられる、加えて、レポーター遺伝子は、ＲＮＡ分析によって発現産物が検出され得る任意の目的の遺伝子を包含し得る。
【0065】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、操作可能に連結されている転写される配列の転写開始の５’末端の近位に位置する核酸配列である。プロモーターは、操作可能に連結されている遺伝子の転写の調節に相互作用する、１つ以上の調節要素を含有し得る。本発明によるプロモーターの例としては、限定されないが、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６バクテリオファージプロモーター、または開始配列が挙げられる。「プロモーター」、「プロモーター配列」、「イニシエーター配列」、または「開始配列」という用語は、同じことを意味するために、本明細書全体を通して互換的に使用され得る。
【0066】
本明細書で使用される「操作可能に連結されている」という用語は、第１の要素の活性を調節することが第２の要素に対する効果を誘発するように配置された、２つの高分子要素を説明する。この様式では、プロモーター要素の活性の調節を使用して、操作可能に連結されているレポーター構築物の発現を変化させるおよび／または調節することができる。例えば、プロモーター要素に操作可能に連結されているレポーター構築物の転写は、プロモーターの活性を「活性化する」因子によって誘導され、プロモーター要素に操作可能に連結されているレポーター構築物の転写は、プロモーターの活性を「遮断する」因子によって阻害される。したがって、そのようなレポーター構築物の転写がプロモーターの活性によって影響を受ける場合、プロモーター領域はレポーター構築物に操作可能に連結している。
【0067】
本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子内にコードされた情報が発現されるプロセスを指す。遺伝子がタンパク質をコードする場合、発現は、ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写、成熟ｍＲＮＡ産物へのｍＲＮＡのプロセシング（必要な場合）、およびタンパク質への成熟ｍＲＮＡの翻訳の両方に関与する。分子が、適切な宿主環境で、ＤＮＡに含有される遺伝子情報をタンパク質産物へと転写、処理、および翻訳する能力を提供するポリペプチドのコード配列および発現制御配列を含有する場合、ならびにそのような発現制御配列が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている場合、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）または遺伝子などの核酸分子は、ポリペプチド（またはタンパク質）を「発現することが可能である」と言われる。
【0068】
本明細書で使用される「試料」という用語は、リガンドの存在について試験することが望まれる任意の試料を指す。本明細書では、「試料」および「試験試料」という用語は、互換的に使用される。
【0069】
本明細書で使用される「相対効力」または「ＲＰ」という用語は、本明細書に記載のアッセイおよび試験キットを使用して測定して、参照化合物と比較した、試験化合物によって呈される生物学的活性の乗数を指し、生物学的活性が、（例えば）ステロイドホルモン受容体に結合し、かつそれを活性化する化合物の能力によって定義される。相対効力が、＞１の場合、試験化合物は、参照化合物と比較して、その生物学的活性の観点でより効力があり、相対効力が、＜１である場合、試験化合物は、参照化合物と比較して、その生物学的活性の観点で効力が低く、相対力価＝１の場合、試験化合物と参照化合物とは、生物学的活性の観点で同等に効力がある。
【0070】
本明細書で使用される「活性化因子」または「ＡＦ」という用語は、試験化合物の（例えば）生理学的に不活性な状態から生理学的に活性な状態への、または生理学的により活性でない状態から生理学的により活性な状態への代謝変換の測定に関連する。活性化因子＞１は、試験化合物が、アッセイにおいて代謝機構の存在下で、より生理学的に活性な状態への代謝変換を受けたことを意味する。
【0071】
「参照閾値」または「参照標準」という用語は、（例えば）試験試料の非存在下、または試験試料およびステロイドホルモン受容体の非存在下で測定されたアッセイ活性のレベルを意味するために互換的に使用され得る。本明細書に記載の発明によるある特定の例では、参照閾値または参照標準は、試験試料の代わりにエタノールを使用して決定される。参照閾値は、標的リガンドの非存在下でのアッセイのベースライン活性またはシグナルを確立することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【0072】
【図1】Ｔ７プロモーターの制御下で、アンドロゲン応答要素（ＡＲＥ）が媒介する、Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマー配列を含むレポーター構築物のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが媒介する転写の阻害の概略図を示す。
【図2】ＡＲが、Ｔ７が媒介するＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーの転写を低減したことを示す。Ｔ７プロモーター－ＡＲＥ－ＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーＤＮＡテンプレートを使用して、インビトロ転写反応を組み立てた。０．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内で反応を組み立て、１１．５ｎｇ／ｍＬのテストステロンの添加によって開始した。２時間のインキュベーション後、ＴＯ１－ビオチン（ＴＯ１－Ｂ）を添加してＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーを測定し、標準的な蛍光光度計を使用して蛍光の増加を検出した。黒の円柱－ＡＲを添加しない対照反応、灰色の円柱－１００ｎｇ／反応または４００ｎｇ／反応でＡＲを添加した反応。
【図3】ＡＲが、Ｔ７が媒介するＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーの転写を低減したことを示す。Ｔ７プロモーター－ＡＲＥ－ＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーＤＮＡテンプレートを使用して、インビトロ転写反応を組み立てた。０．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内で反応を組み立てた。２時間のインキュベーション後、ＴＯ１－Ｂを添加してＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーを測定し、標準的な蛍光光度計を使用して蛍光の増加を検出した。黒の円柱－ＡＲを添加しない対照反応、灰色の円柱－１００ｎｇ／反応でＡＲを添加した反応。濃い灰色の円柱－１００ｎｇ／反応でＡＲを添加し、１１．５ｎｇ／ｍＬのテストステロンで活性化した反応。
【図4】Ｔ７が媒介するＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマー発現のＡＲ阻害をＨＳＰ９０が遮断することを示している。Ｔ７プロモーター－ＡＲＥ－ＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーＤＮＡテンプレートを使用して、インビトロ転写反応を組み立てた。０．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内で反応を組み立てた。２時間のインキュベーション後、ＴＯ１－Ｂを添加してＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーを測定し、標準的な蛍光光度計を使用して蛍光の増加を検出した。黒の円柱－ＡＲを添加しない対照反応、灰色の円柱－１００ｎｇ／反応でＡＲを添加した反応。濃い灰色の円柱－１００ｎｇ／反応でＡＲを添加し、１１．５ｎｇ／ｍＬのテストステロンで活性化した反応。薄い灰色の円柱－１００ｎｇ／反応でＡＲ、および２００ｎｇ／反応でＨＳＰ９０を添加した反応。最も濃い灰色の円柱－１００ｎｇ／反応でＡＲ、および２００ｎｇ／反応でＨＳＰ９０、および１１．５ｎｇ／ｍＬでテストステロンを添加した反応。
【図5】テストステロン活性化ＡＲが、Ｔ７が媒介するＲＮＡアプタマー、Ｍａｎｇｏ ＩＩの発現を用量依存的に低減することを示している。本文に記載されているように反応を組み立てた。これらの反応では、エタノール対照によって、Ｔ７がＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩを生成したことを証明した。これはステロイド、テストステロン（Ｔ）、およびジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の希釈液であるので、エタノール対照が含まれている。エタノール対照で生成された蛍光出力を、任意に１００％割り当て、リガンド活性化反応の参照として使用した。（２．５ｍＭ～２５μＭの範囲にわたり）濃度を減少させたテストステロンを添加してＡＲを活性化したか、またはＤＨＴを２５０μＭで添加した。ＴおよびＤＨＴの両方は、内因性のアンドロゲンであり、ＡＲの強力な活性化因子である。＊＊＊＊ｐ＜０．００１（対エタノール）Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた一元配置分散分析。
【図6】ＡＲの滴定がΔＭａｎｇｏ ＩＩに直接影響を与えることを示している。本文に記載されているように反応を組み立てた（例えば、表７を参照されたい）。これらの反応では、エタノール対照によって、Ｔ７がＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩを生成したことを証明した（灰色の円柱）。これはテストステロン（Ｔ）の希釈液であるので、エタノール対照が含まれている。エタノール対照で生成された蛍光出力を、任意に１００％割り当て、２５０μＭのテストステロンで活性化した反応の参照として使用した（黒の円柱）。ＡＲの濃度を５０ｎｇ～２５ｎｇ～４．２ｎｇに減少させると、顕著なレベルのＡＲ遮断を維持した（ｎ＝５）が、しかしながら、Ｔ７阻害の効果の程度は、５０ｎｇと比較して減少した。ＡＲ濃度を１００ｎｇ（ｎ＝２）に増加すると、Ｔ７阻害に対してさらなる影響はなかった。＊＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＝０．００２（対エタノール）Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた一元配置分散分析。
【図7】ＨＳＰ９０：ＡＲ比がΔＭａｎｇｏ ＩＩに影響を与えることを示している。本文に記載されているように反応を組み立てた（表８を参照されたい）。これらの反応では、エタノール対照によって、Ｔ７がＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩを生成したことを証明した（灰色の円柱）。エタノール対照で生成された蛍光出力を、任意に１００％割り当て、２５０μＭのテストステロンで活性化した反応の参照として使用した（黒の円柱）。結果は、１：１の比は、ＡＲ濃度が増加した場合にのみ効果的であり、ＡＲ濃度が１００ｎｇのときに最大のΔＭａｎｇｏ ＩＩが記録されることを示している。ＡＲ濃度が５０ｎｇまたは１００ｎｇの場合は２：１の比が効果的であった一方で、４：１の比では、ＡＲ濃度が低くても動作し他一方で、８：１の比では、ΔＭａｎｇｏ ＩＩの効果の程度の減少を示した。
【図8】単一のＡＲＥ部位が、Ｔ７転写を低減するのに十分強力であることを示している。ＤＮＡテンプレートが異なることを除いて、本文に記載されているように反応を組み立てた。１組の反応には、単一のＡＲＥのみをコードするＤＮＡテンプレートを使用し、２組目の反応には元来の３ＸＡＲＥ ＤＮＡテンプレートを使用した（配列は表２に示す）。これらの反応では、エタノール対照によって、Ｔ７がＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩを生成したことを証明した（灰色の円柱）。エタノール対照で生成された蛍光出力を、任意に１００％割り当て、２５０μＭのテストステロンで活性化した反応の参照として使用した（黒の円柱）。結果は、単一のＡＲＥが、３ＸＡＲＥと同程度に効果的であることを示している（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＝０．００２）。
【図9】ＤＮＡテンプレート濃度の減少がΔＭａｎｇｏ ＩＩを低減することを示している。本文に記載されているように反応を組み立てた。これらの反応では、エタノール対照によって、Ｔ７がＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩを生成したことを証明した（灰色の円柱）。エタノール対照で生成された蛍光出力を、任意に１００％割り当て、２５０μＭのテストステロンで活性化した反応の参照として使用した（黒の円柱）。結果は、ＤＮＡテンプレート濃度が、反応当たり２５ｎｇ未満に低下すると、ΔＭａｎｇｏ ＩＩを検出する能力が損失されたことを示している（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＝０．００３）。
【図10】Ｔ７単位を５０Ｕから１０Ｕに滴定すると、蛍光が変化の閾値の検出値を下回って減少することを示している。反応当たり５０Ｕ～１０Ｕの酵素を添加するように、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを滴定した。反応は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡテンプレート、および反応緩衝液のみからなった。５０Ｕでは、反応から生成されたＭａｎｇｏ ＩＩが、約３４００００の蛍光読み取り値を生じたことに留意されたい。４０Ｕの酵素を添加すると、これは約２０００００にうまく低減した。それ以上希釈しても、蛍光に測定可能な変化は生じず、これは、約２０００００蛍光単位がこの反応の閾値であることを示している。
【図11】ΔＭａｎｇｏ ＩＩ検出の閾値を示す。５０Ｕまたは１００ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡテンプレート、反応緩衝液、５０ｎｇのＡＲ、１００ｎｇのＨＳＰ９０、および２５０μＭのテストステロン（または対照としてエタノール）を用いて、反応を確立した。データは、５０ＵのＴ７酵素を添加すると、ΔＭａｎｇｏ ＩＩを検出する能力があったことを示しているが、しかしながら、効果の程度は、顕著ではあるが比較的小さいである（ｎ＝５、＊ｐ＝０．０１５５ Ｓｉｄａｋｓ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ検定を用いた一元配置分散分析）。１００ＵのＴ７酵素を添加すると、ΔＭａｎｇｏ ＩＩがより大きい効果の程度で容易に検出された（ｎ＝５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ΔＭａｎｇｏ ＩＩ検出の閾値は、約２０００００である。出力がこれを下回ると、試験結果の解釈が困難であろう。
【図12】エストラジオール活性化ＥＲαでは、単一のＥＲＥ部位が、Ｔ７転写を低減するのに十分強力であることを示している。本文に記載されているように反応を組み立てた。これらの反応では、エタノール対照によって、Ｔ７がＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩを生成したことを証明している。これはステロイドホルモン、エストラジオール（Ｅ２）の希釈液であるので、エタノール対照が含まれている。エタノール対照で生成された蛍光出力を、任意に１００％割り当て、エストラジオール活性化反応の参照として使用した。５ｕＭでエストラジオールを添加して、ＥＲαを活性化した。ｎ＝３、＊＊＊＊ｐ＜０．００１（対エタノール）Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた一元配置分散分析。
【図13】ＡＲ／ＨＳＰ９０－ＡＲＥアッセイが、一定範囲のＡＡＳおよびＳＡＲＭを検出することが可能であることを示している。テストステロン（２５０μＭ）を正の参照として使用した一方で、エタノールを負の参照として使用し、活性を１００％に設定した（緑色の点線）。すべてのデータを、エタノール対照に対して正規化する。アンドロゲン分子のクラスを本文に記載する（表１０）。
【図14】ＲＮＡポリメラーゼ活性が血清によって影響を受けないことを示している。ＤＮＡテンプレート（１００ｎｇ）、緩衝液、ヌクレアーゼを含まない水、およびＡＲ反応ではＡＲ（５０ｎｇ）、ＨＳＰ９０（１００ｎｇ）で、反応を組み立てた。ウマ血清またはＦＣＳ（１０μｌ）を添加し、その後、１００Ｕ（または同等の）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを添加して反応を開始した。反応を３７℃で１５０分間保持し、その後、Ｍａｎｇｏ ＩＩ ＲＮＡアプタマーをＴＯ１－ビオチン（１００ｎＭ）で検出した。データは、ウマ血清またはＦＣＳの存在が、Ｔ７が生成するＭａｎｇｏ ＩＩに影響を与えなかったことを示している。
【図15】血清試料中のテストステロンの検出を示している。テストステロンを添加した１３μｌのＦＣＳを添加したことを除いて、本文に記載されているように反応を組み立てた。エタノールを添加したＦＣＳを非活性化ＡＲ対照として使用し、Ｔ７活性を任意に１００％に設定した。テストステロンは、Ｔ７が生成するＭａｎｇｏ ＩＩの用量依存的な抑制を示し、テストステロン濃度がより高いほどΔＭａｎｇｏ ＩＩが大きくなった。ｐ＜０．０００１対エタノール、Ｓｉｄａｋ’ｓ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ比較を用いた一元配置分散分析。
【図16】尿試料中のアンドロゲン活性の検出を示している。本文に記載されているように反応を組み立てた。エタノールをＡＲ活性化の陰性（ビヒクル）対照として使用し、テストステロン（２５０μＭ）を陽性対照として使用した。子馬＃１および子馬＃２は、２頭の異なる若い雄の競走馬から得た尿試料を表す。去勢馬＃１および去勢馬＃２は、２頭の異なる去勢された雄の馬から得た尿試料を表す。トレンボロン添加は、取り出しおよび抽出ステップの前にトレンボロンを添加した、去勢馬尿試料を表す。エタノール対照で測定されたＴ７活性は、任意に１００％に設定した。テストステロンは、子馬尿試料およびトレンボロンを添加した尿試料でも見られたＴ７が生成するＭａｎｇｏ ＩＩの抑制を示したが、しかしながら、去勢馬試料ではＴ７活性の抑制はほとんど測定されなかった。去勢馬は精巣が除去されており、これらの臓器は男性のテストステロン産生の主な源であるので、内因性アンドロゲンレベルは低いと予想されるであろう。
【図17】ＳＨＲ／ＳＲＥアッセイを使用したプロホルモンの検出を示す。アンドロステンジオンをＳ９肝臓画分と事前にインキュベートした後、肝臓Ｓ９画分反応をステロイドで抽出した。次に、抽出した試料のアンドロゲン活性を試験した。データは、メタノール対照が完全なＴ７活性を表した、すなわち、アンドロゲンの非存在下でＡＲ／ＨＳＰ９０を追加しても影響を受けないことを示している。アンドロステンジオン／Ｓ９抽出試料を試験すると、アンドロステンジオン（ｎ＝２、独立ＮＡＤ Ｓ９画分／抽出反応なし）と比較して、蛍光読み取り値が大幅に低減した（ｎ＝２、独立ステロイド代謝／抽出反応）。
【発明を実施するための形態】
【0073】
本発明は、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試料をスクリーニングするのに有用な試験キット、アッセイ、および方法を提供する。
【0074】
本発明によるある特定の例では、本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法は、例えば、対象から得た試料のアンドロゲンおよび／またはエストロゲン活性を測定することによって、対象のホルモン状態を決定するのに有用である。次いで、この情報を使用して、例えば、対象が、がんを有するかもしくはがんを発症するリスクがあるかどうかを決定するために、または、例えば、閉経などの加齢に関連する内分泌の問題を調査するために、またはホルモン補充療法もしくはホルモン抑制療法の有効性を評価することができる。
【0075】
本発明による他の例では、本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法は、限定されないが、ホルモン感受性のがんを促進し得るフィトエストロゲンを含む、健康に有害であり得る禁止されている添加物または天然活性化剤について食品および健康食品補助食品をスクリーニングするのに有用である。
【0076】
酵素が媒介する活性アッセイおよび試験キット
本明細書に記載の試験キットおよび方法が基づく本発明によるアッセイは、活性に基本的に基づくアッセイであり、試験される試料に由来するリガンドの結合を通じたステロイドホルモン受容体活性化の原理に基づいて機能する。ステロイドホルモン受容体の活性化は、リガンドが受容体に結合し、タンパク質の三次構造のコンフォメーション変化を誘発すると生じ、次いで受容体－リガンド複合体（本明細書では「活性化ステロイドホルモン受容体」とも称される）が、核酸応答要素に結合し、ＲＮＡポリメラーゼに影響を与え、いわゆる「ゲノム応答」を誘発することが可能であることを意味する。言い換えれば、細胞のゲノムからの遺伝子の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする能力であり、次いで、これは、生理学的効果をもたらし得る。本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法によって測定されるのは、調査下の試料中のステロイドまたはステロイド様活性を有するリガンドの存在を検出するための代用物としての、活性化ステロイドホルモン受容体と核酸応答要素との間のこの結合相互作用である。
本明細書に記載の試験キットおよび方法が基づく本発明によるアッセイは、活性に基本的に基づくアッセイであり、試験される試料に由来するリガンドの結合を通じたステロイドホルモン受容体活性化の原理に基づいて機能する。ステロイドホルモン受容体の活性化は、リガンドが受容体に結合し、タンパク質の三次構造のコンフォメーション変化を誘発すると生じ、次いで受容体－リガンド複合体（本明細書では「活性化ステロイドホルモン受容体」とも称される）が、核酸応答要素に結合し、ＲＮＡポリメラーゼに影響を与え、いわゆる「ゲノム応答」を誘発することが可能であることを意味する。言い換えれば、細胞のゲノムからの遺伝子の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする能力であり、次いで、これは、生理学的効果をもたらし得る。本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法によって測定されるのは、調査下の試料中のステロイドまたはステロイド様活性を有するリガンドの存在を検出するための代用物としての、活性化ステロイドホルモン受容体と核酸応答要素との間のこの結合相互作用である。
【0077】
重要なことに、これは、本発明による試験キットおよびアッセイが、（例えば）「デザイナー薬物」などの未知の構造のリガンドによって誘発されるステロイドホルモンの生理活性／活性を検出する能力を有することを意味する。ガス／液体クロマトグラフィーおよび質量分析法などの従来の実験試験設備は調査される分子の構造に関する事前の知識を必要とするので、以前には、これは可能ではなかった。
【0078】
ステロイドホルモンの生理活性／活性を検出するための以前のアプローチは、酵母および哺乳類細胞レポーターアッセイに関与していた（例えば、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｅｎｓｏｒｓ １３：２１４８－２１６３を参照されたい）。そのようなアッセイは、生細胞培養を維持するための（例えば）特殊な設備および専門知識の必要性などの、十分認識されている制限を有する。細胞に基づくシステムを主に模倣する分子フレームワークをモデルにした無細胞アッセイの開発によって、細胞に基づくレポーター対応物（複数可）と比較して、機能性が向上され、アッセイ感受性が改善されたインビトロアッセイが生成された。しかしながら、無細胞アッセイの制限は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩなどのマルチサブユニットホロ酵素ポリメラーゼの使用を要件とすることである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩの組み換え産生は、再現性が変動し達成するのが非常に困難であり、その結果、ホロ酵素は、典型的には、すべての構成要素が存在し、プロモーター配列で一緒になる核抽出物を使用することによって利用可能になる。しかしながら、真核細胞から核抽出物を調製することは、高価な細胞増殖培地、および核の材料を濃縮するために必要な技術的専門知識の必要性が理由で、製造に費用がかかる。
【0079】
この制限に対処するために、出願人らは現在、より容易に入手可能な単一のポリペプチドポリメラーゼに関与する、インビトロ転写反応に基づく無細胞アッセイを開発した。
【0080】
これらの次世代アッセイの開発において、出願人らは、（例えば）バクテリオファージに感染した原核生物細胞に由来する単一のポリペプチドＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、レポーター構築物の読み取り値を表現することが可能であることを同定した。図１～１６と併せて閲覧するときには、実施例１～２を参照されたい。
【0081】
重要なことに、組み換えの市販のバクテリオファージポリメラーゼの使用は、製造に費用のかかる核抽出物の必要性を置き換える。
【0082】
したがって、本発明の一態様では、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）リガンド受容体複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるステロイドホルモン受容体と、
（ｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）リガンド受容体複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0083】
本発明の一例では、試験キットは、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）をさらに含む。
【0084】
本発明のなお別の態様では、リガンドがステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、試料中のリガンドを検出するためのアッセイ方法であって、
（ｉ）試料を、
（ａ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成するステロイドホルモン受容体、ならびに
（ｂ）核酸分子であって、
（１）ポリメラーゼプロモーター配列、
（２）リガンド－受容体複合体によって結合される応答要素、および
（３）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子、
（ｃ）単一のポリペプチドポリメラーゼ、ならびに
（ｄ）ヌクレオシド三リン酸、と接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の転写の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
（ｉ）試料を、
（ａ）試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成するステロイドホルモン受容体、ならびに
（ｂ）核酸分子であって、
（１）ポリメラーゼプロモーター配列、
（２）リガンド－受容体複合体によって結合される応答要素、および
（３）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子、
（ｃ）単一のポリペプチドポリメラーゼ、ならびに
（ｄ）ヌクレオシド三リン酸、と接触させるステップと、
（ｉｉ）リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定するステップと、を含み、
レポーター構築物の転写の測定された低減または阻害が、試料中のリガンドの検出を表す、アッセイ方法が提供される。
【0085】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によって与えられる重要な利点は、酵母および哺乳類細胞レポーターアッセイの細胞環境に存在する分子の複雑さ、または性能のためにＲＮＡポリメラーゼＩＩを必要とするＷＯ２０１８／０８８８５２に記載のものなどの無細胞アッセイのための核抽出物の使用を通じて生じる分子の複雑さの顕著な低減である。分子の複雑さが低減されると、標的リガンドの非存在下でのステロイドホルモン受容体（複数可）によるホルモン応答要素の非特異的活性化が制限されることによって、アッセイの特異性が顕著に向上する。ホルモン応答要素（例えば、アンドロゲン応答要素）は、それらの相補的受容体（例えば、アンドロゲン受容体）に対して高度に選択的ではなく、実際、細胞または核抽出物内に存在し得る他のステロイドホルモン受容体によって活性化され得ることが理解される。例えば、アンドロゲン応答要素の場合、プロゲステロン受容体Ａ、プロゲステロン受容体Ｂ、グルココルチコイド受容体、および／または鉱質コルチコイド受容体などのグループＩＩホルモン受容体クラスの他の非アンドロゲン受容体は、潜在的にＡＲＥを活性化し得る。ひいては、これが、アッセイの特異性の低減を生じさせる。
【0086】
実際、細胞環境または核抽出物によって生じる分子の複雑さの非存在によって、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法が、それらの標的リガンドの検出について高度に選択的であることを意味する。さらに、（例えば）ステロイドホルモン受容体および／またはホルモン応答要素を容易に切り替える能力は、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法に、目的の他の標的リガンドの検出のための多様性を生じる。
【0087】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によって与えられる別の重要な利点は、生物学的反応を化学量論的に定義する独特な能力である。例えば、必須のアッセイ構成要素と非必須のアッセイ構成要素との両方の間の分子関係（複数可）を正確に制御することによって、標的リガンドの検出のためにアッセイ感受性を顕著に向上することができる。言い換えれば、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法は、活性化リガンド－ホルモン受容体複合体とレポーター構築物内に存在するホルモン応答要素との間の結合相互作用の最適数を測定するように構成され得る。対照的に、不可能でない場合、細胞にクローン化された、遺伝子または核酸配列をコードする（例えば）組み換え受容体および／または核酸応答要素の総コピー数は、正確に予測または制御することができないので、リガンドの存在を検出するように構成された細胞に基づくレポーターアッセイを同じ制御の程度で再現することは困難である。存在するＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニット、補因子、および他の非必須タンパク質の正確な量を決定することが困難である場合、核抽出物に基づく無細胞レポーターアッセイを制御することも困難である。
【0088】
これらおよび他の考慮事項は、以下の例によって文書化されている。実例として、図６～９と併せて閲覧するときには、実施例２を参照されたい。具体的には、アンドロゲンリガンド（例えばテストステロン）の検出に関与するプロトタイプアッセイ（「アンドロゲンアッセイプロトタイプ２」）では、出願人らは、（ｉ）ＡＲ：核酸比が、≧７．２であり、かつ（ｉｉ）反応ミックス中の核酸の濃度が、≧０．７８９ｎＭであるとき、活性化アンドロゲン受容体（ＡＲ）が、その相補的ホルモン応答要素（ＡＲＥ、本明細書で定義されるように核酸内に位置する）への結合、およびＴ７が媒介するレポーター構築物の発現を遮断するのに最も効果的であることを実証している。
【0089】
したがって、本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法によるさらなる例では、ステロイドホルモン受容体対核酸の比は、約７：１～約１０：１であり、限定されないが、７．０：１、７．１：１、７．２：１、７．３：１、７．４：１、７．５：１、７．６：１、７．７：１、７．８：１、７．９：１、８．０：１、８．１：１、８．２：１、８．３：１、８．４：１、８．５：１、８．６：１、８．７：１、８．８：１、８．９：１、９．０：１、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、９．８：１、９．９：１、および１０．０：１が挙げられる。
【0090】
当業者はさらに、ステロイドホルモン受容体とホルモン受容体応答要素を含む核酸との間の分子化学量論が、試験キット／アッセイの構成要素部分、ならびに試験される試料の性質に応じて変動し得ることを理解するであろう。例えば、試験キット／アッセイは、限定されないが、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体アルファ、エストロゲン受容体ベータ、プロゲステロン受容体Ａ、プロゲステロン受容体Ｂ、鉱質コルチコイド受容体、およびグルココルチコイド受容体を含む、異なるステロイドホルモン受容体に結合するリガンドを検出するように構成され得、ステロイドホルモン受容体とその相補的な核酸／応答要素との間の比が、（例えば）約１：１～約２０：１であり得る。
【0091】
したがって、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるなお別の例では、
（ｉ）試験キットは、アンドロゲン受容体を含み、アンドロゲン受容体対アンドロゲン応答要素を含む核酸の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｉ）試験キットは、エストロゲン受容体を含み、エストロゲン受容体対エストロゲン応答要素を含む核酸の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｉｉ）試験キットは、プロゲステロン受容体を含み、プロゲステロン受容体対プロゲステロン応答要素を含む核酸の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｖ）試験キットは、鉱質コルチコイド受容体を含み、鉱質コルチコイド受容体対鉱質コルチコイド応答要素を含む核酸の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｖ）試験キットは、グルココルチコイド受容体を含み、グルココルチコイド受容体対グルココルチコイド応答要素を含む核酸の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１である。
（ｉ）試験キットは、アンドロゲン受容体を含み、アンドロゲン受容体対アンドロゲン応答要素を含む核酸の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｉ）試験キットは、エストロゲン受容体を含み、エストロゲン受容体対エストロゲン応答要素を含む核酸の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｉｉ）試験キットは、プロゲステロン受容体を含み、プロゲステロン受容体対プロゲステロン応答要素を含む核酸の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｖ）試験キットは、鉱質コルチコイド受容体を含み、鉱質コルチコイド受容体対鉱質コルチコイド応答要素を含む核酸の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｖ）試験キットは、グルココルチコイド受容体を含み、グルココルチコイド受容体対グルココルチコイド応答要素を含む核酸の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１である。
【0092】
上の考慮事項にもかかわらず、受容体が多すぎる場合、多すぎる受容体自体が、相補的応答要素へのリガンド－受容体複合体の最適な結合を妨げる熱力学的または速度論的障壁を生じ得るので、アッセイが飽和しないように注意する必要がある。本明細書に提供される開示によれば、当業者は、通常の実験を行って、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法の性能について、ステロイドホルモン受容体の最適化された濃度／範囲を滴定することができる（例えば、以下の実施例２．３を参照されたい）。
【0093】
前述のように、出願人らはさらに、ステロイドホルモン受容体が、そのステロイドホルモン受容体に特異的なリガンドの非存在下で、対応する核酸応答要素に結合し、かつそれを活性化するある程度の能力を保持することを決定した。この現象は、時折核酸応答要素の自動活性化と称される。分子の複雑さが低減することによって、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイでは自動活性化のレベルが顕著に低下するが、リガンドの非存在下で、参照閾値（すなわち、応答要素の自動活性化の結果としてのベースラインシグナル）を決定して、標的リガンドを含有する試料の存在下での絶対アッセイシグナル／読み取り値の決定を支援することが望ましい場合がある。
【0094】
したがって、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による別の例では、レポーター構築物の転写の低減または阻害は、参照閾値と比較して測定される。
【0095】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるなお別の例では、レポーター構築物の転写の低減または阻害は、試験試料の非存在下でレポーター構築物の転写を測定することによって決定した参照閾値と比較して測定される。
【0096】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるなおさらなる例では、レポーター構築物の転写の低減または阻害は、試験試料の非存在下および受容体の非存在下でレポーター構築物の転写を測定することによって決定した参照閾値と比較して測定される。
【0097】
アッセイの特異性および性能を向上するための並行アプローチでは、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法は、少なくとも１つのステロイドホルモン受容体補因子を含むように改変され得る。補因子の主な目的は、ステロイドホルモン受容体を不活性なコンフォメーションに保持し、それによって標的リガンドの非存在下でホルモン応答要素に結合し、かつそれを活性化するのを防止することである。
【0098】
試験キットを試験試料と接触させる（または組み合わせる）と、リガンドの存在による補因子の移動が引き起こされ、次いでリガンド結合受容体は、自由に第２のリガンド結合受容体およびホルモン応答要素と複合体を形成する。
【0099】
したがって、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による別の例では、試験キットまたはアッセイ方法は、少なくとも１つのステロイドホルモン受容体補因子をさらに含む。
【0100】
関連する例では、ステロイドホルモン受容体補因子としては、限定されないが、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択される、ステロイドホルモン受容体補因子が挙げられる。
【0101】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるさらに関連する例では、試験キットまたはアッセイ方法は、熱ショックタンパク質９０をさらに含む。
【0102】
しかしながら、ステロイドホルモン受容体補因子の存在は、本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法の必須の特色ではないことが、当業者によって理解されるであろう。これは、補因子の非存在下でもアッセイ結果を達成することができることが理由である。例えば、実施例１／図４に提示されたデータは、熱ショックタンパク質９０の非存在下では、リガンドアッセイ結果と非リガンドアッセイ結果（すなわち、ＡＲ／Ｔ対ＡＲ）との間のシグナルに、依然として測定可能な差があったことを示している。
【0103】
実際、例えば、アッセイ方法が実施される温度を改変することによって、非リガンド受容体によるホルモン応答要素の自動活性化によって生成されるシグナルの量を最小限に抑えるさらなるアプローチが存在する。
【0104】
出願人らは、その核酸応答要素に対する、リガンド結合ステロイドホルモン受容体と非リガンド結合ステロイドホルモン受容体との間の結合親和性／動態の差を観察した。したがって、本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法は、非リガンド結合受容体よりもリガンド結合受容体によるホルモン応答要素の活性化を優先的に測定し、それによって非リガンド結合受容体によって生成されるバックグラウンドシグナルを最小限に抑える温度または温度範囲で実施することができる。
【0105】
したがって、本発明のこの態様によるなお別の例では、試験キットまたはアッセイ方法の性能は、約２５℃～約４２℃、好ましくは約３５℃～約３７℃の温度範囲で実行される。
【0106】
「約２５℃～約４２℃の温度範囲」という用語は、２５℃～４２℃の任意の温度を含むことを意図し、限定されないが、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、および４２℃が挙げられる。当業者は、小数点範囲の温度も使用され得ることを認識するであろう。この点をさらに説明するために、「約３５℃～約３７℃の温度範囲で」としては、限定されないが、３５．０℃、３５．１℃、３５．２℃、３５．３℃、３５．４℃、３５．５℃、３５．６℃、３５．７℃、３５．８℃、３５．９℃、３６．０℃、３６．１℃、３６．２℃、３６．３℃、３６．４℃、３６．５℃、３６．６℃、３６．７℃、３６．８℃、３６．９℃、および３７．０℃が挙げられる。
【0107】
出願人らはさらに、補因子とステロイドホルモン受容体との間の化学量論的関係を操作して、アッセイ感受性をさらに向上することができることを発見した。例えば、実施例２に記載のアンドロゲンアッセイプロトタイプ２によれば、ＡＲは、ＨＳＰ９０：ＡＲ比が約１．２２～４．８８であると、ＡＲ特異的リガンドによって活性化され、ＡＲＥに結合するのに最も効果的であることが出願人らによって決定された。
【0108】
したがって、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるさらなる例では、ＨＳＰ９０対ステロイドホルモン受容体の比は、約１：１～約５：１であると定義される。これとしては、限定されないが、１．０：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５；１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２．０：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５；１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３．０：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５；１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４．０：１、４．１：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５；１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１、または５．０：１として定義される、ＨＳＰ９０対ステロイドホルモン受容体の比が挙げられる。
【0109】
しかしながら、当業者は、ステロイドホルモン受容体補因子とステロイドホルモン受容体との間の分子化学量論が、試験キット／アッセイの組成に応じて変動し得ることを理解するであろう。例えば、試験キット／アッセイは、エストロゲン受容体アルファまたはエストロゲン受容体ベータを含むエストロゲン受容体に結合するリガンドを検出するように構成することができ、エストロゲン受容体補因子とエストロゲン受容体との間の比は、（例えば）約１：１～約２０：１であり得る。
【0110】
したがって、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるなお別の例では、
（ｉ）試験キットは、アンドロゲン受容体を含み、アンドロゲン受容体補因子対アンドロゲン受容体の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｉ）試験キットは、エストロゲン受容体を含み、エストロゲン受容体補因子対エストロゲン受容体の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｉｉ）試験キットは、プロゲステロン受容体を含み、プロゲステロン受容体補因子対プロゲステロン受容体の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｖ）試験キットは、鉱質コルチコイド受容体を含み、鉱質コルチコイド補因子対鉱質コルチコイド受容体の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｖ）試験キットは、グルココルチコイド受容体を含み、グルココルチコイド受容体補因子対グルココルチコイド受容体の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１である。
（ｉ）試験キットは、アンドロゲン受容体を含み、アンドロゲン受容体補因子対アンドロゲン受容体の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｉ）試験キットは、エストロゲン受容体を含み、エストロゲン受容体補因子対エストロゲン受容体の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｉｉ）試験キットは、プロゲステロン受容体を含み、プロゲステロン受容体補因子対プロゲステロン受容体の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｉｖ）試験キットは、鉱質コルチコイド受容体を含み、鉱質コルチコイド補因子対鉱質コルチコイド受容体の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１であり、
（ｖ）試験キットは、グルココルチコイド受容体を含み、グルココルチコイド受容体補因子対グルココルチコイド受容体の比は、限定されないが、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、または２０：１を含む、約１：１～約２０：１である。
【0111】
実施例４の表９の情報は、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法の組成を考慮するときの分子化学量論の議論に関連する重要な考慮事項を要約しており、これは、特に実施例１～３に付随するデータによって裏付けられている。
【0112】
本発明によるアッセイ反応ミックスは、典型的には、１０μＬ～５０μＬの間の総体積を含有するであろう。表９に要約されている情報によれば、これは以下を意味する：
（ｉ）ステロイドホルモン受容体の濃度は、限定されないが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７ ３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｎＭのステロイドホルモン受容体を含む、約１０ｎＭ～約６０ｎＭによって定義される範囲内に保持されるべきであり、
（ｉｉ）ホルモン応答要素を含む核酸分子の濃度は、限定されないが、０．７０、０．８０、０．９０、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、または３．３ｎＭの核酸分子を含む、約０．７０ｎＭ～約３．５ｎＭによって定義される範囲内に保持されるべきであり、
（ｉｉｉ）存在する場合、熱ショックタンパク質９０の濃度は、限定されないが、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｎＭの熱ショックタンパク質９０を含む、約４０ｎＭ～約６０ｎＭによって定義される範囲内に保持されるべきである。
（ｉ）ステロイドホルモン受容体の濃度は、限定されないが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７ ３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｎＭのステロイドホルモン受容体を含む、約１０ｎＭ～約６０ｎＭによって定義される範囲内に保持されるべきであり、
（ｉｉ）ホルモン応答要素を含む核酸分子の濃度は、限定されないが、０．７０、０．８０、０．９０、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、または３．３ｎＭの核酸分子を含む、約０．７０ｎＭ～約３．５ｎＭによって定義される範囲内に保持されるべきであり、
（ｉｉｉ）存在する場合、熱ショックタンパク質９０の濃度は、限定されないが、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｎＭの熱ショックタンパク質９０を含む、約４０ｎＭ～約６０ｎＭによって定義される範囲内に保持されるべきである。
【0113】
さらなる考慮事項は、酵素の濃度／量であり、約２００，０００Ｕの絶対ベースライン閾値活性を想定して、反応ミックス中に約５０～１００個の酵素単位（Ｕ）を用いると、最適なアッセイ結果が達成された。図１０および１１を参照されたい。
【0114】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるなお別の例では、転写の低減または阻害は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、および真核生物ウイルスＲＮＡポリメラーゼから選択される単一のポリペプチドポリメラーゼによって媒介される転写の低減または阻害である。
【0115】
関連する例では、ポリメラーゼは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼである。さらに関連する例では、プロモーター配列は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ開始配列である。
【0116】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるなお別の例では、ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるバクテリオファージポリメラーゼである。
【0117】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による別の例では、バクテリオファージポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。
【0118】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による別の例では、プロモーター配列は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ開始配列である。
【0119】
関連する例では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ開始配列は、５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’（配列番号１）によって定義される配列を含む。
【0120】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるさらなる例では、バクテリオファージポリメラーゼは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼであり、プロモーター配列は、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ開始配列である。
【0121】
関連する例では、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ開始配列は、５’－ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ－３’（配列番号２）によって定義される配列を含む。
【0122】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるなおさらなる例では、バクテリオファージポリメラーゼは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼであり、プロモーター配列は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ開始配列である。
【0123】
関連する例では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ開始配列は、５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’（配列番号３）によって定義される配列を含む。
【0124】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるなお別の例では、レポーター構築物は、転写されてＲＮＡアプタマーを形成すると、フルオロフォアに結合し、それによって蛍光シグナルを生成することが可能であるＲＮＡアプタマーをコードする配列を含む。
【0125】
関連する例では、ＲＮＡアプタマーの二次構造形成を促進し、それによってそのフルオロフォア（複数可）との結合相互作用を最適化するＲＮＡ足場によって、ＲＮＡアプタマーはさらに支持される。さらに関連する例では、ＲＮＡ足場としては、限定されないが、Ｆ３０が挙げられる。
【0126】
別の例では、ＲＮＡアプタマーは、限定されないが、Ｍａｎｇｏ Ｉ、Ｍａｎｇｏ ＩＩ、Ｍａｎｇｏ ＩＩＩ、およびＭａｎｇｏ ＩＶを含む、Ｍａｎｇｏである。関連する例では、Ｍａｎｇｏ ＲＮＡアプタマーに結合し、それによって蛍光シグナルを生成するフルオロフォアは、ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅ（ＴＯ）の誘導体である。
【0127】
別の例では、ＲＮＡアプタマーは、Ｓｐｉｎａｃｈ、ｉＳｐｉｎａｃｈ、ベビーＳｐｉｎａｃｈ、およびＢｒｏｃｃｏｌｉから選択される。関連する例では、ＳｐｉｎａｃｈまたはＢｒｏｃｃｏｌｉ ＲＮＡアプタマーに結合し、それによって蛍光シグナルを生成するフルオロフォアは、３，５－ジフルオロ－４－ヒドロキシベンジリデンイミダゾリノン（ＤＦＨＢＩ）である。
【0128】
別の例では、ＲＮＡアプタマーは、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎである。関連する例では、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡアプタマーに結合し、それによって蛍光シグナルを生成するフルオロフォアはｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎである。
【0129】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるさらなる例では、レポーター構築物は、ＲＮＡアプタマーの単一の配列コピー、またはＲＮＡアプタマーの複数の配列コピーを含む。「複数の配列コピー」という用語は、限定されないが、ＲＮＡアプタマーをコードする配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２個以上のコピーを意味することを意図する。当業者は、ＲＮＡアプタマー配列のコピー数が、通常のアッセイ最適化によって決定した、最適なシグナル対ノイズ比によって制御されるであろうことを認識するであろう。
【0130】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による他の例では、レポーター構築物は、ＲＮＡ分析によって検出することができるタンパク質またはポリペプチドをコードするまたはコードしない遺伝子からなる群から選択される。
【0131】
したがって、本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法は、例えば、試験試料が、ステロイドホルモン受容体活性を有するリガンドの存在について試料をスクリーニングする手段としてのアッセイと組み合わせられると、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）または相補的デオキシリボース核酸（ｃＤＮＡ）レベルを調査することによって、レポーター構築物の転写レベルを検出するように構成され得る。
【0132】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法によるなおさらなる例では、レポーター構築物の転写の低減または阻害は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量的ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ、ｑＰＣＲとしても知られる）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、逆転写ｑＰＣＲ（ＲＴｑＰＣＲ）、逆転写デジタルＰＣＲ（ＲＴｄＰＣＲ）、ＲＮＡｓｅｑまたはインサイチュハイブリダイゼーションを使用して測定することができる。
【0133】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による他の例では、（例えば）ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含むレポーター遺伝子転写レベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムｑＰＣＲおよび逆転写ｑＰＣＲを含む、ｑＰＣＲ）などの確立された技法を使用して、または挿入色素の検出もしくは蛍光ヌクレオチドの直接添加に基づく蛍光などの他の技法を使用して、半定量的／定量的であり得る。例えば、本明細書に記載のように、ＲＮＡアプタマーに結合してＲＮＡ－フルオロフォア複合体を形成するフルオロフォアの使用。これらおよび他の技法は、当業者に既知であろう。
【0134】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、エストロゲン受容体－アルファ（ＥＲ－α）、エストロゲン受容体－ベータ（ＥＲ－β）、プロゲステロン受容体Ａ（ＰＲＡ）、プロゲステロン受容体Ｂ（ＰＲＢ）、鉱質コルチコイド受容体（ＭＲ）、およびグルココルチコイド受容体（ＧＲ）を含むステロイドホルモン受容体に結合するであろう既知および未知の両方の構造の様々なリガンドの検出のために構成されている。
【0135】
アンドロゲン受容体に結合することが知られているリガンドの例としては、限定されないが、テストステロン、ジヒドロテストステロン；限定されないが、ＴＲＥＮＡ、１７α－トレンボロン、１７β－トレンボロン、トレンジオン、ナンドロロン、ボルデノン、アルトレノゲストを含むアンドロゲンアナボリックステロイド（ＡＡＳ）；限定されないが、９３７４６、ＢＭＳ－５４６９２９、ＬＧＤ４０３３、ＡＣＰ１０５、ＹＫ－１１、アンダリン、リガンドロール、オスタリンを含む選択的アンドロゲン受容体モジュレーター（ＳＡＲＭ）が挙げられる。
【0136】
エストロゲン受容体アルファに結合することが知られているリガンドの例としては、限定されないが、エストラジオール、エストロン、エストリオール；ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェン、オスペミフェン、ラソフォキシフェン、シクロフェニル、クロミフェン、ブロパレストロール、バセドキシフェン（Ｂａｓｅｄｏｘｉｆｅｎｅ）、アノルドリンを含む選択的エストロゲン受容体モジュレーター；限定されないが、ポリフェノール（レスベラトロール）、フラバノン（エリオジクチオール、ヘスペレチン、ホモエリオジクチオール、ナリンゲニン）、フラボン（アピゲニン、ルテオリン、タンゲリチン（Ｔａｎｇｅｒｉｔｉｎ））、フラボノール（フィセチン、ケンペロール、ミリセチン、パキポドール、ケルセチン、ラムナジン）、カテキン（プロアントシアニド（Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｅ））、イソフラボノイド（イソフラボンビオカニンＡ、クリシテイン（Ｃｌｙｃｉｔｅｉｎ）、ダイゼイン、ホルモノネチン、ゲニステイン）、イソフラバン（エクオール）、クメスタン（クメストロール）などの食物エストロゲンを含むフィトエストロゲン；限定されないが、ジクロロジフェニルトリクロロエタン（ＤＤＴ）、ダイオキシン、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）、ポリ臭化ビフェニル（ＰＢＢ）、フタレートエステル、エンドスルファン、アトラジン、ゼラノールを含むエストロゲン様内分泌かく乱化学物質（ＥＥＤＣ）；ヒドラジド誘導体などのデザイナー化合物が挙げられる。
【0137】
エストロゲン受容体ベータに結合することが知られているリガンドの例としては、限定されないが、エストロゲン受容体アルファに結合するすべてのリガンド、ならびにジアリールプロピオニトリル（ＤＰＮ）、ならびにＷａｙ－６５９、Ｗａｙ－８１８およびＷａｙ－２０００７０などのＷｙｅｔｈ由来のベンゾオキサゾールが挙げられる。
【0138】
プロゲステロン受容体Ａおよびプロゲステロン受容体Ｂに結合することが知られているリガンドの例としては、限定されないが、プロゲステロン、ノルエチステロン、レボノルゲストレル、メドロキシプロゲステロンアセテート、メゲストロールアセテート、ジドロゲステロン、ドロスピレノン；ウリプリスタルアセテート、テラプリストンアセテート、ビラプリサン（Ｖｉｌａｐｒｉｓａｎ）、アソプリスニル、アソプリスニルエカメート（Ｅｃａｍａｔｅ）を含む選択的プロゲステロン受容体モジュレーター；ミフェプリストン、オナプリストン、リロプリトン（Ｌｉｌｏｐｒｉｔｏｎｅ）、およびゲストリノンを含む抗プロゲスチンが挙げられる。
【0139】
鉱質コルチコイド受容体に結合することが知られているリガンドの例としては、限定されないが、アルドステロン；フルドロコルチゾンなどの合成鉱質コルチコイド；スピロノラクトンおよびエプレレノンなどの抗鉱質コルチコイド；以下に記載のものなどのグルココルチコイド受容体リガンドが挙げられる。
【0140】
グルココルチコイド受容体に結合することが知られているリガンドの例としては、限定されないが、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、アムシノニド、ブデソニド、デソニド、フルオシノニド、ハルシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルオコルトロン、ハロメタゾン、モメタゾン、またはアンタゴニストとしてのミフェプリストン、およびケトコナゾールが挙げられる。
【0141】
例示的なアッセイ構成要素および構築物
試料中に存在するリガンドによって活性化されたステロイドホルモン受容体は二量体化し（すなわち、定義されたように受容体－リガンド複合体を形成し）、その相補的なホルモン応答要素に結合するであろう。本明細書に記載の試験キットおよびアッセイでは、ホルモン応答要素がレポーター構築物に連結され、レポーター構築物の物理的特性の変化を使用して、調査下の試料中のリガンドの存在を表すことができる。本発明による例示的なホルモン応答要素としては、アンドロゲン応答要素（ＡＲＥ）、エストロゲン応答要素（ＥＲＥ）、プロゲステロン応答要素（ＰＲＥ）、鉱質コルチコイド応答要素（ＭＲＥ）、およびグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）が挙げられる。
試料中に存在するリガンドによって活性化されたステロイドホルモン受容体は二量体化し（すなわち、定義されたように受容体－リガンド複合体を形成し）、その相補的なホルモン応答要素に結合するであろう。本明細書に記載の試験キットおよびアッセイでは、ホルモン応答要素がレポーター構築物に連結され、レポーター構築物の物理的特性の変化を使用して、調査下の試料中のリガンドの存在を表すことができる。本発明による例示的なホルモン応答要素としては、アンドロゲン応答要素（ＡＲＥ）、エストロゲン応答要素（ＥＲＥ）、プロゲステロン応答要素（ＰＲＥ）、鉱質コルチコイド応答要素（ＭＲＥ）、およびグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）が挙げられる。
【0142】
前述のように、様々なホルモン応答要素は、活性化リガンド－受容体複合体に選択的に結合するように構成された結合モチーフが組み込まれている。例えば、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲステロン、鉱質コルチコイド、およびグルココルチコイド応答要素の各々は、ジンクフィンガー結合モチーフを介して、それらの二次構造配向において二量体化リガンド受容体複合体（すなわち、（ＨＲ－Ｌ）２）の結合を促進する不完全な２つの六量体（ｄｉｈｅｘａｍｅｒｉｃ）パリンドローム配列を含む。
【0143】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による一例では、アンドロゲン応答要素は、活性化アンドロゲン受容体に結合するＤＮＡ結合モチーフを含む。関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフは、リガンド結合アンドロゲン受容体の二量体（すなわち（ＡＲ－Ｌ）２、「ＡＲ」が、アンドロゲン受容体であり、「Ｌ」が、リガンドである）に結合する。関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフは、活性化アンドロゲン受容体とアンドロゲン応答要素との間に結合特異性を生じる、不完全な２つの六量体パリンドローム配列を含む。さらに関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフを含むアンドロゲン応答要素は、二本鎖デオキシリボ核酸である。
【0144】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による一例では、エストロゲン応答要素は、活性化エストロゲン受容体に結合するＤＮＡ結合モチーフを含む。関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフは、リガンド結合エストロゲン受容体の二量体（すなわち（ＥＲ－Ｌ）２、「ＥＲ」が、ＥＲ－αまたはＥＲ－βから選択されるエストロゲン受容体である）に結合する。さらに関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフは、活性化エストロゲン受容体とエストロゲン応答要素との間に結合特異性を生じる、不完全な２つの六量体パリンドローム配列を含む。さらに関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフを含むエストロゲン応答要素は、二本鎖デオキシリボ核酸である。
【0145】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による一例では、プロゲステロン応答要素は、活性化プロゲステロン受容体に結合するＤＮＡ結合モチーフを含む。関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフは、リガンド結合プロゲステロン受容体の二量体（すなわち（ＰＲ－Ｌ）２、「ＰＲ」が、ＰＲＡまたはＰＲＢから選択されるプロゲステロン受容体である）に結合する。さらに関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフは、活性化プロゲステロン受容体とプロゲステロン応答要素との間に結合特異性を生じる、不完全な２つの六量体パリンドローム配列を含む。さらに関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフを含むプロゲステロン応答要素は、二本鎖デオキシリボ核酸である。
【0146】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による一例では、鉱質コルチコイド応答要素は、活性化鉱質コルチコイド受容体に選択的に結合するＤＮＡ結合モチーフを含む。関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフは、リガンド結合鉱質コルチコイド受容体の二量体（すなわち（ＭＲ－Ｌ）２、「ＭＲ」が、鉱質コルチコイド受容体である）に結合する。さらに関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフは、活性化鉱質コルチコイド受容体と鉱質コルチコイド応答要素との間に結合特異性を生じる、不完全な２つの六量体パリンドローム配列を含む。さらに関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフを含む鉱質コルチコイド応答要素は、二本鎖デオキシリボ核酸である。
【0147】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による一例では、グルココルチコイド応答要素は、活性化グルココルチコイド受容体に選択的に結合するＤＮＡ結合モチーフを含む。関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフは、リガンド結合グルココルチコイド受容体の二量体（すなわち（ＧＲ－Ｌ）２、「ＧＲ」が、グルココルチコイド受容体である）に結合する。さらに関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフは、活性化グルココルチコイド受容体とグルココルチコイド応答要素との間に結合特異性を生じる、不完全な２つの六量体パリンドローム配列を含む。さらに関連する例では、ＤＮＡ結合モチーフを含むグルココルチコイド応答要素は、二本鎖デオキシリボ核酸である。
【0148】
テストステロン、ジヒドロテストステロン、合成ステロイドホルモン（例えば、ＡＡＳ）、および選択的アンドロゲン受容体モジュレーター（すなわち、ＳＡＲＭ）、およびフィトまたはキセノアンドロゲンなどのアンドロゲン受容体に結合し、かつそれを活性化するリガンドの検出は、活性化アンドロゲン受容体複合体に結合することが可能なアンドロゲン応答要素と一緒にアンドロゲン受容体を含む、試験キット／アッセイを必要とする。
【0149】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による一例では、アンドロゲン応答要素は、配列５’－ＡＧＡＡＣＡｎｎｎＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号４）を含むか、またはそれからなり、ｎが、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＡから選択される任意の核酸塩基である。その相補的アンチセンス配列は、５’－ＡＧＡＡＣＡｎｎｎＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号５）として定義され、ｎが、配列番号４と５との間の配列アラインメントに基づいて配列番号４に相補的である塩基（すなわち、Ａ＝Ｔ、Ｔ＝Ａ、Ｇ＝Ｃ、Ｃ＝Ｇ）を表す。
【0150】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による別の例では、アンドロゲン応答要素は、配列５’－ＧＧＴＡＣＡｎｎｎＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号６）を含むか、またはそれからなり、ｎが、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＡから選択される任意の核酸塩基である。その相補的アンチセンス配列は、５’－ＡＧＡＡＣＡｎｎｎＴＧＴＡＣＣ－３’（配列番号７）として定義され、ｎが、配列番号６と７との間の配列アラインメントに基づいて配列番号６に相補的である塩基（すなわち、Ａ＝Ｔ、Ｔ＝Ａ、Ｇ＝Ｃ、Ｃ＝Ｇ）を表す。
【0151】
エストラジオール、エストロン、フィトおよびキセノエストロゲンを含む他のエストロゲン様ステロイドホルモン、ならびに選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）などの、エストロゲン受容体に結合し、かつそれを活性化するリガンドの検出は、活性化エストロゲン受容体複合体に結合することが可能なエストロゲン応答要素と一緒にエストロゲン受容体アルファ（ＥＲ－α）またはエストロゲン受容体ベータ（ＥＲ－β）のいずれかを含む、試験キット／アッセイを必要とする。
【0152】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による一例では、エストロゲン応答要素は、配列５’－ＡＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣＴ－３’（配列番号８）を含むか、またはそれからなり、ｎが、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＡから選択される任意の核酸塩基である。その相補的アンチセンス配列は、５’－ＡＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣＴ－３’（配列番号９）として定義され、ｎが、配列番号８と９との間の配列アラインメントに基づいて配列番号８に相補的である塩基（すなわち、Ａ＝Ｔ、Ｔ＝Ａ、Ｇ＝Ｃ、Ｃ＝Ｇ）を表す。
【0153】
プロゲステロン、ノルエチステロン、レボノルゲストレル、他のプロゲステロン様ステロイドホルモン、および選択的プロゲステロン受容体モジュレーター（ＳＰＲＭ）などの、プロゲステロン受容体に結合し、かつそれを活性化するリガンドの検出は、活性化プロゲステロン受容体複合体に結合することが可能なプロゲステロン応答要素と一緒にプロゲステロン受容体Ａ（ＰＲＡ）またはプロゲステロン受容体Ｂ（ＰＲＢ）のいずれかを含む、試験キット／アッセイを必要とする。
【0154】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による一例では、プロゲステロン応答要素は、配列５’－ＧＧＴＡＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１０）を含むか、またはそれからなる。その相補的アンチセンス配列は、５’－ＡＧＡＡＣＡＧＴＴＴＧＴＡＣＣ－３’（配列番号１１）として定義される。
【0155】
アルドステロン、フルドロコルチゾンなどの合成鉱質コルチコイド、ならびにスピロノラクトンおよびエプレレノンなどの抗鉱質コルチコイドなどの鉱質コルチコイド受容体に結合し、かつそれを活性化するリガンドの検出は、活性化鉱質コルチコイド受容体複合体に結合することが可能な鉱質コルチコイド応答要素と一緒に鉱質コルチコイド受容体を含む、試験キット／アッセイを必要とする。
【0156】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による別の例では、鉱質コルチコイド応答要素は、配列５’－ＡＧＡＡＣＡｎＡＡＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１２）を含むか、またはそれからなり、ｎが、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＡから選択される任意の核酸塩基である。その相補的アンチセンス配列は、５’－ＡＧＡＡＣＡＴＴｎＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１３）として定義され、ｎが、配列番号１２と１３との間の配列アラインメントに基づいて配列番号１２に相補的である塩基（すなわち、Ａ＝Ｔ、Ｔ＝Ａ、Ｇ＝Ｃ、Ｃ＝Ｇ）を表す。
【0157】
コルチゾール、デキサメタゾン、および１１－ジヒドロコルチコステロンなどのグルココルチコイド受容体に結合し、かつそれを活性化するリガンドの検出は、活性化グルココルチコイド受容体複合体に結合することが可能なグルココルチコイド応答要素と一緒にグルココルチコイド受容体を含む、試験キット／アッセイを必要とする。
【0158】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による別の例では、グルココルチコイド応答要素は、配列５’－ＡＧＡＡＣＡｎＡＡＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１２）を含むか、またはそれからなり、ｎが、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＡから選択される任意の核酸塩基である。その相補的アンチセンス配列は、５’－ＡＧＡＡＣＡＴＴｎＴＧＴＴＣＴ－３’（配列番号１３）として定義され、ｎが、配列番号１２と１３との間の配列アラインメントに基づいて配列番号１２に相補的である塩基（すなわち、Ａ＝Ｔ、Ｔ＝Ａ、Ｇ＝Ｃ、Ｃ＝Ｇ）を表す。
【0159】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による例示的な核酸配列としては、限定されないが、以下が挙げられる：
Ｔ７ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター／開始配列を表す。
Ｔ７ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ７ｉが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター／開始配列を表す。
【0160】
関連する例では、Ｔ７ｉプロモーター／開始配列は、５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’（配列番号１）によって定義される。
【0161】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による代替的な例示的な核酸配列としては、限定されないが、以下が挙げられる：
Ｔ３ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉが、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターまたは開始配列を表す。
Ｔ３ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
Ｔ３ｉが、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターまたは開始配列を表す。
【0162】
関連する例では、Ｔ３ｉプロモーター／開始配列は、５’－ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ－３’（配列番号２）によって定義される。
【0163】
本明細書に記載の試験キットおよびアッセイ方法による代替的な例示的な核酸配列としては、以下が挙げられる：
ＳＰ６ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉが、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターまたは開始配列を表す。
ＳＰ６ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－Ｆ３０－ＭａｎｇｏＩＩ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈ：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＡＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＥＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＰＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＭＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉ－ＧＲＥ（ｎ）－ｉＳｐｉｎａｃｈｘ３：ｎ＝１，２，３，４、
ＳＰ６ｉが、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターまたは開始配列を表す。
【0164】
関連する例では、ＳＰ６ｉプロモーター／開始配列は、５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’（配列番号３）によって定義される。
【0165】
本発明による別の例では、試験キットおよび／またはアッセイ方法は、アンドロゲン受容体に結合するリガンドを検出するように構成され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ開始配列、アンドロゲン応答要素、ならびにＦ３０足場およびＭａｎｇｏ ＩＩ ＲＮＡアプタマーをコードするレポーター構築物で構成される核酸配列が、以下の配列番号１４に記載の配列を含む：
［配列番号１４］
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡ３’
［配列番号１４］
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡ３’
【0166】
本発明によるなお別の例では、試験キットおよび／またはアッセイ方法は、エストロゲン受容体アルファまたはエストロゲン受容体ベータに結合するリガンドを検出するように構成され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ開始配列、エストロゲン応答要素、ならびにＦ３０足場およびＭａｎｇｏ ＩＩ ＲＮＡアプタマーをコードするレポーター構築物で構成される核酸配列が、以下の配列番号１５に記載の配列を含む：
［配列番号１５］
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＡＣＣＴＧＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡ３’
［配列番号１５］
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＡＣＣＴＧＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡ３’
【0167】
本発明によるなおさらなる例では、試験キットおよび／またはアッセイ方法は、プロゲステロン受容体Ａまたはプロゲステロン受容体Ｂに結合するリガンドを検出するように構成され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ開始配列、プロゲステロン応答要素、ならびにＦ３０足場およびＭａｎｇｏ ＩＩ ＲＮＡアプタマーをコードするレポーター構築物で構成される核酸配列が、以下の配列番号１６に記載の配列を含む：
［配列番号１６］
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡ３’
［配列番号１６］
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡ３’
【0168】
本発明による別の例では、試験キットおよび／またはアッセイ方法は、鉱質コルチコイド受容体に結合するリガンドを検出するように構成され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ開始配列、鉱質コルチコイド応答要素、ならびにＦ３０足場およびＭａｎｇｏ ＩＩ ＲＮＡアプタマーをコードするレポーター構築物で構成される核酸配列が、以下の配列番号１７に記載の配列を含む：
［配列番号１７］
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡ３’
［配列番号１７］
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡ３’
【0169】
本発明による別の例では、試験キットおよび／またはアッセイ方法は、グルココルチコイド受容体に結合するリガンドを検出するように構成され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ開始配列、グルココルチコイド応答要素、ならびにＦ３０足場およびＭａｎｇｏ ＩＩ ＲＮＡアプタマーをコードするレポーター構築物で構成される核酸配列が、以下の配列番号１８に記載の配列を含む：
［配列番号１８］
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡ３’
［配列番号１８］
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡ３’
【0170】
本発明による試験キットおよびアッセイ方法で使用するための他の核酸／構築物を、以下の表１に要約する。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【0171】
マルチプレックスアッセイシステム
本発明はさらに、同じ試験試料から２つ以上のステロイドホルモンゲノム応答を検出するように構成されたマルチプレックスアッセイを企図する。
本発明はさらに、同じ試験試料から２つ以上のステロイドホルモンゲノム応答を検出するように構成されたマルチプレックスアッセイを企図する。
【0172】
マルチプレックスシステムの関連性をさらに説明するために、ある特定の状況では、例えば、対象のホルモン状態を調査する臨床医が、対象のアンドロゲンおよびエストロゲンレベル／活性の両方を知ることが有用であろう。
【0173】
アンドロゲン受容体に結合するリガンドは、同じアッセイに存在するエストロゲン受容体に結合せずかつそれを活性化せず、逆に、エストロゲン受容体に結合するリガンドは、また同じアッセイに存在するアンドロゲン受容体に結合せずまたそれを活性化しないであろうので、同じ試験試料からのアンドロゲンリガンドおよびエストロゲンリガンドを並行検出することが可能である。これは、アンドロゲン受容体およびエストロゲン受容体が、異なるステロイドホルモン受容体クラスに属しているので、受容体活性化の観点で「クロストーク」がないことが理由である。そのため、同じ試料からアンドロゲンリガンドおよびエストロゲンリガンドの両方を検出するためのマルチプレックスアッセイが開発された。
【0174】
したがって、本発明の別の態様では、アンドロゲンリガンドおよび／またはエストロゲンリガンドを並行検出するための、試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）アンドロゲン受容体が、試料からの相補的リガンドとアンドロゲン受容体－リガンド複合体を形成することが可能である、アンドロゲン受容体と、
（ｉｉ）第１の核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）アンドロゲン受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能であるアンドロゲン応答要素、および
（ｃ）第１のレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、第１の核酸分子と、
（ｉｉｉ）エストロゲン受容体が、試料からの相補的リガンドとエストロゲン受容体－リガンド複合体を形成することが可能である、エストロゲン受容体と、
（ｉｖ）第２の核酸分子であって、
（ｄ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｅ）エトロゲン受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能であるエストロゲン応答要素、および
（ｆ）第２のレポーター構築物を含む、第２の核酸分子と、
（ｉｖ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、を含み、
第１および第２のレポーター構築物が異なり、
試料が試験キットと組み合わせられると、アンドロゲン受容体－リガンド複合体が応答要素に結合することによって引き起こされる第１のレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のアンドロゲンリガンドの存在が検出され、
試料が試験キットと組み合わせられると、エストロゲン受容体－リガンド複合体が応答要素に結合することによって引き起こされる第２のレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のエストロゲンリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）アンドロゲン受容体が、試料からの相補的リガンドとアンドロゲン受容体－リガンド複合体を形成することが可能である、アンドロゲン受容体と、
（ｉｉ）第１の核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）アンドロゲン受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能であるアンドロゲン応答要素、および
（ｃ）第１のレポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、第１の核酸分子と、
（ｉｉｉ）エストロゲン受容体が、試料からの相補的リガンドとエストロゲン受容体－リガンド複合体を形成することが可能である、エストロゲン受容体と、
（ｉｖ）第２の核酸分子であって、
（ｄ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｅ）エトロゲン受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能であるエストロゲン応答要素、および
（ｆ）第２のレポーター構築物を含む、第２の核酸分子と、
（ｉｖ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、を含み、
第１および第２のレポーター構築物が異なり、
試料が試験キットと組み合わせられると、アンドロゲン受容体－リガンド複合体が応答要素に結合することによって引き起こされる第１のレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のアンドロゲンリガンドの存在が検出され、
試料が試験キットと組み合わせられると、エストロゲン受容体－リガンド複合体が応答要素に結合することによって引き起こされる第２のレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のエストロゲンリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0175】
本発明のこの態様による一例では、試験キットは、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体をさらに含む。
【0176】
本発明のこの態様による一例では、第１および第２の核酸分子は、別個の分子である。
【0177】
本発明のこの態様による別の例では、第１および第２の核酸分子は、操作可能に連結されている。
【0178】
本発明のこの態様によるなお別の例では、第１の核酸分子は、配列番号１４によって定義される配列を含む。
【0179】
本発明のこの態様によるさらなる例では、第２の核酸分子は、配列番号１５によって定義される配列を含む。
【0180】
本発明のこの態様によるなおさらなる例では、第１および第２の核酸分子は、操作可能に連結され、配列番号８０によって定義される配列を含む。
【化1】
【0181】
有利なことに、本明細書に記載のアッセイおよび試験キットは、（ｉ）細胞抽出物の非存在下でも実施が可能であり、アッセイシグナルを干渉する（例えば、リガンドと受容体との「クロストーク」は、応答要素の自動活性化をもたらす）天然に存在するリガンドおよび／またはステロイドホルモン受容体を含有せず、ならびに（ｉｉ）本明細書に記載のアッセイシステムの単純さは、第２のリガンドの検出に特異的な第２またはそれ以上の受容体／レポート構築物の組み合わせを含むように、既存のアッセイまたは試験キットを通常通りに改変することができること、同じインビトロ転写機構（例えば、バクテリオファージポリメラーゼ＋ヌクレオシド三リン酸）を利用することによって、各レポーターによって生成される別個のシグナルが、便利に検出され得ることを意味するので、マルチプレックスシステムでの構成に特に好適である。この点をさらに説明するために、本発明によるマルチプレックスアッセイシステムは、例えば、アンドロゲンまたはアンドロゲン様リガンドの存在下で、同じ試料中のエストラジオールの検出に特異的なレポーター構築物によって生成される読み取り値とは独立して測定され得るレポーター読み取り値を生成するであろう、アンドロゲン特異的レポーター構築物を含み得る。
【0182】
当業者は、本発明のマルチプレックスシステムに関連する分子の複雑さの欠如によって与えられる利点を理解し、同じ試験試料からの複数（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の別個のステロイドホルモンゲノム応答の検出が可能であることを認識するであろう。
【0183】
したがって、本発明による試験キットは、少なくとも１つのステロイドホルモン受容体と、少なくとも１つのレポーター構築物を含む少なくとも１つの核酸分子と、を含む。
【0184】
したがって、本明細書に記載の試験キットおよび方法による「ステロイドホルモン受容体」という用語は、２つ以上の異なるタイプのステリオイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）ホルモン受容体（例えばかつただ実例として、テストステロンに結合するステロイドホルモン受容体およびエストラジオールに結合するステロイドホルモン受容体）が存在し得るという意味では、「少なくとも１つのステロイドホルモン受容体」を意味することを意図する。
【0185】
同様に、「［応答要素を含む］核酸分子」という用語は、２つ以上の別個の核酸分子が存在し得、各々が異なる応答要素、および任意選択的に異なるレポーター分子を含むという意味で、「少なくとも１つの核酸」を意味することを意図する。
【0186】
本発明のこの態様による一例では、試験キットは、（ｉ）エストロゲン受容体およびエストロゲン応答要素を含む核酸分子と、（ｉｉ）アンドロゲン受容体およびアンドロゲン応答要素を含む核酸分子と、を含む。
【0187】
関連する例では、エストロゲン応答要素を含む核酸分子は、第１のフルオロフォアに結合することが可能である第１のＲＮＡアプタマーをさらに含む。
【0188】
別の関連する例では、アンドロゲン応答要素を含む核酸分子は、第２のフルオロフォアに結合することが可能である第２のＲＮＡアプタマーをさらに含む。
【0189】
関連する例では、第１および第２のＲＮＡアプタマーとしては、第１のＲＮＡアプタマーが、第２のＲＮＡアプタマーと同一ではないことを条件として、限定されないが、Ｍａｎｇｏ Ｉ、Ｍａｎｇｏ ＩＩ、Ｍａｎｇｏ ＩＩＩ、およびＭａｎｇｏ ＩＶ、Ｓｐｉｎａｃｈ、ｉＳｐｉｎａｃｈ、ベビーＳｐｉｎａｃｈ、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ、およびＭａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎが挙げられる。
【0190】
さらに関連する例では、第１のＲＮＡアプタマーは、Ｍａｎｇｏ ＩＩであり、第２のＲＮＡアプタマーは、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎである。
【0191】
さらに関連する例では、第１のＲＮＡアプタマーは、Ｍａｎｇｏ ＩＩであり、第２のＲＮＡアプタマーは、ｉＳｐｉｎａｃｈである。
【0192】
試験キットおよびアッセイの有用性
有利なことに、本発明は、ステロイドホルモン受容体活性化の原理に基本的に基づいて機能する、活性に基づく試験キット、アッセイ、および方法を提供する。試験される試料内に存在する標的リガンドによるステロイドホルモン受容体活性化（その結果としてのホルモン応答要素への結合を伴う）を検出することによって、本発明は、調査対象のリガンド（複数可）の構造的知識に依存せず、生物学的に活性なリガンドおよび不活性なリガンドの存在を容易に区別することができ、実施するために複雑な実験設備または特定の専門知識を必要としない、費用効果が高く、信頼性が高く、再現性のあるシステムを提供する無細胞の試験キット、アッセイ、および方法を提供する。
有利なことに、本発明は、ステロイドホルモン受容体活性化の原理に基本的に基づいて機能する、活性に基づく試験キット、アッセイ、および方法を提供する。試験される試料内に存在する標的リガンドによるステロイドホルモン受容体活性化（その結果としてのホルモン応答要素への結合を伴う）を検出することによって、本発明は、調査対象のリガンド（複数可）の構造的知識に依存せず、生物学的に活性なリガンドおよび不活性なリガンドの存在を容易に区別することができ、実施するために複雑な実験設備または特定の専門知識を必要としない、費用効果が高く、信頼性が高く、再現性のあるシステムを提供する無細胞の試験キット、アッセイ、および方法を提供する。
【0193】
したがって、本発明の別の態様では、アスリートのドーピング状態を決定するための方法であって、アスリートから得た試料を本明細書に記載の試験キットと組み合わせることと、アスリートのドーピング状態を決定することと、を含む、方法が提供される。
【0194】
本発明のこの態様による一例では、アスリートから得た得た試料は、血清試料、血漿試料、または尿試料である。
【0195】
別の例では、アスリートは、ヒトアスリート、またはウマ、ラクダ、もしくはイヌから選択される非ヒトアスリートである。
【0196】
本発明のさらなる態様では、リガンドがステロイドホルモン受容体を活性化し、細胞内のホルモンゲノム応答を誘発することが可能である、リガンドの存在について試験試料をスクリーニングするための製造物品であって、試料中のリガンドの存在を検出する方法についての説明書と一緒に本明細書に記載の試験キットを含む、製造物品が提供される。
【0197】
本発明のなおさらなる態様では、アスリートのドーピングを決定するための製造物品であって、アスリートに由来する試料中のリガンドの存在を検出するための説明書と一緒に本明細書に記載の試験キットを含み、試料中のリガンドの存在が、アスリートのドーピングを示す、製造物品が提供される。
【0198】
本明細書に記載の様々な試験キットおよびアッセイは各々、（ｉ）試験される試料中に存在し得るリガンドを結合するためのリガンド結合ドメインを含むステロイドホルモン受容体、および（ｉｉ）活性化ステロイドホルモン受容体（またはリガンド－受容体複合体、ＨＲ－Ｌ）によって結合されるタンパク質結合ドメインを含む核酸応答要素を提供する。「活性化ステロイドホルモン受容体」という用語は、受容体－リガンド複合体を指し、ＨＲ－Ｌ構造の様々な変更（モノマー、二量体、三量体など）を含み得る。重要なことに、ホルモン応答要素は、受容体－リガンド複合体に特異的な結合モチーフを含有する。したがって、本発明の試験キットおよびアッセイを目的の試料と組み合わせることによって、ステロイドホルモン受容体に結合し、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発する潜在性を有するリガンドの検出が可能である。
【0199】
「受容体結合ドメイン」、「活性化受容体結合ドメイン」、「ホルモン受容体結合ドメイン」、「活性化ホルモン受容体結合ドメイン」、「受容体－リガンド結合ドメイン」、および「ホルモン受容体－リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書で定義されるように、活性化ホルモン受容体またはリガンド－受容体複合体によって結合されるホルモン応答要素のタンパク質結合ドメインを指すように互換的に使用される。
【0200】
他の例では、本明細書に記載の発明は、ヒト、ならびに競走馬およびイヌを含む非ヒトアスリートで使用されるパフォーマンス向上プロドラッグ／薬物（例えば、アナボリックステロイド）の検出に、有用性を見出す。他の例では、本明細書に記載の発明は、ステロイドホルモン受容体に結合し、細胞内でゲノム応答を誘発し得るか、または（すなわち、いわゆる「プロドラッグ」の場合）代謝処理後に細胞内でゲノム応答を誘発し得る添加物について、食品および健康食品補助食品をスクリーニングすることに有用性を有する。
【0201】
本発明はさらに、リガンドが、生理学的に活性な形態に変換されると、ステロイドホルモン受容体を最終的に活性化することが可能である、試験試料からの１つ以上の生理学的に不活性なリガンドの検出を企図する。したがって、本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法は、対応するステロイドホルモン受容体を活性化するであろうような方式でリガンドを処理することが可能であるステロイド代謝機構をさらに含む。この方式では、栄養補助食品などの試料から、生理学的に不活性なリガンド（例えば、プロホルモン）を検出することが可能である。
【0202】
したがって、本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法は、リガンドを生理学的に不活性な形態から生理学的に活性な形態に、または生理学的に活性な形態からより生理学的に活性な形態に、または生理学的に活性な形態から生理学的により活性でない形態に、または生理学的に活性な形態から生理学的に不活性な形態に変換するのに十分なステロイド代謝機構をさらに含み得る。ステロイド代謝機構は、リガンドが生理学的に活性な形態であるときにのみ、ステロイドホルモン受容体を活性化し、かつゲノム応答を誘発する能力を有する。したがって、本発明による試験キット、アッセイ、および方法にステロイド代謝機構を含めることは、（例えば）リガンドがプロドラッグ（例えばプロホルモン）として存在し、確立された手法を使用した検出を回避し得る、目的の試験試料からの生理学的に不活性なリガンドの検出の促進に役立つ。さらに、本発明による試験キット、アッセイ、および方法にステロイド代謝機構を含めることは、効果を示すために必要なリガンドの生物学的活性／効力の決定に役立つ。
【0203】
図１７に提示されたデータは、この点をさらに説明している。アンドロステンジオン（すなわち、アンドロゲンプロホルモン）を、Ｓ９肝臓画分と事前にインキュベートし、その後、反応ミックスをステロイド用に抽出した（すなわち、潜在的な非特異的リガンドを除去した）。次いで、アンドロゲン活性について、様々な試験試料および対照試料を分析した。結果は、未処理対照のアンドロゲン活性レベルが、ビヒクル対照（すなわちメタノール＋Ｔ７、メタノール＋ＡＲ／ＨＳＰ９０）とほぼ等しかった未処理理対照（すなわちアンドロステンジオン－Ｓ９肝臓）と比較して、アンドロステンジオン＋Ｓ９肝臓処理のレポーター構築物の蛍光の統計的に顕著な低減を実証している。
【0204】
本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法は、定義されるように、受容体－リガンド複合体と核酸内に含有される応答要素との間の結合を検出するための検出手段をさらに含み得る。
【0205】
本発明による試験キットおよびアッセイは、無細胞である。アッセイシステムの分子の複雑さが顕著に低減されるので、これは特に重要である。例えば、（ｉ）ステロイドホルモン分子の熱力学的シンクを生じる潜在性を有する細胞膜構造、および（ｉｉ）細胞に基づくシステムで観察される内因性ステロイドホルモン代謝の非存在によって、感受性が向上したアッセイシステムが提供される。さらにかつ有利には、本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法によれば、必須構造要素（例えば、ステロイドホルモン受容体および１つ以上の活性化受容体結合ドメインを含む核酸応答要素）の相対量を正確に制御して、向上したアッセイ機能および増加した感受性を提供することができる。
【0206】
本明細書に記載の方法によれば、試験試料中に存在するリガンドによって生成されるシグナルの絶対レベルを決定するために、試験結果を参照閾値と比較してもよい。実際、出願人らは、非リガンド結合受容体による応答要素の非特異的結合および／または活性化を観察した。したがって、任意の所与の試験試料について半定量分析を実施することが望ましい場合、本明細書に記載のアッセイおよび方法を、試験試料の非存在下（例えば、陰性対照として作用するエタノールの存在下）で実施して、まず参照閾値を確立してもよい。次いで、試験試料から得たアッセイ結果を参照閾値と比較して、単純な減算手法を使用して、試料中に存在するリガンド（複数可）に起因する絶対活性を決定してもよい。
【0207】
本発明はさらに、参照化合物と比較した試験化合物の効力を決定するための、本明細書に記載のアッセイおよび試験キットの使用を企図する。本発明によれば、「相対効力」という用語は、試験化合物の生物学的活性を参照化合物に対して正規化することによって決定した、参照化合物に対する試験化合物の生物学的活性の乗数として定義される。
【0208】
試験化合物および参照化合物の生物学的活性は、ＥＣ５０、またはその特定の化合物の用量応答曲線から最大応答の半分を与える化合物の濃度を使用して決定することができる。用量応答曲線は、化合物を段階的に希釈し、そのステロイドホルモン受容体の結合／活性化プロファイルを測定することによって生成される。次いで、測定された（例えば、蛍光によって測定された）活性対（すなわち、化合物の段階希釈が対数スケールで最も良好に提示される濃度範囲を生成する）化合物の濃度のプロットを作成する。
【0209】
当業者は、試験化合物の相対効力の尺度が、使用される参照化合物との比較であることを認識するであろう。言い換えれば、試験化合物の相対効力は、その生物学的活性が正規化されている参照化合物に応じて異なる可能性がある。
【0210】
相対効力が＞１である場合、試験化合物は、参照化合物と比較して、アッセイにおいてより高い測定された生物学的活性を起こす。相対効力が＜１である場合、試験化合物は、参照化合物と比較して、アッセイにおいてより低い測定された生物学的活性を起こす。相対効力＝１である場合、試験化合物および参照化合物は、アッセイにおいて等しい生物学的活性を起こす。
【0211】
相対効力はまた、問題の試験化合物の活性化因子を決定するために使用することができる。本明細書で使用される場合、活性化因子は、試験化合物の２つの状態間の相対的活性化の尺度としての、酵母細胞で、もしくは酵母細胞を含まない抽出物（すなわち、代謝機構を含有しない）を使用して決定した試験化合物の相対的効力、または哺乳動物細胞で、もしくは哺乳類細胞を含まない抽出物（すなわち、代謝機構を含む）を使用して決定した同じ試験化合物の相対的効力と関連する。活性化因子＞１は、試験化合物が、アッセイにおいて代謝機構の存在下で、より生理学的に活性な状態への代謝変換を受けたことを意味する。
【0212】
本発明による試験キットおよびアッセイによって与えられるなお別の利点は、性能の相対的な容易さである。言い換えれば、本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法の性能は、複雑な細胞培養技法、経験豊富な実験技師、または複雑な実験試験設備および分析を必要としない。本発明による試験キット、アッセイ、および方法は、比較的単純な試験手順に従って、現場の訓練を受けていない要員によって実施され得るので、これは特に有利である。さらに、試験キット、アッセイ、および方法の性能は、（例えば）競技の直前または直後にアスリートから採取した試料中のパフォーマンス向上物質について試験するときに、リアルタイムの情報を提供することができる。
【0213】
本発明の他の態様では、リガンドが、細胞内にあるとステロイドホルモン受容体と複合体を形成し、ゲノム応答を誘発することが可能である、リガンドの存在について試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるアンドロゲン受容体、または
（ｉｉ）エストロゲン受容体が、エストロゲン受容体アルファまたはエストロゲン受容体ベータである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるエストロゲン受容体、または
（ｉｉｉ）、プロゲステロン受容体が、プロゲステロン受容体Ａまたはプロゲステロン受容体Ｂである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるプロゲステロン受容体、または
（ｉｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能である鉱質コルチコイド受容体、または
（ｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるグルココルチコイド受容体と、
（ｖｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるアンドロゲン受容体、または
（ｉｉ）エストロゲン受容体が、エストロゲン受容体アルファまたはエストロゲン受容体ベータである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるエストロゲン受容体、または
（ｉｉｉ）、プロゲステロン受容体が、プロゲステロン受容体Ａまたはプロゲステロン受容体Ｂである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるプロゲステロン受容体、または
（ｉｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能である鉱質コルチコイド受容体、または
（ｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるグルココルチコイド受容体と、
（ｖｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0214】
本発明の他の態様では、リガンドが、細胞内にあるとステロイドホルモン受容体と複合体を形成し、ゲノム応答を誘発することが可能である、リガンドの存在について試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるアンドロゲン受容体、または
（ｉｉ）エストロゲン受容体が、エストロゲン受容体アルファまたはエストロゲン受容体ベータである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるエストロゲン受容体、または
（ｉｉｉ）、プロゲステロン受容体が、プロゲステロン受容体Ａまたはプロゲステロン受容体Ｂである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるプロゲステロン受容体、または
（ｉｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能である鉱質コルチコイド受容体、または
（ｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるグルココルチコイド受容体と、
（ｖｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｖｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるアンドロゲン受容体、または
（ｉｉ）エストロゲン受容体が、エストロゲン受容体アルファまたはエストロゲン受容体ベータである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるエストロゲン受容体、または
（ｉｉｉ）、プロゲステロン受容体が、プロゲステロン受容体Ａまたはプロゲステロン受容体Ｂである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるプロゲステロン受容体、または
（ｉｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能である鉱質コルチコイド受容体、または
（ｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるグルココルチコイド受容体と、
（ｖｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｖｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｉｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0215】
本発明のなおさらなる態様では、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試験試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるアンドロゲン受容体、または
（ｉｉ）エストロゲン受容体が、エストロゲン受容体アルファまたはエストロゲン受容体ベータである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるエストロゲン受容体、または
（ｉｉｉ）、プロゲステロン受容体が、プロゲステロン受容体Ａまたはプロゲステロン受容体Ｂである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるプロゲステロン受容体、または
（ｉｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能である鉱質コルチコイド受容体、または
（ｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるグルココルチコイド受容体と、
（ｖｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）上の（ｉ）～（ｖ）のうちのいずれかに定義される受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｖｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、
（ｖｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸と、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるアンドロゲン受容体、または
（ｉｉ）エストロゲン受容体が、エストロゲン受容体アルファまたはエストロゲン受容体ベータである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるエストロゲン受容体、または
（ｉｉｉ）、プロゲステロン受容体が、プロゲステロン受容体Ａまたはプロゲステロン受容体Ｂである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるプロゲステロン受容体、または
（ｉｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能である鉱質コルチコイド受容体、または
（ｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるグルココルチコイド受容体と、
（ｖｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）上の（ｉ）～（ｖ）のうちのいずれかに定義される受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｖｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、
（ｖｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸と、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0216】
本発明のなおさらなる態様では、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発することが可能なリガンドの存在について試験試料をスクリーニングするための試験キットであって、
（ｉ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるアンドロゲン受容体、または
（ｉｉ）エストロゲン受容体が、エストロゲン受容体アルファまたはエストロゲン受容体ベータである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるエストロゲン受容体、または
（ｉｉｉ）、プロゲステロン受容体が、プロゲステロン受容体Ａまたはプロゲステロン受容体Ｂである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるプロゲステロン受容体、または
（ｉｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能である鉱質コルチコイド受容体、または
（ｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるグルココルチコイド受容体と、
（ｖｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｖｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）上の（ｉ）～（ｖ）のうちのいずれかに定義される受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｖｉｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、
（ｉｘ）ヌクレオシド三リン酸と、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
（ｉ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるアンドロゲン受容体、または
（ｉｉ）エストロゲン受容体が、エストロゲン受容体アルファまたはエストロゲン受容体ベータである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるエストロゲン受容体、または
（ｉｉｉ）、プロゲステロン受容体が、プロゲステロン受容体Ａまたはプロゲステロン受容体Ｂである、試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるプロゲステロン受容体、または
（ｉｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能である鉱質コルチコイド受容体、または
（ｖ）試験試料からのリガンドとリガンド－受容体複合体を形成することが可能であるグルココルチコイド受容体と、
（ｖｉ）熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、ＨＳＰ９０と熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）との複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、および熱ショックタンパク質４０（ＨＳＰ４０）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、およびｐ２３の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、および熱ショックタンパク質組織化タンパク質（Ｈｏｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、および４８ｋＤ Ｈｉｐタンパク質（Ｈｉｐ）の複合体；ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、およびｐ６０の複合体；ならびにＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ４０、ｐ２３、Ｈｏｐ、Ｈｉｐ、ｐ６０、およびＦＫＢＰ５２の複合体から選択されるステロイドホルモン受容体補因子と、
（ｖｉｉ）核酸分子であって、
（ａ）ポリメラーゼプロモーター配列、
（ｂ）上の（ｉ）～（ｖ）のうちのいずれかに定義される受容体－リガンド複合体によって結合されることが可能である応答要素、および
（ｃ）レポーター構築物を含み、
応答要素（ｂ）が、プロモーター配列（ａ）とレポーター構築物（ｃ）との間に位置し、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、操作可能に連結されている、核酸分子と、
（ｖｉｉｉ）単一のポリペプチドポリメラーゼと、
（ｉｘ）ヌクレオシド三リン酸と、を含み、
試料が試験キットと組み合わせられると、リガンド－受容体複合体が応答要素に結合することによって引き起こされるレポーター構築物の転写の低減または阻害を測定することによって、試料中のリガンドの存在が検出される、試験キットが提供される。
【0217】
本発明のアッセイ、方法および試験キットによるある特定の例では、核酸分子は、応答要素またはレポーター構築物を含む、核酸の様々な構成要素のうちの１つ以上のコピーを含む。例えば、レポーター構築物または核酸分子は、限定されないが、二重コピー、三重コピー、四重コピーなどを含む、核酸応答要素の単一コピーまたは複数コピーを含み得る。
【0218】
本発明の別の例では、ステロイドホルモン受容体は、細胞から精製されるか、または組み換えクローニング、発現、および精製を通じた、細胞に基づくホルモン受容体に由来する。さらなる例では、ステロイドホルモン受容体は合成であり、その配列は、当技術分野で既知の内因性ステロイドホルモン受容体配列をモデルとするか、またはそれから進化させた。
【0219】
当業者はまた、任意のステロイドホルモン受容体が、検出のための目的のリガンドに結合し、それによって活性化される能力を保持することを条件として、本発明の試験キット、アッセイ、および方法に任意のステロイドホルモン受容体を用いることができることを認識するであろう。これとしては、内因性細胞形態、ならびに組み換えまたは合成形態に基づくステロイドホルモン受容体が挙げられる。
【0220】
したがって、本発明による試験キット、アッセイ、および方法は、ステロイドホルモンゲノム応答を誘発する任意のリガンドをスクリーニング／検出するように構成され得る。しかしながら、当業者は、本明細書に記載の様々なアッセイの概念によれば、異なるホルモンクラス（すなわち、リガンド）の検出は、適切に構成および最適化された試験キット、アッセイ、および方法の形式を必要とすることを認識するであろう。例えば、テストステロン、ならびに他のテストステロン様ホルモンなどのアンドロゲン受容体に結合し、かつそれを活性化するリガンドの検出は、活性化アンドロゲン－受容体複合体などに結合することが可能なアンドロゲン応答要素と一緒にアンドロゲン受容体を含む、試験キット／アッセイを必要とする。
【0221】
デザイナステロイドおよび非ステロイドアナボリック薬は、抗ドーピング実験に顕著かつ増大している課題を提起する。テトラヒドロゲストリノンおよびマドール（ｍａｄｏｌ）の検出において２０００年代初頭に最初に同定された、デザイナーアナボリック薬によって提起される脅威は、多数の潜在的な薬剤を含むために急速に増加している。これらの合成由来のアナボリック薬は、製造および供給の両方に関する検出または法的制御を回避するように設計されており、いわゆる「補助食品」として販売されている場合、多くはインターネット上で広く入手可能である。
【0222】
質量分析法は依然として、生物学的試料および／または補助食品中の既知の違法ステロイドホルモンおよび非ステロイドアナボリック薬を同定するための主要な技術である。その感受性および特異性にもかかわらず、質量分析法は、検出のためにステロイドおよび非ステロイドアナボリック薬の化学構造の事前知識を必要とすることによって、依然として制限がある。さらに、質量分析法は、検出されたアナボリック薬の生物学的活性についての情報を提供することができず、生理活性分子と不活性分子とを区別することが不可能である。これは、アスリート、コーチ、トレーナー、マネージャー、および製造業者の法的訴追に必要な情報である。
【0223】
近年、酵母および哺乳類細胞に基づくインビトロアンドロゲンバイオアッセイを使用して、補助食品中の新規の合成アンドロゲンの存在、プロゲスチン、ならびにアンドロゲン、プロアンドロゲン、デザイナーアンドロゲン、およびデザイナー非ステロイドアナボリック薬のアンドロゲンの潜在性が検出されている。しかしながら、これらのアッセイは、本明細書の他の部分に記載されるように、分子の複雑さに関連する制限を被り、性質における分子的および細胞的の両方である技術的スキルを必要とし、時間および集中的な労力を必要とし、高価である。そのため、通常のスクリーニングに含めるために現在の形態のアッセイを考慮することは現実的ではない。言い換えれば、酵母および哺乳類細胞に基づくアッセイは、ハイスループットではなく費用効果が高くないので、顕著な制限を被る。
【0224】
有利なことに、本発明は、ステロイドホルモン受容体活性化の原理に基本的に基づいて機能する、活性に基づく試験キット、アッセイ、および方法を提供する。試験される試料内に存在するリガンドによるステロイドホルモン受容体活性化を検出することによって、本発明は、調査対象のリガンド（複数可）の構造的知識に依存せず、生物学的に活性なリガンドおよび不活性なリガンドの存在を容易に区別することができ、実施するために複雑な実験設備または特定の専門知識を必要としない、費用効果が高く、信頼性が高く、再現性のあるシステムを提供する無細胞の試験キット、アッセイ、および方法を提供する。
【0225】
したがって、本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法による一例では、リガンドは、パフォーマンス向上デザイナー薬物および／またはステロイドである。
【0226】
本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法による別の例では、リガンドは、未知の化学構造のものである。
【0227】
本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法によるさらなる例では、リガンドは、従来未知の化学構造のものである。
【0228】
本発明はさらに、リガンドのそのステロイドホルモン受容体への結合を防止するであろう化合物について目的の試料をスクリーニングすることによって、受容体を活性化せず、ゲノム応答を誘発しないような標的リガンドのアンタゴニストを検出するための、本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法の使用を企図する。
【0229】
これは、内分泌および非内分泌がんの治療のための潜在的な療法として、（例えば）ステロイドホルモン受容体活性化を遮断するアンタゴニストについてスクリーニングする必要があるときに、特に有用である。例えば、１つ以上のエストロゲン受容体を含む、活性に基づく本発明による試験キット、方法、およびアッセイを使用して、アンタゴニストの存在について化合物ライブラリーをスクリーニングすることができるか、またはがん療法中の患者の乳がん組織もしくは血液中のエストロゲン受容体活性化の喪失を監視することができる。
【0230】
本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法のすべての態様によるなおさらなる例では、生物学的試料は、ウマ、イヌ、ラクダ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、トリ、サル、ネズミ、ウサギ、シカ、魚類、サケ、霊長類、およびヒトからなる群から選択される動物に由来する。
【0231】
本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法のすべての態様によるなおさらなる例では、試験試料は、限定されないが、血液（血漿および血清）、筋肉、腫瘍、精液などを含む、尿、唾液、便、毛髪、組織からなる群から選択される生物学的材料に由来する。
【0232】
本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法のすべての態様によるなおさらなる例では、試験試料は、野菜、肉からなる群から選択される食品、限定されないがスポーツドリンクおよびミルクを含む飲料、限定されないが食品補助食品、およびスポーツ補助食品、栄養補助食品、ハーブ抽出物などを含む補助食品に由来する。
【0233】
本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法のすべての態様によるなおさらなる例では、試験試料は、薬物、強壮剤、シロップ、錠剤、舐剤、クリーム、スプレー、およびゲルからなる群から選択される医薬品に由来する。
【0234】
本明細書に記載の試験キット、アッセイ、および方法のすべての態様によるなおさらなる例では、試料は、限定されないが、プラスチックおよび鉱物を含む、液体、水、土壌、織物からなる群から選択される環境に由来する。
【0235】
図１４～１６と併せて閲覧される実施例６に提示されている情報は、試験キットおよびアッセイ方法を使用して、子牛およびウマに由来する血清（図１４～１６）、ならびに子馬から得た尿（図１５および１６）などの生物学的マトリックスから（ステロイドホルモンリガンドの例として）テストステロンを検出したことを実証している。これらのデータは、例えば、ヒトおよびウマアスリートのトラックサイドのドーピング状態の決定、または輸出／輸入品質管理の一部として栄養補助食品に分析を実施するための、本発明による試験キットおよびアッセイ方法の現場での有用性を強化する。
【0236】
したがって、別の例では、試料は、生物学的試料である。関連する例では、生物学的試料は、限定されないが、血液、血漿、血清、唾液、間質液、精液、および尿を含む、体液試料である。
【0237】
別の例では、限定されないが、葉、花、茎、樹皮、根、芽、鞘、花粉、および種子を含む植物に由来する試料。
【0238】
別の例では、試料は、限定されないが、ウマ動物、イヌ動物、ヒトコブラクダ動物、ウシ動物、ブタ動物、ヒツジ動物、ヤギ動物、トリ動物、サル動物、ネズミ動物、ウサギ動物、シカ動物、魚類動物、サケ動物、霊長類動物、およびヒト動物を含む、動物に由来する。
【0239】
別の例では、試験試料は、非生物学的試料である。関連する例では、非生物学的試料としては、限定されないが水を含む液体試料、土壌試料、限定されないがプラスチックを含む織物試料、鉱物試料、食品試料、および医薬品が挙げられる。
【0240】
食品試料の例としては、限定されないが、野菜、肉、飲料、補助食品、およびハーブ抽出物が挙げられる。
【0241】
医薬品の例としては、限定されないが、薬物、強壮剤、シロップ、錠剤、舐剤、クリーム、スプレー、およびゲルが挙げられる。
【0242】
以下の実施例を参照して本発明をさらに説明する。特許請求される本発明は、これらの実施例によって決して限定されることを意図するものではないことが理解されよう。
【実施例】
【0243】
以下の情報およびデータは、アンドロゲン受容体に結合しかつそれを活性化する、（例えば）テストステロンおよびジヒドロテストステロンを含むリガンド、またはエストロゲン受容体に結合しかつそれを活性化する、（例えば）エストラジオールを含むリガンドの検出に関する、様々なプロトタイプアッセイを実証する。これらの実施例を使用して、アンドロゲン受容体に結合するリガンドまたはエストロゲン受容体（すなわち、ＥＲ－αおよびＥＲ－β）に結合するリガンドの検出によって例示されるアッセイの概念および原理が、限定されないがプロゲステロンを含むプロゲステロン受容体に結合するリガンド、限定されないがアルドステロンを含む鉱質コルチコイド受容体に結合するリガンド、および限定されないがコルチゾールを含むグルココルチコイド受容体に結合するリガンドを、限定されないが含む、目的の他の受容体リガンドの検出に等しく適用されるであろう、本明細書に記載され特許請求される活性アッセイプラットフォームを説明する。
【0244】
実施例１
アンドロゲンアッセイプロトタイプ１：アッセイアーキテクチャおよび結果
１．１ インビトロ転写プラットフォーム
インビトロ転写プラットフォームを最初に開発した出願人らは、組み換えアンドロゲン受容体（ＡＲ）、組み換え熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、および転写緩衝液と組み合わせた、Ｍａｎｇｏ ＩＩのＲＮＡアプタマー配列の上流の３Ｘアンドロゲン応答要素（ＡＲＥ）のタンデムアレイの上流のＴ７ ＲＮＡコンセンサスプロモーター配列をコードするＤＮＡ構築物を含む。Ｔ７プロモーターは、フルオロフォアであるＴｈｉａｚｏｌｅ Ｏｒａｎｇｅ １－ビオチン（ＴＯ１）に結合することによって検出されるであろう、高レベルのＲＮＡアプタマー発現を促進するであろう。ＡＲＥがリガンド活性化ＡＲによって結合されると、Ｔ７が促進するアプタマー発現の阻害が生じるであろう。
アンドロゲン応答要素（ＡＲＥ）
・これらの実験で試験したアンドロゲン応答要素は、３ｘＡＲＥのタンデムアレイであった。
アンドロゲン受容体（ＡＲ）
・Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販の組み換えＡＲは試験済みである
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
・これらの研究では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの原料としてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＭｅｇａＳｃｒｉｐｔキット、および必要な緩衝液、およびヌクレオチド三リン酸を使用した。
アンドロゲンアッセイプロトタイプ１：アッセイアーキテクチャおよび結果
１．１ インビトロ転写プラットフォーム
インビトロ転写プラットフォームを最初に開発した出願人らは、組み換えアンドロゲン受容体（ＡＲ）、組み換え熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、および転写緩衝液と組み合わせた、Ｍａｎｇｏ ＩＩのＲＮＡアプタマー配列の上流の３Ｘアンドロゲン応答要素（ＡＲＥ）のタンデムアレイの上流のＴ７ ＲＮＡコンセンサスプロモーター配列をコードするＤＮＡ構築物を含む。Ｔ７プロモーターは、フルオロフォアであるＴｈｉａｚｏｌｅ Ｏｒａｎｇｅ １－ビオチン（ＴＯ１）に結合することによって検出されるであろう、高レベルのＲＮＡアプタマー発現を促進するであろう。ＡＲＥがリガンド活性化ＡＲによって結合されると、Ｔ７が促進するアプタマー発現の阻害が生じるであろう。
アンドロゲン応答要素（ＡＲＥ）
・これらの実験で試験したアンドロゲン応答要素は、３ｘＡＲＥのタンデムアレイであった。
アンドロゲン受容体（ＡＲ）
・Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販の組み換えＡＲは試験済みである
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
・これらの研究では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの原料としてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＭｅｇａＳｃｒｉｐｔキット、および必要な緩衝液、およびヌクレオチド三リン酸を使用した。
【0245】
１．２ ＡＲＥが媒介する転写／翻訳の説明
自然なアンドロゲンシグナル伝達は、アンドロゲン分子が細胞内に拡散し、細胞質内で不活性状態に保持され熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）に結合しているＡＲに結合することから始まる。アンドロゲン分子（またはリガンド）が結合すると、ＡＲは、ＨＳＰ９０を放出し、核局在化および二量体化部位を露出する、コンフォメーション変化を受ける。リガンド－ＡＲ複合体は、ＡＲ調節遺伝子の転写を開始する核への移行のために標的化され、核では、ＡＲがＤＮＡのＡＲＥ部位に結合し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素が集合する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる遺伝子の転写は、ｍＲＮＡ転写を生じ、ひいては、これがリボソーム機構のテンプレートとして作用してタンパク質が作製される。
自然なアンドロゲンシグナル伝達は、アンドロゲン分子が細胞内に拡散し、細胞質内で不活性状態に保持され熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）に結合しているＡＲに結合することから始まる。アンドロゲン分子（またはリガンド）が結合すると、ＡＲは、ＨＳＰ９０を放出し、核局在化および二量体化部位を露出する、コンフォメーション変化を受ける。リガンド－ＡＲ複合体は、ＡＲ調節遺伝子の転写を開始する核への移行のために標的化され、核では、ＡＲがＤＮＡのＡＲＥ部位に結合し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素が集合する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる遺伝子の転写は、ｍＲＮＡ転写を生じ、ひいては、これがリボソーム機構のテンプレートとして作用してタンパク質が作製される。
【0246】
ＡＲＥは、Ｔ７プロモーター（および転写開始部位）の下流に位置するので、テストステロンが配位したＡＲがＡＲＥに結合すると、Ｔ７が媒介する転写を減少させるこの自然の生物学を利用する記載の実験は、テストステロン（天然のアンドロゲン）活性化ＡＲが、Ｔ７が媒介する転写を減少／阻害することを示している。
【0247】
図１は、ＡＲＥが媒介する、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが媒介する転写の遮断の概略図を示している。
【0248】
天然のアンドロゲンであるテストステロンなどのリガンドの存在下で、ＡＲはＡＲＥに結合し、Ｔ７ポリメラーゼによる転写を阻害する。この状態では、形成されるＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーは少ない。
【0249】
リガンドの非存在下では、ＡＲは活性化されずにＡＲＥに結合せず、したがって、ＤＮＡは妨害するタンパク質を含まない。Ｔ７は、ＤＮＡ構築物に沿って進んで、ＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーを生成し、これは、その後ＴＯ１－Ｂ結合および蛍光によって検出される。
【0250】
図２および３に提示された結果を参照して、ＡＲの転写が遮断されたテストステロン活性化について調査した。ＡＲは、完全なＴ７が媒介する転写およびＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーの発現を示さなかった。これは、ＡＲの存在下で低減し、ＡＲが１１．５ｎｇ／ｍｌのテストステロンによって活性化されるとさらに低減する。
【0251】
次に、図４を参照して、ＨＳＰ９０が、ＡＲのベースライン活性化を阻害することができるかどうかを調査した。ＡＲは、テストステロンを介した領域活性化因子－１（ＡＦ－１）の活性化を通じた、または領域活性化因子－２（ＡＦ－２）の自動活性化を介したコンフォメーション変化によって活性化される。ＡＲでは、ＡＦ－２は、非常に活性であり、ＡＲ活性の最大５０％を占める場合がある。ＡＦ－２の自動活性化を抑制するために、ＨＳＰ９０を添加して、リガンドの非存在下ではＡＲＥに結合しないであろう不活性化状態にＡＲを保持した。しかしながら、リガンドの存在下では、ＨＳＰ９０は、ＡＲから競合的に解離するはずであり、配位したＡＲは、ＡＲＥに結合するはずである。
【0252】
実施例２：
アンドロゲンアッセイプロトタイプ２：アッセイアーキテクチャおよび結果
アンドロゲンアッセイプロトタイプ２の概念は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどの単一のタンパク質ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡテンプレート上のそのプロモーター配列に結合することである。ＤＮＡテンプレートは、プロモーターの下流のＲＮＡアプタマーＭａｎｇｏ ＩＩ配列をコードする。ホルモン応答要素（ＨＲＥ）は、Ｔ７プロモーターとＭａｎｇｏ ＩＩ配列との間に位置する。ステロイドホルモン受容体（ＳＨＲ）を、Ｔ７インビトロ転写（ＩＶＴ）反応ミックスに添加し、受容体特異的リガンドによって活性化させると、ＳＨＲは、ＤＮＡテンプレート上のＨＲＥに結合し、この結合位置でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡをＲＮＡに転写することを物理的に阻害し、したがってＭａｎｇｏ ＩＩアプタマーは形成されない。Ｍａｎｇｏ ＩＩの形成は、Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーに結合する反応ミックスにＴＯ１－ビオチンなどの特定のフルオロフォアを添加することによって検出される。ＴＯ１は、Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーに結合すると、５１０ｎｍの波長で励起されると、５３５ｎｍの波長で励起波長を放出する。蛍光は、標準的な蛍光光度計を使用して測定される。
アンドロゲンアッセイプロトタイプ２：アッセイアーキテクチャおよび結果
アンドロゲンアッセイプロトタイプ２の概念は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどの単一のタンパク質ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡテンプレート上のそのプロモーター配列に結合することである。ＤＮＡテンプレートは、プロモーターの下流のＲＮＡアプタマーＭａｎｇｏ ＩＩ配列をコードする。ホルモン応答要素（ＨＲＥ）は、Ｔ７プロモーターとＭａｎｇｏ ＩＩ配列との間に位置する。ステロイドホルモン受容体（ＳＨＲ）を、Ｔ７インビトロ転写（ＩＶＴ）反応ミックスに添加し、受容体特異的リガンドによって活性化させると、ＳＨＲは、ＤＮＡテンプレート上のＨＲＥに結合し、この結合位置でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡをＲＮＡに転写することを物理的に阻害し、したがってＭａｎｇｏ ＩＩアプタマーは形成されない。Ｍａｎｇｏ ＩＩの形成は、Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーに結合する反応ミックスにＴＯ１－ビオチンなどの特定のフルオロフォアを添加することによって検出される。ＴＯ１は、Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーに結合すると、５１０ｎｍの波長で励起されると、５３５ｎｍの波長で励起波長を放出する。蛍光は、標準的な蛍光光度計を使用して測定される。
【0253】
２．１ アンドロゲンアッセイプロトタイプ２の開発に使用したＤＮＡ配列
以下の実験では、ＳＨＲの例としてＡＲまたはＥＲαを使用し、ＨＲＥの例としてＡＲＥまたはＥＲＥを使用する。
以下の実験では、ＳＨＲの例としてＡＲまたはＥＲαを使用し、ＨＲＥの例としてＡＲＥまたはＥＲＥを使用する。
【0254】
Ｔ７が媒介するインビトロ転写を支える重要なステップは、ＤＮＡテンプレート内のそのプロモーター配列を認識するためのものである。次いで、Ｔ７転写が生じたことを測定するには、ＤＮＡ配列は、レポーター酵素（タンパク質）またはレポーターＲＮＡ（例えばアダプマー）をコードし得る。以下の例では、ＤＮＡ配列は、レポーターＲＮＡ（Ｍａｎｇｏ ＩＩ）をコードしていた。
【0255】
市販のＤＮＡ断片合成を使用して、（１）Ｔ７イニシエーター配列、（２）ＡＲＥ、（３）Ｆ３０足場を含むＭａｎｇｏ ＩＩ ＲＮＡアプタマーをコードする一連のＤＮＡテンプレートを生成した。これらのＤＮＡ断片をプラスミドにクローン化し、形質転換したＥ．ｃｏｌｉを使用して増幅した。その後のプラスミド抽出、精製、線状化によって、プロトタイプアッセイ用の最終的なＤＮＡテンプレートが提供された。転写因子がＴ７活性を遮断した他の例は、Ｔ７イニシエーター配列と転写因子部位との間が約１５ｂｐであることが、Ｔ７の進行を遮断するのに最適であることを示している。したがって、１５ｂｐのフィラー配列を、ＤＮＡ断片に含めた。
【表2】
【0256】
２．２ テストステロン活性化ＡＲは、Ｔ７が媒介するＲＮＡアプタマー、Ｍａｎｇｏ ＩＩの発現を抑制することが可能である
ＳＨＲリガンドを検出するためのＳＨＲ－ＨＲＥ－ＲＮＡアプタマー反応は、ホルモン応答要素に結合したＳＨＲによるＴ７転写の遮断に依存する。以下の例では、ＳＨＲおよびＨＲＥを表すために、ＡＲおよびＡＲＥを使用した。
ＳＨＲリガンドを検出するためのＳＨＲ－ＨＲＥ－ＲＮＡアプタマー反応は、ホルモン応答要素に結合したＳＨＲによるＴ７転写の遮断に依存する。以下の例では、ＳＨＲおよびＨＲＥを表すために、ＡＲおよびＡＲＥを使用した。
【表3】
【0257】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを添加して反応を組み立て、開始し、３７℃で１５０分間インキュベートした。この間に、ＲＮＡ Ｍａｎｇｏ ＩＩアプタマーが生成された。Ｍａｎｇｏ ＩＩの検出は、フルオロフォア、ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅ （ＴＯ１）の添加、および蛍光光度計を用いた出力の測定、励起５１０ｎｍ、発光５３５ｎｍによるものであった。図５は、テストステロン活性化ＡＲが、Ｔ７が生成したＲＮＡアプタマーＭａｎｇｏ ＩＩの量を用量依存的様式で低減することが可能であることを示している。テストステロンは、体内で最も豊富な内因性循環アンドロゲンを代表する。テストステロンは、末梢組織（例えば、生殖腺）でジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に変換され得る。ＤＨＴはまた、Ｔ７が生成したＭａｎｇｏ ＩＩにおける、ＡＲが調節した低減を活性化することが見出された。
【0258】
２．３ ステロイドホルモン受容体の滴定
上のように、以下の実験では、ＡＲをステロイドホルモン受容体の例として使用した。
上のように、以下の実験では、ＡＲをステロイドホルモン受容体の例として使用した。
【0259】
上の実験では、表３に示すように、初期ＡＲ濃度は、発明者の研究室で確立した以前の無細胞アッセイに基づいていた。Ｔ７が媒介するＭａｎｇｏ ＩＩ生成の低減は、現在ＤＮＡテンプレートに結合し、活性なすべてのＴ７酵素分子を遮断するのに十分なＡＲがあることに依存する。これは、ＡＲ対Ｔ７の比およびＡＲ対ＤＮＡテンプレートの比の両方が重要であることを意味する。しかしながら、ＡＲのレベルは、蛍光の変化を検出するために必要な十分なＭａｎｇｏ ＩＩ生成を支援するＴ７および／またはＤＮＡテンプレートの最適レベルの背景で考慮する必要がある。
【0260】
次の一連の実験では、Δ［Ｍａｎｇｏ ＩＩ］への影響を示すために、反応当たりのＡＲ濃度を変化させた。
【表4】
【0261】
５０ｎｇのＡＲ反応を「標準」反応として使用すると、ＡＲの分子数は、２．７３７ｅ１１（４５４．５５ｆｍｏｌまたは２２．７２ｎＭ）、対するＤＮＡ分子の数は、３．７９８ｅ１０（６３．０６ｆｍｏｌまたは３．１５ｎＭ）であり、７．２：１のＡＲ：ＤＮＡの過剰比が生じる。ＡＲ濃度を１００ｎｇに２倍にすると、比は２倍の１４．４：１になる。ＡＲ濃度を２５ｎｇに半分にすると、比は半分の３．６：１になり、さらに１４．２ｎｇのＡＲでは再び１．８：１になる。
【0262】
図６のデータは、７．２：１以上のＡＲ：ＤＮＡ比は、より高いΔＭａｎｇｏ ＩＩを生じることを示している。より低い比でもΔＭａｎｇｏ ＩＩが示されるが、効果の程度は低減される。顕著なことに、７．２から１４．４に比を急上昇させると、ΔＭａｎｇｏ ＩＩの効果の程度の改善を示さず、７．２：１のＡＲ対ＤＮＡの過剰が、Ｔ７活性を遮断するのに十分であり、さらに過剰になると冗長性が生じることを示唆している。
【0263】
ＨＳＰ９０が過剰であると、特に低濃度のリガンドでＳＨＲの活性化が遮断されるが、ＨＳＰ９０が不十分であると、ＳＨＲの自動活性化が可能になるので、ステロイドホルモンによるＳＨＲの活性化を考慮すると、ＨＳＰ９０対ＳＨＲの比も調べる必要がある。再び、代表的なＳＨＲとしてＡＲを使用する次の組の実験では、ＨＳＰ９０対ＡＲの比を変化させて、Ｔ７が生成するＭａｎｇｏ ＩＩへのテストステロンによる影響を精査した。
【表5】
【0264】
図７は、ＨＳＰ９０：ＡＲの比が２．４４：１である５０ｎｇのＡＲおよび１００ｎｇのＨＳＰ９０の標準反応が最適であったことを示しているが、しかしながら、他の比でも同じレベルのΔＭａｎｇｏ ＩＩを達成することができた。例えば、６．６９ｅ１１分子（１．１１ｐｍｏｌまたは５５．５ｎＭ）に対応する１００ｎｇのＨＳＰ９０、および５．４７ｅ１１分子（９０９．０９ｆｍｏｌまたは４５．５ｎＭ）に対応する１００ｎｇのＡＲ、または１．２２：１の比はまた、Ｔ７が媒介するＭａｎｇｏ ＩＩの生成の良好な抑制を示した。同様に、それぞれ１．３７ｅ１１分子（２２７．２７ｆｍｏｌまたは１１．４ｎＭ）および６．６９ｅ１１分子（１．１１ｐｍｏｌまたは５５．５ｎＭ）を表すＡＲ（２５ｎｇ）およびＨＳＰ９０（１００ｎｇ）、または４．８８：１の比は、２．４４：１の比と差がないΔＭａｎｇｏＩＩを示した。しかしながら、ＡＲ濃度が＜１００ｎｇの場合の１．２２：１の比と同様に、９．７６：１の比はΔＭａｎｇｏＩＩの低減を示した。
【0265】
重要なことに、図６および７のデータは、生物学的反応を化学量論的に定義する独特な能力を強調している。
【0266】
ＡＲ：ＤＮＡ比が≧７．２：１であると、ＡＲは、ＡＲＥへの結合、およびＴ７の進行の遮断に最も効果的である。ＨＳＰ９０：ＡＲ比が１．２２：１～４．８８：１であると、ＡＲは、リガンドにる活性化、およびＡＲＥへの結合に最も効果的である。
【0267】
２．４ ＨＲＥの操作
これまでのデータは、細胞に基づくＡＲバイオアッセイで一般的に使用されている３Ｘ ＡＲＥ配列を使用している（表２を参照されたい）。しかしながら、同定されたプライマリーＡＲＥは、配列ＡＧＡＡＣＡｇｃｃＴＧＴＴＣＴのものである。Ｔ７酵素がＡＲによって物理的に遮断されるこのアッセイの機能を考慮すると、３Ｘ ＡＲＥ配列の存在は必要ない場合がある。以下の試験では、単一であるが、プライマリーな配列のＡＲＥをＴ７ ＤＮＡテンプレートにクローン化した。図８は、活性化ＡＲがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを遮断した３Ｘ ＡＲＥ配列と同程度に、単一のＡＲＥが効果的であることを明らかに示している。
これまでのデータは、細胞に基づくＡＲバイオアッセイで一般的に使用されている３Ｘ ＡＲＥ配列を使用している（表２を参照されたい）。しかしながら、同定されたプライマリーＡＲＥは、配列ＡＧＡＡＣＡｇｃｃＴＧＴＴＣＴのものである。Ｔ７酵素がＡＲによって物理的に遮断されるこのアッセイの機能を考慮すると、３Ｘ ＡＲＥ配列の存在は必要ない場合がある。以下の試験では、単一であるが、プライマリーな配列のＡＲＥをＴ７ ＤＮＡテンプレートにクローン化した。図８は、活性化ＡＲがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを遮断した３Ｘ ＡＲＥ配列と同程度に、単一のＡＲＥが効果的であることを明らかに示している。
【0268】
２．５ ＤＮＡテンプレートの滴定
ＤＮＡテンプレートはアッセイの重要な構成要素であり、また存在するＡＲ分子の数がＴ７酵素によるレポーター構築物の転写を立体的に妨げることができるように過剰ではなく、Ｔ７転写を支援する濃度である必要がある。
ＤＮＡテンプレートはアッセイの重要な構成要素であり、また存在するＡＲ分子の数がＴ７酵素によるレポーター構築物の転写を立体的に妨げることができるように過剰ではなく、Ｔ７転写を支援する濃度である必要がある。
【0269】
次の一連の実験では、ＡＲおよびＴ７を一定に保持してＤＮＡテンプレートを滴定した。これによって、転写を支援し、ＡＲ遮断を維持するのに必要なＤＮＡ分子の数についての洞察が提供された。図９のデータは、７．２：１のＡＲ：ＤＮＡ比を表す、ＡＲの濃度が５０ｎｇ（２．７３７ｅ１１分子、４５４．５５ｆｍｏｌまたは２２．７２ｎＭ）であり、ＤＮＡ濃度が１００ｎｇ（３．７９８ｅ１０、６３．０６ｆｍｏｌまたは３．１５ｎＭ）であると、ΔＭａｎｇｏ ＩＩの検出が良好であることを示している。ＤＮＡ濃度を１４．４：１、１７．２８：１、２８．８：１の試験比に下げることによって、ＤＮＡに対してＡＲの量を過剰に増加させても、ΔＭａｎｇｏ ＩＩの改善には影響しなかった。したがって、７．２：１の過剰比は、最大の効果を達成する。Ｔ７が媒介する蛍光出力の劇的な減少があったので、ＤＮＡテンプレートを６．４６ｅ９または３．３９８ｅ９に低減すると、ΔＭａｎｇｏ ＩＩに影響を与えたことに留意されたい（データは示さず）。したがって、９．４９５ｅ９分子の二本鎖ＤＮＡは、反応を成功させるために必要な最小レベルであるが、過剰なＡＲ：ＤＮＡを７．２：１超に維持する必要がある。より多くＡＲを添加して７．２を超えると冗長性が生じるが、ＤＮＡを減少させて比を増加させると、Ｔ７が媒介する転写自体がリスクに晒される。
【0270】
図９からのデータは、生物学的に効果的であるが、合成的に達成されたＳＨＲ反応を引き続き定義している。個々の構成要素の化学量論的分析を通じて、ＡＲ：ＤＮＡ比が≧７．２：１であると、ＡＲは、ＡＲＥへの結合、およびＴ７の進行の遮断に最も効果的であることが実験で確認された。しかしながら、この比を構成すると、ＤＮＡテンプレート濃度を最低９．４９５ｅ９分子の二本鎖ＤＮＡに固定する必要があり、そうでなければ、転写の基本レベルが損なわれる。
【0271】
２．５ Ｔ７ポリメラーゼの滴定
ステロイドホルモン受容体の生物学を模倣することができる完全に定義された化学量論的反応を可能にするために考慮する必要がある、アンドロゲンアッセイプロトタイプ２の最後の構成要素は、Ｔ７酵素自体である。これらの実施例では、ＲＮＡアプタマー、Ｍａｎｇｏ ＩＩであるレポーターを生成するために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをこの反応で使用する。
ステロイドホルモン受容体の生物学を模倣することができる完全に定義された化学量論的反応を可能にするために考慮する必要がある、アンドロゲンアッセイプロトタイプ２の最後の構成要素は、Ｔ７酵素自体である。これらの実施例では、ＲＮＡアプタマー、Ｍａｎｇｏ ＩＩであるレポーターを生成するために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをこの反応で使用する。
【0272】
Ｔ７酵素の量は、最適なダイナミックレンジを可能にするであろうスペクトル内で蛍光の読み取りを維持するために重要である。Ｔ７は酵素であるので、重要な要素は濃度だけでなく、活性も重要である。次の一連の実験は、ΔＭａｎｇｏ ＩＩに対するＴ７活性の変化の影響を示した。
【0273】
図１０では、データは、Ｔ７単位を５０Ｕ～１０Ｕに滴定して、Ｔ７が生成したＭａｎｇｏＩＩ：ＴＯ１Ｂの蛍光レベルを示している。明らかな検出ベースラインを示す、２０００００近くのすべての測定値では、４０～１０Ｕの酵素範囲で測定された蛍光に明らかな差はなく、ベースラインでは出力の変化を測定するのに感受性が十分高くないことに留意されたい。これは、ΔＭａｎｇｏＩＩを測定するために、蛍光測定値が、２０００００を超える必要があることを示唆している。
【0274】
最小蛍光レベルの効果をさらに実証するために、Ｔ７（５０Ｕ）またはＴ７（１００Ｕ）を使用して、テストステロン誘導ＡＲで遮断された反応、または対照としてエタノールを用いた反応で、Ｍａｎｇｏ ＩＩＲＮＡアプタマーを生成した。図１１のデータは、５０Ｕを使用した場合、蛍光が約２５００００～３０００００であることを示し、テストステロン活性化はΔＭａｎｇｏ ＩＩで約９％を示しているが、蛍光が、＞６０００００の範囲である場合、同じ反応は約１６％のΔＭａｎｇｏ ＩＩを示している。したがって、データは、Ｔ７活性が、＞３０００００のＭａｎｇｏＩＩ－ＴＯ１Ｂ蛍光を生成する範囲内であることが必要であることを強調している。正確な活性または単位は、組み換えＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの特定の活性におけるバッチ間および／または供給業者間の差に依存するであろう。
【0275】
実施例３：
エストロゲンアッセイプロトタイプ３：アッセイアーキテクチャおよび結果
上の実施例では、ＡＲ／ＡＲＥをＳＨＲ／ＨＲＥの例として使用した。以下の一連の実験では、ＡＲ／ＡＲＥに対して確立して定義した反応化学量論を使用して、他のＳＨＲ、この場合ＥＲαへの試験の適用性を示す。以下に提示された結果は、エストラジオール活性化ＥＲαが、Ｔ７が媒介するＲＮＡアプタマー、Ｍａｎｇｏ ＩＩの発現を抑制することが可能であることを実証している。
エストロゲンアッセイプロトタイプ３：アッセイアーキテクチャおよび結果
上の実施例では、ＡＲ／ＡＲＥをＳＨＲ／ＨＲＥの例として使用した。以下の一連の実験では、ＡＲ／ＡＲＥに対して確立して定義した反応化学量論を使用して、他のＳＨＲ、この場合ＥＲαへの試験の適用性を示す。以下に提示された結果は、エストラジオール活性化ＥＲαが、Ｔ７が媒介するＲＮＡアプタマー、Ｍａｎｇｏ ＩＩの発現を抑制することが可能であることを実証している。
【表6】
【0276】
テストステロンの検出試験に成功したことが証明された標準的なＡＲ／ＡＲＥ条件を使用したが、しかしながら、ＡＲをＥＲαに置き換え、単一のＥＲＥをコードするＤＮＡテンプレートをＡＲＥ ＤＮＡテンプレートに置き換えた（表６）。図１２は、ＡＲをＨＳＰ９０（１００ｎｇ）と組み合わせたＥＲα（５０ｎｇ）に置き換え、５μＭのエストラジオール（Ｅ２）で活性化すると、ＭａｎｇｏＩＩ：ＴＯ１の出力の低減がもたらされたことを示している。ΔＭａｎｇｏ ＩＩは、約６０％であった。比を考慮すると、６８ｋＤａでのＥＲαは、ＡＲ（１１０ｋＤａ）よりも小さく、したがって、重量に対する添加した分子の数は、４．４２８ｅ１１（７３５．２０ｆｍｏｌまたは３６．８ｎＭ）であった。したがって、ＨＳＰ９０：ＥＲαの比は６．６９ｅ１１ ：４．４２８ｅ１１または１．５１：１であり、ＥＲα：ＤＮＡの比は、４．４２８ｅ１１：３．７９８ｅ１０または１１．６６：１であった。これらの両方は、ＳＨＲ／ＨＲＥ試験のＡＲバージョンでアンドロゲンの検出に成功する比であることが見出された範囲内であった。
【表7】
【0277】
エストロゲンの検出についてのＥＲα：ＥＲＥ反応の重要性は２倍である。第１に、必須の試験構成要素をＡＲ／ＡＲＥＤＮＡテンプレートからＥＲ／ＥＲＥ ＤＮＡテンプレートに切り替える際の簡単さを示している。第２に、リガンドがアンドロゲン受容体に結合し、ＨＳＰ９０から移し、ＡＲＥへの結合が第２のステロイドホルモン受容体／ステロイド応答要素の組み合わせに翻訳可能であることによって、アンドロゲン生物学を模倣するＡＲ／ＡＲＥに対して確立された定義された化学量論的反応を示している。
【0278】
データは、試験が無細胞の様式で、かつすべての構成要素を定義することができるような方式、すなわち真のインサイチュ試験で、ステロイドホルモンの生物学を再現することが可能であることを示している。これは、細胞に基づくバイオアッセイまたは、ホロ酵素ＲＮＡポリメラーゼＩＩを提供する核抽出物に基づく無細胞バイオアッセイを使用するときのインビトロの状況とは異なる。細胞に基づくバイオアッセイの場合、ＳＨＲ、ＨＳＰ９０、ＤＮＡテンプレート、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩのレベルは、細胞の発現パターンによって影響を受けるので、まったく定義することができない。核抽出物に基づく無細胞バイオアッセイは、ＳＨＲ、ＨＳＰ９０、およびＨＲＥレベルを記載することによって、反応の化学量論を部分的に定義することができるが、しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼレベルを定義することは不可能である。ＲＮＡポリメラーゼＩＩはホロ酵素であり、いくつかのサブユニットまたはタンパク質で構成されており、したがって、核抽出物の形態でのみ供給することができる。核抽出物は、他のどのタンパク質に存在するか定義されていない。アッセイのこの単一のポリペプチドＲＮＡポリメラーゼ形態では、反応の化学量論を完全に定義することができ、データは、そのような反応を、ステロイドホルモン受容体の天然の生物学を模倣するように合成的に操作することができることを示している。
【0279】
実施例４
プロトタイプアッセイのためのリガンド－ＳＨＲ／ＨＲＥ化学量論的反応
実施例２および３に提示されたデータによって、リガンドが特定の受容体に結合し、それによって、受容体がＨＳＰ９０から移動し、ステロイド応答要素に結合する、従来のステロイドホルモンゲノム応答である、ステロイドホルモン受容体生物学を模倣する、定義された化学量論が明らかになった。天然では、ＳＨＲは、標的遺伝子の発現を活性化または抑制するであろう。本明細書に記載のプロトタイプアッセイでは、配位したＳＨＲの結合は、レポーター分子の発現を抑制する。
プロトタイプアッセイのためのリガンド－ＳＨＲ／ＨＲＥ化学量論的反応
実施例２および３に提示されたデータによって、リガンドが特定の受容体に結合し、それによって、受容体がＨＳＰ９０から移動し、ステロイド応答要素に結合する、従来のステロイドホルモンゲノム応答である、ステロイドホルモン受容体生物学を模倣する、定義された化学量論が明らかになった。天然では、ＳＨＲは、標的遺伝子の発現を活性化または抑制するであろう。本明細書に記載のプロトタイプアッセイでは、配位したＳＨＲの結合は、レポーター分子の発現を抑制する。
【表8】
【表9】
【0280】
実施例５
アンドロゲンアッセイプロトタイプ２はアンドロゲン分子を検出する
アンドロゲン分子は、元来ステロイドホルモンである。テストステロンおよびジヒドロテストステロンは、最も豊富な内因性アンドロゲンである。それらの構造に基づいて、合成アンドロゲンアナボリックステロイドホルモン（ＡＡＳ）が設計され、市場に出回っている。ＡＡＳは、アスリート、ヒト、動物などにおける、最も一般的に乱用されているパフォーマンス向上薬物である。合成的に誘導された別のクラスのアンドロゲン分子は、選択的アンドロゲン受容体モジュレーターまたはＳＡＲＭである。ＡＡＳと同様に、ＳＡＲＭは、アスリートによって乱用されている。ＡＡＳおよびＳＡＲＭの両方は、構造が異なり、非常に多様な異なる側基および骨格を有する。この次の一連の実験では、ＡＲ／ＨＳＰ９０－ＡＲＥプロトタイプアッセイが、異なるＡＡＳおよびＳＡＲＭを検出することが可能であるかどうかを試験した。
アンドロゲンアッセイプロトタイプ２はアンドロゲン分子を検出する
アンドロゲン分子は、元来ステロイドホルモンである。テストステロンおよびジヒドロテストステロンは、最も豊富な内因性アンドロゲンである。それらの構造に基づいて、合成アンドロゲンアナボリックステロイドホルモン（ＡＡＳ）が設計され、市場に出回っている。ＡＡＳは、アスリート、ヒト、動物などにおける、最も一般的に乱用されているパフォーマンス向上薬物である。合成的に誘導された別のクラスのアンドロゲン分子は、選択的アンドロゲン受容体モジュレーターまたはＳＡＲＭである。ＡＡＳと同様に、ＳＡＲＭは、アスリートによって乱用されている。ＡＡＳおよびＳＡＲＭの両方は、構造が異なり、非常に多様な異なる側基および骨格を有する。この次の一連の実験では、ＡＲ／ＨＳＰ９０－ＡＲＥプロトタイプアッセイが、異なるＡＡＳおよびＳＡＲＭを検出することが可能であるかどうかを試験した。
【表10】
【0281】
図１３は、アッセイが多様なＡＡＳおよびＳＡＲＭを検出することが可能であったことを示している。
【0282】
実施例６
アンドロゲンアッセイプロトタイプ２は、生物学的マトリックス中のアンドロゲン分子を検出する
次に、血清または血漿などの生物学的マトリックス中に存在するときのテストステロンを検出する能力について、アンドロゲンアッセイプロトタイプ２を試験した。まず、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが血清の存在下で機能し続けること、すなわち血清自体がＭａｎｇｏ ＩＩアプタマーの生成におけるＴ７の効力を抑制しなかったことを実証する必要があった。図１４は、ウマ血清またはウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼがＭａｎｇｏ ＩＩを生成し続けたことを示している。
アンドロゲンアッセイプロトタイプ２は、生物学的マトリックス中のアンドロゲン分子を検出する
次に、血清または血漿などの生物学的マトリックス中に存在するときのテストステロンを検出する能力について、アンドロゲンアッセイプロトタイプ２を試験した。まず、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが血清の存在下で機能し続けること、すなわち血清自体がＭａｎｇｏ ＩＩアプタマーの生成におけるＴ７の効力を抑制しなかったことを実証する必要があった。図１４は、ウマ血清またはウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼがＭａｎｇｏ ＩＩを生成し続けたことを示している。
【0283】
血清が偶発的にＴ７活性を抑制したという証拠はなかった。次に、血清の存在下で、ＡＲがリガンドの例としてテストステロンに応答し続けるかどうかを試験した。今回は水構成要素をテストステロン（またはビヒクルとしてエタノール）が添加された血清に置き換えたことを除いて、上記のように反応を確立した。図１５は、血清が反応構成要素として存在する場合、反応が損なわれないことを示している。アッセイが、例えば臨床またはスポーツドーピング用途において、生物学的に関連する試料のアンドロゲンレベルを検出することが可能であることを示しているので、この結果は非常に重要である。
【0284】
試験の次の段階では、ウマの尿試料から取り出し、抽出した内因性アンドロゲンを検出する能力について、アンドロゲンアッセイプロトタイプ２を試験した。競走馬の尿試料をレース当日に収集し、通常のプロセスを使用してステロイドを取り出し、抽出した。抽出したステロイドをエタノールに再懸濁し、アッセイを施した。
【0285】
図１６は、アンドロゲンアッセイプロトタイプ２が、子馬（雄ウマ）からの尿試料中で高レベルのアンドロゲンを検出することが可能であった一方で、去勢馬（去勢された雄ウマ）からは高レベルを検出することが可能ではなかったことを示している。去勢馬の尿中のテストステロンおよび添加したトレンボロン（ＡＡＳ）を対照として使用した。
【0286】
【0287】
本発明を例として説明したが、特許請求の範囲に定義された本発明の範囲から逸脱することなく、変形および修正を行うことができることを理解されたい。さらに、特定の特徴について既知の同等物が存在する場合、そのような同等物は、本明細書で具体的に言及されているかのように組み込まれる。
【0288】
本明細書で参照または言及されるすべての特許、出版物、科学記事、ウェブサイト、ならびに他の文書および資料は、本発明が関係する当業者の技能のレベルを示し、そのような参照される各文書および資料は、参照によりその全体が個々に組み込まれるか、またはその全体が本明細書に記載されている場合と同程度の参照によって本明細書に組み込まれる。出願人らは、任意のそのような特許、出版物、科学記事、ウェブサイト、電子的に入手可能な情報、および他の参照資料または文書からの任意のかつすべての資料および情報を本明細書に物理的に組み込む権利を留保する。
【0289】
用いられている用語および表現は、限定ではなく、説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用には、示され説明された特色またはそれらの一部分の任意の同等物を除外する意図はないが、特許請求されるように、本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意選択的な特色によって具体的に開示されているが、本明細書に開示の概念の修正および変形は、当業者によって用いることができ、そのような修正および変形は、本明細書に記載され、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の範囲内であると見なされることが理解されるであろう。
【0290】
発明は、本明細書において広く一般的に説明されてきた。一般的な開示に含まれるより狭義の種および亜属のグループの各々もまた、発明の一部を形成する。これは、削除された材料が本明細書に具体的に列挙されているかどうかに関係なく、属から任意の主題を削除する但し書き、または何かを含まない制限（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）による、発明の一般的な説明を含む。
【0291】
他の例は、以下の特許請求の範囲内にある。加えて、発明の特色または態様が、Ｍａｒｋｕｓｈ群の観点で記載されている場合、当業者は、発明が、それによって、Ｍａｒｋｕｓｈ群の任意の個々のメンバーまたはサブグループのメンバーの観点でも説明されていることを認識するであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】