特許 7611173 組換えＦＡＰ結合タンパク質及びそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-25

(45)【発行日】2025-01-09

(54)【発明の名称】組換えＦＡＰ結合タンパク質及びそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/435 20060101AFI20241226BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20241226BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20241226BHJP

   A61K 51/08 20060101ALI20241226BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241226BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241226BHJP

【ＦＩ】

C07K14/435 ZNA

A61K47/42

A61K48/00

A61K49/00

A61K51/08 200

A61P35/00

C12N15/12

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2021571937

(86)(22)【出願日】2020-06-03

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-08

(86)【国際出願番号】 EP2020065317

(87)【国際公開番号】W WO2020245173

(87)【国際公開日】2020-12-10

【審査請求日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】19178277.0

(32)【優先日】2019-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】515146556

【氏名又は名称】モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】フィードラー， ウルリケ

(72)【発明者】

【氏名】メッツ， クララ

(72)【発明者】

【氏名】ミュラー， ミーシャ ローラント

(72)【発明者】

【氏名】スネル， ダン

【審査官】團野 克也

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３６８３０２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／１４９４３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／０８３２０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０５４９７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／０６９６５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／０６９６５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／１９１５７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０３６２４５３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】ULRIKE FIEDLER; ET AL，ABSTRACT 4552: TUMOR-RESTRICTED IMMUNE MODULATION BY MULTISPECIFIC MOLECULES FROM THE DARPIN TOOLBOX，CANCER RESEARCH，2018年07月，VOL:78, NR:13，PAGE(S):1-3，http://dx.doi.org/10.1158/1538-7445.AM2018-4552

【文献】VICTOR LEVITSKY; ET AL，ABSTRACT B026: DEVELOPMENT OF TUMOR-TARGETED AGONISTIC IMMUNOMODULATORS USING THE DARPIN(R) TECHNOLOGY PLATFORM，CANCER IMMUNOLOGY RESEARCH JUL 2014，米国，2019年02月，VOL:7, NR:SUPPL. 2，PAGE(S):B026(1-5)，http://dx.doi.org/10.1158/2326-6074.CRICIMTEATIAACR18-B026

【文献】ALEXANDER LINK; ET AL，ABSTRACT 3752: PRECLINICAL PHARMACOLOGY OF MP0310: A 4-1BB/FAP BISPECIFIC DARPIN DRUG CANDIDATE PROMOTING TUMOR-RESTRICTED T-CELL COSTIMULATION，CANCER RESEARCH，米国，AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH (AACR)，2018年06月30日，VOL:78, NR:13,SUPPL. S，PAGE(S):3752(1-3)，http://dx.doi.org/10.1158/1538-7445.AM2018-3752

【文献】CHRISTIAN REICHEN; ET AL，ABSTRACT 3029: FAP-MEDIATED TUMOR ACCUMULATION OF A T-CELL AGONISTIC FAP/4-1BB DARPIN DRUG CANDIDATE ANALYZED BY SPECT/CT AND QUANTITATIVE BIODISTRIBUTION ，CANCER RESEARCH，米国，AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH (AACR)，2018年06月30日，VOL:78, NR:13,SUPPL.S，PAGE(S):3029(1-4)，http://dx.doi.org/10.1158/1538-7445.AM2018-3029

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

ＩＰＣ Ｃ１２Ｎ、Ｃ０７Ｋ

ＤＢ名 ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／

ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０

（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｓｅｑ

Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｇｅｎｅｓｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリン反復ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する結合特異性を有し、かつ前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え結合タンパク質。

【請求項2】

配列番号１～３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、欠損している、請求項１に記載の結合タンパク質。

【請求項3】

配列番号１～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、Ａによって置換されている、請求項１又は２に記載の結合タンパク質。

【請求項4】

前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項5】

配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが欠損している、請求項４に記載の結合タンパク質。

【請求項6】

配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、Ａによって置換されている、請求項４又は５に記載の結合タンパク質。

【請求項7】

前記アンキリン反復ドメインが、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項8】

配列番号３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが欠損している、請求項７に記載の結合タンパク質。

【請求項9】

前記アンキリン反復ドメインが、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で、ＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、かつ／又は前記アンキリン反復ドメインが、１０^－８Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、かつ／又は前記アンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害しない、請求項１～８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項10】

前記結合タンパク質が、生物学的活性分子を更に含み、前記生物学的活性分子が、血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、治療有効分子、前記結合タンパク質に結合された細胞を撮影するために有効な分子、又は患者のがんを診断するために有効な分子である、請求項１～９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードする核酸。

【請求項12】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合タンパク質又は請求項１１に記載の核酸、並びに、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物。

【請求項13】

生物学的活性分子を、哺乳動物のＦＡＰ発現細胞又は組織に局在化するための剤であって、請求項１０に記載の結合タンパク質を含む、剤。

【請求項14】

治療を必要とする患者の医学的状態を治療するための医薬であって、治療有効量の請求項１０に記載の結合タンパク質を含み、前記生物学的活性分子が、治療有効分子である、医薬。

【請求項15】

前記ＦＡＰ発現細胞又は組織が、腫瘍内に位置する、請求項１３に記載の剤。

【請求項16】

患者の腫瘍を撮像する及び／又はがんを診断するためのキットであって、請求項１０に記載の結合タンパク質を患者に投与する手段を含み、前記生物学的活性分子が、前記結合タンパク質によって結合した細胞又は組織を撮像するのに有効な分子である、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、欧州特許庁に２０１９年６月４日出願の欧州特許出願公開第１９１７８２７７号の利益及び優先権を主張する。欧州特許出願公開第１９１７８２７７号の内容は、全ての表、図、及び特許請求の範囲を含む、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

開示の分野
本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような結合タンパク質をコードする核酸、そのような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸又は医薬組成物の、腫瘍組織などのＦＡＰ発現組織中の生体分子若しくは生物活性化合物を局在化又は送達するための方法、並びにヒトを含む哺乳動物におけるがんなどの疾患を治療、診断、又は撮像するための方法における使用に関する。

【背景技術】

【0003】

セプラーゼ（Seprase）としても知られる線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）は、ＩＩ型内在性膜セリンペプチダーゼ（type II integral membrane serine peptidase）である。ＦＡＰは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶファミリーに属する（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２７７，１１２６－１１４４（２０１０））。これは、酵素の触媒ドメインが位置する、大きなＣ末端細胞外ドメインを有する２つのＮ－グリコシル化サブユニットを含有する１７０ｋＤａのホモ二量体である（Ｓｃａｎｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：５６５７－５６６１（１９９４）；Ｗｏｎｇａｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８５８（８）：１８７６－８２（２０１６））。ＦＡＰは、そのグリコシル化形態では、ポスト－プロリルジペプチジルペプチダーゼ及びゼラチナーゼ活性の両方を有する（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ２４，２７４－２８１（２００２））。ヒトＦＡＰのホモログは、マウス及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を含むいくつかの種において見出された。

【0004】

ＦＡＰは、肺、結腸直腸、膀胱、卵巣及び乳癌を含む、調べた上皮悪性腫瘍（原発性及び転移性）の９０％超の反応性間質線維芽細胞において、並びに骨及び軟組織肉腫の悪性間葉細胞において選択的に発現されるが、通常、正常な成体組織には存在しない（Ｂｒｅｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１１（２）：２５７－２６６（２０１２）；Ｇａｒｉｎ－Ｃｈｅｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７，７２３５－７２３９（１９９０）；Ｒｅｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３２７－３３３５（１９９３）；Ｒｅｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，３１１０－３１１４（１９８８））。ＦＡＰはまた、特定の悪性腫瘍細胞で発現される。

【0005】

正常組織における多くの一般的ながんにおけるその発現及びその制限された発現により、ＦＡＰは、様々ながんの撮像、診断、及び治療のための有望な抗原性標的と考えられている。ＦＡＰに対するモノクローナル抗体、ＦＡＰ酵素活性の小分子阻害剤、細胞傷害性化合物のＦＡＰ活性化プロドラッグ、及びＦＡＰ特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、臨床的利益のための腫瘍間質におけるＦＡＰの選択的発現を利用する様々なアプローチが考案されてきた。

【0006】

ＦＡＰに対する複数のモノクローナル抗体、例えば、シブロツズマブ（Sibrotuzumab）、ヒトＦＡＰに特異的に結合するＦ１９抗体のヒト化バージョン（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９，１６３９－１６４７（２００３））；Ｆ１９エピトープ特異性を有するヒトＦＡＰに対する更なるヒト化若しくは完全ヒト抗体（Ｍｅｒｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９２，２４０－２４８（２００１）；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６８，１７３０－１７３８（２００１））；及びＦ１９によって認識されたエピトープとは異なるエピトープを認識し、ヒト及びマウスＦＡＰタンパク質に対して交差反応性であるｓｃＦｖ ＭＯ３６（Ｂｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７，４６１－４６９（２００１）が開発されている。ＦＡＰに対する抗体のいくつかは、ＦＡＰの酵素活性を阻害する。例えば、ｓｃＦｖ抗体Ｅ３及びその誘導体は、ＦＡＰ酵素活性及び生物学的機能を有意に阻害した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１３ Ｆｅｂ；２７（２）：５８１－５８９）。腫瘍生物学におけるＦＡＰの役割は複雑であり、完全には理解されておらず、したがって、腫瘍生物学におけるＦＡＰ阻害の潜在的な効果も完全に理解されていない。

【0007】

特異的抗体融合分子は、更に開発されており、例えば、Ｂａｕｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７２：３９３０－３９３９（２００４））は、ＩｇＧ１ ＣＨ２／ＣＨ３ Ｆｃドメインを置換するヒト化抗ＦＡＰ抗体及びヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）からなる融合タンパク質の生成を報告した。更に、Ｂｒｕｎｋｅｒら（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１５（５）：９４６－５７（２０１６））は、腫瘍間質のがん関連線維芽細胞上のＦＡＰ及び腫瘍細胞上の死受容体ＤＲ５を同時に標的とする二重特異性抗体の操作を報告した。

【0008】

腫瘍撮像及びがん診断アプローチも記載されており、例えば、Ｒｕｇｅｒら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １８６：１－１０（２０１４））は、ＦＡＰに対して特異的な単鎖Ｆｖフラグメントを有する蛍光活性化可能なリポソームの生成を報告し、全身蛍光撮像によるＦＡＰ発現腫瘍細胞の蛍光診断撮像で使用するためのその可能性を評価した。更に、Ｈｕａら（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ６：１１１（２０１１））は、抗ＦＡＰ抗体によるＦＡＰに対する染色が、非浸潤性乳管癌（ductal carcinoma in situ（ＤＣＩＳ））の乳がんが微小浸潤をもたらしたかどうかを判定する際に有用であり得るかどうかを調べた。

【0009】

腫瘍間質におけるＦＡＰ発現はまた、局所活性化プロドラッグを開発しようと試みている。Ｂｒｅｎｎｅｎら（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１１（２）：２５７－２６６（２０１２））は、ＦＡＰの制限された発現及び独自の基質選択性を活用して、ＦＡＰ活性化プロドラッグを開発し、腫瘍間質内での細胞傷害性化合物の活性化を標的とするアプローチを議論した。

【0010】

まとめると、ＦＡＰに対する抗体は、がん治療、撮像、及び診断に有用であり得ることが示唆されている。最初の有望な結果にもかかわらず、ＦＡＰ特異的結合から恩恵を受けるがんの治療及び特性評価のための治療的、診断的、及び撮像的アプローチに対する必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【0011】

本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を提供する。加えて、本発明は、そのような結合タンパク質をコードする核酸、そのような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸又は医薬組成物の、腫瘍組織などのＦＡＰ発現細胞若しくは組織に生物学的活性分子を局在化又は送達するための方法、並びにヒトを含む哺乳動物におけるがんなどの疾患を治療、診断、又は撮像するための方法における使用を提供する。

【0012】

一態様では、本発明は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含むそのような組換え結合タンパク質であって、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１～３５及び１４４～１５３のアンキリン反復ドメインのうちのいずれか１つと少なくとも７５％から最大１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、このアンキリン反復ドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０のこのアンキリン反復ドメインの最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている、組換え結合タンパク質を提供する。一例として、特定の一実施形態では、本発明のＦＡＰ特異的組換え結合タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。

【0013】

一態様では、本発明は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含むそのような組換え結合タンパク質であって、このアンキリン反復ドメインが、配列番号４８～１３４のアンキリン反復モジュールのいずれか１つと少なくとも８０％及び最大１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質を提供する。一例として、特定の一実施形態では、本発明のＦＡＰ特異的組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、配列番号９４～９６から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む。特定の一実施形態では、本発明のＦＡＰ特異的組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、配列番号９４のアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュール、配列番号９５のアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュール、及び配列番号９６のアミノ酸配列を有するアンキリン反復モジュールを含む。

【0014】

別の態様では、本発明は、そのようなＦＡＰ特異的組換え結合タンパク質を提供し、結合タンパク質は、生物学的活性分子を更に含む。生物学的活性分子は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、毒素、ポリマー、及び核酸を含む、異なる構造及び機能的クラスの分子から選択され得る。本発明の一態様では、生物学的活性分子は、ＦＡＰ特異的組換え結合タンパク質に共有結合している。共有結合は、融合タンパク質をもたらす、ＦＡＰ特異的結合タンパク質と生物学的活性ペプチド又はポリペプチドとの間のペプチド結合であってもよい。あるいは、生物学的活性分子は、ＦＡＰ特異的結合タンパク質と共有結合的にコンジュゲートしてもよい。一例として、特定の一実施形態では、本発明のＦＡＰ特異的組換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する別のアンキリン反復ドメインに融合した、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。特定の実施形態では、そのような融合タンパク質は、配列番号４０～４２によって提供される。特定の一実施形態では、本発明のＦＡＰ特異的組換え結合タンパク質は、例えば、腫瘍関連抗原、免疫阻害性分子、又は免疫刺激性分子などのがん生物学に関連する標的に対する結合特異性を有する別のポリペプチドに融合した、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。別の実施形態では、本発明のＦＡＰ特異的組換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対する結合特異性を有する別のアンキリン反復ドメインに融合し、例えば、腫瘍関連抗原、免疫阻害性分子、又は免疫刺激性分子などのがん生物学に関連する標的に対する結合特異性を有する別のポリペプチドにも融合した、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。

【0015】

別の態様では、本発明は、本発明のＦＡＰ特異的結合タンパク質をコードする核酸、並びに本発明のＦＡＰ特異的結合タンパク質又は核酸と、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0016】

別の態様では、本発明は、ヒトを含む哺乳動物のＦＡＰ発現組織内の生物学的活性分子を局在化、蓄積及び／又は活性化する方法であって、生物学的活性分子を含む本発明のＦＡＰ特異的結合タンパク質を、この哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。特定の一実施形態では、そのような方法は、生物学的活性分子を含むＦＡＰ特異的結合タンパク質を含み、加えて、結合タンパク質の血清半減期を延長する分子に共有結合されるか、又はそれを含む、ＦＡＰ特異的結合タンパク質をこの哺乳動物に投与することを含む。そのような半減期延長分子は、当技術分野において周知であり、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、抗体のＦｃ部分、及びその他が挙げられる。本発明の特定の一実施形態では、結合タンパク質の血清半減期を延長するそのような分子は、血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。特定の一実施形態では、そのような方法は、ＦＡＰ特異的結合タンパク質を、ＦＡＰ発現腫瘍を有するヒト患者を含む哺乳動物に投与し、その結果、ＦＡＰ発現腫瘍組織内の生物学的活性分子の局在化、蓄積及び／又は活性化をもたらすことを含む。特定の一実施形態では、そのようなＦＡＰ特異的結合タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸配列及び配列番号３８のアミノ酸配列、若しくは同等の標的特異性を有する配列番号３４及び／又は配列番号３８の配列変異体のアミノ酸配列を含む。

【0017】

別の態様では、本発明は、ヒト患者を含む哺乳動物における医学的状態を治療するための方法であって、生物学的活性分子に共有結合した又は生物学的活性分子を含む本発明のＦＡＰ特異的結合タンパク質をこの哺乳動物に投与することを含み、生物学的活性分子が治療有効分子である、方法を提供する。特定の一実施形態では、医学的状態はがんであり、がん又は腫瘍組織はＦＡＰを発現し、治療有効分子は抗がん剤である。特定の一実施形態では、治療有効分子は、ＦＡＰ特異的結合タンパク質が、腫瘍間質のＦＡＰ発現線維芽細胞などの細胞表面上で発現されるＦＡＰに結合するときにのみ活性化される。一実施形態では、このがんは、大腸直腸がん、非小細胞肺がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、胃がん、肺がん、侵襲性膀胱がん、膵臓がん、転移性脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、黒色腫、乳腺癌、肺腺癌、子宮頸部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺がん、骨肉腫、又は軟組織肉腫、及びＦＡＰを発現している良性腫瘍から選択される。一実施形態では、そのようながんは、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、卵巣癌及び乳癌、並びに骨及び軟組織肉腫を含む上皮悪性腫瘍（原発性及び転移生）から選択される。

【0018】

本発明は、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を含むキットを更に提供する。本発明は、本発明の組換え結合タンパク質を産生するための方法であって、（ｉ）この組換え結合タンパク質を細菌中で発現させる工程と、（ｉｉ）クロマトグラフィーを使用してこの組換え結合タンパク質を精製する工程と、を含む、方法を更に提供する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】ヒトＦＡＰに対する結合特異性を有する選択されたアンキリン反復タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍは、タンパク質サイズマーカーに相当する。

【図1B】ヒトＦＡＰに対する結合特異性を有する別の選択されたアンキリン反復タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍは、タンパク質サイズマーカーに相当する。

【図2】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４によって例示される、ヒトＦＡＰに対するアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。様々な濃度（０．４、１．１、３．３、及び１０ｎＭ）の精製アンキリン反復タンパク質を、固定化ヒトＦＡＰを有するＧＬＣチップにオンレート及びオフレート測定にて適用した。得られたＳＰＲトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質－ＦＡＰ相互作用を決定した。ＲＵ、共鳴単位；ｓ、時間（秒）。

【図3】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３３により例示されるようなＦＡＰ＋細胞（ＷＩ３８細胞）へのＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の結合。濃度依存性結合曲線は、決定された蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）に関して示されている。

【図4A】ＦＡＰ特異的ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５のＦＡＰ＋細胞（ＷＩ３８細胞）への結合。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５の濃度依存性結合曲線は、ＭＦＩの計算された倍率増加に関して示される。

【図4B】ＦＡＰ特異的ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５のＣＨＯ－ｗｔ細胞及びＣＨＯ－ＦＡＰ１．９細胞への結合。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５の濃度依存性結合曲線は、ＭＦＩの計算された倍率増加に関して示される。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５は、細胞表面上でＦＡＰを発現するＣＨＯ－ＦＡＰ１．９細胞にのみに結合する。

【図5A】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３６によって例示される、ヒトＦＡＰに対するアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。様々な濃度（３．１３、６．２５、１２．５、及び２５ｎＭ）のアンキリン反復タンパク質を、固定化ヒトＦＡＰを有するＧＬＣチップにオンレート及びオフレート測定にて適用した。得られたＳＰＲトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質－ＦＡＰ相互作用を決定した。ＲＵ、共鳴単位；ｓ、時間（秒）。

【図5B】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３６によって例示されるカニクイザルＦＡＰ（ｃＦＡＰ）へのアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。様々な濃度（３．１３、６．２５、１２．５、及び２５ｎＭ）のアンキリン反復タンパク質を、固定化カニクイザルＦＡＰを有するＧＬＣチップにオンレート及びオフレート測定にて適用した。得られたＳＰＲトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質－ＦＡＰ相互作用を決定した。ＲＵ、共鳴単位；ｓ、時間（秒）。

【図6】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３３により例示されるようなカニクイザルＦＡＰ^＋ＣＨＯ細胞へのＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の結合。濃度依存性結合曲線は、決定された蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）に関して示されている。

【図7A】ＦＡＰ特異的ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１のＵ８７ＭＧ細胞への結合。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１の濃度依存性結合曲線は、決定された蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）に関して示されている。

【図7B】ＦＡＰ特異的ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１のＷＩ３８細胞への結合。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１の濃度依存性結合曲線は、決定された蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）に関して示されている。

【図8】マウスの尾静脈への単回静脈内ボーラス注射後の、マウスの生物学的活性分子に融合されたＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４２）の時間の関数としての血清濃度。

【図9】注射から４８時間後にＦＡＰ陽性マウス腫瘍モデルで評価し、測定された放射能の器官／血液比として決定される、両方ともＴｃ９９^ｍで標識されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１及び対照化合物ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４３の生体分布。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本明細書に開示及び例示されるように、本開示は、ＦＡＰを特異的に標的とするアンキリン反復タンパク質を提供する。設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリ（国際公開第２００２／０２０５６５号、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，５７５－５８２，２００４；Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３，６９５－７０１，２００８）は、高い親和性でそれらの標的に結合する標的特異的に設計されたアンキリン反復ドメインの選択に使用することができる。そのような標的特異的に設計されたアンキリン反復ドメインは、ひいては疾患の治療のための組換え結合タンパク質の有益な成分として使用することができる。設計されたアンキリン反復タンパク質は、モノクローナル抗体の限界を克服する可能性を有する結合分子のクラスであり、したがって新規な治療的アプローチを可能にする。そのようなアンキリン反復タンパク質は、単一の設計されたアンキリン反復ドメインを含んでもよく、又は２つ以上の設計された、同一又は異なる標的特異性を有するアンキリン反復ドメインの組み合わせを含んでもよい（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３，６９５－７０１，２００８；米国特許第９，４５８，２１１号）。単一の設計されたアンキリン反復ドメインのみを含むアンキリン反復タンパク質は、高い親和性及び特異性で所与の標的タンパク質に結合するように選択され得る小タンパク質（１４ｋＤａ）である。これらの特性、及び１つのタンパク質中で２つ以上の設計されたアンキリン反復ドメインを組み合わせる可能性は、設計されたアンキリン反復タンパク質を理想的なアゴニスト、アンタゴニスト及び／又は阻害薬候補とする。更に、そのようなアンキリン反復タンパク質は、様々なエフェクター機能、例えば細胞傷害性剤又は半減期延長剤を担持し、完全に新しい薬物フォーマットを可能にするように操作することができる。まとめると、設計されたアンキリン反復タンパク質は、既存の抗体薬物を超える可能性を有するタンパク質治療薬の次世代の例である。

【0021】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって所有される商標である。

【0022】

一態様では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、このアンキリン反復ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する結合特異性を有し、このアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号４８～１３４、及び（２）配列番号４８～１３４のいずれかにおいて、最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質に関する。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４８～１３４、及び（２）配列番号４８～１３４のいずれかにおいて最大３個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４８～１３４、及び（２）配列番号４８～１３４のいずれかにおいて最大２個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４８～１３４、及び（２）配列番号４８～１３４のいずれかにおいて最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この９、８、７、６、５、４、３、２個、又は１個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置（framework positions）で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、この９、８、７、６、５、４、３、２個、又は１個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号４８～１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0023】

一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４～９８、１１１～１１３及び１３２～１３４、並びに（２）配列番号９４～９８、１１１～１１３及び１３２～１３４のいずれかにおいて、最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４～９８、１１１～１１３及び１３２～１３４、並びに（２）配列番号９４～９８、１１１～１１３及び１３２～１３４のいずれかにおいて、最大３個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４～９８、１１１～１１３及び１３２～１３４、並びに（２）配列番号９４～９８、１１１～１１３及び１３２～１３４のいずれかにおいて、最大２個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４～９８、１１１～１１３及び１３２～１３４、並びに（２）配列番号９４～９８、１１１～１１３及び１３２～１３４のいずれかにおいて、最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この９、８、７、６、５、４、３、２個、又は１個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、この９、８、７、６、５、４、３、２個、又は１個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号９４～９８、１１１～１１３及び１３２～１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0024】

一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号９４のアミノ酸配列、又は配列番号９４において１つ又は２つのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号９５のアミノ酸配列、又は配列番号９５において１つ又は２つのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号９６のアミノ酸配列、又は配列番号９６において１つ又は２つのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号９７のアミノ酸配列、又は配列番号９７において１つ又は２つのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号９８のアミノ酸配列、又は配列番号９８において１つ又は２つのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号９４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。

【0025】

一実施形態では、本明細書に記載され言及されるようなこのアンキリン反復モジュールのこのアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。フレームワーク位置での置換のそのような実施形態は、そのような置換が明示的に記載されているかどうかにかかわらず、全ての実施形態に適用されるものとする。一実施形態では、本明細書に記載され言及されるようなこのアンキリン反復モジュールのこのアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。ランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる置換のそのような実施形態は、そのような置換が明示的に記載されているかどうかにかかわらず、全ての実施形態に適用されるものとする。

【0026】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、この第１のアンキリン反復モジュールは、このアンキリン反復ドメイン内のこの第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。

【0027】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュール及び第３のアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、この第１のアンキリン反復モジュールは、このアンキリン反復ドメイン内のこの第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、この第２のアンキリン反復モジュールは、このアンキリン反復ドメイン内のこの第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。

【0028】

一実施形態では、この第１、この第２及び、存在する場合、この第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号４８～１３４、及び（２）配列番号４８～１３４のいずれかにおいて、最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この第１、この第２及び、存在する場合、この第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４～９８、１１１～１１３及び１３２～１３４、並びに（２）配列番号９４～９８、１１１～１１３及び１３２～１３４のいずれかにおいて、最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0029】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュール及び第３のアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４、及び（２）配列番号９４において、最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９５、及び（２）配列番号９５の最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９６、及び（２）配列番号９６の最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この９、８、７、６、５、４、３、２個、又は１個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、この９、８、７、６、５、４、３、２個、又は１個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。

【0030】

一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４、及び（２）配列番号９４において、最大６個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９５、及び（２）配列番号９５の最大６個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９６、及び（２）配列番号９６の最大６個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この６個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、この６個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。

【0031】

一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４、及び（２）配列番号９４において、最大５個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９５、及び（２）配列番号９５の最大５個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９６、及び（２）配列番号９６の最大５個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この５個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、この５個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。

【0032】

一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４、及び（２）配列番号９４において、最大４個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９５、及び（２）配列番号９５の最大４個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９６、及び（２）配列番号９６の最大４個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この４個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、この４個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。

【0033】

一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４、及び（２）配列番号９４において、最大３個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９５、及び（２）配列番号９５の最大３個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９６、及び（２）配列番号９６の最大３個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この３個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、この３個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。

【0034】

一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４、及び（２）配列番号９４において、最大２個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９５、及び（２）配列番号９５の最大２個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９６、及び（２）配列番号９６の最大２個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この２個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、この２個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。

【0035】

一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９４、及び（２）配列番号９４において１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９５、及び（２）配列番号９５の１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９６、及び（２）配列番号９６の１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、このアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。

【0036】

一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号９４のアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号９５のアミノ酸配列を含み、この第３のアンキリン反復モジュールは、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。

【0037】

一実施形態では、この第１のアンキリン反復モジュールは、このアンキリン反復ドメイン内のこの第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、この第２のアンキリン反復モジュールは、このアンキリン反復ドメイン内のこの第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復モジュールは、第１のアンキリン反復モジュールであり、（１）配列番号９４、及び（２）配列番号９４において最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、このアンキリン反復ドメインは、（１）配列番号９５、及び（２）配列番号９５の最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のアンキリン反復モジュールを更に含み、このアンキリン反復ドメインは、（１）配列番号９６、及び（２）配列番号９６の最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第３のアンキリン反復モジュールを更に含み、この第１のアンキリン反復モジュールが、このアンキリン反復ドメイン内のこの第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、この第２のアンキリン反復モジュールが、このアンキリン反復ドメイン内のこの第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。一実施形態では、この最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、この最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。更に、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、第１、第２、及び第３のアンキリン反復モジュールを含み、この第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号９４のアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号９５のアミノ酸配列を含み、この第３のアンキリン反復モジュールは、配列番号９６のアミノ酸配列を含み、この第１のアンキリン反復モジュールが、このアンキリン反復ドメイン内のこの第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、この第２のアンキリン反復モジュールが、このアンキリン反復ドメイン内のこの第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。

【0038】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９７、及び（２）配列番号９７において、最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９８、及び（２）配列番号９８の最大９個、又は最大８個、又は最大７個、又は最大６個、又は最大５個、又は最大４個、又は最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９７、及び（２）配列番号９７において、最大６個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９８、及び（２）配列番号９８の最大６個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９７、及び（２）配列番号９７において、最大５個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９８、及び（２）配列番号９８の最大５個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９７、及び（２）配列番号９７において、最大４個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９８、及び（２）配列番号９８の最大４個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９７、及び（２）配列番号９７において、最大３個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９８、及び（２）配列番号９８の最大３個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９７、及び（２）配列番号９７において、最大２個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９８、及び（２）配列番号９８の最大２個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９７、及び（２）配列番号９７において、１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９８、及び（２）配列番号９８の１個のアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、このアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、この第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号９７のアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。

【0039】

一実施形態では、この第１のアンキリン反復モジュールは、このアンキリン反復ドメイン内のこの第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、第１及び第２のアンキリン反復モジュールを含み、この第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９７、及び（２）配列番号９７において、最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸と置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号９８、及び（２）配列番号９８の最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸が、別のアミノ酸と置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この第１のアンキリン反復モジュールが、このアンキリン反復ドメイン内のこの第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。一実施形態では、この最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。一実施形態では、この最大３個、又は最大２個、又は最大１個のアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置で起こる。更に、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、第１及び第２のアンキリン反復モジュールを含み、この第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号９７のアミノ酸配列を含み、この第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号９８のアミノ酸配列を含み、この第１のアンキリン反復モジュールが、このアンキリン反復ドメイン内のこの第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。

【0040】

一実施形態では、上記のこのアンキリン反復モジュールにおけるこのアミノ酸置換の全ては、このアンキリン反復モジュールのフレームワーク位置で、かつ位置３、４、６、１４及び１５以外のランダム化位置で起こり、典型的には、モジュールの全体構造は、置換によって影響を受けない。

【0041】

別の態様では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、このアンキリン反復ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する結合特異性を有し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている、組換え結合タンパク質に関する。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0042】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、３５及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、３５及び１４４～１５３から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0043】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、及び３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、及び３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、及び３５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、及び３５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、及び３５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、及び３５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、及び３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、及び３５から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、３３、３４、及び３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0044】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態ではこの組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0045】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１９の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１９の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、配列番号１９の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１９の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0046】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号２６の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号２６と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。

【0047】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３３と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３３と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３３と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３３と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。

【0048】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損している。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。

【0049】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損している。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３５と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３５と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３５と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。

【0050】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメイン中の潜在的な相互作用残基が、配列番号１～３５のアンキリン反復ドメインのいずれか１つにおける対応する位置と同一である。

【0051】

一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意にＡによって置換されている。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意にＡによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１４４～１５３から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0052】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満、又は１０^－８Ｍ未満、又は１０^－９Ｍ未満、又は５×１０^－１０Ｍ未満、又は３×１０^－１０Ｍ未満、又は２×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で、ＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合する。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合する。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、１０^－８Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合する。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、５×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合する。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、２×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合する。

【0053】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0054】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－８Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１～９、１１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～９、１１～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１～９、１１～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～９、１１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～９、１１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～９、１１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～９、１１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～９、１１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0055】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号５～９、１１～２１、２５～２９、３１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５～９、１１～２１、２５～２９、３１～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号５～９、１１～２１、２５～２９、３１～３３、及び１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号５～９、１１～２１、２５～２９、３１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号５～９、１１～２１、２５～２９、３１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号５～９、１１～２１、２５～２９、３１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号５～９、１１～２１、２５～２９、３１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号５～９、１１～２１、２５～２９、３１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0056】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、５×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号６、８、９、１１～２０、２５～２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６、８、９、１１～２０、２５～２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号６、８、９、１１～２０、２５～２９、３１、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号６、８、９、１１～２０、２５～２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号６、８、９、１１～２０、２５～２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号６、８、９、１１～２０、２５～２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号６、８、９、１１～２０、２５～２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号６、８、９、１１～２０、２５～２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0057】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0058】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、２９、３１及び３３～３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0059】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0060】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0061】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。

【0062】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１９の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１９の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。

【0063】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損している。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。

【0064】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意にＡによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意にＡによって置換されている。

【0065】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、２×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、３１及び３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、３１及び３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、及び３１の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、３１及び３４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、３１及び３４のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、３１及び３４のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、３１及び３４のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号８、９、１１～２０、２６、２８、３１及び３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0066】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、２×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0067】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるＦＡＰに対する結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（Ｋ_Ｄ）の典型的かつ好ましい決定は、実施例２に記載されている。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質のＦＡＰに対するこの結合特異性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質のＦＡＰに対するこの結合特異性は、実施例２に記載されるように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。

【0068】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満、又は１０^－８Ｍ未満、又は約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満、又は約５×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満、又は約３×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満、又は約２×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０で、ヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、１０^－８Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、約５×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、約３×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、約２×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。

【0069】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－７Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0070】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－８Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0071】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、３２～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、３２～３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、３２～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、３２～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、３２～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、３２～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、３２～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、３２～３５及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0072】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、及び３２～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、及び３２～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、及び３２～３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、及び３２～３５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、及び３２～３５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、及び３２～３５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、及び３２～３５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号４、５、９～１５、１８、１９、２６～３０、及び３２～３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0073】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0074】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0075】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損している。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。

【0076】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１４４～１５３のアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0077】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約５×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号９～１１、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９～１１、１３～１５、１８、１９、２６及び３３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号９～１１、１３～１５、１８、１９、２６及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号９～１１、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号９～１１、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号９～１１、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号９～１１、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号９～１１、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0078】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約５×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。

【0079】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約５×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１９の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１９の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。

【0080】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約５×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約５×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１４４～１５３から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0081】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約３×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号９、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９、１３～１５、１８、１９、２６及び３３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号９、１３～１５、１８、１９、２６及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号９、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号９、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号９、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号９、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号９、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0082】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約３×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。

【0083】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、約２×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、２６及び３３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、２６及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、２６及び３３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0084】

本発明のアンキリン反復ドメイン及び組換え結合タンパク質の、それぞれ、ヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞への典型的かつ好ましい決定並びにＥＣ_５０の決定は、実施例３に記載されている。したがって、一実施形態では、本発明のアンキリン反復ドメイン及び組換え結合タンパク質のヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞へのこの結合は、実施例３に記載されるように決定される。一実施形態では、本発明のアンキリン反復ドメイン及び組換え結合タンパク質のヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞へのこの結合は、実施例３に記載されるようにＦＡＣＳ分析によって決定される。

【0085】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインは、１０^－７Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。

【0086】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、１０^－７Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0087】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、１０^－８Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。

【0088】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、１０^－８Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0089】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインは、１０^－８Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインは、１０^－８Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。

【0090】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－８Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、１０^－８Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１～９、１１～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～９、１１～３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１～９、１１～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0091】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、１０^－８Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。

【0092】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、１０^－８Ｍ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号５～９、１１～２１、２５～２９、３１～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５～９、１１～２１、２５～２９、３１～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号５～９、１１～２１、２５～２９、３１～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0093】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。

【0094】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、１０^－９Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号５、９、１１～１５、１８、１９、２６～２９、３２～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５、９、１１～１５、１８、１９、２６～２９、３２～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号５、９、１１～１５、１８、１９、２６～２９、３２～３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0095】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、５×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。

【0096】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、５×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号５、９、１１～１５、１８、１９、２６～２９、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５、９、１１～１５、１８、１９、２６～２９、３３～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号５、９、１１～１５、１８、１９、２６～２９、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0097】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。

【0098】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号９、１１～１５、１８、１９、２６、２８、２９、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９、１１～１５、１８、１９、２６、２８、２９、３３～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号９、１１～１５、１８、１９、２６、２８、２９、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0099】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号９、１１～１５、１８、１９、２６、２８、２９、及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９、１１～１５、１８、１９、２６、２８、２９、及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号９、１１～１５、１８、１９、２６、２８、２９、及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0100】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0101】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８、１９、２６及び３３～３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0102】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。

【0103】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１９の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１９の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。

【0104】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損している。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。

【0105】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインは、配列番号１４４～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１４４～１５３から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0106】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約３×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。

【0107】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約３×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号９、１３～１５、１８、１９、２６及び３３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９、１３～１５、１８、１９、２６及び３３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号９、１３～１５、１８、１９、２６及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0108】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、２×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約３×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合する。

【0109】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、２×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約３×１０^－１０Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号９、１４、１８及び２６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９、１４、１８及び２６の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号９、１４、１８及び２６の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0110】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を、２５％を超えて、又は２０％を超えて、又は１５％を超えて、又は１０％を超えて、又は９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％を超えて阻害しない。したがって、一実施形態では、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへのこの結合は、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害しない。別の実施形態では、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへのこの結合は、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２０％を超えて阻害せず、更なる実施形態では、ＦＡＰに対するこのアンキリン反復ドメインのこの結合は、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を１５％を超えて阻害しない。一実施形態では、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへのこの結合は、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を１０％を超えて阻害しない。

【0111】

本発明の組換え結合タンパク質のＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を阻害するかどうかを判定する典型的かつ好ましい方法が、実施例６に記載されている。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質によるＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性の阻害は、実施例６に記載されるように決定される。

【0112】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0113】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0114】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２０％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0115】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を１５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0116】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0117】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２０％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0118】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損している。

【0119】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２０％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損している。

【0120】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0121】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２０％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0122】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0123】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0124】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0125】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損している。

【0126】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、３３～３５、及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0127】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0128】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0129】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインが、配列番号３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損している。

【0130】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、３３～３５及び１４４～１５３のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、３３～３５及び１４４～１５３の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、３３、１４４、１４５及び１４８～１５０の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0131】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８、１９、２６、及び３３～３５の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８、１９、２６、及び３３の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0132】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0133】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２０％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１８の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１８の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0134】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号１９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１９の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損しており、配列番号１９の最後から２番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、任意に、Ａによって置換されている。

【0135】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２５％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損している。

【0136】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、このアンキリン反復ドメインが、３×１０^－１０Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）でＰＢＳ中でヒトＦＡＰに結合し、このアンキリン反復ドメインが、約１０^－９Ｍ若しくはそれ未満のＥＣ_５０でヒトＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に結合し、このアンキリン反復ドメインのＦＡＰへの結合が、ＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を２０％を超えて阻害せず、このアンキリン反復ドメインが、配列番号３４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３４の位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、任意に欠損している。

【0137】

一実施形態では、上記のアンキリン反復ドメインにおける配列変動性のいずれかは、Ｎ末端キャッピングモジュール、Ｃ末端キャッピングモジュール、及び／又はアンキリン反復モジュールにおいて起こり、アンキリン反復モジュールにおける任意の配列変動性が、フレームワーク位置、及びアンキリン反復モジュールのランダム化位置３、４、６、１４及び１５以外の位置でのみ起こり、典型的には、アンキリン反復モジュール及びアンキリン反復ドメインの全体構造は、配列変動性によって影響を受けない。

【0138】

一実施形態では、この組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、この結合タンパク質は、生物学的活性分子を更に含む。

【0139】

一実施形態では、また一例として、この生物学的活性分子は、本発明の組換えタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させることができる。一実施形態では、この生物学的活性分子は、血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。一実施形態では、この生物学的活性分子は、血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、血清アルブミンに対する結合特異性を有するこのアンキリン反復ドメインは、配列番号３８、若しくは配列番号３８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる。一実施形態では、この生物学的活性分子は、血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、血清アルブミンに対する結合特異性を有するこのアンキリン反復ドメインは、配列番号３８からなる。一実施形態では、配列番号３８からなる血清アルブミンに対する結合特異性を有するこのアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカーでＦＡＰに対する結合特異性を有するこのアンキリン反復ドメインに連結され、このペプチドリンカーが、好ましくはプロリン－スレオニンに富むペプチドリンカーであり、更に好ましくは配列番号３９のペプチドリンカーである。

【0140】

一実施形態では、この組換えタンパク質は、（１）配列番号４０～４２及び（２）配列番号４０～４２のいずれかで最大９個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この組換えタンパク質は、（１）配列番号４０及び（２）配列番号４０で最大９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この組換えタンパク質は、（１）配列番号４１及び（２）配列番号４１で最大９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が別のアミノ酸と置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この組換えタンパク質は、（１）配列番号４２及び（２）配列番号４２で最大９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0141】

一実施形態では、この生物学的活性分子は、血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、血清アルブミンに対する結合特異性を有するこのアンキリン反復ドメインは、（１）配列番号１５９及び（２）配列番号１５９の最大９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この生物学的活性分子は、血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、血清アルブミンに対する結合特異性を有するこのアンキリン反復ドメインは、（１）配列番号１６０及び（２）配列番号１６０の最大９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0142】

一実施形態では、この組換えタンパク質は、（１）配列番号３４及び（２）配列番号３４の最大９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択される第１のアミノ酸配列を含み、更に（１）配列番号１５９及び（２）配列番号１５９の最大９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択される第２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、この第１のアミノ酸配列は配列番号３４であり、この第２のアミノ酸配列は配列番号１５９である。一実施形態では、この第１のアミノ酸配列とこの第２のアミノ酸配列とは、ペプチドリンカーを用いて連結されている。一実施形態では、このペプチドリンカーは、プロリン－スレオニンに富むペプチドリンカー、好ましくは配列番号３９のペプチドリンカーである。

【0143】

重要なことに、生物学的活性分子のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインへの融合は、細胞表面上で発現されたＦＡＰを特異的に認識し、かつＦＡＰに結合する能力に影響を与えないことが、更に示されている（実施例５）。実施例５に示されるように、ＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインを含む融合タンパク質は、本発明の組換えタンパク質に存在する更なる生物学的活性分子に関係なく、細胞の表面に発現されるＦＡＰに効率的に結合するそれらの能力を保持する。

【0144】

更に、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む本発明の組換えタンパク質は、生物学的活性分子を、ＦＡＰを発現する腫瘍組織に優先的にｉｎ ｖｉｖｏ局在化又は送達又は標的化することができることが示されている（実施例５）。これは、本発明の放射性標識組換えタンパク質を使用する生体内分布分析によって、ＦＡＰ陽性マウス腫瘍モデルにおいて評価されている。注射後４８時間の生体内分布分析は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインなどの生物学的活性分子を更に含む本発明の組換えタンパク質が、この生物学的活性分子及び組換えタンパク質をＦＡＰ発現腫瘍組織に局在化又は送達又は標的化することができるのみならず、更にＦＡＰ発現腫瘍組織におけるこの生物学的活性分子を蓄積し、その保持を延長することができることを更に示している。したがって、生物学的活性分子若しくは治療的活性分子を含む本発明の組換えタンパク質は、この本発明の組換えタンパク質を、ＦＡＰ発現腫瘍において局在化、送達、標的化、蓄積、活性化及び／又は保持しながら、他の器官及び生物における生物学的活性分子若しくは治療的活性分子の潜在的な副作用を低減することができる。本発明の組換えタンパク質は、ＦＡＰ特異的治療薬、イメージング剤及び／又は診断剤の構成成分として機能し得る。

【0145】

更に、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む本発明の組換えタンパク質は、ＦＡＰ酵素活性を有意に阻害しないことが示されている（実施例６）。これは、本発明の組換えタンパク質の存在下及び非存在下での蛍光発生基質上のＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を測定することによって評価されている。

【0146】

本発明のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインは、１つ以上の追加のアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の構築ブロックとして機能することができる。複数の特徴は、配列番号４０～４２によってコードされるタンパク質を本発明の好ましい組換え結合タンパク質として特徴付ける。これらは、ＦＡＰに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインと、血清アルブミンに対する結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインと、を含む。これらは、血清アルブミン結合とＦＡＰ結合とを組み合わせる第１の組換え結合タンパク質である。血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、特に配列番号３８、配列番号１５９又は配列番号１６０のアンキリン反復ドメイン、若しくはそれらの変異体は、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ半減期をもたらす。結果として、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、かつ血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質は、治療用途に特に有用な実施形態である。

【0147】

一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有するこのアンキリン反復ドメインは、マウス、ラット、イヌ、カニクイザル、又はヒト由来の血清アルブミン、より好ましくはマウス、カニクイザル又はヒト由来の血清アルブミン、より好ましくはカニクイザル又はヒト由来の血清アルブミン、より好ましくはヒト由来の血清アルブミンに、ＰＢＳ中で、１０^－５未満、好ましくは１０^－６Ｍ未満、又はより好ましくは１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合する。一実施形態では、血清アルブミンに対する結合特異性を有するこの設計されたアンキリン反復ドメインは、配列番号３８、配列番号１５９又は配列番号１６０からなり、ヒト血清アルブミンに、ＰＢＳ中で、１０^－５未満、好ましくは１０^－６Ｍ未満、又はより好ましくは１０^－７Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合する。表面プラズモン共鳴を用いた解離定数決定の例は、実施例、例えば、実施例２、及び国際公開第２０１４／０８３２０８号に記載されている。

【0148】

一実施形態では、本発明のこのＦＡＰ特異的組換え結合タンパク質は、ポリペプチドタグを更に含む。ポリペプチドタグは、ポリペプチド／タンパク質に結合されたアミノ酸配列であり、ここで、このアミノ酸配列は、このポリペプチド／タンパク質の精製、検出、若しくは標的化に有用であり、又は、このアミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善し、又は、このアミノ酸配列はエフェクター機能を有する。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグは、結合タンパク質の他の部分に、直接又はペプチドリンカーを介して結合することができる。ポリペプチドタグは当技術分野で周知であり、当業者には十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小ポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、若しくはＳｔｒｅｐタグ、又は酵素（例えばアルカリホスファターゼ）等のポリペプチドであり、これらにより、このポリペプチド／タンパク質、又は標的化に使用できるポリペプチド（免疫グロブリン又はそれらのフラグメント等）及び／若しくはエフェクター分子として使用できるポリペプチドの検出が可能となる。

【0149】

一実施形態では、本発明のこのＦＡＰ特異的組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカーを更に含む。ペプチドリンカーは、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非タンパク質化合物若しくはポリエチレングリコールなどのポリマー、又はタンパク質ドメインと生物学的活性分子、タンパク質ドメインとローカライザー、又は２つの配列タグを、結合させることができるアミノ酸配列である。ペプチドリンカーは、当業者に既知である。例の一覧は、特許出願、国際公開第２００２／０２０５６５号の記載に提供されている。そのようなリンカーの具体例は、グリシン－セリン－リンカー及び可変長のプロリン－スレオニン－リンカーである。グリシン－セリン－リンカーの例は、アミノ酸配列ＧＳ及び配列番号１５５のアミノ酸配列であり、プロリン－スレオニン－リンカーの例は、配列番号３９のアミノ酸配列である。

【0150】

別の態様では、本発明は、本発明のアンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２６、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１９のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３４のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３５のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１８からなる組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３４からなる組換え結合タンパク質をコードする核酸に関する。更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクターに関する。核酸は、当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計されたアンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質を、大腸菌で産生するために使用した。本発明の核酸の例は、配列番号３４のアミノ酸配列をコードする配列番号１５６によって提供される。

【0151】

一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計されたアンキリン反復ドメイン、及び／又は本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計されたアンキリン反復ドメインをコードする核酸、並びに任意に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。

【0152】

一実施形態では、本発明は、組換え結合タンパク質、又は本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸、並びに任意に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。

【0153】

薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は当業者に既知であり、下記でより詳細に説明する。更にまた、上述の、組換え結合タンパク質及び／又は設計されたアンキリン反復ドメイン、及び／又は核酸のうちの１つ以上、特に本発明の組換え結合タンパク質及び／又は核酸を含む、診断用組成物若しくは腫瘍撮像用組成物が提供される。

【0154】

医薬組成物は、本明細書に記載のような組換え結合タンパク質、及び／又は設計されたアンキリン反復ドメイン、及び／又は核酸、好ましくは、組換え結合タンパク質及び／又は核酸、及び例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０に記載のような、薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは安定剤を含む。

【0155】

当業者に既知の、好適な担体、賦形剤又は安定剤としては、例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、５％デキストロース生理食塩水、等張性及び化学的安定性を高める物質、緩衝液並びに保存剤が挙げられる。他の好適な担体としては、それ自体が、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生を誘発しない任意の担体、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸及びアミノ酸コポリマーが挙げられる。医薬組成物はまた、抗がん剤若しくは抗血管新生剤、又は更なる生物活性化合物等の、追加の有効成分を含む、合剤であってもよい。

【0156】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、無菌でなくてはならない、又は、滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に実施される。

【0157】

本発明の一実施形態は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインなどの生物学的活性分子を更に含む本発明の組換え結合タンパク質の、医薬組成物の製造のための使用であって、この組換え結合タンパク質が、ＦＡＰに対する結合特異性を有するこのアンキリン反復ドメインを含むが、血清アルブミンに対する結合特異性を有するこのアンキリン反復ドメインを含まない対応する組換え結合タンパク質と比べて、終末相半減期の延長、好ましくは少なくとも５％、好ましくは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、又は２５０％の終末相半減期の延長を呈する、使用に関する。本発明の一実施形態では、組換え結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含む。

【0158】

一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のような少なくとも１つの組換え結合タンパク質、並びに非イオン性洗剤などの洗剤、リン酸塩緩衝液などの緩衝液、及びスクロースなどの糖を含む。一実施形態では、そのような組成物は、上記のような組換え結合タンパク質及びＰＢＳを含む。

【0159】

別の態様では、本発明は、哺乳動物のＦＡＰ発現細胞又は組織に生物学的活性分子を局在化する方法であって、この生物学的活性分子を含む本発明の組換え結合タンパク質をこの哺乳動物に投与する工程を含む、方法を提供する。一実施形態では、この生物学的活性分子は、ＦＡＰとは異なる標的に対する結合特異性を有する結合タンパク質である。一実施形態では、この哺乳動物はヒトであり、このＦＡＰ発現細胞又は組織は、原発性腫瘍、転移及び／又は腫瘍間質を含む腫瘍内に位置する。腫瘍組織内の生物学的活性分子の選択的局在化、蓄積、保持、及び／又は活性化は、腫瘍組織内の分子の活性を集中させる利点を有し、その一方で、正常及び非腫瘍組織における分子の活性がはるかに少なくなるという利点を有する。そのような効果は、腫瘍微小環境内のＦＡＰの局在化に依存する、ＦＡＰの酵素活性又は腫瘍進行における役割とは無関係であり得る。

【0160】

別の態様では、本発明は医学的状態を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、治療有効量の生物学的活性分子を含む本発明の組換え結合タンパク質を投与する工程を含み、この生物学的活性分子が、治療有効分子である、方法を提供する。一実施形態では、この生物学的活性分子は、ＦＡＰ発現細胞又は組織に局在化される場合に治療有効分子である。一実施形態では、この生物学的活性分子は、ＦＡＰとは異なる標的に対する結合特異性を有する結合タンパク質である。一実施形態では、このＦＡＰ発現細胞又は組織は、原発性腫瘍、転移及び／又は腫瘍間質を含む腫瘍内に位置する。したがって、これらの実施形態は、例えば、免疫チェックポイント阻害剤又は免疫共刺激アゴニストなどの生物学的活性分子の活性を腫瘍微小環境に局在化することによって、腫瘍間質におけるＦＡＰの制限された発現の利用を可能にする。

【0161】

別の態様では、本発明は患者の腫瘍を撮像する方法であって、治療を必要とする患者に、生物学的活性分子を含む本発明の組換え結合タンパク質を投与する工程を含み、この生物学的活性分子が、この結合タンパク質により結合された細胞を撮像するために有効な分子である、方法を提供する。

【0162】

別の態様では、本発明は患者のがんを診断する方法であって、治療を必要とする患者に、生物学的活性分子を含む本発明の組換え結合タンパク質を投与する工程を含み、この生物学的活性分子が、この患者のがんを診断するために有効な分子である、方法を提供する。

【0163】

一実施形態では、本発明は、本発明による医薬組成物又は組換え結合タンパク質の、疾患の治療のための使用に関する。そのため、本発明による医薬組成物又は組換え結合タンパク質は、これらを必要とする患者に、治療有効量で投与される。投与としては、局所投与、経口投与、及び非経口投与を挙げることができる。典型的な投与経路は非経口投与である。非経口投与において、本発明の医薬組成物は、上記で定義したような薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液又はエマルション等の単位用量の注射剤形で製剤化されている。用量及び投与方法は、治療される個体及び特定の疾患によって異なる。

【0164】

更に、上述の医薬組成物又は組換え結合タンパク質のいずれかは、障害の治療について考慮される。

【0165】

一実施形態では、上記の組換え結合タンパク質又は本明細書に記載のそのような他の医薬組成物は、静脈内投与される。非経口用途のため、組換え結合タンパク質又は上記の医薬組成物は、ボーラス注入として又は緩徐な点滴注入により、治療有効量で注入することができる。

【0166】

一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明の組換え結合タンパク質の治療有効量を投与する工程を含む、治療方法に関する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明の医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、治療方法に関する。一実施形態では、本発明は、本発明による医薬組成物の、疾患の治療のための使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療において使用するための医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための核酸に関する。一実施形態では、本発明は、この医薬組成物、組換え結合タンパク質、又核酸分子の、疾患の治療のための医薬としての使用に関する。一実施形態では、本発明は、この医薬組成物、組換え結合タンパク質、又核酸分子の、医薬の製造のための使用に関する。一実施形態では、本発明は、この医薬組成物、組換え結合タンパク質、又核酸分子の、疾患の治療のための医薬の製造のための使用に関する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療のための医薬の製造プロセスであって、この医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸分子が、医薬の活性成分である、製造プロセスに関する。一実施形態では、本発明は、この医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸分子を使用して疾患を治療するプロセスに関する。

【0167】

特に、本発明は、本発明の医薬組成物を使用した医学的状態の治療であって、上記の医学的状態が、がんである、治療に関する。

【0168】

本発明の組換え結合タンパク質又はこの医薬組成物のがん疾患の治療のための使用はまた、当技術分野において既知の１つ以上の他の療法との併用とすることができる。用語「～との併用」は、本明細書で使用する場合、所与の投与計画の下で実施される共投与を指すものとする。これには、異なる化合物の同時投与及び異なる化合物の時間を変えた投与が含まれる（例えば、化合物Ａを１回投与し、かつ化合物Ｂをその後に数回投与する、若しくは逆もまた同様、又は、両化合物を同時に投与し、かつ２つのうちの１つを後の段階でまた投与する）。

【0169】

更なる一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質の、医学的状態、好ましくは腫瘍性疾患、より好ましくはがんの治療に使用される医薬の製造のための使用に関する。

【0170】

一実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物の、腫瘍性疾患、特にがんであり得る、医学的状態の治療に使用される医薬の製造のための使用に関する。

【0171】

一実施形態では、本発明は、上述のアンキリン反復ドメインのいずれかを含む組換え結合タンパク質に関する。

【0172】

一実施形態では、本発明は、この組換え結合タンパク質を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、この組換え結合タンパク質をコードする核酸を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、この医薬組成物を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、この組換え結合タンパク質、及び／又はこの組換え結合タンパク質をコードする核酸、及び／又はこの医薬組成物を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、ＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１８又は配列番号３４を含む組換え結合タンパク質、及び／又はＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１８又は配列番号３４を含む組換え結合タンパク質をコードする核酸、及び／又はＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１８又は配列番号３４を含む組換え結合タンパク質、並びに／若しくはＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメイン、例えば、配列番号１８又は配列番号３４を含む組換え結合タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物を含むキットに関する。

【0173】

一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質を産生するための方法に関する。一実施形態では、本発明は、組換え結合タンパク質、例えば、配列番号１８又は配列番号３４のアミノ酸配列を含む組換え結合タンパク質を産生するための方法であって、（ｉ）この組換え結合タンパク質を細菌中で発現させる工程と、（ｉｉ）クロマトグラフィーを使用してこの組換え結合タンパク質を精製する工程と、を含む、方法に関する。この方法は、追加の工程を含んでもよい。本発明の組換え結合タンパク質のこのような産生方法は、実施例１に記載される。

【0174】

本発明は、実施例に記載の特定の実施形態に制限されない。

【0175】

本明細書は、「Ｐ５６１８＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名前の、本明細書のアミノ酸配列一覧の多数のアミノ酸配列を参照しており、配列表のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0176】

定義
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。

【0177】

本発明の文脈において、用語「タンパク質」はポリペプチドを含む分子を指し、ここで、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び／又は複数のポリペプチド鎖間で二次、三次、及び／又は四次構造を形成することにより、明確な三次元配置を有する、又は、とることができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。個々に二次及び／又は三次構造を形成することにより、明確な三次元配置を有する、又は、とることができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。

【0178】

用語「組換え」は、組換えタンパク質、組換えポリペプチドなどで使用する場合、このタンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって作製されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって作製される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、大腸菌）に挿入すると、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチドを産生することができる。それに応じて産生されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。

【0179】

本発明の文脈において、用語「結合タンパク質」は、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の結合ドメインを含んでもよい。好ましくは、この結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。本発明の結合タンパク質は、ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。

【0180】

更に、任意のそのような結合タンパク質は、当業者に周知の追加のポリペプチド（例えば、ポリペプチドタグ、ペプチドリンカー、結合特異性を有する他のタンパク質性ドメインへの融合、サイトカイン、ホルモン、又はアンタゴニストなど）、又は化学修飾（ポリエチレングリコール、毒素（例えば、免疫原からのＤＭ１）、小分子、抗生物質などへのカップリングなど）を含み得る。本発明の結合タンパク質は、ローカライザー分子を含み得る。

【0181】

用語「結合ドメイン」は、標的に対する結合特異性を呈するタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、この結合ドメインは、組換え結合ドメインである。

【0182】

用語「標的」は、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然に存在する分子などの個々の分子を指し、そのような個々の分子の任意の一部を含むか、又はそのような分子の２つ以上の複合体、又は細胞全体若しくは組織試料、又は任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的は天然に存在する、若しくは、非天然のポリペプチド若しくはタンパク質、又は、例えば、天然に存在する若しくは非天然のリン酸化、アセチル化、若しくはメチル化によって修飾された、化学修飾を含むポリペプチド若しくはタンパク質である。本発明の文脈において、ＦＡＰ及びＦＡＰ発現細胞並びに組織は、ＦＡＰ特異的結合タンパク質の標的である。

【0183】

本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も含む。ポリペプチドは、当業者に周知である。

【0184】

特許出願第２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒら、２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６）は、反復タンパク質の特徴と反復ドメインの特徴、技術、及び用途の一般的な説明を含む。用語「反復タンパク質」は、１つ以上の反復ドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、反復タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの反復ドメインを含む。更に、この反復タンパク質は、更なる非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ及び／又はペプチドリンカーを含む場合がある。反復ドメインは、結合ドメインである場合がある。

【0185】

用語「反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、この反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールを更に含む。明確にするために、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造的相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、ロイシンリッチ反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７～５０８，２００３）、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第２００９／０４０３３８号）の例から、当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができる。

【0186】

設計された反復タンパク質、設計された反復ドメインなどにおいて使用される用語「設計された」は、そのような反復タンパク質及び反復ドメインがそれぞれ人工的であり、自然界では生じないという特性を指す。本発明の結合タンパク質は、反復タンパク質を設計し、これらは少なくとも１つの設計されたアンキリン反復ドメインを含む。

【0187】

用語「標的相互作用残基」は、標的との直接的な相互作用に寄与する反復モジュールのアミノ酸残基を指す。

【0188】

用語「フレームワーク残基」は、反復モジュールのアミノ酸残基を指し、これは、折り畳みトポロジーに寄与する、すなわち、反復モジュールの折り畳みに寄与するか、又は隣接モジュールとの相互作用に寄与する。そのような寄与は、反復モジュール内の他の残基との相互作用、又はα－ヘリックス若しくはβ－シートに見られるポリペプチド骨格構造への影響、又は直鎖ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与であってもよい。

【0189】

そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ及び／若しくはＣＤ分光法などの物理化学法によって得られる構造データの分析によって、又は構造生物学及び／若しくはバイオインフォマティクスにおいて当業者に周知の既知の関連する構造情報と比較することによって同定され得る。

【0190】

用語「反復モジュール」は、元々は天然に生じる反復タンパク質の反復単位から誘導される、設計された反復ドメインの反復されたアミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質のファミリー又はサブファミリー、例えば、アンキリン反復タンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。更に、反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、例えば、実施例１に記載されるように、標的上で選択された反復ドメインから得られ、同じ標的特異性を有する相同反復モジュールから推定される「反復配列モチーフ」を含み得る。

【0191】

したがって、用語「アンキリン反復モジュール」は、元々天然に存在するアンキリン反復タンパク質の反復単位に由来する反復モジュールを指す。アンキリン反復タンパク質は、当業者に周知である。

【0192】

反復モジュールは、標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリ内でランダム化されていないアミノ酸残基を有する位置（「非ランダム化位置」）及び標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリ内でランダム化されたアミノ酸残基を有する位置（「ランダム化位置」）を含み得る。非ランダム化位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化された」とは、例えば、反復モジュールのアミノ酸位置で２つ以上のアミノ酸が許可され、通常の２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可された、若しくはシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、２０個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許可されたことを意味する。本特許出願の目的のために、配列番号４８～１３４のアミノ酸残基３、４、６、１４及び１５は、本発明のアンキリン反復モジュールのランダム化位置である。

【0193】

用語「反復配列モチーフ」は、１つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、この反復モジュールは、同じ標的に対する結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。このフレームワーク残基の位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、この標的相互作用残基の位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化位置及びランダム化位置を含む。

【0194】

用語「反復単位」は、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、この「反復単位」は複数のコピーに見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全てのこのモチーフに共通の定義されたフォールディングトポロジーを示す。そのような反復単位の例としては、ロイシンに富む反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンに富む変異体反復単位が挙げられる。

【0195】

用語「標的に対する結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、「標的に高い特異性で結合する」、「標的に対して特異的」又は「標的特異性」等は、結合タンパク質又は結合ドメインが、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等の非関連タンパク質に結合するよりも、ＰＢＳ中で、標的に、より低い解離定数で結合する（すなわち、より高い親和性で結合する）ことを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での解離定数（「Ｋ_Ｄ」）は、ＭＢＰに対する対応する解離定数よりも、少なくとも１０^２倍、より好ましくは少なくとも１０^３倍、より好ましくは少なくとも１０^４倍、又はより好ましくは少なくとも１０^５倍低い。タンパク質－タンパク質間の相互作用の解離定数を測定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えば、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、当業者に周知である。特定のタンパク質－タンパク質相互作用のＫ_Ｄの測定値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変動し得る。したがって、Ｋ_Ｄ値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及びＰＢＳ等の標準化緩衝液を使用して実施される。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるＦＡＰに対する結合特異性を有する本発明のアンキリン反復ドメイン及び組換え結合タンパク質の解離定数（Ｋ_Ｄ）の典型的かつ好ましい決定は、実施例２に記載されている。

【0196】

用語「約」は、言及した値の＋／－２０％を意味し、例えば、「約５０」は、４０～６０を意味するものとする。

【0197】

用語「ＰＢＳ」は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。

【0198】

用語「マウス血清アルブミン」は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０７７２４を指し、用語「カニクイザル血清アルブミン」（すなわちｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ２Ｖ９Ｚ４を指し、用語「ヒト血清アルブミン」はＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６８を指す。ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列は、配列番号１５４に提供されている。

【0199】

好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期は、哺乳動物、より好ましくはマウス及び／又はカニクイザル、より好ましくはカニクイザルで評価する。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をマウスで測定する場合、評価は、注入後４８時間までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、マウスにおける終末相の評価は、２４時間～４８時間で算出する。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をカニクイザルで測定する場合、評価は、注入後７日目までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、カニクイザルにおける終末相半減期の評価は、１日目～５日目で算出する。当業者は更に、標的媒介クリアランスなどの効果を特定し、終末相半減期を計算する際にそれらを考慮することができる。本発明の組換え結合タンパク質等の薬物の用語「終末相半減期」は、偽平衡に達した後、哺乳動物に投与した薬物の血漿中濃度の半分に達するのに必要な時間を指す（例えば、マウスでは２４時間～４８時間で算出する、又は、カニクイザルでは１日目～５日目で算出する）。終末相半減期は、哺乳動物に投与された薬物の用量の半分を排泄するのに必要な時間とは定義されない。終末相半減期という用語は、当業者に周知である。好ましくは、薬物動態の比較は、任意の投与量、より好ましくは同等の投与量（すなわち、同一のｍｇ／ｋｇ投与量）又は等モル投与量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ投与量）、より好ましくは等モル投与量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ投与量）、で行う。動物での同等及び／又は等モルの投与は、少なくとも２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の実験的な投与量のばらつきを伴うことが、当業者には理解される。好ましくは、薬物動態の測定に用いられる投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇから選択される。

【0200】

プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られている、用語「線維芽細胞活性化タンパク質」又は「ＦＡＰ」は、特に明記されない限り、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）並びにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源からの任意の天然ＦＡＰを指す。この用語は、「完全長」、「未処理ＦＡＰ」、並びに細胞における処理から生じる任意の形態のＦＡＰを包含する。この用語はまた、ＦＡＰの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ１２８８４、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）参照配列ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０まで延びる。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号４５に提供されている。マウスＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ９７３２１、又はＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１まで延びる。配列番号４７は、マウスＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。カニクイザルＦＡＰのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００５５７３３７７．１に示されている。配列番号４６は、Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子は、ＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。

【0201】

用語「生物活性分子」及び「生物学的活性分子」は、例えば、ヒトを含む哺乳動物における生物学的効果又は活性を有し、本発明の結合タンパク質と共有結合又は非共有結合、コンジュゲート、融合、ないしは別の方法で物理的に関連し得る任意の分子を包含することを意図する。この用語は、例えば、クラスター化、タンパク質分解切断、アロステリックな変化、又は二量体化などの活性化事象のみに応じて、生物学的効果又は活性を示す、任意のそのような分子も包含する。この用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド／ポリペプチド、及び／又は医薬品を包含する。用語「ポリヌクレオチド」は、特に明記されない限り、一般にＤＮＡを指すが、ＲＮＡ及びＤＮＡ若しくはＲＮＡの修飾又は人工的形態を含んでもよい。この用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉプラスミドなどを含む。この用語は、標的器官で産物を発現するためのセンスＤＮＡ又はＲＮＡ、及び標的器官での天然又は導入された遺伝子の発現を低減又は排除するためのアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを更に含む。用語「ペプチド」は、４個～２００個のアミノ酸長などの４個～６００個のアミノ酸長のペプチド鎖を指し、したがって、ポリペプチド及びタンパク質を包含する。この用語は、任意の天然に存在する又は人工的な結合タンパク質、結合ドメイン、増殖因子受容体、又はそれらのフラグメント若しくはリガンド、サイトカイン、酵素、ポリペプチドホルモン、抗体、スキャフォールドに基づく抗体様タンパク質、免疫調節タンパク質などを包含する。更に、用語「ペプチド」はまた、例えば、グリコシル化によって修飾されたペプチド、及び、例えば、インスリン及び免疫グロブリンなどのジスルフィド結合によって架橋された、それぞれが４個～６００個のアミノ酸長の長さの２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質も包含する。用語「医薬品」は、生理学的、薬理学的又は治療的効果を誘導するためにレシピエントに投与され得る任意の天然又は合成化合物を含むことを意図する。そのような薬剤の例は、抗腫瘍薬、毒素、抗生物質、ホルモン、抗炎症剤、抗寄生虫剤、ＤＮＡワクチンなどである。

【0202】

用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の任意のフラグメント及び変異体も意味する。そのようなフラグメント及び変異体もまた、当技術分野において周知であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で常時使用されている。したがって、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及び単鎖Ｖ領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、キメラ抗体、抗体融合ポリペプチド、及び非従来型抗体を包含する。

【0203】

「生物学的活性分子をＦＡＰ発現細胞又は組織に局在化する」という文脈において、本明細書で互換的に使用される用語「局在化」又は「送達」は、生物学的に活性な分子がＦＡＰ特異的結合タンパク質に連結されていない場合と比較して、生物学的に活性な分子がＦＡＰ特異的結合タンパク質に連結されている場合の哺乳動物におけるＦＡＰ発現細胞又は組織への生物学的活性分子の増加された局在化を指す。この用語はまた、分子を哺乳動物の標的の部位に標的化することを指し、分子は本発明のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインに連結された生物学的に活性な分子であり、標的はＦＡＰであり、標的はＦＡＰ発現細胞又は組織である。この用語は、好ましくは、哺乳動物のＦＡＰ発現細胞又は組織の部位での本発明のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインに連結された生物学的に活性な分子の蓄積及び／又は保持を更に包含する。本用語はまた、好ましくは、本発明のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインに連結された生物学的に活性な分子の、又は哺乳動物のＦＡＰ発現細胞又は組織の部位で生物学的に活性な分子によって誘導される生物学的応答の局所的活性化を包含する。そのような局所的活性化は、例えば、本発明の連結されたアンキリン反復ドメインがＦＡＰ発現細胞又は組織に結合する際に生物学的に活性な分子によって結合される生物学的に活性な分子又はタンパク質（例えば、細胞表面受容体など）のクラスター化を通して生じ得る。そのような局所的活性化はまた、他の機構、例えば、タンパク質分解切断、アロステリック変化、又は生物学的に活性な分子の二量体化（例えば、プロドラッグの活性化におけるように）を通して生じ得る。この段落で使用するとき、「哺乳動物」はヒトを包含する。「局在化」の結果は、当業者に周知の様々な手段によって測定され得る。一例として、「局在化」は、実施例５に記載されるように、本発明のアンキリン反復ドメインに連結された生物学的に活性な分子の器官対血液比を決定することによって測定することができる。本発明の一実施形態では、連結された生物学的に活性な分子の「局在化」に対するＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインの効果は、ＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインにリンクされていない対応する生物学的に活性な分子と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、又は３００％の器官対血液比の増加によって示される。

【0204】

本明細書で使用する場合、用語「ＦＡＰ発現細胞」又は「ＦＡＰ発現組織」は、ＦＡＰを発現する細胞若しくは細胞を含む組織を指す。そのようなＦＡＰ発現細胞としては、線維芽細胞、特に腫瘍間質線維芽細胞が挙げられる。ＦＡＰは、肺、結腸直腸、膀胱、卵巣及び乳癌を含む、上皮悪性腫瘍（原発性及び転移性）の９０％超の間質線維芽細胞において、並びに骨及び軟組織肉腫の悪性間葉細胞において選択的に発現されるが、通常、正常な成体組織には存在しない。ＦＡＰは、皮膚、前立腺、膵臓の腫瘍細胞などの特定の悪性腫瘍細胞にも発現する（Ｒｅｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，３１１０－３１１４（１９８８）；Ｇａｒｉｎ－Ｃｈｅｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７，７２３５－７２３９（１９９０）；Ｒｅｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３２７－３３３５（１９９３）；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２３，３１９５－３１９８（２００３）；Ｂｒｅｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１１：２５７－２６６（２０１２）；Ｈａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｌｉｎ Ａｐｐｌ．８：４５４－６３（２０１４））。

【0205】

「医学的状態」（又は障害又は疾患）という用語には、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症（特に増殖性網膜症）、神経変性障害、感染症、代謝性疾患、及び腫瘍性疾患が含まれる。本明細書に記載の組換え結合タンパク質のいずれかを、そのような障害、特に、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症、及び腫瘍性疾患を含む群から選択される障害の治療のための医薬の調製に使用することができる。「医学的状態」は、不適切な細胞増殖を特徴とするものである場合がある。医学的状態は、過剰増殖状態である場合がある。本発明は、特に、医学的状態の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明の組換え結合タンパク質又は上記の医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、治療方法に関する。好ましい実施形態では、この医学的状態は腫瘍性疾患である。用語「腫瘍性疾患」は、本明細書で使用する場合、急速に増殖する細胞増殖又は腫瘍を特徴とする、細胞又は組織の異常な状態（state or condition）を指す。一実施形態では、この医学的状態は悪性腫瘍性疾患である。一実施形態では、この医学的状態はがんである。用語「治療有効量」は、患者において所望の効果をもたらすのに十分な量を意味する。

【0206】

用語「がん」及び「がん性」は、本明細書では、典型的には、調節されていない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は記載するために使用される。がんは、固形腫瘍及び液性腫瘍、並びに原発性腫瘍及び転移性を包含する。「腫瘍」は、１つ以上のがん性細胞を含む。固形腫瘍は、典型的には、腫瘍間質も含む。がんの例としては、原発性及び転移性癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病、並びに任意の他の上皮及びリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。脳がん、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、明細胞腎臓がん、頭頸部扁平上皮癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、三重陰性乳がん、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、悪性中皮腫、結腸直腸がん、又は胃がんが挙げられる。

【実施例】

【0207】

以下に開示される出発材料及び試薬は、当業者に既知であり、市販されている、及び／又は周知の技術を使用して調製することができる。

【0208】

材料
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。クローニング及びタンパク質産生株は、大腸菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）であった。組換えヒトＦＡＰはＲｎＤＳｙｓｔｅｍｓ（ＵＳＡ、製品番号３７１５－ＳＥ）又はＰｒｏｔｅｒｏｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ、製品番号ＰＲ－００７１）のいずれかで購入し、組換えマウスＦＡＰはＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＵＳＡ、製品番号８６４７－ＳＥ）より購入した。ヒスチジンタグ付きカニクイザルＦＡＰは、昆虫細胞においてＲｅｌｉａＴｅｃｈ（Ｇｅｒｍａｎｙ）で発現させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓで標準的な精製方法を使用して精製した。ビオチン化したＦＡＰは、標準的なビオチン化試薬及び方法を使用し、ビオチン部分をタンパク質の第一級アミンにカップリングすることにより、化学的に得た。ヒトＦＡＰ活性アッセイのためのＺ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ蛍光発生基質は、Ｂａｃｈｅｍ製（製品番号＃Ｉ－１１４５．０２５０）であった。

【0209】

薬物動態研究用の健康な雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｓａｉｎｔ Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅから供給した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、ＰＢＳ溶液中に配合した（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、Ｒｅｆ．：１００１０－０１５）。マウス血清試料中のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質濃度は、ポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂ１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．３１２１０）及びＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレート上の捕捉試薬としてウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１－１－１抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。検出は、マウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ＩｇＧ（Ａｂ０６、Ｑｉａｇｅｎ、Ｎｏ．３４４５０）及びＴＭＢ基質溶液を用いて行った。

【0210】

分子生物学
特に明記しない限り、方法は既知のプロトコルに従って行う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。

【0211】

設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリ
設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．に記載されている。そのような方法により、ランダム化されたアンキリン反復モジュール及び／又はランダム化されたキャッピングモジュールを有する設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリを構築することができる。例えば、そのようなライブラリは、固定されたＮ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号１３５、１３６又は１３７のＮ末端キャッピングモジュール）又は配列番号１３８によるランダム化されたＮ末端キャッピングモジュールに；配列番号１３９、１４０又は１４１の配列モチーフによる１つ以上のランダム化された反復モジュール；そして固定されたＣ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号１４２、１５７又は１５８のＣ末端キャッピングモジュール）若しくは配列番号１４３によるランダム化されたＣ末端キャッピングモジュールに基づいて、適切に組み立てられ得る。好ましくは、そのようなライブラリは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有さないように組み立てられる。加えて、配列番号１３９、１４０又は１４１の配列モチーフによるランダム化された反復モジュールは、位置１０及び／又は位置１７で更にランダム化される可能性があり；配列番号１３８の配列モチーフによるランダム化されたＮ末端キャッピングモジュールは、位置７及び／又は位置９で更にランダム化される可能性があり、配列番号１４３の配列モチーフによるランダム化されたＣ末端キャッピングモジュールは、位置１０、１１及び／又は１７で更にランダム化され得る。

【0212】

そのようなライブラリ内のそのようなランダム化されたモジュールは、ランダム化されたアミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含んでもよい。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体の補体決定領域（ＣＤＲ）ループライブラリ又は新規に生成されたペプチドライブラリである。例えば、そのようなループ挿入は、誘導として、ヒトリボヌクレアーゼＬ（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ，Ｋｕｓａｋａｂｅ，Ｙ，Ｇｏｔｏ，Ｙ．，Ｋｉｔａｄｅ，Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｔ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２３（３０），３９２９－３９３８，２００４）のＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を使用して設計することができる。２つのアンキリン反復の境界近くに存在するベータターンに１０個のアミノ酸が挿入されているこのアンキリン反復ドメインと同様に、アンキリン反復タンパク質ライブラリは、アンキリン反復ドメインの１つ以上のベータターンに挿入された可変長（例えば、１個～２０個のアミノ酸）のランダム化されたループ（固定及びランダム化位置を有する）を含有してもよい。

【0213】

アンキリン反復タンパク質ライブラリの任意のそのようなＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＲＩＬＬＡＡ、ＲＩＬＬＫＡ、又はＲＥＬＬＫＡモチーフ（例えば、配列番号３４の位置２１～位置２６に存在する）を有し、アンキリン反復タンパク質ライブラリの任意のそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＫＬＮ、ＫＬＡ又はＫＡＡモチーフ（例えば、配列番号３４の最後の３つのアミノ酸に存在する）を有する。

【0214】

そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリの設計は、標的と相互作用するアンキリン反復ドメインの既知の構造によって誘導され得る。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）の独自の受託コード又は識別コード（ＰＤＢ－ＩＤ）によって識別される、そのような構造の例は、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２О、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ－３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。

【0215】

Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃで設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリなどの、設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリの例が記載されている（米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの数字は、Ｎ末端とＣ末端のキャッピングモジュールの間に存在するランダム化された反復モジュールの数を記載している。

【0216】

反復単位及びモジュールの内側の位置を定義するために使用される命名法は、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．に基づいており、アンキリン反復モジュール及びアンキリン反復単位の境界が１つのアミノ酸位置によってシフトされる変更を有する。例えば、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）のアンキリン反復モジュールの位置１は、本開示のアンキリン反復モジュールの位置２に相当し、その結果、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．のアンキリン反復モジュールの位置３３は、本開示の以下のアンキリン反復モジュールの位置１に相当する。

【0217】

全てのＤＮＡ配列は配列決定によって確認され、選択されたタンパク質の計算された分子量は質量分析によって確認された。

【0218】

実施例１：ＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソーム表示（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ＰＮＡＳ ９４，４９３７－４２，１９９７）を使用して、ヒトＦＡＰ（ｈＦＡＰ）に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質は、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって記載されているのと同様のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリから選択した。選択されたクローンの組換えヒトＦＡＰ標的への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）によって評価され、数百のｈＦＡＰ特異的結合タンパク質が正常に選択されたことを示した。例えば、配列番号１～３３のアンキリン反復ドメインは、ｈＦＡＰに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。ｈＦＡＰに対して結合特異性を有するそのようなアンキリン反復ドメインからの個々のアンキリン反復モジュールは、配列番号４８～１３４に提供される。

【0219】

リボソームディスプレイによるＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の選択
ｈＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトＦＡＰを標的タンパク質として、上記のようなアンキリン反復タンパク質のライブラリ、及び確立されたプロトコル（Ｚａｈｎｄ、Ｃ．，Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，６９－７９，２００７）を使用して、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）により行った。各選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する４５から２８に一定に減少させた。最初の４ラウンドの選択は、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシーを増加させて、ラウンド１からラウンド４への選択圧力を増加させる（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。高親和性ＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質を富化するために、標準リボソームディスプレイ選択（上記）の第４ラウンドからの出力は、増加した選択ストリンジェンシーを用いて、１つ又は２つのオフレート選択ラウンドに供した（Ｚａｈｎｄ，２００７，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。各オフレート選択ラウンドの後に最終標準選択ラウンドを行って、オフレート選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。

【0220】

選択されたクローンは、粗抽出物ＨＴＲＦによって示されるようにＦＡＰに特異的に結合する
溶液中でＦＡＰに特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンをｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターにクローニングし、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、次いで、１５０μｌの増殖培地（１％のグルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレート（単一ウェル中の各クローン）中で３７℃にて一晩増殖させた。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１５０μｌの新鮮なＬＢ培地に、新鮮な９６深型ウェルプレートで１０μｌの一晩培養物を接種した。３７℃、８００ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、ＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で発現を誘導し、４時間継続した。細胞を採取し、８．５μｌのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｐｉｅｒｃｅ）に再懸濁し、ペレットが完全に再懸濁するまで振盪しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μｌのＰＢＳを添加し、細胞残渣を遠心分離により除去した。

【0221】

各溶解したクローンの抽出物を、２．２５ｎＭ（最終濃度）のビオチン化ヒトＦＡＰ、１：２５０（最終濃度）の抗ＨＡ－Ｄ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）及び１：４００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）と一緒に、ＰＢＳＴＢ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）で１：１０００希釈（最終濃度）として３８４ウェルプレートのウェルに加え、室温で６０分間インキュベートした。３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００でＨＴＲＦを読み取った。シグナルをバックグラウンド上で正規化した。そのような粗細胞抽出物ＨＴＲＦによる数百個のクローンのスクリーニングにより、ヒトＦＡＰに対する特異性を有する１００個を超える異なるアンキリン反復ドメインが明らかになった。ヒトＦＡＰに特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の例は、配列番号１～３３に提供されている。

【0222】

ヒトＦＡＰに対する結合特異性を有するこれらのアンキリン反復ドメインと、ヒトＦＡＰに対する結合特異性を有さない陰性対照アンキリン反復ドメイン（配列番号４４）とを、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号３６）又はＮ末端Ｈｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）のいずれかを提供するｐＱＥ（ＱＩＡｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ベースの発現ベクターにクローニングした。Ｎ末端Ｈｉｓ－ＨＡタグは、ＨｉｓタグとＨａタグとを組み合わせる。例えば、以下のアンキリン反復タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１（配列番号１、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（配列番号２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３（配列番号３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４（配列番号４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５（配列番号５、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６（配列番号６、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（配列番号７、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（配列番号８、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（配列番号９、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１０（配列番号１０、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１１（配列番号１１、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１２（配列番号１２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１３（配列番号１３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４（配列番号１４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１５（配列番号１５、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１６（配列番号１６、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１７（配列番号１７、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８（配列番号１８、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１９（配列番号１９、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２０（配列番号２０、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２１（配列番号２１、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２２（配列番号２２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２３（配列番号２３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４（配列番号２４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２５（配列番号２５、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２６（配列番号２６、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７（配列番号２７、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８（配列番号２８、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９（配列番号２９、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０（配列番号３０、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１（配列番号３１、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３２（配列番号３２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３３（配列番号３３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓ－ＨＡタグ（配列番号３７）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３６（配列番号１８、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３７（配列番号１９、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３８（配列番号２６、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３９（配列番号３３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、及び
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４４（配列番号４４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）。

【0223】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５の操作
更に、ヒトＦＡＰに特異的に結合する以下のアンキリン反復タンパク質をコードするｐＱＥベースの発現ベクターを構築した。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４（配列番号３４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、及び
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５（配列番号３５、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）。

【0224】

配列番号３４及び配列番号３５を、それぞれ配列番号１８及び配列番号１９の配列に基づいて遺伝子操作した。配列番号１８及び配列番号１９のアンキリン反復ドメインにおいて、Ｎ末端キャッピングモジュールに存在するＲＩＬＬＡＡモチーフ（位置２１～２６）がＲＥＬＬＫＡモチーフに置き換えられ、Ｃ末端キャッピングモジュールは、ＫＬＮモチーフの代わりにＫＡＡモチーフを含むように改変された（配列番号１８の位置１５７～１５９及び配列番号１９の位置１２４～１２６）。

【0225】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４４～＃１５３の操作
更に、ヒトＦＡＰに特異的に結合する以下のアンキリン反復タンパク質をコードするｐＱＥベースの発現ベクターを構築する。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４４（配列番号１４４、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４５（配列番号１４５、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４６（配列番号１４６、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４７（配列番号１４７、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４８（配列番号１４８、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４９（配列番号１４９、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１５０（配列番号１５０、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１５１（配列番号１５１、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１５２（配列番号１５２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１５３（配列番号１５３、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）。

【0226】

配列番号１４４～配列番号１５３を、配列番号１８の配列に基づいて操作した。配列番号１８のアンキリン反復ドメインにおいて、Ｎ末端キャッピングモジュールに存在するＲＩＬＬＡＡモチーフ（位置２１～２６）は、ＲＩＬＬＫＡ又はＲＥＬＬＫＡモチーフによって置き換えられ、及び／又はＣ末端キャッピングモジュールは、ＫＬＮモチーフ（配列番号１８の位置１５７～１５９）の代わりにＫＡＡモチーフを含むように改変され、及び／又は第３の反復モジュールは、プロリンをロイシン（配列番号１８の位置１１６）に置き換えるように改変される。これらの改変は、配列番号１８と比較して、単独で又は組み合わせて、配列番号１４４～１５３の有意に変更された構造又は機能特性をもたらさない。

【0227】

ＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の高レベル及び可溶性発現
更なる分析のために、上記のように粗細胞抽出物ＨＴＲＦで特異的なＦＡＰ結合を示す選択されたクローンを、大腸菌ＢＬ２１又はＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞で発現させ、標準的なプロトコルに従ってＨｉｓタグを使用して精製した。２５ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン；３７℃）を使用して、５００ｍｌの培養物（ＴＢ、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３７℃）に接種した。６００ｎｍで１．０～１．５の吸光度で、培養物を０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら３７℃で４～５時間インキュベートした。培養物を遠心分離し、得られたペレットを２５ｍｌのＴＢＳ_５００（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）に再懸濁し、溶解した（超音波処理又はフレンチプレス）。溶解後、試料を６２．５℃で３０分間熱処理し、遠心分離し、上清を採取して濾過した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（１％（ｖ／ｖ）の最終濃度）及びイミダゾール（２０ｍＭの最終濃度）をホモジネートに添加した。タンパク質を、Ｎｉ－ニトリロ三酢（Ｎｉ－ＮＴＡ）酸カラム、続いて、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システム上のサイズ排除クロマトグラフィーで、当業者に既知の標準的なプロトコル及び樹脂に従って精製した。あるいは、Ｈｉｓタグを欠く選択されたアンキリン反復ドメインを、陰イオン交換クロマトグラフィー、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーによって、当業者に既知の標準的な樹脂及びプロトコルに従って精製した。ＦＡＰに対する結合特異性を有する高可溶性アンキリン反復タンパク質を、１５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥから推定される純度＞９５％で大腸菌培養物から精製した（培養物１リットル当たり最大２００ｍｇのアンキリン反復タンパク質）。そのようなＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの代表的な例は図１Ａ及び図１Ｂに示す。そのような精製アンキリン反復タンパク質を、更なる特性評価のために使用した。

【0228】

実施例２：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるＦＡＰに対する結合特異性を有するアンキリン反復タンパク質の解離定数（Ｋ_Ｄ）の決定
ヒトＦＡＰ標的における精製アンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ機器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。

【0229】

ヒトＦＡＰを１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．３緩衝液で希釈し、ＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）に共有結合で約２０００共鳴単位（ＲＵ）のレベルに固定化した。次いで、アンキリン反復タンパク質とｈＦＡＰとの相互作用を、３０ｎＭ～０．５ｎＭの濃度範囲を網羅するアンキリン反復タンパク質の段階希釈物を含有する２００μｌのランニング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有する）を注入（オンレート測定）し、続いて、１００μｌ／分の一定流量で少なくとも２５分間、ランニング緩衝液流を注入（オフレート測定）することによって測定した。１５μｌの１０ｍＭのグリシンｐＨ２、続いて１５μｌの１２４ｍＭのＨ_３Ｐ０_４を使用して再生を行った。スポット間のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注入（すなわち、ランニング緩衝液のみの注入）を、アンキリン反復タンパク質の注入後に得られたＲＵトレースから減算した（二重参照）。オンレート及びオフレート測定から得られたＳＰＲトレースに基づいて、対応するアンキリン反復タンパク質－ＦＡＰ相互作用のオンレート及びオフレートを決定した。

【0230】

代表的な例として、図２は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４の得られたＳＰＲトレースを示す。解離定数（Ｋ_Ｄ）を、当業者に既知の標準的な手順を用いて、推定されたオンレート及びオフレートから算出した。選択されたアンキリン反復タンパク質のＫ_Ｄ値は、５ｐＭ～１０ｎＭの範囲であると決定された。表１は、いくつかの選択されたアンキリン反復タンパク質のＫ_Ｄ値を例として提供している。

【0231】

【表1】

【0232】

実施例３：ＦＡＣＳによるＦＡＰ＋細胞に対するＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の結合
精製されたＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質のＦＡＰ発現細胞への結合をＦＡＣＳによって分析した。

【0233】

マルチウェルプレートを使用して、ウェル当たり２０，０００個のＷＩ３８細胞を５０μｌのＰＢＳに添加した。次いで、アンキリン反復タンパク質の適切な希釈液（２×希釈工程）５０μｌを細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。アンキリン反復タンパク質結合反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ ＡＦ６４７コンジュゲート（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してＨｉｓタグ付きアンキリン反復タンパク質の直接免疫蛍光検出、及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して生細胞の測定を一段階で一緒に行った。Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ ＡＦ６４７コンジュゲート及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ染料を、１／２００（Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ）及び１／１０００（Ｌ／Ｄ固定可能）の最終希釈液で一緒に細胞に適用し、氷上で２０～３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞を１×ＣｅｌｌＦｉｘ（商標）緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した（１０×ストックを水で１／１０に希釈した）。試料をＣｅｌｌＦｉｘ（商標）緩衝液で、室温で１５～２０分間インキュベートした後、４００ｇで５分間遠心沈殿させた。細胞を２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、取得及びＦＡＣＳ分析まで４℃で保存した。蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）の測定を含む取得及びＦＡＣＳ分析は、ＡｔｔｕｎｅＮｘＴ機器を用いた染色後５日以内に行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ７．０．４）を使用して、非線形回帰曲線フィッティングによって結合曲線を適合させた。

【0234】

代表的な例として、図３は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２６、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３３で得られた結合曲線を示している。ＥＣ_５０値を、当業者に既知の標準的手順を使用して測定した。選択されたアンキリン反復タンパク質のＥＣ_５０値は、１００ｐＭ～５ｎＭの範囲であると決定され、ＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞に対する高い親和性結合を実証した。表２は、選択されたアンキリン反復タンパク質のＥＣ_５０値を例として提供する。

【0235】

【表2】

【0236】

同様に、操作されたアンキリン反復タンパク質、つまり、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５のＦＡＰ発現ＷＩ３８細胞への結合も、本質的に上記のように試験した。試料のＭＦＩをバックグラウンド対照のＭＦＩで除算することにより、ＭＦＩの増加倍率を算出した。バックグラウンド対照では、結合反応緩衝液を、アンキリン反復タンパク質の非存在下で、Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ ＡＦ６４７コンジュゲートとのみインキュベートした。

【0237】

図４Ａは、ＷＩ３８細胞上のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５の結合曲線を示しており、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４とＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５との両方が高い親和性を有するＷＩ３８細胞発現ＦＡＰに結合することを実証している。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４のＥＣ_５０値は０．７３６ｎＭであり、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５のＥＣ_５０値は０．９９４ｎＭであった（表３を参照されたい）。

【0238】

ＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質のＦＡＰ発現細胞への結合が、細胞表面上で発現されたＦＡＰへの結合によって実際に媒介されたことを実証するために、ＦＡＰ発現を有するか又は有さない細胞への選択されたアンキリン反復タンパク質の結合を測定した。この目的のために、細胞表面上でＦＡＰを発現するＣＨＯ細胞を生成した。これらのＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞は、ＦＡＰを発現しない野生型ＣＨＯ細胞と比較して使用することができる。

【0239】

簡潔に言うと、ヒトＦＡＰをコードするｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）を使用して、標準的な分子生物学技術によって発現ベクターを生成した。リポフェクタミンを使用して、ＣＨＯ細胞を発現ベクターでトランスフェクトした。異なる濃度のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｇ－４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ８０９１）を使用して選択圧力を適用した。ｈＦＡＰの発現を、抗ＦＡＰ抗体を使用してフローサイトメトリーにより分析した。１．９ｍｇ／ｍＬのＧ－４１８を使用して得られたＣＨＯ－ｈＦＡＰトランスフェクタントの集団を、これらの細胞（ＣＨＯ－ＦＡＰ１．９細胞）におけるＦＡＰの比較的低い発現レベルに基づいて、更なる実験のために選択した。ＦＡＣＳ分析は、ＣＨＯ－ＦＡＰ１．９細胞が細胞表面でｈＦＡＰを発現するが、野生型ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｗｔ）が発現しないことを示した（データは示さず）。

【0240】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５の一連の希釈物を、野生型ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｗｔ）及びｈＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＦＡＰ１．９）に添加した。結合反応及びその後の分析並びにＭＦＩ測定を、本質的にＷＩ３８細胞について上記のように行った。図４Ｂは、ＣＨＯ－ｗｔ細胞及びＣＨＯ－ＦＡＰ１．９細胞に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５の結合曲線を示しており、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５は、細胞表面でＦＡＰを発現するＣＨＯ細胞（すなわち、ＣＨＯ－ＦＡＰ１．９）にのみ結合することを実証している。したがって、細胞へのＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の結合は、細胞表面上で発現されたＦＡＰへの結合によって媒介される。ＣＨＯ－ＦＡＰ１．９細胞への結合のＥＣ_５０値は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４では１．１８６ｎＭ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５では２．０１６ｎＭであった（表３を参照されたい）。

【0241】

【表3】

【0242】

実施例４：ＳＰＲ及びｃＦＡＰトランスフェクトＣＨＯ細胞によって決定されるカニクイザルＦＡＰへの結合
選択されたアンキリン反復タンパク質のカニクイザルＦＡＰ（ｃＦＡＰ）への結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ機器（ＢｉｏＲａｄ）を使用する可溶性ｃＦＡＰ標的で、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞及び当業者に既知の標準的手順に従うＦＡＣＳを使用して細胞ｃＦＡＰ標的で評価した。

【0243】

簡単に言うと、カニクイザル（cyno）ＦＡＰを１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．３緩衝液で希釈し、ＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）に共有結合で約２０００共鳴単位（ＲＵ）のレベルに固定化した。次いで、アンキリン反復タンパク質とｃＦＡＰとの相互作用を、２５ｎＭ～０．３ｎＭの濃度範囲を網羅するアンキリン反復タンパク質の段階希釈を含有する２００μｌのランニング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有する）を注入（オンレート測定）し、続いて、１００μｌ／分の一定流量で少なくとも２５分間、ランニング緩衝液流を注入（オフレート測定）することによって測定した。１５μｌの１０ｍＭのグリシンｐＨ２、続いて１５μｌの１２４ｍＭのＨ_３Ｐ０_４を使用して再生を行った。スポット間のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注入（すなわち、ランニング緩衝液のみの注入）を、アンキリン反復タンパク質の注入後に得られたＲＵトレースから減算した（二重参照）。オンレート及びオフレート測定から得られたＳＰＲトレースに基づいて、対応するアンキリン反復タンパク質－ＦＡＰ相互作用のオンレート及びオフレートを決定した。

【0244】

代表的な例として、図５はカニクイザル及びヒトＦＡＰの両方に対する、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３６の得られたＳＰＲトレースを示す。解離定数（Ｋ_Ｄ）を、当業者に既知の標準的な手順を用いて、推定されたオンレート及びオフレートから算出した。ｃＦＡＰに対するＫ_Ｄ値は、ｈＦＡＰに対するＫ_Ｄ値の２倍の範囲内にあると判断され、選択されたアンキリン反復タンパク質がこれらの異なる種のＦＡＰタンパク質に同等に結合することを実証している。表４は、いくつかの選択されたアンキリン反復タンパク質のｃＦＡＰ及びｈＦＡＰに対するＫ_Ｄ値を例として提供している。

【0245】

【表4】

【0246】

細胞表面上に発現されたカニクイザルＦＡＰ（ｃＦＡＰ）への選択されたアンキリン反復タンパク質の結合を評価するために、ｃＦＡＰをコードするｃＤＮＡを使用したことを除いて、本質的にｈＦＡＰについて実施例３に記載されるように、ｃＦＡＰを発現する安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を生成した。

【0247】

アンキリン反復タンパク質の一連の希釈物を、ｃＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞に添加した。結合反応及びその後の分析並びにＭＦＩ測定を、本質的にＷＩ３８細胞について実施例３に記載したように行った。図６は、ｃＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２６、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３３の結合曲線を示しており、ＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質が細胞表面で発現されたカニクイザルＦＡＰにも結合することを実証している。ｃＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞への結合についてのＥＣ_５０値を表５に示す。

【0248】

【表5】

【0249】

実施例５：ＦＡＰ発現細胞結合、ＳＰＲ、薬物動態、生体分布、及び生物学的活性分子に融合したＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の腫瘍局在化データ
生物学的活性分子に融合したＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の構築
選択されたＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインを、当業者に既知の標準的な分子生物学的方法を用いて生物学的活性分子に遺伝子学的に融合させた。血清アルブミンに対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン（配列番号３８）を、例示的な生物学的活性分子として選択した。血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメイン及び異なる標的特異性を有する共有結合したアンキリン反復ドメインのｉｎ ｖｉｖｏ半減期延長のためのそれらの使用は、以前に報告されている（例えば、Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，「Ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標） ｄｏｍａｉｎｓ，」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．３０（９）：５８３－５９１（２０１７）；米国特許第９，２８４，３６１号、米国特許第９，４５８，２１１号を参照されたい）。配列番号３８のアンキリン反復ドメインは、マウス、ヒト、及びカニクイザルを含む様々な種の血清アルブミンに結合する。生物学的活性分子は、ペプチドリンカーを介してＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインに連結されていた。プロリン－スレオニンに富むペプチドリンカー（配列番号３９）を、この目的のために例示的なペプチドリンカーとして選択した。

【0250】

実施例１に記載されるように、ＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインを、ペプチドリンカー及び生物学的活性分子と共に、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号３６）を提供するｐＱＥ（ＱＩＡｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ベースの発現ベクターにクローニングして、単純なタンパク質精製を促進した。例えば、以下のアンキリン反復融合タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０（配列番号４０、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）。配列番号４０は、ペプチドリンカーによって連結された配列番号３８及び配列番号１８を含む。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１（配列番号４１、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）。配列番号４１は、ペプチドリンカーによって連結された配列番号３８及び配列番号１９を含む。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４２（配列番号４２、そのＮ末端に融合させたＨｉｓタグ（配列番号３６）を有する）。配列番号４２は、ペプチドリンカーによって連結された配列番号３８及び配列番号２６を含む。

【0251】

生物学的活性分子に融合したＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質のＵ８７ ＭＧ及びＷＩ３８細胞への結合
生物学的活性分子のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインへの融合が、細胞の表面上で発現されたＦＡＰを特異的に認識し、かつこれに結合する能力に影響を及ぼすかどうかを決定するために、選択されたアンキリン反復融合タンパク質のＦＡＰ発現細胞への結合を試験した。Ｕ８７ ＭＧ細胞及びＷＩ３８細胞は、細胞表面上にＦＡＰを発現することが知られており、それらをこれらの実験の代表的な細胞として選択した。Ｕ８７ ＭＧ及びＷＩ３８細胞でのＦＡＰ発現を、ＦＡＣＳ分析によって確認した（データは示さず）。

【0252】

マルチウェルプレートを使用して、ウェル当たり４０，０００個の細胞（Ｕ８７ＭＧ又はＷＩ３８のいずれか）を５０μｌのＰＢＳに添加した。次いで、アンキリン反復融合タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０又はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１）の適切な希釈液（２×希釈工程）５０μｌを細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。アンキリン反復融合タンパク質結合反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ ＡＦ６４７コンジュゲート（ＱＩＡｇｅｎ）を使用してＨｉｓタグ付きアンキリン反復融合タンパク質の直接免疫蛍光検出、及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して生細胞の測定を一段階で一緒に行った。Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ ＡＦ６４７コンジュゲート及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ染料を、１／４００（Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ）及び１／１０００（Ｌ／Ｄ固定可能）の最終希釈液で一緒に細胞に適用し、氷上で２０～３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞を１×ＣｅｌｌＦｉｘ（商標）緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した（１０×ストックを水で１／１０に希釈した）。試料をＣｅｌｌＦｉｘ（商標）緩衝液で、室温で１５～２０分間インキュベートした後、４００ｇで５分間遠心沈殿させた。細胞を２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、取得及びＦＡＣＳ分析まで４℃で保存した。蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）の測定を含む取得及びＦＡＣＳ分析は、ＡｔｔｕｎｅＮｘＴ機器を用いた染色後５日以内に行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ７．０．４）を使用して、非線形回帰曲線フィッティングによって結合曲線を適合させた。

【0253】

図７は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１のＵ８７ＭＧ及びＷＩ３８細胞のそれぞれに対する結合曲線を示す。両方のアンキリン反復融合タンパク質は、濃度依存的な様式で異なる細胞型に結合し、１０～１００ｎＭの濃度で結合飽和に達した。したがって、細胞ＦＡＰに対するアンキリン反復融合タンパク質の特異的結合は、生物学的活性分子への融合を伴わないＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインと比較して同様である。したがって、本発明のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインは、生物学的活性分子に融合することができ、そのようなＦＡＰ特異的アンキリン反復融合タンパク質は、細胞表面上で発現されたＦＡＰに効率的に結合する能力を保持する。

【0254】

マウスにおける生物学的活性分子に融合したＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の薬物動態プロファイル
本発明のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインが、治療薬の開発に有用であるためにｉｎ ｖｉｖｏで適切な血清半減期を有するかどうかを決定するために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４２の薬物動態プロファイルを、マウスで分析した。

【0255】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与及び試料採取
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４２を、各アンキリン反復融合タンパク質に６匹のマウスの尾静脈に１回の静脈内ボーラス注射として投与した。標的投与量レベルは、５ｍＬ／ｋｇの適用量で１ｍｇ／ｋｇであった。アンキリン反復融合タンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に配合した。

【0256】

マウスを、等しい数の動物を有する２つの群に分割した。４つの血清試料を各マウスから採取した。薬学的動態調査のための血液試料を、化合物投与後５分、４時間、２４時間、４８時間、７６時間、９６時間、及び１６８時間に採取した。血液を室温に維持して凝固させ、続いて遠心分離し、血清を採取した。

【0257】

血清試料中のアンキリン反復タンパク質を測定するためのＥＬＩＳＡによる生物分析
ＰＢＳ中の１０ｎＭのポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂ１８）のウェル当たり１００μｌを、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。ウェル当たり３００μｌのＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ）で５回洗浄した後、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００振盪器（４５０ｒｐｍ）で、０．２５％のカゼイン（ＰＢＳＴ－Ｃ）を補充した３００μｌのＰＢＳＴで、室温（ＲＴ）で１時間ウェルをブロックした。プレートを上記のように洗浄した。ＰＢＳＴ－Ｃ中の１００μｌの５ｎｍｏｌ／Ｌのウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１－１－１抗体を添加し、プレートを軌道振盪（４５０ｒｐｍ）しながら室温（２２℃）で１時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄した。

【0258】

希釈した血清試料（１：５の希釈工程で１：２０～１：３１２５００）又はアンキリン反復タンパク質標準曲線試料（１：３の希釈工程で０及び５０～０．０００８ｎｍｏｌ／Ｌ）の１００μｌを、４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で２時間適用した。プレートを上記のように洗浄した。

【0259】

次いで、ウェルを１００μｌのマウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ＩｇＧ（Ａｂ０６、ＰＢＳＴ－Ｃ中１：２０００）と共にインキュベートし、室温、４５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄した。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液を５分間使用して、１ｍｏｌ／ＬのＨ_２ＳＯ_４を１００μｌ添加することによって停止させてＥＬＩＳＡを展開した。４５０ｎｍにおける吸光度と６２０ｎｍにおける吸光度との差を算出した。試料を２つの異なるプレート上で二連で測定した。図８は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４２の血清濃度を、マウスへの単回静脈内投与後の時間の関数として示している。トレースは、化合物のおおよその単一指数関数的除去を示す。

【0260】

薬物動態解析
薬物動態データ解析を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａの一部としてＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムのバージョン７．０を使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓで行った。静脈内ボーラス注射を介して投与された動物の平均濃度－時間データに基づく薬物動態パラメータの計算を、ノンコンパートメント解析（ＮＣＡモデル２００－２０２、ＩＶボーラス、線形台形線形補間）を用いて行った。以下の薬物動態パラメータを計算した。
ＡＵＣｉｎｆ、ＡＵＣｌａｓｔ、ＡＵＣ＿％ｅｘｔｒａｐｏｌ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｃｌ＿ｐｒｅｄ、Ｖｓｓ＿ｐｒｅｄ、ｔ１／２

【0261】

最大血清濃度（Ｃｍａｘ）及びそれらの発生時間（Ｔｍａｘ）は、血清濃度－時間プロファイルから直接得られた。血清濃度－時間曲線下の面積（ＡＵＣｉｎｆ）は、最後のサンプリングポイント（Ｔｌａｓｔ）までの線形台形公式と、終末相の単一指数関数的減少を想定した無限大への外挿によって決定した。無限大への外挿は、Ｃｌａｓｔ／λｚを使用して行われ、式中、λｚは対数線形回帰によって推定された終末相速度定数を示し、Ｃｌａｓｔは種末相対数線形回帰によってＴｌａｓｔで推定された濃度を示している。総血清クリアランス（Ｃｌ＿ｐｒｅｄ）及び見かけの終末相半減期を、以下のように計算した。Ｃｌ＿ｐｒｅｄ＝ｉ．ｖ．投与量／ＡＵＣｉｎｆ及びｔ１／２＝ｌｎ２／λｚ。分布の定常状態の体積Ｖｓｓを、以下によって決定した。Ｖｓｓ＝ｉ．ｖ．投与量・ＡＵＭＣｉｎｆ／（ＡＵＣｉｎｆ）２。ＡＵＭＣｉｎｆは、ＡＵＣｉｎｆの計算についての記載と同じ外挿手順を使用して、無限大に外挿された薬物濃度－時間曲線の１次モーメント下総面積を示している。ｎｍｏｌ／Ｌで与えられた濃度に基づいてＰＫパラメータを計算するために、ｍｇ／ｋｇとして与えられた投与量値をアンキリン反復タンパク質の分子量を使用してｎｍｏｌ／ｋｇに変換した。表６は、試験したアンキリン反復融合タンパク質について得られた薬物動態データを示す。

【0262】

【表6】

【0263】

血清半減期は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０で３８．８時間、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１で２６．９時間、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４２で２６．１時間と決定した。これらのデータは、本発明のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインが、血清アルブミン特異的アンキリン反復ドメインに融合された場合、生物学的活性分子に共有結合したＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインを含む治療薬の成分としてそれらを有用にするために十分なｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することを示している。

【0264】

生物学的活性分子に融合したＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の腫瘍局在化
本発明のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインが、ＦＡＰを発現する腫瘍組織に優先的に生物学的活性分子を局在化するかどうかを判定するために、生物学的活性分子に融合されたＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ局在化を、マウス腫瘍モデルにおいて分析した。

【0265】

ＳＰＲにより測定されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１のマウス及びヒトＦＡＰへの結合
マウス腫瘍モデルでＦＡＰ特異的アンキリン反復融合タンパク質を分析する前に、ＦＡＰ特異的アンキリン反復融合タンパク質がヒトＦＡＰだけでなくマウスＦＡＰ（ｍＦＡＰ）にも結合することを示さなければならない。この目的のために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１の可溶性マウス及びヒトＦＡＰへの結合を、当業者に既知の標準的な手順に従って、ＰｒｏｔｅＯｎ機器（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＳＰＲ測定によって評価した。

【0266】

簡単に言うと、マウスＦＡＰを１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．３緩衝液で希釈し、ＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）に共有結合で約２０００共鳴単位（ＲＵ）のレベルに固定化した。次いで、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１とｍＦＡＰとの相互作用を、５０ｎＭ～３ｎＭの濃度範囲を網羅するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１の段階希釈物を含有する２００μｌのランニング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有する）を注入（オンレート測定）し、続いて、１００μｌ／分の一定流量で３０分間、ランニング緩衝液流を注入（オフレート測定）することによって測定した。１５μｌの１０ｍＭのグリシンｐＨ２、続いて１５μｌの１２４ｍＭのＨ_３Ｐ０_４を使用して再生を行った。スポット間のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注入（すなわち、ランニング緩衝液のみの注入）を、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１の注入後に得られたＲＵトレースから減算した（二重参照）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１のｈＦＡＰへの結合を、実施例２に記載のとおりに決定した。

【0267】

解離定数（Ｋ_Ｄ）を、当業者に既知の標準的な手順を用いて、推定されたオンレート及びオフレートから算出し、表７に報告する。これらの結果は、生物学的活性分子に融合したＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメイン（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１）が、対応するＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインのみと同様のＫ_ＤでヒトＦＡＰに結合すること（表１のＤＡＲＰｉｎタンパク質＃１９を参照）及びマウスＦＡＰとよく交差反応することを示している。マウスＦＡＰに結合するためのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１の解離定数は、１．３ｎＭであると判定した。

【0268】

【表7】

【0269】

生体分布分析によってＦＡＰ陽性マウス腫瘍モデルで評価されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１のｉｎ ｖｉｖｏ局在化
Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞を伴うマウス腫瘍モデルを、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１のｉｎ ｖｉｖｏ局在化を評価するための代表的なＦＡＰ陽性腫瘍モデルとして選択した。Ｕ８７ＭＧ細胞は、それらの細胞表面上にＦＡＰを発現し、それらは、本発明のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインによって結合される（上記参照）。更に、マウスにおけるＵ８７腫瘍も、予想されるようにＦＡＰを発現する（データは示さず）。

【0270】

マウスあたり１０００万個のＵ８７ＭＧ細胞を、雌ＣＤ１（ｎｕ／ｎｕ）マウスに皮下移植した。細胞を、２つの別個の場所（１つの場所につき５００万個の細胞）で移植し、マウス当たり２つの腫瘍を生じさせた。移植された腫瘍細胞を増殖させ、腫瘍体積が５００ｍｍ^３に達するまで、及びアンキリン反復融合タンパク質が投与されるまで、腫瘍を３～４週間増殖させた。

【0271】

投与のためのアンキリン反復融合タンパク質を調製するために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１を、当技術分野において既知の方法に従って、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１のＨｉｓタグとの複合体形成によって、９９ｍ－Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍで放射性標識した（例えば、Ｗａｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：８９７－９０１（１９９９）；Ｅｇｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：１９１３－１９１７（１９９９）を参照されたい）。対照化合物として、ＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインが非結合アンキリン反復ドメイン（すなわち、ＦＡＰに結合せず、既知の結合特異性を有さないアンキリン反復ドメイン）に置き換えられたことを除いて、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１と同一のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４３；配列番号４３）を使用した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４３は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１と同様に、９９ｍ－Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍで放射性標識した。

【0272】

３０匹の雌のＵ８７腫瘍を担持するＣＤ１（ｎｕ／ｎｕ）マウスを、２つの群に分けた。１つの群は、尾静脈への注射により、約３．６ＭＢｑ（約１ｍｇ／ｋｇ）のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１の単回投与量を受容した。他の群は、尾静脈への注射により、約３．６ＭＢｑ（約１ｍｇ／ｋｇ）のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４３の単回投与量を受容した。放射性標識されたアンキリン反復融合タンパク質の注射後の１時間、２４時間及び４８時間に生体分布を監視した。マウスを麻酔し、頸椎脱臼により殺傷し（１時点当たり５匹のマウス）、血液のアリコートを採取した。対象となる器官（例えば、腫瘍、脾臓、腎臓、肝臓、筋肉を含む）を抽出し、秤量し、放射能をγ－カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ ＩＩ Ｇａｍｍａ Ｄ５０１０、ＧＭＩ、ＵＳＡ）で測定した。血液中の測定された放射能に対する異なる器官において測定された放射能の比を計算した。

【0273】

図９は、注射から４８時間後のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１及び対照化合物ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４３の生体分布を示す。腎臓及び２つの腫瘍におけるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１については、高い器官／血液比が観察されたが、他の器官では観察されなかった。対照ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４３では、腎臓において高い器官／血液比が観察されたが、２つの腫瘍又は他の器官では観察されなかった。腎臓中のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４３について観察された高レベルの放射能は、腎臓がＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子の除去部位である可能性が高いためである。２つの腫瘍におけるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１について観察された高いレベルの放射能は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１のＦＡＰ標的化が、高い腫瘍蓄積及び保持をもたらしたことを示している。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１の血清半減期（上記参照）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１の循環からの予想されるクリアランスを考慮すると、注射から４８時間後にＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１について観察された高腫瘍／血液比もまた、ＦＡＰ標的化による腫瘍保持の延長を示す。まとめると、生体分布分析の結果は、本発明のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインを、生物学的活性分子（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１の血清アルブミン結合ドメインなど）に融合させ、ＦＡＰ発現腫瘍組織に生物学的活性分子を局在化させ、かつそれを保持させることができることを示している。したがって、本発明のＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメインを使用して、ＦＡＰ発現腫瘍において治療的に活性な分子（抗腫瘍剤など）を局在化させ、かつそれを保持させて、それにより、他の器官及び生物における治療的活性分子の潜在的な副作用を全体として低減することができる。

【0274】

実施例６：生物学的活性分子に融合したＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質は、腫瘍増殖を阻害し、腫瘍内のヒトＣＤ８ Ｔ細胞の密度を選択的に増加させる。
生物学的活性分子（免疫モジュレータ）に結合されたＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の、Ｔ細胞を刺激し、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍増殖を阻害する能力を、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（ＭｉＸｅｎｏ）で再構成されたＨＴ－２９結腸癌異種移植モデルにおいて試験した。このヒト化マウスモデルは、免疫チェックポイント及び共刺激薬の免疫刺激効果を試験するのに好適であることが記載されている。モデルを使用して、ＦＡＰ特異的アンキリン反復ドメイン及び生物学的活性分子を含む本発明の結合タンパク質が、腫瘍内Ｔ細胞浸潤を増加させ、腫瘍増殖を遅らせることができるかどうかを評価した。実験に使用した結合タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４５）は、ペプチドリンカー（配列番号３９）によってそのＣ末端で生物学的活性分子としてのアゴニストＴ細胞共刺激受容体（ＴＣＣＲ）特異的アンキリン反復タンパク質に連結された配列番号３４を含んでいた。ＴＣＣＲの分子同一性は、２０１９年６月４日に米国特許商標庁で出願され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧに譲渡された、「Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題する米国仮特許出願第６２／８５７，０３７号、及びＰＣＴ国際特許出願（このＰＣＴ出願の出願日に出願された米国仮特許出願第６２／８５７，０３７号に対する優先権を主張する）に開示されている。ＴＣＣＲ及び他の免疫モジュレータは当技術分野で周知である（例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｇａｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５９１－６１９（２００９）を参照されたい）。このモデルにおける標的とされるＴＣＣＲに対するモノクローナル抗体による治療は、腫瘍増殖を有意に遅らせるのに十分であったが、それはまた、加速された移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び肝臓Ｔ細胞浸潤などの強力な全身効果を誘発し、未処置マウスと比較して早期死亡をもたらした。

【0275】

材料及び方法：
腫瘍実験：免疫不全ＮＯＧマウスの右側腹部にＨＴ－２９腫瘍細胞（３．５×１０^６）を皮下接種した。次いで、２人の健常なヒトドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を注射する（３．５×１０^６細胞／マウス）ことにより、マウスをヒト化した。試験物を、表８に示すように、所定のレジメンに従って、腫瘍を有するマウスに投与した。

【0276】

【表8】

【0277】

腫瘍細胞及びＰＢＭＣの接種日を０日目とした。腫瘍増殖を３～４日毎に監視した。実験の１８日目に、マウスを殺処分し、腫瘍を取り出し、フローサイトメトリー及び定量的免疫蛍光（ＱＩＦ）により研究した。腫瘍増殖分析は、マウスがそれ以降、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の徴候を示し始めたため、１８日間に限定された。

【0278】

フローサイトメトリー：生ＦＣＳファイルからのデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。細胞を、ヒト表面マーカＣＤ４５、ＣＤ４、及びＣＤ８を発現する生リンパ球上でゲーティングした。死細胞を、生－死細胞ラベリング染料７－ＡＡＤの組み込みを介して分析から除外した。ヒトＣＤ８ Ｔ細胞の割合を、血液中で検出された全ヒトＣＤ４５陽性細胞の割合として示す。

【0279】

免疫組織化学：組織を剖検でマウスから回収し、凍結組織切片作製用包埋剤（optimum cutting temperature compound）（Ｓａｋｕｒａ）に包埋し、事前に固定することなく凍結した。ＯＣＴ包埋凍結保存試料を７μｍの切片に切断し、スライドガラス上に取り付けた。スライドを冷アセトンで固定した。複数の免疫蛍光染色を、以下の抗体：抗ＣＤ４（ヤギＰａｂ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ＃ＡＦ－３７９－ＮＡ）、抗ＣＤ８（ウサギＰＡｂ、Ａｂｃａｍ＃ａｂ４０５５５）及び抗ＣＤ４５（クローンＨＩ３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０４００２）を用いて行った。これらの抗体は、それぞれ抗ヒツジ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ＃Ａ２１４４８）、抗ウサギ－ローダミンＲｅｄ（商標）Ｘ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃７１１－２９６－１５２）、及び抗マウスＩｇＧ１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１１５－５４５－２０５）によって検出した。画像をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１スライドスキャナ上で取得した。画像をＺｅｎｂｌｕｅソフトウェアで転送し、ＩｍａｇｅＪ １．５１ｎソフトウェアとＦＩＪＩパッケージを使用して分析し、ヒトＣＤ４５、ＣＤ８、及びＣＤ４Ｔ細胞の数が定量化した。

【0280】

統計分析：統計分析を、Ｐｒｉｓｍ ７．０．２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を用いて行った。反復測定二元配置分散分析及びテューキーの多重比較検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、Ｖｅｒｓ．７．０２）を使用して、腫瘍増殖及び体重データを、統計的有意差について分析した。生存曲線を、カプラン－マイヤー法によって分析し、ログランク検定によって比較した。試験終了時のフローサイトメトリーデータを、一元配置分散分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、Ｖｅｒｓ．７．０２）を使用して分析した。両側のＰ＜０．０５は、統計的に有意であると見なされた。

【0281】

結果
腫瘍増殖：腫瘍増殖を、経時的に個々に追跡した。独立標本Ｔ検定を使用して腫瘍接種後１８日目に得られたデータについて実施した統計分析に加えて、腫瘍増殖データを、反復測定二元配置分散分析、続いてテューキーの多重比較検定を使用することによって統計的有意差について分析した。腫瘍増殖阻害を表９に要約する。

【0282】

【表9】

【0283】

腫瘍増殖曲線全体の分析は、試験の終了時の最終腫瘍体積のみの分析と比較して、分析に高い力を与える。２つの分析は、良好に相関する。腫瘍増殖は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４５処置群で遅延した（ｐ＜０．００１）。投与されたビヒクルは、腫瘍増殖に有意な影響を与えなかった。要約すると、試験物質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４５は、皮下ＨＴ－２９ヒト結腸がんＭｉＸｅｎｏモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を示した。

【0284】

血液及び腫瘍の免疫表現型検査：フローサイトメトリーによって得られた結果を確認するために、１８日目に切除された腫瘍における組織学検査によって、ヒトＣＤ４及びＣＤ８ Ｔリンパ球密度を分析した。組織学的検査は、１群当たり５匹のマウスからの組織を使用して行った（データは示さず）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４５での処置は、ビヒクル群と比較して、ヒトＣＤ８ Ｔリンパ球のより深い浸潤をもたらした。この差は有意に達した（Ｐ＜０．０１）。一方、ＣＤ４腫瘍浸潤リンパ球の数は、群にわたって有意に異なるものではなかった。

【0285】

肝臓Ｔ細胞浸潤の組織学的分析：１８日目に切除した肝臓の組織学的検査を、１群当たり５匹のマウスからの組織を使用して行った。小さい、中間、及び大きい表面積として分類された浸潤物の定量は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４５による処置が、肝臓Ｔ細胞浸潤の増加を誘発しなかったことを示した。これは、抗ＴＣＣＲモノクローナル抗体の投与がＮＯＧマウスのヒトＰＢＭＣによる肝臓Ｔ細胞浸潤の増加を誘導したことを示す公開された結果とは対照的である。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４５による処置はまた、未処置のマウスと比較して、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の加速を誘発したり、早期死亡を引き起こしたりしなかった。

【0286】

結論
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４５は、皮下ＨＴ－２９ヒト結腸がんＭｉＸｅｎｏモデルにおいて有意な抗腫瘍活性を示した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４５による処置は、ビヒクル処置マウスと比較して、腫瘍内のヒトＣＤ８ Ｔ細胞の密度の増加をもたらした。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４５による処置は忍容性が高く、体重減少又は生存率の低下をもたらさず、ビヒクル群と比較して肝臓Ｔ細胞浸潤の増加を生じなかった。

【0287】

実施例７：ＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の結合時のＦＡＰ機能活性の特性評価
ＦＡＰの機能活性に対するアンキリン反復結合の効果を評価するために、ＦＡＰ酵素活性を阻害する能力について、選択されたＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質を試験した。この目的のため、蛍光発生基質上のＦＡＰのプロリルエンドペプチダーゼ活性を、ＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の存在下及び非存在下で測定した。

【0288】

簡単に言うと、ヒトＦＡＰタンパク質、Ｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ蛍光発生基質（Ｂａｃｈｅｍ）及び過剰のＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質を、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．５）中で希釈し、Ｆ１６ Ｂｌａｃｋ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに、ウェル当たり１００μｌの総最終容量について、０．１μｌ／ｍｌのヒトＦＡＰ、５０μＭの基質、及び１１２倍モル過剰のアンキリン反復タンパク質（ｈＦＡＰを超える）の最終濃度で添加した。室温で７５分後、それぞれ３８０ｎｍと４６０ｎｍの励起波長及び発光波長を使用して、ｈＦＡＰによる基質の切断を、Ｔｅｃａｎ １０００リーダーで測定した。５０μＭの基質１００μｌを基質ブランク（バックグラウンド対照として）に装填し、アンキリン反復タンパク質を有さない試料（アッセイ緩衝液で置き換えた）を使用して、ＦＡＰの最大活性を決定した。バックグラウンドの正規化の後、所定のアンキリン反復タンパク質の存在下で残されたＦＡＰ活性の割合を、アンキリン反復の存在下でのＦＡＰ活性の最大ＦＡＰ活性に対する比に基づいて決定した。ＦＡＰ特異的アンキリン反復タンパク質の選択されたパネルの結果を表１０に要約する。選択されたアンキリン反復タンパク質のいずれも、ＦＡＰ酵素活性を有意に阻害しなかった。

【0289】

【表10】

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【配列表】

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