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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-26
(45)【発行日】2025-01-10
(54)【発明の名称】細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子、及びその利用
(51)【国際特許分類】
C07D 249/04 20060101AFI20241227BHJP
C07K 11/02 20060101ALI20241227BHJP
【ＦＩ】
C07D249/04 503
C07D249/04 CSP
C07K11/02 ZNA
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021508238
(86)(22)【出願日】2020-02-14
(86)【国際出願番号】 JP2020005760
(87)【国際公開番号】W WO2020195302
(87)【国際公開日】2020-10-01
【審査請求日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】P 2019064519
(32)【優先日】2019-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000000941
【氏名又は名称】株式会社カネカ
(74)【代理人】
【識別番号】110004381
【氏名又は名称】弁理士法人ＩＴＯＨ
(72)【発明者】
【氏名】高津 慶士
(72)【発明者】
【氏名】鹿倉 敏裕
(72)【発明者】
【氏名】石場 優佳
(72)【発明者】
【氏名】馬渡 達也
(72)【発明者】
【氏名】前田 博文
(72)【発明者】
【氏名】北 寛士
(72)【発明者】
【氏名】北野 光昭
【審査官】神谷 昌克
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５２６８３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０８９６４８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】JAFARI,M.R. et al.，Light-responsive bicyclic peptides，Organic & Biomolecular Chemistry，2018年，Vol.16, No.41，pp.7588-7594，DOI 10.1039/c7ob03178e
【文献】ASSEM,N. et al.，Acetone-linked peptides: A convergent approach for peptide macrocyclization and labeling，Angewandte Chemie International Edition，2015年，Vol.54, No.30，pp.8665-8668，DOI 10.1002/anie.201502607
【文献】WERKHOVEN,P.R. et al.，Versatile convergent synthesis of a three peptide loop containing protein mimic of whooping cough pe，Journal of Peptide Science，2014年，Vol.20, No.4，pp.235-239，DOI 10.1002/psc.2624
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ｃ０７Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞膜透過性付与基と、ペプチドを環状化させる環状化基と、を有する細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子であって、
前記細胞膜透過性付与基と、前記ペプチドを環状化させる環状化基とが、連結基を介して連結しており、
前記細胞膜透過性付与基が樹状構造を有し、前記樹状構造の枝の末端にグアニジノ基が３つ導入されており、
前記ペプチドを環状化させる環状化基が、３，５－ビス（クロロメチル）ベンジル基であり、
下記構造式で表されることを特徴とする細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子。
【化1】
【請求項2】
前記ペプチドを環状化させる環状化基は、前記ペプチドを環状化させる環状化基により環状化されるペプチドに含まれるチオール基、アミノ基、及びヒドロキシ基からなる群から選択される少なくとも１種の基と反応するものである請求項１に記載の細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子。
【請求項3】
ペプチドと、前記ペプチドに導入された請求項１から２のいずれかに記載の細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子と、を有することを特徴とするペプチド複合体。
【請求項4】
請求項３に記載のペプチド複合体を有することを特徴とするペプチドライブラリ。
【請求項5】
ペプチドに、請求項１から２のいずれかに記載の細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子を導入する工程を含むことを特徴とするペプチド複合体の製造方法。
【請求項6】
前記ペプチドが、ペプチドライブラリに含まれるペプチドである請求項５に記載のペプチド複合体の製造方法。
【請求項7】
請求項４に記載のペプチドライブラリを用いて機能性ペプチドをスクリーニングする工程を含むことを特徴とする機能性ペプチドのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子、前記リンカー分子が導入されたペプチド複合体及びその製造方法、前記ペプチド複合体を含むペプチドライブラリ、及び前記ペプチドライブラリを用いた機能性ペプチドのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、様々なアミノ酸配列のペプチド（ポリペプチド）ライブラリの中から、特定の疾患に対する治療薬や、標的分子に親和性の高い分子などを選択することが行われるようになっている。
【0003】
前記ペプチドライブラリの作製方法として、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の方法として、ペプチド鎖、ｍＲＮＡ分子、及びリボソームを含むリボソームディスプレイ複合体を用いるリボソームディスプレイ法（ＲＤ法）が知られている（例えば、特許文献１参照）。前記ＲＤ法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系とｍＲＮＡさえあれば、それらを混合するだけで、１０１２種類以上のペプチドライブラリを数分で作製することができる非常に優れた有用なものである。
【0004】
一方で、抗体などのポリペプチドを機能性分子で化学的に修飾してその機能を拡張した医薬品の開発にも注目が集まっている。例えば、ペプチドは、環状化することで生体内での安定性が向上したり、環状化により構造が安定化することで、標的化合物への親和性や選択性が向上したり、分解酵素に対する耐性や細胞膜透過性が発現したりすることもあることが知られている。
【0005】
また、医薬品の開発においては、タンパク質や核酸などの様々な有効成分を細胞内に効率良く取り込めるようにすることも重要である。
【0006】
有効成分を細胞内に取り込む技術としては、例えば、塩基性アミノ酸を多く含む細胞膜透過ペプチドのアミノ酸配列を融合する方法や、中心から規則的に分枝した構造を有する樹状高分子であるデンドリマーを用いる方法（例えば、特許文献２参照）などが知られている。
【0007】
そのため、環状構造を有するペプチドに細胞膜透過性能を付与した分子は、貴重な創薬シーズとなり得ると考えられ、このようなペプチドを含むペプチドライブラリは、その探索に非常に有用な手段となる。
【0008】
これまでに、前記リボソーム複合体におけるペプチド鎖を簡便、容易に環状化（修飾）する技術として、修飾試薬による修飾を特定の時期に行うことで、ＲＮＡとそこから翻訳されたペプチドとを結合するリボソームの接着機能について、本来の機能を失うことなく維持することができることが知られている（例えば、特許文献３参照）。
【0009】
また、ペプチドの環状化と、細胞膜透過性の付与とを行う技術として、これらを段階的に行った例が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【0010】
しかしながら、ペプチドの環状化と、細胞膜透過性の付与とを同時に行うことができる技術は未だ開発されておらず、その速やかな開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【文献】特開２００８－２７１９０３号公報
【文献】米国特許第７，８６２，８０７号明細書
【文献】国際公開第２０１７／２１３１５８号
【非特許文献】
【0012】
【文献】Ｄｒ． Ｎａｉｌａ Ａｓｓｅｍ， Ｄａｖｉｄ Ｊ． Ｆｅｒｒｅｉｒａ， Ｐｒｏｆ．Ｄｒ． Ｄｅｎｎｉｓ Ｗ． Ｗｏｌａｎ， Ｐｒｏｆ．Ｄｒ． Ｐｈｉｌｉｐ Ｅ． Ｄａｗｓｏｎ、Ａｃｅｔｏｎｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１５、５４、８６６５－８６６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ペプチドの環状化と、ペプチドへの細胞膜透過性の付与とを同時に行うことができる細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子、前記リンカー分子が導入されたペプチド複合体及びその製造方法、前記ペプチド複合体を含むペプチドライブラリ、及び前記ペプチドライブラリを用いた機能性ペプチドのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、予想外にも、細胞膜透過性付与基と、ペプチドを環状化させる環状化基とが同一分子内に共存する分子を合成することができることを見出し、この分子を用いることで、ペプチドの環状化と、ペプチドへの細胞膜透過性の付与とを同時に行うことができることを知見した。
【0015】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 細胞膜透過性付与基と、ペプチドを環状化させる環状化基と、を有することを特徴とする細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子である。
＜２＞ ペプチドと、前記ペプチドに導入された前記＜１＞に記載のリンカー分子とを含むことを特徴とするペプチド複合体である。
＜３＞ 前記＜２＞に記載のペプチド複合体を含むことを特徴とするペプチドライブラリである。
＜４＞ ペプチドに、前記＜１＞に記載のリンカー分子を導入する工程を含むことを特徴とするペプチド複合体の製造方法である。
＜５＞ 前記＜３＞に記載のペプチドライブラリを用いて機能性ペプチドをスクリーニングする工程を含むことを特徴とする機能性ペプチドのスクリーニング方法である。
＜１＞ 細胞膜透過性付与基と、ペプチドを環状化させる環状化基と、を有することを特徴とする細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子である。
＜２＞ ペプチドと、前記ペプチドに導入された前記＜１＞に記載のリンカー分子とを含むことを特徴とするペプチド複合体である。
＜３＞ 前記＜２＞に記載のペプチド複合体を含むことを特徴とするペプチドライブラリである。
＜４＞ ペプチドに、前記＜１＞に記載のリンカー分子を導入する工程を含むことを特徴とするペプチド複合体の製造方法である。
＜５＞ 前記＜３＞に記載のペプチドライブラリを用いて機能性ペプチドをスクリーニングする工程を含むことを特徴とする機能性ペプチドのスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【0016】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ペプチドの環状化と、ペプチドへの細胞膜透過性の付与とを同時に行うことができる細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子、前記リンカー分子が導入されたペプチド複合体及びその製造方法、前記ペプチド複合体を含むペプチドライブラリ、及び前記ペプチドライブラリを用いた機能性ペプチドのスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【発明を実施するための形態】
【0018】
（細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子）
本発明の細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子（以下、「リンカー分子」と称することがある。）は、細胞膜透過性付与基と、ペプチドを環状化させる環状化基とを少なくとも有し、必要に応じて更に連結基などのその他の構成を有する。
本発明の細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子（以下、「リンカー分子」と称することがある。）は、細胞膜透過性付与基と、ペプチドを環状化させる環状化基とを少なくとも有し、必要に応じて更に連結基などのその他の構成を有する。
【0019】
前記リンカー分子は、下記一般式（１）で表すことができる。
Ａ－Ｂ－Ｃ ・・・ 一般式（１）
前記一般式（１）中、「Ａ」は環状化基、「Ｂ」は連結基又は単結合、「Ｃ」は細胞膜透過性付与基を表す。
Ａ－Ｂ－Ｃ ・・・ 一般式（１）
前記一般式（１）中、「Ａ」は環状化基、「Ｂ」は連結基又は単結合、「Ｃ」は細胞膜透過性付与基を表す。
【0020】
＜環状化基＞
前記環状化基は、後述するペプチドにおける反応性アミノ酸残基との反応により、前記ペプチドの環状化に寄与する。
前記反応性アミノ酸残基は、前記環状化基と反応するアミノ酸残基であり、前記環状化基と直接反応するアミノ酸残基であってもよいし、前記環状化基と反応できるように修飾されたアミノ酸残基であってもよい。
前記環状化基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、電子吸引基が好ましい。
前記環状化基は、後述するペプチドにおける反応性アミノ酸残基との反応により、前記ペプチドの環状化に寄与する。
前記反応性アミノ酸残基は、前記環状化基と反応するアミノ酸残基であり、前記環状化基と直接反応するアミノ酸残基であってもよいし、前記環状化基と反応できるように修飾されたアミノ酸残基であってもよい。
前記環状化基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、電子吸引基が好ましい。
【0021】
－電子吸引基－
前記電子吸引基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ハロゲンを有することが好ましい。
前記電子吸引基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ハロゲンを有することが好ましい。
【0022】
前記ハロゲンの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0023】
前記ハロゲンの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２以上が好ましい。
【0024】
前記電子吸引基は、２以上の塩素原子を有することが好ましく、置換基を有していてもよいベンジルクロリドがより好ましく、３，５－ビス（クロロメチル）ベンジル基が特に好ましい。
【0025】
前記環状化基によるペプチドの環状化は、前記環状化基と、ペプチドに含まれるチオール基、アミノ基、及びヒドロキシ基からなる群から選択される少なくとも１種の基との反応により行われることが好ましい。
【0026】
＜細胞膜透過性付与基＞
前記細胞膜透過性付与基は、前記ペプチドに細胞膜透過能を付与する基である。
前記細胞膜透過性付与基は、塩基性官能基を有することが好ましい。
前記細胞膜透過性付与基は、前記ペプチドに細胞膜透過能を付与する基である。
前記細胞膜透過性付与基は、塩基性官能基を有することが好ましい。
【0027】
前記細胞膜透過性付与基の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、樹状構造を有する態様が好ましい。
前記細胞膜透過性付与基における樹状構造単位の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１つであってもよいし、２以上であってもよい。
前記樹状構造単位１つあたりの枝の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３以上が好ましい。
前記樹状構造の枝の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記細胞膜透過性付与基における樹状構造単位の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１つであってもよいし、２以上であってもよい。
前記樹状構造単位１つあたりの枝の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３以上が好ましい。
前記樹状構造の枝の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0028】
－塩基性官能基－
前記塩基性官能基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グアニジノ基、アミノ基、イミダゾール基などが挙げられる。これらの中でも、グアニジノ基を有することが好ましい。前記塩基性官能基は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記塩基性官能基の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２以上が好ましい。
前記塩基性官能基は、２以上のグアニジノ基を有する態様が好ましい。
前記塩基性官能基の前記リンカー分子における位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記樹状構造の枝の末端に位置することが好ましい。
前記塩基性官能基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グアニジノ基、アミノ基、イミダゾール基などが挙げられる。これらの中でも、グアニジノ基を有することが好ましい。前記塩基性官能基は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記塩基性官能基の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２以上が好ましい。
前記塩基性官能基は、２以上のグアニジノ基を有する態様が好ましい。
前記塩基性官能基の前記リンカー分子における位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記樹状構造の枝の末端に位置することが好ましい。
【0029】
前記樹状構造を有する細胞膜透過性付与基の具体例としては、例えば、下記一般式（Ｃ）で表されるものなどが挙げられる。
前記一般式（Ｃ）は、枝の数が３である樹状構造を有する細胞膜透過性付与基を表し、式中「Ｙ」は塩基性官能基を表す。
なお、前記塩基性官能基は、全ての枝の末端に形成されていてもよいし、一部の枝の末端に形成されていてもよい。
また、前記細胞膜透過性付与基は、一般式（Ｃ）で表される樹状構造を複数有していてもよく、その場合、枝の数は、例えば、６、９などが挙げられる。
【化1】
なお、前記塩基性官能基は、全ての枝の末端に形成されていてもよいし、一部の枝の末端に形成されていてもよい。
また、前記細胞膜透過性付与基は、一般式（Ｃ）で表される樹状構造を複数有していてもよく、その場合、枝の数は、例えば、６、９などが挙げられる。
【0030】
＜その他の構成＞
前記リンカー分子におけるその他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、連結基などが挙げられる。
前記リンカー分子におけるその他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、連結基などが挙げられる。
【0031】
＜＜連結基＞＞
前記連結基は、前記細胞膜透過性付与基と、前記環状化基とを連結する基である。
前記連結基の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記連結基は、前記細胞膜透過性付与基と、前記環状化基とを連結する基である。
前記連結基の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0032】
前記リンカー分子の具体例としては、以下の構造式で表される化合物などが挙げられる。下記構造式で表されるリンカー分子は、環状化基として、３，５－ビス（クロロメチル）ベンジル基を有し、細胞膜透過性付与基として、樹状構造の末端にグアニジノ基を３つ有し、前記環状化基と前記細胞膜透過性付与基とが、連結基を介して連結している例である。
【化2】
【0033】
＜リンカー分子の製造方法＞
前記リンカー分子の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞膜透過性付与基前駆体形成工程と、前記細胞膜透過性付与基前駆体に連結基を導入する連結基導入工程と、前記連結基に環状化基前駆体を導入する工程と、前記細胞膜透過性付与基前駆体及び前記環状化基前駆体から細胞膜透過性付与基及び環状化基をそれぞれ形成する工程と、を含む方法などが挙げられる。
前記各工程は、公知の化学合成の技術を適宜選択して行うことができる。
例えば、前記細胞膜透過性付与基前駆体形成工程は、米国特許第７，８６２，８０７号明細書などに記載の方法により行うことができる。
前記リンカー分子の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞膜透過性付与基前駆体形成工程と、前記細胞膜透過性付与基前駆体に連結基を導入する連結基導入工程と、前記連結基に環状化基前駆体を導入する工程と、前記細胞膜透過性付与基前駆体及び前記環状化基前駆体から細胞膜透過性付与基及び環状化基をそれぞれ形成する工程と、を含む方法などが挙げられる。
前記各工程は、公知の化学合成の技術を適宜選択して行うことができる。
例えば、前記細胞膜透過性付与基前駆体形成工程は、米国特許第７，８６２，８０７号明細書などに記載の方法により行うことができる。
【0034】
得られたリンカー分子が所望の構造を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、公知の分析方法を適宜選択することができ、例えば、質量分析法、プロトン核磁気共鳴分光法、炭素１３核磁気共鳴分光法、紫外分光法、赤外分光法などの分析方法が挙げられる。
【0035】
本発明のリンカー分子によれば、ペプチドの環状化と、ペプチドへの細胞膜透過性の付与とを１工程で行うことができるので、簡易に短時間でこれらを達成することができる。
【0036】
（ペプチド複合体）
本発明のペプチド複合体は、ペプチドと、前記ペプチドに導入された本発明のリンカー分子とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
本発明のペプチド複合体は、ペプチドと、前記ペプチドに導入された本発明のリンカー分子とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【0037】
＜ペプチド＞
前記ペプチドとしては、前記リンカー分子を導入することにより環状化される限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記リンカー分子の導入に利用するアミノ酸残基（以下、「反応性アミノ酸残基」と称することがある。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、システイン残基、リジン残基、セリン残基、スレオニン残基などが挙げられる。前記反応性アミノ酸残基は、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数としては、前記ペプチドを環状化する点で、２以上が好ましい。前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、反応点が多くなるとペプチドに結合する前記リンカー分子の数や位置が安定せず、アミノ酸配列に由来するペプチドの特性を比較し難くなる場合があるので、１０以下が好ましい。
なお、例えば、ペプチド中のシステイン残基がジスルフィド結合により前記ペプチドの高次構造の安定化に関与しているような場合には、別途、上記反応性アミノ酸残基を前記ペプチドに導入することが好ましい。
前記ペプチドとしては、前記リンカー分子を導入することにより環状化される限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記リンカー分子の導入に利用するアミノ酸残基（以下、「反応性アミノ酸残基」と称することがある。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、システイン残基、リジン残基、セリン残基、スレオニン残基などが挙げられる。前記反応性アミノ酸残基は、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数としては、前記ペプチドを環状化する点で、２以上が好ましい。前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、反応点が多くなるとペプチドに結合する前記リンカー分子の数や位置が安定せず、アミノ酸配列に由来するペプチドの特性を比較し難くなる場合があるので、１０以下が好ましい。
なお、例えば、ペプチド中のシステイン残基がジスルフィド結合により前記ペプチドの高次構造の安定化に関与しているような場合には、別途、上記反応性アミノ酸残基を前記ペプチドに導入することが好ましい。
【0038】
前記反応性アミノ酸残基の前記ペプチドにおける位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0039】
例えば、前記ペプチドとして、ｍＲＮＡ分子、その翻訳物であるペプチド鎖（以下、「ポリペプチド鎖」と称することもある。）、及びリボソームを含むリボソームディスプレイ複合体（以下、「ＲＤ複合体」と称することがある。）を用いる場合には、例えば、リボソームの出口トンネル（ｅｘｉｔ ｔｕｎｎｅｌ）から外に出ている部分であり、具体的にはＮ末端から２番目～Ｃ末端から３０番目の位置（Ｎ末端から２番目の位置及びＣ末端から３０番目の位置を含む）の間とすることが、前記リンカー分子による修飾反応がリボソームにより立体的に阻害され難くなり得る点で、好ましい。
前記Ｃ末端からの位置としては、Ｃ末端から５０番目が好ましく、１００番目がより好ましい。
また、前記反応性アミノ酸残基の位置をＮ末端側から数えた場合、その位置は、ペプチドの鎖長に応じて適宜設定できるが、例えば、Ｎ末端から２～１，０００番目の位置であり、Ｎ末端から２～１００番目の位置が好ましく、Ｎ末端から２～５０番目の位置がより好ましい。
前記Ｃ末端からの位置としては、Ｃ末端から５０番目が好ましく、１００番目がより好ましい。
また、前記反応性アミノ酸残基の位置をＮ末端側から数えた場合、その位置は、ペプチドの鎖長に応じて適宜設定できるが、例えば、Ｎ末端から２～１，０００番目の位置であり、Ｎ末端から２～１００番目の位置が好ましく、Ｎ末端から２～５０番目の位置がより好ましい。
【0040】
前記ＲＤ複合体の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０１７／２１３１５８号に記載の方法などが挙げられる。また、市販のキットを利用して製造することもできる。
【0041】
前記ペプチドのアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ペプチドライブラリとして有用であるように、特定の位置にランダム配列を含むものが好ましい。かかるランダム配列の中から、所定の目的に応じて有用なアミノ酸配列を特定し得る。
【0042】
前記ランダム配列の前記ペプチドにおける位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記反応性アミノ酸残基の位置と同様に、ＲＤ複合体を用いる場合には、Ｎ末端から２番目～Ｃ末端から３０番目の位置（Ｎ末端から２番目の位置及びＣ末端から３０番目の位置を含む）の間とすることが好ましい。即ち、反応性アミノ酸残基は、ランダム配列内に含まれることが好ましい。従ってランダム配列の好ましい位置は、反応性アミノ酸残基の好ましい位置と同じ範囲から設定できる。
【0043】
前記ランダム配列の前記ペプチドにおける数は、１つであってもよく、２つ以上であってもよい。前記ランダム配列の数の上限としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０以下が好ましい。
前記ランダム配列１つあたりのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１以上、３０以下とすることができる。
１つのランダム配列が長くなるほど、またランダム配列の数が多くなるほど、ペプチドライブラリの多様性を高めることができる。
前記ランダム配列１つあたりのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１以上、３０以下とすることができる。
１つのランダム配列が長くなるほど、またランダム配列の数が多くなるほど、ペプチドライブラリの多様性を高めることができる。
【0044】
前記ペプチドは、更に、ＦＬＡＧ（登録商標）配列やポリＨｉｓ配列等のポリペプチド鎖の精製のための配列、プロテアーゼなどにより選択的に切断される配列、スペーサー配列などを含んでいてもよい。
【0045】
前記ペプチドのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０以上、５，０００以下とすることができる。
前記ペプチドのアミノ酸残基数の下限値としては、１５０以上が好ましく、２００以上がより好ましい。また、ペプチドのアミノ酸残基数の上限値としては、８００以下が好ましく、６００以下がより好ましく、５００以下が特に好ましい。前記下限値と上限値とは、適宜組み合わせて選択することができる。
前記ペプチドのアミノ酸残基数の下限値としては、１５０以上が好ましく、２００以上がより好ましい。また、ペプチドのアミノ酸残基数の上限値としては、８００以下が好ましく、６００以下がより好ましく、５００以下が特に好ましい。前記下限値と上限値とは、適宜組み合わせて選択することができる。
【0046】
前記ペプチドの合成方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【0047】
＜リンカー分子＞
前記リンカー分子は、上記した本発明の細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子である。
前記リンカー分子は、前記リンカー分子における環状化基と、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基とが反応することにより前記ペプチドに導入される。前記反応の際に、前記環状化基の構造は変化する。
前記リンカー分子は、上記した本発明の細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子である。
前記リンカー分子は、前記リンカー分子における環状化基と、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基とが反応することにより前記ペプチドに導入される。前記反応の際に、前記環状化基の構造は変化する。
【0048】
＜その他の構成＞
前記ペプチド複合体におけるその他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光物質などの発光物質、色素、放射性物質、薬剤、毒素、核酸、アミノ酸、糖類、脂質、各種ポリマーなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記蛍光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などの蛍光色素が挙げられる。
前記その他の構成は、例えば、上記したペプチドに、直接又は連結基などを介して結合させることができる。
前記ペプチド複合体におけるその他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光物質などの発光物質、色素、放射性物質、薬剤、毒素、核酸、アミノ酸、糖類、脂質、各種ポリマーなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記蛍光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などの蛍光色素が挙げられる。
前記その他の構成は、例えば、上記したペプチドに、直接又は連結基などを介して結合させることができる。
【0049】
（ペプチド複合体の製造方法）
本発明のペプチド複合体の製造方法は、ペプチドに、本発明のリンカー分子を導入するリンカー分子導入工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明のペプチド複合体の製造方法は、ペプチドに、本発明のリンカー分子を導入するリンカー分子導入工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【0050】
＜リンカー分子導入工程＞
前記リンカー分子導入工程は、ペプチドに、本発明のリンカー分子を導入する（以下、「結合させる」、「挿入する」、「連結する」と称することもある。）工程である。
前記リンカー分子導入工程により、ペプチドの環状化と、ペプチドへの細胞膜透過性の付与とを同時に行うことができる。
前記リンカー分子導入工程では、反応物中における少なくとも１つのペプチドにリンカー分子が導入されればよいが、全てのペプチドにリンカー分子が導入されることが好ましい。
前記リンカー分子導入工程は、ペプチドに、本発明のリンカー分子を導入する（以下、「結合させる」、「挿入する」、「連結する」と称することもある。）工程である。
前記リンカー分子導入工程により、ペプチドの環状化と、ペプチドへの細胞膜透過性の付与とを同時に行うことができる。
前記リンカー分子導入工程では、反応物中における少なくとも１つのペプチドにリンカー分子が導入されればよいが、全てのペプチドにリンカー分子が導入されることが好ましい。
【0051】
－ペプチド－
前記ペプチドは、上記した（ペプチド複合体）の＜ペプチド＞の項目に記載したものと同様である。なお、前記ペプチドは、ペプチドライブラリの態様であってもよい。
前記ペプチドは、上記した（ペプチド複合体）の＜ペプチド＞の項目に記載したものと同様である。なお、前記ペプチドは、ペプチドライブラリの態様であってもよい。
【0052】
－導入－
前記導入の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、還元剤の存在下で、前記リンカー分子と、前記ペプチドとを反応させる方法などが挙げられる。
前記還元剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などが挙げられる。
前記反応の温度、時間等の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記導入の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、還元剤の存在下で、前記リンカー分子と、前記ペプチドとを反応させる方法などが挙げられる。
前記還元剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などが挙げられる。
前記反応の温度、時間等の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0053】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分取ＨＰＬＣを用いたペプチド複合体精製工程などが挙げられる。
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分取ＨＰＬＣを用いたペプチド複合体精製工程などが挙げられる。
【0054】
得られたペプチド複合体が所望の構造を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、公知の分析方法を適宜選択することができ、例えば、質量分析法、プロトン核磁気共鳴分光法、炭素１３核磁気共鳴分光法、紫外分光法、赤外分光法などの分析方法が挙げられる。
【0055】
（ペプチドライブラリ）
本発明のペプチドライブラリは、本発明のペプチド複合体を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記ペプチドライブラリは、本発明のペプチド複合体のみからなるものであってもよいし、環状化されていないペプチドが含まれていてもよい。
本発明のペプチドライブラリは、本発明のペプチド複合体を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記ペプチドライブラリは、本発明のペプチド複合体のみからなるものであってもよいし、環状化されていないペプチドが含まれていてもよい。
【0056】
前記ペプチドライブラリは、上記した（ペプチド複合体の製造方法）と同様にして、製造することができる。
【0057】
（機能性ペプチドのスクリーニング方法）
本発明の機能性ペプチドのスクリーニング方法は、本発明のペプチドライブラリを用いて機能性ペプチドをスクリーニングする工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記スクリーニングの方法としては、本発明のペプチドライブラリを用いる限り、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。例えば、所望の対象物質と、前記ペプチドライブラリとを混合し、結合したペプチド複合体（例えば、ＲＤ複合体）を選択し、前記ＲＤ複合体からＲＮＡを解離させ、前記ＲＮＡからＤＮＡを調製し、増幅した後、ｍＲＮＡに転写し、再度ＲＤ複合体ライブラリを作製するという工程を繰り返し、前記対象物質に対する親和性を有する機能性ペプチドをスクリーニングする方法などが挙げられる。
本発明の機能性ペプチドのスクリーニング方法は、本発明のペプチドライブラリを用いて機能性ペプチドをスクリーニングする工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記スクリーニングの方法としては、本発明のペプチドライブラリを用いる限り、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。例えば、所望の対象物質と、前記ペプチドライブラリとを混合し、結合したペプチド複合体（例えば、ＲＤ複合体）を選択し、前記ＲＤ複合体からＲＮＡを解離させ、前記ＲＮＡからＤＮＡを調製し、増幅した後、ｍＲＮＡに転写し、再度ＲＤ複合体ライブラリを作製するという工程を繰り返し、前記対象物質に対する親和性を有する機能性ペプチドをスクリーニングする方法などが挙げられる。
【実施例】
【0058】
以下に実施例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に何ら限定されるものではない。
【0059】
（調製例１：ペプチドの合成）
マイクロウェーブを用いた固相合成法により、リンクアミド（Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ）樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で、以下の配列を有するペプチドを合成した。
ＦＩＴＣ－Ａｈｘ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－ＮＨ２
［上記配列中、「ＦＩＴＣ」はフルオレセインイソチオシアネートを表し、「Ａｈｘ」は６－アミノヘキサン酸を表す。］
マイクロウェーブを用いた固相合成法により、リンクアミド（Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ）樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で、以下の配列を有するペプチドを合成した。
ＦＩＴＣ－Ａｈｘ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－ＮＨ２
［上記配列中、「ＦＩＴＣ」はフルオレセインイソチオシアネートを表し、「Ａｈｘ」は６－アミノヘキサン酸を表す。］
【0060】
前記ペプチドを形成した樹脂を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水／トリイソプロピルシラン／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（９２．５／２．５／２．５／２．５（容量比））に３時間浸漬し、前記ペプチドを樹脂から切り出した。
得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製し凍結乾燥することにより、上記配列を有するペプチド（以下、「Ｐ」と表すことがある。下記構造式参照。）を取得した。
前記ペプチドＰのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
ＥＳＩ－ＭＳ Ｃ７２Ｈ９２Ｎ１６Ｏ２２Ｏ３ 計算値（Ｍ＋２Ｈ＋）８１５．２９５、測定値８１４．６７
得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製し凍結乾燥することにより、上記配列を有するペプチド（以下、「Ｐ」と表すことがある。下記構造式参照。）を取得した。
前記ペプチドＰのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
ＥＳＩ－ＭＳ Ｃ７２Ｈ９２Ｎ１６Ｏ２２Ｏ３ 計算値（Ｍ＋２Ｈ＋）８１５．２９５、測定値８１４．６７
【化3】
【0061】
（実施例１：細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの合成）
＜化合物Ｃ１の合成＞
米国特許第７，８６２，８０７号明細書に記載の方法と同様の方法により、下記構造式で表される化合物Ｃ１を合成した。
なお、構造式中の「Ｂｏｃ」は、「ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基」を表す。
＜化合物Ｃ１の合成＞
米国特許第７，８６２，８０７号明細書に記載の方法と同様の方法により、下記構造式で表される化合物Ｃ１を合成した。
なお、構造式中の「Ｂｏｃ」は、「ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基」を表す。
【化4】
【0062】
＜化合物Ｃ３の合成＞
【化5】
【0063】
上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ３を合成した。
具体的には、化合物Ｃ１（５００ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１５ｍＬ）を０℃に冷却し、化合物Ｃ２（東京化成工業株式会社製、製品番号Ａ２２９３）（１１７．５ｍｇ，０．５０４ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（８５．１ｍｇ，０．６３０ｍｍｏｌ）と１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ／ＨＣｌ）（１２０ｍｇ，０．６３０ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１７時間撹拌した。ここにＨ２Ｏ（２０ｍＬ）を加え、塩化メチレンで抽出を行い（３０ｍＬで３回）、有機層は１Ｎ塩酸（２０ｍＬで２回）と飽和重曹水（２０ｍＬで２回）と水（２０ｍＬで２回）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥しろ過と濃縮を行い、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製（メタノール（ＭｅＯＨ）／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／１０）することにより、化合物Ｃ３を白色固体として取得した（５３３ｍｇ，０．３７９ｍｍｏｌ，収率９０％）。
前記化合物Ｃ３の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ １１．４（ｓ， ３Ｈ）， ８．５８（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．６９（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ６．８４（ｓ， １Ｈ）， ３．８９（ｓ， ２Ｈ）， ３．７１－３．６５（ｍ， ２２Ｈ）， ３．５６－３．５３（ｍ， ６Ｈ）， ３．４２－３．３８（ｍ， ８Ｈ）， ２．４３（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４８（ｓ， ２７Ｈ）
具体的には、化合物Ｃ１（５００ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１５ｍＬ）を０℃に冷却し、化合物Ｃ２（東京化成工業株式会社製、製品番号Ａ２２９３）（１１７．５ｍｇ，０．５０４ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（８５．１ｍｇ，０．６３０ｍｍｏｌ）と１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ／ＨＣｌ）（１２０ｍｇ，０．６３０ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１７時間撹拌した。ここにＨ２Ｏ（２０ｍＬ）を加え、塩化メチレンで抽出を行い（３０ｍＬで３回）、有機層は１Ｎ塩酸（２０ｍＬで２回）と飽和重曹水（２０ｍＬで２回）と水（２０ｍＬで２回）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥しろ過と濃縮を行い、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製（メタノール（ＭｅＯＨ）／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／１０）することにより、化合物Ｃ３を白色固体として取得した（５３３ｍｇ，０．３７９ｍｍｏｌ，収率９０％）。
前記化合物Ｃ３の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ １１．４（ｓ， ３Ｈ）， ８．５８（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．６９（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ６．８４（ｓ， １Ｈ）， ３．８９（ｓ， ２Ｈ）， ３．７１－３．６５（ｍ， ２２Ｈ）， ３．５６－３．５３（ｍ， ６Ｈ）， ３．４２－３．３８（ｍ， ８Ｈ）， ２．４３（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４８（ｓ， ２７Ｈ）
【0064】
＜化合物ＤＢＸＡの合成＞
水素化ナトリウム（１３２ｍｇ，３．０２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（６ｍＬ）に懸濁させ０℃に冷却した。ここに２－プロピン－１－オール（０．１６５ｍＬ，２．８０ｍｍｏｌ）を加え０℃で３０分間撹拌した。１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼン（１．００ｇ，２．８０ｍｍｏｌ）を加え２５℃で２０時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えてから水（１００ｍＬ）と飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで洗浄した。ろ過と濃縮を行い得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）で精製し（塩化メチレン／ヘキサン＝１／２）、下記構造式で表される化合物ＤＢＸＡ（４１６．６ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ，収率４５％）を淡黄色油状物として取得した。
前記化合物ＤＢＸＡの１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ ７．２９（ｓ， １Ｈ）， ７．２６（ｓ， ２Ｈ）， ４．５３（ｓ， ２Ｈ）， ４．４０（ｓ， ４Ｈ）， ４．１５（４ＪＨＨ＝２．５Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３（４ＪＨＨ＝２．０Ｈｚ， １Ｈ）
水素化ナトリウム（１３２ｍｇ，３．０２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（６ｍＬ）に懸濁させ０℃に冷却した。ここに２－プロピン－１－オール（０．１６５ｍＬ，２．８０ｍｍｏｌ）を加え０℃で３０分間撹拌した。１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼン（１．００ｇ，２．８０ｍｍｏｌ）を加え２５℃で２０時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えてから水（１００ｍＬ）と飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで洗浄した。ろ過と濃縮を行い得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）で精製し（塩化メチレン／ヘキサン＝１／２）、下記構造式で表される化合物ＤＢＸＡ（４１６．６ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ，収率４５％）を淡黄色油状物として取得した。
前記化合物ＤＢＸＡの１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ ７．２９（ｓ， １Ｈ）， ７．２６（ｓ， ２Ｈ）， ４．５３（ｓ， ２Ｈ）， ４．４０（ｓ， ４Ｈ）， ４．１５（４ＪＨＨ＝２．５Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３（４ＪＨＨ＝２．０Ｈｚ， １Ｈ）
【化6】
【0065】
＜化合物Ｃ４の合成＞
【化7】
【0066】
上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ４を合成した。
具体的には、化合物Ｃ３（５３３ｍｇ， ０．３７９ｍｍｏｌ）と化合物ＤＢＸＡ（１８８ｍｇ， ０．５６８ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（４０ｍＬ）からなる溶液に窒素ガスバブリングを行い、窒素雰囲気下とした。ここに、硫酸銅水溶液（２００ｍＭ； １．８９ｍＬ，０．３７９ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム水溶液（１００ｍＭ； ７．５８ｍＬ，０．７５８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３時間撹拌した。反応液に水を加え塩化メチレンで抽出を行い（２０ｍＬで３回）、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥しろ過と濃縮を行い、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／２０）することにより、化合物Ｃ４を白色固体として取得した（４９７ｍｇ，０．２８６ｍｍｏｌ，収率７６％）。
前記化合物Ｃ４の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ ８．５８（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．５Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．７７（ｓ， １Ｈ）， ７．７４（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．３４（ｓ， １Ｈ）， ７．３２（ｓ， ２Ｈ）， ６．８２（ｓ， １Ｈ）， ４．６９（ｓ， ２Ｈ）， ４．５８（ｓ， ２Ｈ）， ４．５６（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４７（ｓ， ４Ｈ）， ３．８９（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８７（ｓ， ２Ｈ）， ３．６９（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， ３．６６（ｓ， ６Ｈ）， ３．６１（ｓ， ８Ｈ）， ３．５６－３．５２（ｍ， ６Ｈ）， ３．４１－３．３８（ｍ， ６Ｈ）， ２．４２（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４８（ｓ， ２７Ｈ）
具体的には、化合物Ｃ３（５３３ｍｇ， ０．３７９ｍｍｏｌ）と化合物ＤＢＸＡ（１８８ｍｇ， ０．５６８ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（４０ｍＬ）からなる溶液に窒素ガスバブリングを行い、窒素雰囲気下とした。ここに、硫酸銅水溶液（２００ｍＭ； １．８９ｍＬ，０．３７９ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム水溶液（１００ｍＭ； ７．５８ｍＬ，０．７５８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３時間撹拌した。反応液に水を加え塩化メチレンで抽出を行い（２０ｍＬで３回）、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥しろ過と濃縮を行い、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／２０）することにより、化合物Ｃ４を白色固体として取得した（４９７ｍｇ，０．２８６ｍｍｏｌ，収率７６％）。
前記化合物Ｃ４の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ ８．５８（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．５Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．７７（ｓ， １Ｈ）， ７．７４（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．３４（ｓ， １Ｈ）， ７．３２（ｓ， ２Ｈ）， ６．８２（ｓ， １Ｈ）， ４．６９（ｓ， ２Ｈ）， ４．５８（ｓ， ２Ｈ）， ４．５６（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４７（ｓ， ４Ｈ）， ３．８９（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８７（ｓ， ２Ｈ）， ３．６９（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， ３．６６（ｓ， ６Ｈ）， ３．６１（ｓ， ８Ｈ）， ３．５６－３．５２（ｍ， ６Ｈ）， ３．４１－３．３８（ｍ， ６Ｈ）， ２．４２（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４８（ｓ， ２７Ｈ）
【0067】
＜細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの合成＞
【化8】
【0068】
上記反応式のようにして、上記構造式で表される細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを合成した。
具体的には、化合物Ｃ４（４９７ｍｇ，０．２８６ｍｍｏｌ）と４Ｎ塩酸ジオキサン溶液（３０ｍＬ）を混合し、２５℃で４６時間撹拌した。反応後、白色固体が析出した。上清を除去し、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸ粗生成物を取得した。分取ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製し、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを白色固体として取得した（１１６ｍｇ， ０．１１０ｍｍｏｌ， 収率５４％）。
前記化合物Ｇ３－ＤＣＸのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ２４Ｈ５１Ｎ１４Ｏ８ 計算値（Ｍ＋Ｈ＋）１０４７．５０２、測定値１０４７．９５３
具体的には、化合物Ｃ４（４９７ｍｇ，０．２８６ｍｍｏｌ）と４Ｎ塩酸ジオキサン溶液（３０ｍＬ）を混合し、２５℃で４６時間撹拌した。反応後、白色固体が析出した。上清を除去し、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸ粗生成物を取得した。分取ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製し、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを白色固体として取得した（１１６ｍｇ， ０．１１０ｍｍｏｌ， 収率５４％）。
前記化合物Ｇ３－ＤＣＸのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ２４Ｈ５１Ｎ１４Ｏ８ 計算値（Ｍ＋Ｈ＋）１０４７．５０２、測定値１０４７．９５３
【0069】
（実施例２：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐの合成）
【化9】
【0070】
上記反応式のようにして、上記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐを合成した。
具体的には、調製例１で合成したペプチドＰ（４．８ｍｇ，３．０μｍｏｌ）を５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（１．０ｍＬ）に溶解し、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（０．９４ｍｇ，３．３μｍｏｌ）を加えて２５℃で１時間撹拌した。ここに、実施例１で合成した細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸ（４．７ｍｇ，４．５μｍｏｌ）と水（５００μＬ）からなる溶液を加え、２５℃で２０時間撹拌した。反応液を分取ＨＰＬＣで精製することにより、環状ペプチド（ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ）を取得した（１．０１ｍｇ，０．３８８μｍｏｌ，収率１３％）。
前記分取ＨＰＬＣの分析条件は下記の通りである。前記調製例１で合成したペプチドＰの分析チャートを図１に、前記環状ペプチド（ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ）の分析チャートを図２に示す。
［分析条件］
・ カラム ： ＳＵＰＥＬＣＯ Ｃ１８ ４．７ｍｍ×２５０ｍｍ
・ 検出波長 ： ２２０ｎｍ
・ 流速 ： １．０ｍＬ／分間
・ 溶媒 ： Ａ＝０．１％ＴＦＡ含有水溶液、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液
・ グラジエント ： 溶媒Ｂの濃度（％）＝０％→１００％（０分→２０分）
また、前記ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－ＰのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによる同定データは、以下のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ１１４Ｈ１６３Ｎ３２Ｏ３３Ｏ３ 計算値（Ｍ＋Ｈ＋）２６０４．１２、測定値２６０３．５７５
具体的には、調製例１で合成したペプチドＰ（４．８ｍｇ，３．０μｍｏｌ）を５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（１．０ｍＬ）に溶解し、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（０．９４ｍｇ，３．３μｍｏｌ）を加えて２５℃で１時間撹拌した。ここに、実施例１で合成した細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸ（４．７ｍｇ，４．５μｍｏｌ）と水（５００μＬ）からなる溶液を加え、２５℃で２０時間撹拌した。反応液を分取ＨＰＬＣで精製することにより、環状ペプチド（ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ）を取得した（１．０１ｍｇ，０．３８８μｍｏｌ，収率１３％）。
前記分取ＨＰＬＣの分析条件は下記の通りである。前記調製例１で合成したペプチドＰの分析チャートを図１に、前記環状ペプチド（ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ）の分析チャートを図２に示す。
［分析条件］
・ カラム ： ＳＵＰＥＬＣＯ Ｃ１８ ４．７ｍｍ×２５０ｍｍ
・ 検出波長 ： ２２０ｎｍ
・ 流速 ： １．０ｍＬ／分間
・ 溶媒 ： Ａ＝０．１％ＴＦＡ含有水溶液、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液
・ グラジエント ： 溶媒Ｂの濃度（％）＝０％→１００％（０分→２０分）
また、前記ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－ＰのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによる同定データは、以下のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ１１４Ｈ１６３Ｎ３２Ｏ３３Ｏ３ 計算値（Ｍ＋Ｈ＋）２６０４．１２、測定値２６０３．５７５
【0071】
（試験例１：細胞膜透過能評価）
ＨｅＬａ細胞（Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｘ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ）を、調製例１で合成したペプチド又は実施例２で合成したペプチド複合体２μＭを含む細胞培養液中、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、３７℃の条件下で２時間培養した。ＨｅＬａ細胞の培養には、ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ Ｄ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、１０％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）添加）を用いた。
次いで、Ｄ－ＰＢＳ（－）（ヘパリン（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）添加）で細胞表面を洗浄後、細胞を回収し、Ｄ－ＰＢＳ（－）（０．５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２００ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．２％（ｖ／ｖ）ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）添加）に懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ）を用いて蛍光強度を測定した。フローサイトメトリー解析時には、ヨウ化プロピジウム陽性の死細胞を除いた生細胞集団に対し、蛍光強度最頻値を算出した。結果を表１に示す。
ＨｅＬａ細胞（Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｘ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ）を、調製例１で合成したペプチド又は実施例２で合成したペプチド複合体２μＭを含む細胞培養液中、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、３７℃の条件下で２時間培養した。ＨｅＬａ細胞の培養には、ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ Ｄ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、１０％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）添加）を用いた。
次いで、Ｄ－ＰＢＳ（－）（ヘパリン（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）添加）で細胞表面を洗浄後、細胞を回収し、Ｄ－ＰＢＳ（－）（０．５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２００ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．２％（ｖ／ｖ）ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）添加）に懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ）を用いて蛍光強度を測定した。フローサイトメトリー解析時には、ヨウ化プロピジウム陽性の死細胞を除いた生細胞集団に対し、蛍光強度最頻値を算出した。結果を表１に示す。
【0072】
【表1】
【0073】
表１に示されるとおり、培養２時間後において、調製例１で合成したペプチドはほぼ膜透過しないのに対し、実施例２で合成したペプチド複合体は膜透過していた。このことから、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸをペプチドに導入することにより、ペプチドの環化と同時に細胞膜透過性を獲得したことが実証された。
【0074】
（実施例３：細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸで環化されたペプチドを有するペプチド複合体を含むペプチドライブラリの作製）
＜（１）ＲＮＡライブラリの作製＞
本（１）項では、ＮＮＫ法によるランダムな塩基配列（ＮＮＫ）１０［式中、ＮはＡ、Ｕ、Ｇ又はＣを示し、ＫはＧ又はＵを示し、ＮＮＫはすべてのコドンに対応する］を含むＲＮＡで構成される１０１２以上の多様性を有するＲＮＡライブラリの作製法について説明する。
＜（１）ＲＮＡライブラリの作製＞
本（１）項では、ＮＮＫ法によるランダムな塩基配列（ＮＮＫ）１０［式中、ＮはＡ、Ｕ、Ｇ又はＣを示し、ＫはＧ又はＵを示し、ＮＮＫはすべてのコドンに対応する］を含むＲＮＡで構成される１０１２以上の多様性を有するＲＮＡライブラリの作製法について説明する。
【0075】
このＲＮＡライブラリ作製の為に、鋳型ＤＮＡ（塩基配列：配列番号１、アミノ酸配列：配列番号２）を用いた。具体的には、表２－１に示す組成を有する反応液を用い、表２－２のＰＣＲサイクルでプラスミドを鋳型ＤＮＡとして５’フラグメントを調製した。表２－１中、５ＦｒａｇＦ＿１５０４０９はフォワードプライマー（配列番号４）であり、Ｍａ５ｆｒａｇ＿ｗｉｔｈｏｕｔＨｉｓ＿Ｒ１５０３１０はリバースプライマー（配列番号５）である。
【0076】
【表2-1】
【0077】
【表2-2】
【0078】
次に、表２－３に示す組成を有する反応液を用い、表２－４のＰＣＲサイクルで鋳型ＤＮＡの３’フラグメントを調製した。表２－３中、Ａ１ＭａＮＮＫ１０＿ｗｉｔｈｏｕｔＨｉｓ＿１５０５３１はフォワードプライマー（配列番号６）であり、３ＦｒａｇＲ＿１５０４０９はリバースプライマー（配列番号７）である。
【0079】
【表2-3】
【0080】
【表2-4】
【0081】
次に、表２－５に示す組成を有する反応液を用い、表２－６のＰＣＲサイクルでオーバーラップエクステンション（Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲを行い、上記５’フラグメントと３’フラグメントを連結し、全長を増幅して鋳型ＤＮＡを得た。なお、表２－５中、Ｘ～Ｚは、１×１０１２の５’フラグメントと３’フラグメントを用い、反応液にＨ２Ｏを加えて総量を６０μＬに調整したことを示す。また、５ＦＦｎｅｗ＿１５０４０９はフォワードプライマー（配列番号８）であり、３Ｆ－Ｒｎｅｗ＿１５０４０９はリバースプライマー（配列番号９）である。
【0082】
【表2-5】
【0083】
【表2-6】
【0084】
得られた上記ＤＮＡを鋳型とし、表２－７に示す組成を有する反応液を用い、３７℃で２時間反応させることにより、配列番号３の塩基配列を有する１０１２以上のｍＲＮＡを含むＲＮＡライブラリを得た。このライブラリに含まれるｍＲＮＡは、図３に示す様に５’側から順にＦＬＡＧ（登録商標）サイト、システイン、ランダム配列、システイン、ＴＥＶプロテアーゼサイト、スペーサー配列を有しており、終止コドンを有さない。
【0085】
【表2-7】
【0086】
＜（２）リボソームディスプレイ（ＲＤ）複合体ライブラリの作製＞
ＲＤ複合体は、再構成型無細胞タンパク質合成キット（ジーンフロンティア社製「ＰＵＲＥ ｆｒｅｘ（登録商標）」）を用い、上記のＲＮＡライブラリを使用して調製した。
このＲＤ複合体反応液と、抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製，２０μＬ）を混合し、４℃で６０分間攪拌した。ペプチド部分にＦＬＡＧ配列を有するＲＤ複合体が選択的に結合した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体結合アガロースビーズを回収した。
ＲＤ複合体は、再構成型無細胞タンパク質合成キット（ジーンフロンティア社製「ＰＵＲＥ ｆｒｅｘ（登録商標）」）を用い、上記のＲＮＡライブラリを使用して調製した。
このＲＤ複合体反応液と、抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体結合アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製，２０μＬ）を混合し、４℃で６０分間攪拌した。ペプチド部分にＦＬＡＧ配列を有するＲＤ複合体が選択的に結合した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体結合アガロースビーズを回収した。
【0087】
＜（３）細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを導入したリボソームディスプレイ複合体ライブラリの作製＞
上記（２）で回収したアガロースビーズを８０μＬに希釈した後、還元剤として１０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（４μＬ）（終濃度０．５ｍＭ）と、２００ｍＭ Ｇ３－ＤＣＸ（実施例１で合成した細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子）（０．８μＬ）（終濃度２ｍＭ）を添加し、４℃で終夜環化反応させた。環化反応後、ＦＬＡＧペプチドを添加することにより、ＲＤ複合体をアガロースビーズから溶出させ、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを導入したリボソームディスプレイ複合体ライブラリを得た。
上記（２）で回収したアガロースビーズを８０μＬに希釈した後、還元剤として１０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（４μＬ）（終濃度０．５ｍＭ）と、２００ｍＭ Ｇ３－ＤＣＸ（実施例１で合成した細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子）（０．８μＬ）（終濃度２ｍＭ）を添加し、４℃で終夜環化反応させた。環化反応後、ＦＬＡＧペプチドを添加することにより、ＲＤ複合体をアガロースビーズから溶出させ、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを導入したリボソームディスプレイ複合体ライブラリを得た。
【0088】
（実施例４：細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸで環化されたペプチドを有するペプチド複合体を含むＲＤ複合体の作製）
＜ＲＮＡの作製＞
実施例３で作製したｍＲＮＡにおけるランダム配列（図３において、システイン残基（Ｃ）の間に位置する「（ＮＮＫ）１０」の部分）をアミノ酸配列「ＬＹＲＳＬＰＡＷＲＹＬ」をコードする塩基配列とした以外は、実施例３と同様にして、ｍＲＮＡを作製した。
＜ＲＮＡの作製＞
実施例３で作製したｍＲＮＡにおけるランダム配列（図３において、システイン残基（Ｃ）の間に位置する「（ＮＮＫ）１０」の部分）をアミノ酸配列「ＬＹＲＳＬＰＡＷＲＹＬ」をコードする塩基配列とした以外は、実施例３と同様にして、ｍＲＮＡを作製した。
【0089】
＜ＲＤ複合体の作製＞
前記＜ＲＮＡの作製＞で作製したｍＲＮＡを用いた以外は、実施例３と同様にして、ＲＤ複合体を作製した。
前記＜ＲＮＡの作製＞で作製したｍＲＮＡを用いた以外は、実施例３と同様にして、ＲＤ複合体を作製した。
【0090】
＜細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを導入したリボソームディスプレイ複合体の作製＞
前記＜ＲＤ複合体の作製＞で作製したＲＤ複合体を用いた以外は、実施例３と同様にして、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを導入したＲＤ複合体を得た。
前記＜ＲＤ複合体の作製＞で作製したＲＤ複合体を用いた以外は、実施例３と同様にして、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを導入したＲＤ複合体を得た。
【0091】
前記ＲＤ複合体を含む反応液からアガロースビーズを分離除去し、Ｍｇ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５、１００μＬ）を加えてＲＤ複合体を解離させ、得られたペプチドをＴＥＶプロテアーゼで切断し、ペプチド断片を得た。
また、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行わなかったＲＤ複合体についても同様にして、ペプチド断片を得た。
得られたペプチドの分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで測定した結果を図４に示す。図４中、上段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行わなかった場合に得られたペプチド断片の測定結果を示し、下段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行った場合に得られたペプチド断片の測定結果を示す。図４に示されるように、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行うことで、環状化されたペプチド（図４中の黒の矢印）が得られることが確認された。なお、図４中の白抜きの矢印は環状化されていないペプチドを示す。
また、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行わなかったＲＤ複合体についても同様にして、ペプチド断片を得た。
得られたペプチドの分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで測定した結果を図４に示す。図４中、上段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行わなかった場合に得られたペプチド断片の測定結果を示し、下段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行った場合に得られたペプチド断片の測定結果を示す。図４に示されるように、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行うことで、環状化されたペプチド（図４中の黒の矢印）が得られることが確認された。なお、図４中の白抜きの矢印は環状化されていないペプチドを示す。
【0092】
（実施例５：細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸで環化されたペプチドを有するペプチド複合体を含むＲＤ複合体の作製）
実施例４におけるアミノ酸配列の「ＬＹＲＳＬＰＡＷＲＹＬ」を「ＰＬＦＰＷＰＳＬＷＨＲ」に変えた以外は、実施例４と同様にして、ｍＲＮＡ、ＲＤ複合体、及び細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを導入したリボソームディスプレイ複合体を作製した。
また、実施例４と同様にして、得られたＲＤ複合体からペプチド断片を取得し、その分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで測定した。結果を図５に示す。
図５中、上段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行わなかった場合に得られたペプチド断片の測定結果を示し、下段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行った場合に得られたペプチド断片の測定結果を示す。図５に示されるように、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行うことで、環状化されたペプチド（図５中の黒の矢印）が得られることが確認された。なお、図５中の白抜きの矢印は環状化されていないペプチドを示す。
実施例４におけるアミノ酸配列の「ＬＹＲＳＬＰＡＷＲＹＬ」を「ＰＬＦＰＷＰＳＬＷＨＲ」に変えた以外は、実施例４と同様にして、ｍＲＮＡ、ＲＤ複合体、及び細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを導入したリボソームディスプレイ複合体を作製した。
また、実施例４と同様にして、得られたＲＤ複合体からペプチド断片を取得し、その分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで測定した。結果を図５に示す。
図５中、上段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行わなかった場合に得られたペプチド断片の測定結果を示し、下段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行った場合に得られたペプチド断片の測定結果を示す。図５に示されるように、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行うことで、環状化されたペプチド（図５中の黒の矢印）が得られることが確認された。なお、図５中の白抜きの矢印は環状化されていないペプチドを示す。
【0093】
（実施例６：細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸで環化されたペプチドを有するペプチド複合体を含むＲＤ複合体の作製）
実施例４におけるアミノ酸配列の「ＬＹＲＳＬＰＡＷＲＹＬ」を「ＡＧＲＷＮＶＬＷＲＴＹＴＹＭＨ」に変えた以外は、実施例４と同様にして、ｍＲＮＡ、ＲＤ複合体、及び細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを導入したリボソームディスプレイ複合体を作製した。
また、実施例４と同様にして、得られたＲＤ複合体からペプチド断片を取得し、その分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで測定した。結果を図６に示す。
図６中、上段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行わなかった場合に得られたペプチド断片の測定結果を示し、下段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行った場合に得られたペプチド断片の測定結果を示す。図６に示されるように、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行うことで、環状化されたペプチド（図６中の黒の矢印）が得られることが確認された。なお、図６中の白抜きの矢印は環状化されていないペプチドを示す。
実施例４におけるアミノ酸配列の「ＬＹＲＳＬＰＡＷＲＹＬ」を「ＡＧＲＷＮＶＬＷＲＴＹＴＹＭＨ」に変えた以外は、実施例４と同様にして、ｍＲＮＡ、ＲＤ複合体、及び細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸを導入したリボソームディスプレイ複合体を作製した。
また、実施例４と同様にして、得られたＲＤ複合体からペプチド断片を取得し、その分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳで測定した。結果を図６に示す。
図６中、上段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行わなかった場合に得られたペプチド断片の測定結果を示し、下段は細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行った場合に得られたペプチド断片の測定結果を示す。図６に示されるように、細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子Ｇ３－ＤＣＸの導入を行うことで、環状化されたペプチド（図６中の黒の矢印）が得られることが確認された。なお、図６中の白抜きの矢印は環状化されていないペプチドを示す。
【0094】
実施例４～６に示したように、ペプチドの長さやペプチドを構成するアミノ酸が異なる場合でも、環状化反応が進行することを確認した。
【0095】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ 細胞膜透過性付与基と、ペプチドを環状化させる環状化基と、を有することを特徴とする細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子である。
＜２＞ 前記細胞膜透過性付与基が、塩基性官能基を有する前記＜１＞に記載のリンカー分子である。
＜３＞ 前記塩基性官能基が、グアニジノ基を有する前記＜２＞に記載のリンカー分子である。
＜４＞ 前記塩基性官能基が、２以上のグアニジノ基を有する前記＜３＞に記載のリンカー分子である。
＜５＞ 前記細胞膜透過性付与基が樹状構造を有し、前記塩基性官能基が前記樹状構造の枝の末端に導入されている前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載のリンカー分子である。
＜６＞ 前記環状化基が、電子吸引基である前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のリンカー分子である。
＜７＞ 前記電子吸引基が、ハロゲンを有する前記＜６＞に記載のリンカー分子である。
＜８＞ 前記電子吸引基が、２以上のハロゲンを有する前記＜７＞に記載のリンカー分子である。
＜９＞ 前記電子吸引基が、２以上の塩素原子を有する前記＜８＞に記載のリンカー分子である。
＜１０＞ 前記電子吸引基が、置換基を有していてもよいベンジルクロリドである前記＜９＞に記載のリンカー分子である。
＜１１＞ 前記電子吸引基が、３，５－ビス（クロロメチル）ベンジル基である前記＜１０＞に記載のリンカー分子である。
＜１２＞ 前記環状化基によるペプチドの環状化が、前記環状化基と、ペプチドに含まれるチオール基、アミノ基、及びヒドロキシ基からなる群から選択される少なくとも１種の基との反応により行われる前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載のリンカー分子である。
＜１３＞ 下記構造式で表されることを特徴とする細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子である。
＜１４＞ ペプチドと、前記ペプチドに導入された前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載のリンカー分子とを含むことを特徴とするペプチド複合体である。
＜１５＞ 前記＜１４＞に記載のペプチド複合体を含むことを特徴とするペプチドライブラリである。
＜１６＞ ペプチドに、前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載のリンカー分子を導入する工程を含むことを特徴とするペプチド複合体の製造方法である。
＜１７＞ 前記ペプチドが、ペプチドライブラリに含まれるペプチドである前記＜１６＞に記載のペプチド複合体の製造方法である。
＜１８＞ 前記＜１５＞に記載のペプチドライブラリを用いて機能性ペプチドをスクリーニングする工程を含むことを特徴とする機能性ペプチドのスクリーニング方法である。
＜１＞ 細胞膜透過性付与基と、ペプチドを環状化させる環状化基と、を有することを特徴とする細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子である。
＜２＞ 前記細胞膜透過性付与基が、塩基性官能基を有する前記＜１＞に記載のリンカー分子である。
＜３＞ 前記塩基性官能基が、グアニジノ基を有する前記＜２＞に記載のリンカー分子である。
＜４＞ 前記塩基性官能基が、２以上のグアニジノ基を有する前記＜３＞に記載のリンカー分子である。
＜５＞ 前記細胞膜透過性付与基が樹状構造を有し、前記塩基性官能基が前記樹状構造の枝の末端に導入されている前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載のリンカー分子である。
＜６＞ 前記環状化基が、電子吸引基である前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のリンカー分子である。
＜７＞ 前記電子吸引基が、ハロゲンを有する前記＜６＞に記載のリンカー分子である。
＜８＞ 前記電子吸引基が、２以上のハロゲンを有する前記＜７＞に記載のリンカー分子である。
＜９＞ 前記電子吸引基が、２以上の塩素原子を有する前記＜８＞に記載のリンカー分子である。
＜１０＞ 前記電子吸引基が、置換基を有していてもよいベンジルクロリドである前記＜９＞に記載のリンカー分子である。
＜１１＞ 前記電子吸引基が、３，５－ビス（クロロメチル）ベンジル基である前記＜１０＞に記載のリンカー分子である。
＜１２＞ 前記環状化基によるペプチドの環状化が、前記環状化基と、ペプチドに含まれるチオール基、アミノ基、及びヒドロキシ基からなる群から選択される少なくとも１種の基との反応により行われる前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載のリンカー分子である。
＜１３＞ 下記構造式で表されることを特徴とする細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子である。
【化10】
＜１５＞ 前記＜１４＞に記載のペプチド複合体を含むことを特徴とするペプチドライブラリである。
＜１６＞ ペプチドに、前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載のリンカー分子を導入する工程を含むことを特徴とするペプチド複合体の製造方法である。
＜１７＞ 前記ペプチドが、ペプチドライブラリに含まれるペプチドである前記＜１６＞に記載のペプチド複合体の製造方法である。
＜１８＞ 前記＜１５＞に記載のペプチドライブラリを用いて機能性ペプチドをスクリーニングする工程を含むことを特徴とする機能性ペプチドのスクリーニング方法である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】