特許 7609774 修飾された糸状菌宿主細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-23

(45)【発行日】2025-01-07

(54)【発明の名称】修飾された糸状菌宿主細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/15 20060101AFI20241224BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20241224BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20241224BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20241224BHJP

   C12N 9/38 20060101ALI20241224BHJP

   C12N 9/40 20060101ALI20241224BHJP

   C12N 9/42 20060101ALI20241224BHJP

   C12N 9/26 20060101ALI20241224BHJP

   C12N 9/90 20060101ALI20241224BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20241224BHJP

   C07K 14/37 20060101ALI20241224BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241224BHJP

【ＦＩ】

C12N1/15 ZNA

C12N9/02

C12N15/53

C12N9/00

C12N9/38

C12N9/40

C12N9/42

C12N9/26

C12N9/90

C12N9/10

C07K14/37

C12P21/02 C

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2021529853

(86)(22)【出願日】2019-11-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-09

(86)【国際出願番号】 US2019063415

(87)【国際公開番号】W WO2020112881

(87)【国際公開日】2020-06-04

【審査請求日】2022-11-15

(31)【優先権主張番号】62/772,301

(32)【優先日】2018-11-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500586299

【氏名又は名称】ノボザイムス アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】マイケル レイ

(72)【発明者】

【氏名】ニコラス ヨコムスン

(72)【発明者】

【氏名】井上 千穂

【審査官】上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／０６７５９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５２０６６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／０２８５４４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１５／００１０４９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８

Ｃ１２Ｎ ９／００－９９

Ｃ１２Ｎ １５／００－９０

Ｃ０７Ｋ １４／００－８２５

Ｃ１２Ｐ ２１／００－０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

目的の分泌ポリペプチドを産生する突然変異糸状菌宿主細胞であって、前記突然変異糸状菌宿主細胞が、目的の前記分泌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物を含み、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、非突然変異親細胞と比べて、修飾されるか、切断されるか、部分的に若しくは完全に不活性化されるか、低下したレベルで存在するか、又は除去され、且つ前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、ＹＧＡＲ及び／若しくはＶＰＨＳ［Ｗ／Ｙ］Ｆ及び／若しくはＱＣ［Ａ／Ｖ／Ｓ］ＲＲＬ及び／若しくはＬＫＫＹＴＬＰ及び／若しくはＣＰＨＹＴから選択される少なくとも１つの保存されたアミノ酸モチーフを含み；且つ前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び／又は配列番号２６に示される成熟アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
前記宿主細胞の属が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）である、突然変異糸状菌宿主細胞。

【請求項2】

アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アキュレティヌス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅｔｉｎｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ブラジリエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・フェティデュス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・リュウキュウエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスベルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項3】

トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項4】

目的の前記分泌ポリペプチドが、天然又は異種である、請求項１～３のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項5】

前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、配列番号１、配列番号４、配列番号７及び／又は配列番号１０に示されるゲノムＤＮＡ配列に対して少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる遺伝子によってコードされる、請求項１～４のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項6】

前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、配列番号２、配列番号５、配列番号８及び／又は配列番号１１に示されるｃＤＮＡ配列に対して少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる遺伝子によってコードされる、請求項１～５のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項7】

前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、前記コード遺伝子のナンセンス若しくはフレームシフト突然変異により、前記コード遺伝子の部分的若しくは完全な欠失により、又は前記コード遺伝子のサイレンシングにより、修飾されるか、切断されるか、部分的若しくは完全に不活性化されるか、非突然変異親細胞と比べて低下したレベルで存在するか、又は除去される、請求項１～６のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項8】

非突然変異親宿主細胞と比べて、目的の分泌ポリペプチドの改善された収率を有する突然変異糸状菌宿主細胞を産生する方法であって、特定の順序でなく、
ａ）糸状菌宿主細胞を、目的の前記分泌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物で形質転換するステップと；
ｂ）推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼを修飾するか、切断するか、部分的に若しくは完全に不活性化するか、そのレベルを低下させるか、又は除去するため、前記宿主細胞を突然変異させるステップと、を含み、ここで前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、ＹＧＡＲ及び／若しくはＶＰＨＳ［Ｗ／Ｙ］Ｆ及び／若しくはＱＣ［Ａ／Ｖ／Ｓ］ＲＲＬ及び／若しくはＬＫＫＹＴＬＰ及び／若しくはＣＰＨＹＴから選択される少なくとも１つの保存されたアミノ酸モチーフを含み；且つ前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び／又は配列番号２６に示される成熟アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
前記宿主細胞の属が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）である、方法。

【請求項9】

前記糸状菌宿主細胞が、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アキュレティヌス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅｔｉｎｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ブラジリエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・フェティデュス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・リュウキュウエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスベルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記糸状菌宿主細胞が、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞である、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

目的の前記分泌ポリペプチドが、酵素である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、配列番号１、配列番号４、配列番号７及び／又は配列番号１０で示されるゲノムＤＮＡ配列に対して少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる遺伝子によってコードされる、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、配列番号２、配列番号５、配列番号８及び／又は配列番号１１で示されるｃＤＮＡ配列に対して少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる遺伝子によってコードされる、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、前記コード遺伝子のナンセンス若しくはフレームシフト突然変異により、前記コード遺伝子の部分的若しくは完全な欠失により、又は前記コード遺伝子のサイレンシングにより、修飾されるか、切断されるか、部分的若しくは完全に不活性化されるか、非突然変異親細胞と比べて低下したレベルで存在するか、又は除去される、請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

目的の分泌ポリペプチドを産生する方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載の突然変異糸状菌宿主細胞を前記分泌ポリペプチドの前記産生に対して実用的な条件下で培養するステップを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表に対する参照
本願は、コンピュータで読み込み可能な形式の配列表を含む。コンピュータで読み込み可能な形式は、参照により本明細書中に援用される。

【0002】

本発明は、修飾された糸状菌細胞及びかかる細胞を産生するための方法、並びにその中で目的の分泌ポリペプチドを産生する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

糸状菌宿主細胞は、目的の多種多様なポリペプチドの工業生産を意図して広範に利用される。強力な研究努力は、糸状菌宿主細胞における目的のポリペプチドの産生を改善する、特に生産性及び／又は収率を改善することを対象とする。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明者は、酵素産生宿主細胞内で予測された推定上のステロイドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を修飾することにより、酵素の改善された生産性及び／又は収率がもたらされることを見出した。

【0005】

したがって、第１の態様では、本発明は、目的の分泌ポリペプチドを産生する突然変異糸状菌宿主細胞であって、ここで推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、非突然変異親細胞と比べて、修飾されるか、切断されるか、部分的に若しくは完全に不活性化されるか、低下したレベルで存在するか、又は除去され、且つ前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、ＹＧＡＲ及び／若しくはＶＰＨＳ［Ｗ／Ｙ］Ｆ及び／若しくはＱＣ［Ａ／Ｖ／Ｓ］ＲＲＬ及び／若しくはＬＫＫＹＴＬＰ及び／若しくはＣＰＨＹＴから選択される少なくとも１つの保存されたアミノ酸モチーフを含み；好ましくは、保存されたモチーフの少なくとも２つ；より好ましくは、保存されたモチーフの少なくとも３つ又は４つを含み；最も好ましくは、保存されたモチーフの５つ全部を含む、突然変異糸状菌宿主細胞を対象とする。

【0006】

推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼを修飾するか、切断するか、不活性化するか、そのレベルを低下させるか、又は完全に除去することは、当該技術分野で公知の任意の好適な方法、例えば、前記遺伝子の天然プロモーターの異種プロモーター、好ましくは調節性プロモーターとの置換によりコード遺伝子の発現を低減することにより、実施されてもよい。推定上のステロイドデヒドロゲナーゼのレベルを低下させるための別の方法としては、ユビキチンドメインなどの不安定化ドメインをタンパク質に加え、それによりタンパク質の半減期を減少させることであり得る。さらに、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼを不活性化するか、そのレベルを低下させるか、又は完全に除去するための別の方法は、１つ以上のステロイドデヒドロゲナーゼ阻害剤を同時発現させるか又は添加することである。発現を完全に除去するための便宜的方法の例が、遺伝子欠失、遺伝子置換又は遺伝子中断であり、それは例えば、ナンセンス突然変異をコード配列に導入することによる。コード配列を修飾するための別の方法としては、コード配列の一部を欠失させるか、又はコード配列を突然変異させることによりイントロンプロセシングを改変させるかのいずれかにより、内部欠失を導入することであり得る。さらに、推定上のステロイドデヒドロゲナーゼを不活性化するための別の方法としては、ＲＮＡ干渉若しくはｓｉＲＮＡを用いてその発現を抑制するか、又はプロモーターを有し、おそらくは推定上のステロイドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の末端の方への転写の方向を有するターミネーターが欠如した構築物であって、ＲＮＡポリメラーゼの衝突、又はｍＲＮＡ分子の相補的配列を伴った形成が原因で生じ得るｍＲＮＡの不安定化に起因し、推定上のステロイドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写の立体的妨害をもたらすものの挿入であり得る。

【0007】

したがって、第２の態様では、本発明は、非突然変異親宿主細胞と比べて、目的の分泌ポリペプチドの改善された収率を有する突然変異糸状菌宿主細胞を産生する方法であって、特定の順序でなく、
ａ）糸状菌宿主細胞を、目的の分泌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物で形質転換するステップと；
ｂ）推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼを修飾するか、切断するか、部分的に若しくは完全に不活性化するか、そのレベルを低下させるか、又は除去するため、宿主細胞を突然変異させるステップと、を含み、ここで前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、ＹＧＡＲ及び／若しくはＶＰＨＳ［Ｗ／Ｙ］Ｆ及び／若しくはＱＣ［Ａ／Ｖ／Ｓ］ＲＲＬ及び／若しくはＬＫＫＹＴＬＰ及び／若しくはＣＰＨＹＴから選択される少なくとも１つの保存されたアミノ酸モチーフ；好ましくは、保存されたモチーフの少なくとも２つ；より好ましくは、保存されたモチーフの少なくとも３つ若しくは４つを含み；最も好ましくは、保存されたモチーフの５つ全部を含む、方法に関する。

【0008】

本発明の最終的態様は、目的の分泌ポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）いずれかの先行する請求項に記載の突然変異糸状菌宿主細胞を分泌ポリペプチドの産生に対して実用的な条件下で培養するステップと；任意選択的には、
ｂ）目的の分泌ポリペプチドを回収するステップと、
を含む方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】ｐＮＪＯＣ５７７のプラスミドマップを示す。

【図2】ｐＮＪＯＣ３８３のプラスミドマップを示す。

【図3A】配列番号３、６、９及び１２において同定された４つの推定上のステロイドデヒドロゲナーゼの複数の整列化を示す。同一残基が黒色ボックスにより示される。４つのタンパク質のうちの３つにおいて保存された残基が灰色ボックスにより示される。タンパク質は、デフォルトパラメータを有するＭＵＳＣＬＥアルゴリズムバージョン３．８．３１を用いて整列される（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．（２００４）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２（５），１７９２－１７９７）。

【図3B】図３Ａの説明に同じ。

【図4】ｐＮＪＯＣ５６９のプラスミドマップを示す。

【図5】ＮＪＯＣ５８７株（対照）及びＮＪＯＣ６１８－８１Ｄ株（ステロイドデヒドロゲナーゼ突然変異体）における相対的なリゾチームの生産性／収率（ＬＳＵ（Ｆ）／ｍｌ）を示す。発酵終了時の対照におけるＬＳＵ（Ｆ）／ｍｌデータは、データを正規化するために使用された。図面では、伝統的な小数点の代わりの小数セパレータとして、コンマが使用されている。

【図6】ｐＴｍｍＤ－Ｔｌ＿リパーゼのプラスミドマップを示す。

【図7】ＮＪＯＣ６００－２Ａ株（対照）及びＮＪＯＣ６０９－１Ａ株（ステロイドデヒドロゲナーゼ突然変異体）における相対的なリパーゼの生産性／収率（ＬＵ（ＬＸＰ）／ｍｌ）を示す。発酵終了時の対照におけるＬＵ（ＬＸＰ）／ｍｌデータは、データを正規化するために使用された。図面では、伝統的な小数点の代わりの小数セパレータとして、コンマが使用されている。

【図8】ｐＳＭａｉ３２６のプラスミドマップを示す。

【図9】ＮＪＯＣ６０８－１Ｂ株（対照）及びＮＪＯＣ６１７－７７Ｃ株（ステロイドデヒドロゲナーゼ突然変異体）における相対的なキサンタナーゼの生産性／収率を示す。発酵終了時の対照におけるキサンタナーゼの収率は、データを正規化するために使用された。図面では、伝統的な小数点の代わりの小数セパレータとして、コンマが使用されている。

【図10】ｐＴｍｍＤ－Ｍｆ＿リゾチームのプラスミドマップを示す。

【図11】ＮＪＯＣ６０１－５Ａ株（対照）及びＮＪＯＣ６１０－２Ｂ株（ステロイドデヒドロゲナーゼ突然変異体）における相対的なＭ．ｆ．リゾチームの生産性／収率（ＬＳＵ（Ａ）／ｍｌ）を示す。発酵終了時の対照におけるリゾチームの収率は、データを正規化するために使用された。図面では、伝統的な小数点の代わりの小数セパレータとして、コンマが使用されている。

【図12】ｐＩＨＡＲ４７３のプラスミドマップを示す。

【図13】ｐＡＴ３６３１のプラスミドマップを示す。

【図14】ＡＴ３０９１株（対照）及びＡＴ３９４４株（ステロイドデヒドロゲナーゼ突然変異体）における相対的なフィターゼの生産性／収率を示す。発酵終了時の対照におけるフィターゼの収率は、データを正規化するために使用された。図面では、伝統的な小数点の代わりの小数セパレータとして、コンマが使用されている。

【発明を実施するための形態】

【0010】

定義
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞又は原核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製されることが可能であるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次ＲＮＡ転写物は、成熟型のスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡの前駆体である。

【0011】

コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定されるが、これは、ＡＴＧ、ＧＴＧ、又はＴＴＧなどの開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、又はＴＧＡなどの終止コドンで終了する。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組合せのいずれであってもよい。

【0012】

制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して在来（すなわち、同じ遺伝子に由来する）若しくは外来の（すなわち、異なる遺伝子に由来する）ものであっても、又は、相互に在来若しくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、制御配列は、プロモーター、並びに、転写及び翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域と制御配列の連結を促進させる特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。

【0013】

発現：「発現」という用語は、限定するものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌物を含むポリペプチドの生成に関与するいずれかのステップを含む。

【0014】

発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす制御配列に作動可能にリンクされている直鎖又は環状ＤＮＡ分子を含む。

【0015】

宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入などに対する感受性を有するあらゆる細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異による親細胞と同じではない親細胞のあらゆる子孫を包含する。

【0016】

単離された：「単離された」という用語は、自然界においては生じない形態又は環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、（１）いずれかの非天然物質、（２）限定するものではないが、自然界において関連している天然構成成分の１種又は複数種若しくは全てから少なくとも部分的に取り出されたいずれかの酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド若しくは補因子を含むいずれかの物質；（３）自然界において見出される物質に対して人為的に修飾されたいずれかの物質；又は、（４）自然界で関連する他の成分に対して物質量の増加により修飾されたいずれかの物質（例えば、宿主細胞中の組み換え産物；物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードする遺伝子と自然界で関連するプロモーターより強力なプロモーターの使用）が挙げられる。単離された物質は、発酵ブロスサンプル中に存在してもよい。

【0017】

成熟ポリペプチド：用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳及び任意の翻訳後修飾、例えば、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などに後続する最終形態におけるポリペプチドを意味する。宿主細胞が、同じポリヌクレオチドによって発現される２つ以上の異なる成熟ポリペプチド（即ち、異なるＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸を有する）の混合物を生成することがあることは当該技術分野で公知である。異なる宿主細胞がポリペプチドを別々に処理し、それ故、ポリヌクレオチドを発現する１つの宿主細胞が、同じポリヌクレオチドを発現する別の宿主細胞に対して、異なる成熟ポリペプチド（例えば、異なるＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸を有する）を生成することがあることも当該技術分野で公知である。

【0018】

成熟ポリペプチドコード配列：用語「成熟ポリペプチドコード配列」は、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

【0019】

核酸構築物：用語「核酸構築物」は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は１つ以上の制御配列を含む、通常では天然に存在しないと思われる様式若しくは合成様式で核酸のセグメントを有するように修飾される、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子を意味する。

【0020】

作動可能に連結される：用語「作動可能に連結される」は、制御配列が、ポリヌクレオチドのコード配列に対して、コード配列の発現を誘導するように適切な位置に配置される場合の立体配置を意味する。

【0021】

配列同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメータによって表される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のように算出される：
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）

【0022】

本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のように算出される：
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）

【0023】

宿主細胞
本発明は、目的の異種ポリペプチドの産生及び分泌を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。

【0024】

ポリヌクレオチドを含む構築物又はベクターは、前述の通り、染色体組込み体又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように宿主細胞に導入される。用語「宿主細胞」は、複製中に生じる突然変異が理由で親細胞と同一でない、親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、多くはポリペプチドをコードする遺伝子及びその供給源に依存することになる。

【0025】

宿主細胞は、真菌細胞であってもよい。「真菌」は、本明細書で用いられるとき、アスコミコタ門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、及び接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、並びに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）及びすべての栄養胞子形成菌を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによる定義の通り）。

【0026】

本発明の真菌宿主細胞は、糸状菌細胞である。「糸状菌」は、真菌亜門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌亜門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）のすべての糸状形態を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，上記による定義の通り）。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖からなる菌糸体壁によって特徴づけられる。栄養増殖は、菌糸伸長によるもので、炭素異化作用は、偏性好気性である。

【0027】

糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブジェルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエキロミケス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であってもよい。

【0028】

例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アキュレティヌス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅｔｉｎｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ブラジリエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・フェティデュス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・リュウキュウエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスベルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ブジェルカンデラ・アダスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンズランジカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、ウシグソヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、イチョウタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクトリディオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロックウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼアム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・べネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフテラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アカバンカビ（ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、白色腐朽菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアータ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロタス・エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞であってもよい。

【0029】

真菌細胞は、本質的に公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換されてもよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に適した方法は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１４７０－１４７４、及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１４１９－１４２２に記載されている。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に適した方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７－１５６、及び国際公開第９６／００７８７号パンフレットによって記載されている。

【0030】

一態様では、本発明は、目的の分泌ポリペプチドを産生する突然変異糸状菌宿主細胞であって、ここで推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、修飾されるか、切断されるか、部分的に若しくは完全に不活性化されるか、非突然変異親細胞と比べて低下したレベルで存在するか又は除去され、且つ前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、ＹＧＡＲ及び／若しくはＶＰＨＳ［Ｗ／Ｙ］Ｆ及び／若しくはＱＣ［Ａ／Ｖ／Ｓ］ＲＲＬ及び／若しくはＬＫＫＹＴＬＰ及び／若しくはＣＰＨＹＴから選択される少なくとも１つの保存されたアミノ酸モチーフを含み；好ましくは、保存されたモチーフの少なくとも２つ；より好ましくは、保存されたモチーフの少なくとも３つ若しくは４つを含み；最も好ましくは、保存されたモチーフの５つ全部を含む、突然変異糸状菌宿主細胞に関する。

【0031】

本発明の態様の好ましい実施形態では、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブジェルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエキロミケス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる群から選択される属に属し；さらにより好ましくは、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アキュレティヌス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅｔｉｎｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ブラジリエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・フェティデュス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・リュウキュウエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスベルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ブジェルカンデラ・アダスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）クリソスポリウム・クイーンズランジカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、ウシグソヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、イチョウタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクトリディオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロックウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼアム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・べネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフテラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アカバンカビ（ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、白色腐朽菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアータ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロタス・エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞である。

【0032】

好ましくは、目的の分泌ポリペプチドは、天然又は異種であり；好ましくは、分泌ポリペプチドは、酵素であり；好ましくは、酵素は、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、又はβ－キシロシダーゼである。

【0033】

本発明の好ましい実施形態では、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼは、配列番号３、配列番号６、配列番号９及び／又は配列番号１２で示される成熟アミノ酸配列に対して少なくとも６０％同一なアミノ酸配列；配列番号３、配列番号６、配列番号９及び／又は配列番号１２で示される成熟アミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は最も好ましくは少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。

【0034】

好ましくは、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼは、配列番号１、配列番号４、配列番号７及び／又は配列番号１０で示されるゲノムＤＮＡ配列に対して少なくとも６０％同一なヌクレオチド配列；配列番号１、配列番号４、配列番号７及び／又は配列番号１０で示されるゲノムＤＮＡ配列に対して、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は最も好ましくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる遺伝子によってコードされる。

【0035】

或いは、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼは、配列番号２、配列番号５、配列番号８及び／又は配列番号１１で示されるｃＤＮＡ配列に対して少なくとも６０％同一なヌクレオチド配列；配列番号２、配列番号５、配列番号８及び／又は配列番号１１で示されるｃＤＮＡ配列に対して、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は最も好ましくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる遺伝子によってコードされる。

【0036】

好ましい実施形態では、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼは、コード遺伝子のナンセンス若しくはフレームシフト突然変異により、コード遺伝子の部分的若しくは完全な欠失により、又はコード遺伝子のサイレンシングにより、修飾されているか、切断されているか、部分的若しくは完全に不活性化されているか、非突然変異親細胞と比べて低下したレベルで存在しているか、又は除去されている。

【0037】

第２の態様では、本発明は、非突然変異親宿主細胞と比べて、目的の分泌ポリペプチドの改善された収率を有する突然変異糸状菌宿主細胞を産生する方法であって、特定の順序でなく、
ａ）糸状菌宿主細胞を、目的の分泌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物で形質転換するステップと；
ｂ）推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼを修飾するか、切断するか、部分的に若しくは完全に不活性化するか、そのレベルを低下させるか、又は除去するため、宿主細胞を突然変異させるステップと、を含み、ここで前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、ＹＧＡＲ及び／若しくはＶＰＨＳ［Ｗ／Ｙ］Ｆ及び／若しくはＱＣ［Ａ／Ｖ／Ｓ］ＲＲＬ及び／若しくはＬＫＫＹＴＬＰ及び／若しくはＣＰＨＹＴから選択される少なくとも１つの保存されたアミノ酸モチーフ；好ましくは保存されたモチーフの少なくとも２つ；より好ましくは、保存されたモチーフの少なくとも３つ若しくは４つを含み；最も好ましくは、保存されたモチーフの５つ全部を含む、
方法に関する。

【0038】

核酸構築物
本発明はまた、制御配列と適合性の条件下で、好適な宿主細胞におけるコード配列の発現を指令する１つ又は複数の制御配列に作動可能にリンクされた、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物にも関する。

【0039】

ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現をもたらすために様々な方法で操作してもよい。ベクターに挿入する前のポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに応じて望ましいか、又は必要となり得る。組換えＤＮＡ法を使用してポリヌクレオチドを修飾する技術は、当技術分野で公知である。

【0040】

制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモーターであり得る。プロモーターは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、ミュータント、切断及びハイブリッドプロモーターを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、並びに、宿主細胞に対して相同性又は非相同性である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。

【0041】

糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写を指令する好適なプロモーターの例としては、以下：アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）中性α－アミラーゼ（例えば、ａｍｙＢ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）酸安定α－アミラーゼ（ａｓａＡ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｌｐＡ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉＡ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム・ダリア（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム・クイン（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β－グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β－キシロシダーゼ、及びトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）翻訳伸長因子、並びに、ＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（非翻訳リーダーが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーで置換された、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中性α－アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモーター；非限定的例としては、非翻訳リーダーがアスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーで置換された、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）中性α－アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモーターが挙げられる）の遺伝子から得られるプロモーター；並びに、その突然変異体、切断及びハイブリッドプロモーターがある。その他のプロモーターは、米国特許第６，０１１，１４７号明細書に記載されている。

【0042】

制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネーターであり得る。ターミネーターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’－末端に作動可能にリンクする。本発明においては、宿主細胞において機能するいずれかのターミネーターが用いられ得る。

【0043】

糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネーターは、下記の遺伝子から得られる：アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）α－グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β－グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β－キシロシダーゼ、並びに、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）翻訳伸長因子。

【0044】

制御配列は、プロモーターの下流で、且つ遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化領域であってもよく、これは、遺伝子の発現を増大させる。

【0045】

制御配列はまた、リーダー、すなわち、ｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよく、これは、宿主細胞による翻訳にとって重要である。リーダーは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’－末端に作動可能にリンクさせる。宿主細胞において機能性であれば、どんなリーダーを用いてもよい。

【0046】

糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。

【0047】

制御配列はまた、ポリヌクレオチドの３’－末端に作動可能にリンクし、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに負荷するシグナルとして宿主細胞により認識される配列であるポリアデニル化配列であり得る。宿主細胞において機能するポリアデニル化配列のいずれかが用いられ得る。

【0048】

糸状真菌宿主細胞の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）α－グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。

【0049】

制御配列はまた、ポリペプチドのＮ－末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、及び、ポリペプチドを細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’－末端は、ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。又は、コード配列の５’－末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。又は、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、ポリペプチドの分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列がもちいられてもよい。

【0050】

糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）中性アミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ及びリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。

【0051】

制御配列はまた、ポリペプチドのＮ－末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原又はプロポリペプチド（又は、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒又は自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α－因子の遺伝子から得られ得る。

【0052】

シグナルペプチド及びプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列はポリペプチドのＮ－末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ－末端に隣接して位置されている。

【0053】

宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節配列の例は、調節化合物の存在を含む化学的又は物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。糸状菌においては、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα－アミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモーター、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩプロモーター及びトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩプロモーターが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。

【0054】

発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター、並びに、転写及び翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチド及び制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換を可能とするために１つ又は複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。又は、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。

【0055】

組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖又は閉鎖された環状プラスミドであり得る。

【0056】

ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体又は人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。又は、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、及び、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクター若しくはプラスミド、又は、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクター若しくはプラスミド、又は、トランスポゾンが用いられてもよい。

【0057】

ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入などされた細胞の選択を容易とする１つ又は複数の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性などをもたらす遺伝子である。

【0058】

ー
糸状真菌宿主細胞に使用される選択マーカーとして、限定するものではないが、ａｄｅＡ（ホスホリボシルアミノイミダゾール－スクシノカルボキサミドシンターゼ）、ａｄｅＢ（ホスホリボシル－アミノイミダゾールシンターゼ）、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、並びにこれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子並びにストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子が、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞での使用に好ましい。ａｄｅＡ、ａｄｅＢ、ａｍｄＳ、ｈｐｈ、及びｐｙｒＧ遺伝子が、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞での使用に好ましい。

【0059】

選択マーカーは、国際公開第２０１０／０３９８８９号パンフレットに記載されている通り、二重選択マーカー系であってもよい。一態様では、二重選択マーカーは、ｈｐｈ－ｔｋ二重選択マーカー系である。

【0060】

ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、又は、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。

【0061】

宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、又は、相同的若しくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。又は、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００～１０，０００塩基対、４００～１０，０００塩基対及び８００～１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディング又はコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。

【0062】

部位特異的ゲノム組込みを保証するための別の効率的方法は、国際公開第２０１２／１６００９３号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１８／００３７８９７号明細書に記載の通り、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）フリッパーゼ（ＦＬＰ）及びＦＲＴフリッパーゼ認識配列を使用する、発現カセットの部位特異的な標的化された組込みにおけるゲノム遺伝子座の各々に挿入される、ＦＲＴ部位、例えばＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３の使用である。

【0063】

自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」又は「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミド又はベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。

【0064】

糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１（Ｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ ９８：６１－６７；Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９１６３－９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離及びＡＭＡ１遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示されている方法に従って達成可能である。

【0065】

本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、ポリペプチドの生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、又は、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、したがって、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。

【0066】

上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと）。

【0067】

活性の除去又は低減
本発明はまた、推定上のステロイドデヒドロゲナーゼを修飾するか、切断するか、部分的に若しくは完全に不活性化するか、そのレベルを低下させるか、又は除去するため、宿主細胞を突然変異させるステップを含む方法であって、ここで前記推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼが、ＹＧＡＲ及び／又はＶＰＨＳ［Ｗ／Ｙ］Ｆ及び／若しくはＱＣ［Ａ／Ｖ／Ｓ］ＲＲＬ及び／若しくはＬＫＫＹＴＬＰ及び／若しくはＣＰＨＹＴから選択される少なくとも１つの保存されたアミノ酸モチーフ；好ましくは保存されたモチーフの少なくとも２つ；より好ましくは、保存されたモチーフの少なくとも３つ若しくは４つを含み；最も好ましくは、保存されたモチーフの５つ全部を含む、方法に関する。

【0068】

突然変異細胞は、当該技術分野で周知の方法、例えば、挿入、破壊、置換、又は欠失を用いて、ポリヌクレオチド又はその相同体の発現を低減又は除去することにより構築されてもよい。好ましい態様では、ポリヌクレオチドの発現は、改変、低減又は除去される。改変、低減又は除去されるべきポリヌクレオチドは、例えば、活性にとって必須であるコード領域又はその一部、又はコード領域の発現にとって必要とされる調節エレメントにおいて、突然変異又は修飾されてもよい。かかる調節又は制御配列の例が、プロモーター配列又はその機能的部分、即ちポリヌクレオチドの発現に影響するのに十分な部分であってもよい。可能な修飾についての他の制御配列として、限定はされないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、転写ターミネーター、及び転写活性化因子が挙げられる。

【0069】

ポリヌクレオチドの修飾又は不活性化は、親細胞に突然変異誘発を施し、ポリヌクレオチドの発現が低減又は除去されている場合の突然変異細胞について選択することにより実施されてもよい。突然変異誘発は、特定であっても又はランダムであってもよいが、例えば、好適な物理的若しくは化学的突然変異誘発剤の使用により、好適なオリゴヌクレオチドの使用により、又はＤＮＡ配列にＰＣＲ生成突然変異誘発を施すことにより、実施されてもよい。さらに、突然変異誘発は、これらの突然変異誘発剤の任意の組み合わせの使用により実施されてもよい。

【0070】

本目的に適した物理的又は化学的突然変異誘発剤の例として、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、重亜硫酸ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチド類似体が挙げられる。

【0071】

かかる薬剤が使用されるとき、突然変異誘発は、典型的には、突然変異誘発対象の親細胞を、好適な条件下で選択された突然変異誘発剤の存在下でインキュベートし、遺伝子の発現低下又は無発現を示す突然変異細胞についてスクリーニング及び／又は選択することにより実施される。

【0072】

ポリヌクレオチド又はその相同体の修飾又は不活性化は、遺伝子又はその転写若しくは翻訳に必要とされる調節エレメントにおける１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換、又は欠失により、達成されてもよい。例えば、ヌクレオチドは、停止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームにおける変化又はイントロンプロセシングをもたらすように、挿入又は除去されてもよい。かかる修飾又は不活性化は、当該技術分野で公知の方法に従い、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ生成突然変異誘発により、達成されてもよい。原則的に修飾は、インビボで、即ち直接的に修飾対象のポリヌクレオチドを発現する細胞上で実施されてもよいが、修飾が以下に例示のようにインビトロで実施されることが好ましい。

【0073】

標的化遺伝子を欠失させるか又は破壊するための方法は、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ（１９８５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１７１４－１７２１）；国際公開第９０／００１９２号パンフレット；Ｍａｙ，Ｇ．（１９９２．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ．Ｊ．Ｒ．Ｋｉｎｇｈｏｒｎ ａｎｄ Ｇ．Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，ｐｐ．１－２５）；及びＴｕｒｎｅｒ，Ｇ．（１９９４．Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｓ．Ｄ．Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｋｉｎｇｈｏｒｎ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐｐ．６４１－６６５）により記載されている。

【0074】

ポリヌクレオチドの発現を除去又は低減するための便宜的方法の例は、遺伝子置換、遺伝子欠失、遺伝子編集又は遺伝子破壊の技術に基づく。例えば、遺伝子破壊法において、内因性ポリヌクレオチドに対応する核酸配列は、欠損核酸配列を生成するため、インビトロで突然変異誘発され、次いで欠損遺伝子を生成するため、親細胞に形質転換される。相同組換えにより、欠損核酸配列は、内因性ポリヌクレオチドを置換する。欠損ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドが修飾又は破壊されている形質転換体の選択に使用されてもよいマーカーもコードすることが望ましいことがある。一態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のような選択可能マーカーで破壊される。

【0075】

本発明はまた、細胞内で活性を有するポリペプチドの発現を阻害する方法であって、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を細胞に投与するか又は細胞内で発現させることを含み、ここでｄｓＲＮＡが、ポリヌクレオチド又はその相同体の部分配列を含む、方法に関する。好ましい態様では、ｄｓＲＮＡは、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５又はそれ以上の二本鎖ヌクレオチド長である。

【0076】

ｄｓＲＮＡは、好ましくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。好ましい態様では、ｄｓＲＮＡは、転写を阻害するための低分子干渉ＲＮＡである。別の好ましい態様では、ｄｓＲＮＡは、翻訳を阻害するためのマイクロＲＮＡである。

【0077】

本発明はまた、細胞内でポリペプチドの発現を阻害するための、配列番号１及び／又は配列番号４及び／又は配列番号７及び／又は配列番号１０の成熟ポリペプチドコード配列の一部を含むような二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子に関する。本発明は任意の特定の作用機構によって制限されないが、ｄｓＲＮＡは、細胞に侵入し、類似又は同一配列の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、例えば内因性ｍＲＮＡの分解を引き起こし得る。細胞がｄｓＲＮＡに曝露されるとき、相同性遺伝子からのｍＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と称されるプロセスにより選択的に分解されるが；例えば米国特許第号５，１９０，９３１明細書を参照されたし。

【0078】

本発明のｄｓＲＮＡは、遺伝子サイレンシングにおいて使用され得る。一態様では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡｉを用いてＲＮＡを選択的に分解するための方法を提供する。本方法は、インビトロ、生体外又はインビボで実施されてもよい。一態様では、ｄｓＲＮＡ分子は、細胞、臓器又は動物において機能欠失突然変異を作製するため、使用され得る。ＲＮＡを選択的に分解するため、ｄｓＲＮＡ分子を作製し、使用するための方法は、当該技術分野で周知であり；例えば、米国特許第６，４８９，１２７号明細書；米国特許第６，５０６，５５９号明細書；米国特許第６，５１１，８２４号明細書及び米国特許第６，５１５，１０９号明細書を参照されたし。

【0079】

プロテアーゼ欠損突然変異細胞は、異種分泌ポリペプチドの発現用の宿主細胞として特に有用である。

【0080】

目的の生成物の培養及び精製のために使用される方法は、当該技術分野で公知の方法により実施されてもよい。

【0081】

産生方法
宿主細胞は、技術分野において既知である方法を用いてポリペプチドの生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中並びにポリペプチドの発現及び／又は単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、及び、実験用若しくは産業用発酵槽における小規模若しくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式又は固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素及び窒素源及び無機塩を含む好適な栄養培地において、技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、又は、公開された組成に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接回収可能である。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。

【0082】

ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法として、限定するものではないが、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、又は、酵素基質の消失などが挙げられる。例えば、酵素アッセイを用いてポリペプチドの活性を判定してもよい。

【0083】

ポリペプチドは技術分野において公知である方法を用いて回収され得る。例えば、ポリペプチドは、特にこれらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。一態様では、ポリペプチドを含む発酵ブロスを回収する。

【0084】

ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、又は、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ及びＲｙｄｅｎ編，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。

【0085】

代替的な態様においては、ポリペプチドは回収されず、ポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞がポリペプチドのソースとして用いられ得る。

【0086】

本発明の一態様は、目的の分泌ポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）いずれかの先行する請求項に記載の突然変異糸状菌宿主細胞を分泌ポリペプチドの産生に対して実用的な条件下で培養するステップと；任意選択的には、
ｂ）目的の分泌ポリペプチドを回収するステップと、
を含む方法に関する。

【0087】

好ましい実施形態では、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブジェルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエキロミケス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる群から選択される属に属し；さらにより好ましくは、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞；好ましくは、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アキュレティヌス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅｔｉｎｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ブラジリエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・フェティデュス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・リュウキュウエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスベルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である。

【0088】

好ましくは、目的の分泌ポリペプチドは、酵素であり；好ましくは、酵素は、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はトランスフェラーゼ、例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、又はβ－キシロシダーゼである。

【実施例】

【0089】

糸状菌株
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＢＴＲ２１３は、国際公開第２０１３／０８６６３３号パンフレットに記載されている。

【0090】

トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株ｆｒｔ４ｎｅｗ－１９４０－１９９６－２０１２－１２－１は、Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＢＴＲ２１３のｋｕ７０破壊及びパラセルシンシンテターゼ（ｐａｒＳ）欠失株である。セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）、セロビオヒドロラーゼＩＩ（ｃｂｈ２）、エンドグルカナーゼＩ（ｅｇ１）、及びキシラナーゼＩＩ（ｘｙｎ２）遺伝子は、この株において欠失させており、国際公開第２０１２／１６００９３号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１８／００３７８９７号明細書に記載の通り、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）フリッパーゼ（ＦＬＰ）及びフリッパーゼ認識配列ＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３を使用し、発現カセットの部位特異的な標的化組込みのため、これら４つの遺伝子座の各々に挿入されたＦＲＴ部位（ＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３）を有する。エンドグルカナーゼＩＩ遺伝子（ｅｇ２）及びエンドグルカナーゼＩＩＩ遺伝子（ｅｇ３）は、この株において同様に欠失させる。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）シトシンデアミナーゼ（ｆｃｙＡ）遺伝子を、４つの遺伝子座の各々にＦＲＴ－Ｆ部位とＦＲＴ－Ｆ３部位との間に挿入し、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）に対する対抗選択として使用する。

【0091】

培地及び溶液
ＣＯＶＥプレートは、３４２．３０ｇのスクロース、２５ｇのＤｉｆｃｏ（商標）ノーブル寒天、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍＭアセトアミド、１５ｍＭ塩化セシウム及び脱イオン水からなり、１リットルにした。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0092】

ＣＯＶＥ２プレートは、３０ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍｌの１Ｍアセトアミド、２５ｇのＤｉｆｃｏ（商標）ノーブル寒天、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0093】

５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含有するＣＯＶＥ２グルコースプレートは、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍｌの１Ｍアセトアミド、２５ｇのＤｉｆｃｏ（商標）ノーブル寒天、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。溶液をオートクレーブにより滅菌した。オートクレーブ後、４０ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）グルコース（滅菌）を添加した。溶液を５０℃に冷却し、５－ＦＣを添加し、最終濃度を７５μｇ／ｍｌにした。

【0094】

ＣＯＶＥ塩溶液は、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、７６ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0095】

ＣＯＶＥ微量金属溶液は、０．０４ｇのＮａ₂Ｂ₄Ｏ₇・１０Ｈ₂Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、０．８ｇのＮａ₂ＭｏＯ₂・２Ｈ₂Ｏ、１０ｇのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0096】

発酵バッチ培地は、２４ｇのデキストロース、４０ｇの脱脂大豆、８ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、３ｇのＫ₂ＨＰＯ₄、８ｇのＫ₂ＳＯ₄、３ｇのＣａＣＯ₃、８ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１ｇのクエン酸、８．８ｍｌの８５％リン酸、１ｍｌの消泡剤、１４．７ｍｌの微量金属溶液、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。

【0097】

ＰＤＡプレートは、３９ｇのＤｉｆｃｏ（商標）ポテトデキストロース寒天及び脱イオン水からなり、１リットルにした。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0098】

ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレートは、３９ｇのＤｉｆｃｏ（商標）ポテトデキストロース寒天、３４２．３０ｇのスクロース及び脱イオン水からなり、１リットルにした。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0099】

ＰＥＧ緩衝液は、脱イオン水中、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、及び１０ｍＭ ＣａＣｌ₂からなった。溶液をフィルター滅菌した。

【0100】

サンプル緩衝液（ｐＨ７．５）は、０．１Ｍトリス－ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％トリトンＸ１００からなった。溶液をフィルター滅菌した。振盪フラスコ培地は、２０ｇのグリセロール、１０ｇの脱脂大豆、１．５ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、０．２ｇのＣａＣｌ₂、０．４ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．２ｍｌの微量金属溶液、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。

【0101】

１．２Ｍソルビトールは、２１８．４ｇのソルビトール及び脱イオン水からなり、１リットルにした。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0102】

ＳＴＣは、脱イオン水中、１Ｍソルビトール、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、及び５０ｍＭ ＣａＣｌ₂からなった。溶液をフィルター滅菌した。

【0103】

ＴＢＥ緩衝液は、１０．８ｇのトリス塩基、５ｇのホウ酸、４ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。

【0104】

ＴＥ緩衝液は、１Ｍトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０からなる。

【0105】

微量金属溶液は、２６．１ｇのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、５．５ｇのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、６．６ｇのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、２．６ｇのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、２ｇのクエン酸、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0106】

１．５μＭの５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）を有するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）最少培地（ＴｒＭＭ）プレートは、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、０．６ｇのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、６ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２５ｇのＤｉｆｃｏ（商標）ノーブル寒天、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。溶液をオートクレーブにより滅菌した。オートクレーブ後、４０ｍｌの滅菌５０％（ｗ／ｖ）グルコースを添加した。培地を５０℃に冷却し、ＦｄＵ（滅菌）を添加し、最終濃度を１．５μＭにした。

【0107】

２ｘＹＴ＋Ａｍｐプレートは、１６ｇのＢａｃｔｏ（商標）トリプトン、１０ｇのＢａｃｔｏ（商標）酵母抽出物、５ｇのＮａＣｌ、１５ｇのＢａｃｔｏ（商標）寒天、１００ｍｇ／ｍｌでの１ｍｌのアンピシリン（フィルター滅菌し、オートクレーブ後、添加した）、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0108】

ＹＰ培地は、脱イオン水中、１％Ｂａｃｔｏ（商標）酵母抽出物及び２％Ｂａｃｔｏ（商標）ペプトンからなった。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0109】

ＹＰＤ培地は、１％Ｂａｃｔｏ（商標）酵母抽出物、２％Ｂａｃｔｏ（商標）ペプトン及び２％グルコースからなった。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0110】

発酵フィード培地は、１１９０ｇのグルコース、１４．２ｍｌの８５％Ｈ₃ＰＯ₄及び４８６ｇのＨ₂Ｏからなった。溶液をオートクレーブにより滅菌した。

【0111】

実施例１：トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）からのゲノムＤＮＡ抽出
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を、２５０ｍｌの整流振盪フラスコ内の５０ｍｌのＹＰＤ培地中で、２００ｒｐｍで撹拌しながら２８℃で２日間成長させた。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）系列の漏斗を使用し、培養由来の菌糸を収集し、圧搾乾燥し、次に予備冷却した乳鉢及び乳棒に移した。各菌糸調製物を微粉に粉砕し、液体窒素で凍結維持した。全部で１～２ｇの粉末を５０ｍｌのチューブに移し、ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）を使用し、粉砕した菌糸体粉末からゲノムＤＮＡを抽出した。６５℃に予熱した５ｍｌの緩衝液ＡＰ１（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）、続いて１０μｌのリボヌクレアーゼＡの１００ｍｇ／ｍｌの保存液（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）を５０ｍｌのチューブに添加し、６５℃で２～３時間インキュベートした。全部で１．８ｍｌのＡＰ２緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）を添加し、３０００～５０００×ｇで５分間遠心分離した。５０ｍｌの収集管内に設けたＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ Ｍａｘｉスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）に上清をデカントし、スイングアウトローター内、室温（１５～２５℃）、３０００～５０００×ｇで５分間遠心分離した。収集管における通過画分を、ペレットを妨害することなく、新しい５０ｍｌのチューブに移した。体積が１．５ｍｌの緩衝液ＡＰ３／Ｅ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）を清澄化された可溶化液に添加し、ボルテックスにより直ぐに混合した。形成することがある任意の沈殿物を含むサンプル（最大１５ｍｌ）を、５０ｍｌの収集管内に設けたＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｍａｘｉスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）にピペッティングし、スイングアウトローター内、室温（１５～２５℃）、３０００～５０００×ｇで５分間遠心分離した。通過画分を廃棄した。１２ｍｌの緩衝液ＡＷ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）をＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｍａｘｉスピンカラムに添加し、３０００～５０００×ｇで１０分間遠心分離し、膜を乾燥させた。通過画分と収集管を廃棄した。ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｍａｘｉスピンカラムを新しい５０ｍｌのチューブに移した。６５℃に予熱した０．５ｍｌの緩衝液ＡＥ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）をＤＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｍａｘｉスピンカラム膜上に直接的にピペッティングし、室温（１５～２５℃）で５分間インキュベートし、次に３０００～５０００×ｇで５分間遠心分離し、ゲノムＤＮＡを溶出させた。ゲノムＤＮＡの濃度及び純度を、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより判定した。

【0112】

実施例２：トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のプロトプラストの作製及び形質転換
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のプロトプラストの調製及び形質転換を、Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ ６１：１５５－１６４に類似するプロトコルを用いて実施した。つまり、Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）を、２つの振盪フラスコ（各々は２５ｍｌのＹＰＤ培地を含有する）内で、９０ｒｐｍで穏やかに撹拌しながら２７℃で１７時間培養した。菌糸を、真空駆動ディスポーザブル濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する濾過により収集し、脱イオン水で２回、そして１．２Ｍソルビトールで２回洗浄した。洗浄された菌糸を、５ｍｇ／ｍｌのＹａｔａｌａｓｅ（商標）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）及び０．５ｍｇ／ｍｌのＣｈｉｔｉｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含有する３０ｍｌの１．２Ｍソルビトールに、７５～９０ｒｐｍでゆっくりと振とうさせながら３４℃で６０～７５分間懸濁することにより、プロトプラストを作製した。プロトプラストを８３４×ｇで６分間の遠心分離により収集し、冷却１．２Ｍソルビトールで２回洗浄した。血球計数器を使用し、プロトプラストを計数し、最終濃度が１×１０⁸個のプロトプラスト／ｍｌのＳＴＣに再懸濁した。

【0113】

約１～１０μｇのＤＮＡを１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、ａｍｄＳの選択のため、内容物をＣＯＶＥプレート上に拡散させた。プレートを３０℃で７～９日間インキュベートした。ハイグロマイシンＢ耐性マーカー（ｈｐｈ）を含有するＤＮＡの場合、内容物をＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上に拡散させ、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、ＰＤＡ＋ハイグロマイシンＢからなるオーバーレイを最終濃度が１０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢに添加し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。

【0114】

実施例３：推定上のステロイドデヒドロゲナーゼをコードするＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子（配列番号１）の修飾に対するプラスミド（ｐＮＪＯＣ５７７；配列番号１３）の構築
推定上のステロイドデヒドロゲナーゼドメインをコードする領域内のいくつかの連続アミノ酸の切断又は内部欠失のいずれかをもたらす突然変異の導入による、ＴｒＡ１３３１Ｗ（配列番号１）によってコードされるタンパク質の修飾を意図したプラスミドを、５’標的化領域、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）及びｔｋ（ＨＳＶ－１チミジンキナーゼ）カセット、ｈｐｈ及びｔｋカセットの切除のために使用されるべきリピート、並びに３’標的化領域を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリクローニングキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃ．）を用いて（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩで直線化された）ｐＵＣ１９にクローニングすることにより構築した。５’標的化領域、ｈｐｈ及びｔｋカセット、ｈｐｈ及びｔｋカセットの切除用のリピート及び３’標的化領域を、プライマーセット：
ｏＮＪ５８７（配列番号１９）＋ｏＮＪ６０５（配列番号２０）、
ｏＮＪ６１０（配列番号２５）＋ｏＮＪ６１１（配列番号２６）、
ｏＮＪ６０６（配列番号２１）＋ｏＮＪ６０７（配列番号２２）、及び
ｏＮＪ６０８（配列番号２３）＋ｏＮＪ６０９（配列番号２４）
を使用してＰＣＲ増幅した。

【0115】

Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、製造業者の使用説明書に従い、増幅反応を実施した。ＰＣＲは、鋳型として、５ｎｇのｐＪｆｙＳ１５７９－４１－１１（国際公開第２０１０／０３９８４０号パンフレット）（ｈｐｈ／ｔｋカセットに対する鋳型）又は５０ｎｇのＢＴＲ２１３ゲノムＤＮＡ（国際公開第２０１３／０８６６３３号パンフレット）からなり、１×ＨＦ緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５００ｎＭのフォワードプライマー、５００ｎＭのリバースプライマー、１単位のＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ及び滅菌ミリ－Ｑ（登録商標）Ｈ₂Ｏを添加し、最終体積を５０μｌにした。９８℃で３分間の１サイクル；９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間（リピート断片）又は２．５分間での各々の３５サイクル；及び７２℃で５分間の１サイクルとしてプログラムされたＢｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内で、反応物をインキュベートした。サーモサイクリング後、ＰＣＲ産物をＴＢＥ緩衝液中で１％アガロースゲル電気泳動により分離し、異なるＰＣＲ産物に対応するバンド（２３５４ｂｐ、４３９５ｂｐ、３２２ｂｐ及び１９８６ｂｐ）をゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ及びＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用し、製造業者の使用説明書に従い、精製した。ｐＵＣ１９を、５μｇのｐＵＣ１９、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃ．）及びＳａｃＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃ．）の各々２０単位、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃ．）及び滅菌ミリ－Ｑ（登録商標）Ｈ₂Ｏからなる５０μｌの反応物中、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩで消化し、最終体積を５０μｌにした。反応物を３７℃でインキュベートし、次にＴＢＥ緩衝液中で１％アガロースゲル電気泳動を施した。２６４５ｂｐのｐＵＣ１９ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩ断片をゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ及びＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用し、製造業者の使用説明書に従い、精製した。１×ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及び各々が０．０４ピコモルのＰＣＲ産物からなる総体積３０μＬのＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し、ＰＣＲ産物とｐＵＣ１９ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩ断片とを一緒に融合した。反応物を５０℃で４５分間インキュベートし、次に氷上に置いた。１μＬの反応物を使用し、６０μＬのＳｔｅｌｌａｒ（商標）コンピテント細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造業者の使用説明書に従って形質転換した。形質転換反応物を２つの２ｘＹＴ＋Ａｍｐプレート上に拡散させ、３７℃で一晩インキュベートした。推定上の形質転換体コロニーを選択プレートから単離し、プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、各々から調製し、ＰｖｕＩＩでの消化により断片の適切な挿入についてスクリーニングした。制限酵素消化時に予想されたバンドパターン（４９９１ｂｐ、３３６２ｂｐ、２３６４ｂｐ、４３９ｂｐ及び３７０ｂｐ）を生じるプラスミドＤＮＡを使用し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をｐＮＪＯＣ５７７プラスミド（配列番号１３）のモデルにマッピングした。Ｂａｓｉｃ Ｖａｒｉａｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎモジュールを使用し、任意の一塩基多型の存在を検出した。予想されたヌクレオチド配列を有するプラスミドをｐＮＪＯＣ５７７と名付けた（図１）。

【0116】

実施例４：ＴｒＡ１３３１Ｗによってコードされるタンパク質の修飾を伴うトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株の構築（ＮＪＯＣ５８６）
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｆｒｔ４ｎｅｗ－１９４０－１９９６－２０１２－１２－１プロトプラストを実施例２に記載のように作製した。ｐＮＪＯＣ５７７（８８７１ｂｐのＰｍｅＩ断片）からの約２～４μｇの直線化ＴｒＡ１３３１Ｗ修飾カセットを１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、内容物をＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上に拡散させ、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、ＰＤＡ＋ハイグロマイシンＢからなるオーバーレイを最終濃度１０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢに添加し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。次いで、ハイグロマイシン耐性形質転換体をＰＤＡプレートに移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。形質転換体を、胞子ＰＣＲにより、ＴｒＡ１３３１修飾カセットの正確な組込みについてスクリーニングした。各形質転換体においては、滅菌した１μｌの接種ループを用いて胞子を収集し、薄壁ＰＣＲチューブ内の２０μｌの希釈緩衝液（ＰＨＩＲＥ（商標）Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に懸濁した。各胞子懸濁液をＰＣＲ反応における鋳型として使用し、ＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子座でのＴｒＡ１３３１Ｗ修飾カセットの組込みについてスクリーニングした。各形質転換体に対して２通りのＰＣＲを実施し；１つが組込みの５’部位に対して、１つが組込みの３’部位に対してであった。５’組込みのスクリーニングは、組込み部位の上流領域にアニーリングするプライマー、並びにｈｐｈ及びｔｋカセット内部の領域にアニーリングするプライマーを用いて実施した。３’組込みのスクリーニングは、組込み部位の下流領域にアニーリングするプライマー、並びにｈｐｈ及びｔｋカセット内部の領域にアニーリングするプライマーを用いて実施した。各ＰＣＲ反応は、１μｌの胞子懸濁液、１０ピコモルの各プライマー、１０μｌの２ｘＰＨＩＲＥ（商標）Ｐｌａｎｔ ＰＣＲ緩衝液（ＰＨＩＲＥ（商標）Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．４μｌのＰＨＩＲＥ（商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＨＩＲＥ（商標）Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＨ₂Ｏからなり、最終体積を２０μｌにした。サーモサイクリングを製造業者の使用説明書に従って実施した。ＴＢＥ緩衝液を使用し、１％アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を分析した。次に、所望されるＰＣＲ産物をもたらす形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を実施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子を新しいＰＤＡプレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。上記の５’及び３’組込み検証用ＰＣＲを反復し、ＴＢＥ緩衝液を使用し、１％アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を分析した。ＴｒＡ１３３１Ｗ修飾構築物ｐＮＪＯＣ５７７は、直接リピートによって隣接されたｈｐｈ及びＨＳＶ－１ ｔｋカセットを有し、ｈｐｈ及びＨＳＶ－１ ｔｋカセットからの自発性ループ及びクリーンなＴｒＡ１３３１Ｗ修飾の生成を２つのリピート間の相同組換えを介して促進する。ＴｒＡ１３３１Ｗ修飾カセットの正確な組込みによる形質転換体からの胞子をＨ₂Ｏ中で収集し、希釈物を、１．５μＭの５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）を含有するＴｒＭＭプレート上に拡散させ、３０℃で５日間インキュベートし、ｈｐｈ及びＨＳＶ－１ ｔｋカセットを失っている単離物の同定を容易にした。次に、ＦｄＵ耐性単離物をＰＤＡプレートに移し、ｈｐｈ及びＨＳＶ－１ ｔｋカセットの欠如を胞子ＰＣＲにより検証した。この胞子ＰＣＲでは、３つのプライマー、即ち、ｈｐｈ及びｔｋカセットの上流領域にアニーリングする１つのプライマー、３’組込み部位の外部領域にアニーリングする１つのプライマー、並びにｈｐｈ及びｔｋカセットの内部領域にアニーリングする１つのプライマーを添加した。プライマーは、ｈｐｈ及びｔｋカセットが依然として存在するか否かに応じて、短いＰＣＲ産物又は長いＰＣＲ産物を生成するように設計した。次に、ｈｐｈ及びｔｋカセットを失っている形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を実施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子を新しいＰＤＡプレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。ＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子における所望される突然変異の存在を確認するため、実施例２に記載の通り、いくつかの単離物に対し、ゲノムＤＮＡを調製し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成するために使用し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子（配列番号１）のモデルにマッピングした。Ｂａｓｉｃ Ｖａｒｉａｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎモジュールを使用し、所望される突然変異の存在を検証した。所望される突然変異を有する単離物の１つをＮＪＯＣ５８６と名付け、さらなる試験用に保存した。

【0117】

実施例５：ｐＮＪＯＣ３８３によるトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株ｆｒｔ４ｎｅｗ－１９４０－１９９６－２０１２－１２－１の形質転換
実施例２に記載の通り、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｆｒｔ４ｎｅｗ－１９４０－１９９６－２０１２－１２－１プロトプラストを作製した。約１～１０μｇのｐＮＪＯＣ３８３（宿主株中にＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位を有する４つの遺伝子座でのＦＬＰ媒介性組込みのため、ＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位によって隣接されたアクレモニウム・アルカロフィラム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｍ）ＣＢＳ１１４．９２リゾチーム発現カセットを有するプラスミド；配列番号１４及び図２）を、１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、ａｍｄＳの選択のため、内容物をＣＯＶＥプレート上に拡散させた。プレートを３０℃で７～９日間インキュベートした。各ＣＯＶＥプレートからの形質転換体からの胞子を、７５μｇ／ｍｌの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上に移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。５－ＦＣを含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上の形質転換体からの胞子を、５－ＦＣを含有する新しいＣＯＶＥ２グルコースプレートに移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。次に、いくつかの形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子をＣＯＶＥ２プレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座でのｐＮＪＯＣ３８３からのリゾチーム発現カセットの組込みを確認するため、実施例２に記載の通り、いくつかの単一胞子単離物においてゲノムＤＮＡを調製し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成するために使用し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座（配列番号１５～１８）のモデルにマッピングした。４つすべての部位で正確な組込みを有する単離物の１つをＮＪＯＣ５８７と名付け、さらなる試験用に保存した。

【0118】

実施例６：ｐＮＪＯＣ３８３によるトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＴｒＡ１３３１Ｗ修飾株（ＮＪＯＣ５８６）の形質転換
実施例２に記載の通り、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＮＪＯＣ５８６プロトプラストを作製した。約１～１０μｇのｐＮＪＯＣ３８３（配列番号１４；図２）を、１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、ａｍｄＳの選択のため、内容物をＣＯＶＥプレート上に拡散させた。プレートを３０℃で７～９日間インキュベートした。各ＣＯＶＥプレートからの形質転換体からの胞子を、７５μｇ／ｍｌの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上に移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。５－ＦＣを含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上の形質転換体からの胞子を、５－ＦＣを含有する新しいＣＯＶＥ２グルコースプレートに移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。次に、いくつかの形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子をＣＯＶＥ２に移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座でのｐＮＪＯＣ３８３からのリゾチーム発現カセットの組込みを確認するため、実施例２に記載の通り、いくつかの単一胞子単離物においてゲノムＤＮＡを調製し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成するために使用し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座（配列番号１５～１８）のモデルにマッピングした。４つすべての部位で正確な組込みを有する単離物の１つをＮＪＯＣ５８８と名付け、さらなる試験用に保存した。

【0119】

実施例７：リゾチーム活性アッセイ（ＬＳＵ（Ｆ）／ｍｌ）
発酵からの全培養液を、３０℃でのロティサリーミキサー内で約２時間混合した。全培養液の混合後、すべてのサンプルを前希釈用緩衝液（ｐｒｅ－ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）で１００倍に希釈し、次にロティサリーミキサーを再び使用して約２時間混合した。次いで、１００倍の前希釈サンプルを、１０倍段階希釈により、０．１Ｍトリス－ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％トリトンＸ１００緩衝液、ｐＨ７．５（サンプル緩衝液）で１００００倍に希釈し、続いて希釈サンプルの１／９に至る３倍段階希釈を行った。この方法を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ及びＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）と併用した。リゾチーム標準を、サンプル緩衝液で、０．０５ＬＳＵ（Ｆ）／ｍｌの濃度から０．００２ＬＳＵ（Ｆ）／ｍｌの濃度にかけて希釈した。全部で５０μｌの標準を含む各希釈物を９６ウェル平底プレートに移した。２５ｕｇ／ｍｌのフルオレセインコンジュゲート細胞壁基質溶液５０μＬを各ウェルに添加し、次に周囲温度で４５分間インキュベートした。インキュベーション中、反応速度を、１５分間隔で９６ウェルプレートにおいて４８５ｎｍ（励起）／５２８ｎｍ（放射）で監視した。サンプル濃度を、作成した検量線からの外挿により判定した。

【0120】

実施例８：実験室規模発酵は、ＴｒＡ１３３１Ｗによってコードされるタンパク質の修飾により、リゾチームの生産性／収率の増加がもたらされることを示した
４コピーのリゾチームを発現するＮＪＯＣ５８７株及びＮＪＯＣ５８８株を、２リットル発酵において評価した。各株を、２つのＰＤＡプレート上、３０℃で５～７日間成長させた。３つの５００ｍｌ振盪フラスコであって、各々が１００ｍｌの振盪フラスコ培地を含有するものに、ＰＤＡプレートから１つの振盪フラスコあたり２つのプラグを接種した。振盪フラスコを、２００ｒｐｍでのオービタルシェーカー上、２８℃で４８時間インキュベートした。培養物を発酵用の種として使用した。

【0121】

全部で１５０ｍｌの各々の種培養物を使用し、１．５リットルの発酵バッチ培地を含有する３リットルのガラス被覆発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に接種した。発酵槽を２８℃の温度で維持し、Ａｐｐｌｉｋｏｎ １０３０制御システムを使用し、ｐＨを３．５＋／－０．１のセットポイントに制御した。空気を２．５Ｌ／分の速度で容器に加え、３００～１１００ｒｐｍで回転するＲｕｓｈｔｏｎ羽根車により、培養液を撹拌した。オートクレーブしたグルコース及びリン酸からなる発酵フィード培地を、０～１４ｇ／Ｌ／時間の速度で約７日の期間かけて投与した。全培養液の一定分量を５日目、６日目及び７日目に採取し、５～１０℃で貯蔵してから、リゾチーム活性アッセイにおける処理にかけた。

【0122】

リゾチーム発現レベルを、実施例７に記載のように測定した。ＮＪＯＣ５８８株において、ＮＪＯＣ５８７と比べて増加したリゾチーム発現が認められ、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼをコードするＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子の前記修飾がリゾチーム発現にとって有利であることが示された。

【0123】

実施例９：ＴｒＡ１３３１Ｗコード化タンパク質（配列番号３）の相同体の同定
ＴｒＡ１３３１Ｗによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）を使用し、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及びフザリウム・べネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）のゲノム内の遺伝子によってコードされるタンパク質の相同体についてのＢＬＡＳＴ検索（Ｅ値：１．００ｅ－５及び語長：５）を実施した。各生物に対して得た単一のＢＬＡＳＴヒットを表１に提示する：

【0124】

【表1】

【0125】

異なるタンパク質間のパーセント同一性を、上記のようにＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて算出した。タンパク質間の同一性を表２にまとめる。

【0126】

【表2】

【0127】

表２によると、タンパク質は、約３９％～約７０％の同一性を範囲とする有意な配列同一性を共有する（最高のパーセント同一性が、より密接に関連したＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）タンパク質とコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タンパク質との間で認められるのは想定通りであった）。

【0128】

タンパク質間の関連性をさらに検討するため、デフォルトパラメータを有するＭＵＳＣＬＥアルゴリズムバージョン３．８．３１を用いて、タンパク質を整列した（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．（２００４）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２（５），１７９２－１７９７）。この複数の配列アラインメントからの結果を図３に示す。タンパク質は、高度に保存されたアミノ酸モチーフ、例えば、ＹＧＡＲ及び／又はＶＰＨＳ［Ｗ／Ｙ］Ｆ及び／又はＱＣ［Ａ／Ｖ／Ｓ］ＲＲＬ及び／又はＬＫＫＹＴＬＰ及び／又はＣＰＨＹＴモチーフのいくつかのストレッチ／ブロックが示される図３に示すように、有意なアミノ酸配列同一性を共有した。まとめると、結果は、推定上の酵素が異なる真菌宿主において類似機能を果たす可能性が高いことを示す。

【0129】

実施例１０：推定上のステロイドデヒドロゲナーゼをコードするＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子（配列番号１）の欠失に対するプラスミド（ｐＮＪＯＣ５６９；配列番号２７）の構築
ＴｒＡ１３３１Ｗ（配列番号１）によってコードされる全タンパク質の欠失に対するプラスミドを、５’標的化領域、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）及びｔｋ（ＨＳＶ－１チミジンキナーゼ）カセット、ｈｐｈ及びｔｋカセットの切除のために使用されるべきリピート、並びに３’標的化領域を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリクローニングキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃ．）を用いて（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩで直線化された）ｐＵＣ１９にクローニングすることにより構築した。５’標的化領域、ｈｐｈ及びｔｋカセット、ｈｐｈ及びｔｋカセットの切除のためのリピート、並びに３’標的化領域を、プライマーセット：
ｏＮＪ５８７（配列番号１９）＋ｏＮＪ５８８（配列番号２８）、
ｏＮＪ５９５（配列番号２９）＋ｏＮＪ５９６（配列番号３０）、
ｏＮＪ５９２（配列番号３１）＋ｏＮＪ５９３（配列番号３２）、及び
ｏＮＪ５８９（配列番号３３）＋ｏＮＪ５９０（配列番号３４）
を使用してＰＣＲ増幅した。

【0130】

Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、製造業者の使用説明書に従い、増幅反応を実施した。ＰＣＲは、鋳型として、５ｎｇのｐＪｆｙＳ１５７９－４１－１１（国際公開第２０１０／０３９８４０号パンフレット）（ｈｐｈ／ｔｋカセットに対する鋳型）又は５０ｎｇのＢＴＲ２１３ゲノムＤＮＡ（国際公開第２０１３／０８６６３３号パンフレット）からなり、１×ＨＦ緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５００ｎＭのフォワードプライマー、５００ｎＭのリバースプライマー、１単位のＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ及び滅菌ミリ－Ｑ（登録商標）Ｈ₂Ｏを添加し、最終体積を５０μｌにした。９８℃で３分間の１サイクル；９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間（リピート断片）又は２．５分間での各々の３５サイクル；及び７２℃で５分間の１サイクルとしてプログラムされたＢｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内で、反応物をインキュベートした。サーモサイクリング後、ＰＣＲ産物をＴＢＥ緩衝液中で１％アガロースゲル電気泳動により分離し、異なるＰＣＲ産物に対応するバンド（１５８７ｂｐ、４４０５ｂｐ、３５４ｂｐ及び１５７１ｂｐ）をゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ及びＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用し、製造業者の使用説明書に従い、精製した。ｐＵＣ１９を、５μｇのｐＵＣ１９、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃ．）及びＳａｃＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃ．）の各々２０単位、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃ．）及び滅菌ミリ－Ｑ（登録商標）Ｈ₂Ｏからなる５０μｌの反応物中、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩで消化し、最終体積を５０μｌにした。反応物を３７℃でインキュベートし、次にＴＢＥ緩衝液中で１％アガロースゲル電気泳動を施した。２６４５ｂｐのｐＵＣ１９ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩ断片をゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ及びＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用し、製造業者の使用説明書に従い、精製した。１×ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及び各々が０．０４ピコモルのＰＣＲ産物からなる総体積３０μＬのＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し、ＰＣＲ産物とｐＵＣ１９ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩ断片とを一緒に融合した。反応物を５０℃で４５分間インキュベートし、次に氷上に置いた。１μＬの反応物を使用し、６０μＬのＳｔｅｌｌａｒ（商標）コンピテント細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造業者の使用説明書に従って形質転換した。形質転換反応物を２つの２ｘＹＴ＋Ａｍｐプレート上に拡散させ、３７℃で一晩インキュベートした。推定上の形質転換体コロニーを選択プレートから単離し、プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、各々から調製し、ＰｖｕＩＩでの消化により断片の適切な挿入についてスクリーニングした。制限酵素消化時に予想されたバンドパターン（４２２４ｂｐ、３１１７ｂｐ、２３６４ｂｐ、３７０ｂｐ、２９６ｂｐ）を生じるプラスミドＤＮＡを使用し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をｐＮＪＯＣ５６９プラスミド（配列番号２７）のモデルにマッピングした。Ｂａｓｉｃ Ｖａｒｉａｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎモジュールを使用し、任意の一塩基多型の存在を検出した。予想されたヌクレオチド配列を有するプラスミドをｐＮＪＯＣ５６９と名付けた（図４）。

【0131】

実施例１１：推定上のステロイドデヒドロゲナーゼをコードするＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子の欠失を伴うトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株の構築（ＮＪＯＣ５８４－５Ｄ８Ａ）
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｆｒｔ４ｎｅｗ－１９４０－１９９６－２０１２－１２－１プロトプラストを実施例２に記載のように作製した。ｐＮＪＯＣ５６９（７７１６ｂｐＰｍｅＩ断片）からの約２～４μｇの直線化ＴｒＡ１３３１Ｗ欠失カセットを１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、内容物をＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上に拡散させ、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、ＰＤＡ＋ハイグロマイシンＢからなるオーバーレイを最終濃度１０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢに添加し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。次いで、ハイグロマイシン耐性形質転換体をＰＤＡプレートに移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。形質転換体を、胞子ＰＣＲにより、ＴｒＡ１３３１欠失カセットの正確な組込みについてスクリーニングした。各形質転換体においては、滅菌した１μｌの接種ループを用いて胞子を収集し、薄壁ＰＣＲチューブ内の２０μｌの希釈緩衝液（ＰＨＩＲＥ（商標）Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に懸濁した。各胞子懸濁液をＰＣＲ反応における鋳型として使用し、ＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子座でのＴｒＡ１３３１Ｗ欠失カセットの組込みについてスクリーニングした。各形質転換体に対して２通りのＰＣＲを実施し；１つが組込みの５’部位に対して、１つが組込みの３’部位に対してであった。５’組込みのスクリーニングは、組込み部位の上流領域にアニーリングするプライマー（ｏＮＪ６３２、配列番号３５）、並びにｈｐｈ及びｔｋカセット内部の領域にアニーリングするプライマー（ＡｇＪｇ６８５、配列番号３６）を用いて実施した。３’組込みのスクリーニングは、組込み部位の下流領域にアニーリングするプライマー（ｏＮＪ６３３、配列番号３７）、並びにｈｐｈ及びｔｋカセット内部の領域にアニーリングするプライマー（ＡｇＪｇ６０４、配列番号３８）を用いて実施した。各ＰＣＲ反応は、１μｌの胞子懸濁液、１０ピコモルの各プライマー、１０μｌの２ｘＰＨＩＲＥ（商標）Ｐｌａｎｔ ＰＣＲ緩衝液（ＰＨＩＲＥ（商標）Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．４μｌのＰＨＩＲＥ（商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＨＩＲＥ（商標）Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＨ₂Ｏからなり、最終体積を２０μｌにした。サーモサイクリングを製造業者の使用説明書に従って実施した。ＴＢＥ緩衝液を使用し、１％アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を分析した。次に、所望されるＰＣＲ産物をもたらす形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を実施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子を新しいＰＤＡプレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。上記の５’及び３’組込み検証用ＰＣＲを反復し、ＴＢＥ緩衝液を使用し、１％アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を分析した。ｐＮＪＯＣ５６９からのＴｒＡ１３３１Ｗ欠失構築物は、直接リピートによって隣接されたｈｐｈ及びＨＳＶ－１ ｔｋカセットを有し、ｈｐｈ及びＨＳＶ－１ ｔｋカセットからの自発性ループ及びクリ－ンなＴｒＡ１３３１Ｗ欠失の生成を２つのリピート間の相同組換えを介して促進する。ＴｒＡ１３３１Ｗ修飾カセットの正確な組込みによる形質転換体からの胞子をＨ₂Ｏ中で収集し、希釈物を、１．５μＭの５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（ＦｄＵ）を含有するＴｒＭＭプレート上に拡散させ、３０℃で５日間インキュベートし、ｈｐｈ及びＨＳＶ－１ ｔｋカセットを失っている単離物の同定を容易にした。次に、ＦｄＵ耐性単離物をＰＤＡプレートに移し、ｈｐｈ及びＨＳＶ－１ ｔｋカセットの欠如を胞子ＰＣＲにより検証した。この胞子ＰＣＲでは、３つのプライマー、即ち、ｈｐｈ及びｔｋカセットの上流領域にアニーリングする１つのプライマー、３’組込み部位の外部領域にアニーリングする１つのプライマー、並びにｈｐｈ及びｔｋカセットの内部領域にアニーリングする１つのプライマーを添加した。プライマーは、ｈｐｈ及びｔｋカセットが依然として存在するか否かに応じて、短いＰＣＲ産物又は長いＰＣＲ産物を生成するように設計した。次に、ｈｐｈ及びｔｋカセットを失っている形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を実施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子を新しいＰＤＡプレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。ＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子における所望される欠失の存在を確認するため、実施例２に記載の通り、いくつかの単離物に対し、ゲノムＤＮＡを調製し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成するために使用し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子（配列番号１）のモデルにマッピングした。ＩｎＤｅｌ及びＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｖａｒｉａｎｔモジュールにより、所望される欠失の存在を検証した。所望される欠失を有する単離物の１つをＮＪＯＣ５８４－５Ｄ８Ａと名付け、さらなる試験用に保存した。

【0132】

実施例１２：ｐＮＪＯＣ３８３によるトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株ＮＪＯＣ５８４－５Ｄ８Ａの形質転換
実施例２に記載の通り、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＮＪＯＣ５８４－５Ｄ８Ａプロトプラストを作製した。約１～１０μｇのｐＮＪＯＣ３８３（配列番号１４及び図２）を、１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、ａｍｄＳの選択のため、内容物をＣＯＶＥプレート上に拡散させた。プレートを３０℃で７～９日間インキュベートした。各ＣＯＶＥプレートからの形質転換体からの胞子を、７５μｇ／ｍｌの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上に移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。５－ＦＣを含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上の形質転換体からの胞子を、５－ＦＣを含有する新しいＣＯＶＥ２グルコースプレートに移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。次に、いくつかの形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子をＣＯＶＥ２プレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座でのｐＮＪＯＣ３８３からのリゾチーム発現カセットの組込みを確認するため、実施例２に記載の通り、いくつかの単一胞子単離物においてゲノムＤＮＡを調製し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成するために使用し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座（配列番号１５～１８）のモデルにマッピングした。４つすべての部位で正確な組込みを有する単離物の１つをＮＪＯＣ６１８－８１Ｄと名付け、さらなる試験用に保存した。

【0133】

実施例１３：実験室規模発酵は、ＴｒＡ１３３１Ｗによってコードされるタンパク質の欠失により、リゾチームの生産性／収率の増加ももたらされることを示した
４コピーのリゾチームを発現するＮＪＯＣ５８７株（対照）及びＮＪＯＣ６１８－８１Ｄ株を、２リットル発酵において評価した。各株を、２つのＰＤＡプレート上、３０℃で５～７日間成長させた。３つの５００ｍｌ振盪フラスコであって、各々が１００ｍｌの振盪フラスコ培地を含有するものに、ＰＤＡプレートから１つの振盪フラスコあたり２つのプラグを接種した。振盪フラスコを、２００ｒｐｍでのオービタルシェーカー上、２８℃で４８時間インキュベートした。培養物を発酵用の種として使用した。

【0134】

全部で１５０ｍｌの各々の種培養物を使用し、１．５リットルの発酵バッチ培地を含有する３リットルのガラス被覆発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に接種した。発酵槽を２８℃の温度で維持し、Ａｐｐｌｉｋｏｎ １０３０制御システムを使用し、ｐＨを３．５＋／－０．１のセットポイントに制御した。空気を２．５Ｌ／分の速度で容器に加え、３００～１１００ｒｐｍで回転するＲｕｓｈｔｏｎ羽根車により、培養液を撹拌した。オートクレーブしたグルコース及びリン酸からなる発酵フィード培地を、０～１４ｇ／Ｌ／時間の速度で約７日の期間かけて投与した。全培養液の一定分量を５日目、６日目及び７日目に採取し、５～１０℃で貯蔵してから、リゾチーム活性アッセイにおける処理にかけた。

【0135】

リゾチーム発現レベルを、実施例７に記載のように測定した。アッセイしたすべての時点で、ステロイドデヒドロゲナーゼ欠失株ＮＪＯＣ６１８－８１Ｄにおいて、ＮＪＯＣ５８７と比べて増加したリゾチーム発現が認められた（図５）。結果によると、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼをコードするＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子の不活性化がリゾチーム発現にとって有利であることが示された。

【0136】

実施例１４：ｐＴｍｍＤ－Ｔｌ＿リパーゼによるトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株ｆｒｔ４ｎｅｗ－１９４０－１９９６－２０１２－１２－１の形質転換
実施例２に記載の通り、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｆｒｔ４ｎｅｗ－１９４０－１９９６－２０１２－１２－１プロトプラストを作製した。約１～１０μｇのｐＴｍｍＤ－Ｔｌ＿リパーゼ（宿主株中にＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位を有する４つの遺伝子座でのＦＬＰ媒介性組込みのため、ＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位によって隣接されたサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）ＨＬ７０３リパーゼ変異体発現カセット；配列番号３９及び図６）を、１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、ａｍｄＳの選択のため、内容物をＣＯＶＥプレート上に拡散させた。プレートを３０℃で７～９日間インキュベートした。各ＣＯＶＥプレートからの形質転換体からの胞子を、７５μｇ／ｍｌの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上に移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。５－ＦＣを含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上の形質転換体からの胞子を、５－ＦＣを含有する新しいＣＯＶＥ２グルコースプレートに移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。次に、いくつかの形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子をＣＯＶＥ２プレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座でのｐＮＪＯＣ３８３からのリゾチーム発現カセットの組込みを確認するため、実施例２に記載の通り、いくつかの単一胞子単離物においてゲノムＤＮＡを調製し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成するために使用し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座（配列番号１５～１８）のモデルにマッピングした。４つすべての部位で正確な組込みを有する単離物の１つをＮＪＯＣ６００－２Ａと名付け、さらなる試験用に保存した。

【0137】

実施例１５：ｐＴｍｍＤ－Ｔｌ＿リパーゼによるトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株ＮＪＯＣ５８６の形質転換
実施例２に記載の通り、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＮＪＯＣ５８６プロトプラストを作製した。約１～１０μｇのｐＴｍｍＤ－Ｔｌ＿リパーゼ（宿主株中にＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位を有する４つの遺伝子座でのＦＬＰ媒介性組込みのため、ＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位によって隣接されたサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）ＨＬ７０３リパーゼ変異体発現カセット；配列番号３９及び図６）を、１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、ａｍｄＳの選択のため、内容物をＣＯＶＥプレート上に拡散させた。プレートを３０℃で７～９日間インキュベートした。各ＣＯＶＥプレートからの形質転換体からの胞子を、７５μｇ／ｍｌの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上に移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。５－ＦＣを含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上の形質転換体からの胞子を、５－ＦＣを含有する新しいＣＯＶＥ２グルコースプレートに移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。次に、いくつかの形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子をＣＯＶＥ２プレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座でのｐＮＪＯＣ３８３からのリゾチーム発現カセットの組込みを確認するため、実施例２に記載の通り、いくつかの単一胞子単離物においてゲノムＤＮＡを調製し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成するために使用し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座（配列番号１５～１８）のモデルにマッピングした。４つすべての部位で正確な組込みを有する単離物の１つをＮＪＯＣ６０９－１Ａと名付け、さらなる試験用に保存した。

【0138】

実施例１６：リパーゼＬＵ（ＬＸＰ）／ｍｌの活性アッセイ
この方法を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ及びＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）と併用した。

【0139】

培養上清を、０．０５Ｍ ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸））、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．０１％トリトンＸ１００緩衝液、ｐＨ７．５（サンプル緩衝液）で適切に希釈し、続いて希釈サンプルの０倍～１／３倍～１／９倍に至る段階希釈を行った。Ｌｉｐｅｘ標準を、サンプル緩衝液で、４．０ＬＵ（ＬＸＰ）／ｍｌの濃度から０．１９７ＬＵ（ＬＸＰ）／ｍｌの濃度にかけて希釈した。全部で２０μｌの標準を含む各希釈物を９６ウェル平底プレートに移した。ｐＮＰ－パルミチン酸基質溶液（ｐＮＰＰストックは、９．９９％ＥｔＯＨ中、７．８ｍＭのｐＮＰ－パルミチン酸塩であった－使用液は、１リットルあたり、５００ｍｌの０．１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍｌのｐＮＰＰストック、１００ｍｌの１０％トリトンＸ１００、１４．７ｍｌの６８０ｍＭ ＣａＣｌ₂であり、Ｈ₂Ｏにより最大体積にした）２００μＬを各ウェルに添加し、次に周囲温度で３０分間インキュベートした。インキュベーション中、反応速度を、２０分の期間にわたり、９６ウェルプレートにおいて、４０５ｎｍの光学密度で測定した。サンプル濃度を、作成した検量線からの外挿により判定した。

【0140】

実施例１７：実験室規模発酵は、ＴｒＡ１３３１Ｗによってコードされるタンパク質の欠失により、リパーゼの生産性／収率の増加ももたらされることを示した
４コピーのリゾチームを発現するＮＪＯＣ６００－２Ａ株（対照）及びＮＪＯＣ６０９－１Ａ株を、２リットル発酵において評価した。各株を、２つのＰＤＡプレート上、３０℃で５～７日間成長させた。３つの５００ｍｌ振盪フラスコであって、各々が１００ｍｌの振盪フラスコ培地を含有するものに、ＰＤＡプレートから１つの振盪フラスコあたり２つのプラグを接種した。振盪フラスコを、２００ｒｐｍでのオービタルシェーカー上、２８℃で４８時間インキュベートした。培養物を発酵用の種として使用した。

【0141】

全部で１５０ｍｌの各々の種培養物を使用し、１．５リットルの発酵バッチ培地を含有する３リットルのガラス被覆発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に接種した。発酵槽を２８℃の温度で維持し、Ａｐｐｌｉｋｏｎ １０３０制御システムを使用し、ｐＨを４．５＋／－０．１のセットポイントに制御した。空気を２．５Ｌ／分の速度で容器に加え、３００～１１００ｒｐｍで回転するＲｕｓｈｔｏｎ羽根車により、培養液を撹拌した。オートクレーブしたグルコース及びリン酸からなる発酵フィード培地を、０～１５ｇ／Ｌ／時間の速度で約５日の期間かけて投与した。サンプル（上清）を２日目、３日目、４日目及び５日目に収集し、５℃で貯蔵してから、リパーゼ活性アッセイにおける処理にかけた。

【0142】

リパーゼ発現レベルを実施例１６に記載のように測定した。アッセイしたすべての時点で、ステロイドデヒドロゲナーゼ欠失株ＮＪＯＣ６０９－１Ａにおいて、ＮＪＯＣ６００－２Ａ対照と比べて増加したリパーゼ発現が認められた（図７）（４５％～１３２％間の範囲の改善）。結果によると、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼをコードするＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子の不活性化がリパーゼ発現にとって有利であることが示された。

【0143】

実施例１８：ｐＳＭａｉ３２６によるトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株ｆｒｔ４ｎｅｗ－１９４０－１９９６－２０１２－１２－１の形質転換
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｆｒｔ４ｎｅｗ－１９４０－１９９６－２０１２－１２－１プロトプラストを実施例２に記載のように作製した。約１～１０μｇのｐＳＭａｉ３２６（宿主株中にＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位を有する４つの遺伝子座でのＦＬＰ媒介性組込みのため、ＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位によって隣接されたパエニバチルス種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）キサンタナーゼ変異体発現カセットを有するプラスミド；配列番号４０及び図８）を、１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、ａｍｄＳの選択のため、内容物をＣＯＶＥプレート上に拡散させた。プレートを３０℃で７～９日間インキュベートした。各ＣＯＶＥプレートからの形質転換体からの胞子を、７５μｇ／ｍｌの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上に移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。５－ＦＣを含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上の形質転換体からの胞子を、５－ＦＣを含有する新しいＣＯＶＥ２グルコースプレートに移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。次に、いくつかの形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子をＣＯＶＥ２プレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座でのｐＮＪＯＣ３８３からのリゾチーム発現カセットの組込みを確認するため、実施例２に記載の通り、いくつかの単一胞子単離物においてゲノムＤＮＡを調製し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成するために使用し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座（配列番号１５～１８）のモデルにマッピングした。４つすべての部位で正確な組込みを有する単離物の１つをＮＪＯＣ６０８－１Ｂと名付け、さらなる試験用に保存した。

【0144】

実施例１９：ｐＳＭａｉ３２６によるトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株ＮＪＯＣ５８６の形質転換
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＮＪＯＣ５８６プロトプラストを実施例２に記載のように作製した。約１～１０μｇのｐＳＭａｉ３２６（宿主株中にＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位を有する４つの遺伝子座でのＦＬＰ媒介性組込みのため、ＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位によって隣接されたパエニバチルス種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）キサンタナーゼ変異体発現カセットを有するプラスミド；配列番号４０及び図８）を、１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、ａｍｄＳの選択のため、内容物をＣＯＶＥプレート上に拡散させた。プレートを３０℃で７～９日間インキュベートした。各ＣＯＶＥプレートからの形質転換体からの胞子を、７５μｇ／ｍｌの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上に移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。５－ＦＣを含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上の形質転換体からの胞子を、５－ＦＣを含有する新しいＣＯＶＥ２グルコースプレートに移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。次に、いくつかの形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子をＣＯＶＥ２プレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座でのｐＮＪＯＣ３８３からのリゾチーム発現カセットの組込みを確認するため、実施例２に記載の通り、いくつかの単一胞子単離物においてゲノムＤＮＡを調製し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成するために使用し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座（配列番号１５～１８）のモデルにマッピングした。４つすべての部位で正確な組込みを有する単離物の１つをＮＪＯＣ６１７－７７Ｃと名付け、さらなる試験用に保存した。

【0145】

実施例２０：キサンタナーゼＸＧＵ（Ａ）活性アッセイ
この方法をＴｈｅｒｍｏ Ａｒｅｎａ ３０アナライザ上で実行した。サンプルを、０．１Ｍ ＡＣＥＳ（Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸）、０．０５６Ｍ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＣａＣｌ₂ ２Ｈ₂Ｏ、０．０２５％Ｂｒｉｊ（登録商標）Ｌ２３ ｐＨ７緩衝液（希釈緩衝液）で適切に希釈した。希釈物をキサンタナーゼ標準にし、希釈緩衝液を使用し、７ポイント曲線を作成した。２０μＬの各サンプル及び標準を、１２５μｌの０．１Ｍ ＡＣＥＳ、０．０５６Ｍ ＮａＯＨ（アッセイ緩衝液）及び５０μｌの基質（０．１％（ｗ／ｖ）の修飾キサンタンガム、０．４８％（ｖ／ｖ）のエタノール、０．１Ｍ ＡＣＥＳ、０．０６Ｍ ＮａＯＨ）に添加し、５０℃で１２００秒間インキュベートした。１００μＬの停止剤（５０ｇ／Ｌの酒石酸カリウムナトリウム、２０ｇ／ＬのＰＡＨＢＡＨ（４－ヒドロキシベンズヒドラジド）、５．５２ｇ／Ｌの酢酸ビスマス（ＩＩＩ）、０．５Ｍ ＮａＯＨ）を各反応物に添加し、５０℃で１２００秒間インキュベートした。４０５ｎｍでエンドポイント測定を行った。サンプル活性を、作成した検量線からの外挿により判定した。

【0146】

実施例２１：実験室規模発酵は、ＴｒＡ１３３１Ｗによってコードされるタンパク質の欠失により、キサンタナーゼの生産性／収率の増加ももたらされることを示した
４コピーのリゾチームを発現するＮＪＯＣ６０８－１Ｂ株（対照）及びＮＪＯＣ６１７－７７Ｃ株を、２リットル発酵において評価した。各株を、２つのＰＤＡプレート上、３０℃で５～７日間成長させた。３つの５００ｍｌ振盪フラスコであって、各々が１００ｍｌの振盪フラスコ培地を含有するものに、ＰＤＡプレートから１つの振盪フラスコあたり２つのプラグを接種した。振盪フラスコを、２００ｒｐｍでのオービタルシェーカー上、２８℃で４８時間インキュベートした。培養物を発酵用の種として使用した。

【0147】

全部で１５０ｍｌの各々の種培養物を使用し、１．５リットルの発酵バッチ培地を含有する３リットルのガラス被覆発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に接種した。発酵槽を２８℃の温度で維持し、Ａｐｐｌｉｋｏｎ １０３０制御システムを使用し、ｐＨを４．５＋／－０．１のセットポイントに制御した。空気を２．５Ｌ／分の速度で容器に加え、３００～１１００ｒｐｍで回転するＲｕｓｈｔｏｎ羽根車により、培養液を撹拌した。オートクレーブしたグルコース及びリン酸からなる発酵フィード培地を、０～１５ｇ／Ｌ／時間の速度で約７日の期間かけて投与した。サンプル（上清）を２～７日目に収集し、５℃で貯蔵してから、キサンタナーゼ活性アッセイにおける処理にかけた。

【0148】

リパーゼ発現レベルを実施例２０に記載のように測定した。アッセイしたすべての時点で、ステロイドデヒドロゲナーゼ欠失株ＮＪＯＣ６１７－７７Ｃにおいて、ＮＪＯＣ６０８－１Ｂ対照と比べて増加したキサンタナーゼ発現が認められた（図９）（７～２８％の改善）。結果によると、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼをコードするＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子の不活性化がキサンタナーゼ発現にとって有利であることが示された。

【0149】

実施例２２：ｐＴｍｍＤ－Ｍｆ＿リゾチームによるトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株ｆｒｔ４ｎｅｗ－１９４０－１９９６－２０１２－１２－１の形質転換
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｆｒｔ４ｎｅｗ－１９４０－１９９６－２０１２－１２－１プロトプラストを実施例２に記載のように作製した。約１～１０μｇのｐＴｍｍＤ－Ｍｆ＿リゾチーム（宿主株中にＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位を有する４つの遺伝子座でのＦＬＰ媒介性組込みのため、ＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位によって隣接されたミセリオフトラ・フェルグシイ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｆｅｒｇｕｓｉｉ）リゾチーム発現カセットを有するプラスミド；配列番号４１及び図１０）を、１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、ａｍｄＳの選択のため、内容物をＣＯＶＥプレート上に拡散させた。プレートを３０℃で７～９日間インキュベートした。各ＣＯＶＥプレートからの形質転換体からの胞子を、７５μｇ／ｍｌの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上に移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。５－ＦＣを含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上の形質転換体からの胞子を、５－ＦＣを含有する新しいＣＯＶＥ２グルコースプレートに移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。次に、いくつかの形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子をＣＯＶＥ２プレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座でのｐＮＪＯＣ３８３からのリゾチーム発現カセットの組込みを確認するため、実施例２に記載の通り、いくつかの単一胞子単離物においてゲノムＤＮＡを調製し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成するために使用し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座（配列番号１５～１８）のモデルにマッピングした。４つすべての部位で正確な組込みを有する単離物の１つをＮＪＯＣ６０１－５Ａと名付け、さらなる試験用に保存した。

【0150】

実施例２３：ｐＴｍｍＤ－Ｍｆ＿リゾチームによるトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株ＮＪＯＣ５８６の形質転換
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＮＪＯＣ５８６プロトプラストを実施例２に記載のように作製した。約１～１０μｇのｐＴｍｍＤ－Ｍｆ＿リゾチーム（宿主株中にＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位を有する４つの遺伝子座でのＦＬＰ媒介性組込みのため、ＦＲＴ－Ｆ及びＦＲＴ－Ｆ３部位によって隣接されたミセリオフトラ・フェルグシイ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｆｅｒｇｕｓｉｉ）リゾチーム発現カセットを有するプラスミド；配列番号４１及び図１０）を、１００μｌのプロトプラスト溶液に添加し、緩やかに混合した。ＰＥＧ緩衝液（２５０μｌ）を添加し、反応物を混合し、３４℃で３０分間インキュベートした。次に、ＳＴＣ（１ｍｌ）を添加し、ａｍｄＳの選択のため、内容物をＣＯＶＥプレート上に拡散させた。プレートを３０℃で７～９日間インキュベートした。各ＣＯＶＥプレートからの形質転換体からの胞子を、７５μｇ／ｍｌの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上に移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。５－ＦＣを含有するＣＯＶＥ２グルコースプレート上の形質転換体からの胞子を、５－ＦＣを含有する新しいＣＯＶＥ２グルコースプレートに移し、３０℃で５～７日間インキュベートした。次に、いくつかの形質転換体に対し、ＰＤＡ＋１Ｍスクロースプレート上で単一胞子単離を施した。プレートを３０℃で３～５日間インキュベートした。各コロニーからの胞子を、ＣＯＶＥ２プレートに移し、プレートを３０℃で５～７日間インキュベートした。ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座でのｐＮＪＯＣ３８３からのリゾチーム発現カセットの組込みを確認するため、実施例２に記載の通り、いくつかの単一胞子単離物においてゲノムＤＮＡを調製し、対合末端の配列決定ライブラリーを作成するために使用し、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）上で２×１５０ｂｐの化学を用いて配列決定した。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン１１．０．１（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、配列分析を実施した。Ｔｒｉｍ Ｒｅａｄｓ ｍｏｄｕｌｅを使用し、読み取り値をトリミングした。高ストリンジェンシー設定での参照モジュールに対してＭａｐ Ｒｅａｄを使用し、読み取り値をｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１及びｘｙｎ２遺伝子座（配列番号１５～１８）のモデルにマッピングした。４つすべての部位で正確な組込みを有する単離物の１つをＮＪＯＣ６１０－２Ｂと名付け、さらなる試験用に保存した。

【0151】

実施例２４：リゾチームＬＳＵ（Ａ）活性アッセイ
この方法を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ及びＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）と併用した。全培養液サンプルを、０．１Ｍ酢酸塩、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％トリトンＸ１００緩衝液、ｐＨ４．５（サンプル緩衝液）で適切に希釈し、続いて希釈サンプルの０倍～１／３倍～１／９倍に至る段階希釈を行った。リゾチーム標準を、サンプル緩衝液で、５０ＬＳＵ（Ａ）／ｍｌの濃度から２．４６９ＬＳＵ（Ａ）／ｍｌの濃度にかけて希釈した。全部で２０μｌの標準を含む各希釈物を９６ウェル平底プレートに移した。０．２６ｇ／Ｌのマイクロコッカス・リゾディクティクス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）基質溶液２００μｌを各ウェルに添加し、次に周囲温度で７５分間インキュベートした。インキュベーションの完了時、９６ウェルプレートにおいて、４５０ｎｍの光学密度が得られた。サンプル濃度を、作成した検量線からの外挿により判定した。

【0152】

実施例２５：実験室規模発酵は、ＴｒＡ１３３１Ｗによってコードされるタンパク質の欠失により、Ｍ．ｆ．リゾチームの生産性／収率の増加ももたらされることを示した
４コピーのリゾチームを発現するＮＪＯＣ６０１－５Ａ株（対照）及びＮＪＯＣ６１０－２Ｂ株を、２リットル発酵において評価した。各株を、２つのＰＤＡプレート上、３０℃で５～７日間成長させた。３つの５００ｍｌ振盪フラスコであって、各々が１００ｍｌの振盪フラスコ培地を含有するものに、ＰＤＡプレートから１つの振盪フラスコあたり２つのプラグを接種した。振盪フラスコを、２００ｒｐｍでのオービタルシェーカー上、２８℃で４８時間インキュベートした。培養物を発酵用の種として使用した。

【0153】

全部で１５０ｍｌの各々の種培養物を使用し、１．５リットルの発酵バッチ培地を含有する３リットルのガラス被覆発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に接種した。発酵槽を２８℃の温度で維持し、Ａｐｐｌｉｋｏｎ １０３０制御システムを使用し、ｐＨを３．５＋／－０．１のセットポイントに制御した。空気を２．５Ｌ／分の速度で容器に加え、３００～１１００ｒｐｍで回転するＲｕｓｈｔｏｎ羽根車により、培養液を撹拌した。オートクレーブしたグルコース及びリン酸からなる発酵フィード培地を、０～１５ｇ／Ｌ／時間の速度で約７日の期間かけて投与した。全培養液の一定分量を４日目、５日目、６日目及び７日目に採取し、５℃～１０℃で貯蔵してから、リゾチーム活性（ＬＳＵ（Ａ））アッセイにおける処理にかけた。

【0154】

リパーゼ発現レベルを実施例２４に記載のように測定した。アッセイしたすべての時点で、ステロイドデヒドロゲナーゼ欠失株ＮＪＯＣ６１０－２Ｂにおいて、ＮＪＯＣ６０１－５Ａ対照と比べて増加したＭ．ｆ．リゾチーム発現が認められた（図１１）（６～４７％の改善）。結果によると、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼをコードするＴｒＡ１３３１Ｗ遺伝子の不活性化がＭ．ｆ．リゾチーム発現にとって有利であることが示された。

【0155】

実施例（アスペルギルス・ニガー（ＡＳＰＥＲＧＩＬＬＵＳ ＮＩＧＥＲ））
材料及び方法
特に指定のない限り、ＤＮＡの操作及び形質転換を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．（ｅｄｓ．）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ”．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９０に記載のような分子生物学の標準的方法を用いて実施した。

【0156】

購入した材料（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びキット）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（東洋紡）をプラスミド構築及び増幅のために使用した。Ｑｉａｇｅｎプラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、増幅したプラスミドを回収した。ＤＮＡライゲーションキット（タカラ）又はＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、ライゲーションを行った。Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＴＭ ＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。ＰＣＲ断片の精製及びアガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出のため、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。

【0157】

酵素
ＤＮＡ操作のための酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼなど）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手可能であり、製造者の指示に従って使用した。

【0158】

プラスミド
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ－（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃２１２２０６）
Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（Ｐｇｐｄ）及びＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリプトファンシンターゼターミネーター（ＴｔｒｐＣ）によって駆動されるＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子及び単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）を宿す、ｐＨＵｄａ８０１（国際公開第２０１２／１６００９３号パンフレット）の誘導体であるｐＨＵｄａ９６３は、国際公開第２０１２／１６００９３号パンフレット中の実施例４に記載されている。

【0159】

アクレモニウム・アルカロフィルス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）リゾチーム（Ａａリゾチーム）遺伝子を宿すｐＪａＬ１４７０は、国際公開第２０１５１４４９３６Ａ１号パンフレットに記載されている。

【0160】

微生物株
発現宿主株アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）Ｃ５５５３及びＭ１８１６（ｐｙｒＧ－表現型／Ｃ５５５３のウリジン栄養要求性）はＮｏｖｏｚｙｍｅｓにより単離され、国際公開第２０１２／１６００９３号パンフレット中の実施例１４に記載の土壌から単離されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＮＮ０４９１８４の誘導体である。Ｃ５５５３及びＭ１８１６は、アミログリコシダーゼ（ａｍｙｌｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）活性の発現を破壊するように遺伝子組換えしている。

【0161】

培地
ＣＯＶＥ微量金属溶液は、０．０４ｇのＮａＢ₄Ｏ₇・１０Ｈ₂Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、０．８ｇのＮａ₂ＭｏＯ₂・２Ｈ₂Ｏ、１０ｇのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。

【0162】

５０×ＣＯＶＥ塩溶液は、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、７６ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。

【0163】

ＣＯＶＥ培地は、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌの５０×ＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍｌの１Ｍアセトアミド、１０ｍｌの１．５Ｍ ＣｓＣｌ₂、２５ｇのノーブル寒天、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。

【0164】

ＣＯＶＥ－Ｎ－Ｇｌｙプレートは、２１８ｇのソルビトール、１０ｇのグリセロール、２．０２ｇのＫＮＯ₃、５０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、２５ｇのノーブル寒天、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。

【0165】

ＣＯＶＥ－Ｎ（ｔｆ）は、３４２．３ｇのスクロース、３ｇのＮａＮＯ₃、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、３０ｇのノーブル寒天、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。

【0166】

ＣＯＶＥ－Ｎ上層アガロースは、３４２．３ｇのスクロース、３ｇのＮａＮＯ₃、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、１０ｇの低溶融アガロース、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。

【0167】

ＣＯＶＥ－Ｎは、３０ｇのスクロース、３ｇのＮａＮＯ₃、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、３０ｇのノーブル寒天、及び脱イオン水からなり、１リットルにした。

【0168】

ＳＴＣ緩衝液は、０．８Ｍソルビトール、２５ｍＭトリス、ｐＨ８、及び２５ｍＭ ＣａＣｌ₂からなった。

【0169】

ＳＴＰＣ緩衝液は、ＳＴＣ緩衝液中、４０％ＰＥＧ４０００からなった。

【0170】

ＬＢ培地は、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇの塩化ナトリウム、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。

【0171】

ＬＢプラスアンピシリンプレートは、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇの塩化ナトリウム、１５ｇのバクト（Ｂａｃｔｏ）寒天、１ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリン、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。

【0172】

ＹＰＧ培地は、１０ｇの酵母エキス、２０ｇのバクト（Ｂａｃｔｏ）ペプトン、２０ｇのグルコース、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。

【0173】

ＳＯＣ培地は、２０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、０．５ｇのＮａＣｌ、１０ｍｌの２５０ｍＭ ＫＣｌ、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。

【0174】

ＴＡＥバッファーは、４．８４ｇのトリス塩基、１．１４ｍｌの氷酢酸、２ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡｐＨ８．０、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。

【0175】

アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の形質転換
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種の形質転換は、酵母形質転換のための一般的方法を用いて達成することができる。本発明における好ましい手順は、下記の通りである。

【0176】

１０ｍＭウリジンで補充した１００ｍｌのＹＰＧ培地に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）宿主株を接種し、３２℃、８０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。ペレットを収集し、０．６Ｍ ＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ－グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６Ｍ ＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートし、続いてＳＴＣバッファーで２回洗浄した。

【0177】

プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０⁷プロトプラスト／ｍｌに調節した。約４μｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。１ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。１０ｍｌの５０℃のＣｏｖｅ又はＣｏｖｅ－Ｎ上層アガロースの添加後、反応物をＣｏｖｅ又はＣｏｖｅ－Ｎ（ｔｆ）寒天プレート上に注ぎ、プレートを３０℃で５日間インキュベートした。

【0178】

【表3】

【0179】

３ステップサイクル：
１．前変性：９４℃、２分
２．変性：９４℃、１５秒
３．アニーリング：Ｔｍ－［５～１０］℃^*、３０秒
４．伸長：６８℃、１分／ｋｂ
５．全体で３５サイクルにわたる反復ステップ＃２～４

【0180】

Ａａリゾチーム産生用の実験室規模タンク培養
発酵はフェドバッチ発酵として実施した（Ｈ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ２０００，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，５３：２７２－２７７）。選択した株を液体培地中で前培養し、次いで酵素産生のさらなる培養のため、成長した菌糸をタンクに移した。酵素産生を阻止する、過量でないグルコース及びアンモニウムの供給と共に、３４℃、ｐＨ４．７５で８日間培養した。培養液を酵素アッセイ用に使用した。

【0181】

配列
配列番号４：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ステロイドデヒドロゲナーゼゲノムＤＮＡ配列
配列番号５：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ステロイドデヒドロゲナーゼコード配列（又はｃＤＮＡ）
配列番号６：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ステロイドデヒドロゲナーゼアミノ酸配列

【0182】

実施例２６ アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）におけるステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊
ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊プラスミドｐＩｈａｒ４７３の構築
プラスミドｐＩｈａｒ４７３を、選択可能マーカーとしてのＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）とそのターミネーターリピートによって分離された、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子における５’及び３’隣接領域、及びヒト単純ヘルペスウイルス１（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １）（ＨＳＶ－１）チミジンキナーゼ遺伝子を有するように構築した。ＨＳＶ－１チミジンキナーゼ遺伝子は、ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子の３’隣接領域の３’側に存在し、ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子座を正確に標的にしないアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）形質転換体の対抗選択を可能にする。プラスミドは、下記のようないくつかのステップで構築した。

【0183】

Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ステロイドデヒドロゲナーゼの３’隣接領域を有するＰＣＲ産物は、以下のプライマー：
配列番号４２：プライマーＩＨ１２３２－３’ｓｔｅＤ－Ｆ：
５’－ａａｃｔｃｔｃｔｃｃｔｃｔａｇａＴＴＡＴＧＴＡＧＣＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＣＧＧＧＧＡ－３’
配列番号４３：プライマーＩＨ１２３３－３’ｓｔｅＤ－Ｒ：
５’－ａｃａｇｇａｇａａｔｔｃｔｔａａｔｔａａＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＴＴＴＴＣＡＧＧＣ－３’
を使用して作製した。

【0184】

所望される断片を、材料及び方法に記載のような約１００ｎｇのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＮＮ０４９１８４のゲノムＤＮＡからなる反応物中でＰＣＲにより増幅した。９４℃で２分間の１サイクル；各々が９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、及び６８℃で２分間の３５サイクル；並びに４℃保持としてプログラムしたＢｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラー内で反応物をインキュベートした。得られた１，５００ｂｐのＰＣＲ断片を、ＴＡＥ緩衝液を使用し、０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キットを使用して抽出した。

【0185】

プラスミドｐＨＵｄａ９６３を、ＸｂａＩ及びＰａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）で消化し、ＴＡＥ緩衝液を使用し、０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで８，１５３ｂｐの断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キットを使用して抽出した。８，１５３ｂｐの断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用し、製造業者の使用説明書に従い、１，５００ｂｐのＰＣＲ断片にライゲートした。１μＬの反応混合物をＤＨ５α化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞内に形質転換した。形質転換体を、ＬＢ＋アンピシリンプレート上に拡散させ、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ－プレップキットを使用し、プラスミドＤＮＡをいくつかの形質転換体から精製した。プラスミドＤＮＡを、適切な制限酵素の使用により適切なライゲーションについてスクリーニングし、続いてＴＡＥ緩衝液を使用し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行った。１つのプラスミドをｐＩｈａｒ４７３－３’ｓｔｅＤと名付けた。

【0186】

Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ステロイドデヒドロゲナーゼの５’隣接領域を有するＰＣＲ産物は、以下のプライマー：
配列番号４４：プライマーＩＨ１２３０－５’ｓｔｅＤ－Ｆ：
５’－ｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇｔｔｔａａａｃＡＴＣＣＣＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＡＣＣＧＡＧＴＡＴＧ－３’
配列番号４５：プライマーＩＨ１２３１－５’ｓｔｅＤ－Ｒ：
５’－ｔｃａｇｔｃａｃｃｃｇｇａｔｃｃｃｔａＡＴＧＧＴＧＧＣＡＧＴＣＧＴＧＴＴＧＧＡＴＧＣＣＴ－３’
を使用して作製した。

【0187】

所望される断片を、材料及び方法に記載のような約１００ｎｇのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＮＮ０４９１８４のゲノムＤＮＡからなる反応物中でＰＣＲにより増幅した。９４℃で２分間の１サイクル；各々が９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、及び６８℃で２分間の３５サイクル；並びに４℃保持としてプログラムしたＢｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラー内で反応物をインキュベートした。１，５００ｂｐのＰＣＲ断片を、ＴＡＥ緩衝液を使用し、０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キットを使用して抽出した。

【0188】

プラスミドｐＩｈａｒ４７３－３’ｓｔｅＤを、ＰｍｅＩ及びＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）で消化し、ＴＡＥ緩衝液を使用し、０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで９，６５３ｂｐの断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キットを使用して抽出した。９，６５３ｂｐの断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用し、製造業者の使用説明書に従い、１，５００ｂｐのＰＣＲ断片にライゲートした。５μＬのライゲーション混合物をＤＨ５α化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞内に形質転換した。形質転換体を、ＬＢ＋アンピシリンプレート上に拡散させ、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ－プレップキットを使用し、プラスミドＤＮＡをいくつかの形質転換体から精製した。プラスミドＤＮＡを、適切な制限酵素の使用により適切なライゲーションについてスクリーニングし、続いてＴＡＥ緩衝液を使用し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行った。１つのプラスミドをｐＩｈａｒ４７３と名付けた（配列番号４６、図１２）。

【0189】

アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）株Ｍ１８１６におけるステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）株Ｍ１８１６のプロトプラストは、１０ｍＭウリジンで補充した１００ｍｌのＹＰＧ培地においてこの株を３２℃で１６時間にわたり８０ｒｐｍで穏やかに攪拌しながら培養することにより調製した。ペレットを収集し、０．６Ｍ ＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ－グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６Ｍ ＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を介して５０ｍｌの無菌プラスチック製遠心管中にプロトプラストを濾過した後、０．６Ｍ ＫＣｌで洗浄して、捕捉したプロトプラストを抽出した。合わせた濾過物及び上清を２，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により収集した。上清を廃棄し、ペレットを１０～２５ｍｌのＳＴＣで洗浄し、２，０００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離し、続いてＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０⁷プロトプラスト／ｍｌに調節した。

【0190】

約４μｇのｐｌｈａｒ４７３を１ｍｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。３ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。１２ｍｌの５０℃のＣＯＶＥ－Ｎトップアガロースを添加後、混合物をＣＯＶＥ－Ｎプレートに注ぎ、これらのプレートを３０℃で７日間インキュベートした。増殖した形質転換体を、ｐｌｈａｒ４７３に存在する単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）を発現する細胞を殺傷する薬剤である、１．５ｕＭ５－フルオロ－２－デオキシウリジン（ＦｄＵ）で補充したＣＯＶＥ－Ｎプレートに無菌爪楊枝で移した。単一の胞子単離物をＣＯＶＥ－Ｎ－ｇｌｙプレートに移した。

【0191】

ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊する、ｐｌｈａｒ４７３を含有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）株Ｍ１８１６の形質転換体候補をサザン分析によりスクリーニングした。胞子精製形質転換体の各々を３ｍｌのＹＰＧ培地で培養し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を用いて、バイオマスを収集した。粉砕した菌糸体を、ＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いたゲノムＤＮＡ調製に製造者の指示に従って供した。

【0192】

ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子座の破壊を確認するために、サザンブロット分析を実施した。各形質転換体からの５μｇのゲノムＤＮＡをＳｐｅＩで消化した。ゲノムＤＮＡ消化反応物は、５μｇのゲノムＤＮＡ、１μｌのＳｐｅＩ、２μｌの１０×ＮＥＢ ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー、及び２０μｌまでの水から構成された。ゲノムＤＮＡ消化物を３７℃で約１６時間インキュベートした。消化物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付し、ＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（登録商標）を用いて、ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ，ＵＳＡ）上に、製造者の推奨事項に従い約１時間ブロッティングした。この膜を４８１ｂｐジゴキシゲニン標識アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ステロイドデヒドロゲナーゼプローブとハイブリダイズしたが、このプローブは、以下に示すプライマーＩＨ１２５２－ｓｔｅ－ｐｒｏＦ（センス）及びＩＨ１２５３－ｓｔｅ－５００Ｒ（アンチセンス）を用いたＰＣＲによるジゴキシゲニン－１１－ｄＵＴＰの組み込みにより合成したものである。
配列番号４７：プライマーＩＨ１２５２－ｓｔｅ－ｐｒｏＦ：
５’－ＡＴＡＣＴＣＴＣＣＧＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧ－３’
配列番号４８：プライマーＩＨ１２５３－ｓｔｅ－５００Ｒ：
５’－ＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＡＡＧＧＣＡＡＣ－３’

【0193】

増幅反応物（５０μｌ）は、最終容量５０μｌで、２００μＭのＰＣＲ ＤＩＧ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ｐｌｈａｒ４７３を使用するＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）による０．５μＭのプライマーから構成された。増幅反応物をＢｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で３０秒を３０サイクル、並びに４℃での保持のようにプログラムした。ＰＣＲ産物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、０．５ｋｂ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて抽出した。変性プローブをＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後洗浄（各々、２×ＳＳＣで２回、室温、５分、及び０．１×ＳＳＣで２回、６８℃、１５分）後、ＤＩＧ検出システム及びＣＰＤ－Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、製造業者のプロトコルに従い、化学発光検出を実施した。ＤＩＧ標識ＤＮＡ分子量マーカーＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を標準マーカーとして使用した。ステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子座に正確な組込みをもたらす４７４Ｐ２－１株及び４７４Ｐ２－５株（ハイブリダイズバンドは５１１８ｂｐから７６１２ｂｐで変化した）を、後の実験用に選択した。

【0194】

実施例２７：４７４Ｐ２－１及び４７４Ｐ２－５におけるＡａリゾチームの発現
ａｍｄＳ選択マーカーを伴うＡａリゾチーム遺伝子のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）４７４Ｐ２－１及び４７４Ｐ２－５への染色体挿入（国際公開第２０１５１４４９３６Ａ１号パンフレットに記載のｐＪａＬ１４７０）を、国際公開第２０１２／１６００９３号パンフレットに記載のように実施した。Ａａリゾチーム発現プラスミドは、ｆｌｐリコンビナーゼにより、マンノシルトランスフェラーゼ（ａｌｇ２）、グルコキナーゼ（ｇｕｋＡ）、酸安定性アミラーゼ（ａｓａＡ）及びマルチ銅オキシダーゼ（ｍｃｏＨ）である、４つの予め指定された遺伝子座が標的にされた。

【0195】

Ａａリゾチーム遺伝子の参照ステロイドデヒドロゲナーゼ－野生型Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）Ｃ５５５３への染色体挿入も実施した。十分に成長した株を精製し、サザンブロッティング分析にかけ、Ａａリゾチーム遺伝子がｍｃｏＨ、ｇｕｋＡ、ａｓａＡ及びａｌｇ２遺伝子座に正確に導入されるか否かを確認した。非放射性プローブを作製するための以下のプライマーセットを使用し、選択された形質転換体を分析した。

【0196】

プロモーター領域の場合：
配列番号４９：ＨＴＪＰ－３２４ ＡＡＧＧＧＡＴＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＣＣ
配列番号５０：ＨＴＪＰ－３２５ ＴＧＡＡＧＡＡＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＧ

【0197】

選択された形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡをＳｐｅＩで消化し、次にプロモーター領域で探索した。正しい遺伝子導入事象により、ＳｐｅＩ及びＭｌｕＩ消化による６．７ｋｂ（ａｌｇ２）、２．９ｋｂ（ｍｃｏＨ）、６．７ｋｂ（ｇｕｋＡ）及び２．７ｋｂ（ａｓａＡ）のサイズでのハイブリダイズシグナルが認められ、上記の探索を行った。

【0198】

ｍｃｏＨ、ｇｕｋＡ、ａｓａＡ及びａｌｇ２遺伝子座での遺伝子の４コピーの正しい組込み事象が仮定される株の中で、各宿主（１４７０－４７４Ｐ２－１、１４７０－４７４Ｐ２－５、１４７０－Ｃ５５５３－１３）からのリゾチームを有する１つの株を選択した。

【0199】

実施例２８：酵素産生時のステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊の効果
４７４Ｐ２－１、４７４Ｐ２－５及びＣ５５５３からの１つの株を実験室規模タンク内で発酵させ、それらの酵素活性（ＬＳＵ（Ｆ）／ｍｌ活性）を実施例７に記載の材料及び方法に従って測定し）；結果を下表に示す。ステロイドデヒドロゲナーゼ破壊株は、ガラス発酵槽内で参照ステロイドデヒドロゲナーゼ－野生型株よりも約１．１倍高いリゾチーム（ＬＳＵ（Ｆ）／ｍｌ）活性を示した（表３）。

【0200】

【表4】

【0201】

実施例（アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ））
微生物株
ＡＴ３０９１株は、国際公開第２００６０３７３２８号パンフレットの配列番号４に記載のシトロバクター・ブラアキィ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼを発現している。この株は、国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットに記載のＦＬＰ組込み系を用いて、４つの別々の染色体上の４つの特定の遺伝子座にタンデムな逆方向リピートとして挿入されている、シトロバクター・ブラアキィ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒａａｋｉｉ）フィターゼの８つの遺伝子コピーを有する。ＡＴ３０９１株を作出するために使用される宿主は、国際公開第２０１８１６７１５３号パンフレットの実施例４に記載のＪａＬ１９０３に由来する。

【0202】

コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）株における実験室規模タンク培養
発酵は、フェドバッチ発酵として実施し（Ｈ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ２０００，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，５３：２７２－２７７）、ここでは選択された株を液体培地中で前培養し、次に成長した菌糸をタンクに移し、さらなる培養及び酵素産生に備えた。培養は３４℃で８日間実施した。ｐＨを制御するため、アンモニアを使用した。ｐＨは、バッチ段階中、６で保持し、フェドバッチでは、ｐＨ５．４で保持した。マルトースシロップで栄養した。培養液を酵素アッセイに使用した。

【0203】

国際公開第２００６０３７３２８号パンフレットの実施例４に記載のように、フィターゼ活性測定を実施した。

【0204】

実施例２９－切断されたステロイドデヒドロゲナーゼ遺伝子を有するフィターゼ発現株の構築及び試験
配列番号７（ゲノム）及び配列番号８（ｃＤＮＡ）によってコードされるコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ステロイドデヒドロゲナーゼ（配列番号９）の切断されたステロイドデヒドロゲナーゼを作製し、Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ステロイドデヒドロゲナーゼ突然変異体（ＮＪＯＣ５８６）に類似させるため、停止コドンをアミノ酸位置Ｙ２３４で、コドンＴＡＴをＴＡＧに突然変異させることにより導入した。

【0205】

停止コドンを導入するため、オリゴヌクレオチド媒介性ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を、Ｎｏｅｄｖｉｇ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１５（２０１８）７８－８９に記載のように、Ｃａｓ９をＩｎｃｒｉｐｔａから提供されたＭａｄ７と置換する改良を伴い、実施した。

【0206】

突然変異に使用されるオリゴｏＡＴ３３０３は、アンチセンスの配向であり、以下の配列（配列番号５１）を有する：

【化1】

【0207】

Ｍａｄ７複合体によるさらなる切断を阻止するため、ＰＡＭ部位に突然変異が導入された２つの下線のヌクレオチド及び太字のヌクレオチドは、Ｙ２３４に対応するコドンを停止コドンに変更した。

【0208】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｍａｄ７プラスミドｐＡＴ３６３１（図１３、配列番号５２）は、１）ｃａｓ９遺伝子をｍａｄ７遺伝子と交換し、２）ｐｙｒＧマーカー遺伝子をｂａｒ遺伝子（ビアラホスに対する耐性を与える）と置換し（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ ６：２５１９－２５２３）、且つ３）ｗＡプロトスペーサーを、標的配列の直ぐ上流にＰＡＭ部位ＴＴＴＣを有する、対応する染色体配列を標的化するプロトスペーサーＴＣＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＣＣＣＴＴ（配列番号５３）と置換するといった方法でのｐＡＴ１１５３（国際公開第１９０４６７０３号パンフレット、実施例２５）の修飾により構築した。

【0209】

ＡＴ３０９１のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）形質転換を、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１４１９－１４２２に従って実施した。要するに、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）菌糸をリッチな栄養培養液中で成長させた。菌糸を濾過により培養液から分離した。酵素製剤Ｇｌｕｃａｎｅｘ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）を、リン酸ナトリウムでｐＨ５．０に緩衝化された１．２Ｍ ＭｇＳＯ₄などの浸透圧安定化緩衝液中の菌糸に添加した。懸濁液を撹拌しながら３７℃で６０分間インキュベートした。プロトプラストをＭｉｒａｃｌｏｔｈ（登録商標）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ．）を通して濾過し、菌糸細片を除去した。プロトプラストを収集し、ＳＴＣで２回洗浄した。次に、プロトプラストを２００～１０００μｌのＳＴＣに再懸濁した。

【0210】

ＡＴ３０９１の形質転換の場合、１μｇのプラスミドｐＡＴ３６３１及び１００ピコモルの修復オリゴｏＡＴ３３０３を１００μｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、次に２００μｌのＰＥＧ緩衝液を添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートした。プロトプラストを収集し、１．２Ｍソルビトールで２回洗浄し、２００μｌの１．２Ｍソルビトールに再懸濁した。炭素源としての１．０Ｍスクロースと窒素源としての１０ｍＭ尿素と１００ｍｇ／ｌのビアラホスを含有する最少培地寒天プレート（Ｃｏｖｅ，１９６６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１３：５１－５６）上で形質転換体を選択するとき、ｂａｒ遺伝子を含有する形質転換体を、ビアラホスに対する耐性を与えるそれらの能力について選択した。３７℃での増殖から５～７日後、安定な形質転換体は、勢いよく成長し、胞子形成するコロニーとして出現した。形質転換体は、ＣＲＩＳＰＲ－ｍａｄ７プラスミドが失われる、非選択プレート（即ちビアラホスを有しない）上の分生子柄を通じて１回精製した。

【0211】

予想された突然変異を検証するため、選択された形質転換体に対して以下のプライマー：
ｏＡＴ３１６３：ＣＴＡＧＣＡＧＴＣＴＣＡＡＴＣＧＣ（配列番号５４）
ｏＡＴ３１６４：ＴＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＣ（配列番号５５）
を用いてＰＣＲを実施し、得られた４０４ｂｐのＰＣＲ産物を、ＰＣＲ用に用いられるプライマーを用いて配列決定した。停止コドンが導入されている１つの形質転換体ＡＴ３９４４を、実験室タンク発酵において選択した。

【0212】

ＡＴ３０９１及びＡＴ３９４４及びフィターゼ活性の発酵を、下記方法のように実施した。１１７．４時間から発酵の終了まで、ＡＴ３９４４のフィターゼ活性は、１．４％～６．９％より高かった（１８２．７時間後、約３％より高い状態で終了、図１４）。結果は、推定上の天然ステロイドデヒドロゲナーゼの不活性化が、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）におけるフィターゼ発現に対する正の影響を有することを示す。

【0213】

本明細書中で説明及び主張される発明は、本明細書に開示される特定の態様により範囲が限定されるべきでない。というのは、これらの態様が本発明のいくつかの態様を例示するものとして意図されるからである。いずれかの均等な態様は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。当然ながら、本発明の様々な修飾は、本明細書中で示され、説明される場合に加えて、前記説明から当業者が理解できることになろう。かかる修飾はまた、貼付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。矛盾が生じる場合には、定義を含む本開示が制御する。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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