特許 7611593 ＨＤＡＣ分解剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-26

(45)【発行日】2025-01-10

(54)【発明の名称】ＨＤＡＣ分解剤

(51)【国際特許分類】

   C07D 207/16 20060101AFI20241227BHJP

   C12N 9/99 20060101ALI20241227BHJP

   C12N 9/14 20060101ALI20241227BHJP

   C07D 401/04 20060101ALI20241227BHJP

   C07D 417/12 20060101ALI20241227BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20241227BHJP

   A61K 31/454 20060101ALI20241227BHJP

   A61K 31/427 20060101ALI20241227BHJP

   A61K 31/40 20060101ALI20241227BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241227BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241227BHJP

   C07D 417/14 20060101ALI20241227BHJP

【ＦＩ】

C07D207/16

C12N9/99

C12N9/14

C07D401/04 CSP

C07D417/12

A61K47/55

A61K31/454

A61K31/427

A61K31/40

A61P35/00

A61P43/00 105

C07D417/14

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2022543780

(86)(22)【出願日】2021-01-22

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-15

(86)【国際出願番号】 GB2021050156

(87)【国際公開番号】W WO2021148811

(87)【国際公開日】2021-07-29

【審査請求日】2023-07-21

(31)【優先権主張番号】2001023.7

(32)【優先日】2020-01-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】517298220

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ レスター

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】カウリー，ショーン

(72)【発明者】

【氏名】ホジキンソン，ジェイムス

(72)【発明者】

【氏名】クロス，ジャスミン エム．

(72)【発明者】

【氏名】シュワべ，ジョン

(72)【発明者】

【氏名】スマリー，ジョシュア

(72)【発明者】

【氏名】アダムス，グレース

(72)【発明者】

【氏名】ミラード，クリス

【審査官】高森 ひとみ

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０２０／００２２９６６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１３－５０９４４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５２８８１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５２９５１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５２６４２９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｄ

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは互変異性型：

【化1】

式中、
Ｌは、－Ｌ ^１ －Ｌ ^２ －であるリンカーであり、前記リンカーの骨格の長さは７～５０原子であり、ここで、
Ｌ ^１ は、存在しないか、または－Ｌ ^３ －Ｌ ^４ －Ｌ ^５ －Ｌ ^６ －であり、
Ｌ ^２ は、－Ｌ ^７ －Ｌ ^８ －Ｌ ^９ －Ｌ ^１０ －であり、ここで、
Ｌ ^３ は、置換されていてもよいＣ _１ ～Ｃ _６ アルキレン、置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _６ アルケニレン、または置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _６ アルキニレンであり；
Ｌ ^４ はＮＲ ^５ 、Ｏ、Ｓ、

【化2】

式中、アスタリスクは、Ｌ ^５ 、またはＬ ^５ がない場合はＬ ^６ への結合点を示す、
であり、
Ｌ ^５ は、存在しないか、置換されていてもよいＣ _１ ～Ｃ _６ アルキレン、置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _６ アルケニレン、もしくは置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _６ アルキニレン、置換されていてもよいＣ _６ ～Ｃ _１２ アリーレン、または置換されていてもよい５～１０員のヘテロアリーレンであり；
Ｌ ^６ は、置換されていてもよいＣ _６ ～Ｃ _１２ アリーレン、または置換されていてもよい５～１０員のヘテロアリーレンであり；
Ｌ ^７ は、存在しないか、置換されていてもよいＣ _１ ～Ｃ _６ アルキレン、置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _６ アルケニレン、または置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _６ アルキニレンであり；
Ｌ ^８ は、存在しないか、

【化3】

式中、アスタリスクはＬ ^９ への結合点を示す、
であり、
Ｌ ^９ は、置換されていてもよいＣ _１ ～Ｃ _２０ アルキレン、置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _２０ アルケニレン、または置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _２０ アルキニレンであり、前記アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン基の骨格は、ＯまたはＮＲ ^６ から選択される１つまたは複数のヘテロ原子によって中断されていてもよく、あるいは、
Ｌ ^９ は、

【化4】

式中、アスタリスクは、Ｌ ^１０ 、またはＬ ^１０ がない場合はＲ ^１ への結合点を示す、
であり、
Ｌ ^１０ は、存在しないか、Ｃ（Ｏ）または：

【化5】

式中、アスタリスクは、Ｒ ^１ への結合点を示す、
であり、
Ｌ ^１１ は、独立して、存在しないか、置換されていてもよいＣ _１ ～Ｃ _５ アルキレン、置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _５ アルケニレン、または置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _５ アルキニレンであり；
Ｌ ^１２ およびＬ ^１３ は、独立して、置換されていてもよいＣ _１ ～Ｃ _５ アルキレン、置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _５ アルケニレン、または置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _５ アルキニレンであり；
Ｘ ^８ ～Ｘ ^１２ は、独立して、ＯまたはＮＲ ^６ であり；
Ｒ ^５ およびＲ ^６ は、独立して、Ｈ、Ｃ _１ ～Ｃ _６ アルキル、Ｃ _２ ～Ｃ _６ アルケニル、またはＣ _２ ～Ｃ _６ アルキニルであり；
ｍは０、１～１０の整数であり；かつ、
ｎは１～１０の整数であり、
Ｒ^１は、Ｅ３リガーゼのＥ３リガンドであり、前記Ｒ ^１ が以下のいずれかであり、

【化6】

式中、
Ｘ ^１ ～Ｘ ^７ およびＸ ^１３ は、それぞれＮＨまたはＯであり；
Ｒ ^７ は、Ｈ、置換されていてもよいＣ _１ ～Ｃ _６ アルキル、置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _６ アルケニル、置換されていてもよいＣ _２ ～Ｃ _６ アルキニル、置換されていてもよいＣ _３ ～Ｃ _６ シクロアルキル、置換されていてもよい３～６員の複素環、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい５員もしくは６員のヘテロアリールであり、ここで、Ｒ ^７ が置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素環、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいヘテロアリールである場合、前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニル、前記シクロアルキル、前記複素環、前記フェニル、または前記ヘテロアリールは、置換されていないか、ハロゲン、オキソ、ＯＨまたはＮＨ _２ の１つまたは複数で置換されており；
各Ｒ^２は、独立して、ハロゲン、ＯＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_６アルキニル、Ｃ_６～Ｃ_１２アリール基、または５～１０員のヘテロアリール基であり；
Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、またはＣ_２～Ｃ_６アルキニルであり；
別段の指定がない限り、前記または各置換されていてもよいアルキレン、置換されていてもよいアルケニレン、置換されていてもよいアルキニレン、および置換されていてもよいヘテロアリーレンは、置換されていないか、ハロゲン、オキソ、ＯＨ、ＮＨ _２ 、Ｃ _１ ～Ｃ _６ アルキル、Ｃ _２ ～Ｃ _６ アルケニル、Ｃ _２ ～Ｃ _６ アルキニル、Ｃ _３ ～Ｃ _６ シクロアルキル、３～１０員の複素環、Ｃ _６ ～Ｃ _１２ アリールおよび／または５～１０員のヘテロアリールの、１つまたは複数で置換されており、前記または各置換されていてもよいアリーレンは、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ _２ 、Ｃ _１ ～Ｃ _６ アルキル、Ｃ _２ ～Ｃ _６ アルケニル、Ｃ _２ ～Ｃ _６ アルキニル、Ｃ _３ ～Ｃ _６ シクロアルキル、３～１０員の複素環、Ｃ _６ ～Ｃ _１２ アリールおよび／または５～１０員のヘテロアリールの、１つまたは複数で置換されており；
ｐは０または１～４までの整数である。

【請求項2】

ｐが０であるか、あるいはｐが１であり、前記式（Ｉ）の化合物が式（Ｉａｉｉｉ）または（Ｉａｉｖ）の化合物である、請求項１に記載の化合物：

【化7】

【請求項3】

Ｒ^１が：

【化8】

である、請求項１または２に記載の化合物。

【請求項4】

Ｘ^１、Ｘ^２およびＸ^７がＮＨであり、Ｘ^３およびＸ^１３がＯであり、Ｒ^７がメチルまたは：

【化9】

である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項5】

前記リンカーの骨格が７～４０原子の長さである、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項6】

Ｌ^１が：

【化10】

式中、アスタリスクは、Ｌ^２への結合点を示す、
であるか、あるいはＬ^１が存在しない、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項7】

Ｌ^２が：

【化11】

式中、アスタリスクは、Ｒ^１への結合点を示す、
である、請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項8】

Ｌ^２が：

【化12】

式中、
アスタリスクは、Ｒ^１への結合点を示し；
ｑは少なくとも５の整数であり；
ｒは少なくとも４の整数であり；
ｓは少なくとも２の整数であり；
ｔは少なくとも１の整数であり；
ｕは少なくとも３の整数であり；
ｖは少なくとも１の整数であり；かつ、
ｗは少なくとも２の整数である、
である、請求項７に記載の化合物。

【請求項9】

ｑは５～２０の整数であり；
ｒは４～２０の整数であり；
ｓは２～１０の整数であり；
ｔは１～１０の整数であり；
ｕは３～１５の整数であり；かつ、
ｗは２～１４の整数である、請求項８に記載の化合物。

【請求項10】

Ｌが：

【化13】

式中、
アスタリスクは、Ｒ^１への結合点を示し；
ｑは少なくとも５の整数であり；
ｒは少なくとも４の整数であり；
ｓは少なくとも２の整数であり；
ｔは少なくとも１の整数であり；
ｕは少なくとも３の整数であり；
ｖは少なくとも１の整数であり；かつ、
ｗは少なくとも２の整数である、
である、請求項１～９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項11】

ｑが、５～２０の整数であり；
ｒが、４～２０の整数であり；
ｓは、２～１０の整数であり；
ｔは、１～１０の整数であり；
ｕは、３～１５の整数であり；かつ、
ｗは、２～１４の整数である、請求項９または請求項１０に記載の化合物。

【請求項12】

前記式（Ｉ）の化合物が式（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）または（Ｉｆ）の化合物である、請求項１に記載の化合物：

【化14】

【請求項13】

式（Ｉｃ）の化合物でありｑが１１であるか、または式（Ｉｄ）の化合物でありｒが１０である、請求項１２に記載の化合物。

【請求項14】

式（１０１）～式（１１６）のいずれかの化合物である、請求項１に記載の化合物：

【化15-1】

【化15-2】

【化15-3】

【化15-4】

【請求項15】

請求項１～１４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される錯体、塩、溶媒和物、もしくは互変異性型、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。

【請求項16】

請求項１～１４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される錯体、塩、溶媒和物、もしくは互変異性型、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、対象の癌を治療するための医薬組成物。

【請求項17】

前記癌が血液癌、腸癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、または皮膚癌である、請求項１６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、酵素のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリー、特にコリプレッサー錯体に存在するＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２およびＨＤＡＣ３を分解し得る化合物に関する。本発明は、これらの化合物を含む医薬組成物、および治療におけるこれらの化合物の使用に及ぶ。本発明は、これらの化合物が癌を治療するためにどのように使用され得るかを説明する。

【背景技術】

【0002】

ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）ファミリーの酵素は、しばしばエピジェネティックな消去因子と呼ばれ、ヒストン尾部からアセチル部分を除去することによって機能し、それによってクロマチン構造および遺伝子発現を変更する。現在、５つのＨＤＡＣ阻害剤が、Ｔ細胞リンパ腫および多発性骨髄腫を他の化合物とともに治療する臨床試験での臨床使用が承認されている。ヒトには１８個のＨＤＡＣ酵素が含まれており、そのうち１１個は触媒部位に２価の亜鉛カチオンを有し、７個のサーチュインはその活性がＮＡＤ＋に依存している。バルプロ酸またはＳＡＨＡ（Ｚｏｌｉｎｚａ）などのＺｎ^２＋依存性酵素の阻害剤は、ＣＴＣＬおよび双極性障害の治療に現在臨床で使用されている。しかしながら、これらの薬剤は限られた選択性を示し、この選択性の欠如は、ＨＤＡＣ阻害薬を使用している患者が示す衰弱性の副作用の原因であると考えられてきた。

【0003】

ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＨＤＡＣ３は核に局在し、全細胞デアセチラーゼ活性の約５０％を構成し、遺伝子発現において最も顕著なＨＤＡＣである。それらは単一の存在として機能しないが、Ｓｉｎ３、ＮｕＲＤ、ＣｏＲＥＳＴ、ＭｉＤＡＣ、およびＮＣｏＲなどのはるかに大きなマルチタンパク質コリプレッサー錯体の触媒サブユニットとしてインビボで存在する。これらの錯体は、ゲノムの特定の領域にＨＤＡＣ酵素を組み込む重要な役割を果たし、異なる細胞型の機能を示す。

【0004】

本発明は、酵素のＨＤＡＣファミリーを標的とする他の化合物を開発しようとする発明者らの研究から生じたものである。

【発明の概要】

【0005】

第１の態様によれば、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形型が提供される：

【0006】

【化1】

【0007】

式中、
Ｌは、少なくとも１つの基を含む骨格を有するリンカーであり、前記基または各基は、独立して、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３０アルケニレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３０アルキニレン、ＮＲ^３、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリーレン、および置換されていてもよい５～１０員のヘテロアリーレンからなるリストから選択され、前記リンカーの骨格の長さは７～５０原子であり；
Ｒ^１は、Ｅ３リガンドであり；
各Ｒ^２は、独立して、ハロゲン、ＯＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_６アルキニル、Ｃ_６～Ｃ_１２アリール基、または５～１０員のヘテロアリール基であり；
Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、またはＣ_２～Ｃ_６アルキニルであり；
ｐは０または１～４までの整数である。

【0008】

前記式（Ｉ）の化合物は、タンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）である。ＰＲＯＴＡＣは、目的のタンパク質（ＰＯＩ）のリガンドをＥ３リガンドのリガンドと結合させるヘテロ二官能性分子であり、Ｅ３リガーゼを動員してＰＯＩのポリユビキチン化および分解をもたらす。有利なことに、式（Ｉ）の化合物は、ＨＤＡＣ酵素とのタンパク質間相互作用および分解の成功を誘導し得る。特に、本発明者らは、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞株において、式（Ｉ）の化合物がヒストンアセチル化レベルを上昇させ、臨床候補ＣＩ－９９４に匹敵する細胞生存率を低下し得ることを見出した。

【0009】

本発明者らが知る限り、ＣＩ－９９４などの選択的ベンズアミドＨＤＡＣ阻害剤を摂取し、それをＰＲＯＴＡＣに変換し、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＨＤＡＣ３の分解を示したのはこれが初めてである。疾患におけるＨＤＡＣ薬の意義および重要性、およびＰＲＯＴＡＣ技術の利点を考えると、医学的重要性および潜在的有用性は非常に高くなり得る。

【0010】

本明細書で使用される「アルキレン」という用語は、別段の指定がない限り、二価飽和直鎖炭化水素を指す。本明細書で使用される用語「アルケニレン」および「アルキニレン」は、別段の指定がない限り、それぞれ、二価オレフィン性不飽和直鎖炭化水素または二価アセチレン性不飽和直鎖炭化水素を指す。「アリーレン」という用語は、二価の芳香族６～１２員炭化水素基を指す。「ヘテロアリーレン」という用語は、少なくとも１個の環原子がヘテロ原子である二価の芳香族５～１０員環系を指す。

【0011】

前記または各置換されていてもよいアルキレン、置換されていてもよいアルケニレン、置換されていてもよいアルキニレン、および置換されていてもよいヘテロアリールは、置換されていないか、ハロゲン、オキソ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_６アルキニル、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキル、３～１０員の複素環、Ｃ_６～Ｃ_１２アリールおよび／または５～１０員の複素環の、１つまたは複数で置換され得る。前記または各置換されていてもよいアリールは、置換されていないか、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニルおよび／またはＣ_２～Ｃ_６アルキニル、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキル、３～１０員の複素環、Ｃ_６～Ｃ_１２アリールおよび／または５～１０員の複素環の、１つまたは複数で置換され得る。

【0012】

「リンカーの主鎖」という用語は、

【0013】

【化2】

【0014】

とＲ^１との間の結合原子の最短連続鎖を指すことが理解されよう。

【0015】

いくつかの実施形態において、ｐは１である。したがって、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａｉ）または（Ｉａｉｉ）の化合物であり得る：

【0016】

【化3】

【0017】

Ｒ^２は、ハロゲンまたは５員または１０員のヘテロアリール基であり得る。Ｒ^２が５員または１０員のヘテロアリール基である実施形態では、それは５員または６員のヘテロアリール基であり得る。したがって、Ｒ^２は、１Ｈ－ピロリル、フラニルまたはチオフェニルであり得る。Ｒ^２がハロゲンである実施形態では、それはフッ素、塩素、ヨウ素または臭素であり得る。好ましくは、Ｒ^２はフッ素または塩素であり、最も好ましくはフッ素である。

【0018】

したがって、前記式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａｉｉｉ）または式（Ｉａｉｖ）であり得る：

【0019】

【化4】

【0020】

他の実施形態では、ｐは０である。したがって、前記式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｂ）の化合物であってもよい：

【0021】

【化5】

【0022】

Ｅ３リガンドはＥ３リガーゼのリガンドであることが理解されよう。前記Ｅ３リガンドは、フォン・ヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ、セレブロンＥ３ユビキチンリガーゼ、ｃＩＡＰ１ Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはＭＤＭ２ Ｅ３ユビキチンリガーゼ、または生物学的に活性なアイソフォームまたはその類似体に対するものであり得る。これらのＥ３リガンドには多数の結合位置が可能であり、前記リンカーは可能な結合位置のいずれかでＥ３リガンドを結合し得ることが理解されよう。

【0023】

例として、Ｒ^１は次の構造を有し得る：

【0024】

【化6】

【0025】

式中、
Ｘ^１～Ｘ^７およびＸ^１３は、それぞれＮＨまたはＯであり、
Ｒ^７は、Ｈ、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニル、置換されていてもよいＣ_３～Ｃ_６シクロアルキル、置換されていてもよい３～６員の複素環、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい５員もしくは６員の複素環である。前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、複素環、フェニルまたはヘテロアリールは、置換されていないか、ハロゲン、オキソ、ＯＨまたはＮＨ_２の１つまたは複数で置換され得る。前記ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であってよく、好ましくはフッ素または塩素であり、より好ましくはフッ素である。

【0026】

より好ましくは、Ｒ^１は以下のものである：

【0027】

【化7】

【0028】

好ましくは、Ｘ^１およびＸ^２はＮＨである。好ましくはＸ^３はＯである。好ましくはＸ^６はＯである。好ましくはＸ^７はＮＨである。好ましくは、Ｘ^１３はＯである。

【0029】

好ましくは、Ｒ^７は、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニル、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニル、置換されていてもよいシクロプロピルまたは置換されていてもよい３員複素環である。より好ましくは、Ｒ^７はメチルまたは：

【0030】

【化8】

【0031】

である。

【0032】

最も好ましくは、Ｒ^１は、

【0033】

【化9】

【0034】

である。

【0035】

前記リンカーの骨格は、長さが７～４０原子、より好ましくは長さが８～３０原子、９～２５原子、１０～２０原子、または１１～１５原子、最も好ましくは、長さが１３原子であり得る。

【0036】

前記リンカーの骨格は、長さが７～４０原子、より好ましくは、長さが８～３０原子、９～２５原子、１０～２０原子、または１１～１８原子、最も好ましくは長さが１３～１６原子であり得る。

【0037】

実施例で説明したように、本発明者らは、より長いリンカー長を有する化合物についてインビボで特に有望な結果を得た。前記インビボでの結果は、リンカーが短い分子ほど活性が高いことを示していたため、これは驚くべきことである。さらに、本発明者らは、より長いリンカーを有する化合物が細胞膜を通過するのが困難であると予測したであろう。リンカーの長さが長い化合物ほど活性が高いという事実は、予測することができなかった。

【0038】

Ｌは、－Ｌ^１－Ｌ^２－であってよく、ここで、
Ｌ^１は、存在しないか、または－Ｌ^３－Ｌ^４－Ｌ^５－Ｌ^６－であり、
Ｌ^２は、－Ｌ^７－Ｌ^８－Ｌ^９－Ｌ^１０－であり、ここで、
Ｌ^３は、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニレン、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニレンであり；
Ｌ^４はＮＲ^５、Ｏ、Ｓ、

【0039】

【化10】

【0040】

であり、式中、アスタリスクは、Ｌ^５、またはＬ^５がない場合はＬ^６への結合点を示し；
Ｌ^５は、存在しないか、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニレン、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリーレン、または置換されていてもよい５～１０員のヘテロアリーレンであり；
Ｌ^６は、置換されていてもよいＣ_６～Ｃ_１２アリーレン、または置換されていてもよい５～１０員のヘテロアリーレンであり；
Ｌ^７は、存在しないか、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_６アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルケニレン、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_６アルキニレンであり；
Ｌ^８は、存在しないか、

【0041】

【化11】

【0042】

であり、式中、アスタリスクはＬ^９への結合点を示し；
Ｌ^９は、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_２０アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_２０アルケニレン、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_２０アルキニレンであり、前記アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン基の骨格は、ＯまたはＮＲ^６から選択される１つまたは複数のヘテロ原子によって中断されていてもよく、あるいは、
Ｌ^９は、

【0043】

【化12】

【0044】

であり、式中、アスタリスクは、Ｌ^１０、またはＬ^１０がない場合はＲ^１への結合点を示し；
Ｌ^１０は、存在しないか、Ｃ（Ｏ）または：

【0045】

【化13】

【0046】

であり、式中、アスタリスクは、Ｒ^１への結合点を示し；
Ｌ^１１は、存在しないか、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_５アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_５アルケニレン、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_５アルキニレンであり；
Ｌ^１２およびＬ^１３は、独立して、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_５アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_５アルケニレン、または置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_５アルキニレンであり；
Ｘ^８～Ｘ^１２は、独立して、ＯまたはＮＲ^６であり；
Ｒ^５およびＲ^６は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、またはＣ_２～Ｃ_６アルキニルであり；
ｍは、０、１～１０の整数であり；かつ、
ｎは、１～１０の整数である。

【0047】

いくつかの実施形態では、Ｌ^１は存在している。

【0048】

Ｌ^３は、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニレンであり得る。したがって、Ｌ^３は－ＣＨ_２－であり得る。

【0049】

Ｌ^４は、ＮＲ^５または、

【0050】

【化14】

【0051】

であり得る。好ましくは、Ｘ^８はＮＲ^５である。好ましくは、Ｘ^９はＯである。好ましくは、Ｒ^５はＨである。

【0052】

Ｌ^５は、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニレンであり得る。したがって、Ｌ^５は－ＣＨ_２－であり得る。

【0053】

あるいは、Ｌ^５は、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい５員もしくは６員ヘテロアリールであり得る。前記５員または６員ヘテロアリールは、置換されていてもよいピリジニル、置換されていてもよいピリダジニル、置換されていてもよいピリミジニルまたは置換されていてもよいトリアジニルであり得る。前記フェニルまたはヘテロアリールは非置換であり得る。

【0054】

あるいは、Ｌ^５が存在しなくてもよい。

【0055】

Ｌ^６は、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよい５員もしくは６員ヘテロアリールであり得る。前記５員または６員ヘテロアリールは、置換されていてもよいピロリル、置換されていてもよいイミダゾリル、置換されていてもよいピラゾリル、置換されていてもよいトリアゾリル、置換されていてもよいピリジニル、置換されていてもよいピリダジニル、置換されていてもよいピリミジニルまたは置換されていてもよいトリアジニルであり得る。前記フェニルまたはヘテロアリールは、非置換であるか、フェニルまたは５員もしくは６員ヘテロアリールで置換され得る。

【0056】

したがって、いくつかの実施形態では、Ｌ^１は：

【0057】

【化15】

【0058】

であってよく、アスタリスクは、Ｌ^２への結合点を示す。

【0059】

あるいは、Ｌ^１が存在しなくてもよい。

【0060】

Ｌ^７は、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキレンまたは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキレンであり得る。したがって、Ｌ^７は－ＣＨ_２－であり得る。

【0061】

いくつかの実施形態では、Ｌ^７は存在しない。

【0062】

Ｌ^８は：

【0063】

【化16】

【0064】

であり得る。好ましくは、Ｘ^１０はＮＲ^６である。好ましくは、Ｒ^６はＨである。

【0065】

いくつかの実施形態では、Ｌ^８は存在しない。

【0066】

いくつかの実施形態では、Ｌ^９は、置換されていてもよいＣ_５～Ｃ_１５アルキレン、置換されていてもよいＣ_５～Ｃ_１５アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_５～Ｃ_１５アルキニレンであり得る。アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン基の骨格は、いかなるヘテロ原子によっても中断されてはならない。より好ましくは、Ｌ^９は、置換されていてもよいＣ_８～Ｃ_１３アルキレン、置換されていてもよいＣ_８～Ｃ_１３アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_８～Ｃ_１３アルキニレンであり、最も好ましくはＣ_１０～Ｃ_１２アルキレンである。したがって、いくつかの実施形態では、Ｌ^９は－（ＣＨ_２）_１１－であり得る。

【0067】

あるいは、Ｌ^９は、置換されていてもよいＣ_３～Ｃ_１０アルキレン、置換されていてもよいＣ_３～Ｃ_１０アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_３～Ｃ_１０アルキニレンであり得る。アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン基の骨格は、いかなるヘテロ原子によっても中断されてはならない。より好ましくは、Ｌ^９は、置換されていてもよいＣ_５～Ｃ_９アルキレン、置換されていてもよいＣ_５～Ｃ_９アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_５～Ｃ_９アルキニレンであり、最も好ましくはＣ_６～Ｃ_８アルキレンである。したがって、いくつかの実施形態では、Ｌ^９は－（ＣＨ_２）_７－であり得る。

【0068】

あるいは、Ｌ^９は、置換されていてもよいＣ_３～Ｃ_１５アルキレン、置換されていてもよいＣ_３～Ｃ_１５アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_３～Ｃ_１５アルキニレンであってよく、前記アルキレン基、アルケニレン基またはアルキニレン基の骨格は、１つまたは複数のヘテロ原子によって中断される。より好ましくは、Ｌ^９は、置換されていてもよいＣ_５～Ｃ_１２アルキレン、置換されていてもよいＣ_５～Ｃ_１２アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_５～Ｃ_１２アルキニレンであり、最も好ましくはＣ_７～Ｃ_１０アルキレンアルキニレンであり、前記アルキレン基、アルケニレン基またはアルキニレン基の骨格は、１つまたは複数のヘテロ原子によって中断されている。好ましくは、前記アルキレン基、アルケニレン基またはアルキニレン基の骨格は、１～４、より好ましくは１～３、最も好ましくは１～２のヘテロ原子によって中断される。好ましくは、前記または各ヘテロ原子はＯである。

【0069】

いくつかの実施形態では、Ｌ^９は：

【0070】

【化17】

【0071】

であってよく、式中、ｖは少なくとも１の整数であり、ｗは少なくとも２の整数であり、アスタリスクはＬ^１０、またはＬ^１０が存在しない場合にはＲ^１への結合点を示す。

【0072】

他の実施形態では、Ｌ^９は：

【0073】

【化18】

【0074】

であり得る。Ｌ^１１は、独立して、存在しないか、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニレンであり得る。より好ましくは、Ｌ^１１はＣＨ_２である。Ｌ^１２は、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニレンであり得る。いくつかの実施形態では、Ｌ^１２は－ＣＨ_２ＣＨ_２－である。ｎは１～５までの整数である。いくつかの実施形態では、ｎは１、２または３であってもよい。Ｌ^１３は独立して、置換されていてもよいＣ_１～Ｃ_３アルキレン、置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルケニレンまたは置換されていてもよいＣ_２～Ｃ_３アルキニレンであり得る。より好ましくは、Ｌ^１３はＣＨ_２である。いくつかの実施形態では、ｍは０である。他の実施形態では、ｍは１である。

【0075】

いくつかの実施形態では、Ｌ^１０はＣ（Ｏ）である。

【0076】

他の実施形態では、Ｌ^１０は存在しない。

【0077】

したがって、Ｌ^２は：

【0078】

【化19】

【0079】

であってよく、アスタリスクは、Ｒ^１への結合点を示す。

【0080】

好ましい実施形態では、Ｌ^２は：

【0081】

【化20】

【0082】

であってよく、式中、
アスタリスクは、Ｒ^１への結合点を示し；
ｑは少なくとも５の整数であり；
ｒは少なくとも４の整数であり；
ｓは少なくとも２の整数であり；
ｔは少なくとも１の整数であり；
ｕは少なくとも３の整数であり；
ｖは少なくとも１の整数であり；かつ、
ｗは少なくとも２の整数である。

【0083】

好ましい実施形態では、Ｌは、

【0084】

【化21】

【0085】

であってよく、式中、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗは上記で定義した通りである。

【0086】

好ましくは、ｑは５～２０、より好ましくは７～１５、最も好ましくは１０～１２の整数である。いくつかの実施形態では、ｑは５、８または１１である。好ましい実施形態では、ｑは１１である。

【0087】

好ましくは、ｒは４～２０、より好ましくは７～１５、最も好ましくは９～１１の整数である。いくつかの実施形態では、ｒは４、７、１０または１２である。好ましい実施形態では、ｒは１０である。他の実施形態では、ｒは１２である。

【0088】

好ましくは、ｓは２～１０、より好ましくは２～５の整数である。好ましい実施形態では、ｓは２または３である。

【0089】

好ましくは、ｔは１～１０、より好ましくは１～５の整数である。好ましい実施形態では、ｔは１または２である。

【0090】

好ましくは、ｕは、２～１５、３～１２、４～１０、または６～８の整数である。いくつかの実施形態では、ｕは７である。

【0091】

好ましくは、ｖは１～１３、３～１２、４～１０、または６～９の整数である。いくつかの実施形態では、ｖは６である。他の実施形態では、ｖは９である。

【0092】

好ましくは、ｗは、２～１４、３～１２、５～１０、または７～９の整数である。いくつかの実施形態では、ｗは８である。

【0093】

式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）または（Ｉｆ）の化合物であり得る：

【0094】

【化22】

【0095】

式中、ｑ、ｒ、ｓおよびｔは上記で定義した通りである。

【0096】

式（Ｉ）の化合物は、式（１０１）～（１１６）の化合物であり得る：

【0097】

【化23-1】

【0098】

【化23-2】

【0099】

【化23-3】

【0100】

【化23-4】

【0101】

「薬学的に許容される塩」という用語は、その生物学的特性を保持し、毒性がなく、または、その他の点では薬学的使用に望ましくないものではない、本明細書で提供される化合物のいずれかの塩を指すと理解され得る。そのような塩は、当技術分野で公知の様々な有機対イオンおよび無機対イオンから誘導され得る。そのような塩には以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、アデピック、アスパラギン酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンチルプロピオン酸、グリコール酸、グルタル酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、ソルビン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ピクリン酸、桂皮酸、マンデル酸、フタル酸、ラウリン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４－クロロベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、カンファー酸、カンファースルホン酸、４－メチルビシクロ［２．２．２］－オクタ－２－エン－１－カルボン酸、グルコヘプトン、３－フェニルプロピオン、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ－ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、安息香酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、キナ酸、ムコン酸、およびそのような酸などの、有機酸または無機酸で形成される酸付加塩；または
（２）以下のいずれか一方である、親化合物に酸性プロトンが存在する場合に形成される塩基付加塩：
（ａ）金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンもしくはアルミニウムイオン、または水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化亜鉛、水酸化バリウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属水酸化物、アンモニアによって置換される、あるいは、
（ｂ）アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、Ｎ－メチルグルカミンピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウムなどの脂肪族、脂環式、または芳香族有機アミンなどの有機塩基と相互作用する。

【0102】

薬学的に許容される塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどが挙げられて、前記化合物が塩基性官能基を含む場合、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩、炭酸塩または炭酸水素塩、硫酸塩または硫酸水素塩、ホウ酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ピログルタミン酸塩、糖酸塩、ステアリン酸塩、スルファミン酸塩、硝酸塩、オロチン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸、パモ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンチルプロピオン酸、グリコール酸、グルタル酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、タン酸、酒石酸、トシル酸、ソルビン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、カンシル酸、クエン酸、シクラミン酸、安息香酸、イセチオン酸、エシル酸、ギ酸、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ピクリン酸、桂皮酸、マンデル酸、フタル酸、ラウリン酸、メタンスルホン酸（メシル酸）、メチル硫酸、ナフチル酸、２－ナプシル酸、ニコチン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸（ベシル酸）、４－クロロベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、４－メチルビシクロ［２．２．２］－オクタ－２－エン－１－カルボン酸塩、グルコヘプトン酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、酢酸トリメチル、酢酸ｔｅｒｔ－ブチル、硫酸ラウリル、グルセプト酸、グルコン酸、グルクロン酸、六フッ化リン酸、ヒベンズ酸、安息香酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、キナ酸、ムコン酸、キシノホ酸などの、毒性のない有機酸または無機酸の塩が挙げられる。

【0103】

酸および塩基のヘミ塩、例えば、ヘミ硫酸塩も形成され得る。

【0104】

「溶媒和物」という用語は、非共有分子間力によって結合された化学量論量または非化学量論量の溶媒をさらに含む、本明細書で提供される化合物またはその塩を指すと理解され得る。溶媒が水の場合、溶媒和物は水和物である。

【0105】

第２の態様では、治療に使用するための、第１の態様で定義した式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される錯体、塩、溶媒和物、互変異性体もしくは多形体が提供される。

【0106】

第３の態様では、癌の治療に使用するための、第１の態様で定義した式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される錯体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形型が提供される。

【0107】

第４の態様では、対象の癌を治療、予防、または改善する方法が提供され、この方法は、そのような治療を必要とする対象に、第１の態様で定義されるような治療有効量の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される錯体、塩、溶媒和物、互変異性型もしくは多形型を投与することを含む。

【0108】

前記癌は、固形腫瘍または固形癌であり得る。前記癌は、血液癌、腸癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、または皮膚癌であり得る。前記血液癌は、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫であり得る。前記リンパ腫は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）であり得る。前記腸癌は、結腸癌または直腸癌であり得る。前記脳腫瘍は、神経膠腫または神経膠芽腫であり得る。前記乳癌はＢＲＣＡ陽性乳癌であり得る。前記乳癌は、ＨＥＲ２陽性乳癌またはＨＥＲ２陰性乳癌であり得る。前記乳癌は、トリプルネガティブ乳癌であり得る。前記肝臓癌は、肝細胞癌であり得る。前記肺癌は、非小細胞肺癌、または小細胞肺癌であり得る。前記皮膚癌は黒色腫であり得る。

【0109】

本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、癌を治療、改善、または予防するための、単剤療法で使用され得る医薬品において（すなわち、阻害剤のみの使用）、使用され得ることが理解されるであろう。あるいは、前記阻害剤またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、癌を治療、改善、または予防するための既知の療法の補助として、または組み合わせて使用され得る。

【0110】

前記式（Ｉ）の化合物は、特に前記組成物が使用される方法に応じて、多くの異なる形態を有する組成物に組み合わせられ得る。したがって、例えば、前記組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または治療が必要な人や動物に投与され得る他のいずれかの適切な形態、の形態であり得る。本発明による薬剤のビヒクルは、それが投与される対象によって十分に許容されるものであるべきであることが理解されるであろう。

【0111】

前記式（Ｉ）の化合物を含む薬剤は、多くの方法で使用され得る。式（Ｉ）の化合物を含む組成物は、吸入（例えば、鼻腔内）によって投与され得る。組成物は、局所使用のために処方をもされ得る。例えば、クリームや軟膏を皮膚に塗布され得る。

【0112】

前記式（Ｉ）の化合物はまた、徐放または遅延放出デバイス内に組み込まれ得る。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入され得て、薬剤は数週間または数ヶ月にわたって放出されることがある。前記デバイスは、治療部位に少なくとも隣接して配置され得る。そのようなデバイスは、本発明に従って使用される阻害剤による長期治療が必要であり、通常は頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）を必要とする場合に特に有利であり得る。

【0113】

前記式（Ｉ）の化合物、および前記化合物を含む組成物は、血流への注射によって、または治療を必要とする部位、例えば癌性腫瘍またはそれに隣接する血流への直接注射によって対象に投与され得る。注射は、静脈内（ボーラスまたは注入）または皮下（ボーラスまたは注入）、皮内（ボーラスまたは注入）または筋肉内（ボーラスまたは注入）であり得る。

【0114】

好ましい実施形態において、前記式（Ｉ）の化合物は経口投与される。したがって、前記式（Ｉ）の化合物は、例えば、錠剤、カプセルまたは液体の形態で経口摂取され得る組成物内に含有され得る。

【0115】

必要とされる前記式（Ｉ）の化合物の量は、その生物学的活性およびバイオアベイラビリティによって決定され、これは投与様式、式（Ｉ）の化合物の物理化学的特性、および単剤療法として使用されているか、あるいは併用療法で使用されているか、に依存することが理解されるであろう。前記投与頻度はまた、治療される対象における式（Ｉ）の化合物の半減期によっても影響を受ける。投与される最適用量は、当業者によって決定され得て、使用中の前記特定の阻害剤、前記医薬組成物の強度、前記投与様式、および前記癌の進行によって変化する。治療を受ける前記特定の対象に依存する追加の要因により、対象の年齢、体重、性別、食事、投与時期などの投与量を調整する必要がある。

【0116】

前記式（Ｉ）の化合物は、治療する前記癌の発症前、発症中、または発症後に投与され得る。１日量は１回の投与で与えられ得る。あるいは、前記式（Ｉ）の化合物は、１日に２回またはそれ以上与えられて、かつ１日に２回与えられ得る。

【0117】

通常、前記式（Ｉ）の化合物の０．０１μｇ／ｋｇ体重～５００ｍｇ／ｋｇ体重の１日量を、癌の治療、改善または予防に使用され得る。より好ましくは、１日量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～４００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ体重～２００ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0118】

治療を受けている患者は、起床時に１回目の用量を服用し、その後夕方に２回目の用量を服用するか（２回の服用体制の場合）、その後３時間または４時間間隔で服用する。あるいは、徐放装置を使用して、反復用量を投与する必要なく、本発明による阻害剤の最適用量を患者に提供し得る。

【0119】

製薬業界で従来から使用されているものなどの既知の手順（例えば、インビボ実験、臨床試験など）を使用して、本発明による阻害剤および正確な治療計画（阻害剤の１日量および投与頻度など）を含む特定の製剤を形成し得る。本発明者らは、前記式（Ｉ）の化合物の使用に基づいて癌を治療するための医薬組成物を記載した最初の者であると信じている。

【0120】

したがって、第５の態様では、対象の癌を治療するための医薬組成物が提供され、前記組成物は、第１の態様で定義される式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される錯体、塩、溶媒和物、互変異性体型もしくは多形型、および薬学的に許容されるビヒクルを含む。

【0121】

前記医薬組成物は、癌の対象における治療的改善、予防または治療に使用され得る。

【0122】

前記医薬組成物は、癌を治療、改善、または予防するための既知の治療法をさらに含み得る。

【0123】

本発明はまた、第６の態様において、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される錯体、塩、溶媒和物、互変異性体もしくは多形体、および薬学的に許容されるビヒクル、の治療有効量を接触させることを含む、第５の態様による組成物の製造方法を提供する。

【0124】

「対象」は、脊椎動物、哺乳類、または家畜であり得る。したがって、本発明による式（Ｉ）の化合物、組成物および医薬品は、いずれかの哺乳動物、例えば家畜（例えばウマ）、ペットの治療に使用され得て、または他の獣医学的用途に使用され得る。しかしながら、最も好ましくは、前記対象はヒトである。

【0125】

式（Ｉ）の化合物の「治療有効量」は、対象に投与された場合、前記癌を治療するのに必要な薬物の量であるいずれかの量である。

【0126】

例えば、使用される式（Ｉ）の化合物の治療有効量は、約０．０１ｍｇ～約８００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇであり得る。前記式（Ｉ）の化合物の量は、約０．１ｍｇ～約２５０ｍｇであることが好ましく、約０．１ｍｇ～約２０ｍｇであることが最も好ましい。

【0127】

本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、医薬組成物の処方に有用であることが当業者に知られている、いずれかの既知の化合物、または公知の化合物の組み合わせである。

【0128】

一実施形態では、前記薬学的に許容されるビヒクルは固体であってよく、前記組成物は粉末または錠剤の形態であり得る。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、染料、増量剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味料、防腐剤、染料、コーティング、または錠剤崩壊剤、としても作用し得る１つまたは複数の物質を含み得る。前記ビヒクルはまた封入材料であり得る。粉末において、前記ビヒクルは、本発明による微粉化された活性剤（すなわち阻害剤）と混合された微粉化された固体である。錠剤において、前記阻害剤は、必要な圧縮特性を有するビヒクルと適切な割合で混合され、望ましい形状およびサイズに圧縮され得る。前記粉末および錠剤は、好ましくは９９％までの阻害剤を含有する。適切な固体ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂が挙げられる。他の実施形態では、前記薬学的ビヒクルはゲルであってよく、前記組成物はクリームなどの形態であり得る。

【0129】

しかしながら、前記薬学的ビヒクルは液体であってよく、前記薬学的組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル、および加圧組成物の調製に使用される。前記式（Ｉ）の化合物は、水、有機溶媒、両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪などの、薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁され得る。前記液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味料、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定剤、または浸透圧調節剤などの、他の適切な医薬品添加物を含み得る。経口および非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例としては、水（上記の添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコール、例えば、グリコール、および多価アルコールが挙げられる）およびその誘導体、並びに油（例えば、分別ココナッツオイルおよびラッカセイ油）が挙げられる。非経口投与の場合、前記ビヒクルは、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの、油性エステルでもあり得る。無菌液体ビヒクルは、非経口投与用の無菌液体形態組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。

【0130】

無菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内注射、髄腔内注射、硬膜外注射、腹腔内注射、静脈内注射、および特に皮下注射によって利用され得る。前記式（Ｉ）の化合物は、無菌水、生理食塩水、または他の適切な無菌注射媒体を使用して、投与時に溶解または懸濁され得る無菌固体組成物として調製され得る。

【0131】

前記式（Ｉ）の化合物および本発明の組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステルとその無水物にエチレンオキサイドとを共重合させたもの）などを含有する滅菌溶液または懸濁液の形態で投与され得る。本発明に従って使用される式（Ｉ）の化合物はまた、液体または固体組成物の形態で経口投与され得る。経口投与に適した組成物には、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、および散剤などの固体形態、並びに溶液、シロップ、エリキシル、並びに懸濁液などの液体形態が含まれる。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、エマルジョン、および懸濁液が挙げられる。

【0132】

本明細書に記載されたすべての特徴（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）、および／またはそのように開示されたいずれかの方法またはプロセスのすべてのステップは、そのような機能および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、いずれかの組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせられ得る。

【0133】

本発明をよりよく理解するために、また、本発明の実施形態がどのように実施されるかを示すために、例として添付の図面を参照する。

【図面の簡単な説明】

【0134】

【図1】図１は、ベンズアミドベースのＨＤＡＣ阻害剤を示している。ＣＩ－９９４は、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＨＤＡＣ３の選択的阻害、細胞増殖の阻害、アポトーシスの誘導、および抗腫瘍活性を示す。ＭＳ－２７５は、抗腫瘍活性を有するＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ３の選択的阻害剤で、現在、乳癌の第ＩＩＩ相臨床試験が行われている。ＭＧＣＤ０１０３は、固形腫瘍および非小細胞肺癌の臨床試験におけるＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、およびＨＤＡＣ１１阻害剤である。

【図2A】図２Ａは、ＣＩ－９９４がＨＤＡＣ２の結合ポケットに位置する場合、ＣＩ－９９４のアセチル基がＨＤＡＣ２触媒活性部位（ＰＤＢ：４ＬＹ１）から表面に露出する様子を示す模式図である。

【図2B】図２Ｂおよび図２Ｃは、本発明者らによって合成された化合物の構造を示す。

【図2C】図２Ｂおよび図２Ｃは、本発明者らによって合成された化合物の構造を示す。

【図3A】図３Ａは、ＬＳＤ１－ＣｏＲＥＳＴ－ＨＤＡＣ錯体によるＡＭＣ－蛍光ヒストン脱アセチル化酵素阻害アッセイを示すグラフである。

【図3B】図３Ｂは、２４時間後のＥ１４マウス胚性幹細胞におけるヒストン３リジン５６アセチル化（Ｈ３Ｋ５６Ａｃ）レベルを示す。ＣＩ－９９４＝４０μＭ、パノビノスタット＝３０ｎＭ

【図4A】図４Ａは、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞株を示した試薬で２４時間処理した後の、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＨＤＡＣ３抗体による免疫ブロットを示している。数値はＤＭＳＯコントロール＝１００％に対する百分率を表す。

【図4B】図４Ｂは、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞株における示された処理の２４時間後のヒストンＨ３リジン９アセチル化レベルを示している。

【図4C】図４Ｃは、不活性なＶＨＬジアステレオ異性体を含むＮＣ－ＰＲＯＴＡＣ４がＨＣＴ１１６細胞の分解を誘発しないことを示している。ＣＩ－９９４＝４０μＭ、パノビノスタット＝３０ｎＭ

【図5】図５は、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞株における化合物４およびＣＩ－９９４の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）データを示している。

【図6A】図６は、本発明者らによって合成されたさらなる化合物の構造を示す。

【図6B】図６は、本発明者らによって合成されたさらなる化合物の構造を示す。

【図7】図７は、２４時間処理後のＨＣＴ１１６細胞におけるＨＤＡＣ１／ＨＤＡＣ２のレベルに対する化合物２の効果を示す。

【図8】図８は、２４時間処理後のＨＣＴ１１６細胞におけるＨＤＡＣ１／ＨＤＡＣ２に対する他の代表的な化合物の効果を示している。

【発明を実施するための形態】

【0135】

実施例１：４つの予備的タンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）の合成
ＰＲＯＴＡＣ設計のために、本発明者らは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＨＤＡＣ３に対する選択性を示すベンズアミドベースのＨＤＡＣ阻害剤を選択した。ＣＩ－９９４（図１を参照）は、ＨＤＡＣ１に対して０．４１μＭ、ＨＤＡＣ３に対して０．７５μＭ、およびＨＤＡＣ８に対して約１００μＭのＫｉ値を報告している。この阻害剤は、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＨＤＡＣ３に関連する表現型を示し、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、インビトロおよびインビボで幅広い抗腫瘍活性を示す。ＣＩ－９９４はその抗腫瘍特性について臨床試験中であり、類似のベンズアミドＭＳ－２７５およびＭＧＣＤ０１０３（図１を参照）は現在、乳癌および非小細胞肺癌に対する第ＩＩＩ相臨床試験中である。より最近では、ＣＩ－９９４は、脊髄損傷後のマウスにおける神経保護効果、認知障害の治療、および心房細動の軽減についても報告されている。

【0136】

本発明者らは、類似のベンズアミド阻害剤のアセチル基が触媒活性部位から突出し、ＨＤＡＣ２において表面露出しているため（図２Ｂおよび図２Ｃに示されるＰＲＯＴＡＣ１～ＰＲＯＴＡＣ４を参照のこと）、フェニル部分のアセチル基からＣＩ－９９４を官能化した（図２Ａ）。したがって、本発明者らは、この位置での官能化がＨＤＡＣ結合を維持し得るという仮説を立てた。以前のＰＲＯＴＡＣ研究で、リンカーの長さが分解の誘導に重要な役割を果たすことが示されているように、短いアルキルリンカーの長さを用意し（ｎ＝６）、長いリンカーの長さを用意した（ｎ＝１２）。合成を早めるためにアルキルリンカーを選択した。２つの異なるＥ３リガンドもまた選択され；フォン・ヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）リガンド、およびＥ３リガンドの選択としてのセレブロンリガンド、並びにリンカーの長さもまた、Ｅ３リガーゼとのタンパク質間結合の成功、よって分解に影響を与え得る。

【0137】

実施例２：インビボでの予備的ＰＲＯＴＡＣの評価
本発明者らは、ＬＳＤ１－ＣｏＲＥＳＴ－ＨＤＡＣ１錯体を用いた確立された蛍光デアセチラーゼアッセイを使用して、彼らの予備的なＰＲＯＴＡＣをインビトロで評価した。この錯体を典型的なＨＤＡＣ多タンパク質錯体として使用して、そのようなヘテロ二官能性分子ＰＲＯＴＡＣ１～４が無傷の多タンパク質錯体の文脈でＨＤＡＣ酵素に依然として関与し得るかどうかを決定した。ＰＲＯＴＡＣ１～ＰＲＯＴＡＣ４のＩＣ_５０値は、陽性対照としてＣＩ－９９４と並べて決定され；陰性対照として、本発明者らは、Ｂｏｃ保護ＣＩ－９９４、化合物５をも合成した（図３参照）。化合物５は、ＨＤＡＣ活性部位で亜鉛をキレートすることができず、ＨＤＡＣ阻害を示さないはずである。

【0138】

考察
本発明者らは、ＣＩ－９９４が、文献と一致する約０．５μＭのＩＣ_５０値を有し、ＨＤＡＣ阻害を示さないことを観察した（図３Ａ参照のこと）。リンカー長が短い暫定的なＰＲＯＴＡＣ１およびＰＲＯＴＡＣ３はすべて、ＣＩ－９９４に直接匹敵するＩＣ_５０値でＣｏＲＥＳＴ錯体のＨＤＡＣ１に関与し、一方、より長いリンカー長であるＰＲＯＴＡＣ２およびＰＲＯＴＡＣ４は依然として阻害を維持していたが、ＰＲＯＴＡＣ１およびＰＲＯＴＡＣ３と比較して約１０～１５倍の阻害低下を有していた。

【0139】

実施例３：細胞内での予備的ＰＲＯＴＡＣの評価
本発明者らは、細胞におけるＨＤＡＣ活性に対するそれらの化合物の効果を評価することを進めた。以前の研究で、本発明者らは、アセチル化ヒストンＨ３ Ｌｙｓ５６（Ｈ３Ｋ５６ａｃ）が胚性幹（ＥＳ）細胞におけるＨＤＡＣ１の直接基質であることを実証した。

【0140】

考察
ＰＲＯＴＡＣ１～ＰＲＯＴＡＣ４が細胞内のＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＨＤＡＣ３の活性を低下させる能力を調べるために、彼らは定量的ウェスタンブロッティングを使用してＨ３Ｋ５６ａｃを測定することから開始した（図３Ｂを参照のこと）。ＣＩ－９９４および汎ＨＤＡＣ阻害剤パノビノスタットを陽性対照として使用した。Ｈ３Ｋ５６のアセチル化レベルは、予測通りパノビノスタットおよびＣＩ－９９４で増加し、興味深いことに、より長いリンカー長を有するＰＲＯＴＡＣ、すなわちＰＲＯＴＡＣ２およびＰＲＯＴＡＣ４のみが、アセチル化を同様のレベルまで増加させた（図３Ｂを参照のこと）。

【0141】

本発明者らは、ＰＲＯＴＡＣ１およびＰＲＯＴＡＣ３はインビトロで活性であるが、ＨＤＡＣ阻害または分解のための細胞標的に到達できない場合があると推測している。

【0142】

ＰＲＯＴＡＣ２およびＰＲＯＴＡＣ４がインビトロおよび細胞内でヒストン脱アセチル化活性を低下させるというコンフォメーションにより、本発明者らは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＨＤＡＣ３タンパク質存在量の定量化を進めた。ＥＳ細胞では部分的な分解が観察されたが（データは示していない）、分解はヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６でさらに顕著であった。２４時間後、用量依存的に分解が観察された（図４Ａを参照のこと）。ＶＨＬベースのＰＲＯＴＡＣ４は、Ｃｅｒｅｂｌｏｎ ＰＲＯＴＡＣ２よりも効果的な分解剤であった（図７を参照のこと）。ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２は、ＰＲＯＴＡＣ４を使用した１０μＭでほぼ完全に分解されたが、ＨＤＡＣ３レベルも低下した。１μＭでは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＨＤＡＣ３で約５０％の分解が観察された。興味深いことに、１０ｎＭのＰＲＯＴＡＣ４でさえ、完全なＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２レベルは回復しなかった。

【0143】

ＰＲＯＴＡＣ４を用いて２４時間処理した後のＨＣＴ１１６細胞において、ＨＤＡＣ活性のもう１つの確立された残基であるヒストンＨ３ Ｌｙｓ９（Ｈ３Ｋ９ａｃ）のアセチル化レベルも測定された。１０μＭのＰＲＯＴＡＣ４アセチル化レベルは、ＤＭＳＯコントロールと比較して非常に上昇し（図４Ｂ）、１０μＭでのＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２レベルの減少と一致した（図４Ａ）。しかし、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２およびＨＤＡＣ３を含む１μＭでは、約４０～４８％のレベルで、Ｈ３Ｋ９アセチル化レベルはＤＭＳＯコントロールと同様であった。少なくともＨ３Ｋ９ａｃにおいて、アセチル化が大幅に増加していることを示しており、ほぼ完全なＨＤＡＣの分解が必要であり、部分的な分解では十分ではない。ＨＤＡＣ分解がＶＨＬ媒介プロテアソーム分解経路を介して起こっていることを確認するために、本発明者らは、ＶＨＬの不活性ジアステレオ異性体を有するＮＣ－ＰＲＯＴＡＣ４を合成した（図４Ｃ）。ＰＲＯＴＡＣ４と並べて比較した場合、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２の分解は観察されず、ＶＨＬを介したＥ３リガーゼ経路を介して分解が起こっていることが確認された。

【0144】

実施例４：蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣ）を使用した結腸癌ＨＣＴ１１６細胞株の細胞周期に対するＰＲＯＴＡＣ４の効果の評価
次に、本発明者らは、結腸癌ＨＣＴ１１６細胞株における細胞周期に対するＰＲＯＴＡＣ４の効果を調査した。

【0145】

４８時間後、１０μＭのＰＲＯＴＡＣ４で有意な細胞死が観察された（図５）。４０μＭにおいて、４８時間後の細胞死は、ＣＩ－９９４と同様のレベルであった。ＰＲＯＴＡＣ４の細胞生存率に対する効果はＣＩ－９９４に匹敵するものであったが、インビトロにおけるＬＳＤ１－ＣｏＲＥＳＴ－ＨＤＡＣ１錯体に対するＰＲＯＴＡＣ４のＩＣ_５０は１６．８μＭであり、ＣＩ－９９４の０．５μＭと比較して、ＰＲＯＴＡＣ４では１０μＭでほぼ完全なＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２の分解が観察されることに注意することが重要である。したがって、ＰＲＯＴＡＣ４で観察された表現型は、細胞内のＣｏＲＥＳＴ錯体並びに他のＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２含有錯体の阻害ではなく、分解による可能性が最も高い。

【0146】

実施例５：さらなるＰＲＯＴＡＣの合成
本発明者らは、ＰＲＯＴＡＣ５～ＰＲＯＴＡＣ１０をさらに合成した（図２Ｂ、図２Ｃ、図６Ａ、および図６Ｂを参照のこと）。

【0147】

実施例６：さらなるＰＲＯＴＡＣの合成および評価
本発明者らはさらに以下のＰＲＯＴＡＣを合成した。

【0148】

【化24-1】

【0149】

【化24-2】

【0150】

【化24-3】

【0151】

前記化合物は、ＨＣＴ１１６細胞系において０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭでスクリーニングされた。濃度に関係なく、観察された最大の分解が記録された。新規の化合物のスクリーニングは、スループットを向上させるためにウェルあたり４００，０００細胞の６ウェルプレート、５ｍＬ培地で行った。図８に代表的な化合物を示す。

【0152】

前記化合物の活性を分析し、ＰＲＯＴＡＣ４と比較し、結果を以下の表に示す。ＣＩ－９９４およびＢｏｃＣＩ－９９４は、それぞれＣｏＲＥＳＴ、ＮｕＲＤ、ＭｉＤＡＣ、およびＳＭＲＴアッセイのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして提供される。

【0153】

ＰＲＯＴＡＣ４のＩＣ_５０値は、アッセイが異なる条件下で実行されたため、図３のものとは異なることに注意すること。

【0154】

【表1】

【0155】

【表2】

【0156】

考察
本発明者らは、ＣｏＲＥＳＴ、ＮｕＲＤ、ＭｉＤＡＣおよびＳＭＲＴ錯体においてＣＩ－９９４に匹敵するＩＣ_５０値を有する多数の化合物を合成した。さらに、細胞においてテストした場合、前記化合物はＨＤＡＣ分解剤でもあることが見出された。

【0157】

理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、低い分解が観察される場合、ＰＲＯＴＡＣが特定の錯体を標的にしていることを示し得ることに注目する。例えば、ＰＲＯＴＡＣ２２のヘッド基のチオフェン基は、ＰＲＯＴＡＣをＣｏＲＥＳＴに対して選択的にすると考えられている。したがって、この化合物で観察される比較的低い％のＨＤＡＣ分解は、この選択性によるものであり得る。

【0158】

結論
ＰＲＯＴＡＣアプローチは多くのタンパク質標的に適用されているが、重要なことに、すべてのタンパク質が分解しやすいわけではない。これは、非選択的パンキナーゼ阻害剤に基づくＰＲＯＴＡＣで観察されている。錯体を形成しない、細胞質に局在するＨＤＡＣ６もまた最近、ヒドロキサム酸ベースのＰＲＯＴＡＣによる分解の優先的な標的として同定された。本発明者らは、多タンパク質コリプレッサー錯体の構成要素である核局在ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２およびＨＤＡＣ３のデグレーダーを同定した。細胞内の特定のＨＤＡＣマーカーのアセチル化レベルに大きな影響を与えるには、ほぼ完全なＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＨＤＡＣ３の分解が必要である。しかしながら、潜在的な複雑な選択的分解因子により、全体的なアセチル化レベル、および特定のＨＤＡＣアセチル化マーカーが予測され、汎ＨＤＡＣ阻害剤と比較して増加していない場合があるが、特定の疾患に関連するＨＤＡＣコリプレッサー錯体に対して、より高い有効性または副作用の軽減を示しうる。意外なことに、本発明者らは、アルキルリンカーの長さが細胞透過性にとって重要であることを発見した。化合物１および化合物３は、化合物２および化合物４よりも分子量が低く、インビトロでのＨＤＡＣ阻害剤が優れているにもかかわらず、細胞内のヒストンのアセチル化レベルを変化させることができなかった。ＰＲＯＴＡＣリンカーの長さおよび化学的性質は、細胞内での活性に大きな影響を与えると考えられる。上記のようなＨＤＡＣ分解は、重要なＨＤＡＣコリプレッサー錯体の化学プローブおよび治療法に代わる戦略を提供し得る。

【0159】

材料および方法
一般的方法
使用した出発物質および溶媒は、商業的に入手可能な供給源から購入し、さらに精製することなく使用した。脱水ＴＨＦおよび脱水ＤＣＭを、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｃ． ＰｕｒｅＳｏｌｖ溶媒精製システムを用いて乾燥した。すべての化学名は、ＣｈｅｍＤｒａｗ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌを使用して生成されている。特に明記しない限り、すべての反応は攪拌し、窒素下で行った。すべての反応は、アルミニウムで支持されたシリカで実行されるＴＬＣを使用して観察した。Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ精製システムを使用する分取カラムクロマトグラフィーおよびフラッシュカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（２３０～４００メッシュ）を使用して実施した。

【0160】

Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８カラムにＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを搭載したＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００システムで、分析およびセミ分取ＨＰＬＣを実行した。方法１、Ａ＝Ｈ_２Ｏ、Ｂ＝ＣＨ_３ＣＮ、５～１００％Ｂ、１０ｍＬ／分の流量、４５分のグラジエント。方法２、Ａ＝Ｈ_２Ｏ中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝ＣＨ_３ＣＮ中の０．１％ＴＦＡ、５～１００％Ｂ、１０ｍＬ／分の流量、４５分のグラジエント。

【0161】

核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ５００（^１Ｈ，５００ＭＨｚ；^１３Ｃ １２５ＭＨｚ）またはＢｒｕｋｅｒ４００（^１Ｈ，４００ＭＨｚ；^１３Ｃ １００ＭＨｚ）機器を使用して、参照として重水素化溶媒－ＣＤＣｌ_３（δ_Ｈ＝７．２６ｐｐｍ，δ_Ｃ＝７７．００ｐｐｍ）、ＤＭＳＯ－ｄ_６（δ_Ｈ＝２．５０ｐｐｍ，δ_Ｃ＝３９．５１ｐｐｍ）、ＣＤ_３ＯＤ（δ_Ｈ＝３．３１ｐｐｍ，δ_Ｃ＝４９．１５ｐｐｍ）、またはＣＤ_３ＣＮ（δ_Ｈ＝１．９４ｐｐｍ，δ_Ｃ＝１．３９，１１８．６９ｐｐｍ）を使用して周囲温度で取得した。ＡＣＤＬａｂｓソフトウェア（ＣｈｅｍｓｋｅｔｃｈおよびＳｐｅｃｔｒｕｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）を使用して、ピークの選択、統合、結合定数の計算を行った。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、Ｗａｔｅｒ Ａｑｕｉｔｙ ＸＥＶＯ Ｑ ＴｏＦマシンで記録され、ｍ／ｚで測定された。

【0162】

一般的方法Ａ．ＤＩＰＥＡ（１．５当量）を置換アニリン（１当量）の脱水ＤＣＭ（２．５ｍＬ／ｍｍｏｌ）溶液に０℃で添加し、続いて４－ニトロベンゾイルクロリド（１．１当量）を脱水ＤＣＭ溶液として添加した。混合物を０℃で３０分間、次いで室温で一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、次いで飽和ＮａＨＣＯ_４、１Ｍ ＨＣｌおよび飽和ＮａＣｌで洗浄した。次いで、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、真空で濃縮し、その後、適宜精製して、望みの化合物を得た。

【0163】

一般的方法Ｂ．トリエチルアミン（３当量）を４－アミノベンズアミド出発物質（１当量）の脱水ＴＨＦ（１０ｍＬ／ｍｍｏｌ）溶液に０℃で加えた後、塩化アセチル（１．２当量）を滴下した。混合物を０℃で３０分間、次いで室温で２時間撹拌した。反応混合物を真空で濃縮して、対応する粗生成物を得て、これをクロマトグラフィーで精製して、望みの化合物を得た。

【0164】

一般的方法Ｃ．ＴＦＡ（２０当量）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ／ｍｍｏｌ）中のＢｏｃ保護ＨＤＡＣ阻害剤／阻害剤－リンカー（１当量）の撹拌溶液に添加し、得られた反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応混合物を真空で濃縮し、ＭｅＯＨ（０．１Ｍ）に溶解し、ＭＰ－カーボネート樹脂（３．０２ｍｍｏｌ／ｇ負荷容量）中で２～３時間攪拌し、次いで濾過した。濾液を真空中で濃縮して、望みのＨＤＡＣ阻害剤／阻害剤－リンカーを得た。

【0165】

一般的方法Ｄ．ジカルボン酸（１当量）の１，４－ジオキサン／ＤＭＦ（１：１、４ｍＬ／ｍｍｏｌ）溶液に、臭化ベンジル（１当量）を添加し、続いてＮａＨＣＯ_３（１当量）を添加した。得られた懸濁液を９０℃で一晩加熱した。反応混合物を室温まで放冷した後、減圧濃縮した。次いで、粗残留物をＥｔＯＡｃに懸濁させて、飽和ＮａＣｌおよび水で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、対応する粗生成物を得て、これをクロマトグラフィーで精製して、望みの化合物を得た。

【0166】

一般的方法Ｅ．０℃の酸リンカー（１．１～１．３当量）の脱水ＤＭＦ（１０ｍＬ／ｍｍｏｌ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（３当量）およびＨＡＴＵ（１．３～１．５当量）を添加した。反応混合物を１５分間撹拌し、その後アミン（１当量）のＤＭＦ溶液をゆっくりと加え、得られた溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、次いで飽和ＮａＨＣＯ_３および飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、対応する粗生成物を得て、これをクロマトグラフィーで精製して、望みの化合物を得た。

【0167】

一般的方法Ｆ．ベンジルエステル保護ＨＤＡＣｉ－リンカーコンジュゲート（１当量）のＴＨＦ溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（１０％ｗｔ）を添加した。反応フラスコを窒素で満たし、シュレンクラインを使用して３回排気した後、水素のバルーンを追加して、得られた混合物を４～１８時間激しく撹拌した。水素のバルーンを取り除き、フラスコを窒素でフラッシュした。反応混合物をガラスマイクロファイバー濾紙を通して濾過し、濾液を真空で濃縮して、望みの化合物を得た。

【0168】

一般的方法Ｇ．０℃のＨＤＡＣｉ－リンカー酸（１．２当量）の乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（３当量）およびＨＡＴＵ（１．３当量）を添加した。反応混合物を１５分間攪拌した後、（４Ｒ）－３－メチル－Ｌ－バリル－４－ヒドロキシ－Ｎ－［［４－（４－メチル－５－チアゾリル）フェニル］メチル］－Ｌ－プロリンアミド塩酸塩（ＶＨ＿０３２アミン、０．０８～０．１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液をゆっくりと添加し、得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、次いで飽和ＮａＨＣＯ_３（２×５ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、対応する粗生成物を得て、これをクロマトグラフィーで精製して、望みの化合物を得た。

【0169】

一般的方法Ｈ．ＴＦＡ（０．４ｍＬまたは２０当量）をＤＣＭ（２ｍＬ）中のＢｏｃ保護ＰＲＯＴＡＣ（１当量）の攪拌溶液に加え、得られた反応混合物を室温で４～６時間攪拌した。反応混合物を真空で濃縮し、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解し、ＭＰ－カーボネート樹脂（３．０２ｍｍｏｌ／ｇ負荷容量）中で２～３時間攪拌し、次いで濾過した。濾液を真空濃縮し、得られた固体をＭｅＣＮ：Ｈ_２Ｏ（１：１）に溶解し、凍結乾燥して残留ＴＦＡ不純物を除去し、最終ＰＲＯＴＡＣを得た。

【0170】

一般的方法Ｉ．脱水ＤＭＦ（０．８ｍＬ）中のＥ３配位子フェノール（１当量）、臭化アルキル（１当量）およびＫ_２ＣＯ_３（３当量）の混合物を７０℃で一晩撹拌した。反応物を真空で濃縮して、対応する粗生成物を得て、これをクロマトグラフィーで精製して、望みの化合物を得た。

【0171】

一般的方法Ｊ．２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）酢酸（ＣＲＢＮ酸、１当量）の脱水ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、０℃において、ＤＩＰＥＡ（３当量）およびＨＡＴＵ（１．２当量）を追加した。反応混合物を１５分間撹拌し、その後ＨＤＡＣｉ－リンカーアミン（１当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液をゆっくりと加え、得られた溶液を室温で１８時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、次いで飽和ＮａＨＣＯ_３（２×１０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、対応する粗生成物を得て、これをクロマトグラフィーで精製して、最終的なＰＲＯＴＡＣを得た。

【0172】

一般的方法Ｋ．０℃のＨＤＡＣｉ－リンカー酸（１．２当量）の脱水ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（３当量）およびＨＡＴＵ（１．３当量）を添加した。反応混合物を１５分間攪拌した後、ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－２－（（２Ｓ，４Ｓ）－４－アミノ－２－（（（Ｒ）－１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－１－イル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－１－シクロヘキシル－２－オキソエチル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）カルバメート塩酸塩ＤＭＦ（１ｍＬ）中の（Ａ ４１００９９．１アミン、０．０４ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、次いで飽和ＮａＨＣＯ_３（２×５ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、対応する粗生成物を得て、これをクロマトグラフィーで精製して、望みの化合物を得た。

【0173】

ＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）の合成

【0174】

【化25】

【0175】

ｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノフェニル）カルバメート（２）：Ｂｏｃ_２Ｏ（６．０５ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を、７（３．００ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．６４ｍＬ、３３．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２５ｍＬ）溶液に３時間かけて滴下し、その後、混合物を室温で１５時間撹拌した。反応混合物を真空で濃縮して、灰色の結晶性固体を得て、次いで、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に再溶解した。この溶液を水（２×３０ｍＬ）および飽和ブライン（２×３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で濾過した後、真空で濃縮して、黄色／灰色の固体を得た。粗固体をカラムクロマトグラフィー（固体ロード、ヘキサン中１０～２５％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、８（４．７２ｇ、２２．５ｍｍｏｌ、収率８２％）を黄色／灰色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₁₁H₁₆N₂O₂Na: 231.1109, found 231.1112.
ｔｅｒｔ－ブチル（５－フルオロ－２－ニトロフェニル）カルバメート（４）：２（４．６１ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を、３（３．００ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５９ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．５４ｍＬ、１１．０６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３５ｍＬ）溶液に０℃で滴下し、次いで混合物を８０℃で１５時間撹拌した。反応混合物を真空濃縮し、次いでＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に再溶解し、２Ｍ ＨＣｌ（１００ｍＬ）を添加した。ＥｔＯＡｃ層を回収し、次いで水層をさらなるＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、オレンジ色のオイル（５．１０ｇ）を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中１０～２０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、４（２．７７ｇ、１０．７ｍｍｏｌ、収率５６％）を黄色の結晶固体として得た。HRMS (ESI, direct infusion) m/z: [M-H]^- calculated for C₁₁H₁₂N₂O₄F: 255.0781, found 255.0780.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノ－５－フルオロフェニル）カルバメート（５）：４（１．６８ｇ、６．５６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５０ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（１７０ｍｇ）を添加した。反応フラスコを窒素で満たし、シュレンクラインを使用して３回排気した後、水素のバルーンを加え、得られた混合物を４．５時間激しく撹拌した。水素のバルーンを取り外し、フラスコを窒素でフラッシュした。反応混合物をガラスマイクロファイバーフィルターを通して濾過し、次いで濾液を真空で濃縮して、５（１．４３ｇ、６．２６ｍｍｏｌ、収率９６％）をベージュ色の固体として得た。MS (ESI) m/z: 227 [M+H]⁺.
ｔｅｒｔ－ブチル（４－ブロモ－２－ニトロフェニル）カルバメート（７）：Ｂｏｃ_２Ｏ（２．２１ｇ、１０．１４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を、６（２．００ｇ、９．２２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．１１３ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．５４ｍＬ、１１．０６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３５ｍＬ）溶液に０℃で滴下し、次いで混合物を６０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、次いでカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、７（１．５２４ｇ、４．７６ｍｍｏｌ、収率４７％）を黄色の結晶固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [(M-Boc)+H]⁺ calculated for C₆H₆BrN₂O₄ (⁸¹Br): 218.9592, found 218.9594.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－ニトロ－４－（チオフェン－２－イル）フェニル）カルバメート（８）：ＤＭＥ／水（２：１、３６ｍＬ）の溶液に、チオフェン－２－イルボロン酸（０．７７ｇ、６．０５ｍｍｏｌ）、７（１．６０ｇ、５．０５ｍｍｏｌ）、Ｎａ_２ＣＯ_３（０．８０ｇ、７．５７ｍｍｏｌ）、およびＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（０．３８ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を１１０℃で１６時間激しく攪拌した。反応混合物をさらに水（４０ｍＬ）で希釈し、次いで生成物をＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、水（２×７０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、茶色の固体（１．９２０ｇ）を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ドライロード、ヘキサン中０～５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、８（１．２１ｇ、３．７４ｍｍｏｌ、収率７４％）をオレンジ色の結晶固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M-H]^-calculated for C₁₅H₁₅N₂O₄S: 319.0753, found 319.0753.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノ－４－（チオフェン－２－イル）フェニル）カルバメート（９）：８（１．１８１ｇ、３．６９ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１５ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１２０ｇ）を添加した。反応フラスコを窒素で満たし、シュレンクラインを使用して３回排気した後、水素のバルーンを加え、得られた混合物を４時間激しく撹拌した。水素のバルーンを取り外し、フラスコを窒素でフラッシュした。反応混合物をガラスマイクロファイバーフィルターを通して濾過し、次いで濾液を真空で濃縮して、９（１．０５７ｇ、３．６０ｍｍｏｌ、収率９８％）を褐色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₁₅H₁₉N₂O₂S: 291.1167, found 291.1167.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－ニトロベンズアミド）フェニル）カルバメート（１０ａ）：一般的方法Ａに従って、２（４．１７ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）および４－ニトロベンゾイルクロリド（４．０９ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）から１０ａを得た。粗生成物をＥｔＯＨ中で摩砕し、次いで濾過して、１０ａ（５．５２ｇ、１５．３ｍｍｏｌ、収率７６％）を淡黄色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₁₈H₁₉N₃O₅Na: 380.1222, found 380.1223.
ｔｅｒｔ－ブチル（５－フルオロ－２－（４－ニトロベンズアミド）フェニル）カルバメート（１０ｂ）：一般的方法Ａに従い、５（１．２７ｇ、５．６０ｍｍｏｌ）および塩化４－ニトロベンゾイル（１．１５ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）から１０ｂを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、１０ｂ（１．８７ｇ、４．９３ｍｍｏｌ、収率８８％）を綿毛状の薄茶色の固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₁₈H₁₈N₃O₅FNa: 398.1128, found 398.1125.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－ニトロベンズアミド）－４－（チオフェン－２－イル）フェニル）カルバメート（１０ｃ）：一般的方法Ａに従い、９（４００ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）および４－ニトロベンゾイルクロリド（２８４ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）から１０ｃを得た。粗生成物をＥｔＯＨ中で摩砕し、次いで濾過して、１０ｃ（４５９ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、収率７６％）を淡緑色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₂₂H₂₂N₃O₅S: 440.1280, found 440.1280.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－アミノベンズアミド）フェニル）カルバメート（１１ａ）：１０ａ（５．５２ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ／ＴＨＦ（１：１、１００ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．５５ｇ）を加えた。反応フラスコを窒素で満たし、シュレンクラインを使用して３回排気した後、水素のバルーンを加え、得られた混合物を１８時間激しく撹拌した。水素のバルーンを取り外し、フラスコを窒素でフラッシュした。反応混合物をセライトを通して濾過し、次いでセライトをさらなるＭｅＯＨ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、濾液を真空で濃縮して、１１ａ（５．２３ｇ、１５．３ｍｍｏｌ、収率１００％）を綿毛状の白色結晶固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₁₈H₂₁N₃O₃Na: 350.1481, found 350.1486.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－アミノベンズアミド）－５－フルオロフェニル）カルバメート（１１ｂ）：１０ｂ（１．５２５ｇ、４．０６３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１００ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１５５ｇ）を加えた。反応フラスコを窒素で満たし、シュレンクラインを使用して排気を３回行った後、水素のバルーンを加え、得られた混合物を７時間激しく撹拌した。水素のバルーンを取り外し、フラスコを窒素でフラッシュした。反応混合物をガラスマイクロファイバーフィルターを通して濾過し、次いで濾液を真空で濃縮して、１１ｂ（１．３３５ｇ、３．８２７ｍｍｏｌ、収率９４％）を淡灰色の結晶固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₁₈H₂₁N₃O₃F: 346.1567, found 346.1563.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－アミノベンズアミド）－４－（チオフェン－２－イル）フェニル）カルバメート（１１ｃ）：１０ｃ（０．３３３ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：１、１２０ｍＬ）溶液に、ＳｎＣｌ_２（０．８６３ｇ、４．５５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で１週間撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、次いで飽和Ｎａ_２ＣＯ_３（４０ｍＬ）をゆっくりと添加した。生成物をＤＣＭ（４×４０ｍＬ）で抽出し、次いで有機層を合わせ、ブライン（２×８０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、１１ｃ（０．２８３ｇ、０．６２ｍｍｏｌ、収率８２％）を黄色の結晶固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₂₂H₂₄N₃O₃S: 410.1538, found 410.1530.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－アセトアミドベンズアミド）フェニル）カルバメート（１２ａ）：一般的方法Ｂに従い、１１ａ（２００ｍｇ、０．６１１ｍｍｏｌ）および塩化アセチル（０．０５２ｍＬ、０．７３３ｍｍｏｌ）から１２ａを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ドライロード、１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、１２ａ（１９３ｍｇ、０．５１７ｍｍｏｌ、収率８５％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₂₀H₂₃N₃O₄Na: 392.1586, found 392.1586.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－アセトアミドベンズアミド）－５－フルオロフェニル）カルバメート（１２ｂ）：一般的方法Ｂに従って、１１ｂ（９５．７ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）および塩化アセチル（０．０２４ｍＬ、０．３３３ｍｍｏｌ）から１２ｂを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ドライロード、５０～１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、１２ｂ（１０１．０ｍｇ、０．２５８ｍｍｏｌ、収率９３％）を淡黄色／褐色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₂₀H₂₃FN₃O₄: 388.1673, found 388.1672.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－アセトアミドベンズアミド）－４－（チオフェン－２－イル）フェニル）カルバメート（１２ｃ）：一般的方法Ｂに従って、１１ｃ（９６．６ｍｇ、０．２３６ｍｍｏｌ）および塩化アセチル（０．０２０ｍＬ、０．２８３ｍｍｏｌ）から１２ｃを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（０～１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、１２ｃ（７２．８ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ、収率６８％）を淡黄色／緑色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₂₄H₂₆N₃O₄S: 452.1644, found 452.1643.
４－アセトアミド－Ｎ－（２－アミノフェニル）ベンズアミド（ＣＩ－９９４）：一般的方法Ｃに従って、１２ａ（４７．５ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を行って、ＣＩ－９９４（３５．６ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ、収率９７％）を黄色／白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₁₅H₁₆N₃O₂: 270.1243, found 270.1247.
４－アセトアミド－Ｎ－（２－アミノ－４－フルオロフェニル）ベンズアミド（ＢＲＤ３３０８）：一般的方法Ｃに従って、１２ｂ（８７．０ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を行い、ＢＲＤ３３０８（５９．３ｍｇ、０．２０２ｍｍｏｌ、収率９０％）を黄色／茶色の固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₁₅H₁₅FN₃O₂: 288.1148, found 288.1139.
４－アセトアミド－Ｎ－（２－アミノ－５－（チオフェン－２－イル）フェニル）ベンズアミド（Ｃｐｄ－６０）：一般的方法Ｃに従って、１２ｃ（４８．２ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を行い、Ｃｐｄ－６０（３５．５ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ、収率９３％）を淡黄色／緑色の固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₁₉H₁₈N₃O₂S: 352.1120, found 352.1120.
リンカーの合成

【0176】

【化26】

【0177】

９－（ベンジルオキシ）－９－オキソノナン酸（１４ａ）：一般的方法Ｄに従って、１３ａ（２．００ｇ、１０．６３ｍｍｏｌ）および臭化ベンジル（１．２６ｍＬ、１０．６３ｍｍｏｌ）から１４ａを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、１４ａ（１．０８３ｇ、３．８５ｍｍｏｌ、収率３６％）を無色透明オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺calculated for C₁₆H₂₂O₄Na: 301.1416, found 301.1415.
１２－（ベンジルオキシ）－１２－オキソドデカン酸（１４ｂ）：一般的方法Ｄに従って、１３ｂ（２．００ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）および臭化ベンジル（１．０３ｍＬ、８．６８ｍｍｏｌ）から１４ｂを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、１４ｂ（０．９９８ｇ、２．９９ｍｍｏｌ、収率３４％）を無色透明オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₁₉H₂₈O₄Na: 343.1885, found 343.1887.
１４－（ベンジルオキシ）－１４－オキソテトラデカン酸（１４ｃ）：一般的方法Ｄに従って、１３ｃ（１．５０ｇ、５．８１ｍｍｏｌ）および臭化ベンジル（０．６９ｍＬ、５．８１ｍｍｏｌ）から１４ｃを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、１４ｃ（０．６２８ｇ、１．７８ｍｍｏｌ、収率３１％）を無色透明オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₂₁H₃₃O₄: 349.2379, found 349.2374.
３－オキソ－１－フェニル－２，５，８，１１－テトラオキサトリデカン－１３－酸（１６）：一般的方法Ｄに従って、１５（１．００ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）および臭化ベンジル（０．３７ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）から１６を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～１０％のＭｅＯＨ）によって精製して、１６（０．４８４ｇ、１．５３ｍｍｏｌ、収率４９％）を透明黄色オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₁₅H₂₁O_7: 313.1287, found 313.1290.
ｂｉ－ｔｅｒｔ－ブチル－２，２’－（ヘキサン－１，６－ジイルビス（オキシ））ジアセテート（１７）：ヘキサン－１，６－ジオール（１．５０ｇ、１２．６９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５２ｍｌ）に溶解させた後、ｔｅｒｔ－ブチル－２－ブロモアセテート（１５．０ｍｌ、１０２．２８ｍｍｏｌ）を滴下し、続いてテトラ－ｎ－ブチルアンモニウムブロミド（４．５０ｇ、１３．９６ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、反応混合物を０℃に冷却した後、ＮａＯＨ（３７％ｗ／ｗ、５２ｍｌ）を添加した。次いで、反応混合物を室温で１６時間激しく攪拌した。粗反応混合物は二相であり、有機層（上層）は黄色であった。有機層を分離し、次いで水層をＤＣＭ（３×１５ｍｌ）で洗浄した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ_４で乾燥させた後、濾過し、真空で濃縮して、透明な淡黄色のオイル（６．８７ｇ）を得て、これはゆっくりと結晶化した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１％ＭｅＯＨ）により精製して、１７（１．０１５ｇ、２．９０ｍｍｏｌ、収率２３％）を無色透明オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺calculated for C₁₈H₃₄O₆Na: 369.2253, found 369.2255.
ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－２，２’－（ノナン－１，９－ジイルビス（オキシ））ジアセテート（１８）およびｔｅｒｔ－ブチル－２－（（９－ヒドロキシノニル）オキシ）アセテート（１９）：ノナン－１，９－ジオール（２．００ｇ、１２．４８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍｌ）に溶解した後、ｔｅｒｔ－ブチル－２－ブロモアセテート（５．５３ｍｌ、３７．４４ｍｍｏｌ）を滴下し、続いてテトラ－ｎ－ブチルアンモニウムブロミド（４．４３ｇ、１３．７３ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、反応混合物を０℃に冷却した後、ＮａＯＨ（３７％ｗ／ｗ、５０ｍｌ）を添加した。次いで、反応混合物を室温で１６時間激しく攪拌した。粗反応混合物は二相であり、有機層（上層）は淡黄色であった。有機層を分離し、次いで水層をＤＣＭ（３×１５ｍｌ）で洗浄した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ_４で乾燥させた後、濾過し、真空で濃縮して、透明淡黄色オイルを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中１０～３０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、１８（２．８０ｇ、７．１４ｍｍｏｌ、収率５７％）および１９（１．３８７ｇ、５．０１ｍｍｏｌ、収率４０％）を無色透明オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₁₅H₃₀O₄Na: 297.2042, found 297.2046.
２，２’－（ヘキサン－１，６－ジイルビス（オキシ））二酢酸（２０ａ）：ＤＣＭ（２ｍＬ）中の１７（０．４６０ｇ、１．３３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にＴＦＡ（０．４ｍＬ）を加え、得られた反応混合物を室温で４時間攪拌した。反応混合物を真空で濃縮して、２０ａ（３１９．０ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ、収率９９％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₁₀H₁₉O₆: 235.1182, found 235.1182.
２，２’－（ノナン－１，９－ジイルビス（オキシ））二酢酸（２０ｂ）：ＤＣＭ（３ｍＬ）中の１８（１．５５ｇ、３．９９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にＴＦＡ（３ｍＬ）を加え、得られた反応混合物を室温で４．５時間攪拌した。反応混合物を真空で濃縮して、２０ｂ（１．０９ｇ、ｍｍｏｌ、３．９５ｍｍｏｌ、収率９９％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₁₃H₂₅O₆: 277.1651, found 277.1656.
２－（（６－（２－（ベンジルオキシ）－２－オキソエトキシ）ヘキシル）オキシ）酢酸（２１ａ）：一般的方法Ｄに従って、２０ａ（０．３０４ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）および臭化ベンジル（０．１５ｍＬ、１．３０ｍｍｏｌ）から２１ａを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、２１ａ（０．１１０ｇ、０．３４ｍｍｏｌ、収率２６％）を黄色オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₁₇H₂₅O₆: 325.1651, found 325.1659.
２－（（９－（２－（ベンジルオキシ）－２－オキソエトキシ）ノニル）オキシ）酢酸（２１ｂ）：一般的方法Ｄに従って、２０ｂ（１．０４７ｇ、３．７９ｍｍｏｌ）および臭化ベンジル（０．４５ｍＬ、３．７９ｍｍｏｌ）から２１ｂを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２１ｂ（０．４６３ｇ、１．２４ｍｍｏｌ、収率３３％）を透明な淡黄色オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₂₀H₃₁O₆: 367.2121, found 367.2121.
９－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエトキシ）ノナン酸（２２）：二クロム酸ピリジニウム（６８５．５ｍｇ、１．８２２ｍｍｏｌ）を、１９（１００．０ｍｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に少しずつ加え、室温で６時間撹拌した。反応混合物を１０％クエン酸溶液（３０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（４×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ（３×３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、２２（１０９．８ｍｇ、０．３６１ｍｍｏｌ、収率９９％）を淡黄色オイルとして得た。HRMS (ESI -ve, Direct Infusion) m/z: [M-H]^-calculated for C₁₅H₂₇O₅: 287.1858, found 287.1862.
ベンジル－９－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－２－オキソエトキシ）ノナノエート（２３）：２２（２１５．３ｍｇ、０．７４７ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン／ＤＭＦ（１：１、８ｍＬ）溶液に、臭化ベンジル（０．１０ｍＬ、０．８２１ｍｍｏｌ）を加え、続いてＮＥｔ_３（０．１２ｍＬ、０．８８５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で５時間攪拌した。反応混合物を真空で濃縮して黄色オイルを得て、次いで粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～４０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、２３（１５９．９ｍｇ、０．４１８ｍｍｏｌ、収率５６％）を透明淡黄色オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₂₂H₃₄O₅Na: 401.2304, found 401.2303.
２－（（９－（ベンジルオキシ）－９－オキソノニル）オキシ）酢酸（２４）：ＤＣＭ（２ｍＬ）中の２３（１５９．９ｍｇ、０．４２２）の攪拌溶液にＴＦＡ（１ｍＬ）を加え、得られた反応混合物を室温で４時間攪拌した。反応混合物を真空で濃縮して、２４（１３２．５ｍｇ、０．４０７ｍｍｏｌ、収率９８％）を無色透明オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₁₈H₂₇O₅: 323.1858, found 323.1862.
ＶＨＬリガンドを用いたＨＤＡＣｉ－リンカーコンジュゲートの合成

【0178】

【化27】

【0179】

ベンジル－１２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－１２－オキソドデカノアート（２５ａ）：一般的方法Ｅに従い、１４ａ（２５７ｍｇ、０．８０２ｍｍｏｌ）および１１ａ（２００ｍｇ、０．６１１ｍｍｏｌ）から２５ａを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、２５ａ（２７４ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ、収率７０％）を淡黄色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₃₇H₄₇N₃O₆Na: 652.3363, found 652.3364.
ベンジル－９－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－９－オキソノナノアート（２５ｂ）：一般的方法Ｅに従い、１４ｂ（０．４７５ｇ、１．７１ｍｍｏｌ）および１１ａ（０．４３０ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）から２５ｂを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２５ｂ（０．５４０ｇ、０．９４ｍｍｏｌ、収率５３％）を黄色のタールとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₃₄H₄₂N₃O₆: 588.3074, found 588.3067.
ベンジル－１４－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－１４－オキソテトラデカン酸（２５ｃ）：一般的方法Ｅに従い、１４ｃ（４２１．４ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）および１１ａ（３００．０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）から２５ｃを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２５ｃ（３７２．４ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、収率６１％）を黄色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₉H₅₂N₃O₆: 658.3856, found 658.3880.
ベンジル－２－（（６－（２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ヘキシル）オキシ）アセテート（２５ｄ）：一般的方法Ｅに従い、２１ａ（７８．２ｍｇ、０．２４１ｍｍｏｌ）および１１ａ（７１．８ｍｇ、０．２１９ｍｍｏｌ）から２５ｄを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～１００％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２５ｄ（７６．５ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ、収率５５％）を淡黄色オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₅H₄₄N₃O₈: 634.3128, found 634.3125.
ｔｅｒｔ－ブチル－２－（（９－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－９－オキソノニル）オキシ）アセテート（２５ｅ）：一般的方法Ｅに従い、２２（８５．０ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）および１１ａ（８８．４ｍｇ、０．２７０ｍｍｏｌ）から２５ｅを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～１００％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２５ｅ（６６．３ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、収率４１％）を黄色のタールとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₃H₄₈N₃O₇: 598.3492, found 598.3484.
ベンジル－９－（２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノナノアート（２５ｆ）：一般的方法Ｅに従い、２４（１３０．０ｍｇ、０．４０３ｍｍｏｌ）および１１ａ（１１０．０ｍｇ、０．３３６ｍｍｏｌ）から２５ｆを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～１００％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２５ｆ（１５７．４ｍｇ、０．２４７ｍｍｏｌ、収率７３％）を無色透明のタールとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₆H₄₆N₃O₇: 632.3336, found 632.3335.
ベンジル－２－（（９－（２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノニル）オキシ）アセテート（２５ｇ）：一般的方法Ｅに従って、２１ｂ（１４５．０ｍｇ、０．３９６ｍｍｏｌ）および１１ａ（９９．６ｍｇ、０．３０４ｍｍｏｌ）から２５ｇを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～７０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２５ｇ（１５７．８ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ、収率７５％）を無色透明のタールとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₈H₅₀N₃O₈: 676.3598, found 676.3605.
ベンジル－１２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４－フルオロフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－１２－オキソドデカン酸（２５ｈ）：一般的方法Ｅに従い、１４ａ（２４６．４ｍｇ、０．７６７ｍｍｏｌ）および１１ｂ（２０１．８ｍｇ、０．５８４ｍｍｏｌ）から２５ｈを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中１０～８０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２５ｈ（３３２．４ｍｇ、０．５０８ｍｍｏｌ、収率８７％）を濃いオレンジ色のタールとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₃₇H₄₇FN₃O₆: 648.3449, found 648.3452.
ベンジル－２－（（９－（２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４－フルオロフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノニル）オキシ）アセテート（２５ｉ）：一般的方法Ｅに従い、２１ｂ（１６７．７ｍｇ、０．４５８ｍｍｏｌ）および１１ｂ（１２０．０ｍｇ、０．３４７ｍｍｏｌ）から２５ｉを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中２５～３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２５ｉ（１１４．８ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ、収率４２％）をオレンジ色のタールとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₈H₄₉FN₃O₈: 694.3504, found 694.3517.
ベンジル－２－（２－（２－（２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－５－（チオフェン－２－イル）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）エトキシ）エトキシ）アセテート（２５ｊ）：一般的方法Ｅに従い、１６（１１４．０ｍｇ、０．３６２ｍｍｏｌ）および１１ｃ（１１４．０ｍｇ、０．２７８ｍｍｏｌ）から２５ｊを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～１００％ＥｔＯＡｃ、生成物は８０～９０％ＥｔＯＡｃで溶出）により精製して、２５ｉ（１１７．５ｍｇ、０．１６２ｍｍｏｌ、収率５８％）を暗黄色タールとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₇H₄₂N₃O₉S: 704.2642, found 704.2637.
１２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－１２－オキソドデカン酸（２６ａ）：一般的方法Ｆに従い、２５ａ（１７１ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）のベンジルエステル水素化分解を実施して、２６ａ（１４６ｍｇ、０．２６６ｍｍｏｌ、収率９８％）を淡白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₃₀H₄₁N₃O₆Na: 562.2893, found 562.2886.
９－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－９－オキソノナン酸（２６ｂ）：一般的方法Ｆに従い、２５ｂ（３７０．８ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）のベンジルエステル水素化分解を実施して、２６ｂ（２９５．１ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ、収率９３％）を白色結晶固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₂₇H₃₆N₃O₆: 498.2604, found 498.2597.
１４－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－１４－オキソテトラデカン酸（２６ｃ）：一般的方法Ｆに従って、２５ｃ（３４８．６ｍｇ、０．５３０ｍｍｏｌ）のベンジルエステル水素化分解を行い、２６ｃ（３０２．０ｍｇ、０．５２７ｍｍｏｌ、収率９９％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₂H₄₆N₃O₆: 568.3387, found 568.3391.
２－（（６－（２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ヘキシル）オキシ）酢酸（２６ｄ）：一般的方法Ｆに従い、２５ｄ（７６．５ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）のベンジルエステル水素化分解を実施して、２６ｄ（６５．８ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ、収率９９％）を無色透明オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₂₈H₃₈N₃O₈: 544.2659, found 544.2645.
２－（（９－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－９－オキソノニル）オキシ）酢酸（２６ｅ）：２５ｅ（６２．７ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２．７ｍＬ）溶液に、ＮａＯＨのＭｅＯＨ溶液（４Ｍ、０．３ｍＬ）を添加した。反応物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、次いで水（１０ｍＬ）に再溶解させ、ＨＣｌ（３Ｍ、約１ｍＬ）でｐＨ２に酸性化した。次に、生成物をＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、２６ｅ（５５．４ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ、収率９１％）を黄色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₂₉H₄₀N₃O₇: 542.2866, found 542.2861.
９－（２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノナン酸（２６ｆ）：一般的方法Ｆに従い、２５ｆ（１２０．２ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）のベンジルエステル水素化分解を実施して、２６ｆ（１０５．６ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ、収率９９％）を無色透明タールとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₂₉H₄₀N₃O₇: 542.2866, found 542.2863.
２－（（９－（２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノニル）オキシ）酢酸（２６ｇ）：一般的方法Ｆに従い、２５ｇ（１３４．８ｍｇ、０．１９９ｍｍｏｌ）のベンジルエステル水素化分解を行い、２６ｇ（１１８．７ｍｇ、０．１９９ｍｍｏｌ、収率１００％）を無色透明タールとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₁H₄₄N₃O₈: 586.3128, found 586.3128.
１２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４－フルオロフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－１２－オキソドデカン酸（２６ｈ）：一般的方法Ｆに従い、２５ｈ（２１９．６ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ）のベンジルエステル水素化分解を実施して、２６ｈ（１９２．９ｍｇ、０．２６６ｍｍｏｌ、収率９８％）を淡紫／褐色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₀H₄₁FN₃O₆: 558.2979, found 558.2974.
２－（（９－（２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４－フルオロフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノニル）オキシ）酢酸（２６ｉ）：一般的方法Ｆに従って、２５ｉ（１１４．０ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ）のベンジルエステル水素化分解を実施して、２６ｉ（９９．８ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ、収率１００％）を黄色／褐色タールとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₁H₄₃FN₃O₈: 604.3034, found 604.3046.
２－（２－（２－（２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－５－（チオフェン－２－イル）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）エトキシ）エトキシ）酢酸（２６ｊ）：２５ｊ（１１１．６ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液に、溶液がｐＨ１０（ＭｅＯＨ中０．４Ｍ ＮａＯＨ）に達するまでＮａＯＨ（１６０ｍｇ）を添加し、次いで得られた溶液を室温で４時間撹拌した。反応混合物を真空濃縮し、次いで水（１０ｍＬ）に溶解し、ＥｔＯＡＣ（２０ｍＬ）で洗浄した。水層をＨＣｌ（１Ｍ）でｐＨ２に酸性化し、生成物をＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出し、次いで合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、２６ｊ（９６．７ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ、８７％収率）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₃₀H₃₆N₃O₉S: 614.2172, found 614.2161.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（１２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）））ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－１２－オキソドデカンアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（２７ａ）：一般的方法Ｇに従い、２６ａ（６５．５ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）およびＶＨ＿０３２アミン（５０．０ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）から２７ａを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～５％ＭｅＯＨ）により精製して、２７ａ（６１．９ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ、収率６４％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₂H₇₀N₇O₈S: 952.5007, found 952.5009.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（９－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－９－オキソノナンアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（２７ｂ）：一般的方法Ｇに従い、２６ｂ（５９．９ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）およびＶＨ＿０３２アミン（５０．０ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）から２７ｂを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～５％ＭｅＯＨ）によって精製して、２７ｂ（７６．１ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ、収率８４％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₄₉H₆₄N₇O₈S: 910.4537, found 910.4529.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（１４－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－１４－オキソテトラデカンアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（２７ｃ）：一般的方法Ｇに従って、２６ｃ（５３．５ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）およびＶＨ＿０３２アミン（４０．０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）から２７ｃを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～５％ＭｅＯＨ）によって精製して、２７ｃ（６２．５ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ、収率７９％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₄H₇₄N₇O₈S: 980.5320, found 980.5303.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（２－（（６－（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ヘキシル）オキシ）アセトアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（２７ｄ）：一般的方法Ｇに従い、２６ｄ（６７．２ｍｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）およびＶＨ＿０３２アミン（５０．０ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）から２７ｄを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ）によって精製して、２７ｄ（９２．４ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ、収率９４％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₀H₆₆N₇O₁₀S: 956.4592, found 956.4590.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（９－（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノナンアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（２７ｅ）：一般的方法Ｇに従い、２６ｅ（５２．３ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）およびＶＨ＿０３２アミン（４０．０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）から２７ｅを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ）によって精製して、２７ｅ（６８．４ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ、収率８９％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₁H₆₈N₇O₉S: 954.4799, found 954.4798.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（２－（（９－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－９－オキソノニル）オキシ）アセトアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（２７ｆ）：一般的方法Ｇに従い、２６ｆ（５２．８ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）およびＶＨ＿０３２アミン（４０．０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）から２７ｆを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ）によって精製して、２７ｆ（７２．９、０．０７６ｍｍｏｌ、収率９５％）を淡黄色／白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₁H₆₈N₇O₉S: 954.4799, found 954.4792.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（２－（（９－（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノニル）オキシ）アセトアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（２７ｇ）：一般的方法Ｇに従い、２６ｇ（５６．２ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）およびＶＨ＿０３２アミン（４０．０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）から２７ｇを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～８％ＭｅＯＨ）によって精製して、２７ｇ（６８．４ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ、収率８５％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₃H₇₂N₇O₁₀S: 998.5061, found 998.5048.
ｔｅｒｔ－ブチル（５－フルオロ－２－（４－（１２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－１２－オキソドデカンアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（２７ｈ）：一般的方法Ｇに従い、２６ｈ（５３．２ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）およびＶＨ＿０３２アミン（４０．０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）から２７ｈを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ）により精製して、２７ｈ（５８．７ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ、収率７５％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₂H₆₉FN₇O₈S: 970.4912, found 970.4913.
ｔｅｒｔ－ブチル（５－フルオロ－２－（４－（２－（（９－（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノニル）オキシ）アセトアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（２７ｉ）：一般的方法Ｇに従い、２６ｉ（５７．６ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）およびＶＨ＿０３２アミン（４０．０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）から２７ｉを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～８％ＭｅＯＨ）によって精製して、２７ｉ（７５．７、０．０７２ｍｍｏｌ、収率９０％）を淡黄色／白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₃H₇₁FN₇O₁₀S: 1016.4967, found 1016.4928.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（（Ｓ）－１３－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－カルボニル）－１４，１４－ジメチル－１１－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデカンアミド）ベンズアミド）－４－（チオフェン－２－イル）フェニル）カルバメート（２７ｊ）：一般的方法Ｇに従って、２６ｊ（３５．１ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）およびＶＨ＿０３２アミン（２４．０ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）から２７ｊを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ）により精製して、２７ｊ（３０．３ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ、収率６１％）を黄色タールとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₂H₆₄N₇O₁₁S₂: 1026.4105, found 1026.4066.

【0180】

【化28】

【0181】

Ｎ１－（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）－Ｎ１２－（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）ドデカンジアミド（ＰＲＯＴＡＣ４）：一般的方法Ｈに従い、２７ａ（３７．６ｍｇ、０．０３９５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ４（２５．８ｍｇ、０．０２８８ｍｍｏｌ、収率７３％）を淡黄色固体として得た。生物学的評価の前に、ＰＲＯＴＡＣをセミ分取ＨＰＬＣ（Ｈ_２Ｏ中５～９５％のＭｅＣＮ、２６０ｎｍ、４５分のグラジエント）によってさらに精製した。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.86 (s, 1 H, 39-CH), 7.95 (d, J=8.8 Hz, 2 H, 15-CH), 7.72 (d, J=8.8 Hz, 2 H, 14-CH), 7.43 - 7.48 (m, 2 H, 36-CH), 7.38 - 7.42 (m, 2 H, 35-CH), 7.18 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 23-CH), 7.07 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 21-CH), 6.90 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 20-CH), 6.76 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 22-CH), 4.60 - 4.66 (m, 1 H, 24-CH), 4.55 - 4.60 (m, 1 H, 31-CH), 4.50 - 4.55 (m, 1 H, 33-CH), 4.47 - 4.50 (m, 1 H, 29-CH), 4.31 - 4.39 (m, 1 H, 33-CH), 3.86 - 3.93 (m, 1 H, 28-CH), 3.76 - 3.83 (m, 1 H, 28-CH), 2.47 (s, 3 H, 41-CH₃), 2.40 (t, J=7.5 Hz, 2 H, 11-CH₂), 2.18 - 2.33 (m, 3 H, 2-CH₂,30-CH), 2.03 - 2.12 (m, 1 H, 30-CH), 1.70 (quin, J=7.5 Hz, 2 H, 10-CH₂), 1.53 - 1.64 (m, 2 H, 3-CH₂), 1.28 - 1.41 (m, 12 H, (4-9)-CH₂), 1.03 (s, 9 H, 26-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₇H₆₂N₇O₆S: 852.4476, found 852.4482.

【0182】

【化29】

【0183】

Ｎ１－（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）－Ｎ９－（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）ノナンジアミド（ＰＲＯＴＡＣ６）：一般的な方法Ｈに従い、２７ｂ（３７．６ｍｇ、０．０３９５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ６（３７．０ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、収率９９％）を淡白色固体として得た。生物学的評価の前に、ＰＲＯＴＡＣをセミ分取ＨＰＬＣ（Ｈ_２Ｏ中５～９５％のＭｅＣＮ、２６０ｎｍ、４５分のグラジエント）によってさらに精製した。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.86 (s, 1 H, 36-CH), 7.95 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 12-CH), 7.71 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 11-CH), 7.45 (d, J=8.4 Hz, 2 H, 33-CH), 7.40 (d, J=8.4 Hz, 2 H, 32-CH), 7.18 (app. dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 20-CH), 7.07 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 18-CH), 6.90 (app. dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 17-CH), 6.76 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 19-CH), 4.63 (s, 1 H, 21-CH), 4.55 - 4.61 (m, 1 H, 28-CH), 4.50 - 4.55 (m, 1 H, 30-CH), 4.47 - 4.50 (m, 1 H, 29-CH), 4.31 - 4.38 (m, 1 H, 30-CH), 3.87 - 3.94 (m, 1 H, 25-CH), 3.76 - 3.83 (m, 1 H, 25-CH), 2.46 (s, 3 H, 38-CH₃), 2.39 (t, J=7.5 Hz, 2 H, 8-CH₃), 2.17 - 2.33 (m, 3 H, 2-CH₂,27-CH), 2.03 - 2.11 (m, 1 H, 27-CH), 1.70 (quin, J=7.5 Hz, 2 H, 7-CH₂), 1.61 (quin, J=6.9 Hz, 2 H, 3-CH₂), 1.27 - 1.44 (m, 6 H, (4-6)-CH₂), 1.03 (s, 9 H, 23-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₄H₅₆N₇O₆S: 810.4013, found 810.4005.

【0184】

【化30】

【0185】

Ｎ１－（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）－Ｎ１４－（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）テトラデカンジアミド（ＰＲＯＴＡＣ３４）：一般的な方法Ｈに従って、２７ｃ（６２．５ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ３４（５１．６ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ、収率９１％）を白色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.86 (s, 1 H, 41, CH), 7.95 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 17-CH), 7.72 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 16-CH), 7.43 - 7.47 (m, 2 H, 38-CH), 7.38 - 7.43 (m, 2 H, 37-CH), 7.18 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 25-CH), 7.06 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 23-CH), 6.90 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 22-CH), 6.76 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 24-CH), 4.63 (s, 1 H, 26-CH), 4.55 - 4.60 (m, 1 H, 33-CH), 4.52 (d, J=15.5 Hz, 1 H, 35-CH), 4.46 - 4.50 (m, 1 H, 31-CH), 4.34 (d, J=15.5 Hz, 1 H, 35-CH), 3.86 - 3.93 (m, 1 H, 30-CH), 3.75 - 3.82 (m, 1 H, 30-CH), 2.46 (s, 3 H, 43-CH₃), 2.39 (t, J=7.4 Hz, 2 H, 13-CH₂), 2.17 - 2.32 (m, 3 H, 2-CH₂,32-CH), 2.03 - 2.11 (m, 1 H, 32-CH), 1.70 (quin, J=7.4 Hz, 2 H, 12-CH₂), 1.52 - 1.65 (m, 2 H, 3-CH₂), 1.27 - 1.39 (m, 16 H, (4-11)-CH₂), 1.03 (s, 9 H, 28-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₉H₆₆N₇O₆S: 880.4795, found 880.4762.

【0186】

【化31】

【0187】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－（２－（（６－（２－（（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ヘキシル）オキシ）アセトアミド）－３，３－ジメチルブタノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＰＲＯＴＡＣ１２）：一般的方法Ｈに従い、２７ｄ（８６．３ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ１２（７１．７ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ、収率９０％）を淡黄色固体として得た。生物学的評価の前に、ＰＲＯＴＡＣをセミ分取ＨＰＬＣ（Ｈ_２Ｏ中５～９５％のＭｅＣＮ、２６０ｎｍ、４５分のグラジエント）によってさらに精製した。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.85 (s, 1 H, 37-CH), 7.96 (d, J=8.6 Hz, 2 H, 13-CH), 7.75 (d, J=8.6 Hz, 2 H, 12-CH), 7.42 - 7.45 (m, 2 H, 34-CH), 7.37 - 7.41 (m, 2 H, 33-CH), 7.18 (dd, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 21-CH), 7.07 (td, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 19-CH), 6.89 (dd, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 18-CH), 6.76 (td, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 20-CH), 4.69 (s, 1 H, 22-CH), 4.55 - 4.62 (m, 1 H, 29-CH), 4.45 - 4.55 (m, 2 H, 27,31-CH), 4.31 - 4.38 (m, 1 H, 31-CH), 4.05 - 4.11 (m, 2 H, 9-CH₂), 3.95 - 4.00 (m, 1 H, 2-CH), 3.89 - 3.94 (m, 1 H, 2-CH), 3.83 - 3.89 (m, 1 H, 26-CH), 3.75 - 3.82 (m, 1 H, 26-CH), 3.53 - 3.62 (m, 4 H, 3,8-CH₂), 2.46 (s, 3 H, 39-CH₃), 2.18 - 2.27 (m, 1 H, 28-CH), 2.03 - 2.13 (m, 1 H, 28-CH), 1.62 - 1.73 (m, 4 H, 4,7-CH₂), 1.42 - 1.52 (m, 4 H, 5,6-CH₂), 1.03 (s, 9 H, 24-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₅H₅₈N₇O₈S: 856.4068, found 856.4064.

【0188】

【化32】

【0189】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－（２－（（９－（（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－９－オキソノニル）オキシ）アセトアミド）－３，３－ジメチルブタノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＰＲＯＴＡＣ１３）：一般的な方法Ｈに従い、２７ｅ（６６．９ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ１３（５２．５ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ、収率８６％）を淡黄色固体として得た。生物学的評価の前に、ＰＲＯＴＡＣをセミ分取ＨＰＬＣ（Ｈ_２Ｏ中５～９５％のＭｅＣＮ、２６０ｎｍ、４５分のグラジエント）によってさらに精製した。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.85 (s, 1 H, 38-CH), 7.94 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 14-CH), 7.72 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 13-CH), 7.43 - 7.47 (m, 2 H, 35-CH), 7.37 - 7.42 (m, 2 H, 34-CH), 7.17 (dd, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 22-CH), 7.07 (app. td, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 20-CH), 6.89 (dd, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 19-CH), 6.76 (app. td, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 21-CH), 4.69 (s, 1 H, 23-CH), 4.56 - 4.63 (m, 1 H, 30-CH), 4.47 - 4.55 (m, 2 H, 28,32-CH), 4.35 (d, J=15.5 Hz, 1 H, 32-CH), 3.94 - 3.99 (m, 1 H, 2-CH), 3.89 - 3.94 (m, 1 H, 2-CH), 3.84 - 3.89 (m, 1 H, 27-CH), 3.76 - 3.82 (m, 1 H, 27-CH), 3.53 (t, J=6.3 Hz, 2 H, 3-CH₂), 2.46 (s, 3 H, 40-CH₃), 2.37 (t, J=7.5 Hz, 2 H, 10-CH₂), 2.19 - 2.27 (m, 1 H, 29-CH), 2.04 - 2.12 (m, 1 H, 29-CH), 1.59 - 1.71 (m, 4 H, 4,9-CH₂), 1.33 - 1.43 (m, 8 H, (5-8)-CH₂), 1.03 (s, 9 H, 25-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₆H₆₀N₇O₇S: 854.4275, found 854.4277.

【0190】

【化33】

【0191】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－（９－（２－（（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノナンアミド）－３，３－ジメチルブタノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＰＲＯＴＡＣ１４）：一般的方法Ｈに従い、２７ｆ（６０．２ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ１４（５０．６ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ、収率９３％）を淡黄色固体として得た。生物学的評価の前に、ＰＲＯＴＡＣをセミ分取ＨＰＬＣ（Ｈ_２Ｏ中５～９５％のＭｅＣＮ、２６０ｎｍ、４５分のグラジエント）によってさらに精製した。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.86 (s, 1 H, 38-CH), 7.98 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 14-CH), 7.77 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 13-CH), 7.45 (d, J=8.3 Hz, 2 H, 35-CH), 7.41 (d, J=8.3 Hz, 2 H, 34-CH), 7.18 (dd, J=7.6, 1.3 Hz, 1 H, 22-CH), 7.07 (app. td, J=7.6, 1.3 Hz, 1 H, 20-CH), 6.90 (dd, J=7.6, 1.3 Hz, 1 H, 19-CH), 6.77 (app. td, J=7.6, 1.3 Hz, 1 H, 21-CH), 4.63 (s, 1 H, 23-CH), 4.56 - 4.59 (m, 1 H, 30-CH), 4.52 (d, J=15.5 Hz, 1 H, 32-CH), 4.46 - 4.50 (m, 1 H, 28-CH), 4.35 (d, J=15.5 Hz, 1 H, 32-CH), 4.09 (s, 2 H, 10-CH₂), 3.86 - 3.92 (m, 1 H, 27-CH), 3.76 - 3.82 (m, 1 H, 27-CH), 3.60 (t, J=6.6 Hz, 2 H, 9-CH₂), 2.47 (s, 3 H, 40-CH₃), 2.18 - 2.32 (m, 3 H, 2-CH₂,29-CH), 2.03 - 2.12 (m, 1 H, 29-CH), 1.68 (quin, J=6.6 Hz, 2 H, 8-CH₂), 1.56 - 1.64 (m, 2 H, 3-CH₂), 1.32 - 1.45 (m, 8 H, (4-7)-CH₂), 1.03 (s, 9 H, 25-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₆H₆₀N₇O₇S: 854.4275, found 854.4268.

【0192】

【化34】

【0193】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－（２－（（９－（２－（（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノニル）オキシ）アセトアミド）－３，３－ジメチルブタノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＰＲＯＴＡＣ１６）：一般的方法Ｈに従い、２７ｇ（６６．７ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ１６（５８．２ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ、収率９６％）を淡黄色固体として得た。生物学的評価の前に、ＰＲＯＴＡＣをセミ分取ＨＰＬＣ（Ｈ_２Ｏ中５～９５％のＭｅＣＮ、２６０ｎｍ、４５分のグラジエント）によってさらに精製した。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.86 (s, 1 H, 40-CH), 7.97 (d, J=8.6 Hz, 2 H, 16-CH), 7.76 (d, J=8.6 Hz, 2 H, 15-CH), 7.45 (d, J=8.3 Hz, 2 H, 37-CH), 7.39 (d, J=8.3 Hz, 2 H, 36-CH), 7.18 (dd, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 24-CH), 7.07 (app. td, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 22-CH), 6.90 (dd, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 21-CH), 6.76 (app. td, J=7.7, 1.1 Hz, 1 H, 23-CH), 4.69 (s, 1 H, 25-CH), 4.56 - 4.61 (m, 1 H, 32-CH), 4.53 (d, J=15.5 Hz, 1 H, 34-CH), 4.46 - 4.50 (m, 1 H, 30-CH), 4.34 (d, J=15.5 Hz, 1 H, 34-CH), 4.07 (s, 2 H, 12-CH₂), 3.97 (d, J=15.4 Hz, 1 H, 2-CH₂), 3.92 (d, J=15.4 Hz, 1 H, 2-CH₂), 3.83 - 3.90 (m, 1 H, 29-CH), 3.75 - 3.82 (m, 1 H, 29-CH), 3.50 - 3.59 (m, 4 H, 3,11-CH₂), 2.46 (s, 3 H, 42-CH₃), 2.17 - 2.26 (m, 1 H, 31-CH), 2.03 - 2.11 (m, 1 H, 31-CH), 1.59 - 1.69 (m, 4 H, 4,10-CH₂), 1.32 - 1.44 (m, 10 H, (5-9)-CH₂), 1.03 (s, 9 H, 27-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₈H₆₄N₇O₈S: 898.4537, found 898.4531.

【0194】

【化35】

【0195】

Ｎ１－（４－（（２－アミノ－４－フルオロフェニル）カルバモイル）フェニル）－Ｎ１２－（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）ドデカンジアミド（ＰＲＯＴＡＣ１７）：一般的方法Ｈに従い、２７ｈ（５８．７ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ１７（４９．２ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ、収率９２％）を淡黄色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.86 (s, 1 H, 39-CH), 7.94 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 15-CH), 7.72 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 14-CH), 7.43 - 7.47 (m, 2 H, 36-CH), 7.37 - 7.42 (m, 2 H, 35-CH), 7.11 (dd, J_HH=8.6, J_HF=6.0 Hz, 1 H, 23-CH), 6.58 (dd, J_HF=10.7, J_HH=2.8 Hz, 1 H, 20-CH), 6.41 (app. td, J_HF=8.6, J_HH =8.6, 2.8 Hz, 1 H, 22-CH), 4.63 (s, 1 H, 24-CH), 4.55 - 4.60 (m, 1 H, 31-CH), 4.52 (d, J=15.5 Hz, 1 H, 33-CH), 4.47 - 4.50 (m, 1 H, 29-CH), 4.35 (d, J=15.5 Hz, 1 H, 33-CH), 3.86 - 3.93 (m, 1 H, 28-CH), 3.76 - 3.82 (m, 1 H, 28-CH), 2.46 (s, 3 H, 41-CH₃), 2.39 (t, J=7.5 Hz, 2 H, 11-CH₂), 2.17 - 2.31 (m, 3 H, 2-CH₂,30-CH), 2.03 - 2.12 (m, 1 H, 30-CH), 1.69 (quin, J=7.5 Hz, 2 H, 10-CH₂), 1.53 - 1.63 (m, 2 H, 3-CH₂), 1.29 - 1.37 (m, 12 H, (4-9)-CH₂), 1.03 (s, 9 H, 26-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₇H₆₁FN₇O₆S: 870.4388, found 870.4376.

【0196】

【化36】

【0197】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－（２－（（９－（２－（（４－（（２－アミノ－４－フルオロフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）ノニル）オキシ）アセトアミド）－３，３－ジメチルブタノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＰＲＯＴＡＣ２０）：一般的方法Ｈに従って、２７ｉ（７０．８ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ２０（６３．３ｍｇ、０．０６８、収率９８％）を薄茶色の固体として得た。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.86 (s, 1 H, 40-CH), 7.96 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 16-CH), 7.75 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 15-CH), 7.42 - 7.47 (m, 2 H, 37-CH), 7.37 - 7.42 (m, 2 H, 36-CH), 7.11 (dd, J_HH=8.6, J_HF=6.1 Hz, 1 H, 24-CH), 6.58 (dd, J_HF=10.7, J_HH=2.8 Hz, 1 H, 20-CH), 6.41 (td, J_HF=8.6, J_HH=8.6, 2.8 Hz, 1 H, 23-CH), 4.68 (s, 1 H, 25-CH), 4.59 (dd, J=9.0, 7.8 Hz, 1 H, 32-CH), 4.52 (d, J=15.6 Hz, 1 H, 34-CH), 4.47 - 4.50 (m, 1 H, 30-CH), 4.34 (d, J=15.6 Hz, 1 H, 34-CH), 4.07 (s, 2 H, 12-CH₂), 3.95 (d, J=15.4 Hz, 1 H, 2-CH₂), 3.94 (d, J=15.4 Hz, 1 H, 2-CH₂), 3.84 - 3.89 (m, 1 H, 29-CH), 3.74 - 3.82 (m, 1 H, 29-CH), 3.50 - 3.59 (m, 4 H, (3,11)-CH₂), 2.46 (s, 3 H, 42-CH₃), 2.18 - 2.27 (m, 1 H, 31-CH), 2.02 - 2.12 (m, 1 H, 31-CH), 1.58 - 1.68 (m, 4 H, (4,10)-CH₂), 1.32 - 1.43 (m, 12 H, (5-9)-CH₂), 1.03 (s, 9 H, 27-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₈H₆₃FN₇O₈S: 916.4443, found 916.4426.

【0198】

【化37】

【0199】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－１４－（（４－（（２－アミノ－５－（チオフェン－２－イル）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－４，１４－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－３－アザテトラデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＰＲＯＴＡＣ２２）：一般的方法Ｈに従い、２７ｊ（３０．３ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ２２（２６．８ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ、収率９９％）を淡黄色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.84 (s, 1 H, 39-CH), 7.98 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 11-CH), 7.75 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 10-CH), 7.49 (d, J=2.1 Hz, 1 H, 19-CH), 7.40 - 7.44 (m, 2 H, 36-CH), 7.36 - 7.39 (m, 2 H, 35-CH), 7.34 (dd, J=8.3, 2.1 Hz, 1 H, 17-CH), 7.22 (d, J=5.0 Hz, 1 H, 23-CH), 7.19 (d, J=3.7 Hz, 1 H, 21-CH), 7.01 (dd, J=5.0, 3.7 Hz, 1 H, 22-CH), 6.89 (d, J=8.3 Hz, 1 H, 16-CH), 4.68 (s, 1 H, 24-CH), 4.54 - 4.60 (m, 1 H, 31-CH), 4.51 (d, J=15.5 Hz, 1 H, 33-CH), 4.46 - 4.49 (m, 1 H, 29-CH), 4.31 (d, J=15.5 Hz, 1 H, 33-CH), 4.15 (d, J=15.8 Hz, 1 H, 7-CH), 4.09 (d, J=15.8 Hz, 1 H, 7-CH), 4.02 (d, J=15.6 Hz, 1 H, 2-CH), 3.91 (d, J=15.6 Hz, 1 H, 2-CH), 3.82 - 3.87 (m, 1 H, 28-CH), 3.69 - 3.81 (m, 9 H, 28-CH,(3-6)-CH₂), 2.45 (s, 3 H, 41-CH₃), 2.16 - 2.24 (m, 1 H, 30-CH), 2.03 - 2.11 (m, 1 H, 30-CH), 1.02 (s, 9 H, 26-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₇H₅₆N₇O₉S₂: 926.3581, found 926.3556.
代替ＶＨＬリガンドを含むＨＤＡＣ ＰＲＯＴＡＣの合成

【0200】

【化38】

【0201】

ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（１２－ブロモデカンアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（２９）：一般的方法Ｅに従い、２８（３３２．６ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）および１１ａ（３００．０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）から２９を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、２９（２０７．０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、収率３８％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₀H₄₃ ⁸¹BrN₃O₄: 590.2416, found 590.2411.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（１２－（２－（（（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－アセトアミド－３，３－ジメチルブタノイル）－４－ヒドロキシピロリジン－２－カルボキサミド）メチル）－５－（４－メチルチアゾール－５－イル）フェノキシ）ドデカンアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（３０ａ）：一般的方法Ｉに従い、（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－アセトアミド－３，３－ジメチルブタノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（２－ヒドロキシ－４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＶＨ ０３２フェノール、１７．２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）および２９（２０．０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）から３０ａを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ）によって精製して、３０ａ（１７．８ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、収率５２％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₄H₇₄N₇O₉S: 996.5269 , found 996.5239.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（１２－（２－（（（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－（１－フルオロシクロプロパン－１－カルボキサミド）－３，３－ジメチルブタノイル）－４－ヒドロキシピロリジン－２－カルボキサミド）メチル）－５－（４－メチルチアゾール－５－イル）フェノキシ）ドデカンアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（３０ｂ）：一般的方法Ｉに従い、（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－（１－フルオロシクロプロパン－１－カルボキサミド）－３，３－ジメチルブタノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（２－ヒドロキシ－４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＶＨ １０１フェノール、１８．６ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）および２９（２０．０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）から３０ｂを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１～１０％ＭｅＯＨ）により精製して、３０ｂ（２４．２ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、収率６４％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₆H₇₅FN₇O₉S: 1040.5331, found 1040.5304.

【0202】

【化39】

【0203】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２－アセトアミド－３，３－ジメチルブタノイル）－Ｎ－（２－（（１２－（（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－１２－オキソドデシル）オキシ）－４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）－４－ヒドロキシピロリジン－２－カルボキサミド（ＰＲＯＴＡＣ３５）：一般的方法Ｈに従って、３０ａ（１７．８ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ３５（１６．１ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、収率９９％）を白色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.86 (s, 1 H, 28-CH), 7.95 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 15-CH), 7.72 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 14-CH), 7.47 (d, J=8.2 Hz, 1 H, 32-CH), 7.17 (dd, J=7.7, 1.3 Hz, 1 H, 23-CH), 7.07 (app. td, J=7.7, 1.3 Hz, 1 H, 21-CH), 6.94 - 7.00 (m, 2 H, 25,31-CH), 6.90 (dd, J=7.7, 1.3 Hz, 1 H, 20-CH), 6.76 (app. td, J=7.7, 1.3 Hz, 1 H, 22-CH), 4.57 - 4.65 (m, 2 H, 36,41-CH), 4.48 - 4.52 (m, 1 H, 38-CH), 4.46 (d, J=16.1 Hz, 1 H, 34-CH), 4.39 (d, J=16.1 Hz, 1 H, 34-CH), 4.05 (t, J=6.3 Hz, 2 H, 1-CH₂), 3.86 - 3.92 (m, 1 H, 39-CH₂), 3.75 - 3.81 (m, 1 H, 39-CH₂), 2.48 (s, 3 H, 30-CH₃), 2.40 (t, J=7.5 Hz, 2 H, 11-CH₂), 2.17 - 2.25 (m, 1 H, 37-CH), 2.07 - 2.15 (m, 1 H, 37-CH), 1.99 (s, 3 H, 45-CH₃), 1.78 - 1.87 (m, 2 H, 2-CH₂), 1.71 (quin, J=7.3 Hz, 2 H, 10-CH₂), 1.46 - 1.56 (m, 2 H, 3-CH₂), 1.32 - 1.42 (m, 12 H, (4-9)-CH₂), 1.02 (s, 9 H, 43-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₉H₆₆N₇O₇S: 896.4744, found 896.4744.

【0204】

【化40】

【0205】

（２Ｓ，４Ｒ）－Ｎ－（２－（（１２－（（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－１２－オキソドデシル）オキシ）－４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）－１－（（Ｓ）－２－（１－フルオロシクロプロパン－１－カルボキサミド）－３，３－ジメチルブタノイル）－４－ヒドロキシピロリジン－２－カルボキサミド（ＰＲＯＴＡＣ３６）：一般的方法Ｈに従い、３０ｂ（２４．２ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を行い、続いてカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２～５％ＭｅＯＨ）による精製を行い、ＰＲＯＴＡＣ３６（１１．７ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、収率５７％）を白色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.86 (s, 1 H, 28-CH), 7.95 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 15-CH), 7.72 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 14-CH), 7.47 (d, J=7.7 Hz, 1 H, 32-CH), 7.17 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 23-CH), 7.06 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 21-CH), 6.96 - 7.02 (m, 2 H, 25,31-CH), 6.90 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 20-CH), 6.76 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 22-CH), 4.74 (d, J_HF=0.8 Hz, 1 H, 41-CH), 4.60 - 4.67 (m, 1 H, 36-CH), 4.49 - 4.53 (m, 1 H, 38-CH), 4.47 (d, J=16.0 Hz, 1 H, 34-CH), 4.39 (d, J=16.0 Hz, 1 H, 34-CH), 4.06 (t, J=6.3 Hz, 2 H, 1-CH₂), 3.82 - 3.88 (m, 1 H, 39-CH), 3.76 - 3.81 (m, 1 H, 39-CH), 2.48 (s, 3 H, 30-CH₃), 2.40 (t, J=7.5 Hz, 2 H, 11-CH₂), 2.19 - 2.27 (m, 1 H, 37-CH), 2.09 - 2.16 (m, 1 H, 37-CH), 1.78 - 1.89 (m, 2 H, 2-CH₂), 1.64 - 1.76 (m, 2 H, 10-CH₂), 1.48 - 1.57 (m, 2 H, 3-CH₂), 1.28 - 1.40 (m, 16 H, (4-9)-CH₂,46-CH₂), 1.04 (s, 9 H, 43-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₁H₆₇FN₇O₇S: 940.4807, found 940.4781.
ＩＡＰリガンドを含むＨＤＡＣ ＰＲＯＴＡＣの合成

【0206】

【化41】

【0207】

ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－２－（（２Ｓ，４Ｓ）－４－（１２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－１２－オキソドデカンアミド）－２－（（（Ｒ）－１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－１－イル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－１－シクロヘキシル－２－オキソエチル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）カルバメート（３２ａ）：一般的方法Ｋに従い、２６ａ（２４．３ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）およびＡ ４１００９９．１アミン（２４．５ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）から３２ａを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ）によって精製して、３２ａ（２６．１ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ、収率６０％）を淡黄色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₆₂H₈₉N₈O₁₀: 1105.6702, found 1105.6704.
ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－２－（（２Ｓ，４Ｓ）－４－（２－（２－（２－（２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）エトキシ）エトキシ）アセトアミド）－２－（（（Ｒ）－１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－１－イル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－１－シクロヘキシル－２－オキソエチル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）カルバメート（３２ｂ）：一般的方法Ｋに従い、３１（２４．０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）およびＡ ４１００９９．１アミン（２４．５ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）から３２ｂを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ）によって精製して、３２ｂ（３４．０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、収率８１％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₈H₈₁N₈O₁₃: 1097.5923, found 1097.5881.

【0208】

【化42】

【0209】

Ｎ^１－（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）－Ｎ^１２－（（３Ｓ，５Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－シクロヘキシル－２－（（Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパンアミド）アセチル）－５－（（（Ｒ）－１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－１－イル）カルバモイル）ピロリジン－３－イル）ドデカンジアミド（ＰＲＯＴＡＣ２６）：一般的方法Ｈに従って、３２ａ（２６．１ｍｇ、０．０２２７ｍｍｏｌ）の２か所のＢｏｃ脱保護を実行して、ＰＲＯＴＡＣ２６（２１．０ｍｇ、０．０２２３ｍｍｏｌ、収率９８％）を淡黄色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 7.95 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 15-CH), 7.73 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 14-CH), 7.35 - 7.42 (m, 1 H, 35-CH), 7.18 (dd, J=7.8, 1.2 Hz, 1 H, 23-CH), 7.11 - 7.15 (m, 2 H, 36,37-CH), 7.05 - 7.10 (m, 2 H, 21,38-CH), 6.90 (dd, J=7.8, 1.2 Hz, 1 H, 20-CH), 6.77 (app. td, J=7.8, 1.2 Hz, 1 H, 22-CH), 5.02 - 5.09 (m, 1 H, 29-CH), 4.41 - 4.53 (m, 3 H, 24,26,40-CH), 4.16 (dd, J=10.3, 6.2 Hz, 1 H, 27-CH), 3.57 (dd, J=10.3, 5.4 Hz, 1 H, 27-CH), 3.13 (q, J=6.8 Hz, 1 H, 48-CH), 2.72 - 2.84 (m, 2 H, 32-CH₂), 2.46 - 2.55 (m, 1 H, 25-CH), 2.40 (t, J=7.4 Hz, 2 H, 11-CH₂), 2.29 (s, 3 H, 50-CH₃), 2.19 (t, J=7.5 Hz, 2 H, 2-CH₂), 1.67 - 1.96 (m, 13 H, 10,30,31-CH₂,25,41,(42-46)-CH), 1.57 - 1.64 (m, 2 H, 3-CH₂), 1.32 - 1.42 (m, 12 H, (4-9)-CH₂), 1.23-1.29 (m, 3 H, (43-45)-CH), 1.20 (d, J=6.8 Hz, 3 H, 49-CH₃), 1.03 - 1.05 (m, 2 H, 42,46-CH). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₂H₇₃N₈O₆: 905.5653, found 905.5648.

【0210】

【化43】

【0211】

（２Ｓ，４Ｓ）－４－（２－（２－（２－（２－（（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－２－オキソエトキシ）エトキシ）エトキシ）アセトアミド）－１－（（Ｓ）－２－シクロヘキシル－２－（（Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパンアミド）アセチル）－Ｎ－（（Ｒ）－１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン－１－イル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＰＲＯＴＡＣ２８）：一般的方法Ｈに従って、３２ｂ（３４．０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の二重Ｂｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ２８（２６．８ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ、収率９５％）を白色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 7.98 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 11-CH), 7.80 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 10-CH), 7.33 - 7.39 (m, 1 H, 31-CH), 7.19 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 19-CH), 7.03 - 7.15 (m, 4 H, 17,32,33,34-CH), 6.90 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 16-CH), 6.75 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 18-CH), 5.00 - 5.08 (m, 1 H, 25-CH), 4.58 - 4.65 (m, 1 H, 20-CH), 4.46 (dd, J=8.9, 4.7 Hz, 1 H, 22-CH), 4.43 (d, J=8.4 Hz, 1 H, 36-CH), 4.08 - 4.18 (m, 3 H, 7-CH₂,23-CH), 4.01 (s, 2 H, 2-CH₂), 3.79 - 3.87 (m, 2 H, PEG-CH₂), 3.70 - 3.79 (m, 6 H, PEG-CH₂x 3), 3.62 - 3.68 (m, 1 H, 23-CH), 3.09 (q, J=6.8 Hz, 1 H, 44-CH), 2.68 - 2.85 (m, 2 H, 28-CH₂), 2.44 - 2.53 (m, 1 H, 21-CH₂), 2.26 (s, 3 H, 46-CH₃), 1.62 - 1.98 (m, 11 H, 26,27-CH₂,21,37,(38-42)-CH), 1.17 - 1.27 (m, 3 H, (39-41)-CH), 1.16 (d, J=6.9 Hz, 3 H, 45-CH₃), 0.98 - 1.13 (m, 2 H, 38,42-CH). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₈H₆₅N₈O₉: 897.4875, found 897.4860.
ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－（３－（（１２－（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル））アミノ）フェニル）カルバモイル）フェニル）アミノ）－１２－オキソドデシル）オキシ）ベンゾイル）チアゾール－２－イル）ピロリジン－１－イル）－１－シクロヘキシル－２－オキソエチル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）カルバメート（３３）：一般的方法Ｉに従い、ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－シクロヘキシル－２－（（Ｓ）－２－（４－（３－ヒドロキシベンゾイル）チアゾール－２－イル）ピロリジン－１－イル）－２－オキソエチル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）カルバメート（ＬＣＬ１６１フェノール、２０．５ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）および２９（２０．０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）から３３を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１～８％ＭｅＯＨ）により精製して、３３（１４．７ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、収率３７％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₆₁H₈₄N₇O₁₀S: 1106.6000, found 1106.5963.

【0212】

【化44】

【0213】

Ｎ－（２－アミノフェニル）－４－（１２－（３－（２－（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－シクロヘキシル－２－（（Ｓ）－２－（メチルアミノ）プロパンアミド）アセチル）ピロリジン－２－イル）チアゾール－４－カルボニル）フェノキシ）ドデカンアミド）ベンズアミド（ＰＲＯＴＡＣ３７）：一般的方法Ｈに従って、３３（１４．７ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）の２か所のＢｏｃ脱保護を行い、続いてカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～１０％ＭｅＯＨ）による精製を行い、ＰＲＯＴＡＣ３７（９．４ｍｇ、０．０１０３ｍｍｏｌ、収率８２％）を白い固体として得た。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.32 (s, 1 H, 32-CH), 7.95 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 15-CH), 7.65 - 7.76 (m, 4 H, 14,27,29-CH), 7.42 (app. t, J=8.0 Hz, 1 H, 26-CH), 7.15 - 7.22 (m, 2 H, 23,25-CH), 7.07 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 21-CH), 6.90 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 20-CH), 6.77 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 22-CH), 5.48 (dd, J=7.8, 3.1 Hz, 1 H, 34-CH), 4.52 - 4.60 (m, 1 H, 39-CH), 4.04 (t, J=6.4 Hz, 2 H, 1-CH₂), 3.95 - 4.01 (m, 1 H, 37-CH), 3.86 - 3.93 (m, 1 H, 37-CH), 3.20 (q, J=6.8 Hz, 1 H, 47-CH), 2.40 (t, J=7.5 Hz, 2 H, 11-CH₂), 2.29 - 2.37 (m, 4 H, 35-CH,49-CH₃), 2.18 - 2.28 (m, 2 H, 35,36-CH), 2.08 - 2.17 (m, 1 H, 36-CH), 1.77 - 1.85 (m, 2 H, 2-CH₂), 1.54 - 1.77 (m, 8 H, 10-CH₂,40-CH,(41-45)-CH),1.46 - 1.53 (m, 2 H, 3-CH₂), 1.32 - 1.43 (m, 12 H, (4-9)-CH₂), 1.24 (d, J=6.8 Hz, 3 H, 48-CH₃), 1.00 - 1.18 (m, 5 H, (41-45)-CH). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺calculated for C₅₁H₆₈N₇O₆S: 906.4952, found 906.4925.
ＣＲＢＮリガンドを含むＨＤＡＣ ＰＲＯＴＡＣの合成

【0214】

【化45】

【0215】

９－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ノナン酸（３５ａ）：ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（０．３０５ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン／水（２：１、２ｍＬ）溶液を、３４ａ（０．２２０ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）およびＮａＯＨ（０．０５１ｇ，１．２７ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン／水（２：１，７ｍＬ）溶液に０℃においてゆっくりと加え、その後混合物を室温で６４時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮して淡黄色固体（０．３９１ｇ）を得て、次に塩基性残渣を水（２０ｍＬ）に再溶解し、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で洗浄した。次いで、水相を１Ｍ ＨＣｌ（約２ｍＬ）でｐＨ１に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、３５ａ（０．２６０ｇ、０．９４ｍｍｏｌ、収率７４％）を透明黄色タール（ゆっくりと結晶化）として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₁₄H₂₈NO₄: 274.2018, found 274.2017.
１２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ドデカン酸（３５ｂ）：Ｂｏｃ_２Ｏ（２．２３ｇ、１０．２２ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン／水（２：１、１０ｍＬ）溶液を、３４ｂ（２．００ｇ、９．２９ｍｍｏｌ）およびＮａＯＨ（０．３７ｇ、９．２９ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン／水（２：１、５０ｍＬ）溶液に、０℃においてゆっくりと加え、室温で１８時間攪拌した。反応混合物を真空濃縮し、次いで塩基性残留物を水（１００ｍＬ）に再溶解し、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で洗浄した。次いで、水相を１Ｍ ＨＣｌ（約１５ｍＬ）でｐＨ１に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、３５ｂ（２．４１ｇ、７．５６ｍｍｏｌ、収率８１％）を綿毛状の白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₁₇H₃₃NO₄Na: 338.2307, found 338.2307.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（９－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ノナアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（３６ａ）：一般的方法Ｅに従って、３５ａ（２４７．５ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）および１１ａ（２５０．０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）から３６ａを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０～８０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、３６ａ（２５５．８ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、収率５７％）を得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₂H₄₇N₄O₆: 583.3496, found 583.3492.
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（１２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ドデカンアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（３６ｂ）：一般的方法Ｅに従って、３５ｂ（３１８ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）および１１ａ（３００ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）から３６ｂを得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、３６ｂ（３７４ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ、収率６５％）を淡黄色の結晶固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₃₅H₅₂N₄O₆Na: 647.3785, found 647.3792.
４－（９－アミノノナンアミド）－Ｎ－（２－アミノフェニル）ベンズアミド（３７ａ）：一般的方法Ｃに従い、３６ａ（９６．０ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、３７ａ（５４．０ｍｇ、０．１４０ｍｍｏｌ、収率８５％）を淡黄色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₂₂H₃₁N₄O₂: 383.2447, found 383.2440.
４－（１２－アミノドデカンアミド）－Ｎ－（２－アミノフェニル）ベンズアミド（３７ｂ）： 一般的方法Ｃに従って、３６ｂ（１５９ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、３７ｂ（１０４ｍｇ、０．２４２ｍｍｏｌ、収率９５％）を淡黄色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₂₅H₃₇N₄O₂: 425.2917, found 425.2918.

【0216】

【化46】

【0217】

Ｎ－（２－アミノフェニル）－４－（９－（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）アセトアミド）ノナンアミド）ベンズアミド（ＰＲＯＴＡＣ５）：一般的方法Ｊに従い、ＣＲＢＮ酸（３３．９ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）および３７ａ（３９．０ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）からＰＲＯＴＡＣ５を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）によって精製して、ＰＲＯＴＡＣ５（２２．５ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、収率３１％）を淡黄色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d4) δ_H ppm 7.94 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 12-CH), 7.79 (dd, J=8.4, 7.3 Hz, 1 H, 25-CH), 7.71 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 11-CH), 7.52 (dd, J=7.3, 0.5 Hz, 1 H, 26-CH), 7.41 (dd, J=8.4, 0.5 Hz, 1 H, 24-CH), 7.18 (app. dd, J=7.7, 1.4 Hz, 1 H, 20-CH), 7.08 (app. td, J= 7.7, 1.4 Hz, 1 H, 18-CH), 6.90 (app. dd, J=7.7, 1.4 Hz, 1 H, 17-CH), 6.77 (app. td, J=7.7, 1.4 Hz, 1 H, 19-CH), 5.13 (dd, J=12.5, 5.5 Hz, 1 H, 31-CH), 4.75 (s, 2 H, 22-CH₂), 3.29 - 3.33 (m, 2 H, 1-CH₂), 2.82 - 2.93 (m, 1 H, 34-CH), 2.66 - 2.79 (m, 2 H, 34-CH,35-CH), 2.39 (t, J=7.5 Hz, 2 H, 8-CH₂), 2.10 - 2.18 (m, 1 H, 35-CH), 1.70 (quin, J=7.1 Hz, 2 H, 7-CH₂), 1.58 (quin, J=7.1 Hz, 2 H, 2-CH₂), 1.35 - 1.40 (m, 8 H, (3-6)-CH₂). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₃₇H₄₁N₆O₈; 697.2986, found 697.2981.

【0218】

【化47】

【0219】

Ｎ－（２－アミノフェニル）－４－（１２－（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）オキシ）アセトアミド）ドデカンアミド）ベンズアミド（ＰＲＯＴＡＣ２）：一般的方法Ｊに従い、ＣＲＢＮ酸（３１．６ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）および３７ｂ（４０．４ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）からＰＲＯＴＡＣ２を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）によって精製して、ＰＲＯＴＡＣ２（２５．４ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ、収率３４％）を淡黄色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ_H ppm 11.11 (br s, 1 H, NH), 10.11 (s, 1 H, NH), 9.54 (s, 1 H, NH), 7.93 (d, J=8.8 Hz, 2 H, 15-CH), 7.91 (s, 1H, NH), 7.81 (dd, J=8.4, 7.2 Hz, 1 H, 28-CH), 7.70 (d, J=8.8 Hz, 2 H, 14-CH), 7.50 (d, J=7.2 Hz, 1 H, 29-CH), 7.39 (d, J=8.4 Hz, 1 H, 27-CH), 7.15 (dd, J=7.7, 1.4 Hz, 1 H, 23-CH), 6.96 (app. td, J=7.7, 1.4 Hz, 1 H, 21-CH), 6.78 (dd, J=7.7, 1.4 Hz, 1 H, 20-CH), 6.59 (app. td, J=7.7, 1.4 Hz, 1 H, 22-CH), 5.12 (dd, J=12.9, 5.4 Hz, 1 H, 34-CH), 4.87 (s, 2 H, NH₂), 4.76 (s, 2 H, 25-CH₂), 3.13 (q, J=6.5 Hz, 2 H, 1-CH₂), 2.85 - 2.95 (m, 1 H, 37-CH), 2.53 - 2.63 (m, 2 H, 37-CH,38-CH), 2.33 (t, J=7.4 Hz, 2 H, 11-CH₂), 2.00 - 2.07 (m, 1 H, 38-CH), 1.59 (quin, J=7.0 Hz, 2 H, 10-CH₂), 1.39 - 1.47 (m, 2 H, 2-CH₂), 1.23 - 1.31 (m, 14 H, (3-9)-CH₂). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₀H₄₇N₆O₈: 739.3455, found 739.3455.
ＶＨＬリガンドを含むＨＤＡＣ ＰＲＯＴＡＣを合成するためのクリックケミストリーの利用

【0220】

【化48】

【0221】

４－（｛［（Ｐｒｏｐ－２－ｙｎ－１－イルオキシ）カルボニル］アミノ｝メチル）安息香酸（３８）：プロパルギルアルコール（０．１２ｍＬ、１．９８ｍｍｏｌ）およびカルボニルジイミダゾール（０．３２ｇ、１．９８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、１０℃で１時間攪拌した。４－（アミノメチル）安息香酸（０．３０ｇ、１．９８ｍｍｏｌ）、ＤＢＵ（０．２９ｍＬ、１．９８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．２７ｍＬ、１．９８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に懸濁させ、ＣＤＩ中間体溶液を合わせ、反応物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、Ｈ_２Ｏ（１０ｍＬ）に懸濁させ、溶液を１Ｍ ＨＣｌ溶液でｐＨ５に酸性化した。得られた沈殿物を重力濾過によって回収し、風乾して３８（０．３５ｇ、収率７５％）を白色粉末として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₁₂H₁₂NO₄: 234.0766, found 234.0764.
ｔｅｒｔ－ブチル－Ｎ－｛２－［４－（｛［（ｐｒｏｐ－２－ｙｎ－１－イルオキシ）カルボニル］アミノ｝メチル）ベンズアミド］フェニル｝カルバメート（３９）：３８およびＨＡＴＵ（０．４９ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、室温で１時間撹拌した。ｔｅｒｔ－ブチル－Ｎ－（２－アミノフェニル）カルバメート（０．１８ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．３０ｍＬ、１．７１ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）に懸濁した。有機溶液を飽和ＮａＨＣＯ_３（２×２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、有機層を合わせ、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗油状物をシリカのフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ３０：７０～５０：５０グラジエント）により精製して、３９（０．２８ｇ、収率７６％）を淡いピンク色オイルとして得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₂₃H₂₆N₃O₅:424.1872, found 424.1871.
８－（４－（（（（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）ベンジル）カルバモイル）オキシ）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）オクタン酸（４０）：３９（０．１３ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、８－アジド－オクタン酸（０．０５ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）およびＣｕＩ（０．０１ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下で脱気したＤＭＦ：ＭｅＣＮ（５ｍＬ、２：１）に懸濁させた。２，６－ルチジン（０．０６ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に懸濁し、飽和ＮａＨＣＯ_３で洗浄した。ＮａＨＣＯ_３（２×１０ｍＬ）、ブライン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、有機層を合わせ、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗油状物をシリカのフラッシュクロマトグラフィー（３～５％ＭｅＯＨ：ＤＣＭ溶媒グラジエント）により精製して、４０（０．０８ｇ、４６％）を淡白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₃₁H₄₀N₆O₇Na: 631.2856, found 631.2856.
（１－（８－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－８－オキソオクチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル（４－（（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）フェニル）カルバモイル）ベンジル）カルバメート（４１）：一般的方法Ｇに従い、４０（０．０７５ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびＶＨ＿０３２アミン（０．０５ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）から４１を得た。粗生成物をシリカでのフラッシュクロマトグラフィー（２～７％ＭｅＯＨ：ＤＣＭ溶媒グラジエント）により精製して、４１（０．０８ｇ、７８％）を淡白色の結晶固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₅₃H₆₈N₁₀O₉SNa: 1043.4789, found 1043.4758.

【0222】

【化49】

【0223】

（１－（８－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－８－オキソオクチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）ベンジル）カルバメート（ＰＲＯＴＡＣ２９）：一般的方法Ｈに従って、４１（０．０８ｇ、０．０８ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実施して、ＰＲＯＴＡＣ２９（０．０６ｇ、８４％）を淡白色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δH ppm 8.75 (s, 1H, 45-CH), 7.87 (s, 1H, 1-CH), 7.82 (m, 2H, 9-CH), 7.35-7.33 (m, 2H, 41-CH), 7.31-7.27 (m, 4H, 8-CH, 42-CH), 7.08-7.06 (m, 1H, 14-CH), 6.98-6.94 (m, 1H, 16-CH), 6.80-6.77 (m, 1H, 17-CH), 6.67-6.63 (m, 1H, 15-CH), 5.05 (s, 2H, 3-CH₂), 4.51 (s, 1H, 29-CH), 4.47-4.39 (m, 2H, 36-CH, 39-CH), 4.38-4.36 (m, 1H, 34-CH), 4.28-4.19 (m, 3H, 20-CH₂, 39-CH), 4.25 (s, 2H, 6-CH₂), 3.79-3.76 (m, 1H, 33-CH), 3.69-3.65 (m, 1H, 33-CH), 2.35 (s, 3H, 47-CH₃), 2.17-2.06 (m, 3H, 26-CH₂, 35-CH), 1.99-1.92 (m, 1H, 35-CH), 1.80-1.73 (m, 2H, 21-CH₂), 1.49-1.42 (m, 2H, 25-CH₂), 1.23-1.14 (m, 6H, 22-CH₂, 23-CH₂, 24-CH₂). 0.91 (s, 9H, 31-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calculated for C₄₈H₆₀N₁₀O₇SNa: 943.4265, found 943.4246.
ＶＨＬリガンドの不活性異性体を使用したＰＲＯＴＡＣ４ネガティブコントロールの合成

【0224】

【化50】

【0225】

ｔｅｒｔ－ブチル（２－（４－（１２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）））ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－１２－オキソドデカンアミド）ベンズアミド）フェニル）カルバメート（２７ａ＊）：０℃の２６ａ（５１．４ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．０４ｍＬ、０．２３８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（３９．３ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１５分間攪拌し、その後（２Ｓ，４Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－アミノ－３，３－ジメチル－ブタノイル］－４－ヒドロキシ－Ｎ－［［４－（４－メチルチアゾール－５－イル）フェニル］メチル］ピロリジン－２－カルボキサミド二塩酸塩（ＶＨ＿０３２＊アミン、４０．０ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液をゆっくり加え、得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、次いで飽和ＮａＨＣＯ_３（２×５ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、暗黄色のタール（１０４ｍｇ）を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０～５％ＭｅＯＨ）によって精製して、２７ａ＊（５０．８ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ、収率６７％）を白色固体として得た。HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₅₂H₇₀N₇O₈S: 952.5007, found 952.4999.

【0226】

【化51】

【0227】

Ｎ１－（４－（（２－アミノフェニル）カルバモイル）フェニル）－Ｎ１２－（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）ドデカンジアミド（ＮＣ－ＰＲＯＴＡＣ４）：一般的方法Ｈに従って、２７ａ＊（２９．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）のＢｏｃ脱保護を実行して、ＮＣ－ＰＲＯＴＡＣ４（２５．６ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ、収率９８％）を淡黄色固体として得た。生物学的評価の前に、生成物をセミ分取ＨＰＬＣ（Ｈ_２Ｏ中の５～９５％ＭｅＣＮ、２６０ｎｍ、４５分のグラジエント）によってさらに精製した。¹H NMR (400 MHz, Methanol-d₄) δ_H ppm 8.86 (s, 1 H, 39-CH) 7.95 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 15-CH) 7.72 (d, J=8.7 Hz, 2 H, 14-CH) 7.44 (d, J=8.5 Hz, 2 H, 36-CH) 7.40 (d, J=8.5 Hz, 2 H, 35-CH) 7.18 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 23-CH) 7.07 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 21-CH) 6.90 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 20-CH) 6.76 (app. td, J=7.8, 1.3 Hz, 1 H, 22-CH), 4.47 - 4.58 (m, 3 H, 24-CH,31-CH,33-CH) 4.32 - 4.40 (m, 2 H, 29-CH,33-CH) 4.03 (dd, J=10.5, 5.1 Hz, 1 H, 28-CH) 3.69 (dd, J=10.5, 3.5 Hz, 1 H, 28-CH) 2.47 (s, 3 H, 41-CH₃) 2.42 - 2.45 (m, 1 H, 30-CH) 2.40 (t, J=7.4 Hz, 2 H, 11-CH₂) 2.18 - 2.32 (m, 2 H, 2-CH₂) 1.97 (dt, J=13.3, 4.3 Hz, 1 H, 30-CH) 1.70 (quin, J=7.4 Hz, 2 H, 10-CH₂) 1.53 - 1.63 (m, 2 H, 3-CH₂) 1.33 - 1.39 (m, 4 H, 4-CH₂,9-CH₂) 1.29 - 1.33 (m, 8 H, (5-8)-CH₂) 1.03 (s, 9 H, 26-CH₃). HRMS (ESI) m/z: [M+H]⁺ calculated for C₄₇H₆₂N₇O₆S: 852.4482, found 852.4483.
ＣｏＲＥＳＴ錯体を用いたインビトロＨＤＡＣアッセイ
ＬＳＤ１－ＨＤＡＣ－ＣｏＲＥＳＴ錯体に対する阻害試験は、２酵素蛍光ベースのＨＤＡＣアッセイを使用して実行された。阻害剤／ＰＲＯＴＡＣをＤＭＳＯに５０ｍＭで溶解し、ＨＤＡＣアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して１：２段階希釈を行い、濃度範囲を得た。これらの溶液１０μＬを個々のウェルに添加し、続いてＨＤＡＣアッセイ緩衝液（１８ｎＭ）に溶解したＨＤＡＣ錯体２０μＬおよびＨＤＡＣアッセイ緩衝液に溶解した基質Ｂｏｃ－（Ａｃ）Ｌｙｓ－ＡＭＣ２０μＬを添加した。

【0228】

アッセイは、ウェルあたり５０μＬの反応量で黒の９６ウェルプレートで実行された。すべての決定は三重に行った。阻害剤を含まない対照ウェルを使用して、阻害がいつ停止したかを決定した。３７℃、１５０ｒｐｍにおいて２０分間インキュベーションした後、トリプシン（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍＬトリプシン）を含む展開液５０μＬを添加して脱アセチル化を停止した。蛍光強度はプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、２０３０マルチラベルリーダー、ＶＩＣＴＯＲ Ｘ５、λ_ｅｘ ３３５ｎｍ、λ_ｅｍ ４６０ｎｍ）で測定した。ＨＤＡＣ活性は、ウェル蛍光から平均ブランク蛍光を差し引くことによって計算した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを利用して、ＩＣ５０値を決定した。

【0229】

細胞株および材料
Ｅ１４野生型（ＷＴ）マウス胚性幹（ｍＥＳ）細胞は、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｆ９６６５）、１Ｘ グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、１０３７８－０１６）、１００μＭ β－メルカプトエタノール（シグマ）および白血病抑制因子（社内で合成）を添加したノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ、１０８２９－０１８）からなる標準的なｍＥＳ培地中のゼラチン化プレート上で維持された。ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）および１Ｘ グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、１０３７８－０１６）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ、４１９６５－０３９）で増殖させた。両方の細胞株を３７℃において、５％ＣＯ_２でインキュベートした。対照としてＨＤＡＣ阻害剤ＣＩ－９９４（１０／４０μＭ）およびパノビノスタット（３０ｎＭ）と共にＰＲＯＴＡＣ（０．０１～４０μＭ）を用いて細胞を処理した。

【0230】

ウェスタンブロッティング
ＨＣＴ１１６細胞またはｍＥＳ細胞は、播種の２４時間後に処理された。処理の２４時間後、細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８３４０）を含む溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ－４０、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で溶解し、氷上で３０分間インキュベートした後、遠心分離を行った（１８，０００ｒｃｆ、１５分、４℃）。上清を回収し、タンパク質アッセイ色素試薬濃縮物（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用したブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を定量化した。ヒストン抽出のために、等量の０．４Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４をペレットに添加し、抽出物を４℃において一晩置いた。一晩インキュベートした後、チューブを遠心分離し（１８，０００ｒｃｆ、１５分、４℃）、上清（ヒストン抽出物）を回収した。

【0231】

ウエスタンブロットは、ＮｕＰＡＧＥＴＭ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（４Ｘ）を使用して、レーンあたり２０～３０μｇのタンパク質または１０μＬの酸抽出ヒストンをロードしたＮｕＰＡＧＥＴＭ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルで実行した。サイズ基準にはＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｌｕｓ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｌａｄｄｅｒを使用した。１４０Ｖで７５～９０分間ゲル電気泳動した後、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に３０Ｖで６０分間転写した。メンブレンを一次抗体（以下にリストされる）で６０～９０分間プローブした。ブロットは、相補的なＩＲＤｙｅ共役二次抗体で展開され、バンドはＯｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して可視化された。Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅを使用して、画像処理およびバンド強度の定量化を実行した。

【0232】

抗体情報
一次抗体；
α－チューブリン－Ｓｉｇｍａ、ｔ５１６８（１：１０，０００希釈）
ＨＤＡＣ１－アブカム、１０９４１１（１：２，０００希釈）
ＨＤＡＣ２－メルク ミリポア、０５－８１４（１：２，０００希釈）
ＨＤＡＣ３－Ａｂｃａｍ、３２３６９（１：２，０００希釈）
Ｈ３－メルク ミリポア、０５－４９９（１：１，０００希釈）
Ｈ３Ｋ９Ａｃ－Ｕｐｓｔａｔｅ、０６－９４２（１：１，０００希釈）
Ｈ３Ｋ２７Ａｃ－メルク ミリポア、０７－３６０（１：１，０００希釈）
Ｈ３Ｋ５６Ａｃ－アクティブモチーフ、３９２８１（１：１，０００希釈）
二次抗体；
ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＬＴ－ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、９２６－６８０２３（１：１０，０００希釈）
ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ－ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、９２６－３２２１０（１：１０，０００希釈）
細胞生存率アッセイ
細胞死を分析するため、細胞は、播種の２４時間後にＤＭＳＯ、ＣＩ－９９４（４０μＭ）、またはＰＲＯＴＡＣ４（１～４０μＭ）を用いて処理された。処理の２４時間後、細胞を回収し、７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールで－２０℃で一晩固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後暗所において室温で３０分間、５０μｇのヨウ化プロピジウムおよびＲＮａｓｅ Ａ（１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベーションした。サンプルは、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えたＰＥ＿ＡチャネルでＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】