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特許7611931ガイダンス及びナビゲーションコントロール（ＧＮＣ）抗体様タンパク質、その製造方法及び使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-26
(45)【発行日】2025-01-10
(54)【発明の名称】ガイダンス及びナビゲーションコントロール（ＧＮＣ）抗体様タンパク質、その製造方法及び使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20241227BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241227BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241227BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241227BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241227BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241227BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241227BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241227BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241227BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20241227BHJP
A61K 51/10 20060101ALI20241227BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20241227BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241227BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241227BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241227BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20241227BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20241227BHJP
C07K 16/30 20060101ALN20241227BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20241227BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P35/00
A61P37/06
A61P31/00
A61K51/10 200
A61K49/00
A61K47/68
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61P37/04
C12N15/13
C07K16/28
C07K16/30
C12P21/08
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2022555920
(86)(22)【出願日】2021-03-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-28
(86)【国際出願番号】 US2021022849
(87)【国際公開番号】W WO2021188737
(87)【国際公開日】2021-09-23
【審査請求日】2022-11-14
(31)【優先権主張番号】62/991,042
(32)【優先日】2020-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517218697
【氏名又は名称】システィミューン， インク．
【氏名又は名称原語表記】ＳＹＳＴＩＭＭＵＮＥ， ＩＮＣ．
(73)【特許権者】
【識別番号】522263714
【氏名又は名称】バイリ－バイオ（チェンドゥ）ファーマスーティカル シーオー．，エルティーディー．
【住所又は居所原語表記】１３９ Ｂａｉｌｉ Ｒｏａｄ， Ｗｅｎｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｃｈｅｎｇｄｕ， Ｓｉｃｈｕａｎ ６１１１３０， ｔｈｅ Ｐｅｏｐｌｅ’ ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】ツー， イ
(72)【発明者】
【氏名】ガレット，デニス アール．
(72)【発明者】
【氏名】ツァイ，ツング－アイ
(72)【発明者】
【氏名】チャタジー，スミリ
(72)【発明者】
【氏名】レンショー， ブレア
(72)【発明者】
【氏名】ヴィンセント， クリストファー， ジー．
(72)【発明者】
【氏名】ウェイト，アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】マック，ガー シー アマンダ
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／１９１１２５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／１９１１２０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００８－５０７５２０（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
六重特異性抗体タンパク質であって、Ｎ末端及びＣ末端を有し、前記Ｎ末端から前記Ｃ末端まで直列に、
Ｎ末端にある第１結合ドメイン（Ｄ１）、
重鎖部分と軽鎖部分を含むＦａｂ領域である第２結合ドメイン（Ｄ２）、
Ｆｃ領域、
ＰＤ－Ｌ１に対して結合親和性を有する第３結合ドメイン（Ｄ３）、及び
４－１ＢＢに対して結合親和性を有するＣ末端にある第４結合ドメイン（Ｄ４）、
を含み、
Ｄ２において、前記軽鎖部分のＣ末端に第５結合ドメイン（Ｄ５）が共有結合し、前記軽鎖部分のＮ末端に第６結合ドメイン（Ｄ６）が共有結合し、前記重鎖部分のＮ末端にＤ１が結合し、前記重鎖部分のＣ末端に前記Ｆｃ領域が結合し、
Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６は、それぞれｓｃＦｖドメインであり、
前記六重特異性抗体タンパク質は、
配列番号１０６及び１０８に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＥＧＦＲ、Ｄ２がＣＤ３、Ｄ５がＨＥＲ３、Ｄ６がＣＤ１９に対して結合親和性を有し、又は
配列番号１７６及び１７８に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＥＧＦＲ、Ｄ２がＣＤ３、Ｄ５がＣＤ１９、Ｄ６がＨＥＲ３に対して結合親和性を有し、又は
配列番号３２４及び３２６に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ３、Ｄ２がＥＧＦＲ、Ｄ５がＨＥＲ３、Ｄ６がＣＤ１９に対して結合親和性を有し、又は
配列番号３２８及び３３０に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ３、Ｄ２がＥＧＦＲ、Ｄ５がＨＥＲ３、Ｄ６がＣＤ１９に対して結合親和性を有し、又は
配列番号３３２及び３３４に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＥＧＦＲ、Ｄ２がＣＤ３、Ｄ５がＨＥＲ３、Ｄ６がＣＤ１９に対して結合親和性を有する、六重特異性抗体タンパク質。
【請求項2】
請求項１に記載の六重特異性抗体タンパク質のアミノ酸配列をコードする、単離された核酸。
【請求項3】
請求項２に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
【請求項4】
請求項２に記載の単離された核酸を含む宿主細胞であって、前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である、宿主細胞。
【請求項5】
リンカーを介して請求項１に記載の六重特異性抗体タンパク質に結合した細胞毒性剤又は造影剤を含む免疫複合体であって、前記リンカーは、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、ジスルフィド結合、イミド結合、スルホン結合、リン酸結合、リン酸エステル結合、ペプチド結合、疎水性ポリ（エチレングリコール）リンカー又はそれらの組み合わせを含む、免疫複合体。
【請求項6】
薬学的に許容される担体と、請求項１に記載の六重特異性抗体タンパク質及び／又は請求項５に記載の免疫複合体とを含む、医薬組成物。
【請求項7】
がん、自己免疫疾患又は感染症に罹患している対象を治療するための医薬組成物であって、有効量の請求項１に記載の六重特異性抗体タンパク質及び/又は請求項５に記載の免疫複合体を含む、医薬組成物。
【請求項8】
有効濃度の請求項１に記載の六重特異性抗体タンパク質を含む溶液であって、前記溶液は、血漿である、溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
【0002】
本出願は、２０２０年３月１７日に提出された米国仮出願第６２／９９１，０４２号の優先権を主張し（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ））、その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本出願は、がん免疫療法に用いる多重特異性抗体の技術分野に関し、より具体的には、免疫細胞及び腫瘍細胞の両方の表面分子に対して多重結合活性を有するガイダンス及びナビゲーションコントロール（ＧＮＣ）抗体の製造及び使用方法に関する。
【背景技術】
【0004】
がん細胞は、宿主の免疫系による破壊と排除を回避するためのさまざまな戦略を実施する。生物学的治療の機能、特異性、効力及び有効性を改善する緊急の必要性がある。がん治療における標的療法の成功も、さまざまな耐性メカニズムによって妨げられてきた。腫瘍の可塑性は、前立腺及び肺腺癌から黒色腫及び基底細胞癌に至るまで、さまざまな癌における標的療法回避のモードとして浮上している。堅牢な抗腫瘍免疫応答の形成を妨げるメカニズムには、少なくとも次のカテゴリーのいくつかが含まれると考えられている。１）腫瘍抗原プロセシング又は提示の欠陥；２）活性化メカニズムの欠如；３）阻害メカニズムと免疫抑制状態；及び４） 耐性腫瘍細胞（４）。これらの回避と抵抗のメカニズムを克服するために、複数の免疫エフェクター（Ｔ細胞エンゲージャー、チェックポイント阻害剤、自然免疫を含むが、これらに限定されない）を併用免疫療法戦略に容易にする新しい治療戦略が設計されている。しかし、このような併用療法の戦略は、多くの場合、２つ以上の独立した生物製剤を意味し、それぞれの製品の臨床的安全性と有効性の承認だけでなく、独立した生物製剤の製造も必要とする。併用療法は、免疫細胞又は腫瘍細胞のいずれか、あるいはその両方を標的とする場合がある。例えば、ＣＤ３とＣＤ１９の両方を標的とする二重特異性抗体を使用する抗体療法、又は抗ＣＤ１９キメラ抗体を発現する改変Ｔ細胞を含むＣＡＲ－Ｔ細胞療法がある。これらの免疫療法による一般的な副作用の１つは、免疫調節が不十分であることを示すサイトカイン放出症候群である。この文脈では、追加の免疫調節を獲得しながら、腫瘍の可塑性、すなわち腫瘍抗原及び／又は耐性腫瘍細胞の不均一で動的な発現を克服するための新しい戦略が必要である。
【0005】
この目的に向けて、ガイダンス及びナビゲーションコントロール（ＧＮＣ）としても知られる多重特異性抗体のプラットフォームは、Ｔ細胞エンゲージャー、共刺激因子、チェックポイント阻害剤及び腫瘍抗原の複数のターゲティングを促進するために確立された（出願人の出願ＷＯ／２０１９／００５６４１、ＷＯ２０１９１９１１２０及びＰＣＴ／ＵＳ２０／５９２３０；その全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、四重特異性ＧＮＣ（テトラＧＮＣ）抗体は、液体及び固形腫瘍の両方を治療するためのＧＮＣ－Ｔ細胞療法の構築に使用することができる。多機能ＧＮＣ分子にもかかわらず、エピトープ陰性腫瘍細胞は標的にされないままであるため、免疫療法が回避される。例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、自己免疫組織の損傷を防ぐために厳密に調節されているため、通常、正常な組織ではＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しない。したがって、ＮＫＧ２Ｄ受容体を使用することは、自然免疫認識プロセスを介したがん免疫療法の効果的なターゲティングメカニズムになる可能性がある。そこで、細胞治療に関連する多重特異性抗体をさらに開発する必要性が明確に存在する。多特異性単剤は依然として非常に望ましいものであり、費用対効果が高いが、テトラＧＮＣ抗体を超える強力で安定した多特異性抗体を設計、発現及び製造することは技術的に困難である。
【発明の概要】
【0006】
以下の概要は単なる例示であり、決して限定することを意図するものではない。上記の例示的な態様、実施形態、及び特徴に加えて、さらなる態様、実施形態、及び特徴は、図面及び以下の詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。
【0007】
本発明は、結合特異性を有するタンパク質（例えば、多重特異性抗体様タンパク質及びその断片）、多重特異性抗体様タンパク質及びその断片の製造及び使用方法を提供する。前記多重特異性抗体様タンパク質は、多重特異性抗体を含み得る。これらの結合タンパク質の断片は、ｓｃＦｖドメイン、Ｆａｂ領域、Ｆｃドメイン、ＶＨ、ＶＬ、軽鎖、重鎖、可変領域、相補性決定領域 （ＣＤＲ）を含んでもよいが、これらに限定されない。
【0008】
一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、多重特異性抗体、モノクローナル抗体、単離されたモノクローナル抗体、又はヒト化抗体であり得る。
【0009】
一実施形態において、前記タンパク質は、結合ドメインのような様々なドメイン及び領域を含んでもよい。一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、第１結合ドメイン（Ｄ１）、第２結合ドメイン（Ｄ２）、第３結合ドメイン（Ｄ３）、第４結合ドメイン（Ｄ４）、第５結合ドメイン（Ｄ５）又は第６結合ドメイン（Ｄ６）を含む１つ以上の結合ドメインを有してもよい。本発明の多重特異性抗体様タンパク質は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、四重特異性、五重特異性又は六重特異性であり得る。
【0010】
一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６などの前記結合ドメインは、それぞれ独立してＴ細胞活性化受容体、免疫細胞受容体、免疫チェックポイント分子、共刺激因子、白血球の受容体、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、組織細胞の受容体、がん細胞の受容体又はそれらの組み合わせに対して特異的に結合親和性を有してもよい。
【0011】
一実施形態において、前記Ｔ細胞活性化受容体は、ＣＤ３を含んでもよい。一実施形態において、前記免疫チェックポイント受容体は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ＬＯＸ－１、シグレック１５、ＣＤ４７、ＨＶＥＭ ＳＩＲＰα、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ７３、シグレック１５、ＣＤ４７又はそれらの組み合わせを含んでもよい。一実施形態において、前記共刺激受容体は、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７、ＣＤ３０又はそれらの組み合わせを含んでもよい。一実施形態において、前記腫瘍関連抗原は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＲＦＶＩＩＩ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン３、ｇｐＡ３３、ＧＤ２、ＴＲＯＰ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ３９、ＣＬＤＮ１８．２、ＤＬＬ３、ＨＬＡ－Ｇ、ＦｃＲＨ５、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＬＩＶ－１、ＭＵＣ１、ＣＤ１３８、ＣＤ７０、ｕＰＡＲ、ＣＤ３８又はそれらの組み合わせを含んでもよい。
【0012】
一実施形態において、Ｔ細胞活性化受容体のための結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のための結合ドメインに隣接する。
【0013】
一実施形態において、前記Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６は、それぞれ独立してｓｃＦｖドメイン、受容体又はリガンドであってもよい。一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質におけるＤ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つは、ｓｃＦｖドメインを含む。一実施形態において、Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６は、全てｓｃＦｖドメインである。
【0014】
一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質におけるＤ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つは、受容体を含む。一実施形態において、Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６は、全て受容体である。
【0015】
一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質におけるＤ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つは、リガンドを含む。一実施形態において、Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６は、全てリガンドを含む。
【0016】
一実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨの方向でＶＬに結合したＶＨを含み得る。一実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、ＶＬとＶＨとの間にジスルフィド結合を含み得る。一実施形態において、ジスルフィド結合は、ｓｃＦｖドメインのＶＬ１００とＶＨ４４の間にある。一実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、ＶＨに置換Ｒ１９Ｓ（Ｋａｂａｔ）を含み得る。
【0017】
一実施形態において、多重特異性抗体様タンパク質は、Ｆｃ領域を含み得る。一実施形態において、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ又はＣＤＣを含むがこれらに限定されないエフェクター細胞機能を排除するようにエンジニアリングされる。一実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ又はＫ３２２Ａ（Ｅｕナンバリング）に少なくとも１つの変異を含む。一実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｋ３２２Ａに変異を含む。一実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｋ３２２Ａ（Ｅｕナンバリング）に変異を含む。
【0018】
ドメイン及び領域は、リンカーを介して接続することができる。一実施形態において、リンカーは、（ＧｘＳｙ）ｎリンカーを含み得る。ここで、ｎ、ｘ及びｙは、それぞれ独立して１から１０の整数である。一実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。一実施形態において、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。一実施形態において、ｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【0019】
一態様において、本発明は、六重特異性抗体様タンパク質を提供する。一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質は、Ｎ末端及びＣ末端を有し、Ｎ末端からＣ末端まで直列にＮ末端にある第１結合ドメイン（Ｄ１）と、第２結合ドメイン（Ｄ２）としての軽鎖を含み得るＦａｂ領域と、Ｆｃ領域と、ＰＤ－Ｌ１に対して結合親和性を有する第３結合ドメイン（Ｄ３）と、Ｃ末端にある４－１ＢＢに対してを有する結合親和性第４結合ドメイン（Ｄ４）とを含み、前記軽鎖は、Ｃ末端に共有結合した第５結合ドメイン（Ｄ５）、及びＮ末端に共有結合した第６結合ドメイン（Ｄ６）を含み得る。Ｄ１、Ｄ２、Ｄ５及びＤ６は、それぞれ独立して腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又はＣＤ３に対して結合親和性を有し得る。
【0020】
一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合親和性を有するＤ１又はＤ２を含み得る。一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合親和性を有するＤ１を含み得る。一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合親和性を有するＤ２を含み得る。
【0021】
一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ２０、メソテリン、クローディン１８．２、ＨＥＲ２、ＣＤ３３又はそれらの組み合わせに対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；それぞれ独立して腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有するＤ５及びＤ６を含み得る。
【0022】
一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；それぞれ独立してＮＫＧ２Ｄリガンド、ＨＥＲ３、ＣＤ１９又はそれらの組み合わせに対して結合特異性を有するＤ５及びＤ６を含み得る。
【0023】
一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質は、ＥＧＦＲに対して結合特異性を有するＤ１；ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し得るＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；ＣＤ１９に対して結合特異性を有するＤ５；及びＨＥＲ３に対して結合特異性を有するＤ６を含み得る。
【0024】
一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質は、ＥＧＦＲに対して結合特異性を有するＤ１；ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；ＨＥＲ３に対して結合特異性を有するＤ５；及びＣＤ１９に対して結合特異性を有するＤ６を含み得る。
【0025】
一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；ＥＧＦＲに対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；ＨＥＲ３に対して結合特異性を有するＤ５；及びＣＤ１９に対して結合特異性を有するＤ６を含み得る。
【0026】
一実施形態において、前記六重特異性抗体様タンパク質は、配列番号１７６、１７８、１０６、１０８、３３２、３３４、３２４、３２６、３２８又は３３０と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0027】
一態様において、本発明は、四重特異性又は五重特異性抗体様タンパク質を提供する。一実施形態において、前記抗体様タンパク質はＮ末端及びＣ末端を含み、Ｎ末端からＣ末端まで直列にＮ末端にある第１結合ドメイン（Ｄ１）と、第２結合ドメイン（Ｄ２）としての軽鎖（必要に応じてＣ末端に共有結合した第５結合ドメイン（Ｄ５）又はＮ末端に共有結合した第６結合ドメイン（Ｄ６）を含み得る）を含み得るＦａｂ領域と、Ｆｃ領域と、第３結合ドメイン（Ｄ３）と、Ｃ末端にある第４結合ドメイン（Ｄ４）とを含み得る。一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、配列番号１１０、１１２、１１６、１１８、１２２、１２４、１２８、１３０、１３４、１３６、１４０、１４２、１４６、１４８、１５２、１５４、１５８、１６０、１６４、１６６、１７０、１７２、１１２、１１４、１１８、１２０、１２４、１２６、１３０、１３２、１３６、１３８、１４２、１４４、１４８、１５０、１５４、１５６、１６０、１６２、１６６、１６８、１７２、１７４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、３０２、３０４、３０６又は３０８と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0028】
一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、四重特異性であり得る。一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、五重特異性であり得る。一実施形態において、Ｄ２、Ｄ５及びＤ６は、それぞれ独立して腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して結合親和性を有し得る。
【0029】
一実施形態において、前記四重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；及び４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４を含み得る。
【0030】
一実施形態において、前記四重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ２２、メソテリン、ＧＤ２及びクローディン１８．２からなる群より選択される抗原に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；及び４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４を含み得る。
【0031】
一実施形態において、前記五重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；それぞれ独立して腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有するＤ２及びＤ５；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；及び４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４を含み得る。
【0032】
一実施形態において、前記五重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；及びＨＥＲ３に対して結合特異性を有するＤ５を含み得る。
【0033】
一実施形態において、前記五重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲｖＩＩＩに対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；及びＨＥＲ３に対して結合特異性を有するＤ５を含み得る。
【0034】
一実施形態において、前記五重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；ＣＤ２０に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；及びＣＤ１９に対して結合特異性を有するＤ５を含み得る。
【0035】
一実施形態において、前記五重特異性抗体様タンパク質は、それぞれ独立して腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有するＤ１及びＤ６；ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４を含み得る。
【0036】
一実施形態において、前記五重特異性抗体様タンパク質は、ＥＧＦＲに対して結合特異性を有するＤ１；ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；及びＣＤ１９に対して結合特異性を有するＤ６を含み得る。
【0037】
一態様において、本発明は、少なくとも１つの結合ドメインを受容体として有する多重特異性抗体様タンパク質を提供する。一実施形態において、前記受容体は、ＮＫＧ２Ｄである。
【0038】
一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、Ｎ末端及びＣ末端を含み、Ｎ末端からＣ末端まで直列に必要に応じてＮ末端にある第１結合ドメイン（Ｄ１）と、軽鎖（必要に応じてＣ末端に共有結合した第５結合ドメイン（Ｄ５）及び／又はＮ末端に共有結合した第６結合ドメイン（Ｄ６）を含み得る）を含み得る第２結合ドメイン（Ｄ２）と、Ｆｃ領域と、必要に応じて第３結合ドメイン（Ｄ３）と、必要に応じてＣ末端にある第４結合ドメイン（Ｄ４）とを含み、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６の少なくとも１つは、ＮＫＧ２Ｄであり、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６は、それぞれ独立してＴ細胞活性化受容体、免疫細胞受容体、免疫チェックポイント分子、共刺激因子、白血球の受容体、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、組織細胞の受容体、がん細胞の受容体又はそれらの組み合わせ特異的に結合親和性を有し得る。
【0039】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、四重特異性又は五重特異性であり得る。
【0040】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＣＬ及びＣＨ１に結合した二量体を含むＤ２を含み得る。前記二量体はＮＫＧ２Ｄである。一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む単一特異性抗体様タンパク質は、配列番号１９６又は１９８と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％ 配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0041】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、それぞれ独立してＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＲＯＲ１、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン３、ｇｐＡ３３、ＧＤ２、ＴＲＯＰ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＣＬＤＮ１８．２、ＤＬＬ３、ＨＬＡ－Ｇ、ＦｃＲＨ５、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＬＩＶ－１、ＭＵＣ１、ＣＤ１３８、ＣＤ７０、ＣＤ１６、ｕＰＡＲ、シグレック１５、ＣＤ４７、ＣＤ３８、ＮＫｐ４６、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ＬＯＸ－１、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７からなる群より選択される抗原に対して結合特異性を有するＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６を含み得る。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインを含み得る。
【0042】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、それぞれ独立して腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有するＤ２、Ｄ５及びＤ６を含み得る。一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有するＤ２を含み得る。一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、それぞれ独立してＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ３、ＰＤ－Ｌ１、４－１ＢＢ又はそれらの組み合わせに対して結合特異性を有するＤ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４を含み得る。
【0043】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、７８、８０、８２、８４、８６、８８、３０又は３２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0044】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ１；ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；及び４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４を含み得る。
【0045】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ１；ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ２；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ３；及びＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ４を含む。
【0046】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ１；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ２；ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ３；及びＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ４を含む。
【0047】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ１；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ２；ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ３；及びＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ４を含む。
【0048】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；及びＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ５を含む。
【0049】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；メソテリン、クローディン１８．２、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＣＤ３３からなる群より選択される抗原に対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；及びＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ５を含む。
【0050】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；及びＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ２を含む。
【0051】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；ＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ２；及び腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有するＤ６を含む。
【0052】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；ＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ２；及びＣＤ１９に対して結合特異性を有するＤ６を含む。
【0053】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；ＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；及び４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４を含む。
【0054】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；ＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；及び腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有するＤ６を含む。
【0055】
一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを含む多重特異性抗体様タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するＤ１；ＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有するＤ２；ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ３；４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４；及びＣＤ１９に対して結合特異性を有するＤ６を含む。
【0056】
第２の態様において、本発明は、本発明の多重特異性抗体様タンパク質のアミノ酸配列をコードする単離された核酸配列を提供する。
【0057】
第３の態様において、本発明は、発現ベクターを提供する。一実施形態において、前記発現ベクターは、本発明の単離された核酸配列を含む。
【0058】
別の態様において、本発明は、前記単離された核酸配列を含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、前記宿主細胞は、原核細胞である。一実施形態において、前記宿主細胞は、真核細胞である。
【0059】
別の態様において、本発明は、多重特異性抗体様タンパク質及びそれらの断片を提供する。一実施形態において、前記方法は、多重特異性抗体又は単量体をコードするＤＮＡ配列が発現されるように単離された核酸配列を含む宿主細胞を培養するステップ；及び前記多重特異性抗体を精製するステップを含む。前記単離された核酸配列は、多重特異性抗体様タンパク質又はそれらの断片のアミノ酸をコードする。
【0060】
別の態様において、本発明は、免疫複合体を提供する。一実施形態において、前記免疫複合体は、リンカーを介して多重特異性抗体に結合した細胞毒性剤又は造影剤を含み得る。前記リンカーは、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、ジスルフィド結合、イミド結合、スルホン結合、リン酸結合、リン酸エステル結合、ペプチド結合、疎水性ポリ（エチレングリコール）リンカー又はそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態において、前記細胞毒性剤又は造影剤は、化学療法剤、成長阻害剤、カリケアマイシンのクラスからの細胞毒性剤、有糸分裂阻害剤、放射性同位元素、毒素、治療薬、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【0061】
別の態様において、本発明は、医薬組成物を提供する。一実施形態において、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体、及び多重特異性抗体タンパク質又はその断片、及び／又は免疫複合体を含み得る。一実施形態において、前記医薬組成物は、放射性同位元素、放射性核種、毒素、化学療法剤又はそれらの組み合わせから選択される治療薬を含み得る。
【0062】
別の態様において、本発明は、対象のがん、自己免疫疾患又は感染症を治療又は予防するための方法を提供する。一実施形態において、前記方法は、精製された多重特異性抗体様タンパク質又はそれらの断片を含み得る医薬組成物を投与するステップを含む。一実施形態において、前記方法は、前記対象に有効量の精製された多重特異性抗体様タンパク質、免疫複合体又は医薬組成物を投与するステップを含み得る。
【0063】
一実施形態では、上記方法は、有効量の治療剤を共投与するステップをさらに含んでもよい。上記治療剤は、抗体、化学療法剤、酵素、抗エストロゲン剤、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、チェックポイント阻害剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはタンパク質合成阻害剤、ＲＡＳ阻害剤、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７３の阻害剤又はそれらの組み合わせを含む。
【0064】
一実施形態において、前記対象はヒトである。一実施形態において、前記対象は哺乳類である。一実施形態において、前記対象はチンパンジーである。一実施形態において、前記対象はペット動物である。
【0065】
別の態様において、本発明は、有効量濃度の精製された多重特異性抗体様タンパク質又はそれらの断片、免疫複合体又は医薬組成物を含む溶液を提供する。一実施形態において、前記溶液は、ヒト対象の血漿である。
【図面の簡単な説明】
【0066】
本明細書の開示の前述及び他の特徴は、添付の図面と併せて、以下の説明及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。図面は、本明細書の開示に従って用意されたいくつかの実施形態のみを示しており、従って、その範囲を限定するものと見なされるべきではなく、本明細書の開示は、添付の図面の使用を通じてさらなる特異性及び詳細が説明され得る。
【0067】
【図1】Ｄ２結合ドメインとしてＦａｂ領域又は二量体受容体を有するとともに、重鎖（Ｄ１、Ｄ３及びＤ４）及び軽鎖（Ｄ５及びＤ６）に５つの抗原結合ドメインを有するように構成され、可変配列に基づく抗体断片、非可変配列によってコードされる受容体及びリガンドから選択された多様な構造を有するヘキサＧＮＣ抗体を示す。
【0068】
【図2】ＮＫＧ２Ｄ受容体及び４１ＢＢＬを含む精製テトラＧＮＣ抗体（Ａ～Ｃ）、ならびに精製ＮＫＧ２ＤペンタＧＮＣ（Ｄ）の安定性及び高品質を実証する分析ＳＥＣの結果を示す。
【0069】
【図3】４つのテトラＧＮＣ抗体（ＳＩ－４９Ｅ１、ＳＩ－４９Ｅ２、ＳＩ－４９Ｅ３、ＳＩ－４９Ｅ４）及びαＰＤ－Ｌ１とα４１ＢＢドメインの両方を欠く２つの二重特異性対照抗体（ＳＩ－４９Ｘ１、ＳＩ－４９Ｘ２）の、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を発現するＭＩＣＡを標的とする場合の比較効力を測定するＴＤＣＣアッセイを示す。
【0070】
【図4】１つのＮＫＧ２Ｄ－ＭＳＬＮペンタＧＮＣ（ＳＩ－４９Ｐ１）、２つのＭＳＬＮテトラＧＮＣ（ＳＩ－５１Ｅ４及びＳＩ－５１Ｅ１）、及び１つのＮＫＧ２Ｄ－ＭＳＬＮトリＧＮＣ（ＳＩ－５１Ｘ１，対照）の、ＭＩＣＡ及びメソテリン発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を標的とする場合の比較効力を測定するＴＤＣＣアッセイを示す。
【0071】
【図5】３つの部分１結合ドメイン及び腫瘍抗原に特異的に結合する単一の部分２を有する１グループの子宮頸がん細胞（Ｈｅｌａ）を標的とする場合のテトラＧＮＣ抗体の比較効力を測定するＴＤＣＣアッセイを示す。
【0072】
【図6】部分１結合特異性（ＳＩ－１）の存在（ＳＩ－１Ｐ２、ＳＩ－５５Ｅ１及びＳＩ－５５Ｅ２）及び非存在下で、全ての分子でＥＧＦＲに対して同じ結合特異性を有し、ＳＩ－１及びＳＩ－１Ｐ２でＨＥＲ３に対して同じ結合特異性を有する多重特異性ＧＮＣ抗体の、ＥＧＦＲ発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞を標的とする場合の比較効力を測定するＴＤＣＣアッセイを示す。
【0073】
【図7】バイＧＮＣ抗体（ＳＩ－５０Ｘ１）と比較する、全てのｓｃＦｖドメインに追加のジスルフィド結合を有する（ＳＩ－５０Ｅ６，ステープル化）及び有さない（ＳＩ－５０Ｅ１）テトラＧＮＣの、ＥＧＦＲ発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞を標的とする場合の比較効力を測定するＴＤＣＣアッセイを示す。
【0074】
【図8】モジュラークローニングシステムによるＤ１、Ｄ３及びＤ４からのＣＤ３、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに対する３つの部分１結合特異性、及びＤ２、Ｄ５及びＤ６の３つの腫瘍抗原に対する部分２結合特異性の任意の組み合わせを有する多重特異性ＧＮＣ抗体のクラスの産生を示す。
【発明を実施するための形態】
【0075】
以下の詳細な説明では、その一部を構成する添付の図面を参照する。図面では、文脈上別段の指示がない限り、通常、類似の記号は類似のコンポーネントを識別します。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載されている例示的な実施形態は、限定することを意味するものではない。 本明細書に提示される主題の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書に記載され、図に示されているように、本開示の側面は、本明細書で明示的に検討されている様々な構成で配置、置換、結合、分離、及び設計が可能であることは、容易に理解できる。
【0076】
本発明は、特に単離された抗体、この抗体の製造方法；この抗体若しくは抗原結合断片から構成される二重特異性若しくは多重特異性分子、抗体薬物複合体及び／又は免疫複合体；この抗体、二重特異性若しくは多重特異性分子、抗体薬物複合体及び／又は免疫複合体を含む医薬組成物；前記分子及び組成物を製造する方法；ならびに本発明の分子及び組成物を用いてがんを治療する方法を提供する。
【0077】
本発明は、多重特異性ＧＮＣ抗体、特に、四重特異性、五重特異性及び六重特異性ＧＮＣ（テトラＧＮＣ、ペンタＧＮＣ、ヘキサＧＮＣ）抗体の製造及び使用方法に関する。一般的に、ＧＮＣ抗体などのＧＮＣタンパク質は、Ｔ細胞の活性化などの免疫細胞に関与する部分１、及び腫瘍細胞を標的とする部分２の２つの部分で構成されることを特徴としている。ＧＮＣ抗体は、Ｔ細胞活性化のための抗ＣＤ３、共刺激のための抗４－１ＢＢ、免疫チェックポイントを阻害するための抗ＰＤ－Ｌ１などの免疫細胞に関与する複数の抗原結合ドメインを保持する。がん治療のための抗体療法の有効性を向上させるために、ＧＮＣ抗体は、ＧＮＣ抗体の２つの部分の特徴を保持しながら、構造的に安定してコンパクトになるように設計されている。この改善により、同じ又は異なる腫瘍細胞上の第２腫瘍関連抗原に対する結合特異性が追加され得る。ＧＮＣ抗体は、ＦｃＲｎを介したリサイクルと半減期の延長、及び容易なプロテインＡに基づく精製を可能にするＦｃドメインを含む。必要に応じて、Ｆｃ受容体媒介性免疫を組み込むことができる。ＧＮＣ抗体は通常、増加した抗原結合ドメイン （ＡｇＢＤ）のため、ＩｇＧ抗体よりも大きく、これは、Ｔ細胞と腫瘍細胞の両方に結合するための空間的柔軟性を提供する。ＧＮＣ抗体は、１つ又は複数の腫瘍抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン３、ｇｐＡ３３、ＧＤ２、ＴＲＯＰ２を含むが、これらに限定されない）を標的とすることにより、がんを治療するための効果的な抗体療法となる可能性がある。テトラＧＮＣ抗体やペンタＧＮＣ抗体などの多重特異性Ｔ細胞エンゲージング抗体は、従来の免疫療法に比べて際立った利点を有する。これらの抗体は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を有するＴ細胞上のＣＤ３の架橋機能を示し、この機能により、Ｔ細胞を患者から除去したり、患者に再導入する前に腫瘍細胞に特異的になるように遺伝子改変したりする必要なく、これらの抗体が腫瘍細胞を殺すようにリダイレクト及び誘導される（キメラ抗原受容体Ｔ細胞又はＣＡＲ－Ｔ療法としても知られている）。ＧＮＣタンパク質媒介性抗体療法又はＴ細胞療法は、Ｔ細胞の遺伝子改変を伴わない。後者は、改変されたＴ細胞をクローン性増殖、即ちＴ細胞性白血病に変換するリスクを伴う可能性がある。
【0078】
本発明は、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含む四重、五重及び六重特異性ＧＮＣ（テトラＧＮＣ、ペンタＧＮＣ、ヘキサＧＮＣ）抗体を提供する（図１）。ヘキサＧＮＣ抗体は、Ｄ２結合ドメインとしてＦａｂ領域又は二量体受容体を有するとともに、重鎖（Ｄ１、Ｄ３及びＤ４）及び軽鎖（Ｄ５及びＤ６）に５つの抗原結合ドメインを有するように構成することができ、可変配列に基づく抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）、非可変配列によってコードされる受容体及びリガンドから選択された多様な構造を備えている。Ｆａｂ領域のＶＨ及びＶＬは、結合特異性を有する又は有さない非Ｆａｂ二量体によって置換され得る。一実施形態において、２本の鎖のＦｃドメインは、ヘテロ二量体の形成を促進するために、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」としても知られる相補的な変異を含むようにエンジニアリングされる。ヘキサＧＮＣ抗体は、免疫エフェクター細胞又は標的がん細胞によって発現される少なくとも６つの抗原に対する６つの独立した結合特異性を含む。従来の併用療法と比較して、ヘキサＧＮＣ抗体のクラスは、有効性を向上させ、製造コストを削減するために、単一薬剤としてがんを治療するように設計される。このようにして、この治療は臨床管理のＳＯＰを簡素化し、多変量投与に関する物流上の懸念を緩和し、患者にとってより手頃な価格になる。
【0079】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物活性を示す限り、具体的には、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト抗体及びアンタゴニスト抗体）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２及びＦｖ）をカバーする。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ｓｃＦｖ、二重特異性、二重有効、ヒト及びヒト化抗体であってもよい。既知の抗原に結合する分子の活性断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ及びＦｖ断片、並びにＦａｂ免疫グロブリン発現ライブラリの産物、上述したいずれかの抗体及び断片のエピトープ結合断片が含まれる。いくつかの実施形態において、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性部分、即ち、抗原に免疫特異的に結合する結合部位を含む分子を含んでもよい。免疫グロブリンは、任意のタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。一実施形態では、抗体は、完全抗体及び完全抗体に由来の任意の抗原結合断片であってもよい。典型的な抗体は、通常、２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖からなるヘテロ四量体タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨと略記）及び重鎖定常ドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬと略記）及び軽鎖定常ドメインから構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、超可変相補性決定領域ｓ（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域のドメインにさらに分けられ得る。各可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）は、通常、アミノ末端からカルボキシ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配列される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合領域がある。
【0080】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、集団を含む個々の抗体は、少量存在する可能性のある自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンにコンタミネーションされていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されない。例えば、本明細書の開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、又は組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７参照）。
【0081】
モノクローナル抗体は、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と重鎖及び／又は軽鎖の一部が同一又は相同であり、一方、鎖の残りの部分は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来する、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体の断片の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含んでいてもよい（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５［１９８４］）。
【0082】
モノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ又はファージディスプレイ（レビューはＳｉｅｇｅｌ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．９：１５－２２（２００２）参照）を含むさまざまな方法を使用して、又は初代Ｂ細胞から直接抗体を分子クローニングすること（Ｔｉｌｌｅｒ．Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：４５３－７（２０１１）参照）で生産し得る。本明細書の開示において、抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１蛋白質及び細胞表面上でヒトＰＤ－Ｌ１を一過性発現する細胞の両方でウサギを免疫することにより作製された。ウサギは、親和性、多様性、特異性の高い抗体を作成することが知られている（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４９：ｅ３０５）。免疫動物のＢ細胞をインビトロで培養し、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の生産についてスクリーニングした。ウサギの免疫及びその後のＢ細胞培養に加えて、抗体の生成と発見のための他の一般的な戦略には、他の動物（マウスなど）の免疫、その後のハイブリドーマ及び／又はファージ、酵母若しくは哺乳動物細胞でのディスプレイ；或いは合成可変遺伝子ライブラリを用いたディスプレイが含まれる。抗体可変遺伝子は、組換えＤＮＡ技術を使用して単離され、得られた抗体は組換えで発現され、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する能力、非ヒト霊長類ＰＤ－Ｌ１に結合する能力、ヒトＴ細胞活性化を増強する能力などの所望の特徴についてさらにスクリーニングされた。この抗体発見の一般的な方法は、Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＬＯＳ Ｏｎｅ．９：ｅ８６１８４（２０１４）に記載されている方法と似ている。
【0083】
「抗原又はエピトープ結合部分もしくは断片」という用語は、抗原に結合することができる抗体の断片を指す。これらの断片は、インタクト抗体の抗原結合機能及び追加機能の能力を有していてもよい。結合断片の例は、合成リンカーによって単一ポリペプチド鎖に接続された抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＶＬ、定常軽鎖（ＣＬ）、ＶＨ、及び定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片を含むが、これらに限定されない。抗体断片は、当業者に知られている従来の方法を使用して生産される。抗体断片は、インタクト抗体で使用される同じ技術を使用して、有用性に関してスクリーニングできる。
【0084】
「抗原又はエピトープ結合断片」は、多くの当該技術分野で知られている技術により、本明細書の開示の抗体に由来し得る。例えば、精製モノクローナル抗体をペプシンなどの酵素で切断し、ＨＰＬＣゲルろ過にかけることができる。次に、Ｆａｂ断片を含む適切な画分を収集し、膜濾過などにより濃縮し得る。抗体の活性断片の単離のための一般的な技術のさらなる説明については、例えば、Ｋｈａｗ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２３：１０１１－１０１９（１９８２）、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：６６３－６９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６を参照。
【0085】
抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を持つ「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名前が容易に結晶化する能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋できるＦ（ａｂ′）２断片が生成される。
【0086】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）を含んでいてもよい。Ｆａｂ′断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が追加されていることにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ′－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ'の本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ′）２抗体断片は元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片のペアとして生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【0087】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体で構成され、非共有結合で緊密に結合している。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を規定する。集合的に、６つのＣＤＲは抗体に抗原結合特異性を付与する。
【0088】
脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパとラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのいずれかに割り当てることができる。
【0089】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラスがある。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－４、ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、デルタ、イプシロン、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造と三次元配置はよく知られている。
【0090】
「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分が１つ（又はそれ以上）のヒト免疫グロブリンに由来する操作された抗体のタイプを指す。さらに、フレームワークサポート残基は、結合親和性を保持するために変更されてもよい。「ヒト化抗体」を得る方法は、当業者によく知られている。（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８６：１００２９－１００３２ （１９８９）， Ｈｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９：４２１ （１９９１）参照）。
【0091】
本明細書で使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「蛋白質」という用語は互換性があり、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構成される生体分子を意味すると定義される。
【0092】
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、「１つ以上」を意味すると定義され、文脈が不適切でない限り複数形を含む。
【0093】
「単離された」とは、それが自然に発生する成分の少なくともいくつかを含まない生体分子を意味する。「単離された」とは、本明細書に開示の様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、発現元の細胞又は細胞培養物から同定及び分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。典型的には、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程により調製される。「単離された抗体」とは、異なる抗原結合特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。
【0094】
「組換え」とは、外因性宿主細胞で組換え核酸技術を使用して抗体が生成されることを意味する。
【0095】
「抗原」という用語は、生物、特に動物、より具体的にはヒトを含む哺乳動物において免疫応答を誘発することができる実体又はその断片を指す。この用語は、抗原性又は抗原決定基に関与する免疫原及びその領域を含む。
【0096】
また、本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、免疫原性剤に対する抗体、T細胞又は他の反応性免疫細胞の生産を誘発又は増強し、ヒト又は動物の免疫応答に寄与する物質を指す。個体が治療される障害を緩和又は軽減するために、本明細書の開示の投与された免疫原性組成物に対して十分な抗体、T細胞及び他の反応性免疫細胞を生産すると、免疫応答が生じる。
【0097】
特定の抗原又はエピトープに対する「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的」とは、非特異的相互作用とは明らかに異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を持たない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することにより測定し得る。例えば、特異的結合は、標的に類似した制御分子との競合により決定し得る。
【0098】
「親和性」という用語は、抗体／抗原、受容体／リガンドなどの２つのポリペプチド間の引力の尺度を指す。２つのポリペプチド間の固有の引力は、特定の相互作用の結合親和性平衡解離定数（ＫＤ）として表すことができる。ＫＤ結合親和性定数は、例えば、バイオレイヤー干渉法によって測定することができる。ここで、ＫＤは、ｋｄｉｓ（解離速度定数）とｋｏｎ（結合速度定数）の比、即ち、ＫＤ＝ｋｄｉｓ／ｋｏｎである。
【0099】
特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、少なくとも約１０－４Ｍ、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、少なくとも約１０－１２Ｍ、又はそれ以上の抗原又はエピトープに対するＫＤを有する抗体によって示され得る。ここで、ＫＤは特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原又はエピトープに対して対照分子の２０～、５０～、１００～、５００～、１０００～、５０００～、１００００～倍、又はより大きいＫＤを有してもよい。
【0100】
また、特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照に対するエピトープについて少なくとも２０～、５０～、１００～、５００～、１０００～、５０００～、１００００～倍、又はより大きい抗原又はエピトープに対するＫＡ又はＫａを有する抗体により示すことができる。ここで、ＫＡ又はＫａは、特定の抗体－抗原相互作用の結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）速度を意味する。
【0101】
２つの配列間の「相同性」は、配列の同一性によって決定される。互いに比較される２つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は、好ましくは、より長い配列のヌクレオチド残基と同一であるより短い配列のヌクレオチド残基の割合に関する。配列同一性は、コンピュータープログラムを使用して従来通りに決定できる。所定の配列と本明細書の開示の上記の配列との比較において現れる逸脱は、例えば、追加、欠失、置換、挿入又は組換えによって引き起こされてもよい。
【0102】
本明細書の開示は、本明細書に含まれる特定の実施形態及び実施例の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解されてもよい。本明細書の開示は、その特定の実施形態の特定の詳細を参照して説明されたが、そのような詳細な説明は、開示の範囲に対する限定とみなされるべきではない。
【0103】
実施例
実施例１：方法及びアッセイ
発現及び精製
実施例１：方法及びアッセイ
発現及び精製
【0104】
制限クローニング及び／又はギブソンア・センブリを用いて、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列をカスタム遺伝子断片からｐＴＴ５ベクターにクローニングした。製造業者の指示に従って、プラスミドＤＮＡをＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ａ２９１３３）に一過性にトランスフェクトして多重特異性ＧＮＣタンパク質を産生した。７～９日後にプロテインＡセンサーを備えたＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ装置を用いて力価を測定した。
【0105】
ＧＮＣタンパク質をプロテインＡクロマトグラフィー（Ｃｙｔｉｖａ、１７５４９８５３）により精製し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．６）で溶出し、その後、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の１／５を添加して直ちに中和した。アフィニティー精製後に分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）によりタンパク質の品質を評価した。ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ ＳＥＣ ３００Ａ、７．８ｘ３００ｍｍ、３．５μｍカラムを備えたＡｃｑｕｉｔｙ Ａｒｃ Ｗａｔｅｒｓを用いてａＳＥＣを実施した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラムを用いた分取ＳＥＣステップでタンパク質をさらに精製した。後続のすべてのアッセイは、少なくとも９０％の目的タンパク質であるタンパク質を用いてａＳＥＣによって実行された。
【0106】
T細胞依存性細胞毒性アッセイ
【0107】
Ｔ細胞依存性細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイは、Ｎａｚａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）に記載の方法により実行された。確立されたがん細胞株（ＡＤＣＣ）からの標的細胞をまずルシフェラーゼ発現遺伝子で形質導入してルシフェラーゼ陽性の標的細胞を産生する。次に、これらの標的細胞を細胞培養フラスコで増殖させる。適切な数に拡大された後、これらの標的細胞を持ち上げ、計数し、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６液体ディスペンサーを用いて以前の増殖特性に応じて適切な密度で３８４ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ３５７０）に再接種する。接着細胞株の場合、細胞をＣＯ２制御ジャケット付き組織培養インキュベーターで一晩プレートに接着させる。次に、ＰＢＭＣ又は前に拡大したＴ細胞（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）のいずれかを、適切なエフェクター／標的比（通常、５：１）でプレーティングし、プレートに試験Ｔ細胞標的剤の希釈系列を投与する。試験物質の実験を４回（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）実施し、９６ウェルの希釈ブロックをロボット（Ｏｐｅｎｔｒｏｎｓ ＯＴ－２リキッドハンドリングロボット）で３８４ウェルの象限にスタンプする。ＴＤＣＣアッセイプレートを７２～９６時間インキュベートする。細胞生存率曲線の読み取りは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｒｉｇｈｔ－ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキットを用いて行われる。簡単に言えば、２０ｕＬをＴＤＣＣアッセイプレートに加え、約１５分間インキュベートした後、ＢＭＧ Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーで発光を測定する。死滅曲線とＥＣ５０値を分析し、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアでプロットする。
【0108】
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ
多角度光散乱（ＭＡＬＳ）、吸光度（ＵＶ）及び／又は屈折率（ＲＩ）濃度検出器と組み合わせて分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳは通常、ＦＤＡ ＩＮＤ提出をサポートするために、抗体の分析特性評価及び初期段階の臨床試験で使用される。サイズ排除は、Ａｃｑｕｉｔｙ Ａｒｃ Ｗａｔｅｒｓ及びＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ ＳＥＣ３００Ａ、７．８ｘ３００ｍｍ、３．５μｍカラムを用いて実行される。ＭＡＬＳコンポーネントはＷｙａｔｔ ｍｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ／ＯＰｔｉｌｌａｂ Ｔ－ｒＥＸシステムを使用する。分子量は、分子濃度の変化Δｃに伴う溶液屈折率ｎの変化Δｎの測定値（Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ示差屈折計を用いてｄｎ／ｄｃ（＝Δｎ／Δｃ）値を測定する）から決定することができる。ｍｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器によって測定された、分子によって散乱された光の強度は、モル質量に正比例する。
多角度光散乱（ＭＡＬＳ）、吸光度（ＵＶ）及び／又は屈折率（ＲＩ）濃度検出器と組み合わせて分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳは通常、ＦＤＡ ＩＮＤ提出をサポートするために、抗体の分析特性評価及び初期段階の臨床試験で使用される。サイズ排除は、Ａｃｑｕｉｔｙ Ａｒｃ Ｗａｔｅｒｓ及びＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ ＳＥＣ３００Ａ、７．８ｘ３００ｍｍ、３．５μｍカラムを用いて実行される。ＭＡＬＳコンポーネントはＷｙａｔｔ ｍｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ／ＯＰｔｉｌｌａｂ Ｔ－ｒＥＸシステムを使用する。分子量は、分子濃度の変化Δｃに伴う溶液屈折率ｎの変化Δｎの測定値（Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ示差屈折計を用いてｄｎ／ｄｃ（＝Δｎ／Δｃ）値を測定する）から決定することができる。ｍｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器によって測定された、分子によって散乱された光の強度は、モル質量に正比例する。
【0109】
ＯＣＴＥＴ
ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔプラットフォームは、タンパク質間相互作用を測定するためのラベルフリー技術としてバイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）を適用する。これは、バイオセンサーチップ上の固定化タンパク質層と内部参照層の２つの表面から反射される白色光の干渉パターンを分析する光学分析技術である。バイオセンサーの先端に結合した分子の数が変化すると、干渉パターンが変化し、リアルタイムで測定することができる。この方法では、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃキャプチャー（ＡＨＣ）バイオセンサーの先端表面に固定化された抗体と溶液中の抗原との結合により、バイオセンサー先端の光学的厚さが増加し、その結果、生物学的層の厚さの変化を直接反映する波長シフトΔλが生じる。この２つの分子の相互作用はリアルタイムで測定され、結合特異性、結合速度と解離速度、又は濃度を精確かつ正確に監視することができる。未結合の分子、周囲の媒体の屈折率の変化、又は流速の変化は、干渉パターンに影響しない。Ｏｃｔｅｔシステムでは、ＡＨＣチップを用いてＧＮＣタンパク質を固定化し、精製抗原を分析物として単一濃度（例えば、１００ｎＭ）又は系列濃度（例えば、２００ｎＭから始まる７つの１：２連続希釈）で用いて標的抗原へのＧＮＣタンパク質の結合を容易に分析することができる。
ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔプラットフォームは、タンパク質間相互作用を測定するためのラベルフリー技術としてバイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）を適用する。これは、バイオセンサーチップ上の固定化タンパク質層と内部参照層の２つの表面から反射される白色光の干渉パターンを分析する光学分析技術である。バイオセンサーの先端に結合した分子の数が変化すると、干渉パターンが変化し、リアルタイムで測定することができる。この方法では、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃキャプチャー（ＡＨＣ）バイオセンサーの先端表面に固定化された抗体と溶液中の抗原との結合により、バイオセンサー先端の光学的厚さが増加し、その結果、生物学的層の厚さの変化を直接反映する波長シフトΔλが生じる。この２つの分子の相互作用はリアルタイムで測定され、結合特異性、結合速度と解離速度、又は濃度を精確かつ正確に監視することができる。未結合の分子、周囲の媒体の屈折率の変化、又は流速の変化は、干渉パターンに影響しない。Ｏｃｔｅｔシステムでは、ＡＨＣチップを用いてＧＮＣタンパク質を固定化し、精製抗原を分析物として単一濃度（例えば、１００ｎＭ）又は系列濃度（例えば、２００ｎＭから始まる７つの１：２連続希釈）で用いて標的抗原へのＧＮＣタンパク質の結合を容易に分析することができる。
【0110】
動的光散乱（ＤＬＳ）によるＴｍ
抗体サンプル（１ｍｇ／ｍｌ）の流体力学的半径（Ｒｈ）を、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダーを用いて２５℃から７５℃まで１℃刻み、０．２６℃／ｍｉｎの速度で測定した。各温度で５秒間の合計３回の取得を収集した。ＤＹＮＡＭＩＣＳ７．８．１．３ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲｈが大幅に変化し始める半径と開始温度及び転移曲線の中点（Ｔｍ）を計算した。
抗体サンプル（１ｍｇ／ｍｌ）の流体力学的半径（Ｒｈ）を、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダーを用いて２５℃から７５℃まで１℃刻み、０．２６℃／ｍｉｎの速度で測定した。各温度で５秒間の合計３回の取得を収集した。ＤＹＮＡＭＩＣＳ７．８．１．３ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲｈが大幅に変化し始める半径と開始温度及び転移曲線の中点（Ｔｍ）を計算した。
【0111】
定量的フローサイトメトリー（ｑＦＡＣＳ）
ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対計数ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃ３６９５０）をキャリブレーションに使用し、一次抗体パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、ＭＭ１１１由来の抗ＨＥＲ３（ＨＥＲ３）、ＰＬ２２１Ｇ５（ＰＤ－Ｌ１）、ＴＦ ３Ｈ８－１（ＣＥＡ）、及びトラスツズマブ（ＨＥＲ２）を用いて様々な腫瘍細胞株の対応する受容体数を定量化した（Ｗａｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｙｔｏｍ．２０１６）．
ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対計数ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃ３６９５０）をキャリブレーションに使用し、一次抗体パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、ＭＭ１１１由来の抗ＨＥＲ３（ＨＥＲ３）、ＰＬ２２１Ｇ５（ＰＤ－Ｌ１）、ＴＦ ３Ｈ８－１（ＣＥＡ）、及びトラスツズマブ（ＨＥＲ２）を用いて様々な腫瘍細胞株の対応する受容体数を定量化した（Ｗａｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｙｔｏｍ．２０１６）．
【0112】
実施例２：ＮＫＧ２Ｄを結合ドメインの一つとして有するＧＮＣ抗体
ＮＫＧ２Ｄは、形質転換細胞及び感染細胞の検出と排除のための主要な認識受容体であり、感染又は癌などのゲノムストレスの結果として、細胞ストレス中でそのリガンドが誘導される。ヒトでは、ＮＫＧ２ＤはＮＫ遺伝子複合体（ＮＫＣ）に位置するＫＬＲＫ１遺伝子によってコードされ、ＮＫ細胞、γδＴ細胞及びＣＤ８＋αβＴ細胞によって発現される。ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体複合体は六量体構造に集合する一方、ＮＫＧ２Ｄ自体はホモ二量体を形成し、その外部ドメインはリガンド結合に役立つ。ＮＫ細胞では、ＮＫＧ２Ｄは活性化受容体として機能し、それ自体が細胞毒性を引き起こすことができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの機能は、それらを活性化するための共刺激シグナルを送ることである。主要組織適合複合体クラスＩポリペプチド関連配列Ａ遺伝子（ＭＩＣＡ）は、基本的にすべてのヒトナチュラルキラー（ＮＫ）、γδＴ及びＣＤ８＋αβＴ細胞の表面で発現される活性化受容体ＮＫＧ２Ｄを刺激するリガンドとして作用する膜結合タンパク質をコードする。ＭＩＣＡタンパク質はほとんどの細胞には存在しないが、感染や発がん性形質転換によって誘導される可能性があり、上皮腫瘍で頻繁に発現される。ＮＫＧ２Ｄは、ＭＩＣＡに結合すると、ＭＩＣＡを発現する感染細胞及び腫瘍細胞に対するＮＫ細胞及びγδＴ細胞の細胞溶解反応を活性化する。したがって、膜結合型ＭＩＣＡは、感染や自然に発生した腫瘍に対する初期免疫応答のシグナルとして機能する。一方、ヒト腫瘍細胞は自発的に可溶型のＭＩＣＡを放出し、ＮＫＧ２Ｄ のダウンレギュレーションを引き起こし、ＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍免疫応答の深刻な障害を引き起こす。これは、腫瘍の免疫回避を促進し、遊離ＮＫＧ２Ｄによって中和される可能性のある感染に対する宿主の抵抗力を弱めると考えられている。この文脈において、またＧＮＣタンパク質の定義により、ＮＫＧ２Ｄは細胞毒性細胞結合部分の１つである（出願人の出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３９１６０を参照；その全体が本明細書に組み込まれる）。
ＮＫＧ２Ｄは、形質転換細胞及び感染細胞の検出と排除のための主要な認識受容体であり、感染又は癌などのゲノムストレスの結果として、細胞ストレス中でそのリガンドが誘導される。ヒトでは、ＮＫＧ２ＤはＮＫ遺伝子複合体（ＮＫＣ）に位置するＫＬＲＫ１遺伝子によってコードされ、ＮＫ細胞、γδＴ細胞及びＣＤ８＋αβＴ細胞によって発現される。ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体複合体は六量体構造に集合する一方、ＮＫＧ２Ｄ自体はホモ二量体を形成し、その外部ドメインはリガンド結合に役立つ。ＮＫ細胞では、ＮＫＧ２Ｄは活性化受容体として機能し、それ自体が細胞毒性を引き起こすことができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの機能は、それらを活性化するための共刺激シグナルを送ることである。主要組織適合複合体クラスＩポリペプチド関連配列Ａ遺伝子（ＭＩＣＡ）は、基本的にすべてのヒトナチュラルキラー（ＮＫ）、γδＴ及びＣＤ８＋αβＴ細胞の表面で発現される活性化受容体ＮＫＧ２Ｄを刺激するリガンドとして作用する膜結合タンパク質をコードする。ＭＩＣＡタンパク質はほとんどの細胞には存在しないが、感染や発がん性形質転換によって誘導される可能性があり、上皮腫瘍で頻繁に発現される。ＮＫＧ２Ｄは、ＭＩＣＡに結合すると、ＭＩＣＡを発現する感染細胞及び腫瘍細胞に対するＮＫ細胞及びγδＴ細胞の細胞溶解反応を活性化する。したがって、膜結合型ＭＩＣＡは、感染や自然に発生した腫瘍に対する初期免疫応答のシグナルとして機能する。一方、ヒト腫瘍細胞は自発的に可溶型のＭＩＣＡを放出し、ＮＫＧ２Ｄ のダウンレギュレーションを引き起こし、ＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍免疫応答の深刻な障害を引き起こす。これは、腫瘍の免疫回避を促進し、遊離ＮＫＧ２Ｄによって中和される可能性のある感染に対する宿主の抵抗力を弱めると考えられている。この文脈において、またＧＮＣタンパク質の定義により、ＮＫＧ２Ｄは細胞毒性細胞結合部分の１つである（出願人の出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３９１６０を参照；その全体が本明細書に組み込まれる）。
【0113】
ＮＫＧ２Ｄリガンド結合特異性を有するＧＮＣ抗体は、共通のコア抗体ドメインを含み、そのＦｃ領域はエフェクター機能を有していてもよいか、又は欠いていてもよい。重鎖（ＨＣ）上の結合ドメインの１つとしてＮＫＧ２Ｄ二量体を有するテトラＧＮＣ抗体を生成した（表１）。これらの抗体は、２つの追加のｓｃＦｖドメイン（４－１ＢＢへの結合ドメインを含む。４－１ＢＢは、通常、活性化Ｔ細胞で発現されるＴＮＦスーパーファミリー受容体（ＳＩ－４９Ｅ１、ＳＩ－４９Ｅ２、ＳＩ－４９Ｅ３、ＳＩ－４９Ｅ４；表１）である）、又は１つの追加ｓｃＦｖ及び４１ＢＢＬ（三量体型）（通常、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に見られ、４－１ＢＢに結合する（ＳＩ－４９Ｅ１１、ＳＩ－４９Ｅ１２、ＳＩ－４９Ｅ１３；表１））を有した。これらの４つの結合ドメイン（Ｄ１からＤ４）は、Ｇ／Ｓリンカー領域を介して融合され、単一の重鎖（ＨＣ、鎖Ａ又は鎖１）として発現された。図１に示す定義により、これらのタイプのテトラＧＮＣ抗体は、ＶＨドメイン（Ｄ２又はＦａｂ）のＮ末端に位置するｓｃＦｖの１つ（Ｄ１）と、Ｆｃ領域に連続して結合した２つのｓｃＦｖ（Ｄ３及びＤ４）を有することを特徴とするのに対し、軽鎖（ＬＣ）は、天然構成でＶＬドメイン（Ｄ２又はＦａｂ）のみを含む。ＮＫＧ２Ｄ結合特異性を有するペンタＧＮＣ抗体を製造するための１つの戦略は、ＬＣのＮ（Ｄ６）又はＣ（Ｄ５）末端に追加のＮＫＧ２Ｄタンデムリピートホモ二量体を設計することである（図１）。ＬＣからの結合ドメインとしてＮＫＧ２Ｄ二量体を有する５つのＤ５－ペンタＧＮＣ抗体を生成した（ＳＩ－４９Ｐ１、ＳＩ－４９Ｐ２、ＳＩ－４９Ｐ３、ＳＩ－４９Ｐ４及びＳＩ－４９Ｐ５；表２）。これらのＤ５－ペンタＧＮＣ抗体の特徴は、抗ＣＤ３、抗ＰＤ－Ｌ１、抗４－１ＢＢ及びＮＫＧ２Ｄの４つの細胞毒性結合部分と組み合わせた単一のがん標的部分（Ｄ２）である。表３には、独立した結合ドメインとしての例示的ながん標的部分及び細胞毒性結合部分の両方の情報が示されている。この定義によれば、ＰＤ－Ｌ１は免疫チェックポイントマーカーとしてがん細胞で発現されるが、がんを標的とする部分として分類されていない。これらのＤ５－ペンタＧＮＣ抗体は、ＨＣにある追加の３つのｓｃＦｖ結合領域及びＬＣにある１つのＮＫＧ２Ｄタンデムリピートホモ二量体を有するコア抗体結合ドメイン（合計５つの異なる特異性）から構成されるが、構成は多様である可能性がある。例えば、前記ペンタＧＮＣ抗体は、追加の２つのｓｃＦｖ結合領域と１つのＴＮＦスーパーファミリー（三量体型）ドメイン、及び１つのＮＫＧ２Ｄタンデムリピートホモ二量体を有するコア抗体結合ドメイン（合計５つの異なる特異性）を含んでもよい。ＮＫＧ２Ｄと４１ＢＢＬは典型的な抗原結合ドメイン構造、つまりＦａｂとｓｃＦｖのどちらでもないため、コアにＦａｂを有するようなＧＮＣ抗体は、他の場所では同じ意味でＧＮＣ分子又はＧＮＣタンパク質と呼ばれることがある。さらに、ドメイン構造は、これらの多重特異性ＧＮＣタンパク質を安定化するためにエンジニアリングされてもよい。例えば、各ｓｃＦｖドメインは、構造全体を安定化するために選択される、ｖＬ１００及びｖＨ４４でジスルフィド結合によりステープル化されたバリアント及び未ステープル化バリアントの両方を有し得る。
【0114】
分析ＳＥＣは、ＮＫＧ２Ｄ受容体及び４１ＢＢＬを含む精製されたテトラＧＮＣ抗体、並びにＬＣからのＮＫＧ２Ｄ結合特異性を有する複数のＤ５－ペンタＧＮＣ（ＳＩ－４９Ｅ１、ＳＩ－４９Ｅ２、ＳＩ－４９Ｅ３、ＳＩ－４９Ｅ４、ＳＩ－４９Ｅ１１、ＳＩ－４９Ｅ１２、ＳＩ－４９Ｅ１３、ＳＩ－４９Ｐ１、ＳＩ－４９Ｐ２、ＳＩ－４９Ｐ３及びＳＩ－４９Ｐ４を含む）（２Ｄ）の安定性と高品質を示す（図２Ａ－２Ｃ）。この結果は、これらの非定型ＧＮＣ抗体が容易に精製され、安定状態を維持できることを証明している。
【0115】
実施例３：結合ドメインの１つとしてＮＫＧ２Ｄを有するＧＮＣ抗体の効力の比較
ＮＫ細胞では、ＮＫＧ２Ｄは活性化受容体として機能し、それ自体が細胞毒性を引き起こすことができる一方、ＣＤ８＋Ｔ細胞では、ＮＫＧ２Ｄの機能は共刺激シグナルを送ってそれらを活性化することである。ＮＫＧ２Ｄはホモ二量体を形成し、その外部ドメインはリガンド結合に役立つ。この機能により、ＮＫＧ２ＤはＧＮＣフォーマットで非可変配列に基づく結合ドメインとなり、他の結合ドメインが追加されて多重特異性ＮＫＧ２Ｄ－ＧＮＣタンパク質のクラスを作成することができる。一ＧＮＣフォーマットにおいて、個々のＮＫＧ２Ｄ単量体は、重鎖及び軽鎖のＤ２位置に組み込まれ、ＨＣ／ＬＣ二量体化で二量体ＮＫＧ２Ｄ受容体を形成した。したがって、ＮＫＧ２Ｄは、多特異性抗体様タンパク質ＧＮＣ分子がそのリガンドに結合するための受容体として機能することができる。他のＧＮＣフォーマットにおいて、ＮＫＧ２Ｄタンデムリピートは、ホモ二量体化して機能的な二量体受容体を形成する個々のＮＫＧ２Ｄ単量体間に（ＧｘＳｙ）ｎリンカーを追加することによって設計された。このＮＫＧ２Ｄタンデム二量体構造は、Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５又はＤ６に配置され得る。
ＮＫ細胞では、ＮＫＧ２Ｄは活性化受容体として機能し、それ自体が細胞毒性を引き起こすことができる一方、ＣＤ８＋Ｔ細胞では、ＮＫＧ２Ｄの機能は共刺激シグナルを送ってそれらを活性化することである。ＮＫＧ２Ｄはホモ二量体を形成し、その外部ドメインはリガンド結合に役立つ。この機能により、ＮＫＧ２ＤはＧＮＣフォーマットで非可変配列に基づく結合ドメインとなり、他の結合ドメインが追加されて多重特異性ＮＫＧ２Ｄ－ＧＮＣタンパク質のクラスを作成することができる。一ＧＮＣフォーマットにおいて、個々のＮＫＧ２Ｄ単量体は、重鎖及び軽鎖のＤ２位置に組み込まれ、ＨＣ／ＬＣ二量体化で二量体ＮＫＧ２Ｄ受容体を形成した。したがって、ＮＫＧ２Ｄは、多特異性抗体様タンパク質ＧＮＣ分子がそのリガンドに結合するための受容体として機能することができる。他のＧＮＣフォーマットにおいて、ＮＫＧ２Ｄタンデムリピートは、ホモ二量体化して機能的な二量体受容体を形成する個々のＮＫＧ２Ｄ単量体間に（ＧｘＳｙ）ｎリンカーを追加することによって設計された。このＮＫＧ２Ｄタンデム二量体構造は、Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５又はＤ６に配置され得る。
【0116】
テトラＧＮＣ抗体におけるＮＫＧ２Ｄ位置の影響を評価するために、ＳＩ－４９Ｅ１、ＳＩ－４９Ｅ２、ＳＩ－４９Ｅ３、ＳＩ－４９Ｅ４をＴＤＣＣアッセイに使用した（図３）。ＭＩＣＡを発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を使用すると、４つのＮＫＧ２ＤテトラＧＮＣ抗体はすべて、対照抗体ＳＩ－４９Ｘ１（二重特異性ＮＫＧ２Ｄ－αＣＤ３－Ｆｃ抗体）及びＳＩ－４９Ｘ２（二重特異性Ｆｃ－αＣＤ３－ＮＫＧ２Ｄ抗体）よりも高い効力を示している。対照抗体ＳＩ－４９Ｘ１及びＳＩ－４９Ｘ２は、いずれも抗ＰＤ－Ｌ１及び抗４－１ＢＢｓｃＦｖを欠いている。この結果は、ＰＤ－Ｌ１及び／又は４－１ＢＢに対する結合特異性が毒性に寄与することを示している。４つのＮＫＧ２ＤテトラＧＮＣ抗体間の小さな違いは、それらの構成と免疫細胞へのアクセス可能性の違いを大きく反映する可能性がある。
【0117】
ＳＩ－４９Ｐ１、ＳＩ－４９Ｐ２、ＳＩ－４９Ｐ３、ＳＩ－４９Ｐ４及びＳＩ－４９Ｐ５（表２）を用いたＴＤＣＣアッセイにより、ペンタＧＮＣ抗体におけるＮＫＧ２Ｄ位置の影響を評価した（図４）。ＮＫＧ２Ｄ－αＭＳＬＮペンタＧＮＣ抗体ＳＩ－４９Ｐ１は、テトラＧＮＣ対照抗体ＳＩ－５１Ｅ４とＳＩ－５１Ｅ１、及びＮＫＧ２Ｄ－αメソテリン（αＭＳＬＮ）対照抗体ＳＩ－５１Ｘ１よりも高い効力で細胞を死滅させる。この観察は、テトラＧＮＣ抗体へのＮＫＧ２Ｄの付加及び位置が効力を改善する傾向を示している。αＰＤ－Ｌ１及びα４－１ＢＢを含まない三重特異性αＮＫＧ２Ｄ－ＬＣ／αＣＤ３－αＭＳＬＮ－Ｆｃである対照抗体ＳＩ－５１Ｘ１は、効力が低く、αＰＤ－Ｌ１及びα４－１ＢＢドメインの両方が毒性を増強できることを示している。細胞の死滅効力は、ペンタＧＮＣ＞テトラＧＮＣ＞ペンタＧＮＣ対照抗体である。
【0118】
ＮＫＧ２Ｄ受容体ドメイン二量体がＴ細胞をリダイレクトして、テトラＧＮＣ又はペンタＧＮＣ抗体のコンテキストでＭＩＣＡを有する腫瘍細胞を殺す能力を定量化するために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１標的細胞を用いたＴＤＣＣアッセイを実施した。試験品は、Ｄ２に陰性対照抗ＦＩＴＣドメインがある対照テトラＧＮＣ抗体（ＳＩ－３８Ｅ７２、αＣＤ３ｘαＦＩＴＣｘαＰＤ－Ｌ１ｘα４－１ＢＢ）、異なるＧＮＣ位置に結合ドメインがあるテトラＧＮＣ抗体（ＳＩ－４９Ｅ１、ＳＩ－４９Ｅ２、ＳＩ－４９Ｅ３、ＳＩ－４９Ｅ４、ＮＫＧ２ＤｘαＣＤ３ｘαＰＤ－Ｌ１ｘα４－１ＢＢ）、及び追加のαＭＳＬＮ結合ドメインを有するペンタＧＮＣ（ＳＩ－４９Ｐ１、αＣＤ３ｘαＭＳＬＮｘαＰＤ－Ｌ１ｘα４－１ＢＢｘＮＫＧ２Ｄ）を含む。エフェクター細胞：標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ）は５：１であり、精製されたＴ細胞、標的細胞及び薬物希釈液を９６時間インキュベートした後、残りの腫瘍細胞を表す発光を読み取った。一部の実験は異なる日に行われたため、ＥＣ５０の絶対値は異なる場合があることに注意されたい。それにもかかわらず、表４の結果は、ＮＫＧ２Ｄドメインを含むすべてのテトラＧＮＣ抗体がＮＫＧ２Ｄを含まない対応するテトラＧＮＣ（ＳＩ－３８Ｅ７２）よりも約１０倍（ＳＩ－４９Ｅ２）から１３０倍以上（ＳＩ－４９Ｅ４）の範囲で顕著に高いＴＤＣＣ効力を有することを示している。これらのテトラＧＮＣ抗体間の違いは、同一群の４つの結合ドメインの構成に起因する可能性があるが、抗ＴＡＡ部分の追加により、ペンタＧＮＣ抗体ＳＩ－４９Ｐ１の効力は６００倍以上大幅に増加した。したがって、ＮＫＧ２Ｄなどの細胞毒性結合部分を１つ追加することにより、効力が向上することができ、抗ＴＡＡ結合部分を追加することにより、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅の効力が特異的に増加することができる。
【0119】
実施例4：軽鎖夾雑物を除去する変異
抗体ベースのタンパク質は、ほとんどの場合、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。この場合、プロテインＡ樹脂は、ＦｃドメインのＣＨ２－ＣＨ３界面の結合部位で抗体を捕捉する。しかし、プロテインＡは、ＶＨ３ファミリーＦｖのＶＨドメインにも結合する。ほとんどの抗体ベースのプラットフォームでは、ＶＨドメインは一般に重鎖上にあるため、これは問題にならない。しかし、ＶＨ３を含むｓｃＦｖが軽鎖に結合すると、精製中にＶＨドメインがプロテインＡレジンに結合し、軽鎖の単量体と二量体が目的の重軽鎖ヘテロ四量体に混入する恐れがある。したがって、軽鎖に任意のＶＨ３ドメインを含む多重特異性抗体を作製する際の潜在的な障害は、プロテインＡ溶出における追加の夾雑物の存在である。これは、軽鎖が重鎖よりも効率的に発現する場合に特に問題となり、大量の軽鎖夾雑物が目的のタンパク質アセンブリとともに精製される。
抗体ベースのタンパク質は、ほとんどの場合、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。この場合、プロテインＡ樹脂は、ＦｃドメインのＣＨ２－ＣＨ３界面の結合部位で抗体を捕捉する。しかし、プロテインＡは、ＶＨ３ファミリーＦｖのＶＨドメインにも結合する。ほとんどの抗体ベースのプラットフォームでは、ＶＨドメインは一般に重鎖上にあるため、これは問題にならない。しかし、ＶＨ３を含むｓｃＦｖが軽鎖に結合すると、精製中にＶＨドメインがプロテインＡレジンに結合し、軽鎖の単量体と二量体が目的の重軽鎖ヘテロ四量体に混入する恐れがある。したがって、軽鎖に任意のＶＨ３ドメインを含む多重特異性抗体を作製する際の潜在的な障害は、プロテインＡ溶出における追加の夾雑物の存在である。これは、軽鎖が重鎖よりも効率的に発現する場合に特に問題となり、大量の軽鎖夾雑物が目的のタンパク質アセンブリとともに精製される。
【0120】
ＶＨ３ファミリーメンバーのプロテインＡ結合を合理的に妨害するために、結合界面を妨害する構造的アプローチを採用した。結晶構造１ＤＥＥ（Ｇｒａｉｌｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００．）は、ＶＨ３の残基Ｒ１９（Ｋａｂａｔナンバリング）がプロテインＡドメインＤの２つの側鎖と直接接触することを示した。特に、Ｑ３２及びＤ３６との接触を排除して、相互作用を大幅に弱めることができる。したがって、Ｒ１９は、側鎖が短いためにこれらの相互作用を形成しないセリンに変異した。さらに、Ｓ１９は他のＶＨファミリーメンバーに自然に存在し、他の置換よりも免疫原性が低い可能性があることを示唆している。
【0121】
ＧＮＣ軽鎖上のＶＨ３含有ｓｃＦｖのＶＨドメインのＦＲ１領域に変異Ｒ１９Ｓ（Ｋａｂａｔナンバリング）を組み込んだ。具体的には、ヘキサＧＮＣ抗体ＳＩ－５５－Ｈ１１は、Ｄ５の抗ＨＥＲ３ｓｃＦｖドメイン及びドメイン６の抗ＣＤ１９ｓｃＦｖをコードする軽鎖配列にＲ１９Ｓ変異を含んだ。目的残基はプロテインＡ結合界面にあるため、ＲからＳへの変異はプロテインＡとの相互作用を破壊する。軽鎖ｓｃＦｖにおけるプロテインＡ結合の除去により、精製中におけるプロテインＡへの軽鎖単量体及び二量体の結合が防止される。その結果、軽鎖夾雑物のないより均質な製品が得られる。軽鎖あたり最大２つのＶＨ３ｓｃＦｖを含むことができるヘキサＧＮＣの場合、この変異は、目的生成物の効率的な精製には特に重要である。
【0122】
実施例５：異なる結合ドメインの構造を有する多重特異性ＧＮＣ抗体の効力の比較
【0123】
多重特異性ＧＮＣタンパク質の一般的なスキーム（図１）では、多重特異性ＧＮＣ抗体の各結合ドメインは、可変配列に基づくＦａｂ、ｓｃＦｖ、又は非可変配列に基づくリガンド、受容体若しくは他の結合構造であり得る。各結合ドメインの構造的多様性が多重特異性ＧＮＣ抗体の全体的な機能にどのように影響するかを評価するために、ＴＤＣＣアッセイを実施して膵臓がん細胞（ＢｘＰＣ３）のＴ細胞媒介死滅を誘導した。表５に示されるように、３つのペンタＧＮＣ抗体（ＳＩ－１Ｐ１、ＳＩ－５５Ｐ９及びＳＩ－５５Ｐ１０）及び１つのヘキサＧＮＣ抗体（ＳＩ－５５Ｈ１１）を用いてＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＣＤ１９、ＣＤ３及び４－１ＢＢに対する結合特異性の変化を評価した。すべての被験物質は、位置Ｄ３にαＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖを含み、その位置又は構造に変化がなかった。ＥＧＦＲに対する結合特異性については、変化は位置（Ｄ１ｖｓＤ２）を含んだ。結合については、変化は、構造（ステープル化ｖｓ未ステープル化）及び位置（Ｄ１ｖｓＤ２）の両方を含んだ。４－１ＢＢに対する結合特異性については、変化は、構造及び結合メカニズムの両方を含んだ（４１ＢＢＬを介した可変配列に基づくｓｃＦｖと非可変配列に基づくリガンド－受容体相互作用、つまり４－１ＢＢリガンド三量体から４－１ＢＢ受容体への相互作用）。ＣＤ１９に対する結合特異性については、変化は、ヒト化可変配列に関連した。ＨＥＲ３に対する結合特異性については、ＨＥＲ３がＢＸＰＣ３細胞の表面上で検出されなかったので、この違いは、テトラＧＮＣ、ペンタＧＮＣ又はヘキサＧＮＣ抗体のいずれかとしてこのグループに約立った（表９参照）。
【0124】
ＴＤＣＣアッセイは、同じ条件（例えば、エフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）５：１）下で設定され、精製されたＴ細胞、標的細胞及び薬物希釈液を７２時間インキュベートした後、残りの腫瘍細胞を表す発光を読み取った。一部の実験は異なる日に行われたため、ＥＣ５０値は誤差範囲内で実験ごとに異なる場合があることに注意されたい。それにもかかわらず、これらのペンタＧＮＣ及びヘキサＧＮＣ抗体の効力は１ｐＭ未満で、１０倍の範囲内であり、構造上の変化は、ＢＸＰＣ３細胞を殺す効果よりも製造コストと実現可能性を大幅に改善する可能性があることを示している。この文脈において、結合特異性の組成は、依然として、特定の形態のがんを標的とする多重特異性ＧＮＣ抗体を作成するための決定要因である。
【0125】
実施例６：多重特異性ＧＮＣ抗体の部分１と部分２の組成
最大６つの結合特異性を備えた多重特異性ＧＮＣ抗体は、がん細胞を殺す能力が最も高い抗体療法に適用することができる。例えば、ＥＣ５０の値は、ｎＭからｐＭ又はｆＭのレベルまで低下することができる。成功した非常に有効な多重特異性ＧＮＣ抗体は、部分１と部分２の両方の抗原の組成に依存する。表４は、標的乳がん細胞としてＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を用いたＴＤＣＣアッセイによりテトラＧＮＣ抗体における４つの部分１結合特異性（即ち、αＣＤ３、αＰＤ－Ｌ１、α４－１ＢＢ及びＮＫＧ２Ｄ）の比較効力を確立した。３つの部分１結合ドメイン（即ち、それぞれＨＣのＤ１、Ｄ３及びＤ４としてのαＣＤ３、αＰＤ－Ｌ１及びα４－１ＢＢ）を含む対照抗体（ＳＩ－３８Ｅ７２）と比較して、４番目の部分１結合ドメインの追加により、非可変配列に基づくＮＫＧ２Ｄ二量体受容体は、構成に応じて効力を約１０倍から１３０倍改善した。しかし、抗ＴＡＡ部分を追加することにより、ペンタＧＮＣ抗体（ＳＩ－５５Ｈ１１）の効力は最大６００倍まで大幅に増加した。
最大６つの結合特異性を備えた多重特異性ＧＮＣ抗体は、がん細胞を殺す能力が最も高い抗体療法に適用することができる。例えば、ＥＣ５０の値は、ｎＭからｐＭ又はｆＭのレベルまで低下することができる。成功した非常に有効な多重特異性ＧＮＣ抗体は、部分１と部分２の両方の抗原の組成に依存する。表４は、標的乳がん細胞としてＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を用いたＴＤＣＣアッセイによりテトラＧＮＣ抗体における４つの部分１結合特異性（即ち、αＣＤ３、αＰＤ－Ｌ１、α４－１ＢＢ及びＮＫＧ２Ｄ）の比較効力を確立した。３つの部分１結合ドメイン（即ち、それぞれＨＣのＤ１、Ｄ３及びＤ４としてのαＣＤ３、αＰＤ－Ｌ１及びα４－１ＢＢ）を含む対照抗体（ＳＩ－３８Ｅ７２）と比較して、４番目の部分１結合ドメインの追加により、非可変配列に基づくＮＫＧ２Ｄ二量体受容体は、構成に応じて効力を約１０倍から１３０倍改善した。しかし、抗ＴＡＡ部分を追加することにより、ペンタＧＮＣ抗体（ＳＩ－５５Ｈ１１）の効力は最大６００倍まで大幅に増加した。
【0126】
３つの部分１結合ドメインと組み合わせた部分１結合特異性を評価するために、標的細胞として乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を用いてＴＤＣＣアッセイを実施した。すべての被験物質は、Ｄ１、Ｄ３、及びＤ４の位置にそれぞれαＣＤ３、αＰＤ－Ｌ１及びα－４－１ＢＢｓｃＦｖを含んだ。テトラＧＮＣ抗体（ＳＩ－３８Ｅ７２）（部分１結合ドメインがなく、Ｄ２にいかなる腫瘍抗原にも特異的でないα－ＦＩＴＣドメインを有する）は、対照として使用された。他のテトラＧＮＣ被験物質は、Ｄ２に様々な結合ドメインを有する（ＳＩ－５５Ｅ：αＥＧＦＲセツキシマブ；ＳＩ－５５Ｅ２：αＥＧＦＲパニツムマブ；ＳＩ－５０Ｅ１：αＨＥＲ２トラスツズマブ；及びＳＩ－５１Ｅ１：αメソテリンアマツキシマブ）、ペンタＧＮＣ抗体（ＳＩ－１Ｐ１）は、Ｄ２にαＥＧＦＲ セツキシマブ、Ｄ５にαＨＥＲ３ ＭＭ１１１ｓｃＦｖを有したＤ５。エフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）は５：１又は１０：１であり、精製されたＴ細胞、標的細胞、及び薬物希釈液を９６時間インキュベートした後、残りの腫瘍細胞を表す発光を読み取った。一部の実験は異なる日に行われたため、ＥＣ５０値は異なる場合があるが、誤差範囲内であることに注意されたい。それにもかかわらず、結果は、Ｄ２にαＴＡＡドメインを含むすべてのＧＮＣ抗体が、Ｄ２にαＦＩＴＣを含む対照よりも顕著に（２０～１００倍）強力なＴＤＣＣを誘導したことを示している（表６）。ペンタＧＮＣ抗体（ＳＩ－１Ｐ１）のＥＣ５０はテトラＧＮＣのＥＣ５０と同様であり、これは、ドメインを追加することにより、強力なＴＤＣＣを保持しながらＴＡＡ選択性を向上できることを示している。
【0127】
実施例７：３つの部分１結合を有するテトラＧＮＣ構成を用いたＴＡＡのスクリーニング
Ｄ１、Ｄ３及びＤ４に固定された３つの部分１結合ドメインの構成（表６）をバックボーンＨＣとして用いてＴＡＡの新規及び／又は有効な部分２結合ドメインを正確に特定することができる。異なる腫瘍抗原を標的とする多重特異性ＧＮＣ抗体がＴ細胞媒介性殺傷を誘導する能力を評価するために、子宮頸がん細胞株ＨｅＬａを標的細胞として用いたＴＤＣＣアッセイを行った。全ての被験物質は、それぞれＤ１、Ｄ３及びＤ４にαＣＤ３、αＰＤ－Ｌ１及びα４－１ＢＢｓｃＦｖを有し、テトラＧＮＣ抗体（ＳＩ－３８Ｅ７２）は、Ｄ２にいかなる腫瘍抗原にも特異的でないαＦＩＴＣドメインを有するため、対照として使用された。他のテトラＧＮＣ被験物質は、Ｄ２に様々な結合ドメインを有する（表７）。エフェクター細胞：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）は１０：１であり、精製されたＴ細胞、標的細胞及び薬物希釈液を９６時間インキュベートした後、残りの腫瘍細胞を表す発光を読み取った。一部の実験は異なる日に行われたため、ＥＣ５０値は異なる場合があるが、誤差範囲内であることに注意されたい。それにもかかわらず、同じ日の実験の結果は、２つの抗ＥＧＦＲテトラＧＮＣ抗体（ＳＩ－５５Ｅ１（Ｃｅｔ）及びＳＩ－５５Ｅ２（Ｐａｎ））が、それぞれ１３ｐＭ及び９ｐＭの効力でがん細胞の５０％以上を死滅させたことを示している（図５）。他の被験物質（ＳＩ－５１Ｅ１、ＳＩ－５２Ｅ１、ＳＩ－５０Ｅ２、ＳＩ－５４Ｅ１、ＳＩ－５５Ｅ３、ＳＩ－５６Ｅ１、ＳＩ－５７Ｅ１及びＳＩ－３８Ｅ１７）は、接種細胞を２０％未満死滅させ、弱い殺傷力を示した。したがって、それらのＥＣ５０値は、ＳＩ－５５Ｅ１及びＳＩ－５５Ｅ２のほどではなかった。ＳＩ－５５Ｅ３はＤ２又はニモツズマブから採取したＦａｂに抗ＥＧＦＲ結合ドメインを有し、そのＥＧＦＲに対する結合親和性がＳＩ－５５Ｅ１のパニツムマブ及びＳＩ－５５Ｅ２のセツキシマブよりも低い（出願人の出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５９２３０；その全体が本明細書に組み込まれる）。驚いたことに、ＳＩ－５５Ｅ３は弱い殺傷能力を示したものの１つであった。この発見は、結合特異性と親和性の両方が、多重特異性ＧＮＣ抗体媒介のＴＤＣＣにおいて役割を果たすことを示している。
Ｄ１、Ｄ３及びＤ４に固定された３つの部分１結合ドメインの構成（表６）をバックボーンＨＣとして用いてＴＡＡの新規及び／又は有効な部分２結合ドメインを正確に特定することができる。異なる腫瘍抗原を標的とする多重特異性ＧＮＣ抗体がＴ細胞媒介性殺傷を誘導する能力を評価するために、子宮頸がん細胞株ＨｅＬａを標的細胞として用いたＴＤＣＣアッセイを行った。全ての被験物質は、それぞれＤ１、Ｄ３及びＤ４にαＣＤ３、αＰＤ－Ｌ１及びα４－１ＢＢｓｃＦｖを有し、テトラＧＮＣ抗体（ＳＩ－３８Ｅ７２）は、Ｄ２にいかなる腫瘍抗原にも特異的でないαＦＩＴＣドメインを有するため、対照として使用された。他のテトラＧＮＣ被験物質は、Ｄ２に様々な結合ドメインを有する（表７）。エフェクター細胞：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）は１０：１であり、精製されたＴ細胞、標的細胞及び薬物希釈液を９６時間インキュベートした後、残りの腫瘍細胞を表す発光を読み取った。一部の実験は異なる日に行われたため、ＥＣ５０値は異なる場合があるが、誤差範囲内であることに注意されたい。それにもかかわらず、同じ日の実験の結果は、２つの抗ＥＧＦＲテトラＧＮＣ抗体（ＳＩ－５５Ｅ１（Ｃｅｔ）及びＳＩ－５５Ｅ２（Ｐａｎ））が、それぞれ１３ｐＭ及び９ｐＭの効力でがん細胞の５０％以上を死滅させたことを示している（図５）。他の被験物質（ＳＩ－５１Ｅ１、ＳＩ－５２Ｅ１、ＳＩ－５０Ｅ２、ＳＩ－５４Ｅ１、ＳＩ－５５Ｅ３、ＳＩ－５６Ｅ１、ＳＩ－５７Ｅ１及びＳＩ－３８Ｅ１７）は、接種細胞を２０％未満死滅させ、弱い殺傷力を示した。したがって、それらのＥＣ５０値は、ＳＩ－５５Ｅ１及びＳＩ－５５Ｅ２のほどではなかった。ＳＩ－５５Ｅ３はＤ２又はニモツズマブから採取したＦａｂに抗ＥＧＦＲ結合ドメインを有し、そのＥＧＦＲに対する結合親和性がＳＩ－５５Ｅ１のパニツムマブ及びＳＩ－５５Ｅ２のセツキシマブよりも低い（出願人の出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５９２３０；その全体が本明細書に組み込まれる）。驚いたことに、ＳＩ－５５Ｅ３は弱い殺傷能力を示したものの１つであった。この発見は、結合特異性と親和性の両方が、多重特異性ＧＮＣ抗体媒介のＴＤＣＣにおいて役割を果たすことを示している。
【0128】
実施例８：同じ多重特異性ＧＮＣ抗体の異なるがん細胞を死滅させる効力の比較
【0129】
同じ構成の部分１結合ドメインを有し、ＥＧＦＲを標的とするＳＩ－５５Ｅ１及びＳＩ－５５Ｅ２の比較効力をさらに特徴付けるために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株をＴＤＣＣアッセイに使用した。同日の実験では、ＥＧＦＲとＨＥＲ３の両方を標的とする２つの追加抗体を使用した。ＳＩ－１Ｐ２は、ＳＩ－５５Ｅ１及びＳＩ－５５Ｅ２と同じ構造の部分１結合ドメインに加えて、ＨＥＲ３に結合する追加の部分２ドメインを有するペンタＧＮＣ抗体であり、ＳＩ－１は、部分１結合ドメインの非存在下でＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の両方に対する二重特異性抗体である。このＴＤＣＣアッセイの材料及び方法は、実施例１に記載したものと同じであった。図６に示すように、ＳＩ－５５Ｅ１、ＳＩ－５５Ｅ２及びＳＩ－１Ｐ２は、重複する用量生存率曲線によって示される同等の効力を発揮し、それらのＥＣ５０値は１７～２９ｆＭの範囲であった（表６）。これに対し、ＳＩ－１は、同じ日の実験において、ｎＭ単位未満の用量で応答を示さなかった。この結果は、３つの部分１結合ドメイン（ＣＤ３、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢ）が多重特異性ＧＮＣ抗体の効力に大きく寄与するという概念を支持した。
【0130】
抗ＣＤ３などの部分１結合ドメインの追加効果を測定するために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を標的細胞として用いたＴＤＣＣアッセイにより２つのテトラＧＮＣ抗体（ＳＩ－５０Ｅ１及びＳＩ－５０Ｅ６）及び１つのｂｉＧＮＣ抗体（ＳＩ－５０Ｘ１）を分析した。３つの抗体はすべて、トラスツズマブ由来のＨＥＲ２に対して同じ結合特異性を有する（表６）。ＳＩ－５０Ｅ１とＳＩ－５０Ｅ６は、部分１及び部分２結合ドメインの構成が同じであるが、ＳＩ－５０Ｅ６のｓｃＦｖドメインは、安定性を高めるために追加のジスルフィド結合でエンジニアリング（つまり、ステープル化）されたのに対し、ＳＩ－５０Ｅ１のｓｃＦｖドメインは、ステープル化されなかった。ＳＩ－５０Ｘ１は、ＣＤ３及びＨＥＲ２を標的とする二重特異性抗体である。ＴＤＣＣ用量反応曲線は、３つのＧＮＣ抗体がすべて強力であり、それらのＥＣ５０値がｆＭの範囲であることを明確に示している（図７）。曲線及びＥＣ値の違いは、３つの抗体間でＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢに対する部分２結合ドメインが存在しないか存在するかによるものであった。
【0131】
実施例９：多重特異性ＧＮＣ抗体のためのＴＡＡの選択と部分２結合ドメインの組み立て
【0132】
抗体療法は、がん細胞を直接的又は間接的に殺すために様々な戦略を採用しており、どちらの作用機序も表面抗原への結合に依存している。一方、がん細胞は、進化することで抗体及び／又は免疫細胞によって認識されることを回避する能力を取得する。最大６つの結合特異性の能力を有する多重特異性ＧＮＣ抗体は、ｐＭ及びｆＭの範囲でインビトロＥＣ５０により測定されたところ、最大の効力を示した。非常に有効な多重特異性ＧＮＣ抗体は、部分１及び部分２抗原の両方の組成に依存する。ここで、構成（ＨＣのＤ１、Ｄ３及びＤ４のそれぞれ）にある３つの部分１結合ドメイン（ＣＤ３、ＰＤ－Ｌ１及び４－１ＢＢ）は、多重特異性ＧＮＣ抗体のバックボーンを提供する。このようにフォーマットされたＧＮＣ抗体により、標的がん細胞のＴＡＡの選択、スクリーニング及び最適化が可能になる（図８）。
【0133】
ＴＡＡ表面発現プロファイルの重要性を実証するために、定量的フローサイトメトリー（ｑＦＡＣＳ）を実行して、様々な腫瘍標的の細胞あたりの受容体のおおよその数を定量化した。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３は、ＥＧＦＲファミリーメンバーであり、その発現は通常固形腫瘍によってアップレギュレートされ、ＰＤ－Ｌ１は、ヒトがんの一部で利用される免疫チェックポイントシグナル伝達を阻害するための標的である。それにもかかわらず、ＨＥＲ３及びＰＤ－Ｌ１の表面発現は、それぞれＭＤＡ－ＭＢ－２３２細胞及びＨｅｌａ細胞では検出できなかった（表８）。この観察結果は、それぞれＥＧＦＲ又はＨＥＲ２を標的とするＳＩ－５５Ｅ１、ＳＩ－５５Ｅ２及びＳＩ－５０Ｅ１と比較して、ＳＩ－１Ｐ１によってＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の両方を標的とする場合、合成致死効果が欠如することの説明を提供することができる（表６）。とします。また、対照抗体（ＳＩ－３８Ｅ７２）によるＴＤＣＣの誘導の失敗は、Ｈｅｌａ細胞にＰＤ－Ｌ１が存在しないためである可能性が高いことも解釈することができる（表７）。がん細胞の進化及び動的な発現プロファイルに照らして、表９に示される様々な種類のがん細胞を用いて任意の候補抗体をＴＤＣＣについて試験することができる。
【0134】
ＴＡＡをスクリーニングするために、モジュラークローニングプラットフォームを用いて、多重特異性ＧＮＣ抗体の部分２結合ドメインを組み立てるためのＴＡＡ又はＴＡＡのエピトープを効率的に同定することができる。例えば、ＴＡＡ－ＦｃテトラＧＮＣ－１及びＴＡＡ－ＦｃテトラＧＮＣ－２は、ペアワイズの同じ結合特異性を有する２つのグループのテトラＧＮＣ抗体である唯一の違いは、すべてのＴＡＡ－ＦｃテトラＧＮＣ－２抗体がＨＣのステープル化ｓｃＦｖドメインＤ１、Ｄ３及びＤ４（ＶＨ４４→Ｃ及びＶＬ１００→Ｃの変異）を有することである。この場合、ＨＣを交換して２グループのテトラＧＮＣ抗体を生成した。他の実施例において、ＬＣを交換してＴＡＡへの結合ドメインが追加された多重特異性ＧＮＣ抗体を生成することができる（例えば、ＳＩ－５５Ｐ１０からＳＩ－５５Ｈ１１、及びＳＩ－５５Ｅ１からＳＩ－１Ｐ１）。このモジュラークローニングプラットフォームにより、単一の抗ＴＡＡモノクローナル抗体から始めて、最大３つのＴＡＡを含む多重特異性ＧＮＣ抗体を効率的に組み立てることができる。
【0135】
実施例１０：Ｄ２位置に受容体を有する多重特異性ＧＮＣタンパク質の機能
【0136】
各分子位置の多様な結合ドメインに対応するＧＮＣプラットフォームの柔軟性をさらに検証するために、Ｄ２位置にＮＫＧ２Ｄ受容体を有する１グループのタンパク質を産生した（表１０）。単量体ＮＫＧ２Ｄが両方のＧＮＣ鎖のＤ２位置に組み込まれると、ＮＫＧ２Ｄ単量体は、鎖間会合時に二量体化することが予測された。ＳＩ－４９Ｒ２１は、抗体ＶＨ／ＶＬドメインの代わりにＮＫＧ２Ｄ受容体を有する単一特異性ＧＮＣ（抗体様タンパク質）である。ＳＩ－４９Ｒ２２は、そのＦｃドメインもヘテロ二量体化のためのｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ変異（チェーンＡ：Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ；及びチェーンＢ：Ｔ３６６Ｗ）を含む以外、同じフォーマットを含む。ＳＩ－４９Ｒ２３は、抗体のＦｃドメインに直接融合したＮＫＧ２Ｄを有する単一特異性タンパク質であり、ＳＩ－４９Ｒ２４は、同じ構造を有するが、さらにＦｃにｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ変異を有する。ＳＩ－４９Ｒ１９は、Ｄ１に抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、Ｄ２にＮＫＧ２Ｄを有する二重特異性ＧＮＣであり、ＳＩ－４９Ｒ１８は、さらにＤ６に抗ＣＤ１９を有する三重特異性ＧＮＣである。ＳＩ－４９Ｅ１５は、Ｄ１に抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、Ｄ２にＮＫＧ２Ｄ、Ｄ３に抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、Ｄ４に抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖを有する。ＳＩ－４９Ｐ６は、ＳＩ－４９Ｅ１５と同じドメインを有するのに加え、さらにＤ６に抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを有する。ＳＩ－４９Ｐ７は、抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖの代わりにＤ４に４－１ＢＢリガンド三量体を含むことを除いて、ＳＩ－４９Ｐ６と同じ構造を有する。
【0137】
Ｄ２にＮＫＧ２Ｄを有するすべてのタンパク質を成功に発現及び精製した。Ｄ２位置にあるＮＫＧ２Ｄ受容体の機能を検証するために、オクテット結合を実行した。ＧＮＣタンパク質を５ｕｇ／ｍｌでＡＨＣセンサーにロードした後、ヒトＭＩＣＡ（Ａｃｒｏ、ＭＩＡ－Ｈ５２２１）の１：２連続希釈液（最高濃度１００ｎＭ）に結合させた。１：１結合モデルへのグローバルフィット（ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔ）から得られた結合親和性（ＫＤ値）を表１１に示す。Ｄ２にＮＫＧ２Ｄを有するモノ、バイ、トリ、テトラ及びペンタＧＮＣタンパク質は、２０ｎＭ未満のＫＤ値によって証明されるように、ＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣＡへの強い結合を保持することが示されている。
【0138】
実施例１１：ＧＮＣ位置、ヒト化又はドメインフォーマットに依存しない抗原結合
【0139】
ＧＮＣプラットフォームの適応性をさらに実証するために、同じ抗原（ＣＤ３ｘＥＧＦＲｘＰＤ－Ｌ１ｘ４－１ＢＢｘＣＤ１９ｘＨＥＲ３）を標的とする１グループの六重特異性ＧＮＣタンパク質を産生した。このグループの全体は、Ｄ３に抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖ、Ｄ４に抗４－１ＢＢｓｃＦｖ、Ｄ５に抗ＨＥＲ３ｓｃＦｖ及びＤ６に抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを含んだ。２つの分子（ＳＩ－７７Ｈ４及びＳＩ－７７Ｈ５）は、Ｄ１に抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、Ｄ２に抗ＥＧＦＲ Ｆａｂを含み、違いはＳＩ－７７Ｈ４の抗ＥＧＦＲドメインがヒト化されたのに対し、ＳＩ－７７Ｈ５の抗ＥＧＦＲドメインがマウス配列を保持していることである。２つの分子（ＳＩ－５５Ｈ１１及びＳＩ－５５Ｈ１２）は、Ｄ１に抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、Ｄ２に抗ＣＤ３ Ｆａｂを含み、違いは、Ｄ２ＶＨ／ＶＬがＳＩ－５５Ｈ１２ではなく、ＳＩ－５５Ｈ１１（ＶＨ－４４Ｃ、ＶＬ－１００Ｃ）にジスルフィドステープルを含むことである。従って、このグループは、Ｄ１／Ｄ２の配置がタンパク質発現特性又は標的腫瘍関連抗原への結合親和性のいずれかに影響を与えるか否かを明らかにすることができた。
【0140】
タンパク質は、実施例１に記載されるように、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現された。約８日後、ＯｃｔｅｔプラットフォームでプロテインＡセンサーを用いてＧＮＣ力価を測定した（表１２）。結果は、抗ＥＧＦＲ及び抗ＣＤ３ドメインの位置及びフォーマットに関係なく、六重特異性ＧＮＣタンパク質が良好に発現したことを示している（≧３０μｇ／ｍｌ）。最初のプロテインＡ精製ステップの後、すべてのタンパク質は、凝集レベルが同様に低く、目的タンパク質の割合は７２～８５％の範囲であった（表１２）。次に、ヒトＥＧＦＲに対する抗ＥＧＦＲドメインの親和性を、ＧＮＣタンパク質をＡＨＣセンサーにロードし、単一濃度（１００ｎＭ）のＨｉｓタグ付きヒトＥＧＦＲ（社内で発現）を分析物として使用することによって評価した。表１２に示すように、抗ＥＧＦＲ及び抗ＣＤ３ドメインの位置とフォーマットは、ＥＧＦＲ 結合親和性に顕著な影響を与えなかった（約２倍以内のＫＤ値）。したがって、ＧＮＣタンパク質は、Ｄ１とＤ２の間の抗ＴＡＡ及び抗ＣＤ３ドメインの位置に関係なく、完全な機能を保持している。
【0141】
【表1】
【0142】
【表2】
【0143】
【表3】
【0144】
【表4】
【0145】
【表5】
a284A10：出願人の出願PCT/US2018/039143を参照
bSI-huBU12：出願人の出願PCT/US2020/059230を参照
【0146】
【表6】
【0147】
【表7】
【0148】
【表8】
【0149】
【表9】
【0150】
【表10】
*SI-49R22は、knobs-into-holes変異を有するヘテロ二量体化Fcを含む(チェーンA:T366S/L368A/Y407V;チェーンB:T366W)。
**SI-49R23は、CH1/CLドメインを欠いている。
***SI-49R24は、knobs-into-holes変異(チェーンA:T366S/L368A/Y407V;チェーンB:T366W)を有するヘテロ二量体化Fcを含み、CH1/CLドメインを欠いている。
【0151】
【表11】
【0152】
【表12】
*SI-55H11 D2は、VHとVL(VH-44C、VL-100C)の間にジスルフィドステープルを含む。
【0153】
CDR's underlined in amino acid sequences
Chain A: HC or Chain 1
Chain B: LC or Chain 2
>SEQ ID 1 SI-49E1 chain A nt
TTTCTTAATTCCCTTTTCAACCAAGAGGTTCAGATCCCCTTGACTGAAAGCTATTGCGGCCCTTGTCCGAAAAACTGGATATGTTACAAGAATAATTGTTACCAATTCTTCGACGAAAGCAAGAACTGGTATGAGAGTCAGGCGTCTTGTATGAGTCAGAATGCCAGCCTGCTTAAGGTTTATTCAAAAGAAGACCAGGATCTGCTTAAGTTGGTAAAGAGCTACCACTGGATGGGGCTGGTACATATCCCAACGAATGGGTCATGGCAGTGGGAGGACGGTTCTATTCTGAGTCCAAATCTCCTGACGATCATCGAAATGCAGAAAGGGGACTGTGCCCTGTATGCATCATCCTTCAAGGGGTACATCGAGAACTGCAGTACCCCAAATACCTACATTTGTATGCAAAGAACGGTTGGAGGCGGTGGCTCAGGCGGAGGCGGCTCAGGAGGTGGCGGTTCAGGAGGCGGCGGATCTTTCCTAAACTCATTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGCTACCAATTTTTTGATGAGAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGATGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCCTCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACGTACATCTGCATGCAAAGGACTGTGGTCGACGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACGGTGGTTCTTCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGGTACGACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTGCTGCTGGTAGTGCTGGTATCACTTACGACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGATCGGCGTTTTCGTTCGACTACGCCATGGACCTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGATCTGGCGGAGGTGGTTCCGGCGGTGGCGGCTCCGGTGGAGGCGGCTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTTCCCACTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTTGGGGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGCTCCGGACGGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACTGCCTCTGGATTCACCATCAGTAGCTACCACATGCAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTACATCGGAACCATTAGTAGTGGTGGTAATGTATACTACGCAAGCTCCGCTAGAGGCAGATTCACCATCTCCAGACCCTCGTCCAAGAACACGGTGGATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACTCTGGTTATAGTGATCCTATGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGACGTTGTGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACCTGTCAGGCCAGTCAGAACATTAGGACTTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCAGCCAATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGCCTGGCGATGCTGCAACTTACTATTGTCAGTCTACCTATCTTGGTACTGATTATGTTGGCGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>SEQ ID 2 SI-49E1 chain A aa
FLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVVDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIAAGSAGITYDANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAFSFDYAMDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSWGNVDNVFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGRSLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISSYHMQWVRQAPGKGLEYIGTISSGGNVYYASSARGRFTISRPSSKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGYSDPMWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQNIRTYLSWYQQKPGKAPKLLIYAAANLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISDLEPGDAATYYCQSTYLGTDYVGGAFGGGTKVEIK
>SEQ ID 3 SI-49E1 chain B nt
GACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
>SEQ ID 4 SI-49E1 chain B aa
DVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>SEQ ID 5 SI-49E2 chain A nt
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>SEQ ID 6 SI-49E2 chain A aa
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> SEQ ID 8 SI-49E2 chain B aa
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>SEQ ID 10 SI-49E3 chain A aa
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>SEQ ID 12 SI-49E3 chain B aa
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>SEQ ID 13 SI-49E4 chain A nt
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>SEQ ID 16 SI-49E4 chain B aa
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>SEQ ID 17 SI-49E11 chain A nt
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>SEQ ID 25 SI-49E13 chain A nt
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>SEQ ID 27 SI-49E13 chain B nt
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>SEQ ID 28 SI-49E13 chain B aa DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSWGNVDNVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>SEQ ID 29 SI-49E14 chain A nt
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>SEQ ID 35 SI-1P1 chain B nt
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>SEQ ID 37 SI-1P2 chain A nt
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>SEQ ID 43 SI-1P4 chain B nt
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>SEQ ID 44 SI-1P4 chain B aa
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>SEQ ID 45 SI-39P1 chain A nt
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>SEQ ID 47 SI-39P1 chain B nt
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>SEQ ID 49 SI-38P5 chain A nt
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>SEQ ID 50 SI-38P5 chain A aa
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>SEQ ID 57 SI-49P1 chain A nt
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>SEQ ID 58 SI-49P1 chain A aa
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>SEQ ID 59 SI-49P1 chain B nt
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>SEQ ID 60 SI-49P1 chain B aa
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>SEQ ID 61 SI-49P2 chain A nt
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>SEQ ID 62 SI-49P2 chain A aa
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>SEQ ID 63 SI-49P2 chain B nt
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>SEQ ID 64 SI-49P2 chain B aa
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>SEQ ID 65 SI-49P3 chain A nt
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>SEQ ID 66 SI-49P3 chain A aa
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>SEQ ID 67 SI-49P3 chain B nt
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>SEQ ID 68 SI-49P3 chain B aa
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>SEQ ID 69 SI-49P4 chain A nt
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>SEQ ID 71 SI-49P4 chain B nt
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>SEQ ID 73 SI-49P5 chain A nt
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>SEQ ID 74 SI-49P5 chain A aa
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>SEQ ID 77 SI-49P6 chain A nt
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>SEQ ID 81 SI-49P7 chain A nt
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>SEQ ID 97 SI-38E17 chain A nt
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>SEQ ID 105 SI-55H11 chain A nt
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>SEQ ID 106 SI-55H11 chain A aa
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>SEQ ID 109 SI-50E1 chain A nt
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>SEQ ID 110 SI-50E1 chain A aa
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>SEQ ID 112 SI-50E1 and SI-50E6 chain B aa
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>SEQ ID 113 SI-50E6 chain A nt
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>SEQ ID 114 SI-50E6 chain A aa
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>SEQ ID 115 SI-50E2 chain A nt
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>SEQ ID 117 SI-50E2 and SI-50E7 chain B nt
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>SEQ ID 118 SI-50E2 and SI-50E7 chain B aa
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>SEQ ID 119 SI-50E7 chain A nt
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>SEQ ID 127 SI-52E1 chain A nt GACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACGGTGGTTCTTCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCGACAGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCAGAGGTCCAACTGCTGCAGTCTGGACCTGAGCTGGAGAAGCCTGGCGCTTCAGTGATGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTCCTCATTCACTGGCTACAACATGAACTGGGTGAGGCAGAACATTGGAAAGAGCCTTGAATGGATTGGAGCTATTGATCCTTACTATGGTGGAACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACATTGACTGTAGACAAATCGTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAAGAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGTAAGCGGAATGGAGTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGGTACGACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTGCTGCTGGTAGTGCTGGTATCACTTACGACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGATCGGCGTTTTCGTTCGACTACGCCATGGACCTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGATCTGGCGGAGGTGGTTCCGGCGGTGGCGGCTCCGGTGGAGGCGGCTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTTCCCACTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTTGGGGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGCTCCGGACGGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACTGCCTCTGGATTCACCATCAGTAGCTACCACATGCAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTACATCGGAACCATTAGTAGTGGTGGTAATGTATACTACGCAAGCTCCGCTAGAGGCAGATTCACCATCTCCAGACCCTCGTCCAAGAACACGGTGGATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACTCTGGTTATAGTGATCCTATGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGACGTTGTGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACCTGTCAGGCCAGTCAGAACATTAGGACTTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCAGCCAATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGCCTGGCGATGCTGCAACTTACTATTGTCAGTCTACCTATCTTGGTACTGATTATGTTGGCGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAATGA
>SEQ ID 128 SI-52E1 chain A aa
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>SEQ ID 129 SI-52E1 and SI-52E4 chain B nt
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>SEQ ID 130 SI-52E1 and SI-52E4 chain B aa
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>SEQ ID 131 SI-52E4 chain A nt
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>SEQ ID 132 SI-52E4 chain A aa
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>SEQ ID 133 SI-53E1 chain A nt
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>SEQ ID 134 SI-53E1 chain A aa
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>SEQ ID 135 SI-53E1 and SI-53E3 chain B nt
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
>SEQ ID 136 SI-53E1 and SI-53E3 chain B aa
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>SEQ ID 137 SI-53E3 chain A nt
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>SEQ ID 149 SI-55E8 chain A nt
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>SEQ ID 186 SI-49R19 chain B aa
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>SEQ ID 187 SI-49R18 chain A nt
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>SEQ ID 188 SI-49R18 chain A aa
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>SEQ ID 189 SI-49R18 chain B nt
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>SEQ ID 190 SI-49R18 chain B aa
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>SEQ ID 191 SI-49E15 chain A nt
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>SEQ ID 192 SI-49E15 chain A aa
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>SEQ ID 193 SI-49E15 chain B nt
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>SEQ ID 194 SI-49E15 chain B aa
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>SEQ ID 195 SI-49R21 chain A nt
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>SEQ ID 196 SI-49R21 chain A aa
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>SEQ ID 197 SI-49R21 chain B nt
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>SEQ ID 200 SI-49R22 chain A aa
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>SEQ ID 201 SI-49R22 chain B nt
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>SEQ ID 202 SI-49R22 chain B aa
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>SEQ ID 203 SI-49R22 chain C nt
TTTCTTAATTCCCTTTTCAACCAAGAGGTTCAGATCCCCTTGACTGAAAGCTATTGCGGCCCTTGTCCGAAAAACTGGATATGTTACAAGAATAATTGTTACCAATTCTTCGACGAAAGCAAGAACTGGTATGAGAGTCAGGCGTCTTGTATGAGTCAGAATGCCAGCCTGCTTAAGGTTTATTCAAAAGAAGACCAGGATCTGCTTAAGTTGGTAAAGAGCTACCACTGGATGGGGCTGGTACATATCCCAACGAATGGGTCATGGCAGTGGGAGGACGGTTCTATTCTGAGTCCAAATCTCCTGACGATCATCGAAATGCAGAAAGGGGACTGTGCCCTGTATGCATCATCCTTCAAGGGGTACATCGAGAACTGCAGTACCCCAAATACCTACATTTGTATGCAAAGAACGGTTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGTACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGCGCCGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
>SEQ ID 204 SI-49R22 chain C aa
FLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>SEQ ID 205 SI-49R23 chain A nt
TTTCTTAATTCCCTTTTCAACCAAGAGGTTCAGATCCCCTTGACTGAAAGCTATTGCGGCCCTTGTCCGAAAAACTGGATATGTTACAAGAATAATTGTTACCAATTCTTCGACGAAAGCAAGAACTGGTATGAGAGTCAGGCGTCTTGTATGAGTCAGAATGCCAGCCTGCTTAAGGTTTATTCAAAAGAAGACCAGGATCTGCTTAAGTTGGTAAAGAGCTACCACTGGATGGGGCTGGTACATATCCCAACGAATGGGTCATGGCAGTGGGAGGACGGTTCTATTCTGAGTCCAAATCTCCTGACGATCATCGAAATGCAGAAAGGGGACTGTGCCCTGTATGCATCATCCTTCAAGGGGTACATCGAGAACTGCAGTACCCCAAATACCTACATTTGTATGCAAAGAACGGTTGCTAGCGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
>SEQ ID 206 SI-49R23 chain A aa
FLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>SEQ ID 207 SI-49R24 chain A nt
TTTCTTAATTCCCTTTTCAACCAAGAGGTTCAGATCCCCTTGACTGAAAGCTATTGCGGCCCTTGTCCGAAAAACTGGATATGTTACAAGAATAATTGTTACCAATTCTTCGACGAAAGCAAGAACTGGTATGAGAGTCAGGCGTCTTGTATGAGTCAGAATGCCAGCCTGCTTAAGGTTTATTCAAAAGAAGACCAGGATCTGCTTAAGTTGGTAAAGAGCTACCACTGGATGGGGCTGGTACATATCCCAACGAATGGGTCATGGCAGTGGGAGGACGGTTCTATTCTGAGTCCAAATCTCCTGACGATCATCGAAATGCAGAAAGGGGACTGTGCCCTGTATGCATCATCCTTCAAGGGGTACATCGAGAACTGCAGTACCCCAAATACCTACATTTGTATGCAAAGAACGGTTGCTAGCGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
>SEQ ID 208 SI-49R24 chain A aa
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>SEQ ID 209 SI-49R24 chain B nt
TTTCTTAATTCCCTTTTCAACCAAGAGGTTCAGATCCCCTTGACTGAAAGCTATTGCGGCCCTTGTCCGAAAAACTGGATATGTTACAAGAATAATTGTTACCAATTCTTCGACGAAAGCAAGAACTGGTATGAGAGTCAGGCGTCTTGTATGAGTCAGAATGCCAGCCTGCTTAAGGTTTATTCAAAAGAAGACCAGGATCTGCTTAAGTTGGTAAAGAGCTACCACTGGATGGGGCTGGTACATATCCCAACGAATGGGTCATGGCAGTGGGAGGACGGTTCTATTCTGAGTCCAAATCTCCTGACGATCATCGAAATGCAGAAAGGGGACTGTGCCCTGTATGCATCATCCTTCAAGGGGTACATCGAGAACTGCAGTACCCCAAATACCTACATTTGTATGCAAAGAACGGTTGCTAGCGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTGTACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGCGCCGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
>SEQ ID 210 SI-49R24 chain B aa
FLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>SEQ ID 217 anti-claudin zolbetuximab VH nt
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAAATATTTATCCTTCTGATAGTTATACTAACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGATCGTGGAGGGGTAACTCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
>SEQ ID 218 anti-claudin zolbetuximab VH aa
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTRSWRGNSFDYWGQGTTLTVSS
>SEQ ID 219 anti-claudin zolbetuximab VL nt
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA
>SEQ ID 220 anti-claudin zolbetuximab VL aa
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIK
>SEQ ID 221 anti-HER2 trastuzumab VH nt
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
>SEQ ID 222 anti-HER2 trastuzumab VH aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
>SEQ ID 223 anti-HER2 trastuzumab VL nt
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGCTCCAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAA
>SEQ ID 224 anti-HER2 trastuzumab VL aa
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
>SEQ ID 225 anti-HER2 pertuzumab VH nt
GAAGTGCAGCTCGTCGAAAGCGGTGGCGGACTGGTTCAGCCCGGTGGTTCTCTGCGGCTGTCTTGTGCTGCCTCGGGTTTCACGTTCACTGACTACACAATGGACTGGGTGCGTCAGGCTCCTGGAAAGGGATTGGAGTGGGTAGCCGACGTTAATCCAAACTCCGGCGGGAGCATCTACAACCAGAGGTTCAAGGGGAGGTTCACTCTGAGCGTGGATCGCTCCAAGAACACGCTGTACCTCCAGATGAACTCTCTCAGGGCCGAGGACACGGCTGTTTACTATTGCGCGAGGAACCTGGGTCCTTCCTTCTACTTCGACTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTGACCGTCAGCTCC
>SEQ ID 226 anti-HER2 pertuzumab VH aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS
>SEQ ID 227 anti-HER2 pertuzumab VL nt
GACATCCAGATGACACAATCTCCTAGCAGTCTGAGCGCAAGTGTTGGAGATCGTGTCACCATCACATGCAAGGCCAGCCAGGATGTGAGCATTGGAGTCGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCAAGGCACCCAAGCTGCTGATCTACTCGGCCAGTTACAGATACACTGGCGTACCTTCGAGGTTTAGTGGTAGCGGTTCTGGAACCGATTTCACCCTCACCATTAGCTCCCTCCAACCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAATACTACATCTACCCTTACACGTTCGGCCAAGGCACTAAGGTCGAGATTAAA
>SEQ ID 228 anti-HER2 pertuzumab VL aa
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK
>SEQ ID 229 anti-mesothelin amatuximab VH nt
CAGGTACAACTGCAGCAGTCTGGGCCTGAGCTGGAGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACTTATTACTCCTTACAATGGTGCTTCTAGCTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGACCTCCTCAGTCTGACATCTGAAGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGGGGGGGTTACGACGGGAGGGGTTTTGACTACTGGGGATCTGGGACCCCGGTCACCGTCTCCTCA
>SEQ ID 230 anti-mesothelin amatuximab VH aa
QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSS
>SEQ ID 231 anti-mesothelin amatuximab VL nt
GACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAGGTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAAACTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCGTGGAGGCTGAAGATGATGCAACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAAGCACCCTCTCACGTTCGGATCCGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
>SEQ ID 232 anti-mesothelin amatuximab VL aa
DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIK
>SEQ ID 233 anti-GD2 dinutuximab VH nt
GAGGTCCAACTGCTGCAGTCTGGACCTGAGCTGGAGAAGCCTGGCGCTTCAGTGATGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTCCTCATTCACTGGCTACAACATGAACTGGGTGAGGCAGAACATTGGAAAGAGCCTTGAATGGATTGGAGCTATTGATCCTTACTATGGTGGAACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACATTGACTGTAGACAAATCGTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAAGAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGTAAGCGGAATGGAGTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
>SEQ ID 234 anti-GD2 dinutuximab VH aa
EVQLLQSGPELEKPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSS
>SEQ ID 235 anti-GD2 dinutuximab VL nt
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGATCTAGTCAGAGTCTTGTACACCGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATTCACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGTTCTCAAAGTACACATGTTCCTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
>SEQ ID 236 anti-GD2 dinutuximab VL aa
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK
>SEQ ID 237 anti-CD20 rituximab VH nt
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCCGGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTGAGCGCC
>SEQ ID 238 anti-CD20 rituximab VH aa
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA
>SEQ ID 239 anti-CD20 rituximab VL nt
CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCCGCCATCCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGGGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGTGCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
>SEQ ID 240 anti-CD20 rituximab VL aa
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
>SEQ ID 241 anti-EGFR cetuximab VH nt
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTACTATGATTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC
>SEQ ID 242 anti-EGFR cetuximab VH aa
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS
>SEQ ID 243 anti-EGFR cetuximab VL nt
GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGTCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTGGCACAAACATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATTCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAATAATAACTGGCCAACCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
>SEQ ID 244 anti-EGFR cetuximab VL aa
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK
>SEQ ID 245 anti-EGFR panitumumab VH nt
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTGATTACTACTGGACCTGGATCCGGCAGTCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACACATCTATTACAGTGGGAACACCAATTATAACCCCTCCCTCAAGAGCCGACTCACCATATCAATTGACACGTCCAAGACTCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCATTTATTACTGTGTGCGAGATCGAGTGACTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGC
>SEQ ID 246 anti-EGFR panitumumab VH aa
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSS
>SEQ ID 247 anti-EGFR panitumumab VL nt
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATCAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTTCTGTCAACACTTTGATCATCTCCCGCTCGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATTAAA
>SEQ ID 248 anti-EGFR panitumumab VL aa
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIK
>SEQ ID 249 anti-EGFR nimotuzumab VH nt
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTACATCTACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGGCATCAACCCCACCAGCGGCGGCAGCAACTTCAACGAGAAGTTCAAGACCCGGGTGACCATCACCGCCGACGAGAGCAGCACCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCTTCTACTTCTGCACCCGGCAGGGCCTGTGGTTCGACAGCGACGGCCGGGGCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC
>SEQ ID 250 anti-EGFR nimotuzumab VH aa
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSS
>SEQ ID 251 anti-EGFR nimotuzumab VL nt
GATATTCAAATGACTCAATCTCCTTCTTCTCTTTCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTTACTATTACTTGTCGTTCTTCTCAAAATATTGTTCATTCTAATGGTAATACTTATCTTGATTGGTATCAACAAACTCCTGGTAAAGCTCCTAAACTTCTTATTTATAAAGTTTCTAATCGTTTTTCTGGTGTTCCTTCTCGTTTTTCTGGTTCTGGTTCTGGTACTGATTTTACTTTTACTATTTCTTCTCTTCAACCTGAAGATATTGCTACTTATTATTGTTTTCAATATTCTCATGTTCCTTGGACTTTTGGTCAAGGTACTAAACTTCAAATTACT
>SEQ ID 252 anti-EGFR nimotuzumab VL aa
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQIT
>SEQ ID 253 anti-CD22 inotuzumab VH nt
GAGGTGCAATTGGTCCAGTCAGGAGCAGAGGTTAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTCAAAGTTTCGTGTAAGGCCAGCGGCTACAGGTTCACAAATTATTGGATTCATTGGGTCAGGCAGGCTCCGGGACAAGGCCTGGAATGGATCGGTGGCATTAATCCCGGGAATAACTACGCTACATATAGGAGAAAATTCCAGGGCAGAGTTACGATGACCGCGGACACCTCCACAAGCACTGTCTACATGGAGCTGTCATCTCTGAGATCCGAGGACACCGCAGTGTACTATTGTACTAGAGAAGGCTACGGTAATTACGGAGCCTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTAGTCACAGTCTCCTCA
>SEQ ID 254 anti-CD22 inotuzumab VH aa
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGGINPGNNYATYRRKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYGNYGAWFAYWGQGTLVTVSS
>SEQ ID 255 anti-CD22 inotuzumab VL nt
GACGTTCAAGTGACCCAGAGCCCATCCAGCCTGAGCGCATCTGTAGGAGACCGGGTCACCATCACTTGTAGATCCAGTCAGAGTCTTGCAAACAGTTATGGGAACACCTTTTTGTCTTGGTATCTGCACAAACCAGGTAAAGCCCCACAATTGCTCATCTACGGAATCTCTAACAGATTTAGTGGTGTACCAGACAGGTTCAGCGGTTCCGGAAGTGGTACTGATTTCACCCTCACGATCTCGTCTCTCCAGCCAGAAGATTTCGCCACTTATTACTGTTTACAAGGTACACATCAGCCGTACACATTCGGTCAGGGTACTAAAGTAGAAATCAAA
>SEQ ID 256 anti-CD22 inotuzumab VL aa
DVQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLANSYGNTFLSWYLHKPGKAPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIK
>SEQ ID 257 anti-CD30 brentuximab VH nt
CAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACTACTATATAACCTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAGCGGTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTTCATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCTGTCTATTTCTGTGCGAACTATGGTAACTACTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCAGGTCACTGTCTCTGCA
>SEQ ID 258 anti-CD30 brentuximab VH aa
QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA
>SEQ ID 259 anti-CD30 brentuximab VL nt
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTTTGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAAGTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
>SEQ ID 260 anti-CD30 brentuximab VL aa
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CAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCGCGATGGAAGTGCGAGTTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTGGGGTGGGCTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>SEQ ID 262 anti-HER3 MM-111 VH aa
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>SEQ ID 263 anti-HER3 MM-111 VL nt
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>SEQ ID 264 anti-HER3 MM-111 VL aa
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>SEQ ID 266 anti-EGFRvIII ABT-806 VH aa
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>SEQ ID 267 anti-EGFRvIII ABT-806 VL nt
GACATCCTGATGACCCAATCTCCATCCTCCATGTCTGTATCTCTGGGAGACACAGTCAGCATCACTTGCCATTCAAGTCAGGACATTAACAGTAATATAGGGTGGTTGCAGCAGAGACCAGGGAAATCATTTAAGGGCCTGATCTATCATGGAACCAACTTGGACGATGAAGTTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGAGCCGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTGTACAGTATGCTCAGTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
>SEQ ID 268 anti-EGFRvIII ABT-806 VL aa
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>SEQ ID 269 anti-CD19 21D4 VH nt
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>SEQ ID 271 anti-CD19 21D4 VL nt
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>SEQ ID 274 anti-CD33 gemtuzumab VH aa
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GATATACAACTTACGCAGTCTCCCTCCACTCTGTCAGCGTCCGTAGGGGACAGAGTAACGATAACATGCAGGGCCTCAGAAAGTCTTGACAACTACGGCATAAGGTTCCTCACATGGTTTCAACAGAAGCCGGGTAAAGCACCAAAACTCCTGATGTATGCTGCGTCTAACCAGGGGTCCGGTGTTCCTAGTCGGTTTTCAGGCAGCGGTAGCGGTACCGAGTTCACTCTCACAATTTCCAGTCTTCAGCCTGACGATTTCGCAACGTATTATTGCCAACAAACTAAGGAAGTGCCTTGGAGCTTTGGGCAAGGCACCAAGGTCGAGGTGAAG
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>SEQ ID 278 anti-CD3 284A10 VH aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVST
>SEQ ID 279 anti-CD3 284A10 VL nt
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>SEQ ID 280 anti-CD3 284A10 VL aa
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>SEQ ID 283 anti-PD-L1 PL221G5 VL nt
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>SEQ ID 284 anti-PD-L1 PL221G5 VL aa
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>SEQ ID 286 anti-4-1BB 466F6 VH aa
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>SEQ ID 287 anti-4-1BB 466F6 VL nt
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>SEQ ID 288 anti-4-1BB 466F6 VL aa
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>SEQ ID 290 anti-CD19 SI-BU12 VH aa
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>SEQ ID 291 anti-CD19 SI-BU12 VL nt
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>SEQ ID 292 anti-CD19 SI-BU12 VL aa
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>SEQ ID 293 NKG2D nt
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>SEQ ID 294 NKG2D aa
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>SEQ ID 295 4-1BB ligand nt
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>SEQ ID 296 4-1BB ligand aa
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>SEQ ID 301 SI-55P9 chain A nt
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>SEQ ID 302 SI-55P9 chain A aa
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>SEQ ID 303 SI-55P9 chain B nt
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>SEQ ID 304 SI-55P9 chain B aa
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>SEQ ID 305 SI-55P10 chain A nt
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>SEQ ID 306 SI-55P10 chain A aa
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>SEQ ID 307 SI-55P10 chain B nt
GAAAATGTATTGACACAGAGCCCCGCCTCCCTCAGTGCCTCACCTGGGGAAAGGGTAACTATCACTTGCTCTGCATCAAGCAGCGTCTCATACATGCATTGGTATCAACAAAAGCCTGGACAGGCCCCCAAGCTCTGGATATACGATACGAGCAAGCTGGCTTCCGGCGTACCTAGCCGCTTCAGTGGTTCCGGCTCAGGCAACGATCACACCCTTACGATTTCCAGTATGGAACCCGAAGATTTTGCAACTTATTATTGTTTCCAGGGGAGCGTGTACCCATTCACTTTCGGGCAGGGGACAAAAGTGACGGTACTGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCCGGCGGTGGCGGCTCCGGTGGAGGCGGCTCTCAGGTCACATTGAAGGAATCTGGCCCCGGCCTTGTTCAGCCAGGACAGACCCTTAGGCTCACCTGTGCCTTCAGTGGTTTTTCTCTTAGCACTAGCGGTATGGGGGTCGGCTGGATTCGGCAGCCTCCCGGCAAAGGTCTTGAGTGGTTGGCTCACATTTGGTGGGACGACGACAAACGGTATAATCCTGCCTTGAAAAGTCGGCTGACCATTAGTAAGGATACCTCAAAAAATCAAGTGTACTTGCAAATGAATAGCCTTGACGCCGAGGATACGGCTGTATATTATTGCGCGCGGATGGAACTCTGGTCTTACTACTTTGATTATTGGGGGCAGGGGACTCTCGTCACGGTCTCGAGCGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCAGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
>SEQ ID 308 SI-55P10 chain B aa
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>SEQ ID 309 NKG2D dimer nt
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>SEQ ID 310 NKG2D dimer aa
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>SEQ ID 311 anti-FITC 4-4-20 VH nt
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>SEQ ID 312 anti-FITC 4-4-20 VH aa
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>SEQ ID 313 anti-FITC 4-4-20 VL nt
GATGTCGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACGTTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGGTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
>SEQ ID 314 anti-FITC 4-4-20 VL aa
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK
>SEQ ID 315 anti-CD3 284A10 FR 1 VH nt
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>SEQ ID 316 anti-CD3 284A10 FR 1 VH aa
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>SEQ ID 317 anti-CD3 284A10 FR 1 VL nt
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>SEQ ID 318 anti-CD3 284A10 FR 1 VL aa
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGQGTKLTVL
>SEQ ID 319 anti-EGFR H7 VH nt
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>SEQ ID 320 anti-EGFR H7 VH aa
QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS
>SEQ ID 321 anti-EGFR H7 VL nt
GAAATCGTCCTTACACAATCTCCTAGCACACTGAGTGTGAGCCCCGGCGAACGCGCGACTTTCTCTTGCAGGGCAAGTCAATCCATAGGGACTAATATACATTGGTATCAACAAAAGCCAGGTAAACCACCCAGGCTTTTGATTAAGTATGCAAGTGAGTCTATTTCCGGTATCCCTGACCGCTTCTCTGGATCAGGCAGTGGCACAGAGTTCACACTCACCATATCTAGTGTGCAATCAGAGGACTTCGCCGTGTATTACTGCCAACAGAATAATAACTGGCCGACTACCTTCGGACCCGGTACAAAGCTGACCGTTTTA
>SEQ ID 322 anti-EGFR H7 VL aa
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>SEQ ID 323 SI-77H4 chain A nt
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>SEQ ID 333 SI-55H12 chain B nt
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】