特許 7610774 ヌクレアーゼ反応、リガーゼ反応、ポリメラーゼ反応、及びシーケンシング反応を組み合わせて使用し、核酸の配列、発現、コピー数、またはメチル化変化を決定するためのデバイス、プロセス、及びシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-25

(45)【発行日】2025-01-09

(54)【発明の名称】ヌクレアーゼ反応、リガーゼ反応、ポリメラーゼ反応、及びシーケンシング反応を組み合わせて使用し、核酸の配列、発現、コピー数、またはメチル化変化を決定するためのデバイス、プロセス、及びシステム

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20241226BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20241226BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20241226BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A ZNA

C12Q1/68 100Z

C12Q1/6837 Z

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2022130367

(22)【出願日】2022-08-18

(62)【分割の表示】P 2019553187の分割

【原出願日】2018-03-29

(65)【公開番号】P2022166216

(43)【公開日】2022-11-01

【審査請求日】2022-09-14

(31)【優先権主張番号】62/478,412

(32)【優先日】2017-03-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】508057896

【氏名又は名称】コーネル・ユニバーシティー

【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＮＥＬＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】バラニー フランシス

【審査官】井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５３３０９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－０２４０７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－１６０７２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４－５０２９２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／０５１０７６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｑ １／６８３７

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

注入口と；
出口と；
前記注入口及び前記出口と流体連結し、空間を画定するカートリッジと
を含む、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムであって、
前記空間が、
個々の行と列で構成される複数の産物捕捉細区画を備える固体支持体の入った産物捕捉筐体であって、各個々の産物捕捉細区画が、疎水性表面でそれぞれが隔てられる複数の個別の親水性マイクロポアのアレイを含み、前記個別の親水性マイクロポアはそれぞれ、対向する第１及び第２の開口端を有し、前記第１の端は大きい直径を有し、前記第２の端は前記第１の端の直径よりも小さい直径を有し、物質が前記注入口から前記産物捕捉細区画の列を通って、前記細区画内のマイクロポアの前記アレイと接触しそして前記出口に至ることが可能であるように、前記産物捕捉筐体が複数の流体流路を備えており、前記複数の流体流路は前記固体支持体の上方及び下方に位置する、前記産物捕捉筐体
を含む、
前記システム。

【請求項2】

前記注入口または前記出口を通して試薬及び／または反応物を前記産物捕捉筐体へ誘導するか、または前記産物捕捉筐体から排出するか、を選択するための１つ以上のバルブ
をさらに含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

前記産物捕捉筐体に近接する１つ以上の発熱体を前記カートリッジ内にさらに含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項4】

試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの調製方法であって、
請求項１に記載のシステムを提供することと、
捕捉オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを、前記産物捕捉筐体内の前記固体支持体上の前記産物捕捉細区画の前記マイクロポアに加え、それにより、前記捕捉オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを前記マイクロポア内に保持することと
を含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１７年３月２９日出願の米国仮特許出願第６２／４７８，４１２号の優先利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、ヌクレアーゼ反応、ライゲーション反応、ポリメラーゼ反応、及びシーケンシング反応の組み合わせを使用し、核酸の配列、発現、コピー数、またはメチル化変化を決定するためのデバイス、プロセス、及びシステムに関する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
ＤＮＡシーケンシングの進歩により、出生前医療、移植有効性、がん及び他の疾患の検出、ならびに個別化治療を向上させる非侵襲的分子診断の標準化及び開発に期待が寄せられている。現状では、疾患素因または早期疾患を有する患者は特定されず、また疾患を有する患者に最善の治療が施されていない。これはすべて、診断段階での失敗が原因である。

【0004】

がんの分野では、早期発見、治療指導、及び再発の監視すべてが血液試料から可能であるような技術の開発が必要とされている。それには、（ｉ）既知の遺伝子における単塩基変異、小挿入変異、及び小欠失変異（無細胞ＤＮＡの１％～０．０１％に存在する場合）の高感度検出；（ｉｉ）プロモーターの高メチル化及び低メチル化（無細胞ＤＮＡの１％～０．０１％に存在する場合）の高感度検出；（ｉｉｉ）腫瘍由来のエキソソームもしくはＲＩＳＣ複合体、または血液中の循環腫瘍細胞から単離された腫瘍特異的ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡの正確な定量；（ｉｖ）循環腫瘍細胞から単離されたＤＮＡにおける腫瘍特異的なコピー変化の正確な定量；（ｖ）循環腫瘍細胞から単離されたＤＮＡにおける変異、プロモーターの高メチル化及び低メチル化の正確な定量を開発する必要性が挙げられる。上記はすべて（循環腫瘍細胞から単離されたＤＮＡにおける腫瘍特異的なコピー変化の定量を除き）、ゲノムの標的遺伝子または標的領域に焦点を定めたシーケンシングを必要とする。さらに、元の断片の双方の鎖から配列情報またはメチル化状態を決定するには、希少な事象の確認が不可避である。

【0005】

正常血漿には、正常な生理学的過程（すなわち、エキソソーム、アポトーシス）を経て正常細胞から放出された核酸が含まれる。ストレス、炎症、感染、または損傷といった状態下では、核酸が追加放出される場合もある。一般に、アポトーシス細胞から放出されるＤＮＡは平均１６０ｂｐ長であるが、胎児細胞からのＤＮＡは平均約１４０ｂｐである。がん患者由来の血漿には、異常な生理学的過程を経てがん細胞から放出される核酸に加え、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）内の核酸が含まれている。同様に、妊婦の血漿には胎児細胞から放出された核酸が含まれている。

【0006】

信頼性のある診断及びスクリーニング試験を開発するにはいくつかの課題がある。第１の課題は、疾患の徴候（すなわち早期がん）を示す腫瘍または胎児から発せられるマーカーと、正常組織から発せられる同じマーカーの存在とを区別することである。また、検査するマーカーの数及び試験のコストと、アッセイの特異性及び感度とのバランスを計る必要がある。これは、がんなどの疾患の生物学的変動への対処を必要とする課題である。多くの場合、アッセイはスクリーニングツールとして機能すべきものであり、二次診断のフォローアップ（すなわち、大腸内視鏡検査、羊水穿刺）を利用できる必要がある。生物学的問題を複雑化しているのは、核酸配列の変異またはプロモーターのメチル化の違いを確実に検出すること、または極少数の初期細胞由来（すなわちＣＴＣ由来）、もしくはがんもしくは胎児特異的シグナルが、正常細胞から発せられるはるかに大量の核酸の存在下にある場合に、ＤＮＡまたはＲＮＡのコピー数を確実に定量することが必要とされることである。最後に、目的とする疾患特異的核酸の違いを検出して得られる真のシグナルと、試料に存在する正常な核酸から生じる偽シグナルと、疾患特異的核酸の違いが存在しない場合に生じる偽シグナルとを区別するという技術的課題がある。

【0007】

一例として、血漿において、ｐ５３遺伝子またはメチル化されたプロモーター領域に変異を有する循環腫瘍ＤＮＡの存在を検出するという課題について検討する。そのような試料には、正常細胞から生じるはるかに大量の無細胞ＤＮＡが含まれており、腫瘍ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡ全体の０．０１％しか含まれない場合がある。したがって、そのような突然変異体ＤＮＡの存在を全シーケンシングによって発見しようとすると、変異を有する１０個のゲノムを識別するのに、１００，０００個のゲノムをシーケンシングする必要がある。それには、３００，０００ＧＢのＤＮＡのシーケンシングが要求される。これは、膨大なデータ管理の問題は言うまでもなく、現行のシーケンシング技術の範囲を超える作業である。この問題を回避するために、多くのグループが特異的標的領域の取得、または問題の領域のＰＣＲ増幅を試みている。配列取得にはドロップアウトが生じるという欠点があり、その結果、目的とする配列のおそらく９０～９５％は取得されるが、目的の断片が欠落する。もう一つの選択肢であるＰＣＲ増幅は、真の変異と区別できない稀なエラーを誘発する危険性がある。さらに、ＰＣＲによってメチル化情報が失われる。プロモーターのメチル化の存在を決定するためにバイサルファイト処理が従来から使用されてきたが、これもＤＮＡ試料を破壊し、無細胞ＤＮＡの複数のメチル化の変化を特定する能力に欠けている。

【0008】

エラー率を低減し、シーケンシングランの精度を向上させるためのいくつかの異なる手法がある。ＤＮＡの同じ領域を３０～１００回シーケンシングすることにより、高いエラー率が存在する場合でもコンセンサス精度を達成することができる。ただし、エラー率が高いと、例えば正常なＤＮＡの存在下でがんの変異を特定しようとする場合、低存在量の配列変異体の特定が非常に困難になる。したがって、比較的存在量の少ない変異を検出するには、エラー率の低さが要求される。タグ付きアンプリコンディープシーケンシング（ＴＡｍ－Ｓｅｑ）法（Ｆｏｒｓｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ，” Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．４（１３６）：１３６（２０１２）（非特許文献１））と呼ばれる第１の手法は、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ、及びＫＲＡＳを含む、がん関連遺伝子の選択領域を対象とする５９９５塩基を増幅するプライマー設計に基づくものである。この手法は、２％～６５％の頻度でｐ５３遺伝子の変異を特定することができる。この手法では、多数のＰＣＲプライマーとのマルチプレックス反応でＤＮＡを前増幅（１５サイクル）するプライマーが設計される。前増幅では目的とする産物と不要な産物の両方が生成されるので、後にシングルプレックスＰＣＲを実行して、目的とする産物それぞれをさらに増幅する。この断片に最終のバーコーディングＰＣＲ工程を施した後、標準の次世代シーケンシングを行う。この手法の利点は、少数の出発核酸の増幅に卓越している、長年の実績をもつマルチプレックスＰＣＲ－ＰＣＲを利用していることである。欠点としては、この手法は増幅の初期ラウンドで真の変異とＰＣＲエラーとを区別できないことである。したがって、２％の感度（すなわち、５０ｗｔ対立遺伝子中の１つの変異対立遺伝子の検出）は、治療判断を行う前の末期がんの評価には十分であるが、早期検出には感度が不十分である。

【0009】

第１の手法の変形例は、Ｓａｆｅ－Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ「Ｓａｆｅ－ＳｅｑＳ」（Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８（２３）：９５３０－５（２０１１）（非特許文献２））と呼ばれるもので、ランダムに断片化されたゲノムＤＮＡがリンカーの末端に付加され、リンカーがゲノムＤＮＡとライゲーションされる。この手法は、ゲノムシーケンシングにより示される変異のほとんどが実際にはエラーであることを実証し、推定されるシーケンシングエラーを少なくとも７０分の１に低減させた。同様に、超高感度ディープシーケンシング（Ｎａｒａｙａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｕｓｉｎｇ Ｅｒｒｏｒ－ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２（１４）：３４９２－８（２０１２）（非特許文献３））と呼ばれる手法は、ネステッドＰＣＲ増幅用のプライマーにバーコードを付加する。想定されるように、バイオインフォマティクスツールに依存した、バーコードを付加して稀な変異及びコピー数の変動を検出する類似システムが開発された（Ｔａｌａｓａｚ，Ａ．；Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｒａｒｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ、米国特許出願公開第ＵＳ ２０１４／００６６３１７ Ａ１号（特許文献１））。ペアエンドリードを使用すると、推定される変異を含む領域が網羅される。この方法は、後期がん患者の血漿中の既知の変異を追跡するために使用された。これらの手法では、コンセンサス配列を確定するには多数の読み取りが必要である。これらの方法は標的ＤＮＡ全体の伸長を必要とするため、特に脱アミノ化シトシンなどの損傷した塩基がコピーされると、真の変異とポリメラーゼによるエラーとを区別できないことになる。最後に、これらの方法では断片内のＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報は提供されない。

【0010】

デュプレックスシーケンシング（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｌｔｒａ－Ｒａｒｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（３６）：１４５０８－１３（２０１２）（非特許文献４））と呼ばれる第２の手法は、１２塩基のランダムなタグを含んだ二重鎖リンカーの使用に基づくものである。インプット標的ＤＮＡのトップ鎖とボトム鎖の両方を増幅することにより、所与の断片が（各末端の１２塩基からなる）固有の識別子を得るため、それをシーケンシングにより追跡することができる。固有のタグセットを共有する配列リードは、トップ鎖またはボトム鎖のいずれの方向にも鎖の識別子を有するメンバーを含むペアになったファミリーに分類される。各ファミリーペアは１つの二本鎖ＤＮＡ断片の増幅に反映される。１つのみまたは少数のファミリーメンバーに存在する変異は、増幅の後半で発生するシーケンシングのミスまたはＰＣＲで生じたエラーを表す。ペアとなる１つのファミリーの多くのメンバーまたは全メンバーで発生する変異は、変異原性ＤＮＡ損傷部位がコピーされると発生し得るような、増幅の初回ラウンド中のＰＣＲエラーから生じる。それに対してＤＮＡ断片の両方の鎖に存在する真の変異は、１つのファミリーペアの全メンバーに現れる。アーティファクトとなる変異がファミリーペアで真の変異と同時発生する可能性があるが、エラー修正された一本鎖コンセンサス配列を作成する際に、ＰＣＲ増幅の初回ラウンドで発生するものを除くすべてを個別に識別して除外しておくことができる。その後、個々のＤＮＡ二重鎖の二本鎖のそれぞれから得た配列を比較して、ＰＣＲの初回ラウンド中に発生した残りのエラーを排除した二重鎖コンセンサス配列を取得することができる。この手法の利点は、真の変異をＰＣＲエラーまたは変異原性ＤＮＡ損傷と明確に区別し、３．８×１０^－１０の極めて低いエラー率を達成することである。この手法の欠点は、ファミリーペアの少なくとも５つのメンバーの各鎖を取得するために多数の断片のシーケンシングが必要になることである（すなわち、元の断片あたり最低１０個の配列を読み取るが、変動があるため、これよりはるかに多くを必要とする場合がある）。さらに、この方法は、ｃｆＤＮＡでは試験されていないが、ｃｆＤＮＡは、無傷のゲノムＤＮＡから生成される断片よりも小さい傾向があるため、すべての潜在的な変異を網羅するには、より多数の断片のシーケンシングが要求されることになる。最後に、この方法では断片内のＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報は提供されない。

【0011】

１分子分子反転プローブ法（ｓｍＭＩＰ）（Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ，Ｈｉｇｈ－Ａｃｃｕｒａｃｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ－Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ，” Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（５）：８４３－５４（２０１３）（非特許文献５））と呼ばれる第３の手法は、１分子タギング法とマルチプレックス法とを組み合わせた捕捉により、低頻度のサブクローン変動の高感度検出を可能にする。この方法は、臨床標本においてエラー率２．６×１０^－５を主張している。この手法の欠点は、ファミリーペアの少なくとも５つのメンバーの各鎖を取得するために多数の断片のシーケンシングが必要になることである（すなわち、元の断片あたり最低１０個の配列を読み取るが、変動があるため、これよりはるかに多くを必要とする場合がある）。また、この方法は、標的ＤＮＡ全体の伸長を必要とするため、特に脱アミノ化シトシンなどの損傷した塩基がコピーされると、真の変異とポリメラーゼによるエラーとを区別することができないことになる。さらに、この方法は、ｃｆＤＮＡでは試験されていないが、ｃｆＤＮＡは、無傷のゲノムＤＮＡから生成される断片よりも小さい傾向があるため、すべての潜在的な変異を網羅するには、より多数の断片のシーケンシングが要求されることになる。最後に、この方法では断片内のＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報は提供されない。

【0012】

サークルシーケンシング（Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｅｒｒｏｒｓ ａｒｅ Ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｍａｇｎｉｔｕｄｅ Ｕｓｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０（４９）：１９８７２－７（２０１３）（非特許文献６）；Ａｃｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｆｉｔｎｅｓｓ Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ ｏｆ ａｎ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｎａｔｕｒｅ ２０１４ ５０５（７４８５）：６８６－９０（２０１４）（非特許文献７）；及びＡｃｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ，” Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．９（７）：１７６０－９（２０１４）（非特許文献８））と呼ばれる第４の手法は、ＤＮＡまたはＲＮＡを約１５０塩基に断片化し、変性して一本鎖を形成し、そのような一本鎖を環状化して、ランダムヘキサマープライマー及びｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用して（ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ及びホルムアミドピリミジン－ＤＮＡグリコシラーゼの存在下で）ローリングサークル増幅を行い、その産物を約５００塩基に再断片化した後、標準的な次世代シーケンシングを進めることに基づくものである。この手法の利点は、ローリングサークル増幅により、元の標的ＤＮＡを剥がしながら多数のタンデムコピーが作成されるため、ポリメラーゼエラーは１つのコピーにしか出現しないが、真の変異はすべてのコピーに出現し得ることである。コピーが物理的に相互連結されるため、リードファミリーのサイズは平均３コピーである。この方法はまた、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ及びホルムアミドピリミジン－ＤＮＡグリコシラーゼを使用して、損傷した塩基が含まれる標的を除去し、そのようなエラーを排除する。この技術の利点は、現行レベルの約０．１～１×１０^－２から、７．６×１０^－６もの低率に至るシーケンシングエラー率をとることである。現状では、後者のエラー率は、野生型ＤＮＡが１００～１０，０００倍過剰に存在する場合に、血漿中のがん変異を識別するのに十分である。さらなる利点は、同じ配列の２～３コピーが物理的に連結されるため、１つの断片から生成される配列データによって真の変異を検証できることである。これは、デュプレックスシーケンシング手法を使用した場合に少なくとも１０個の断片を要するのとは対照的である。しかしながら、この方法では、コピー数の変化を判別する機能は提供されず、また断片内のＣｐＧ部位のメチル化状態に関する情報も提供されない。

【0013】

Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓが開発した第５の手法（Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｂａｓｅ Ｒｅａｄｓ ｏｎ Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ＤＮＡ Ｎａｎｏａｒｒａｙｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７（５９６１）：７８－８１（２０１０）（非特許文献９））は、ナノボールアレイでのライゲーションの読み取りの使用に基づくものである。約４００ヌクレオチドのゲノムＤＮＡをリンカーで環状化し、切断して、リンカーと再環状化し、最終的に約４つのリンカーが含まれるまで再環状化する。ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡのローリングサークル増幅を行い、ナノボールを生成する。次に、これをアレイに配置し、ライゲーションを用いた手法を使用してシーケンシングする。この手法の本明細書との関連が顕著な点は、同じ配列の多数のタンデムコピーを生成した後、単一のローリングサークル増幅産物からのシーケンシングが可能なことである。リガーゼまたはポリメラーゼのいずれかによって（ローリングサークルと他のｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ手法とを組み合わせることにより）同じ配列を複数回調べるため、塩基あたりのエラー率を大幅に減少させることができる。したがって、ローリングサークル産物から直接シーケンシングすることで、上記のサークルシーケンシング手法と同じ利点が多数得られる。

【0014】

ＳＭＲＴ－１分子リアルタイムシーケンシング（Ｆｌｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７（６）：４６１－５（２０１０）（非特許文献１０））と呼ばれる第６の手法は、ＤＮＡ断片の末端にヘアピンループを追加して、鎖置換活性をもつＤＮＡポリメラーゼを、その共有結合した閉ループの周りに伸長させ、２つの相補鎖に関する配列情報を得ることに基づくものである。具体的には、１分子のポリメラーゼが、蛍光標識ヌクレオチドの相補核酸鎖への取り込みを触媒する。メチル化塩基の反対側のヌクレオチドを取り込むと、ポリメラーゼは減速または「スタッター」し、その結果生じる蛍光パルスにより、Ｎ^６－メチルアデニン、５－メチルシトシン、及び５－ヒドロキシメチルシトシンを含む、ＤＮＡ鋳型内の修飾ヌクレオチドを直接検出することができる。特にポリメラーゼが閉ループを数回横断して、コンセンサス配列を決定できるようになるため、この手法の精度は向上している。この技術は「ダンベル」型の基質（ほとんどが、ＤＮＡの線形断片の２つの相補配列で構成される）の配列情報を得るように設計されているが、一本鎖の環状基質にも適用することができる。

【0015】

いくつかの研究グループ及び企業が、固有の分子識別子（ＵＭＩ）またはバーコードを各断片に付加しながら、特異的標的配列を増幅するキットを開発している。

【0016】

ＳｉＭＳｅｎ－Ｓｅｑ（シーケンシングを用いた高感度変異検出のための、単純マルチプレックスＰＣＲによるＤＮＡのバーコード処理）と呼ばれる簡潔な手法は、高忠実度のポリメラーゼを用いた２ラウンドのＰＣＲを使用して、各断片、ならびに外部ユニバーサルプライマーにヘアピン保護バーコードを付加する（Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｍｐｌｅ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ，ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４（１１）：ｅ１０５）（２０１６）（非特許文献１１））。この手法では、標的ＤＮＡからバーコードを「隠す」アダプターステムが一方のプライマーに含まれているため、バーコード配列内のランダムな塩基によって、標的へのプライマーのハイブリダイゼーションが誤誘導されることがない。他方のプライマーは、末端にＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列をもつ通常のプライマーである。高忠実度ポリメラーゼによる２ラウンドの増幅の後、アダプター及びバーコードが標的断片に付加される。プロテアーゼ処理及び希釈後に、患者の識別子バーコードが含まれるＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを使用して２回目のＰＣＲを実行する。この手法は、未処理のシーケンシングエラーのホットスポット位置を特定していたが、現在では１本の鎖のみをバーコード処理するように設計されている。

【0017】

ＴｈｒｕＰＬＥＸ Ｔａｇ－ｓｅｑキット（Ｒｕｂｉｃｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）では、ステムループアダプターを二本鎖ＤＮＡの末端にライゲーションする。標準のＹアダプターと同様に、ゲノムＤＮＡが修復されて平滑末端が得られる。次の工程で、５’末端がブロックされた固有の分子タグ（ＵＭＩ）を含むステムループアダプターが、ＤＮＡの５’末端にライゲーションされ、標的断片の３’末端にニックが残る。ステムループアダプターには一本鎖オーバーハングがなく、互いのライゲーションが起きにくい。これはどちらも、他の多くのＮＧＳ調製物に見られる非特異的なバックグラウンドに影響するものである。代わりに、ステムループアダプターには切断可能な複製停止塩基が含まれている。最後の工程で、ＤＮＡの３’末端を伸長してライブラリ合成が完了し、高忠実度の増幅により、Ｉｌｌｕｍｉｎａ互換インデックスが付加される。空のアダプターが残存する場合は分解される。ライゲーション反応は非効率的なことがあり、変異試料の投入量が制限される場合には収量が低下する可能性が生じる。さらに、この手法は特異的標的の選択性がない。

【0018】

ＮＥＢＮｅｘｔ Ｄｉｒｅｃｔ標的濃縮手法（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）では、ＤＮＡを約１５０～２００ｂｐ長に断片化する。断片化されたＤＮＡは、対象とする各標的の３’末端を規定するビオチン化オリゴヌクレオチド「ベイト」に迅速にハイブリダイズされる。このようなオリゴヌクレオチドベイトは、各標的のトップ鎖とボトム鎖の両方に設計される。ベイト－標的のハイブリッドをストレプトアビジンビーズに結合し、３’オフターゲット配列があれば酵素によりトリミングすることで平滑末端が生成される。このようにハイブリダイゼーション時間の短さと３’オフターゲット配列の酵素除去とを兼ね備えることで、従来のハイブリダイゼーションによる濃縮方法と比較して、シーケンシング効率の向上が可能になる。次に、トリミングした標的を、固有の分子識別子（ＵＭＩ）及び試料バーコードを含むＩｌｌｕｍｉｎａ互換ライブラリに変換する。この変換は次のように実行される。ターミナルトランスフェラーゼで平滑末端をｄＡテール化し、ヘアピン型ループ配列と一本鎖ｄＡオーバーハングとのライゲーションを可能にする。次に、ＤＮＡポリメラーゼでプローブを伸長して元の断片のコピーを生成し、ランダムな５’末端をもつ二本鎖ＤＮＡを生成する。これらの末端を平滑化し（Ｔ４ポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼ１を使用）、最初の断片化によるリン酸が５’末端に含まれるか、またはＴ４キナーゼを使用してリン酸が付加される。これで、この新しい末端がＵＭＩ配列を含む元の標的鎖へのアダプターのライゲーションに適するものになる。次に、アダプターヘアピンループを切断することにより、５’アダプター配列、ＵＭＩ配列、５’標的配列のストレッチ、ベイトに相補的な３’末端までの目的標的領域、ｐｏｌｙｄＡ配列、そしてさらに３’アダプター配列で構成されるトップ鎖が生成される。次に、このトップ鎖を溶解してストレプトアビジンビーズを除去でき、これを精製すると、患者識別子バーコードを含むＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔアダプターによる増幅に適するものになる。１日以内で配列に対応したライブラリが生成される。この手順は、ほとんどの自動液体処理装置と適合性がある。この技術は、目的とする断片のみの捕捉に非常に効率的であるように設計されているが、長時間の複数工程を要する手順でもあり、変異試料の投入量が制限される場合には収量が低下する可能性がある。

【0019】

ＱＩＡｓｅｑ標的ＲＮＡシーケンシング手法（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）では、固有の識別子をＲＮＡ配列に付加することで、その正確な計数が可能である。ＲＮＡ試料を精製した後、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを合成する。最初の５’共通配列、内部の１２塩基分子タグ（すなわちＵＭＩ）、及び遺伝子特異的３’部分で構成される複合プライマーを使用して、ｃＤＮＡから伸長産物を生成する。伸長後、反応物を精製して未反応のプライマーを除去する。これに続いて、ユニバーサルプライマー、及び第２の５’共通配列を含む第２の遺伝子特異的プライマーを使用して第１段階のＰＣＲを行う。製造業者によれば、第１の遺伝子特異的プライマーと第２の遺伝子特異的プライマーは、「互いを認識しないため、プライマー二量体が最小限に抑えられる」。第１のＰＣＲの後に、追加の反応物精製工程がある。これに続いて、ユニバーサルアダプター配列を使用して第２段階のＰＣＲを行い、患者識別子バーコードを含むＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔアダプターを付加する。６時間以内で配列に対応したライブラリが生成される。各初期ｃＤＮＡ分子は、ＵＭＩを含むプライマーによって伸長することが想定されるため、転写産物を固有のＵＭＩと照合して、各ＲＮＡ分子の元の転写産物が存在する数を計数できるため、１つの転写産物の５つの複製物を同じ遺伝子の５つの固有の転写産物と区別することができる。この技術は、ＲＮＡ－ｓｅｑの場合と同様であるが、非常に特異的な目的とする断片についてＲＮＡ断片を計数するように設計されている。また、この技術は、低存在量の変異の同定にも適合可能であるが、複数回の洗浄手順により、変異試料の投入量が制限される場合には収量が低下する可能性が生じる。

【0020】

液体生検の臨床研究のためのＯｎｃｏｍｉｎｅ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）では、２段階のＰＣＲ反応を使用して、ｃｆＤＮＡから標的配列を直接増幅する。順方向と逆方向両方の複合プライマーには、第１／第２の５’共通配列、内部の固有分子タグ（すなわちＵＭＩ）、及び遺伝子特異的３’部分を含む。正確には２サイクルのＰＣＲ後に、２つの複合二本鎖産物が形成される。第１の産物には、トップ鎖プライマー伸長産物、トップ鎖標的配列、及び第２の共通配列を含むボトム鎖プライマーの相補体を含む。これを、ボトム鎖標的配列を含むボトム鎖プライマーの初期伸長にハイブリダイズする。第２の産物には、ボトム鎖プライマー伸長産物、ボトム鎖標的配列、及び第１の共通配列を含むトップ鎖プライマーの相補体を含む。これを、トップ鎖標的配列を含むトップ鎖プライマーの初期伸長物にハイブリダイズする。したがって、トップ鎖とボトム鎖の両方に、ユニバーサルアダプター配列、及び各初期標的鎖から生じる固有のＵＭＩ配列が含まれる。次に、遺伝子特異的プライマーから精製された標的アンプリコンが固体支持体上に捕捉される。固体支持体から産物を遊離させた後、ユニバーサルアダプター配列を使用して適切な第２段階のＰＣＲを行い、患者識別子バーコードを含むＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔアダプターを付加する。数時間以内で配列に対応したライブラリが生成され、その後、ビーズ上でのエマルジョンＰＣＲを使用して、さらなる鋳型調製物と組み合わせることができる。この手法は非常に迅速かつ頑強であるが、最初の遺伝子特異的プライマーを物理的に除去すると共に、第２のＰＣＲ工程後に（おそらくプライマー二量体を排除するため）精製／サイズ選別するという余分な工程を必要とする。また、この手順により、変異試料の投入量が制限される場合に収量が低下する可能性が生じるかどうかは不明瞭である。

【0021】

本発明は、当技術分野における上記及び他の欠点を克服することを対象とする。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0022】

【文献】米国特許出願公開第ＵＳ ２０１４／００６６３１７ Ａ１号

【非特許文献】

【0023】

【文献】Ｆｏｒｓｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ，” Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．４（１３６）：１３６（２０１２）

【文献】Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８（２３）：９５３０－５（２０１１）

【文献】Ｎａｒａｙａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｔｓｐｏｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｕｓｉｎｇ Ｅｒｒｏｒ－ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２（１４）：３４９２－８（２０１２）

【文献】Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｌｔｒａ－Ｒａｒｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９（３６）：１４５０８－１３（２０１２）

【文献】Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ，Ｈｉｇｈ－Ａｃｃｕｒａｃｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ－Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ，” Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（５）：８４３－５４（２０１３）

【文献】Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｅｒｒｏｒｓ ａｒｅ Ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｍａｇｎｉｔｕｄｅ Ｕｓｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０（４９）：１９８７２－７（２０１３）

【文献】Ａｃｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｆｉｔｎｅｓｓ Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ ｏｆ ａｎ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｎａｔｕｒｅ ２０１４ ５０５（７４８５）：６８６－９０（２０１４）

【文献】Ａｃｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ，” Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．９（７）：１７６０－９（２０１４）

【文献】Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｂａｓｅ Ｒｅａｄｓ ｏｎ Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ＤＮＡ Ｎａｎｏａｒｒａｙｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７（５９６１）：７８－８１（２０１０）

【文献】Ｆｌｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７（６）：４６１－５（２０１０）

【文献】Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｍｐｌｅ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ，ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４（１１）：ｅ１０５）（２０１６）

【発明の概要】

【0024】

本発明の一態様は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムに関する。本システムには、注入口及びカートリッジが含まれる。カートリッジは、注入口と流体連結された複数の一次反応チャンバーを含む空間を画定しており、そのチャンバーに注入口からの物質を受け入れ、その物質から一次反応チャンバー産物を産生する。この空間にはまた、複数の個々の列の複数の産物捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体も含まれ、各個々の産物捕捉サブユニットは、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロポアまたはマイクロウェルのアレイを含み、そこで一次反応産物をさらに反応させてアレイ産物を産生する。アレイ産物は、マイクロポアまたはマイクロウェルで検出されるが、その場合、個々の産物捕捉サブユニットの１つ以上の列に、複数の一次反応チャンバーのうちの１つを通った物質を受け入れる。

【0025】

本発明の別の態様は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムに関する。システムには、注入口、出口、及びマイクロポアまたはマイクロウェルのアレイを含むカートリッジを含み、カートリッジは注入口及び出口と流体連結されている。カートリッジは、注入口と流体連結された複数の一次反応チャンバーを含む空間を画定しており、そのチャンバーに注入口からの物質を受け入れ、その物質から一次反応チャンバー産物を産生する。この空間にはまた、複数の二次反応チャンバーが含まれ、そのうちの１つ以上は、複数の一次反応チャンバーのうちの１つと流体連結されており、そこに複数の一次反応チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れ、二次反応チャンバー産物を産生する。複数の一次及び二次反応チャンバーの少なくともいくつかを、複数の一次及び二次反応チャンバー内に液体のトラフを保持するように構成することで、後続反応でチャンバー産物またはアレイ産物を産生するための試料、試薬、及び／または生成反応物の混合が容易になる。この空間にはまた、それぞれが複数の二次反応チャンバーのうちの１つと流体連結された複数の混合チャンバーが含まれ、そこに複数の二次反応チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れ、物質を産物捕捉筐体に排出し、それにより、個々の産物捕捉サブユニットの各列が、１つ以上の混合チャンバーのうちの１つに流体連結され、１つ以上の混合チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れる。この空間にはまた、複数の個々の列の複数の産物捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体も含まれ、各個々の産物捕捉サブユニットは、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロポアまたはマイクロウェルのアレイを含み、そこで二次反応産物をさらに反応させてアレイ産物を産生する。アレイ産物は、マイクロポアまたはマイクロウェルで検出されるが、その場合、個々の産物捕捉サブユニットの１つ以上の列に、複数の一次反応チャンバーのうちの１つを通った物質を受け入れる。

【0026】

本発明の別の態様は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムに関する。システムには、注入口、出口、ならびに注入口及び出口と流体連結されているカートリッジを含む。カートリッジは、複数の個々の列の産物捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体が含まれる空間を画定する。各個々の産物捕捉サブユニットは、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロポアのアレイを含み、マイクロポアはそれぞれ、対向する第１及び第２の開口端を有し、第１の端は大きい直径を有し、第２の端は第１の端の直径よりも小さい直径を有する。産物捕捉筐体は、物質が注入口から産物捕捉サブユニットの列を通って、それらサブユニット内のマイクロポアのアレイと接触し、出口に至ることが可能であるように、複数の流体流路を備えており、この複数の流体流路は固体支持体の上及び下に位置する。

【0027】

本発明のさらなる態様は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの調製方法に関する。この方法は、本発明のシステムを提供すること、ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを、産物捕捉筐体内の固体支持体上の産物捕捉サブユニットのマイクロポアまたはマイクロウェルに加えることを含む。その結果、ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブが、マイクロポアまたはマイクロウェル内に保持される。

【0028】

本発明の別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。１つ以上の一次反応チャンバー及び／または１つ以上の二次反応チャンバー（存在する場合）の充填に続くプロセスには、システムで一次反応及び／または二次反応を実行し、一次反応及び／または二次反応の実行に基づいて、マイクロウェルまたはマイクロポア内の試料中の標的核酸分子の存在を検出することを含む。

【0029】

本発明の別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。一次反応及び／または二次反応の実行後、消光基及び蛍光基を含む１つ以上のプローブをポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはリボヌクレアーゼが標的特異的に切断する条件下で、そのような反応の産物をマイクロウェルまたはマイクロポア内で増幅すると、標的核酸分子が試料に存在する場合、蛍光基が遊離されてシグナルが生じる。

【0030】

本発明の別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。このプロセスには、複数の標的核酸分子が含まれる試料を供給し、次いで標的核酸分子の一部に相補的な第１の部分、及び第２の部分を有する一次オリゴヌクレオチドプライマーのセット及びポリメラーゼとその試料とを接触させ、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成することを含む。この混合物を一次反応チャンバーでポリメラーゼ連鎖反応に供し、増幅産物のセットを産生する。増幅産物は、複数の個々の列の複数の捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体に送られる。各個々の産物捕捉サブユニットは、第２の部分に相補的な固定された捕捉プローブを含む複数の個別のマイクロポアのアレイを含む。固定された捕捉プローブに標的核酸分子が捕捉され、コピーされる。固定された標的核酸分子のヌクレオチド配列は、マイクロポアでシーケンシング反応を実行することにより得られる。

【0031】

本発明はまた、試料中の複数の核酸分子を同定するためのマイクロタイタープレートを調製するプロセスに関する。これには、複数の個々の行と列をもつ産物捕捉サブユニットを備えるマイクロタイタープレートを提供することを含み、各個々の産物捕捉サブユニットは、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロウェルのアレイを含む。マイクロタイタープレートのマイクロウェルに、オリゴヌクレオチドプライマー及び／またはプローブを含有する水性液体を充填する。マイクロタイタープレートを遠心分離して、水性液体を、マイクロタイタープレート内の各個々の産物捕捉サブユニットの未充填マイクロウェルに分散させる。その後、遠心分離が終了すると、水性液体が疎水性表面と接触していない状態になる。水性液体を蒸発させ、マイクロウェルを乾燥することで、マイクロウェルにオリゴヌクレオチドプライマーを残留させる。

【0032】

本発明の別の態様は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムに関する。このシステムには、注入口、出口、ならびに注入口及び出口と流体連結されているカートリッジを含む。カートリッジは、複数の個々の列の産物捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体が含まれる空間を画定する。各個々の産物捕捉サブユニットは、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロポアのアレイを含み、マイクロポアはそれぞれ、対向する第１及び第２の開口端を有し、第１の端は大きい直径を有し、第２の端は第１の端の直径よりも小さい直径を有する。産物捕捉筐体は、物質が注入口から産物捕捉サブユニットの列を通って、それらサブユニット内のマイクロポアのアレイと接触し、出口に至ることが可能であるように、複数の流体流路を備えており、この複数の流体流路は固体支持体の上及び下に位置する。

【0033】

本発明は、血液試料から疾患の原因を直接判定するための一連のデバイス、チャンバー、及びアッセイを提供する。臨床試料から核酸を精製し、標的領域を一連の増幅反応に供し、リアルタイムＰＣＲまたはシーケンシングのいずれかを読み取り値として使用して、標的を同定または計数する。

【0034】

本発明は、米国及び世界が直面している主要な診断臨床上の課題に対処しやすくすることを目的とする。最大の未充足ニーズは、最も早い段階でがんを発見することである。利用可能で正確な早期発見検査は、米国で年間３００，０００人超、世界で４，０００，０００人超の生命を救う可能性があり、米国だけで年間医療費を３０００億ドル節約することができる。この課題の解決策の一つとして有望なものが、本出願で説明するような、１分子レベルの感度で、複数のＤＮＡ変異及びメチル化の変化を同時にアッセイするプロセスとシステムを提供することである。同じアッセイを使用して、血液中の「がんマーカーの負荷」を監視し、所与の治療が手術後の残存がん細胞をどれだけ効果的に殺傷しているかを監視することもできる。関連する課題は、別の治療法がまだ有効であり得る時点で、がんの早期再発について患者を監視することである。本発明は、がんマーカーの追跡に、Ｔａｑｍａｎ（商標）アッセイ、シーケンシング、またはその両方を使用する柔軟性が得られる。

【0035】

感染性疾患検査は、単一の病原体検出から、症状に基づく病原体検出または血液媒介性の病原体検出へと移行しつつある。本発明は、何百もの標的に対する正確なウイルス負荷値または細菌負荷値が同時に得られる可能性をもち、医師が臨床的に実行可能な決定を下す指針となる。例えば、呼吸器疾患を患っている患者を、インフルエンザ及びパラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト型結核菌、肺炎球菌、Ａ群レンサ球菌、マイコプラズマ肺炎、ヘモフィルスインフルエンザなどのあらゆる株について同時に検査することができる。血液媒介性の病原体の場合、本発明を使用して、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ＭＲＳＡ、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（ＶＲＥ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（毒素生産物を含む）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（ＫＰＣのものを含む）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）などを区別することができる。発熱の症状がある海外旅行者を検査して、ジカウイルスを、ウイルス性出血熱（デング熱、黄熱病、西ナイル熱、アレナウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、及びその他のフラビウイルス）またはその他のウイルス（インフルエンザ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ、チクングニア、風疹、はしか、パルボウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルス、及びアルファウイルス感染）、または寄生虫原因（マラリア）もしくは細菌原因（Ａ群レンサ球菌、リケッチア、ボレリア、レプトスピラ症）と区別することができる。

【0036】

非侵襲的出生前検査は現在、直接シーケンシングによる染色体断片の計数、またはアレイを用いた定量によるライゲーションに基づく検出のいずれかを使用して染色体コピー異常を識別するために使用されている。１分子レベルで標的を正確に同定及び計数する本発明の能力は、正確性の高い結果をより低コストで提供する機会をもたらすと考えられる。例として、生命にかかわる常染色体及びＸ連鎖劣性メンデル型遺伝病；２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、ターナー症候群、クラインフェルター症候群（染色体コピー異常）；デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、ならびにその他の遺伝性疾患について、より完全な血液検査が可能である。
[本発明1001]
注入口と
空間を画定するカートリッジと
を含む、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムであって、
前記空間が、
前記注入口からの物質を受け入れ、前記物質から一次反応チャンバー産物を産生するために前記注入口と流体連結された、複数の一次反応チャンバーと、
複数の産物捕捉サブユニットの複数の個々の列を備える固体支持体の入った産物捕捉筐体であって、各個々の産物捕捉サブユニットが、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロポアまたはマイクロウェルのアレイを含み、そこで一次反応産物をさらに反応させてアレイ産物を産生し、これを前記マイクロポアまたはマイクロウェルで検出し、ここで、個々の産物捕捉サブユニットの1つ以上の前記列に、前記複数の一次反応チャンバーのうちの1つを通った物質を受け入れる、前記産物捕捉筐体と
を含む、
前記システム。
[本発明1002]
前記産物捕捉筐体から物質を排出するための出口をさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1003]
前記カートリッジによって画定される前記空間が、
そこに前記注入口から物質が排出され、そこから物質が前記複数の一次反応チャンバーに排出される、1つ以上の初期反応チャンバー
をさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1004]
前記カートリッジによって画定される前記空間が、
前記複数の一次反応チャンバーのうちの1つからの物質を受け入れるために、そのうちの1つ以上が前記複数の一次反応チャンバーのうちの1つと流体連結されている、複数の二次反応チャンバーと、
前記複数の二次反応チャンバーのうちの1つからの物質を受け入れ、かつ物質を前記産物捕捉筐体に排出し、それにより、個々の産物捕捉サブユニットの各列が、1つ以上の混合チャンバーのうちの1つからの物質を受け入れるために該1つ以上の混合チャンバーのうちの1つに流体連結された、それぞれが前記複数の二次反応チャンバーのうちの1つと流体連結された複数の混合チャンバーと
をさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1005]
前記複数の一次及び二次反応チャンバーの少なくともいくつかが、前記複数の一次及び二次反応チャンバー内に液体のトラフを保持するように構成される、本発明1004のシステム。
[本発明1006]
前記複数の一次及び二次反応チャンバーのそれぞれが、前記複数の一次及び二次反応チャンバー内に液体のトラフを保持する内部バッフルを有する、本発明1004のシステム。
[本発明1007]
前記複数の一次及び／または二次反応チャンバーのそれぞれが、前記複数の一次及び二次反応チャンバー内に複数の液体のトラフを保持する1つ以上の内部バッフルを有する、本発明1004のシステム。
[本発明1008]
前記混合チャンバーのそれぞれが、物質が前記混合チャンバーに入る付近から、物質が前記混合チャンバーを出る付近まで延在する仕切部を含む、本発明1004のシステム。
[本発明1009]
前記混合チャンバーのそれぞれが、疎水性の高い第1の表面と、第1の表面から間隔をあけて配置され、第1の表面よりも疎水性が低い第2の表面とを含み、
前記第1及び第2の表面が、物質が前記混合チャンバーに入る付近から、物質が前記混合チャンバーを出る付近まで延在する、
本発明1004のシステム。
[本発明1010]
前記一次反応チャンバー及び／または前記二次反応チャンバーが、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブをそこにスポットできる内部表面を含む、本発明1004のシステム。
[本発明1011]
前記産物捕捉サブユニットが、複数の個別のマイクロポアのアレイを含み、前記マイクロポアはそれぞれ、対向する第1及び第2の開口端を有し、前記第1の端は大きい直径を有し、前記第2の端は前記第1の端の直径よりも小さい直径を有する、本発明1001のシステム。
[本発明1012]
前記産物捕捉筐体内の前記マイクロポアの前記第2の端を覆うメッシュスクリーン
をさらに含む、本発明1011のシステム。
[本発明1013]
前記個別のマイクロポア内に配置されたビーズ
をさらに含む、本発明1011のシステム。
[本発明1014]
前記産物捕捉サブユニットが、開口端及び閉口端をそれぞれが有する複数の個別のマイクロウェルのアレイを含む、本発明1001のシステム。
[本発明1015]
前記産物捕捉筐体が、
物質が前記複数の混合チャンバーから前記産物捕捉サブユニットの列を通って、それらサブユニット内のマイクロポアまたはマイクロウェルのアレイと接触することを可能にする複数の流体流路
を含む、本発明1004のシステム。
[本発明1016]
前記複数の流体流路が、前記固体支持体の上方及び下方に位置する、本発明1015のシステム。
[本発明1017]
前記複数の流体流路が、前記固体支持体の上方に位置する、本発明1015のシステム。
[本発明1018]
前記注入口を通して試薬または反応物をカートリッジへ誘導するか、またはカートリッジから排出するか、を選択するための1つ以上のバルブ
をさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1019]
前記出口及び／または前記産物捕捉筐体内の前記出口から離れた位置を通して試薬または反応物を前記産物捕捉筐体へ誘導するか、または前記産物捕捉筐体から排出するか、を選択するための1つ以上のバルブ
をさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1020]
前記一次反応チャンバー及び／または前記産物捕捉筐体に近接する1つ以上の発熱体を前記カートリッジ内にさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1021]
前記初期反応チャンバーに近接する1つ以上の発熱体を前記カートリッジ内にさらに含む、本発明1003のシステム。
[本発明1022]
前記二次反応チャンバーのうちの1つ及び／または前記1つ以上の前記混合チャンバーに近接する1つ以上の発熱体を前記カートリッジ内にさらに含む、本発明1004のシステム。
[本発明1023]
試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの調製方法であって、
本発明1001のシステムを提供することと、
ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを、前記産物捕捉筐体内の前記固体支持体上の前記産物捕捉サブユニットの前記マイクロポアまたはマイクロウェルに加え、それにより、前記ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを前記マイクロポアまたはマイクロウェル内に保持することと
を含む、前記方法。
[本発明1024]
前記試料中の標的核酸の一部と相補的なヌクレオチド配列を含む第1の部分をそれぞれが有する一次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを、前記1つ以上の一次反応チャンバーに充填することをさらに含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記一次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが、
前記マイクロポアまたはマイクロウェル内に保持されたユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーの一部と同一であるかまたは相補的であるヌクレオチド配列を含む、第2の部分
をさらに含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの調製方法であって、
本発明1004のシステムを提供することと、
ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを、前記産物捕捉筐体内の前記固体支持体上の前記産物捕捉サブユニットの前記マイクロポアまたはマイクロウェルに加え、それにより、前記ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを前記マイクロポアまたはマイクロウェル内に保持することと
を含む、前記方法。
[本発明1027]
前記試料中の標的核酸の一部と相補的なヌクレオチド配列を含む第1の部分をそれぞれが有する一次または二次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを、前記1つ以上の一次反応チャンバー及び／または二次反応チャンバーに充填することをさらに含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記一次または二次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが、
前記マイクロポアまたはマイクロウェル内に保持されたユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーの一部と同一であるかまたは相補的であるヌクレオチド配列を含む、第2の部分
をさらに含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記産物捕捉サブユニットが、個別のマイクロポアのアレイを含み、
前記マイクロポアはそれぞれ、対向する第1及び第2の開口端を有し、
前記第1の端は大きい直径を有し、前記第2の端は前記第1の端の直径よりも小さい直径を有し、
前記マイクロポアの前記第1の端と流体連通する第1の通路と、前記マイクロポアの前記第2の端と流体連通する第2の通路と、を備え、
ここで、前記ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブが、以下に示す順序の以下の工程：
疎水性液体を前記第2の通路に通しながら、前記ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを、前記第1の通路を通して、前記第1の開口端から前記マイクロポアに通す工程；
疎水性液体を前記第2の通路に通しながら、疎水性液体を前記第1の通路に通す工程；
疎水性液体を前記第2の通路に通しながら、揮発性溶媒を前記第1の通路に通す工程；及び
熱、疎水性液体、揮発性溶媒、さらに空気を前記第2の通路に通しながら、空気を前記第1の通路を通す工程
を含む方法により、前記マイクロポアに加えられる、
本発明1023または本発明1026の方法。
[本発明1030]
前記産物捕捉サブユニットが、個別のマイクロポアのアレイを含み、
前記マイクロポアはそれぞれ、対向する第1及び第2の開口端を有し、
前記第1の端は大きい直径を有し、前記第2の端は前記第1の端の直径よりも小さい直径を有し、
前記マイクロポアの前記第1の端と流体連通する第1の通路と、前記第2の端を覆うメッシュスクリーンによって前記マイクロポアの前記第2の端と隔てられかつ第2の通路と流体連通される第2の通路と、を備え、
ここで、前記検出または捕捉オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが、以下に示す順序の以下の工程：
前記ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを、前記第1の通路を通して、前記第1の開口端から前記マイクロポアに通す工程；
前記ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを前記第1の通路から排出しながら、疎水性液体を前記第1の通路に通す工程；
疎水性液体を前記第2の通路に通しながら、疎水性液体を前記第1の通路に通す工程；
疎水性液体を前記第2の通路に通しながら、揮発性溶媒を前記第1の通路に通す工程；及び
熱、疎水性液体、揮発性溶媒、さらに空気を前記第2の通路に通しながら、空気を前記第1の通路を通す工程
を含む方法により、前記マイクロポアに加えられる、
本発明1023または本発明1026の方法。
[本発明1031]
本発明1025または本発明1028の方法により調製されるシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスであって、
前記1つ以上の一次反応チャンバーに充填することが、及び存在する場合には任意で、前記1つ以上の二次反応チャンバーに充填することが、
前記システム内で前記一次反応及び／または二次反応を実行することと、
前記一次反応及び／または二次反応の実行に基づいて、前記マイクロウェルまたはマイクロポア内の前記試料中の標的核酸分子の存在を検出することと
をさらに含む、前記プロセス。
[本発明1032]
前記検出することが、
標的核酸分子が試料に存在する場合、蛍光基が遊離されてシグナルが生じるように、消光基及び蛍光基を含む1つ以上のプローブをポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはリボヌクレアーゼが標的特異的に切断する条件下で、前記一次及び／または二次反応の前記産物を前記マイクロウェルまたはマイクロポア内で増幅すること
を含む、本発明1031のプロセス。
[本発明1033]
前記一次反応及び／または二次反応を実行することが、
複数の標的核酸分子が含まれる試料を供給することと；
第1のポリメラーゼ伸長または連鎖反応混合物を形成するために、前記標的核酸分子の一部に相補的な第1の部分、または前記標的核酸分子の相補体を有する一次オリゴヌクレオチドプライマーのセット、及びポリメラーゼと、前記試料とを接触させることと；
伸長産物または増幅産物の第1のセットを産生するために、1つ以上の初期反応チャンバーまたは一次反応チャンバーで前記第1のポリメラーゼ伸長または連鎖反応混合物を第1のポリメラーゼ伸長または連鎖反応に供することと；
第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、伸長産物または増幅産物の前記第1のセットを、一次伸長産物または一次増幅産物の一部と相補的である第1の部分を有する二次オリゴヌクレオチドプライマーのセット、及びポリメラーゼとを接触させることと；
5’の第2の部分配列、標的ヌクレオチド配列特異的部分またはその相補体、及び3’の第2の部分相補配列をそれぞれの二次増幅産物が含む増幅産物の第2のセットを産生するために、前記一次または二次反応チャンバーで前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を第2のポリメラーゼ連鎖反応に供することと
を含む、本発明1031のプロセス。
[本発明1034]
前記一次反応及び／または二次反応を実行することが、
複数の標的核酸分子が含まれる試料を供給することと；
第1のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記標的核酸分子の一部に相補的な部分またはその伸長産物を有する一次オリゴヌクレオチドプライマーのセット、及びポリメラーゼと、前記試料とを接触させることと；
増幅産物の第1のセットを産生するために、1つ以上の初期反応チャンバーまたは一次反応チャンバーで前記第1のポリメラーゼ連鎖反応混合物を第1のポリメラーゼ連鎖反応に供することと；
リガーゼ検出反応混合物を形成するために、増幅産物の前記第1のセットの一部と相補的である第1の部分、及び第2の部分を有するオリゴヌクレオチドプローブのセット、ならびにリガーゼと、増幅産物の前記第1のセットとを接触させることと；
5’の第2の部分配列、標的ヌクレオチド配列特異的部分またはその相補体、及び3’の第2の部分配列をそれぞれのライゲーション産物が含むライゲーション産物のセットを産生するために、前記一次または二次反応チャンバーで前記リガーゼ検出反応混合物をリガーゼ検出反応に供することと
を含む、本発明1031のプロセス。
[本発明1035]
前記1つ以上の一次反応チャンバーに充填すること、存在する場合には前記1つ以上の二次反応チャンバーに充填すること、ならびに前記システムで一次反応及び／または二次反応を実行することが、以下に示す順序の以下の工程：
疎水性液体を前記注入口から前記システムに通す工程；
一次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、ならびに逆転写及び／もしくはポリメラーゼ連鎖反応試薬、さらに疎水性液体を前記注入口から前記システムに送る工程；
前記システムでポリメラーゼ伸長または連鎖反応を実行する工程；
前記注入口を通して前記システムから物質を排出する工程；
疎水性液体、ポリメラーゼ連鎖反応試薬またはリガーゼ検出反応試薬、さらに疎水性液体を前記注入口から前記システムに送る工程；ならびに
前記システムでポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ検出反応を実行する工程
を含むプロセスによって実行される、本発明1031のプロセス。
[本発明1036]
前記産物捕捉サブユニットが、個別のマイクロポアのアレイを含み、
前記マイクロポアはそれぞれ、対向する第1及び第2の開口端を有し、
前記第1の端は大きい直径を有し、前記第2の端は前記第1の端の直径よりも小さい直径を有し、
前記マイクロポアの第1の端と流体連通する第1の通路と、前記マイクロポアの前記第2の端と流体連通する第2の通路と、を備え、
ここで、前記システムで前記二次反応を実行することが、以下に示す順序の以下の工程：
疎水性液体を前記第2の通路に通しながら、ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ検出反応の前記産物を、前記第1の通路を通して前記産物捕捉筐体に送る工程；
疎水性液体を前記第1及び第2の通路に通す工程；及び
ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ検出反応の前記産物を、前記産物捕捉サブユニットの前記マイクロポア内でユニバーサルタグプライマー及びプローブとのポリメラーゼ連鎖反応に供する工程
を含むプロセスによって実行される、
本発明1031のプロセス。
[本発明1037]
前記産物捕捉サブユニットが、個別のマイクロポアのアレイを含み、
前記マイクロポアはそれぞれ、対向する第1及び第2の開口端を有し、
前記第1の端は大きい直径を有し、前記第2の端は前記第1の端の直径よりも小さい直径を有し、
前記マイクロポアの第1の端と流体連通する第1の通路と、前記マイクロポアの前記第2の端を覆うメッシュスクリーンによって前記マイクロポアの前記第2の端と流体連通されかつ隔てられた第2の通路と、を備え、
前記システムで前記二次反応を実行することが、以下に示す順序の以下の工程：
ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ検出反応の前記産物を、前記第1の通路を通して前記産物捕捉筐体に送る工程；
疎水性液体を前記第1の通路に通す工程；
疎水性液体を前記第1及び第2の通路に通す工程；
ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ検出反応の前記産物を、前記産物捕捉サブユニットの前記マイクロポア内でユニバーサルタグプライマー及びプローブとのポリメラーゼ連鎖反応に供する工程
を含むプロセスによって実行される、
本発明1031のプロセス。
[本発明1038]
1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写産物配列、1つ以上の転座、及び／または1つ以上のメチル化残基によって、前記試料中または他の試料中の他の核酸分子のヌクレオチド配列とは異なっている標的ヌクレオチド配列が含まれる複数の核酸分子を、試料において同定する、本発明1031のプロセス。
[本発明1039]
本発明1024の方法により調製されるシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスであって、前記1つ以上の一次反応チャンバーに充填することに続いて、前記プロセスが、
前記システム内で前記一次反応を実行することと、
前記一次反応を実行することに続いて前記試料中の標的核酸分子の前記ヌクレオチド配列を取得することと
をさらに含む、前記プロセス。
[本発明1040]
前記一次反応を実行することが、
複数の標的核酸分子が含まれる試料を供給することと；
ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記標的核酸分子の一部に相補的な第1の部分、及び第2の部分を有する一次オリゴヌクレオチドプライマーのセット、ならびにポリメラーゼと、前記試料とを接触させることと；
増幅産物のセットを産生するために、前記一次反応チャンバーで前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物をポリメラーゼ連鎖反応に供することと；
各個々の産物捕捉サブユニットが、前記第2の部分に相補的な固定された捕捉プローブを含む複数の個別のマイクロポアのアレイを含む、複数の個々の列の複数の捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った前記産物捕捉筐体に前記増幅産物を送ることであって、前記試料中の標的核酸分子の前記ヌクレオチド配列を取得することが前記マイクロポア内で実行される、前記送ることと
を含む、本発明1039のプロセス。
[本発明1041]
前記産物捕捉サブユニットが、複数の個別のマイクロポアのアレイを含み、前記マイクロポアはそれぞれ、対向する第1及び第2の開口端を有し、前記第1の端は大きい直径を有し、前記第2の端は前記第1の端の直径よりも小さい直径を有する、本発明1040のプロセス。
[本発明1042]
前記産物捕捉筐体内の前記マイクロポアの前記第2の端を覆うメッシュスクリーン
をさらに含む、本発明1041のプロセス。
[本発明1043]
前記個別のマイクロポア内に配置された前記固定された捕捉プローブを含むビーズ
をさらに含む、本発明1040のプロセス。
[本発明1044]
前記ヌクレオチド配列を取得する前と、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物をポリメラーゼ連鎖反応に供した後に、前記増幅産物から少なくとも1つの第2の部分を除去することをさらに含む、本発明1040のプロセス。
[本発明1045]
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、アプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ、もしくは8－オキシグアニンＤＮＡグリコシラーゼ、またはそれらの組み合わせを用いて、前記除去することを実施する、本発明1044のプロセス。
[本発明1046]
前記産物捕捉サブユニットが、個別のマイクロポアのアレイを含み、
前記マイクロポアはそれぞれ、対向する第1及び第2の開口端を有し、
前記第1の端は大きい直径を有し、前記第2の端は前記第1の端の直径よりも小さい直径を有し、
前記マイクロポアの第1の端と流体連通する第1の通路と、前記マイクロポアの前記第2の端を覆うメッシュスクリーンによって前記マイクロポアの前記第2の端と流体連通されかつ隔てられた第2の通路と、を備え、
ここで、前記ヌクレオチド配列を取得することが、以下に示す順序の以下の工程：
ポリメラーゼ連鎖反応の前記産物を、前記第1の通路を通して前記産物捕捉筐体に送る工程；
前記産物を個別のマイクロウェルに分配するように、疎水性液体を前記第1の通路に通す工程；
疎水性液体を前記第1及び第2の通路に通す工程；
増幅産物を産生する条件下で、前記マイクロウェルの内部表面に固定された前記捕捉オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応及び／または等温反応にて前記産物を増幅する工程；
疎水性液体を前記第2の通路に通しながら、揮発性溶媒を前記第1の通路に通す工程；
前記産物を個別のマイクロウェルに単離するように、疎水性液体を前記第2の通路に通しながら、前記ポリメラーゼ連鎖反応及び／または等温反応の前記産物を変性し、固定されていない核酸分子を前記第1の通路から洗い流す工程；
揮発性溶媒、空気、さらにシーケンシング試薬を前記第2の通路に通しながら、水よりも高密度の疎水性液体を前記第1の通路に通す工程；ならびに
前記産物捕捉サブユニットでシーケンシング反応を実行する工程
を含むプロセスによって実行される、
本発明1039のプロセス。
[本発明1047]
試料中の複数の核酸分子を同定するためのマイクロタイタープレートを調製するプロセスであって、
複数の個々の行と列をもつ産物捕捉サブユニットを備え、各個々の産物捕捉サブユニットが、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロウェルのアレイを含む、マイクロタイタープレートを提供することと；
オリゴヌクレオチドプライマー及び／またはプローブを含有する水性液体のセットを、前記マイクロタイタープレートの前記マイクロウェルのセットに充填することと；
前記水性液体を、前記マイクロタイタープレート内の各個々の産物捕捉サブユニットの未充填マイクロウェルに分散させるために、前記マイクロタイタープレートを遠心分離することと；
前記水性液体が前記疎水性表面と接触していない状態にするために、前記遠心分離を終了することと；
前記水性液体を蒸発させることと；
前記マイクロウェルに前記オリゴヌクレオチドプライマーを残留させるように、前記マイクロウェルを乾燥することと
を含む、前記プロセス。
[本発明1048]
本発明1047のプロセスにより調製されるマイクロタイタープレートを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスであって、
水性試料を前記マイクロタイタープレートに投入することと；
疎水性液体が前記水性試料の上に位置するように、前記疎水性液体を前記マイクロタイタープレートに投入することと；
前記水性液体を、前記マイクロタイタープレート内の未充填マイクロウェルに分散させるために、前記マイクロタイタープレートを遠心分離することと；
前記試料が前記疎水性表面と接触していない状態にするために、前記遠心分離を終了することと；
前記標的核酸分子が前記試料に存在する場合に、蛍光基が遊離されてシグナルが生じるように、消光基及び蛍光基を含む1つ以上のプローブをポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはリボヌクレアーゼが標的特異的に切断する条件下で、核酸分子の増幅反応を実施することと
を含む、前記プロセス。
[本発明1049]
1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写産物配列、1つ以上の転座、及び／または1つ以上のメチル化残基によって、前記試料中または他の試料中の他の核酸分子のヌクレオチド配列とは異なっている標的ヌクレオチド配列が含まれる複数の核酸分子を、試料において同定する、本発明1048のプロセス。
[本発明1050]
注入口と；
出口と；
前記注入口及び前記出口と流体連結し、空間を画定するカートリッジと
を含む、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムであって、
前記空間が、
複数の個々の列の産物捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体であって、各個々の産物捕捉サブユニットが、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロポアのアレイを含み、前記マイクロポアはそれぞれ、対向する第1及び第2の開口端を有し、前記第1の端は大きい直径を有し、前記第2の端は前記第1の端の直径よりも小さい直径を有し、物質が前記注入口から前記産物捕捉サブユニットの列を通って、前記サブユニット内のマイクロポアの前記アレイと接触しそして前記出口に至ることが可能であるように、前記産物捕捉筐体が複数の流体流路を備えており、前記複数の流体流路は前記固体支持体の上方及び下方に位置する、前記産物捕捉筐体
を含む、
前記システム。
[本発明1051]
前記注入口または前記出口を通して試薬及び／または反応物を前記産物捕捉筐体へ誘導するか、または前記産物捕捉筐体から排出するか、を選択するための1つ以上のバルブ
をさらに含む、本発明1050のシステム。
[本発明1052]
前記産物捕捉筐体に近接する1つ以上の発熱体を前記カートリッジ内にさらに含む、本発明1050のシステム。
[本発明1053]
試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの調製方法であって、
本発明1050のシステムを提供することと、
捕捉オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを、前記産物捕捉筐体内の前記固体支持体上の前記産物捕捉サブユニットの前記マイクロポアに加え、それにより、前記捕捉オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを前記マイクロポアまたはマイクロウェル内に保持することと
を含む、前記方法。
[本発明1054]
本発明1053の方法により調製されるシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスであって、捕捉オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを前記マイクロポアに前記加えることに続いて、前記プロセスが、
前記システム内で前記反応を実行することと、
前記反応の実行に基づいて、前記マイクロポア内の前記試料中の標的核酸分子の存在を検出することと
を含む、前記プロセス。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】図１Ａ～図１Ｄは、細区画で構成され、カートリッジとの流体連結に適する固体支持体の概略図を示す。各細区画には、後続のｑＰＣＲ、ＵｎｉＴａｑ、ＦＲＥＴ、ｑＬＤＲ、またはシーケンシング反応、及び標的同定のためのマイクロポアまたはマイクロウェルが含まれる。図１Ａでは、各細区画は幅４００ミクロン×長さ６００ミクロン（長方形断面図として図示）であり、直径５０ミクロンの２４個のマイクロポアまたはマイクロウェルが含まれる。細区画間にはさらに１００ミクロン幅の隆起部が使用され、細区画の間隔及び追加の構造支持体を提供する。これらを長方形の細区画の行間及び列間に「白色」領域として表す。図１Ｂでは、各細区画は幅６００ミクロン×長さ４００ミクロン（長方形断面図として図示）であり、直径５ミクロンの２，７６０個のマイクロポアまたはマイクロウェルが含まれる。細区画間にはさらに１００ミクロン幅の隆起部が使用され、細区画の間隔及び追加の構造支持体を提供する。図１Ｃでは、各細区画は幅８００ミクロン×長さ１，２００ミクロン（長方形断面図として図示）であり、直径５０ミクロンの９６個のマイクロポアまたはマイクロウェルが含まれる。細区画間にはさらに２００ミクロン幅の隆起部が使用され、細区画の間隔及び追加の構造支持体を提供する。図１Ｄでは、各細区画は幅４００ミクロン×長さ６００ミクロン（長方形断面図として図示）であり、直径５ミクロンの２，７６０個のマイクロポアまたはマイクロウェルが含まれる。細区画間にはさらに１００ミクロン幅の隆起部が使用され、細区画の間隔及び追加の構造支持体を提供する。

【図2】直径５０ミクロンのマイクロウェルまたはマイクロポアのアレイへのマイクロ流路の流体接続の概略正面図を示す。図２は、数千のマイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバーの例示的な設計の概略正面図を示している。この図では、注入試料は大きな六角形チャンバー（下部）に流体接続され、六角形チャンバーは第１の１２個の菱形チャンバーのセット（４個おきに、それぞれ大トラフ、中トラフ、及び小トラフを含む）に流体接続され、第１の１２個の菱形チャンバーのセットは第２の２４個の菱形チャンバーのセット（２個おきに、それぞれ大トラフ及び小トラフを含む）に流体接続され、第２の菱形チャンバーのセットは、２４個の細長い混合チャンバーに流体接続され、混合チャンバーは、マイクロウェルまたはマイクロポア（拡大正面図ではパネルの上部に２行のみを図示）が含まれるチャンバーに流体接続されている。

【図3】直径５ミクロンのマイクロポアのアレイへのマイクロ流路の流体接続の概略正面図を示す。図３は、Ｔａｑｍａｎ（商標）またはシーケンシング反応に適した、数百万のマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバーの別の例示的な設計の概略正面図を示している。この図では、注入試料は大きな六角形チャンバー（下部）に流体接続され、六角形チャンバーは第１の８個の六角形チャンバーのセット（４個おきに、それぞれ大トラフ及び小トラフを含む）に流体接続され、第１の六角形チャンバーのセットは第２の１６個の六角形チャンバーのセット（２個おきに、それぞれ大トラフ及び小トラフを含む）に流体接続され、第２の六角形チャンバーのセットは、１６個の細長い混合チャンバーに流体接続され、混合チャンバーは、マイクロウェルまたはマイクロポア（拡大正面図ではパネルの上部に２行のみを図示）が含まれるチャンバーに流体接続されている。

【図4】図４Ａ～図４Ｃは、固体支持体内の５０ミクロンのマイクロウェルの概略正面図（図４Ａ）、図４Ａの線Ｂ－Ｂに沿った断面図（図４Ｂ）、及び図４Ａの線Ｃ－Ｃに沿った断面図（図４Ｃ）を示し、流体の流れを誘導しやすくし、構造安定性をもたらすために、チャンバー間の隆起部がプレートにどのように連結されているかを示している。この図は、５または２．５ミクロンのマイクロポアにも該当するが、その場合、各チャンバー内に図示されるマイクロポアは多くなる。一実施形態では、縦方向の隆起部は上部プレート及び下部プレートと面一であり、横方向の隆起部は液体が列の上を流れるが、ある列から次の列へは流れないようにするためのくぼみまたは流路を有する。

【図5】図５Ａ～図５Ｃは、固体支持体内の５０ミクロンのマイクロウェルの概略正面図（図５Ａ）、図５Ａの線Ｂ－Ｂに沿った断面図（図５Ｂ）、及び図５Ａの線Ｃ－Ｃに沿った断面図（図５Ｃ）を示し、流体の流れを誘導しやすくし、構造安定性をもたらすために、チャンバー間の隆起部が２枚のプレートにどのように連結されているかを示している。この図は、５または２．５ミクロンのマイクロポアにも該当するが、その場合、各チャンバー内に図示されるマイクロポアは多くなる。この図では、チャンバーの前面は淡色プレートとマイクロポアの広径側との間の領域であり、チャンバーの背面は暗色プレートとマイクロポアの狭径側との間の領域である。背面プレートを発熱体に押し付けることで、温度制御、加熱、及び／または熱サイクルが可能になる。一実施形態では、縦方向の隆起部は上部プレート及び下部プレートと面一であり、横方向の隆起部は液体が列の上を流れるが、ある列から次の列へは流れないようにするためのくぼみまたは流路を有する。

【図6】図６Ａ～図６Ｃは、図１３と同様である固体支持体内の５０、５、または２．５ミクロンのマイクロポアの概略正面図（図６Ａ）、図６Ａの線Ｂ－Ｂに沿った断面図（図６Ｂ）、及び図６Ａの線Ｃ－Ｃに沿った断面図（図６Ｃ）を示す。ただし、この図では、５０、５、または２．５ミクロンのマイクロポアの底部が、２００～４００ナノメートル厚の窒化ケイ素上に０．５ミクロンの穴をもつ別の層をどのように備えるかを示している。この層により、５または２．５ミクロンのマイクロポアに前面から液体を充填することができ、背面の０．５ミクロンのポアから空気は通るが液体は漏れないようにすることができる。この図では、チャンバーの前面は淡色プレートとマイクロポアの広径側との間の領域であり、チャンバーの背面は暗色プレートとマイクロポアの狭径側との間の領域である。背面プレートを発熱体に押し付けることで、温度制御、加熱、及び／または熱サイクルが可能になる。

【図7】図７Ａ～図７Ｉは、異なる試薬を混合すること、様々な増幅反応を実施すること、または後ほど次の反応に使用するため、もしくはマイクロウェルもしくはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させるために上記増幅反応物の一部を保存することを含む様々な操作を行うことができるプレチャンバーの様々な設計の概略正面図を示す。図７Ａは、排出後に少量の反応物を保持するためのトラフを備えたチャンバーを示す。図７Ｂは、排出後に中量の反応物を保持するためのトラフを備えたチャンバーを示す。図７Ｃは、排出後に多量の反応物を保持するためのトラフを備えたチャンバーを示す。図７Ｄは、排出後に１種または２種の少量の反応物を保持するための２つのトラフを備えたチャンバーを示す。図７Ｅは、排出後に１種の中量の反応物及び／または１種の少量の反応物を保持するための２つのトラフを備えたチャンバーを示す。図７Ｆは、排出後に多量の反応物を保持するためのトラフを備え、第２の反応流体を下方へ移動させ、最初の反応により予め残存する産物と完全に混合することを確実にする追加障壁を備えるチャンバーを示す。図７Ｇは、図７Ａと同様であるが、チャンバー下部ではなく側面から試薬が投入される。図７Ｈは図７Ｇと類似しているが、より多量の産物がチャンバー下部に保持される。図７Ｉは、図７Ｈと同様であるが、水性液層と油層とを個別に移動できるような追加部分をいくつか備えている。図７Ｉでは、チャンバーは図７Ｈと同様であるが、追加部分をいくつか備える。

【図8】図８Ａ～図８Ｃは、マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバーの様々な設計の概略正面図を示す。図８Ａは、８つのチャンバー内の流体連結するプライマー及び／またはプローブ（灰色の円）が、チャンバーを出た後、より細長いチャンバーへ、そしてマイクロウェルまたはマイクロポアの行へと入り、最終的にマイクロウェルまたはマイクロポア内で乾燥され、内部表面に共有結合する例である。図８Ｂは、４＋４のチャンバーに流体連結する試薬が、チャンバーを出た後、より細長いチャンバーに入る例である。左側はコーティングされているか、極疎水性のプラスチックで作製されているが、右側はわずかに疎水性であるか、やや親水性である。図８Ｃは図８Ａと同様であるが、チャンバーが４つしかなく、プラスチック製の隆起部または仕切部を追加で備える。

【図9】図９Ａ～図９Ｂは、図５Ａ及び図６Ｂに例示されるような、マイクロポアに充填するための実施形態の概略側面図を示す。図９Ａは、上部と下部の両側が開口しているマイクロポアを示す。上部からマイクロポアにプライマー（及びプローブ）が流体導入されると同時に、下部から油が導入される。続いて、油によって頂部領域から水溶液が押し流され、プライマー／プローブは流体分離される。プライマーが固定され、乾燥される場合がある。図９Ｂは、頂部側が開口し、２００～４００ナノメートル厚の窒化ケイ素上に０．５ミクロンの穴をもつ別の層を備えるマイクロポアを示す。この層により、５０、５、または２．５ミクロンのマイクロポアに前面から液体を充填することができ、底面の０．５ミクロンの孔から空気は通るが液体は漏れないようにすることができる。

【図10】マイクロウェルまたはマイクロポアに充填する前に、反応チャンバーに充填する実施形態の概略正面図を示す。この構成は、２組の反応チャンバーで構成され、それぞれトラフを有し、第２のセットには適切なライゲーションプローブオリゴヌクレオチド（灰色の円）が事前にスポットされている。下部に軽油キャップを導入した後、標的、ＰＣＲプライマー、及びＰＣＲ試薬を含む水性液体を投入し、次いで重油を使用して、第１の反応チャンバーのセットに流体移動させる。ＰＣＲ工程の後、油と大半の水性反応物が排出され、最初の２つのチャンバーのトラフに産物の一部が残る。チャンバーに再び軽油を充填した後、ＬＤＲ試薬及び酵素を充填し、次いでこの水性反応混合物を、重油を使用して、第２の反応チャンバーのセット（事前にスポットされたＬＤＲプライマーとここで混合する）に流体移動させる。

【図11】図１１Ａ～図１１Ｂは、Ｔａｑｍａｎ（商標）またはＵｎｉＴａｑ反応などのリアルタイムＰＣＲ反応を実施するために、図５Ａ及び図６Ｂに例示されるようなマイクロポアに充填するための実施形態の概略正面図を示す。図は、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマーセット）を予備充填して乾燥させたマイクロポアから始まっている。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。図１１Ａでは、テール付き標的またはライゲーションされたプローブが下部前面からマイクロポアに流体導入されると同時に、下部背面から油が導入される。続いて、前面から油が流入すると、非生産的な容積から水性液体が押し出され、マイクロポアへ流入すると同時に、前面の各個々のマイクロポアが油で覆われる。図１１Ｂでは、マイクロポアの内側表面と０．５ミクロンの穴のある窒化ケイ素を除き、すべての表面が疎水性である。水性流体は下部前面から注入されると、前面からマイクロポアに入り、背面から空気を押し出すが、０．５ミクロンの窒化ケイ素の孔は通過しない。水性液体が前面からマイクロポアに充填されたときに、前面から油が流入すると、非生産的な容積から水性液体が押し出され、マイクロポアへ流入すると同時に、前面の各個々のマイクロポアが油で覆われる。チャンバーの背面に油が充填されてもよい。各マイクロポアは流体分離されており、後続の独立した増幅及び熱サイクル反応に適している。

【図12】シーケンシング反応を実行するために、図６に例示されるようなマイクロポアに充填するための実施形態の概略側面図を示す。この例では、マイクロポアの内側表面と０．５ミクロンの穴のある窒化ケイ素を除き、すべての表面が疎水性である。水性流体は下部前面から注入されると、前面からマイクロポアに入り、背面から空気を押し出すが、０．５ミクロンの窒化ケイ素の孔は通過しない。水性液体が前面からマイクロポアに充填されたときに、前面から油が流入すると、非生産的な容積から水性液体が押し出され、マイクロポアへ流入すると同時に、前面の各個々のマイクロポアが油で覆われる。背面にも油が充填されている。各マイクロポアは流体分離されており、鋳型鎖を増幅して、マイクロポアの内部表面の固体支持体に固定する後続の独立した熱サイクル反応に適している。油は前面チャンバーから排出され、反対側の鎖産物は変性され、他の産物及びプライマーは洗い流される。重油プラグを使用して前面チャンバー下部を塞ぐと同時に、背面をすすぐと、シーケンシングに適したマイクロポア内でクローン増殖されて固定された標的鎖がアレイに供給される。

【図13】図１３Ａ～１３Ｂは、図１及び図６に記載のマイクロウェルまたはマイクロポアを使用したチャンバー形式の概略正面図を示す。図１３Ａは、細区画が幅８００ミクロン×長さ１２００ミクロン（長方形断面図として図示）であるマイクロウェル形式であり、直径５０ミクロンの９６個のマイクロウェルが含まれる。細区画間にはさらに２００ミクロン幅の隆起部が使用され、細区画の間隔及び追加の構造支持体を提供する。これらを長方形の細区画の行間及び列間に「白色」領域として表す。図１３Ｂは、マイクロタイタープレート形式のマイクロポアのアレイ上でシーケンシングするためのマイクロ流体チャンバーの概要である。拡大図には、それぞれ２，０７２個のマイクロポアを含む、２つの二重列及び１つの二重行の細区画のみを示す。一実施形態では、マイクロポアを含むチャンバーへの供給は、流体閉鎖または流体開放できる一連の個々の開口部から、音響液滴射出を使用して、所与の列のチャンバーすべてに、試薬、酵素、標的、または前増幅した標的を流入させる。音響液滴射出を使用する場合、一連の親水性の入力チャンバーに液滴を供給し、続いてマイクロポアの列に供給することにより、個々の開口部への流体の流入を促進することができる。この概略図では、個々の開口部はそれぞれ親水性の入力チャンバーに接続されており、そのチャンバーから２列のマイクロポアへ供給される。さらに、チャンバーはまた、１つの入口からチャンバーすべてに試薬を流入させ、反対側で単一の廃棄口または出口へと流出させることを可能にするように流体連結されている。親水性の入力チャンバーに試薬、酵素、標的、または前増幅した標的が適切に充填されると、これらの開口部は閉じられ、その後、油または他の試薬が１つの入口から追加され、投入溶液がマイクロポアへと流体移動して、さらに反応が行われる。

【図14】適切なプライマー及びプローブの予備充填に適した、図１３Ａに記載のチャンバー内のマイクロウェルを使用するマイクロタイタープレート形式の概略側面図を示す。工程Ａは、疎水性プレート内の１つのチャンバーの側面図を示す。これには、両側に隆起部がある５０ミクロンの親水性ウェルが含まれる。工程Ｂで、プレートの上下を反転し、音響液滴射出を使用して、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、変異またはメチル化特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマーセット）を充填した。工程Ｃで、プレートを遠心分離し、空のマイクロウェルに水性液体を分散させる。対する工程Ｄは、遠心分離後に、水溶液が疎水性表面を回避するように、マイクロウェル上に液滴が形成されている様子を示す。工程Ｅで、水溶液を蒸発させると、ウェルには乾燥したプライマー／プローブのセットが残る（工程Ｆに図示）。

【図15】図１３Ａに記載のチャンバー内のマイクロウェルを使用し、適切なＴａｑｍａｎ（商標）またはＵｎｉＴａｑのプライマー及びプローブを予備充填した、マイクロタイタープレート形式の概略側面図を示す。工程Ａは、疎水性プレート内の１つのチャンバーの側面図を示す。これには、両側に隆起部がある５０ミクロンの親水性ウェルが含まれる。工程Ｂで、プレートの上下を反転し、音響液滴射出を使用して、リアルタイム増幅（すなわちＴａｑｍａｎ（商標）反応）及び標的ＤＮＡに適した試薬を充填する。工程Ｃで、水性層を疎水性鉱油で覆う。工程Ｄで、プレートをスイングバケットローターに移し、遠心分離する。高濃度の水性液体が空のマイクロウェルに分散する。工程Ｅで、プレートをサーモサイクラーに移動する。鉱油で覆われ、増幅に適した個々のマイクロウェルに液滴が分離する。

【図16】未知の病原体を同定または相対定量するための、Ｔａｑｍａｎ（商標）の読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＰＣＲ手順を示す。

【図17】未知の病原体を同定または相対定量するための、ＵｎｉＴａｑの読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＰＣＲ手順を示す。

【図18】未知の病原体を同定または相対定量するための、スプリットプローブＵｎｉＴａｑ（ＵｎｉＲｑ）の読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＰＣＲ手順を示す。

【図19】未知の病原体を同定または相対定量するための、Ｔａｑｍａｎ（商標）の読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ手順を示す。

【図20】未知の病原体を同定または相対定量するための、ＵｎｉＴａｑの読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ手順を示す。

【図21】未知の病原体を同定または相対定量するための、スプリットプローブＵｎｉＴａｑ（ＵｎｉＳｐＴｑ）の読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ手順を示す。

【図22】未知の病原体を同定または相対定量するための、ユニバーサルスプリットプローブの読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ｑＬＤＲ（ＵｎｉＬＤｑ）手順を示す。

【図23】未知の病原体を同定または相対定量するための、標的特異的スプリットプローブの読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ｑＬＤＲ（ＴｓＬＤｑ）手順を示す。

【図24】マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である概略正面図を示す。この設計は、未知の病原体の同定及び定量のための、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－ＵｎｉＴａｑ検出（あるいは、標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いた、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－リアルタイムＰＣＲ）の実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。灰色の円は、異なるプライマーまたはプローブのセットが予備充填されている行または列の領域を記号で表している。

【図25】図２５Ａ～図２５Ｂは、数千のマイクロポアを含むマイクロポアプレートを使用して、ＵｎｉＴａｑまたは標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－リアルタイムＰＣＲアッセイを実行するための、カートリッジ及びバルブ、構成の概略側面図を示す。図２５Ａは、直径５０ミクロンのマイクロウェルまたはマイクロポアのアレイへのマイクロ流路の流体接続を示す概略正面図である。図２５Ｂでは、マイクロポアプレートは孔の両側から流体連通可能である。第１の側面（プレートの上部、プレートの左側に図示）は、バルブ１、２、及び３と連通しており、対して第２の側面（プレートの下部、プレートの右側に図示）は、バルブ４及び５と連通している。

【図26】未知の病原体を血液から直接同定または相対定量するための、Ｔａｑｍａｎ（商標）の読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＰＣＲ手順を示す。

【図27】未知の病原体を血液から直接同定または相対定量するための、ＵｎｉＴａｑの読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＰＣＲ手順を示す。

【図28】低レベルの変異を同定または相対定量するための、Ｔａｑｍａｎ（商標）の読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。

【図29】低レベルの変異を同定または相対定量するための、ＵｎｉＴａｑの読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。

【図30】マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である正面図を示す。この設計は、血漿中の低レベルの未知の変異を同定及び定量するためのマルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－ＵｎｉＴａｑ検出の実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。（あるいは、変異特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いた、マルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲを使用する）。灰色の円は、異なるプライマーまたはプローブのセットが予備充填されている行または列の領域を記号で表している。

【図31】低レベルのメチル化を同定または相対定量するための、Ｔａｑｍａｎ（商標）の読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ（場合によりキャリーオーバー防止を伴う）反応を示す。

【図32】低レベルのメチル化を同定または相対定量するための、ＵｎｉＴａｑの読み取りを用いた例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ（場合によりキャリーオーバー防止を伴う）反応を示す。

【図33】野生型及び選択的スプライシングされたｍＲＮＡ転写産物を同定または相対定量するための、ＵｎｉＴａｑの読み取りを用いた例示的なＲＴ－ＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ反応を示す。

【図34】マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である正面図を示す。この設計は、希少及び過剰発現両方のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはスプライス変異体を同定及び定量するためのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ－ＬＤＲ－ＵｎｉＴａｑ検出の実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。（あるいは、標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いた、マルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲを使用する）。灰色の円は、異なるプライマーまたはプローブのセットが予備充填されている行または列の領域を記号で表している。

【図35】未知の病原体の一方の鎖における変異を同定するための、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの読み取りを用いた例示的な断片識別子ＰＣＲ法を示す。この例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。

【図36】マイクロポアあたりの産物収率を最大化するため、第１のタグプライマーが、溶液中と、固定された第２のタグプライマー（第１のタグプライマーより長い）のいずれよりも多量に存在する、断片識別子ＰＣＲ法の一実施形態を示す。

【図37】マイクロポアあたりの産物収率を最大化するため、溶液中の第１のタグプライマーが、２つの異なる５’部分、及び５’付加部分をもつプライマーを含み、溶液中と、固定された第２のタグプライマー（第１のタグプライマーより長い）のいずれよりも多量に存在する、断片識別子ＰＣＲ法の別の実施形態を示す。

【図38】マイクロポアあたりの産物収率を最大化するため、溶液中の第１のタグプライマーが、ｄＡ３５、及びＧＣリッチ足場にｄＡ３５を付加したプライマーを含み、溶液中と、固定された第２のタグプライマー（第１のタグプライマーより長い）のいずれよりも多量に存在する、断片識別子ＰＣＲ法の別の実施形態を示す。

【図39】マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である正面図を示す。この設計は、未知の病原体同定のための、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－シーケンシングの実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。灰色の円は、異なるプライマーまたはプローブのセットが予備充填されている行または列の領域を記号で表している。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。

【図40】ｃｆＤＮＡの一方の標的鎖において低存在量の変異を同定するための、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの読み取りを用いた例示的な断片識別子ＰＣＲ法を示す。この例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。

【図41】ｃｆＤＮＡの重複断片にわたって、一方の標的鎖における低存在量の変異を同定するための、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの読み取りを用いた例示的な断片識別子ＰＣＲ法を示す。この例では、第２のタグ配列プライマーがビオチン化されており、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに捕捉されて、マイクロポアに分配されるか、またはストレプトアビジンでコーティングされたマイクロポアに直接分配される。

【図42】ｃｆＤＮＡの重複断片にわたって、一方の標的鎖における低存在量の変異を同定するための、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの読み取りを用いた例示的な断片識別子ＰＣＲ法を示す。この例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。

【図43】ビオチン化または固定された第２のタグ配列プライマーを用いたＰＣＲ増幅のさらなる詳細を示す。これは、より短いアンプリコンは増幅しないパンハンドル構造を形成するが、目的とする長い産物は固体支持体上で増幅することを示している。

【図44】ｃｆＤＮＡの重複断片にわたって、一方の標的鎖における低存在量の変異を同定するための、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの読み取りを用いた例示的な断片識別子ＰＣＲ法の別の実施形態を示す。この図では、第２のタグ配列を含む２つの標的特異的プライマーが示されている。この例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。

【図45】ｃｆＤＮＡの重複断片にわたって、一方の標的鎖における低存在量の変異を同定するための、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの読み取りを用いた例示的な断片識別子ＰＣＲ法の別の実施形態を示す。この図では、第１のタグ配列を含む２つの標的特異的プライマーが示されている。この例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。

【図46】ｃｆＤＮＡの重複断片にわたって、両方の標的鎖における低存在量の変異を同定するための、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの読み取りを用いた例示的な断片識別子ＰＣＲ法を示す。この例では、固定された第１のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。第２のタグ配列を含む異なるネステッドプライマーを使用することにより、トップ鎖から増幅された領域がボトム鎖から増幅された領域と異なるため、トップ鎖及びボトム鎖の配列から得られる読み取りを区別することができる。

【図47】ＳＮＰを同定し、ｃｆＤＮＡの両方の遺伝子座特異的鎖のコピー数を計数するための、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの読み取りを用いた例示的な断片識別子ＰＣＲ法を示す。この例では、固定された第１のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。第２のタグ配列を含む異なるネステッドプライマーを使用することにより、トップ鎖から増幅された領域がボトム鎖から増幅された領域と異なるため、トップ鎖及びボトム鎖の配列から得られる読み取りを区別することができる。

【図48】マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である正面図を示す。この設計は、血漿中の低存在量の未知の変異を同定するため、または血漿中のトリソミーの非侵襲的出生前検査のための、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－シーケンシングの実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。灰色の円は、異なるプライマーまたはプローブのセットが予備充填されている行または列の領域を記号で表している。

【図49】図４９Ａ～図４９Ｂは、断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングを使用して、血漿中の低存在量の未知の変異を同定するためのカートリッジ及びバルブの構成である概略側面図を示す。図４９Ａは、直径５ミクロンのマイクロポアのアレイへのマイクロ流路の流体接続を示す概略正面図である。図４９Ｂは、数百万のミクロポアを含むマイクロポアプレートを使用した、断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングの流体システムである。マイクロポアプレートは孔の両側から流体連通可能である。第１の側面（プレートの上部、プレートの左側に図示）は、バルブ１、２、及び３と連通しており、対して第２の側面（プレートの下部、プレートの右側に図示）は、バルブ４、５、及び６と連通している。

【図50】断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングを使用して、血漿中の低存在量の未知の変異を同定するためのカートリッジ及びバルブの構成である概略側面図を示す。工程Ａは、直径５ミクロンのマイクロポアのアレイにマイクロ流路が流体接続されたマイクロプレートの提供を含む。工程Ｂは、初期反応を個々のウェルで実行し、その後、音響液滴射出を使用して、適切な試薬、酵素、緩衝液、標的、及び／または前増幅した標的を、入力チャンバー、及び数百万のマイクロポアを含む列へと至る開口部に流入させることを示す。工程Ｃは、４つのバルブに流体連結されたプレートを示す。マイクロポアプレートは孔の両側から流体連通可能である。第１の側面（プレートの上部に図示）は、バルブ１及び３と連通しており、対して第２の側面（プレートの下部に図示）は、バルブ２及び４と連通している。

【図51】ｃｆＤＮＡの一方の標的鎖において低存在量のメチル化を同定するための、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの読み取りを用いた例示的なＢｓｈ１２３６Ｉ－バイサルファイト－断片識別子ＰＣＲ法を示す。この例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。

【図52】マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である正面図を示す。この設計は、血漿中の低存在量の未知の変異及びメチル化を同定するための、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－シーケンシング及びＢｓｈ１２３６Ｉ－バイサルファイト－マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－シーケンシングの実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。

【図53】ＣＴＣまたはエキソソームから単離された低存在量及び中存在量のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びスプライス部位変異体を同定するための、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの読み取りを用いた例示的な断片識別子ＲＴ－ＰＣＲ法を示す。この例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。

【図54】マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である正面図を示す。この設計は、ＣＴＣまたはエキソソームから単離された低存在量及び中存在量のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びスプライス部位変異体を同定するためのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－ＵｎｉＴａｑ検出の実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。（あるいは、転写産物特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いた、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－リアルタイムＰＣＲ）。灰色の円は、異なるプライマーまたはプローブのセットが予備充填されている行または列の領域を記号で表している。

【発明を実施するための形態】

【0038】

発明の詳細な説明
本発明の一態様は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムに関する。本システムには、注入口及びカートリッジが含まれる。カートリッジは、注入口と流体連結された複数の一次反応チャンバーを含む空間を画定しており、そのチャンバーに注入口からの物質を受け入れ、その物質から一次反応チャンバー産物を産生する。この空間にはまた、複数の個々の列の複数の産物捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体も含まれ、各個々の産物捕捉サブユニットは、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロポアまたはマイクロウェルのアレイを含み、そこで一次反応産物をさらに反応させてアレイ産物を産生する。アレイ産物は、マイクロポアまたはマイクロウェルで検出されるが、その場合、個々の産物捕捉サブユニットの１つ以上の列に、複数の一次反応チャンバーのうちの１つを通った物質を受け入れる。

【0039】

一実施形態では、本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムは、産物捕捉筐体から物質を排出するための出口をさらに含む。

【0040】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの別の実施形態では、カートリッジによって画定される空間に、１つ以上の初期反応チャンバーがさらに含まれ、そこに注入口から物質が排出され、そこから物質が複数の一次反応チャンバーに排出される。

【0041】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの、さらに別の実施形態では、カートリッジによって画定される空間に、複数の二次反応チャンバーがさらに含まれ、そのうちの１つ以上は、複数の一次反応チャンバーのうちの１つと流体連結されており、複数の一次反応チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れる。この空間にはまた、それぞれが複数の二次反応チャンバーのうちの１つと流体連結された複数の混合チャンバーが含まれ、そこに複数の二次反応チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れ、物質を産物捕捉筐体に排出し、それにより、個々の産物捕捉サブユニットの各列が、１つ以上の混合チャンバーのうちの１つに流体連結され、１つ以上の混合チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れる。

【0042】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの本実施形態によれば、複数の一次及び二次反応チャンバーの少なくともいくつかを、複数の一次及び二次反応チャンバー内に液体のトラフを保持するように構成する。

【0043】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムであり、カートリッジによって画定される空間に、複数の二次反応チャンバー及び複数の混合チャンバーがさらに含まれる別の実施形態では、複数の一次及び／または二次反応チャンバーのそれぞれが、複数の一次及び二次反応チャンバー内に液体のトラフを保持する内部バッフルを有する。

【0044】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムであり、カートリッジによって画定される空間に、複数の二次反応チャンバー及び複数の混合チャンバーがさらに含まれる、さらに別の実施形態では、複数の一次及び／または二次反応チャンバーのそれぞれが、複数の一次及び二次反応チャンバー内に複数の液体のトラフを保持する１つ以上の内部バッフルを有する。

【0045】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムであり、カートリッジによって画定される空間に、複数の二次反応チャンバー及び複数の混合チャンバーがさらに含まれる、さらなる実施形態では、混合チャンバーのそれぞれが、物質が混合チャンバーに入る付近から、物質が混合チャンバーを出る付近まで延在する仕切部を含む。

【0046】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムであり、カートリッジによって画定される空間に、複数の二次反応チャンバー及び複数の混合チャンバーがさらに含まれる別の実施形態では、混合チャンバーのそれぞれが、疎水性の高い第１の表面と、第１の表面から間隔をあけて配置され、第１の表面よりも疎水性が低い第２の表面とを含み、第１及び第２の表面は、物質が混合チャンバーに入る付近から、物質が混合チャンバーを出る付近まで延在する。

【0047】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムであり、カートリッジによって画定される空間に、複数の二次反応チャンバー及び複数の混合チャンバーがさらに含まれる、さらに別の実施形態では、一次反応チャンバー及び／または二次反応チャンバーは、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブをそこにスポットできる内部表面を含む。

【0048】

本発明に従う試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの別の実施形態では、産物捕捉サブユニットは、複数の個別のマイクロポアのアレイを含み、マイクロポアはそれぞれ、対向する第１及び第２の開口端を有し、第１の端は大きい直径を有し、第２の端は第１の端の直径よりも小さい直径を有する。

【0049】

このシステムは、産物捕捉筐体内のマイクロポアの第２の端か、または個別のマイクロポア内に配置されたビーズを覆うメッシュスクリーンをさらに備えてもよい。

【0050】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムのさらなる実施形態では、産物捕捉サブユニットは、それぞれが開口端及び閉口端を有する複数の個別のマイクロウェルのアレイを含む。

【0051】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムであり、カートリッジによって画定される空間に、複数の二次反応チャンバー及び複数の混合チャンバーがさらに含まれる別の実施形態では、産物捕捉筐体は、物質が複数の混合チャンバーから産物捕捉サブユニットの列を通って、それらサブユニット内のマイクロポアまたはマイクロウェルのアレイと接触することが可能であるように複数の流体流路を含む。

【0052】

複数の流体流路は、固体支持体の上方に位置しても、及び／または下方に位置してもよい。

【0053】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの別の実施形態では、システムは、注入口を通して、試薬または反応物をカートリッジへ誘導するか、またはカートリッジから排出するか、を選択するための１つ以上のバルブをさらに含み得る。

【0054】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムのさらなる実施形態では、システムは、出口及び／または産物捕捉筐体内の出口から離れた位置を通して、試薬または反応物を産物捕捉筐体へ誘導するか、または産物捕捉筐体から排出するか、を選択するための１つ以上のバルブをさらに含む。

【0055】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの、さらに別の実施形態では、システムは、一次反応チャンバー及び／または産物捕捉筐体に近接する１つ以上の発熱体をカートリッジ内にさらに含む。

【0056】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの別の実施形態では、カートリッジによって画定される空間に、１つ以上の初期反応チャンバーがさらに含まれ、そこに注入口から物質が排出され、そこから物質が複数の一次反応チャンバーに排出される。システムは、初期反応チャンバーに近接する１つ以上の発熱体をカートリッジ内にさらに含み得る。

【0057】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの別の実施形態では、カートリッジによって画定される空間に、複数の二次反応チャンバー及び複数の混合チャンバーがさらに含まれる場合、システムは、二次反応チャンバーのうちの１つ及び／または混合チャンバーのうちの１つ以上に近接する１つ以上の発熱体をカートリッジ内にさらに含み得る。

【0058】

本発明の別の態様は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムに関する。システムには、注入口、出口、及びマイクロポアまたはマイクロウェルのアレイを含むカートリッジを含み、カートリッジは注入口及び出口と流体連結されている。カートリッジは、注入口と流体連結された複数の一次反応チャンバーを含む空間を画定しており、そのチャンバーに注入口からの物質を受け入れ、その物質から一次反応チャンバー産物を産生する。この空間にはまた、複数の二次反応チャンバーが含まれ、そのうちの１つ以上は、複数の一次反応チャンバーのうちの１つと流体連結されており、そこに複数の一次反応チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れ、二次反応チャンバー産物を産生する。複数の一次及び二次反応チャンバーの少なくともいくつかを、複数の一次及び二次反応チャンバー内に液体のトラフを保持するように構成することで、後続反応でチャンバー産物またはアレイ産物を産生するための試料、試薬、及び／または生成反応物の混合が容易になる。この空間にはまた、それぞれが複数の二次反応チャンバーのうちの１つと流体連結された複数の混合チャンバーが含まれ、そこに複数の二次反応チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れ、物質を産物捕捉筐体に排出し、それにより、個々の産物捕捉サブユニットの各列が、１つ以上の混合チャンバーのうちの１つに流体連結され、１つ以上の混合チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れる。この空間にはまた、複数の個々の列の複数の産物捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体も含まれ、各個々の産物捕捉サブユニットは、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロポアまたはマイクロウェルのアレイを含み、そこで二次反応産物をさらに反応させてアレイ産物を産生する。アレイ産物は、マイクロポアまたはマイクロウェルで検出されるが、その場合、個々の産物捕捉サブユニットの１つ以上の列に、複数の一次反応チャンバーのうちの１つを通った物質を受け入れる。

【0059】

本発明の別の態様は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムに関する。システムには、注入口、第２の注入位置、出口、ならびに注入口、第２の注入位置、及び出口と流体連結されているカートリッジを含む。カートリッジは、複数の個々の列の産物捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体が含まれる空間を画定し、各個々の産物捕捉サブユニットは、複数の個別のマイクロポアのアレイを含む。産物捕捉筐体は、物質が注入口及び／または第２の注入位置から産物捕捉サブユニットの列を通って、それらサブユニット内のマイクロポアのアレイと接触し、出口に至ることが可能であるように、複数の流体流路を備えており、この複数の流体流路は固体支持体の上及び下に位置する。１つ以上のバルブを使用して、注入口、出口、及び／または産物捕捉筐体内の出口から離れた第２の注入位置を通して、試薬または反応物を産物捕捉筐体へ誘導するか、または産物捕捉筐体から排出するか、を選択する。

【0060】

本発明のさらなる態様は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの調製方法に関する。この方法は、本発明のシステムを提供すること、ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを、産物捕捉筐体内の固体支持体上の産物捕捉サブユニットのマイクロポアまたはマイクロウェルに加えることを含む。その結果、ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブが、マイクロポアまたはマイクロウェル内に保持される。

【0061】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの調製方法は、試料中の標的核酸の一部と相補的なヌクレオチド配列を含む第１の部分をそれぞれが有する一次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを、１つ以上の一次反応チャンバーに充填することをさらに含み得る。本実施形態によれば、一次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、マイクロポアまたはマイクロウェル内に保持されたユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーの一部と同一であるかまたは相補的であるヌクレオチド配列を含む第２の部分を、さらに含み得る。

【0062】

本発明のさらなる態様は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの調製方法に関する。この方法は、本発明のシステムを提供することを含み、システムは注入口及びカートリッジを含む。カートリッジが画定する空間には、注入口からの物質を受け入れ、その物質から一次反応チャンバー産物を産生する、注入口と流体連結された複数の一次反応チャンバー；複数の個々の列の複数の産物捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体であって、各個々の産物捕捉サブユニットが、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロポアまたはマイクロウェルのアレイを含み、そこで一次反応産物をさらに反応させてアレイ産物を産生し、これをマイクロポアまたはマイクロウェルで検出し、個々の産物捕捉サブユニットの１つ以上の列に、複数の一次反応チャンバーのうちの１つを通った物質を受け入れる、産物捕捉筐体；そのうちの１つ以上が、複数の一次反応チャンバーのうちの１つと流体連結されており、複数の一次反応チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れる、複数の二次反応チャンバー；及び複数の混合チャンバーであって、それぞれが上記複数の二次反応チャンバーのうちの１つと流体連結され、上記複数の二次反応チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れ、かつ物質を上記産物捕捉筐体に排出し、それにより、個々の産物捕捉サブユニットの各列が、上記１つ以上の混合チャンバーのうちの１つに流体連結され、上記１つ以上の混合チャンバーのうちの１つからの物質を受け入れる、複数の混合チャンバーが含まれる。この方法は、ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを、産物捕捉筐体内の固体支持体上の産物捕捉サブユニットのマイクロポアまたはマイクロウェルに加えることをさらに含む。その結果、ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブが、マイクロポアまたはマイクロウェル内に保持される。

【0063】

本方法は、試料中の標的核酸の一部と相補的なヌクレオチド配列を含む第１の部分をそれぞれが有する一次または二次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを、１つ以上の一次反応チャンバー及び／または二次反応チャンバーに充填することをさらに含み得る。本実施形態によれば、一次または二次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、マイクロポアまたはマイクロウェル内に保持されたユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーの一部と同一であるかまたは相補的であるヌクレオチド配列を含む第２の部分を、さらに含み得る。

【0064】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの調製方法に関する一実施形態では、産物捕捉サブユニットは、個別のマイクロポアのアレイを含み、マイクロポアはそれぞれ、対向する第１及び第２の開口端を有し、第１の端は大きい直径を有し、第２の端は第１の端の直径よりも小さい直径を有し、マイクロポアの第１の端と流体連通する第１の通路と、マイクロポアの第２の端と流体連通する第２の通路を備え、ここでユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブは、以下に示す順序の以下の工程を含む方法により、マイクロポア内に加えられる：ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブが第１の通路を通り、第１の開口端からマイクロポアに入ると同時に、疎水性液体が第２の通路に通される；疎水性液体を第２の通路に通しながら、疎水性液体を第１の通路に通す；疎水性液体を第２の通路に通しながら、揮発性溶媒を第１の通路に通す；空気が第１の通路を通ると同時に、熱、疎水性液体、揮発性溶媒、さらに空気が第２の通路に通される。

【0065】

本発明の試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの調製方法に関する別の実施形態では、産物捕捉サブユニットは、個別のマイクロポアのアレイを含み、マイクロポアはそれぞれ、対向する第１及び第２の開口端を有し、第１の端は大きい直径を有し、第２の端は第１の端の直径よりも小さい直径を有し、マイクロポアの第１の端と流体連通する第１の通路と、第２の通路と流体連通され、第２の端を覆うメッシュスクリーンによってマイクロポアの第２の端と隔てられた第２の通路を備え、ここで検出または捕捉オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、以下に示す順序の以下の工程を含む方法により、マイクロポア内に加えられる：ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブが第１の通路を通り、第１の開口端からマイクロポアに入る；疎水性液体が第１の通路を通り、ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを第１の通路から排出する；疎水性液体を第２の通路に通しながら、疎水性液体を第１の通路に通す；疎水性液体を第２の通路に通しながら、揮発性溶媒を第１の通路に通す；空気が第１の通路を通ると同時に、熱、疎水性液体、揮発性溶媒、さらに空気が第２の通路に通される。

【0066】

本発明の別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。１つ以上の一次反応チャンバー及び／または１つ以上の二次反応チャンバー（存在する場合）の充填に続くプロセスには、システムで一次反応及び／または二次反応を実施し、一次反応及び／または二次反応の実行に基づいて、マイクロウェルまたはマイクロポア内の試料中の標的核酸分子の存在を検出することを含む。

【0067】

本発明の別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。一次反応及び／または二次反応の実行後、消光基及び蛍光基を含む１つ以上のプローブをポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはリボヌクレアーゼが標的特異的に切断する条件下で、そのような反応の産物をマイクロウェルまたはマイクロポア内で増幅すると、標的核酸分子が試料に存在する場合、蛍光基が遊離されてシグナルが生じる。

【0068】

本発明の別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。一次反応及び／または二次反応を実行するプロセスには、複数の標的核酸分子を含有する試料を供給し、標的核酸分子の一部に相補的な第１の部分、または標的核酸分子の相補体を有する一次オリゴヌクレオチドプライマーのセット、及びポリメラーゼとその試料を接触させ、第１のポリメラーゼ伸長または連鎖反応混合物を形成することを含む。この混合物を１つ以上の初期反応または一次反応チャンバーで第１のポリメラーゼ伸長または連鎖反応に供し、伸長産物または増幅産物の第１のセットを産生する。次にこの産物を、一次伸長産物または一次増幅産物の一部と相補的である第１の部分を有する二次オリゴヌクレオチドプライマーのセット、及びポリメラーゼと接触させ、第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。この第２の混合物を一次または二次反応チャンバーで第２のポリメラーゼ連鎖反応に供し、増幅産物の第２のセットを産生する。二次増幅産物はそれぞれ、５’の第２の部分配列、標的ヌクレオチド配列特異的部分、またはその相補体、及び３’の第２の部分相補配列を含む。

【0069】

本発明の別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。一次反応及び／または二次反応を実行するプロセスには、複数の標的核酸分子を含有する試料を供給し、標的核酸分子の一部に相補的な部分、またはその伸長産物を有する一次オリゴヌクレオチドプライマーのセット、及びポリメラーゼとその試料を接触させ、第１のポリメラーゼ伸長または連鎖反応混合物を形成することを含む。この混合物を１つ以上の初期反応または一次反応チャンバーで第１のポリメラーゼ連鎖反応に供し、伸長産物または増幅産物の第１のセットを産生する。次にこの産物を、増幅産物の第１のセットの一部と相補的である第１の部分、及び第２の部分を有するオリゴヌクレオチドプローブのセット、ならびにリガーゼと接触させ、リガーゼ検出反応混合物を形成する。この第２の混合物を一次または二次反応チャンバーでリガーゼ検出反応に供し、ライゲーション産物のセットを産生する。ライゲーション産物はそれぞれ、５’の第２の部分配列、標的ヌクレオチド配列特異的部分、またはその相補体、及び３’の第２の部分配列を含む。

【0070】

本発明のさらに別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。１つ以上の一次反応チャンバー（存在する場合）に充填するプロセス、ならびにシステムで一次反応及び／または二次反応を実行するプロセスは、以下に示す順序の以下の工程を伴うプロセスによって実施される。疎水性液体を注入口からシステムに通す。一次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、ならびに逆転写及び／またはポリメラーゼ連鎖反応試薬、さらに疎水性液体を注入口からシステムに通す。システム内でポリメラーゼ伸長または連鎖反応が実行され、物質は注入口を通りシステムから排出される。疎水性液体、ポリメラーゼ連鎖反応試薬またはリガーゼ検出反応試薬、さらに疎水性液体が注入口からシステムに送られ、システムでポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ検出反応が実行される。

【0071】

本発明の別の実施形態は、産物捕捉サブユニットが個別のマイクロポアのアレイを含む本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。マイクロポアはそれぞれ、対向する第１及び第２の開口端を有し、第１の端は大きい直径を有し、第２の端は第１の端の直径よりも小さい直径を有し、マイクロポアの第１の端と流体連通する第１の通路と、マイクロポアの第２の端と流体連通する第２の通路を備え、ここでシステムでの二次反応の上記の実行は、以下に示す順序の以下の工程を伴うプロセスによって実施される。ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ検出反応の産物が、第１の通路を通って産物捕捉筐体に送られると同時に、疎水性液体が第２の通路を通る。疎水性液体をさらに第１及び第２の通路に通す。次にポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ検出反応の産物を、産物捕捉サブユニットのマイクロポア内でユニバーサルタグプライマー及びプローブとのポリメラーゼ連鎖反応に供する。

【0072】

本発明の別の実施形態は、産物捕捉サブユニットが個別のマイクロポアのアレイを含む本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。マイクロポアはそれぞれ、対向する第１及び第２の開口端を有し、第１の端は大きい直径を有し、第２の端は第１の端の直径よりも小さい直径を有し、マイクロポアの第１の端と流体連通する第１の通路と、マイクロポアの第２の端を覆うメッシュスクリーンによってマイクロポアの第２の端と流体連通されかつ隔てられた第２の通路とを備え、ここでシステムでの二次反応を実行するプロセスは、以下に示す順序の以下の工程を伴うプロセスによって実施される。ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ検出反応の産物が、第１の通路を通って産物捕捉筐体に送られる。疎水性液体を第１の通路に通す。さらに疎水性液体を第１及び第２の通路に通す。ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ検出反応の産物を、産物捕捉サブユニットのマイクロポア内でユニバーサルタグプライマー及びプローブとのポリメラーゼ連鎖反応に供する。

【0073】

本発明の別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスであって、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、１つ以上の転座、及び／または１つ以上のメチル化残基によって、試料中または他の試料中の他の核酸分子のヌクレオチド配列とは異なっている標的ヌクレオチド配列が含まれる複数の核酸分子を試料において同定するプロセスに関する。

【0074】

本発明の別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスであって、そのシステムの調製が、試料中の標的核酸の一部と相補的なヌクレオチド配列を含む第１の部分をそれぞれが有する一次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを、１つ以上の一次反応チャンバーに充填することを含むプロセスに関する。１つ以上の一次反応チャンバーに充填するプロセスに続くプロセスが、システムで一次反応を実行することと、一次反応を行うプロセスに続いて試料中の標的核酸分子のヌクレオチド配列を取得することとをさらに含む。

【0075】

本発明の別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。このプロセスには、複数の標的核酸分子が含まれる試料を供給し、標的核酸分子の一部に相補的な第１の部分、及び第２の部分を有する一次オリゴヌクレオチドプライマーのセット、ならびにポリメラーゼとその試料を接触させ、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成することを含む。この混合物を一次反応チャンバーでポリメラーゼ連鎖反応に供し、増幅産物のセットを産生する。増幅産物は、複数の個々の列の複数の捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体に送られ、各個々の産物捕捉サブユニットは、第２の部分に相補的な固定された捕捉プローブを含む複数の個別のマイクロポアのアレイを含む。固定された捕捉プローブに標的核酸分子が捕捉され、コピーされる。固定された標的核酸分子のヌクレオチド配列は、マイクロポアでシーケンシング反応を実行することにより得られる。

【0076】

本実施形態によれば、産物捕捉サブユニットは、複数の個別のマイクロポアのアレイを含み、マイクロポアはそれぞれ、対向する第１及び第２の開口端を有し、第１の端は大きい直径を有し、第２の端は第１の端の直径よりも小さい直径を有し得る。このプロセスはさらに、産物捕捉筐体内のマイクロポアの第２の端を覆うメッシュスクリーンを含んでもよい。

【0077】

別の実施形態では、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスは、固定された捕捉プローブを含有するビーズを個々のマイクロポアに配置することをさらに含む。

【0078】

さらなる実施形態では、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスは、ヌクレオチド配列を取得するプロセスの前と、ポリメラーゼ連鎖反応混合物をポリメラーゼ連鎖反応に供した後に、増幅産物から少なくとも１つの第２の部分を除去することをさらに含む。少なくとも１つの第２の部分を除去するプロセスは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、アプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ、もしくは８－オキシグアニンＤＮＡグリコシラーゼ、またはそれらの組み合わせを用いて実施することができる。

【0079】

別の実施形態は、本発明のシステムを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。このプロセスは、本発明のシステムを提供することと、ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを、産物捕捉筐体内の固体支持体上の産物捕捉サブユニットのマイクロポアまたはマイクロウェルに加えることとを含み、その場合、ユニバーサルタグまたは捕捉オリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブは、マイクロポアまたはマイクロウェル内に保持される。このプロセスはさらに、試料中の標的核酸の一部と相補的なヌクレオチド配列を含む第１の部分をそれぞれが有する一次反応オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを、１つ以上の一次反応チャンバーに充填することと、システムで一次反応を実行することとを含む。プロセスはさらに、一次反応を実行するプロセスに続いて試料中の標的核酸分子のヌクレオチド配列を取得することをさらに含む。産物捕捉サブユニットは、個別のマイクロポアのアレイを含み、マイクロポアはそれぞれ、対向する第１及び第２の開口端を有し、第１の端は大きい直径を有し、第２の端は第１の端の直径よりも小さい直径を有し、マイクロポアの第１の端と流体連通する第１の通路と、マイクロポアの第２の端を覆うメッシュスクリーンによってマイクロポアの第２の端と流体連通されかつ隔てられた第２の通路とを備え、ここでヌクレオチド配列を取得するプロセスは、以下に示す順序の以下の工程を含むプロセスによって実施される。ポリメラーゼ連鎖反応の産物が、上記第１の通路を通って産物捕捉筐体に送られる。次に疎水性液体を第１の通路に通し、それによって産物が個別のマイクロウェルに分配される。次に、疎水性液体を第１及び第２の通路に通す。増幅産物を産生する条件下で、マイクロウェルの内部表面に固定された捕捉オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応及び／または等温反応にて産物を増幅する。次に、疎水性液体を第２の通路に通しながら、揮発性溶媒を第１の通路に通す。ポリメラーゼ連鎖反応及び／または等温反応の産物は変性され、固定されていない核酸分子は第１の通路から洗い流され、疎水性液体は第２の通路を通り、それによって産物は個別のマイクロウェルに単離される。水よりも高密度の疎水性液体を第１の通路に通すと同時に、揮発性溶媒、空気、さらにシーケンシング試薬を第２の通路に通す。その後、産物捕捉サブユニットでシーケンシング反応を実行する。

【0080】

本発明はまた、試料中の複数の核酸分子を同定するためのマイクロタイタープレートを調製するプロセスに関する。それには、複数の個々の行と列をもつ産物捕捉サブユニットを備えるマイクロタイタープレートを提供することを含み、各個々の産物捕捉サブユニットは、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロウェルのアレイを含む。マイクロタイタープレートのマイクロウェルに、オリゴヌクレオチドプライマー及び／またはプローブを含有する水性液体を充填する。マイクロタイタープレートを遠心分離して、水性液体を、マイクロタイタープレート内の各個々の産物捕捉サブユニットの未充填マイクロウェルに分散させる。その後、遠心分離が終了すると、水性液体が疎水性表面と接触していない状態になる。水性液体を蒸発させ、マイクロウェルを乾燥することで、マイクロウェルにオリゴヌクレオチドプライマーを残留させる。

【0081】

本発明の別の実施形態は、マイクロタイタープレートのマイクロウェル内で乾燥したオリゴヌクレオチドプライマーを調製するための本発明のプロセスを使用して、試料中の複数の核酸分子を同定するプロセスに関する。それには、疎水性液体が水性試料の上に位置するように、水性試料をマイクロタイタープレートに投入した後に、疎水性液体をマイクロタイタープレートに投入することを含む。マイクロタイタープレートを遠心分離して、水性液体を、マイクロタイタープレート内の未充填のマイクロウェルに分散させる。その後、遠心分離が終了すると、水性液体が疎水性表面と接触していない状態になる。消光基及び蛍光基を含む１つ以上のプローブをポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはリボヌクレアーゼが標的特異的に切断する条件下で、核酸分子の増幅反応を行うと、標的核酸分子が試料に存在する場合、蛍光基が遊離されてシグナルが生じる。

【0082】

本実施形態によれば、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、１つ以上の転座、及び／または１つ以上のメチル化残基によって、試料中または他の試料中の他の核酸分子のヌクレオチド配列とは異なっている標的ヌクレオチド配列が含まれる複数の核酸分子を同定する。

【0083】

本発明の別の態様は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムに関する。このシステムには、注入口、出口、ならびに注入口及び出口と流体連結されているカートリッジを含む。カートリッジは、複数の個々の列の産物捕捉サブユニットを備える固体支持体の入った産物捕捉筐体が含まれる空間を画定する。各個々の産物捕捉サブユニットは、疎水性表面で隔てられた複数の個別の親水性マイクロポアのアレイを含み、マイクロポアはそれぞれ、対向する第１及び第２の開口端を有し、第１の端は大きい直径を有し、第２の端は第１の端の直径よりも小さい直径を有する。産物捕捉筐体は、物質が注入口から産物捕捉サブユニットの列を通って、それらサブユニット内のマイクロポアのアレイと接触し、出口に至ることが可能であるように、複数の流体流路を備えており、この複数の流体流路は固体支持体の上及び下に位置する。

【0084】

一実施形態では、試料中の複数の核酸分子を同定するシステムは、注入口または出口を通して、試薬及び／または反応物を産物捕捉筐体へ誘導するか、または産物捕捉筐体から排出するか、を選択するための１つ以上のバルブをさらに含む。

【0085】

試料中の複数の核酸分子を同定するための別の実施形態では、システムは、産物捕捉筐体に近接する１つ以上の発熱体をカートリッジ内にさらに含む。

【0086】

本発明は、試料中の複数の核酸分子を同定するためのシステムの調製方法に関する。この方法は、本発明のシステムを提供することを含み、システムは上記のように、注入口、出口、ならびに注入口及び出口と流体連結され、かつ空間を画定するカートリッジを含む。この方法は、捕捉オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを、産物捕捉筐体内の固体支持体上の産物捕捉サブユニットのマイクロポアに加え、捕捉オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブをマイクロポアまたはマイクロウェル内に保持することをさらに含む。一実施形態では、この方法は、システムで反応を実行することと、その反応の実行に基づいて、マイクロポア内の試料中の標的核酸分子の存在を検出することとをさらに含む。

【0087】

本発明は、血液試料から直接疾患の原因を判定するための一連のデバイス、チャンバー、及びアッセイを提供する。臨床試料から核酸を精製し、標的領域を一連の増幅反応に供し、リアルタイムＰＣＲまたはシーケンシングのいずれかを読み取り値として使用して、標的を同定または計数する。これらのデバイスで対応できる喫緊の臨床ニーズの概要を表１に示す。

【0088】

（表１）血液試料から疾患の原因を直接判定する臨床ニーズの概要

【0089】

複数の未知の病原体または変異を検出する際の主たる課題の一つは、マルチプレックス反応においてＰＣＲのドロップアウトを回避すると同時に、可能性のある断片及び目的とする断片をすべて増幅することである。マルチプレックスＰＣＲ反応は最適化が困難な場合があり、断片のドロップアウトという問題が絶えずつきまとう。８～１２サイクルの範囲の初期ＰＣＲサイクルであれば、比較的コピー数を維持できる場合が多いが、一部の断片がより効率的に増幅されると、それらが過剰増幅して、低効率の断片よりも優勢になる傾向があり、結果として以降のサイクルで断片のドロップアウトが生じる。この問題に対する解決策の一つは、最初はサイクルを制限してマルチプレックス増幅を実行した後、産物を２４～４８個の反応チャンバーに分割して、複雑性がはるかに低い状態で後続の増幅反応を行うことである。もう一つの解決策は、初期増幅産物を希釈して、数十、数百、または数千のマイクロポアまたはマイクロウェルを含む細区画に入れることである。それにより、所与のマイクロポアまたはマイクロウェルを１～４つのｑＰＣＲまたは個別のシーケンシング反応に使用できるため、ＰＣＲのドロップアウトのリスクを最小限に抑えながら、正確な標的の計数または定量が可能になる。

【0090】

本発明の一態様は、一連の細区画、好ましくは行と列に整列されたものであり、各細区画が、後続のｑＰＣＲ、ＵｎｉＴａｑ、ＦＲＥＴ、ｑＬＤＲ、またはシーケンシング反応及び標的同定のための、１桁、数十、数百、または数千のマイクロポアまたはマイクロウェルを備えるものである。好ましい実施形態では、標的が存在すると蛍光で読み取りされる。いくつかの実施形態では、標的は増幅されて、マイクロポアまたはマイクロウェル内の固体支持体に固定または結合される。そのような固定は、マイクロポアもしくはマイクロウェルの内部表面、マイクロポアもしくはマイクロウェルの表面に固定されたデンドリマー状プライマー、または増幅前にマイクロポアもしくはマイクロウェル内に予め分配されているか、もしくは初回増幅後にマイクロポアもしくはマイクロウェルに分配されるマイクロビーズに対して直接行われる場合がある。固体支持体への固定または結合により、増幅された標的を１回以上調べて、標的内の変異、ＳＮＰ、または配列変異の有無を決定することができる。これには、複数ラウンドのライゲーション検出反応（ＬＤＲ）、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、またはｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎが含まれる。

【0091】

細区画を行と列に整列することで、ユニバーサルもしくは標的特異的プライマー、酵素、試薬、緩衝液、標的、または前増幅した標的のいずれかを、そのような行及び列に充填しやすくなる。流体連結または流体接続された流路を経由して、全細区画にわたる所与の行または列に液体を流入させることによって、あるいは例えば音響液滴射出（ＡＤＥ）技術を使用して個別の細区画に液体を正確に分注することによって、充填を達成することができる。ＡＤＥ機器の製造業者の一つはＬａｂｃｙｔｅ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）である。

【0092】

本発明の一実施形態では、この柔軟な設計構造により、３８４個、７６８個、または１５３６個の標的、変異、耐性遺伝子、病因遺伝子、及び／または株変異体もしくは血清型変異体を潜在的に表すウイルス、細菌、原生動物、マラリア、または他の病原性の核酸の同定、ジェノタイピング、及び／または定量が可能になる。通常、収量が血液１ｍｌあたり１～２コロニー形成単位であるため、細菌性ＤＮＡを血液から直接検出することは特に困難な課題であるが、空間多重化手法では、それでもなお３２個、６４個、または１２８個の潜在的な標的を同定できる場合がある。以下に記載するシーケンシングモジュールを使用すると、この設計により１，５３６個の潜在的な病原体標的について約１５０塩基のリードを決定することができる。

【0093】

この設計の別の実施形態は、空間希釈（例えば４８区分）を使用し、血漿から直接、コピー数を正確に計数して、トリソミーの非侵襲的出生前検査（ＮＩＰＴ）を行うことが可能である。４８区分、すなわち４８列のそれぞれにおいて、ワトソン鎖がクリック鎖と一致する必要があるため（各鎖の一方と所与の断片から生成されるため）、これは鎖の欠失またはその他のエラーの内部標準となる。２番（対照）、１３番、１８番、２１番、Ｘ、及びＹ染色体の複数の固有の遺伝子座を使用して、コピー数を確定し、トリソミーまたは他の染色体コピーの変化を識別する。一実施形態では、両鎖で１８４個の遺伝子座領域を調べることができるが、これを３６８個または７３６個の遺伝子座領域に増加させることができる。

【0094】

設計の別の実施形態は、最大６４個または１２８個の潜在的標的に対する、血漿からの直接的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲによる１分子変異検出を可能にするほか、単一のシグナルによって遺伝子内の複数の変異（すなわちＫ－ｒａｓコドン１２及び１３における変異）を評価する場合の柔軟性もさらに備えている。選択遺伝子のプロモーター領域においてＣｐＧ部位のメチル化を同定及び計数する際に、類似するレベルの柔軟性を適用することができる。チャンバー内で段階希釈を実行できるため、例えばエキソソームまたは血小板から単離された、希少及び過剰発現両方のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはスプライス変異体を含め、３８４個のＲＮＡ標的の正確な計数が可能である。

【0095】

設計の別の実施形態は、１４４個の標的領域における低存在量の変異の決定を可能にし、両鎖について約１５０塩基のリードが得られ、それにより各変異が正確に計数される。メチル化領域をシーケンシングすることで、これらの領域を前濃縮できるため、低存在量で存在する場合であっても、２，０００を超えるメチル化ＣｐＧプロモーター領域を調べることができる。

【0096】

本発明の一実施形態（図１Ａを参照）では、細区画Ｚは列Ａ_１～Ａ_ｉｉ及び行Ｂ_１～Ｂ_ｖに存在し、幅４００ミクロン×長さ６００ミクロンである。細区画Ｚ間にはさらに１００ミクロン幅の隆起部Ｘ及びＹが使用され、細区画の間隔及び追加の構造支持体を提供する。そのような隆起部は、細区画間の流体運動を可能にするくぼみまたは流路を有するように設計されてもよい。マイクロポアまたはマイクロウェルは、複合材料、プラスチック、金属、ガラス、ケイ素、窒化ケイ素、またはそれらの混合物を含み得る固体支持体で作製される。マイクロポアまたはマイクロウェルの寸法は、直径５０ミクロン、深さ約５０ミクロン～深さ４００ミクロンの範囲であってよく、底部が開口されていても（すなわちマイクロポア）または閉口されていてもよい（すなわちマイクロウェル）。５０ミクロンのマイクロポアの底部が、２００～４００ナノメートル厚の窒化ケイ素上に０．５ミクロンの穴をもつ別の層を備える場合があり、それにより、５０ミクロンのマイクロポアに上部から液体を充填することができ、底部の０．５ミクロンの孔から空気は通るが液体は漏れないようにすることができる。微孔性の窒化ケイ素膜は、シリコンウェハ基板上に配置された窒化ケイ素層のフォトリソグラフィーパターニング及び反応性イオンエッチングなどの周知の方法により作製することができる（ＤｅｓＯｒｍｅａｕｘ ＪＰ ｅｔ ａｌ．，“Ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｎｉｔｒｉｄｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｏｕｓ Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ，” Ｎａｎｏｓｃａｌｅ ６（１８）：１０７９８－８０５（２０１４）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、各細区画は、正方充填または六方充填で形成された、直径５０ミクロンの６×４＝２４個のマイクロポアまたはマイクロウェルを備える。そのような実施形態は、後続のｑＰＣＲ、ＵｎｉＴａｑ、ＦＲＥＴ、またはｑＬＤＲ検出に最適である。

【0097】

（表２）カートリッジ形式またはマイクロタイタープレート形式のマイクロウェルまたはマイクロポアの様々な実施形態

【0098】

本発明の別の実施形態（図１Ｂ）では、細区画Ｚは列Ａ_１～Ａ_ｉ及び行Ｂ_１～Ｂ_ｉｘに存在し、幅４００ミクロン×長さ６００ミクロンである。細区画Ｚ間にはさらに１００ミクロン幅の隆起部Ｘ及びＹが使用され、細区画の間隔及び追加の構造支持体を提供する。そのような隆起部は、細区画間の流体運動を可能にするくぼみまたは流路を有するように設計されてもよい。マイクロポアまたはマイクロウェルは、複合材料、プラスチック、金属、ガラス、ケイ素、窒化ケイ素、またはそれらの混合物を含み得る固体支持体で作製される。マイクロポアまたはマイクロウェルの寸法は、直径５ミクロン、深さ約５ミクロン～深さ４０ミクロンの範囲であってよく、底部が開口されていても（すなわちマイクロポア）または閉口されていてもよい（すなわちマイクロウェル）。５ミクロンのマイクロポアの底部が、２００～４００ナノメートル厚の窒化ケイ素上に０．５ミクロンの穴をもつ別の層を備える場合があり、それにより、５ミクロンのマイクロポアに上部から液体を充填することができ、底部の０．５ミクロンの孔から空気は通るが液体は漏れないようにすることができる。一実施形態では、各細区画は、六方充填で形成された、直径５ミクロンの６０×４６＝２，７６０個のマイクロポアまたはマイクロウェルを備える。そのような実施形態は、後続のｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたはｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎに最適である。

【0099】

上記実施形態の別の変形例では、細区画Ｚは、幅４００ミクロン×長さ６００ミクロンであり、細区画間に幅１００ミクロンの隆起部Ｘ及びＹを備える。マイクロポアまたはマイクロウェルの寸法は、直径２．５ミクロン、深さ約２．５ミクロン～深さ２０ミクロンの範囲であってよく、底部が開口されていても（すなわちマイクロポア）または閉口されていてもよい（すなわちマイクロウェル）。２．５ミクロンのマイクロポアの底部が、２００～４００ナノメートル厚の窒化ケイ素上に０．５ミクロンの穴をもつ別の層を備える場合があり、それにより、２．５ミクロンのマイクロポアに上部から液体を充填することができ、底部の０．５ミクロンの孔から空気は通るが液体は漏れないようにすることができる。一実施形態では、各細区画は、六方充填で形成された、直径２．５ミクロンの１００×９２＝１１，０４０個のマイクロポアまたはマイクロウェルを備える。そのような実施形態は、後続のｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたはｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎに最適である。

【0100】

本発明の別の実施形態（図１Ｃ）では、細区画Ｚは列Ａ_１～Ａ_ｉ及び行Ｂ_１～Ｂ_ｉｉに存在し、幅８００ミクロン×長さ１，２００ミクロンである。細区画Ｚ間にはさらに２００ミクロン幅の隆起部Ｘ及びＹが使用され、細区画の間隔及び追加の構造支持体を提供する。そのような隆起部は、細区画間の流体運動を可能にするくぼみまたは流路を有するように設計されてもよい。マイクロウェルは、複合材料、プラスチック、金属、ガラス、ケイ素、窒化ケイ素、またはそれらの混合物を含み得る固体支持体で作製される。マイクロウェルの寸法は、直径５０ミクロン、深さ約５０ミクロン～深さ４００ミクロンの範囲であってよい。一実施形態では、各細区画は、正方充填または六方充填で形成された、直径５０ミクロンの１２×８＝９６個のマイクロポアまたはマイクロウェルを備える。そのような実施形態は、後続のｑＰＣＲ、ＵｎｉＴａｑ、ＦＲＥＴ、またはｑＬＤＲ検出に最適である。

【0101】

本発明の別の実施形態（図１Ｄを参照）では、細区画Ｚは列Ａ_１～Ａ_ｉｉ及び行Ｂ_１～Ｂ_ｖに存在し、幅４００ミクロン×長さ６００ミクロンである。細区画Ｚ間にはさらに１００ミクロン幅の隆起部Ｘ及びＹが使用され、細区画の間隔及び追加の構造支持体を提供する。そのような隆起部は、細区画間の流体運動を可能にするくぼみまたは流路を有するように設計されてもよい。マイクロポアは、複合材料、プラスチック、金属、ガラス、ケイ素、窒化ケイ素、またはそれらの混合物を含み得る固体支持体で作製される。マイクロポアの寸法は、直径５ミクロン、深さ約５ミクロン～深さ４０ミクロンの範囲であってよい。５ミクロンのマイクロポアの底部が、２００～４００ナノメートル厚の窒化ケイ素上に０．５ミクロンの穴をもつ別の層を備える場合があり、それにより、５ミクロンのマイクロポアに上部から液体を充填することができ、底部の０．５ミクロンの孔から空気は通るが液体は漏れないようにすることができる。一実施形態では、各細区画は、六方充填で形成された、直径５ミクロンの６０×４６＝２，７６０個のマイクロポアまたはマイクロウェルを備える。そのような実施形態は、後続のｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたはｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎに最適である。

【0102】

上記実施形態の別の変形例では、細区画は、幅４００ミクロン×長さ６００ミクロンであり、細区画間に幅１００ミクロンの隆起部を備える。マイクロポアまたはマイクロウェルの寸法は、直径２．５ミクロン、深さ約２．５ミクロン～深さ２０ミクロンの範囲であってよい。２．５ミクロンのマイクロポアの底部が、２００～４００ナノメートル厚の窒化ケイ素上に０．５ミクロンの穴をもつ別の層を備える場合があり、それにより、２．５ミクロンのマイクロポアに上部から液体を充填することができ、底部の０．５ミクロンの孔から空気は通るが液体は漏れないようにすることができる。一実施形態では、各細区画は、六方充填で形成された、直径２．５ミクロンの１００×９２＝１１，０４０個のマイクロポアを備える。そのような実施形態は、後続のｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたはｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎに最適である。

【0103】

デバイスは、マイクロ流体流路に流体接続されたマイクロポアまたはマイクロウェルのアレイを備えると想定される。一実施形態では、流体接続された流路により、様々な試薬及び酵素を一連の反応チャンバーに供給し、前増幅反応を行ってから産物をマイクロポアまたはマイクロウェルのアレイに移動させ、後続のＴａｑｍａｎ（商標）またはシーケンシング読み取りを行うことが可能である。

【0104】

図２の左（下）部分は、直径５０ミクロンのマイクロウェルまたはマイクロポアのアレイへのマイクロ流路の流体接続を示す概略正面図である。図２のこの部分では、マイクロ流路は、注入口２及び出口８を有するカートリッジ４によって画定される空間６に存在する。図２の右（上）部分は、カートリッジ内部の構成要素の詳細図を記載したものであり、数千のマイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバーの例示的な設計の概略正面図を示している。この設計は、後述するような、ＣＴＣまたはエキソソームから単離された低存在量及び中存在量のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びスプライス部位変異体を同定するためのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－ＵｎｉＴａｑ検出の実行に適したチャンバー構造を示している。この図では、試料注入口は、入口１２を経て大きな六角形チャンバー１０（下）に流体接続され、六角形チャンバーは、導管１４によって、第１の１２個の菱形チャンバーのセット１６（４個おきに、それぞれ大トラフ１８ｃ、中トラフ１８ｂ、及び小トラフ１８ａを含む）に流体接続され、第１の菱形チャンバーのセットは、導管２０によって、第２の２４個の菱形チャンバーのセット２２（２個おきに、それぞれ大トラフ２４ａ及び小トラフ２４ｂを含む）に流体接続され、第２の菱形チャンバーのセットは、導管２６によって、２４個の細長い混合チャンバー２８に流体接続され、混合チャンバーは、導管３０によって、マイクロウェルまたはマイクロポアが含まれる細区画３２（パネルの上部に２行のみを図示）に流体接続されている。全チャンバーに所与のレベルで等しく充填するために、流体の流れを制限するように蛇行経路が設計されている場合がある。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。

【0105】

図３の左（下）部分は、直径５ミクロンのマイクロポアのアレイへのマイクロ流路の流体接続を示す概略正面図である。図３のこの部分では、マイクロ流路は、注入口１０２及び出口１０８を有するカートリッジ１０４によって画定される空間１０６に存在する。図３の右（上）部分は、カートリッジ内部の構成要素の詳細図を記載したものであり、Ｔａｑｍａｎ（商標）またはシーケンシング反応に適した、数百万のマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバーの別の例示的な設計の概略正面図を示している。この図では、注入試料は、入口１１２を経て大きな六角形チャンバー１１０（下）に流体接続され、大きな六角形チャンバーは、導管１１４によって、第１の８個の六角形チャンバーのセット１１６（４個おきに、それぞれ大トラフ１１８ａ及び小トラフ１１８ｂを含む）に流体接続され、第１の六角形チャンバーのセットは、導管１２０によって、第２の１６個の六角形チャンバーのセット１２２（２個おきに、それぞれ大トラフ１２４ａ及び小トラフ１２４ｂを含む）に流体接続され、第２の六角形チャンバーのセットは、導管１２６によって、１６個の細長い混合チャンバー１２８に流体接続され、混合チャンバーは、導管１３０によって、マイクロポアが含まれる細区画１３２（パネルの上部に２行のみを図示）に流体接続されている。第２の１６個の六角形チャンバーのセット１２２は、互いに少しずつオフセットした例が示されているが、これは密な構造を保ちながら、各チャンバー内での液体容積を大きくできるようにするためである。全チャンバーに所与のレベルで等しく充填するために、流体の流れを制限するように流体経路が設計されている場合がある。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。

【0106】

図４Ａ～図４Ｃは、固体支持体の細区画２３２内の５０ミクロンのマイクロウェルと、流体の流れを誘導しやすくするプレート２０４の概略正面図（図４Ａ）、図４Ａの線Ｂ－Ｂに沿った概略水平断面図（図４Ｂ）、及び図４Ａの線Ｃ－Ｃに沿った概略垂直断面図（図４Ｃ）を示す。この図は、５または２．５ミクロンのマイクロポア２０２にも該当するが、その場合、各チャンバー内に図示されるマイクロポアは多くなる。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。これはウェルの六方空間配置の例を示す。この実施形態では、マイクロウェルの内部表面は親水性表面を有し、対する外部表面は疎水性であるため、標的または前増幅した標的及び／またはプライマーが含まれる水性液体をマイクロウェルの上に（例えば下から上に）流すと、水性液体が各マイクロウェルに充填される。続いて疎水性液体（すなわち鉱油、シリコーン油、フッ素化油、またはペルフルオロデカリン）をウェルの上に流すと、疎水性液体で覆われた個々のウェルに水性液体が残り、それぞれが隔離されたウェル内で、後続の酵素反応または増幅反応を独立して進行することが可能である。

【0107】

図４の一実施形態では、プレートの表面は疎水性である。別の実施形態では、プレートの表面は親水性である。一実施形態では、チャンバーからの注入及び排出を制御する１つ以上のバルブを用いて、下部から液体を流入させ、上部から流出させる。下部から上部へ至る水性液体のマイクロウェルへの流れは、下部から陽圧をかけること、すなわち上部が空気に開放されたチャンバーに液体を送出することによって、及び／または陰圧をかけること（すなわちシリンジ吸引または部分的な真空引き）によって促進することができる。流速は、様々な組み合わせの圧力を使用して調整することができる。

【0108】

図５Ａ～図５Ｃは、固体支持体の細区画２３２内の５０ミクロンのマイクロポア２０２の概略正面図（図５Ａ）、図５Ａの線Ｂ－Ｂに沿った概略水平断面図（図５Ｂ）、及び図５Ａの線Ｃ－Ｃに沿った概略垂直断面図（図５Ｃ）を示す。これは図４Ａ～図４Ｃと同様であるが、前面プレート２０４及び背面プレート２０６を備える。この図では、チャンバーの前面は前面プレートとマイクロポアの広径側との間の領域であり、チャンバーの背面は背面プレートとマイクロポアの狭径側との間の領域である。背面プレートを発熱体に押し付けることで、温度制御、加熱、及び／または熱サイクルが可能になる。

【0109】

図４Ａ～図４Ｃ及び図５Ａ～図５Ｃはいずれも、流体の流れを誘導しやすくし、構造安定性をもたらすために、細区画間の隆起部がプレート２０４及び２０６にどのように連結されているかを示している。この図は、５または２．５ミクロンのマイクロポアにも該当するが、その場合、各チャンバー内に図示されるマイクロポアは多くなる。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。一実施形態では、縦方向の隆起部はプレートと面一であり、横方向の隆起部は液体が列の上を流れるが、ある列から次の列へは流れないようにするためのくぼみまたは流路を有する。最初に特定のプライマーを行内に予備充填するのに適した別の実施形態では、列間の流路を閉鎖するため、ならびに追加分の高さを設け、行全体に流体を流すことは可能であるが、ある行から次の行へは流れないようにするための隆起を有する横方向の隆起部と共に一時的かつ補足的なプレートを利用する。目的とするプライマーセットが行に充填された後、液体が蒸発するにつれて、プライマーはマイクロポア内の親水性表面で濃縮される。プレートを取り外すと、その蒸発を促進することができ、その後、最後のプレートを元に戻すと、行から列の上へと流れるが、ある列から次の列へは流れないようにすることができる。マイクロポアが含まれる固体支持体の背面にある隆起部も、類似する構造のものであり、背面でも液体が列の上を流れるように背面プレートに取り付けられる。横方向の隆起部にある流路またはくぼみの位置は、望ましい構造支持体が得られるようにオフセットされていてもよい。隆起部、くぼみ、または横方向の隆起部の流路の正確な寸法を最適化して、流体の流れが最適下限となるデッドスペース、すなわち所与のチャンバーの角のスペースを回避することができる。

【0110】

図６Ａ～図６Ｃは、図５Ａ～図５Ｃと同様に、固体支持体２３２内の５０、５、または２．５ミクロンのマイクロポア２０２の概略正面図（図６Ａ）、図６Ａの線Ｂ－Ｂに沿った概略水平断面図（図６Ｂ）、及び図６Ａの線Ｃ－Ｃに沿った概略垂直断面図（図６Ｃ）を示す。ただし、この図では、５０、５、または２．５ミクロンのマイクロポアの底部が、２００～４００ナノメートル厚の窒化ケイ素上に０．５ミクロンの穴をもつ別の層２３８をどのように備えるかを示している。この層により、５０、５、または２．５ミクロンのマイクロポアに前面から液体を充填することができ、背面の０．５ミクロンのポアから空気は通るが液体は漏れないようにすることができる。これらの図では、チャンバーの前面は前面プレート２０４とマイクロポアの広径側との間の領域であり、チャンバーの背面は背面プレート２０６とマイクロポアの狭径側との間の領域である。背面プレート２０６を発熱体に押し付けることで、温度制御、加熱、及び／または熱サイクルが可能になる。一実施形態では、プレート２０４及び２０６いずれの表面も疎水性である。別の実施形態では、一方のプレートの表面は親水性であり、他方は疎水性である。別の実施形態では、両方のプレートの表面が親水性である。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。

【0111】

以下のセクションでは、異なるマイクロ流体チャンバー構造の説明を記載すると共に、様々なチャンバー、マイクロウェル、及び／またはマイクロポアに、後続の核酸の増幅、検出、及び／またはシーケンシング反応に適した液体がどのように充填されるかについて例示する。

【0112】

図７Ａ～図７Ｉは、異なる試薬を混合すること、様々な増幅反応を実施すること、または後ほど次の反応に使用するため、もしくはマイクロウェルもしくはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させるために上記増幅反応物の一部を保存することを含む様々な操作を行うことができるプレチャンバーの様々な設計の概略正面図を示す。一般に、流体は下部口から入り、上部口から出る。いくつかの補足例では、サイズ及び種類が同じである複数のチャンバーに同時に充填される。これらの例では、チャンバーは一般に疎水性の材料で作製されており、液体は親水性である。こうした例では、少量の低密度疎水性油（すなわち鉱油）を使用して各チャンバーの上部を密閉することで、液体の水分を失うことなく、熱サイクルすることが可能である。場合により、後方から水性液体を押し流す際には、これらのチャンバーの下部を密閉する疎水性液体はフッ素化油、すなわちペルフルオロデカリンなどのより高密度なものであり得る。さらに、グリセロール（１０％ｖ／ｖ超を使用した場合、酵素活性に影響を及ぼす）などの添加剤、または酵素安定性を増強するか、もしくはＧＣリッチ標的の増幅を増強する他の化合物、例えばベタイン、エクトイン、ヒドロキシエクトイン、マンノシルグリセレート、マンノシルグリセルアミド、リン酸ジグリセロール、または他の糖もしくは糖誘導体を使用して、水性層の密度及び粘度を調整することができる。図７Ａでは、鉱油の小さなプラグにより、液体がチャンバーに注入されるように水性反応成分が誘導される。鉱油が上部出口に到達し、チャンバーが密閉されると、チャンバーに水性液体が充填され、下部入口はフッ素化油で密閉される。熱サイクル（または他の反応）の後、液体が排出されると、入口の左側にある浅いトラフに保持された少量の水性液体が残る。新たに試薬が導入されると、先の反応の増幅産物と混合されることになる。図７Ｂは図７Ａと同様であるが、より多量の産物がトラフに保持される。図７Ｃは図７Ａと同様であるが、ほぼ半量の産物がトラフに保持される。図７Ｄは図７Ａの変形例であり、いくつかのプライマーセットが右側の第２のトラフにプリントされる場合がある。これらの条件下では、下部チャンバーでの最初の反応からの産物を、第１（左側）のトラフには充填されるが、第２のトラフを超えないように、この第２のチャンバーへ流体流入させることができる。液体が排出されると、入口の左側にある浅いトラフに保持された少量の水性液体が残る。新たに試薬が導入されると、先の反応の増幅産物に加え、第２のトラフに付着するプライマーとも混合されることになる。この方法では、一次ＰＣＲに続いて二次ＬＤＲまたはＰＣＲ反応を行うことができる。留意点として、二次反応からの液体を排出すると、産物は左側と右側両方のトラフに残る。図７Ｅは図７Ｄの変形例であり、第１の産物セットの方を多く保持するために第１のトラフの方が大きくなっている。図７Ｆは図７Ｃと同様であるが、第２のプラスチック部品を備える。これにより、第２の反応流体を下方へ移動させ、最初の反応により予め残存する産物と完全に混合することを確実にする。図７Ｇは図７Ａと同様であるが、下部ではなく側面から試薬が投入される。それによって、最初の反応からの一部の産物をチャンバーに保持し、後で第２の反応物と混合することができる。図７Ｈは図７Ｇと同様であるが、より多量の産物がチャンバー下部に保持される。図７Ｉでは、チャンバーは図７Ｈと同様であるが、追加部分をいくつか備える。鉱油が入口に押し上げられると、一部は２本の細い疎水性チューブに入り、残りはチャンバーの側面に入る。それに続く水性液体は、細い疎水性の開口部には入らず、前方に鉱油の小さなプラグがある反応チャンバーに完全に流入される。鉱油が上部出口に到達し、チャンバーが密閉されると、チャンバーに水性液体が充填され、２本の細いチューブにも鉱油が充填され、下部入口はフッ素化油で密閉される。反応後、液体が排出されると、２本の細いチューブから鉱油が、続いて空気が排出される。チャンバー内で産生された産物はいかるものもそこに留まる。十分な水性流体が追加され、上部の空気開口部を超えて液体が押し上げられると、産物は次のチャンバーに流体流入することができる。

【0113】

図８Ａ～図８Ｃは、マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに、導管１４、２０、２６、及び３０内の液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバーの様々な設計の概略正面図を示す。図８Ａは、８つのチャンバー１６内の流体連結するプライマー及び／またはプローブ（灰色の円１７）が、チャンバーを出た後、導管２６によって、より細長いチャンバー２８へ、そしてマイクロウェルまたはマイクロポアの細区画３２へと入り、最終的にマイクロウェルまたはマイクロポア内で乾燥され、内部表面に共有結合する例である。一実施形態では、カートリッジの製造時に、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマー）を行に予備充填する。一実施形態では、一時的なプレートを使用して、マイクロウェルまたはマイクロポアの列全体にわたるが、各行は互いに隔離された流体経路を提供する。図の上部にある灰色の円は、例えば音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティングによってプライマーセットが送達またはプリントされる可能性のある位置を示している。プリント後、マイクロ流体流路を使用してプライマーセットを各行に分配し、個別のマイクロウェルまたはマイクロポア内で乾燥させることができる。プライマーセットが適切に送達され、所定の位置で乾燥された後は、一時的なプレートを取り外して、永続的なカバーと交換し、マイクロウェルまたはマイクロポアの列の上を通るが、各列を隣接列から隔離する流体経路を提供する。図８Ｂは、トラフ１８及び２４ならびにバッフル２３を備えた４＋４のチャンバー１６及び２２に流体連結する試薬が、チャンバーを出た後、細長いチャンバー２８、さらに導管３０及び細区画３２へと流入する例である。この図では、灰色の円２５は、ポリメラーゼ及び／またはリガーゼによるＤＮＡ増幅反応に適した特異的プライマーを表す。長いチャンバーの左側は極疎水性のプラスチックでコーティングされているか、またはそれで作製されているが、右側はわずかに疎水性であるか、やや親水性である。鉱油の小さなプラグは最初のチャンバーから押し出されると、自然に左方向へ移動し、プラグに続く水性反応物が、マイクロウェルまたはマイクロポアで構成される列（図の上部）へと直接押し流される。したがって、最初に水性液体に露出させる（それにより、閉じ込められた気泡が液体の動きを妨げるのを回避する）ことにより、マイクロウェルまたはマイクロポアへの充填が最適に機能すれば、この手段により、鉱油が経路から取り除かれる。図８Ｃは図８Ｂと同様の概略図であり、その図では、トラフ１８及びバッフル１９を備えた４つのチャンバー１６に流体連結する試薬が、チャンバーを出た後、細長いチャンバー２８、さらに細区画３２へと流入する。この図では、灰色の円１７は、ポリメラーゼ及び／またはリガーゼによるＤＮＡ増幅反応に適した特異的プライマーを表す。図８Ｃには、追加のプラスチック製隆起部または仕切部２９が示されている。これは、後続の水溶液がチャンバーを通って押し上げられる際に、疎水性油を水溶液から分離し、それと混ざらないようにする効果がある。

【0114】

図９Ａ～図９Ｂは、図５Ｂ及び図６Ｂに例示されるような、マイクロポアに充填するための実施形態の概略側面図を示す。これらの図では、マイクロポア２０２の内側は親水性であり、他の表面は疎水性である。一実施形態では、マイクロポアのアレイへの流体移動に適したプレチャンバー内に、例えば音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティング（図８Ａを参照）により、異なるプライマー及びプローブがプリントされる。図９Ａ及び図９Ｂにおいて、前面プレート２０４は流路２４０の上方に示されている。図９Ａは、固体支持体２３２内の、頂部と底部の両側が開口しているマイクロポア２０２を示す。上部流路２４０からマイクロポアにプライマー（及びプローブ）が流体導入されると同時に、背面プレート２０６と形成される下部流路２４２から油（好ましくは水溶液よりも高密度である）が導入される。続いて、油（低密度のもの）によって上部流路２４０から水溶液が押し流され、プライマー／プローブは流体分離される。プライマーが表面に共有結合的に固定されている場合、その化学作用は、上部流路２４０と下部流路２４２の両方に油が充填されたときに起こり得る。あるいは、捕捉によりプライマーが固定される場合もあり、例えばビオチン化プライマーはストレプトアビジンをコーティングした表面によって捕捉することができる。プライマー－プローブを後で乾燥させる場合、酢酸アンモニウムなどの揮発性塩に配合するか、あるいはベタイン、エクトイン、ヒドロキシエクトイン、マンノシルグリセレート、マンノシルグリルアミド、リン酸ジグリセロール、または他の糖もしくは糖誘導体を含有する安定化緩衝液を加えてもよい。その後、マイクロポア内の水溶液と混和しない揮発性有機物（すなわちヘキサノール）を用いて、上部の油を押し流すことができる。揮発性有機物を空気で押し流し、穏やかな熱の存在下で水を蒸発させると、目的とするプライマー及びプローブが乾燥してマイクロポアの内部表面に残るようにすることができる。下部の油も揮発性有機物、続いて空気で押し流し、アレイチャンバーを乾燥させてもよい。あるいは、プライマーがマイクロポア２０２の内部表面に固定されている場合、過剰なプライマーを洗い流した後、任意の揮発性有機物（すなわちエタノール）を加えて乾燥させる。図９Ｂは、上部流路２４０（プレート２０２とで形成）側が開口する固体支持体２３２内にあり、２００～４００ナノメートル厚の窒化ケイ素上に０．５ミクロンの穴をもつ別の層２３８を備えるマイクロポア２０２を示す。この層により、５０、５、または２．５ミクロンのマイクロポアに流路２４０経由で前面から液体を充填することができ、下部流路２４２（背面プレート２０６とで形成）の０．５ミクロンの孔から空気は通るが液体は漏れないようにすることができる。この図では、任意のプライマーの固定工程時に必要とされる場合、マイクロポア２０２内の反応物を後で加熱できるように下部流路２４２に油が追加されている。他の実施形態、例えば固定を伴わずにプライマー／プローブを追加する場合、下部及び／または上部のチャンバーに油を使用してもしなくてもよい。

【0115】

図１０は、細区画３２のマイクロウェルまたはマイクロポアに充填する前に、反応チャンバーに充填する実施形態の概略正面図を示す。この構成には、導管１４及び２０によって供給が行われる２組の反応チャンバー１６及び２２が含まれ、それぞれがトラフ１８及び２４を有し、第２のセットには適切なライゲーションプローブオリゴヌクレオチド（灰色の円２５）が事前にスポットされている。左側は、マイクロポアアレイでのＴａｑｍａｎ（商標）読み取り前の初期マルチプレックスＰＣＲ前増幅及びそれに続くリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）用のマイクロ流路及びチャンバーの一部の概略図を示している。次のパネルでは、下部の導管１４に軽油キャップ、続いて標的、ＰＣＲプライマー、及びＰＣＲ試薬を含む水性液体を導入した後、重油を使用して、この水性反応混合物を第１の反応チャンバーのセット１６に流体移動させる。ＰＣＲ熱サイクル工程の後、油と大半の水性反応物が導管１４によって排出されるが、最初の２つのチャンバー１６それぞれのトラフ１８に少量のＰＣＲ産物が保持される。導管１４経由でチャンバーに再び軽油を充填した後、ＬＤＲ試薬及び酵素を充填し、次いでこの水性反応混合物を、重油を使用して第２の反応チャンバーのセット２２（事前にスポットされたＬＤＲプライマーとここで混合する）に流体移動させる。反応チャンバー２２から、導管２６によって反応チャンバー２８（プラスチック製隆起部または仕切部２９により分割される）へ、さらに導管３０によってマイクロウェルまたはマイクロポアの細区画３２へと流入する。ＬＤＲの熱サイクル工程の後、再度試薬が排出されるが、ＬＤＲ産物はトラフ２４に保持される。このときこの産物は、図１１Ａから～図１１Ｂで説明するように、ＰＣＲマスターミックスと流体混合して、マイクロポアアレイへ移動させ、後続のＴａｑｍａｎ（商標）反応を行うのに適したものである。

【0116】

図１１Ａ～図１１Ｂは、Ｔａｑｍａｎ（商標）またはＵｎｉＴａｑ反応などのリアルタイムＰＣＲ反応を実施するために、図５Ｃ及び図６Ｃに例示されるようなマイクロポア２０２に充填するための実施形態の概略側面図を示す。図１１Ａ～図１１Ｂでは、流路２４０の左側に前面プレート２０４が示され、流路２４２の右側に背面プレート２０６が示されている。この図は、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマー）を予備充填して乾燥させた、固体支持体２３２内のマイクロポア２０２から始まっている。一実施形態では、マイクロポア２０２の内部表面は親水性表面を有し、対する外側の前面２４４及び背面２４６は疎水性であるため、標的または前増幅した標的及び／またはプライマーが含まれる水性液体をマイクロポアの上に（例えば下部から流路２４２を通り、孔の直径が大きい前面側２４４から流路２４０を通り上部まで）流すと、水性液体が各マイクロポアに充填される。一実施形態では、チャンバーからの注入及び排出を制御する１つ以上のバルブを用いて、流路２４０または２４２の下部から液体を流入させ、流路２４０または２４２の上部から流出させる。一実施形態では、チャンバーの前後の流体の注入及び排出が、個々のバルブによって、または個々に圧力を加えることによって調整または制御される。下部から上部へ至る水性液体のマイクロポアへの流れは、流路２４０または２４２経由で下部から陽圧をかけること、すなわち上部が空気に開放されたチャンバーに液体を送出することによって、及び／または陰圧をかけること（すなわちシリンジ吸引または部分的な真空引き）によって促進することができる。流速は、上部、下部、前面、または背面から様々な組み合わせの圧力を使用して調整することができる。例示目的で、マイクロポア２０２内での後続の個別化した増幅に適する水性液体をマイクロポア２０２に充填する作業について検討する。図１１Ａでは、マイクロポア２０２の内側表面を除き、前面２４４及び背面２４６を含むすべての表面が疎水性である。下部前面から陽圧を利用して水性流体が注入されると、流体が流路２４０を通って前面２４４からマイクロポア２０２に入り、流路２４２を通って背面２４６から空気が押し出され、マイクロポア２０２の背面にメニスカスが形成される。最初に充填されたマイクロポアの背面から液体を押し出すのに十分な圧力を生じさせるために、前面で水性液体が上昇するにつれ重量が増加しないように、下部背面２４６から流路２４２へと疎水性液体を押し出して、マイクロポア２０２の背面の水性メニスカスを形成直後に覆う。至適な圧力高の差は実験により決定することができる。この差は、液体の粘度、液体の密度、液体の体積差に加え、マイクロポアのある固体支持体の外側表面の疎水性の作用であると考えられる。水性液体が流路２４０を通って前面２４４からマイクロポア２０２に充填されたときに、前面２４４から流路２４０を通って疎水性液体（すなわち重油）が流入すると、非生産的な容積から水性液体が押し出され、マイクロポア２０２へ流入すると同時に、前面２４４の各個々のマイクロポア２０２が油で覆われる。それにより、マイクロポアそれぞれに水性液体が充填され、前面２４４及び背面２４６は疎水性液体で密閉される。各マイクロポア２０２は流体分離されており、後続の独立した増幅及び熱サイクル反応に適している。図１１Ｂでは、マイクロポア２０２の内側表面と０．５ミクロンの穴のある窒化ケイ素２３８を除き、すべての表面が疎水性である。流路２４０経由で下部前面２４４から陽圧を利用して水性流体が注入されると、流体が前面２４４からマイクロポア２０２に入り、流路２４２経由で背面２４６から空気を押し出し、液体は０．５ミクロンの窒化ケイ素の孔を通過しない。水性液体が前面２４４からマイクロポア２０２に充填されたときに、前面２４４から流路２４０を通って油が流入すると、非生産的な容積から水性液体が押し出され、マイクロポア２０２へ流入すると同時に、前面２４４の各個々のマイクロポア２０２が油で覆われる。チャンバーの背面に加湿空気を充填して加熱し、最終的にマイクロポア内の水性液体を加熱してもよい。あるいは、流路２４２経由でチャンバーの背面２４６にも図のように油を充填してもよい。それにより、マイクロポア２０２それぞれに水性液体が充填され、前面及び背面が油で密閉される。各マイクロポアは流体分離されており、後続の独立した増幅及び熱サイクル反応に適している。

【0117】

図１２は、シーケンシング反応を実行するために、図６Ａ～図６Ｃに例示されるようなマイクロポアに充填するための実施形態の概略側面図を示す。図１２では、流路２４０の左側に前面プレート２０４が示され、流路２４２の右側に背面プレート２０６が示されている。この例では、マイクロポア２０２の内側表面と０．５ミクロンの穴のある窒化ケイ素２３８を除き、前面２４４及び背面２４６を含むすべての表面が疎水性である。流路２４０経由で下部前面２４４から陽圧を利用して水性流体が注入されると、流体は前面２４４からマイクロポア２０２に入り、流路２４２経由で背面２４６から空気を押し出し、０．５ミクロンの窒化ケイ素の孔は通過しない。水性液体が前面２４４からマイクロポア２０２に充填されたときに、前面２４４から油が流入すると、非生産的な容積から水性液体が押し出され、マイクロポアへ流入すると同時に、前面２４４の各個々のマイクロポアが油で覆われる。流路２４２の背面２４６にも油が充填されている。それにより、マイクロポア２０２それぞれに水性液体が充填され、前面２４４及び背面２４６は油で密閉される。各マイクロポア２０２は流体分離されており、鋳型鎖を増幅して、マイクロポアの内部表面の固体支持体に固定する後続の独立した熱サイクル反応に適している。油は流路２４０を通り前面２４４から押し流されるが、反対側の鎖産物は変性され、他の産物及びプライマーは洗い流される。重油プラグを使用して流路２４０で前面２４４下部を塞ぐと同時に、流路２４２に通して背面２４６をすすぎ、場合により空気乾燥させると、シーケンシングに適したマイクロポア２０２内でクローン増殖されて固定された標的鎖がアレイに供給される。背面２４６の下部から上部前面２４４及び背面２４６に至る、水性液体のマイクロポアへの流れは、下部から陽圧をかけること、すなわち上部が空気に開放された流路２４０または２４２に液体を送出することによって、及び／または陰圧をかけること（すなわちシリンジ吸引または部分的な真空引き）によって促進することができる。流速は様々な組み合わせの圧力を使用して、または上部背面での開口を制限することにより調整できるため、必ずシーケンシング試薬の体積のほとんどが下部背面２４６から入り、マイクロポア２０２を通って上部前面２４４から排出される。マイクロポア２０２の背面側に窒化ケイ素層２３８を使用するさらなる利点は、前面側２４４から追加された水性液体は、背面側２４６の空気界面を破壊しないが、流路２４２の背面２４６に水性液体が充填されている場合、０．５ミクロンの穴からマイクロポア２０２の前面２４４へと自由に通過することである。これにより、後続のシーケンシング反応での試薬の追加及び様々な試薬の流入または流出において柔軟性が高まる。

【0118】

図１３Ａ～図１３Ｂは、図１及び図６Ａ～図６Ｃに記載のマイクロウェルまたはマイクロポアを使用したチャンバー形式の概略正面図を示す。図１３Ａは、空間３０６を画定するカートリッジ３０４内の細区画３３２が幅８００ミクロン×長さ１２００ミクロン（長方形断面図として図示）であり、直径５０ミクロンの９６個のマイクロウェルが含まれるマイクロウェル形式の概要を示す。細区画３３２間にはさらに２００ミクロン幅の隆起部３５０が使用され、細区画の間隔及び追加の構造支持体を提供する。これらを長方形の細区画３３２の行間及び列間に「白色」領域として表す。この概略図では、簡潔にするため、３２列×３２行を示している。他の実施形態として、４８列×４８行、及び６４列×６４行が挙げられる。図１３Ｂは、マイクロタイタープレート形式のマイクロポアのアレイ上でシーケンシングするためのマイクロ流体チャンバーの概要を示す。本概略図では、空間４０６を画定するカートリッジ４０４内の３２の二重列×３２の二重行を示し、拡大図には、２，０７２個のマイクロポアをそれぞれが含む、（白色隆起部４５０で区切られた）細区画４３２の二重列２つと二重行１つのみを示す。他の実施形態として、４８の二重列×４８の二重行、６４の二重列×６４の二重行が挙げられる。さらに他の実施形態として、９６列×９６行、及び１２８列×１２８行が挙げられる。一実施形態では、マイクロポアを含むチャンバーへの注入口を通る供給は、流体閉鎖または流体開放できる一連の個々の開口部から、音響液滴射出を使用して、列のチャンバーすべてに、試薬、酵素、標的、または前増幅した標的を流入させる。音響液滴射出を使用する場合、反対側から陰圧をかけること（すなわち真空）によって、及び／または一連の親水性入力チャンバー４５２及び導管４５４及び遷移部４５６に導管４５５内の液滴を供給し、続いてマイクロポアの列を有する細区画４３２に供給することにより、注入口４０２から個々の開口部への流体の流入を促進することができる。この概略図では、個々の開口部はそれぞれ親水性の入力チャンバー４５２に接続されており、そのチャンバーからマイクロポアを含む２列の細区画４３２へ供給される。さらに、チャンバーはまた、１つの入口からチャンバーすべてに試薬を流入させ、反対側で単一の廃棄口または出口４０８へと流出させることを可能にするように流体連結されている。親水性の入力チャンバー４５２に試薬、酵素、標的、または前増幅した標的が適切に充填されると、これらの開口部は閉じられ、その後、油または他の試薬が１つの入口から追加され、投入溶液がマイクロポアへと流体移動して、さらに反応が行われる。

【0119】

マイクロウェルまたはマイクロポアの代替構成も考慮することができる。ＯｐｅｎＡｒｒａｙ技術は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手可能である。この技術では、様々な異なる方法で構成できる、３，０７２個のスルーホールを備えるスライド大の顕微鏡用金属プレートを使用する。例えばプレートを６４個のスルーホールまたはマイクロポアを備える４８のサブアレイに分割することができる（各サブアレイは、従来の３８４ウェルマイクロタイタープレートと同じ間隔である）。現在の構成では、各スルーホールは直径３００ミクロン、深さ３００ミクロンであり、スルーホールは親水性であるか、または親水性コーティングを備えているが、プレートの前表面及び後表面は疎水性コーティングを備えている。そのため、表面張力によって水性試薬がスルーホールに保持される。適切な増幅及び検出プライマーをスルーホールに充填した後、これらのプライマーをスルーホールの内側表面で乾燥させることができる。続いて、試料、酵素、及び適切な緩衝液を加えるとプライマーは溶解されるが、疎水性液体（すなわち鉱油）を両側に使用すると反応物は各スルーホール内の所定位置に密閉される。直径６０ミクロンのスルーホールを製造して、この技術を拡張すると、サブアレイあたり約１，２２５個のスルーホール、スライド大の顕微鏡プレートあたりの合計では５８，８００個のスルーホールまたはマイクロポアが可能になる。また、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒが開発した別のシステムがＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ＤデジタルＰＣＲ ２０Ｋチップであり、これは直径６０ミクロンのマイクロウェル２０，０００個を含むようにエッチングされたシリコン基板で構成されている。プライマー、試薬、及び酵素を加え、プレートを密閉して液体をマイクロウェルに分配し、反応を実行する。制限はチップ上で１回の反応しか実行できない点である。もう一つのシステムは、Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）が開発しており、Ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステムとして知られている。このシステムでは、標準的なマイクロタイタープレートが、３２，０００個のマイクロウェル（直径約５０ミクロンのもの）を含む２４個のチャンバー、または８，０００個のマイクロウェルを含む９６個のチャンバーに分割されている。この設計はまた、２００，０００個のマイクロウェル（直径約２０ミクロンのもの）を含む２４個のチャンバー、５０，０００個のマイクロウェルを含む９６個のチャンバー、または１２，５００個のマイクロウェルを含む３８４個のチャンバーの使用にも対応している。各チャンバーは入力流路に流体連結された入力ウェルを備え、入力流路は個別の区画で構成される多数の接続流路と流体連結され、さらに接続流路はすべて、通気口または空気穴を有する出力流路に流体連結されている。流路の下部には、プレートの密閉に適した透明なプラスチックがある。プライマー、試薬、及び酵素を入力ウェルに加えると、入力流路及び接続流路を経て流体送出され、過剰分は出力流路及び通気口に移動する。続いてローラーを使用して下部の密閉部を加圧すると流路が遮断され、それにより各区画が熱サイクル及びデジタルＰＣＲ読み取りに適した、分離されたマイクロウェルになる。圧力を利用して接続流路を一時的に遮断し、増幅反応中に限り区画（マイクロウェル）を作成することによって、または後で溶解することができる一時的な封止材によって、下部のプラスチックのみ一時的な密閉部を形成するように、このシステムを変更することができる。後続のシーケンシング反応で、個々の区画（マイクロウェル）内で標的が増幅及び固定された後、下部のプラスチックの密閉が解除され、未反応の試薬及び共有結合で固定されていない産物を変性させて洗い流すことができる。得られたクローン増幅された一本鎖標的は、以下に記載されるか、または当技術分野で公知である、後続のｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ反応に適している。

【0120】

図１４は、適切なプライマー及びプローブの予備充填に適した、図１３Ａに記載の固体支持体３３２内のマイクロウェル３０２を使用するマイクロタイタープレート形式５００の概略側面図を示す。工程Ａは、疎水性プレート内の１つのチャンバーの側面図を示す。これには、両側に隆起部３５０がある５０ミクロンの親水性ウェルが含まれる。工程Ｂで、プレートの上下を反転し、音響液滴射出を使用して、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、変異またはメチル化特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマーセット）を充填した。工程Ｃで、プレートを遠心分離し、空のマイクロウェルに水性液体を分散させる。対する工程Ｄは、遠心分離後に、水溶液が疎水性表面を回避するように、マイクロウェル上に液滴が形成されている様子を示す。工程Ｅで、水溶液を蒸発させると、ウェルには乾燥したプライマー／プローブのセットが残る（工程Ｆに図示）。

【0121】

図１５は、図１３のパネルＡに記載の固体支持体３３２内のマイクロウェル３０２及び隆起部３５０を使用し、適切なＴａｑｍａｎ（商標）またはＵｎｉＴａｑのプライマー及びプローブ（例示）を任意に予備充填した、マイクロタイタープレート形式の概略側面図を示す。工程Ａは、疎水性プレート内の１つのチャンバーの側面図を示す。これには、両側に隆起部がある５０ミクロンの親水性ウェルが含まれる。工程Ｂで、プレートの上下を反転し、音響液滴射出を使用して、リアルタイム増幅（すなわちＴａｑｍａｎ（商標）反応）及び標的ＤＮＡに適した試薬を充填する。ＰＣＲプライマー及びＴａｑｍａｎ（商標）プローブ（複数可）は、予めチャンバーに追加され、乾燥される場合もあれば（図１４に例示）、あるいは標的、酵素、及び試薬と共に追加される。工程Ｃで、水性層を疎水性鉱油で覆う。工程Ｄで、プレートをスイングバケットローターに移し、遠心分離する。高濃度の水性液体が空のマイクロウェルに分散する。工程Ｅで、プレートをサーモサイクラーに移動する。鉱油で覆われ、増幅に適した個々のマイクロウェルに液滴が分離する。

【0122】

本発明の一態様は、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって、試料中または他の試料中の他の核酸分子のヌクレオチド配列とは異なっている標的ヌクレオチド配列が含まれる複数の核酸分子を試料において同定する方法を対象とする。この方法には、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって、他の核酸分子のヌクレオチド配列とは異なっている標的ヌクレオチド配列が含まれる１つ以上の核酸分子を含有する可能性のある試料を提供することを含む。１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが提供され、各一次オリゴヌクレオチドプライマープライマーセットは、（ａ）標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。接触させる試料を、１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼとブレンドして、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し、このポリメラーゼ連鎖反応混合物を変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む、１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供することにより、標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む一次伸長産物を形成する。最初のＰＣＲ産物を２４、３６、または４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。この方法はさらに、一次伸長産物を、ポリメラーゼ及び１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットとブレンドして二次ポリメラーゼ反応混合物を形成することを含む。各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）標的ヌクレオチド配列に隣接する及び／またはそれを含む配列に相補的な５’プライマー特異的部分及びヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、ならびに（ｂ）第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の部分に相補的な５’プライマー特異的部分及びヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。接触させる試料を、１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼとブレンドして、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し、このポリメラーゼ連鎖反応混合物を変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む、１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供することにより、標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む一次伸長産物を形成する。試料中の二次伸長産物配列を検出及び識別して、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって、試料中の他の核酸分子のヌクレオチド配列とは異なっている標的ヌクレオチド配列が含まれる１つ以上の核酸分子の存在を同定する。

【0123】

図１６～図１８に本発明の本態様の様々な実施形態を示す。

【0124】

図１６（工程Ａ～Ｆ）は、未知の病原体同定のための例示的なＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＰＣＲを示している。この方法は、工程Ａに示すように、病原体ゲノムＤＮＡを分離することから始まる。病原体がＲＮＡウイルスの場合、最初の逆転写酵素工程を使用してｃＤＮＡを生成する。図１６（工程Ｂ）に示すように、試料を初期反応チャンバー内で増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、対象とする標的含有領域を増幅する。遺伝子座特異的プライマー及びデオキシヌクレオチドミックスを使用して、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応を実行する。一実施形態では、生成される異なるアンプリコンの相対比を維持するため、サイクルを制限して（１２～２０サイクル）増幅を実行する。別の実施形態では、プライマー二量体の増幅を防ぐため、各プライマーの５’末端に８～１１塩基の同じテールが含まれる。最初のＰＣＲ産物を２４、３６、または４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。

【0125】

図１６の工程Ｃに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチド二次プライマーを一次増幅産物とハイブリダイズし、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）を使用して対象とする標的含有領域を増幅する。この図の工程Ｃに示すように、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を二次プライマーに含めることにより、別の特異性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、ポリメラーゼ伸長性に優れる３’ＯＨ基が生じる（図１６、工程Ｃ）。第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーには５’プライマー特異的部分（Ａｉ）が含まれ、第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーには、二次増幅産物の後続の増幅を可能にする５’プライマー特異的部分（Ｃｉ）が含まれる。二次増幅反応の後、各一次ＰＣＲ反応チャンバーからの伸長産物は、１つ以上のタグ特異的プライマーペア（各ペアは、対応するプライマーＡｉ及びＣｉで構成される）が含まれる３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配され、ＰＣＲ増幅、及び検出される。図１６の工程Ｅ及びＦに示すように、ＰＣＲ産物の検出は、従来のＴａｑＭａｎ（商標）検出アッセイを使用して実施することができる（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，２７０，９６７号及びＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，６０１，８２１号を参照。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＴａｑＭａｎ（商標）を使用した検出では、二次ＰＣＲ産物のプライマー特異的部分のハイブリダイゼーションに適したプライマーと併用して、標的領域にまたがるオリゴヌクレオチドプローブが増幅及び検出に使用される。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブには、一方の末端に蛍光レポーター基（Ｆ１）が、もう一方の末端に消光分子（Ｑ）が含まれており、これらは互いに、無傷のプローブ内で、消光分子がレポーター基の蛍光を消光する程度に近接している。増幅時に、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ及び上流プライマーは、ライゲーション産物の相補領域にハイブリダイズする。ポリメラーゼの５’－＞３’ヌクレアーゼ活性により、ハイブリダイズしたプライマーが伸長し、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの蛍光基が遊離され、検出可能なシグナルが生じる（図１６、工程Ｆ）。

【0126】

図１７（工程Ａ～Ｆ）は、未知の病原体同定のための例示的なＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＰＣＲを示している。この方法は、工程Ａに示すように、病原体ゲノムＤＮＡを分離することから始まる。病原体がＲＮＡウイルスの場合、最初の逆転写酵素工程を使用してｃＤＮＡを生成する。図１７（工程Ｂ）に示すように、試料を初期反応チャンバー内で増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、対象とする標的含有領域を増幅する。遺伝子座特異的プライマー及びデオキシヌクレオチドミックスを使用して、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応を実行する。一実施形態では、生成される異なるアンプリコンの相対比を維持するため、サイクルを制限して（１２～２０サイクル）増幅を実行する。別の実施形態では、プライマー二量体の増幅を防ぐため、各プライマーの５’末端に８～１１塩基の同じテールが含まれる。最初のＰＣＲ産物を２４、３６、または４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。

【0127】

ＵｎｉＴａｑシステムは、Ｓｐｉｅｒの米国特許出願公開第２０１１／０２１２８４６号に完全に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＵｎｉＴａｑシステムは３つの固有の「タグ」配列の使用を伴い、図１７の工程Ｃに示すように、固有のタグ配列の少なくとも１つ（Ａｉ）は第１のオリゴヌクレオチドプライマーに存在し、第２及び第３の固有のタグ部分（Ｂｉ及びＣｉ）は、第２のオリゴヌクレオチドプライマー配列に存在する。プライマーセットのオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅すると、得られる伸長産物には、Ａｉ配列－標的特異的配列－Ｂｉ’配列－Ｃｉ’配列が含まれることになる。ＵｎｉＴａｑ手法の重要な点は、正のシグナルを生成するには、ＰＣＲプライマーセットの二次オリゴヌクレオチドプライマーの両方が正確に一致するセットであることが必要とされるため、高度に多重化された核酸の検出が可能なことである。例えば、本明細書に記載されるように、これは、２つの部分、すなわち２つのタグの相互のハイブリダイゼーションを必要とすることにより達成される。

【0128】

図１７の工程Ｃに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチド二次プライマーを一次増幅産物とハイブリダイズし、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）を使用して対象とする標的含有領域を増幅する。この図の工程Ｃに示すように、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を二次プライマーに含めることにより、別の特異性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、ポリメラーゼ伸長性に優れる３’ＯＨ基が生じる（図１７、工程Ｃ）。第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーには５’プライマー特異的部分（Ａｉ）が含まれ、第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーには、二次増幅産物の後続の増幅及び検出を可能にする５’プライマー特異的部分（Ｂｉ、Ｃｉ）が含まれる。二次増幅反応の後、各一次ＰＣＲ反応チャンバーからの伸長産物は、対応するプライマー（Ｆ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ及びＣｉ）で各ペアが構成される１つ以上のタグ特異的プライマーペアが含まれる３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配される。検出の際、Ａｉ（第１のプライマー特異的部分）、Ｂｉ’（ＵｎｉＴａｑ検出部分）、及びＣｉ’（第２のプライマー特異的部分）が含まれる二次ＰＣＲ産物は、Ａｉと同じヌクレオチド配列を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及びＣｉ’に相補的な第２のオリゴヌクレオチドプライマー（すなわちＣｉ）を使用して、両鎖にプライミングされる。第１のオリゴヌクレオチドプライマーはまた、一端に検出可能な標識Ｆ１を有し、他端に消光分子（Ｑ）を有するＵｎｉＴａｑ検出プローブ（Ｂｉ）も含む（Ｆ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ）。場合により、ポリメラーゼブロッキングユニット、例えばＨＥＧ、ＴＨＦ、Ｓｐ－１８、ＺＥＮ、またはポリメラーゼ伸長を停止するのに十分である、当技術分野で公知の他の任意のブロッカーが、消光分子の近位に配置される。ＰＣＲ増幅により、図１７の工程Ｆに示す二本鎖産物が形成される。この例では、ポリメラーゼブロッキングユニットは、第１のユニバーサルプライマーの５’部分（Ｂｉ）をポリメラーゼがコピーするのを妨げることで、一本鎖になるときに産物のボトム鎖がヘアピンを形成できないようにする。そのようなヘアピンが形成されると、ステムの３’末端にアンプリコンとのアニーリングを生じるため、この３’末端のポリメラーゼ伸長によりＰＣＲ反応が終了することになる。

【0129】

二本鎖ＰＣＲ産物が変性され、その後、温度が低下すると、産物の上部鎖は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの５’部分（Ｂｉ）と鎖の反対端の部分Ｂｉ’との間にステムを有するヘアピンを形成する（図１７、工程Ｇ）。また、この工程中に、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、ヘアピンを形成する産物の５’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）とアニーリングする。工程Ｇにおいて第２のユニバーサルプライマーが伸長すると、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、検出可能な標識Ｄ１または消光分子がアンプリコンの５’末端から切断され、それにより標識と消光分子間の距離が長くなり、標識の検出が可能になる。

【0130】

図１８（工程Ａ～Ｆ）は、未知の病原体同定のための例示的なＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＰＣＲ（ＵｎｉＲｑ）を示している。この方法は、工程Ａに示すように、病原体ゲノムＤＮＡを分離することから始まる。病原体がＲＮＡウイルスの場合、最初の逆転写酵素工程を使用してｃＤＮＡを生成する。図１８（工程Ｂ）に示すように、試料を初期反応チャンバー内で増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、対象とする標的含有領域を増幅する。遺伝子座特異的プライマー及びデオキシヌクレオチドミックスを使用して、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応を実行する。一実施形態では、生成される異なるアンプリコンの相対比を維持するため、サイクルを制限して（１２～２０サイクル）増幅を実行する。別の実施形態では、プライマー二量体の増幅を防ぐため、各プライマーの５’末端に８～１１塩基の同じテールが含まれる。最初のＰＣＲ産物を２４、３６、または４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。

【0131】

スプリットプローブシステムは、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許第９，５９８，７２８号に完全に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ここで、ＰＣＲ増幅用に設計されたスプリットプローブシステムは４つの固有の「タグ」配列の使用を伴い、図１８の工程Ｃに示すように、固有のタグ配列（Ａｉ）ならびに第２及び第３の固有のタグ部分のスプリット部分（Ｂｉ’、ｔｉ’）は、第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーに存在し、第２及び第３の固有のタグ部分の他のスプリット部分（ｔｊ及びＢｊ）、ならびに第４の固有のタグ配列（Ｃｉ）は第２の二次オリゴヌクレオチドプライマー配列に存在する。プライマーセットのオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅すると、得られる伸長産物には、Ａｉ配列－－Ｂｉ’及びｔｉ’配列－標的特異的配列－ｔｉ’，Ｂｊ’配列－Ｃｉ’配列が含まれることになる。スプリットプローブ手法の重要な点は、正のシグナルを得るには、ＰＣＲプライマーセットの二次オリゴヌクレオチドプライマーの両方が正しいことが必要とされるため、高度に多重化された核酸の検出が可能なことである。例えば、本明細書に記載されるように、これは、２つの部分、すなわち２つのタグの相互のハイブリダイゼーションを必要とすることにより達成される。

【0132】

図１８の工程Ｃに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチド二次プライマーを一次増幅産物とハイブリダイズし、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）を使用して対象とする標的含有領域を増幅する。この図の工程Ｃに示すように、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を二次プライマーに含めることにより、別の特異性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、ポリメラーゼ伸長性に優れる３’ＯＨ基が生じる（図１８、工程Ｃ）。第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーには、５’プライマー特異的部分（Ａｉ、Ｂｉ’、ｔｉ’）が含まれ、第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーには、二次増幅産物の後続の増幅及び検出を可能にする５’プライマー特異的部分（ｔｊ、Ｂｊ、Ｃｉ）が含まれる。二次増幅反応の後、各一次ＰＣＲ反応チャンバーからの伸長産物は、対応するプライマー（Ｆ１－ｒ－Ｂｊ，Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ、及びＣｉ）で各ペアが構成される１つ以上のタグ特異的プライマーペアが含まれる３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配される。検出の際、Ａｉ（第１のプライマー特異的部分）、Ｂｉ’（スプリットＵｎｉＴａｑ検出部分）、ｔｉ’（標的配列に相補的な領域）、内部ｔｉ，ｔｊ配列を含む標的配列、ｔｊ’（標的配列に相補的な領域）、Ｂｉ’（スプリットＵｎｉＴａｑ検出部分）、及びＣｉ’（第２のプライマー特異的部分）が含まれる二次ＰＣＲ産物は、Ａｉと同じヌクレオチド配列を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及びＣｉ’に相補的な第２のオリゴヌクレオチドプライマー（すなわちＣｉ）を使用して、両鎖にプライミングされる。第１のオリゴヌクレオチドプライマーはまた、一端に検出可能な標識Ｆ１を有し、他端に消光分子（Ｑ）を有するＵｎｉＴａｑ検出プローブ（Ｂｊ，Ｂｉ、内部にリボース塩基を有する）も含む（Ｆ１－ｒ－Ｂｊ，Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ）。場合により、ポリメラーゼブロッキングユニット、例えばＨＥＧ、ＴＨＦ、Ｓｐ－１８、ＺＥＮ、またはポリメラーゼ伸長を停止するのに十分である、当技術分野で公知の他の任意のブロッカーが、消光分子の近位に配置される。ＰＣＲ増幅により、図１８の工程Ｆに示す二本鎖産物が形成される。この例では、ポリメラーゼブロッキングユニットは、第１のユニバーサルプライマーの５’部分（Ｂｊ，Ｂｉ）をポリメラーゼがコピーするのを妨げることで、一本鎖になるときに産物のボトム鎖がヘアピンを形成できないようにする。そのようなヘアピンが形成されると、ステムの３’末端にアンプリコンとのアニーリングを生じるため、この３’末端のポリメラーゼ伸長によりＰＣＲ反応が終了することになる。

【0133】

二本鎖ＰＣＲ産物が変性され、その後、温度が低下すると、産物の上部鎖は、病原体特異的配列（ｔｉとｔｉ’；ｔｊとｔｊ’）、ＢｉとＢｉ’、及びＢｊとＢｊ’との間に４つのヘアピンを形成する。それにより、Ｂｊ配列のリボース塩基は二本鎖になり、ＲＮａｓｅＨ２により蛍光基Ｆ１標識を産物から遊離できるため、標識と消光分子との距離が長くなり、標識の検出が可能になる（図１８、工程Ｇ）。スプリットプローブ設計の利点の一つは、プライマー二量体の形成に起因する偽産物、すなわち（Ｆ１－ｒ－Ｂｊ，Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ－Ｂｉ’－ｔｉ’－プライマー二量体－ｔｊ’，Ｂｊ’－Ｃｉ’）が、偽陽性シグナルを示さない点である。これは、ｔｉとｔｉ’；ｔｊとｔｊ’のヘアピンが形成されず、ＢｉとＢｉ’のステムのみが残され、その結果、増幅反応で使用されるハイブリダイゼーション温度でｒ－ＢｊとＢｊ’配列がステムを形成しないためである。

【0134】

本発明の別の態様は、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって、試料中または他の試料中の他の核酸分子のヌクレオチド配列とは異なっている標的ヌクレオチド配列が含まれる複数の核酸分子を試料において同定する方法を対象とする。この方法には、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって、他の核酸分子のヌクレオチド配列とは異なっている標的ヌクレオチド配列が含まれる１つ以上の核酸分子を含有する可能性のある試料を提供することを含む。１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが提供され、各一次オリゴヌクレオチドプライマープライマーセットは、（ａ）標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長産物の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。接触させる試料を、１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼとブレンドして、初期反応チャンバー内でポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し、このポリメラーゼ連鎖反応混合物を変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む、１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供することにより、標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む一次伸長産物を形成する。最初のＰＣＲ産物を２４、３６、または４８個の一次ＬＤＲ反応チャンバーに分配する。この方法はさらに、一次伸長産物を、リガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドしてライゲーション反応混合物を形成することを含む。各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｂ）標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、それらの間に接合部を有する一次伸長産物の相補的な標的ヌクレオチド配列に互いに隣接して、塩基特異的にハイブリダイズするように構成される。１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを、共にライゲーションし、ライゲーション反応混合物においてライゲーション産物配列を形成し、試料中のライゲーション産物配列を検出及び識別して、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって、試料中の他の核酸分子のヌクレオチド配列とは異なっている標的ヌクレオチド配列が含まれる１つ以上の核酸分子の存在を同定する。

【0135】

図１９～２３に本発明の本態様の様々な実施形態を示す。

【0136】

図１９（工程Ａ～Ｆ）は、未知の病原体同定のための例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ（商標））を示している。この方法は、工程Ａに示すように、病原体ゲノムＤＮＡを分離することから始まる。病原体がＲＮＡウイルスの場合、最初の逆転写酵素工程を使用してｃＤＮＡを生成する。図１９（工程Ｂ）に示すように、試料を初期ＰＣＲ反応チャンバー内で増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、対象とする標的含有領域を増幅する。遺伝子座特異的プライマー及びデオキシヌクレオチドミックスを使用して、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応を実行する。一実施形態では、生成される異なるアンプリコンの相対比を維持するため、サイクルを制限して（１２～２０サイクル）増幅を実行する。別の実施形態では、２０～４０サイクルを使用して対象とする領域を増幅する。別の実施形態では、プライマー二量体の増幅を防ぐため、各プライマーの５’末端に８～１１塩基の同じテールが含まれる。最初のＰＣＲ産物を２４、３６、または４８個の一次ＬＤＲ反応チャンバーに分配する（工程Ｃ）。

【0137】

図１９の工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブが増幅産物にハイブリダイズし、２つのオリゴヌクレオチドがその相補配列にハイブリダイズされると、リガーゼ（黒丸）によって共に共有結合され閉じられる。上流のオリゴヌクレオチドプローブには５’プライマー特異的部分（Ａｉ）が含まれ、下流のオリゴヌクレオチドプローブには、ライゲーション産物の後続の増幅を可能にする３’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）が含まれる。ライゲーションの後、各一次ＬＤＲ反応チャンバーからのライゲーション産物は、１つ以上のタグ特異的プライマーペア（各ペアは、対応するプライマーＡｉ及びＣｉで構成される）が含まれる３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配され、ＰＣＲ増幅、及び検出される。図１９の工程Ｅ及びＦに示すように、ライゲーション産物の検出は、従来のＴａｑＭａｎ（商標）検出アッセイを使用して実施することができる（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，２７０，９６７号及びＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，６０１，８２１号を参照。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＴａｑＭａｎ（商標）を使用した検出では、ライゲーション産物のプライマー特異的部分のハイブリダイゼーションに適したプライマーと併用して、ライゲーション接合部にまたがるオリゴヌクレオチドプローブが増幅及び検出に使用される。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブには、一方の末端に蛍光レポーター基（Ｆ１）が、もう一方の末端に消光分子（Ｑ）が含まれており、これらは互いに、無傷のプローブ内で、消光分子がレポーター基の蛍光を消光する程度に近接している。増幅時に、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ及び上流プライマーは、ライゲーション産物の相補領域にハイブリダイズする。ポリメラーゼの５’－＞３’ヌクレアーゼ活性により、ハイブリダイズしたプライマーが伸長し、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの蛍光基が遊離され、検出可能なシグナルが生成される（図１９、工程Ｆ）。

【0138】

図２０は、未知の病原体同定のための別の例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ（ＵｎｉＴａｑ）を示している。この方法は、工程Ａに示すように、病原体ゲノムＤＮＡを分離することから始まる。病原体がＲＮＡウイルスの場合、最初の逆転写酵素工程を使用してｃＤＮＡを生成する。図２０（工程Ｂ）に示すように、試料を初期反応チャンバー内で増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、対象とする標的含有領域を増幅する。この実施形態では、ライゲーションプローブは、検出を容易にするためにＵｎｉＴａｑプライマー及びタグ配列を含むように設計されている。別の実施形態では、プライマー二量体の増幅を防ぐため、各プライマーの５’末端に８～１１塩基の同じテールが含まれる。最初のＰＣＲ産物を２４、３６、または４８個の一次ＬＤＲ反応チャンバーに分配する（工程Ｃ）。

【0139】

ＵｎｉＴａｑシステムは、Ｓｐｉｅｒの米国特許出願公開第２０１１／０２１２８４６号に完全に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＵｎｉＴａｑシステムは３つの固有の「タグ」配列の使用を伴い、図２０の工程Ｄに示すように、固有のタグ配列の少なくとも１つ（Ａｉ）は第１のオリゴヌクレオチドプローブに存在し、第２及び第３の固有のタグ部分（Ｂｉ及びＣｉ）は、第２のオリゴヌクレオチドプローブ配列に存在する。プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブをライゲーションすると、得られるライゲーション産物には、Ａｉ配列－標的特異的配列－Ｂｉ’配列－Ｃｉ’配列が含まれることになる。ＵｎｉＴａｑ手法の重要な点は、正のシグナルを得るには、ライゲーションプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブの両方が正しいことが必要とされるため、高度に多重化された核酸の検出が可能なことである。例えば、本明細書に記載されるように、これは、２つの部分、すなわち２つのタグの相互のハイブリダイゼーションを必要とすることにより達成される。

【0140】

ライゲーションの後、各一次ＬＤＲ反応チャンバーからのライゲーション産物は、適切なＵｎｉＴａｑプライマーペアが含まれる３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配される（図２０、工程Ｅ）。検出の際、Ａｉ（第１のプライマー特異的部分）、Ｂｉ’（ＵｎｉＴａｑ検出部分）、及びＣｉ’（第２のプライマー特異的部分）が含まれるライゲーション産物は、Ａｉと同じヌクレオチド配列を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及びＣｉ’に相補的な第２のオリゴヌクレオチドプライマー（すなわちＣｉ）を使用して、両鎖にプライミングされる。第１のオリゴヌクレオチドプライマーはまた、一端に検出可能な標識Ｆ１を有し、他端に消光分子（Ｑ）を有するＵｎｉＴａｑ検出プローブ（Ｂｉ）も含む（Ｆ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ）。場合により、ポリメラーゼブロッキングユニット、例えばＨＥＧ、ＴＨＦ、Ｓｐ－１８、ＺＥＮ、またはポリメラーゼ伸長を停止するのに十分である、当技術分野で公知の他の任意のブロッカーが、消光分子の近位に配置される。ＰＣＲ増幅により、図２０の工程Ｆに示す二本鎖産物が形成される。この例では、ポリメラーゼブロッキングユニットは、第１のユニバーサルプライマーの５’部分（Ｂｉ）をポリメラーゼがコピーするのを妨げることで、一本鎖になるときに産物のボトム鎖がヘアピンを形成できないようにする。そのようなヘアピンが形成されると、ステムの３’末端にアンプリコンとのアニーリングを生じるため、この３’末端のポリメラーゼ伸長によりＰＣＲ反応が終了することになる。

【0141】

二本鎖ＰＣＲ産物が変性され、その後、温度が低下すると、産物の上部鎖は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの５’部分（Ｂｉ）と鎖の反対端の部分Ｂｉ’との間にステムを有するヘアピンを形成する（図２０、工程Ｇ）。また、この工程中に、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、ヘアピンを形成する産物の５’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）とアニーリングする。工程Ｇにおいて第２のユニバーサルプライマーが伸長すると、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、検出可能な標識Ｄ１または消光分子がアンプリコンの５’末端から切断され、それにより標識と消光分子間の距離が長くなり、標識の検出が可能になる。

【0142】

図２１は、未知の病原体同定のための別の例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ（ＵｎｉＳｐＴｑ）を示している。この方法は、工程Ａに示すように、病原体ゲノムＤＮＡを分離することから始まる。病原体がＲＮＡウイルスの場合、最初の逆転写酵素工程を使用してｃＤＮＡを生成する。図２０（工程Ｂ）に示すように、試料を初期反応チャンバー内で増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、対象とする標的含有領域を増幅する。この実施形態では、ライゲーションプローブは、検出を容易にするためにスプリットプローブ及びタグ配列を含むように設計されている。別の実施形態では、プライマー二量体の増幅を防ぐため、各プライマーの５’末端に８～１１塩基の同じテールが含まれる。最初のＰＣＲ産物を２４、３６、または４８個の一次ＬＤＲ反応チャンバーに分配する（工程Ｃ）。

【0143】

スプリットプローブシステムは、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許第９，５９８，７２８号に完全に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。スプリットプローブシステムは４つの固有の「タグ」配列の使用を伴い、図２１の工程Ｄに示すように、固有のタグ配列（Ａｉ）ならびにスプリット部分の第２及び第３の固有のタグ部分（Ｂｉ’，ｚｉ）は、第１のオリゴヌクレオチドプローブに存在し、他のスプリット部分の第２及び第３の固有のタグ部分（ｚｊ’，Ｂｊ’）、ならびに第４の固有のタグ配列（Ｃｉ’）は第２のオリゴヌクレオチドプローブ配列に存在する。プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブをライゲーションすると、得られるライゲーション産物には、Ａｉ配列－Ｂｉ’及びｚｉ配列－標的特異的配列－ｚｉ’，Ｂｊ’配列－Ｃｉ’配列が含まれることになる。スプリットプローブ手法の重要な点は、正のシグナルを得るには、ライゲーションプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブの両方が正しいことが必要とされるため、高度に多重化された核酸の検出が可能なことである。例えば、本明細書に記載されるように、これは、２つの部分、すなわち２つのタグの相互のハイブリダイゼーションを必要とすることにより達成される。

【0144】

ライゲーションの後、各一次ＬＤＲ反応チャンバーからのライゲーション産物は、適切なＵｎｉＴａｑプライマーペアが含まれる３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配される（図２１、工程Ｅ）。検出の際、Ａｉ（第１のプライマー特異的部分）、Ｂｉ’（第１のスプリットプローブ検出部分）、Ｂｊ’（第２のスプリットプローブ検出部分）、及びＣｉ’（第２のプライマー特異的部分）が含まれるライゲーション産物は、Ａｉと同じヌクレオチド配列を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及びＣｉ’に相補的な第２のオリゴヌクレオチドプライマー（すなわちＣｉ）を使用して、両鎖にプライミングされる。第１のオリゴヌクレオチドプライマーはまた、一端に検出可能な標識Ｆ１を有し、他端に消光分子（Ｑ）を有するＵｎｉＴａｑ検出プローブ（Ｂｊ，Ｂｉ）も含む（Ｆ１－Ｂｊ，Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ）。場合により、ポリメラーゼブロッキングユニット、例えばＨＥＧ、ＴＨＦ、Ｓｐ－１８、ＺＥＮ、またはポリメラーゼ伸長を停止するのに十分である、当技術分野で公知の他の任意のブロッカーが、消光分子の近位に配置される。ＰＣＲ増幅により、図２１の工程Ｆに示す二本鎖産物が形成される。この例では、ポリメラーゼブロッキングユニットは、第１のユニバーサルプライマーの５’部分（Ｂｊ，Ｂｉ）をポリメラーゼがコピーするのを妨げることで、一本鎖になるときに産物のボトム鎖がヘアピンを形成できないようにする。そのようなヘアピンが形成されると、ステムの３’末端にアンプリコンとのアニーリングを生じるため、この３’末端のポリメラーゼ伸長によりＰＣＲ反応が終了することになる。

【0145】

二本鎖ＰＣＲ産物が変性され、その後、温度が低下すると、産物の上部鎖は、ＢｉとＢｉ’、ｚｉとｚｉ’、及びＢｊとＢｊ’との間に３つのヘアピンを形成する（図２１、工程Ｇ）。また、この工程中に、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、ヘアピンを形成する産物の５’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）とアニーリングする。工程Ｇにおいて第２のユニバーサルプライマーが伸長すると、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、検出可能な標識Ｄ１または消光分子がアンプリコンの５’末端から切断され、それにより標識と消光分子間の距離が長くなり、標識の検出が可能になる。ポリメラーゼがＢｊ’を通過するとすぐに短いｚｉ－ｚｉ’ステムは破断し、さらにポリメラーゼは伸長を続け、ｄｓＤＮＡ産物を生成する。

【0146】

ＵｎｉＴａｑプローブ手法及びスプリットプローブ手法はいずれも、標準のプライマー／プローブセットを適切なマイクロポアまたはマイクロウェルにプリントできるという利点をもたらす。Ｃｉプライマーは、ライゲーションして産物を形成したか、ライゲーションされないままかを問わず、下流のＬＤＲプローブのコピーを作成することになる。その伸長産物が、標的不在下でＵｎｉＴａｑプローブ設計を使用して上流のプローブ／プライマーとプライマー二量体を形成する場合、そのような産物（Ｆ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ－部分標的－Ｂｉ’－Ｃｉ’）は、ハイブリダイゼーション温度でＢｉとＢｉ’のヘアピンを形成し、その結果、偽陽性シグナルが生じることになる。スプリットプローブ設計の利点の一つは、そのような偽産物（Ｆ１－Ｂｊ，Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ－部分標的－ｚｉ’，Ｂｊ’－Ｃｉ’）が偽陽性シグナルを示さない点である。これは、ＢｉとＢｉ’；ｚｉとｚｉ’のヘアピンが形成されず、ＢｊとＢｊ’の配列のみが残され、その結果、増幅反応で使用されるハイブリダイゼーション温度でステムを形成しないためである。

【0147】

また、以下の図２２及び図２３に例示されるように、ライゲーション産物を使用して、ＰＣＲ－ｑＬＤＲと呼ばれるプロセスでシグナルを直接生成することもできる。そのような手法の一つが、文献全体が参照により本明細書に組み込まれるＢａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．のＷＯ／２０１６／０５７８３２に記載されており、これはライゲーション後にＦＲＥＴまたは蛍光シグナルを生じるライゲーション検出プローブを使用する。

【0148】

一実施形態では、第１のライゲーションプローブには、３’標的特異的領域、及びドナーまたはアクセプター部分を有する５’テール配列が含まれ、プローブセットの第２のライゲーションプローブには、アクセプターまたはドナー部分をそれぞれが有する５’標的特異的領域及び３’テール配列が含まれる。プローブセットのライゲーションプローブの５’及び３’テール配列は、互いに相補的であり、アクセプター基とドナー基は、互いに近接した状態になると、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を介して検出可能なシグナルが生じる。ライゲーション後、ライゲーションされていないオリゴヌクレオチドプローブは洗い流され、固定された増幅産物からライゲーション産物が変性される。変性すると、ライゲーション産物の相補的な５’及び３’テール配列が互いにハイブリダイズし、ドナー基とアクセプター基が互いに近接した状態になり、検出可能なＦＲＥＴシグナルが生じる。

【0149】

別の実施形態では、上流プローブには、５’末端の蛍光レポーター基に続いて、テール配列部分、消光基（例えばＺＥＮ）、及び標的特異的部分が含まれる場合がある。一本鎖形態では、蛍光基はＺｅｎ基によって消光される。上流及び下流のライゲーションプローブをライゲーションし、得られるライゲーション産物を変性すると、ライゲーション産物の相補的な５’及び３’テール部分はハイブリダイズして短い二本鎖部分を形成する。このような条件下では、レポーター基が消光基によって消光されることがなく、検出可能なシグナルが生じる。これをハイブリダイゼーション脱消光プローブ（ＨｕＱＰ）と呼ぶ。

【0150】

ＰＣＲを必要としないｑＬＤＲの手法は、「ＳＮＰ検出用多重リガーゼ反応及びプローブ切断（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｌｉｇａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｅ Ｃｌｅａｖａｇｅｓ ｆｏｒ ＳＮＰ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる（Ｋｉｍ，“ＰＣＲ Ｆｒｅｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｌｉｇａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｅ Ｃｌｅａｖａｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＳＮＰ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＫＲＡＳ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｔｔｏｍｏｌｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，” Ａｎａｌｙｓｔ １４１（１６）：６３８１－６３８６（２０１６）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この手法では、接合部で標的との完全な相補性が存在する場合に、２つのプライマーがハイブリタイズして標的にライゲーションされる。２つのプライマーには、ライゲーションされない３’及び５’末端に非相補配列も含まれる。ライゲーション後、ライゲーション産物（ＬＰ）は、鎖置換ヘアピン（ＳＤＨ）と複合体を形成するが、これは標的よりもＳＤＨの方がＬＰの融解温度（Ｔｍ）が高いためである。さらに、遊離した標的を、２つのプライマーとの新たなライゲーションに再利用することができる。リガーゼ反応にＳＤＨを追加することで、等温条件時に、単一標的それぞれに対して、複数の酵素による２つのプライマーのライゲーションが可能になる。検出可能なシグナルを生成するため、ＳＮＰ特異的ライゲーションの後に、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を用いて改変サイクリングプローブアッセイを行う。サイクリングプローブアッセイでは、各端に蛍光ドナーとクエンチャーを含む標的結合キメラプローブをＲＮａｓｅ Ｈにより消化する。ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡホスホジエステル結合がＲＮＡ－ＤＮＡヘテロ二重鎖に存在する場合にのみ、その結合を切断する。ヘテロ二重鎖のＤＮＡは消化されず、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡも消化されない。サイクリングプローブアッセイは、ＲＮａｓｅ Ｈのこのような特性を利用するように設計されている。ＲＮＡが分解されて標的ＤＮＡ鎖が解放されると、別の無傷のＲＮＡ分子がＤＮＡとハイブリダイズでき、線形のシグナル増幅が生じる。

【0151】

図２２は、未知の病原体同定のための別の例示的なＰＣＲ－ｑＬＤＲ（ＵｎｉＬＤｑ）を示している。この方法は、工程Ａに示すように、病原体ゲノムＤＮＡを分離することから始まる。病原体がＲＮＡウイルスの場合、最初の逆転写酵素工程を使用してｃＤＮＡを生成する。図２２（工程Ｂ）に示すように、試料を初期反応チャンバー内で増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、対象とする標的含有領域を増幅する。この実施形態では、ライゲーションプローブは、検出を容易にするためにタグ配列を含むように設計されている。別の実施形態では、プライマー二量体の増幅を防ぐため、各プライマーの５’末端に８～１１塩基の同じテールが含まれる。最初のＰＣＲ産物を３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配する（工程Ｃ）。

【0152】

病原体特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドは、後続の検出用のタグ（Ｂｉ’－ｔｉ’－上流標的配列；下流標的配列－ｔｊ’－Ｂｊ’）を有する。ｔｉ’及びｔｊ’配列は、ライゲーション接合部の標的の配列ｔｉ、ｔｊに相補的である。特異的ＳＮＰまたは変異を検出する場合に、ＬＮＡまたはＰＮＡ野生型プローブをブロックすると、野生型配列へのライゲーションが抑制される。この図の工程Ｄに示すように、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を上流ライゲーションプローブに含めることにより、別の特異性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、ライゲーションに優れる３’ＯＨ基が生じる（図２２、工程Ｄ）。標的特異的オリゴヌクレオチドプローブが増幅産物にハイブリダイズし、任意のＲＮａｓｅＨ工程で３’ＯＨ基が解放されると、２つのオリゴヌクレオチドがその相補配列にハイブリダイズされたときに、リガーゼ（黒丸）によって共に共有結合され閉じられる（図２２、工程Ｅ）。

【0153】

プローブ（Ｆ１－ｒ－Ｂｊ，Ｂｉ－Ｑ）の存在下で、変性工程の後、温度が低下すると、プローブと病原体特異的配列（ｔｉとｔｉ’；ｔｊとｔｊ’）、ＢｉとＢｉ’、及びＢｊとＢｊ’との間に４つの二本鎖ステムが形成される。それにより、Ｂｊ配列のリボース塩基は二本鎖になり、ＲＮａｓｅＨ２により蛍光基が遊離し、シグナルを生成することができる（図２２、工程Ｆ）。切断されたプローブは産物から解離し、新たなプローブがハイブリダイズして、さらなるシグナルを生成することができる。ライゲーションされていないＬＤＲプライマーは必ずしもヘアピンを形成しないため、ＲＮａｓｅＨ２はシグナルを発生しないことになる。この手法の一実施形態では、ＰＣＲ反応後、産物は、標的特異的ＬＤＲプライマーに加え、ユニバーサルプローブ（複数可）がすでに含まれたマイクロウェルまたはマイクロポアに分配される。

【0154】

図２３は、未知の病原体同定のための別の例示的なＰＣＲ－ｑＬＤＲ（ＴｓＬＤＧ）を示している。この方法は、工程Ａに示すように、病原体ゲノムＤＮＡを分離することから始まる。病原体がＲＮＡウイルスの場合、最初の逆転写酵素工程を使用してｃＤＮＡを生成する。図２３（工程Ｂ）に示すように、試料を初期反応チャンバー内で増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、対象とする標的含有領域を増幅する。この実施形態では、ライゲーションプローブは、検出を容易にするためにタグ配列を含むように設計されている。別の実施形態では、プライマー二量体の増幅を防ぐため、各プライマーの５’末端に８～１１塩基の同じテールが含まれる。最初のＰＣＲ産物を３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配する（工程Ｃ）。

【0155】

病原体特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドは、後続の検出用のタグ（Ｂｉ’－上流標的配列；下流標的配列－ｔｊ’）を有する。ｔｊ’配列は、ライゲーション接合部の標的のｔｊ配列に相補的である。特異的ＳＮＰまたは変異を検出する場合に、ＬＮＡまたはＰＮＡ野生型プローブをブロックすると、野生型配列へのライゲーションが抑制される。この図の工程Ｄに示すように、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を上流ライゲーションプローブに含めることにより、別の特異性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、ライゲーションに優れる３’ＯＨ基が生じる（図２３、工程Ｄ）。標的特異的オリゴヌクレオチドプローブが増幅産物にハイブリダイズし、任意のＲＮａｓｅＨ工程で３’ＯＨ基が解放されると、２つのオリゴヌクレオチドが相補配列にハイブリダイズされたときに、リガーゼ（黒丸）によって共に共有結合され閉じられる（図２３、工程Ｅ）。

【0156】

プローブ（Ｆ１－ｒ－病原体配列－Ｂｉ－Ｑ）の存在下で、変性工程の後、温度が低下すると、病原体特異的配列間（ｔｉ，ｔｊとｔｉ’，ｔｊ’）、及びＢｉとＢｉ’の間に２つの二本鎖ステムが形成される。それにより、病原体配列のリボース塩基は二本鎖になり、ＲＮａｓｅＨ２により蛍光基が遊離し、シグナルを生成することができる。切断されたプローブは産物から解離し、新たなプローブがハイブリダイズして、さらなるシグナルを生成することができる。ライゲーションされていないＬＤＲプライマーはどちらもステムを形成しないため、ＲＮａｓｅＨ２はシグナルを発生しないことになる。この手法の一実施形態では、ＰＣＲ反応後、産物は、標的特異的ＬＤＲプライマーに加え、病原体配列特異的プローブ（複数可）がすでに含まれたマイクロウェルまたはマイクロポアに分配される。

【0157】

切断可能プローブ（ｃＰ）によるｑＬＤＲは、ＦＲＥＴプローブまたはハイブリダイゼーション脱消光（ＨｕＱＰ）プローブのいずれかによるＬＤＲを使用する場合よりも、生成されるシグナルの程度が大きくなる。後者は、サイクルの関数である線形シグナルを生成する。すなわち、ＬＤＲを「Ｘ」サイクルを実行する場合、生成される蛍光シグナルの量「Ｆ」はＸに比例する（すなわちＦ＝ｆ（Ｘ））。図２２及び２３と同様の切断可能プローブを使用する場合、生成されるシグナルの量は、１回のＬＤＲサイクル中にプローブが切断される回数「Ｃ」とサイクル数Ｘ両方の関数である（すなわちＦ＝ｆ（Ｘ）（Ｘ－１）Ｃ）。実際のレベルでは、ＬＤＲ－ＦＲＥＴまたはＬＤＲ－ＨｕＱＰを５０サイクル実行すると、シグナル変化のダイナミックレンジは５０倍になるが、ＬＤＲ－ｃＰを５０サイクル実行すると、シグナル変化のダイナミックレンジは１，２２５倍になる。

【0158】

図２４は、マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である概略正面図である。この設計は、未知の病原体の同定及び定量のための、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－ＵｎｉＴａｑ検出（あるいは、標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いた、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－リアルタイムＰＣＲ）の実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。図２４では、注入試料は大きな六角形チャンバー１６（トラフ１８を含む；下部、初期反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバー１６は、導管２０によって六角形チャンバー２２（大トラフ２４及びバッフル２３を含む、一次ＰＣＲ反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバー２２は、導管２６によって細長い混合チャンバー２８に流体接続され、混合チャンバーは、導管３０によって、マイクロウェルまたはマイクロポアの細区画３２が含まれるチャンバー（パネルの上部に４行のみを図示）に流体接続されている。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。カートリッジの製造時に、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマー）を細区画の行に予備充填する。カートリッジの製造時に、マイクロウェルまたはマイクロポアの列へと至る一次ＰＣＲ反応チャンバーに、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグ配列のいずれかを５’末端にもつネステッドＰＣＲプライマーセットが予備充填されている。図の右側にある灰色の円２５は、例えば音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティングによってプローブセットが送達またはプリントされる可能性のある位置を示している。この例図では、７６８個に相当する２４列３２行に計画された細区画を４つずつ示し、各細区画には２４個のマイクロウェルまたはマイクロポアが含まれる。この例では、最初のマルチプレックスＰＣＲ増幅（またはＲＮＡ標的の逆転写ＰＣＲ）を９サイクル行い、元の各標的の最大５１２コピーを初期反応チャンバーで産生する。必要に応じて、新しいＰＣＲ試薬を追加し、最初のマルチプレックス反応物を一次ＰＣＲ反応チャンバー（上記のネステッドＰＣＲプライマーを予備充填）に分配する。この場合、各一次ＰＣＲ反応チャンバー内の元の各病原体の平均分配数は２０コピーである。場合により、ＲＮＡ塩基及び３’ブロッキング基を含むプライマーは、正しい標的に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によりブロックが解除されるため、追加の特異性が提供され、偽産物が回避される。ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグをもつ標的特異的プライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、５サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり平均６４０コピーの各病原体特異的標的が産生される。必要に応じて、新しいＰＣＲ試薬を追加し、各一次ＰＣＲ反応チャンバーのネステッドＰＣＲ産物と混合し、混合チャンバーへ、さらに各列のマイクロポアへと分配する。各行の各細区画のユニバーサルまたはＵｎｉＴａｑプライマーは、正しいタグをもつ各列からの産物のみを増幅する。マイクロポアのポアソン分布では、最初に低存在量で存在する病原体特異的標的を計数するが、各細区画のマイクロポアにわたるＣｔ値は、最初に高存在量で存在する病原体特異的標的の概算のコピー情報を提供することになる。

【0159】

図２４のカートリッジ設計はまた、未知の病原体の同定及び定量のための、マルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－ＵｎｉＴａｑ検出（あるいは、標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いた、マルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲ）を実施する際にも使用することができる。カートリッジの製造時に、マイクロウェルまたはマイクロポアの列へと至る一次ＬＤＲ反応チャンバーに、ライゲーションされない５’（上流）末端及び３’（下流）末端にＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグ配列のいずれかをもつＬＤＲ’プローブセットが予備充填されている。図の右側にある灰色の円２５は、例えば音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティングによってプローブセットが送達またはプリントされる可能性のある位置を示している。プローブを乾燥させて、カートリッジのカバー部分を取り付け、プローブセットを適切な位置に密閉する。カートリッジの使用時には、カートリッジの初期反応チャンバーから一次ＬＤＲ反応チャンバー、混合チャンバーを経て、最終的に各列が隣接する列から隔てられたマイクロウェルまたはマイクロポアの列まで反応物が流体移動する。この例図では、７６８個に相当する計画された２４列４つ、３２行８つの細区画を示し、各細区画には２４個のマイクロウェルまたはマイクロポアが含まれる。この例では、最初のマルチプレックスＰＣＲ増幅（またはＲＮＡ標的の逆転写ＰＣＲ）を３０サイクル行い、元の標的を初期反応チャンバーで増幅する。ポリメラーゼを不活性化し（例えば加熱死滅化またはプロテアーゼ消化などによる）、マルチプレックス産物をリガーゼ、ＡＴＰ、またはＮＡＤを含むリガーゼ反応混合物に１０倍希釈し、一次ＬＤＲ反応チャンバー（上記のＬＤＲプローブを予備充填）に分配する。場合により、ＲＮＡ塩基及び３’ブロッキング基を含む、ＰＣＲプライマー及び／またはＬＤＲ上流プローブは、正しい標的に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によりブロックが解除されるため、追加の特異性が提供され、偽産物が回避される。ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグをもつアレル特異的プローブを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、２０サイクルのＬＤＲを実行する。新しいＰＣＲ試薬を追加し、各一次ＬＤＲ反応チャンバーのＬＤＲ産物と混合し、混合チャンバーへ、さらに各列のマイクロポアへと分配する。各行の各細区画のユニバーサルまたはＵｎｉＴａｑプライマーは、正しいタグをもつ各列からの産物のみを増幅する。各細区画の２４個のマイクロポアにわたるＣｔ値は、最初に高存在量で存在する病原体特異的標的の概算のコピー情報を提供することになる。

【0160】

各細区画に９６個のマイクロウェルを含む、２，３０４個に相当する４８列４８行の細区画を使用する代替的実施形態では、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマー）を、各行の適切な細区画に、音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティングによって直接送達した後、個々のマイクロウェル内で乾燥させる。最初のマルチプレックスＰＣＲ増幅（またはＲＮＡ標的の逆転写ＰＣＲ）を１０サイクル行い、元の各標的の最大１，０２４コピーを初期反応チャンバーまたはウェルで産生する。必要に応じて、「タンデム」ＰＣＲプライマーを使用する。新しいＰＣＲ試薬を追加し、最初のマルチプレックス反応物を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバー（音響液滴射出を使用してネステッドＰＣＲプライマーを追加）に分配する。この場合、ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーあたりの元の各病原体の平均分配数は２０コピーである。場合により、ＲＮＡ塩基及び３’ブロッキング基を含むプライマーは、正しい標的に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によりブロックが解除されるため、追加の特異性が提供され、偽産物が回避される。ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグをもつ標的特異的プライマーを２４個組または４８個組のプライマーセットにして使用し、３～４サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり平均１６０～３２０コピーの各病原体特異的標的が産生される。新しいＰＣＲ試薬を追加し、各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーのネステッドＰＣＲ産物と混合し、各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を、９６個のマイクロウェルを備える、それぞれ２４個２セットまたは１２個４セットの細区画に分配する。２セットを使用する場合、第２のセットは第１のセットの１００／１希釈である。４セットを使用する場合、各セットは前のセットの２０／１希釈である。これにより、大きな規模にわたって存在する病原体の網羅が可能になる。平均して、最初の各細区画に元の各病原体が１２コピー得られ、所与の１マイクロウェルに元の病原体が１または０コピー得られることになる。存在する病原体の数が多くなると、各細区画に追加のコピーが得られることになる。各行の各細区画のユニバーサルまたはＵｎｉＴａｑプライマーは、正しいタグをもつ各列からの産物のみを増幅する。９６個のマイクロウェルのポアソン分布では、最初に低存在量で存在する病原体特異的標的を計数するが、細区画のマイクロウェルにわたるＣｔ値は、最初に高存在量で存在する病原体特異的標的の概算のコピー情報を提供することになる。

【0161】

図２５Ａ～図２５Ｂは、ＵｎｉＴａｑまたは標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－リアルタイムＰＣＲを使用して、未知の病原体を同定及び定量する；ＵｎｉＴａｑまたは変異特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲを使用して、血漿中の低レベルの未知の変異を同定及び定量する；ならびにＵｎｉＴａｑまたは標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲを使用して、血漿中の低レベルのメチル化及び未知の変異を同定及び定量するためのカートリッジ４、バルブ、及び試薬構成の概略側面図を示す。図２５Ａは、直径５０ミクロンのマイクロウェルまたはマイクロポアのアレイへのマイクロ流路の流体接続を示す概略正面図である。簡潔にするため、図には、１つの初期マルチプレックス反応チャンバー１０、トラフ１８を備える１６個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１６、トラフ２４及びバッフル２３を備える１６個の二次マルチプレックス反応チャンバー２２、１６個の細い混合チャンバー２８、ならびに１６列で数千個のマイクロポアまたはマイクロウェルからなる細区画３２を含む１つの主要チャンバーを例示している。示されるように、これらは導管１４、２０、２６、及び３０によって、共に結合されている。流体は、注入口２からカートリッジ４に入り、出口８から出る。ただし、チャンバーの他の構成も使用することができ、例えば、図２４に記載される病原体検出用のマルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－リアルタイムＰＣＲには、二次マルチプレックス反応チャンバーは必要としない。図２５Ｂは、数千のマイクロポア２０２で構成されるマイクロポアプレートシステム（一般的には図１１～図１２に記載のもの）を使用した、ＵｎｉＴａｑまたは標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－リアルタイムＰＣＲの流体システムを示す。マイクロポアプレートは孔の両側から流体連通可能である。第１の側面（プレートの上部、プレートの左側に図示）は、バルブ１、２、及び３と連通しており、対して第２の側面（プレートの下部、プレートの右側に図示）は、バルブ４及び５と連通している。バルブ１は、必要に応じて、初期マルチプレックス反応チャンバー、一次ＰＣＲ反応チャンバー、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、溶解／プロテアーゼ緩衝液、酵素、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、緩衝液、ＥｔＯＨ、軽油、及び重油を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。さらに、バルブ１は、バルブ３から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第１の側、他のチャンバー、ＰＣＲ反応チャンバー、及び初期マルチプレックス反応チャンバーを空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。バルブ１は、バルブ２を選択することもできる。バルブ２は、初期マルチプレックス反応チャンバー、ＰＣＲ反応チャンバー、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、初期マルチプレックスＰＣＲプライマー、マスターＰＣＲミックス、初期逆転写プライマー、マスター逆転写ミックス、洗浄液、ＥｔＯＨ、及び空気を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。バルブ４は、マイクロポアプレートの第２の側にわたり空気、軽油、重油、及び廃棄物を分注し、バルブ５を経由して廃棄する。さらに、バルブ１は、バルブ５から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第２の側を空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。

【0162】

（表３）マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－リアルタイムＰＣＲ用の試薬構成

【0163】

図２５Ｂは、初期マルチプレックス反応チャンバー１０、２４～４８個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１６、２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー２２、及び２４～４８列を含む主要チャンバー２８、及び数千のマイクロポアまたはマイクロウェル２０２の細区画３２に個別に加熱／冷却を施せるように設計されるいくつかの発熱体１～４を示す。背面プレート２０６（前面プレート２０４の反対側）、またはマイクロポアもしくはマイクロウェルの流路（複数可）２４０及び２４２の１つ以上の平面（複数可）２４４及び２４６、ならびに反応チャンバーを、これらの発熱体に押し付けることで、温度制御、加熱、及び／または熱サイクルが可能になる。図２５に示すように、２４～４８個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１６及び２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー２２の裏側にある２つの発熱体は、すべての一次チャンバーをすべての二次チャンバーとは独立して制御する２つの長方形（水平）ストリップとして設計される。例えば、初期反応チャンバー１０、一次チャンバー１６、二次チャンバー２２、混合チャンバー２８、及び数千のマイクロウェルまたはマイクロポアの細区画を含む主要チャンバーのいずれかに、一次チャンバーごとに独立した発熱体がある代替構成、追加の行または発熱体を有する追加のチャンバー行（すなわち一次、二次、三次など）がある代替構成、及び／または行もしくは列とは異なる幾何形態で配置された２４～４８個の空間多重化を有する代替構成も使用することができる。例えば、それぞれが個別の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１６、個別の二次マルチプレックス反応チャンバー２２、個別の混合チャンバー２８、及び数百～数千のマイクロポアまたはマイクロウェルの細区画を含む個別のチャンバーと流体接続されている、２４個の個々の入力ウェルがプレートに含まれていてもよい。試料は、任意の初期マルチプレックス反応を受けた後、音響液滴射出または他の流体工学手段によって２４個の個別の入力ウェルに注入されてもよい。

【0164】

図２６（工程Ａ～Ｆ）は、未知の細菌病原体を血液から直接同定するための例示的なＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＰＣＲを示す。この方法は、工程Ａに示すように、病原体ゲノムＤＮＡを分離することから始まる。血液から直接細菌を予め捕捉する、すなわちアプタマーまたは抗体を使用することにより、検出が容易になる。課題となるのは、大量の過剰なＷＢＣ ＤＮＡから希少な細菌ＤＮＡのみを増幅することである。図２６（工程Ｂ）に示すように、試料を２４個、３６個、または４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配し、それぞれを増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、対象とする標的含有領域を増幅する。標的特異的プライマー及びデオキシヌクレオチドミックスを使用して、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応を実行する。場合により、鎖置換ポリメラーゼを、標的ごとにタンデムまたは多数のプライマーと共に使用する。一実施形態では、サイクルを制限して（１２～２０サイクル）増幅を実行する。別の実施形態では、プライマー二量体の増幅を防ぐため、各プライマーの５’末端に８～１１塩基の同じテールが含まれる。

【0165】

図２６の工程Ｃに示すように、二次ＰＣＲ反応チャンバー内で、標的特異的オリゴヌクレオチド二次プライマーを一次増幅産物とハイブリダイズし、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）を使用して対象とする標的含有領域を増幅する。この図の工程Ｃに示すように、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を二次プライマーに含めることにより、別の特異性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、ポリメラーゼ伸長性に優れる３’ＯＨ基が生じる（図２６、工程Ｃ）。ネステッドプライマー増幅に続いて、各二次ＰＣＲ反応チャンバーの産物が、３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配される。図１６（図２６、工程Ｄ～Ｆを参照）で上述したように、対応するプライマーＡｉとＣｉのペア、及びライゲーション接合部にわたるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して、または当技術分野で公知の他の好適な手段を使用してＰＣＲ産物を検出することができる。

【0166】

図２７（工程Ａ～Ｆ）は、未知の細菌病原体を血液から直接同定するための別の例示的なＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＰＣＲを示す。この方法は、ＵｎｉＴａｑ読み取りを使用する以外は、図２６に示すものと同様に、標的核酸の一次ＰＣＲ反応チャンバーへの初期分配、及びマルチプレックスＰＣＲ増幅から始まる。

【0167】

図２７の工程Ｃに示すように、二次ＰＣＲ反応チャンバー内で、標的特異的オリゴヌクレオチド二次プライマーを一次増幅産物とハイブリダイズし、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）を使用して対象とする標的含有領域を増幅する。この図の工程Ｃに示すように、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を二次プライマーに含めることにより、別の特異性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、ポリメラーゼ伸長性に優れる３’ＯＨ基が生じる（図２７、工程Ｃ）。ネステッドプライマー増幅に続いて、各二次ＰＣＲ反応チャンバーの産物が、３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配される。ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（すなわちＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ、Ｃｉ）を使用してＰＣＲ産物を増幅し、図１７（図２７、工程Ｄ～Ｇを参照）で上述したように、または当技術分野で公知の他の好適な手段を使用して検出する。

【0168】

図２４のカートリッジ設計はまた、血液から直接、未知の細菌病原体のマルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－ＵｎｉＴａｑ検出を実施する際にも使用することができる。（あるいは、標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いた、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－リアルタイムＰＣＲ）。カートリッジの製造時に、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマー）を行に予備充填する。カートリッジの使用時には、カートリッジの初期反応チャンバーから一次ＰＣＲ反応チャンバー、混合チャンバーを経て、最終的に各列が隣接する列から隔てられたマイクロウェルまたはマイクロポアの列まで反応物が流体移動する。この例図では、７６８個に相当する２４列及び３２行の細区画を示し、各細区画には２４個のマイクロウェルまたはマイクロポアが含まれる。２４列に試料を分配し、最初のマルチプレックスＰＣＲ増幅を、鎖置換ポリメラーゼと、１０～１２ｂｐのテールをもつ大きなタンデムプライマーのセットまたは複数のプライマーセットを用いて２０サイクル行い、元の各標的（存在する場合）あたり１，０００，０００コピーを産生する。ＲＮＡ塩基及び３’ブロッキング基を含むネステッドプライマーは、正しい標的に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によりブロックが解除されるため、追加の特異性が提供され、偽産物が回避される。ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグをもつ標的特異的プライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、各一次ＰＣＲ反応チャンバーで１０サイクルのネステッドＰＣＲを実行する。必要に応じて、新しいＰＣＲ試薬を追加し、各一次ＰＣＲ反応チャンバーのネステッドＰＣＲ産物と混合し、混合チャンバーから、さらに各列のマイクロウェルまたはマイクロポアへと分配する。各行の各細区画のユニバーサルまたはＵｎｉＴａｑプライマーは、正しいタグをもつ各列からの産物のみを増幅する。標的の前増幅と、プライマーの二量体形成を防ぐテールの使用により、１細胞レベルでの細菌病原体の同定が可能になる。

【0169】

各細区画に９６個のマイクロウェルを含む、２，３０４個に相当する４８列及び４８行の細区画を使用する代替的実施形態では、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマー）を、各行の適切な細区画に、音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティングによって直接送達した後、個々のマイクロウェル内で乾燥させる。初期試料を４８個のウェルに分配する。ウェルまたは初期反応チャンバーで９サイクルのマルチプレックスＰＣＲを実行すると、元の各病原体（存在する場合）が最大５１２コピー得られる。「タンデム」以上のＰＣＲプライマーセットを使用する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべてのＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１２塩基の同じ５’テール配列が含まれる。平均して、最初の各細区画に元の各病原体が１０コピー得られ、所与の１マイクロウェルに元の病原体が１または０コピー得られることになる。存在する病原体の数が多くなると、各細区画に追加のコピーが得られることになる。各行の各細区画のユニバーサルまたはＵｎｉＴａｑプライマーは、正しいタグをもつ各列からの産物のみを増幅する。９６個のマイクロウェルのポアソン分布では、最初に低存在量で存在する病原体特異的標的を計数するが、マイクロウェルにわたるＣｔ値は、最初に高存在量で存在する病原体特異的標的の概算のコピー情報を提供することになる。

【0170】

図２８は、低レベル変異を検出するための別の例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ反応（任意でキャリーオーバー防止を含む）を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡは単離され（図２８、工程Ａ）、２４、３６、４８、または６４個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配された後、ＰＣＲが行われる。単離されたＤＮＡ試料は、試料に存在する可能性のあるｄＵ含有核酸分子を消化するため、場合によりＵＤＧで処理される（図２８、工程Ｂ）。遺伝子座特異的上流プライマー、遺伝子座特異的下流プライマー、野生型配列を含むブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブ、及びｄＵＴＰを場合により含むデオキシヌクレオチドミックスを使用して、対象とする領域を選択的に増幅する。本実施形態では、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、別の選択性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、変異の数塩基上流にあり、ポリメラーゼ伸長に適した３’ＯＨ基が解放される（図２８、工程Ｂ）。上流のＰＣＲプライマーと部分的に重複する野生型配列を含むブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、野生型配列への結合に対しては、上流のプライマーよりも競合優先性をもつが、変異ＤＮＡに対してほど強くないため、ＰＣＲの各ラウンド中の野生型ＤＮＡの増幅が抑制される。図２８の工程Ｃに示すように、増幅産物には場合によりｄＵが含まれるが、ＵＤＧまたは類似の酵素で後処理すると、キャリーオーバーを防止することができる。各一次ＰＣＲ反応チャンバーからの産物は、対応する二次ＬＤＲ反応チャンバーに分配される。

【0171】

図２８の工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブが増幅産物にハイブリダイズし、２つのオリゴヌクレオチドがその相補配列にハイブリダイズされると、リガーゼ（黒丸）によって共に共有結合され閉じられる。本実施形態では、対象とする変異の検出に特異的な配列をもつ上流オリゴヌクレオチドプローブには、ライゲーション産物の後続の検出を促進する５’プライマー特異的部分（Ａｉ）がさらに含まれる。この場合もまた、野生型配列を含むブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブが存在することで、ＰＣＲ増幅工程中に、変異体配列の濃縮後に、存在する場合がある野生型標的配列へのライゲーションが抑制される。変異型と野生型両方の配列に共通する配列をもつ下流オリゴヌクレオチドプローブには、３’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）が含まれ、変異の検出に特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、後続の変異体ライゲーション産物のみの増幅及び検出を可能にする。この図の工程Ｄに示すように、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を上流ライゲーションプローブに含めることにより、別の特異性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、ライゲーションに優れる３’ＯＨ基が生じる（図２８、工程Ｄ）。ライゲーションに続いて、各二次ＬＤＲ反応チャンバーの産物が、３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配される。図１９（図２８、工程Ｅ～Ｇを参照）で上述したように、対応するプライマーＡｉとＣｉのペア、及びライゲーション接合部にわたるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して、または当技術分野で公知の他の好適な手段を使用してライゲーション産物を検出することができる。

【0172】

図２９は、低レベル変異を検出するための別の例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ反応（任意でキャリーオーバー防止を含む）を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡは単離され（図２９、工程Ａ）、２４、３６、４８、または６４個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配された後、ＰＣＲが行われる。単離されたＤＮＡ試料は、試料に存在する可能性のあるｄＵ含有核酸分子を消化するため、場合によりＵＤＧで処理される（図２９、工程Ｂ）。上流の遺伝子座特異的プライマーは、変異の数塩基上流に設計され、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含む。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基を除去して、ポリメラーゼ伸長に適した３’ＯＨ基が解放される（図２９、工程Ｂ）。上流のＰＣＲプライマーと部分的に重複する野生型配列を含むブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、野生型配列への結合に対しては、上流のプライマーよりも競合優先性をもつが、変異ＤＮＡに対してほど強くないため、ＰＣＲの各ラウンド中の野生型ＤＮＡの増幅が抑制される。図２９の工程Ｃに示すように、増幅産物には場合によりｄＵが含まれるが、ＵＤＧまたは類似の酵素で後処理すると、キャリーオーバーを防止することができる。各一次ＰＣＲ反応チャンバーからの産物は、対応する二次ＬＤＲ反応チャンバーに分配される。

【0173】

図２９の工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブが増幅産物にハイブリダイズし、２つのオリゴヌクレオチドがその相補配列にハイブリダイズされると、リガーゼ（黒丸）によって共に共有結合され閉じられる。本実施形態では、対象とする変異の検出に特異的な配列をもつ上流オリゴヌクレオチドプローブには、ライゲーション産物の後続の検出を促進する５’プライマー特異的部分（Ａｉ）がさらに含まれる。この場合もまた、野生型配列を含むブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブが存在することで、ＰＣＲ増幅工程中に、変異体配列の濃縮後に存在する場合がある野生型標的配列へのライゲーションが抑制される。変異型と野生型両方の配列に共通する配列をもつ下流オリゴヌクレオチドプローブには、３’プライマー特異的部分（Ｂｉ’－Ｃｉ’）が含まれ、変異の検出に特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、後続の変異体ライゲーション産物のみの増幅及び検出を可能にする。この図の工程Ｄに示すように、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を上流ライゲーションプローブに含めることにより、別の特異性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、ライゲーションに優れる３’ＯＨ基が生じる（図２９、工程Ｄ）。ライゲーションに続いて、各二次ＬＤＲ反応チャンバーの産物が、３８４個または７６８個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配される。ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（すなわちＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ、Ｃｉ）を使用してライゲーション産物を増幅し、図２０（図２９、工程Ｅ～Ｈを参照）で上述したように、または当技術分野で公知の他の好適な手段を使用して検出する。

【0174】

図３０は、マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である概略正面図である。この設計は、血漿中の低レベルの未知の変異を同定及び定量するためのマルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－ＵｎｉＴａｑ検出の実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。（あるいは、変異特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いた、マルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲを使用する）。図３０では、注入試料は入口１２を経て初期反応チャンバー１０（下）に流体接続され、適切な試薬と混合される。初期反応チャンバー１０（下）は、導管１４によって第１の六角形チャンバーセット１６（小トラフ１８を含む、一次ＰＣＲ反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバー１６は、導管２０によって、第２の六角形チャンバーセット２２（大トラフ２４及びバッフル２３を含む、二次ＰＣＲ反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバー２２は、導管２６によって細長い混合チャンバー２８に流体接続され、混合チャンバー２８は、導管３０によって、マイクロウェルまたはマイクロポアの細区画３２が含まれるチャンバーに流体接続されている（パネルの上部に４行のみを図示）。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。カートリッジの製造時に、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマー）を行に予備充填する。カートリッジの製造時に、マイクロウェルまたはマイクロポアの細区画の列へと至る二次ＬＤＲ反応チャンバー２２に、ライゲーションされない５’（上流）末端及び３’（下流）末端にＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグ配列のいずれかをもつＬＤＲ’プローブセットが場合により予備充填されている。図の左側にある灰色の円２５は、例えば音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティングによってプローブセットを送達またはプリントされる可能性のある位置を示している。プローブを乾燥させて、カートリッジのカバー部分を取り付け、プローブセットを適切な位置に密閉する。あるいは、同じＬＤＲプライマーセットを各プレチャンバーで使用する場合、ＰＣＲ工程の後に追加できるため、最初にカートリッジにプリントする必要がない。カートリッジの使用時には、カートリッジの初期反応チャンバー１０から一次ＰＣＲ反応チャンバー１６、二次ＬＤＲ反応チャンバー２２を経て、最終的には混合チャンバー２８に達し、さらに各列が隣接する列から隔てられたマイクロウェルまたはマイクロポアの細区画３２の列まで反応物が流体移動する。この例図では、７６８個に相当する２４列３２行に計画された細区画を４つずつ示し、各細区画には２４個のマイクロウェルまたはマイクロポアが含まれる。この例では、最初のマルチプレックスＰＣＲ増幅が、最初の一次ＰＣＲ反応チャンバー１６のそれぞれで、野生型配列の増幅は抑制するが、変異型配列は抑制しないＰＮＡまたはＬＮＡの存在下で１０～４０サイクル繰り返される。別の実施形態では、マルチプレックスＰＣＲ時の断片のドロップアウトを最小限に抑えるために、最初の「前増幅」マルチプレックスＰＣＲを、初期反応チャンバー１０で８～２０サイクル実行する。その後、この産物を一次ＰＣＲ反応チャンバー１６に分配する。ある変形例では、一次反応チャンバーのそれぞれに、野生型配列の増幅を抑制するＰＮＡまたはＬＮＡをもつ１～４個のＰＣＲプライマーセットが含まれており、シングルまたはマルチプレックスＰＣＲをさらに１０～３０サイクル実行し、潜在的な変異を含む１～４種類の断片を単一の一次反応チャンバーで増幅することができる。別の変形例では、４つの一次反応チャンバー６組に、野生型配列の増幅を抑制するＰＮＡまたはＬＮＡをもつ４～１６個のＰＣＲプライマーセットが含まれており、マルチプレックスＰＣＲをさらに１０～３０サイクル実行し、潜在的な変異を含む４～１６種類の断片を単一の一次反応チャンバーで増幅することができる。ポリメラーゼを不活性化し（例えば加熱死滅化またはプロテアーゼ消化などによる）、各チャンバーのマルチプレックス産物をリガーゼ、ＡＴＰ、またはＮＡＤを含むリガーゼ反応混合物に１０倍希釈し、対応する二次ＬＤＲ反応チャンバー２２（上記のＬＤＲプローブを予備充填）に分配する。場合により、ＲＮＡ塩基及び３’ブロッキング基を含む、ＰＣＲプライマー及び／またはＬＤＲ上流プローブは、正しい標的に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によりブロックが解除されるため、追加の特異性が提供され、偽産物が回避される。ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグをもつアレル特異的プローブを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、２０サイクルのＬＤＲを実行する。ＬＤＲプライマーが、同じ遺伝子の異なる変異に対して、同じ細区画で同じシグナルを生じるように設計することができる。新しいＰＣＲ試薬を追加し、各二次ＰＣＲ反応チャンバー２２のＬＤＲ産物と混合し、混合チャンバー２８から、さらに各列のマイクロポアへと分配する。各行の各細区画のユニバーサルまたはＵｎｉＴａｑプライマーは、正しいタグをもつ各列からの産物のみを増幅する。それぞれの列での特異的変異の有無により、血漿中の低レベル変異の数を計数することができる。

【0175】

各細区画に９６個のマイクロウェルを含む、２，３０４個に相当する４８列及び４８行の細区画を使用する代替的実施形態では、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマー）を、各行の適切な細区画に、音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティングによって直接送達した後、個々のマイクロウェル内で乾燥させる。最初の試料を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバー１６に分配する。血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝１０，０００ゲノム相当である。平均して、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバー１６あたり２００コピーであり、最大１つの変異がある。野生型ＤＮＡの増幅を低減するため、ブロッキングＰＮＡまたはＬＮＡを用いて１０～４０サイクルの遺伝子座特異的ＰＣＲを実行する。任意：ＰＣＲ反応時にｄＵＴＰを使用する（ＵＤＧで前処理し、初期試料のキャリーオーバー汚染を防止する）。場合により、ＲＮＡ塩基及び３’ブロッキング基を含む、ＰＣＲプライマー及び／またはＬＤＲ上流プローブは、正しい標的に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によりブロックが解除されるため、追加の特異性が提供され、偽産物が回避される。また、すべての下流ＰＣＲプライマーには、プライマー二量体の増幅を抑制するために、好ましくは８～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる。別の実施形態では、マルチプレックスＰＣＲ時の断片のドロップアウトを最小限に抑えるために、最初の「前増幅」マルチプレックスＰＣＲを、初期ウェルまたは反応チャンバーで８～２０サイクル実行する。その後、この産物を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバー１６に分配する。ある変形例では、４８個のウェルまたは一次反応チャンバーのそれぞれに、野生型配列の増幅を抑制するＰＮＡまたはＬＮＡをもつ１～４個のＰＣＲプライマーセットが含まれており、シングルまたはマルチプレックスＰＣＲをさらに１０～３０サイクル実行し、潜在的な変異を含む１～４種類の断片を単一のウェルまたは一次反応チャンバーで増幅することができる。別の変形例では、４つの一次反応チャンバー１２組に、野生型配列の増幅を抑制するＰＮＡまたはＬＮＡをもつ４～１６個のＰＣＲプライマーセットが含まれており、マルチプレックスＰＣＲをさらに１０～３０サイクル実行し、潜在的な変異を含む４～１６種類の断片を単一のウェルまたは一次反応チャンバーで増幅することができる。各ウェルの産物をＬＤＲプライマー及び緩衝液で希釈する。ウェルまたは二次ＬＤＲ反応チャンバー２２内で、ＵｎｉＴａｑテールをもつアレル特異的プライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、２０サイクルのＬＤＲを実行する。ＬＤＲプライマーが、同じ遺伝子の異なる変異に対して、同じ細区画で同じシグナルを生じるように設計することができる。ＬＤＲ反応は、同じ反応チャンバーで実行することも、２つの個々の反応チャンバーで実行して、再合一することもできる。ＵｎｉＴａｑマスターミックス及びＵＤＧを追加し、各ウェルまたは二次ＬＤＲ反応チャンバー２２の産物を、それぞれ９６個のマイクロポアを含む４８個の細区画に分配する。細区画には適切なＵｎｉＴａｑプライマー及び／またはプローブが事前にスポットされている（図２８及び図２９を参照）。事前にスポットされたプライマーセットを使用して各マイクロポア内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。

【0176】

図２５のカートリッジ及びバルブ構成を使用して、ＵｎｉＴａｑまたは変異特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲを使用して、血漿中の低レベルの未知の変異を同定及び定量することもできる。この図はまた、数千のマイクロポアで構成されるマイクロポアプレートを使用した、ＵｎｉＴａｑまたは変異特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲの流体システムを示す。マイクロポアプレートは孔の両側から流体連通可能である。第１の側面（プレートの上部、プレートの左側に図示）は、バルブ１、２、及び３と連通しており、対して第２の側面（プレートの下部、プレートの右側に図示）は、バルブ４及び５と連通している。バルブ１は、必要に応じて、２４～４８個の初期マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー、２４～４８個のＬＤＲ反応チャンバー、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、溶解／プロテアーゼ緩衝液、酵素、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、緩衝液、ＥｔＯＨ、軽油、及び重油を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。さらに、バルブ１は、バルブ３から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第１の側、他のチャンバー、ＬＤＲ反応チャンバー、及び初期マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバーを空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。バルブ１は、バルブ２を選択することもできる。バルブ２は、２４～４８個の初期マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー、２４～４８個のＬＤＲ反応チャンバー、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、初期マルチプレックスＰＣＲプライマー、任意のＬＤＲプライマー、マスターＰＣＲミックス、マスターＬＤＲミックス、マスターＵＤＧミックス、緩衝液、洗浄液、ＥｔＯＨ、及び空気を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。バルブ４は、マイクロポアプレートの第２の側にわたり空気、軽油、重油、及び廃棄物を分注し、バルブ５を経由して廃棄する。さらに、バルブ１は、バルブ５から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第２の側を空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。

【0177】

（表４）マルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲ用の試薬構成

【0178】

図２５Ｂは、初期マルチプレックス反応チャンバー１０、２４～４８個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１６、２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー２２、ならびに２４～４８列で数千個のマイクロポアまたはマイクロウェルの細区画を含む主要チャンバーに個別に加熱／冷却を施せるように設計されるいくつかの発熱体を示す。背面プレート、またはマイクロポアもしくはマイクロウェルチャンバーの１つ以上の平面（複数可）、ならびに反応チャンバーを、これらの発熱体に押し付けることで、温度制御、加熱、及び／または熱サイクルが可能になる。図２５に示すように、２４～４８個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１０及び２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー２２の裏側にある２つの発熱体は、すべての一次チャンバーをすべての二次チャンバーとは独立して制御する２つの長方形（水平）ストリップとして設計される。代替構成も使用することができ、例えば最初のマルチプレックスＰＣＲを、（ｉ）野生型ＤＮＡの伸長を抑制するブロッキングプライマーの有無を問わず、片側のマルチプレックスプライマーを線形伸長する、及び（ｉｉ）相補的プライマーを追加して、最初の伸長産物のＰＣＲ増幅を制限するか、または拡張するという２つの工程に分割してもよい。そのような構成では、（ｉ）２４～４８個の一次マルチプレックスポリメラーゼ伸長反応チャンバー、（ｉｉ）２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー、（ｉｉｉ）２４～４８個の三次マルチプレックス反応チャンバー、及び（ｉｖ）２４～４８列で数千個のマイクロポアまたはマイクロウェルを含む主要チャンバーの裏側に、少なくとも４つの、独立して制御される発熱体が必要になる。

【0179】

図３１は、メチル化を検出するための別の例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ反応（任意でキャリーオーバー防止を含む）を示す。ゲノムまたはｃｆＤＮＡは単離され（図３１、工程Ａ）、初期反応チャンバー内でＢｓｈ１２３６Ｉにより処理されて（ＣＧ＾ＣＧ）、非メチル化ＤＮＡが完全に消化される。単離されたＤＮＡ試料は、試料に存在する可能性のあるｄＵ含有核酸分子を消化するため、場合によりＵＤＧで処理される（図３１、工程Ｂ）。酵素処理されたＤＮＡをバイサルファイトで処理し、Ｃを５ｍｅＣではなくＵに変換し、鎖を非相補的にする。次いで、バイサルファイト処理されたＤＮＡを、２４、３６、４８、または６４個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配し、対象とするメチル化ＣｐＧを含む遺伝子座特異的領域を、ＰＣＲを使用して増幅する（図３１、工程Ｂ）。本実施形態では、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を上流プライマーに含めることにより、別の選択性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、変異の数塩基上流にあり、ポリメラーゼ伸長に適した３’ＯＨ基が解放される（図３１、工程Ｂ）。プライマー二量体を防ぐため、下流プライマーは５’末端に８～１１塩基の同じテールを含む。図３１の工程Ｃに示すように、増幅産物には場合によりｄＵが含まれるが、ＵＤＧまたは類似の酵素で後処理すると、キャリーオーバーを防止することができる。

【0180】

図３１の工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブが増幅産物にハイブリダイズし、二次ＬＤＲ反応チャンバー内で２つのオリゴヌクレオチドが相補配列にハイブリダイズされると、リガーゼ（黒丸）によって共に共有結合され閉じられる。本実施形態では、対象とするＣｐＧのメチル化状態の検出に特異的な配列をもつ上流オリゴヌクレオチドプローブには、ライゲーション産物の後続の検出を促進する５’プライマー特異的部分（Ａｉ）がさらに含まれる。下流オリゴヌクレオチドプローブには、３’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）が含まれ、変異の検出に特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、後続のメチル化特異的ライゲーション産物のみの増幅及び検出を可能にする。この図の工程Ｄに示すように、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を上流ライゲーションプローブに含めることにより、別の特異性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、ライゲーションに優れる３’ＯＨ基が生じる（図３１、工程Ｄ）。ライゲーションに続いて、図１９（図３１、工程Ｅ～Ｇを参照）で上述したように、対応するプライマーＡｉとＣｉのペア、及びライゲーション接合部にわたるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して、または当技術分野で公知の他の好適な手段を使用してライゲーション産物を検出することができる。

【0181】

図３２は、図３１の工程Ａ～Ｃと同様の初期工程を用いて、メチル化を検出するための別の例示的なＰＣＲ－ＬＤＲ－ｑＰＣＲ反応（任意でキャリーオーバー防止を含む）を示す。図３２の工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブが増幅産物にハイブリダイズし、２つのオリゴヌクレオチドがその相補配列にハイブリダイズされると、リガーゼ（黒丸）によって共に共有結合され閉じられる。本実施形態では、対象とするＣｐＧのメチル化状態の検出に特異的な配列をもつ上流オリゴヌクレオチドプローブには、ライゲーション産物の後続の検出を促進する５’プライマー特異的部分（Ａｉ）がさらに含まれる。下流オリゴヌクレオチドプローブには、３’プライマー特異的部分（Ｂｉ’－Ｃｉ’）が含まれ、変異の検出に特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、後続のメチル化特異的ライゲーション産物のみの増幅及び検出を可能にする。この図の工程Ｄに示すように、３’切断ブロッキング基（Ｂｌｋ３’、例えばＣ３スペーサー）及びＲＮＡ塩基（ｒ）を上流ライゲーションプローブに含めることにより、別の特異性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ（星印）によりＲＮＡ塩基が除去され、ライゲーションに優れる３’ＯＨ基が生じる（図３２、工程Ｄ）。ライゲーションに続いて、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（すなわちＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ、Ｃｉ）を使用してライゲーション産物を増幅し、図２０（図３２、工程Ｅ～Ｈを参照）で上述したように、または当技術分野で公知の他の好適な手段を使用して検出する。

【0182】

図３０のカートリッジ設計はまた、血漿中の低レベルのメチル化及び未知の変異を同定及び定量するために、マルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－ＵｎｉＴａｑ検出を実施する際にも使用することができる。（あるいは、変異またはメチル化特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いた、マルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲを使用する）。

【0183】

図２５のカートリッジ及びバルブ構成を使用して、ＵｎｉＴａｑまたは標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲを使用して、血漿中の低レベルのメチル化及び未知の変異を同定及び定量することもできる。この図は、数千のマイクロポアで構成されるマイクロポアプレートを使用した、ＵｎｉＴａｑまたは標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲの流体システムを示す。マイクロポアプレートは孔の両側から流体連通可能である。第１の側面（プレートの上部、プレートの左側に図示）は、バルブ１、２、及び３と連通しており、対して第２の側面（プレートの下部、プレートの右側に図示）は、バルブ４及び５と連通している。バルブ１は、必要に応じて、バイサルファイト反応チャンバー、２４～４８個の初期マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー、２４～４８個のＬＤＲ反応チャンバー、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、溶解／プロテアーゼ緩衝液、酵素、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、緩衝液、ＥｔＯＨ、軽油、及び重油を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。さらに、バルブ１は、バルブ３から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第１の側、他のチャンバー、ＬＤＲ反応チャンバー、初期マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー、及びバイサルファイト反応チャンバーを空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。バルブ１は、バルブ２を選択することもできる。バルブ２は、バイサルファイト反応チャンバー、２４～４８個の初期マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー、２４～４８個のＬＤＲ反応チャンバー、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、メチル化標的用の初期マルチプレックスＰＣＲプライマー、変異標的用の初期マルチプレックスＰＣＲプライマー、任意のＬＤＲプライマー、マスターＰＣＲミックス、マスターＬＤＲミックス、マスターＵＤＧミックス、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、バイサルファイト、緩衝液、洗浄液、ＥｔＯＨ、及び空気を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。バルブ４は、マイクロポアプレートの第２の側にわたり空気、軽油、重油、及び廃棄物を分注し、バルブ５を経由して廃棄する。さらに、バルブ１は、バルブ５から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第２の側を空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。

【0184】

（表５）マルチプレックスＰＣＲ－ＬＤＲ－リアルタイムＰＣＲ用の試薬構成（バイサルファイトあり）

【0185】

図２５Ｂは、初期マルチプレックス反応チャンバー１０、２４～４８個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１６、２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー２２、ならびに２４～４８列で数千個のマイクロポアまたはマイクロウェルの細区画を含む主要チャンバーに個別に加熱／冷却を施せるように設計されるいくつかの発熱体を示す。背面プレート、またはマイクロポアもしくはマイクロウェルチャンバーの１つ以上の平面（複数可）、ならびに反応チャンバーを、これらの発熱体に押し付けることで、温度制御、加熱、及び／または熱サイクルが可能になる。図２５に示すように、２４～４８個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１０及び２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー２２の裏側にある２つの発熱体は、すべての一次チャンバーをすべての二次チャンバーとは独立して制御する２つの長方形（水平）ストリップとして設計される。代替構成を使用することもできる。例えば、Ｂｓｈ１２３６Ｉ選択プロセスの代わりに、メチル化ＤＮＡにメチル特異的結合タンパク質または抗体を使用するために、メチル化ＤＮＡが濃縮される場合がある。この工程は、カートリッジ内で行うことも、またはメチル濃縮されたＤＮＡをカートリッジに入れる前に行うこともできる。バイサルファイト処理後の最初のマルチプレックスＰＣＲを、（ｉ）非メチル化ＤＮＡ ＤＮＡの伸長を抑制するブロッキングプライマーの有無を問わず、片側のマルチプレックスプライマーを線形伸長する、及び（ｉｉ）相補的プライマーを追加して、最初の伸長産物のＰＣＲ増幅を制限するか、または拡張するという２つの工程に分割してもよい。そのような構成では、（ｉ）２４～４８個の一次マルチプレックスポリメラーゼ伸長反応チャンバー、（ｉｉ）２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー、（ｉｉｉ）２４～４８個の三次マルチプレックス反応チャンバー、及び（ｉｖ）２４～４８列で数千個のマイクロポアまたはマイクロウェルを含む主要チャンバーの裏側に、少なくとも４つの、独立して制御される発熱体が必要になる。

【0186】

図３３は、低レベルの選択的スプライシング転写産物を検出するためのＲＴ－ＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＰＣＲ反応を示す。図３３の工程Ａは、検出される、エクソン３ａが含まれる野生型転写産物（上）、及びエクソン３ｂが含まれる低レベルの選択的スプライシング転写産物（下）を示している。この方法には、ｍＲＮＡを単離すること、及び初期反応チャンバー内で３’転写産物特異的プライマー（すなわちエクソン４）を使用して逆転写酵素でｃＤＮＡコピーを生成することを含む。Ｔａｑポリメラーゼを活性化して、異なるアンプリコンの相対比を維持するため、サイクルを制限して（すなわち７サイクル）ＰＣＲ増幅を実行する（図３３、工程Ｂ）。一実施形態では、最初のマルチプレックス反応物を６つの一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。この場合、各一次ＰＣＲ反応チャンバーへの元の各転写産物の平均分配数は２０コピーである。

【0187】

図３３の工程Ｃに示すように、一次ＰＣＲ反応チャンバー内で、標的特異的オリゴヌクレオチド二次プライマーを一次増幅産物とハイブリダイズし、ポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）を使用して対象とする標的含有領域をＰＣＲ増幅する（すなわち１０サイクル）。本実施形態では、選択的スプライス変異体（すなわちエクソン３ｂ）に特異的であり、野生型変異体（すなわちエクソン３ａ）とはハイブリダイズしないプライマーを利用して、選択的スプライス変異体に対応する増幅産物のみを産生する。６つの各チャンバーからの産物は、それよりも小さい４つの二次反応／希釈チャンバー（合計２４個のチャンバー）に別々に希釈される。ネステッドプライマー増幅に続いて、各二次反応／希釈チャンバーからのＰＣＲ産物は別々に希釈され、３８４個または７６８個のマイクロポアに分配される。ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（すなわちＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ、Ｃｉ）を使用して産物を増幅し、図２０（図３３、工程Ｄ～Ｆを参照）で上述したように、または当技術分野で公知の他の好適な手段を使用して検出する。

【0188】

図３４は、マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である概略正面図である。この設計は、希少及び過剰発現両方のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはスプライス変異体を計数するためのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－ＵｎｉＴａｑ検出の実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。（あるいは、標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いた、マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－リアルタイムＰＣＲ）。図３４では、注入試料は入口１２を経て初期反応チャンバー１０（下）に流体接続される。初期反応チャンバー１０は、導管１４によって六角形チャンバー１６（大トラフ１８を備え、一次ＰＣＲ反応チャンバーを構成）に流体連結される。一次ＰＣＲ反応チャンバー１６は、導管２０によって第２の六角形チャンバーセット２２（最初の各チャンバーが接続される４つのチャンバー。大トラフ２４ａ、中トラフ２４ｃ、小トラフ２４ｂ、及び極小トラフ２４ｄをそれぞれが備え、二次反応／希釈チャンバー２２を構成）に流体接続され、六角形チャンバー２２は、導管２６によって細長い混合チャンバー２８に流体接続され、混合チャンバーは、導管３０によって、マイクロウェルまたはマイクロポアを含む細区画３２のチャンバー（パネルの上部に４行のみを図示）に流体接続されている。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。カートリッジの製造時に、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマー）を行に予備充填する。カートリッジの製造時に、マイクロウェルまたはマイクロポアの列へと至るチャンバーに、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグ配列のいずれかを５’末端にもつネステッドＰＣＲプライマーセットが予備充填されている。図の左側にある灰色の円１７は、例えば音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティングによってプライマーセットが送達またはプリントされる可能性のある位置を示している。プライマーを乾燥させて、カートリッジのカバー部分を取り付け、プローブセットを適切な位置に密閉する。カートリッジの使用時には、カートリッジの最初のチャンバーからカートリッジへ、最終的に各列が隣接する列から隔てられたマイクロウェルまたはマイクロポアの列まで反応物が流体移動する。この例図では、７６８個に相当する２４列及び３２行に計画された細区画を４つずつ示し、各細区画には２４個のマイクロウェルまたはマイクロポアが含まれる。この例では、初期反応チャンバーで最初のマルチプレックス逆転写ＰＣＲを７サイクル行い、元の標的を増幅する。最初のマルチプレックス産物を一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。この場合、各一次ＰＣＲ反応チャンバーへの元の各転写産物の平均分配数は２０コピーである。ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグをもつ標的特異的プライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、１０サイクルのネステッドＰＣＲを実行する。各一次ＰＣＲ反応チャンバーは、排出後も一定比率の液体量を保持するように設計されている。３サイクルの充填と排出を実行して、産物を別々に希釈する。各一次ＰＣＲ反応チャンバーからの産物を、二次反応／希釈チャンバーに分配する。各二次反応／希釈チャンバーは、排出後も一定比率の液体量を保持するように設計されている。３サイクルの充填と排出を実行して、産物を別々に希釈する。ネステッドＰＣＲ産物を混合チャンバーへ、さらに各列のマイクロポアへと分配する。各行のユニバーサルまたはＵｎｉＴａｑプライマーは、正しいタグをもつ各列からの産物のみを増幅する。マイクロポア内のポアソン分布により、低コピー、中コピー、及び高コピーのｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはスプライス変異体を計数する。

【0189】

各細区画に９６個のマイクロウェルを含む、２，３０４個に相当する４８列及び４８行の細区画を使用する代替的実施形態では、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマー）を、各行の適切な細区画に、音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティングによって直接送達した後、個々のマイクロウェル内で乾燥させる。初期反応チャンバーまたはウェルで、１０サイクルのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲを実行すると、元の各ＲＮＡ分子の最大１，０２４コピーが得られる。必要に応じて、「タンデム」ＰＣＲプライマーを使用する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべてのＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる場合がある。最初のマルチプレックス産物を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。元の各ＲＮＡ標的の各ウェルへの平均分配数は２０コピーである。ＵｎｉＴａｑテールをもつプライマーを２４個組または４８個組のプライマーセットにして使用し、３～４サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、元の各病原体の最大１６０～３２０コピーが得られる。各ウェルの産物を、９６個のマイクロポアを備える、それぞれ２４個２セットまたは１２個４セットの細区画に分配する。２セットを使用する場合、第２のセットは第１のセットの１００／１希釈である。４セットを使用する場合、各セットは前のセットの２０／１希釈である。これにより、大きな規模にわたって存在するＲＮＡ分子の網羅が可能になる。平均して、最初の各細区画に元の各ＲＮＡ分子が１２コピー得られ、所与の１マイクロポアに元のＲＮＡが１または０コピー得られることになる。存在するＲＮＡの数が多くなると、各細区画に追加のコピーが得られることになる。事前にスポットされたＵｎｉＴａｑプライマーセットを使用して各マイクロポア内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。２セットまたは４セットの希釈物にわたる９６個のマイクロポアのポアソン分布により、試料中のＲＮＡコピー数が非常に多い場合はもとより、ＲＮＡコピー数が非常に少ない場合でも、ある程度の計数が可能になる。

【0190】

本発明の別の実施形態は、固体支持体での標的分子の合成またはライゲーションによるシーケンシングのためのシステムである。例えば図１に記載するように、直径５ミクロンのマイクロポア内で１つ以上の標的分子を増幅する。標的は増幅されて、マイクロポアまたはマイクロウェル内の固体支持体に固定または結合される。そのような固定は、マイクロポアもしくはマイクロウェルの内部表面、マイクロポアもしくはマイクロウェルの表面に固定されたデンドリマー状プライマー、または増幅前にマイクロポアもしくはマイクロウェル内に予め分配されているか、もしくは増幅後にマイクロポアもしくはマイクロウェルに分配されるマイクロビーズに対して直接行われる場合がある。マイクロビーズは表面積がかなり大きい多孔質の場合があり、マイクロポア単独の内側表面で達成し得るよりも高レベルの増幅が可能である。固体支持体への固定または結合により、増幅された標的を１回以上調べて、標的内の変異、ＳＮＰ、または配列変異の有無を決定することができる。

【0191】

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの蛍光産物を検出するための標準的な手法は、ウェルあたり１つの標的のみを増幅する、及び単一のユニバーサルプライマーを使用してシーケンシングリードを生成することに依拠する。単一の標的分子を増幅する手法の一つは、クラスター増幅として知られ、固体支持体上に順方向と逆方向両方のプライマーを固定することである。ただし、この手法は、伸長産物が新しいプライマーとハイブリダイズせず、互いが再ハイブリダイズする傾向があるため、クラスター内の鎖の総収量が制限される。代替手法は、油に囲まれた水滴内のビーズ上でＤＮＡを増幅することである。本明細書では、溶液中で増幅を行った後、固体支持体または固定プライマー上に産物を捕捉して、さらに伸長させ、増幅産物のコピーを作製する簡潔な手法を提案する。この方法では、より大量に反応が行われるため、高収量の複数の増幅産物が得られ、さらにこれを、選択された標的特異的プライマー、または代わりに共通領域及び可変領域を含む異なるシーケンシングプライマーのセットを使用してシーケンシングすることができる。適切な充填量及びプライマーの選択により、各ラウンドのシーケンシングで、約３０％～３５％のマイクロポアで固有のシーケンシング読み取りが可能になる。

【0192】

マイクロポア及びマイクロウェルは、内側に親水性表面を、外側に疎水性表面を有するように構築される。この構造は、異なる個々の量の液体に試料流体を注入するのに適しており、マイクロポアまたはマイクロウェル間でのクロストークがない増幅を可能にする。さらに、親水性表面を官能化すると、マイクロポアまたはマイクロウェル内にはプライマーを結合／固定できるが、外部には結合／固定できないため、クロストークをなくすことができる。

【0193】

固体支持体がポリ（メタクリル酸メチル）（別名ＰＭＭＡ、プレキシガラス、Ｌｕｃｉｔｅ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレン、またはポリプロピレンの被覆用材で構成される場合、手法の一つは、ＵＶレーザーアブレーションによってマイクロポアまたはマイクロウェルを作製することである。あるいは、マイクロポア及びマイクロウェルを、射出成形、インプリント、ホットエンボス、またはエッチングによって作製し、マスキング手法を使用してそれらの特定の表面をＵＶ光に曝露する。これらのプロセスでは、５’アミノ末端オリゴヌクレオチドの、ＥＤＣ／ＮＨＳを介在する共有結合に適したカルボキシレート表面を生成し、マイクロアレイを作製する（Ｓｉｔｕｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｏｎｔｏ Ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）ｗｉｔｈ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ－ａｂｕｎｄａｎｔ Ｐｏｉｎｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，” Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４０（１）：１２３－３５（２００５）；ＭｃＣａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｓｉｓｔ－ｆｒｅｅ Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ－ｂａｓｅｄ Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ，”Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１２７（３）：８４２－３（２００５）；Ｓｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｏｎｔｏ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ Ｕｓｉｎｇ ＵＶ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｉｎｔｏ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｏｆ Ｌｏｗ－ａｂｕｎｄａｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｉｎｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ３７（１）：１０３－１３（２００５）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈｉｐｓ Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙ（Ｍｅｔｈｙｌ Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ－Ａｂｕｎｄａｎｔ ＤＮＡ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，” Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．７５（５）：１１３０－４０（２００３）。それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0194】

代替的実施形態では、共有結合ポリマーブラシを原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）によってＰＭＭＡの表面に成長させる（Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａｑｕｅｏｕｓ－ｂａｓｅｄ Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ＡＴＲＰ Ｇｒａｆｔｉｎｇ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｒｕｓｈｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙ（Ｍｅｔｈｙｌ Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，” Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２８（４０）：１４２５４－６０（２０１２）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この手法は、ＰＭＭＡ表面へのＡＴＲＰ開始剤の共有結合固定と、後続のポリ（Ｎイソプロピルアクリルアミド）ＰＮＩＰＡＡｍの表面開始水性ＡＴＲＰの生成に基づいている。簡潔には、ＰＭＭＡの選択領域をＵＶ修飾してカルボン酸官能基を導入し、その後ＥＤＣ／ＮＨＳのエチレンジアミンと反応させてアミノ基に変換する。次に、これらのアミン官能化ＰＭＭＡ表面をＡＴＲＰ開始剤Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－２－ブロモ－２－メチルプロピオネートの活性化エステルと反応させる。水中で原子移動重合を行い、共有結合した開始剤表面からＰＮＩＰＡＡｍブラシを成長させる。表面からポリマーをグラフトする際の、この水性系の経路は、様々な基材及び水溶性ＡＴＲＰモノマーに適合させることができる。

【0195】

代替的実施形態では、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）を用いてＣＯＣ表面を光グラフト化した。これには、最初の段階で表面開始剤の共有結合を形成し、その後、第２段階でこれらの部位からＰＥＧＭＡのグラフト重合を行うという２段階の逐次手法を使用する（Ｓｔａｃｈｏｗｉａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｃｌｉｃ Ｏｌｅｆｉｎ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈｉｐｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｐｈｏｔｏｇｒａｆｔｉｎｇ，” Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ．３０（７）：１０８８－９３（２００７）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。類似する手法が低密度ポリエチレンフィルムにも使用される。（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｗ－Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｆｉｌｍｓ ｂｙ ＵＶ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｇｒａｆｔ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ Ｐｈｏｔｏｌａｍｉｎａｔｉｏｎ，” Ｌａｎｇｍｕｉｒ １４（４）：９２１－９２７（１９９８）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0196】

代替的実施形態では、親水性コーティングを使用して疎水性表面を親水性表面に変換する（Ｚｉｌｉｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｃｏａｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，” Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅ．１６（１）：１０７－１４（２０１４）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の変形例では、光反応性コーティングを使用してデバイスの濡れ性を空間的に制御し、親水性表面を形成する（Ａｂａｔｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｏｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｃｏａｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ Ｗｅｔｔａｂｉｌｉｔｙ，” Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ８（１２）：２１５７－６０（２００８）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0197】

全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開第２０１５／００９９６４２号に記載されているように、固体支持体の表面に、オリゴヌクレオチドを固体支持体に結合するリンカー分子の層が含まれていてもよいが、リンカー分子は本発明の必須要素ではないことが理解されよう。リンカー分子は、好ましくは完成した基材のポリマーが、基材に露出した分子と自由に相互作用できる程度の十分な長さのものである。十分な露出を得るには、リンカー分子は６～５０原子長でなければならない。親水性／疎水性といった特性に基づいて適切なリンカー分子を選択することができる。リンカー分子は、例えば、アリールアセチレン、２～１０モノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二塩基酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであってもよい。

【0198】

リンカー分子は、例えば（ポリ）トリフルオロクロロエチレン表面を使用して、炭素－炭素結合を介して基材に結合させることができる。リンカー分子は、場合により規則的な配列で、すなわち頭部基の一部として、重合された単層に結合されてもよい。代替的実施形態では、リンカー分子は基材の表面に吸着される。

【0199】

本発明のデバイスには、用途に応じた様々な種類のオリゴヌクレオチドを含み得る。本発明の一実施形態では、デバイスのオリゴヌクレオチドは、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，８５２，４８７号及び同第７，４５５，９６５号に記載される、捕捉オリゴヌクレオチドプローブである。したがって、本発明は、固体支持体上に複数の標的ヌクレオチド配列を捕捉する方法も包含する。

【0200】

本発明のデバイスを使用して実施することができる固相増幅の他の適切な方法は、Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，０１７，７３８号、Ｇｏｒｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，７４１，４６３号、Ｒｉｇａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，７５４，４２９号、及びＣｈｅｅ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，３５５，４３１号、ならびにＳａｂｏｔ ｅｔ ａｌ．の米国特許公開第２００９／０２２６９７５号、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．の米国特許公開第２００１／００３６６３２号、Ｓｕｎｄａｒａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．の同第２００８／０１０８１４９号、Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌの米国特許公開第２００５／００５３９８０号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明のデバイスはまた、他のマルチプレックス核酸反応の実施にも適しており、この反応には、限定されないが、一塩基または多塩基伸長反応、プライマー伸長アッセイ、固相シーケンシング、固相オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、ペアエンドリード、ＲＮＡシーケンシング、コピー数解析、ＣｈＩＰシーケンシング、及び全体が参照により本明細書に組み込まれるＯｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開第２０１０／００１５６２６号に記載の他の反応が含まれる。

【0201】

全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開第２０１５／００９９６４２号に記載されているように、本発明の一態様は、固体支持体上のマイクロウェルまたはマイクロポア内にオリゴヌクレオチドを結合させる方法に関する。第１のこれらの方法には、底面、上面、及び底面と上面との間に広がる複数の側面を有する固体支持体を提供することを含む。底面、上面、及び複数の側面は、固体支持体上に複数のマイクロウェルまたはマイクロポアを集合的に形成する。固体支持体の底面を覆うためにマスクを利用し、マスクしたデバイスが活性化作用物に曝露されると、固体支持体のマスクされていない表面は活性化され、対して固体支持体のマスクされた表面は不活化される。固体支持体からマスクを除去し、オリゴヌクレオチドが固体支持体の活性化表面とは結合するが、固体支持体の不活化表面には結合しない効果のある条件下で、露出した固体支持体を複数のオリゴヌクレオチドと接触させることにより、オリゴヌクレオチドが固体支持体上のマイクロウェルまたはマイクロポア内に結合される。

【0202】

全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開第２０１５／００９９６４２号に記載されているように、本発明の本態様によれば、固体支持体は好ましくはポリマー材料を含む。好適なポリマーとして、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリカーボネート、ポリスルホン、エラストマー、及びポリマー性有機シリコーンが挙げられるが、これらに限定されない。底面、上面、及び底面と上面との間に広がる複数の側面を有する固体支持体は、平面を有する固体支持体から形成され、この平面は固体支持体上にマイクロウェルまたはマイクロポアを作製するため、底面、上面、及び複数の側面を形成するように処理されている。一実施形態では、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許第８，７５８，９７４号に記載されるホットエンボスを平面に施す。この手法は、固体支持体がポリマー材料を含む場合に好ましい。本発明の本態様の代替的実施形態では、固体支持体上にマイクロウェルまたはマイクロポアを作製するため、平面にフォトリソグラフィーを施す。

【0203】

オリゴヌクレオチドを含む生体分子の結合のためにポリマーの表面を修飾する方法が、Ｓｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許第８，７５８，９７４号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。固体支持体上のマイクロウェルまたはマイクロポア内でのオリゴヌクレオチドの選択的活性化及び結合を達成するため、固体支持体上の複数のパターン位置を選択的にマスクして、活性化作用物、例えばＵＶ光に曝露する。本発明の本態様の一実施形態では、活性化作用物は化学線である。好ましくは、化学線への曝露は酸化雰囲気で実施される。多くの用途において通常の空気が適しているが、必要に応じて、パターンの形成を変更するために、酸素（または他の酸化剤）の濃度が高いかまたは低い雰囲気を使用することもできる。酸素の代わりに、または酸素に加えて、当技術分野で公知の他の酸化剤、例えばＳＯ２、ＮＯ２、またはＣＮＢｒを使用してもよい（例えばＫａｖｃ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｙ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｒｏｕｐｓ，” Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１２：１０５３－１０５９（２０００）；Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ，”Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｂｙ Ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙａｎｏ Ｇｒｏｕｐｓ，” Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．２０：５１５－５２０（１９９９），を参照。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。化学線曝露によりポリマー表面が活性化されて、光酸化が促進し、曝露表面にカルボキシル基が生成される。化学線活性化に適した表面として、アクリレートポリマー（例えばＰＭＭＡ）、芳香族ポリマー（例えばポリスチレン、フェノキシ樹脂）、ポリアミド、ポリスルホン、及びコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0204】

化学線を活性化作用物として使用するアレイ表面の活性化は、使用されるポリマーが吸収する周波数の広帯域紫外線、狭帯域ＵＶランプ（例えば２５４ｎｍ）、またはＵＶレーザーへの曝露により達成することができる。あるいは、酸素プラズマを活性化作用物として使用し、アレイ表面の活性化を達成することができる。環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）は、自家蛍光レベルが並外れて低く、ＵＶまたは酸素プラズマ曝露後に高密度の官能基を生成する能力があるため、好ましいポリマーである。

【0205】

全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許第８，７５８，９７４号に記載されるように、オリゴヌクレオチド、好ましくはアミン末端オリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法、例えば架橋剤としてエチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、及び中間体エステルとしてＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用するクリックケミストリーを用いて、表面の活性化領域に結合される。ただし、ジスルフィド、マレイミド、またはシロキサンなどの他の結合化学物質も使用することができる。複数のマイクロウェルまたはマイクロポアが含まれるアレイを形成する場合、オリゴヌクレオチドはウェルの活性化された側面と、存在する場合は底面には結合するが、マスクされた上面には結合しない。

【0206】

全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開第２０１５／００９９６４２号に記載されているように、固体支持体上にオリゴヌクレオチドのアレイを形成する別の方法は、平面基材と、基材表面にわたる感光層とを有する固体支持体を提供することを含む。固体支持体は、固体支持体上にマイクロウェルまたはマイクロポアを形成するのに有効な条件下でフォトリソグラフィープロセスを施す。オリゴヌクレオチドが、フォトリソグラフィープロセスによって露光された感光層の部分には結合するが、未露光のままの部分には結合しないか、あるいは未露光のままの部分には結合するが、露光された部分には結合しない効果がある条件下で、固体支持体をオリゴヌクレオチドと接触させることにより、オリゴヌクレオチドが固体支持体上のマイクロウェルまたはマイクロポア内に結合される。

【0207】

オリゴヌクレオチドの固体支持体への共有結合を可能にするように、感光性表面（すなわちＳＵ－８またはその変種の１つ）に官能基を生成する様々な方法が当技術分野で公知である。好適な官能基として、カルボキシル基、カルボニル基、ヒドロキシル基、アミノ基、エポキシ基、及びシラノール基が挙げられるが、これらに限定されない。

【0208】

全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開第２０１５／００９９６４２号に記載されているように、ＳＵ－８は、追加の活性化または修飾を伴わないオリゴヌクレオチドの共有結合に適したエポキシド環を含む好ましい表面材料である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ Ｇｒａｆｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＵ－８ ｆｏｒ Ｂｉｏ－ＭＥＭＳ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．１７：１３７１－１３８０（２００７）も参照。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、表面エポキシド基を加水分解し、第一級アミンをもつオリゴヌクレオチドと第二級アミンを形成するアルカリ溶液（ｐＨ約１２）を使用して、アミン末端オリゴヌクレオチドをＳＵ－８の表面に付加することができる。あるいは、ＳＵ－８のマイクロウェルまたはマイクロポアを硝酸で処理して、表面に拘束されたヒドロキシル基を生成した後、オリゴヌクレオチドに含まれる第一級アミンと反応させる（図２４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ Ｇｒａｆｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＵ－８ ｆｏｒ Ｂｉｏ－ＭＥＭＳ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．１７：１３７１－１３８０（２００７）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに別の実施形態では、ＳＵ－８ポリマーマイクロウェルまたはマイクロポアをＵＶ照射（２５４ｎｍ）に曝露して表面のヒドロキシル基及びカルボン酸基を生成する。これらの手法は、活性化作用物への曝露後にその表面化学を変化させない材料を固体支持体基材が含んでいるため、接触光学式マスクを必要としない。

【0209】

エポキシ系レジストと互換性のある代替の結合化学物質、例えばＳＵ－８はまた、オリゴヌクレオチドをマイクロウェルまたはマイクロポアの内部表面に結合させる用途にも適している。例えば、一実施形態では、架橋試薬を使用して、支持体の表面に存在する官能基を修飾する。好適な架橋試薬として、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開第２０１５／００９９６４２号に記載される、グリシン、グルタルアルデヒド、及びアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0210】

デンドリマーを固体支持体に固定するための一実施形態では、ｂＤＮＡとして知られる一連の分岐オリゴデオキシリボヌクレオチドを介して複数のプライマーを固体表面に結合する。（Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｂ－ｔｙｐｅ Ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ｂＤＮＡ）Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（２３）：４８３５－４１（１９９７）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この手法では、ｂＤＮＡに、１つの固有なオリゴヌクレオチドである一次配列、櫛状分岐ネットワークを介して異なるオリゴヌクレオチドの多くの同一コピーに共有結合する二次配列が含まれる。標的増幅に適したオリゴヌクレオチド複合体の複数のコピーを、ｂＤＮＡネットワークにハイブリダイズし、次いで共有結合的に架橋させる。鎖間架橋に適したヌクレオチド類似体は以下に示す。あるいは、ＤＮＡリガーゼなどの酵素プロセスを使用して鎖を連結することができる。オリゴヌクレオチド複合体の５’末端は、二次配列に相補的であり、架橋に適するように設計されているが、３’末端は、目的とする標的の増幅用タグ配列としての使用に適している。

【0211】

デンドリマー様ＤＮＡのアセンブリ制御のための多用途かつ独創的な実施形態は、ハイブリダイゼーションにより作製されるＹ字型ＤＮＡ分子を使用する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ－ｌｉｋｅ ＤＮＡ，” Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ．３（１）：３８－４２（２００４）；Ｕｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ－ｌｉｋｅ ＤＮＡ－ｂａｓｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｎａｎｏｂａｒｃｏｄｅｓ，” Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．１（２）：９９５－１０００（２００６）；Ｃａｍｐｏｌｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＤＮＡ ａｓ ａ Ｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６２（６）：６０６－１６（２０１０）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ハイブリダイゼーションを制御して、より小型のＹ字型分子を互いにライゲーションし、マルチアーム型デンドリマー構造を作成した後、ＤＮＡ鎖を互いに架橋して永続的なものにすることにより、そのような分子をアセンブリすることができる。５’または３’末端に、アミノ基、ビオチン基、またはその他の部分をもつ末端ＤＮＡ分子の一部を使用することで、デンドリマー複合体の固体支持体への共有結合または非共有結合による固定に適した分子になる。標的増幅に適した複合オリゴヌクレオチドの複数のコピーを、ｂＤＮＡネットワークにハイブリダイズし、次いで共有結合的に架橋するかまたはライゲーションする。複合オリゴヌクレオチドの５’末端は、二次配列に相補的であり、架橋またはライゲーションに適するように設計されているが、３’末端は、目的とする標的の増幅用タグ配列としての使用に適している。

【0212】

別の実施形態では、分岐ＤＮＡは、「ステップワイズ及びダブルクリック」ケミストリーを使用した付加環化によるトリプロパルギル化オリゴヌクレオチドから合成される。（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｙ－ｓｈａｐｅｄ ＤＮＡ： ”ｃｌｉｃｋ” Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ Ｄｅｎｄｒｏｎｉｚｅｄ ８－ａｚａ－７－ｄｅａｚａｇｕａｎｉｎｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，” Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． ２３（４）：８５６－７０ （２０１２）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。２つの末端三重結合をもつ７－トリプロパルギルアミン側鎖で修飾されたデンドロン化オリゴヌクレオチドをビスアジドでさらに官能化し、２つの末端アジド基をもつ誘導体を得る。続いて、２つのアジド基または２つの三重結合をもつ分岐側鎖をＤＮＡ断片と組み合わせて、対応するクリック反応可能な官能基を得る。同様に、市販のアジド、アルキン、またはＤＢＣＯ部分を含むオリゴヌクレオチドを使用してもよい。こうした手法により、分岐した（Ｙ字型）３本アームのＤＮＡが得られる。相補的オリゴヌクレオチドの第１のセットによる分岐ＤＮＡのアニーリングにより、超分子集合体が得られ、これを本明細書に記載の架橋手法を使用することにより熱安定性にすることができる。相補的な複合オリゴヌクレオチドの第２のセットを超分子ｂＤＮＡネットワークにハイブリダイズし、次いで共有結合的に架橋するかまたはライゲーションする。複合オリゴヌクレオチドの５’末端は、相補的オリゴヌクレオチドの第１のセットに相補的であり、架橋またはライゲーションに適するように設計されているが、３’末端は、目的とする標的の増幅用タグ配列としての使用に適している。

【0213】

別の実施形態では、デンドリマーは固体支持体上で直接アセンブリされる（Ｂｅｎｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｗｉｔｈ ＰＡＭＡＭ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｌｉｎｋｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（２）：Ｅ１０（２００２）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この手法は、目的とする標的の増幅にタグ配列として使用するのに適する、固体支持体と望ましいオリゴヌクレオチドとの間のメディエーター部分として、予め組み立てられたポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）放射状デンドリマーを使用する。６４個の第一級アミノ基を外圏に含むデンドリマーをシリル化ガラス支持体に共有結合させ、続いてその樹状高分子をグルタル酸無水物で修飾し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドで活性化させる。これで、活性化された表面を、アミノ修飾されたＤＮＡオリゴマーで装飾でき、目的とするオリゴヌクレオチドプライマーが高密度に充填された非常に安定性の高い表面が得られる。

【0214】

別の実施形態では、（アジドとの）銅フリークリックケミストリー用のジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）；（アジドとの）クリックケミストリー用の５－オクタジイニルｄＵ；Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ（ペプチド結合用）；またはアルキンもしくはＤＢＣＯとのクリックケミストリー用のアジドを使用して、固体表面、別のオリゴヌクレオチド、またはデンドリマーオリゴヌクレオチドにプライマーを共有結合することができる。他のオリゴヌクレオチドまたは固体支持体いずれへの架橋にも適した、修飾塩基を含むオリゴヌクレオチドが、例えばＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ ５２２４１，ＵＳＡ）から市販されている。

【0215】

別の実施形態では、フラン部分を含む修飾塩基を用いてオリゴヌクレオチドを合成する。メチレンブルーの存在下で可視光に曝露されると、一重項酸素の形成を誘発し、それがフランの酸化を引き起こし、さらにその結果生じるアルデヒドが相補的なＡまたはＣと迅速に反応して安定した鎖間付加物を形成する。（Ｏｐ ｄｅ Ｂｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｌｉｇｈｔ，” Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３４（２６）：１０７３７－４０（２０１２）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0216】

デンドリマー構造を安定化するための別の手法は、光架橋を利用することである。（Ｒａｊｅｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｏｔｏ－ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ－ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ Ｏｒｉｇａｍｉ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｅｒ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ，” Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３３（３７）：１４４８８－９１（２０１１）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この手法では、８－メトキシプソラレンを使用して、ＵＶ光への曝露時にピリミジン塩基を互いに架橋する。

【0217】

別の実施形態では、脱塩基部位のヌクレオチド類似体を使用して、鎖間架橋を促進する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ＤＮＡ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｏｘｉｄｉｚｅｄ Ａｂａｓｉｃ Ｓｉｔｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，” Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．７９（１３）：５９４８－５７（２０１４）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0218】

別の実施形態では、４－ビニル置換ピリミジン及び６－ビニルプリンヌクレオチド類似体を使用して、鎖間架橋を形成する（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，“４－ｖｉｎｙｌ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｅｘｈｉｂｉｔ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｓ ｗｉｔｈ ＲＮＡ ａｎｄ Ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１（１３）：６７７４－８１（２０１３）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの類似体として、シトシンとの架橋のための２－アミノ－６－ビニルプリン誘導体、ならびに４－ビニル置換ピリミジン誘導体、Ｔ－ビニル及びＵ－ビニルが挙げられる。

【0219】

全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．のＷＯ ２０１６／０５７８３２に記載されているように、（アジドとの）銅フリークリックケミストリー用のジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）；（アジドとの）クリックケミストリー用の５－オクタジイニルｄＵ；Ａｍｉｎｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ（ペプチド結合用）；またはアルケンもしくはＤＢＣＯとのクリックケミストリー用のアジドを使用して、固体表面にオリゴヌクレオチドを共有結合することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドにビオチン基またはＨｉｓタグなどの捕捉部分が含まれていてもよく、これらが、固体支持体上のマイクロウェルまたはマイクロポア内に存在する固定化ストレプトアビジンまたはＮＴＡマトリックスによってそれぞれ捕捉されることになる。

【0220】

制限された（短鎖）ＲＣＡアンプリコンの共有結合された同一のコピーで表面を形成する代替手段として、Ｓｅｑｕｏｉａ増幅（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．の２０１３／０１２４４０）及び野火（ｗｉｌｄｆｉｒｅ）増幅（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０（３５）：１４３２０－３（２０１３）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。

【0221】

全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．のＷＯ ２０１５／１８８１９２に記載されているように、固体支持体は多種多様な材料から作製することができる。基材は、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、チューブ、球体、ビーズ、容器、毛細管、パッド、薄片、フィルム、プレート、スライド、ディスク、膜などとして存在する生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらのいずれかの組み合わせであり得る。基材は、盤状、正方形、円形などの任意の利便な形状を有し得る。基材は、好ましくは平坦であるが、様々な代わりの表面構成を採る場合もある。例えば、基材はハイブリダイゼーションがそこで行われる隆起領域または陥没領域を含んでもよい。基材及びその表面は、好ましくは本明細書に記載のシーケンシング反応をそこで実施するための剛性支持体を形成している。

【0222】

鋳型作製に使用される市販の次世代シーケンシング用固体支持体プラットフォームを、本発明のシステム及び方法に利用することができる。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｆｌｏｗ Ｃｅｌｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）ＩｏｎＳｐｈｅｒｅ（商標）及びエマルジョンＰＣＲビーズ、ならびに４５４エマルジョンＰＣＲビーズを本発明のシステム及び方法に使用することができる。その結果、環状キメラ一本鎖核酸構築物の第１の固体支持体プライマー特異的部分は、市販のＮＧＳ固体支持体に固定されたプライマーと同一であるように設計される。したがって、第１の固体支持体プライマー特異的部分の相補体を含む伸長産物が、ＮＧＳ固体支持体表面のプライマーにハイブリダイズすることができる。

【0223】

図３５は、１つの標的鎖の病原体をシーケンシング及び同定するためのプライマー設計の一実施形態を示す。ゲノムＤＮＡを単離し、ＲＮＡウイルスの場合には、最初の逆転写酵素工程でｃＤＮＡを生成する。初期反応チャンバー内で、ＰＣＲを使用して標的ＤＮＡを前増幅してもよい（図３５、工程Ａ）。一変形例では、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡまたはｃＤＮＡを２４、３６、または４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。標的配列を増幅するため、遺伝子座特異的ネステッドプライマーのペアを準備する。プライマーペアはそれぞれ、（ｉ）第１の遺伝子座特異的プライマーであって、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーと；（ｉｉ）プライマー配列全体に２つ以上のｄＵ塩基を有する第２の遺伝子座特異的プライマーであって、第２の５’共通配列部分またはタグ配列部分、断片識別子配列、ならびに遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーとで構成される。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除され、ポリメラーゼ介在性の伸長に適した３’ＯＨが解放される（図３５、工程Ｂ）。熱安定性ポリメラーゼ、好ましくは鎖置換ポリメラーゼを使用して、２サイクルまたは３サイクルのＰＣＲ増幅を実行する。この増幅サイクルにより、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、２つの遺伝子座特異的プライマー部分間の標的配列、内部断片識別子、及び第２の５’共通配列またはタグ配列が含まれる産物が産生される。産物中の元のプライマー及びプライマーの一部は、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）及び場合によりＡＰＥ１（ヒトアプリンエンドヌクレアーゼ；図３５、工程Ｃ）を使用して破壊される。その結果、各二本鎖増幅産物の一方の末端部分が一本鎖になる。固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンがマイクロポアに含まれる場合もある。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している。（図３５、工程Ｄ）。

【0224】

特にマイクロポアまたはビーズ内で複数の産物を増幅する場合に、最良のシーケンシングシグナルを得るには、固定されたプライマーのほとんどが伸長され、シーケンシングに適する標的含有鎖に変換されるように産物を増幅することが望ましい。図３６、図３７、及び図３８は、個別にもしくは組み合わせて、または他の手法と共に使用することができる３つの異なる実施形態を示す。

【0225】

図３６は、第１のタグプライマーが、溶液中と、固定された第２のタグプライマーのいずれよりも多量に存在する一実施形態を示す。固定されたプライマーは、溶液中の第２のタグプライマーよりも長い。場合により、固定プライマーにハイブリダイズする一本鎖産物の合成に優位であり、そのようなプライマーの伸長を完了まで促進するように、ＰＣＲまたはその他の増幅サイクルの終了時のハイブリダイゼーション温度を短い方のタグプライマーのＴｍより高くする。

【0226】

図３７は、溶液中の第１のタグプライマーが、２つの異なる５’部分、及び５’付加部分をもつプライマーを含み、いずれの第２のタグプライマーよりも多量に存在する別の実施形態を示す。固定されたプライマーは、溶液中の第２のタグプライマーよりも長い。５’－３’ヌクレアーゼ活性を欠く鎖置換ポリメラーゼを使用して、等温増幅と熱サイクル増幅を組み合わせて実行する。異なる５’部分をもつ産物を再アニーリングすると、末端にＹ字型構造が生じ、鎖置換増幅が可能になる。これは、固定されたプライマーの伸長を完了まで促進する効果がある。

【0227】

図３８は、溶液中の第１のタグプライマーが、ｄＡ３５、及びＧＣリッチ足場にｄＡ３５を付加したプライマーを含み、いずれの第２のタグプライマーよりも多量に存在する別の実施形態を示す。固定されたプライマーは、溶液中の第２のタグプライマーよりも長い。５’－３’ヌクレアーゼ活性を欠く鎖置換ポリメラーゼを使用して、等温増幅及び／または熱サイクル増幅を実行する。プライマーの足場は、標的に結合された場合にのみＲＮａｓｅＨ２により放出される。過剰な一本鎖産物は、固定されたプライマーにハイブリダイズし、固定されたプライマーの伸長を完了まで促進する効果がある。

【0228】

固定された伸長産物のシーケンシングは、本明細書に記載及び図示されているｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを使用して行うことができる。ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓとして、蛍光によるｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ及びイオンによるｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓが挙げられる。他の好適なシーケンシング方法を用いることもでき、これには例えば、蛍光プライマーハイブリダイゼーション、分子ビーコンハイブリダイゼーション、プライマー伸長、エキソヌクレアーゼを用いたシーケンシング、リガーゼ検出反応、リガーゼ連鎖反応、パイロシーケンシング法、蛍光によるｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎ、ナノポア及びナノチューブを用いたシーケンシング、ならびにイオンによるｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎが含まれるが、これらに限定されない。

【0229】

全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．のＷＯ ２０１６／１５４３３７に完全に記載されているように、固体支持体上に標的核酸分子を固定するのに適した捕捉分子及び方法は、上述されている。同様に、固相増幅を使用して標的核酸分子に相補的な固定された伸長産物を産生する方法も上述されている。

【0230】

本発明の本態様によれば、固定された標的核酸分子またはその固定された伸長産物に、ヌクレオチド伸長反応プロセスを施す。ヌクレオチド伸長反応混合物は、ヌクレオチド三リン酸の集合体を含み、集合体中の各種類のヌクレオチド三リン酸は、（ｉ）異なる切断可能な蛍光標識基、及び（ｉｉ）後続のヌクレオチド三リン酸の添加を阻害する切断可能なブロッキング部分を有する。

【0231】

ヌクレオチド三リン酸のブロッキング部分は、その３’ＯＨ基への後続のヌクレオチド三リン酸の付加を直接ブロックすることができる。本実施形態では、リボースの２’－Ｏまたはデオキシリボースの３’－Ｏのヌクレオシド三リン酸に、ブロッキング部分を付加する。このようなヌクレオチド三リン酸は、蛍光ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓと同一であるか、または類似する（Ｊｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｏｕｒ－ｃｏｌｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ，” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３（５２）：１９６３５－４０（２００６）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。３’－Ｏブロッキング基の場合、文献に十分な実証例がいくつかあり、これにはアミノ基、アジドメチル基、及びシアノエチル基などを含むが、これらに限定されない。酵素の取り込み効率と脱ブロッキング工程時の除去しやすさを兼ね備えるように、基の具体的な特性を選択する必要がある。ブロッキング基の除去は、ブロッキング基の化学的特性に固有のものであるが、例として、プライマー－鋳型の二重鎖を保持し、プライマー－鋳型の二重鎖の溶解によるシグナルの損失を引き起こさない温度での穏やかな水性試薬（すなわち還元剤）の使用が挙げられる。

【0232】

あるいは、ヌクレオチド三リン酸のブロッキング部分は、その３’ＯＨ基への後続のヌクレオチド三リン酸の付加を不可逆的に阻害する。このようなブロッキング部分は、ヌクレオシドのＣ５またはＣ７位置、すなわちそれぞれピリミジンまたはプリンのヌクレオチド三リン酸に付加することができる。このようなヌクレオチド三リン酸は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ（商標）（ＬａｓｅｒＧｅｎ， Ｉｎｃ．）（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｌａｓｓ ｏｆ ３’ＯＨ Ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０（１５）：７４０４－１５（Ｍａｙ ２０１２）及びＬｉｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ３’－ＯＨ Ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ２ ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ Ａｌｋｙｌａｔｅｄ ＨＯＭｅｄＵ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９（６）：ｅ３９（２０１１）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、及びＶｉｒｔｕａｌ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）（Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｂｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｖｉｒｔｕａｌ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：５９３－５９５（２００３）、Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌの米国特許第８，０７１，７５５号、Ｓｉｄｄｉｑｉ ｅｔ ａｌの米国特許第８，１１４，９７３号、Ｓｉｄｄｉｑｉ ｅｔ ａｌのＷＯ ２００８／０１６９０７７。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）と同一であるか、または類似している。立体バルクもしくは電荷阻害または両方の組み合わせを利用する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、ｄＮＴＰの取り込みを阻害する化学部分を使用することができる。阻害部分の例は、Ｇｌｕ－ＧｌｕまたはＡｓｐ－Ａｓｐのジペプチドである。

【0233】

これらすべての実施形態において、遺伝子特異的プライマーを使用して、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを開始し、標的の固有の配列を決定することができる。一実施形態では、最初のネステッド増幅に使用される上流遺伝子座特異的プライマーは、シーケンシングプライマーとしても機能し得る。これらのプライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除されるため、不正確なプライマー結合による誤った読み取りの可能性が実質的に排除される。

【0234】

あるいは、遺伝子座特異的プライマーは、可変領域を含むように設計される。個別の標的に異なった可変領域が含まれることになり、さらにそれを個別のプライマーを使用してシーケンシングする。一実施形態では、第１の８～１６種のシーケンシングプライマーのセットは、共通の５’配列（１６塩基）及び可変３’配列（８塩基）を含む。または、第２の６４～２５６種のシーケンシングプライマーのセットは、共通の５’配列（８塩基）、中間の可変配列（８塩基、８～１６種の変異体）、及び超可変３’配列（８塩基、６４～２５６種の変異体）を含む。手法の一つは、スプリット＆プール合成戦略を使用することである。例として、１６種の変異体プライマーのファミリーの合成には、遺伝子座特異的３’領域を合成し、４つのアリコートに分割し、それぞれ４塩基を追加して、プールし、再び４アリコートに分割し、それぞれ４塩基を追加して、さらにプールし、最後に５’末端の１６塩基の共通配列と合成することを含む。３’側の最初の４塩基がＧＴＣＡ、ＡＣＴＧ、ＴＧＡＣ、及びＣＡＧＴであり、次の４塩基がＧＣＴＡ、ＡＴＣＧ、ＴＡＧＣ、及びＣＧＡＴであり、続いて５’側の１６塩基があると考えられる。このように、１６種のシーケンシングプライマーのセットを使用することで、各アンプリコンを一意にシーケンシングすると同時に、あるプライマーが不適合な相補体に結合することによるミスプライミングを最小限に抑えることができる。

【0235】

図３９は、マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である概略正面図である。この設計は、未知の病原体同定のための、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－シーケンシングの実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。図３９では、注入試料は大きな六角形チャンバー１１６（下部、初期反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバー１１６は、導管１２０によって六角形チャンバー１２２のセット（大トラフ１２４及びバッフル１２３を含む、一次ＰＣＲ反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバー１２２は、導管１２６によって細長い混合チャンバー１２８に流体接続され、混合チャンバーは、導管１３０によって、マイクロポアが含まれる細区画１３２のチャンバー（パネルの上部に４行のみを図示）に流体接続されている。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。カートリッジの製造時に、１つ以上のユニバーサルタグプライマーセットが行に予備充填され、そのうち１つのプライマーは固体支持体に固定され、他のプライマーは結合されるが、そのプライマーは高温で放出される。カートリッジの製造時に、マイクロウェルまたはマイクロポアの列へと至るチャンバーに、ユニバーサルタグ配列を５’末端にもつネステッドＰＣＲプライマーセットが予備充填されている。図の左側にある灰色の円１２５は、例えば音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティングによってプライマーセットが送達またはプリントされる可能性のある位置を示している。プライマーを乾燥させて、カートリッジのカバー部分を取り付け、プライマーセットを適切な位置に密閉する。カートリッジの使用時には、カートリッジの最初のチャンバーからカートリッジへ、最終的に各列が隣接する列から隔てられたマイクロウェルまたはマイクロポアの列まで反応物が流体移動する。この例図では、３，０７２個に相当する４８列及び６４行に計画された細区画を４つずつ示し、各細区画に２，７６０個のマイクロポア、アレイ合計で８，４７８，７２０個のマイクロポアが含まれる。この例では、最初のマルチプレックスＰＣＲ増幅（またはＲＮＡ標的の逆転写ＰＣＲ）を１０サイクル行い、元の各標的の最大１，０２４コピーが初期反応チャンバーで産生される。必要に応じて、新しいＰＣＲ試薬を追加し、最初のマルチプレックス反応物を一次ＰＣＲ反応チャンバー（上記のネステッドＰＣＲプライマーを予備充填）に分配する。この場合、各一次ＰＣＲ反応チャンバー内の元の各病原体標的の平均分配数は２０コピーである。場合により、ＲＮＡ塩基及び３’ブロッキング基を含むプライマーは、正しい標的に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によりブロックが解除されるため、追加の特異性が提供され、偽産物が回避される。ユニバーサルタグをもつ標的特異的プライマーを３２個組または６４個組のプライマーセットにして使用し、５サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり平均６４０コピーの各病原体特異的標的が産生される。ＵＤＧ／ＡＰＥ１を用いて産物からユニバーサルプライマー配列を除去し、マイクロポア内の固定されたプライマーへのハイブリダイゼーションを促進する一本鎖テールをＰＣＲ産物の片側に形成する。必要に応じて、新しいＰＣＲ試薬を追加し、各一次ＰＣＲ反応チャンバーのネステッドＰＣＲ産物と混合し、混合チャンバーへ、さらに各列のマイクロポアへと分配する。各マイクロポア内で１つ以上の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。各行の各細区画のユニバーサルプライマーは、正しいタグをもつ各列からの産物のみを増幅する。標的特異的またはユニバーサルタグ特異的シーケンシングプライマーのいずれかを追加する。ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを実行する。マイクロポア内のポアソン分布により標的配列を計数し、直接配列情報により変異病原体を特定する。

【0236】

図３９のカートリッジ設計はまた、未知の病原体同定のためのマルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－シーケンシングを実施する別の実施形態にも使用することができる。本実施形態では、すべてのマイクロポアに、固定された単一のユニバーサルプライマーが予備充填され、マイクロポアは乾燥される。すべての細区画に同一のプライマーが入っているため、列を通して、または他の方法で追加することができる。この例図では、３，０７２個に相当する４８列及び６４行に計画された細区画を４つずつ示し、各細区画に２，７６０個のマイクロポア、アレイ合計で８，４７８，７２０個のマイクロポアが含まれる。この例では、最初のマルチプレックスＰＣＲ増幅（またはＲＮＡ標的の逆転写ＰＣＲ）を１０サイクル行い、元の各標的の最大１，０２４コピーが初期反応チャンバーで産生される。必要に応じて、新しいＰＣＲ試薬を追加し、最初のマルチプレックス反応物を一次ＰＣＲ反応チャンバー（上記のネステッドＰＣＲプライマーを予備充填）に分配する。この場合、各一次ＰＣＲ反応チャンバー内の元の各病原体標的の平均分配数は２０コピーである。場合により、ＲＮＡ塩基及び３’ブロッキング基を含むプライマーは、正しい標的に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によりブロックが解除されるため、追加の特異性が提供され、偽産物が回避される。セットのうち１つのプライマーに８～１２個の固有のタグ配列をもち、５’末端に共通配列をもつ標的特異的プライマーを使用して、５サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり平均６４０コピーの各病原体特異的標的が産生される。ＵＤＧ／ＡＰＥ１を用いて産物からユニバーサルプライマー配列を除去し、マイクロポア内の固定されたプライマーへのハイブリダイゼーションを促進する一本鎖テールをＰＣＲ産物の片側に形成する。必要に応じて、新しいＰＣＲ試薬を追加し、各一次ＰＣＲ反応チャンバーのネステッドＰＣＲ産物と混合し、混合チャンバーへ、さらに各列のマイクロポアへと分配する。各マイクロポア内で１つ以上の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。各行の各細区画のユニバーサルプライマーは、正しいタグをもつ各列からの産物のみを増幅する。標的特異的プライマーか、または固有のタグ特異的部分をもつユニバーサルプライマーのいずれかをシーケンシングプライマーとして追加する。ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを実行する。マイクロポア内のポアソン分布により標的配列を計数し、直接配列情報により変異病原体を特定する。

【0237】

２，３０４個に相当する４８の二重列及び４８の二重行の細区画を使用する代替的実施形態では、各細区画は１１，０４０個のマイクロポアを含み、二重列あたり５２９，９２０個のマイクロポアを有する。最初に１０サイクルのＰＣＲで試料をマルチプレックス増幅すると、ウェルまたは初期反応チャンバー内に元の各病原体の最大１，０２４コピーが得られる。図５０に示すように、例えば音響液滴射出を使用して、最初のマルチプレックス産物を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配し、一次ＰＣＲ反応チャンバー内で遺伝子座特異的プライマー、緩衝液、及びポリメラーゼと混合する。各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーへの元の各病原体の平均分配数は２０コピーである。３２組のネステッドＰＣＲを２～３サイクル実行すると、元の各病原体標的の最大８０～１６０コピーが得られる。場合により、ＵＤＧ／ＡＰＥ１を用いて産物からユニバーサルプライマー配列を除去し、マイクロポア内の固定されたプライマーへの産物のハイブリダイゼーションを改善する。各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を５２９，９２０個のマイクロポアに分配する。各マイクロポア内で複数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを実行する。マイクロポア内のポアソン分布により標的配列を計数し、直接配列情報により変異病原体を特定する。

【0238】

図４０は、１つの標的鎖の変異をシーケンシング及び同定するためのプライマー設計の一実施形態を示す。本実施形態及び以下の実施形態では、元のゲノムセグメントに、例えば腫瘍特異的変異を含む、ｃｆＤＮＡのセグメント（約１６０ｂｐ）または断片化されたゲノムＤＮＡのセグメント（約１６０ｂｐ）が含まれる（図４０、工程Ａ）。試料を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。低存在量の変異に関して、各変異断片が異なる一次ＰＣＲ反応チャンバーに存在することが空間的分布により保証されることになる。したがって、２つ以上の一次ＰＣＲ反応チャンバーに変異が存在する場合、それがポリメラーゼエラーではなく真の変異である可能性が高い。標的配列を増幅するため、遺伝子座特異的ネステッドプライマーのペアを準備する。プライマーペアはそれぞれ、（ｉ）第１の遺伝子座特異的プライマーであって、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーと；（ｉｉ）プライマー配列全体に２つ以上のｄＵ塩基を有する第２の遺伝子座特異的プライマーであって、第２の５’共通配列部分またはタグ配列部分、断片識別子配列、ならびに遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーとで構成される。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除され、ポリメラーゼ介在性の伸長に適した３’ＯＨが解放される（図４０、工程Ｂ）。熱安定性ポリメラーゼ、好ましくは鎖置換ポリメラーゼを使用して、２サイクルまたは３サイクルのＰＣＲ増幅を実行する。この増幅サイクルにより、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、２つの遺伝子座特異的プライマー部分間の標的配列、内部断片識別子、及び第２の５’共通配列またはタグ配列の相補体が含まれる産物が産生される。産物中の元のプライマー及びプライマーの一部は、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）及び場合によりＡＰＥ１（ヒトアプリンエンドヌクレアーゼ；図４０、工程Ｃ）を使用して破壊される。その結果、各二本鎖増幅産物の一方の末端部分が一本鎖になる。一変形例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンがマイクロポアに含まれる場合もある。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している。（図４０、工程Ｄ）。別の変形例では、第２のタグ配列を含むビオチン化プライマーを一本鎖領域にアニールする。鎖置換ポリメラーゼが伸長し、断片の全長二本鎖コピーを形成する。伸長したビオチン化プライマーと遊離したビオチン化プライマーの両方が、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに捕捉されてマイクロポアに分配されるか、またはストレプトアビジンでコーティングされたマイクロポアに直接捕捉される。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンがマイクロポアに含まれる場合もある。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している（図示しないが、以下の図４１と同様）。

【0239】

図４１及び図４２は、重複断片にわたる１つの標的鎖の変異をシーケンシング及び同定するためのプライマー設計の実施形態を示す。試料を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。低存在量の変異に関して、各変異断片が異なる一次ＰＣＲ反応チャンバーに存在することが空間的分布により保証されることになる。重複する標的配列を増幅するため、重複領域（すなわち、がん特異的遺伝子の１つ以上のエクソン）にわたる遺伝子座特異的ネステッドプライマーのペアを準備する。プライマーペアはそれぞれ、（ｉ）第１の遺伝子座特異的プライマーであって、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーと；（ｉｉ）プライマー配列全体に２つ以上のｄＵ塩基を有する第２の遺伝子座特異的プライマーであって、第１の共通配列またはタグ配列とわずかに異なる第２の５’共通配列部分またはタグ配列部分、断片識別子配列、ならびに遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーとで構成される。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除され、ポリメラーゼ介在性の伸長に適した３’ＯＨが解放される（図４１、工程Ｂ）。熱安定性ポリメラーゼ、好ましくは鎖置換ポリメラーゼを使用して、２サイクルまたは３サイクルのＰＣＲ増幅を実行する。この増幅サイクルにより、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、２つの遺伝子座特異的プライマー部分間の標的配列、内部断片識別子、及び第２の５’共通配列またはタグ配列の相補体が含まれる、短い（プライマー二量体よりわずかに長い）産物及び長い産物（１００塩基以上の標的配列を含む）両方の重複産物が産生される。産物中の元のプライマー及びプライマーの一部は、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）及び場合によりＡＰＥ１（ヒトアプリンエンドヌクレアーゼ；図４１、工程Ｃ）を使用して破壊される。その結果、各二本鎖増幅産物の一方の末端部分が一本鎖になる。一変形例では、第２のタグ配列を含むビオチン化プライマーを一本鎖領域にアニールする。鎖置換ポリメラーゼが伸長し、断片の全長二本鎖コピーを形成する（図４１、工程Ｄ）。伸長したビオチン化プライマーと遊離したビオチン化プライマーの両方が、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに捕捉されてマイクロポアに分配されるか、またはストレプトアビジンでコーティングされたマイクロポアに直接捕捉される。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、長い方の産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンがマイクロポアに含まれる場合もある。短い産物はパンハンドルを形成するため、増幅されない。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している（図４１、工程Ｅ）。図４３の工程Ａは、短い産物ではなく長い産物がどのように増幅されるかを詳細に示している。別の変形例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、長い方の産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンがマイクロポアに含まれる場合もある。短い産物はパンハンドルを形成するため、増幅されない。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している。（図４２、工程Ｄ）。図４３の工程Ｂは、１つのプライマーを固定した場合に、短い産物ではなく長い産物がどのように増幅されるかを詳細に示している。

【0240】

図４４及び図４５は、重複断片にわたる１つの標的鎖の変異をシーケンシング及び同定するためのプライマー設計の一実施形態を示す。試料を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。低存在量の変異に関して、各変異断片が異なる一次ＰＣＲ反応チャンバーに存在することが空間的分布により保証されることになる。重複する標的配列を増幅するため、重複領域（すなわち、がん特異的遺伝子の１つ以上のエクソン）にわたる遺伝子座特異的ネステッドプライマーのペアを準備する。プライマーペアはそれぞれ、（ｉ）第１の遺伝子座特異的プライマーであって、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーと；（ｉｉ）プライマー配列全体に２つ以上のｄＵ塩基を有する第２の遺伝子座特異的プライマーであって、第２の５’共通配列部分またはタグ配列部分、断片識別子配列、ならびに遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーとで構成される。プライマーのペアは、重複するセットが反対の向きになるように、すなわち同じタグ配列をもつプライマーからは短い産物（ほぼプライマー二量体程度の大きさ）が生じ、２つの異なるタグ配列をもつプライマーからは長い産物が生じるように設計されている。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除され、ポリメラーゼ介在性の伸長に適した３’ＯＨが解放される（図４４、図４５、工程Ｂ）。熱安定性ポリメラーゼ、好ましくは鎖置換ポリメラーゼを使用して、２サイクルまたは３サイクルのＰＣＲ増幅を実行する。この増幅サイクルにより、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、２つの遺伝子座特異的プライマー部分間の標的配列、内部断片識別子、及び第２の５’共通配列またはタグ配列の相補体が含まれる、短い（プライマー二量体よりわずかに長く、同一のタグを含む）産物、及び１００塩基以上の標的配列を含む長い産物の両方の重複産物が産生される。産物中の元のプライマー及びプライマーの一部は、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）及び場合によりＡＰＥ１（ヒトアプリンエンドヌクレアーゼ；図４４、図４５、工程Ｃ）を使用して破壊される。その結果、各二本鎖増幅産物の一方の末端部分が一本鎖になる。一変形例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、長い方の産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンがマイクロポアに含まれる場合もある。短い産物は、第２のタグ配列が欠落しているか（図４４、工程Ｄ）、またはパンハンドルを形成しているため、増幅されず、さらに固体支持体に結合されない（図４５、工程Ｄ）。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している。（図４４及び図４５、工程Ｄ）。別の変形例では、第２のタグ配列を含むビオチン化プライマーを一本鎖領域にアニールする。鎖置換ポリメラーゼが伸長し、断片の全長二本鎖コピーを形成する。伸長したビオチン化プライマーと遊離したビオチン化プライマーの両方が、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに捕捉されてマイクロポアに分配されるか、またはストレプトアビジンでコーティングされたマイクロポアに直接捕捉される。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、長い方の産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンがマイクロポアに含まれる場合もある。短い産物は、第２のタグ配列が欠落しているか、またはパンハンドルを形成しているため、増幅されず、さらに固体支持体に結合されない。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している（図示しないが、図４１と同様）。

【0241】

図４６は、重複断片にわたる両方の標的鎖の変異をシーケンシング及び同定するためのプライマー設計の一実施形態を示す。試料を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。低存在量の変異に関して、各変異断片が異なる一次ＰＣＲ反応チャンバーに存在することが空間的分布により保証されることになる。重複する標的配列を増幅するため、重複領域（すなわち、がん特異的遺伝子の１つ以上のエクソン）にわたる遺伝子座特異的ネステッドプライマーのペアを準備する。プライマーペアはそれぞれ、（ｉ）プライマー配列全体に２つ以上のｄＵ塩基を有する第１の遺伝子座特異的プライマーであって、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、断片識別子配列、遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーと；（ｉｉ）プライマー配列全体に２つ以上のｄＵ塩基を有する第２の遺伝子座特異的プライマーであって、同一またはわずかに異なる第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、断片識別子配列、ならびに遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーとで構成される。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除され、ポリメラーゼ介在性の伸長に適した３’ＯＨが解放される（図４６、工程Ｂ）。熱安定性ポリメラーゼ、好ましくはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２サイクルまたは３サイクルのＰＣＲ増幅を実行する。この増幅サイクルにより、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、内部断片識別子、２つの遺伝子座特異的プライマー部分間の標的配列、別の内部断片識別子、及び第１の５’共通配列またはタグ配列と同一またはわずかに異なる相補体が含まれる、短い産物（ただし、上流プライマーからの伸長が、短い伸長産物と衝突することになるため、Ｔａｑポリメラーゼの５’－＞３’エキソヌクレアーゼ活性により大半が破壊される）、及び長い産物（１００塩基以上の標的配列を含む）両方の重複産物が産生される。産物中の元のプライマー及びプライマーの一部は、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）及び場合によりＡＰＥ１（ヒトアプリンエンドヌクレアーゼ；図４６、工程Ｃ）を使用して破壊される。その結果、各二本鎖増幅産物の両方の末端部分が一本鎖になる。一変形例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、長い方の産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンが含まれる場合もある。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している。（図４６、工程Ｅ）。別の変形例では、第１のタグ配列を含むビオチン化プライマーを一本鎖領域にアニールする。鎖置換ポリメラーゼが伸長し、各断片の両鎖の全長二本鎖コピーを形成する。第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される第３の遺伝子座特異的ネステッドプライマーのセットを追加する。第３の遺伝子座特異的プライマーのセットは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除され、ポリメラーゼ介在性の伸長、好ましくは鎖置換ポリメラーゼを使用した１～２回のＰＣＲサイクルに適する３’ＯＨが解放される。伸長したビオチン化プライマーと遊離したビオチン化プライマーの両方が、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに捕捉されてマイクロポアに分配されるか、またはストレプトアビジンでコーティングされたマイクロポアに直接捕捉される。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、長い方の産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンがマイクロポアに含まれる場合もある。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している。

【0242】

図４７は、ＳＮＰをシーケンシングして同定し、両方の遺伝子座鎖のコピー数を計数するためのプライマー設計の一実施形態を示している。試料を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。低存在量の変異に関して、各変異断片が異なる一次ＰＣＲ反応チャンバーに存在することが空間的分布により保証されることになる。ＳＮＰを含む標的配列を増幅するため、遺伝子座特異的プライマーのペアを準備する。プライマーペアはそれぞれ、（ｉ）プライマー配列全体に２つ以上のｄＵ塩基を有する第１の遺伝子座特異的プライマーであって、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、断片識別子配列、遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーと；（ｉｉ）プライマー配列全体に２つ以上のｄＵ塩基を有する第２の遺伝子座特異的プライマーであって、同一またはわずかに異なる第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、断片識別子配列、ならびに遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーとで構成される。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除され、ポリメラーゼ介在性の伸長に適した３’ＯＨが解放される（図４７、工程Ｂ）。熱安定性ポリメラーゼ、好ましくは鎖置換ポリメラーゼを使用して、３サイクルのＰＣＲ増幅を実行する。このような増幅サイクルにより、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、内部断片識別子、２つの遺伝子座特異的プライマー部分間の標的配列、別の内部断片識別子、及び第１の５’共通配列またはタグ配列と同一またはわずかに異なる相補体が含まれる産物が産生される。産物中の元のプライマー及びプライマーの一部は、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）及び場合によりＡＰＥ１（ヒトアプリンエンドヌクレアーゼ；図４７、工程Ｃ）を使用して破壊される。その結果、各二本鎖増幅産物の両方の末端部分が一本鎖になる。一変形例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンがマイクロポアに含まれる場合もある。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している。（図４７、工程Ｄ）。別の変形例では、第１のタグ配列を含むビオチン化プライマーを一本鎖領域にアニールする。鎖置換ポリメラーゼが伸長し、各断片の両鎖の全長二本鎖コピーを形成する。第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される第３の遺伝子座特異的ネステッドプライマーのセットを追加する。第３の遺伝子座特異的プライマーのセットは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除され、ポリメラーゼ介在性の伸長、好ましくは鎖置換ポリメラーゼを使用した１～２回のＰＣＲサイクルに適する３’ＯＨが解放される。伸長したビオチン化プライマーと遊離したビオチン化プライマーの両方が、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに捕捉されてマイクロポアに分配されるか、またはストレプトアビジンでコーティングされたマイクロポアに直接捕捉される。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンがマイクロポアに含まれる場合もある。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している（図示しないが、図４１と同様）。

【0243】

図４８は、マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である概略正面図である。この設計は、断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングを使用した、血漿中の低存在量の未知の変異の同定に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。図４８では、注入試料は、導管１２０によって六角形チャンバーのセット１２２（大トラフ１２４及びバッフル１２３を含む、一次ＰＣＲ反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバーは、導管１２６によって細長い混合チャンバー１２８に流体接続され、混合チャンバーは、導管１３０によって、マイクロポアの細区画２３２を含むチャンバー（パネルの上部に４行のみを図示）に流体接続されている。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。カートリッジの製造時に、固定された単一のユニバーサルプライマーがマイクロポアに予備充填され、マイクロポアは乾燥される。すべての細区画に同一のプライマーが入っているため、列を通して、または他の方法で追加することができる。カートリッジの使用時には、カートリッジへ、さらに最終的に各列が隣接する列から隔てられたマイクロウェルまたはマイクロポアの列まで反応物が流体移動する。この例図では、３，０７２個に相当する４８列及び６４行に計画された細区画を４つずつ示し、各細区画に２，７６０個のマイクロポア、アレイ合計で８，４７８，７２０個のマイクロポアが含まれる。この例では、初期血漿ＤＮＡ（最高レベルである１０，０００ゲノム相当）が緩衝液、酵素、断片識別子プライマーと混合され、均等に分割され、菱形チャンバーのセットに流体移動し、一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配される。各標的の平均分配数は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり２００コピーであり、最大１つの変異がある。場合により、ＲＮＡ塩基及び３’ブロッキング基を含むプライマーは、正しい標的に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によりブロックが解除されるため、追加の特異性が提供され、偽産物が回避される。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。トップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。ＵＤＧ／ＡＰＥ１を用いて産物からユニバーサルプライマー配列を除去し、マイクロポア内の固定されたプライマーへのハイブリダイゼーションを促進する一本鎖テールをＰＣＲ産物の片側または両側に形成する。必要に応じて、新しいＰＣＲ試薬を追加し、各一次ＰＣＲ反応チャンバーのＰＣＲ産物と混合し、混合チャンバーへ、さらに各列のマイクロポアへと分配する。標的特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各マイクロポア内で１つ以上の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。標的特異的プライマーか、または固有のタグ特異的部分をもつユニバーサルプライマーのいずれかをシーケンシングプライマーとして追加する。ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを実行する。約８０塩基の配列情報に加えて、１０塩基の固有の断片識別子バーコードを生成し、両方の鎖を検証しながら、各変異を正確に計数する。一実施形態では、７２個のシーケンシングプライマーを使用し、必要な場合には重複領域を含む、ワトソン鎖及びクリック鎖の両方について、３６個の標的領域をカバーする。必要に応じて、追加の７２個のシーケンシングプライマーを使用することができる。別の実施形態では、カートリッジは、４ラウンドのシーケンシング＝２８８プライマー、すなわち両方の鎖の１４４の標的領域をカバーして、各変異を正確に計数する余地をもつように設計される。別の実施形態では、元のネステッドプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。また、マスターの共通配列と、さらに異なる断片を固有にシーケンシングする３’末端の８～１２塩基とを含む共通配列の異なるセットで構成されるネステッドプライマーを設計することができ、それにより個々のシーケンシングプライマーあたり平均７２個の産物がシーケンシングされる。場合により、次のシーケンシングプライマーで次の７２個の断片のシーケンシングを繰り返す。

【0244】

代替的実施形態では、２，３０４個に相当する４８の二重列及び４８の二重行の細区画であり、各細区画が１１，０４０個のマイクロポアを含み、二重行あたり５２９，９２０個のマイクロポアを有する細区画を使用して、低存在量の変異を同定して計数する。図５０に示すように、例えば音響液滴射出を使用して、初期試料を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配し、４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバー内で遺伝子座特異的プライマー、緩衝液、及びポリメラーゼと混合する。血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝１０，０００ゲノム相当である。平均して、各標的は細区画あたり２００コピーであり、最大１つの変異がある。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。トップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理し、５２９，９２０個のマイクロポアをもつ区分（列）に産物を分配する。７５％が捕捉されると想定すると、所与の標的は区分（列）あたり約１２００コピーを有し、変異が存在する場合、「ワトソン鎖」が約３コピーと「クリック鎖」が約３コピー存在するはずである。標的特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各マイクロポア内で多数の産物をＰＣＲ増幅した後、固定されていない鎖を溶解させる。一実施形態では、２５６個のシーケンシングプライマーを追加し、必要な場合には重複領域を含む、ワトソン鎖及びクリック鎖の両方について、１２８個の標的領域をカバーする。約８０塩基の配列情報に加えて、１０塩基の固有の断片識別子バーコードを生成する。５２９，９２０個のマイクロポアのうち約３０７，２００個のマイクロポアで配列情報が生成され、これらの約７５％で、シーケンシングラウンドあたり１つのＰＣＲ産物からのリードが得られることになる。必要とされる標的領域をシーケンシングするために、さらに２５６個のシーケンシングプライマーを必要な頻度で追加する。一実施形態では、元のネステッドプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。別の実施形態では、マスターの共通配列と、さらに異なる断片を固有にシーケンシングする３’末端の８～１６塩基とを含む共通配列の異なるセットで構成されるネステッドプライマーを設計することができ、それにより個々のシーケンシングプライマーあたり平均２５６個の産物がシーケンシングされる。場合により、次のシーケンシングプライマーで次の２５６個の断片のシーケンシングを繰り返す。

【0245】

図４８に示す設計は、断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングを使用した、血漿中のトリソミーの非侵襲的出生前検査（ＮＩＰＴ）にも適している。基本的な考え方は、各鎖のコピーが存在する数を計数することである。一次ＰＣＲ反応チャンバーのそれぞれにおいて、ワトソン鎖がクリック鎖と一致する必要があるため（各鎖の一方と所与の断片から生成されるため）、これは鎖の欠失またはその他のエラーの内部標準となる。２番（対照）、１３番、１８番、２１番、Ｘ、及びＹ染色体の複数の固有の遺伝子座を使用して、コピー数を確定し、ならびにトリソミーまたは他の染色体コピーの変化を識別する。

【0246】

カートリッジの製造時に、固定された単一のユニバーサルプライマーがマイクロポアに予備充填され、マイクロポアは乾燥される。すべての細区画に同一のプライマーが入っているため、列を通して、または他の方法で追加することができる。カートリッジの使用時には、カートリッジへ、さらに最終的に各列が隣接する列から隔てられたマイクロウェルまたはマイクロポアの列まで反応物が流体移動する。この例図では、３，０７２個に相当する４８列６４行に計画された細区画を４つずつ示し、各細区画に２，７６０個のマイクロポア、アレイ合計で８，４７８，７２０個のマイクロポアが含まれる。この例では、初期血漿ＤＮＡ（２，０００ゲノム相当に調整）が緩衝液、酵素、断片識別子プライマーと混合され、均等に分割され、菱形チャンバーのセットに流体移動し、４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配される。各遺伝子座の平均分配数は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり４０コピーであり、異なるＳＮＰがある。場合により、ＲＮＡ塩基及び３’ブロッキング基を含むプライマーは、正しい標的に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によりブロックが解除されるため、追加の特異性が提供され、偽産物が回避される。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。トップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。ＵＤＧ／ＡＰＥ１を用いて産物からユニバーサルプライマー配列を除去し、マイクロポア内の固定されたプライマーへのハイブリダイゼーションを促進する一本鎖テールをＰＣＲ産物の両側に形成する。必要に応じて、新しいＰＣＲ試薬を追加し、各一次ＰＣＲ反応チャンバーのＰＣＲ産物と混合し、混合チャンバーへ、さらに各列のマイクロポアへと分配する。標的特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各マイクロポア内で１つ以上の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。標的特異的プライマーか、または固有のタグ特異的部分をもつユニバーサルプライマーのいずれかをシーケンシングプライマーとして追加する。ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを実行する。約５０塩基の配列情報に加えて、１０塩基の固有の断片識別子バーコードを生成し、両方の鎖を検証しながら、各ＳＮＰ及び染色体コピー数を正確に計数する。

【0247】

代替的実施形態では、ＮＩＰＴの染色体コピーの変化を同定するために、２，３０４個に相当する４８の二重列及び４８の二重行であり、各細区画が１１，０４０個のマイクロポアを含み、二重行あたり５２９，９２０個のマイクロポアを有する細区画を使用する。初期試料を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。血漿／試料中のＤＮＡを２，０００ゲノム相当に調整する。遺伝子座特異的プライマー、緩衝液、及びポリメラーゼと混合した初期試料を、図５０に示すように、例えば音響液滴射出を使用して、４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。平均して、各遺伝子座は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり４０コピーであり、異なるＳＮＰがある。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。トップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理して、各一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を５２９，９２０個のマイクロポアに分配する。７５％が捕捉されると想定すると、所与の遺伝子座は細区画あたり約２４０コピーを有することになる（ワトソン鎖で１２０とクリック鎖で１２０）。遺伝子座特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各ウェル内で多数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。一実施形態では、２，２０８個のシーケンシングプライマー（または１つのプライマー、以下を参照）を追加し、ワトソン鎖及びクリック鎖の両方について、１，１０４個の遺伝子座領域をカバーする。約５０塩基の配列情報に加えて、１０塩基の固有の断片識別子バーコードを生成する。必要に応じて、追加の２，２０８個のシーケンシングプライマー（または１つのプライマー、以下を参照）を追加する。上記の計算は、平均して約５０％のマイクロポアに充填されることを基準とする。（ポアソン分布：平均ラムダ＝０．４；初期比率ｘ＝０）。そのような条件下では、マイクロポアの約６０％は何もシーケンシングリードが得られず、約３０％は固有（すなわち単一リード）であり、約７．５％で二重リードが得られ、及び約１．３％で三重リードが得られることになる。実用レベルでは、ＳＮＰを区別するには単一リードが明確である。遺伝子座の決定には二重リードを使用できるが、ＳＮＰを区別するには二重リードを使用すべきではない。単一リードから二重リードまでで、９０％を超える鎖がカバーされ、またその分布は本質的にランダムであるため、初期試料に存在する各鎖の正確性の高い計数がこの手法で可能になるはずである。一実施形態では、元のネステッドプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。別の実施形態では、マスターの共通配列と、さらに異なる断片を固有にシーケンシングする３’末端の８～１６塩基とを含む共通配列の異なるセットで構成されるネステッドプライマーを設計することができ、それにより個々のシーケンシングプライマーあたり平均３６８個の産物がシーケンシングされる。次のシーケンシングプライマーで次の１，１０４個の断片のシーケンシングを繰り返す。

【0248】

臨床試料中のコピー数を正確に計数する能力には、補足的な用途もある。ＮＩＰＴの分野では、新規デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を検出する機会が生じることがある。この疾患は、ＤＭＤ遺伝子の一部の欠失により散発的に発生する場合がある。ＤＭＤにわたるＳＮＰと全エクソンの両方が網羅されるため、コピー損失の正確な評価が可能になる。

【0249】

コピー数とＳＮＰの両方を正確に計数する能力の別の実施形態は、最初は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）においてだが、最終的にはｃｆＤＮＡにおいても、ＬＯＨまたは遺伝子増幅を同定するためのものである。その患者の正常細胞の二倍体ゲノムのハプロタイプを決定することによって、この手法は容易になるが、これはバフィーコート画分（多形核白血球、ＰＭＮ）から単離されたＤＮＡからの標準的手法によって行うことができる。統計的有意性を達成するには十分なＤＮＡが必要となるが、簡潔には、所与の染色体アーム（すなわち８ｐ、がんでは欠失することが多い；または２０ｑ、がんで増加することが多い）で全ＳＮＰの一貫した過少計数または過剰計数がある場合、それは臨床試料におけるそのアームの減少または増加それぞれを示唆することになる。この手法は、血漿試料中の腫瘍由来ｃｆＤＮＡの比率に応じた、がんの検出において（すなわち、ｃｆＤＮＡにおいてＬＯＨの同定を試みる場合に）十分な感度をもつことができ、治療決定の指針、または療法の有効性の監視（すなわち、ＣＴＣからコピーの変化を直接評価する場合）に役立つ場合がある。

【0250】

図４９Ａ～４９Ｂは、断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングを使用した、血漿中の低存在量の未知の変異の同定；マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－シーケンシングを使用した、未知の病原体の同定；及び断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングを使用した、血漿中の低存在量のメチル化及び未知の変異の同定のための、カートリッジ１０４及びバルブ構成の概略側面図を示す。図４９Ａは、直径５ミクロンのマイクロポア２０２のアレイである細区画へのマイクロ流路の流体接続を示す概略正面図である。マイクロポアのアレイの下部には別の層２３８がある。簡潔にするため、図には、１つの初期マルチプレックス反応チャンバー１１０、（トラフ１１８を備える）１６個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１１６、（トラフ１２４及びバッフル１２３を備える）１６個の二次マルチプレックス反応チャンバー１２２、１６個の細い混合チャンバー１２８、ならびに１６列で数百万個のマイクロポアまたはマイクロウェルからなる細区画２３２を含む１つの主要チャンバーを例示している。示されるように、これらは導管１１４、１２０、１２６、及び１３０によって、共に結合されている。流体は、注入口１０２からカートリッジ１０４に入り、出口１０８から出る。ただし、チャンバーの他の構成も使用することができ、例えば、図４８に記載される病原体検出用のマルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－シーケンシングには、二次マルチプレックス反応チャンバーは必要としない。図４９Ｂは、数百万のミクロポア２０２を含むマイクロポアプレートを使用した、断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングの流体システムを示す。マイクロポアプレートは孔の両側から流体連通可能である。第１の側面２４４（プレートの上部、プレートの左側に図示）は、バルブ１、２、及び３と連通しており、対して第２の側面２４６（プレートの下部、プレートの右側に図示）は、バルブ４、５、及び６と連通している。バルブ１は、必要に応じて、初期反応チャンバー１１０、４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバー１１６、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、溶解／プロテアーゼ緩衝液、酵素、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、緩衝液、ＥｔＯＨ、軽油、及び重油を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。さらに、バルブ１は、バルブ３から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第１の側、他のチャンバー、一次ＰＣＲ反応チャンバー１１６、及び初期反応チャンバー１１０を空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。バルブ１は、バルブ２を選択することもできる。バルブ２は、初期マルチプレックス反応チャンバー、ＰＣＲ反応チャンバー、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、断片ＩＤ ＰＣＲプライマー、マスターＰＣＲミックス、マスターＵＤＧ／ＡＰＥ１緩衝液、ネステッド＆ユニバーサルプライマー、洗浄液、ＥｔＯＨ、及び空気を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。バルブ５は、マイクロポアプレートの第２の側にわたって、シーケンシングプライマーセット１、２、及び３、緩衝液、ＥＴＯＨ、空気、軽油、重油、ならびに廃棄物を分注し、バルブ６を経由して廃棄する。バルブ５は、バルブ４を選択することもできる。バルブ４は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ用のポリメラーゼ及び適切な蛍光標識ヌクレオチドを含む伸長ミックス、すすぎ緩衝液、イメージング緩衝液、切断緩衝液、及び洗浄液を分注する。さらに、バルブ１は、バルブ６から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第２の側を空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。

【0251】

（表６）断片識別子ＰＣＲ－シーケンシング用の試薬構成（変異）

【0252】

図４９Ｂは、初期マルチプレックス反応チャンバー１１０、２４～４８個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１１６、２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー１２２、ならびに２４～４８列で数千個のマイクロポアまたはマイクロウェルの細区画２３２を含む主要チャンバーに個別に加熱／冷却を施せるように設計されるいくつかの発熱体を示す。背面プレート２０６（前面プレート２０４の反対側）、またはマイクロポアもしくはマイクロウェルチャンバーの１つ以上の平面（複数可）、ならびに反応チャンバーを、これらの発熱体に押し付けることで、温度制御、加熱、及び／または熱サイクルが可能になる。図４９に示すように、２４～４８個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１１６及び２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー１２２の裏側にある２つの発熱体は、すべての一次チャンバーをすべての二次チャンバーとは独立して制御する２つの長方形（水平）ストリップとして設計される。代替構成を使用することもできる。例えば、初期反応チャンバー１１０、一次チャンバー１１６、二次チャンバー１１８、混合チャンバー１２０、ならびに数千のマイクロポアまたはマイクロウェルの細区画２３２を含む主要チャンバーのいずれかに、一次チャンバーごとに独立した発熱体がある、追加の行または発熱体を有する追加のチャンバー行（すなわち一次、二次、三次など）がある、及び／または行もしくは列とは異なる幾何形態で配置された２４～４８個の空間多重化を有する。代替構成も使用することができ、例えば最初のサイクルを制限したＰＣＲを、（ｉ）野生型ＤＮＡの伸長を抑制するブロッキングプライマーの有無を問わず、片側のマルチプレックスプライマーを線形伸長する、及び（ｉｉ）相補的プライマーを追加して、最初の伸長産物を１または２サイクルＰＣＲ増幅するという２つの工程に分割してもよい。別の例では、それぞれが個別の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１１６、個別の二次マルチプレックス反応チャンバー１２２、個別の混合チャンバー１２８、及び数千～数百万のマイクロポアまたはマイクロウェルの細区画２３２を含む個別のチャンバーと流体接続されている、２４個の個々の入力ウェルがプレートに含まれていてもよい。試料は、任意の初期マルチプレックス反応を受けた後、音響液滴射出または他の流体工学手段によって２４個の個別の入力ウェルに注入されてもよい。

【0253】

図４９のカートリッジ及びバルブ構成は、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－シーケンシングを使用した未知の病原体の同定に使用することもできる。この図は、数百万のマイクロポアを含むマイクロポアプレートを使用した、マルチプレックスＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－シーケンシングの流体システムを示す。マイクロポアプレートは孔の両側から流体連通可能である。第１の側面（プレート２４４の上部、プレートの左側に図示）は、バルブ１、２、及び３と連通しており、対して第２の側面（プレート２４６の下部、プレートの右側に図示）は、バルブ４、５、及び６と連通している。バルブ１は、必要に応じて、初期マルチプレックス反応チャンバー１１０、４８個のＰＣＲ反応チャンバー１１６、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、溶解／プロテアーゼ緩衝液、酵素、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、緩衝液、ＥｔＯＨ、軽油、及び重油を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。さらに、バルブ１は、バルブ３から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第１の側、他のチャンバー、一次ＰＣＲ反応チャンバー１１６、及び初期反応チャンバー１１０を空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。バルブ１は、バルブ２を選択することもできる。バルブ２は、初期反応チャンバー１１０、一次ＰＣＲ反応チャンバー１１６、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、初期マルチプレックスＰＣＲプライマー、マスターＰＣＲミックス、初期逆転写プライマー、マスター逆転写ミックス、マスターＵＤＧ／ＡＰＥ１緩衝液、ネステッド＆ユニバーサルプライマー、洗浄液、ＥｔＯＨ、及び空気を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。バルブ５は、マイクロポアプレートの第２の側にわたって、シーケンシングプライマーセット１、２、及び３、緩衝液、ＥＴＯＨ、空気、軽油、重油、ならびに廃棄物を分注し、バルブ６を経由して廃棄する。バルブ５は、バルブ４を選択することもできる。バルブ４は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ用のポリメラーゼ及び適切な蛍光標識ヌクレオチドを含む伸長ミックス、すすぎ緩衝液、イメージング緩衝液、切断緩衝液、及び洗浄液を分注する。さらに、バルブ１は、バルブ６から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第２の側を空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。

【0254】

（表７）ＰＣＲ－シーケンシング用の試薬構成（未知の病原体）

【0255】

図５０は、断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングを使用して、血漿中の低存在量の未知の変異を同定するための、注入口４０２及び出口４０８を備える代替カートリッジ４０４ならびにバルブ構成の概略図を示す。パネルＡは、直径５ミクロンのマイクロポアのアレイへのマイクロ流路の流体接続を示す概略正面図を示す。この構成は、上記の代替的実施形態、すなわち２，３０４個に相当する４８の二重列及び４８の二重行であり、各細区画が１１，０４０個のマイクロポアを含み、二重行あたり５２９，９２０個のマイクロポアを有する細区画を使用する場合のものである。これらの実施形態では、初期反応を個々のウェルまたは反応チャンバー４５２で実行し、その後、導管４５５経由で音響液滴射出を使用して、適切な試薬、酵素、緩衝液、標的、及び／または前増幅した標的を、マイクロポアを含む列を有する入力チャンバー及び細区画４３２へと至る開口部４５６に導管４５４経由で流入させる。その後、プレートは４つのバルブに流体連結される（パネルＣ）。細区画４３２を出た液体は、導管４５４から、チャンバー４６７、及び導管４５７を通って、出口４０５に至る。マイクロポアプレートは、流路２４０及び２４２経由で孔の両側から流体連通可能である。第１の側面２０６（プレートの上部に図示）は、バルブ１及び３と連通しており、対して第２の側面２０４（プレートの下部に図示）は、バルブ２及び４と連通している。バルブ１は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ用のポリメラーゼ及び適切な蛍光標識ヌクレオチドを含む伸長ミックス、すすぎ緩衝液、イメージング緩衝液、切断緩衝液、洗浄液、軽油、及びＥＴＯＨを分注する。バルブ２は、洗浄液、すすぎ緩衝液、切断緩衝液、ＥＴＯＨ、重油、及び空気を分注する。さらに、バルブ１は、バルブ４から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第２の側を空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。

【0256】

図５１は、１つの標的鎖のメチル化をシーケンシング及び同定するためのプライマー設計の一実施形態を示す。初期反応チャンバー内で、ｃｆＤＮＡをＢｓｈ１２３６Ｉで処理し（ＣＧ＾ＣＧ）、非メチル化ＤＮＡを完全に消化する。バイサルファイトで処理し、Ｃを５ｍｅＣではなくｄＵに変換し、鎖を非相補的にする。試料を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。低存在量のメチル化に関して、各メチル化断片が異なる一次ＰＣＲ反応チャンバーに存在することが空間的分布により保証されることになる。したがって、２つ以上の一次ＰＣＲ反応チャンバーにメチル化が存在する場合、それが不完全な切断またはバイサルファイト変換によるものではなく真のメチル化である可能性が高い。標的配列を増幅するため、遺伝子座特異的ネステッドプライマーのペアを準備する。プライマーペアはそれぞれ、（ｉ）第１の遺伝子座特異的プライマーであって、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーと；（ｉｉ）プライマー配列全体に２つ以上のｄＵ塩基を有する第２の遺伝子座特異的プライマーであって、第２の５’共通配列部分またはタグ配列部分、断片識別子配列、ならびに遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーとで構成される。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除され、ポリメラーゼ介在性の伸長に適した３’ＯＨが解放される（図５１、工程Ｂ）。熱安定性ポリメラーゼ、好ましくは鎖置換ポリメラーゼを使用して、２サイクルまたは３サイクルのＰＣＲ増幅を実行する。この増幅サイクルにより、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、２つの遺伝子座特異的プライマー部分間の標的配列、内部断片識別子、及び第２の５’共通配列またはタグ配列の相補体が含まれる産物が産生される。産物中の元のバイサルファイト変換されたＤＮＡ、プライマー、及びプライマーの一部は、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）及び場合によりＡＰＥ１（ヒトアプリンエンドヌクレアーゼ；図５１、工程Ｃ）を使用して破壊される。その結果、各二本鎖増幅産物の一方の末端部分が一本鎖になる。一変形例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンが含まれる場合もある。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している（図５１、工程Ｄ）。別の変形例では、第２のタグ配列を含むビオチン化プライマーを一本鎖領域にアニールする。鎖置換ポリメラーゼが伸長し、断片の全長二本鎖コピーを形成する。伸長したビオチン化プライマーと遊離したビオチン化プライマーの両方が、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに捕捉されてマイクロポアに分配されるか、またはストレプトアビジンでコーティングされたマイクロポアに直接捕捉される。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンがマイクロポアに含まれる場合もある。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している（図示しないが、図４１と同様）。

【0257】

図５２は、マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である概略正面図である。この設計は、断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングを使用した、血漿中の低存在量のメチル化及び未知の変異の同定に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。図５２では、注入試料は大きな六角形チャンバー１１０（下部、初期反応チャンバー）に注入口１１２経由で流体接続され、六角形チャンバー１１０は、導管１１４によって第１の六角形チャンバーのセット１１６（小トラフ１１８を含む、一次ＰＣＲ反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバー１１６は、導管１２０によって第２の六角形チャンバーのセット１２２（大トラフ１２４及びバッフル１２３を含む、二次反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバー１２２は、導管１２６によって細長い混合チャンバー１２８に流体接続され、混合チャンバーは、導管１３０によって、マイクロポアの細区画２３２を含むチャンバー（パネルの上部に４行のみを図示）に流体接続されている。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。カートリッジの製造時に、固定された単一のユニバーサルプライマーがマイクロポアに予備充填され、マイクロポアは乾燥される。すべての細区画に同一のプライマーが入っているため、列を通して、または他の方法で追加することができる。カートリッジの使用時には、カートリッジへ、さらに最終的に各列が隣接する列から隔てられたマイクロウェルまたはマイクロポアの列まで反応物が流体移動する。この例図では、３，０７２個に相当する４８列及び６４行に計画された細区画を４つずつ示し、各細区画に２，７６０個のマイクロポア、アレイ合計で８，４７８，７２０個のマイクロポアが含まれる。この例では、初期血漿ＤＮＡ（最高レベルである１０，０００ゲノム相当）は半分に分割され、第２の半量は一時的に保存される。第１の半量は緩衝液、酵素、断片識別子プライマーと混合され、均等に分割され、第１の菱形チャンバーのセットに流体移動し、４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配される。各標的の平均分配数は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり２００コピーであり、最大１つの変異がある。場合により、ＲＮＡ塩基及び３’ブロッキング基を含むプライマーは、正しい標的に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によりブロックが解除されるため、追加の特異性が提供され、偽産物が回避される。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。トップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。ＵＤＧ／ＡＰＥ１を用いて産物からユニバーサルプライマー配列を除去し、マイクロポア内の固定されたプライマーへのハイブリダイゼーションを促進する一本鎖テールをＰＣＲ産物の片側または両側に形成する。産物は二次反応チャンバーに流体移動し、初期のチャンバーは排出して洗浄される。第２の半量の試料は初期反応チャンバー内でＢｓｈ１２３６Ｉにより消化される。消化したＤＮＡをバイサルファイトで処理し、ＤＮＡ鎖を再精製する。バイサルファイト処理したＤＮＡをプライマー、試薬、及びポリメラーゼと混合し、第１の４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーのセットに分配する。制限エンドヌクレアーゼ切断後の血漿中の最高レベルのＤＮＡは、約２００ゲノム相当である。平均して、エンドヌクレアーゼ処理後、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり４コピーであり、最大１つのメチル化がある。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。元のメチル化ＤＮＡのトップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。ＵＤＧ／ＡＰＥ１を用いて産物からユニバーサルプライマー配列を除去し、一本鎖テールをＰＣＲ産物の片側または両側に形成する。このようなメチル化特異的一次ＰＣＲ産物は、二次反応チャンバー内で先の変異特異的産物と混合された後、長い（細い）混合チャンバーへと移動されると同時に、新鮮な緩衝液、プライマー、及びポリメラーゼと混合された後、最終的に各列のマイクロポアを含むチャンバーに産物が分配される。標的特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各マイクロポア内で１つ以上の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。標的特異的プライマーか、または固有のタグ特異的部分をもつユニバーサルプライマーのいずれかをシーケンシングプライマーとして追加する。ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを実行する。約８０塩基の配列情報に加えて、１０塩基の固有の断片識別子バーコードを生成し、両方の鎖を検証しながら、各変異を正確に計数する。一実施形態では、７２個のシーケンシングプライマーを使用して３６個の標的領域をカバーし、必要な場合には重複領域を含む、ワトソン鎖及びクリック鎖の両方において変異を同定及び検証する。必要に応じて、追加の７２個のシーケンシングプライマーを使用することができる。別の実施形態では、カートリッジは、４ラウンドのシーケンシング＝２８８プライマー、すなわち両方の鎖の１４４の標的領域をカバーして、各変異を正確に計数する余地をもつように設計される。別の実施形態では、元のネステッドプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。また、マスターの共通配列と、さらに異なる断片を固有にシーケンシングする３’末端の８～１２塩基とを含む共通配列の異なるセットで構成されるネステッドプライマーを設計することができ、それにより個々のシーケンシングプライマーあたり平均７２個の産物がシーケンシングされる。場合により、次のシーケンシングプライマーで次の７２個の断片のシーケンシングを繰り返す。一実施形態では、潜在的変異が含まれる領域と同じラウンドでメチル化領域をシーケンシングする。別の実施形態では、１回の独立したシーケンシングランでメチル化領域をカバーしており、すべてのメチル化領域を正確に計数して、理論上、２，７６０のメチル化領域をカバーすることができる。

【0258】

代替的実施形態では、２，３０４個に相当する４８の二重列及び４８の二重行の細区画であり、各細区画が１１，０４０個のマイクロポアを含み、二重行あたり５２９，９２０個のマイクロポアを有する細区画を使用して、低存在量のメチル化及び変異を同定して計数する。初期血漿試料を半分に分割した後、図５０に示すように、例えば音響液滴射出を使用して、半量を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配し、４８個の細区画内の遺伝子座特異的プライマー、緩衝液、及びポリメラーゼと混合する。血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝１０，０００ゲノム相当である。平均して、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり２００コピーであり、最大１つの変異がある。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。トップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理して、産物からユニバーサルプライマー配列を除去する。第２の半量の試料をウェルまたは初期反応チャンバー内で、Ｂｓｈ１２３６Ｉで消化する。消化したＤＮＡをバイサルファイトで処理し、ＤＮＡ鎖を再精製する。バイサルファイト処理したＤＮＡをプライマー、試薬、及びポリメラーゼと混合し、４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。制限エンドヌクレアーゼ切断後の血漿中の最高レベルのＤＮＡは、約２００ゲノム相当である。平均して、エンドヌクレアーゼ処理後、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり４コピーであり、最大１つのメチル化がある。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。元のメチル化ＤＮＡのトップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理して、産物からユニバーサルプライマー配列を除去する。各一次ＰＣＲ反応チャンバーからのメチル化及び変異標的産物を混合し、５２９，９２０個のマイクロポアに分配する。７５％が捕捉されると想定すると、所与の変異標的は区分（列）あたり約１２００コピーを有し、変異が存在する場合、「ワトソン鎖」が約３コピーと「クリック鎖」が約３コピー存在するはずである。７５％が捕捉されると想定すると、所与のメチル化標的は区分（列）あたり約１６コピーを有し、メチル化領域が存在する場合、「ワトソン鎖」が約３コピーと「クリック鎖」が約３コピー存在するはずである。標的特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各マイクロポア内で多数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。一実施形態では、２５６個のシーケンシングプライマーを追加し、必要な場合には重複領域を含む、ワトソン鎖及びクリック鎖の両方について、１２８個の標的領域をカバーする。約８０塩基の配列情報に加えて、１０塩基の固有の断片識別子バーコードを生成する。５２９，９２０個のマイクロポアのうち約３０７，２００個のマイクロポアで配列情報が生成され、これらの約７５％で、シーケンシングラウンドあたり１つのＰＣＲ産物からのリードが得られることになる。必要とする数の標的領域をシーケンシングするために、さらに２５６個のシーケンシングプライマーを必要な頻度で追加する。一実施形態では、元のネステッドプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。別の実施形態では、マスターの共通配列と、さらに異なる断片を固有にシーケンシングする３’末端の８～１６塩基とを含む共通配列の異なるセットで構成されるネステッドプライマーを設計することができ、それにより個々のシーケンシングプライマーあたり平均２５６個の産物がシーケンシングされる。場合により、次のシーケンシングプライマーで次の２５６個の断片のシーケンシングを繰り返す。一実施形態では、潜在的変異が含まれる領域と同じラウンドでメチル化領域をシーケンシングする。別の実施形態では、１回の独立したシーケンシングランでメチル化領域をカバーしており、すべてのメチル化領域を正確に計数して、理論上、１９，２００のメチル化領域をカバーすることができる。したがって、メチル化領域だけに対応するマスターの共通配列を使用すれば、この単一のプライマーによって、１回のランですべてのメチル化領域をカバーすることができる。

【0259】

図４９のカートリッジ及びバルブ構成は、断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングを使用した、血漿中の低存在量のメチル化及び未知の変異の同定のために使用することができる。この図は、数百万のマイクロポアを含むマイクロポアプレートを使用した、断片識別子ＰＣＲ－シーケンシングの流体システムを示す。マイクロポアプレートは孔の両側から流体連通可能である。第１の側面（プレートの上部、プレートの左側に図示）は、バルブ１、２、及び３と連通しており、対して第２の側面（プレートの下部、プレートの右側に図示）は、バルブ４、５、及び６と連通している。バルブ１は、必要に応じて、初期反応チャンバー、４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバー、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、溶解／プロテアーゼ緩衝液、酵素、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、緩衝液、ＥｔＯＨ、軽油、及び重油を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。さらに、バルブ１は、バルブ３から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第１の側、他のチャンバー、一次ＰＣＲ反応チャンバー、及び初期反応チャンバーを空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。バルブ１は、バルブ２を選択することもできる。バルブ２は、初期マルチプレックス反応チャンバー、ＰＣＲ反応チャンバー、及びマイクロポアプレートの第１の側にわたる追加チャンバーを通じて、断片ＩＤ ＰＣＲプライマー、マスターＰＣＲミックス、マスターＵＤＧ／ＡＰＥ１緩衝液、ネステッド＆ユニバーサルプライマー１、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、バイサルファイト、断片ＩＤ ＰＣＲプライマー２、ネステッド＆ユニバーサルプライマー２、洗浄液、ＥｔＯＨ、及び空気を分注し、バルブ３を経由して廃棄する。バルブ５は、マイクロポアプレートの第２の側にわたって、シーケンシングプライマーセット１、２、及び３、緩衝液、ＥＴＯＨ、空気、軽油、重油、ならびに廃棄物を分注し、バルブ６を経由して廃棄する。バルブ５は、バルブ４を選択することもできる。バルブ４は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ用のポリメラーゼ及び適切な蛍光標識ヌクレオチドを含む伸長ミックス、すすぎ緩衝液、イメージング緩衝液、切断緩衝液、及び洗浄液を分注する。さらに、バルブ１は、バルブ６から空気を逆方向に導入することにより、マイクロポアプレートの第２の側を空にするために使用できる廃棄口を選択することができる。

【0260】

（表８）断片識別子ＰＣＲ－シーケンシング用の試薬構成（変異及びメチル化）

【0261】

図４９Ｂは、初期マルチプレックス反応チャンバー１１０、２４～４８個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１１６、２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー１２２、ならびに２４～４８列で数千個のマイクロポアまたはマイクロウェルの細区画２３２を含む主要チャンバーに個別に加熱／冷却を施せるように設計されるいくつかの発熱体を示す。背面プレート、またはマイクロポアもしくはマイクロウェルチャンバーの１つ以上の平面（複数可）、ならびに反応チャンバーを、これらの発熱体に押し付けることで、温度制御、加熱、及び／または熱サイクルが可能になる。図４９に示すように、２４～４８個の一次マルチプレックスＰＣＲ反応チャンバー１１６及び２４～４８個の二次マルチプレックス反応チャンバー１２２の裏側にある２つの発熱体は、すべての一次チャンバーをすべての二次チャンバーとは独立して制御する２つの長方形（水平）ストリップとして設計される。例えば、初期マルチプレックス反応チャンバー１１０、一次チャンバー１１６、二次チャンバー１２２、混合チャンバー１２８、ならびに数千のマイクロポアまたはマイクロウェルの区画２３２を含む主要チャンバーのいずれかに、一次チャンバーごとに独立した発熱体がある代替構成、追加の行または発熱体を有する追加のチャンバー行（すなわち一次、二次、三次など）がある代替構成、及び／または行もしくは列とは異なる幾何形態で配置された２４～４８個の空間多重化を有する代替構成も使用することができる。代替構成も使用することができ、例えば、Ｂｓｈ１２３６Ｉ選択プロセスの代わりに、メチル化ＤＮＡにメチル特異的結合タンパク質または抗体を使用するために、メチル化ＤＮＡを濃縮する。この工程は、カートリッジ内で行うことも、またはメチル濃縮されたＤＮＡをカートリッジに入れる前に行うこともできる。バイサルファイト処理後の最初のサイクルを制限したマルチプレックスＰＣＲは、（ｉ）非メチル化ＤＮＡＤＮＡの伸長を抑制するブロッキングプライマーの有無を問わず、片側のマルチプレックスプライマーを線形伸長する、及び（ｉｉ）相補的プライマーを追加して、最初の伸長産物を１または２サイクルＰＣＲ増幅するという２つの工程に分割してもよい。

【0262】

図５３は、低存在量及び中存在量のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びスプライス変異体をシーケンシングするためのプライマー設計の一実施形態を示す。逆転写酵素を使用して、初期反応チャンバー内で３’転写産物特異的プライマーによりｃＤＮＡコピーを作製する（図５３、工程Ａ）。試料を２４個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。転写産物配列を増幅するため、転写産物特異的ネステッドプライマーのペアを準備する。プライマーペアはそれぞれ、（ｉ）第１の遺伝子座特異的プライマーであって、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーと；（ｉｉ）プライマー配列全体に２つ以上のｄＵ塩基を有する第２の遺伝子座特異的プライマーであって、第２の５’共通配列部分またはタグ配列部分、転写産物識別子配列、ならびに遺伝子座特異的３’部分、３’末端のリボヌクレオチドなどの切断可能な塩基及びブロッキング基で構成される上記のプライマーとで構成される。遺伝子座特異的プライマーは、ｃＤＮＡまたは相補体に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除され、ポリメラーゼ介在性の伸長に適した３’ＯＨが解放される（図５３、工程Ｂ）。熱安定性ポリメラーゼ、好ましくは鎖置換ポリメラーゼを使用して、２サイクルまたは３サイクルのＰＣＲ増幅を実行する。この増幅サイクルにより、第１の５’共通配列部分またはタグ配列部分、２つの遺伝子座特異的プライマー部分間の転写産物配列、内部転写産物識別子、及び第２の５’共通配列またはタグ配列の相補体が含まれる産物が産生される。産物中の元のプライマー及びプライマーの一部は、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）及び場合によりＡＰＥ１（ヒトアプリンエンドヌクレアーゼ；図５３、工程Ｃ）を使用して破壊される。その結果、各二本鎖増幅産物の一方の末端部分が一本鎖になる。一変形例では、固定された第２のタグ配列プライマーを含むマイクロポアに産物を、またはマイクロポアにビーズを分配する。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のウェルには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、そのポアに異なる領域からの複数のクローンアンプリコンが含まれる場合もある。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している（図５３、工程Ｄ）。別の変形例では、第２のタグ配列を含むビオチン化プライマーを一本鎖領域にアニールする。鎖置換ポリメラーゼが伸長し、断片の全長二本鎖コピーを形成する。伸長したビオチン化プライマーと遊離したビオチン化プライマーの両方が、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに捕捉されてマイクロポアに分配されるか、またはストレプトアビジンでコーティングされたマイクロポアに直接捕捉される。第１及び第２のタグプライマーの両方が存在する場合、産物はマイクロポア内でＰＣＲ増幅される。その結果、所与のマイクロポアには一般に、所与の領域のゼロまたは１つのクローン増幅物が含まれるが、異なる領域からの複数のクローンアンプリコンが含まれる場合もある。変性、及び未結合断片の除去後に残存する係留された一本鎖標的ＤＮＡは、プライマー誘導シーケンシングに適している（図示しないが、図４１と同様）。

【0263】

図５４は、マイクロウェルまたはマイクロポアを含むチャンバーに液体を流体移動させることを可能にするプレチャンバー充填の例示的な設計の一部である概略正面図である。この設計は、希少及び過剰発現両方のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライス変異体、または遺伝子融合体を計数するためのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－ＵｎｉＴａｑ検出の実行に適したチャンバー構造とマイクロウェルまたはマイクロポアを示している。（あるいは、標的特異的Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブを用いた、マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ－ネステッドＰＣＲ－リアルタイムＰＣＲ）。注入試料は注入口１２から大きな六角形チャンバー１０（下部、初期反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバー１０は、導管１４によって、第１の六角形チャンバーのセット１６（８個おきに、それぞれ大トラフ１８ｃ、中トラフ１８ｂ、及び小トラフ１８ａを含む（図５４には大トラフ１８ａを含むものを示す）、一次ＰＣＲ反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバー１６は、導管２０によって、第２の六角形チャンバーのセット２２（２個おきに、それぞれ大トラフ２４ａ及び小トラフ２４ｂを含む、二次反応チャンバー）に流体接続され、六角形チャンバー２２は、導管２６によって細長い混合チャンバー２８に流体接続され、混合チャンバーは、導管３０によって、マイクロウェルまたはマイクロポアの細区画３２が含まれるチャンバー（パネルの上部に４行のみを図示）に流体接続されている。図は縮尺通りではなく、例示を目的とする。カートリッジの製造時に、１～４種のＵｎｉＴａｑプライマーセット（または代わりに、標的特異的なＴａｑｍａｎ（商標）プローブを備えた１～４種のユニバーサルタグプライマー）を行に予備充填する。カートリッジの製造時に、マイクロウェルまたはマイクロポアの列へと至るチャンバーに、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグ配列のいずれかを５’末端にもつネステッドＰＣＲプライマーセットが予備充填されている。図の左側にある灰色の円１７は、例えば音響液滴射出、毛細管、インクジェット、またはクイル式プリンティングによってプライマーセットを送達またはプリントすることが可能な位置を示している。プライマーを乾燥させて、カートリッジのカバー部分を取り付け、プローブセットを適切な位置に密閉する。カートリッジの使用時には、カートリッジの最初のチャンバーからカートリッジへ、最終的に各列が隣接する列から隔てられたマイクロウェルまたはマイクロポアの列まで反応物が流体移動する。この例図では、３，０７２個に相当する計画された４８列４つ、６４行８つの細区画を示し、各細区画に２，７６０個のマイクロポア、アレイ合計で８，４７８，７２０個のマイクロポアが含まれる。この例では、最初のマルチプレックス逆転写ＰＣＲを９サイクル行い、元の各転写産物の最大５１２コピーが初期反応チャンバーで産生される。最初のマルチプレックス産物を一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。この場合、各一次ＰＣＲ反応チャンバーへの元の各転写産物の平均分配数は２０コピーである。ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグをもつ標的特異的プライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、１０サイクルのネステッドＰＣＲを実行する。各一次ＰＣＲ反応チャンバーは、排出後も一定比率の液体量を保持するように設計されている。３サイクルの充填と排出を実行して、産物を別々に希釈する。各一次ＰＣＲ反応チャンバーからの産物を、２つの二次反応チャンバーに希釈する。各二次反応チャンバーは、排出後も一定比率の液体量を保持するように設計されている。２サイクルの充填と排出を実行して、産物を別々に希釈する。ネステッドＰＣＲ産物を混合チャンバーへ、さらに各列のマイクロポアへと分配する。各行のユニバーサルまたはＵｎｉＴａｑプライマーは、正しいタグをもつ各列からの産物のみを増幅する。マイクロポア内のポアソン分布により、低コピー、中コピー、及び高コピーのｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライス変異体、または遺伝子融合体を計数する。

【実施例】

【0264】

仮想実施例１－未知の病原体の同定及び定量のためのＰＣＲ－ＰＣＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）またはＰＣＲ－ＰＣＲ Ｕｎｉｔａｑ検出の使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが２４、及び列あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが３８４である、２４×１６＝３８４（または場合により７６８）個の細区画を備える９，２１６マイクロウェルまたはマイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する（事前にスポットされたアレイを使用）：図１６、図１７、図１８、及び図２４を参照のこと。

【0265】

アッセイは、３８４個、７６８個、または１，５３６個の潜在的標的を検出及び定量するように設計される場合がある。カートリッジを準備するにあたり、カートリッジを組み立てる前に、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグプライマー及び標的特異的プローブセットが垂直に追加されたアレイの前面に１６個、３２個、または６４個いずれかのネステッドＰＣＲプライマーペアを２４箇所スポットし、乾燥させる必要がある。

【0266】

１．試料の初回マルチプレックス増幅－潜在的標的が３８４個、７６８個、または１５３６個。初期反応チャンバーで９サイクルのマルチプレックスＰＣＲを実行し、元の各病原体の最大５１２コピーを得る。必要に応じて、「タンデム」ＰＣＲプライマーを使用する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべてのＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる場合がある。

【0267】

２．最初のマルチプレックス産物を２４個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。各一次ＰＣＲ反応チャンバーへの元の各病原体標的の平均分配数は２０コピーである。ＵｎｉＴａｑテールをもつプライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、５サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、元の各病原体の最大６４０コピーが得られる。

【0268】

３．各一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を３８４個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配する。平均して、各細区画（２４個のマイクロウェルまたはマイクロポアを含む）に元の各病原体が４０コピー得られ、所与の１ウェルに元の病原体が１または２コピー得られることになる。存在する病原体の数が多くなると、各細区画に追加のコピーが得られることになる。ＵｎｉＴａｑプライマーセットを使用して各ウェル内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。２４個のマイクロウェルまたはマイクロポア（細区画あたり）のポアソン分布では、最初に低存在量で存在する病原体特異的標的を計数するが、２４個のマイクロウェルまたはマイクロポア（細区画あたり）にわたるＣｔ値は、最初に高存在量で存在する病原体特異的標的の概算のコピー情報を提供することになる。

【0269】

注１：特にネステッドプライマーを使用する場合、このアッセイ形式の成否は、ＵｎｉＴａｑプライマーによってプライマー二量体が形成されないかどうかによる。３’ブロックされたＵｎｉＴａｑプライマーと、ＲＮＡ塩基のブロックを解除するＲＮａｓｅＨ２を使用すると、この問題が解決すると考えられる（図１７を参照）。同じ３’ブロック／ＲＮａｓｅの手段をネステッドプライマーセットにも使用できるが、病原体の配列のずれがプライマーによる特定の標的の増幅を妨げる可能性があるため、ネステッドプライマーの効果が減少するリスクがわずかながら存在する。

【0270】

注２：プライマー二量体からの標的非依存性シグナルを回避する追加手法は、タグ領域に部分標的配列を含むネステッドプライマーを使用し、５’－３’ヌクレアーゼ活性を欠く鎖置換ポリメラーゼを使用して標的内の相補領域を増幅することである。ＵｎｉＴａｑ増幅工程後、二本鎖産物を変性すると、標識産物はクローバー型構造を形成して、プローブのＲＮＡ塩基は二本鎖型になり、ＲＮａｓｅＨ２による蛍光基の遊離に適したものになる（図１８を参照）。ただし、病原体の非存在下でプライマー二量体が形成される場合、産物の病原体特異的配列がないため、クローバー型構造が形成されず、したがってＲＮａｓｅＨ２による切断もされない。ウイルス病原体の場合には、標的の配列のずれが、目的とするクローバー型構造の形成を妨げる可能性があるため、このようなプライマーが標的を特定する効果が減少し得るリスクがわずかながら存在することに留意されたい。

【0271】

注３：ＲＮＡウイルスの場合、最初に逆転写酵素工程を加えるか、または増幅緩衝液にＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ及びＭｎ２＋を使用して、シングルステップのＲＴ－ＰＣＲを行うことができる。また、試料を分割して、１つのアリコートを潜在的なＲＮＡ標的の増幅（例えば１０サイクル）に使用し、第２のアリコートを潜在的な低レベルの細菌標的の増幅（例えば２０サイクル）に使用できる点にも留意されたい。その後、２つの別々のＰＣＲ増幅産物を混合し、ＰＣＲ緩衝液で希釈して、２４個の細区画に分配し、ネステッドＰＣＲ反応に供する。

【0272】

注４：ＵｎｉＴａｑプライマーを使用する一つの利点は、それらを互いに極めて近接して配置できるため、単一の初期標的アンプリコンから複数のネステッド産物を産生できることである。その結果、各病原体に対する２、３、または４つの初期標的と、それに続く各標的断片内部の２、３、または４つのネステッドプライマーセットを含むプライマー設計が可能になる。４～１６個の可能性のあるシグナルのうち最小限２つまたは３つが観察された場合にのみ病原体が陽性とみなされることになる。この手法のもう一つの利点は、最初のマルチプレックス反応においてＰＣＲプライマーの数が制限されていることである。さらなる利点は、これらのシグナルが異なる細区画に表示されるようにプライマーを設計することで、何らかの標的非依存性（偽）シグナルを低減できることである。

【0273】

仮想実施例２－未知の病原体の同定及び定量のためのＰＣＲ－ＰＣＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）またはＰＣＲ－ＰＣＲ Ｕｎｉｔａｑ検出の使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロウェルが９６、及び列あたりのマイクロウェルが４，６０８である、４８×４８＝２，３０４個の細区画を備える２２１，１８４６マイクロウェルアレイ形式用のカートリッジを使用する（マイクロタイターアレイプレートへ音響液滴射出）：図１６、図１７、及び図１８を参照のこと。

【0274】

アッセイは、５７６個または１，１５２個の潜在的標的を検出及び定量するように設計される場合がある。マイクロタイタープレートを準備するにあたり、マイクロタイタープレートを使用する前に、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグプライマー及び標的特異的プローブセットを追加し、それらを乾燥させることが必要になる。

【0275】

１．試料の初回マルチプレックス増幅－潜在的標的が５７６個または１，１５２個。ウェルまたは初期反応チャンバー内で、１０サイクルのマルチプレックスＰＣＲを実行し、元の各病原体の最大１，０２４コピーを得る。必要に応じて、「タンデム」ＰＣＲプライマーを使用する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべてのＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる場合がある。

【0276】

２．最初のマルチプレックス産物を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーへの元の各病原体標的の平均分配数は２０コピーである。ＵｎｉＴａｑテールをもつプライマーを２４個組または４８個組のプライマーセットにして使用し、３～４サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、元の各病原体の最大１６０～３２０コピーが得られる。

【0277】

３．各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を、９６個のマイクロウェルを備える、それぞれ２４個２セットまたは１２個４セットの細区画に分配する。２セットを使用する場合、第２のセットは第１のセットの１００／１希釈である。４セットを使用する場合、各セットは前のセットの２０／１希釈である。これにより、大きな規模にわたって存在する病原体の網羅が可能になる。平均して、最初の各細区画に元の各病原体が１２コピー得られ、所与の１マイクロウェルに元の病原体が１または０コピー得られることになる。存在する病原体の数が多くなると、各細区画に追加のコピーが得られることになる。事前にスポットされたＵｎｉＴａｑプライマーセットを使用して各マイクロウェル内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロウェル内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。２セットまたは４セットの希釈物にわたる９６マイクロウェルのポアソン分布により、試料中の病原体コピー数が非常に多い場合はもとより、病原体コピー数が非常に少ない場合でも、ある程度の計数が可能になる。

【0278】

上記実施例１の注１～４も参照のこと。

【0279】

仮想実施例３－未知の病原体の同定及び定量のためのＰＣＲ－ＬＤＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）、ＰＣＲ－ＬＤＲ Ｕｎｉｔａｑ、またはＰＣＲ－ＬＤＲ－スプリットＵｎｉＴａｑ（ＵｎｉＳｐＴｑ）検出の使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが２４、及び列あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが３８４である、２４×１６＝３８４（または場合により７６８）個の細区画を備える９，２１６マイクロウェルまたはマイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する（事前にスポットされたアレイを使用）：図１９、図２０、図２１、及び図２４を参照のこと。

【0280】

アッセイは、３８４個、７６８個、または１，５３６個の潜在的標的を検出及び定量するように設計される場合がある。カートリッジを準備するにあたり、カートリッジを組み立てる前に、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグプライマー及び標的特異的プローブセットが垂直に追加されたアレイの前面に１６個、３２個、または６４個いずれかのＬＤＲプライマーペアを２４箇所スポットし、乾燥させる必要がある。

【0281】

１．試料の初回マルチプレックス増幅－潜在的標的が３８４個、７６８個、または１５３６個。初期反応チャンバー内で、３０サイクルのＰＣＲを実行し、元の各病原体を最大限に増幅させる。必要に応じて、「タンデム」ＰＣＲプライマーを使用する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべてのＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる必要がある。

【0282】

２．最初のマルチプレックス産物を２４個の一次ＬＤＲ反応チャンバーに分配すると同時に１０倍に希釈する。各一次ＬＤＲ反応チャンバーへの元の各病原体標的の平均分配数は数百万コピーになる。ＵｎｉＴａｑテールをもつアレル特異的プライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、２０サイクルのＬＤＲを実行する。

【0283】

３．各一次ＬＤＲ反応チャンバーのＬＤＲ産物を３８４個のマイクロポアに分配する。ＵｎｉＴａｑプライマーセットを使用して各ウェル内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。２４個のマイクロウェルまたはマイクロポア（細区画あたり）にわたるＣｔ値は、最初に高存在量で存在する病原体特異的標的の概算のコピー情報を提供する。

【0284】

注１：このアッセイ形式の成否は、ＵｎｉＴａｑプライマーによって、例えば下流ＬＤＲプライマーとのプライマー二量体が形成されないかどうかによる。この問題を以下のように解決した：元の試料に偶発的なキャリーオーバー汚染があれば、それを破壊するＵＤＧを初期ＰＣＲ反応物に含め、ＰＣＲ産物にｄＵＴＰを組み込む。ＬＤＲ後、ＵｎｉＴａｑマスターミックスにＵＤＧを含有し、ＰＣＲ産物があればすべて破壊することにより、ＬＤＲ産物からの増幅のみが可能になる。（図１９及び図２０も参照）。

【0285】

注２：最後の増幅工程にＵｎｉＴａｑプライマーを使用する場合、単純なプローブ設計（図２０）またはスプリットプローブ設計（図２１）のいずれかを使用して実行することができる。下流のライゲーションプライマーからの伸長産物が上流のＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ ＵｎｉＴａｑタグプライマーとプライマー二量体を形成する場合、元のプローブ設計では、ライゲーション非依存性プライマー二量体が形成される可能性がある（図２０）。プライマー二量体の問題は、図２１に示すスプリットプローブ設計を使用して対処することができる。ＵｎｉＴａｑ増幅工程後、二本鎖産物を変性すると、標識産物はステムループ構造を形成して、Ｔａｑポリメラーゼの５’－３’ヌクレアーゼ活性によってプライマーＣｉが伸長し、蛍光基を遊離してシグナルを生成することが可能になる。ポリメラーゼが第１のステム領域を通過するとすぐに第２の短い（ｚｉ－ｚｉ’）ステムは破断し、ポリメラーゼは伸長を続け、ｄｓＤＮＡ産物を生成する。下流のライゲーションプライマーからの伸長産物と上流のＦ１－Ｂｉ－Ｑ－Ａｉ ＵｎｉＴａｑタグプライマーとにより生じた、ライゲーション非依存性プライマー二量体産物が存在する場合、その産物はｚｉ配列を欠いており、その結果、完全なステムループ構造を形成しないことになる。したがって、Ｃｉが伸長しても、Ｂｊプローブ領域はＢｊ’配列にハイブリダイズされず、蛍光基（Ｆ１）が消光基（Ｑ）から遊離することがない。

【0286】

注３：ＲＮＡウイルスの場合、最初に逆転写酵素工程を加えるか、または増幅緩衝液にＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ及びＭｎ２＋を使用して、シングルステップのＲＴ－ＰＣＲを行うことができる。また、試料を分割して、１つのアリコートを潜在的なＲＮＡ標的の増幅（例えば３０サイクル）に使用し、第２のアリコートを潜在的な低レベルの細菌標的の増幅（例えば４０サイクル）に使用できる点にも留意されたい。その後、２つの別々のＰＣＲ増幅産物を混合し、ＬＤＲ緩衝液で希釈して、２４個の二次ＬＤＲ反応チャンバーに分配し、ＬＤＲ反応に供する。

【0287】

注４：ＬＤＲプライマーを使用する一つの利点は、それらを互いに極めて近接して配置できるため、単一の初期標的アンプリコンから、重複していても複数のＬＤＲ産物を産生できることである。その結果、各病原体に対する２、３、または４つの初期標的と、それに続く各標的断片内部の２、３、または４つのＬＤＲプライマーセットを含むプライマー設計が可能になる。４～１６個の可能性のあるシグナルのうち最小限２つまたは３つが観察された場合にのみ病原体が陽性とみなされることになる。この手法のもう一つの利点は、最初のマルチプレックス反応においてＰＣＲプライマーの数が制限されていることである。さらなる利点は、これらのシグナルが異なる細区画に表示されるようにプライマーを設計することで、何らかの標的非依存性（偽）シグナルを低減できることである。

【0288】

仮想実施例４－未知の病原体の同定及び定量のための、ユニバーサルまたは標的特異的プローブ（例えばＵｎｉＬＤｑまたはＴｓＬＤｑ）を用いたＰＣＲ－ＰＣＲ－ｑＬＤＲ検出またはＰＣＲ－ｑＬＤＲ検出の使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが２４、及び列あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが３８４である、２４×１６＝３８４（または場合により７６８）個の細区画を備える９，２１６マイクロウェルまたはマイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する（事前にスポットされたアレイを使用）：図２２及び図２３を参照のこと。

【0289】

アッセイは、３８４個、７６８個、または１，５３６個の潜在的標的を検出及び定量するように設計される場合がある。カートリッジを準備するにあたり、カートリッジを組み立てる前に、ｑＬＤＲプライマー及びプローブセットが垂直に追加されたアレイの前面に１６個、３２個、または６４個いずれかのネステッドＰＣＲプライマーペアを２４箇所スポットし、乾燥させる必要がある。

【0290】

１．試料の初回マルチプレックス増幅－潜在的標的が３８４個、７６８個、または１５３６個。初期反応チャンバー内で、１０～１５サイクルのＰＣＲを実行し、元の各病原体標的を１，０００～３２，０００倍に増幅する。必要に応じて、「タンデム」ＰＣＲプライマーを使用する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべてのＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる必要がある。

【0291】

２．最初のマルチプレックス産物を２４個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配すると同時に１０倍に希釈する。各一次ＰＣＲ反応チャンバーへの元の各病原体標的の平均分配数は４～１３０コピーになる。上記のプライマーまたはネステッドプライマーいずれかのサブセットを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、２０～３０サイクルのＰＣＲを実行する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべてのＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる必要がある。

【0292】

３．各一次ＰＣＲ反応チャンバーのＰＣＲ産物を３８４個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配する。下記のプライマーセットを使用して各ウェル内で１、２、または４つの潜在的な産物をｉＬＤＲ（「ｉ」は等温を意味する）増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。

【0293】

未知の細菌病原体を血液から直接同定するための代替法（ＰＣＲ－ｑＬＤＲ検出を使用）：
１．初期試料を２４個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。潜在的標的が３２個、６４個、または１２８個である試料の初回マルチプレックス増幅を行う。３０～４０サイクルのマルチプレックスＰＣＲを実行し、存在する場合、元の各標的の数十億コピーを得る。「タンデム」以上のＰＣＲプライマーセットを使用する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべてのＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１２塩基の同じ５’テール配列が含まれる。

【0294】

２．各一次ＰＣＲ反応チャンバーのＰＣＲ産物を３８４個のマイクロポアに分配する。下記のプライマーセットを使用して各ウェル内で１、２、または４つの潜在的な産物をｉＬＤＲ（ｉは等温を意味する）増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。

【0295】

注１：ＵｎｉＴａｑを使用して蛍光シグナルを生成する代わりに、「ｉＬＤＲ」（ｉは等温を意味する）という名称の新しい手法を導入する（図２２及び図２３を参照）。この手法の第１の変形例では、ユニバーサルタグとプローブ配列を使用する（図２２）。ここで、ＬＤＲプライマーには、タグ配列（Ｂｉ’；Ｂｊ’）に加え、ライゲーション接合部領域に相補的な配列（ｔｉ’，ｔｊ’）の両方が含まれている。ＰＣＲ増幅産物の存在下で、ライゲーションプローブは互いに隣接してハイブリダイズし、熱安定性リガーゼを使用して共有結合する。プローブ（Ｆ１－ｒ－Ｂｊ，Ｂｉ－Ｑ）の存在下で、変性工程の後、温度が低下すると、プローブと病原体特異的配列（ｔｉとｔｉ’；ｔｊとｔｊ’）、ＢｉとＢｉ’、及びＢｊとＢｊ’との間に４つの二本鎖ステムが形成される。それにより、Ｂｊ配列のリボース塩基は二本鎖になり、ＲＮａｓｅＨ２により蛍光基（Ｆ１）が遊離し、シグナルを生成することができる。切断されたプローブは産物から解離し、新たなプローブがハイブリダイズして、さらなるシグナルを生成することができる。ライゲーションされていないＬＤＲプライマーは必ずしもヘアピンを形成しないため、ＲＮａｓｅＨ２はシグナルを発生しないことになる。生成されるシグナルの量は、先のＬＤＲ工程で産生された累積ＬＤＲ産物への各ハイブリダイゼーション工程中に切断されるプローブ数の関数である。例えば、産生されたＬＤＲ産物ごとに１０個の蛍光分子が遊離されるとすると、５サイクルのＬＤＲ後にはシグナルが１０倍増加し、１５サイクル後には１００倍増加し、及び４６サイクル後には１，０００倍増加することになる。形成される産物量は約４～５×（サイクル数）＾２である。ＰＣＲ－ｉＬＤＲを使用する潜在的な利点は、手順に２つの工程しか必要としないことである（ＰＣＲ－ＬＤＲ－ＵｎｉＴａｑでは代わりに３工程を必要とする）。ｉＬＤＲ工程によって検出に十分なシグナルが生成される場合、プロトコル全体が簡素化される。

【0296】

注２：ｉＬＤＲの第２の変形例は、配列特異的なプローブを使用する。ここで、ＬＤＲプライマーには、１つのタグ配列（Ｂｉ’）と、ライゲーション接合部領域に相補的な１つの配列（ｔｊ’）が含まれている。プローブ（Ｆ１－ｒ－病原体配列－Ｂｉ－Ｑ）の存在下で、変性工程の後、温度が低下すると、病原体特異的配列間（ｔｉ，ｔｊとｔｉ’，ｔｊ’）、及びＢｉとＢｉ’の間に２つの二本鎖ステムが形成される。それにより、病原体配列のリボース塩基は二本鎖になり、ＲＮａｓｅＨ２により蛍光基が遊離し、シグナルを生成することができる。切断されたプローブは産物から解離し、新たなプローブがハイブリダイズして、さらなるシグナルを生成することができる。ライゲーションされていないＬＤＲプライマーはどちらもステムを形成しないため、ＲＮａｓｅＨ２はシグナルを発生しないことになる。上記のように、生成されるシグナルの量は、先のＬＤＲ工程で産生された累積ＬＤＲ産物への各ハイブリダイゼーション工程中に切断されるプローブ数の関数である。

【0297】

注３：ＲＮＡウイルスの場合、最初に逆転写酵素工程を加えるか、または増幅緩衝液にＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ及びＭｎ２＋を使用して、シングルステップのＲＴ－ＰＣＲを行うことができる。また、試料を分割して、１つのアリコートを潜在的なＲＮＡ標的の増幅（例えば３０サイクル）に使用し、第２のアリコートを潜在的な低レベルの細菌標的の増幅（例えば４０サイクル）に使用できる点にも留意されたい。その後、２つの別々のＰＣＲ増幅産物を混合し、ＬＤＲ緩衝液で希釈して、２４個の二次ＬＤＲ反応チャンバーに分配し、ＬＤＲ反応に供する。

【0298】

注４：ＬＤＲプライマーを使用する一つの利点は、それらを互いに極めて近接して配置できるため、単一の初期標的アンプリコンから、重なったものでも複数のＬＤＲ産物を産生できることである。その結果、各病原体に対する２、３、または４つの初期標的と、それに続く各標的断片内部の２、３、または４つのＬＤＲプライマーセットを含むプライマー設計が可能になる。４～１６個の可能性のあるシグナルのうち最小限２つまたは３つが観察された場合にのみ病原体が陽性とみなされることになる。この手法のもう一つの利点は、最初のマルチプレックス反応においてＰＣＲプライマーの数が制限されていることである。さらなる利点は、これらのシグナルが異なる細区画に表示されるようにプライマーを設計することで、何らかの標的非依存性（偽）シグナルを低減できることである。

【0299】

仮想実施例５－血液から未知の病原体を直接同定及び定量するための、ＰＣＲ－ＰＣＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）またはＰＣＲ－ＰＣＲ Ｕｎｉｔａｑ検出の使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが２４、及び列あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが３８４である、２４×１６＝３８４（または場合により７６８）個の細区画を備える９，２１６マイクロウェルまたはマイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する（事前にスポットされたアレイを使用）：図２６及び図２７を参照のこと。

【0300】

アッセイは、３２個、６４個、または１２８個の潜在的標的を検出及び定量するように設計される場合がある。カートリッジを準備するにあたり、カートリッジを組み立てる前に、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグ及び標的特異的プローブ及びプライマーセットが垂直に追加されたアレイの前面に１６個、３２個、または６４個のネステッドＰＣＲプライマーペアをスポットし、乾燥させる必要がある。

【0301】

１．初期試料を２４個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。潜在的標的が３２個、６４個、または１２８個である試料の初回マルチプレックス増幅を行う。２０サイクルのマルチプレックスＰＣＲを実行し、存在する場合、元の各標的の最大１，０００，０００コピーを得る。「タンデム」以上のＰＣＲプライマーセットを使用する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべてのＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１２塩基の同じ５’テール配列が含まれる。

【0302】

２．二次ＰＣＲ反応チャンバーで、ＵｎｉＴａｑテールをもつプライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、１０サイクルのネステッドＰＣＲを実行する。プライマーは、正確な標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除される。

【0303】

３．各二次ＰＣＲ反応チャンバーのＰＣＲ産物を３８４個のマイクロポアに分配する。各行のユニバーサルまたはＵｎｉＴａｑプライマーは、正しいタグをもつ各列からの産物のみを増幅する。標的の前増幅と、プライマーの二量体形成を防ぐテールの使用により、１細胞レベルでの細菌病原体の同定が可能になる。

【0304】

注１：このアッセイ形式の成否は、ＵｎｉＴａｑプライマーによって、例えばネステッドプライマーとのプライマー二量体が形成されないかどうかによる。３’ブロックされたＵｎｉＴａｑプライマーと、ＲＮＡ塩基のブロックを解除するＲＮａｓｅＨ２を使用すると、この問題が解決すると考えられる。同じ３’ブロック／ＲＮａｓｅの手段をネステッドプライマーセットにも使用できるが、病原体の配列のずれがプライマーによる特定の標的の増幅を妨げる可能性があるため、ネステッドプライマーの効果が減少するリスクがわずかながら存在する。

【0305】

注２：ＵｎｉＴａｑプライマーを使用する一つの利点は、それらを互いに極めて近接して配置できるため、単一の初期標的アンプリコンから複数のネステッド産物を産生できることである。その結果、各病原体に対する２、３、または４つの初期標的と、それに続く各標的断片内部の２、３、または４つのネステッドプライマーセットを含むプライマー設計が可能になる。４～１６個の可能性のあるシグナルのうち最小限２つまたは３つが観察された場合にのみ病原体が陽性とみなされることになる。

【0306】

仮想実施例６－血液から未知の病原体を直接同定及び定量するための、ＰＣＲ－ＰＣＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）またはＰＣＲ－ＰＣＲ Ｕｎｉｔａｑ検出の使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロウェルが９６、及び列あたりのマイクロウェルが４，６０８である、４８×４８＝２，３０４個の細区画を備える２２１，１８４６マイクロウェルアレイ形式用のカートリッジを使用する（マイクロタイターアレイプレートへ音響液滴射出）：図２６及び図２７を参照のこと。

【0307】

アッセイは、４８個、９６個、または１９２個の潜在的標的を検出及び定量するように設計される場合がある。マイクロタイタープレートを準備するにあたり、マイクロタイタープレートを使用する前に、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグプライマー及び標的特異的プローブセットを追加し、それらを乾燥させることが必要になる。

【0308】

１．初期試料を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。潜在的標的が４８個、９６個、または１９２個である試料の初回マルチプレックス増幅を行う。９サイクルのマルチプレックスＰＣＲを実行し、存在する場合、元の各病原体の最大５１２コピーを得る。「タンデム」以上のＰＣＲプライマーセットを使用する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべてのＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１２塩基の同じ５’テール配列が含まれる。

【0309】

２．各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を、それぞれ９６個のマイクロウェルを備える、４８個の細区画に分配する。細区画には適切なネステッド標的特異的プライマー、ＵｎｉＴａｑプライマー、及び／またはプローブが事前にスポットされている（図１６、図１７、及び図１８を参照）。平均して、最初の各細区画に元の各病原体が１０コピー得られ、所与の１マイクロウェルに元の病原体が１または０コピー得られることになる。存在する病原体の数が多くなると、各細区画に追加のコピーが得られることになる。事前にスポットされたプライマーセットを使用して各マイクロポア内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロウェル内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。９６個のマイクロウェルのポアソン分布により、病原体コピー数が非常に少ない場合でも、ある程度の計数が可能になる。

【0310】

上記実施例５の注１～２も参照のこと。

【0311】

仮想実施例７－血漿から低存在量の変異及び／またはＣｐＧメチル化を直接同定及び定量するための、ＰＣＲ－ＬＤＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）またはＰＣＲ－ＬＤＲ Ｕｎｉｔａｑ検出の使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが２４、及び列あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが３８４である、２４×１６＝３８４（または場合により７６８）個の細区画を備える９，２１６マイクロウェルまたはマイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する（事前にスポットされたアレイを使用）：図２８、図２９、及び図３０を参照のこと。

【0312】

アッセイは、６４個または１２８個の潜在的標的を検出及び定量化するように設計することができ、複数の変異を単一の蛍光色によって評価することが可能であるカートリッジを準備するにあたり、カートリッジを組み立てる前に、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグ及び標的特異的プローブ及びプライマーセットが垂直に追加されたアレイの前面に１６個、３２個、または６４個のネステッドＰＣＲプライマーペアをスポットし、乾燥させる必要がある。

【0313】

１．初期試料を２４個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝１０，０００ゲノム相当である。平均して、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり４００コピーであり、最大１つの変異がある。野生型ＤＮＡの増幅を低減するため、ブロッキングＰＮＡまたはＬＮＡを用いて１０～４０サイクルの遺伝子座特異的ＰＣＲを実行する。任意：ＰＣＲ反応時にｄＵＴＰを使用する（ＵＤＧで前処理し、初期試料のキャリーオーバー汚染を防止する）。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべての下流ＰＣＲプライマーに好ましくは８～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる必要がある。

【0314】

２．各一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物をＬＤＲプライマー及び緩衝液で希釈して、産物を二次ＬＤＲ反応チャンバーに分配する。ＵｎｉＴａｑテールをもつアレル特異的プライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、２０サイクルのＬＤＲを実行する。ＬＤＲプライマーが、同じ遺伝子の異なる変異に対して、同じ細区画で同じシグナルを生じるように設計することができる。ＬＤＲ反応は、同じ反応チャンバーで実行することも、２つの個々の反応チャンバーで実行して、再合一することもできる。

【0315】

３．ＵｎｉＴａｑマスターミックス及びＵＤＧを追加し、各二次ＬＤＲ反応チャンバーの産物を、３８４個のマイクロポアに分配する。ＵｎｉＴａｑプライマーセットを使用して各ウェル内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。

【0316】

注１：この設計には、基板全体で同一のＬＤＲプライマーセットを使用するか、または異なるＬＤＲプライマーセットをプリントした後、ＰＣＲ反応のアリコートと結合させ、その後、マイクロポアに分配する前に再度、産物を混合するという選択肢がある。

【0317】

注２：３’ブロッキング基及びＲＮＡ塩基を上流プライマーに含めることにより、別の選択性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ２によりＲＮＡ塩基が除去され、変異の数塩基上流にあり、ポリメラーゼ伸長に適した３’ＯＨ基が解放される。上流のＰＣＲプライマーと部分的に重複する野生型配列を含むブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、野生型配列への結合に対しては、上流のプライマーよりも競合優先性をもつが、変異ＤＮＡに対するほど強くないため、ＰＣＲの各ラウンド中の野生型ＤＮＡの増幅が抑制される。

【0318】

注３：同様に、３’ブロッキング基、及び標的特異的ハイブリダイゼーション時にＲＮａｓｅ Ｈ２によって除去されるＲＮＡ塩基を下流プライマーに含めることにより、さらに選択性を方法に組み込むことができる。さらに、同一の５’テールを約２４～３０塩基まで伸長することができる。この配列への「ユニバーサル」プライマー（３’ブロッキング基及びＲＮＡ塩基も含む）の追加が可能であれば、このプライマーが初期ＰＣＲ増幅工程で遺伝子座特異的プライマーよりも高濃度で存在することになる。ユニバーサルプライマーは、マルチプレックス増幅時にすべてのＰＣＲ産物の増幅を促進する。

【0319】

注４．あるいは、マルチプレックスＰＣＲ時の断片のドロップアウトを最小限に抑えるために、最初の「前増幅」マルチプレックスＰＣＲを、初期反応チャンバーで８～２０サイクル実行する。次に、この産物を２４個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。ある変形例では、２４個の一次反応チャンバーのそれぞれに、野生型配列の増幅を抑制するＰＮＡまたはＬＮＡをもつ１～４個のＰＣＲプライマーセットが含まれており、シングルまたはマルチプレックスＰＣＲをさらに１０～３０サイクル実行し、潜在的な変異を含む１～４種類の断片を単一の一次反応チャンバーで増幅することができる。別の変形例では、４つの一次反応チャンバー６組に、野生型配列の増幅を抑制するＰＮＡまたはＬＮＡをもつ４～１６個のＰＣＲプライマーセットが含まれており、マルチプレックスＰＣＲをさらに１０～３０サイクル実行し、潜在的な変異を含む４～１６種類の断片を単一の一次反応チャンバーで増幅することができる。

【0320】

注５：この設計はまた、メチル化検出との組み合わせが可能である。

【0321】

血漿中の低存在量ＣｐＧメチル化の同定及び定量の場合（変異と組み合わせた場合；バイサルファイト－ＰＣＲ－ＬＤＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）、またはバイサルファイト－ＰＣＲ－ＬＤＲ－Ｕｎｉｔａｑ検出を使用。図３１、図３２、及び図３０を参照）：
１．初期反応チャンバー内で試料をＢｓｈ１２３６Ｉで消化する。バイサルファイトで処理する。ＤＮＡ鎖を再精製する。

【0322】

２．バイサルファイト処理した試料を２４個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。ＲＥ切断後の血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝２００ゲノム相当である。必要に応じて、野生型ＤＮＡの増幅を低減するため、任意のブロッキングＰＮＡまたはＬＮＡを用いて０～４０サイクルの遺伝子座特異的ＰＣＲを実行する。ＰＣＲ反応時にｄＵＴＰを使用する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべての下流ＰＣＲプライマーに好ましくは８～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる必要がある。

【0323】

２．各一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物をＬＤＲプライマー及び緩衝液で希釈して、産物を二次ＬＤＲ反応チャンバーに分配する。ＵｎｉＴａｑテールをもつメチル特異的プライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、２０サイクルのＬＤＲを実行する。ＬＤＲプライマーが、異なるメチル化領域に対して、すなわち同じプロモーター領域のトップ鎖及びボトム鎖に対して、同じ細区画で同じシグナルを生じるように設計することができる。ＬＤＲ反応は、同じ反応チャンバーで実行することも、２つの個々の反応チャンバーで実行して、再合一することもできる。

【0324】

３．ＵｎｉＴａｑマスターミックス及びＵＤＧを追加し、各二次ＬＤＲ反応チャンバーの産物を、３８４個のマイクロポアに分配する。ＵｎｉＴａｑプライマーセットを使用して各ウェル内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。

【0325】

注１：この設計には、基板全体で同一のＬＤＲプライマーセットを使用するか、または異なるＬＤＲプライマーセットをプリントした後、ＰＣＲ反応のアリコートと結合させ、その後、マイクロポアに分配する前に再度、産物を混合するという選択肢がある。

【0326】

注２：３’ブロッキング基及びＲＮＡ塩基を上流プライマーに含めることにより、別の選択性の階層を方法に組み込むことができる。標的特異的ハイブリダイゼーション時に、ＲＮａｓｅ Ｈ２によりＲＮＡ塩基が除去され、変異の数塩基上流にあり、ポリメラーゼ伸長に適した３’ＯＨ基が解放される。上流のＰＣＲプライマーと部分的に重複する野生型配列を含むブロッキングＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、野生型配列への結合に対しては、上流のプライマーよりも競合優先性をもつが、変異ＤＮＡに対するほど強くないため、ＰＣＲの各ラウンド中の野生型ＤＮＡの増幅が抑制される。

【0327】

注３：同様に、３’ブロッキング基、及び標的特異的ハイブリダイゼーション時にＲＮａｓｅ Ｈ２によって除去されるＲＮＡ塩基を下流プライマーに含めることにより、さらに選択性を方法に組み込むことができる。さらに、同一の５’テールを約２４～３０塩基まで伸長することができる。この配列への「ユニバーサル」プライマー（３’ブロッキング基及びＲＮＡ塩基も含む）の追加が可能であれば、このプライマーが初期ＰＣＲ増幅工程で遺伝子座特異的プライマーよりも高濃度で存在することになる。ユニバーサルプライマーは、マルチプレックス増幅時にすべてのＰＣＲ産物の増幅を促進する。

【0328】

注４：別の実施形態では、マルチプレックスＰＣＲ時の断片のドロップアウトを最小限に抑えるために、最初の「前増幅」マルチプレックスＰＣＲを、初期反応チャンバーで８～２０サイクル実行する。次に、この産物を２４個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。ある変形例では、２４個の一次反応チャンバーのそれぞれに、１～４個のＰＣＲプライマーセットが含まれており、シングルまたはマルチプレックスＰＣＲをさらに１０～３０サイクル実行し、潜在的なメチル化を含む１～４種類の断片を単一の一次反応チャンバーで増幅することができる。別の変形例では、４つの一次反応チャンバー６組に、４～１６個のＰＣＲプライマーセットが含まれており、マルチプレックスＰＣＲをさらに１０～３０サイクル実行し、潜在的なメチル化を含む４～１６種類の断片を単一の一次反応チャンバーで増幅することができる。

【0329】

注５：この設計はまた、変異検出との組み合わせも可能である。

【0330】

仮想実施例８－血漿から低存在量の変異及び／またはＣｐＧメチル化を直接同定及び定量するための、ＰＣＲ－ＬＤＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）またはＰＣＲ－ＬＤＲ Ｕｎｉｔａｑ検出の使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロウェルが９６、及び列あたりのマイクロウェルが４，６０８である、４８×４８＝２，３０４個の細区画を備える２２１，１８４６マイクロウェルアレイ形式用のカートリッジを使用する（マイクロタイターアレイプレートへ音響液滴射出）：図２８及び図２９を参照のこと。

【0331】

アッセイは、４８個、９６個、または１９２個の潜在的標的を検出及び定量するように設計される場合がある。マイクロタイタープレートを準備するにあたり、マイクロタイタープレートを使用する前に、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグプライマー及び標的特異的プローブセットを追加し、それらを乾燥させることが必要になる。

【0332】

１．初期試料を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝１０，０００ゲノム相当である。平均して、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり２００コピーであり、最大１つの変異がある。野生型ＤＮＡの増幅を低減するため、ブロッキングＰＮＡまたはＬＮＡを用いて１０～４０サイクルの遺伝子座特異的ＰＣＲを実行する。任意：ＰＣＲ反応時にｄＵＴＰを使用する（ＵＤＧで前処理し、初期試料のキャリーオーバー汚染を防止する）。

【0333】

２．各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物をＬＤＲプライマー及び緩衝液で希釈して、二次ＬＤＲ反応チャンバーに分配する。ＵｎｉＴａｑテールをもつアレル特異的プライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、２０サイクルのＬＤＲを実行する。ＬＤＲプライマーが、同じ遺伝子の異なる変異に対して、同じ細区画で同じシグナルを生じるように設計することができる。ＬＤＲ反応は、同じ反応チャンバーで実行することも、２つの個々の反応チャンバーで実行して、再合一することもできる。

【0334】

３．ＵｎｉＴａｑマスターミックス及びＵＤＧを追加し、各ウェルまたは二次ＬＤＲ反応チャンバーの産物を、それぞれ９６個のマイクロポアを含む４８個の細区画に分配する。細区画には適切なＵｎｉＴａｑプライマー及び／またはプローブが事前にスポットされている（図２８及び図２９を参照）。事前にスポットされたプライマーセットを使用して各マイクロポア内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。

【0335】

血漿中の低存在量ＣｐＧメチル化の同定及び定量の場合（変異と組み合わせた場合；バイサルファイト－ＰＣＲ－ＬＤＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）、またはバイサルファイト－ＰＣＲ－ＬＤＲ－Ｕｎｉｔａｑ検出を使用。図３１及び図３２を参照）：
１．初期反応チャンバー内で試料をＢｓｈ１２３６Ｉで消化する。バイサルファイトで処理する。ＤＮＡ鎖を再精製する。

【0336】

２．バイサルファイト処理した試料を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。ＲＥ切断後の血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝２００ゲノム相当である。必要に応じて、野生型ＤＮＡの増幅を低減するため、任意のブロッキングＰＮＡまたはＬＮＡを用いて１０～４０サイクルの遺伝子座特異的ＰＣＲを実行する。任意：ＰＣＲ反応時にｄＵＴＰを使用する。

【0337】

３．各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物をＬＤＲプライマー及び緩衝液で希釈して、二次ＬＤＲ反応チャンバーに分配する。ＵｎｉＴａｑテールをもつメチル特異的プライマーを１６個組、３２個組、または６４個組のプライマーセットにして使用し、２０サイクルのＬＤＲを実行する。ＬＤＲプライマーが、異なるメチル化領域に対して、すなわち同じプロモーター領域のトップ鎖及びボトム鎖に対して、同じ細区画で同じシグナルを生じるように設計することができる。ＬＤＲ反応は、同じ反応チャンバーで実行することも、２つの個々の反応チャンバーで実行して、再合一することもできる。

【0338】

４．ＵｎｉＴａｑマスターミックス及びＵＤＧを追加し、各ウェルまたは二次ＬＤＲ反応チャンバーの産物を、それぞれ９６個のマイクロポアを含む４８個の細区画に分配する。細区画には適切なＵｎｉＴａｑプライマー及び／またはプローブが事前にスポットされている（図３１及び図３２を参照）。事前にスポットされたプライマーセットを使用して各マイクロポア内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。

【0339】

上記実施例７の注１～５も参照のこと。

【0340】

仮想実施例９－希少及び過剰発現両方のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはスプライス変異体の正確な計数のための、ＰＣＲ－ＰＣＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）またはＰＣＲ－ＰＣＲ Ｕｎｉｔａｑ検出の使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが２４、及び列あたりのマイクロウェルまたはマイクロポアが３８４である、２４×１６＝３８４（または場合により７６８）個の細区画を備える９，２１６マイクロウェルまたはマイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する（事前にスポットされたアレイを使用）：スプライス変異体を例とする図３３、及び図３４を参照のこと。

【0341】

アッセイは、３８４個の潜在的標的を検出及び定量するように設計することができる。カートリッジを準備するにあたり、カートリッジを組み立てる前に、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグ及び標的特異的プローブ及びプライマーセットが垂直に追加されたアレイの前面に１６個、３２個、または６４個のネステッドＰＣＲプライマーペアをスポットし、乾燥させる必要がある。

【0342】

１．潜在的標的が３８４個である試料の初回マルチプレックス逆転写／増幅を行う。初期反応チャンバーで７サイクルのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲを実行し、元の各転写産物の最大１２８コピーを得る。プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべての逆転写及びＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる必要がある。

【0343】

２．最初のマルチプレックス産物を６個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。各一次ＰＣＲ反応チャンバーへの元の各転写産物の平均分配数は２０コピーである。ＵｎｉＴａｑテールをもつプライマーを一次ＰＣＲ反応チャンバーごとに１６個組、３２個組、または６４個組の固有のプライマーセットにして使用し、１０サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、元の各転写産物の最大２０，４８０コピーが得られる。この例では、最小数で、おおよそ元のＲＮＡ転写産物１個で２０，４８０コピーが得られ、元のＲＮＡ転写産物１００個で２，０４８，０００コピーが得られ、元のＲＮＡ転写産物１０，０００個で２０４，８００，０００コピーが得られることになり、３つの異なる転写産物セットが正確に定量される。

【0344】

３．６つの一次ＰＣＲ反応チャンバーは、排出後も反応物中に一定比率の液体量を保持するように設計されている。この例では、ネステッドＰＣＲ反応物の全体積は８０単位に指定され、保持量は４０単位以下に指定される。この例示では、一次ＰＣＲ反応チャンバー１及び２のマルチプレックス増幅プライマーセットは低レベルの転写産物（４０単位の液体を保持）に対応し、一次ＰＣＲ反応チャンバー３及び４は中レベルの転写産物（１０単位の液体を保持）に対応し、一次ＰＣＲ反応チャンバー５及び６は高レベルの転写産物（３単位の液体を保持）に対応する。最初の排出後に残留する液体及び最小コピーの計算値は以下の通りである。

【0345】

ポリメラーゼを阻害する抗体を含む新しいマスターミックス４０μを残留液体に加え、再び排出する：

【0346】

ポリメラーゼを阻害する抗体を含む新しいマスターミックス４０μを残留液体に加え、再び排出する：

【0347】

新しいマスターミックス４０μを残留液体に加え、今度は上方に流入させ、合計体積が２０単位であり、１０単位以下を保持できる４つの二次反応／希釈チャンバー、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤに等分する。

ＳＲチャンバー３及び４、ならびに５及び６は、上記の約２倍の分子数を有することになる。

【0348】

新しいマスターミックス１０μを上方チャンバー内の残留液体に加え、再び排出する：

ＳＲチャンバー３及び４、ならびに５及び６は、上記の約２倍の分子数を有することになる。

【0349】

新しいマスターミックス１０μを上方チャンバー内の残留液体に加え、再び排出する：

ＳＲチャンバー３及び４、ならびに５及び６は、上記の約２倍の分子数を有することになる。

【0350】

最後に、十分なマスターミックスが追加され、同時に残留産物及び試薬はすべて、マイクロポア内への移動に備えて、より大きい混合チャンバーに移動される。

【0351】

４．各二次反応／希釈チャンバーの産物を３８４個のマイクロウェルまたはマイクロポアに分配する。平均して、Ａの二次反応／希釈チャンバーそれぞれに元の各転写産物が５コピー得られ、Ｂ、Ｃ、及びＤの二次反応／希釈チャンバーでは徐々に少なくなる。ＵｎｉＴａｑプライマーセットを使用して各ウェル内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。２４個のマイクロポアのポアソン分布により、Ａの二次反応／希釈チャンバー内の極少のコピー転写産物の計数が可能になり、Ｂ、Ｃ、及びＤの二次反応／希釈チャンバーの２４個のマイクロポアにわたるポアソン分布により、３～４桁の規模でコピー数が多い転写産物の計数が可能になる。

【0352】

二次反応／希釈チャンバー１及び２では、１個（「Ａ」列の２４個のマイクロポアのうち平均約５個に充填）から約１，５００～３，０００個（「Ｄ」列の２４個のマイクロウェルまたはマイクロポアのうち平均約１５～２１個に充填）までの範囲の開始転写産物を正確に計数する。

【0353】

二次反応／希釈チャンバー３及び４では、１００個（「Ａ」列の２４個のマイクロポアのうち平均約１０個に充填）から約１５０，０００～３００，０００個（「Ｄ」列の２４個のマイクロウェルまたはマイクロポアのうち平均約１５～２１個に充填）までの範囲の開始転写産物を正確に計数する。

【0354】

二次反応／希釈チャンバー５及び６では、１０，０００個（「Ａ」列の２４個のマイクロポアのうち平均約１０個に充填）から約１５，０００，０００～３０，０００，０００個（「Ｄ」列の２４個のマイクロウェルまたはマイクロポアのうち平均約１５～２１個に充填）までの範囲の開始転写産物を正確に計数する。

【0355】

注１：このアッセイ形式の成否は、ＵｎｉＴａｑプライマーによって、例えばネステッドプライマーとのプライマー二量体が形成されないかどうかによる。３’ブロックされたＵｎｉＴａｑプライマーと、ＲＮＡ塩基のブロックを解除するＲＮａｓｅＨ２を使用すると、この問題が解決すると考えられる。同じ３’ブロック／ＲＮａｓｅの手段をネステッドプライマーセットにも使用できるが、病原体の配列のずれがプライマーによる特定の標的の増幅を妨げる可能性があるため、ネステッドプライマーの効果が減少するリスクがわずかながら存在する。

【0356】

注２：ＵｎｉＴａｑプライマーを使用する一つの利点は、それらを互いに極めて近接して配置できるため、単一の初期標的転写産物から複数のネステッド産物を産生できることである。その結果、各転写産物領域内に２つのネステッドプライマーセットを含むプライマー設計が可能になる。これにより、所与の転写産物の二重検証が可能になる。この手法のもう一つの利点は、最初のマルチプレックス反応においてＰＣＲプライマーの数が制限されていることである。さらなる利点は、これらのシグナルが異なる細区画に表示されるようにプライマーを設計することで、何らかの標的非依存性（偽）シグナルを低減できることである。

【0357】

注３：異なる希釈物を含む異なるチャンバーセットを設計する代替法として、ＰＣＲサイクル数の変更を含む異なる条件下で、個々の発熱体が異なるチャンバーで動作してもよい。

【0358】

仮想実施例１０－希少及び過剰発現両方のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはスプライス変異体の正確な計数のための、ＰＣＲ－ＰＣＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）またはＰＣＲ－ＰＣＲ Ｕｎｉｔａｑ検出の使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロウェルが９６、及び列あたりのマイクロウェルが４，６０８である、４８×４８＝２，３０４個の細区画を備える２２１，１８４６マイクロウェルアレイ形式用のカートリッジを使用する（マイクロタイターアレイプレートへ音響液滴射出）：スプライス変異体を例とする図３３を参照のこと。

【0359】

アッセイは、５７６個または１，１５２個の潜在的標的を検出及び定量するように設計される場合がある。マイクロタイタープレートを準備するにあたり、マイクロタイタープレートを使用する前に、ＵｎｉＴａｑまたはユニバーサルタグプライマー及び標的特異的プローブセットをスポットし、それらを乾燥させることが必要になる。

【0360】

１．潜在的標的が５７６個または１，１５２個である試料の初回マルチプレックス逆転写／増幅を行う。初期反応チャンバーで、１０サイクルのマルチプレックスＰＣＲを実行し、元の各ＲＮＡ分子の最大１，０２４コピーを得る。必要に応じて、「タンデム」ＰＣＲプライマーを使用する。また、プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべてのＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる場合がある。

【0361】

２．最初のマルチプレックス産物を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。元の各ＲＮＡ標的の各ウェルへの平均分配数は２０コピーである。ＵｎｉＴａｑテールをもつプライマーを２４個組または４８個組のプライマーセットにして使用し、３～４サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、元の各ＲＮＡ分子の最大１６０～３２０コピーが得られる。

【0362】

３．各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を、９６個のマイクロポアを備える、それぞれ２４個２セットまたは１２個４セットの細区画に分配する。２セットを使用する場合、第２のセットは第１のセットの１００／１希釈である。４セットを使用する場合、各セットは前のセットの２０／１希釈である。これにより、大きな規模にわたって存在するＲＮＡ分子の網羅が可能になる。平均して、最初の各細区画に元の各ＲＮＡ分子が１２コピー得られ、所与の１マイクロポアに元のＲＮＡが１または０コピー得られることになる。存在するＲＮＡの数が多くなると、各細区画に追加のコピーが得られることになる。事前にスポットされたＵｎｉＴａｑプライマーセットを使用して各マイクロポア内で１、２、または４つの潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。ＵｎｉＴａｑプライマーには１つ、２つ、または４つの異なる蛍光色素を使用する。２セットまたは４セットの希釈物にわたる９６個のマイクロポアのポアソン分布により、試料中のＲＮＡコピー数が非常に多い場合はもとより、ＲＮＡコピー数が非常に少ない場合でも、ある程度の計数が可能になる。

【0363】

上記実施例９の注１～２も参照のこと。

【0364】

仮想実施例１１－未知の病原体の同定及びジェノタイピングのためのＰＣＲ－ＰＣＲ－シーケンシングの使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロポアが２，７６０、及び列あたりのマイクロポアが８８，３２０である、４８×３２＝１，５３６個の細区画を備える、標的シーケンシング用の４，２３９，３６０マイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する。固定したプライマーを用いたマルチプレックス増幅については、図３５を参照のこと。固体表面での増幅を完了まで促進することに関する詳細については、図３６、図３７、及び図３８を参照のこと。

【0365】

アッセイは、１，５３６個の潜在的標的を同定及びジェノタイピングするように設計することができる。カートリッジを準備するにあたり、カートリッジを組み立てる前に、アレイの前面に４８×３２個のＰＣＲプライマーペアを、背面には３２×４８個のＰＣＲシーケンシングプライマーをスポットし、それらを乾燥させる必要がある。

【0366】

１．潜在的標的が１，５３６個である試料の初回マルチプレックス増幅を行う。初期反応チャンバー内で、１０サイクルのＰＣＲを実行し、元の各病原体の最大１，０２４コピーを得る。

【0367】

２．最初のマルチプレックス産物を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。各一次ＰＣＲ反応チャンバーへの元の各病原体標的の平均分配数は２０コピーである。遺伝子座特異的ネステッドプライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除される。３２個ずつ５サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、元の各病原体の最大６４０コピーが得られる。場合により、ＵＤＧ／ＡＰＥ１を用いて産物からユニバーサルプライマー配列を除去し、マイクロポア内の固定されたプライマーへの産物のハイブリダイゼーションを改善する。

【0368】

３．各一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を８８，３２０個のマイクロポアに分配する。平均して、各細区画（２，７６０個のマイクロポアを含む）に元の各病原体の２０コピーが得られることになる。各マイクロポア内で複数の産物をＰＣＲ増幅し、さらに固定されていない鎖を溶解させる。

【0369】

４．４８個の標的それぞれに対する４８個のシーケンシングプライマーを３２個の細区画に垂直に追加する。１，５３６個の潜在的標的を同時にシーケンシングすることができる。２，７６０個のマイクロポアのポアソン分布により、低存在量の標的を計数することができる。

【0370】

同じ４８個の細区画にシーケンシングプライマーを追加した、未知の病原体の同定及びジェノタイピングのためのＰＣＲ－ＰＣＲ－シーケンシング（図４９を参照）：
シーケンシングプライマーを同方向に、すなわち再分割せずに追加する場合、４８×ｎ個の潜在的標的が存在し、８８，３２０／ｎ個のマイクロポア／細区画である。

【0371】

これに対処する方法はいくつかある。一つの手法は一般に、細菌病原体がウイルス病原体よりも低レベルで存在することである。本来のＰＣＲサイクルには、第２のプライマーを用いないウイルス病原体のＲＴ工程が含まれる場合があるため、細菌の断片ほど多くは増幅されない。また、本来のＰＣＲ工程はサイクルが少ない可能性があり、ネステッドＰＣＲ工程でもサイクルが少ない可能性がある。したがって、８８，３２０個のマイクロポア／区分（すなわち列）で、一部の病原体がより多く存在する場合、すなわち一部が２，０００コピー存在し、それ以外が５コピー存在する場合であっても、細区画あたり３２個の標的をシーケンシングするのは不合理というわけではない。また、３２個のシーケンシングプライマー×４８のセットがデバイスにプリントされることにも留意されたい。その場合、１回のシーケンシングランで１，５３６個の潜在的標的を同時に検出すると共に、２，７６０個のマイクロポアのポアソン分布を利用することが可能である。

【0372】

もう一つの手法は、ユニバーサルプライマーと、固体支持体に結合されていない側のネステッドＰＣＲプライマーの標的特異的配列との間に８～１２塩基の固有の配列を組み込むことである。これにより、より多くのユニバーサルシーケンシングプライマーの３’側の８～１２塩基を使用して、潜在的標的のセットをシーケンシングすることが可能である。

【0373】

もう一つの手法は、ネステッドＰＣＲプライマーのセットごとに異なるユニバーサルプライマーを使用し、さらに目的とするユニバーサルのセットを３２分割してマイクロポア内にプリントすることである。これにより、各増幅産物が実質的に、規定した行及び列へ確実に送られることになる。この手法の利点は、様々な産物の個々のＴａｑｍａｎ（商標）またはＬＤＲ検出も可能になることである。

【0374】

この案の変形例では、ユニバーサルプライマー配列はＵｎｉＴａｑ配列である。望ましいＵｎｉＴａｑプライマーは、ポア内に３２個ずつプリントされる。この手法は、すべてのプライマーの固定化を必要としないが、デンドリマーへのハイブリダイゼーションを使用して一時的に適所に保持することができる。

【0375】

４８区分に分割した、４色ＬＤＲ－ＦＲＥＴ検出により、１９２個の標的を同時に高精度で計数することが可能である点に留意されたい。４８区分のそれぞれに、増幅された異なる標的のセット（例えば１６個）があるため、３８４個すべてのＬＤＲプライマーを同時に追加でき、また各自それらが選別されることになる。これにより、わずか４つのＬＤＲ反応で７６８個の標的を正確に定量及び計数することができる。

【0376】

仮想実施例１２－未知の病原体の同定及びジェノタイピングのためのＰＣＲ－ＰＣＲ－シーケンシングの使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロポアが１１，０４０、及び列あたりのマイクロポアが５２９，９２０である、４８の二重列×４８の二重行＝２，３０４個の細区画を備える、標的シーケンシング用の２５，４３６，１６０マイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する。固定したプライマーを用いたマルチプレックス増幅については、図３５を参照のこと。固体表面での増幅を完了まで促進することに関する詳細については、図３６、図３７、及び図３８を参照のこと。

【0377】

アッセイは、２，３０４～９，２１６個の潜在的標的を同定及びジェノタイピングするように設計することができる。カートリッジを準備するにあたり、カートリッジを組み立てる前に、アレイの前面に４８×４８個のＰＣＲプライマーペアを、背面には４８×４８個のＰＣＲシーケンシングプライマーをスポットし、それらを乾燥させる必要がある。

【0378】

１．潜在的標的が２，３０４～９，２１６個である試料の初回マルチプレックス増幅を行う。初期反応チャンバー内で、１０サイクルのＰＣＲを実行し、元の各病原体の最大１，０２４コピーを得る。

【0379】

２．最初のマルチプレックス産物を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーへの元の各病原体標的の平均分配数は２０コピーである。遺伝子座特異的ネステッドプライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除される。３２個ずつ２～３サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、元の各病原体の最大８０～１６０コピーが得られる。場合により、ＵＤＧ／ＡＰＥ１を用いて産物からユニバーサルプライマー配列を除去し、マイクロポア内の固定されたプライマーへの産物のハイブリダイゼーションを改善する。

【0380】

３．各ウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を５２９，９２０個のマイクロポアに分配する。各マイクロポア内で複数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。

【0381】

同じ４８個の細区画にシーケンシングプライマーを追加した、未知の病原体の同定及びジェノタイピングのためのＰＣＲ－ＰＣＲ－シーケンシング：
シーケンシングプライマーを同方向に、すなわち再分割せずに追加する場合、４８×ｎ個の潜在的標的が存在し、５２９，９２０／ｎ個のマイクロポア／細区画である。

【0382】

これに対処する方法はいくつかある。一つの手法は一般に、細菌病原体がウイルス病原体よりも低レベルで存在することである。本来のＰＣＲサイクルには、第２のプライマーを用いないウイルス病原体のＲＴ工程が含まれる場合があるため、細菌の断片ほど多くは増幅されない。また、本来のＰＣＲ工程はサイクルが少ない可能性がある。したがって、５２９，９２０個のマイクロポア／区分（列）で、一部の病原体がより多く存在する場合、すなわち一部が２，０００コピー存在し、それ以外が５コピー存在する場合であっても、区分（列）あたり３２個の標的をシーケンシングするのは不合理というわけではない。また、１９２個のシーケンシングプライマー×４８のセットがデバイスに分配されることにも留意されたい。その場合、１回のシーケンシングランで９，２１６個の潜在的標的を同時に検出すると共に、５２９，９２０個のマイクロポアのポアソン分布を利用することが可能である。

【0383】

もう一つの手法は、ユニバーサルプライマーと、固体支持体に結合されていない側のネステッドＰＣＲプライマーの標的特異的配列との間に８～１６塩基の固有の配列を組み込むことである。これにより、より多くのユニバーサルシーケンシングプライマーの３’側の８～１６塩基を使用して、潜在的標的のセットをシーケンシングすることが可能である。

【0384】

第１の８～１６種のシーケンシングプライマーのセットは、共通の５’配列（１６塩基）及び可変３’配列（８塩基）を含み得る。または、第２の６４～２５６種のシーケンシングプライマーのセットは、共通の５’配列（８塩基）、中間の可変配列（８塩基、８～１６種の変異体）、及び超可変３’配列（８塩基、６４～２５６種の変異体）を含み得る。

【0385】

仮想実施例１３－血漿から低存在量の変異及び／またはＣｐＧメチル化を直接同定及び計数するためのＰＣＲ－ＰＣＲ－シーケンシングの使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロポアが２，７６０、及び列あたりのマイクロポアが８８，３２０である、４８×３２＝１，５３６個の細区画を備える、標的シーケンシング用の４，２３９，３６０マイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する。図４０～４６及び図４８を参照のこと。

【0386】

１．初期試料を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝１０，０００ゲノム相当である。平均して、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり２００コピーであり、最大１つの変異がある。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除される。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。トップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。

【0387】

２．ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理して、各一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を８８，３２０個のマイクロポアに分配する。７５％が捕捉されると想定すると、所与の標的は区分（列）あたり約１２００コピーを有し、変異が存在する場合、「ワトソン鎖」が約３コピーと「クリック鎖」が約３コピー存在するはずである。標的特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各ウェル内で多数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。

【0388】

３．７２個のシーケンシングプライマーを追加し、必要な場合には重複領域を含む、ワトソン鎖及びクリック鎖の両方について、３６個の標的領域をカバーする。約８０塩基の配列情報に加えて、１０塩基の固有の断片識別子バーコードを生成する。

【0389】

４．追加の７２個のシーケンシングプライマーを追加する。現行のカートリッジは、４ラウンドのシーケンシング＝２８８プライマー、すなわち両方の鎖の１４４の標的領域をカバーし、各変異を正確に計数する余地を容易に有する。

【0390】

注１：元のネステッドプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。

【0391】

注２：また、マスターの共通配列と、さらに異なる断片を固有にシーケンシングする３’末端の８～１２塩基とを含む共通配列の異なるセットで構成されるネステッドプライマーを設計することができ、それにより個々のシーケンシングプライマーあたり平均７２個の産物がシーケンシングされる。次のシーケンシングプライマーで次の７２個の断片のシーケンシングを繰り返す。

【0392】

血漿中の低存在量ＣｐＧメチル化の同定及び定量の場合（変異と組み合わせた場合；バイサルファイト－ＰＣＲ－ＰＣＲ－シーケンシングを使用。図５１及び図５２を参照）：
１．初期反応チャンバー内で試料をＢｓｈ１２３６Ｉで消化する。バイサルファイトで処理する。鎖を再精製する。

【0393】

２．バイサルファイト処理した試料を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。ＲＥ切断後の血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝２００ゲノム相当である。平均して、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり４コピーであり、最大１つのメチル化がある。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除される。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。元のメチル化ＤＮＡのトップ鎖の４つのコピーとボトム鎖の４つのコピーを得る。

【0394】

３．ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理して、各一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を８８，３２０個のマイクロポアに分配する。７５％が捕捉されると想定すると、所与の標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり約１６コピーを有し、メチル化領域が存在する場合、「ワトソン鎖」が約３コピーと「クリック鎖」が約３コピー存在するはずである。標的特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各ウェル内で多数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。

【0395】

４．メチル化領域をカバーするために要求される数のシーケンシングプライマーを追加する。（すべてのメチル化領域を正確に計数して、理論上、１回のシーケンシングランで２，７６０のメチル化領域をカバーすることができる）。

【0396】

注１：元のネステッドプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。

【0397】

バイサルファイト－ＰＣＲ－ＰＣＲシーケンシングを使用した、血漿中の低存在量ＣｐＧメチル化の同定及び定量（単独で行う場合）：
１．初期反応チャンバー内で試料をＢｓｈ１２３６Ｉで消化する。バイサルファイトで処理する。鎖を再精製する。

【0398】

２．バイサルファイト処理した試料を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。ＲＥ切断後の血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝２００ゲノム相当である。平均して、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり４コピーであり、最大１つのメチル化がある。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除される。１つの鎖に対して１１サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。１つの鎖の元のメチル化ＤＮＡの１，０２４コピーが得られる。

【0399】

３．ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理して、各一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を８８，３２０個のマイクロポアに分配する。７５％が捕捉されると想定すると、所与の標的は区分（列）あたり約１００コピーを有し、メチル化領域が存在する場合、その鎖が約２４コピー存在するはずである。各ウェル内で複数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。

【0400】

４．１２個の標的それぞれに対する１２個のシーケンシングプライマーを３２個の細区画に垂直に追加する。３８４個の潜在的メチル化標的を同時にシーケンシングすることができる。２，７６０個のマイクロポアのポアソン分布により、メチル化標的を計数することができる。すべてのメチル化領域を正確に計数して、合計３８４個の潜在的なメチル化標的領域を同時に評価することができる。

【0401】

注１：元の標的特異的な第２のプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。

【0402】

仮想実施例１４－血漿から低存在量の変異及び／またはＣｐＧメチル化を直接同定及び計数するためのＰＣＲ－ＰＣＲ－シーケンシングの使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロポアが１１，０４０、及び列あたりのマイクロポアが５２９，９２０である、４８の二重列×４８の二重行＝２，３０４個の細区画を備える、標的シーケンシング用の２５，４３６，１６０マイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する。図４０～４６及び図４８を参照のこと。

【0403】

１．初期試料を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝１０，０００ゲノム相当である。平均して、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり２００コピーであり、最大１つの変異がある。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除される。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。トップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。

【0404】

２．ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理して、各一次ＰＣＲ反応チャンバーからの産物を５２９，９２０個のマイクロポアに分配する。７５％が捕捉されると想定すると、所与の標的は区分（列）あたり約１２００コピーを有し、変異が存在する場合、「ワトソン鎖」が約３コピーと「クリック鎖」が約３コピー存在するはずである。標的特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各ウェル内で多数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。

【0405】

３．２５６個のシーケンシングプライマーを追加し、必要な場合には重複領域を含む、ワトソン鎖及びクリック鎖の両方について、１２８個の標的領域をカバーする。約８０塩基の配列情報に加えて、１０塩基の固有の断片識別子バーコードを生成する。５２９，９２０個のマイクロポアのうち約３０７，２００個のマイクロポアで配列情報が生成され、これらの約７５％で、シーケンシングラウンドあたり１つのＰＣＲ産物からのリードが得られることになる。

【0406】

４．必要とする数の標的領域をシーケンシングするために、さらに２５６個のシーケンシングプライマーを必要な頻度で追加する。

【0407】

注１：元のネステッドプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。

【0408】

注２：マスターの共通配列と、さらに異なる断片を固有にシーケンシングする３’末端の８～１６塩基とを含む共通配列の異なるセットで構成されるネステッドプライマーを設計することができ、それにより個々のシーケンシングプライマーあたり平均２５６個の産物がシーケンシングされる。次のシーケンシングプライマーで次の２５６個の断片のシーケンシングを繰り返す。

【0409】

血漿中の低存在量ＣｐＧメチル化の同定及び定量の場合（変異と組み合わせた場合；バイサルファイト－ＰＣＲ－ＰＣＲ－シーケンシングを使用。図５１を参照）：
１．初期反応チャンバー内で試料をＢｓｈ１２３６Ｉで消化する。バイサルファイトで処理する。鎖を再精製する。

【0410】

２．バイサルファイト処理した試料を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。ＲＥ切断後の血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝２００ゲノム相当である。平均して、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり４コピーであり、最大１つのメチル化がある。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除される。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。元のメチル化ＤＮＡのトップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。

【0411】

３．ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理して、各一次ＰＣＲ反応チャンバーからの産物を５２９，９２０個のマイクロポアに分配する。７５％が捕捉されると想定すると、所与の標的は区分（列）あたり約１６コピーを有し、メチル化領域が存在する場合、「ワトソン鎖」が約３コピーと「クリック鎖」が約３コピー存在するはずである。標的特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各ウェル内で多数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。

【0412】

４．メチル化領域をカバーするために要求される数のシーケンシングプライマーを追加する。すべてのメチル化領域を正確に計数して、理論上、１回のシーケンシングランで１９，２００のメチル化領域をカバーすることができる。したがって、メチル化領域だけに対応するマスターの共通配列を使用すれば、この単一のプライマーによって、１回のランですべてのメチル化領域をカバーすることができる。

【0413】

注１：元のネステッドプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。

【0414】

バイサルファイト－ＰＣＲ－ＰＣＲシーケンシングを使用した、血漿中の低存在量ＣｐＧメチル化の同定及び定量（単独で行う場合）：
１．初期反応チャンバー内で試料をＢｓｈ１２３６Ｉで消化する。バイサルファイトで処理する。鎖を再精製する。

【0415】

２．バイサルファイト処理した試料を４８個のウェルまたは一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。ＲＥ切断後の血漿中の最高レベルのＤＮＡ＝２００ゲノム相当である。平均して、各標的は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり４コピーであり、最大１つのメチル化がある。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除される。１つの鎖に対して１１サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。１つの鎖の元のメチル化ＤＮＡの１，０２４コピーが得られる。

【0416】

３．ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理して、各一次ＰＣＲ反応チャンバーからの産物を５２９，９２０個のマイクロポアに分配する。７５％が捕捉されると想定すると、所与の標的は区分（列）あたり約１００コピーを有し、メチル化領域が存在する場合、その鎖が約２４コピー存在するはずである。各ウェル内で複数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。

【0417】

４．メチル化領域をカバーするために要求される数のシーケンシングプライマーを追加する。すべてのメチル化領域を正確に計数して、理論上、１回のシーケンシングランで１９，２００のメチル化領域をカバーすることができる。したがって、メチル化領域だけに対応するマスターの共通配列を使用すれば、この単一のプライマーによって、１回のランですべてのメチル化領域をカバーすることができる。

【0418】

注１．元の標的特異的な第２のプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。

【0419】

仮想実施例１５－血漿からの直接的なトリソミーの非侵襲的出生前検査（ＮＩＰＴ）のためのＰＣＲ－ＰＣＲ－シーケンシングの使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロポアが２，７６０、及び列あたりのマイクロポアが８８，３２０である、４８×３２＝１，５３６個の細区画を備える、標的シーケンシング用の４，２３９，３６０マイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する。図５０を参照のこと。

【0420】

１．血漿／試料中のＤＮＡを２，０００ゲノム相当に調整する。初期試料を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。平均して、各遺伝子座は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり４０コピーであり、異なるＳＮＰがある。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除される。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。トップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。

【0421】

２．ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理して、各一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を８８，３２０個のマイクロポアに分配する。７５％が捕捉されると想定すると、所与の遺伝子座は区分、すなわち列あたり約２４０コピーを有することになる（ワトソン鎖で１２０とクリック鎖で１２０）。遺伝子座特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各ウェル内で多数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。

【0422】

３．３６８個のシーケンシングプライマー（または１つのプライマー、以下の注２を参照）を追加し、ワトソン鎖及びクリック鎖の両方について、１８４個の遺伝子座領域をカバーする。約５０塩基の配列情報に加えて、１０塩基の固有の断片識別子バーコードを生成する。

【0423】

４．追加の３６８個のシーケンシングプライマー（または１つのプライマー、以下の注２を参照）を追加する。現行のカートリッジは、４ラウンドのシーケンシング＝両鎖の７３６の遺伝子座領域をカバーし、ワトソン鎖とクリック鎖の両方で各ＳＮＰを正確に計数する余地を有する。

【0424】

基本的な考え方は、各鎖のコピーが存在する数を計数することである。４８区分、すなわち４８列のそれぞれにおいて、ワトソン鎖がクリック鎖と一致する必要があるため（各鎖の一方と所与の断片から生成されるため）、これは鎖の欠失またはその他のエラーの内部標準となる。２番（対照）、１３番、１８番、２１番、Ｘ、及びＹ染色体の複数の固有の遺伝子座を使用して、コピー数を確定し、ならびにトリソミーまたは他の染色体コピーの変化を識別する。

【0425】

上記の計算は、平均して約５０％のマイクロポアに充填されることを基準とする。（ポアソン分布：平均ラムダ＝０．４；初期比率ｘ＝０）。そのような条件下では、マイクロポアの約６０％は何もシーケンシングリードが得られず、約３０％は固有（すなわち単一リード）であり、約７．５％で二重リードが得られ、及び約１．３％で三重リードが得られることになる。実用レベルでは、ＳＮＰを区別するには単一リードが明確である。遺伝子座の決定には二重リードを使用できるが、ＳＮＰを区別するには二重リードを使用すべきではない。単一リードから二重リードまでで、９０％を超える鎖がカバーされ、またその分布は本質的にランダムであるため、初期試料に存在する各鎖の正確性の高い計数がこの手法で可能になるはずである。

【0426】

注１：元のネステッドプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。

【0427】

注２：マスターの共通配列と、さらに異なる断片を固有にシーケンシングする３’末端の８～１２塩基とを含む共通配列の異なるセットで構成されるネステッドプライマーを設計することができ、それにより個々のシーケンシングプライマーあたり平均３６８個の産物がシーケンシングされる。次のシーケンシングプライマーで次の３６８個の断片のシーケンシングを繰り返す。

【0428】

仮想実施例１６－血漿からの直接的なトリソミーの非侵襲的出生前検査（ＮＩＰＴ）のためのＰＣＲ－ＰＣＲ－シーケンシングの使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロポアが１１，０４０、及び列あたりのマイクロポアが５２９，９２０である、４８の二重列×４８の二重行＝２，３０４個の細区画を備える、標的シーケンシング用の２５，４３６，１６０マイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する。図５０を参照のこと。

【0429】

１．血漿／試料中のＤＮＡを２，０００ゲノム相当に調整する。初期試料を４８個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。平均して、各遺伝子座は一次ＰＣＲ反応チャンバーあたり４０コピーであり、異なるＳＮＰがある。遺伝子座特異的プライマーは、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２によりブロック解除される。各鎖がわずかに異なる配列をカバーする両方の鎖について、３サイクルの断片識別子ＰＣＲを実行する。トップ鎖の４つのコピーと、ボトム鎖の４つのコピーを得る。

【0430】

２．ＵＤＧ／ＡＰＥ１で処理して、各一次ＰＣＲ反応チャンバーの産物を５２９，９２０個のマイクロポアに分配する。７５％が捕捉されると想定すると、所与の遺伝子座は区分、すなわち列あたり約２４０コピーを有することになる（ワトソン鎖で１２０とクリック鎖で１２０）。遺伝子座特異的ネステッドプライマー及びユニバーサルプライマーを使用して、各ウェル内で多数の産物をＰＣＲ増幅し、固定されていない鎖を溶解させる。

【0431】

３．２，２０８個のシーケンシングプライマー（または１つのプライマー、以下の注２を参照）を追加し、ワトソン鎖及びクリック鎖の両方について、１，１０４個の遺伝子座領域をカバーする。約５０塩基の配列情報に加えて、１０塩基の固有の断片識別子バーコードを生成する。

【0432】

４．追加の２，２０８個のシーケンシングプライマー（または１つのプライマー、以下の注２を参照）を追加する。

【0433】

基本的な考え方は、各鎖のコピーがいくつ存在するかを計数することである。４８区分、すなわち４８列のそれぞれにおいて、ワトソン鎖がクリック鎖と一致する必要があるため（各鎖の一方と所与の断片から生成されるため）、これは鎖の欠失またはその他のエラーの内部標準となる。２番（対照）、１３番、１８番、２１番、Ｘ、及びＹ染色体の複数の固有の遺伝子座を使用して、コピー数を確定し、ならびにトリソミーまたは他の染色体コピーの変化を識別する。

【0434】

上記の計算は、平均して約５０％のマイクロポアに充填されることを基準とする。（ポアソン分布：平均ラムダ＝０．４；初期比率ｘ＝０）。そのような条件下では、マイクロポアの約６０％は何もシーケンシングリードが得られず、約３０％は固有（すなわち単一リード）であり、約７．５％で二重リードが得られ、及び約１．３％で三重リードが得られることになる。実用レベルでは、ＳＮＰを区別するには単一リードが明確である。遺伝子座の決定には二重リードを使用できるが、ＳＮＰを区別するには使用すべきではない。単一リードから二重リードまでで、９０％を超える鎖がカバーされ、またその分布は本質的にランダムであるため、初期試料に存在する各鎖の正確性の高い計数がこの手法で可能になるはずである。

【0435】

注１：元のネステッドプライマーをシーケンシングプライマーとして使用することもできる。

【0436】

注２：マスターの共通配列と、さらに異なる断片を固有にシーケンシングする３’末端の８～１６塩基とを含む共通配列の異なるセットで構成されるネステッドプライマーを設計することができ、それにより個々のシーケンシングプライマーあたり平均３６８個の産物がシーケンシングされる。次のシーケンシングプライマーで次の１，１０４個の断片のシーケンシングを繰り返す。

【0437】

仮想実施例１７－希少及び過剰発現両方のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはスプライス変異体の正確な計数のための、ＰＣＲ－ＰＣＲ－Ｔａｑｍａｎ（商標）またはＰＣＲ－ＰＣＲ Ｕｎｉｔａｑ検出の使用
以下に記載するアッセイは、細区画あたりのマイクロポアが２，７６０、及び列あたりのマイクロポアが８８，３２０である、４８×３２＝１，５３６個の細区画を備える、標的シーケンシング用の４，２３９，３６０マイクロポアアレイ形式用のカートリッジを使用する。図５３及び図５４を参照のこと。アッセイは、１，５３６個の潜在的標的を検出及び定量するように設計することができる。

【0438】

１．潜在的標的が１，５３６個である試料の初回マルチプレックス逆転写／増幅を行う。初期反応チャンバーで９サイクルのＰＣＲを実行し、元の各転写産物の最大５１２コピーを得る。プライマー二量体の増幅を抑制するために、すべての逆転写及びＰＣＲプライマーに好ましくは１０～１１塩基の同じ５’テール配列が含まれる必要がある。

【0439】

２．最初のマルチプレックス産物を２４個の一次ＰＣＲ反応チャンバーに分配する。各一次ＰＣＲ反応チャンバーへの元の各転写産物の平均分配数は２０コピーである。ＵｎｉＴａｑテールをもつプライマーを一次ＰＣＲ反応チャンバーごとに３２個組の固有のプライマーセットにして使用し、１０サイクルのネステッドＰＣＲを実行すると、元の各転写産物の最大２０，４８０コピーが得られる。この例では、最小数で、おおよそ元のＲＮＡ転写産物１個で２０，４８０コピーが得られ、元のＲＮＡ転写産物１００個で２，０４８，０００コピーが得られ、元のＲＮＡ転写産物１０，０００個で２０４，８００，０００コピーが得られることになり、３つの異なる転写産物セットが正確に定量される。

【0440】

３．２４個の各一次ＰＣＲ反応チャンバーは、排出後も反応物中に一定比率の液体量を保持するように設計されている。この例では、ネステッドＰＣＲ反応物の全体積は８０単位に指定され、保持量は４０単位以下に指定される。この例示では、一次ＰＣＲ反応チャンバー１～８のマルチプレックス増幅プライマーセットは低レベルの転写産物（４０単位の液体を保持）に対応し、一次ＰＣＲ反応チャンバー９～１６は高レベルの転写産物（１０単位の液体を保持）に対応し、一次ＰＣＲ反応チャンバー１７～２４は高レベルの転写産物（３単位の液体を保持）に対応する。最初の排出後に残留する液体及び最小コピーの計算値は以下の通りである：

【0441】

ポリメラーゼを阻害する抗体を含む新しいマスターミックス４０μを残留液体に加え、再び排出する：

【0442】

ポリメラーゼを阻害する抗体を含む新しいマスターミックス４０μを残留液体に加え、再び排出する：

【0443】

新しいマスターミックス４０μを残留液体に加え、今度は上方に流入させ、合計体積が２０単位であり、１０単位以下を保持できる、二次反応／希釈チャンバーＡ及びＢに等分する。

ＳＲチャンバー９～１６、ならびに１７～２４は、上記の約２倍の分子数を有することになる。

【0444】

新しいマスターミックス１０μを上方チャンバー内の残留液体に加え、再び排出する：

ＳＲチャンバー９～１６、ならびに１７～２４は、上記の約２倍の分子数を有することになる。

【0445】

最後に、十分なマスターミックスが追加され、同時に残留産物及び試薬はすべて、マイクロポア内への移動に備えて、より大きい混合チャンバーに移動される。

【0446】

４．各二次反応／希釈チャンバーの産物を８８，３２０個のマイクロポアに分配する。平均して、Ａの二次反応／希釈チャンバーそれぞれに元の各転写産物が５コピー得られ、Ｂの二次反応／希釈チャンバーでは約２００分の１に減少する。ＵｎｉＴａｑプライマーセットを使用して各マイクロポア内で潜在的な産物をＰＣＲ増幅し、各細区画の各マイクロポア内のＣｔ値を測定する。（任意：ＵｎｉＴａｑプライマーで２種類または４種類の蛍光色素を使用して、転写産物の総数を２倍または４倍にすることができる）。２，７６０個のマイクロポアのポアソン分布により、Ａの二次反応／希釈チャンバー内の極少のコピー転写産物の計数が可能になり、Ｂの二次反応／希釈チャンバーの２，７６０個のマイクロポアにわたるポアソン分布により、３桁の規模でコピー数が多い転写産物の計数が可能になる。

【0447】

二次反応／希釈チャンバー１～８では、１個（「Ａ」列の２，７６０個のマイクロポアのうち平均約５個に充填）から約１１０，０００～２２０，０００個（「Ｂ」列の２，７６０個のマイクロポアのうち平均約１，７６６～２，２９０個に充填）までの範囲の開始転写産物を正確に計数する。

【0448】

二次反応／希釈チャンバー３及び４では、１００個（「Ａ」列の２，７６０個のマイクロポアのうち平均約１０個に充填）から約１１，０００，０００～２２，０００，０００個（「Ｂ」列の２，７６０個のマイクロポアのうち平均約１，７６６～２，２９０個に充填）までの範囲の開始転写産物を正確に計数する。

【0449】

二次反応／希釈チャンバー５及び６では、１０，０００個（「Ａ」列の２，７６０個のマイクロポアのうち平均約１０個に充填）から約１，１００，０００，０００～２，２００，０００，０００個（「Ｂ」列の２，７６０個のマイクロポアのうち平均約１，７６６～２，２９０個に充填）までの範囲の開始転写産物を正確に計数する。

【0450】

注１：このアッセイ形式の成否は、ＵｎｉＴａｑプライマーによって、例えばネステッドプライマーとのプライマー二量体が形成されないかどうかによる。３’ブロックされたＵｎｉＴａｑプライマーと、ＲＮＡ塩基のブロックを解除するＲＮａｓｅＨ２を使用すると、この問題が解決すると考えられる。同じ３’ブロック／ＲＮａｓｅの手段をネステッドプライマーセットにも使用できるが、病原体の配列のずれがプライマーによる特定の標的の増幅を妨げる可能性があるため、ネステッドプライマーの効果が減少するリスクがわずかながら存在する。

【0451】

注２：ＵｎｉＴａｑプライマーを使用する一つの利点は、それらを互いに極めて近接して配置できるため、単一の初期標的転写産物から複数のネステッド産物を産生できることである。その結果、各転写産物領域内に２つのネステッドプライマーセットを含むプライマー設計が可能になる。これにより、所与の転写産物の二重検証が可能になる。この手法のもう一つの利点は、最初のマルチプレックス反応においてＰＣＲプライマーの数が制限されていることである。さらなる利点は、これらのシグナルが異なる区分（列）に表示されるようにプライマーを設計することで、何らかの標的非依存性（偽）シグナルを低減できることである。

【0452】

注３：異なる希釈物を含む異なるチャンバーセットを設計する代替法として、ＰＣＲサイクル数の変更を含む異なる条件下で、個々の発熱体が異なるチャンバーで動作してもよい。

【0453】

同じ４８の区分（すなわち列）にシーケンシングプライマーを追加して、希少及び過剰発現両方のｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはスプライス変異体の正確な計数：
シーケンシングプライマーを同方向に、すなわち再分割せずに追加する場合、４８×ｎ個の潜在的標的が存在し、８８，３２０／ｎ個のマイクロポア／細区画である。

【0454】

これに対処する方法は２つある。一つの手法は一般に、細菌病原体がウイルス病原体よりも低レベルで存在することである。本来のＰＣＲサイクルには、第２のプライマーを用いないウイルス病原体のＲＴ工程が含まれる場合があるため、細菌の断片ほど多くは増幅されない。また、本来のＰＣＲ工程はサイクルが少ない可能性があり、ネステッドＰＣＲ工程でもサイクルが少ない可能性がある。したがって、８８，３２０個のマイクロポア／区分（列）で、一部の病原体がより多く存在する場合、すなわち一部が２，０００コピー存在し、それ以外が５コピー存在する場合であっても、区分あたり３２個の標的をシーケンシングするのは不合理というわけではない。また、３２個のシーケンシングプライマー×４８のセットがデバイスにプリントされることにも留意されたい。その場合、１回のシーケンシングランで１，５３６個の潜在的標的を同時に検出すると共に、２，７６０個のマイクロポアのポアソン分布を利用することが可能である。

【0455】

もう一つの手法は、ユニバーサルプライマーと、固体支持体に結合されていない側のネステッドＰＣＲプライマーの標的特異的配列との間に８～１２塩基の固有の配列を組み込むことである。これにより、より多くのユニバーサルシーケンシングプライマーの３’側の８～１２塩基を使用して、潜在的標的のセットをシーケンシングすることが可能である。

【0456】

もう一つの手法は、ネステッドＰＣＲプライマーのセットごとに異なるユニバーサルプライマーを使用し、さらに目的とするユニバーサルのセットを３２分割してマイクロポア内にプリントすることである。これにより、各増幅産物が実質的に、規定した行及び列へ確実に送られることになる。この手法の利点は、様々な産物の個々のＴａｑｍａｎ（商標）またはＬＤＲ検出も可能になることである。

【0457】

この案の変形例では、ユニバーサルプライマー配列はＵｎｉＴａｑ配列である。望ましいＵｎｉＴａｑプライマーは、ポア内に３２個ずつプリントされる。この手法は、すべてのプライマーの固定化を必要としないが、デンドリマーへのハイブリダイゼーションを使用して一時的に適所に保持することができる。

【0458】

４８区分に分割した、４色ＬＤＲ－ＦＲＥＴ検出により、１９２個の標的を同時に高精度で計数することが可能である点に留意されたい。４８区分のそれぞれに、増幅された異なる標的のセット（例えば１６個）があるため、３８４個すべてのＬＤＲプライマーを同時に追加でき、また各自それらが選別されることになる。これにより、わずか４つのＬＤＲ反応で７６８個の標的を正確に定量及び計数することができる。

【0459】

潜在的標的が３８４個の場合（ＵｎｉＴａｑプライマーセットを垂直に追加し、組み立てる前に乾燥させる）。
アレイの前面に１６個、３２個、または６４個いずれかのネステッドＰＣＲプライマーペアを２４箇所スポットする必要がある。

【0460】

仮想実施例１８－スプリットＵｎｉＴａｑプローブ（ＵｎｉＲｑ）を用いたＰＣＲプライマー設計の例
図１８のスプリットＵｎｉＴａｑプローブ（ＵｎｉＲｑ）を用いたＰＣＲプライマー設計の例：（Ｔｍ＝６４．６）（合計１８６ｂｐ；２８＋２８ｂｐ ＴＳ ＤＮＡ）

【0461】

ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１に基づくＴｍ計算に関する注記：
所与のＴｍ値は、内部太字配列ｔｉとｔｉ’のヘアピンで６２．６℃、構造全体で５３．１℃である。

【0462】

所与のＴｍ値は、内部斜字配列ｔｊとｔｊ’のヘアピンで５９．７℃、構造全体で５３．１℃である。

【0463】

離れた太字配列ｔｉとｔｉ’は３８．６℃でハイブリダイズする。

【0464】

離れた斜字配列ｔｊとｔｊ’は３７．２℃でハイブリダイズする。

【0465】

離れた二重下線配列ＢｉとＢｉ’、及びＢｊとＢｊ’のＴｍは、それぞれ３０．２及び４７．６である。

【0466】

４つのヘアピン領域を合計すると、ヘアピン全体のＴｍは６４．６になる。

【0467】

可能性のあるプライマー二量体ＰＣＲ産物（両方のスプリット相補体にハイブリダイズするプローブ部分のＴｍ＝５４．４）
（注：プライマー二量体は正当な標的配列

を欠くため、そのような産物へのＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーションによって３’ブロックが遊離することはなく、そのため増幅もされない）

（上流標的配列；２８ｂｐ）（下流標的配列；２８ｂｐ）

【0468】

仮想実施例１９－分離したスプリットＵｎｉＴａｑプローブ（ＵｎｉＳｐＴｑ）を用いたＰＣＲプライマー設計の例
分離したスプリットＵｎｉＴａｑプローブを用いたＰＣＲプライマー設計の例：（Ｔｍ＝６２．６）（合計１５６ｂｐ；２８＋２８ｂｐ ＴＳ ＤＮＡ）

【0469】

ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１に基づくＴｍ計算に関する注記：
所与のＴｍ値は、内部太字配列ｔｉとｔｉ’のヘアピンで６２．６℃、構造全体で５３．１℃である。

【0470】

所与のＴｍ値は、内部斜字配列ｔｊとｔｊ’のヘアピンで５９．７℃、構造全体で５３．１℃である。

【0471】

離れた太字配列ｔｉとｔｉ’は３８．６℃でハイブリダイズする。

【0472】

離れた斜字配列ｔｊとｔｊ’は３７．２℃でハイブリダイズする。

【0473】

離れた二重下線配列ＢｉとＢｉ’、及びＢｊとＢｊ’のＴｍは、それぞれ３６．４及び４２．７である。

【0474】

４つのヘアピン領域を合計すると、ヘアピン全体は６２．６になる。

【0475】

可能性のあるプライマー二量体ＰＣＲ産物（両方のスプリット相補体にハイブリダイズするプローブ部分のＴｍ＝５１．４）
（注：プライマー二量体は正当な標的配列

を欠くため、そのような産物へのＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーションによって３’ブロックが遊離することはなく、そのため増幅もされない）

（上流標的配列；２８ｂｐ）（下流標的配列；２８ｂｐ）

【0476】

仮想実施例２０－スプリットＵｎｉＴａｑプローブ（ＵｎｉＳｐＴｑ）を用いたＬＤＲプライマー設計の例
図２１のスプリットＵｎｉＴａｑプローブ（ＵｎｉＳｐＴｑ）を用いたＬＤＲプライマー設計の例（Ｔｍ＝６６．６）（合計１７０ｂｐ；６０ｂｐ ＴＳ ＤＮＡ）

【0477】

ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１に基づくＴｍ計算に関する注記：
所与のＴｍ値は、内部太字配列ｚｉとｚｉ’のヘアピンで６４℃、構造全体で５７．４℃である。

【0478】

離れた太字配列ｚｉとｚｉ’は４２．９℃でハイブリダイズする。

【0479】

離れた二重下線配列ＢｉとＢｉ’、及びＢｊとＢｊ’のＴｍは、それぞれ３５．１及び５０．３である。

【0480】

３つのヘアピン領域を合計すると、Ｔｍは６６．６になる。

【0481】

本実施例は、従来のＵｎｉＴａｑと同様、プライマーの１つにプローブが結合されたスプリットジップコード設計を使用する方法を示している。この実施例の利点は、プローブオリゴヌクレオチドが上流ＬＤＲプライマーまたは下流ＬＤＲプライマーのいずれにもハイブリダイズするが、２つに分離したＬＤＲプローブが共有結合し、互いにハイブリダイズできる場合にのみ両方にハイブリダイズすることである。上記のように、ＬＤＲ反応は１０ｎＭのプローブで実行され、ＵｎｉＴａｑ反応を開始するときに産物が１０倍に希釈される。これは、ＬＤＲプライマーの最大濃度が１ｎＭ、すなわちＵｎｉＴａｑプローブ濃度の約２５０～５００分の１であることを意味する。したがって、上記のように、プローブの２つが１ｎＭの場合、３方向のハイブリダイゼーションの可能性はゼロに低下する。ただし、ＬＤＲ産物が存在する場合は、それが増幅され、産物の全体濃度が増加して、単に１分子がそれ自体にハイブリダイズするだけになる（結合されたＵｎｉＴａｑプローブを含む増幅ＬＤＲ産物）。

【0482】

仮想実施例２１－分離したスプリットＵｎｉＴａｑプローブ（ＵｎｉＳｐＴｑ）を用いたＬＤＲプライマー設計の例
分離したスプリットＵｎｉＴａｑプローブを用いたＬＤＲプライマー設計の例：（Ｔｍ＝６５．２）（合計１５０ｂｐ；６０ｂｐ ＴＳ ＤＮＡ）

【0483】

ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１に基づくＴｍ計算に関する注記：
所与のＴｍ値は、内部太字配列ｚｉとｚｉ’のヘアピンで６４℃、構造全体で５６．３℃である。

【0484】

離れた太字配列ｚｉとｚｉ’は４４．７℃でハイブリダイズする。

【0485】

離れた二重下線配列ＢｉとＢｉ’、及びＢｊとＢｊ’のＴｍは、それぞれ４３．０及び４５．９である。

【0486】

３つのヘアピン領域を合計すると、Ｔｍは６５．２になる。

【0487】

本実施例は、分離プローブを用いたスプリットジップコード設計を使用する方法を示している。この実施例の利点は、プローブオリゴヌクレオチドが上流ＬＤＲプライマーまたは下流ＬＤＲプライマーのいずれにもハイブリダイズするが、２つに分離したＬＤＲプローブが共有結合し、互いにハイブリダイズできる場合にのみ両方にハイブリダイズすることである。さらに重要な点として、平均的なＰＣＲ実験では１００～５００ｎＭのプライマー濃度を使用するが、本明細書に記載のＬＤＲ反応では１０ｎＭのプライマー濃度を使用するとみなされる。産物はＵｎｉＴａｑ反応を開始するときに１０倍に希釈されるが、これは、ＬＤＲプライマーの最大濃度が１ｎＭ、すなわちＵｎｉＴａｑプローブ濃度の約２５０～５００分の１であることを意味する。したがって、プローブの２つが１ｎＭの場合、３方向のハイブリダイゼーションの可能性はゼロに低下する。ただし、ＬＤＲ産物が存在する場合は、それが増幅され、産物の全体濃度が増加して、単に２分子が互いにハイブリダイズするだけになる（増幅されたＬＤＲ産物とＵｎｉＴａｑプローブ）。

【0488】

仮想実施例２２－追加されたユニバーサルプローブ（ＵｎｉＬＤｑ）の等温ＲＮａｓｅＨ２切断を用いたｑＬＤＲプライマー設計の例
追加されたユニバーサルプローブ（ＵｎｉＬＤｑ；図２２）の等温ＲＮａｓｅＨ２切断を用いたｑＬＤＲプライマー設計の例：（Ｔｍ＝６４．８）（合計１４５ｂｐ；６０ｂｐ ＴＳ ＤＮＡ）

【0489】

ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１に基づくＴｍ計算に関する注記：
所与のＴｍ値は、内部太字配列ｔｉとｔｉ’のヘアピンで６７℃、構造全体で６７．７℃である。

【0490】

所与のＴｍ値は、内部斜字配列ｔｊとｔｊ’のヘアピンで６３．７℃、構造全体で６７．７℃である。

【0491】

離れた太字配列ｔｉとｔｉ’は３８．６℃でハイブリダイズする。

【0492】

離れた斜字配列ｔｊとｔｊ’は３７．２℃でハイブリダイズする。

【0493】

離れた二重下線配列ＢｉとＢｉ’、及びＢｊとＢｊ’のＴｍは、それぞれ３６．４及び４２．７である。

【0494】

４つの二本鎖ステム領域を合計すると、Ｔｍ値は６４．８になる。

【0495】

仮想実施例２３－追加された標的特異的プローブ（ＴｓＬＤｑ）の等温ＲＮａｓｅＨ２切断を用いたｑＬＤＲプライマー設計
追加された標的特異的プローブ（ＴｓＬＤｑ；図２３）の等温ＲＮａｓｅＨ２切断を用いたｑＬＤＲプライマー設計の例（Ｔｍ＝６２）（合計８４ｂｐ、Ｂ－ｒａｆ Ｖ６００Ｅ変異の例）。

【0496】

ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１に基づくＴｍ計算に関する注記：
上流及び下流のＬＤＲプライマーの組み合わせ部分

１４－ｍｅｒ、Ｔｍ５０．５℃

【0497】

離れた二重下線配列Ｂｉ及びＢｉ’：

のＴｍは４７．８℃である。

【0498】

２つの二本鎖ステム領域を合計すると、Ｔｍ値は６２℃になる。

【0499】

本明細書で好ましい実施形態を示し、詳細に説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の変更、追加、置換などがなされ得るため、これらも以下の特許請求の範囲に規定されるような本発明の範囲内にあるとみなされることは当業者に明らかであろう。

【0500】

配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> Cornell University
<120> DEVICES, PROCESSES, AND SYSTEMS FOR DETERMINATION OF NUCLEIC ACID
SEQUENCE, EXPRESSION, COPY NUMBER, OR METHYLATION CHANGES USING
COMBINED NUCLEASE, LIGASE, POLYMERASE, AND SEQUENCING REACTIONS
<150> US 62/478,412
<151> 2017-03-29
<160> 67
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> n at positions 1-16 can be a, g, c, or t
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nnnnnnnnnn nnnnnngtca gcta 24

<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> n at positions 1-16 can be a, g, c, or t
<400> 2
nnnnnnnnnn nnnnnngtca atcg 24

<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> n at positions 1-16 can be a, g, c, or t
<400> 3
nnnnnnnnnn nnnnnngtca tagc 24

<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> n at positions 1-16 can be a, g, c, or t
<400> 4
nnnnnnnnnn nnnnnngtca cgat 24

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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
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<400> 5
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<212> DNA
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<223> primer
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<400> 6
nnnnnnnnnn nnnnnnactg atcg 24

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<212> DNA
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<223> primer
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<222> (1)..(16)
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<400> 7
nnnnnnnnnn nnnnnnactg tagc 24

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<212> DNA
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<223> primer
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<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> n at positions 1-16 can be a, g, c, or t
<400> 8
nnnnnnnnnn nnnnnnactg cgat 24

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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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<221> misc_feature
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<223> primer
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<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
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nnnnnnnnnn nnnnnntgac atcg 24

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<212> DNA
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<223> primer
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<222> (1)..(16)
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nnnnnnnnnn nnnnnntgac tagc 24

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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> n at positions 1-16 can be a, g, c, or t
<400> 12
nnnnnnnnnn nnnnnntgac cgat 24

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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> n at positions 1-16 can be a, g, c, or t
<400> 13
nnnnnnnnnn nnnnnncagt gcta 24

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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> n at positions 1-16 can be a, g, c, or t
<400> 14
nnnnnnnnnn nnnnnncagt atcg 24

<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> n at positions 1-16 can be a, g, c, or t
<400> 15
nnnnnnnnnn nnnnnncagt tagc 24

<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> n at positions 1-16 can be a, g, c, or t
<400> 16
nnnnnnnnnn nnnnnncagt cgat 24

<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
tcagtatcgg cgtagtcacc tgttttgttg atcactatcg ga 42

<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
tcgacgatag gtttccgcac tcacaggcag ctagcgatag tac 43

<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 can be a, g, c, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 is RNA
<400> 19
tcacanggca gcacaacaaa acatcagtat cggcgtagtc acc 43

<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
tcgacgatag gtttccgcac 20

<210> 21
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 can be a, g, c, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 is RNA
<400> 21
tcacanggca gcacaacaaa acatcagtat cggcgtagtc acctgttttg ttgatcacta 60
tcgga 65

<210> 22
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
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<400> 22
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntc cgatagtgaa agcgatagta c 51

<210> 23
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> n at positions 1-28 can be a, g, c, or t
<400> 23
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngt actatcgcta gctgcctgtg agtgcggaaa 60
cctatcgtcg a 71

<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
tccgatagtg aaagcgatag tac 23

<210> 25
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 can be a, g, c, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 is RNA
<400> 25
tcacanggca gcacaacaaa acatcagtat cggcgtagtc acctgttttg ttgatcacta 60
tcgga 65

<210> 26
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(56)
<223> n at positions 1-56 can be a, g, c, or t
<400> 26
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnngtac 60
tatcgctagc tgcctgtgag tgcggaaacc tatcgtcga 99

<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
tcagtatcgg cgtagtcacc gagtttcctt gatcactatc gga 43

<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
tcgacgatag gtttccgcac tcacagtcag ctagcgatag tac 43

<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
tcagtatcgg cgtagtcacc 20

<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
tcgacgatag gtttccgcac 20

<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 can be a, g, c, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 is RNA
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tcacangtca gcacaaggaa actc 24

<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 can be a, g, c, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 is RNA
<400> 32
tcacangtca gcacaaggaa actc 24

<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 33
tcagtatccg cgtagtcacc gagtttcctt gatcactatc gga 43

<210> 34
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> n at positions 1-28 can be a, g, c, or t
<400> 34
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntc cgatagtgaa agcgatagta c 51

<210> 35
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> n at positions 1-28 can be a, g, c, or t
<400> 35
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngt actatcgcta gctgactgtg agtgcggaaa 60
cctatcgtcg a 71

<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 36
tccgatagtg aaagcgatag tac 23

<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 can be a, g, c, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 is RNA
<400> 37
tcacangtca gcacaaggaa actc 24

<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 38
tcagtatccg cgtagtcacc gagtttcctt gatcactatc gga 43

<210> 39
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(56)
<223> n at positions 1-56 can be a, g, c, or t
<400> 39
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnngtac 60
tatcgctagc tgactgtgag tgcggaaacc tatcgtcga 99

<210> 40
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 40
tcagtatcgg cgtagtcacc ctgttttgtt gatcactatc ggac 44

<210> 41
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> n at positions 1-30 can be a, g, c, or t
<400> 41
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtccgatagt gaagctgcct gtgaggtgcg 60
gaaacctatc gtcga 75

<210> 42
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 42
ctcacaggca gcacaacaaa acagtcagta tcggcgtagt cacc 44

<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 43
tcgacgatag gtttccgcac 20

<210> 44
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 44
ctcacaggca gcacaacaaa acagtcagta tcggcgtagt caccctgttt tgttgatcac 60
tatcggac 68

<210> 45
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> n at positions 1-60 can be a, g, c, or t
<400> 45
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
gtccgatagt gaagctgcct gtgaggtgcg gaaacctatc gtcga 105

<210> 46
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 46
tcagtatcgg cgtagtcacc cgagtttcct tgatcacttt cggac 45

<210> 47
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> n at positions 1-30 can be a, g, c, or t
<400> 47
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtccgaaagt gaagctgact gtgaggtgcg 60
gaaacctatc gtcga 75

<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 48
tcagtatcgg cgtagtcacc 20

<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 49
tcgacgatag gtttccgcac 20

<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 50
ctcacagtca gcacaaggaa actcg 25

<210> 51
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 51
tcagtatcgg cgtagtcacc cgagtttcct tgatcacttt cggac 45

<210> 52
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> n at positions 1-60 can be a, g, c, or t
<400> 52
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
gtccgaaagt gaagctgact gtgaggtgcg gaaacctatc gtcga 105

<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 53
gagtttcctt gatcactatc gga 23

<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n at position 13 can be a, g, c, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n at position 13 is RNA
<400> 54
tccgatagtg aanagcgg 18

<210> 55
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 55
agcgatagta c 11

<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 56
gtactatcgc tagctgactg tga 23

<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 can be a, g, c, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 is RNA
<400> 57
tcacangtca gcacaaggaa actc 24

<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 58
gagtttcctt gatcactatc gga 23

<210> 59
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> n at positions 1-30 can be a, g, c, or t
<400> 59
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tccgatagtg aa 42

<210> 60
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(41)
<223> n at positions 12-41 can be a, g, c, or t
<400> 60
agcgatagta cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 41

<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 61
gtactatcgc tagctgactg tga 23

<210> 62
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> n at position 48 can be a, g, c, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> n at position 48 is RNA
<400> 62
cgagtttcct tggagtccta aataggtgat tttggtctag ctacgganga gac 53

<210> 63
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 63
gaaatctcga tggagtgggt cccatttggt acgagat 37

<210> 64
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 64
cgagtttcct tggagtccta aataggtgat tttggtctag ctacggagaa atctcgatgg 60
agtgggtccc atttggtacg agat 84

<210> 65
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 can be a, g, c, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n at position 6 is RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n at position 7 is u
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n at position 7 is an RNA
<400> 65
cgagannttc tccgtaccaa ggaaactcg 29

<210> 66
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 66
acggagaaat ctcg 14

<210> 67
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 67
cgagtttcct tgg 13

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【配列表】

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