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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-24
(45)【発行日】2025-01-08
(54)【発明の名称】抗菌剤の探索方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/18 20060101AFI20241225BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/18
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2020175069
(22)【出願日】2020-10-19
(65)【公開番号】P2021065228
(43)【公開日】2021-04-30
【審査請求日】2023-10-05
(31)【優先権主張番号】P 2019192485
(32)【優先日】2019-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】501481492
【氏名又は名称】株式会社ゲノム創薬研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】399086263
【氏名又は名称】学校法人帝京大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002136
【氏名又は名称】弁理士法人たかはし国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】関水 和久
(72)【発明者】
【氏名】浜本 洋
(72)【発明者】
【氏名】橋本 佳奈
【審査官】天野 皓己
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－００５４８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－２３１０２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】早川 正幸，“土壌放線菌の選択分離方法および分布に関する研究”，ACTINOMYCETOLOGICA，1990年，Vol. 4, No. 2，p.103－112
【文献】KHATTAB A. et al.，Streptomyces species from red sea habitat: Isolation, characterization and screening for antibacterial compounds，IJPCBS，2016年，Vol. 6, No. 1，P. 62-71
【文献】HAMAKI T. et al.，“Isolation of novel bacteria and actinomycetes using soil-extract agar medium”，Journal of Bioscience and Bioengineering，2005年05月，Vol. 99, No. 5，p.485-492，DOI: 10.1263/jbb.99.485
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００ － ３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程１、工程２、工程３、工程７及び工程８の全てを有することを特徴とする抗菌剤の探索方法。工程１：滅菌処理を行った「『土壌に水を加えて混合して滅菌処理を行ったものの上清である土壌エキス』と寒天を含有する貧栄養の固体培地」に、土壌の懸濁液の上清を広げて培養することによって該土壌に含有されている菌Ａのコロニーを形成させる土壌菌コロニー形成工程
工程２：「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程１で菌Ａのコロニーが形成された固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する重層固体培地形成工程
工程３：上記重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記コロニーを中心として形成された阻止円を見出し、該阻止円の略中央に存在する菌Ａのコロニーから菌Ａを選択採取し、菌Ａだけに純化する菌Ａの純化工程
工程７：菌Ａを液体培地の中で培養し、有機溶媒を加えて撹拌混合し、可溶分を乾固し、水を加えて菌Ａの濃度の異なる複数のサンプルを調製し、該サンプル毎に、抗菌の対象となる菌Ｂに対しての抗菌性を測定し、１０倍以上希釈しても抗菌性を示す「菌Ａに由来するサンプル」を選択するサンプル選択工程Ａ
工程８：カイコ感染モデルを使用して、上記工程７で選択されたサンプルの中から、抗菌の対象となる菌Ｂに対して抗菌治療効果があるサンプルを選択するサンプル選択工程Ｂ
【請求項2】
上記工程１で形成する上記菌Ａのコロニーの大きさが、平均直径０．５ｍｍ以上１０ｍｍ以下である請求項１に記載の抗菌剤の探索方法。
【請求項3】
更に、上記工程３より後に、以下の工程４を有する請求項１又は請求項２に記載の抗菌剤の探索方法。工程４：上記工程３で純化した菌Ａのコロニーを、固体培地上で純培養する工程
【請求項4】
更に、上記工程４より後に、以下の工程５及び工程６を有する請求項３に記載の抗菌剤の探索方法。工程５：「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程４で菌Ａを純培養した固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する工程
工程６：上記純培養した菌Ａ上に形成した重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記純培養した菌Ａを中心として阻止円が形成されることを確認する工程
【請求項5】
上記工程７において、及び／又は、上記工程７より後に、以下の工程ａ及び／又は工程ｂを行う請求項１ないし請求項４の何れかの請求項に記載の抗菌剤の探索方法。工程ａ：難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒に転溶する工程
工程ｂ：カラム分画する工程
【請求項6】
以下の工程ａ及び／又は工程ｂを行ってから工程７を行う請求項１ないし請求項４の何れかの請求項に記載の抗菌剤の探索方法。工程ａ：難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒に転溶する工程
工程ｂ：カラム分画する工程
【請求項7】
更に、上記工程８より後に、以下の工程９を有する請求項１ないし請求項６の何れかの請求項に記載の抗菌剤の探索方法。工程９：上記工程８で選択されたサンプルの中から、抗菌剤を分離して獲得する抗菌剤獲得工程
【請求項8】
上記工程２又は上記工程５における寒天は、菌Ｂが黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）である場合には融点３０℃以上６０℃以下の寒天であり、菌Ｂが大腸菌（Escherichia coli）又はパン酵母（Saccharomyces cerevisiae）である場合には融点３０℃以上４５℃以下の寒天である請求項１ないし請求項７の何れかの請求項に記載の抗菌剤の探索方法。
【請求項9】
上記工程２又は上記工程５における重層固体培地の厚さが、０．５ｍｍ以上１０ｍｍ以下である請求項１ないし請求項８の何れかの請求項に記載の抗菌剤の探索方法。
【請求項10】
上記菌Ｂが病原性の細菌又は真菌である請求項１ないし請求項９の何れかの請求項に記載の抗菌剤の探索方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗菌剤の探索方法に関し、更に詳しくは、土壌菌由来の抗菌剤を効率的に探索する方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
抗生物質である抗菌剤は、医療分野において極めて重要である。しかも、新たな感染症が出現する恐れがあり、また既存の抗菌剤が効き難い耐性菌が既に出現しており、また、今後更に新たな耐性菌が出現する可能性が高く、それらが大きな社会問題になっている。
しかしながら、従来の抗菌剤の探索方法は、コスト対効果の点で劣り、また、薬事規制の厳しさの点でも魅力がなくなりつつあり、そのためもあって、近年、製薬会社等による新規の抗菌剤の発見・探索は減速傾向にある。
しかしながら、従来の抗菌剤の探索方法は、コスト対効果の点で劣り、また、薬事規制の厳しさの点でも魅力がなくなりつつあり、そのためもあって、近年、製薬会社等による新規の抗菌剤の発見・探索は減速傾向にある。
【0003】
従来の探索法は、抗菌剤を産生する菌を単離し、該菌を液体培地で純粋培養し、産生した物質の抗菌活性を検出し、該物質を精製し構造を決定し、動物（マウス等）を用いた実験で体内動態・治療効果・薬効・副作用等を確認する、と言った手順をとっている。
すなわち、従来法は、抗菌性を有する物質を産生する１つの菌を見つけ、該菌が産生する抗菌活性のある単一物質を見つけ、該物質を精製すると言う技術思想に基づいており、複数の菌を並行して評価したり、複数の産生物質を並行して評価したりできないため、新規の抗菌剤の発見・探索に限界をもたらしていると考えられる。
すなわち、従来法は、抗菌性を有する物質を産生する１つの菌を見つけ、該菌が産生する抗菌活性のある単一物質を見つけ、該物質を精製すると言う技術思想に基づいており、複数の菌を並行して評価したり、複数の産生物質を並行して評価したりできないため、新規の抗菌剤の発見・探索に限界をもたらしていると考えられる。
【0004】
また、従来法では、長期間かけて発見し、その後、精製して得られた抗菌活性を有する単一物質を、多数のマウス等を用いて評価したところ、体内動態が劣る、抗菌活性は高くても治療効果に劣る、又は、副作用が大きい、等が理由となって、後の方の検討・評価の段階で没になる場合が多かった。
【0005】
一方、本発明者は、カイコ感染モデルを確立し（特許文献１、２、非特許文献１～３）、それを用いて新たな骨格の抗菌剤・抗生物質を見出している（特許文献３～７、非特許文献４～６）。
すなわち、具体的には、抗菌剤・抗生物質の治療効果の指標となるＥＤ５０値が、カイコと哺乳動物でよく一致していることを確かめている（非特許文献２）。これは、カイコでの抗生物質の体内動態が哺乳動物と共通しているからである（非特許文献３）。
すなわち、具体的には、抗菌剤・抗生物質の治療効果の指標となるＥＤ５０値が、カイコと哺乳動物でよく一致していることを確かめている（非特許文献２）。これは、カイコでの抗生物質の体内動態が哺乳動物と共通しているからである（非特許文献３）。
【0006】
実際、既に、カイコ感染モデルを用いて新規のターゲットを有する新規の抗菌剤・抗生物質を見出している（非特許文献４）。また、沖縄の土壌由来のライソバクター（Lysobacter）属の細菌から、ライソシンＥというＭＲＳＡに有効な新規抗菌剤・抗生物質を見出している（特許文献３～６、非特許文献５）。また、ＡＳＰ２３９７という新規抗真菌薬も見出している（非特許文献６）。
このように、カイコ感染モデルが、治療効果まで加味した新規抗菌剤・抗生物質の探索に有効であることが分かっている。
このように、カイコ感染モデルが、治療効果まで加味した新規抗菌剤・抗生物質の探索に有効であることが分かっている。
【0007】
近年、新規構造の抗菌剤の出現が少ない中、前記のように大きな問題点のある既存の探索方法に代わって、新たな優れた抗菌剤・抗生物質の探索方法を発明することが強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特開２００７－３２７９６４号公報
【文献】特開２０１０－１３３９７５号公報
【文献】特開２０１２－００６９１７号公報
【文献】特開２０１２－００５４８０号公報
【文献】特開２０１２－００５４８１号公報
【文献】国際公開第２０１１／１４８９５９号
【文献】特開２０１６－２１０７７６号公報
【非特許文献】
【0009】
【文献】Kaito C, Akimitsu N, Watanabe H & Sekimizu K (2002) Microb Pathog 32: 183-190.
【文献】Hamamoto H, Kurokawa K, Kaito C, et al. (2004) Antimicrob Agents Chemother 48: 774-779.
【文献】Hamamoto H, Tonoike A, Narushima K, Horie R & Sekimizu K (2009) Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 149: 334-339.
【文献】Paudel A, Hamamoto H, Panthee S, Kaneko K, Matsunaga S, Kanai M, Suzuki Y, Sekimizu K. (2017) Front. Microbiol., 8: 712.
【文献】Hamamoto H, Urai M, Ishii K, Yasukawa J, Paudel A, Murai M, Kaji T, Kuranaga T, Hamase K, Katsu T, Jie Su, Adachi T, Uchida R, Tomoda H, Yamada M, Souma M, Kurihara H, Inoue M, Sekimizu K. (2015) Nature Chemical Biology, 11: 127-133.
【文献】Nakamura I, Kanasaki R, Yoshikawa K, Furukawa S, Fujie A, Hamamoto H, Sekimizu K. (2017) J Antibiot (Tokyo). 70: 41-44.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、優れた抗菌剤・抗生物質の探索方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、カイコ感染モデルを使用して、「病原菌等の菌Ｂに対して抗菌治療効果がある化合物」を含有するサンプルを選択するにあたり、特定の方法で「抗菌性物質を含有するサンプル」を得れば、複数種の菌、複数種の抗菌剤・抗生物質を並行してスクリーニングでき、しかも漏れなく効率的に抗菌剤を探索できることを見出して本発明に至った。
【0012】
すなわち、本発明は、以下の工程１、工程２、工程３、工程７及び工程８の全てを有することを特徴とする抗菌剤の探索方法を提供するものである。
工程１：滅菌処理を行った貧栄養の固体培地に、土壌の懸濁液の上清を広げて培養することによって該土壌に含有されている菌Ａのコロニーを形成させる土壌菌コロニー形成工程
工程２：「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程１で菌Ａのコロニーが形成された固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する重層固体培地形成工程
工程３：上記重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記コロニーを中心として形成された阻止円を見出し、該阻止円の略中央に存在する菌Ａのコロニーから菌Ａを選択採取し、菌Ａだけに純化する菌Ａの純化工程
工程７：菌Ａを液体培地の中で培養し、有機溶媒を加えて撹拌混合し、可溶分を乾固し、水を加えてＭＩＣ値を測定するためのサンプルを調製し、抗菌の対象となる菌Ｂに対してＭＩＣ値が１／１０以下となる「菌Ａに由来するサンプル」を選択するサンプル選択工程Ａ
工程８：カイコ感染モデルを使用して、上記工程７で選択されたサンプルの中から、抗菌の対象となる菌Ｂに対して抗菌治療効果があるサンプルを選択するサンプル選択工程Ｂ
工程１：滅菌処理を行った貧栄養の固体培地に、土壌の懸濁液の上清を広げて培養することによって該土壌に含有されている菌Ａのコロニーを形成させる土壌菌コロニー形成工程
工程２：「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程１で菌Ａのコロニーが形成された固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する重層固体培地形成工程
工程３：上記重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記コロニーを中心として形成された阻止円を見出し、該阻止円の略中央に存在する菌Ａのコロニーから菌Ａを選択採取し、菌Ａだけに純化する菌Ａの純化工程
工程７：菌Ａを液体培地の中で培養し、有機溶媒を加えて撹拌混合し、可溶分を乾固し、水を加えてＭＩＣ値を測定するためのサンプルを調製し、抗菌の対象となる菌Ｂに対してＭＩＣ値が１／１０以下となる「菌Ａに由来するサンプル」を選択するサンプル選択工程Ａ
工程８：カイコ感染モデルを使用して、上記工程７で選択されたサンプルの中から、抗菌の対象となる菌Ｂに対して抗菌治療効果があるサンプルを選択するサンプル選択工程Ｂ
【0013】
また、本発明は、更に、上記工程３より後に、以下の工程４を有する上記の抗菌剤の探索方法を提供するものである。
工程４：上記工程３で純化した菌Ａのコロニーを、固体培地上で純培養する工程
工程４：上記工程３で純化した菌Ａのコロニーを、固体培地上で純培養する工程
【0014】
また、本発明は、更に、上記工程４より後に、以下の工程５及び工程６を有する上記の抗菌剤の探索方法を提供するものである。
工程５：「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程４で菌Ａを純培養した固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する工程
工程６：上記純培養した菌Ａ上に形成した重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記純培養した菌Ａを中心として阻止円が形成されることを確認する工程
工程５：「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程４で菌Ａを純培養した固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する工程
工程６：上記純培養した菌Ａ上に形成した重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記純培養した菌Ａを中心として阻止円が形成されることを確認する工程
【0015】
また、本発明は、上記工程７において、及び／又は、上記工程７より後に、以下の工程ａ及び／又は工程ｂを行う前記の抗菌剤の探索方法を提供するものである。
工程ａ：難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒に転溶する工程
工程ｂ：カラム分画する工程
工程ａ：難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒に転溶する工程
工程ｂ：カラム分画する工程
【0016】
また、本発明は、更に、上記工程８より後に、以下の工程９を有する上記の抗菌剤の探索方法を提供するものである。
工程９：上記工程８で選択されたサンプルの中から、抗菌剤を分離して獲得する抗菌剤獲得工程
工程９：上記工程８で選択されたサンプルの中から、抗菌剤を分離して獲得する抗菌剤獲得工程
【発明の効果】
【0017】
本発明によれば、前記問題点や課題を解決し、初期の探索段階から、ヒトにおける体内動態まで加味した抗菌剤・抗生物質の探索が可能である。すなわち、カイコ感染モデルを使用して、カイコの死亡等を基に抗菌剤を選択すれば、治験等の後の段階で没になるもの（例えば治療効果のないもの等）を「抗菌剤候補」として最初から排除できるので、コストと時間が節約されて探索が効率的になる。
【0018】
更に、カイコ感染モデルを使用すれば、初期の探索段階から抗菌剤候補物質を単一物質に絞る必要がないため、単一物質への精製や構造決定は、治療効果まで含めて良好なものに絞られた後段階で行えばよく、その点からもコストと時間が節約される。
また、マウス等の脊椎動物（哺乳動物）に比べ、道義的に問題が少ないカイコを用いるので、多くのサンプルの評価が可能である。
また、マウス等の脊椎動物（哺乳動物）に比べ、道義的に問題が少ないカイコを用いるので、多くのサンプルの評価が可能である。
【0019】
カイコ感染モデルでは、複数種類の抗菌性化合物を有するサンプルや、不純物を含むサンプルのスクリーニング評価（探索）が可能である。この優位点を十分に生かすために、本発明では、該カイコ感染モデルでの評価に供するための特に好適な「サンプルを得る方法」を開発・採用した。
すなわち、本発明における阻止円を利用する方法は、上記の点からカイコ感染モデルに極めて良くマッチングしており、しかも、クルードの状態で多数の抗菌性物質を漏れなく捕捉するために、本発明において「工程１、２、３、７、８を有する方法」は極めて有効である。
すなわち、本発明における阻止円を利用する方法は、上記の点からカイコ感染モデルに極めて良くマッチングしており、しかも、クルードの状態で多数の抗菌性物質を漏れなく捕捉するために、本発明において「工程１、２、３、７、８を有する方法」は極めて有効である。
【0020】
本発明は、貧栄養の固体培地［土壌培地（Soil medium）］、重層固体培地形成［ソフトアガー重層法（Soft agar screening）］、カイコ感染モデル［カイコ生体内活性評価（Silkworm in vivo evaluation）］が相乗的に組み合わされて顕著な効果を奏するものである。
【0021】
更に、工程４、５及び６を組み合わせれば、上記マッチング性と特長を更に有するようになると共に、カイコ感染モデルによる評価に入る前に、効率よく複数の候補物質を分離できる。また、工程３までで仮に阻止円を形成しない菌Ａが混入してしまっていても、それらを除去でき、ノイズを減らすことができる。
【0022】
更に、工程ａ及び／又は工程ｂを組み合わせれば、例えば「自然免疫を抑制する物質」が「菌Ａの産生物質」に混入していた場合、該物質の除去ができる。すなわち、菌Ｂに対する抗菌活性と治療活性があるにもかかわらず、そこにカイコの自然免疫を抑制する物質が混入していることによって該カイコの自然免疫活性が下がり、そのため、その後に菌Ｂによって該カイコが死亡してしまうケースを排除することができる。言い換えれば、カイコによる治療効果の確認において、別要因でカイコを殺してしまうケースを排除することができる。
工程ａや工程ｂは、菌Ｂが細菌であっても真菌であっても行うことができるが、菌Ｂが真菌のときに上記ケースが現出することが多い。従って、工程ａ及び／又は工程ｂの追加は、菌Ｂが真菌のときに特に有効である。
工程ａや工程ｂは、菌Ｂが細菌であっても真菌であっても行うことができるが、菌Ｂが真菌のときに上記ケースが現出することが多い。従って、工程ａ及び／又は工程ｂの追加は、菌Ｂが真菌のときに特に有効である。
【0023】
本発明においては、土壌菌である菌Ａのコロニー自体を、病原菌等の菌Ｂの増殖が阻害されたときに形成される阻止円の中心物質（物体）とするので、その段階では、菌の単離も抗生物質の単離もしていない。
そのために、複数の菌Ａや該菌Ａの産生物（抗生物質）を同時並行でスクリーニングできると共に、探索の初期段階で菌Ａの特定も抗生物質の同定も行わないので、無駄がなくなり、コストと時間が節約できる。
そのために、複数の菌Ａや該菌Ａの産生物（抗生物質）を同時並行でスクリーニングできると共に、探索の初期段階で菌Ａの特定も抗生物質の同定も行わないので、無駄がなくなり、コストと時間が節約できる。
【0024】
従来の抗菌剤・抗生物質の探索法は、産生菌を単離し、該菌を液体培地で大量に純粋培養して、該産生物の抗菌活性を検出し、それからマウス等を用いて、体内動態・治療効果・薬効・副作用等を確認する。しかし、その方法では、複数の菌を並行して評価することも、複数の産生物質を並行して評価することもできず、その上探索の初期段階から精製・単一物質の単離を必要とするので、コストと時間の関係で、新規の抗菌剤の発見・探索に限界をもたらしていた。
現行のスクリーニングにおいて、土壌細菌をランダムに選択して培養し抽出液を調製した場合、後述するＭＩＣ値が１／１０以下となるサンプルを得るのは容易ではない。本発明は、工程１、２、３と言った初期の工程から、阻止円を形成する抗生物質生産菌を土壌等から集める、と言う技術思想を見出したことによってなされた。
現行のスクリーニングにおいて、土壌細菌をランダムに選択して培養し抽出液を調製した場合、後述するＭＩＣ値が１／１０以下となるサンプルを得るのは容易ではない。本発明は、工程１、２、３と言った初期の工程から、阻止円を形成する抗生物質生産菌を土壌等から集める、と言う技術思想を見出したことによってなされた。
【0025】
本発明の、工程１、２、３、７及び８を有する方法、更には、それらの工程に、「工程４、５及び６」及び／又は「工程９」を組み合わせた方法によれば、上記した従来法の欠点が全て解消され、極めて効率的に優れた抗菌剤を見出すことができる。
【0026】
本発明の、工程１、２、３、（４）、（５）、（６）、７、（ａ）、（ｂ）、８、及び、（９）を有する方法によれば（ここで、（ ）内は有すると好ましい態様）、探索初期における抗菌剤・抗生物質の種類が多く量が少なくてすむ（更に、混合物であってもよい）。まずは、優れた抗菌性物質を産生する菌Ａと該抗菌性物質の存在自体を確かめることを最優先としている。本発明は、その点に特化して、広範囲に漏れなくそれらを探索・選択することができる。
【0027】
実際にヒト等に使用することを考えると、抗菌剤は水溶性を有することが望ましい。
工程７で、抗菌剤を溶解して抽出する有機溶媒の種類や、その水との混合割合等を調整することで、水溶性を有する物質（抗菌剤）を抽出することができ、そこでも効率的にスクリーニングを行っている。
また、阻止円を形成したと言うことは、該阻止円形成の原因となる抗菌剤・抗生物質が水溶性を有すると言うことを意味する。従って、そこでも（工程３でも）、効率的にスクリーニングを行っている。
工程７で、抗菌剤を溶解して抽出する有機溶媒の種類や、その水との混合割合等を調整することで、水溶性を有する物質（抗菌剤）を抽出することができ、そこでも効率的にスクリーニングを行っている。
また、阻止円を形成したと言うことは、該阻止円形成の原因となる抗菌剤・抗生物質が水溶性を有すると言うことを意味する。従って、そこでも（工程３でも）、効率的にスクリーニングを行っている。
【0028】
具体的には、工程１を行うことによって、効率よく、広範囲に多数の評価ができると共に、従来は見落とされていた難培養菌やマイナーな菌も、見出す（選択する）ことが可能である。
また、工程２及び工程３では、「特定された単一の抗菌剤」による阻止円を形成させて（利用して）いるわけではないので、菌Ａも抗菌剤も特定することなしに、すなわち精製・特定を後回しにすることで、効率的な探索が可能となる。
また、工程２及び工程３では、「特定された単一の抗菌剤」による阻止円を形成させて（利用して）いるわけではないので、菌Ａも抗菌剤も特定することなしに、すなわち精製・特定を後回しにすることで、効率的な探索が可能となる。
【0029】
また、工程７では、ＭＩＣ値の小ささによる篩い分けが重要であるが、希釈倍率であるＭＩＣ値を考慮さえすれば、クルードの状態で「カイコ感染モデルを使用した評価段階」に進めるので、極めて効率的である。
また、工程８におけるカイコ感染モデルは、クルードのサンプルでも試験ができること、及び、道義的問題の少ないカイコを使用すること等に関係して、前記優れた効果を相乗的に発揮する。
また、工程８におけるカイコ感染モデルは、クルードのサンプルでも試験ができること、及び、道義的問題の少ないカイコを使用すること等に関係して、前記優れた効果を相乗的に発揮する。
【0030】
カイコ感染モデルでは、上述したように、探索初期の段階で「治療効果まである抗菌剤」のスクリーニング（探索）が可能であるため、治験等の検討後期の段階で、体内動態が悪い等が原因で没になる物質が減少する。従って、カイコ感染モデル自体が、抗菌剤・抗生物質の優れた探索方法ではある。
【0031】
本発明では、更に、「カイコ感染モデルによる試験」に供するサンプルの態様、及び、サンプルの取得・選択方法等について、検討し向上させた。前記した通り、本発明におけるサンプルの取得・選択方法（工程１から工程７まで）は、カイコ感染モデル用として、極めて良くマッチングしており、カイコ感染モデルの特長を最大限に生かしたものとなっている。従って、本発明によって、カイコ感染モデルがブラッシュアップされた。
【0032】
「カイコ感染モデルによる『治療効果まである抗菌剤』のスクリーニング（探索）」に使用するためのサンプルの選択方法として、本発明の工程１、２、３、（４、５、６）、７、（９）を用いたときと、カイコ感染モデルにはよるが本発明の上記工程を用いないときとの比較を図１に示す。
図１（ａ）（ｂ）（ｃ）は、探索に用いた母集団が、順に、「化合物ライブラリー」、「天然物」、「土壌」と言うように異なってはいるが、図１（ｃ）に示したように、本発明による「治療効果有の抗生物質」の発見確率は、図１（ａ）（ｂ）のそれを遥かに上回っており、本発明によって初めて現実性のある探索方法になったと言える。
図１（ａ）（ｂ）（ｃ）は、探索に用いた母集団が、順に、「化合物ライブラリー」、「天然物」、「土壌」と言うように異なってはいるが、図１（ｃ）に示したように、本発明による「治療効果有の抗生物質」の発見確率は、図１（ａ）（ｂ）のそれを遥かに上回っており、本発明によって初めて現実性のある探索方法になったと言える。
【0033】
具体的には、実施例でも記載する通り、黄色ブドウ球菌に対して阻止円を形成する７９１株（工程６まで）から、培養液アセトン抽出液を調製し、カイコにおいて治療効果を有する２０サンプル（工程８まで）を得ている（図１（ｃ））。
これは、化合物ライブラリーから探索した場合（図１（ａ））と比較して１０００倍、天然物から探索した場合（図１（ｂ））と比較して１０倍の発見確率である。
これは、化合物ライブラリーから探索した場合（図１（ａ））と比較して１０００倍、天然物から探索した場合（図１（ｂ））と比較して１０倍の発見確率である。
【0034】
また、実施例で記載する通り、大腸菌Ｗ３１１０に対して阻止円を形成する３２９株（工程６まで）から、培養液アセトン抽出液を調製し、カイコにおいて抗緑膿菌治療効果を有する１８サンプル（工程８まで）を得ている（図１（ｃ））。これまでは、グラム陰性菌に対して治療効果を有する物質は発見できなかった（図１（ａ））。従って、本発明は、抗グラム陰性菌治療効果物質を探索（スクリーニング）できる方法として有効である。
【0035】
本発明では、抗菌性の指針であるＭＩＣ値と共に、カイコ感染モデルを使用して治療効果まで加味して探索（スクリーニング）する。そのため、従来、治療効果があったにもかかわらず、例えば、若干ＭＩＣ値が大きい（分母が小さい）、すなわち若干抗菌性が低いために探索（スクリーング）から漏れてしまっていた菌Ａ（の産生物）（抗菌剤候補）を漏らさずピックアップすることができる。
また、本発明は、新規な抗菌剤が探索できるので、探索された抗菌剤は、既存の抗菌剤に対して耐性を得てしまった菌Ｂ（耐性菌Ｂ）に対しても抗菌性を示す可能性が高い。従って、本発明によれば、耐性菌用抗菌剤の探索ができる。
また、本発明は、新規な抗菌剤が探索できるので、探索された抗菌剤は、既存の抗菌剤に対して耐性を得てしまった菌Ｂ（耐性菌Ｂ）に対しても抗菌性を示す可能性が高い。従って、本発明によれば、耐性菌用抗菌剤の探索ができる。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】カイコ感染モデルを使用したときの「カイコに投与するサンプル」の選択（取得）形態の変化による抗菌性物質の発見効率の違いを示す表である。 （ａ）化合物ライブラリーからスタートしたときの工程１～８を有さない従来法での発見効率 （ｂ）天然物からスタートしたときの工程１～８を有さない従来法での発見効率 （ｃ）土壌からスタートしたときの工程１～８を有する本発明法での発見効率
【図2】本発明の好ましい態様の一例の工程フローである。
【図3】工程１で、貧栄養の固体培地上に形成された土壌菌Ａのコロニーの一例を示す写真である。
【図4】工程３で、黄色ブドウ球菌（菌Ｂ）に対して、土壌菌Ａのコロニーの周りに形成された阻止円の一例を示す写真である。
【図5】工程３で、大腸菌（菌Ｂ）に対して、土壌菌Ａのコロニーの周りに形成された阻止円の一例を示す写真である。
【図6】工程３で、パン酵母（菌Ｂ）に対して、土壌菌Ａのコロニーの周りに形成された阻止円の一例を示す写真である。
【図7】工程６で、黄色ブドウ球菌（菌Ｂ）に対して、土壌菌Ａのコロニーの周りに形成された阻止円の一例を示す写真である。
【図8】工程６で、大腸菌（菌Ｂ）に対して、土壌菌Ａのコロニーの周りに形成された阻止円の一例を示す写真である。
【図9】工程６で、パン酵母（菌Ｂ）に対して、土壌菌Ａのコロニーの周りに形成された阻止円の一例を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0037】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【0038】
本発明の抗菌剤の探索方法は、少なくとも以下の工程を有する。ただし、工程４ないし工程６、及び、工程９は必須ではないが、有することが好ましい。
工程１：滅菌処理を行った貧栄養の固体培地に、土壌の懸濁液の上清を広げて培養することによって該土壌に含有されている菌Ａのコロニーを形成させる土壌菌コロニー形成工程
工程２：「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程１で菌Ａのコロニーが形成された固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する重層固体培地形成工程
工程３：上記重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記コロニーを中心として形成された阻止円を見出し、該阻止円の略中央に存在する菌Ａのコロニーから菌Ａを選択採取し、菌Ａだけに純化する菌Ａの純化工程
工程４：上記工程３で純化した菌Ａのコロニーを、固体培地上で純培養する工程
工程５：「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程４で菌Ａを純培養した固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する工程
工程６：上記純培養した菌Ａ上に形成した重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記純培養した菌Ａを中心として阻止円が形成されることを確認する工程
工程７：菌Ａを液体培地の中で培養し、有機溶媒を加えて撹拌混合し、可溶分を乾固し、水を加えてＭＩＣ値を測定するためのサンプルを調製し、抗菌の対象となる菌Ｂに対してＭＩＣ値が１／１０以下となる「菌Ａに由来するサンプル」を選択するサンプル選択工程Ａ
工程８：カイコ感染モデルを使用して、上記工程６で選択されたサンプルの中から、抗菌の対象となる菌Ｂに対して抗菌治療効果があるサンプルを選択するサンプル選択工程Ｂ
工程９：上記工程７で選択されたサンプルの中から、抗菌剤を分離して獲得する抗菌剤獲得工程
工程１：滅菌処理を行った貧栄養の固体培地に、土壌の懸濁液の上清を広げて培養することによって該土壌に含有されている菌Ａのコロニーを形成させる土壌菌コロニー形成工程
工程２：「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程１で菌Ａのコロニーが形成された固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する重層固体培地形成工程
工程３：上記重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記コロニーを中心として形成された阻止円を見出し、該阻止円の略中央に存在する菌Ａのコロニーから菌Ａを選択採取し、菌Ａだけに純化する菌Ａの純化工程
工程４：上記工程３で純化した菌Ａのコロニーを、固体培地上で純培養する工程
工程５：「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程４で菌Ａを純培養した固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する工程
工程６：上記純培養した菌Ａ上に形成した重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記純培養した菌Ａを中心として阻止円が形成されることを確認する工程
工程７：菌Ａを液体培地の中で培養し、有機溶媒を加えて撹拌混合し、可溶分を乾固し、水を加えてＭＩＣ値を測定するためのサンプルを調製し、抗菌の対象となる菌Ｂに対してＭＩＣ値が１／１０以下となる「菌Ａに由来するサンプル」を選択するサンプル選択工程Ａ
工程８：カイコ感染モデルを使用して、上記工程６で選択されたサンプルの中から、抗菌の対象となる菌Ｂに対して抗菌治療効果があるサンプルを選択するサンプル選択工程Ｂ
工程９：上記工程７で選択されたサンプルの中から、抗菌剤を分離して獲得する抗菌剤獲得工程
【0039】
＜工程１＞
工程１は、滅菌処理を行った貧栄養の固体培地に、土壌Ｓの懸濁液の上清を広げて培養することによって該土壌Ｓに含有されている菌Ａのコロニーを形成させる土壌菌コロニー形成工程である。
なお、「菌Ａ」と記載したときの菌の種類は、同時に１種類であっても２種類以上であってもよい。土壌菌である「菌Ａ」を、抗菌の対象となる「菌Ｂ」と区別するために、「Ａ」と言う文字を用いただけであり、「菌Ａ」と記載したときの菌は、１種類に限定されず、複数種類でもよく、むしろ複数種類であることが、工程３までは又は工程６の前までは同時に存在することが好ましい。
上記「土壌Ｓの懸濁液」は、土壌Ｓに滅菌水を加えて調製した懸濁液が好ましい。
工程１は、滅菌処理を行った貧栄養の固体培地に、土壌Ｓの懸濁液の上清を広げて培養することによって該土壌Ｓに含有されている菌Ａのコロニーを形成させる土壌菌コロニー形成工程である。
なお、「菌Ａ」と記載したときの菌の種類は、同時に１種類であっても２種類以上であってもよい。土壌菌である「菌Ａ」を、抗菌の対象となる「菌Ｂ」と区別するために、「Ａ」と言う文字を用いただけであり、「菌Ａ」と記載したときの菌は、１種類に限定されず、複数種類でもよく、むしろ複数種類であることが、工程３までは又は工程６の前までは同時に存在することが好ましい。
上記「土壌Ｓの懸濁液」は、土壌Ｓに滅菌水を加えて調製した懸濁液が好ましい。
【0040】
上記固体培地としては、特に限定はないが、寒天培地が好ましい。
上記「貧栄養」とは、増殖速度の大きい菌が大きなコロニーを形成してしまって、増殖速度の小さい菌がコロニーを形成できない、と言うことが起らない（他の菌のコロニー形成を阻害しない）ような栄養分の少なさを言い、該固体培地を形成するときに積極的に所謂「栄養分」を加えないことを言う。
上記「貧栄養」とは、増殖速度の大きい菌が大きなコロニーを形成してしまって、増殖速度の小さい菌がコロニーを形成できない、と言うことが起らない（他の菌のコロニー形成を阻害しない）ような栄養分の少なさを言い、該固体培地を形成するときに積極的に所謂「栄養分」を加えないことを言う。
【0041】
従来のＹＭＥ寒天培地等の栄養培地を用いると、菌株による増殖速度の違いが著しく、大きなコロニーが形成されて他の菌株のコロニー形成が阻害される。また、単に栄養分の濃度を下げただけの場合には、現れるコロニーの種類が制限される場合がある。
貧栄養の固体培地を用いることによって、一度に多数の（好ましくは多種類の）コロニーを小さい状態で得ることが可能となった。その結果、工程３における阻止円の略中央に存在する物体（コロニー）として好適な形状となった。
貧栄養の固体培地を用いることによって、一度に多数の（好ましくは多種類の）コロニーを小さい状態で得ることが可能となった。その結果、工程３における阻止円の略中央に存在する物体（コロニー）として好適な形状となった。
【0042】
工程１で形成する菌Ａのコロニーの大きさは、平均直径０．５ｍｍ以上１０ｍｍ以下が好ましく、平均直径１ｍｍ以上５ｍｍ以下がより好ましく、平均直径２ｍｍ以上３ｍｍ以下が特に好ましい。
【0043】
菌Ａのコロニーが大き過ぎると、１つの容器（シャーレ等）で、少数のコロニー又は菌Ａしか評価できない、工程３で阻止円の好適な直径や形状が得られない等の場合がある。
一方、菌Ａのコロニーが小さ過ぎると、選択されるべきだった菌Ａが十分な量の抗菌剤を産生できず、工程３で阻止円を形成させることができない場合等がある。
一方、菌Ａのコロニーが小さ過ぎると、選択されるべきだった菌Ａが十分な量の抗菌剤を産生できず、工程３で阻止円を形成させることができない場合等がある。
【0044】
特に好ましい貧栄養の固体培地としては、土壌Ｒに水を加えて、よく撹拌混合して、オートクレーブ等を用いて滅菌処理を行い、その上清（以下、「土壌エキス」と記載することがある）に寒天等の固体培地材料を加え、固化させることにより得られたものが挙げられる。
本発明の抗菌剤の探索方法は、上記「貧栄養の固体培地」が、土壌エキスを含有するものであることが好ましい。
本発明の抗菌剤の探索方法は、上記「貧栄養の固体培地」が、土壌エキスを含有するものであることが好ましい。
【0045】
固体培地作製用の土壌Ｒとしては、探索対象である抗菌剤を産生する菌Ａが含有されている土壌Ｓとは、同じものでも異なるものでもよい。
特に限定はないが、１つのシャーレに異なる土壌Ｓ、Ｓ’、Ｓ”・・・の混合懸濁液の上清を広げてもよく、その場合は、土壌Ｒとしては、土壌Ｓ、Ｓ’、Ｓ”・・・の何れかと同一であることが好ましい。
１つのシャーレに１種の土壌Ｓの懸濁液の上清を広げた場合は、特に限定はないが、土壌Ｒとしては、土壌Ｓであることが特に好ましい。すなわち、同一の土壌を用いることが特に好ましい。
特に限定はないが、１つのシャーレに異なる土壌Ｓ、Ｓ’、Ｓ”・・・の混合懸濁液の上清を広げてもよく、その場合は、土壌Ｒとしては、土壌Ｓ、Ｓ’、Ｓ”・・・の何れかと同一であることが好ましい。
１つのシャーレに１種の土壌Ｓの懸濁液の上清を広げた場合は、特に限定はないが、土壌Ｒとしては、土壌Ｓであることが特に好ましい。すなわち、同一の土壌を用いることが特に好ましい。
【0046】
本発明において、「土壌」とは、天然に存在する全体としては固体状のものを言い、鉱物、岩石、砂等の無機物；生物の産生物、排泄物、死体、腐食物質等の有機物；石油、石油前段階物質、石油抗泉水、鉱泉水・温泉水、河川水、湖沼水、海水等の天然液体；生物（生体）；等の混合物を言う。地面に存在するものの他、河川、湖沼、海等の水の底に存在するものも含む。
【0047】
土壌には、その土壌特有の無機物や有機物が含有されているが、探索対象である抗菌剤を産生する菌Ａが含有されていた土壌Ｓと、固定培地の土壌エキスの原料である土壌Ｒとに含有される無機物や有機物が共通していると、菌Ａの培養環境として好適である。特に、ミネラル成分、微量元素成分、金属（イオン）成分、酸アルカリ成分等が同一であると、菌Ａの培養環境としてより好適であると考えられる。
それによって、土壌Ｓに含有される微量の菌Ａや、コロニーを作り難い菌Ａ等も、漏らさずにコロニー（すなわち、抗生物質産生物体）として使用し易いようにできる。
それによって、土壌Ｓに含有される微量の菌Ａや、コロニーを作り難い菌Ａ等も、漏らさずにコロニー（すなわち、抗生物質産生物体）として使用し易いようにできる。
【0048】
工程１における滅菌処理は、オートクレーブ処理等、公知の方法で（常法によって）行うことが可能である。
また、土壌Ｓに水を加えて調製した懸濁液の上清を広げて培養して土壌菌コロニー形成させることも公知の方法で行うことができる。
また、土壌Ｓに水を加えて調製した懸濁液の上清を広げて培養して土壌菌コロニー形成させることも公知の方法で行うことができる。
【0049】
すなわち、該上清は、滅菌生理食塩水、滅菌蒸留水、滅菌脱イオン水等で希釈して、上記培地上に広げることが好ましい。抗生物質生産菌を取得するという目的のためには、滅菌されている必要は必ずしもないが、滅菌されていない場合は、得られた生産菌が得られた経路が不明確となる。
希釈倍率は、土壌Ｓの懸濁液を作るときに加えた水の量（懸濁液の濃度）に依存するが、土壌Ｓと同質量の水を加えて懸濁液を作製したときに換算して、希釈倍率は、１０倍以上１００００倍以下が好ましく、５０倍以上５０００倍以下がより好ましく、１００倍以上２０００倍以下が特に好ましい。
希釈倍率は、土壌Ｓの懸濁液を作るときに加えた水の量（懸濁液の濃度）に依存するが、土壌Ｓと同質量の水を加えて懸濁液を作製したときに換算して、希釈倍率は、１０倍以上１００００倍以下が好ましく、５０倍以上５０００倍以下がより好ましく、１００倍以上２０００倍以下が特に好ましい。
【0050】
菌Ａのコロニーを形成させるための培養条件は、特に限定はないが、４℃以上４０℃以下が好ましく、２７℃以上３２℃以下が特に好ましい。また、培養の時間は、特に限定はないが、２４時間以上１２０時間以下が好ましく、４８時間以上９６時間以下が特に好ましい。
【0051】
＜工程２＞
工程２は、「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程１で菌Ａのコロニーが形成された固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する重層固体培地形成工程である。
工程２は、「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程１で菌Ａのコロニーが形成された固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する重層固体培地形成工程である。
【0052】
抗菌の対象となる菌Ｂは、病原性であることが好ましく、工程１～３における菌Ａとは異なり、通常は単一種類である。
本発明の「抗菌剤の探索方法」における菌Ｂは、病原性の微生物であることが好ましく、病原性の細菌又は真菌であることが特に好ましい。また、菌Ｂとしては、既存の抗菌剤に対して耐性を獲得していない菌は勿論のこと、耐性又は低・中程度の耐性を獲得した菌も、本発明における特に好ましい菌として挙げられる。
本発明の「抗菌剤の探索方法」における菌Ｂは、病原性の微生物であることが好ましく、病原性の細菌又は真菌であることが特に好ましい。また、菌Ｂとしては、既存の抗菌剤に対して耐性を獲得していない菌は勿論のこと、耐性又は低・中程度の耐性を獲得した菌も、本発明における特に好ましい菌として挙げられる。
【0053】
工程２における菌Ｂと、以下に示す工程８における菌Ｂとは、抗菌機構が類似していると考えられる場合には異なっていてもよい。有効な抗菌剤が共通していると考えられ、スクリーニング結果が類似若しくは同一と考えられるからである。
【0054】
上記工程１で菌Ａのコロニーを形成した固体培地の上に、重層固体培地を形成するための「菌Ｂを含有する重層液」を流し込むためには、重層液中に存在する菌Ｂが死なない温度で該重層液が液体である必要がある。そのため、ここで使用する寒天は、菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度では、菌Ｂ用の培地に加えた状態で液体であるような寒天であることが必須である。
【0055】
実際に流し込む際の重層液の温度は、「（寒天の融点若しくは）重層液の融点」以上であり、かつ、「菌Ｂが死なない最高温度」以下である。
ここで、「融点」とは、重層液をシャーレ等の容器に流し込めるだけの流動性を有する温度範囲のうちの最低温度のことを言う。
また、単に「寒天」と記載したときは、（寒天を精製等した）アガロースをも意味し、アガロースに他の物質が混合して所謂「寒天」となっている状態も含む。
ここで、「融点」とは、重層液をシャーレ等の容器に流し込めるだけの流動性を有する温度範囲のうちの最低温度のことを言う。
また、単に「寒天」と記載したときは、（寒天を精製等した）アガロースをも意味し、アガロースに他の物質が混合して所謂「寒天」となっている状態も含む。
【0056】
工程２及び／又は工程５における寒天は、菌Ｂが黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のように５６℃で生存できる菌である場合には、融点３０℃以上６０℃以下の寒天であることが好ましく、融点３０℃以上５６℃以下の寒天であることがより好ましく、融点３０℃以上５３℃以下の寒天であることが特に好ましい。
菌Ｂが上記黄色ブドウ球菌以外の菌、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）等のように４５℃で生存できるが５５℃では生存できない菌である場合には、融点２８℃以上５０℃以下の寒天であることが好ましく、融点３０℃以上４５℃以下の寒天であることが特に好ましい。
上記融点の範囲内の寒天であれば、菌Ｂを含有する重層液が、上記菌Ｂの不死亡条件と重層液の液体条件の両方を満足する。
菌Ｂが上記黄色ブドウ球菌以外の菌、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）等のように４５℃で生存できるが５５℃では生存できない菌である場合には、融点２８℃以上５０℃以下の寒天であることが好ましく、融点３０℃以上４５℃以下の寒天であることが特に好ましい。
上記融点の範囲内の寒天であれば、菌Ｂを含有する重層液が、上記菌Ｂの不死亡条件と重層液の液体条件の両方を満足する。
【0057】
例えば、菌Ｂが黄色ブドウ球菌の場合には、黄色ブドウ球菌は５８℃でも生きているので、融点が５６℃の寒天でも使用可能であるが、菌Ｂが大腸菌やパン酵母等場合には、大腸菌やパン酵母は、４５℃では死なないが５８℃では死ぬので、例えば、「融点が５６℃の寒天を用いて重層液の温度を５８℃にして」シャーレ等に流し込むと菌が死んでしまい、下記の工程で阻止円を形成させることはできない。
【0058】
上記条件を満足すれば、使用する寒天若しくはアガロースは、特に限定はないが、低融点アガロース、ソフトアガー等と言われているものが好適に用いられる。
以下、これらの寒天等を使用する工程２、工程５を、「ソフトアガー重層」と略記することがある。
以下、これらの寒天等を使用する工程２、工程５を、「ソフトアガー重層」と略記することがある。
【0059】
菌Ｂ用の培地に寒天を加えて得られた（そのときの温度では）液体状態である寒天培地は、オートクレーブ等で滅菌してから、菌Ｂを加えて重層液を調製することが、「抗菌の対象となる菌Ｂ」以外の菌を排除する点から好ましい。
【0060】
上記のようにして得られた重層液を、工程１で菌Ａのコロニーが形成された固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する。
流し込んだ後、冷却して重層固体培地を形成させるが、その後のインキュベーション温度（菌Ｂの増殖温度）で、固体状態若しくは流動性のない状態を保つように、重層液（や重層固体培地）の物性・濃度・組成を調整する。
流し込んだ後、冷却して重層固体培地を形成させるが、その後のインキュベーション温度（菌Ｂの増殖温度）で、固体状態若しくは流動性のない状態を保つように、重層液（や重層固体培地）の物性・濃度・組成を調整する。
【0061】
重層液によって得られた重層固体培地のみの厚さは、０．５ｍｍ以上１０ｍｍ以下が好ましく、１ｍｍ以上５ｍｍ以下がより好ましく、２ｍｍ以上３ｍｍ以下が特に好ましい。
重層固体培地の厚さが薄過ぎると、菌Ｂの量が不足して、シャーレ等の容器の中で一面に菌Ｂが増殖し難い場合があり、その場合には阻止円が観察できない場合がある。
一方、重層固体培地の厚さが厚過ぎると、生産菌から分泌された抗生物質が拡散により希釈され阻止円が観察できない場合がある。
重層固体培地の厚さが薄過ぎると、菌Ｂの量が不足して、シャーレ等の容器の中で一面に菌Ｂが増殖し難い場合があり、その場合には阻止円が観察できない場合がある。
一方、重層固体培地の厚さが厚過ぎると、生産菌から分泌された抗生物質が拡散により希釈され阻止円が観察できない場合がある。
【0062】
＜工程３＞
工程３は、上記重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記コロニーを中心として形成された阻止円を見出し、該阻止円の略中央に存在する菌Ａのコロニーから菌Ａを選択採取し、菌Ａだけに純化する菌Ａの純化工程である。なお、「菌Ａ」と記載したとき、該菌Ａは１種類でも複数種類でもよい。
工程３は、上記重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記コロニーを中心として形成された阻止円を見出し、該阻止円の略中央に存在する菌Ａのコロニーから菌Ａを選択採取し、菌Ａだけに純化する菌Ａの純化工程である。なお、「菌Ａ」と記載したとき、該菌Ａは１種類でも複数種類でもよい。
【0063】
工程３に先立って、菌Ｂを増殖させるためにインキュベーションを行う。その温度は、菌Ｂの種類にもよるが、４℃以上４０℃以下が好ましく、３０℃以上３７℃以下が特に好ましい。
該温度が低過ぎると、菌Ｂを一面に増殖させられず、阻止円ができない場合等がある。一方、該温度が高過ぎると、融点の低い寒天を用いた重層固体培地が流動性になってしまう場合、菌Ｂが増殖できず阻止円を観察できない場合等がある。
該温度が低過ぎると、菌Ｂを一面に増殖させられず、阻止円ができない場合等がある。一方、該温度が高過ぎると、融点の低い寒天を用いた重層固体培地が流動性になってしまう場合、菌Ｂが増殖できず阻止円を観察できない場合等がある。
【0064】
また、該インキュベーションの時間は、菌Ｂの種類にもよるが、６時間以上４８時間以下が好ましく、１２時間以上２４時間以下が特に好ましい。
該時間が短過ぎると、菌の増殖が不十分で阻止円が観察できない場合等があり、一方、該時間が長過ぎると、形成された阻止円が菌の増殖で観察できなくなる場合等がある。
該時間が短過ぎると、菌の増殖が不十分で阻止円が観察できない場合等があり、一方、該時間が長過ぎると、形成された阻止円が菌の増殖で観察できなくなる場合等がある。
【0065】
阻止円を見出したら、該阻止円の略中央に存在する「菌Ａのコロニー」から、菌Ａを選択採取する。採取した菌Ａに、少量の重層固体培地や、抗生物質非生産菌が存在してもよい。それらは以下の純化の工程で除去される。
【0066】
菌Ａの純化で用いる固体培地は、特に限定されず、ＹＭＥ寒天培地等の汎用のものが使用可能である。増殖条件も特に限定はなく、常法によって行うことができる。
【0067】
＜工程４＞
工程４は、上記工程３で純化した菌Ａのコロニーを、固体培地上で純培養する工程である。
工程４は、必須ではないが、抗菌性のない菌（阻止円を形成し得ない菌）が混入している場合等があるので、行うことが好ましい。なお、「工程４」又は「工程４～６」は繰り返すこともできる。
工程４は、上記工程３で純化した菌Ａのコロニーを、固体培地上で純培養する工程である。
工程４は、必須ではないが、抗菌性のない菌（阻止円を形成し得ない菌）が混入している場合等があるので、行うことが好ましい。なお、「工程４」又は「工程４～６」は繰り返すこともできる。
【0068】
工程４で用いる固体培地は、特に限定されず、ＹＭＥ寒天培地等の汎用のものが使用可能である。増殖条件も特に限定はなく、常法によって行うことができる。
【0069】
＜工程５＞
工程５は、「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程４で菌Ａを純培養した固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する工程である。
工程５は、「抗菌の対象となる菌Ｂ用の培地に、『該培地に加えた状態で該抗菌の対象となる菌Ｂが死なない少なくとも一点の温度』では液体状態であるような寒天を加えて得られた液体寒天培地」に、該抗菌の対象となる菌Ｂを加えて重層液を調製し、該重層液を、上記工程４で菌Ａを純培養した固体培地の上に流し込み冷却することによって重層固体培地を形成する工程である。
【0070】
前記した通り、工程３で選択採取した「菌Ａ」は、複数の菌種が混在している場合が多く、該複数種類の「菌Ａ」の中には、阻止円を形成しないものもある。なお、工程１で形成させた菌Ａのコロニーの中に、阻止円を形成し得ない菌Ａと阻止円を形成する菌Ａが混在していて、阻止円ができる場合もあると考えられる。
工程３の段階で、「阻止円を形成した菌Ａ」に混入していた「阻止円を形成し得ない菌Ａ」を排除するため等に工程５を行う。なお、「工程５、６」は繰り返すこともできる。
工程３の段階で、「阻止円を形成した菌Ａ」に混入していた「阻止円を形成し得ない菌Ａ」を排除するため等に工程５を行う。なお、「工程５、６」は繰り返すこともできる。
【0071】
工程５における、寒天の種類、重層液の調製条件、菌Ｂの種類、菌Ｂの濃度、温度条件、重層固体培地の厚さ、重層固体培地のインキュベーション条件等は、工程２と全く同一にする必要はないが、好ましい範囲等については、前記した工程２と同様である。
【0072】
＜工程６＞
工程６は、上記純培養した菌Ａ上に形成した重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記純培養した菌Ａを中心として阻止円が形成されることを確認する工程である。
工程６は、上記純培養した菌Ａ上に形成した重層固体培地の上で一面に増殖した抗菌の対象となる菌Ｂの面中に、上記純培養した菌Ａを中心として阻止円が形成されることを確認する工程である。
【0073】
工程６に先立って、菌Ｂを増殖させるためにインキュベーションを行うが、その条件は、工程３の前に行うインキュベーションの条件と同じでも異なっていてもよいが、その条件範囲については、前記した工程３の前に行うインキュベーションの条件範囲と同様である。
【0074】
本発明において、「菌Ａ」と記載したときの菌は、１種類に限定されず、複数種類の混合でもよいが、工程６によって、「菌Ｂに対して阻止円を形成しない菌Ａ」を排除し、菌Ｂに対して阻止円を形成する菌Ａのみを分離精製選択する。すなわち、工程３において選択採取されてしまった「抗菌剤を産生しない菌Ａ」を排除する。
【0075】
＜工程７＞
工程７は、菌Ａを液体培地の中で培養し、有機溶媒を加えて撹拌混合し、可溶分を乾固し、水を加えてＭＩＣ値を測定するためのサンプルを調製し、抗菌の対象となる菌Ｂに対してＭＩＣ値が１／１０以下となる「菌Ａに由来するサンプル」を選択するサンプル選択工程Ａである。工程７は、抗菌活性を評価し抗菌活性を指標にサンプルを選択する工程である。
工程７で用いる菌Ａは、工程３で阻止円を形成し（純化し）た菌Ａである。
工程７は、菌Ａを液体培地の中で培養し、有機溶媒を加えて撹拌混合し、可溶分を乾固し、水を加えてＭＩＣ値を測定するためのサンプルを調製し、抗菌の対象となる菌Ｂに対してＭＩＣ値が１／１０以下となる「菌Ａに由来するサンプル」を選択するサンプル選択工程Ａである。工程７は、抗菌活性を評価し抗菌活性を指標にサンプルを選択する工程である。
工程７で用いる菌Ａは、工程３で阻止円を形成し（純化し）た菌Ａである。
【0076】
工程７で用いる液体培地は、特に限定されず、公知のものが用いられる。また、工程１のように「貧栄養」ではなく、「栄養」であることが好ましい。好ましい液体培地としては、例えば、ＹＭＥ液体培地等が挙げられる。
【0077】
上記有機溶媒は、上記液体培地内に存在する取得目的成分である抗菌剤・抗生物質を溶解させるようなものならば特に限定はないが、（液体培地に含まれる）水に使用割合において相溶するもの、又は、水にある程度相溶するものが好ましい。
具体的には、アセトン、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）等のケトン；メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール；酢酸エチル等のエステル；クロロホルム等の塩素系溶媒；ヘキサン等の炭化水素；等が挙げられる。特に好ましくは、アセトン、メタノール、エタノール等である。
具体的には、アセトン、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）等のケトン；メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール；酢酸エチル等のエステル；クロロホルム等の塩素系溶媒；ヘキサン等の炭化水素；等が挙げられる。特に好ましくは、アセトン、メタノール、エタノール等である。
【0078】
ここでの「ＭＩＣ値」は、以下のように定義する。
工程７の前段階の工程で得られた菌Ａのコロニーを、ＹＭＥ液体培地２０ｍＬ中で、３０℃で４日間培養し、そこに同体積のアセトンを加え、遠心分離して上清を得る。該上清をエバポレーションによって固体成分を得て、そこに１ｍＬの純水を加えて溶解させ、得られた溶液を「ＭＩＣ値を測定するためのサンプル」とする。
次いで、該サンプル液を、希釈率１０倍を挟んで段階的に純水で希釈して、希釈率の異なる複数の試験液を調製し、抗菌の対象となる菌Ｂに対して、濁度の減少や生菌数の減少等を好適な方法により測定して、該試験液の抗菌性を測定する。
上記方法で得られた抗菌性を示す最大の希釈率の逆数、すなわち、「抗菌性を示す希釈率の逆数」の内の最小の値を、「ＭＩＣ値」と定義する。
工程７の前段階の工程で得られた菌Ａのコロニーを、ＹＭＥ液体培地２０ｍＬ中で、３０℃で４日間培養し、そこに同体積のアセトンを加え、遠心分離して上清を得る。該上清をエバポレーションによって固体成分を得て、そこに１ｍＬの純水を加えて溶解させ、得られた溶液を「ＭＩＣ値を測定するためのサンプル」とする。
次いで、該サンプル液を、希釈率１０倍を挟んで段階的に純水で希釈して、希釈率の異なる複数の試験液を調製し、抗菌の対象となる菌Ｂに対して、濁度の減少や生菌数の減少等を好適な方法により測定して、該試験液の抗菌性を測定する。
上記方法で得られた抗菌性を示す最大の希釈率の逆数、すなわち、「抗菌性を示す希釈率の逆数」の内の最小の値を、「ＭＩＣ値」と定義する。
【0079】
工程７では、上記のように定義された「ＭＩＣ値」が１／１０以下となるものを、「菌Ａに由来するサンプル」として選択する。すなわち、上記した「ＭＩＣ値を測定するためのサンプル」を１０倍以上希釈しても抗菌性を示すサンプルだけを選択する。
【0080】
なお、上記したサンプル液の調製方法や上記した抗菌性の測定方法は、本発明の「ＭＩＣ値」を定義する際の調製方法・測定方法であって、実際に本発明を実施する際のサンプルの調製方法や測定方法は、上記した「ＭＩＣ値の定義に用いた方法」に限定されないことは言うまでもない。すなわち、実際に実施した調製方法や測定方法の如何によらず、得られたものが「上記で定義されたＭＩＣ値」の範囲に入っていれば、本発明の技術的範囲に包含される。
【0081】
選択基準となるＭＩＣ値は、１／１０以下となる「菌Ａに由来するサンプル」を選択することが必須である。それは、サンプル５０μＬを血液量が５００μＬであるカイコ（使用する体重２ｇの５令カイコ）に注射した際に１０倍希釈される、という原理に基づいている。１／１０以下となるサンプルを全て選択する必要はないが、全て選択することが最も好ましい。
この段階から選択基準を厳しくしてもよく、その場合には、選択基準となるＭＩＣ値の閾値については、「１／１０００以上１／１０以下の値」以下のサンプルを選択することが好ましく、「１／５００以上１／１０以下の値」以下であることがより好ましく、「１／１００以上１／１０以下の値」であることが特に好ましい。
この段階から選択基準を厳しくしてもよく、その場合には、選択基準となるＭＩＣ値の閾値については、「１／１０００以上１／１０以下の値」以下のサンプルを選択することが好ましく、「１／５００以上１／１０以下の値」以下であることがより好ましく、「１／１００以上１／１０以下の値」であることが特に好ましい。
【0082】
上記値が小さ過ぎると、実際には優れた抗菌剤を工程７の段階でふるい落としてしまう場合、スクリーニングが厳し過ぎて工程８のカイコ感染モデルでの評価にまで至るまでにサンプル数が少なくなり過ぎる場合、等がある。一方、上記値が大き過ぎると、実用可能な抗菌性を有していないものまでも選択してしまう場合、スクリーニングが甘過ぎて工程８に供するサンプルにノイズが多くなってしまう場合、等がある。
【0083】
カイコに注射するサンプル液は、カイコの体液や体重を勘案して、約５０μＬが好ましい。感染治療実験に使用する５令１日目のカイコの血液（体液）は、１頭当たり約５００μＬである。従って、カイコの血液（体液）中で、該サンプル液は１／１０に希釈される。そのため、感染治療実験に用いるサンプルの抗菌活性は、ＭＩＣ値で１／１０以下である必要がある。それよりもＭＩＣ値が高いサンプルでは、治療効果を期待することができない。抗菌活性が体液由来の物質により促進される場合には、ＭＩＣ値が１／１０より大きくても治療効果が得られる場合があるが、そのような場合は特殊である。
【0084】
＜工程ａと工程ｂに共通＞
工程ａは、難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒に転溶する工程である。
工程ｂは、カラム分画する工程である。
工程ａ及び／又は工程ｂは、「上記工程７において、すなわち、上記工程７の中で」及び／又は「上記工程７より後に」行う。ここで、「上記工程７より後に行う」とは、上記工程７に続いて行うことの他に、下記する工程８の後に行うことも含まれる。
以下、「工程ａ及び／又は工程ｂ」を、工程ａと工程ｂの順番を問わず（逆にしてもよく）「工程ａｂ」と略記する場合がある。
工程ａは、難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒に転溶する工程である。
工程ｂは、カラム分画する工程である。
工程ａ及び／又は工程ｂは、「上記工程７において、すなわち、上記工程７の中で」及び／又は「上記工程７より後に」行う。ここで、「上記工程７より後に行う」とは、上記工程７に続いて行うことの他に、下記する工程８の後に行うことも含まれる。
以下、「工程ａ及び／又は工程ｂ」を、工程ａと工程ｂの順番を問わず（逆にしてもよく）「工程ａｂ」と略記する場合がある。
【0085】
工程ａｂは、工程７において、菌Ａを液体培地の中で培養し、アセトン等の有機溶媒を加えて撹拌混合し、可溶分を乾固し、水を加えて調製したサンプルで行ってもよく（以下、アセトンに限らずこの操作を単に「アセトン抽出」と略記する場合がある）；「有機溶媒を加えて撹拌混合し可溶分を乾固し水を加えて溶解させたサンプル」でＭＩＣ値を測定してから行ってもよい。
【0086】
工程ａ又は工程ｂを行うごとにＭＩＣ値を測定してもよいし、工程ａｂを行う前に、又は、工程ａｂを行った後に、ＭＩＣ値を測定してもよい。工程７において、工程ａｂを行ってからＭＩＣ値を測定することが好ましい。
また、工程ａ又は工程ｂを行うごとに工程８の治療効果を測定してもよいし、工程ａｂを行う前に、又は、工程ａｂを行った後に、工程８の治療効果を測定してもよい。
工程７のＭＩＣ値の測定、工程８の治療効果の測定は、工程７中や工程ａｂ中で頻繁に行えば、抗菌剤探索の精度が上がると共に、治療効果を期待できないサンプルを早い段階で見出すことで、後の工程を行うサンプル数が減り、時間の短縮につながる。
また、工程ａ又は工程ｂを行うごとに工程８の治療効果を測定してもよいし、工程ａｂを行う前に、又は、工程ａｂを行った後に、工程８の治療効果を測定してもよい。
工程７のＭＩＣ値の測定、工程８の治療効果の測定は、工程７中や工程ａｂ中で頻繁に行えば、抗菌剤探索の精度が上がると共に、治療効果を期待できないサンプルを早い段階で見出すことで、後の工程を行うサンプル数が減り、時間の短縮につながる。
【0087】
限定はされないが、好ましくは、以下が挙げられる。なお、以下、工程ａと工程ｂは一方しか書いてない場合は互いに置き換えることができるし、両方記載してある場合はその順番を逆にすることもできる。
アセトン抽出⇒工程ａ⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒工程ａ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒工程ａ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒ＭＩＣ値測定⇒工程ａ⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒ＭＩＣ値測定⇒工程ａ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８⇒工程ａ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８⇒工程ａ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８⇒工程ａ⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒工程ａ⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒工程ａ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒工程ａ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒ＭＩＣ値測定⇒工程ａ⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒ＭＩＣ値測定⇒工程ａ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８⇒工程ａ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８⇒工程ａ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
アセトン抽出⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８⇒工程ａ⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８
【0088】
限定はされないが、特に好ましくは、アセトン抽出⇒ＭＩＣ値測定⇒工程ａ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程ｂ⇒ＭＩＣ値測定⇒工程８である。
【0089】
本発明において、工程ａや工程ｂは、必須ではないが、行うことによって、工程８において、治療効果のあるサンプルを漏れなく常に拾えるようになる。すなわち、「感度」が上がる。
【0090】
「工程３又は工程６で得られたサンプル」の中や、「工程７において、有機溶媒を加えて撹拌混合し、可溶分を乾固し、水を加えてＭＩＣ値を測定するために調製したサンプル」の中には、カイコに対して「自然免疫を抑制する物質」、「毒性を有する物質」等が混入している可能性・場合があり、そのようなサンプルの場合には、該物質を除去するために、工程ａ及び／又は工程ｂを行うことが好ましい。
【0091】
そのようなサンプルの場合、続けて工程８で、カイコを用いて治療効果を確認しようとしても、菌Ｂのためではなく、上記物質のためにカイコが死亡してしまう場合がある。すなわち、菌Ｂに対して実際は治療活性があるにもかかわらず、そこに例えばカイコの自然免疫を下げる物質が混入していることによって、注射された菌Ｂによって該カイコが死亡してしまう場合が考えられる。工程ａ及び／又は工程ｂを行って、「自然免疫を抑制する物質」や「毒性を有する物質」を取り除けば、そのような場合を排除することができる。言い換えれば、カイコによる治療効果の確認において、別要因でカイコを殺してしまうケースを排除することができる。
【0092】
工程ａや工程ｂは、菌Ｂが細菌であっても真菌であっても行うことが可能であるが（実施例１参照）、特に菌Ｂが真菌のときには行うことが好ましい（実施例２参照）。
【0093】
＜工程ａ＞
工程ａは、難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒に転溶する工程である。
（アセトン等の）有機溶媒を加えて撹拌混合し、可溶分を乾固して得られた物に水を加えて調製したサンプルに対して、「難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒」を加えて、例えば撹拌して、「水」より「難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒」に溶解し易い物質を「難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒」に溶解させる。例えば、分液ロートや遠心分離で分液して、「難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒」層を分取する。
工程ａは、難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒に転溶する工程である。
（アセトン等の）有機溶媒を加えて撹拌混合し、可溶分を乾固して得られた物に水を加えて調製したサンプルに対して、「難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒」を加えて、例えば撹拌して、「水」より「難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒」に溶解し易い物質を「難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒」に溶解させる。例えば、分液ロートや遠心分離で分液して、「難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒」層を分取する。
【0094】
ここで、「難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒」としては、特に限定はないが、ｎ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール等のアルコール；メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、ｔｅｒｔ－ブチルメチルケトン等のケトン；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル；クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素系溶媒；ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素；トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素が挙げられる。
より好ましくは、ｎ－ブタノール、酢酸エチル、クロロホルム、トルエン等であり、特に好ましくは、ｎ－ブタノール等である。
より好ましくは、ｎ－ブタノール、酢酸エチル、クロロホルム、トルエン等であり、特に好ましくは、ｎ－ブタノール等である。
【0095】
抗菌剤は一般に油溶性が高く、（自然）免疫抑制剤は一般に水溶性が高いために、工程ａによって、水相に溶解している（自然）免疫抑制剤が除去され、「難水溶性若しくは非水溶性有機溶媒」に溶解している抗菌剤だけが得られるとも考えられる。
【0096】
＜工程ｂ＞
工程ｂは、カラム分画する工程である。
使用するカラムとしては、特に限定はないが、ＯＤＳのＣ８、Ｃ１８等が挙げられる。
溶出は、特に限定はされないが、アルコール系溶媒が好ましい。
工程ｂは、カラム分画する工程である。
使用するカラムとしては、特に限定はないが、ＯＤＳのＣ８、Ｃ１８等が挙げられる。
溶出は、特に限定はされないが、アルコール系溶媒が好ましい。
【0097】
＜工程８＞
工程８は、カイコ感染モデルを使用して、上記工程７で選択したサンプルの中から、抗菌の対象となる菌Ｂに対して抗菌治療効果があるサンプルを選択するサンプル選択工程Ｂである。
工程８は、カイコ感染モデルを使用して、上記工程７で選択したサンプルの中から、抗菌の対象となる菌Ｂに対して抗菌治療効果があるサンプルを選択するサンプル選択工程Ｂである。
【0098】
カイコ感染モデルは、カイコに、抗菌剤の候補となる物質を含有するサンプルと、該抗菌の対象となる菌とを投与し、カイコの死、カイコの変色、カイコの衰弱等を基準にして該抗菌剤の候補の中から抗菌剤（含有サンプル）をスクリーニングする方法である。
カイコ感染モデルは、例えば、特許文献１、２、及び、非特許文献１～３等に記載されており、明確に定義され、有効であることが分かっているものである。また、カイコ感染モデルによれば、ＬＤ５０、ＥＤ５０等が、マウス等の哺乳動物と類似することが確かめられている。
カイコ感染モデルは、例えば、特許文献１、２、及び、非特許文献１～３等に記載されており、明確に定義され、有効であることが分かっているものである。また、カイコ感染モデルによれば、ＬＤ５０、ＥＤ５０等が、マウス等の哺乳動物と類似することが確かめられている。
【0099】
カイコ感染モデルを使用して選択（スクリーニング）されたサンプルには、抗菌の対象となる菌Ｂに対して抗菌治療効果がある抗菌剤が含まれている。抗菌効果のみならず、工程８では、治療効果をも加味して選択（スクリーニング）がなされている。
【0100】
工程８の後に、前記した工程ａ及び／又は工程ｂを行うことも好ましい。また、工程ａ及び／又は工程ｂを行った後に（行うごとに）工程８を差し挟むことによって、治療効果の有無や自然免疫を阻害してカイコを殺していたか否か等を、その都度確認することもできる。「工程７より後に工程ａ及び／又は工程ｂを行う」と言う表現には、「工程８より後に工程ａ及び／又は工程ｂを行う」ことが含まれる。
【0101】
＜工程９＞
工程９は、上記工程８で選択されたサンプルの中から、抗菌剤を分離して獲得する「抗菌剤獲得工程」である。
工程９で分離獲得された抗菌剤は、工程８までに抗菌性でスクリーニングされているので、菌Ｂに対して抗菌治療効果がある抗菌剤である。
前記工程８で選択したサンプルの中には、抗菌剤以外にも菌Ｂに由来する物質が含有されており、工程８では、かかる「菌Ｂに由来する不要物質」等を除去する。該不要物質としては、例えば、生産菌の細胞内に存在していた様々な物質、培地由来の成分等が挙げられ、工程７において、水／有機溶媒に溶解してしまった物質等が挙げられる。
工程９は、上記工程８で選択されたサンプルの中から、抗菌剤を分離して獲得する「抗菌剤獲得工程」である。
工程９で分離獲得された抗菌剤は、工程８までに抗菌性でスクリーニングされているので、菌Ｂに対して抗菌治療効果がある抗菌剤である。
前記工程８で選択したサンプルの中には、抗菌剤以外にも菌Ｂに由来する物質が含有されており、工程８では、かかる「菌Ｂに由来する不要物質」等を除去する。該不要物質としては、例えば、生産菌の細胞内に存在していた様々な物質、培地由来の成分等が挙げられ、工程７において、水／有機溶媒に溶解してしまった物質等が挙げられる。
【0102】
抗菌剤を分離する方法は、特に限定はなく、例えば、有機溶媒による二層分配、有機溶媒沈殿、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣ、再結晶等を用いる。分離の確認も公知の方法が使用できる。
【0103】
本発明では、工程９までに、抗菌剤・抗生物質を単離する必要がないので、スクリーニングが極めて効率的である。また、工程９でも、例えばマウス等に投与するだけの抗菌剤・抗生物質の量を確保する必要がないので、スクリーニングが極めて効率的である。
すなわち、従来法に比べて、本発明は、最も重要な点である、「抗菌剤が存在すること自体」のスクリーニングが極めて効率的である。
すなわち、従来法に比べて、本発明は、最も重要な点である、「抗菌剤が存在すること自体」のスクリーニングが極めて効率的である。
【実施例】
【0104】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。
「実施例１」では、工程１～９の全てを行った実施例のみを記載し、また、使用する菌種は代表的なものだけであるが、本発明は、その要旨を超えない限りこの実施例１に限定されるものではない。
「実施例２」では、表９に示した工程を行った実施例のみを記載したが、本発明は、その要旨を超えない限りこの実施例２に限定されるものではない。
また、「％」は、それが物質の量に関するものであるときは、特に断りがない限り「質量％」を意味する。
「実施例１」では、工程１～９の全てを行った実施例のみを記載し、また、使用する菌種は代表的なものだけであるが、本発明は、その要旨を超えない限りこの実施例１に限定されるものではない。
「実施例２」では、表９に示した工程を行った実施例のみを記載したが、本発明は、その要旨を超えない限りこの実施例２に限定されるものではない。
また、「％」は、それが物質の量に関するものであるときは、特に断りがない限り「質量％」を意味する。
【0105】
実施例１
＜工程１＞
＜土壌エキスを含有する固体培地の作製、及び、菌Ａの培養（土壌菌コロニーの形成）＞
土壌Ｒの２Ｌに、水（ＲＯ水）２．５Ｌを加え、オートクレーブ処理（１２１℃、２０分）を行った。その後、遠心（８０００ｒｐｍ、５分）をして上清を得て、「土壌エキス」とした。
そこに、寒天（終濃度１．５質量％）を加え、オートクレーブ処理後、直径１０ｃｍのプラスチックシャーレに注ぎ込み、室温にて固化させた。こうして貧栄養の固体培地を調製した。
＜工程１＞
＜土壌エキスを含有する固体培地の作製、及び、菌Ａの培養（土壌菌コロニーの形成）＞
土壌Ｒの２Ｌに、水（ＲＯ水）２．５Ｌを加え、オートクレーブ処理（１２１℃、２０分）を行った。その後、遠心（８０００ｒｐｍ、５分）をして上清を得て、「土壌エキス」とした。
そこに、寒天（終濃度１．５質量％）を加え、オートクレーブ処理後、直径１０ｃｍのプラスチックシャーレに注ぎ込み、室温にて固化させた。こうして貧栄養の固体培地を調製した。
【0106】
土壌Ｓに等量の水（ＲＯ水）を加え、撹拌後５分放置し、上清を生理食塩水で１０００倍に希釈し、そこから１００μＬを、コンラージ棒で、上記固体培地（土壌Ｒの土壌エキス含有寒天培地）に広げ、３０℃にて４日間培養して、菌Ａの土壌菌コロニーを形成させた。
【0107】
土壌Ｒと土壌Ｓは、同一場所から採取したものを分割して使用したので、実質的に同一と考えられた。
【0108】
コロニーの大きさは、平均直径２ｍｍ以下となるように（上記のように）培養条件を調節・設定した結果、平均直径で、０．５ｍｍ～３ｍｍであった。
直径１０ｃｍのシャーレ中のコロニーの個数は、５０個～５００個であった。
直径１０ｃｍのシャーレ中のコロニーの個数は、５０個～５００個であった。
【0109】
＜工程２＞
＜重層固体培地の形成（菌Ａを含むソフトアガーの重層）＞
菌Ｂとして、黄色ブドウ球菌に対しては、ＬＢ７５培地（ＮａＣｌを７５ｇ／Ｌ含む）、大腸菌に対しては、ＬＢ１０培地（ＮａＣｌを１０ｇ／Ｌ含む）、パン酵母に対しては、ＹＰＤ培地に、それぞれ寒天（大腸菌及びパン酵母では低融点アガロース）８ｇ／Ｌを加えてオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）をし、下記の流し込み時の温度で液体の重層液（ソフトアガー）を得た。
黄色ブドウ球菌に用いた寒天の融点は、５５℃であり、大腸菌とパン酵母に用いた寒天の融点は、３５℃であった。
＜重層固体培地の形成（菌Ａを含むソフトアガーの重層）＞
菌Ｂとして、黄色ブドウ球菌に対しては、ＬＢ７５培地（ＮａＣｌを７５ｇ／Ｌ含む）、大腸菌に対しては、ＬＢ１０培地（ＮａＣｌを１０ｇ／Ｌ含む）、パン酵母に対しては、ＹＰＤ培地に、それぞれ寒天（大腸菌及びパン酵母では低融点アガロース）８ｇ／Ｌを加えてオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）をし、下記の流し込み時の温度で液体の重層液（ソフトアガー）を得た。
黄色ブドウ球菌に用いた寒天の融点は、５５℃であり、大腸菌とパン酵母に用いた寒天の融点は、３５℃であった。
【0110】
上記した３種の菌Ｂの順番で、それぞれ、５８℃、４５℃、及び、４５℃に冷却し、菌のフルグロースを、それぞれ、１／１００、１／４０、１／８０の体積で加えて撹拌して、それぞれの菌Ｂを含有する重層液を得た。
該重層液のそれぞれ１０ｍＬを、土壌菌のコロニーが形成された直径１０ｃｍのシャーレに流し込んだ。室温にて３０分以上静置して重層固体培地を得た。
その後、３０℃にて１日インキュベーションをした。
該重層液のそれぞれ１０ｍＬを、土壌菌のコロニーが形成された直径１０ｃｍのシャーレに流し込んだ。室温にて３０分以上静置して重層固体培地を得た。
その後、３０℃にて１日インキュベーションをした。
【0111】
＜工程３＞
＜阻止円の観察と阻止円を形成させた菌Ａの純化＞
上記インキュベーション後、阻止円の形成を観察した。阻止円の中央に存在する、抗菌剤・抗生物質の生産菌と考えられる菌Ａのコロニーから菌Ａを採取した。ここで、菌Ａとしては、１種類の菌であるとは限らない。
＜阻止円の観察と阻止円を形成させた菌Ａの純化＞
上記インキュベーション後、阻止円の形成を観察した。阻止円の中央に存在する、抗菌剤・抗生物質の生産菌と考えられる菌Ａのコロニーから菌Ａを採取した。ここで、菌Ａとしては、１種類の菌であるとは限らない。
【0112】
上記で採取した菌Ａには、少量の重層固体培地や抗生物質非生産菌が存在している可能性があるので、それらは以下の純化の工程で除去した。
菌Ａの純化で用いる固体培地としてＹＭＥ寒天培地を使用し、純化は常法に従って行った。
菌Ａの純化で用いる固体培地としてＹＭＥ寒天培地を使用し、純化は常法に従って行った。
【0113】
＜工程４＞
＜工程３で得られた菌Ａの純培養＞
工程３で得られたコロニー中の菌Ａを、ＹＭＥ寒天培地上で純培養した。
＜工程３で得られた菌Ａの純培養＞
工程３で得られたコロニー中の菌Ａを、ＹＭＥ寒天培地上で純培養した。
【0114】
＜工程５＞
＜純培養された菌Ａの上に菌Ｂを含むソフトアガーを重層した固体培地の形成＞
工程２で、「土壌菌のコロニーが形成された」に代えて、「菌Ａを純培養した」とした以外は、工程２と同様にして、純培養された菌Ａの上に菌Ｂを含むソフトアガーを重層した固体培地を形成した。
＜純培養された菌Ａの上に菌Ｂを含むソフトアガーを重層した固体培地の形成＞
工程２で、「土壌菌のコロニーが形成された」に代えて、「菌Ａを純培養した」とした以外は、工程２と同様にして、純培養された菌Ａの上に菌Ｂを含むソフトアガーを重層した固体培地を形成した。
【0115】
＜工程６＞
＜阻止円の観察＞
菌Ａの純培養のうち、一面に増殖した菌Ｂ中に阻止円を形成しないものが存在する場合があったので、そのようなものは排除し、阻止円を形成した菌Ａだけを選択した。
＜阻止円の観察＞
菌Ａの純培養のうち、一面に増殖した菌Ｂ中に阻止円を形成しないものが存在する場合があったので、そのようなものは排除し、阻止円を形成した菌Ａだけを選択した。
【0116】
＜工程７＞
＜ＭＩＣ値が小さいサンプルの選択（有機溶媒による抽出と得られたサンプル液のＭＩＣ値測定）＞
工程３で純化した抗菌剤・抗生物質の産生候補株を、ＹＭＥ液体培地２０ｍＬ中で３０℃にて、４日間振盪培養した。
得られた培養液に、アセトン２０ｍＬ（ＹＭＥ液体培地と等量）を加えて撹拌し、遠心（８０００ｒｍｐ、５分）して上清を得た。該上清を高速エバポレーター（Labconco社製）にて乾固（脱液、乾燥）させ、そこに水１ｍＬ（ミリＱ水（登録商標）１ｍＬ）を加えてボルテックスにより溶解させた。
ｐＨを５から８の間になるように、１０ＮのＮａＯＨにより調整し、ＭＩＣ値測定用のサンプル（液）とした。
＜ＭＩＣ値が小さいサンプルの選択（有機溶媒による抽出と得られたサンプル液のＭＩＣ値測定）＞
工程３で純化した抗菌剤・抗生物質の産生候補株を、ＹＭＥ液体培地２０ｍＬ中で３０℃にて、４日間振盪培養した。
得られた培養液に、アセトン２０ｍＬ（ＹＭＥ液体培地と等量）を加えて撹拌し、遠心（８０００ｒｍｐ、５分）して上清を得た。該上清を高速エバポレーター（Labconco社製）にて乾固（脱液、乾燥）させ、そこに水１ｍＬ（ミリＱ水（登録商標）１ｍＬ）を加えてボルテックスにより溶解させた。
ｐＨを５から８の間になるように、１０ＮのＮａＯＨにより調整し、ＭＩＣ値測定用のサンプル（液）とした。
【0117】
グラム陽性細菌である黄色ブドウ球菌関しては、工程７でも同じ菌株を使用したが、グラム陰性菌については、大腸菌で評価した。また、真菌であるパン酵母に関しては、工程７では、病原性真菌であるカンジダ菌（Candida albicans, ATCC10231）に変更した。
【0118】
上記サンプル（液）を、生理食塩水で２倍希釈系列により、１／２から１／２５６の８段階に希釈し、その５０μＬを、ミューラーヒントン培地（ＭＨ培地）で１／１０００に希釈した黄色ブドウ球菌、大腸菌、５０μＬと混合して、３７℃にて２４時間インキュベーションし、濁度の有無を目視で判定し、ＭＩＣ値を求めた。
【0119】
カンジダ菌については、５３０ｎｍでの吸光度が０．５となる菌の懸濁液を、１／１０００にＲＰＭＩ培地で希釈し、サンプル１００μＬと混合して、３７℃にて４８時間インキュベーションして濁度の有無を判定した。
【0120】
得られたＭＩＣ値が、１／１０以下の値を示したサンプル（液）を、次の工程である、カイコを用いた治療試験に選択した。すなわち、１０倍以上に希釈しても抗菌活性を示したサンプル液を選択した。そのような抗菌活性が一定以上であるサンプルを選択する理由は、用いる５令幼虫（体重２グラム）の体液が５００μＬであり、注射試験に用いるサンプル量が５０μＬであるため、注射直後にサンプルが１０倍に希釈され、ＭＩＣ値が１／１０以下でなければ治療効果が期待できないためである。この事情は、体液内物質により抗菌活性が促進されるような抗生物質に対してはあてはまらないが、そのような事例は例外的である。
【0121】
＜工程８＞
＜カイコ感染モデルでの治療試験（菌Ｂに対して抗菌治療効果があるサンプルの選択）＞
ＭＩＣ値が１／１０以下を示すサンプルについて、原液及び各種希釈液を調製し、治療試験（カイコ感染モデルによるスクリーニング（探索））に供した。上に述べた理由に基づき、希釈したサンプルのＭＩＣ値が１／１０より大きくならないようにした。
＜カイコ感染モデルでの治療試験（菌Ｂに対して抗菌治療効果があるサンプルの選択）＞
ＭＩＣ値が１／１０以下を示すサンプルについて、原液及び各種希釈液を調製し、治療試験（カイコ感染モデルによるスクリーニング（探索））に供した。上に述べた理由に基づき、希釈したサンプルのＭＩＣ値が１／１０より大きくならないようにした。
【0122】
工程２～６では、グラム陽性細菌については、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus, MSSA1株）を、グラム陰性細菌については大腸菌（Escherichia coli, W3110株）を、真菌についてはパン酵母（Saccharomyces cerevisiae, BY4741株）を用いたが、工程８の治療試験（カイコ感染モデルによるスクリーニング（探索））においては、それぞれ、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus, MSSA1株）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa, PAO1株）、及び、カンジダ菌（Candida albicans, ATCC10231）を用いた。
【0123】
５令カイコに、１匹あたり１ｇの人工餌を１日間与えた。使用したカイコの体重は平均２．０ｇであった。
【0124】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus, MSSA1株）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa, PAO1株）、及び、カンジダ菌（Candida albicans, ATCC10231）を、それぞれ液体培地中でフルグロースとなるまで培養し、生理食塩水で、それぞれ上記順番で、１／１０、１／１０００、及び、１／１に希釈して、５０μＬをカイコの血液内に注射した。
注射後、直ちに水（滅菌ミリＱ水）（「Milli-Q」は登録商標）で希釈した上記サンプル液を、５０μＬずつ、カイコの血液内に注射した。１群当りのカイコの総数は４匹とした。
注射後、直ちに水（滅菌ミリＱ水）（「Milli-Q」は登録商標）で希釈した上記サンプル液を、５０μＬずつ、カイコの血液内に注射した。１群当りのカイコの総数は４匹とした。
【0125】
黄色ブドウ球菌、緑膿菌、カンジダ菌、それぞれについて、注射後、２４～４８時間後にカイコの生死を判定し、生存曲線からＥＤ５０を算出した。
治療効果のネガティブコントロールには、０．９質量％ＮａＣｌを、ポジティブコントロールには、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、及び、カンジダ菌のそれぞれについて、その順番で、１００μｇ／ｍＬバンコマイシン、２ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び、１ｍｇ／ｍＬアムホテリシンＢを用いた。
治療効果のネガティブコントロールには、０．９質量％ＮａＣｌを、ポジティブコントロールには、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、及び、カンジダ菌のそれぞれについて、その順番で、１００μｇ／ｍＬバンコマイシン、２ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び、１ｍｇ／ｍＬアムホテリシンＢを用いた。
【0126】
それぞれの菌Ｂ（黄色ブドウ球菌（表１）、緑膿菌（表４）、カンジダ菌）に対して抗菌治療効果があるサンプルを選択した。
【0127】
菌Ｂが黄色ブドウ球菌の場合、カイコ感染モデルで治療効果が見られたサンプルについては、更に、複数の株のＭＲＳＡ（メシチリン耐性黄色ブドウ球菌）に対するＭＩＣ値も求めた（表２）。
ＭＲＳＡは、臨床で用いられている抗生物質に対して耐性を示すことが知られている。ＭＲＳＡが耐性を示す候補化合物は、既に臨床で使われている抗生物質と同様であるとみなすことができる。従って、ＭＲＳＡの中に耐性を示す株があるサンプルについては、この段階で新規抗生物質ではないと判定した。
ＭＲＳＡは、臨床で用いられている抗生物質に対して耐性を示すことが知られている。ＭＲＳＡが耐性を示す候補化合物は、既に臨床で使われている抗生物質と同様であるとみなすことができる。従って、ＭＲＳＡの中に耐性を示す株があるサンプルについては、この段階で新規抗生物質ではないと判定した。
【0128】
工程７まで使用した菌Ｂが黄色ブドウ球菌の場合、カイコ感染モデルで治療効果が見られたサンプルについては、更に、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）に対するＭＩＣ値も求めた（表３）。
【0129】
＜工程９＞
＜抗菌剤の分離・獲得＞
＜＜治療活性画分のＬＣ－ＭＳ分析＞＞
アセトン抽出画分に治療効果が見られたｔ４－１１について、ブタノール転溶し、Ｃ１８－ＯＤＳカラムのＨＰＬＣによる分取を行なった。
カイコの感染モデルで治療効果を示した画分（１８～１９分に溶出）について、更に、ＬＣ－ＭＳ（Waters社製、Xevo G2-XS Q-TOF）による分析を行なった。ＬＣでの各ピークの精密質量を求め、既知の抗生物質との比較をDictionary of Natural Productsにより行なった。
＜抗菌剤の分離・獲得＞
＜＜治療活性画分のＬＣ－ＭＳ分析＞＞
アセトン抽出画分に治療効果が見られたｔ４－１１について、ブタノール転溶し、Ｃ１８－ＯＤＳカラムのＨＰＬＣによる分取を行なった。
カイコの感染モデルで治療効果を示した画分（１８～１９分に溶出）について、更に、ＬＣ－ＭＳ（Waters社製、Xevo G2-XS Q-TOF）による分析を行なった。ＬＣでの各ピークの精密質量を求め、既知の抗生物質との比較をDictionary of Natural Productsにより行なった。
【0130】
［実施例１の結果］
実施例１の操作フローの概略を図２に示す。図２には、工程４～６（図２では「2nd screening」）を加えた「工程１ないし工程８の全体フロー」が示してあり、工程１～８の全てを行うと、全部で４回のスクリーニングを行ったことになる。
実施例１の操作フローの概略を図２に示す。図２には、工程４～６（図２では「2nd screening」）を加えた「工程１ないし工程８の全体フロー」が示してあり、工程１～８の全てを行うと、全部で４回のスクリーニングを行ったことになる。
【0131】
＜工程１＞
土壌Ｒに水を加えてオートクレーブし、その上清に寒天を加えることにより、貧栄養の土壌寒天培地を作製したが、この培地を使うことによって、一度に多数のコロニーを小さい状態で得ることが可能となった（図３）。
前記した通り、形成された菌Ａのコロニーの大きさは、土壌エキスを含有する貧栄養の固体培地を用いたため、阻止円形成の中心物体（抗生物質源）として十分に小さくでき、工程３において、大きさや個数等において好適に阻止円が観察でき、阻止円の中心から菌Ａを採取できた（図４～６）。
一方、従来のＹＭＥ寒天培地等の栄養培地を用いたところ、菌株による増殖速度の違いが著しく、大きなコロニーが形成されてしまい、他の菌株のコロニー形成が阻害された（図示せず）。また、単に栄養濃度を下げただけの場合には、現れるコロニーの種類が制限された。
土壌Ｒに水を加えてオートクレーブし、その上清に寒天を加えることにより、貧栄養の土壌寒天培地を作製したが、この培地を使うことによって、一度に多数のコロニーを小さい状態で得ることが可能となった（図３）。
前記した通り、形成された菌Ａのコロニーの大きさは、土壌エキスを含有する貧栄養の固体培地を用いたため、阻止円形成の中心物体（抗生物質源）として十分に小さくでき、工程３において、大きさや個数等において好適に阻止円が観察でき、阻止円の中心から菌Ａを採取できた（図４～６）。
一方、従来のＹＭＥ寒天培地等の栄養培地を用いたところ、菌株による増殖速度の違いが著しく、大きなコロニーが形成されてしまい、他の菌株のコロニー形成が阻害された（図示せず）。また、単に栄養濃度を下げただけの場合には、現れるコロニーの種類が制限された。
【0132】
＜工程２、工程３＞
カイコ感染モデルで、カイコの血液内に注射した試験サンプル液の治療効果を知るためには、十分に高い「抗菌活性を有するサンプル液」を用意する必要がある。なぜなら、体重２ｇのカイコには５００μＬの血液があり、通常用いている注射量５０μＬの条件では、注射後直ちに１０倍に希釈されてしまうからである。
従って、抗菌活性が治療の原因である場合には、ＭＩＣ値が１／１０以下である必要がある。さもなければ、注射直後の血液による１０倍の希釈により抗菌活性が見られなくなってしまうからである。
カイコ感染モデルで、カイコの血液内に注射した試験サンプル液の治療効果を知るためには、十分に高い「抗菌活性を有するサンプル液」を用意する必要がある。なぜなら、体重２ｇのカイコには５００μＬの血液があり、通常用いている注射量５０μＬの条件では、注射後直ちに１０倍に希釈されてしまうからである。
従って、抗菌活性が治療の原因である場合には、ＭＩＣ値が１／１０以下である必要がある。さもなければ、注射直後の血液による１０倍の希釈により抗菌活性が見られなくなってしまうからである。
【0133】
実際のスクリーニングにおいて、ＭＩＣ値が１／１０以下のサンプルを多数得るのは容易ではない。土壌細菌をランダムに選択して培養し、アセトン抽出液を調製した場合、ＭＩＣ値が１／１０以下となるサンプルを得るのは困難であるため、阻止円を形成する抗生物質生産菌を土壌から集める、という本発明に至ったのである。
【0134】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus, MSSA1株）、大腸菌（Escherichia coli, W3110株）、及び、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae, BY4741株）を含むソフトアガーを、「土壌Ｒ寒天固体培地上の土壌菌Ａのコロニー」の上に重層し、インキュベーションすると、何れの菌でも、阻止円が見出された（図４～図６）。
該阻止円の中心からは、好適に「阻止円を形成する菌Ａ」が採取できた（菌Ａは混合物の場合がある）。
該阻止円の中心からは、好適に「阻止円を形成する菌Ａ」が採取できた（菌Ａは混合物の場合がある）。
【0135】
＜工程４、５、６＞
実施例１の工程６で観察された（得られた）阻止円を形成した菌Ａは、黄色ブドウ球菌では７９１株であり、大腸菌では３２９株であり、パン酵母では４３３株であった。
実施例１の工程６で観察された（得られた）阻止円を形成した菌Ａは、黄色ブドウ球菌では７９１株であり、大腸菌では３２９株であり、パン酵母では４３３株であった。
【0136】
＜工程７＞
グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌では、阻止円を形成した７９１株の２９％に当たる２２９株（サンプル）が、ＭＩＣ値１／１０以下を示した。
グラム陰性菌である大腸菌では、阻止円を形成した３２９株の８．２％に当たる２７株（サンプル）がＭＩＣ値１／８以下を示した。
真菌では、パン酵母で阻止円を形成した４３３株の３４％に当たる１４７株（サンプル）が、病原性真菌であるカンジダ菌（Candida albicans, ATCC10231）に対して、ＭＩＣ値１／１０以下を示した。
グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌では、阻止円を形成した７９１株の２９％に当たる２２９株（サンプル）が、ＭＩＣ値１／１０以下を示した。
グラム陰性菌である大腸菌では、阻止円を形成した３２９株の８．２％に当たる２７株（サンプル）がＭＩＣ値１／８以下を示した。
真菌では、パン酵母で阻止円を形成した４３３株の３４％に当たる１４７株（サンプル）が、病原性真菌であるカンジダ菌（Candida albicans, ATCC10231）に対して、ＭＩＣ値１／１０以下を示した。
【0137】
＜工程８＞
＜＜黄色ブドウ球菌＞＞
カイコ感染モデルにおいて治療効果を示す２０サンプルが得られた（表１）。
更に、それらについて、「８種のＭＲＳＡ」に対してＭＩＣ値を求め、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１）と比較した。
その結果、１１サンプルについては、耐性を示すＭＲＳＡ株がないことが判明した（表１、表２）。
＜＜黄色ブドウ球菌＞＞
カイコ感染モデルにおいて治療効果を示す２０サンプルが得られた（表１）。
更に、それらについて、「８種のＭＲＳＡ」に対してＭＩＣ値を求め、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ１）と比較した。
その結果、１１サンプルについては、耐性を示すＭＲＳＡ株がないことが判明した（表１、表２）。
【0138】
【表1】
【0139】
【表2】
【0140】
この結果は、これらの１１サンプルについては、新規抗生物質であるか、既に抗ＭＲＳＡ感染治療薬として臨床で使われているか、又は、開発中の抗生物質であることを示唆している。これらの１１サンプルについては、本発明において、少なくとも独立に得られた新規抗菌剤（新規抗生物質）の候補である。
以上より、本発明は、耐性菌を含め、抗生物質の探索方法として優れていることが分かった。
以上より、本発明は、耐性菌を含め、抗生物質の探索方法として優れていることが分かった。
【0141】
カイコ感染モデル（ＭＳＳＡ１感染モデル）で治療効果を示した２０サンプルのうち、４サンプル（sample NO.6-39、6-40、10-27、14-7）は、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）に対して高い抗菌活性を示した（表１、表３）。
以上より、本発明は、グラム陽性菌全体に対して、抗菌剤・抗生物質の探索方法として優れていることが分かった。
以上より、本発明は、グラム陽性菌全体に対して、抗菌剤・抗生物質の探索方法として優れていることが分かった。
【0142】
【表3】
【0143】
黄色ブドウ球菌に対して阻止円を形成する７９１株から、ＭＩＣ値１／１０以下の２２６サンプルが得られ、カイコにおいて治療効果を有する２０サンプルを得た（表１、表６、図１（ｃ））。
この結果は、化合物ライブラリーから従来法で探索した場合と比較して１０００倍、天然物から従来法で探索した場合と比較して１０倍の発見効率である（図１（ａ）（ｂ）（ｃ））。本発明で、阻止円形成法を取り入れたことにより、抗菌活性が高い多くのサンプルの取得が容易になったことが主な原因として挙げられる。
この結果は、化合物ライブラリーから従来法で探索した場合と比較して１０００倍、天然物から従来法で探索した場合と比較して１０倍の発見効率である（図１（ａ）（ｂ）（ｃ））。本発明で、阻止円形成法を取り入れたことにより、抗菌活性が高い多くのサンプルの取得が容易になったことが主な原因として挙げられる。
【0144】
＜＜緑膿菌＞＞
緑膿菌ＰＡＯ１に対して治療効果を示したサンプルの抗菌活性、菌種、工程８で選択された治療活性物質のブタノール転溶性について表４に示す。
カイコ感染モデル（工程８）において、緑膿菌に対して治療効果を示す１８サンプルが得られた（表４）。
表４に示した１８サンプルは、緑膿菌接種の１日前にカイコに投与することで、全て顕著な治療効果を示した（表４内には示さず）。この結果は、これらのサンプルの治療活性がカイコの免疫活性化効果によることを意味している。
緑膿菌ＰＡＯ１に対して治療効果を示したサンプルの抗菌活性、菌種、工程８で選択された治療活性物質のブタノール転溶性について表４に示す。
カイコ感染モデル（工程８）において、緑膿菌に対して治療効果を示す１８サンプルが得られた（表４）。
表４に示した１８サンプルは、緑膿菌接種の１日前にカイコに投与することで、全て顕著な治療効果を示した（表４内には示さず）。この結果は、これらのサンプルの治療活性がカイコの免疫活性化効果によることを意味している。
【0145】
【表4】
【0146】
表５に、カイコ感染モデル（工程８）において、緑膿菌に対して治療効果を示した１０サンプルについて、アセトン抽出画分、ブタノール転溶画分、活性の収率を示した。
【0147】
【表5】
【0148】
大腸菌Ｗ３１１０に対して阻止円を形成する３２９株から、ＭＩＣ値１／８以下の２７サンプルが得られ、カイコにおいて抗緑膿菌治療効果を有する１８サンプルが得られた（表４、図１（ｃ））。
これまで、従来法ではグラム陰性菌に対する治療効果物質を発見できなかった（図１（ａ））。本発明の阻止円形成法は、抗グラム陰性菌治療効果物質を発見できる方法として有効であることが示された。
これまで、従来法ではグラム陰性菌に対する治療効果物質を発見できなかった（図１（ａ））。本発明の阻止円形成法は、抗グラム陰性菌治療効果物質を発見できる方法として有効であることが示された。
【0149】
＜＜真菌＞＞
真菌であるカンジダ菌について、ＭＩＣ値が１／１０以下となるサンプルとして１４７サンプルであったが、その後増えて２３２サンプルが得られている。それらの中から、カイコ感染モデルを用いて治療効果を示すサンプルを探索（スクリーニング）することができる。
真菌の評価については、実施例２として後述する。
真菌であるカンジダ菌について、ＭＩＣ値が１／１０以下となるサンプルとして１４７サンプルであったが、その後増えて２３２サンプルが得られている。それらの中から、カイコ感染モデルを用いて治療効果を示すサンプルを探索（スクリーニング）することができる。
真菌の評価については、実施例２として後述する。
【0150】
＜工程９＞
＜＜黄色ブドウ球菌＞＞
ＭＲＳＡ株が耐性を示さないと判定した１１サンプルのうちの１０サンプルについて、ブタノール転溶画分の治療効果を試験した結果、６サンプル（sample NO.14-7、t4-11、t5-2、t5-3、t5-18、t5-32）について、治療効果物質がブタノールに転溶することが分かった（表１、項目「ブタノール転溶」）。
＜＜黄色ブドウ球菌＞＞
ＭＲＳＡ株が耐性を示さないと判定した１１サンプルのうちの１０サンプルについて、ブタノール転溶画分の治療効果を試験した結果、６サンプル（sample NO.14-7、t4-11、t5-2、t5-3、t5-18、t5-32）について、治療効果物質がブタノールに転溶することが分かった（表１、項目「ブタノール転溶」）。
【0151】
ブタノール転溶する物質は、ＨＰＬＣ等の有機溶媒中での精製操作が可能であり、精製が容易であると考えられる。更に、これら６サンプルについて、ＨＰＬＣによる分析を実施した。
【0152】
sample NO.t5-32は、ＨＰＬＣの溶出時間及びＵＶ吸収パターンから、既知の治療薬であるライソシンＥ（特許文献３～７、非特許文献４～６）が含まれていることが判明した。既知の優れた抗生物質を探索できたことにより、本願発明が抗菌剤・抗生物質の探索に有力であることを示している。
【0153】
sample NO.t5-2、t5-3、t5-18は、ＨＰＬＣ分析における吸収パターンが一致していること、生産菌の種が同一（Streptomyces capoamus）であることから、同じ生産菌由来の物質であることが示唆された。これらは、何れも新規抗菌剤・抗生物質である可能性がある。
【0154】
sample NO.t4-11については、アセトン抽出画分をブタノール転溶し、Ｃ１８カラムによるＨＰＬＣで、溶出時間１分間隔で分画し、それぞれの画分のカイコ感染モデルでの治療活性を検討した。
その結果、１８から１９分に溶出する画分に治療活性が見出された。更に、この画分をＬＣ－ＭＳで分析し、出現した各ピークの精密質量を求めた結果、既に治療効果を示す抗生物質として報告のある、WAP-8294 A1、及び、WAP-8294 A2と一致した質量であることが判明した。既知の優れた抗生物質を探索できたことにより、本願発明が抗菌剤・抗生物質の探索に有力であることが示された。
その結果、１８から１９分に溶出する画分に治療活性が見出された。更に、この画分をＬＣ－ＭＳで分析し、出現した各ピークの精密質量を求めた結果、既に治療効果を示す抗生物質として報告のある、WAP-8294 A1、及び、WAP-8294 A2と一致した質量であることが判明した。既知の優れた抗生物質を探索できたことにより、本願発明が抗菌剤・抗生物質の探索に有力であることが示された。
【0155】
＜＜緑膿菌＞＞
治療効果を示した１８サンプルについて、ブタノール転溶画分の治療効果を試験し、１２サンプル（sample NO.w2-19、w2-25、w2-26、w3-9、w6-13、w7-16、w7-29、w8-11、w16-2, w16-10, w17-7, w17-10）に治療効果が示唆された（表１、項目「ブタノール転溶」）。
治療効果を示した１８サンプルについて、ブタノール転溶画分の治療効果を試験し、１２サンプル（sample NO.w2-19、w2-25、w2-26、w3-9、w6-13、w7-16、w7-29、w8-11、w16-2, w16-10, w17-7, w17-10）に治療効果が示唆された（表１、項目「ブタノール転溶」）。
【0156】
実施例２
＜真菌で工程ａ及び工程ｂを行った実施例＞
実施例１で結果を示した通り、菌Ｂが細菌である黄色ブドウ球菌の場合は、以下の表６のような結果が得られた。なお、阻止円を形成した菌は、前記した通り、工程４、５、６を行い、阻止円が形成されることを確認したものを（工程６の後に）数えた。
＜真菌で工程ａ及び工程ｂを行った実施例＞
実施例１で結果を示した通り、菌Ｂが細菌である黄色ブドウ球菌の場合は、以下の表６のような結果が得られた。なお、阻止円を形成した菌は、前記した通り、工程４、５、６を行い、阻止円が形成されることを確認したものを（工程６の後に）数えた。
【0157】
【表6】
【0158】
それに対し、菌Ｂを、真菌であるカンジダ属の菌（Candida albicans, ATCC10231）に代えた以外は実施例１と同様に評価探索した結果、すなわち、工程ａも工程ｂも行わずに評価探索した結果、以下の表７のような結果が得られた。なお、「阻止円を形成した菌」は、工程４、５、６を行い、阻止円が形成されることを確認したものを（すなわち、工程６の後に）数えた。
【0159】
【表7】
【0160】
表７の結果から、カンジダ（菌Ｂ）に対する治療薬のスクリーニング（結果：０サンプル）では、（ＭＩＣ値が１／１０以下であり、かつ）抗菌治療効果がある物質が工程７までのサンプル中に存在していたとしても、該サンプル中に、同時に免疫抑制物質や毒性物質等が含有されていて、それによってカイコが死亡するため、カイコ感染モデルでの真の抗菌治療効果が見えていない場合もあると考えられた。
【0161】
実際に、カンジダ菌を用いた場合、以下の表８の結果が得られた。
実施例１の工程８の項に記載した通り、液体培地中でフルグロースとなるまで培養し、生理食塩水で希釈して、５０μＬをカイコの血液内に注射した。注射後、直ちに、滅菌ミリＱ水で希釈したサンプル液を、５０μＬずつ、カイコの血液内に注射した。
実施例１の工程８の項に記載した通り、液体培地中でフルグロースとなるまで培養し、生理食塩水で希釈して、５０μＬをカイコの血液内に注射した。注射後、直ちに、滅菌ミリＱ水で希釈したサンプル液を、５０μＬずつ、カイコの血液内に注射した。
【0162】
すなわち、実施例１で菌Ｂがカンジダ菌の場合には、表８に示す結果が得られた。
なお、表８中「＋」は工程８でカイコに注射したことを示し、「－」はカイコに注射しなかったことを示す。「○」は全数（例えば３）生存、「×」は半数以上死亡したことを示す。
なお、表８中「＋」は工程８でカイコに注射したことを示し、「－」はカイコに注射しなかったことを示す。「○」は全数（例えば３）生存、「×」は半数以上死亡したことを示す。
【0163】
【表8】
【0164】
カンジダ菌を注射しなければ、１日目も２日目も生存していた（Ｎｏ．Ａ、Ｃ）。
一方、カンジダ菌を注射した場合、２日目は、サンプル注射の如何に依らず死亡したが（Ｎｏ．Ｂ、Ｄ）、１日目は、むしろ、サンプル注射なしでは生存していたが（Ｎｏ．Ｂ）、サンプル注射ありでは死亡した（Ｎｏ．Ｄ）。
これは、サンプルの中に、抗菌治療効果がある物質が存在していたとしても、そこに同時に含有されていた自然免疫抑制物質や毒性物質等が働き、それによってカイコが死亡した可能性を示唆している。すなわち、サンプル中の自然免疫抑制物質がカイコの自然免疫を抑制し、そのため、該カイコは、カンジダ菌によって死亡した可能性があると考えられた。
一方、カンジダ菌を注射した場合、２日目は、サンプル注射の如何に依らず死亡したが（Ｎｏ．Ｂ、Ｄ）、１日目は、むしろ、サンプル注射なしでは生存していたが（Ｎｏ．Ｂ）、サンプル注射ありでは死亡した（Ｎｏ．Ｄ）。
これは、サンプルの中に、抗菌治療効果がある物質が存在していたとしても、そこに同時に含有されていた自然免疫抑制物質や毒性物質等が働き、それによってカイコが死亡した可能性を示唆している。すなわち、サンプル中の自然免疫抑制物質がカイコの自然免疫を抑制し、そのため、該カイコは、カンジダ菌によって死亡した可能性があると考えられた。
【0165】
もしそうであれば、抗真菌活性物質と毒性物質の分離工程を加えることで、特に真菌に対する抗菌治療効果を有する物質の発見効率を上げることができるはずである。そこで、以下の検討を行った。
【0166】
具体的には、実施例１では、アセトン抽出画分（アセトン可溶分）を、工程７で抗真菌活性（ＭＩＣ値）測定に用いており、工程８で抗菌治療効果の試験に用いていたが、実施例２では、該「アセトン抽出画分（アセトン可溶分）」に対し、更に、工程ａとして「ブタノール転溶」、及び、工程ｂとして「ＯＤＳカートリッジカラムによる分画」の２段階の精製工程を追加した（表９参照）。
【0167】
下記表９では、上の行から下の行に向けて、その順で操作（試験）を行った。表９に記載していない操作（内容）は、前記した実施例１とほぼ同様に試験を行った。菌Ｂとしては、カンジダ属の菌（Candida albicans, ATCC10231）を用いた。
【0168】
【表9】
【0169】
＜＜菌Ｂ（カンジダ菌）に対する菌Ａの選択＞＞
前記した通り、菌Ｂが真菌であるカンジダ菌の場合には、工程７の後に２３２サンプルだったところ、工程８の後に０サンプルとなった。そこで、工程７の後に残った上記２３２サンプルの中から、以下２つの条件を満たす菌を１０個選択した。これら１０個の菌を、それぞれ、「＃１」ないし「＃１０」とする（表１０参照）
前記した通り、菌Ｂが真菌であるカンジダ菌の場合には、工程７の後に２３２サンプルだったところ、工程８の後に０サンプルとなった。そこで、工程７の後に残った上記２３２サンプルの中から、以下２つの条件を満たす菌を１０個選択した。これら１０個の菌を、それぞれ、「＃１」ないし「＃１０」とする（表１０参照）
【0170】
＜＜＜条件１＞＞＞
工程７において、アセトン抽出サンプルの抗カンジダ活性が高い（ＭＩＣ値が小さい（ＭＩＣ値の分母が大きい））。
＜＜＜条件２＞＞＞
工程８において、カイコにおける治療効果試験にて、コントロールのカンジダだけを注射した群が全数生存しているとき、サンプルとカンジダの両方を注射した群が半数以上死亡する。
工程７において、アセトン抽出サンプルの抗カンジダ活性が高い（ＭＩＣ値が小さい（ＭＩＣ値の分母が大きい））。
＜＜＜条件２＞＞＞
工程８において、カイコにおける治療効果試験にて、コントロールのカンジダだけを注射した群が全数生存しているとき、サンプルとカンジダの両方を注射した群が半数以上死亡する。
【0171】
＜＜工程７：アセトン抽出画分の調製＞＞
ＹＭＥ寒天培地に上記２つの条件で選択した菌のグリセロールストックを塗布し、３０℃２日間培養した。
ＹＭＥ寒天培地上に増殖した菌を、ＹＭＥ液体培地を２０ｍＬずつ分注した１００ｍＬナスフラスコ４本に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４日間振盪培養を行った。
液体培養後、同量のアセトンを加え、８０００ｒｐｍ、５分間遠心し、遠心上清を乾固後、液体培地の１／２０量の前記したミリＱ水に溶解した。その後、ｐＨを７に調整した。
ＹＭＥ寒天培地に上記２つの条件で選択した菌のグリセロールストックを塗布し、３０℃２日間培養した。
ＹＭＥ寒天培地上に増殖した菌を、ＹＭＥ液体培地を２０ｍＬずつ分注した１００ｍＬナスフラスコ４本に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍの条件で４日間振盪培養を行った。
液体培養後、同量のアセトンを加え、８０００ｒｐｍ、５分間遠心し、遠心上清を乾固後、液体培地の１／２０量の前記したミリＱ水に溶解した。その後、ｐＨを７に調整した。
【0172】
＜＜工程ａ：ブタノール転溶画分の調製＞＞
アセトン抽出画分と同量のブタノールを加え、８０００ｒｐｍ、５分間遠心し、遠心上清を得た。この工程に必要な時間は、１サンプルあたり１０分間以内であった。
得られた遠心上清を、遠心エバポレーターにて１２時間乾固後、ブタノール添加前と同量の生理食塩水に溶解した。
アセトン抽出画分と同量のブタノールを加え、８０００ｒｐｍ、５分間遠心し、遠心上清を得た。この工程に必要な時間は、１サンプルあたり１０分間以内であった。
得られた遠心上清を、遠心エバポレーターにて１２時間乾固後、ブタノール添加前と同量の生理食塩水に溶解した。
【0173】
＜＜工程７：ＭＩＣの測定＞＞
サブロー液体培地でカンジダを２日間培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収後、生理食塩水にて菌濃度がＯＤ５３０＝０．５になるよう調整した。
得られたＯＤ５３０＝０．５の菌液を、ＲＰＭＩ１６４０－ＭＯＰＳにて１／１０００に希釈し、丸底９６穴プレートに１００μＬずつ分注した。丸底９６穴プレートの１列目にサンプルを１００μＬ加え、段階希釈を行った。
その後、３７℃で２日間培養し、菌の増殖が抑制された最小濃度をＭＩＣ値とした。
サブロー液体培地でカンジダを２日間培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収後、生理食塩水にて菌濃度がＯＤ５３０＝０．５になるよう調整した。
得られたＯＤ５３０＝０．５の菌液を、ＲＰＭＩ１６４０－ＭＯＰＳにて１／１０００に希釈し、丸底９６穴プレートに１００μＬずつ分注した。丸底９６穴プレートの１列目にサンプルを１００μＬ加え、段階希釈を行った。
その後、３７℃で２日間培養し、菌の増殖が抑制された最小濃度をＭＩＣ値とした。
【0174】
＜＜工程ｂ：ＯＤＳカートリッジカラムによる分画＞＞
ＯＤＳ Ｓｅｐ-Ｐａｋカートリッジカラムを使用した。アセトン、メタノール、水にてカラムの洗浄を行い、サンプルをカラムにアプライ後、水、１０％ＭｅＯＨ、２０％ＭｅＯＨ、３０％ＭｅＯＨ、４０％ＭｅＯＨ、５０％ＭｅＯＨ、６０％ＭｅＯＨ、７０％ＭｅＯＨ、８０％ＭｅＯＨ、９０％ＭｅＯＨ、１００％ＭｅＯＨ、アセトンにて溶出した。
この工程に必要な時間は、１サンプルあたり１０分以内であった。
分取したサンプルを、遠心エバポレーターにて、１２時間乾固後、ブタノール転溶サンプルに対し４倍濃縮になるように生理食塩水に溶解した。
ＯＤＳ Ｓｅｐ-Ｐａｋカートリッジカラムを使用した。アセトン、メタノール、水にてカラムの洗浄を行い、サンプルをカラムにアプライ後、水、１０％ＭｅＯＨ、２０％ＭｅＯＨ、３０％ＭｅＯＨ、４０％ＭｅＯＨ、５０％ＭｅＯＨ、６０％ＭｅＯＨ、７０％ＭｅＯＨ、８０％ＭｅＯＨ、９０％ＭｅＯＨ、１００％ＭｅＯＨ、アセトンにて溶出した。
この工程に必要な時間は、１サンプルあたり１０分以内であった。
分取したサンプルを、遠心エバポレーターにて、１２時間乾固後、ブタノール転溶サンプルに対し４倍濃縮になるように生理食塩水に溶解した。
【0175】
＜＜工程８：カイコを用いた治療効果の測定＞＞
サブロー液体培地でカンジダを２日間培養した。
培養液を遠心分離し、菌体を回収した。培養液に対して１０倍の生理食塩水で懸濁し、５０μＬを、１日エサを食べた５令カイコ幼虫に血液内注射した。その後、直ちに生理食塩水で希釈したサンプルを５０μＬずつ血液内注射した。
注射後、１日後及び２日後にカイコの生死を判定した。
サブロー液体培地でカンジダを２日間培養した。
培養液を遠心分離し、菌体を回収した。培養液に対して１０倍の生理食塩水で懸濁し、５０μＬを、１日エサを食べた５令カイコ幼虫に血液内注射した。その後、直ちに生理食塩水で希釈したサンプルを５０μＬずつ血液内注射した。
注射後、１日後及び２日後にカイコの生死を判定した。
【0176】
カイコを用いた治療効果評価（試験）で、治療効果を期待する上で、サンプルのＭＩＣ値が１／１０以下であることが必要である。なぜなら、カイコ（体重２ｇ）に５０μＬのサンプルを血液内注射すると、直ちに１／１０に希釈されてしまうからである。本研究ではＭＩＣが１／１０以下であるサンプルについて、カイコでの抗菌治療効果を見た。
【0177】
［実施例２の結果］
＜工程７：抗菌活性試験＞
１０個の菌から調製した、アセトン抽出画分、ブタノール転溶画分、及び、ＯＤＳカラムフラクションの、カンジダに対するＭＩＣ値（希釈倍率）を表１０に示す。
なお、表１０には記載していないが、１０％ＭｅＯＨ、２０％ＭｅＯＨ、３０％ＭｅＯＨ、４０％ＭｅＯＨ、５０％ＭｅＯＨ、アセトンにて溶出したサンプルのＭＩＣ値は、何れも「＞１／２」又は「１／２」と大きかった（抗菌活性が低かった）。
＜工程７：抗菌活性試験＞
１０個の菌から調製した、アセトン抽出画分、ブタノール転溶画分、及び、ＯＤＳカラムフラクションの、カンジダに対するＭＩＣ値（希釈倍率）を表１０に示す。
なお、表１０には記載していないが、１０％ＭｅＯＨ、２０％ＭｅＯＨ、３０％ＭｅＯＨ、４０％ＭｅＯＨ、５０％ＭｅＯＨ、アセトンにて溶出したサンプルのＭＩＣ値は、何れも「＞１／２」又は「１／２」と大きかった（抗菌活性が低かった）。
【0178】
【表10】
【0179】
表１０から分かる通り、＃１から＃１０の１０サンプルのうち、ブタノール転溶画分のＭＩＣ値が１／１０以下であるものは６サンプル（Ｎｏ．１、６～１０）であった。
この６サンプルについて、ＯＤＳカートリッジカラムにて分画し、抗菌活性試験を実施した結果、６サンプルとも、高濃度のＭｅＯＨ溶出画分に、「ＭＩＣ値＜１／１０」の抗菌活性が見られた（表１０参照）。
この６サンプルについて、ＯＤＳカートリッジカラムにて分画し、抗菌活性試験を実施した結果、６サンプルとも、高濃度のＭｅＯＨ溶出画分に、「ＭＩＣ値＜１／１０」の抗菌活性が見られた（表１０参照）。
【0180】
＜工程８：治療効果評価（試験）＞
上記工程で、「ＭＩＣ値＜１／１０」のＯＤＳフラクションについて、カイコにおける治療効果試験を実施した。結果を表１１に示す。
上記工程で、「ＭＩＣ値＜１／１０」のＯＤＳフラクションについて、カイコにおける治療効果試験を実施した。結果を表１１に示す。
【0181】
【表11】
【0182】
表１１から分かる通り、１／１０希釈したカンジダを注射したコントロール（表１１中のＮｏ．１０２とＮｏ．１３７は、１日目は全数生存（３／３）したが、２日目は半数以上死亡した。すなわち、前記した表８のＮｏ．Ｂと同様の結果である。
【0183】
アセトン抽出画分（１／１（無希釈）、１／１０希釈）は、注射１日後において、半数以上のカイコが死亡した。すなわち、前記した通り、工程ａも工程ｂも行わなかったサンプルを注射し、カンジダを注射した場合は、表８のＮｏ．Ｄに記載と同様に、１日目で半数以上が死亡した。
それに対し、「工程ａ：ブタノール転溶、及び／又は、工程ｂ：カラム分画を行ったサンプル」を注射し、カンジダを注射したサンプルは、表１１から分かる通り、１日後でも半数以上が生存していたもの（生存率「２／３」又は「３／３」のもの）があった。このことは、自然免疫抑制物質又は毒性物質等が、工程ａ又は工程ｂを行うことで除去されたことを示唆している。
それに対し、「工程ａ：ブタノール転溶、及び／又は、工程ｂ：カラム分画を行ったサンプル」を注射し、カンジダを注射したサンプルは、表１１から分かる通り、１日後でも半数以上が生存していたもの（生存率「２／３」又は「３／３」のもの）があった。このことは、自然免疫抑制物質又は毒性物質等が、工程ａ又は工程ｂを行うことで除去されたことを示唆している。
【0184】
更に、サンプルとカンジダを注射したサンプルの中には、１日後に半数以上が生存していた群があっただけでなく、２日目も半数以上が生存していた群があった。
注射２日目にカイコが半数以上生存していたサンプル注射群は、以下の３群であった。すなわち、「サンプル＃１」の８０％ＭｅＯＨ（１／１）（表１１中のＮｏ．１０５）、「サンプル＃１」の９０％ＭｅＯＨ（１／１）（表１１中のＮｏ．１０６）、０．５ｍｇ／ｍＬ ＡｍｐＢ（コントロール）、であった。
なお、工程ａも工程ｂも行っていない前記表８のＮｏ．Ｄは、１日目で半数以上が死亡しているので、２日目も当然に半数以上が死亡していた（表８参照）。
表１１中、「ＡｍｐＢ」は、ポジティブコントロールとして使用した、真菌感染症に対して広く一般に使用されている抗真菌薬である「アムホテリシンＢ」を示す。
注射２日目にカイコが半数以上生存していたサンプル注射群は、以下の３群であった。すなわち、「サンプル＃１」の８０％ＭｅＯＨ（１／１）（表１１中のＮｏ．１０５）、「サンプル＃１」の９０％ＭｅＯＨ（１／１）（表１１中のＮｏ．１０６）、０．５ｍｇ／ｍＬ ＡｍｐＢ（コントロール）、であった。
なお、工程ａも工程ｂも行っていない前記表８のＮｏ．Ｄは、１日目で半数以上が死亡しているので、２日目も当然に半数以上が死亡していた（表８参照）。
表１１中、「ＡｍｐＢ」は、ポジティブコントロールとして使用した、真菌感染症に対して広く一般に使用されている抗真菌薬である「アムホテリシンＢ」を示す。
【0185】
菌Ｂがカンジダ菌の場合、工程ａと工程ｂを行わないと、工程８で治療効果が確認されたサンプル数が２３２サンプル中０サンプルだったが（表７参照）、１０サンプル選択したうち、工程ａと工程ｂを行うことによって、工程８で治療効果が確認されたサンプル数が１サンプル（＃１）となった（表１２参照）。
【0186】
【表12】
【0187】
この「サンプル＃１」は、工程ａと工程ｂを行わない場合は治療効果なしと判定されたが、工程ａと工程ｂの実施により治療効果が見出された。すなわち、工程ａと工程ｂを行うことで、本発明の「抗菌剤の探索方法」の感度が上がった。
【0188】
工程ａ及び／又は工程ｂを加えたとしても、工程１から、ここまでの全工程が短時間に実施可能であった。しかも、多くの菌Ａや菌Ａからのサンプルの同時進行での探索が可能であった。
【0189】
また、表７に記載の通り、工程７の後、抗菌活性あり（ＭＩＣ値が１／１０以下）は、２３２サンプルであった。前記した通り、その中から１０サンプル抜き出して１サンプル（＃１）に治療効果が認められた（約１／１０の割合）（表１２参照）。このことは、実施例２で未検証の２２２サンプルに、治療効果が認められるサンプルが、その約１／１０の約２２個存在する可能性をも示唆している。
【0190】
＜工程９：抗菌剤を分離して獲得＞
工程８で治療効果が認められたサンプル＃１について、ＨＰＬＣを用いた精製を行い、新規性の判定をすることができる。サンプル＃１のＨＰＬＣ分画サンプル中の主な成分について、それが既知の抗真菌剤か否かを確かめることができる。
工程８で治療効果が認められたサンプル＃１について、ＨＰＬＣを用いた精製を行い、新規性の判定をすることができる。サンプル＃１のＨＰＬＣ分画サンプル中の主な成分について、それが既知の抗真菌剤か否かを確かめることができる。
【0191】
「工程ａ（ブタノール転溶等）で得られる物質、及び／又は、工程ｂ（ＯＤＳカラム等に吸着・溶出）される物質」は、工程９における更なる精製が容易になり、及び、物質の抗菌剤としての新規性の判定が容易になる。すなわち、このような物質は、Ｃ１８カラム等を用いたＨＰＬＣによる精製や、ＬＣ／ＭＳによる分子量の決定に基づく新規性の判定が更に容易となる。
【産業上の利用可能性】
【0192】
本発明の探索方法を使用すれば、多くの「治療活性があり、しかも耐性菌に対しても効果を示す候補化合物」を探索・選択できる。また、抗生物質の治療効果は、カイコとマウスで一致していることが分かっているので、本発明でカイコに対する治療効果を示した抗生物質は、マウスにおいても（従ってヒトにおいても）治療効果があると考えられる。
また、本発明の探索方法を使用して得られたものに「耐性菌に対して治療効果があると期待されるもの」があったが、そのことは、そのものが臨床上まだ使用されたことのない新規抗生物質である可能性を示唆している。
また、本発明の探索方法を使用して得られたものに「耐性菌に対して治療効果があると期待されるもの」があったが、そのことは、そのものが臨床上まだ使用されたことのない新規抗生物質である可能性を示唆している。
【0193】
本発明で見出された、耐性菌に有効でかつ治療効果のある抗生物質の粗画分を精製し、構造を決定すれば、このような新規抗生物質は、耐性菌による感染症の治療薬として臨床上有効であると期待される。
【0194】
従って、本発明の「抗菌剤の探索方法」は、抗菌剤・抗生物質等の探索・開発・製造を行っている分野に広く利用されるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】