特許 7610307 非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体およびその調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-24

(45)【発行日】2025-01-08

(54)【発明の名称】非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体およびその調製方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/39 20060101AFI20241225BHJP

   A61K 47/56 20170101ALI20241225BHJP

   C08B 37/08 20060101ALI20241225BHJP

   A61P 19/02 20060101ALN20241225BHJP

【ＦＩ】

A61K38/39

A61K47/56

C08B37/08 A

A61P19/02

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2023563140

(86)(22)【出願日】2021-11-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-09

(86)【国際出願番号】 CN2021134442

(87)【国際公開番号】W WO2022160917

(87)【国際公開日】2022-08-04

【審査請求日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】202110114882.4

(32)【優先日】2021-01-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】523239686

【氏名又は名称】曲 詞

【氏名又は名称原語表記】ＣＩ， Ｑｕ

【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ ２００５ Ｏｆ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １， ２０ Ｓｈａｏｙａｏｊｕ Ｒｄ． Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００１３ （ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】100146374

【弁理士】

【氏名又は名称】有馬 百子

(72)【発明者】

【氏名】曲 詞

(72)【発明者】

【氏名】張 貴士

【審査官】長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１７－２１８４０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０５７６９７３７（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０９１５６６９１（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２０１０－０５３０８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０２－０００４２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０７－２７８２０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１１０８９７１５９（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０４９０６６２４（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０３８１９６８５（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９

Ｃ０８Ｂ ３７／０８

Ａ６１Ｐ １９／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）活性化：非変性ＩＩ型コラーゲンを含む粉末または微小粒子を一定量とり、活性化剤を加えて混合し、０～８０℃で１ｍｉｎ～３００ｍｉｎ保持すること、
（２）篩い分け：工程（１）で得られた混合物を篩い分け、反応に関与しなかった活性化剤を除去すること、
（３）カップリング：工程（２）で得られた反応に関与しなかった活性化剤が除去された混合物に、キトサンオリゴ糖を加え、０～８０℃で動的混合を１ｍｉｎ～３００ｍｉｎ行うこと、
（４）乾燥：工程（３）で得られた混合物を、水分含有量が８％以下になるように乾燥し、非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体である生成物を得ること
からなる工程を含み、
前記活性化剤は、大豆イソフラボン、又はジヒドロミリセチンを含むブルーベリーエキスであることを特徴とする、
非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体の調製方法。

【請求項2】

前記活性化剤は、大豆イソフラボンであることを特徴とする、
請求項１に記載の調製方法。

【請求項3】

活性化剤と非変性ＩＩ型コラーゲンの質量比は、１００：１～１：１００００であることを特徴とする、
請求項２に記載の調製方法。

【請求項4】

前記工程（３）で加えられたキトサンオリゴ糖の重合度は、２～１０であることを特徴とする、
請求項１～３のいずれか一項に記載の調製方法。

【請求項5】

前記工程（３）で加えられたキトサンオリゴ糖は、平均重合度が２～１０である異なる重合度を持つキトサンオリゴ糖の混合物であることを特徴とする、
請求項１～３のいずれか一項に記載の調製方法。

【請求項6】

前記工程（３）で加えられたキトサンオリゴ糖と非変性ＩＩ型コラーゲンの質量比は、１００：１～１：２００であることを特徴とする、
請求項１～３のいずれか一項に記載の調製方法。

【請求項7】

前記工程（２）において、工程（１）で得られた混合物を、メッシュスクリーンを用いて篩い分けることを特徴とする、
請求項１～３のいずれか一項に記載の調製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジーにおけるタンパク質複合体の調製技術に属し、具体的には、非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体およびその調製方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

コラーゲンは、動物細胞が発現する三重らせん構造を持つ天然の生体高分子であり、細胞外のマトリックスの主な成分として、ほぼ全ての組織に存在し、哺乳類の体内の全タンパク質の約１／３を占め、動物の皮膚、アキレス腱、軟骨および他の結合組織に広く存在する。コラーゲンは、組織における支持や連結の役割を果たすと共に、細胞の分化、増殖、遊走、接着などに影響を与え、組織の形態、機械的強度および組織内の代謝などにも重要な影響を及ぼす。現在、哺乳類では、２８種類の様々なコラーゲンが発見されている。様々なコラーゲンは、動物体において分布状態、存在形態、合成および代謝経路などがそれぞれ異なっている。

【0003】

ＩＩ型コラーゲンは、関節軟骨や骨などの組織に存在することが多く、主に動物の軟骨細胞から分泌される。ＩＩ型コラーゲンは、軟骨構造の構造的完全性を維持し、軟骨組織に張力や支持力を与えるために、体内で頑丈な網目構造に絡み合うフィブリル形成コラーゲンに属する。ＩＩ型コラーゲンは、軟骨細胞の接着、増殖、分化を促進する特異的分子認識シグナルを持ち、Ｉ型コラーゲンよりも軟骨細胞の表現形成および構造維持に寄与する。ＩＩ型コラーゲンの発現や代謝の異常、分子構造の変性は、さまざまな疾患の原因となる。

【0004】

関節リウマチは、主に関節滑膜炎を特徴とする慢性の自己疾患であり、ＩＩ型コラーゲンに対する自己免疫応答に関連する疾患である。その病態メカニズムの鍵は、関節の再発性炎症にある。関節リウマチの病理学的特徴には、主に滑膜内層細胞の増殖、間質性炎症細胞の豊富な浸潤、血管新生および形成、ならびに軟骨および骨組織の破壊がある。関節リウマチは、ヒトにおける免疫疾患に属し、ＩＩ型コラーゲンが豊富な部位にさまざまな疾患を引き起こす可能性がある。

【0005】

ＩＩ型コラーゲンの経口投与による免疫寛容の誘導は、関節リウマチの予防・治療に有意な効果がある。ＩＩ型コラーゲンの免疫決定基は、インビボで抗原に結合し複合体を形成し、分泌経路を経て抗原提示細胞の表面に提示され、受容体特異的免疫関連細胞の表面受容体に認識されて複合体を形成する。これにより、特異的免疫関連細胞を活性化して増殖させ、様々な免疫因子を分泌して、免疫応答を開始させる。その結果、局所腸管関連リンパ組織の特異的免疫が生じ、全身性免疫応答が抑制される末梢免疫寛容の一形態である。

【0006】

従来のＩＩ型コラーゲンは、経口投与するとヒトの胃で分解され、腸管での標的放出率が低下する。これと同時に、ネイティブのＩＩ型コラーゲンの表面のアミノ酸はほとんどが負に帯電して分布しており、腸の表面の細胞によるコラーゲンの貪食が阻害されるため、効果が限定的であることが多い。非変性ＩＩ型コラーゲンは、適切な経路を経て腸管での標的放出率を改善し、腸管細胞による貪食率を向上させることによって、治療効果の向上につながる。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、従来の非変性ＩＩ型コラーゲンの使用中の低い放出率および低い貪食率による関節炎に対する治療効果の制限に対して、非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体およびその調製方法を提供する。

【0008】

本発明の一側面によれば、
（１）活性化：非変性ＩＩ型コラーゲンを含む粉末または微小粒子を一定量とり、活性化剤を加えて混合し、０～８０℃で１ｍｉｎ～３００ｍｉｎ保持すること、
（２）篩い分け：工程（１）で得られた混合物を篩い分け、反応に関与しなかった活性化剤を除去すること、
（３）カップリング：工程（２）で得られた反応に関与しなかった活性化剤が除去された混合物に、キトサンオリゴ糖を加え、０～８０℃で動的混合を１ｍｉｎ～３００ｍｉｎ行うこと、
（４）乾燥：工程（３）で得られた混合物を、水分含有量が８％以下になるように乾燥し、非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体である生成物を得ること
からなる工程を含む非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体の調製方法を提供する。

【0009】

好ましくは、上記の工程（１）で加えられた活性化剤は、ダイゼイン、大豆イソフラボン、アントシアニジン、アントシアニン、茶ポリフェノール、ジヒドロミリセチン、またはこれらを含む植物抽出物である。

【0010】

好ましくは、上記の活性化剤と非変性ＩＩ型コラーゲンの質量比は、１００：１～１：１００００である。

【0011】

好ましくは、上記の工程（３）で加えられたキトサンオリゴ糖の重合度は、２～１０である。

【0012】

好ましくは、上記の工程（３）で加えられたキトサンオリゴ糖は、平均重合度が２～１０である異なる重合度を持つキトサンオリゴ糖の混合物である。

【0013】

好ましくは、上記の工程（３）で加えられたキトサンオリゴ糖と非変性ＩＩ型コラーゲンの質量比は、１００：１～１：２００である。

【0014】

好ましくは、上記の工程（２）において、工程（１）で得られた混合物を、メッシュスクリーンを用いて篩い分ける。

【0015】

本発明の別の側面によれば、上記の実施形態に記載の調製方法で調製された非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体を提供する。

【0016】

好ましくは、上記の複合体には、非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖が、化学結合として存在する。

【0017】

好ましくは、非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖の比率は、１：２００～１００：１の範囲にある。

【0018】

本発明の実施形態に係る非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体の調製方法は、実施プロセスが簡易で、作業工程が少なく、効率が高いという利点を有する。本発明の実施形態は、活性化剤を用いてキトサンオリゴ糖を非変性ＩＩ型コラーゲンの表面に固定化し、非変性ＩＩ型コラーゲンの表面の正電荷の密度を増加させることができる。したがって、本発明の実施形態に係る非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体中の非変性ＩＩ型コラーゲンは、経口投与後にインビボでのプロテアーゼによる分解を受けにくくなり、非変性ＩＩ型コラーゲンの腸管での標的放出率を高めることができ、さらに、本発明の実施形態に係る複合体における非変性ＩＩ型コラーゲンは、腸の表面の細胞によるコラーゲンの貪食を促進するため、腸細胞によるその非変性ＩＩ型コラーゲンの貪食率を改善し、治療効果を向上させる。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明を具体的な実施形態により具体的に説明するが、実施形態は、本発明に係る非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体及びその調製方法の例示に過ぎず、本発明の特許の全体を表すものではなく、ましてや本発明の保護範囲を限定するものとして解釈すべきではないことに留意されたく、本発明の実質的な概念から逸脱しないことを前提に、いくつかの調整や改良を行うことも可能であり、これらはすべて本発明の保護範囲に含まれる。

【0020】

本発明の一般的な概念によれば、
（１）活性化：非変性ＩＩ型コラーゲンを含む粉末または微小粒子（例えば、動物の軟骨を前処理して得られた粉末または微小粒子）を一定量とり、活性化剤を加えて（例えば、均一に）混合し、０～８０℃で（例えば、３５～４０℃または５０～５５℃）１ ｍｉｎ～３００ｍｉｎ（例えば、９０ｍｉｎまたは２００ｍｉｎ）保持すること；
（２）篩い分け：工程（１）で得られた混合物を篩い分け、反応に関与しなかった活性化剤を除去すること、
（３）カップリング：工程（２）で得られた反応に関与しなかった活性化剤が除去された混合物に、キトサンオリゴ糖を加え、０～８０℃（例えば、３５～４０℃または５０～５５℃）で動的混合を１ｍｉｎ～３００ｍｉｎ（例えば、９０ｍｉｎまたは１２０ｍｉｎ）行うこと、
（４）乾燥：工程（３）で得られた混合物を、水分含有量が８％以下（例えば、７％以下または６％以下）になるように乾燥し、非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体である生成物を得ること
からなる工程を含む非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体の調製方法を提供する。

【0021】

本発明の実施形態の調製方法において、活性化剤を用いて、キトサンオリゴ糖を非変性ＩＩ型コラーゲンの表面に固定化し、非変性ＩＩ型コラーゲンを、経口投与後にインビボでのプロテアーゼによる分解を受けにくくなり、非変性ＩＩ型コラーゲンの腸管での標的放出率を高めることができる。さらに、活性化剤を加えることによって、非変性ＩＩ型コラーゲンの表面の正電荷の密度を増加させることができるため、該複合体における非変性ＩＩ型コラーゲンは、腸の表面の細胞によるコラーゲンの貪食を促進するため、腸細胞による非変性ＩＩ型コラーゲンの貪食率を改善する。本発明の調製方法で得られた複合体は、非変性ＩＩ型コラーゲンによる治療効果を向上させる。

【0022】

実施形態において、上記の工程（１）で加えられた活性化剤は、フラボン、アントシアニジン、ポリフェノール化合物、またはこれらを含む植物抽出物である。

【0023】

実施形態において、活性化剤と非変性ＩＩ型コラーゲン粉末または微小粒子の質量比は、１：１０などの１００：１～１：１００００である。

【0024】

実施形態において、上記の工程（３）で加えられたキトサンオリゴ糖の重合度は、３または４などの２～１０である。

【0025】

一例として、上記の工程（３）で加えられたキトサンオリゴ糖は、平均重合度が３または４などの２～１０である異なる重合度を持つキトサンオリゴ糖の混合物である。

【0026】

一例として、上記の工程（３）で加えられたキトサンオリゴ糖と非変性ＩＩ型コラーゲンの粉末または微小粒子の質量比は、２．５：１または１：５などの１００：１～１：２００である。

【0027】

実施形態において、上記の工程（２）において、工程（１）で得られた混合物を、メッシュスクリーンを用いて篩い分ける。例えば、工程（１）で得られた混合物を、２００～５００メッシュのメッシュスクリーンを用いて篩い分けてよい。

【0028】

本発明の別の概念によれば、上記の実施形態のいずれか１つに記載の調製方法で調製された非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖を含む複合体をさらに提供する。

【0029】

実施形態において、上記の複合体には、非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖が、化学結合として存在する。

【0030】

実施形態において、非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖の比率は、１：２００～１００：１の範囲にある。

【0031】

以下、本発明の実施例の一部のみを示しており、これらは例示的な説明のためにのみ使用されており、本発明の他の実現可能な実施例は当業者には理解されるであろうから、ここでは繰り返さないこととする。

【実施例1】

【0032】

原料は、動物軟骨を前処理して得られた非変性ＩＩ型コラーゲンを２０％含む微小粒子であり、水分含有量が約２０％、活性化剤が大豆イソフラボンであった。

【0033】

（１）活性化：平均粒径が３００メッシュのトリ軟骨粉末を２００ｇ取り、大豆イソフラボンを４ｇ加えて、機械的方法で均一に混合後に、３５℃～４０℃の条件で２００ｍｉｎ保持した。

【0034】

（２）篩い分け：工程（１）で得られた混合物を５００メッシュのメッシュスクリーンを用いて篩い分け、残留物を採集した。

【0035】

（３）カップリング：工程（２）で得られた残留物に、平均重合度４のキトサンオリゴ糖を１００ｇ加えて、３５℃～４０℃で２００ｍｉｎ振とうして混合した。

【0036】

（４）乾燥：工程（３）で得られた混合物を、水分含有量が７％以下になるまで低温で真空乾燥した。

【0037】

該混合物は、非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖の複合体を含み、キトサンオリゴ糖は、非変性ＩＩ型コラーゲンの表面に共有結合でカップリングされている。試験結果から、該複合体における非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖の比率が２２．３：１であったことが分かった。

【実施例2】

【0038】

原料は、トリ軟骨から抽出した非変性ＩＩ型コラーゲンの凍結乾燥粉末であり、水分含有量が約１０％であって、活性化剤はジヒドロミリセチンを２０％含むブルーベリーエキスであり、水分含有量が約６％であった。

【0039】

（１）活性化：非変性ＩＩ型コラーゲンの凍結乾燥粉末を１００ｇ取り、ブルーベリーエキスを１０ｇ加えて、機械的方法で均一に混合後に、５０℃～５５℃で９０ｍｉｎ保持した。

【0040】

（２）篩い分け：工程（１）で得られた混合物を、２００メッシュのメッシュスクリーンを用いて篩い分け、非変性ＩＩ型コラーゲンの凍結乾燥粉末を採集した。

【0041】

（３）カップリング：工程（２）で得られた凍結乾燥粉末に、平均重合度３のキトサンオリゴ糖を２０ｇ加えて、５０℃～５５℃で１２０ｍｉｎ振とうして混合した。

【0042】

（４）乾燥：工程（３）で得られた混合物を、水分含有量が６％以下になるまで低温で真空乾燥した。

【0043】

該混合物は、非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖の複合体を含む。試験結果から、該複合体における非変性ＩＩ型コラーゲンとキトサンオリゴ糖の比率が２０．６：１であったことが分かった。