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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-25
(45)【発行日】2025-01-09
(54)【発明の名称】免疫原性アルギナーゼ２ポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 7/08 20060101AFI20241226BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20241226BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20241226BHJP
C12N 9/14 20060101ALI20241226BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20241226BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20241226BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20241226BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241226BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241226BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241226BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241226BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241226BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20241226BHJP
【ＦＩ】
C07K7/08 ZNA
C07K7/06
C07K14/47
C12N9/14
A61K39/00 H
A61K38/10
A61K39/39
A61P43/00 111
A61P35/00
A61P37/04
A61K39/395 N
A61P35/02
C12N15/55
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2021526247
(86)(22)【出願日】2019-11-14
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-18
(86)【国際出願番号】 EP2019081369
(87)【国際公開番号】W WO2020099582
(87)【国際公開日】2020-05-22
【審査請求日】2022-08-22
(31)【優先権主張番号】1818576.9
(32)【優先日】2018-11-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】518289427
【氏名又は名称】アイオー バイオテック エーピーエス
【氏名又は名称原語表記】ＩＯ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡｐＳ
【住所又は居所原語表記】Ｏｌｅ Ｍａａｌｏｅｓ Ｖｅｊ ３， ２２００ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｎ， Ｄｅｎｍａｒｋ
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アンデルセン，マッズ ハルド
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０６５５６３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】欧州特許出願公開第０１０３３４０１（ＥＰ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１８／０３２０２０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１２－５０７３０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１４９１５０（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号５１の少なくとも２１、２２および２３位のアミノ酸を含み、配列番号５１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列を含むまたはそれからなり、最大で５０アミノ酸の長さを有する、ヒトアルギナーゼ２（配列番号５１）の免疫原性断片である、ポリペプチド。
【請求項2】
配列番号５１の最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個の連続したアミノ酸を含むまたはそれらからなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
配列番号５９、５８、５７、５４、５５、５６、２または３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０もしくは４５アミノ酸の最大長を有する、および／またはＣ末端アミノ酸が対応するアミドに置き換えられている、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドおよびアジュバントを含む、組成物。
【請求項6】
少なくとも１つの薬学上許容可能な希釈剤、担体または保存剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記アジュバントが、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、油／界面活性剤ベースのアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、イミダゾキノリン、およびモンタニドＩＳＡアジュバントからなる群から選択される、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項8】
対象における癌を治療または予防する方法であって、ポリペプチドまたは組成物を対象に投与することを含む方法に使用するための、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項５～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記方法が、さらなる癌療法の同時投与または逐次投与をさらに含む、請求項８に記載のポリペプチドまたは組成物。
【請求項10】
前記さらなる癌療法が、免疫系チェックポイント阻害剤である、請求項９に記載のポリペプチドまたは組成物。
【請求項11】
前記免疫系チェックポイント阻害剤が抗体である、請求項１０に記載のポリペプチドまたは組成物。
【請求項12】
前記抗体が抗ＰＤ１抗体である、請求項１１に記載のポリペプチドまたは組成物。
【請求項13】
前記癌が、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌、もしくは小腸癌であるか、または結腸直腸癌もしくは胃癌であるか、または黒色腫であるか、または白血病である、請求項８～１２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは組成物。
【請求項14】
前記白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１３の記載のポリペプチドまたは組成物。
【請求項15】
前記癌が、免疫系チェックポイント阻害剤を用いた治療に抵抗性である、請求項８～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは組成物。
【請求項16】
アルギナーゼ２特異的Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激する方法であって、前記方法が、細胞を請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項５～７のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項17】
前記細胞が、健常対象または癌患者から採取されたサンプル中に存在する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記サンプルが腫瘍サンプルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、アルギナーゼ２に由来する新規なポリペプチドに関する。本発明はまた、ポリペプチドの使用と、ポリペプチド含む組成物に関する。
本発明は、アルギナーゼ２に由来する新規なポリペプチドに関する。本発明はまた、ポリペプチドの使用と、ポリペプチド含む組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
アルギナーゼは、アミノ酸Ｌ－アルギニンをＬ－オルニチンおよび尿素に変換する反応を触媒する酵素である。これは、アルギニンの微小環境を枯渇させ、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答の抑制をもたらす。アルギナーゼ活性の増大が、例えば、乳癌、肺癌、結腸癌または前立腺癌を有する患者の癌細胞において検出されている。ラットアルギナーゼ遺伝子をトランスフェクトしたマウスマクロファージは、共培養された腫瘍細胞の増殖を促進することが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で示されている。さらに、マクロファージによるアルギナーゼ発現の誘導は、ポリアミン合成を介した腫瘍血管新生を増大させることが示されている。マウス肺癌モデルの結果から、高レベルのアルギナーゼを発現する成熟腫瘍関連骨髄性細胞の亜集団が存在したことが示された。これらの腫瘍関連骨髄性細胞は、細胞外Ｌ－アルギニンを枯渇させ、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抗原特異的増殖を阻害した。アルギナーゼ阻害剤の注入により、マウスにおける肺癌の成長が遮断された。これは、腫瘍細胞および腫瘍関連骨髄性細胞におけるアルギナーゼ発現の誘導が、ＴＩＬに対する負の効果を介した抗腫瘍免疫応答の抑制によって、どのように腫瘍成長を促進し得るかを示すものである。
アルギナーゼは、アミノ酸Ｌ－アルギニンをＬ－オルニチンおよび尿素に変換する反応を触媒する酵素である。これは、アルギニンの微小環境を枯渇させ、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答の抑制をもたらす。アルギナーゼ活性の増大が、例えば、乳癌、肺癌、結腸癌または前立腺癌を有する患者の癌細胞において検出されている。ラットアルギナーゼ遺伝子をトランスフェクトしたマウスマクロファージは、共培養された腫瘍細胞の増殖を促進することが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で示されている。さらに、マクロファージによるアルギナーゼ発現の誘導は、ポリアミン合成を介した腫瘍血管新生を増大させることが示されている。マウス肺癌モデルの結果から、高レベルのアルギナーゼを発現する成熟腫瘍関連骨髄性細胞の亜集団が存在したことが示された。これらの腫瘍関連骨髄性細胞は、細胞外Ｌ－アルギニンを枯渇させ、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抗原特異的増殖を阻害した。アルギナーゼ阻害剤の注入により、マウスにおける肺癌の成長が遮断された。これは、腫瘍細胞および腫瘍関連骨髄性細胞におけるアルギナーゼ発現の誘導が、ＴＩＬに対する負の効果を介した抗腫瘍免疫応答の抑制によって、どのように腫瘍成長を促進し得るかを示すものである。
【0003】
ＭＤＳＣ（骨髄由来免疫抑制細胞）は、エフェクターＴ細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化、増殖、および細胞傷害性を阻害するとともに、Ｔｒｅｇの分化および増殖を誘導する。癌細胞およびＭＤＳＣの両方とも、酵素の一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）およびアルギナーゼを介したＬ－アルギニン代謝を操作することによって、Ｔ細胞を抑制し得る。多くの腫瘍は、アルギナーゼおよび誘導性ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）の発現の亢進を示し、腫瘍微小環境からのアルギニン枯渇をもたらす。いくつかの研究が、腫瘍特異的Ｔ細胞応答の抑制におけるこの変化した腫瘍アルギニン代謝の重要性を強調しており、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）芽球がＴ細胞増殖および造血幹細胞を阻害するアルギナーゼ依存的能力を示すことが、最近実証された。さらに、アルギナーゼおよびｉＮＯＳ阻害剤は、ＡＭＬの抑制活性を低減させる。
【0004】
哺乳動物において、２つのアルギナーゼアイソエンザイム：アルギナーゼ１およびアルギナーゼ２が存在する。この２つのアイソエンザイムは、同じ生化学的反応を触媒するが（よって、酵素アッセイにより区別することができない）、細胞発現、調節および細胞内局在において異なっている。
【発明の概要】
【0005】
本発明者らは、免疫原性に関する「ホットスポット」であるアルギナーゼ１およびアルギナーゼ２の５０アミノ酸領域を以前に同定した。この領域は、全長ヒトアルギナーゼ１（配列番号５３）の１６１～２１０位もしくは全長ヒトアルギナーゼ２（配列番号５１）の１８０～２２９位、またはマウスアルギナーゼの対応する位置に相当する。この領域およびそれに由来するペプチドは、ＷＯ２０１８０６５５６３に記載されている。本発明者らはまた、アルギナーゼ１の「ホットスポット」領域に由来するポリペプチドの特異的なサブセットが、免疫応答を刺激するのに特に有効であることを同定した。これらのペプチドは、全長ヒトアルギナーゼ１の１６９～２０６位、全長ヒトアルギナーゼ１の１６９～２００位または全長ヒトアルギナーゼ１の１６９～２１０位（またはヒトアルギナーゼ２もしくはマウスアルギナーゼ１の対応する位置）に相当する。このポリペプチドのこのサブセットは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０７５７３１およびその優先権出願ＧＢ１８１５５４９．９において記載されている。
【0006】
本発明者らは今回、ヒトアルギナーゼ２の全体的に異なる領域に由来するポリペプチドが、免疫応答を刺激するのに特に有効であることを同定した。意外にも、この領域は、ヒトアルギナーゼ２の輸送ペプチドのＣ末端（配列番号５１の２２位 － 図７における概略図を参照）に及ぶ。ヒトアルギナーゼ１に対する配列同一性は、この領域において比較的低い。
【0007】
本発明のポリペプチドは、アルギナーゼ２およびアルギナーゼ２発現細胞に対する有益な免疫応答を刺激するのに特に有効であることが期待される。癌に対する新規な免疫療法の開発には、病因に関与する分子および免疫系によって認識される特異タンパク質の完全な理解が必要である。臨床現場において、アルギナーゼ特異的免疫応答の誘導は、癌細胞の死滅に加えて、一般に、アルギナーゼ発現細胞、特にＭＤＳＣおよび腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の免疫抑制機能を抑制することによって、抗癌免疫応答を支持し得る。したがって、アルギナーゼ発現細胞は、例えば、本発明のポリペプチドのワクチン接種により、骨髄性樹状細胞を標的とする他の免疫療法アプローチの所望の効果と拮抗するため、結果として、さらなる抗癌免疫療法と高度に相乗的となるであろう。
【0008】
本発明は、（ｉ）配列番号５１の少なくとも２１、２２および２３位のアミノ酸を含む、または（ｉｉ）配列番号５１の１８０～２２９位から選択される、配列番号５１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列を含むまたはそれからなる、ヒトアルギナーゼ２（配列番号５１）の免疫原性断片であるポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、（ｉ）または（ｉｉ）に定義される配列番号５１の最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個の連続したアミノ酸を含み得るまたはそれらからなり得る。前記ポリペプチドは、配列番号５９、５８、５７、５４、５５、５６、２、３、１９、２０、２１、６０または６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得る。前記ポリペプチドは、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０アミノ酸の最大長を有し得る、および／またはＣ末端アミノ酸が対応するアミドに置き換えられている。前記ポリペプチドは、単離され得る。
【0009】
本発明はまた、（ｉ）配列番号５２の少なくとも２１、２２および２３位のアミノ酸を含む、または（ｉｉ）配列番号５２の１８０～２２９位から選択される、配列番号５２の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列を含むまたはそれからなる、マウスアルギナーゼ２（配列番号５２）の免疫原性断片であるポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、（ｉ）または（ｉｉ）に定義される配列番号５２の最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個の連続したアミノ酸を含み得るまたはそれらからなり得る。前記ポリペプチドは、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０アミノ酸の最大長を有し得る、および／またはＣ末端アミノ酸が対応するアミドに置き換えられている。前記ポリペプチドは、単離され得る。
【0010】
本発明はまた、本発明のポリペプチド、少なくとも１つの薬学上許容可能な希釈剤、担体または保存剤、および場合によりアジュバントを含む組成物を提供する。
【0011】
本発明はまた、対象における疾患または病態を治療または予防する方法であって、本発明のポリペプチドまたは組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図2】図２は、ホットスポット領域に相当するＡＲＧ２ペプチドが、健常ドナーおよび黒色腫患者（ＡＡ９１４．３０）由来のＰＢＭＣにより認識されることを示す。スポット数は、ペプチドで刺激したウェルおよびペプチドなしの対照ウェルの平均の差として示す。ウェルあたり５×１０５個の細胞を播種し、ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。応答は、分布によらないリサンプリング（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｆｒｅｅ ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ：ＤＦＲ）法を用いて分析した。
【図3】図３は、複数のＡＲＧ２ライブラリーペプチドが、健常ドナー由来のＰＢＭＣにより認識されることを示す。スポット数は、ペプチドで刺激したウェルおよびペプチドなしの対照ウェルの平均の差として示す。ウェルあたり４～４．５×１０５個の細胞を播種し、ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。ボックスは、６例の健常ドナーのスクリーニング後に最も高く、かつ最も多くの応答を示すペプチドを表す。
【図4】図４は、ホットスポット領域のペプチドに対する応答を検証するものである。スポット数は、ペプチドで刺激したウェルおよびペプチドなしの対照ウェルの平均の差として示す。ウェルあたり５×１０５個の細胞を播種し、ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。ボックスは、得られた応答のより容易な比較のために、ほぼ同一の配列を有するペプチドを表す。
【図5】図５は、ＡＲＧ２＿１、ＡＲＧ２＿５、ＡＲＧ２＿８、ＡＲＧ２＿１３およびＡＲＧ２＿２２に対する応答の検証を示す。スポット数は、ペプチドで刺激したウェルおよびペプチドなしの対照ウェルの平均の差として示す。ペプチド刺激ありまたはなしのウェルあたり３×１０５個の細胞を播種し、三重反復で行った。強い顕著な応答が、ＡＲＧ２＿１に対して認められた。
【図6A】図６Ａおよび６Ｂは、ＡＲＧ２＿１またはペプチドなしに対する２例の健常ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を示す。ＰＢＭＣ細胞をＣＤ４抗体で染色し、ＡＲＧ２＿１刺激ありまたはなしでのフローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン放出アッセイにおいて分析した。ＣＤ４細胞は、ＡＲＧ２由来ペプチドで刺激された場合、ＩＦＮ－ガンマ（ｙ軸）またはＴＮＦ－アルファ（ｘ軸）の両方を放出することが、図から確認できる。
【図6B】図６Ａおよび６Ｂは、ＡＲＧ２＿１またはペプチドなしに対する２例の健常ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を示す。ＰＢＭＣ細胞をＣＤ４抗体で染色し、ＡＲＧ２＿１刺激ありまたはなしでのフローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン放出アッセイにおいて分析した。ＣＤ４細胞は、ＡＲＧ２由来ペプチドで刺激された場合、ＩＦＮ－ガンマ（ｙ軸）またはＴＮＦ－アルファ（ｘ軸）の両方を放出することが、図から確認できる。
【図8】図８は、ホットスポット領域に相当するＡＲＧ２ペプチドが、健常ドナー（ＢＣまたはＢｕｆ－Ｍ）および癌患者（ＡＡ、黒色腫；ＵＲ、腎細胞癌）由来のＰＢＭＣにより認識されることを示す。スポット数は、ペプチドで刺激したウェルおよびペプチドなしの対照ウェルの平均の差として示す。ウェルあたり４×１０５個の細胞を播種し、ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。応答は、分布によらないリサンプリング（ＤＦＲ）法を用いて分析した。＊－ｐ≦０．０５、＊＊－ｐ≦０．０１。
【図9】図９は、ＡＲＧ２＿１またはペプチドなしに対する１例の癌患者のＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答を示す。ＰＢＭＣ細胞をＣＤ８抗体で染色し、ＡＲＧ２＿１刺激ありまたはなしでのフローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン放出アッセイにおいて分析した。ＴＮＦ－アルファの多少のバックグラウンド放出が認められたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＡＲＧ２由来ペプチドで刺激された場合、より多くのＩＦＮ－ガンマ（ｙ軸）およびＴＮＦ－アルファ（ｘ軸）を放出することが、図から確認できる。
【図10】図１０は、前刺激なしで、ＥＬＩＳＰＯＴプレート中で＋／－ペプチドによる７２時間インキュベーションを行った後の、ＡＲＧ２＿１に対するｅｘ ｖｉｖｏ ＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す。ペプチドＡＲＧ２＿１ありまたはなし（対照）のウェルに、ウェルあたり９×１０５個の細胞を播種し、三重反復で行った。スポット数は、ペプチドで刺激したウェルおよびペプチドなしの対照ウェルの平均として示す。
【図11】図１１は、ｉｎ ｖｉｖｏマウスＡｒｇ２試験に関する実験スキームを示す。各群３匹のマウスに対し、６つのペプチドのうち１つを皮下ワクチン接種する。７日後、マウスを屠殺し、脾臓をホモジナイズし、ＰＢＭＣをｍＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴに使用する。
【図12】図１２は、図１１の実験後に行ったｍＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。スポット数は、ペプチドで刺激したウェルおよびペプチドなしの対照の平均の差として示す。ペプチドありまたはなしのウェルに、ウェルあたり８×１０５個の細胞を播種し、三重反復で計数した。角括弧は、同じペプチドをワクチン接種されたマウスを表し、ボックスは、最も強くかつ最も顕著な応答を示すマウスを強調するものである。
【図13】図１３は、ｍＡＲＧ２＿１８８－１９６のワクチン接種は、ｍＡｒｇ２＿１８８－１９６およびｍＡｒｇ２＿１８２－１９７の両方に対して強いｍＩＦＮγ応答を与えることを示す。ウェルあたり８×１０５個の細胞を播種し、ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。
【図14】図１４は、ＡＲＧ２－１は、健常ドナーおよび固形腫瘍またはＡＭＬを有する癌患者の両方に由来する両ＰＭＢＣにより広く認識されることを示す。（Ａ）健常ドナー（ｎ＝３３）、固形腫瘍を有する癌患者（ｎ＝１９）またはＡＭＬを有する癌患者（ｎ＝１９）由来のＰＭＢＣにおけるＡＲＧ２－１ペプチドに対するＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。ウェルあたり３～４×１０５個の細胞を播種した。ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。各スポットは、１例のドナーを表し、ペプチド特異的ＩＦＮγ分泌細胞の数（ペプチドで刺激したウェルおよび対照ウェルの平均の差）を示す。（Ｂ）ＡＲＧ２－１による刺激ありまたは非刺激対照に関する、健常ドナー（ＨＤ４９およびＨＤ５０）および固形腫瘍を有する癌患者（ＡＡ２７）におけるＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生に対する代表的な細胞内サイトカイン染色。
【図15A】図１５は、長鎖ＡＲＧ２ペプチドＡ２Ｌ２は、健常ドナーおよび癌患者において強く頻繁なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することを示す。（Ａ）６例の健常ドナー由来のＰＢＭＣにおける長鎖ペプチドＡ２Ｌ１、Ａ２Ｌ２およびＡ２Ｌ３に対するＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。ウェルあたり４×１０５個の細胞を播種し、ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。特異的スポット数（ペプチド特異的ＩＦＮγ分泌細胞）は、ペプチドで刺激したウェルおよび対照ウェルの平均のＩＦＮγスポットの数の差として示す。ペプチドに対する応答は、３つの設定において測定不能多数（ＴＮＴＣ）であり、７５０超のスポットとした。
【図15B】図１５は、長鎖ＡＲＧ２ペプチドＡ２Ｌ２は、健常ドナーおよび癌患者において強く頻繁なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することを示す。（Ｂ）６例の健常ドナー由来のＰＢＭＣにおけるＡ２Ｌ２およびＡＲＧ２－１に対するＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。ウェルあたり４×１０５個の細胞を播種し、ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。特異的スポット数（ペプチド特異的ＩＦＮγ分泌細胞）は、ペプチドで刺激したウェルおよび対照ウェルのＩＦＮγスポットの平均数の差として示す。分布によらないリサンプリング法に従って、＊ ｐ≦０．０５または＊＊ ｐ≦０．０１。
【図15C】図１５は、長鎖ＡＲＧ２ペプチドＡ２Ｌ２は、健常ドナーおよび癌患者において強く頻繁なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することを示す。（Ｃ）健常ドナー（ｎ＝３０）および固形腫瘍を有する癌患者（ｎ＝１８）由来のＰＢＭＣにおけるＡ２Ｌ２ペプチドに対するＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。ウェルあたり３～４×１０５個の細胞を播種した。ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。各スポットは、１例のドナーを表し、ペプチド特異的ＩＦＮγ分泌細胞の数（ペプチドで刺激したウェルおよび対照ウェルの平均の差）を示す。
【図15D】図１５は、長鎖ＡＲＧ２ペプチドＡ２Ｌ２は、健常ドナーおよび癌患者において強く頻繁なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することを示す。（Ｄ）Ａ２Ｌ２による刺激ありまたは刺激なしの対照について、健常ドナー（ＨＤ４８およびＨＤ５３）および固形腫瘍を有する癌患者（ＡＡ２７）におけるＩＦＮγおよびＴＦＮａの産生に対する代表的な細胞内サイトカイン染色。
【図15E】図１５は、長鎖ＡＲＧ２ペプチドＡ２Ｌ２は、健常ドナーおよび癌患者において強く頻繁なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することを示す。（Ｅ）２つのペプチドに対する応答の大きさの比較のための、健常ドナー（ｎ＝２６）および固形腫瘍を有する癌患者（ｎ＝１１）由来のＰＢＭＣにおけるＡＲＧ２－１およびＡ２Ｌ２に対するＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。ウェルあたり４×１０５個の細胞を播種し、ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。特異的スポット数（ペプチド特異的ＩＦＮγ分泌細胞）は、ペプチドで刺激したウェルおよび対照ウェルのＩＦＮγスポットの平均数の差として示す。ｎｓ：ｐ＝０．７０３８。
【図16A】図１６は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２発現樹状細胞を認識することを示す。（Ａ）ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞を、前立腺癌を有する患者から増殖させた。Ｔ細胞培養物の特異性を、ペプチドで刺激した細胞および刺激なしの対照におけるＴＮＦαおよびＩＦＮγの産生に対する細胞内サイトカイン染色により評価した。左：ＡＲＧ２－１ペプチド刺激細胞および刺激なしの（対照）細胞に対するドットプロット。右：対照の刺激（ペプチドなし）、ＡＲＧ２－１ペプチド刺激またはＡ２Ｌ２ペプチド刺激に応答したＩＦＮγ、ＴＮＦαまたは両方を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（％）。
【図16B】図１６は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２発現樹状細胞を認識することを示す。（Ｂ）対照の刺激（ペプチドなし）、ＡＲＧ２－１ペプチドまたはＡ２Ｌ２ペプチドに対するＥＬＩＳＰＯＴ応答により評価したＡＲＧ２特異的Ｔ細胞の特異性。ウェルあたり４×１０４個の細胞を播種した。ＴＮＴＣ＝測定不能多数（５００スポット超）。
【図16C】図１６は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２発現樹状細胞を認識することを示す。（Ｃ）ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞のＨＬＡ拘束性を調べた。異なるクラスＩＩ遮断剤の存在下におけるＡＲＧ２－１ペプチドに対するＡＲＧ２特異的Ｔ細胞のＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。
【図16D】図１６は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２発現樹状細胞を認識することを示す。（Ｄ）関連のない対照ｍＲＮＡ（疑似ｍＲＮＡ）またはＡＲＧ２ ｍＲＮＡでトランスフェクトした自家樹状細胞に対するＡＲＧ２特異的Ｔ細胞によるＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。エフェクター：標的比５：１で、ウェルあたり５×１０４個のエフェクター細胞を播種した。分布によらないリサンプリング法に従って、＊ ｐ≦０．０５または＊＊ ｐ≦０．０１。
【図17A】図１７は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ａ）ＨＬＡマッチ悪性細胞を同定するために、ＡＲＧ２－１ペプチドで予めパルスした異なる関連癌細胞株に対するＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答において、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞を調べた。ペプチド刺激なしの同じ癌細胞株を、対照として調べた。エフェクター：標的比１：１で、ウェルあたり１×１０４個のエフェクター細胞を播種した。分布によらないリサンプリング法に従って、＊ ｐ≦０．０５または＊＊ ｐ≦０．０１。ＴＮＴＣ＝測定不能多数（＞５００）。
【図17B】図１７は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ｂ）ＡＲＧ２－１ペプチドおよびクラスＩＩ遮断剤でパルスしたＴＨＰ－１細胞に対するＡＲＧ２特異的Ｔ細胞のＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。
【図17C】図１７は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ｃ）異なるサイトカインとともにＴＨＰ－１細胞を４８時間インキュベーションした後のＲＴ－ｑＰＣＲにより評価したＴＨＰ－１におけるＡＲＧ２発現量。データは、非刺激ＴＨＰ－１細胞に対する倍数変化、平均＋ＳＤ、ｎ＝４として表す。
【図17D】図１７は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ｄ）サイトカインカクテルで刺激したＴＨＰ－１細胞に対するＡＲＧ２特異的Ｔ細胞のＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。エフェクター：標的比５：１で、ウェルあたり１．５×１０５個のエフェクター細胞を播種した。分布によらないリサンプリング法に従って、＊＊ ｐ≦０．０１およびｎｓ＝有意ではない。
【図17E】図１７は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ｅ）刺激なしのＴＨＰ－１細胞またはサイトカインカクテルで前刺激したＴＨＰ－１細胞とともに４８時間インキュベートした場合の、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞からのＴＮＦαおよびＩＦＮγの産生の細胞内染色。エフェクター：標的比２：１で、条件あたり５００，０００個のエフェクター細胞を使用した。
【図17F】図１７は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ｆ）サイトカインカクテルとともに４８時間インキュベーションした後のＲＴ－ｑＰＣＲにより評価したＴＨＰ－１細胞におけるＡＲＧ１およびＡＲＧ２の発現量。刺激なしのＴＨＰ－１細胞は、対照としての役割を果たした。データは、ハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢに対する相対発現量、平均＋ＳＤ、ｎ＝４として表す。
【図17G】図１７は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ｇ）サイトカインカクテル（ＴＨＰ－１＋サイトカイン）およびクラスＩＩ遮断剤、ａＨＬＡ－ＤＲで刺激したＴＨＰ－１細胞に対するＡＲＧ２特異的Ｔ細胞のＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。エフェクター：標的比５：１で、ウェルあたり１．５×１０５個のエフェクター細胞を播種した。分布によらないリサンプリング法に従って、＊＊ ｐ≦０．０１およびｎｓ＝有意ではない。
【図17H】図１７は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ｈ）サイトカインカクテルまたはＩＦＮγによる４８時間の刺激後のＲＴ－ｑＰＣＲにより評価したＴＨＰ－１細胞におけるＡＲＧ２発現量。刺激なしのＴＨＰ－１細胞は、対照として使用する。データは、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬＰＯに対する相対発現量、平均＋ＳＤ、ｎ＝４として表す。
【図17I】図１７は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ｉ）サイトカインカクテル（ＴＨＰ－１＋サイトカイン）またはＩＦＮγ（ＴＨＰ－１＋ＩＦＮγ）で前刺激したＴＨＰ－１細胞に対するＡＲＧ２特異的Ｔ細胞のＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。エフェクター：標的比２．５：１で、ウェルあたり５×１０４個のエフェクター細胞を播種した。分布によらないリサンプリング法に従って、＊＊ ｐ≦０．０１およびｎｓ＝有意ではない。
【図18A】図１８は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ａ）サイトカインカクテルとともに４８時間インキュベーションした後のＲＴ－ｑＰＣＲにより評価したＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１（ＭＭ１）細胞におけるＡＲＧ２発現量。データは、刺激なしのＭＭ１細胞に対する倍数変化、平均＋ＳＤ、ｎ＝４として表す。
【図18B】図１８は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ｂ）サイトカインカクテルまたはＩＦＮγとともに４８時間インキュベーションした後のＲＴ－ｑＰＣＲにより評価したＭＭ１細胞におけるＡＲＧ２発現量。データは、刺激なしのＭＭ１細胞に対する倍数変化、平均＋ＳＤ、ｎ＝４として表す。
【図18C】図１８は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、ＡＲＧ２を発現する悪性骨髄性細胞を認識することを示す。（Ｃ）サイトカインカクテル（ＭＭ１＋サイトカインカクテル）またはＩＦＮγ（ＭＭ１＋ＩＦＮγ）で前刺激したＭＭ１細胞に対するＡＲＧ２特異的Ｔ細胞のＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。エフェクター：標的比２．５：１で、ウェルあたり５×１０４個のエフェクター細胞を播種した。分布によらないリサンプリング法に従って、＊＊ ｐ≦０．０１およびｎｓ＝有意ではない。
【図19A】図１９は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞によるＡＲＧ２発現細胞の認識は、標的細胞の抗原プロセシング機構に加えて、ＡＲＧ２発現のレベルに依存することを示す。（Ａ）刺激なしの、またはサイトカインカクテルで前刺激した、およびＡＲＧ１またはＡＲＧ２ ｍＲＮＡで疑似トランスフェクトしたまたはトランスフェクトしたＴＨＰ－１細胞に対するＡＲＧ２特異的Ｔ細胞のＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答。エフェクター：標的比２．５：１で、ウェルあたり５×１０４個のエフェクター細胞を播種した。分布によらないリサンプリング法に従って、＊＊ ｐ≦０．０１およびｎｓ＝有意ではない。
【図19B】図１９は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞によるＡＲＧ２発現細胞の認識は、標的細胞の抗原プロセシング機構に加えて、ＡＲＧ２発現のレベルに依存することを示す。（Ｂ）刺激なしのＴＨＰ－１細胞またはサイトカインカクテルで前刺激し、次いで、疑似（疑似）トランスフェクションまたはＡＲＧ２ ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）トランスフェクションのいずれかを行ったＴＨＰ－１細胞とともにインキュベートした場合の、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＴＮＦαおよびＩＦＮγの産生の細胞内染色。エフェクター：標的比２：１で、条件あたり５００，０００個のエフェクター細胞を使用した。
【図19C】図１９は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞によるＡＲＧ２発現細胞の認識は、標的細胞の抗原プロセシング機構に加えて、ＡＲＧ２発現のレベルに依存することを示す。（Ｃ）ＡＲＧ２特異的ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの４８時間後のＲＴ－ｑＰＣＲにより評価したＴＨＰ－１細胞におけるＡＲＧ２発現量。データは、疑似トランスフェクトＴＨＰ－１細胞に対する倍数変化、平均＋ＳＤ、ｎ＝４として表す。
【図19D】図１９は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞によるＡＲＧ２発現細胞の認識は、標的細胞の抗原プロセシング機構に加えて、ＡＲＧ２発現のレベルに依存することを示す。（Ｄ）セットアップ前に４８時間、非刺激条件またはサイトカインカクテル刺激条件下で保存した疑似またはｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞とともにインキュベートした場合の、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＴＮＦαおよびＩＦＮγの産生の細胞内染色。エフェクター：標的比２：１で、条件あたり５００，０００個のエフェクター細胞を使用した。
【図19E】図１９は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞によるＡＲＧ２発現細胞の認識は、標的細胞の抗原プロセシング機構に加えて、ＡＲＧ２発現のレベルに依存することを示す。（Ｅ）ＡＲＧ２特異的ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションに次いで、サイトカインカクテル刺激を行った４８時間後のＲＴ－ｑＰＣＲにより評価したＴＨＰ－１細胞におけるＡＲＧ２発現量。データは、刺激なしの疑似トランスフェクトＴＨＰ－１細胞に対する倍数変化、平均＋ＳＤ、ｎ＝４として表す。
【図20A】図２０（Ａ）６つの異なる予測されるＡｒｇ２エピトープのうち１つをワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞のマウスＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴスクリーニング。ウェルあたり８×１０５個の細胞を播種し、ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。特異的スポット数（ペプチド特異的ＩＦＮγ分泌細胞）は、ペプチドで刺激したウェルおよび対照ウェルのＩＦＮγスポットの平均数の差として示す。
【図20B】（Ｂ）Ａｒｇ２ペプチドＰ４（Ｍ１－Ｍ５）をワクチン接種したまたは対照ワクチン接種（Ｃｔｒｌ１－４）をしたＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞のマウスＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ。ウェルあたり８×１０５個の細胞を播種し、ペプチドおよび対照の刺激を三重反復で行った。特異的スポット数（ペプチド特異的ＩＦＮγ分泌細胞）は、ペプチドで刺激したウェルおよび対照ウェルの平均のＩＦＮγスポットの数の差として示す。
【図20C】（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおける異なる起源の移植腫瘍におけるＡｒｇ２発現量。腫瘍型あたり３個の移植腫瘍を評価した。データは、ハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ１に対する相対発現量、平均＋ＳＤ、ｎ＝３として表す。
【図20D】（Ｄ）抗ＰＤ－１処理の追加ありまたはなしでのＬＬ２接種マウスにおけるＡｒｇ２ワクチン接種を用いた２つの個々の有効性試験の処理スケジュール。０日目に、５×１０５個のＬＬ２細胞を右側腹部に皮下注射し、次いで、（Ｅ）対照もしくはＡｒｇ２ペプチドによるＡｒｇ２ワクチン接種（両群ｎ＝２０）または（Ｆ）対照ワクチン接種、Ａｒｇ２ワクチン接種、抗ＰＤ－１処理、もしくはＡｒｇ２ワクチン接種＋抗ＰＤ－１処理（全群ｎ＝１０）による処理を行った。（Ｅ～Ｆ）個々の有効性試験におけるＬＬ２腫瘍の平均腫瘍成長。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表し、＊＊＊＊＝ｐ≦０．０００１。（Ｇ）（Ｅ）に記載の処理群の個々の腫瘍サイズ。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図20E】（Ｄ）抗ＰＤ－１処理の追加ありまたはなしでのＬＬ２接種マウスにおけるＡｒｇ２ワクチン接種を用いた２つの個々の有効性試験の処理スケジュール。０日目に、５×１０５個のＬＬ２細胞を右側腹部に皮下注射し、次いで、（Ｅ）対照もしくはＡｒｇ２ペプチドによるＡｒｇ２ワクチン接種（両群ｎ＝２０）または（Ｆ）対照ワクチン接種、Ａｒｇ２ワクチン接種、抗ＰＤ－１処理、もしくはＡｒｇ２ワクチン接種＋抗ＰＤ－１処理（全群ｎ＝１０）による処理を行った。（Ｅ～Ｆ）個々の有効性試験におけるＬＬ２腫瘍の平均腫瘍成長。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表し、＊＊＊＊＝ｐ≦０．０００１。（Ｇ）（Ｅ）に記載の処理群の個々の腫瘍サイズ。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図20F】（Ｄ）抗ＰＤ－１処理の追加ありまたはなしでのＬＬ２接種マウスにおけるＡｒｇ２ワクチン接種を用いた２つの個々の有効性試験の処理スケジュール。０日目に、５×１０５個のＬＬ２細胞を右側腹部に皮下注射し、次いで、（Ｅ）対照もしくはＡｒｇ２ペプチドによるＡｒｇ２ワクチン接種（両群ｎ＝２０）または（Ｆ）対照ワクチン接種、Ａｒｇ２ワクチン接種、抗ＰＤ－１処理、もしくはＡｒｇ２ワクチン接種＋抗ＰＤ－１処理（全群ｎ＝１０）による処理を行った。（Ｅ～Ｆ）個々の有効性試験におけるＬＬ２腫瘍の平均腫瘍成長。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表し、＊＊＊＊＝ｐ≦０．０００１。（Ｇ）（Ｅ）に記載の処理群の個々の腫瘍サイズ。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図20G】（Ｄ）抗ＰＤ－１処理の追加ありまたはなしでのＬＬ２接種マウスにおけるＡｒｇ２ワクチン接種を用いた２つの個々の有効性試験の処理スケジュール。０日目に、５×１０５個のＬＬ２細胞を右側腹部に皮下注射し、次いで、（Ｅ）対照もしくはＡｒｇ２ペプチドによるＡｒｇ２ワクチン接種（両群ｎ＝２０）または（Ｆ）対照ワクチン接種、Ａｒｇ２ワクチン接種、抗ＰＤ－１処理、もしくはＡｒｇ２ワクチン接種＋抗ＰＤ－１処理（全群ｎ＝１０）による処理を行った。（Ｅ～Ｆ）個々の有効性試験におけるＬＬ２腫瘍の平均腫瘍成長。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表し、＊＊＊＊＝ｐ≦０．０００１。（Ｇ）（Ｅ）に記載の処理群の個々の腫瘍サイズ。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
配列の簡単な説明
配列番号１～３８はそれぞれ、ヒトアルギナーゼ２に由来するポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３９および４０はそれぞれ、ヒトアルギナーゼ２およびアルギナーゼ１の対応する「ホットスポット」領域である。
配列番号４１～４４はそれぞれ、ヒトアルギナーゼ１に由来するポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４５～５０はそれぞれ、マウスアルギナーゼ２に由来するポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５１は、全長ヒトアルギナーゼ２のアミノ酸配列である。
配列番号５２は、全長マウスアルギナーゼ２のアミノ酸配列である。
配列番号５３は、全長ヒトアルギナーゼ１のアミノ酸配列である。
配列番号５４～５６はそれぞれ、配列番号２のポリペプチド（Ａｒｇ２＿１）内のＨＬＡ－Ａ２またはＡ３エピトープと予測される配列に相当する、ヒトアルギナーゼ２由来のポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５７～５９はそれぞれ、配列番号５４～５６のエピトープの少なくとも１つを含むヒトアルギナーゼ２由来のさらなるポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６０～６１はそれぞれ、配列番号３９の「ホットスポット」領域由来の配列を含むヒトアルギナーゼ２由来のさらなるポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６２は、ヒトアルギナーゼ２の予測されるシグナル配列である。
配列番号１～３８はそれぞれ、ヒトアルギナーゼ２に由来するポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３９および４０はそれぞれ、ヒトアルギナーゼ２およびアルギナーゼ１の対応する「ホットスポット」領域である。
配列番号４１～４４はそれぞれ、ヒトアルギナーゼ１に由来するポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４５～５０はそれぞれ、マウスアルギナーゼ２に由来するポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５１は、全長ヒトアルギナーゼ２のアミノ酸配列である。
配列番号５２は、全長マウスアルギナーゼ２のアミノ酸配列である。
配列番号５３は、全長ヒトアルギナーゼ１のアミノ酸配列である。
配列番号５４～５６はそれぞれ、配列番号２のポリペプチド（Ａｒｇ２＿１）内のＨＬＡ－Ａ２またはＡ３エピトープと予測される配列に相当する、ヒトアルギナーゼ２由来のポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５７～５９はそれぞれ、配列番号５４～５６のエピトープの少なくとも１つを含むヒトアルギナーゼ２由来のさらなるポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６０～６１はそれぞれ、配列番号３９の「ホットスポット」領域由来の配列を含むヒトアルギナーゼ２由来のさらなるポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６２は、ヒトアルギナーゼ２の予測されるシグナル配列である。
【0014】
発明の詳細な説明
開示される製品および方法の異なる適用が、当技術分野における特定のニーズに合わせられ得ると理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明することを目的としており、限定を意図するものではないと理解されるべきである。
開示される製品および方法の異なる適用が、当技術分野における特定のニーズに合わせられ得ると理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明することを目的としており、限定を意図するものではないと理解されるべきである。
【0015】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容によって別途明確に規定されない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「ポリペプチド(a polypeptide)」に対する言及は、「複数のポリペプチド(polypeptides)」などを含む。
【0016】
本明細書において、「ポリペプチド」は、その最も広い意味で、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、または他のペプチド疑似の化合物を指すように使用される。よって、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列と、より長いポリペプチドおよびタンパク質も包含する。本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、Ｄ光学異性体またはＬ光学異性体の両方を含む、天然および／もしくは非天然アミノ酸または合成アミノ酸のいずれか、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド疑似を指す。
【0017】
用語「患者」および「対象」は、互換的に使用され、通常はヒトを指す。
【0018】
上記または下記を問わず、本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、引用することによりその全体が本明細書の一部とされる。
【0019】
本発明者らは、輸送ペプチドのＣ末端を占めるヒトアルギナーゼ２の領域が、特に免疫原性であることを同定した。輸送ペプチドのＣ末端残基は、配列番号５１の２２番目に相当する。したがって、輸送ペプチドのＣ末端を占める領域は少なくとも配列番号１の２１、２２及び２３番目のアミノ酸を包含する。
【0020】
本明細書における「免疫原性」とは、好ましくは、アルギナーゼ２タンパク質が、アルギナーゼ２タンパク質を発現する細胞内または細胞上に存在する場合に、ポリペプチドがアルギナーゼ２タンパク質に対する免疫応答を誘発できることを意味する。言い換えれば、ポリペプチドは、アルギナーゼ２に対して免疫原性であると説明され得る。あるいは、ポリペプチドは、アルギナーゼ２の免疫原性断片として説明され得る。免疫応答は、好ましくは、Ｔ細胞応答であり、ポリペプチドはＴ細胞エピトープを含むアルギナーゼ２の免疫原性断片として説明され得る。免疫応答は、個体（または個体から採取したサンプル）に対するポリペプチドの投与後、少なくとも１つの個体（または前記サンプル）において検出され得る。
【0021】
ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を含む任意の適切な方法を用いて、免疫原性であると同定することができる。例えば、ペプチドは、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の特徴のうち少なくとも１つを有する場合、免疫原性であると同定することができる：
（ｉ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定された場合、健常対象および／または癌患者のＰＢＬ集団においてＩＦＮ－γ産生細胞を誘発することができる；および／または
（ｉｉ）アルギナーゼ２と反応性であるＣＴＬの腫瘍組織のサンプルにおいてｉｎ ｓｉｔｕで検出することができる；および／または
（ｉｉｉ）特異的Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長を誘導することができる。
ポリペプチドが免疫原性であるかどうかを決定するのに適切な方法も、以下の実施例の項で説明される。
（ｉ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定された場合、健常対象および／または癌患者のＰＢＬ集団においてＩＦＮ－γ産生細胞を誘発することができる；および／または
（ｉｉ）アルギナーゼ２と反応性であるＣＴＬの腫瘍組織のサンプルにおいてｉｎ ｓｉｔｕで検出することができる；および／または
（ｉｉｉ）特異的Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長を誘導することができる。
ポリペプチドが免疫原性であるかどうかを決定するのに適切な方法も、以下の実施例の項で説明される。
【0022】
本発明のポリペプチドは、（ｉ）配列番号５１の少なくとも２１、２２および２３位のアミノ酸を含む、または（ｉｉ）配列番号５１の１８０～２２９位から選択される、配列番号５１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列を含むまたはそれからなる、ヒトアルギナーゼ２（配列番号５１）の免疫原性断片である。前記ポリペプチドは、（ｉ）または（ｉｉ）に定義される配列番号５１の最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個の連続したアミノ酸を含み得るまたはそれらからなり得る。前記ポリペプチドは、配列番号５９、５８、５７、５４、５５、５６、２、３、１９、２０、２１、６０または６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得る。前記ポリペプチドは、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０アミノ酸の最大長を有し得る、および／またはＣ末端アミノ酸が対応するアミドに置き換えられている。前記ポリペプチドは、単離され得る。
【0023】
前記ポリペプチドは、好ましくは、配列番号５１の少なくとも２１、２２および２３位のアミノ酸、すなわち、配列ＫＳＶを含む、配列番号５１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列を含むまたはそれからなる。前記配列番号５１の少なくとも９個の連続したアミノ酸は、好ましくは、配列番号５４（ＩＬＫＫＳＶＨＳＶＡ）、配列番号５５（ＩＬＫＫＳＶＨＳＶ）または配列番号５６（ＳＩＬＫＫＳＶＨＳＶ）のアミノ酸配列を含む。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号５４、５５または５６のアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得る。これらの配列を組み込んだ配列番号５１のより長いポリペプチド断片が、特に好ましい。例えば、本発明は、配列番号５１の最大５０個の連続したアミノ酸のポリペプチドを提供し、連続したアミノ酸は、配列番号５４、５５または５６のいずれか１つのアミノ配列を含む。この種の例示的なポリペプチドは、配列番号２、３、５７、５８、または５９のいずれか１つの配列を含むまたはそれからなるポリペプチドである。配列番号５９、５８および５７のいずれか１つの配列を含むまたはそれからなるポリペプチドが、好ましい。配列番号５９の配列を含むまたはそれからなるポリペプチドが、特に好ましい。
【0024】
本明細書に記載の任意のポリペプチドにおいて、修飾配列を有するポリペプチドが、非修飾配列を有するポリペプチドと比較して、アルギナーゼ２に対して同等または増大した免疫原性を示す限りにおいて、アミノ酸配列は、１個、２個、３個、４個、または５個（すなわち、最大５個）の付加、欠失または置換によって修飾されてもよい。「同等」とは、修飾配列のポリペプチドが、非修飾配列のポリペプチドと比較して、アルギナーゼ２に対する有意に低減した免疫原性を示さないことであると理解されるべきである。配列間の免疫原性のいずれの比較も、同じアッセイを使用して実施すべきである。特に断りのない限り、ポリペプチド配列に対する修飾は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的置換では、アミノ酸が、類似の化学構造、類似の化学的特性または類似の側鎖体積の他のアミノ酸と置き換えられる。導入されたアミノ酸は、置き換わるアミノ酸と、類似の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有し得る。あるいは、保存的置換では、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入し得る。保存的アミノ酸変化は、当技術分野で周知であり、下記の表Ａ１に定義される２０個の主要アミノ酸の特性に従って選択してもよい。アミノ酸が類似の極性を有する場合、これは、表Ａ２におけるアミノ酸側鎖に関する疎水性親水性指標を参照することによって、決定することができる。
【0025】
【表1】
【0026】
【表2】
【0027】
本明細書に開示される任意のポリペプチドにおいて、ポリペプチドが、非修飾配列を有するポリペプチドと比較して、アルギナーゼ２に対する同等または増大した免疫原性を示すならば、生理化学的特性（例えば、安定性）を改善するために、以下の修飾のうちいずれか１つ以上を行ってもよい：
ａ）Ｃ末端アミノ酸の対応するアミドとの置換（カルボキシペプチダーゼに対する抵抗性を増大させることができる）；
ｂ）Ｎ末端アミノ酸の対応するアシル化アミノ酸との置換（アミノペプチダーゼに対する抵抗性を増大させることができる）；
ｃ）１つ以上のアミノ酸の対応するメチル化アミノ酸との置換（タンパク質分解抵抗性を改善することができる）；
ｄ）１つ以上のアミノ酸のＤ－立体配置の対応するアミノ酸との置換（タンパク質分解抵抗性を改善することができる）。
ａ）Ｃ末端アミノ酸の対応するアミドとの置換（カルボキシペプチダーゼに対する抵抗性を増大させることができる）；
ｂ）Ｎ末端アミノ酸の対応するアシル化アミノ酸との置換（アミノペプチダーゼに対する抵抗性を増大させることができる）；
ｃ）１つ以上のアミノ酸の対応するメチル化アミノ酸との置換（タンパク質分解抵抗性を改善することができる）；
ｄ）１つ以上のアミノ酸のＤ－立体配置の対応するアミノ酸との置換（タンパク質分解抵抗性を改善することができる）。
【0028】
本明細書に開示される任意のポリペプチドは、前記ポリペプチドが、さらなる部分を欠くポリペプチドと比較して、アルギナーゼ２に対して同等または増大した免疫原性を示す限りにおいて、溶解性、安定性を改善するため、および／または製造／単離の一助となるために、少なくとも１つの付加的な部分をＮおよび／またはＣ末端に付着させてもよい。適切な部分としては、親水性アミノ酸が挙げられる。例えば、アミノ酸配列ＫＫ、ＫＲまたはＲＲを、Ｎ末端および／またはＣ末端に付加させてもよい。他の適切な部分としては、アルブミンまたはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）が挙げられる。
【0029】
本明細書に開示されるポリペプチドは、任意の適切な手段によって製造することができる。例えば、ポリペプチドは、当技術分野で公知の標準的な技法、例えば、Ｆｍｏｃ固相化学、Ｂｏｃ固相化学または液相ペプチド合成を使用して、直接合成してもよい。あるいは、ポリペプチドは、細胞、通常は細菌細胞を、前記ポリペプチドをコードする核酸分子またはベクターで形質転換することによって、製造してもよい。
【0030】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子およびベクターを提供する。本発明はまた、このような核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0031】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドの限定されない例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された形態または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、任意の周囲の培地からのポリペプチドの実質的な、しかし完全ではない単離があり得ることを意味する。ポリヌクレオチドは、それらの使用目的を妨げない担体または希釈剤と混合してもよく、その場合でも、実質的に単離されたとみなされ得る。選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、例えば、発現ベクターにおける適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。本発明の目的で、このような核酸配列としては、限定されるものではないが、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡ由来のゲノム配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置し得る。
【0032】
ポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら(1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)における例により説明されるように、当技術分野で周知の方法に従って合成することができる。本発明の核酸分子は、挿入配列に動作可能に連結された調節配列を含み、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおける本発明のポリペプチドの発現を可能とする発現カセットの形態で提供され得る。次に、これらの発現カセットは、通常は、ベクター（例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクター）内で提供される。このような発現カセットは、宿主対象に直接投与してもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、宿主対象に投与してもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを用いて調製および／または投与される。適切なベクターは、十分な量の遺伝情報を運び、本発明のポリペプチドの発現を可能とすることができる任意のベクターであり得る。
【0033】
したがって、本発明は、このようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。このような発現ベクターは、分子生物学の技術分野で慣例的に構築され、例えば、プラスミドＤＮＡおよび適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他の要素、例えば、本発明のペプチドの発現を可能とするために、必要であり得る、および正確な方向で位置するポリアデニル化シグナルの使用が関与し得る。他の適切なベクターは、当業者に明らかであろう。この点に関するさらなる例については、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照する。
【0034】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを発現するように改変されている細胞を含む。このような細胞は、通常は、細菌細胞、例えば大腸菌などの原核細胞を含む。このような細胞は、本発明のポリペプチドを製造するために、慣用的な方法を用いて培養してもよい。
【0035】
本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態であり得る。本発明のポリペプチドは、使用目的を妨げない担体、保存剤、もしくは希釈剤（以下で考察する）、および／またはアジュバント（これも以下で考察する）と混合してもよく、その場合でも、実質的に単離されたとみなされ得る。本発明のポリペプチドはまた、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、本発明のポリペプチドは、一般に、製剤中に少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％または９９％のタンパク質を含む。
【0036】
ポリペプチドを含む組成物
別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学上許容可能な担体、保存剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。担体、保存剤および賦形剤は、組成物の他の成分と適合する、および組成物が投与される対象にとって有害ではないという意味で、「許容可能」でなければならない。通常は、すべての成分および最終組成物は、無菌かつパイロジェンフリーである。組成物は、医薬組成物であり得る。組成物は、好ましくは、アジュバントを含み得る。
別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学上許容可能な担体、保存剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。担体、保存剤および賦形剤は、組成物の他の成分と適合する、および組成物が投与される対象にとって有害ではないという意味で、「許容可能」でなければならない。通常は、すべての成分および最終組成物は、無菌かつパイロジェンフリーである。組成物は、医薬組成物であり得る。組成物は、好ましくは、アジュバントを含み得る。
【0037】
アジュバントは、組成物へのその混合が、組成物により誘発される免疫応答を増大またはそうでなければ修飾する、任意の物質である。広く定義されるアジュバントは、免疫応答を促進する物質である。アジュバントはまた、投与部位からの有効薬剤の緩徐かつ持続した放出ももたらすという点で、好ましくは、デポ効果を有し得る。アジュバントに関する一般的な考察は、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (第2版, 1986) 61-63頁において提供されている。
【0038】
アジュバントは、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＤＭＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＣＧＰ１１６８７、ノル－ＭＤＰともいう）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ－ＰＥともいう）、２％スクアレン／ツイーン－８０．ＲＴＭ．エマルション中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リピドＡを含むリポ多糖およびその種々の誘導体、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、メルクアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来のワックスＤ、コリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、およびブルセラ属のメンバーに認められる物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ Ａ、ＡＬＵＮ（ＵＳ５８７６７および５，５５４，３７２を参照のこと）、リピドＡ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、モンタニドＩＳＡ－５１およびＱＳ－２１からなる群から選択され得る。種々のサポニン抽出物も、免疫原性組成物におけるアジュバントとして有用であることが示唆されている。顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）も、アジュバントとして使用してもよい。
【0039】
本発明とともに使用される好ましいアジュバントとしては、油／界面活性剤ベースのアジュバント、例えば、モンタニドアジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ社、ベルギーから入手可能）、好ましくは、モンタニドＩＳＡ－５１が挙げられる。他の好ましいアジュバントは、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含むアジュバントである。さらに他の好ましいアジュバントは、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、例えば、ポリＩ：Ｃである。ＧＭ－ＣＳＦおよびイミダゾキニリンも、好ましいアジュバントの例である。
【0040】
アジュバントは、最も好ましくは、モンタニドＩＳＡアジュバントである。モンタニドＩＳＡアジュバントは、好ましくは、モンタニドＩＳＡ５１またはモンタニドＩＳＡ７２０である。
【0041】
Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (第2版, 1986)61-63頁において、目的の抗原が低分子量であるか、または免疫原性が不十分な場合、免疫原性担体へのカップリングが推奨されることも記載されている。したがって、本発明のポリペプチドを、担体にカップリングしてもよい。担体は、アジュバントと独立して存在し得る。担体の機能は、例えば、活性もしくは免疫原性を増大させるため、安定性を付与するため、生物活性を増大させるため、または血清中半減期を増大させるために、ポリペプチド断片の分子量を増加させることであり得る。さらに、担体は、ポリペプチドまたはその断片をＴ細胞に提示する助けとなり得る。したがって、組成物において、ポリペプチドは、以下に記載するような担体と会合し得る。
【0042】
担体は、当業者に公知の任意の適切な担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞、例えば樹状細胞（ＤＣ）であり得る。担体タンパク質としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質（トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン、免疫グロブリン等）、またはホルモン（インスリン等）またはパルミチン酸が挙げられる。あるいは、担体タンパク質は、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドであり得る。あるいは、担体は、デキストラン、例えばセファロースであり得る。担体は、ヒトに対して生理学的上許容可能であり、安全でなければならない。
【0043】
組成物が賦形剤を含む場合、賦形剤は、組成物の他の成分と適合する、およびそのレシピエントにとって有害ではないという意味で、「薬学上許容可能」でなければならない。補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが、賦形剤中に存在してもよい。これらの賦形剤および補助物質は、一般に、組成物を投与される個体において免疫応答を誘導せず、過度の毒性を伴わずに投与することができる医薬品である。薬学上許容可能な賦形剤としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノール等の液体が挙げられる。薬学上許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩も含まれ得る。薬学上許容可能な賦形剤、ビヒクルおよび補助物質の完全な考察は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)において入手可能である。
【0044】
適切な組成物の処方は、標準的な医薬処方化学および方法（これらはすべて、当業者にとって容易に入手可能である）を用いて、実施することができる。このような組成物は、ボーラス投与または連続投与にとって適切な形態で、調製、包装、または販売され得る。注射用組成物は、単位投与形、例えば、アンプルまたは場合により保存剤を含有する多回投与容器で、調製、包装、または販売され得る。組成物としては、限定されるものではないが、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルション、ペースト、および埋込み型徐放性製剤または生分解性製剤が挙げられる。組成物の一つの実施形態において、有効成分は、再構成された組成物の投与前に、適切なビヒクル（例えば、無菌パイロジェンフリー水）で再構成するために、乾燥（例えば、粉末または顆粒）形態で提供される。組成物は、無菌注射用の水性または油性の懸濁液または溶液の形態で、調製、包装、または販売され得る。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従って処方され得、有効成分に加えて、本明細書に記載のアジュバント、賦形剤および補助物質等の追加の成分を含み得る。このような無菌注射用製剤は、例えば、水または１，３－ブタンジオールなどの無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒を用いて調製され得る。他の許容可能な希釈剤および溶媒としては、限定されるものではないが、リンゲル液、等張食塩水、および、合成モノまたはジグリセリド等の固定油が挙げられる。有用な他の組成物としては、微結晶形で、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の成分として、有効成分を含む組成物が挙げられる。徐放または埋込みのための組成物は、薬学上許容可能なポリマー性または疎水性材料、例えば、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩を含み得る。あるいは、組成物の有効成分は、カプセル化され得る、粒子状担体に吸着され得る、または粒子状担体と会合し得る。適切な粒子状担体としては、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来する担体、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）に由来するＰＬＧ微粒子が挙げられる。例えば、Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368を参照されたい。他の微粒子系およびポリマー、例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンなどのポリマー、およびこれらの分子のコンジュゲートも使用することができる。
【0045】
使用方法
本発明のポリペプチドまたは組成物は、対象における疾患または病態を治療または予防する方法において使用され得る。本発明のポリペプチドまたは組成物は、対象における疾患または病態を治療または予防する方法における使用のための薬剤の製造において使用され得る。方法は、前記ポリペプチドまたは前記組成物を前記対象に投与することを含む。投与は、治療上または予防上有効な量の前記ポリペプチドまたは前記組成物を、それを必要とする対象に投与するものであり得る。
本発明のポリペプチドまたは組成物は、対象における疾患または病態を治療または予防する方法において使用され得る。本発明のポリペプチドまたは組成物は、対象における疾患または病態を治療または予防する方法における使用のための薬剤の製造において使用され得る。方法は、前記ポリペプチドまたは前記組成物を前記対象に投与することを含む。投与は、治療上または予防上有効な量の前記ポリペプチドまたは前記組成物を、それを必要とする対象に投与するものであり得る。
【0046】
疾患または病態は、アルギナーゼ２の不適切なまたは過剰な免疫抑制機能を少なくとも部分的に特徴とし得る。疾患または病態は、癌、好ましくは、アルギナーゼ２を発現する、および／またはアルギナーゼ２の不適切なもしくは過剰な免疫抑制機能と関連する癌であり得る。癌は、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、脳癌、頭頚部癌もしくは小腸癌であり得るか、結腸直腸癌もしくは胃癌、または黒色腫、または白血病、好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）もしくは慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）であり得る。癌は、他の癌治療に耐性を有し得る、特に抗ＰＤ１療法などの免疫系チェックポイント阻害剤に耐性を有し得る。
【0047】
方法は、併用する癌療法との同時投与または逐次投与を含み得る。併用する癌療法は、サイトカイン療法、Ｔ細胞療法、ＮＫ療法、免疫系チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線療法、免疫刺激物質（追加のワクチンなど）、または遺伝子療法から選択され得る。
【0048】
免疫系チェックポイント阻害剤は、特に追加の癌療法とすることが好ましい。アルギナーゼ２に対するワクチン療法は、免疫系チェックポンと阻害剤との併用で相乗効果を奏し得る。免疫系チェックポイントの例としては下記が挙げられる：
ａ）インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ１）とその基質の相互作用
ｂ）ＰＤ１とＰＤＬ１および／またはＰＤ１とＰＤＬ２の相互作用
ｃ）ＣＴＬＡ４とＣＤ８６および／またはＣＴＬＡ４とＣＤ８０の相互作用
ｄ）Ｂ７－Ｈ３および／またはＢ７－Ｈ４と、それぞれのリガンドの相互作用
ｅ）ＨＶＥＭとＢＴＬＡの相互作用
ｆ）ＧＡＬ９とＴＩＭ３の相互作用
ｇ）ＭＨＣクラスＩまたはＩＩとＬＡＧ３の相互作用
ｈ）ＭＨＣクラスＩまたはＩＩとＫＩＲの相互作用
チェックポイント（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の阻害は、追加の癌療法として特に好ましい。
チェックポイント阻害剤は、免疫系チェックポイントを遮断または阻害する任意の免疫調節剤（抗体など）であってもよく、または、免疫系チェックポイントの成分もしくは前記成分の免疫原性断片を含む免疫療法組成物であって、免疫系におけるチェックポイントの標的化を刺激する免疫療法組成物であってもよい。
ａ）インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ１）とその基質の相互作用
ｂ）ＰＤ１とＰＤＬ１および／またはＰＤ１とＰＤＬ２の相互作用
ｃ）ＣＴＬＡ４とＣＤ８６および／またはＣＴＬＡ４とＣＤ８０の相互作用
ｄ）Ｂ７－Ｈ３および／またはＢ７－Ｈ４と、それぞれのリガンドの相互作用
ｅ）ＨＶＥＭとＢＴＬＡの相互作用
ｆ）ＧＡＬ９とＴＩＭ３の相互作用
ｇ）ＭＨＣクラスＩまたはＩＩとＬＡＧ３の相互作用
ｈ）ＭＨＣクラスＩまたはＩＩとＫＩＲの相互作用
チェックポイント（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の阻害は、追加の癌療法として特に好ましい。
チェックポイント阻害剤は、免疫系チェックポイントを遮断または阻害する任意の免疫調節剤（抗体など）であってもよく、または、免疫系チェックポイントの成分もしくは前記成分の免疫原性断片を含む免疫療法組成物であって、免疫系におけるチェックポイントの標的化を刺激する免疫療法組成物であってもよい。
【0049】
追加の癌療法は、抗体であってもよい。
【0050】
抗体は、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブペゴール、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブペンテテート、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アチヌマブ、アトリズマブ（＝トシリズマブ）、アトロリムマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビマグルマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、コンシズマブ、クレネズマブ、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、ドゥリゴツマブ、デュピルマブ、ドゥシギツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴール、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エボロクマブ、エクスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ＧＳ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、ランパリズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レクサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ－ＣＤ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オズリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブベドチン、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポラツズマブベドチン、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、キリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレズマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルピリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（＝トレメリムマブ）、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ（＝アトリズマブ）、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマホドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブまたはゾリモマブアリトクスであり得る。
【0051】
好ましい抗体としては、ナタリズマブ、ベドリズマブ、ベリムマブ、アタシセプト、アレファセプト、オテリキシズマブ、テプリズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、エプラツズマブ、アレムツズマブ、アバタセプト、エクリズマブ、オマリズマブ、カナキヌマブ、メポリズマブ、レスリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ゴリムマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、イブリツモマブ、チウキセタン、トシツモマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、デノスマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブおよびベドチンが挙げられる。
【0052】
本発明の方法において使用され得る特に好ましい抗体としては、ダラツムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アベルマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブおよびオファツムマブが挙げられる。ダラツムマブが特に好ましい。ニボルマブ等の抗ＰＤ１抗体も特に好ましい。
【0053】
併用する癌療法は、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イリノテカン、レナリドミド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、レブラミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンからなる群から選択され得る。
【0054】
本発明の組成物のポリペプチドは、細胞を前記ポリペプチドまたは組成物に接触させることを含む、アルギナーゼ１特異的Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を刺激する方法においても使用され得る。方法は、ｅｘ ｖｉｖｏで行ってもよい。細胞は、健常対象または癌患者から採取されたサンプル、例えば、腫瘍サンプル中に存在し得る。
【0055】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は、保護の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。前述の説明および以下の実施例に開示される特徴は、両方とも別々に、またその任意の組合せにおいて、その多様な形態で本発明を実現するための材料であり得る。
【0056】
実施例１
材料と方法
患者材料
健常ドナー由来のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）での密度勾配分離を用いて単離し、１０％ＤＭＳＯを添加したＦＢＳ中にて－１５０℃で凍結保存した。癌患者由来のＰＢＭＣは、すべての抗癌療法の終了から最低４週後に、血液サンプルから単離した。プロトコールは、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｃａｐｉｔａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋにより承認され、ヘルシンキ宣言の規定に従って実施した。患者からの書面によるインフォームドコンセントを、試験登録前に取得した。
材料と方法
患者材料
健常ドナー由来のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）での密度勾配分離を用いて単離し、１０％ＤＭＳＯを添加したＦＢＳ中にて－１５０℃で凍結保存した。癌患者由来のＰＢＭＣは、すべての抗癌療法の終了から最低４週後に、血液サンプルから単離した。プロトコールは、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｃａｐｉｔａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋにより承認され、ヘルシンキ宣言の規定に従って実施した。患者からの書面によるインフォームドコンセントを、試験登録前に取得した。
【0057】
ペプチド
ペプチドを、標準的な方法により合成し、ＤＭＳＯに溶解してストック濃度１０ｍＭを得た。これらの実験に使用したペプチドの配列については、「配列」という表題の項目においても説明する。ペプチドは、配列番号、名称、またはアルギナーゼ２の全長配列における各ペプチド配列の開始および終了位置によって示される。それぞれ互換的に使用され得る。例えば、配列番号２のペプチドは、一方で名称Ａｒｇ２＿１という場合もあり、または、一方でＡｒｇ２ａａ１１－３０（１１の開始位置および３０の終了位置を示す）という場合もある。各例における意図する参照は、文脈から明らかとなるであろう。
ペプチドを、標準的な方法により合成し、ＤＭＳＯに溶解してストック濃度１０ｍＭを得た。これらの実験に使用したペプチドの配列については、「配列」という表題の項目においても説明する。ペプチドは、配列番号、名称、またはアルギナーゼ２の全長配列における各ペプチド配列の開始および終了位置によって示される。それぞれ互換的に使用され得る。例えば、配列番号２のペプチドは、一方で名称Ａｒｇ２＿１という場合もあり、または、一方でＡｒｇ２ａａ１１－３０（１１の開始位置および３０の終了位置を示す）という場合もある。各例における意図する参照は、文脈から明らかとなるであろう。
【0058】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＰＯＴのために、癌患者および健常ドナーに由来するＰＢＭＣを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用する前に、２４ウェルプレート中で２０μＭのアルギナーゼ１由来ペプチド（または対照としてペプチドなし）および１２０Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２で７日間パルスした。細胞を、ＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社）でプレコートした９６ウェルニトロセルロースＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＭＡＩＰ Ｎ４５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に播種した。アルギナーゼペプチドを加え、終濃度５μＭとし、プレートを３７℃で１４～１６時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗い流し、二次ビオチン化Ａｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３４２０－６－１０００）を、室温で２時間加えた。非結合二次抗体を洗い流し、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３３１０－１０）を、室温で１時間加えた。非結合コンジュゲート酵素を洗い流し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３６５０－１０）を加えることにより、アッセイを展開した。展開したＥＬＩＳＰＯＴプレートを、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔソフトウェアｖ５．１を用いたＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ Ｕｌｔｉｍａｔｅ－Ｖアナライザーで分析した。応答は、アルギナーゼ２で刺激したウェルおよびペプチド添加なしのウェル中の平均数間の差として報告した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＰＯＴのために、癌患者および健常ドナーに由来するＰＢＭＣを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用する前に、２４ウェルプレート中で２０μＭのアルギナーゼ１由来ペプチド（または対照としてペプチドなし）および１２０Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２で７日間パルスした。細胞を、ＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社）でプレコートした９６ウェルニトロセルロースＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＭＡＩＰ Ｎ４５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に播種した。アルギナーゼペプチドを加え、終濃度５μＭとし、プレートを３７℃で１４～１６時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗い流し、二次ビオチン化Ａｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３４２０－６－１０００）を、室温で２時間加えた。非結合二次抗体を洗い流し、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３３１０－１０）を、室温で１時間加えた。非結合コンジュゲート酵素を洗い流し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｍａｂｔｅｃｈ社、カタログ番号３６５０－１０）を加えることにより、アッセイを展開した。展開したＥＬＩＳＰＯＴプレートを、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔソフトウェアｖ５．１を用いたＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ Ｕｌｔｉｍａｔｅ－Ｖアナライザーで分析した。応答は、アルギナーゼ２で刺激したウェルおよびペプチド添加なしのウェル中の平均数間の差として報告した。
【0059】
細胞内染色
ＰＢＭＣを、ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ペプチド刺激の最初の１時間の後に加えた）の存在下で、アルギナーゼ由来ペプチド（または対照としてペプチドなしでインキュベーション）で５時間刺激した後に、細胞培養物の細胞内染色を行った。刺激した細胞を、表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）に対する蛍光標識抗体で染色し、その後、固定／透過処理および透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号００－５１２３－４３）を用いて、製造業者の説明書に従って透過処理した。次いで、透過処理した細胞を、ＩＦＮγおよびＴＮＦαに対する蛍光色素標識抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行った。以下の抗体：ＩＦＮγ－ＡＰＣ（カタログ番号３４１１１７）、ＴＮＦα－４５５ ＢＶ４２１（カタログ番号５６２７８３）、ＣＤ４－ＦＩＴＣ（カタログ番号３４７４１３）、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ（カタログ番号３４５７７４）、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｈ７（カタログ番号５６０２７５）（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から）、死細胞染色－ＦＶＳ５１０（５６４４０６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、製造業者の説明書に従って使用した。
ＰＢＭＣを、ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ペプチド刺激の最初の１時間の後に加えた）の存在下で、アルギナーゼ由来ペプチド（または対照としてペプチドなしでインキュベーション）で５時間刺激した後に、細胞培養物の細胞内染色を行った。刺激した細胞を、表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）に対する蛍光標識抗体で染色し、その後、固定／透過処理および透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号００－５１２３－４３）を用いて、製造業者の説明書に従って透過処理した。次いで、透過処理した細胞を、ＩＦＮγおよびＴＮＦαに対する蛍光色素標識抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行った。以下の抗体：ＩＦＮγ－ＡＰＣ（カタログ番号３４１１１７）、ＴＮＦα－４５５ ＢＶ４２１（カタログ番号５６２７８３）、ＣＤ４－ＦＩＴＣ（カタログ番号３４７４１３）、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ（カタログ番号３４５７７４）、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｈ７（カタログ番号５６０２７５）（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から）、死細胞染色－ＦＶＳ５１０（５６４４０６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、製造業者の説明書に従って使用した。
【0060】
結果
アルギナーゼ１ホットスポットに基づいたアルギナーゼ２ペプチドに関するスクリーニング
以前に同定されたアルギナーゼ１の１６１～２１０位の５０アミノ酸長アルギナーゼ１ホットスポット領域に基づき、アルギナーゼ２における対応する領域（１８０～２２９位）を網羅する４個のペプチドを、試験のために選択した。これらのペプチドは、Ａｒｇ２－Ｅ１７（ａａ１８０－１９９）、Ａｒｇ２－Ｅ１８（ａａ１９０－２０９）、Ａｒｇ２－Ｅ１９（ａａ２００－２１９）およびＡｒｇ２－Ｅ２０（２１０－２２９）である。アルギナーゼ１およびアルギナーゼ２の比較模式図については、図１を参照のこと。Ａｒｇ２－Ｅ１７は、慣例的な方法により合成できなかったため、実験は、残りの３個のペプチドを用いて行った。
アルギナーゼ１ホットスポットに基づいたアルギナーゼ２ペプチドに関するスクリーニング
以前に同定されたアルギナーゼ１の１６１～２１０位の５０アミノ酸長アルギナーゼ１ホットスポット領域に基づき、アルギナーゼ２における対応する領域（１８０～２２９位）を網羅する４個のペプチドを、試験のために選択した。これらのペプチドは、Ａｒｇ２－Ｅ１７（ａａ１８０－１９９）、Ａｒｇ２－Ｅ１８（ａａ１９０－２０９）、Ａｒｇ２－Ｅ１９（ａａ２００－２１９）およびＡｒｇ２－Ｅ２０（２１０－２２９）である。アルギナーゼ１およびアルギナーゼ２の比較模式図については、図１を参照のこと。Ａｒｇ２－Ｅ１７は、慣例的な方法により合成できなかったため、実験は、残りの３個のペプチドを用いて行った。
【0061】
これらのペプチドがアルギナーゼ２応答を同定するのに使用できるかどうかを試験するために、１２例の健常ドナーおよび１例の癌患者由来のＰＢＭＣを、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにおける応答について選別した。ＰＢＭＣは、ＥＬＩＳＰＯＴの前に１週間、アルギナーゼ２ペプチドおよび低用量ＩＬ－２で刺激した。
【0062】
図２に示されるように、ペプチドは、少なくとも１例の対象由来のＰＢＭＣにより、全て認識された。Ａｒｇ２－Ｅ１８は、最高かつ最も一貫した応答を示した。
【0063】
他のアルギナーゼ２ペプチドに関するペプチドライブラリースクリーニング
全アルギナーゼ２タンパク質配列をオーバーラップする２０アミノ酸長のペプチドとして分割し（最終的に２４アミノ酸のペプチド）、全配列（配列番号１～３４）を網羅する３４個のペプチドのライブラリーを作製した。ライブラリー中の各ペプチドは、以下のペプチドの最初の１０個のアミノ酸とオーバーラップしていた。このアルギナーゼ２ペプチドライブラリーおよびＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、本発明者らは次に、自発的応答に関して６例の健常ドナー由来のＰＢＭＣを選別した。３～４個の隣接する２０－ｍｅｒアルギナーゼ２ライブラリーペプチドのプールおよび低用量ＩＬ－２（１２０Ｕ／ｍＬ）で、ＰＢＭＣを１週間刺激した。次いで、それらをＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのためにセットアップし、各２０－ｍｅｒペプチドに対する応答に関して別々に選別した。
全アルギナーゼ２タンパク質配列をオーバーラップする２０アミノ酸長のペプチドとして分割し（最終的に２４アミノ酸のペプチド）、全配列（配列番号１～３４）を網羅する３４個のペプチドのライブラリーを作製した。ライブラリー中の各ペプチドは、以下のペプチドの最初の１０個のアミノ酸とオーバーラップしていた。このアルギナーゼ２ペプチドライブラリーおよびＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、本発明者らは次に、自発的応答に関して６例の健常ドナー由来のＰＢＭＣを選別した。３～４個の隣接する２０－ｍｅｒアルギナーゼ２ライブラリーペプチドのプールおよび低用量ＩＬ－２（１２０Ｕ／ｍＬ）で、ＰＢＭＣを１週間刺激した。次いで、それらをＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのためにセットアップし、各２０－ｍｅｒペプチドに対する応答に関して別々に選別した。
【0064】
図３に示されるように、以下の８個のペプチドが、最高かつ最も大量の応答を示した：
【0065】
ＡＲＧ２＿１（ａａ１１－３０）、ＡＲＧ２＿５（ａａ５１－７０）、ＡＲＧ２＿８（ａａ８１－１００）、ＡＲＧ２＿１３（ａａ１３１－１５０）、ＡＲＧ２＿１８（１８１－２００）、ＡＲＧ２＿２０（２０１－２２０）、ＡＲＧ２＿２１（ａａ２１１－２３０）およびＡＲＧ２＿２２（２２１－２４０）。
【0066】
Ａｒｇ２＿１８、Ａｒｇ２＿２０、Ａｒｇ２＿２１およびＡｒｇ２＿２２は総て、以前に同定されたホットスポット領域内に含まれているか、またはそれとオーバーラップしている。しかしながら、他のペプチド（最も高い応答を示したペプチド、Ａｒｇ２＿１を含む）は、アルギナーゼ２タンパク質の異なる領域に由来する。
【0067】
ライブラリースクリーニング（ホットスポット領域）の検証
２例の健常ドナー由来のＰＢＭＣを、単一ペプチドおよび低用量ＩＬ－２（１２０Ｕ／ｍＬ）で１週間刺激した後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、ライブラリースクリーニングにおいて認められた応答を検証した。
２例の健常ドナー由来のＰＢＭＣを、単一ペプチドおよび低用量ＩＬ－２（１２０Ｕ／ｍＬ）で１週間刺激した後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、ライブラリースクリーニングにおいて認められた応答を検証した。
【0068】
ＡＲＧ２＿１８、ＡＲＧ２＿１９、ＡＲＧ２＿２０およびＡＲＧ２＿２１をそれぞれ、この検証実験において試験し、ＡＲＧ２－Ｅ１８、ＡＲＧ２－Ｅ１９およびＡＲＧ２－Ｅ２０は、アルギナーゼ２の同じ領域とオーバーラップしているため、これらも加えた。Ａｒｇ２－Ｅ１７は、慣例的な方法により合成できなかったため、再度除外した。
【0069】
６個の試験したペプチドを、以下にアラインメントで示す：
図４に示されるように、試験したペプチドのそれぞれに対する応答が認められ、最初のスクリーニングが検証された。ペプチドのオーバーラップするペアは、ほぼ同一の応答を示したが、ＡＲＧ２＿２１およびＡＲＧ２－Ｅ２０は例外で、より強い応答が、ＡＲＧ２＿２１に対して１例の健常ドナーにおいて認められた。この実験における最強かつ最も一貫した応答は、ＡＲＧ２＿１８で得られた。
【0070】
ライブラリースクリーニング（他の領域）の検証
４例の健常ドナー由来のＰＢＭＣを、単一ペプチドおよび低用量ＩＬ－２（１２０Ｕ／ｍＬ）で１週間刺激した後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、ライブラリースクリーニングにおいて認められた応答を検証した。ＡＲＧ２＿１、ＡＲＧ２＿５、ＡＲＧ２＿１３、ＡＲＧ２＿１８およびＡＲＧ２＿２２を、この検証において試験した。図５に示されるように、強い顕著な応答が、特にＡｒｇ２＿１に対して認められた。
４例の健常ドナー由来のＰＢＭＣを、単一ペプチドおよび低用量ＩＬ－２（１２０Ｕ／ｍＬ）で１週間刺激した後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、ライブラリースクリーニングにおいて認められた応答を検証した。ＡＲＧ２＿１、ＡＲＧ２＿５、ＡＲＧ２＿１３、ＡＲＧ２＿１８およびＡＲＧ２＿２２を、この検証において試験した。図５に示されるように、強い顕著な応答が、特にＡｒｇ２＿１に対して認められた。
【0071】
このため、細胞内サイトカイン染色アッセイを同じ細胞に対して使用し、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋応答が存在したかどうかを解明した。２例の健常ドナーに関して、Ｂｕｆ－Ｍ－０１およびＢｕｆ－Ｍ－０２、０．２％および０．１％二重陽性（ＤＰ）ＣＤ４＋細胞が認められ（図６Ａおよび６Ｂにおける代表的なプロットを参照のこと）、これらのドナーにおけるＡＲＧ２＿１に対するＣＤ４＋応答が示唆された。
【0072】
ＡＲＧ２＿１に対する応答に関する癌患者および健常ドナーのさらなるスクリーニング
ＡＲＧ２＿１を使用して、８例の黒色腫患者（ＡＡ０７－ＡＡ３１）、４例の前立腺癌患者（ＵＲ０７－２７）および１３例の健常ドナーにおける応答に関するスクリーニングを行った。それぞれに由来するＰＢＭＣを、単一ペプチドおよび低用量ＩＬ－２（１２０Ｕ／ｍＬ）で１週間刺激した後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。
ＡＲＧ２＿１を使用して、８例の黒色腫患者（ＡＡ０７－ＡＡ３１）、４例の前立腺癌患者（ＵＲ０７－２７）および１３例の健常ドナーにおける応答に関するスクリーニングを行った。それぞれに由来するＰＢＭＣを、単一ペプチドおよび低用量ＩＬ－２（１２０Ｕ／ｍＬ）で１週間刺激した後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。
【0073】
図８に示されるように、有意な応答が、試験したドナー２５例中１５例（６０％）に認められ、応答は、患者および健常ドナーにおいてほぼ等しい強さに見られた。
【0074】
ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにおいて明らかな応答を示したＰＢＭＣを、細胞内サイトカイン染色にも使用した。本発明者らは、２例の健常ドナー由来のＣＤ４細胞を分析し、これらの２例のドナーにおいて、ＣＤ４細胞は、ＡＲＧ２＿１に対して特異的に反応していたことを示した。さらに、本発明者らは、前立腺癌患者（ＵＲ１２）由来のＰＢＭＣのうち、ＡＲＧ２＿１に対するＣＤ８＋応答も存在していたことを見出した（ＣＤ８＋ ＤＰ細胞０．９％ 対 対照０．５％）。図９を参照のこと。まとめると、これらのＩＣＳの結果は、検出されたＡＲＧ２＿１応答は、Ｔ細胞媒介性であり、さらに、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の両方により媒介され得ることを示している。
【0075】
したがって、ＡＲＧ２＿１内のＨＬＡ－Ａ２およびＨＬＡ－Ａ３エピトープに関する予測を、www.syfpeithi.deサーバーを用いて行った。以下のエピトープが、ＡＲＧ２＿１配列内に存在すると予測された：
３個の予測エピトープは総て、配列番号５１の２１、２２および２３位の輸送ペプチド境界を組み込んでいる。
【0076】
ＡＲＧ２＿１に対する応答は、前刺激なしでも認められる（「ｅｘ ｖｉｖｏ ＥＬＩＳＰＯＴ」）
先の実験（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは「間接的な」ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ）において強い応答を示していた１例の癌患者および３例の健常ドナーを、ｅｘ ｖｉｖｏ ＥＬＩＳＰＯＴにおいても試験した。このことは、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの前に、ＰＢＭＣは前刺激されず、＋／－ Ａｒｇ２＿１ペプチドで７２時間単にインキュベートすることを意味する。図１０に示されるように、ＡＲＧ２＿１に対する応答が検出された。特異的Ｔ細胞応答がｅｘ ｖｉｖｏにおいて直接検出可能であったという事実は、特に注目すべきである。ほぼ例外なく、腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞は、四量体染色またはＥＬＩＳＰＯＴのいずれかにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド前刺激なしでｅｘ ｖｉｖｏで直接ＰＢＭＣにおいて検出することは通常可能ではない。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの前刺激工程なしで非ウイルス抗原に対する免疫応答を検出できることは、非常に稀有である。そのため、これらの結果は、ＡＲＧ２＿１配列およびその中に含まれるエピトープの高い免疫原性を強調するものである。したがって、データは、免疫系はアルギナーゼ２発現細胞を選択的に標的とすることができ、アルギナーゼ発現の免疫調節効果を低減し、それにより、抗腫瘍免疫応答を増強することを意味するため、このような配列は良好なワクチン接種の標的である。さらに、これらのデータは、アルギナーゼ２特異的Ｔ細胞（特に、ＡＲＧ２＿１内の１つまたは複数のエピトープを認識するもの）は、免疫系において天然的な役割を果たすことを示唆している。このことは、このような配列に対するワクチン接種は、患者において毒性を誘導しない可能性が最も高いことを意味する。
先の実験（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは「間接的な」ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ）において強い応答を示していた１例の癌患者および３例の健常ドナーを、ｅｘ ｖｉｖｏ ＥＬＩＳＰＯＴにおいても試験した。このことは、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの前に、ＰＢＭＣは前刺激されず、＋／－ Ａｒｇ２＿１ペプチドで７２時間単にインキュベートすることを意味する。図１０に示されるように、ＡＲＧ２＿１に対する応答が検出された。特異的Ｔ細胞応答がｅｘ ｖｉｖｏにおいて直接検出可能であったという事実は、特に注目すべきである。ほぼ例外なく、腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞は、四量体染色またはＥＬＩＳＰＯＴのいずれかにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド前刺激なしでｅｘ ｖｉｖｏで直接ＰＢＭＣにおいて検出することは通常可能ではない。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの前刺激工程なしで非ウイルス抗原に対する免疫応答を検出できることは、非常に稀有である。そのため、これらの結果は、ＡＲＧ２＿１配列およびその中に含まれるエピトープの高い免疫原性を強調するものである。したがって、データは、免疫系はアルギナーゼ２発現細胞を選択的に標的とすることができ、アルギナーゼ発現の免疫調節効果を低減し、それにより、抗腫瘍免疫応答を増強することを意味するため、このような配列は良好なワクチン接種の標的である。さらに、これらのデータは、アルギナーゼ２特異的Ｔ細胞（特に、ＡＲＧ２＿１内の１つまたは複数のエピトープを認識するもの）は、免疫系において天然的な役割を果たすことを示唆している。このことは、このような配列に対するワクチン接種は、患者において毒性を誘導しない可能性が最も高いことを意味する。
【0077】
考察
癌におけるアルギナーゼ２発現細胞の存在は、癌特異的エフェクターリンパ球の増殖を防ぐ免疫抑制腫瘍微小環境に寄与する。したがって、このようなアルギナーゼ２発現細胞（腫瘍細胞および他の調節細胞を含み得る）を特異的に標的とすることは、免疫抑制効果を低減し、癌特異的エフェクター細胞の活性化および増殖を可能とすることにより、直接的な利益および間接的な利益を有し得る。抗癌免疫療法は、免疫抑制細胞によりしばしば拮抗されることを考慮すると、アルギナーゼ２エピトープを標的とすることのこの二重効果は、高度に相乗的であり得る。これらの実験が、アルギナーゼ２に対する天然のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞媒介性免疫が存在すること（特に、Ａｒｇ２＿１配列内のエピトープに対して）を示していることを考慮すると、ワクチン接種の状況においてアルギナーゼ２を標的とすることが成功する可能性は高い。
癌におけるアルギナーゼ２発現細胞の存在は、癌特異的エフェクターリンパ球の増殖を防ぐ免疫抑制腫瘍微小環境に寄与する。したがって、このようなアルギナーゼ２発現細胞（腫瘍細胞および他の調節細胞を含み得る）を特異的に標的とすることは、免疫抑制効果を低減し、癌特異的エフェクター細胞の活性化および増殖を可能とすることにより、直接的な利益および間接的な利益を有し得る。抗癌免疫療法は、免疫抑制細胞によりしばしば拮抗されることを考慮すると、アルギナーゼ２エピトープを標的とすることのこの二重効果は、高度に相乗的であり得る。これらの実験が、アルギナーゼ２に対する天然のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞媒介性免疫が存在すること（特に、Ａｒｇ２＿１配列内のエピトープに対して）を示していることを考慮すると、ワクチン接種の状況においてアルギナーゼ２を標的とすることが成功する可能性は高い。
【0078】
実施例２ － ヒトＡＲＧ２ペプチドのさらなる検討
材料と方法
患者材料
健常ドナー由来のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｌｅｒｅ社）での密度勾配分離を用いて単離し、１０％ＤＭＳＯを添加したＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中にて－１５０℃で凍結保存した。癌患者由来のＰＢＭＣは、総ての抗癌療法の終了から４週以後に、血液サンプルから単離した。ＡＭＬを有する患者由来のＰＢＭＣは、異なる疾患および治療段階の患者、すなわち治療中の患者を含む患者由来の血液サンプルから単離した。全てのプロトコールは、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｃａｐｉｔａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋにより承認され、ヘルシンキ宣言の規定に従って実施した。患者からの書面によるインフォームドコンセントを、試験登録前に取得した。ＰＭＢＣは、５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したＸ－ｖｉｖｏ（ＢｉｏＮｏｒｄｉｋａ社）中で維持した。
材料と方法
患者材料
健常ドナー由来のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ａｌｅｒｅ社）での密度勾配分離を用いて単離し、１０％ＤＭＳＯを添加したＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中にて－１５０℃で凍結保存した。癌患者由来のＰＢＭＣは、総ての抗癌療法の終了から４週以後に、血液サンプルから単離した。ＡＭＬを有する患者由来のＰＢＭＣは、異なる疾患および治療段階の患者、すなわち治療中の患者を含む患者由来の血液サンプルから単離した。全てのプロトコールは、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｃａｐｉｔａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋにより承認され、ヘルシンキ宣言の規定に従って実施した。患者からの書面によるインフォームドコンセントを、試験登録前に取得した。ＰＭＢＣは、５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したＸ－ｖｉｖｏ（ＢｉｏＮｏｒｄｉｋａ社）中で維持した。
【0079】
細胞培養
ＴＨＰ－１を、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社）中で培養した。Ｓｅｔ２細胞を、２０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ中で培養した。ＯＣＩ－ＡＭＬ－２細胞を、１０％ＦＢＳを添加したアルファ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で培養した。ＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１細胞を、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および１倍非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加したＲＰＭＩ中で培養した。全ての細胞株を試験し、マイコプラズマに対して陰性であることを確認した。細胞を週２～３回継代した。
ＴＨＰ－１を、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社）中で培養した。Ｓｅｔ２細胞を、２０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ中で培養した。ＯＣＩ－ＡＭＬ－２細胞を、１０％ＦＢＳを添加したアルファ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で培養した。ＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１細胞を、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および１倍非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加したＲＰＭＩ中で培養した。全ての細胞株を試験し、マイコプラズマに対して陰性であることを確認した。細胞を週２～３回継代した。
【0080】
ＩＬ－４（４００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ－１３（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）またはサイトカインカクテル（４００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４、１０００Ｕ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍｌ ＴＮＦα）を添加した培地に０．５～０．７５×１０６細胞／ｍＬ培地をそれぞれ播種してサイトカイン刺激を行った。４８時間のインキュベーションの後、種々の実験のために細胞を回収した。全てのサイトカインは、Ｔｒｉｃｈｅｍ社からのものである。
【0081】
ペプチド
３４個の２０ｍｅｒペプチドのＡＲＧ２ペプチドライブラリーをＰｅｐＳｃａｎにより合成し、免疫応答に関するスクリーニングのためにＤＭＳＯに１０ｍＭで溶解した。残りの実験のために、ＡＲＧ２－１を滅菌水に２ｍＭで溶解した。長鎖ＡＲＧ２ペプチド（Ａ２Ｌ１、Ａ２Ｌ２、Ａ２Ｌ３（配列番号５８、５９、５７）をＳｃｈａｅｆｅｒにより合成し、滅菌水に２ｍＭとなるように溶解した。滅菌水に溶解したペプチドを、使用前に０．２２μｍフィルターで濾過した。合成したペプチドの純度は、９０％超であった。全ペプチドの一覧については、表１を参照のこと。
３４個の２０ｍｅｒペプチドのＡＲＧ２ペプチドライブラリーをＰｅｐＳｃａｎにより合成し、免疫応答に関するスクリーニングのためにＤＭＳＯに１０ｍＭで溶解した。残りの実験のために、ＡＲＧ２－１を滅菌水に２ｍＭで溶解した。長鎖ＡＲＧ２ペプチド（Ａ２Ｌ１、Ａ２Ｌ２、Ａ２Ｌ３（配列番号５８、５９、５７）をＳｃｈａｅｆｅｒにより合成し、滅菌水に２ｍＭとなるように溶解した。滅菌水に溶解したペプチドを、使用前に０．２２μｍフィルターで濾過した。合成したペプチドの純度は、９０％超であった。全ペプチドの一覧については、表１を参照のこと。
【0082】
ペプチド刺激およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
健常ドナーまたは癌患者由来のＰＢＭＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１０μＭのＡＲＧ２由来ペプチドで刺激し、アッセイ感度を増強させた。２日目に、ＩＬ－２を加え、計１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）とした。７日後、４～６×１０５個のＰＢＭＣを、ＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社）でプレコートしたＥＬＩＳＰＯＴプレートの底部に播種した。各ドナーまたは患者由来のＰＢＭＣは、ペプチド（５μＭ ＡＲＧ２由来ペプチド）および対照の刺激について、三重反復または四重反復測定となるようセットアップした。細胞を、抗原の存在下でＥＬＩＳＰＯＴプレートにおいて１４～１６時間インキュベートし、その後、それらを洗い流し、二次ビオチン化抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社）を加えた。２時間のインキュベーション後、二次抗体を洗い流し、次いで、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（Ｍａｂｔｅｃｈ社）を加えて１時間置いた。次に、非結合酵素を洗い流し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｍａｂｔｅｃｈ社）を加えて、アッセイを行った。展開したＥＬＩＳＰＯＴプレートを、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェア、バージョン５．１を用いたＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ｓ６ Ｕｌｔｉｍａｔｅ－Ｖアナライザーで分析した。応答は、ＡＲＧ２由来ペプチドで刺激したウェルおよび対照ウェル中の平均スポット数の差として報告する。
健常ドナーまたは癌患者由来のＰＢＭＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１０μＭのＡＲＧ２由来ペプチドで刺激し、アッセイ感度を増強させた。２日目に、ＩＬ－２を加え、計１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）とした。７日後、４～６×１０５個のＰＢＭＣを、ＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社）でプレコートしたＥＬＩＳＰＯＴプレートの底部に播種した。各ドナーまたは患者由来のＰＢＭＣは、ペプチド（５μＭ ＡＲＧ２由来ペプチド）および対照の刺激について、三重反復または四重反復測定となるようセットアップした。細胞を、抗原の存在下でＥＬＩＳＰＯＴプレートにおいて１４～１６時間インキュベートし、その後、それらを洗い流し、二次ビオチン化抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ社）を加えた。２時間のインキュベーション後、二次抗体を洗い流し、次いで、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（Ｍａｂｔｅｃｈ社）を加えて１時間置いた。次に、非結合酵素を洗い流し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｍａｂｔｅｃｈ社）を加えて、アッセイを行った。展開したＥＬＩＳＰＯＴプレートを、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェア、バージョン５．１を用いたＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ｓ６ Ｕｌｔｉｍａｔｅ－Ｖアナライザーで分析した。応答は、ＡＲＧ２由来ペプチドで刺激したウェルおよび対照ウェル中の平均スポット数の差として報告する。
【0083】
ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞（エフェクター細胞）および標的細胞としての種々の免疫細胞または癌細胞（標的細胞）を用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、ＥＬＩＳＰＯＴウェルの底部に１～５×１０４個のエフェクター細胞（前述の通り）および１～２．５×１０４個の標的細胞（前述の通り）を播種して、セットアップした。標的細胞のペプチドパルスを、２０μＭペプチドとともに細胞のインキュベーションを１時間行うことにより実施し、次いで、２回洗浄し、非結合ペプチドを除去した。これらの細胞は、陽性対照とした。標的細胞なしで播種したエフェクター細胞を陰性対照とした。全ての条件は、三重反復または四重反復測定となるようセットアップした。
【0084】
細胞内サイトカイン染色アッセイ
細胞培養物の細胞内染色を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＲＧ２由来ペプチド刺激の１週後に、ＰＢＭＣに対して行った。アッセイのために、９×１０５個のＰＢＭＣを、ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（最初の１時間のペプチド刺激後に加えた）の存在下で、ＡＲＧ２由来ペプチドで５時間再刺激した（または、対照としてのペプチドなしでインキュベートした）。刺激した細胞を、表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）に対する蛍光標識抗体で染色し、その後、固定／透過処理および透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号００－５１２３－４３）を用いて、製造業者の説明書に従って透過処理した。次いで、透過処理した細胞を、ＩＦＮγおよびＴＮＦαに対する蛍光色素標識抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行った。以下の抗体：ＩＦＮγ－ＡＰＣ、ＴＮＦα－ＢＶ４２１、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ、ＣＤ８－ＦＩＴＣ、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｈ７、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ、および死細胞染色－ＦＶＳ５１０（総てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から）を、製造業者の説明書に従って使用した。標的細胞に応答したＡＲＧ２特異的Ｔ細胞のサイトカイン産生を検出するための細胞内サイトカイン染色のために、５×１０５個のＡＲＧ２特異的細胞を、２．５×１０５個の標的細胞とともに５時間インキュベートした。その後、最初の１時間のインキュベーション後にＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）を加えた。
細胞培養物の細胞内染色を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＲＧ２由来ペプチド刺激の１週後に、ＰＢＭＣに対して行った。アッセイのために、９×１０５個のＰＢＭＣを、ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（最初の１時間のペプチド刺激後に加えた）の存在下で、ＡＲＧ２由来ペプチドで５時間再刺激した（または、対照としてのペプチドなしでインキュベートした）。刺激した細胞を、表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）に対する蛍光標識抗体で染色し、その後、固定／透過処理および透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号００－５１２３－４３）を用いて、製造業者の説明書に従って透過処理した。次いで、透過処理した細胞を、ＩＦＮγおよびＴＮＦαに対する蛍光色素標識抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行った。以下の抗体：ＩＦＮγ－ＡＰＣ、ＴＮＦα－ＢＶ４２１、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ、ＣＤ８－ＦＩＴＣ、ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｈ７、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ、および死細胞染色－ＦＶＳ５１０（総てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から）を、製造業者の説明書に従って使用した。標的細胞に応答したＡＲＧ２特異的Ｔ細胞のサイトカイン産生を検出するための細胞内サイトカイン染色のために、５×１０５個のＡＲＧ２特異的細胞を、２．５×１０５個の標的細胞とともに５時間インキュベートした。その後、最初の１時間のインキュベーション後にＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）を加えた。
【0085】
ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物の確立
照射ＡＲＧ２－１をロードした自家成熟樹状細胞で前立腺癌患者由来のＰＭＢＣを最初に刺激することにより、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物を確立した。翌日、ＩＬ－１２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ－７（４０Ｕ／ｍｌ）を加えた。ＰＢＭＣを、ＡＲＧ２－１ペプチドをロードした自家ＤＣで８日毎に再刺激し、次いで、翌日にＩＬ－２（１２０Ｕ／ｍｌ）を加えた。４回の刺激後、ＩＦＮγ富化キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社）を用いて、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞を富化した。細胞を増殖させ、ＣＤ４＋富化キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社）を用いて、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞をさらに富化した。
照射ＡＲＧ２－１をロードした自家成熟樹状細胞で前立腺癌患者由来のＰＭＢＣを最初に刺激することにより、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物を確立した。翌日、ＩＬ－１２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ－７（４０Ｕ／ｍｌ）を加えた。ＰＢＭＣを、ＡＲＧ２－１ペプチドをロードした自家ＤＣで８日毎に再刺激し、次いで、翌日にＩＬ－２（１２０Ｕ／ｍｌ）を加えた。４回の刺激後、ＩＦＮγ富化キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社）を用いて、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞を富化した。細胞を増殖させ、ＣＤ４＋富化キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社）を用いて、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞をさらに富化した。
【0086】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡの作製
ＡＲＧ２（ＮＭ＿００１１７２．４）をコードするｃＤＮＡを合成し、ＢａｍＨＩ制限部位を用いて、ＨＬＡクラスＩＩ標的プラスミドｐＧＥＭ－ｓｉｇ－ＤＣ．ＬＡＭＰ（Ｄｒ．Ｋ．Ｔｈｉｅｌｅｍａｎｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌのご厚意による提供）にクローン化した。ｐＧＥＭ－ＡＲＧ２－ＤＣ－ＬＡＭＰプラスミドを、ＳｐｅＩを用いて線形化した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＤＮＡ鋳型として用いた（ＯＭ論文＊＊参照）。
ＡＲＧ２（ＮＭ＿００１１７２．４）をコードするｃＤＮＡを合成し、ＢａｍＨＩ制限部位を用いて、ＨＬＡクラスＩＩ標的プラスミドｐＧＥＭ－ｓｉｇ－ＤＣ．ＬＡＭＰ（Ｄｒ．Ｋ．Ｔｈｉｅｌｅｍａｎｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌのご厚意による提供）にクローン化した。ｐＧＥＭ－ＡＲＧ２－ＤＣ－ＬＡＭＰプラスミドを、ＳｐｅＩを用いて線形化した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＤＮＡ鋳型として用いた（ＯＭ論文＊＊参照）。
【0087】
全ＲＮＡ抽出
細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、遠心分離によりペレット化した。ＲＮＡ抽出まで、細胞ペレットを氷上で保存、または－８０℃で凍結した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＲＮＡｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて抽出し、３０μｌのＲＮＡフリー水中で最終溶出した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。ＲＮＡを－８０℃で保存した。
細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、遠心分離によりペレット化した。ＲＮＡ抽出まで、細胞ペレットを氷上で保存、または－８０℃で凍結した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＲＮＡｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて抽出し、３０μｌのＲＮＡフリー水中で最終溶出した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。ＲＮＡを－８０℃で保存した。
【0088】
ＲＴ－ｑＰＣＲ
全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写した。各反応につき、１０００ｎｇのＲＮＡを逆転写した。ＲＴ－ｑＰＣＲのために、ｃＤＮＡを１：５に希釈し、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔでのＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いたＲＴ－ｑＰＣＲ分析に供した。ＲＴ－ｑＰＣＲは四重反復で実施し、データは、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬＰＯおよび対照サンプルの発現レベルに対して正規化したｄｄＣＴ法を用いて、分析した。増幅しなかった低濃度サンプルについては、Ｃｔを４０とした。逆転写酵素なしの対照（逆転写酵素なしでｃＤＮＡ反応をセットアップ）は、特異的増幅の対照とした。この試験に使用したプライマーの一覧を、以下に示す。
全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写した。各反応につき、１０００ｎｇのＲＮＡを逆転写した。ＲＴ－ｑＰＣＲのために、ｃＤＮＡを１：５に希釈し、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔでのＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いたＲＴ－ｑＰＣＲ分析に供した。ＲＴ－ｑＰＣＲは四重反復で実施し、データは、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬＰＯおよび対照サンプルの発現レベルに対して正規化したｄｄＣＴ法を用いて、分析した。増幅しなかった低濃度サンプルについては、Ｃｔを４０とした。逆転写酵素なしの対照（逆転写酵素なしでｃＤＮＡ反応をセットアップ）は、特異的増幅の対照とした。この試験に使用したプライマーの一覧を、以下に示す。
【0089】
【表3】
【0090】
エレクトロポレーション
ｍＲＮＡについて、ＤＣまたは癌細胞を、以前に記載のエレクトロポレーションパラメーターを用いて、ＡＲＧ１－ＤＣ－ＬＡＭＰ ｍＲＮＡ、ＡＲＧ２－ＤＣ－ＬＡＭＰ ｍＲＮＡまたはｅＧＦＰをコードする対照ｍＲＮＡでトランスフェクトした。簡潔には、細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で２回洗浄し、最終細胞濃度９～１２×１０６細胞／ｍｌに調整した。３５０μｌの細胞懸濁液を、氷上で５分間プレインキュベートした後、１０μｇのｍＲＮＡを加えた。次いで、細胞懸濁液を２ｍｍ（癌細胞）または４ｍｍ（ＤＣ）のギャップエレクトロポレーションキュベットに迅速に移し、電気穿孔した（ＯＭ論文を参照のこと）。エレクトロポレーションの後、細胞を、予め加温した培地を入れたディッシュに迅速に移し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下でインキュベートした後、異なる実験的分析に使用した。ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、１時間静置した後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにセットアップしたか、または、一晩静置した後、細胞内サイトカイン染色アッセイにセットアップした。エレクトロポレーション効率は、ＧＦＰをトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析により、トランスフェクションの２４時間後に測定した。
ｍＲＮＡについて、ＤＣまたは癌細胞を、以前に記載のエレクトロポレーションパラメーターを用いて、ＡＲＧ１－ＤＣ－ＬＡＭＰ ｍＲＮＡ、ＡＲＧ２－ＤＣ－ＬＡＭＰ ｍＲＮＡまたはｅＧＦＰをコードする対照ｍＲＮＡでトランスフェクトした。簡潔には、細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で２回洗浄し、最終細胞濃度９～１２×１０６細胞／ｍｌに調整した。３５０μｌの細胞懸濁液を、氷上で５分間プレインキュベートした後、１０μｇのｍＲＮＡを加えた。次いで、細胞懸濁液を２ｍｍ（癌細胞）または４ｍｍ（ＤＣ）のギャップエレクトロポレーションキュベットに迅速に移し、電気穿孔した（ＯＭ論文を参照のこと）。エレクトロポレーションの後、細胞を、予め加温した培地を入れたディッシュに迅速に移し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下でインキュベートした後、異なる実験的分析に使用した。ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、１時間静置した後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにセットアップしたか、または、一晩静置した後、細胞内サイトカイン染色アッセイにセットアップした。エレクトロポレーション効率は、ＧＦＰをトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析により、トランスフェクションの２４時間後に測定した。
【0091】
ｓｉＲＮＡ媒介性ＡＲＧ２サイレンシング
ＡＲＧ２を標的とする３個一組のｓｉＲＮＡ二本鎖を、Ａｍｂｉｏｎ社から得た（ＡＲＧ２ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ、ＩＤ ｓ１５７１、ｓ１５７２、ｓ１５７３）。ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼフリー水に懸濁して０．１ｎｍｏｌ原液とし、－８０℃で保存した。ＡＲＧ２サイレンシング実験について、ＴＨＰ－１細胞を上記のようにエレクトロポレーションのために調製し、０．０２ｎｍｏｌ ｓｉＲＮＡ溶液のワーキング溶液１０μｌを、３個のｓｉＲＮＡのそれぞれに加えた後、以前に記載したようにトランスフェクションした。トランスフェクションの直後、細胞を予め加温した培地に移し、１時間インキュベートした。次いで、トランスフェクトした細胞を２つに分割し、その細胞の半分に対して、サイトカインカクテル（４００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４、１０００Ｕ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍｌ ＴＮＦα）を加えた。細胞を培地またはサイトカインカクテルを含有する培地において４８時間インキュベートした後、それらを細胞内サイトカイン染色アッセイにセットアップした。ＲＴ－ｑＰＣＲによるノックダウン効率を増加させるために、４８時間後に細胞のＲＮＡをペレット化した。
ＡＲＧ２を標的とする３個一組のｓｉＲＮＡ二本鎖を、Ａｍｂｉｏｎ社から得た（ＡＲＧ２ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ、ＩＤ ｓ１５７１、ｓ１５７２、ｓ１５７３）。ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼフリー水に懸濁して０．１ｎｍｏｌ原液とし、－８０℃で保存した。ＡＲＧ２サイレンシング実験について、ＴＨＰ－１細胞を上記のようにエレクトロポレーションのために調製し、０．０２ｎｍｏｌ ｓｉＲＮＡ溶液のワーキング溶液１０μｌを、３個のｓｉＲＮＡのそれぞれに加えた後、以前に記載したようにトランスフェクションした。トランスフェクションの直後、細胞を予め加温した培地に移し、１時間インキュベートした。次いで、トランスフェクトした細胞を２つに分割し、その細胞の半分に対して、サイトカインカクテル（４００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４、１０００Ｕ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍｌ ＴＮＦα）を加えた。細胞を培地またはサイトカインカクテルを含有する培地において４８時間インキュベートした後、それらを細胞内サイトカイン染色アッセイにセットアップした。ＲＴ－ｑＰＣＲによるノックダウン効率を増加させるために、４８時間後に細胞のＲＮＡをペレット化した。
【0092】
ＨＬＡ－ＤＲ発現のフローサイトメトリー分析
ＨＬＡ－ＤＲ発現分析を、疑似（サイトカインなし）、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）またはサイトカインカクテル（４００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４、１０００Ｕ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍｌ ＴＮＦα）で４８時間刺激した細胞に対して行った。簡潔には、細胞を洗浄し、７－ＡＡＤ（カタログ番号：５１－６８９８１Ｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）およびＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ（カタログ番号：５５５５５８１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）またはＦＩＴＣ結合マウスＩｇＧ１ Ｋアイソタイプ対照（ＦＣ）（カタログ番号：４００１０９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で、４℃にて３０分間染色した。過剰な抗体を洗い流した後、細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ機器で分析した。ＨＬＡ－ＤＲ発現レベルは、染色したＭＨＣクラスＩＩ生細胞とアイソタイプ対照生細胞との間のＭＦＩの差として示す。
ＨＬＡ－ＤＲ発現分析を、疑似（サイトカインなし）、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）またはサイトカインカクテル（４００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４、１０００Ｕ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍｌ ＴＮＦα）で４８時間刺激した細胞に対して行った。簡潔には、細胞を洗浄し、７－ＡＡＤ（カタログ番号：５１－６８９８１Ｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）およびＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ（カタログ番号：５５５５５８１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）またはＦＩＴＣ結合マウスＩｇＧ１ Ｋアイソタイプ対照（ＦＣ）（カタログ番号：４００１０９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で、４℃にて３０分間染色した。過剰な抗体を洗い流した後、細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ機器で分析した。ＨＬＡ－ＤＲ発現レベルは、染色したＭＨＣクラスＩＩ生細胞とアイソタイプ対照生細胞との間のＭＦＩの差として示す。
【0093】
統計解析
ＥＬＩＳＰＯＴ応答は、分布によらないリサンプリング（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｆｒｅｅ ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ：ＤＦＲ）法を用いて分析した。ＥＬＩＳＰＯＴ応答の統計解析を、Ｒスタジオを用いて行った。ＡＲＧ２－１およびＡ２Ｌ２に対する応答（特異的ＩＦＮγ分泌細胞）の差を、ウィルコクソンの対のある符号順位ｔ検定（Ｐｒｉｓｍ ８を用いた）を使用して、有意水準０．０５として比較した。対照とＡｒｇ２ワクチン接種群との間の平均腫瘍成長の差の統計解析を、Ｐｒｉｓｍ ８を用いた混合効果分析により行った。
ＥＬＩＳＰＯＴ応答は、分布によらないリサンプリング（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｆｒｅｅ ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ：ＤＦＲ）法を用いて分析した。ＥＬＩＳＰＯＴ応答の統計解析を、Ｒスタジオを用いて行った。ＡＲＧ２－１およびＡ２Ｌ２に対する応答（特異的ＩＦＮγ分泌細胞）の差を、ウィルコクソンの対のある符号順位ｔ検定（Ｐｒｉｓｍ ８を用いた）を使用して、有意水準０．０５として比較した。対照とＡｒｇ２ワクチン接種群との間の平均腫瘍成長の差の統計解析を、Ｐｒｉｓｍ ８を用いた混合効果分析により行った。
【0094】
結果
ＡＲＧ２に対する自発的免疫応答
実施例１において概説したように、ＡＲＧ２－１は、選別されたドナーにおいて最も高く、かつ最も頻繁な応答を示すことが認められた。興味深いことに、ＡＲＧ２－１は、ＡＲＧ２のトランジット配列（ａａ１－２２）の一部である。シグナルペプチド配列は、ＨＬＡ分子の観点で、それらのプロセシングおよび提示に関して、プロテオソーム分解またはＴＡＰに大部分が依存しない興味深い種類のペプチドエピトープを示す。さらに、ＡＲＧ２のこの部分は、ＡＲＧ１の対応する配列との配列重複をほぼ有さない。以下のアラインメントを参照のこと：
ＡＲＧ２に対する自発的免疫応答
実施例１において概説したように、ＡＲＧ２－１は、選別されたドナーにおいて最も高く、かつ最も頻繁な応答を示すことが認められた。興味深いことに、ＡＲＧ２－１は、ＡＲＧ２のトランジット配列（ａａ１－２２）の一部である。シグナルペプチド配列は、ＨＬＡ分子の観点で、それらのプロセシングおよび提示に関して、プロテオソーム分解またはＴＡＰに大部分が依存しない興味深い種類のペプチドエピトープを示す。さらに、ＡＲＧ２のこの部分は、ＡＲＧ１の対応する配列との配列重複をほぼ有さない。以下のアラインメントを参照のこと：
【0095】
したがって、ＡＲＧ２－１を用いて、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる３３例のＨＤおよび１９例の固形腫瘍を有する癌患者（黒色腫患者１１例、前立腺癌患者７例、および乳癌患者１例）におけるＡＲＧ２免疫応答に関するスクリーニングを行った。強い頻繁な応答が、健常ドナーおよび固形腫瘍を有する癌患者の両方において認められ、有意な応答が、選別されたドナーのおよそ７５％において認められた（図１４Ａを参照のこと。 この図中のいくつかのデータポイントは、図８にも示されている）。
【0096】
ＡＲＧ２は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者において認められた免疫抑制微小環境において重要な役割を果たすと報告されているため、ＡＭＬと診断された患者由来のＰＢＭＣにおけるＡＲＧ２特異的Ｔ細胞の存在の可能性も、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにより検討した。この目的を達成するため、本発明者らは、ＡＭＬと診断された９例の患者から末梢血を採取した。採血およびその後のＰＢＭＣ単離は、治療状況とは関連なく行ったため、試験対象の患者は、広く多様な疾患段階および治療段階を示す。有意な応答が、試験した患者９例中３例に認められ（図１４Ａを参照のこと）、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞はＡＭＬ患者において実際に存在し得ることが示唆された。健常ドナーおよび固形腫瘍を有する癌患者におけるＩＦＮγおよびＴＦＮａの産生に対する細胞内サイトカイン染色は、ＡＲＧ２－１に対するＣＤ４＋応答を主に示した（図１４Ｂ）。
【0097】
長鎖ＡＲＧ２ペプチドエピトープの特性評価
２０－および３０ｍｅｒのＡＲＧ１ペプチドと比較して、より長い（３８－ｍｅｒ）ＡＲＧ１ペプチドは、ＡＲＧ１特異的Ｔ細胞の刺激に優れていることが、以前に実証されている。したがって、組織型に依存しない個体におけるＡＲＧ２特異的Ｔ細胞の刺激に関して、最適な広域宿主のＡＲＧ２由来エピトープを同定するために、ＡＲＧ２－１周囲の配列のより長い部分に及ぶより長いＡＲＧ２ペプチドエピトープを、ＨＬＡ予測アルゴリズム（www.syfpeithi.deおよびcbs.dtu.dkにて入手可能）に基づいて設計した。これらの配列を、ヒトアルギナーゼ２の予測シグナル配列ならびにＡＲＧ２－０、ＡＲＧ２－１およびＡＲＧ２－２の２０ｍｅｒ配列のアラインメントを以下に示す。
２０－および３０ｍｅｒのＡＲＧ１ペプチドと比較して、より長い（３８－ｍｅｒ）ＡＲＧ１ペプチドは、ＡＲＧ１特異的Ｔ細胞の刺激に優れていることが、以前に実証されている。したがって、組織型に依存しない個体におけるＡＲＧ２特異的Ｔ細胞の刺激に関して、最適な広域宿主のＡＲＧ２由来エピトープを同定するために、ＡＲＧ２－１周囲の配列のより長い部分に及ぶより長いＡＲＧ２ペプチドエピトープを、ＨＬＡ予測アルゴリズム（www.syfpeithi.deおよびcbs.dtu.dkにて入手可能）に基づいて設計した。これらの配列を、ヒトアルギナーゼ２の予測シグナル配列ならびにＡＲＧ２－０、ＡＲＧ２－１およびＡＲＧ２－２の２０ｍｅｒ配列のアラインメントを以下に示す。
【0098】
【表4】
【0099】
これらの長鎖ＡＲＧ２ペプチドが、ＡＲＧ２応答を同定するために使用できるかどうかを試験するために、６例の健常ドナー由来のＰＢＭＣを、３個の長鎖ペプチドのそれぞれで１回ずつ刺激した。その後、ＰＢＭＣを用いて、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにおける免疫応答についてスクリーニングを行った。図１５Ａに示されるように、３個の長鎖ペプチド総てに対する免疫応答が同定されたが、３３－ｍｅｒ Ａ２Ｌ２が、試験したドナーにおいて３個の長鎖ペプチドのうち最も強く、かつ最も頻繁な免疫応答を示した。ＡＲＧ２－１はＡ２Ｌ２内に含まれるため、より長いペプチドＡ２Ｌ２を検討し、それがＡＲＧ２特異的Ｔ細胞をより効率的に刺激したかどうかを決定した。このため、６例の健常ドナーをＡＲＧ２－１またはＡ２Ｌ２のいずれかで１回刺激し、次いで、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてセットアップした。６例中５例のドナーにおいて、有意ではないものの（ｐ＝０．０６２５）、Ａ２Ｌ２免疫応答はＡＲＧ２－１応答より高く（図１５Ｂ）、両ペプチドは頻繁な免疫応答を誘発することが示唆された。
【0100】
Ａ２Ｌ２の免疫原性を特徴付けるため、３０例の健常ドナーおよび１８例の癌患者（黒色腫患者１４例、前立腺癌患者３例、乳癌患者１例）由来のＰＢＭＣを、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより選別した。強い頻繁な応答が、健常ドナーおよび癌患者の両方の約８０％において認められた（図１５Ｃ）。ＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生に対する細胞内サイトカイン染色は、ＡＲＧ２－１に対して認められたものと類似するＡ２Ｌ２刺激に対するＣＤ４＋応答のみを示した（図１５Ｄ）。Ａ２Ｌ２に対する免疫応答は、有意ではないものの（ｐ＝０．７０３８）、同じドナーにおけるＡＲＧ２－１応答と比較して、平均して高かった（図１５Ｅ）。
【0101】
ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞の特性評価
ＡＲＧ２に対する免疫応答をさらに特徴付けるために、ＡＲＧ２特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞培養物を作製した。これは、前立腺癌患者から単離した細胞を、ＡＲＧ２ペプチドをロードした自家ＤＣで繰り返し刺激して、特異的細胞を富化してすばやく増殖させることで得られた。Ｔ細胞培養物は、ＴＮＦαおよびＩＦＮγに対する細胞内サイトカイン染色（図１６Ａ）ならびにＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ（図１６Ｂ）において、ＡＲＧ２およびＡ２Ｌ２の両方に対して高度に特異的であった。さらに、ペプチドで刺激したＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物からのＩＦＮγ産生は、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにおいて、ＨＬＡ－ＤＲ遮断剤の添加によって阻害されるが、ＨＬＡ－ＤＰまたはＨＬＡ－ＤＱ遮断剤の添加では阻害されないことが認められた（図１６Ｃ）。ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物の特異性を評価するため、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物の、ＡＲＧ２の細胞内発現を伴う細胞に対する認識能およびそれらに対する反応性を調べた。この目的を達成するため、リソソーム区画に対するタンパク質を標的として、そのタンパク質をクラスＩＩ提示に指向させる、ＤＣ－ＬＡＭＰシグナル配列と融合したＡＲＧ２をコードするｍＲＮＡで、自家ＤＣをトランスフェクトした。疑似のトランスフェクトしたＤＣと比較して、ＡＲＧ２ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣに対して、より高い反応性が認められた（図１６Ｄ）。トランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析は、９０％超のトランスフェクション効率を示し、疑似およびｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣのｍＲＮＡ分析は、トランスフェクションの２４時間後にＡＲＧ２の発現が大幅に増加することを示した（データ示さず）。
ＡＲＧ２に対する免疫応答をさらに特徴付けるために、ＡＲＧ２特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞培養物を作製した。これは、前立腺癌患者から単離した細胞を、ＡＲＧ２ペプチドをロードした自家ＤＣで繰り返し刺激して、特異的細胞を富化してすばやく増殖させることで得られた。Ｔ細胞培養物は、ＴＮＦαおよびＩＦＮγに対する細胞内サイトカイン染色（図１６Ａ）ならびにＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ（図１６Ｂ）において、ＡＲＧ２およびＡ２Ｌ２の両方に対して高度に特異的であった。さらに、ペプチドで刺激したＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物からのＩＦＮγ産生は、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにおいて、ＨＬＡ－ＤＲ遮断剤の添加によって阻害されるが、ＨＬＡ－ＤＰまたはＨＬＡ－ＤＱ遮断剤の添加では阻害されないことが認められた（図１６Ｃ）。ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物の特異性を評価するため、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物の、ＡＲＧ２の細胞内発現を伴う細胞に対する認識能およびそれらに対する反応性を調べた。この目的を達成するため、リソソーム区画に対するタンパク質を標的として、そのタンパク質をクラスＩＩ提示に指向させる、ＤＣ－ＬＡＭＰシグナル配列と融合したＡＲＧ２をコードするｍＲＮＡで、自家ＤＣをトランスフェクトした。疑似のトランスフェクトしたＤＣと比較して、ＡＲＧ２ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣに対して、より高い反応性が認められた（図１６Ｄ）。トランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析は、９０％超のトランスフェクション効率を示し、疑似およびｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣのｍＲＮＡ分析は、トランスフェクションの２４時間後にＡＲＧ２の発現が大幅に増加することを示した（データ示さず）。
【0102】
ＡＲＧ２産生免疫細胞に対する反応性を示したが、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物の、異なる癌細胞に対する認識能および反応性を、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて検討した。特異的Ｔ細胞培養物に関するドナーのＨＬＡシークエンシング分析によって、本発明者らは、低い内因性ＡＲＧ２発現を伴う３個のＨＬＡマッチ（ＨＬＡ－ＤＲ０１：０１）ＡＭＬ細胞株を選択することができ（ＯＣＩ－ＡＭＬ２、ＴＨＰ－１およびＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１ データ示さず）、ＡＲＧ２－１ペプチドでパルスして、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ用の標的細胞としてその後使用することができた。高い内因性ＡＲＧ２発現を伴うが、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物とＨＬＡミスマッチである別のＡＭＬ細胞株であるＳｅｔ２を、陰性対照として含めた。ＯＣＩ－ＡＭＬ２、ＴＨＰ－１およびＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞により効率的に認識されたが（図１７Ａ）、Ｓｅｔ２は認識されなかった。２つの異なるＨＬＡ－ＤＲ特異的抗体を添加することにより、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞のＨＬＡ－ＤＲ拘束性が確認された。これは、両ＨＬＡ－ＤＲ遮断剤の添加で、ＡＲＧ２－１パルスＴＨＰ－１細胞の認識が抑制されたことによる（図１７Ｂ）。
【0103】
ＴＨＰ－１細胞株は、ＡＭＬを有する患者の末梢血に由来する単球性細胞株である。ＴＨＰ－１細胞は、それらの周囲における特異的サイトカインの存在に依存したそれらの機能により、ある程度の可塑性を維持していると報告されている。ＩＬ－４およびＩＬ－１３は、ＡＲＧ１の主要誘導因子であると報告されているが、ＡＲＧ２に対するそれらの機能は周知ではない。さらに、ＴＨＰ－１細胞は、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＦＮαのサイトカインカクテル（本明細書において「サイトカインカクテル」という）による４８時間の刺激時に、ＤＣ様の特徴を獲得すると報告されている。したがって、ＩＬ－４、ＩＬ－１３またはサイトカインカクテルによるＴＨＰ－１細胞の刺激が、ＴＨＰ－１細胞におけるＡＲＧ２発現を増大させるかどうかを調べた。サイトカインカクテルによる刺激で、ＡＲＧ２発現の２倍超の誘導が認められたが、一方、ＩＬ－４およびＩＬ－１３は、ＡＲＧ２発現レベルに対して大きな効果を示さなかった（図１７Ｃ）。次に、サイトカインカクテル刺激後のＡＲＧ２発現の増大が、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞からの免疫応答を誘発し得るかどうかを検討した。実際に、サイトカインカクテルは、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにおいて刺激されたＴＨＰ－１細胞の認識（図１７Ｄ）ならびに細胞内サイトカイン染色により検出されたＴＮＦαおよびＩＦＮγの産生（図１７Ｅ）をもたらすことが認められた。サイトカインによるＴＨＰ－１細胞の処理後に、ＡＲＧ２発現のみが増大し、一方、ＡＲＧ１発現は不変のままであった（図１７Ｆ）。サイトカインで刺激したＴＨＰ－１細胞に対する応答は、ＨＬＡ－ＤＲ特異的抗体により遮断することができた（図１７Ｇ）。
【0104】
注目すべきことに、サイトカインカクテルで刺激したＴＨＰ－１細胞は、刺激していない細胞と比較して、形態を変化させ、より多くのコロニー形成、小さな突出および付着性の獲得が認められた（データ示さず）。重要なことに、サイトカインカクテルは、ＨＬＡ－ＤＲ発現をアップレギュレートしなかった（データ示さず）。対照的に、ＩＦＮγによるＴＨＰ－１細胞の処理は、細胞表面上のＨＬＡ－ＤＲ発現を増大させるが（示さず）、ＡＲＧ２発現は増大させず（図１７Ｈ）、ＩＦＮγで刺激したＴＨＰ－１細胞は、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＡＲＧ２特異的Ｔ細胞により認識されなかった（図１７Ｉ）。
【0105】
ＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１は、ＴＨＰ－１細胞と同様に、分化能またはサイトカイン刺激の影響を受ける能力を維持するＡＭＬ細胞株である。ＴＨＰ－１細胞に関する観察所見と同様に、サイトカインによりＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１細胞におけるＡＲＧ２発現を増大させることが可能であった（図１８Ａ）。サイトカインカクテルによるＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１細胞の刺激は、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１細胞の刺激していない細胞と比較して、ＨＬＡ－ＤＲの発現を増大させなかった（示さず）。さらに、ＩＦＮγで刺激したＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１細胞は、ＡＲＧ２発現をアップレギュレートせず（図１８Ｂ）、サイトカインで処理したＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１細胞のみが、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにおけるＡＲＧ２特異的Ｔ細胞により認識された（図１８Ｃ）。サイトカインカクテルで刺激したＭＯＮＯ－ＭＡＣ－１は、ＴＨＰ－１細胞で認められたものと同様に、形態も変化させる（示さず）。
【0106】
ＡＲＧ２発現依存性Ｔ細胞認識の概念をさらに検証するため、ＡＲＧ２－ＤＣ－ＬＡＭＰ構築物を用いて、ＴＨＰ－１細胞をＡＲＧ２ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。ＤＣ－ＬＡＭＰ配列は、成熟ＤＣに対して特異的であると報告されているが、ＴＨＰ－１細胞は、ＤＣ様細胞に分化し得、このため、構築物は、ＴＨＰ－１細胞のトランスフェクションにも適用可能である。実際に、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞培養物は、ＡＲＧ２－ＤＣ－ＬＡＭＰ ｍＲＮＡでトランスフェクトしたＴＨＰ－１細胞に対して反応することが認められた（図１９Ａ）。さらに、反応性は、ＡＲＧ１－ＤＣ－ＬＡＭＰ ｍＲＮＡでトランスフェクトした細胞と比較して、ＡＲＧ２－ＤＣ－ＬＡＭＰ ｍＲＮＡでトランスフェクトした細胞に対して有意に高く（図７Ａ）、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞の特異性が強調された。さらに、トランスフェクション前のサイトカインによる４８時間の刺激は、ｍＲＮＡのトランスフェクションまたはサイトカイン刺激のみを受けた細胞と比較して、免疫応答を増大させた（図１９Ａ）。ＴＮＦαおよびＩＦＮγの産生についての細胞内サイトカイン染色は、同様の傾向を示した（図１９Ｂ）。トランスフェクションの２４時間後にＧＦＰ発現細胞のＦＡＣＳ分析を行い、エレクトロポレーション効率を評価したところ、効率的なトランスフェクションが示された（ＧＦＰ＋細胞が９９％超）（データ示さず）。これと一致して、疑似細胞と比較して、ＡＲＧ２およびＡＲＧ１発現の大きな倍数増加が、それぞれＡＲＧ２－ＤＣ－ＬＡＭＰ ｍＲＮＡまたはＡＲＧ１－ＤＣ－ＬＡＭＰ ｍＲＮＡでのトランスフェクションの２４時間後に認められた（データ示さず）。ｍＲＮＡトランスフェクトＴＨＰ－１細胞におけるＡＲＧ２発現レベルは、Ｓｅｔ２細胞における内因性ＡＲＧ２発現レベルと比較して高かった（データ示さず）。
【0107】
次に、本発明者らは、ＡＲＧ２のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンを用いて、Ｔ細胞の認識および活性化が、ＡＲＧ２発現に依存的であったことをさらに証明した。３個のＡＲＧ２特異的ｓｉＲＮＡのプールでのＴＨＰ－１細胞のトランスフェクションは、効率的なＡＲＧ２ ＫＤをもたらした（図１９Ｃ）。ＴＮＦαおよびＩＦＮγの産生を、ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションおよびサイトカイン刺激の４８時間後の細胞内サイトカイン染色により検証した。本発明者らは、たとえ産生を完全には抑制できなかった場合でも、疑似＋サイトカイン細胞と比較して、ｓｉＲＮＡ＋サイトカイン細胞に対するＡＲＧ２特異的Ｔ細胞からのＴＮＦαおよびＩＦＮγの両方の産生が減少することを観察した（図１９Ｄ）。細胞におけるＡＲＧ２発現のＲＴ－ｑＰＣＲは、ｓｉＲＮＡ＋サイトカイン細胞におけるＡＲＧ２ ＫＤも示したが、ＡＲＧ２発現レベルは、ｓｉＲＮＡ ＫＤのみで得られたレベルよりわずかに高い（図１９Ｅ）。
【0108】
実施例３ － マウスモデルにおけるワクチン原理の証明
アルギナーゼ２に対するワクチン接種の治療可能性を実証するために、マウスモデルを構築した。マウスアルギナーゼ２の、ヒトアルギナーゼ２に対する配列相同性は８５％であるため、単純にヒト配列を使用することはできない。エピトープ予測サーバーを使用して、Ｃ５７マウスに関するマウスアルギナーゼ２における可能性のあるエピトープ（Ｈ－２Ｋｂ、Ｈ２－Ｄｂ）を検索した。
アルギナーゼ２に対するワクチン接種の治療可能性を実証するために、マウスモデルを構築した。マウスアルギナーゼ２の、ヒトアルギナーゼ２に対する配列相同性は８５％であるため、単純にヒト配列を使用することはできない。エピトープ予測サーバーを使用して、Ｃ５７マウスに関するマウスアルギナーゼ２における可能性のあるエピトープ（Ｈ－２Ｋｂ、Ｈ２－Ｄｂ）を検索した。
【0109】
Ｈ２－ＫｂおよびＨ２－Ｄｂへの結合について予測されたエピトープは、ａａ８５およびａａ１８２の周囲の２つのクラスターに認められた。これらを、オーバーラップを例示するためにアラインメントとして以下に示す。
【0110】
【表5】
【0111】
各予測エピトープは、Ｈ２－ＫｂまたはＨ２－Ｄｂのいずれかに結合することが予測されるが、ｍＡｒｇ２＿Ｐ２は、２個の予測エピトープによりひとまとめになり、理論的には、Ｈ２－ＫｂおよびＨ２－Ｄｂの両方に結合することができる。ｍＡｒｇ２＿Ｐ６は、Ｈ２－ＫｂおよびＨ２－Ｄｂの両方に結合すると予測された。
【0112】
これらのペプチドをワクチン接種スクリーニングに用い（図１１における実験模式図参照）、３匹のＣ５７マウスに対し、６個のペプチドのうち１個を皮下ワクチン接種した。１週後、マウスを屠殺し、脾臓をホモジナイズしてＰＢＭＣを得た。これらを用いてＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴをセットアップし、ワクチン接種に使用したペプチドおよび重複配列を有する他の予測エピトープペプチドの両方に対する応答に関してスクリーニングした。
【0113】
図１２に示されるように、ｍＡｒｇ２ Ｐ５（ａａ１８８－１９６）をワクチン接種したマウスは、最も強力かつ最も顕著な応答を示した。さらに、このペプチドを用いたワクチン接種実験を行った。図１３に示されるように、ｍＡｒｇ２ Ｐ５をワクチン接種したマウスにおける応答が、ｍＡｒｇ２ Ｐ５（ａａ１８８－１９６）およびＰ４（ａａ１８２－１９７）の両方に対して認められたが、一方、ｍＡｒｇ２ Ｐ３（ａｓ１９１－１９８）に対しては、応答は認められなかったか、または弱い応答のみが認められた。このことは、主要なエピトープがａａ１８８－１９６内に位置することを示唆している。しかしながら、全体的に、実験は、アルギナーゼ２ペプチドのワクチン接種は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫応答を刺激できることを実証しており、一般的原理としてアルギナーゼ２のワクチン接種について治療可能性が検証された。
【0114】
実施例４ － マウスモデル － ルイス肺癌におけるワクチン原理のさらなる証明
材料と方法
ペプチドの設計 － 実施例３を参照のこと。
材料と方法
ペプチドの設計 － 実施例３を参照のこと。
【0115】
細胞培養
腫瘍由来細胞株ルイス肺（ＬＬ２）を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で培養した。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）でフラスコから剥離することにより、細胞を週２～３回継代した。
腫瘍由来細胞株ルイス肺（ＬＬ２）を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で培養した。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）でフラスコから剥離することにより、細胞を週２～３回継代した。
【0116】
動物実験
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｈｅｒｌｅｖ Ｈｏｓｐｉｔａｌの動物施設にて、動物実験を行った。マウスを用いた総ての実験は、Ｄａｎｉｓｈ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｃｉｌにより審査および承認された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの毎日のケアおよび飼育は、動物施設の動物飼育者により行われた。治療的ワクチン接種試験のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＴａｃｏｎｉｃ社から購入した。
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｈｅｒｌｅｖ Ｈｏｓｐｉｔａｌの動物施設にて、動物実験を行った。マウスを用いた総ての実験は、Ｄａｎｉｓｈ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｃｉｌにより審査および承認された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの毎日のケアおよび飼育は、動物施設の動物飼育者により行われた。治療的ワクチン接種試験のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＴａｃｏｎｉｃ社から購入した。
【0117】
腫瘍の注射
ＬＬ２細胞（５×１０５）を１００μｌの無血清培地に再懸濁し、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍容積をデジタルノギスにより測定し、腫瘍試験のエンドポイントは、腫瘍が閾値サイズ８００ｍｍ３に達したとき、または腫瘍上に潰瘍が形成されたときとした。
ＬＬ２細胞（５×１０５）を１００μｌの無血清培地に再懸濁し、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍容積をデジタルノギスにより測定し、腫瘍試験のエンドポイントは、腫瘍が閾値サイズ８００ｍｍ３に達したとき、または腫瘍上に潰瘍が形成されたときとした。
【0118】
ペプチドワクチン接種およびマウスＥＬＩＳＰＯＴ
マウスＡｒｇ２ペプチド（Ｐ１－Ｐ６）を、ＰｅｐＳｃａｎまたはＳｃｈａｅｆｅｒにより合成し、報告された溶解度に応じて、それぞれ２ｍＭまたは１０ｍＭで超純水またはＤＭＳＯのいずれかに溶解した。溶解したペプチドは、その後、総容量１００μＬで投与される全ペプチド１００μｇの最適用量が得られるように、モンタニドアジュバント（５０μＬ／マウス）（Ｓｅｐｐｉｃ Ｉｎｃ．）で乳化した。乳化したペプチドのワクチン接種は、２７Ｇ針を用いて、１２～１６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの基部または尾部または側腹部への皮下注射により行った。対照マウスに、総容量１００μＬの水およびモンタニド乳化剤を与えた。腫瘍を接種したマウスに対する治療的ワクチン試験に関しては、ワクチン接種は、それぞれ尾部の側面および左側腹部に、腫瘍接種後０および７日目に行った。エピトープのスクリーニング － および検証実験のために、ワクチンの単一用量を、マウスの右側腹部に投与した。１週間後、マウスを屠殺し、脾臓を回収した。脾臓を７０μＭフィルターを介して分解し、Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて赤血球を溶解した。細胞を４回洗浄し、計数した後、ウェルあたり８×１０６個の細胞をマウスＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのためにセットアップした。
マウスＡｒｇ２ペプチド（Ｐ１－Ｐ６）を、ＰｅｐＳｃａｎまたはＳｃｈａｅｆｅｒにより合成し、報告された溶解度に応じて、それぞれ２ｍＭまたは１０ｍＭで超純水またはＤＭＳＯのいずれかに溶解した。溶解したペプチドは、その後、総容量１００μＬで投与される全ペプチド１００μｇの最適用量が得られるように、モンタニドアジュバント（５０μＬ／マウス）（Ｓｅｐｐｉｃ Ｉｎｃ．）で乳化した。乳化したペプチドのワクチン接種は、２７Ｇ針を用いて、１２～１６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの基部または尾部または側腹部への皮下注射により行った。対照マウスに、総容量１００μＬの水およびモンタニド乳化剤を与えた。腫瘍を接種したマウスに対する治療的ワクチン試験に関しては、ワクチン接種は、それぞれ尾部の側面および左側腹部に、腫瘍接種後０および７日目に行った。エピトープのスクリーニング － および検証実験のために、ワクチンの単一用量を、マウスの右側腹部に投与した。１週間後、マウスを屠殺し、脾臓を回収した。脾臓を７０μＭフィルターを介して分解し、Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて赤血球を溶解した。細胞を４回洗浄し、計数した後、ウェルあたり８×１０６個の細胞をマウスＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのためにセットアップした。
【0119】
ＰＤ－１遮断抗体による処理
抗マウスＰＤ－１（ＣＤ２７９）モノクローナル抗体を、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社から購入した（クローン：ＲＭＰ１－１４）。有効性試験のために、マウスに対し、２００μｌ ＰＢＳ中２５０μｇのＰＤ－１遮断抗体を腹膜内注射により投与した。マウスを、ＬＬ２接種後４日目から週３回抗ＰＤ－１で処理した。
抗マウスＰＤ－１（ＣＤ２７９）モノクローナル抗体を、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社から購入した（クローン：ＲＭＰ１－１４）。有効性試験のために、マウスに対し、２００μｌ ＰＢＳ中２５０μｇのＰＤ－１遮断抗体を腹膜内注射により投与した。マウスを、ＬＬ２接種後４日目から週３回抗ＰＤ－１で処理した。
【0120】
統計解析
ＥＬＩＳＰＯＴ応答は、Ｍｏｏｄｉｅら（参考文献）により記載の分布によらないリサンプリング（ＤＦＲ）法を用いて分析した。ＥＬＩＳＰＯＴ応答の統計解析を、Ｒスタジオを用いて行った。ＡＲＧ２－１およびＡ２Ｌ２に対する応答（特異的ＩＦＮγ分泌細胞）の差を、ウィルコクソンの符号順位ｔ検定（Ｐｒｉｓｍ ８を用いた）を使用して、有意水準を０．０５として比較した。対照とＡｒｇ２ワクチン接種群との間の平均腫瘍成長の差の統計解析を、Ｐｒｉｓｍ ８を用いた混合効果分析により行った。
ＥＬＩＳＰＯＴ応答は、Ｍｏｏｄｉｅら（参考文献）により記載の分布によらないリサンプリング（ＤＦＲ）法を用いて分析した。ＥＬＩＳＰＯＴ応答の統計解析を、Ｒスタジオを用いて行った。ＡＲＧ２－１およびＡ２Ｌ２に対する応答（特異的ＩＦＮγ分泌細胞）の差を、ウィルコクソンの符号順位ｔ検定（Ｐｒｉｓｍ ８を用いた）を使用して、有意水準を０．０５として比較した。対照とＡｒｇ２ワクチン接種群との間の平均腫瘍成長の差の統計解析を、Ｐｒｉｓｍ ８を用いた混合効果分析により行った。
【0121】
結果
実施例１および２は、ＡＲＧ２を発現する免疫細胞および癌細胞の両方が、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞により特異的に認識される、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける特異的Ｔ細胞に対する標的としてのＡＲＧ２を示している。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡＲＧ２特異的Ｔ細胞の潜在的な機能的効果を調べるため、実施例３では、さらに評価された関連するマウスＡｒｇ２ペプチドエピトープを同定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ペプチド－モンタニドエマルション中でのマウスの皮下ワクチン接種による免疫応答について選別した。群あたり３匹のマウスに対し、６個の候補ペプチドのそれぞれをワクチン接種し、７日後、マウスを屠殺し、脾細胞を単離し、ｅｘ ｖｉｖｏ ｍＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて分析した。Ｐ４をワクチン接種した３匹のマウスの全てにおいて、強い免疫応答が認められた（図１２を参照のこと。加えて、同じデータを図２０Ａにも示す）。このことは、群あたりより多くのマウスを用いた類似の実験において、その後確認された（図２０Ｂ）。
実施例１および２は、ＡＲＧ２を発現する免疫細胞および癌細胞の両方が、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞により特異的に認識される、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける特異的Ｔ細胞に対する標的としてのＡＲＧ２を示している。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡＲＧ２特異的Ｔ細胞の潜在的な機能的効果を調べるため、実施例３では、さらに評価された関連するマウスＡｒｇ２ペプチドエピトープを同定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ペプチド－モンタニドエマルション中でのマウスの皮下ワクチン接種による免疫応答について選別した。群あたり３匹のマウスに対し、６個の候補ペプチドのそれぞれをワクチン接種し、７日後、マウスを屠殺し、脾細胞を単離し、ｅｘ ｖｉｖｏ ｍＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて分析した。Ｐ４をワクチン接種した３匹のマウスの全てにおいて、強い免疫応答が認められた（図１２を参照のこと。加えて、同じデータを図２０Ａにも示す）。このことは、群あたりより多くのマウスを用いた類似の実験において、その後確認された（図２０Ｂ）。
【0122】
最も関連のある腫瘍モデルを同定するために、Ｃ５７ＢＬ／６起源の異なる移植腫瘍のパネルにおいてＡｒｇ２発現を評価した。本発明者らは、ルイス肺（ＬＬ２）腫瘍細胞により形成された腫瘍におけるＡｒｇ２の最も一貫した高い発現を見出した（図２０Ｃ）。ＬＬ２腫瘍細胞でのＣ５７ＢＬ／６マウスのチャレンジに次いで、２回のワクチン接種（腫瘍接種後０日目および７日目－図２Ｄにおける処理スケジュールを参照のこと）は、疑似ワクチン接種対照群（対照）と比較して、Ａｒｇ２ワクチン接種マウス（Ｐ４）において腫瘍成長の減少を引き起こした（図２０Ｅ）。腫瘍上に潰瘍が形成されたため、マウスを腫瘍接種後１２日目に屠殺した。Ａｒｇ２ワクチン接種が、抗ＰＤ１抗体の効果を誘導し得る様式でＴＭＥを修飾し得るかどうか調べるために、本発明者らは、ＬＬ２モデルにおいて、ｍＡＲＧ２（１８８－１９７）（Ｐ４と表される）に対するワクチン接種と抗ＰＤ１を組み合わせた。予想されたように、抗ＰＤ１抗体を用いた単独療法は、このモデルにおいて腫瘍成長に影響を及ぼさなかった。しかしながら、抗ＰＤ１とＡＲＧ２ワクチン接種との組合せは、相加効果を示した（図２０ＦおよびＧ）。腫瘍上に潰瘍が形成されたため、マウスを腫瘍接種後１２日目に屠殺した。
【0123】
実施例１～４の全体的な要約および考察
実施例は、ＡＲＧ２は特異的Ｔ細胞の標的であり、よって、特異的ＡＲＧ２特異的エフェクターＴ細胞は、ＡＲＧ２発現免疫抑制細胞を標的とする潜在的な新規の手段として利用できることを示している。第１に、実施例では、全ＡＲＧ２配列を網羅するペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより、癌患者および健常ドナーの両方に天然に存在する末梢ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞を同定した。興味深いことに、ＡＲＧ２は、末梢Ｔ細胞により頻繁に認識された複数のエピトープを含むことが発見された。ＡＲＧ２に対する頻繁なＴ細胞応答は、ＡＲＧ２の高い免疫原性を強調するものであり、ＡＲＧ２を発現する癌を有する患者、例えば、前立腺癌またはＡＭＬを有する患者におけるＡＲＧ２特異的免疫応答をブーストする可能性を支持するものである。さらに、健常人における強い免疫応答は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、免疫系の自然な一部であり、免疫ホメオスタシスにとって重要であり得ることを示唆している。さらに、ＡＲＧ２の見かけ上最も免疫原性の高い領域に由来するペプチドに対して反応した特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、増殖させた。結果は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、実際にＡＲＧ２発現骨髄性細胞を認識し、それらに対して反応することを示している。
実施例は、ＡＲＧ２は特異的Ｔ細胞の標的であり、よって、特異的ＡＲＧ２特異的エフェクターＴ細胞は、ＡＲＧ２発現免疫抑制細胞を標的とする潜在的な新規の手段として利用できることを示している。第１に、実施例では、全ＡＲＧ２配列を網羅するペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより、癌患者および健常ドナーの両方に天然に存在する末梢ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞を同定した。興味深いことに、ＡＲＧ２は、末梢Ｔ細胞により頻繁に認識された複数のエピトープを含むことが発見された。ＡＲＧ２に対する頻繁なＴ細胞応答は、ＡＲＧ２の高い免疫原性を強調するものであり、ＡＲＧ２を発現する癌を有する患者、例えば、前立腺癌またはＡＭＬを有する患者におけるＡＲＧ２特異的免疫応答をブーストする可能性を支持するものである。さらに、健常人における強い免疫応答は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、免疫系の自然な一部であり、免疫ホメオスタシスにとって重要であり得ることを示唆している。さらに、ＡＲＧ２の見かけ上最も免疫原性の高い領域に由来するペプチドに対して反応した特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、増殖させた。結果は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞は、実際にＡＲＧ２発現骨髄性細胞を認識し、それらに対して反応することを示している。
【0124】
一般に、腫瘍は現在、免疫浸潤に応じて、以下のカテゴリーに分けられる；（ｉ）まれな免疫浸潤物（いわゆる「冷たい」腫瘍において）；（ｉｉ）悪性細胞との接触から排除される免疫浸潤物（いわゆる「除外された」腫瘍において）；または（ｉｉｉ）強固な免疫抑制機序により抑制される大量の腫瘍浸潤物（いわゆる「熱い」腫瘍において）。重要な治療戦略は、「冷たい」および「除外された」腫瘍を「熱い」腫瘍に転換する臨床的組合せである。後者は一般に、免疫療法、特にチェックポイント遮断での疾患転帰の改善と関連しているからである。アルギナーゼの重要な特徴は、これらの腫瘍におけるアルギナーゼを発現する免疫抑制性の免疫細胞に起因する「除外された」腫瘍型におけるその発現である。ＡＲＧ１は、ＩＬ－１０およびＴＧＦ－βに加えて、ＩＬ－４およびＩＬ－１３などのＴｈ２サイトカインに応答して、Ｍ２様マクロファージにおいてアップレギュレートされることがよく説明されている。対照的に、ＡＲＧ２の調節は、非常に限定されて説明されているにすぎないが、興味深いことに、大量の非メチル化シトシングアニンモチーフ（ＣｐＧ）を含有するリポ多糖およびオリゴデオキシヌクレオチドなどのＴｏｌｌ様受容体リガンドは、マウスマクロファージにおけるＡＲＧ２発現を誘導することが示唆されている。
【0125】
ＩＬ１βおよびＴＮＦαが神経芽腫細胞においてＡＲＧ２を誘導したことが、さらに最近説明された。重要なことに、本試験において、本発明者らは、サイトカインの混合物、すなわちＩＬ４、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－αが、悪性骨髄性細胞においてＡＲＧ２を誘導することをさらに示している。したがって、ＡＲＧ２は、除外された腫瘍においてのみならず、より「中間の」～「熱い」腫瘍においても、存在する環境によって誘導されると考えられる。したがって、ＡＲＧ１またはＡＲＧ２が誘導される微小環境は異なるため、ＡＲＧ１およびＡＲＧ２が、異なる細胞により、および腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中の異なる腫瘍型において発現されることが認められていることは、意外なものではない。したがって、ＡＲＧ１は主にＭＤＳＣおよびＴＡＭにより発現されるが、ＡＲＧ２は、種々の固形腫瘍細胞、ＡＭＬ芽球およびＣＡＦにより発現されることが説明されている。したがって、ワクチン接種のためのＡＲＧ１およびＡＲＧ２の組合せは、ＴＭＥ中の異なる免疫抑制アルギナーゼ発現細胞を標的とするのに有益であり得、より多くの患者にとって利益となり得る。さらに、炎症を伝播する活性化Ｍ１マクロファージは、ＩＦＮγなどのＴｈ１サイトカインに応答して生じることが、よく説明されている。重要なことに、多くの間質細胞は、最終分化細胞ではなく、炎症促進性刺激が与えられた免疫担当細胞に戻り得る。例えば、ワクチン接種によるアルギナーゼ特異的Ｔ細胞の活性化は、腫瘍部位においてＴｈ１炎症を実際に引き起こすはずである。他の種類の抗制御性Ｔ細胞、例えば、ＩＤＯおよびＰＤ－Ｌ１特異的炎症促進性Ｔ細胞が存在することが知られており、Ｔｈ１炎症シグナル、例えば、ＩＦＮγは、このようなＩＤＯおよびＰＤ－Ｌ１特異的Ｔ細胞の自発的な増殖をもたらすことが報告されており、アルギナーゼとＩＤＯまたはＰＤＬ１ベースのワクチンとの潜在的な相乗作用が示唆されている。このシナリオにおいて、 ADDIN REFMGR.CITE ADDIN EN.CITE.DATA ＡＲＧ１／ＡＲＧ２ワクチン接種は、腫瘍部位においてＴｈ１炎症を誘導し得るか、あるいはアルギナーゼ発現細胞がリンパ球浸潤を防止する。次に、この効果は、ＩＤＯおよび／またはＰＤ－Ｌ１を誘導し、これらの標的に由来するエピトープを認識する抗Ｔｒｅｇによるさらなる標的化を可能にすると思われる。このため、異なる抗Ｔｒｅｇ標的抗原由来のエピトープの組合せは、ワクチン接種アプローチにおいて追加的（相加的）でありうる。同様に、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞を活性化するＡＲＧ２免疫調節ワクチンとチェックポイント遮断抗体との併用療法は、炎症性腫瘍においてのみ作用するチェックポイント遮断単独と比較して、療法に応答し得る患者の数を増やすはずである。したがって、アルギナーゼ発現細胞は、腫瘍部位におけるエフェクターリンパ球増殖を防止するため、癌を有する多くの患者において抗ＰＤ１療法の効果が欠如することの重要な理由となっている。本試験において、本発明者らは、ＡＲＧ２が、よく説明されているＰＤ－Ｌ１抵抗性腫瘍モデルルイス肺において実際に発現されることを示す。本発明者らは、ワクチン接種によるＡＲＧ２特異的Ｔ細胞の活性化は、ルイス肺細胞成長を阻害し、最も重要なことに、抗ＰＤ１と相乗的に機能することを示す。このため、免疫調節ＡＲＧ２ワクチン接種との組合せは、実際に、抵抗性ルイス肺細胞を、抗ＰＤ１療法に対して感受性にさせ得る。
【0126】
全体的に、実施例は、ＡＲＧ２特異的Ｔ細胞が、免疫系の自然な一部として存在し、癌における免疫抑制から離れるようにバランスを傾けるために容易に利用され得ることを示している。ＡＲＧ２に対する治療的ワクチン接種は、癌細胞に対する癌特異的免疫応答を呈すると思われる炎症性ＴＭＥの発生を促進するはずである。したがって、ＡＲＧ２ベースのワクチンは、さらなる免疫療法、特にチェックポイント阻害剤と相乗的に機能する可能性が高い。実施例において使用したヒトＡＲＧ２由来の最も免疫原性の高いペプチドは、微小環境のバランスを取り戻すのに重要であり得るＡＲＧ２特異的Ｔ細胞応答を刺激するのに有効であり、単一アプローチ療法または癌細胞を標的とすることのみを目的とした現在の癌ワクチンと比較して、チェックポイント遮断剤などのＴ細胞増強薬の効果を増大させるはずである。
【0127】
配列
開始位置および終了位置は、特に断りのない限り、全長ヒトアルギナーゼ２（配列番号５１）内の位置を示す。
開始位置および終了位置は、特に断りのない限り、全長ヒトアルギナーゼ２（配列番号５１）内の位置を示す。
【0128】
【表6】
【0129】
［１］（ｉ）配列番号５１の少なくとも２１、２２および２３位のアミノ酸を含む、または（ｉｉ）配列番号５１の１８０～２２９位から選択される、配列番号５１の少なくとも９個の連続したアミノ酸の配列を含むまたはそれからなる、ヒトアルギナーゼ２（配列番号５１）の免疫原性断片である、ポリペプチド。
［２］（ｉ）または（ｉｉ）に定義される配列番号５１の最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個の連続したアミノ酸を含むまたはそれらからなる、［１］に記載のポリペプチド。
［３］配列番号５９、５８、５７、５４、５５、５６、２、３、１９、２０、２１、６０または６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、［１］または［２］に記載のポリペプチド。
［４］９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０アミノ酸の最大長を有する、および／またはＣ末端アミノ酸が対応するアミドに置き換えられている、［１］～［３］のいずれかに記載のポリペプチド。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチドおよびアジュバントを含む、組成物。
［６］少なくとも１つの薬学上許容可能な希釈剤、担体または保存剤を含む、［５］に記載の組成物。
［７］前記アジュバントが、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、油／界面活性剤ベースのアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、イミダゾキニリン、およびモンタニドＩＳＡアジュバントからなる群から選択される、［５］または［６］に記載の組成物。
［８］対象における疾患または病態を治療または予防する方法であって、［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチドまたは［５］～［７］に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
［９］前記疾患または病態が、アルギナーゼ２の不適当なもしくは過剰な免疫抑制機能を少なくとも部分的に特徴とする、および／または前記疾患もしくは病態が癌である、［８］に記載の方法。
［１０］前記疾患または病態が癌であり、場合により、前記方法が、さらなる癌療法の同時投与または逐次投与をさらに含む、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］前記さらなる癌療法が、免疫系チェックポイント阻害剤、好ましくは、抗体である、［１０］に記載の方法。
［１２］前記抗体が抗ＰＤ１抗体である、［１１］に記載の方法。
［１３］前記癌が、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌、もしくは小腸癌であるか、または結腸直腸癌もしくは胃癌であるか、または黒色腫であるか、または白血病、好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であり、場合により、前記癌が、免疫系チェックポイント阻害剤を用いた治療に抵抗性である、［８］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］アルギナーゼ２特異的Ｔ細胞を刺激する方法であって、前記方法が、細胞を［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチドまたは［５］～［７］のいずれかに記載の組成物と接触させることを含み、場合により、前記細胞が、健常対象または癌患者から採取されたサンプル、場合により、腫瘍サンプル中に存在する、方法。
［１５］［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図17E】
【図17F】
【図17G】
【図17H】
【図17I】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図19E】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図20D】
【図20E】
【図20F】
【図20G】
【配列表】