知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタの特許一覧
特許7613750ドナーアポトーシス白血球が誘導する移植免疫寛容のバイオマーカー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-06
(45)【発行日】2025-01-15
(54)【発明の名称】ドナーアポトーシス白血球が誘導する移植免疫寛容のバイオマーカー
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/06 20060101AFI20250107BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20250107BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20250107BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/06
G01N33/48 M ZNA
C12N5/0783
【請求項の数】
31
(21)【出願番号】P 2021561700
(86)(22)【出願日】2020-04-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-27
(86)【国際出願番号】 US2020028575
(87)【国際公開番号】W WO2020214849
(87)【国際公開日】2020-10-22
【審査請求日】2023-04-14
(31)【優先権主張番号】62/834,798
(32)【優先日】2019-04-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】305023366
【氏名又は名称】リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】へリング， バーナード ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ラマチャンドラン， サバリナサン
(72)【発明者】
【氏名】シン， アマール
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】Transplantation，2017年，Vol.101, No.11，pp.2682-2690
【文献】Nature Medicine，2013年，Vol.19，pp.739-746
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＡＧＲＩＣＯＬＡ（ＳＴＮ）
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯ（ＳＴＮ）
ＦＳＴＡ（ＳＴＮ）
ＳＣＩＳＥＡＲＣＨ（ＳＴＮ）
ＴＯＸＣＥＮＴＥＲ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）細胞の出現率を、移植片レシピエント患者が一過性免疫療法に乗じて投与された１またはそれ以上のドナー抗原により誘導された移植免疫寛容を有するかどうかの指標とする方法であって、以下：（ａ）前記移植片レシピエント患者由来の第一血液試料をアッセイしてＴｒ１細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし前記第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得られている、ならびに
（ｂ）前記移植片レシピエント患者由来の第二血液試料をアッセイしてＴｒ１細胞の出現率を検出すること、ただし前記第二血液試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得られている、
を含み、
前記第二血液試料におけるＴｒ１細胞の出現率がＴｒ１細胞の前記ベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、前記移植片レシピエント患者は、前記１またはそれ以上のドナー抗原により誘導された移植免疫寛容を有するとして示され、
前記Ｔｒ１細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋を有し、
前記Ｔｒ１細胞の出現率は、血液試料中のＴｒ１細胞の割合であり、
前記１またはそれ以上のドナー抗原が、ドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）、ドナーペプチドを結合させたドナー特異的輸注（ＤＳＴ）ナノ粒子、ドナーペプチドを封入したＤＳＴナノ粒子、および／またはドナーペプチドを結合させたレシピエントアポトーシス白血球を含む、前記方法。
【請求項2】
制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）細胞の出現率を、移植片レシピエント患者が１またはそれ以上のドナー抗原により誘導された移植免疫寛容を有するかどうかの指標とする方法であって、以下：（ａ）移植片レシピエント患者から得られた第一血液試料をアッセイしてＴｒ１細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし前記第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得られている、
（ｂ）前記患者から得られた第二血液試料をアッセイしてＴｒ１細胞の出現率を検出すること、ただし前記第二血液試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得られている、
を含み、
前記第二血液試料におけるＴｒ１細胞の出現率が前記ベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、前記移植片レシピエント患者は、一過性免疫療法に乗じて注入された１またはそれ以上のドナー抗原により誘導された移植免疫寛容を有するとして示され、
前記Ｔｒ１細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋を有し、
前記Ｔｒ１細胞の出現率は、血液試料中のＴｒ１細胞の割合であり、
前記１またはそれ以上のドナー抗原が、ドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）を含む、前記方法。
【請求項3】
前記移植片レシピエント患者が前記１またはそれ以上のドナー抗原により誘導された移植免疫寛容を有するとして示された場合、前記移植片レシピエント患者は、免疫抑制剤の投与を止めることにより治療されると示される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記方法は、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する前記Ｔｒ１細胞の間接的特異性を決定することをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記方法は、前記Ｔｒ１細胞のトランスクリプトーム符号を同定することをさらに含み、前記トランスクリプトーム符号は抗原特異的シグナル伝達を示すマーカーを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号は、ＳＨ２Ｄ２ａである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記方法は、活性化状態を示す前記Ｔｒ１細胞のトランスクリプトーム符号を同定することをさらに含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
活性化状態を示す前記トランスクリプトーム符号は、ミトコンドリア呼吸関連転写物ＮＤＵＦＳ４である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
工程（ａ）における全ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ－３＋ＣＤ４＋（Ｔｒ１）細胞の前記出現率は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーで特定される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
工程（ａ）における全ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ－３＋ＣＤ４＋（Ｔｒ１）細胞の前記出現率は、ＣｙＴＯＦマスサイトメトリーで特定される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記移植片レシピエント患者は、移植の７日前に、ドナーアポトーシス白血球の静脈内注入を２回受けている、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記一過性免疫療法は、少なくとも１種の免疫抑制剤を含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記免疫抑制剤は、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及び炎症促進性サイトカインを標的とする併用抗炎症治療薬である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の前記阻害剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、Ｆｃ改変抗ＣＤ４０Ｌ抗体、Ｆａｂ’抗ＣＤ４０Ｌ抗体、またはＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激に干渉するペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の前記阻害剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ２Ｃ１０Ｒ４である、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項17】
前記一過性免疫療法は、抗炎症剤を含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記抗炎症剤は、αＩＬ－６Ｒ及び／またはｓＴＮＦＲである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記抗炎症剤は、αＩＬ－６Ｒであり、及び前記αＩＬ－６Ｒは、トシリズマブである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記抗炎症剤は、ｓＴＮＦＲであり、及び前記ｓＴＮＦＲは、エタネルセプトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記移植片レシピエント患者は、同種移植片を受けている、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記同種移植片は、固形臓器同種移植片である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記固形臓器同種移植片は、膵臓移植片、肝臓移植片、腸移植片、心臓移植片、腎臓移植片、肺移植片、または子宮移植片を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
記固形臓器同種移植片は、腎臓移植片である、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
前記腎臓移植片は、生体ドナー腎臓移植片である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記同種移植片は、組織同種移植片である、請求項２１に記載の方法。
【請求項27】
前記組織同種移植片は、脂肪組織、羊膜組織、絨毛組織、結合組織、硬膜、顔面組織、腸管組織、腺組織、肝臓組織、筋組織、神経組織、眼球組織、膵臓組織、心膜、骨格組織、皮膚組織、泌尿生殖器組織、または血管組織を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記同種移植片は、細胞移植片である、請求項２１に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞移植片は、膵島細胞、肝細胞、筋芽細胞、胚幹細胞由来分化細胞移植片、誘導型多能性幹細胞由来分化細胞移植片、または骨髄移植片を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記胚幹細胞由来分化細胞移植片は、膵島移植または膵島ベータ細胞移植片である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記誘導型多能性幹細胞由来分化細胞移植片は、膵島移植または膵島ベータ細胞移植片である、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１９年４月１６日に出願された米国仮出願第６２／８３４，７９８号の優先権を主張する。上記参照される出願の全内容は、そのまま全体が本明細書中参照として援用される。
本出願は、２０１９年４月１６日に出願された米国仮出願第６２／８３４，７９８号の優先権を主張する。上記参照される出願の全内容は、そのまま全体が本明細書中参照として援用される。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所より授与されたＡＩ１０２４６３の下、政府からの支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所より授与されたＡＩ１０２４６３の下、政府からの支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
末期臓器不全の多くの患者にとって、移植は、最も有効な治療選択肢となってきた。現行の免疫抑制レジメンは、急性拒絶を有効に防止するが、慢性拒絶については、それらレジメンの罹病率の高さ及び慢性拒絶防止に対する効果の欠如という深刻な問題が依然としてある。慢性的に免疫抑制された移植レシピエント数は増加し続けているが、これらレシピエントはこうした問題に苦しみ続けており、レシピエントの生存率にも悪影響が出ている。同種移植片に免疫寛容を誘導すれば、維持免疫療法の必要性がなくなり、長期同種移植片生着率が改善されると思われる。しかし、免疫寛容は、６５年よりも昔に小動物モデルで最初に実証され、その臨床的意義があるにもかかわらず、これが実現しているのは、混合増血キメラを通じたごくわずかな患者においてのみであり、この場合、広大な条件付け療法が必要とされる。同様に、サルでの翻訳モデルにおいて、混合キメラのみが、同一ドナー腎臓同種移植片に対してほぼ一貫して免疫慣用を誘導した。
【0004】
非ヒト霊長類研究では、ドナーアポトーシス白血球レジメンは、一貫して有効であり、集中短期免疫療法をほとんど必要としなかった。有効性及び非常に好ましい安全性プロファイルという理由から、このレジメンは、初めての臨床応用可能な非キメラ移植免疫寛容レジメンである。ヒトレシピエントにおける移植免疫寛容の誘導、維持、及び喪失をモニタリングするためのバイオマーカーが、必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、ヒトレシピエントにおいて固形臓器、組織、及び細胞同種移植片の免疫寛容の誘導、維持、及び喪失をモニタリングするためのバイオマーカーを特定する。
【0006】
ある特定の実施形態において、本発明は、一過性免疫療法に乗じて投与されたドナー抗原により誘導された移植免疫寛容を有する移植片レシピエント患者を特定する方法を提供し、本方法は、以下：（ａ）患者由来の第一血液試料をアッセイして標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、（ｂ）患者由来の第二血液試料をアッセイして標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、ならびに（ｃ）手技後出現率がベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、当該患者を、ドナー抗原により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、を含み、本方法において、標的細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である。ある特定の実施形態において、一過性免疫療法に乗じて投与されたドナー抗原により誘導された移植免疫寛容を有する移植片レシピエント患者は、移植免疫寛容が維持されている。ある特定の実施形態において、ドナー抗原は、ドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）、ドナーペプチドを結合させたもしくはドナーペプチドを封入したドナー特異的輸注（ＤＳＴ）ナノ粒子、及び／またはドナーペプチドを結合させたレシピエントアポトーシス白血球である。ある特定の実施形態において、標的細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）であり、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、及び活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。
【0007】
ある特定の実施形態において、移植片レシピエント患者は、移植免疫寛容が維持されている。ある特定の実施形態において、移植片レシピエント患者は、免疫寛容が誘導されたが失敗したことがある。ある特定の実施形態において、免疫寛容は、移植片レシピエント患者に誘導されていなかった。
【0008】
ある特定の実施形態において、本発明は、以下：（ａ）移植片レシピエント患者から第一血液試料を得て標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、（ｂ）患者から第二血液試料を得て標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、（ｃ）第一血液試料及び第二血液試料をアッセイして、免疫寛容化前後の標的細胞レベルを検出すること、（ｄ）手技後出現率がベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、当該移植片レシピエント患者を、一過性免疫療法に乗じて注入されたドナー抗原により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、を含む方法を提供し、本方法において、標的細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である。ある特定の実施形態において、ドナー抗原は、ドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）、ドナーペプチドを結合させたもしくはドナーペプチドを封入したドナー特異的輸注（ＤＳＴ）ナノ粒子、及び／またはドナーペプチドを結合させたレシピエントアポトーシス白血球である。ある特定の実施形態において、標的細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）であり、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、及び活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。
【0009】
ある特定の実施形態において、移植片レシピエント患者は、移植免疫寛容が維持されている。ある特定の実施形態において、移植片レシピエント患者は、免疫寛容が誘導されたが失敗したことがある。ある特定の実施形態において、免疫寛容は、移植片レシピエント患者に誘導されていなかった。
【0010】
ある特定の実施形態において、本発明は、一過性免疫療法に乗じたドナーアポトーシス白血球の移植時付近注入（すなわち、移植時点前後での注入であり、少なくとも１回の注入は、移植の数日前に行われる）により誘導された移植免疫寛容を有する移植片レシピエント患者を特定する方法を提供し、本方法は、以下：（ａ）患者由来の第一血液試料をアッセイして標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、（ｂ）患者由来の第二血液試料をアッセイして標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、ならびに（ｃ）手技後出現率がベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、当該患者を、ドナーアポトーシス白血球により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、を含み、本方法において、標的細胞は、ＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋細胞として定義される制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である。ある特定の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し（当該ＭＨＣクラスＩペプチドとともに添加されたレシピエント特異的ＭＨＣクラスＩＩ四量体を用いて検証される）、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、及び／または活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。ある特定の実施形態において、標的細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）であり、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、及び活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。ある特定の実施形態において、一過性免疫療法に乗じて投与されたドナー抗原により誘導された移植免疫寛容を有する移植片レシピエント患者は、移植免疫寛容が維持されている。
【0011】
本明細書中使用される場合、「一過性免疫療法に乗じて」という用語は、レシピエントが、免疫治療薬、例えば、細胞の中でも特に抗原提示細胞及びそれらによるドナー反応性Ｔ細胞の活性化、任意のＣＤ４０発現細胞、ならびに直接Ｔ細胞及びＢ細胞を標的とする免疫抑制薬などを、一過性で投与されることを意味する。本明細書中使用される場合、「一過性」は、治療効果が、短時間のみ、例えば、数日間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１日間）、または数週間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２週間）、または数ヶ月間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月間）持続することを意味する。本明細書中使用される場合、「免疫抑制」は、免疫応答の部分的または完全な抑制を意味し、この場合、身体の免疫系は、意図的に機能停止されているか、身体に免疫抑制薬を投与されていない場合よりも有効性が落とされている。ある特定の実施形態において、免疫療法は、抗炎症治療薬の一過性投与も含む。
【0012】
ある特定の実施形態において、本発明は、以下：（ａ）移植片レシピエント患者から第一血液試料を得て標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、（ｂ）患者から第二血液試料を得て標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、（ｃ）第一血液試料及び第二血液試料をアッセイして、免疫寛容化前後の標的細胞レベルを検出すること、（ｄ）手技後出現率がベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、当該移植片レシピエント患者を、ドナーアポトーシス白血球により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、を含む方法を提供し、本方法において、標的細胞は、ＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋細胞として定義される制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である。ある特定の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、及び／または活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。ある特定の実施形態において、標的細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）であり、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、ならびに活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。
【0013】
ある特定の実施形態において、本発明は、移植片レシピエントの治療方法を提供し、本方法は、以下を含む：（ａ）上記の方法を用いて、一過性免疫療法に乗じて注入されたドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有する移植片レシピエント患者を特定すること、及び（ｂ）免疫抑制剤の投与を止めることにより、移植片レシピエント患者を治療すること。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
一過性免疫療法に乗じて投与されたドナー抗原により誘導された移植免疫寛容を有する移植片レシピエント患者の特定方法であって、以下：
（ａ）前記患者由来の第一血液試料をアッセイして標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし前記第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、
（ｂ）前記患者由来の第二血液試料をアッセイして標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし前記第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、ならびに
（ｃ）前記手技後出現率が前記ベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、前記患者を、前記ドナー抗原により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、
を含み、
前記標的細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ ＋ 、ＬＡＧ－３ ＋ 、ＣＤ４ ＋ を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である、
前記方法。
（項目２）
以下：
（ａ）移植片レシピエント患者から第一血液試料を得て標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし前記第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、
（ｂ）前記患者から第二血液試料を得て標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし前記第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、
（ｃ）前記第一血液試料及び前記第二血液試料をアッセイして免疫寛容化前及び後の標的細胞のレベルを検出すること、
（ｄ）前記手技後出現率が前記ベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、前記移植片レシピエント患者を一過性免疫療法に乗じて注入されたドナー抗原により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、
を含む方法であって、
前記標的細胞は、ＣＤ４９ｂ ＋ 、ＬＡＧ－３ ＋ 、ＣＤ４ ＋ を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である、
前記方法。
（項目３）
前記ドナー抗原は、ドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）、ドナーペプチドを結合させたもしくはドナーペプチドを封入したドナー特異的輸注（ＤＳＴ）ナノ粒子、及び／またはドナーペプチドを結合させたレシピエントアポトーシス白血球である、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記移植片レシピエント患者は、移植免疫寛容が維持されている、項目１から３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記移植片レシピエント患者は、免疫寛容が誘導されたが、その後失敗した、項目１から３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
免疫寛容は、前記移植片レシピエント患者に誘導されていなかった、項目１から３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
移植片レシピエント患者の治療方法であって、以下：
（ａ）項目１から６のいずれか１項に記載の方法を用いることで、前記移植片レシピエント患者を特定すること、
（ｂ）免疫抑制剤の投与を止めることにより、前記移植片レシピエント患者を治療すること、
を含む、前記方法。
（項目８）
前記Ｔｒ１細胞は、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対して間接的特異性を呈する、項目１から７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記Ｔｒ１細胞は、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有する、項目１から８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号は、ＳＨ２Ｄ２ａである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記Ｔｒ１細胞は、活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する、項目１から１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
活性化状態を示す前記トランスクリプトーム符号は、ミトコンドリア呼吸関連転写物ＮＤＵＦＳ４である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記標的細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ ＋ 、ＬＡＧ－３ ＋ 、ＣＤ４ ＋ を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）であり、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、ならびに活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する、項目１から１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
工程（ａ）における全ＣＤ４ ＋ Ｔ細胞中のＣＤ４９ｂ ＋ ＬＡＧ－３ ＋ ＣＤ４ ＋ （Ｔｒ１）細胞の前記出現率は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーで特定される、項目１から１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
工程（ａ）における全ＣＤ４ ＋ Ｔ細胞中のＣＤ４９ｂ ＋ ＬＡＧ－３ ＋ ＣＤ４ ＋ （Ｔｒ１）細胞の前記出現率は、ＣｙＴＯＦマスサイトメトリーで特定される、項目１から１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
標的細胞の前記出現率の少なくとも２倍の上昇は、ドナーアポトーシス白血球の前記移植時付近注入により誘導された免疫寛容／免疫受入れを示す、項目１から１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記出現率の少なくとも少なくとも３倍の上昇は、ドナーアポトーシス白血球の前記移植時付近注入により誘導された免疫寛容／免疫受入れを示す、項目１から１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記出現率の少なくとも少なくとも５倍の上昇は、ドナーアポトーシス白血球の前記移植時付近注入により誘導された免疫寛容／免疫受入れを示す、項目１から１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記患者は、ドナーアポトーシス白血球の移植時付近、静脈内注入を２回受けている、項目１から１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記一過性免疫療法は、少なくとも１種の免疫抑制剤を含む、項目１から１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記免疫抑制剤は、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及び炎症促進性サイトカインを標的とする併用抗炎症治療薬である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の前記阻害剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、Ｆｃ改変（不能化、サイレント）抗ＣＤ４０Ｌ抗体、Ｆａｂ’抗ＣＤ４０Ｌ抗体、またはＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激に干渉するペプチドである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の前記阻害剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ２Ｃ１０Ｒ４である、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記一過性免疫療法は、抗炎症剤を含む、項目１から２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記抗炎症剤は、αＩＬ－６Ｒ及び／またはｓＴＮＦＲである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記抗炎症剤は、αＩＬ－６Ｒであり、及び前記αＩＬ－６Ｒは、トシリズマブである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記抗炎症剤は、ｓＴＮＦＲであり、及び前記ｓＴＮＦＲは、エタネルセプトである、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記移植片は、同種移植片である、項目１から２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記同種移植片は、固形臓器同種移植片である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記固形臓器同種移植片は、膵臓、肝臓、腸、心臓、腎臓、肺、または子宮移植片である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
記固形臓器同種移植片は、腎臓移植片である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記腎臓移植片は、生体ドナー腎臓移植片である、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記同種移植片は、組織同種移植片である、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記組織は、脂肪組織、羊膜組織、絨毛組織、結合組織、硬膜、顔面組織、腸管組織、腺組織、肝臓組織、筋組織、神経組織、眼球組織、膵臓組織、心膜、骨格組織、皮膚組織、泌尿生殖器組織、または血管組織である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記同種移植片は、細胞移植片である、項目２９に記載の方法。
（項目３７）
前記同種移植片は、膵島、肝細胞、筋芽細胞、胚幹細胞由来分化細胞移植片、または誘導型多能性幹細胞由来分化細胞移植片、または骨髄移植片である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記胚幹細胞由来分化細胞移植片は、膵島または膵島ベータ細胞移植片である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記誘導型多能性幹細胞由来分化細胞移植片は、膵島または膵島ベータ細胞移植片である、項目３７に記載の方法。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
一過性免疫療法に乗じて投与されたドナー抗原により誘導された移植免疫寛容を有する移植片レシピエント患者の特定方法であって、以下：
（ａ）前記患者由来の第一血液試料をアッセイして標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし前記第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、
（ｂ）前記患者由来の第二血液試料をアッセイして標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし前記第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、ならびに
（ｃ）前記手技後出現率が前記ベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、前記患者を、前記ドナー抗原により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、
を含み、
前記標的細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ ＋ 、ＬＡＧ－３ ＋ 、ＣＤ４ ＋ を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である、
前記方法。
（項目２）
以下：
（ａ）移植片レシピエント患者から第一血液試料を得て標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし前記第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、
（ｂ）前記患者から第二血液試料を得て標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし前記第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、
（ｃ）前記第一血液試料及び前記第二血液試料をアッセイして免疫寛容化前及び後の標的細胞のレベルを検出すること、
（ｄ）前記手技後出現率が前記ベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、前記移植片レシピエント患者を一過性免疫療法に乗じて注入されたドナー抗原により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、
を含む方法であって、
前記標的細胞は、ＣＤ４９ｂ ＋ 、ＬＡＧ－３ ＋ 、ＣＤ４ ＋ を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である、
前記方法。
（項目３）
前記ドナー抗原は、ドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）、ドナーペプチドを結合させたもしくはドナーペプチドを封入したドナー特異的輸注（ＤＳＴ）ナノ粒子、及び／またはドナーペプチドを結合させたレシピエントアポトーシス白血球である、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記移植片レシピエント患者は、移植免疫寛容が維持されている、項目１から３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記移植片レシピエント患者は、免疫寛容が誘導されたが、その後失敗した、項目１から３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
免疫寛容は、前記移植片レシピエント患者に誘導されていなかった、項目１から３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
移植片レシピエント患者の治療方法であって、以下：
（ａ）項目１から６のいずれか１項に記載の方法を用いることで、前記移植片レシピエント患者を特定すること、
（ｂ）免疫抑制剤の投与を止めることにより、前記移植片レシピエント患者を治療すること、
を含む、前記方法。
（項目８）
前記Ｔｒ１細胞は、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対して間接的特異性を呈する、項目１から７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記Ｔｒ１細胞は、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有する、項目１から８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号は、ＳＨ２Ｄ２ａである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記Ｔｒ１細胞は、活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する、項目１から１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
活性化状態を示す前記トランスクリプトーム符号は、ミトコンドリア呼吸関連転写物ＮＤＵＦＳ４である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記標的細胞は、マーカーＣＤ４９ｂ ＋ 、ＬＡＧ－３ ＋ 、ＣＤ４ ＋ を有する制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）であり、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、ならびに活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する、項目１から１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
工程（ａ）における全ＣＤ４ ＋ Ｔ細胞中のＣＤ４９ｂ ＋ ＬＡＧ－３ ＋ ＣＤ４ ＋ （Ｔｒ１）細胞の前記出現率は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーで特定される、項目１から１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
工程（ａ）における全ＣＤ４ ＋ Ｔ細胞中のＣＤ４９ｂ ＋ ＬＡＧ－３ ＋ ＣＤ４ ＋ （Ｔｒ１）細胞の前記出現率は、ＣｙＴＯＦマスサイトメトリーで特定される、項目１から１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
標的細胞の前記出現率の少なくとも２倍の上昇は、ドナーアポトーシス白血球の前記移植時付近注入により誘導された免疫寛容／免疫受入れを示す、項目１から１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記出現率の少なくとも少なくとも３倍の上昇は、ドナーアポトーシス白血球の前記移植時付近注入により誘導された免疫寛容／免疫受入れを示す、項目１から１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記出現率の少なくとも少なくとも５倍の上昇は、ドナーアポトーシス白血球の前記移植時付近注入により誘導された免疫寛容／免疫受入れを示す、項目１から１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記患者は、ドナーアポトーシス白血球の移植時付近、静脈内注入を２回受けている、項目１から１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記一過性免疫療法は、少なくとも１種の免疫抑制剤を含む、項目１から１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記免疫抑制剤は、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及び炎症促進性サイトカインを標的とする併用抗炎症治療薬である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の前記阻害剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、Ｆｃ改変（不能化、サイレント）抗ＣＤ４０Ｌ抗体、Ｆａｂ’抗ＣＤ４０Ｌ抗体、またはＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激に干渉するペプチドである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の前記阻害剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ２Ｃ１０Ｒ４である、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記一過性免疫療法は、抗炎症剤を含む、項目１から２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記抗炎症剤は、αＩＬ－６Ｒ及び／またはｓＴＮＦＲである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記抗炎症剤は、αＩＬ－６Ｒであり、及び前記αＩＬ－６Ｒは、トシリズマブである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記抗炎症剤は、ｓＴＮＦＲであり、及び前記ｓＴＮＦＲは、エタネルセプトである、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記移植片は、同種移植片である、項目１から２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記同種移植片は、固形臓器同種移植片である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記固形臓器同種移植片は、膵臓、肝臓、腸、心臓、腎臓、肺、または子宮移植片である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
記固形臓器同種移植片は、腎臓移植片である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記腎臓移植片は、生体ドナー腎臓移植片である、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記同種移植片は、組織同種移植片である、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記組織は、脂肪組織、羊膜組織、絨毛組織、結合組織、硬膜、顔面組織、腸管組織、腺組織、肝臓組織、筋組織、神経組織、眼球組織、膵臓組織、心膜、骨格組織、皮膚組織、泌尿生殖器組織、または血管組織である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記同種移植片は、細胞移植片である、項目２９に記載の方法。
（項目３７）
前記同種移植片は、膵島、肝細胞、筋芽細胞、胚幹細胞由来分化細胞移植片、または誘導型多能性幹細胞由来分化細胞移植片、または骨髄移植片である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記胚幹細胞由来分化細胞移植片は、膵島または膵島ベータ細胞移植片である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記誘導型多能性幹細胞由来分化細胞移植片は、膵島または膵島ベータ細胞移植片である、項目３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1A】Ｔｒ１細胞のフローゲーティング法。（ａ）Ｔｒ１細胞（ＣＤ３＋Ｔ細胞のＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－に対してＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ－３＋をゲートする）、ただしダブレット及び死細胞を除く。
【図1B】四量体染色のフローゲーティング法。フローゲーティング法は、四量体＋合計ＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒ１細胞、及びＴｒｅｇ細胞の列挙を示す。
【図1C】Ｔｒ１細胞の転写プロファイル。左側パネル：ＸＢＰ１、ＳＵＭＯ２、及びＳＨ２Ｄ２の転写レベルを、終了時に得られたＰＢＬ中の散布図として提示する。右側パネル：コホートＢ及びＣのレシピエントで終了時に得られたＰＢＬ中のＮＤＵＦＳ４及びＮＤＵＦＳ５の相対発現プロファイルを、散布図として提示する。
【図2】免疫寛容動物におけるＴｒ１細胞出現率の上昇。ＡＤＬ注入は、制御性表現型を持つ免疫細胞の出現率を上昇させ、機能を増強させる。コホートＢ（ｎ＝７、丸）及びコホートＣ（ｎ＝５、四角）のサルにおける制御性表現型を持つ循環細胞の相対数。終了時のＰＢＬ、ＬＭＮＣ、及びＬＮ中のＴｒ１細胞。
【図3】免疫寛容動物におけるＴｒ１細胞の枯渇は、ドナー特異的増殖を回復させる。移植の１２ヶ月後に収集されたコホートＣ（ｎ＝３）のＰＢＬ中のＴｒ１細胞、Ｔｒｅｇ細胞、及びＢｒｅｇ細胞の枯渇は、ＣＦＳＥ－ＭＬＲにおいて、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ２０＋細胞のドナー特異的増殖を回復させた。
【図4】Ｔｒ１細胞においてｓｉＲＮＡによりＳＨ２Ｄ２ａをサイレンシングすると、ドナー特異的増殖の抑制が消失する。Ｔｒ１細胞におけるＳＨ２Ｄ２のＲＮＡサイレンシングは、Ｔｒ１細胞の抑制能力を無力化する。ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ２０＋細胞で、それぞれ、Ｔｒ１細胞なし、Ｔｒ１細胞＋ビヒクルあり、及びＳＨ２Ｄ２転写分子を標的とするｓｉＲＮＡで処理したＴｒ１細胞ありの場合を、ドナー処理したレシピエントＰＢＬのみと比較した、ドナー特異的増殖の変化倍率。
【図5】四量体染色のフローゲーティング法。免疫寛容動物において四量体＋ドナー特異的Ｔｒ１細胞の出現率が上昇。コホートＢ、Ｃ、及びＤのサルの中でゲートされた四量体＋ＣＤ４＋ｌｙｍ内のＴｒｅｇ細胞（ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－）のパーセンテージ。
【図6】一過性免疫抑制に加えられたＡＤＬ注入は、サルにおいて、膵島同種移植片の安定寛容を促進する。（Ａ）コホートＢ及びＣのサルにおける、治療製品、投薬量、経路、及びタイムラインを含む免疫療法プロトコル。ｓＴＮＦＲは、可溶性腫瘍壊死因子受容体（エタネルセプト）；抗ＩＬ－６Ｒは、抗ＩＬ－６受容体（トシリズマブ）；ＩＥは、膵島等価物である。（Ｂ）組織学検査により裏付けられた無拒絶膵島同種移植片生着率のカプラン・マイヤー法による推定は、コホートＢ（ＡＤＬなし；ｎ＝７；破線；Ｐ＝０．０２１、Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）に比べてコホートＣ（ＡＤＬあり；ｎ＝５；実線）で優れた持続性同種移植片生着を示す。
【図7】免疫寛容バイオマーカーの不在は、ベースラインの移植前においてドナー抗原に感作されたレシピエントにおける移植された移植片機能の早期喪失と相関する。末梢循環中のＴｒ１細胞の出現率（ＡＤＬ＋ＴＩＳ前及び移植後）を、フローサイトメトリーで分析した。ドナー抗原に感作されたレシピエントにおける移植前のＡＤＬ注入及びＴＩＳは、移植後１４日目のＴｒ１細胞の出現率に、上昇ではなくて顕著な低下をもたらした。移植後２８日目、循環Ｔｒ１細胞の出現率は、同一レシピエントのナイーブ状態で観察されたレベルに到達した。これらレシピエントにおいて、移植前血清は、ベースラインでドナー抗原に感作されていることのエビデンスを示した。これらレシピエントにおけるＴｒ１細胞のモニタリングは、ミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対して間接的特異性があり高度に定義されたトランスクリプトームプロファイルを持つＴｒ１細胞を特異的にモニタリングしていなかった場合でさえ、ＡＤＬ注入及びＴＩＳがこれらレシピエントにおいてドナーアロ抗原に対する免疫寛容の誘導に失敗したことを強く示唆した。
【図8】免疫寛容バイオマーカーの喪失は、移植された移植片機能の喪失に先行する。末梢循環中のＴｒ１細胞の出現率（ＡＤＬ＋ＴＩＳ前及び移植後）を、フローサイトメトリーで分析した。ＡＤＬ注入及びＴＩＳは、移植後初期に、Ｔｒ１細胞の出現率の顕著な上昇をもたらした。循環Ｔｒ１細胞の出現率は、移植後１８０日目には、減少し始め、３００日目には、ナイーブ状態で観察されたレベルに到達した。このことは、免疫寛容バイオマーカーの喪失が、移植片機能の喪失に先行することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
ドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）を用いた負のワクチン投与は、移植においてドナー抗原特異的免疫寛容を誘導するための有望な非キメラ戦略となっている。化学架橋剤エチルカルボジイミド（ＥＣＤＩ）を用いてｅｘ ｖｉｖｏで処理された白血球は、静脈内注入後、急速にアポトーシスを進行させた。マウス同種移植モデルにおいて、－７日目及び＋１日目（０日目の移植を基準として）にＥＣＤＩ処理したドナーアポトーシス脾細胞を静脈内注入すると、堅固なアロ抗原特異的免疫寛容が、軽微な抗原ミスマッチの皮膚移植片に対して、完全主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ミスマッチ膵島同種移植片に対して、及び短期ラパマイシン併用の場合に心臓同種移植片に対して、誘導された。ドナーＥＣＤＩ処理脾細胞のほとんどは、脾辺縁帯抗原提示細胞（ＡＰＣ）により迅速に内部移行され、アポトーシス体の取り込み後のＡＰＣの成熟は停止されて、負の共刺激分子の選択的上方制御をもたらし、正の共刺激分子ではもたらさなかった。
【0016】
レシピエントＡＰＣとの遭遇後、間接的アロ特異性を持つＴ細胞は、急速にその数を増加させ、続いて重度のクローン収縮を起こした。残存するＴ細胞は、脾臓に隔離され、同種移植片または同種移植片排出リンパ節に輸送されなかった。宿主貪食細胞による内部移行を受けなかった残存ドナーＥＣＤＩ処理脾細胞は、直接アロ特異性を持つＴ細胞を弱く活性化し、それらを、その後の刺激（アネルギー）に対して抵抗性にした。ＥＣＤＩ処理脾細胞は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞及び骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）も活性化させ、それらの数を増加させた。したがって、マウス同種移植モデルにおいて、ＥＣＤＩ処理脾細胞を介したアロ抗原送達により誘導される移植片保護の機構には、直接特異性を持つ抗ドナーＣＤ４＋Ｔ細胞のクローンアネルギー、間接特異性を持つ抗ドナーＣＤ４＋Ｔ細胞のクローン枯渇、ならびにＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞及びＭＤＳＣによる調節が関与していた。
【0017】
自己免疫及びアレルギーのマスモデルにおいて、ＥＣＤＩと架橋した抗原を同系白血球の表面に静脈内送達すると、抗原特異的免疫寛容が回復した。重要なことは、この戦略は、ナイーブＴ細胞をプライミングすることならびに既存のメモリー／エフェクターＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の反応を有効に制御することの両方を阻止したことである。多発性硬化症患者を含む臨床試験により、自家白血球とＥＣＤＩのカップリング後に脳炎惹起性ペプチドを静脈内送達することの安全性が確認されるとともに、有効性の予備的エビデンスも得られた。
【0018】
本研究では、マウス同種移植におけるＥＣＤＩ処理したドナー脾細胞に対する知見を大幅に拡大して、一過性免疫抑制下で２回ＡＤＬ注入を投与したアカゲザル（サルと称する）における膵島同種移植片に対する安定免疫寛容を実証した。本発明者らは、本発明者らのモデルにおける持続した免疫寛容が、ドナー特異的Ｔ及びＢ細胞クローンの枯渇と関連したことを見出した。これは、１つのＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）アレルがマッチしたＡＤＬ及び同種移植片のレシピエントで最も顕著であり、強力かつ持続性の調節であった。抗原特異的Ｔｒ１細胞を含む複数の免疫細胞サブセットが、免疫調節に関与しており、ドナー反応性Ｔ細胞の移植後増殖及びそれらの同種移植片への動員を抑制していた。
【0019】
ＡＤＬが誘導する移植免疫寛容には、別個の特異性及びトランスクリプトーム符号を持つＴｒ１細胞を含む制御性免疫細胞サブセットが関与しており、これにより、一過性免疫抑制に乗じて静脈内に注入されるＡＤＬにより誘導される制御性免疫寛容の誘導、維持、及び喪失をモニタリングするためのバイオマーカーが特定される。ベースラインと手技後の血液試料の間で、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性ならびに抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号（例えば、ＳＨ２Ｄ２ａ）及び活性化状態と関連したミトコンドリア呼吸を示すトランスクリプトーム符号（例えば、ＮＤＵＦＳ４）を呈する、循環ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞）のうちＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ－３＋であるものの出現率に２倍を超える増加があれば、それは移植免疫寛容を示す。
【0020】
ある特定の実施形態において、本発明は、一過性免疫療法に乗じてドナーアポトーシス白血球を移植時付近注入することにより誘導された移植免疫寛容を有する移植片レシピエント患者を特定する方法を提供し、本方法は、以下：一過性免疫療法に乗じてドナーアポトーシス白血球を移植時付近注入することにより誘導された移植免疫寛容を有する移植片レシピエント患者を特定する方法、本方法は、以下：（ａ）患者由来の第一血液試料をアッセイして標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、（ｂ）患者由来の第二血液試料をアッセイして標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、ならびに（ｃ）手技後出現率がベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、当該患者を、ドナーアポトーシス白血球により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、を含み、本方法において、標的細胞は、ＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋細胞として定義される制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である。ある特定の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し（当該ＭＨＣクラスＩペプチドとともに添加されたレシピエント特異的ＭＨＣクラスＩＩ四量体を用いて検証される）、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、及び／または活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。
【0021】
ある特定の実施形態において、本発明は、以下：（ａ）患者から第一血液試料を得て標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、（ｂ）患者から第二血液試料を得て標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、（ｃ）第一血液試料及び第二血液試料をアッセイして、免疫寛容化前後の標的細胞レベルを検出すること、（ｄ）手技後出現率がベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、当該患者を、ドナーアポトーシス白血球により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、を含む方法を提供し、本方法において、標的細胞は、ＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋細胞として定義される制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である。ある特定の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、及び／または活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。
【0022】
ある特定の実施形態において、本発明は、移植片レシピエントの治療方法を提供し、本方法は、以下を含む：（ａ）本明細書中記載されるとおり移植片レシピエント患者を特定すること、及び（ｂ）免疫抑制剤の投与を止めることにより、移植片レシピエント患者を治療すること。
【0023】
移植片レシピエント患者が、移植片に対する免疫寛容を獲得し及びそれを維持しているかどうかを判定することは重要である。ある特定の実施形態において、患者が受ける移植片は、同種移植片になる。本明細書中使用される場合、「同種移植片」という用語は、同じ種であるが遺伝的に同一ではない（すなわち、別個の）ドナーからレシピエントへ移植される、細胞、組織、または臓器と定義される。移植片は、同種移植片、同種異系移植片、またはホモ移植片と呼ぶ場合がある。ある特定の実施形態において、同種移植片は、固形臓器同種移植片、例えば、腎臓、膵臓、肝臓、腸、心臓、肺、または子宮移植片である。ある特定の実施形態において、同種移植片は、組織同種移植片であり、そのような組織として、脂肪組織、羊膜組織、絨毛組織、結合組織、硬膜、顔面組織、腸管組織、腺組織、肝臓組織、筋組織、神経組織、眼球組織、膵臓組織、心膜、骨格組織、皮膚組織、泌尿生殖器組織、及び血管組織が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、同種移植片は、細胞同種移植片、例えば、膵島、肝細胞、筋芽細胞、胚幹細胞由来分化細胞移植片（例えば、膵島または膵島ベータ細胞または肝細胞移植）、あるいは誘導型多能性幹細胞由来分化細胞移植片（例えば、膵島または膵島ベータ細胞移植）、造血幹細胞移植片、あるいは骨髄移植片である。
【0024】
本明細書中使用される場合、「免疫受入れ」、「免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」、「免疫学的寛容」、または「免疫寛容（ｉｍｍｕｎｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」とは、所定の生物における、免疫応答を誘発する能力を有する物質または組織に対する、免疫系の無反応状態である。「移植免疫寛容」という用語は、免疫寛容の一つの形態である。「移植免疫寛容」は、維持免疫抑制療法の不在下での長期同種移植片生着である。この定義の暗黙の了解として、臓器移植の免疫寛容レシピエントは、ドナー抗原に対して無反応であるが、他の（第三者）抗原に対する反応性は維持している。免疫抑制を断ち切ることに成功しており、かつ安定した移植片機能を１年以上維持している臓器移植片レシピエントは、機能的または運用的に寛容性であると称する。
【0025】
免疫療法
ある特定の状況において、移植片レシピエント患者は、移植免疫寛容を誘導する目的で、移植片の前、移植片と同時に、または移植片に続いて、免疫療法を受けることになり、この場合、免疫療法は、ドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）の投与である。
ある特定の状況において、移植片レシピエント患者は、移植免疫寛容を誘導する目的で、移植片の前、移植片と同時に、または移植片に続いて、免疫療法を受けることになり、この場合、免疫療法は、ドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）の投与である。
【0026】
ある特定の実施形態において、患者は、移植片の前、移植片と同時に、または移植片に続いて、免疫療法を受ける。ある特定の実施形態において、ドナーアポトーシス白血球は、１種または複数の免疫調節性分子及び一過性抗炎症治療薬とともに、またはそれらに加えて投与することができ、免疫調節性分子は、例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ抗体、Ｆｃ改変抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激に干渉するペプチド、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス）であり、ならびに一過性抗炎症治療薬として、コンプスタチン（例えば、コンプスタチン誘導体ＡＰＬ－２）、サイトカインアンタゴニスト（例えば、抗ＩＬ－６受容体ｍＡｂ（トシリズマブ）、抗ＩＬ－６抗体（サリルマブ、オロキズマブ（ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ））、可溶性ＴＮＦ受容体（エタネルセプト）、抗ＴＮＦ－アルファ抗体（例えば、インフリキシマブ（レミケード）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ））、α１－抗トリプシン、核内因子－κＢ阻害剤（例えば、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、及び他のポリクローナルＴ細胞枯渇抗体、アレムツズマブ（キャンパス）、抗ＩＬ－２Ｒ Ａｂ（バシリキシマブ）、Ｂ細胞標的指向化戦略（例えば、Ｂ細胞枯渇バイオ製剤、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ１９、もしくはＣＤ２２を標的とするバイオ製剤、及び／またはＢ細胞調節バイオ製剤、例えば、ＢＬｙＳ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０、ＩｇＧ４、ＩＣＯＳ、ＩＬ－２１、Ｂ７ＲＰ１を標的とするバイオ製剤）、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸、スフィンゴシン－１リン酸受容体を下方制御するダウンレギュレーター（例えば、ＦＴＹ７２０）、ＪＡＫ阻害剤（例えば、トファシチニブ）、免疫グロブリン（例えば、ＩＶＩｇ）、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ（アバタセプト／オレンシア）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ、Ｎｕｌｏｊｉｘ）、タクロリムス（プログラフ）、シクロスポリンＡ、レフルノミド、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、及び抗ＣＤ１２２抗体、デオキシスパガリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒因子、補体阻害剤（例えば、Ｃ１阻害剤、コンプスタチン）、抗Ｃ５抗体（エクリズマブ／Ｓｏｌｉｒｉｓ）、メチルプレドニゾロン、アザチオプリンが挙げられる。Ｂ細胞を標的とするバイオ製剤の制限ではなく例として、リツキシマブ及び抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。
【0027】
ある特定の実施形態において、一過性免疫療法は、少なくとも１種の免疫抑制剤を含む。ある特定の実施形態において、免疫抑制剤は、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、及び炎症促進性サイトカインを標的とする併用抗炎症治療薬である。ある特定の実施形態において、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の阻害剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、Ｆｃ改変（不能化、サイレント）またはＦａｂ’抗ＣＤ４０Ｌ抗体、あるいはＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激に干渉するペプチドである。ある特定の実施形態において、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ共刺激の阻害剤は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ２Ｃ１０Ｒ４である。ある特定の実施形態において、少なくとも１種の免疫抑制剤は、ラパマイシンである。ある特定の実施形態において、一過性免疫療法は、抗炎症剤を含む。ある特定の実施形態において、抗炎症剤は、抗ＩＬ－６Ｒ（トシリズマブ）及び／またはｓＴＮＦＲ（エタネルセプト）である。
【0028】
ある特定の実施形態において、０日目の移植を基準に、－７日目及び＋１日目にドナーアポトーシス白血球を注入することにより免疫系の活性化及び抗ドナー免疫の誘導を防ぐため、レシピエントは、細胞の中でも特に、抗原提示細胞、及びそれらによるドナー反応性Ｔ細胞活性化、他のＣＤ４０発現細胞、またはＴ細胞及びＢ細胞を直接、標的とする薬物で一過性に免疫抑制された。ドナーアポトーシス白血球の調製及び投与の方法は、当該分野で既知である。Ｌｕｏ Ｘ， Ｐｏｔｈｏｖｅｎ ＫＬ， ＭｃＣａｒｔｈｙ Ｄ， ＤｅＧｕｔｅｓ Ｍ， Ｍａｒｔｉｎ Ａ， Ｇｅｔｔｓ ＤＲ， Ｘｉａ Ｇ， Ｈｅ Ｊ， Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ｋａｕｆｍａｎ ＤＢ， Ｍｉｌｌｅｒ ＳＤ， ＥＣＤＩ－ｆｉｘｅｄ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｄｏｎｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｆｏｒ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｖｉａ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００８ Ｓｅｐ ２３；１０５（３８）： １４５２７－３２； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． 米国特許第８，７３４，７８６号。各免疫抑制剤の初回用量は、０日目の移植を基準に、－８または－７日目に投与された。アンタゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ２Ｃ１０Ｒ４は、－８、－１、７、及び１４日目に、５０ｍｇ・ｋｇ－１でＩＶ投与された。ラパマイシン（ラパミューン（登録商標））は、－７日目から移植後２１日目までＰＯで投与された。目的トラフレベルは、５～１２ｎｇ・ｍＬ－１であった。併用抗炎症治療は、ｉ）αＩＬ－６Ｒ（トシリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））を－７、０、７、１４、及び２１日目に１０ｍｇ・ｋｇ－１でＩＶ投与、ならびにｉｉ）ｓＴＮＦＲ（エタネルセプト、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））を－７及び０日目に１ｍｇ・ｋｇ－１でＩＶ及び３、７、１０、１４、及び２１日目に０．５ｍｇ・ｋｇ－１でＳＣ投与、からなるものであった。
【0029】
ある特定の実施形態において、免疫抑制剤の初回用量は、移植の７～１４日（例えば、－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－１３、－１４日）前に、患者に投与される。ある特定の実施形態において、免疫抑制剤の２回目の用量は、移植の数日後（例えば、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８、＋１９＋、または＋２０日目）に、移植片レシピエント患者に投与される。ある特定の実施形態において、免疫抑制剤の複数回の用量は、数日～数ヶ月の治療期間のスパンで移植片レシピエントに投与される（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回用量）。
【0030】
治療は、選択した投与経路を通じて投与することができる。治療は、注入または注射により、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与することができる。
【0031】
標的細胞
本発明のある特定の実施形態において、第一（ベースライン）生体試料、例えば、血液試料は、免疫療法及び移植の前（「免疫寛容化前」）に、患者から採取される。ある特定の実施形態において、－７日目に、患者はドナーアポトーシス細胞の注入を受け、０日目に、移植片レシピエント患者は移植を受け、そして＋１日目に、移植片レシピエント患者はドナーアポトーシス細胞の２回目の注入を受ける。第二生体試料は、移植の後（「移植後」）に採取され、第三試料は、ドナーアポトーシス細胞の２回目の注入後に採取される。ある特定の実施形態において、第四生体試料が、細胞の１回目の注入及び移植の後に採取される。これらの試料から、非常に特異的な標的細胞が単離される、すなわち、ＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋細胞として定義される制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）として特定される細胞である。ある特定の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、及び／または活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。寛容原性Ｔｒ１細胞は、ドナーアポトーシス白血球の移植時付近注入により誘導される免疫寛容／免疫受入れの重要なメディエーターであると考えられるＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットである。
本発明のある特定の実施形態において、第一（ベースライン）生体試料、例えば、血液試料は、免疫療法及び移植の前（「免疫寛容化前」）に、患者から採取される。ある特定の実施形態において、－７日目に、患者はドナーアポトーシス細胞の注入を受け、０日目に、移植片レシピエント患者は移植を受け、そして＋１日目に、移植片レシピエント患者はドナーアポトーシス細胞の２回目の注入を受ける。第二生体試料は、移植の後（「移植後」）に採取され、第三試料は、ドナーアポトーシス細胞の２回目の注入後に採取される。ある特定の実施形態において、第四生体試料が、細胞の１回目の注入及び移植の後に採取される。これらの試料から、非常に特異的な標的細胞が単離される、すなわち、ＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋細胞として定義される制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）として特定される細胞である。ある特定の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、及び／または活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。寛容原性Ｔｒ１細胞は、ドナーアポトーシス白血球の移植時付近注入により誘導される免疫寛容／免疫受入れの重要なメディエーターであると考えられるＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットである。
【0032】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ四量体染色により、定義された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の特性分析、定量、及び選別が可能になる。ＭＨＣ四量体は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の特性分析に必須のツールである。比較的稀な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで四量体染色するプロトコルは、基礎免疫学及び臨床免疫学において、ヘルパーＴ細胞分析の重要なツールを提供してきた。（Ｕｃｈｔｅｎｈａｇｅｎ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＤ４＋ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｔｅｔｒａｍｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ７， １２６１４ （２０１６）； Ｄａｙ， Ｃ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｕｓｉｎｇ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１２， ８３１－８４２ （２００３）； Ｋｗｏｋ， Ｗ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４t Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２５， １４０７－１４０９．ｅ１４０１ （２０１０）； Ｍｏｏｎ， Ｊ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｖａｒｉｅｓ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２７， ２０３－２１３ （２００７））。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ四量体染色は、免疫学において貴重なアプローチとなっており、天然に発生するＴ細胞レパートリーの直接照合、ワクチン接種及び疾患などの摂動により引き起こされるＴ細胞応答の変化の評価を可能にするとともに、モデル系における所見の変換関連性を確認する手段を提供する。
【0033】
フローサイトメトリー及びゲーティングを用いて、ＣＤ４９ｂ＋及びＬＡＧ－３＋であるＣＤ４＋Ｔ細胞を特定することは、当該分野で既知である。ＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ－３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｒ１細胞と称する。ある特定の実施形態において、試料中のＴｒ１細胞の出現率は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーで特定される。間接的特異性を持つＴｒ１細胞のサブセットは、ミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドとともに添加されたＭＨＣクラスＩＩ四量体を用いて特定される。ある特定の実施形態において、この強力な四量体技術は、これらの稀なドナーペプチド特異的細胞サブセットを追跡する。ある特定の実施形態において、Ｔｒ１細胞の出現率は、ＣｙＴＯＦマスサイトメトリーで特定される。
【0034】
次に、特定の標的細胞、すなわち、ＣＤ４９ｂ＋及びＬＡＧ－３＋であるＣＤ４＋Ｔ細胞が分析されて、それらが少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有するかどうかが判定された。少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドが存在するかどうかのこの判定は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いてもたらされる。ある特定の実施形態において、ミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドは、ＡＰＶＡＬＲＮＬＲＧＹＹＮＱＳという、ＭＨＣクラスＩ分子の可変領域中の１４量体ペプチドである（２８－１１４アミノ酸）。ＮＣＢＩウェブサイトにおいて、Ｍａｍｕ ＤＲＢ配列とヒトゲノムでｔ－ＢＬＡＳＴ分析を行ったところ、ヒトホモログが特定された。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１３（受入番号ＣＤＰ３２９０５．１）は、９２％同一であり、Ｍａｍｕ ＤＲＢ０３ａに対してポジティブ９６％及びギャップ０％であり、ｅ値が６ｅ－１７８であった。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１４（受入番号ＡＢＮ５４６８３．１）は、９３％同一であり、Ｍａｍｕ ＤＲＢ０３ａに対してポジティブ９４％及びギャップ０％であり、ｅ値が２ｅ－１７５であった。
【0035】
Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ情報資源を利用して、Ｍａｍｕ ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ配列から、ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１３またはＨＬＡ ＤＲＢ１＊１４に対して高い結合親和性を持つペプチドを同定した（表１）。
【表1】
【0036】
特定の標的細胞を、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を特定するためにも分析した。本明細書中使用される場合、細胞の「トランスクリプトーム符号」とは、細胞集団におけるＲＮＡの発現レベルである。簡単に述べると、選別した標的細胞由来のＲＮＡを、報告された安定寛容を持つ移植片レシピエント由来の細胞で先に行われた不偏ＲＮＡｓｅｑ分析により選択及び定義されたプライマー及びプローブのセットを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲで分析する。本発明のある特定の実施形態において、定量的リアルタイムＰＣＲは、フロー選別されたＴｒ１細胞から得られたＲＮＡに対して行われた。ある特定の実施形態において、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号は、ＳＨ２ドメイン含有２Ａ（ＳＨ２Ｄ２ａ）である。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0037】
ある特定の実施形態において、トランスクリプトーム符号は、活性化状態を示す。ある特定の実施形態において、活性化状態を示すトランスクリプトーム符号は、ミトコンドリア呼吸関連転写物ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼサブユニットＳ４（ＮＤＵＦＳ４）である。
【0038】
移植片
ある特定の実施形態において、移植片は、同種移植片である。ある特定の実施形態において、同種移植片は、固形臓器同種移植片である。ある特定の実施形態において、同種移植片は、腎臓、膵臓、肝臓、腸、心臓、肺、または子宮移植などの固形臓器同種移植片である。ある特定の実施形態において、固形臓器同種移植片は、腎臓移植片である。ある特定の実施形態において、同種移植片は、組織同種移植片であり、そのような組織として、脂肪組織、羊膜組織、絨毛組織、結合組織、硬膜、顔面組織、腸管組織、腺組織、肝臓組織、筋組織、神経組織、眼球組織、膵臓組織、心膜、骨格組織、皮膚組織、泌尿生殖器組織、及び血管組織が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、同種移植片は、細胞同種移植片、例えば、膵島、肝細胞、筋芽細胞、胚幹細胞由来分化細胞移植片（例えば、膵島または膵島ベータ細胞または肝細胞移植）、あるいは誘導型多能性幹細胞由来分化細胞移植片（例えば、膵島または膵島ベータ細胞移植）、造血幹細胞移植片、あるいは骨髄移植片である。
ある特定の実施形態において、移植片は、同種移植片である。ある特定の実施形態において、同種移植片は、固形臓器同種移植片である。ある特定の実施形態において、同種移植片は、腎臓、膵臓、肝臓、腸、心臓、肺、または子宮移植などの固形臓器同種移植片である。ある特定の実施形態において、固形臓器同種移植片は、腎臓移植片である。ある特定の実施形態において、同種移植片は、組織同種移植片であり、そのような組織として、脂肪組織、羊膜組織、絨毛組織、結合組織、硬膜、顔面組織、腸管組織、腺組織、肝臓組織、筋組織、神経組織、眼球組織、膵臓組織、心膜、骨格組織、皮膚組織、泌尿生殖器組織、及び血管組織が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、同種移植片は、細胞同種移植片、例えば、膵島、肝細胞、筋芽細胞、胚幹細胞由来分化細胞移植片（例えば、膵島または膵島ベータ細胞または肝細胞移植）、あるいは誘導型多能性幹細胞由来分化細胞移植片（例えば、膵島または膵島ベータ細胞移植）、造血幹細胞移植片、あるいは骨髄移植片である。
【0039】
ある特定の実施形態において、移植片は、生体ドナー移植片である。ある特定の実施形態において、同種移植片は、細胞移植片である。
【0040】
アッセイ法
ある特定の実施形態において、本発明は、以下の工程、（ａ）患者由来の第一血液試料をアッセイして標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、（ｂ）患者由来の第二血液試料をアッセイして標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、ならびに（ｃ）手技後出現率がベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、当該患者を、ドナーアポトーシス白血球により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、を含み、本発明において、標的細胞は、ＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋細胞として定義される制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である。ある特定の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、及び／または活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。
ある特定の実施形態において、本発明は、以下の工程、（ａ）患者由来の第一血液試料をアッセイして標的細胞のベースライン出現率を検出すること、ただし第一血液試料は、免疫寛容化前、移植前、及び一過性免疫療法開始前に得る、（ｂ）患者由来の第二血液試料をアッセイして標的細胞の手技後出現率を検出すること、ただし第二試料は、免疫寛容化後、移植後、及び一過性免疫療法開始後に得る、ならびに（ｃ）手技後出現率がベースライン出現率より少なくとも２倍高い場合、当該患者を、ドナーアポトーシス白血球により誘導された移植免疫寛容／免疫受入れを有するとして特定すること、を含み、本発明において、標的細胞は、ＣＤ４９ｂ＋、ＬＡＧ－３＋、ＣＤ４＋細胞として定義される制御性Ｔ細胞１型（Ｔｒ１）である。ある特定の実施形態において、Ｔｒ１細胞は、少なくとも１種のミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドに対する間接的特異性を有し、抗原特異的シグナル伝達を示すトランスクリプトーム符号を有し、及び／または活性化状態を示すトランスクリプトーム符号を有する。
【0041】
ある特定の実施形態において、第一（ベースライン）試料中の標的細胞の出現率が、第二（手技後）試料及びその後の試料中の標的細胞の出現率と比較される。ある特定の実施形態において、出現率が少なくとも２倍上昇しているという判定は、ドナーアポトーシス白血球の移植時付近注入により誘導された免疫寛容／免疫受入れを示す。ある特定の実施形態において、出現率が少なくとも３倍上昇しているという判定は、ドナーアポトーシス白血球の移植時付近注入により誘導された免疫寛容／免疫受入れを示す。ある特定の実施形態において、第一資料と第二試料の間で出現率は、少なくとも２倍上昇、少なくとも３倍上昇、少なくとも４倍上昇、少なくとも５倍上昇、少なくとも１０倍上昇、少なくとも２０倍上昇、少なくとも３０倍上昇、少なくとも５０倍上昇、少なくとも６０倍上昇、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍上昇、少なくとも９０倍上昇、少なくとも１００倍、またはそれより高い倍率で上昇している。
【0042】
ある特定の実施形態において、標的細胞の出現率は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーで特定される。ある特定の実施形態において、標的細胞の出現率は、ＣｙＴＯＦマスサイトメトリーで特定される。
【0043】
ある特定の実施形態において、移植片レシピエント患者は、移植時付近、静脈内ドナーアポトーシス白血球の注入を２回受けている。
【0044】
ある特定の実施形態において、移植片レシピエント患者由来の末梢血単核球を、蛍光結合抗体及びマーカーの限定カクテル（抗ＣＤ４、抗ＣＤ４９ｂ、抗ＬＡＧ３、ミスマッチドナーＭＨＣクラスＩペプチドとともに添加したＭＨＣクラスＩＩ四量体）で染色して、マイクロ流体技術を用いた標識化細胞の選別を促進し、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて免疫寛容関連転写物を引き続き定量することで、標識化細胞を特性決定する。
【0045】
ミスマッチドナーペプチドに対する間接的特異性を持ち、抗原特異的ＴＣＲシグナル伝達を示す転写物（ＳＨ２Ｄ２ａ）及び代謝的活性状態を示す転写物（ＮＤＵＦＳ４））を発現する、そのように定義されたＣＤ４＋ＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ３＋Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞）のパーセンテージは、ベースラインでは極めて低い。当該循環Ｔ細胞サブセットのパーセンテージが２～３倍より高く上昇することは、抗原特異的免疫寛容状態の存在でしか説明することができない。
【0046】
本発明を、ここから、以下の制限をかけない実施例により解説する。
【実施例】
【0047】
実施例１
移植免疫寛容は、何十年もの間、臨床関連の目標として追及されてきた。本研究において、短期免疫療法下で移植時付近ＡＤＬ注入を２回行うレジメンは、１つのＭＨＣ－ＩＩ ＤＲＢアレルがマッチした非感作サル５匹中５匹において、膵島同種移植片に対する長期（≧１年）免疫寛容を、安全に誘導したことが実証された。これらの知見は、厳密な前臨床同種移植ＮＨＰモデルで得られたものであるが、他に類を見ないものであり、ヒトにおいて非キメラ移植免疫寛容に向かう臨床応用可能な道筋を初めて指し示すものである。
移植免疫寛容は、何十年もの間、臨床関連の目標として追及されてきた。本研究において、短期免疫療法下で移植時付近ＡＤＬ注入を２回行うレジメンは、１つのＭＨＣ－ＩＩ ＤＲＢアレルがマッチした非感作サル５匹中５匹において、膵島同種移植片に対する長期（≧１年）免疫寛容を、安全に誘導したことが実証された。これらの知見は、厳密な前臨床同種移植ＮＨＰモデルで得られたものであるが、他に類を見ないものであり、ヒトにおいて非キメラ移植免疫寛容に向かう臨床応用可能な道筋を初めて指し示すものである。
【0048】
先行ＮＨＰ研究から、ドナー骨髄が、ＣＤ１５４遮断を含む骨髄非破壊的前処置下で投与された場合、腎臓同種移植片では免疫寛容が報告されたが、心臓または膵島同種移植片では報告されなかった。こうした研究のうち１件においてそのように処置されたサル８匹のうち、６匹は、維持免疫抑制の不在下で１年間、腎臓同種移植片機能を維持した。そのうえ、これらのうち３匹は、慢性拒絶を発生させることなく、長期機能を維持した。別の研究では非キメラ戦略を用いて、腎臓同種移植片の免疫寛容が達成されたが、一貫性のないものにすぎず、抗ＣＤ４０Ｌを８週間及びラパマイシンを９０日間の投与と合わせてドナー特異的輸血を受けたサル５匹中３匹においてだった。同様なＮＨＰ戦略、ならびに他の以前に研究された戦略は、維持免疫抑制またはラパマイシン単独療法の中止後の膵島同種移植片生着を延長したが、本発明者らの研究とは異なり、それらプロトコルのどれも、持続性免疫寛容を誘導しなかった。現在研究されている他の細胞性免疫寛容戦略とは対照的に、本発明者らのレジメンは、制御性細胞の養子移植を必要としなかった。その代わりに、本発明者らは、短期免疫抑制下での移植時付近ＡＤＬ注入が、複数の制御性細胞型の関与する強力で持続する免疫調節をｉｎ－ｖｉｖｏで確立することを見出した。安全性に関して、本発明者らのレジメンは、混合キメラ戦略とは異なり、初期移植後直接経路活性化を制御するための、放射線照射、無差別な普遍化Ｔ細胞除去、造血幹細胞同時移植、あるいはカルシニューリン阻害剤または抗ＣＤ８枯渇抗体いずれかを用いる過程を必要とせずに、安定した免疫寛容を有効に誘導した。最後に、可溶性ペプチド及び改変ペプチドリガンド療法が関与する他の抗原特異的戦略とは異なり、本発明者らのＥＣＤＩ固定白血球注入は、本発明者らの前臨床試験において、または多発性硬化症の臨床試験において、アナフィラキシーのリスクまたは任意の他の安全性懸念と無関係であった。
【0049】
複数の別個の免疫機構が、本発明者らの一過性免疫抑制下での１つのＤＲＢがマッチしたＡＤＬの注入及び膵島同種移植片に対する免疫寛容と関連していた。本レジメンは、Ｋｉ６７＋増殖性細胞、ＭＬＲでのアロ反応性増殖、増殖性ＴＣＲβクローン、及び本発明者らの四量体試験におけるミスマッチＭＨＣクラスＩアロペプチドに対する間接的特異性を持つＣＤ４＋Ｔ細胞を追跡した本発明者らの観察によりコホートＡで裏付けられたとおり、２回の移植時付近ＡＤＬ注入後、早期にアロ反応性エフェクターＴ及びＢ細胞を枯渇させた。先行マウス研究では、ＡＤＬ注入後のＡＰＣによるアポトーシス体の取り込みが、陽性共刺激を下方制御しつつも、ＰＤ－Ｌ１／２発現を実質的に増加させたことが示された１２。そのようなパターンを呈するＡＰＣは、迅速に（しかし一過性に）ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１０を産生するＴ細胞を活性化させたが、ＩＬ－２、ＩＬ－６、及びＴＮＦ－αを産生するＴ細胞を活性化させなかった。これは、抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシス枯渇を促進することが知られているサイトカイン微小環境である。本発明者らの併用免疫療法の一部であるラパマイシンは、ＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ遮断下でドナー抗原により引き起こされる活性化誘導型細胞死を増強する。
【0050】
本研究では、ｉｎ－ｖｉｔｒｏで、循環ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＥＭ細胞の移植後増殖、それらの移植片への動員、ならびにドナー反応性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、これらの抑制が、コホートＣで記録された（が、コホートＢ及びＤでは記録されなかった）。これらの知見は、本発明者らのＡＤＬ注入及び１つのＤＲＢマッチが、免疫寛容の誘導及び維持に重要な役割を果たしていたことを示唆する。ｉｎ－ｖｉｔｒｏで本発明者らが観察した制御性サブセットの枯渇後ドナーに対するＴ細胞増殖の回復は、ドナー特異的Ｔ細胞クローンが、除去されたのでもアネルギー化されたのでもなく、そうではなくて、調節により、それらの移植後増殖及びエフェクター機能が制御されたことを示唆する。
【0051】
この解釈をさらに支持するため、本発明者らは、コホートＣにおいて短期免疫抑制にＡＤＬ注入を追加することで、循環ＭＤＳＣならびにＴｒ１、Ｔｒｅｇ、ＮＳ、Ｂｒｅｇ、及びＢ１０細胞の顕著なかつ持続した増加を特徴とする制御性ネットワークが確立されたことを示した。終了時、Ｔｒ１細胞は、コホートＣ（コホートＢと比較して）レシピエントの同種移植片を有する肝臓内及びリンパ節においても、顕著により普及していた。この制御性ネットワークの形成の根底にある詳細な機構は、また解明されていない。そうであっても、本発明者らの１つのＤＲＢがマッチしたＡＤＬの注入が、宿主脾臓辺縁帯ＡＰＣにおいて及び宿主肝臓類洞内皮細胞において、ＭＨＣ－ＩＩ分子による提示のための大量の共有ＭＨＣ－ＩＩペプチドを提供したと考えられる。活性化Ｔ細胞へのトロゴサイトーシス後、そのようなペプチドＭＨＣ－ＩＩ複合体は、自己認識するように歪んだＴＣＲレパートリーを有する胸腺由来Ｔｒｅｇ（ｔＴｒｅｇ）細胞に強力な活性化シグナルを送達する可能性があることが、知られている。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ－１０産生Ｔｒ１細胞の生成を促進することが知られている４６が、本発明者らの研究においてＴｒ１細胞の増殖が、活性化ｔＴｒｅｇの影響によるものであり、ｄｅ－ｎｏｖｏ形成及び／またはドナー反応性エフェクターＴ細胞の変換をもたらしたのであるかどうかは、まだ明らかではない。自己免疫モデルにおいて、自己ＭＨＣ－ＩＩと結合した自己免疫疾患関連ペプチドでコーティングしたナノ粒子により生成するＴｒ１様細胞は、同族Ｂ細胞が疾患抑制制御性Ｂ細胞へと分化するのを駆動することにより、制御性ネットワーク形成に寄与することが知られている。本発明者らの研究においてマッチしたＭＨＣ－ＩＩペプチドが制御性ネットワークを促進したという概念と一致して、１つのＤＲＢがマッチしたＡＤＬのコホートＣレシピエントにおける循環Ｔｒｅｇ、Ｔｒ１、及びＢｒｅｇ細胞の出現率は、完全ミスマッチコホートＤレシピエントにおける出現率よりも顕著に高かった。
【0052】
制御性サブセットの中で、Ｔｒ１細胞が、Ｔ及びＢ細胞のドナー特異的増殖の最も強力な抑制を呈し、これには、部分的に、ＩＬ－１０が介在したことがわかった。対照的に、第三者応答は、選別Ｔｒ１細胞による影響を受けなかった。このことは、それらの抗原特異性を示す。本発明者らの四量体研究は、コホートＣにおいて、ミスマッチドナーＭＨＣ－Ｉペプチドに対する間接的特異性を持つ循環Ｔｒｅｇ及びＴｒ１細胞が移植後持続的に増加することを明らかにした（しかし、コホートＢ及びＤではそうならなかった）。この知見は、それらの抗原特異性を実証し、マウス及びヒト同種移植片レシピエントの先行研究と一致していた。先行研究では、１つのＭＨＣ－ＩＩアレルがマッチした輸血後、共有された自己ＭＨＣ－ＩＩ分子によるミスマッチＭＨＣ－Ｉペプチド提示により誘導される調節が示された。ＡＤＬは、完全ミスマッチマウス同種移植片レシピエントにおいて制御性サブセットを増加させた６。これらのモデルにおけるＭＨＣ－ＩＩマッチングの効果は、これから研究しなければならない。コホートＣレシピエントにおいて、Ｔｒ１細胞は、ＳＨ２Ｄ２レベルの顕著な上昇を含む類を見ない免疫細胞シグナル伝達を呈した。Ｓｈ２Ｄ２ａの遺伝子産物であるＴ細胞特異的アダプタータンパク質（ＴＳＡｄ）は、それがＬｃｋ５１と相互作用することを通じて、ＴＣＲシグナル伝達を調節する。しかしながら、これが存在しないと、全身性自己免疫が促進される。コホートＣにおいて、Ｔｒ１細胞トランスクリプトームプロファイルは、Ｔｒ１細胞におけるミトコンドリア呼吸活性及びエネルギー利用の上昇も実証し、それらの活性化状態を明らかにした。
【0053】
コホートＢ（ＡＤＬ注入なし）において、レシピエント７匹中２匹が、免疫抑制なしの同種移植片生着を移植後１年間維持し、７匹全てが、急性拒絶を回避した。これにより、初期の直接経路活性化が、ＭＨＣ－ＩＩマッチしたレシピエントにおいて強力な誘導で抑制された場合、好適な同種移植片生着が達成可能であることが確認された。しかしながら、ほとんどのコホートＢレシピエントにおいてｄｅ－ｎｏｖｏのＤＳＡが発生したことにより裏付けられるとおり、このレジメンは、間接的経路活性化を制御することに失敗した。一過性免疫抑制下で１つのＤＲＢがマッチしたＡＤＬを注入することの寛容原性有効性は、感作されたコホートＥレシピエント、特に、予め形成されたＤＳＡを持つレシピエントに限定されており、これらのレシピエントでは、メモリーＴ細胞が、ＩＦＮ－γを分泌しないものも含めて、ＤＳＡ応答に必須であり、これらのレシピエントでは、ＤＳＡオプソニン化ＡＤＬの取り込みにより活性化されたＡＰＣが、ドナー反応性Ｔ細胞を、寛容化する代わりに刺激した可能性が高い。図７及び図８に提示するのは、ベースラインでドナー抗原に対し感作されていたコホートの一部である膵島移植片レシピエントのデータ（図７）ならびにＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ（ＤＲＢアレルも含む）においてドナーと完全ミスマッチであったレシピエントサルのデータ（図８）である。
【0054】
方法
試験動物
コホートには、インド産の目的に応じて繁殖されたサル（アカゲザル）のドナー及びレシピエントが含まれており、これらはＡｌｐｈａＧｅｎｅｓｉｓ、Ｉｎｃ、Ｙｅｍａｓｓｅｅ、ＳＣの国立衛生感染症コロニー研究所から入手した。探索群には、３匹のオスが含まれ、年齢７．３±０．１及び体重１２．５±１．５ｋｇであった。対照コホートには、８匹のオスが含まれ、年齢４．３±２．１及び体重６．２±１．６ｋｇであった。実験コホートには、７匹のオス及び１匹のメスが含まれ、年齢４．１±１．７及び体重５．２±１．２ｋｇであった。ドナーコホートには、１９匹のオスが含まれ、年齢６．７±３．３及び体重１１．７±３．６ｋｇであった。動物は、ヘルペスウイルス－１（Ｂウイルス）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、Ｄ型サルレトロウイルス（ＳＲＶ）、及びサルＴリンパ球向性ウイルス（ＳＴＬＶ－１）を持たなかった。適格性には、追加で、ＡＢＯ適合性、及び研究で定義されたＭＨＣマッチング（ＭＨＣ－Ｉ－異質及び１つのＭＨＣ－ＩＩ ＤＲＢアレルがマッチしたドナーレシピエント対）が含まれた。全ての動物に、４５４パイロシーケンス法（ウィスコンシン国立霊長類研究センターの遺伝学サービス部署）６０により高分解ＭＨＣ－Ｉ及び－ＩＩ遺伝子型決定を行った。動物は、自由に水を得ることができるようにし、体重（ＢＷ）に基づいてビスケット（Ｈａｒｌａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ２０５５Ｃ、Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を給餌した。動物の食事は、新鮮な果物、野菜、穀物、豆類、ナッツ、及びマルチビタミン製剤で、毎日充実させた。半年ごとに、獣医学的身体検査を全ての動物で行った。動物は、社会的に収容されており、感覚的関与を奨励し、採食行動を向上させ、新規探索、精神的刺激を促進し、探索、遊び、及び活動レベルを上昇させ、社会的行動を強化させるように計画された環境発展プログラムに参加しており、合わせて、種特異的行動に費やされる時間配分を増加させる機会が動物に提供された。サルは、医療行為に協力するように訓練されており、医療行為には、手からの給餌及び飲水、移送ケージ内への移動、ならびに検査、投薬、代謝試験、及び採血のための姿勢を取ることが含まれた。また、動物は、留置型の中央及び門脈内血管アクセス手段が装着されていた。ＳＴＺ（１００ｍｇ／ｋｇのＩＶ）で糖尿病を誘導し、基礎Ｃ－ペプチド＜０．３ｎｇ／ｍＬ及び静脈内グルコース負荷に対する陰性Ｃ－ペプチド反応により糖尿病であることを確認した６１。レシピエントサルのモニタリングには、研究スタッフによる毎日の臨床評価、獣医スタッフによる定期検査、ならびに毎週の血液及び化学検査室による試験が含まれた。この試験における全ての動物の世話及び処置は、ミネソタ大学動物実験委員会の承認を受けて行われたものであり、実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に準拠していた（実験動物資源局、国立学術会議、米国保健福祉省）。
試験動物
コホートには、インド産の目的に応じて繁殖されたサル（アカゲザル）のドナー及びレシピエントが含まれており、これらはＡｌｐｈａＧｅｎｅｓｉｓ、Ｉｎｃ、Ｙｅｍａｓｓｅｅ、ＳＣの国立衛生感染症コロニー研究所から入手した。探索群には、３匹のオスが含まれ、年齢７．３±０．１及び体重１２．５±１．５ｋｇであった。対照コホートには、８匹のオスが含まれ、年齢４．３±２．１及び体重６．２±１．６ｋｇであった。実験コホートには、７匹のオス及び１匹のメスが含まれ、年齢４．１±１．７及び体重５．２±１．２ｋｇであった。ドナーコホートには、１９匹のオスが含まれ、年齢６．７±３．３及び体重１１．７±３．６ｋｇであった。動物は、ヘルペスウイルス－１（Ｂウイルス）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、Ｄ型サルレトロウイルス（ＳＲＶ）、及びサルＴリンパ球向性ウイルス（ＳＴＬＶ－１）を持たなかった。適格性には、追加で、ＡＢＯ適合性、及び研究で定義されたＭＨＣマッチング（ＭＨＣ－Ｉ－異質及び１つのＭＨＣ－ＩＩ ＤＲＢアレルがマッチしたドナーレシピエント対）が含まれた。全ての動物に、４５４パイロシーケンス法（ウィスコンシン国立霊長類研究センターの遺伝学サービス部署）６０により高分解ＭＨＣ－Ｉ及び－ＩＩ遺伝子型決定を行った。動物は、自由に水を得ることができるようにし、体重（ＢＷ）に基づいてビスケット（Ｈａｒｌａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ２０５５Ｃ、Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を給餌した。動物の食事は、新鮮な果物、野菜、穀物、豆類、ナッツ、及びマルチビタミン製剤で、毎日充実させた。半年ごとに、獣医学的身体検査を全ての動物で行った。動物は、社会的に収容されており、感覚的関与を奨励し、採食行動を向上させ、新規探索、精神的刺激を促進し、探索、遊び、及び活動レベルを上昇させ、社会的行動を強化させるように計画された環境発展プログラムに参加しており、合わせて、種特異的行動に費やされる時間配分を増加させる機会が動物に提供された。サルは、医療行為に協力するように訓練されており、医療行為には、手からの給餌及び飲水、移送ケージ内への移動、ならびに検査、投薬、代謝試験、及び採血のための姿勢を取ることが含まれた。また、動物は、留置型の中央及び門脈内血管アクセス手段が装着されていた。ＳＴＺ（１００ｍｇ／ｋｇのＩＶ）で糖尿病を誘導し、基礎Ｃ－ペプチド＜０．３ｎｇ／ｍＬ及び静脈内グルコース負荷に対する陰性Ｃ－ペプチド反応により糖尿病であることを確認した６１。レシピエントサルのモニタリングには、研究スタッフによる毎日の臨床評価、獣医スタッフによる定期検査、ならびに毎週の血液及び化学検査室による試験が含まれた。この試験における全ての動物の世話及び処置は、ミネソタ大学動物実験委員会の承認を受けて行われたものであり、実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に準拠していた（実験動物資源局、国立学術会議、米国保健福祉省）。
【0055】
免疫細胞表現型のフローサイトメトリー分析
コホートＢ～Ｅのサルの、凍結保存された末梢血単核球（ＰＢＬ）試料、肝臓由来組織浸潤単核球（ＬＭＮＣ）試料、及びリンパ節（ＬＮ）試料で、多色フローサイトメトリー分析を行った。１×１０６の細胞を生死判別染色（Ａｑｕａ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色して、生細胞を細胞デブリから識別した。細胞を、抗体、蛍光－マイナス－ワン（ＦＭＯ）、及び／またはアイソタイプ対照を用いて、室温で２５分間染色し、続いて固定（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）し、洗った。制御性Ｔ細胞、ならびに増殖Ｔ及びＢ細胞、ならびに細胞内サイトカインを評価するため、ＰＢＬを、細胞外エピトープを認識する抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、及びＣＤ１２７）を用いて染色し、続いてＦｏｘＰ３固定／透過処理キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定／透過処理し、抗ＦｏｘＰ３、Ｋｉ６７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、及びＴＧＦ－β抗体を用いて染色した。３－レーザーＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＦＡＣＳＤＩＶＡ６．１．３を用いて、最小で２００，０００の事象が得られた。これらサブ集団それぞれの相対パーセンテージは、ＦｌｏｗＪｏ１０．１ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて特定した。
コホートＢ～Ｅのサルの、凍結保存された末梢血単核球（ＰＢＬ）試料、肝臓由来組織浸潤単核球（ＬＭＮＣ）試料、及びリンパ節（ＬＮ）試料で、多色フローサイトメトリー分析を行った。１×１０６の細胞を生死判別染色（Ａｑｕａ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色して、生細胞を細胞デブリから識別した。細胞を、抗体、蛍光－マイナス－ワン（ＦＭＯ）、及び／またはアイソタイプ対照を用いて、室温で２５分間染色し、続いて固定（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）し、洗った。制御性Ｔ細胞、ならびに増殖Ｔ及びＢ細胞、ならびに細胞内サイトカインを評価するため、ＰＢＬを、細胞外エピトープを認識する抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、及びＣＤ１２７）を用いて染色し、続いてＦｏｘＰ３固定／透過処理キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定／透過処理し、抗ＦｏｘＰ３、Ｋｉ６７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、及びＴＧＦ－β抗体を用いて染色した。３－レーザーＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＦＡＣＳＤＩＶＡ６．１．３を用いて、最小で２００，０００の事象が得られた。これらサブ集団それぞれの相対パーセンテージは、ＦｌｏｗＪｏ１０．１ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて特定した。
【0056】
ゲーティング法
最初に、細胞をＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａでゲートし、次いでＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａでゲートして、ダブレットを識別した。図１Ａ－１Ｃ、図２。次いで、十分に特性決定されたＳＳＣ－Ａ及びＦＳＣ－Ａ特性に基づいて、リンパ球をゲートした。死細胞は、生死判別染色に基づいて除外した。以下の表現型特性を用いて、免疫細胞集団を定義した：Ｔ細胞：ＣＤ３＋リンパ球；ＣＤ４＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋／ＣＤ３＋／ＣＤ８－；ＣＤ８＋Ｔ細胞：ＣＤ８＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４－；ＣＤ４またはＣＤ８ＴＥＭ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞内でＣＤ２ｈｉ／ＣＤ２８－であるものとして特定した。ＰＤ－１、Ｔｂｅｔ、ＣＤ４０、及びＫｉ６７の発現は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方及びＣＤ２０＋Ｂ細胞で特定した。ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ－５）発現をＣＤ４Ｔ細胞で検査して、Ｔｆｈ細胞：ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を数え上げた。制御性Ｔ細胞は、Ｔｒ１細胞：ゲートされたＣＤ４ｖＣＤ４５ＲＡ－リンパ球のうちＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ－３＋であるもの、Ｔｒｅｇ細胞：ゲートされたＣＤ４＋ＣＤ２５＋リンパ球のうちＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋であるもの、ナチュラルサプレッサー（ＮＳ）細胞：ゲートされたＣＤ８リンパ球のうちＣＤ８＋ＣＤ１２２＋であるものとして定義し、ならびにＢｒｅｇ細胞に関しては：制御性Ｂ細胞（ＣＤ２４ｈｉＣＤ３８ｈｉ）、Ｂ１０細胞：ＣＤ３－ＣＤ１９＋／ＣＤ２０＋リンパ球内で、ＣＤ２４、ＣＤ２７、及びＣＤ３８抗原の発現に基づき（ＣＤ２４ｈｉＣＤ２７＋）として定義した。ゲートされたＬｉｎ－（ＣＤ３－ＣＤ２０－）ＨＬＡ－ＤＲ－ＣＤ１４＋細胞を分析して、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）：ＣＤ１４＋Ｌｉｎ－ＨＬＡ－ＤＲ－細胞のうちＣＤ１１ｂｈｉＣＤ３３ｈｉであるもの、を数え上げた。
最初に、細胞をＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａでゲートし、次いでＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａでゲートして、ダブレットを識別した。図１Ａ－１Ｃ、図２。次いで、十分に特性決定されたＳＳＣ－Ａ及びＦＳＣ－Ａ特性に基づいて、リンパ球をゲートした。死細胞は、生死判別染色に基づいて除外した。以下の表現型特性を用いて、免疫細胞集団を定義した：Ｔ細胞：ＣＤ３＋リンパ球；ＣＤ４＋Ｔ細胞：ＣＤ４＋／ＣＤ３＋／ＣＤ８－；ＣＤ８＋Ｔ細胞：ＣＤ８＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４－；ＣＤ４またはＣＤ８ＴＥＭ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞内でＣＤ２ｈｉ／ＣＤ２８－であるものとして特定した。ＰＤ－１、Ｔｂｅｔ、ＣＤ４０、及びＫｉ６７の発現は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方及びＣＤ２０＋Ｂ細胞で特定した。ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ－５）発現をＣＤ４Ｔ細胞で検査して、Ｔｆｈ細胞：ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を数え上げた。制御性Ｔ細胞は、Ｔｒ１細胞：ゲートされたＣＤ４ｖＣＤ４５ＲＡ－リンパ球のうちＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ－３＋であるもの、Ｔｒｅｇ細胞：ゲートされたＣＤ４＋ＣＤ２５＋リンパ球のうちＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋であるもの、ナチュラルサプレッサー（ＮＳ）細胞：ゲートされたＣＤ８リンパ球のうちＣＤ８＋ＣＤ１２２＋であるものとして定義し、ならびにＢｒｅｇ細胞に関しては：制御性Ｂ細胞（ＣＤ２４ｈｉＣＤ３８ｈｉ）、Ｂ１０細胞：ＣＤ３－ＣＤ１９＋／ＣＤ２０＋リンパ球内で、ＣＤ２４、ＣＤ２７、及びＣＤ３８抗原の発現に基づき（ＣＤ２４ｈｉＣＤ２７＋）として定義した。ゲートされたＬｉｎ－（ＣＤ３－ＣＤ２０－）ＨＬＡ－ＤＲ－ＣＤ１４＋細胞を分析して、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）：ＣＤ１４＋Ｌｉｎ－ＨＬＡ－ＤＲ－細胞のうちＣＤ１１ｂｈｉＣＤ３３ｈｉであるもの、を数え上げた。
【0057】
ドナー特異的Ｔ及びＢ細胞応答
膵島ドナー及び移植片レシピエント由来の凍結貯蔵ＰＢＬ試料で、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を行った。レシピエントサル由来の応答側ＰＢＬ（３００，０００細胞）試料を、２．５μＭのＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ３４５５４）で標識し、膵島ドナー（ｄｏｎｏｒ）及び無関係のＭＨＣミスマッチドナー（第三者）由来の刺激側ＰＢＬ（３００，０００細胞）をＶＰＤ－４５０標識（ＢＤ、カタログ番号５６２１５８）して放射線照射（３０００ｃＧｙ）したものと共培養した。実験の別のセットでは、ナイーブな応答側サル由来のＣＦＳＥ標識化ＰＢＬを、膵島ドナー由来のＥＣＤＩ固定したＰＢＬ（ＡＤＬ）と共培養した（３００，０００細胞）。ドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）を調製した。ＭＬＲの６日目、ＣＦＳＥ希釈液で、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ２０＋細胞を測定し、ＣＦＳＥの低い細胞を増殖性細胞として、これのパーセンテージで表した。
膵島ドナー及び移植片レシピエント由来の凍結貯蔵ＰＢＬ試料で、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を行った。レシピエントサル由来の応答側ＰＢＬ（３００，０００細胞）試料を、２．５μＭのＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ３４５５４）で標識し、膵島ドナー（ｄｏｎｏｒ）及び無関係のＭＨＣミスマッチドナー（第三者）由来の刺激側ＰＢＬ（３００，０００細胞）をＶＰＤ－４５０標識（ＢＤ、カタログ番号５６２１５８）して放射線照射（３０００ｃＧｙ）したものと共培養した。実験の別のセットでは、ナイーブな応答側サル由来のＣＦＳＥ標識化ＰＢＬを、膵島ドナー由来のＥＣＤＩ固定したＰＢＬ（ＡＤＬ）と共培養した（３００，０００細胞）。ドナーアポトーシス白血球（ＡＤＬ）を調製した。ＭＬＲの６日目、ＣＦＳＥ希釈液で、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ２０＋細胞を測定し、ＣＦＳＥの低い細胞を増殖性細胞として、これのパーセンテージで表した。
【0058】
ドナー刺激されたＴｒ１細胞の多機能サイトカインプロファイルの評価。コホートＢ（ｎ＝３）、コホートＣ（ｎ＝３）、及びコホートＥ（ｎ＝２）のサルの末梢血由来のＴ細胞を、終了時に採取した。簡単に述べると、応答側レシピエントのＰＢＬ（１×１０６細胞）を、１：１の比でドナーＰＢＬ（ＶＰＤ－４５０標識化）の存在下、４８時間、培養した。これらのドナー刺激された細胞を、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ－Ａ（１０ｕｇ／ｍｌ）の存在下、少量のＰＭＡ／イオノマイシンを用いて４時間、手早く活性化した。細胞を、ＣＤ４、ＣＤ４９ｂ、及びＬＡＧ－３に関して表面染色し、続いて、透過固定処理し、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－βに関して細胞内染色した。Ｔｒ１細胞を特定するためのゲーティング法を、上記のとおり行った。
【0059】
ＥＬＩＳＰＯＴ。ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイのため、コホートＢ及びコホートＣのサルから長期的に収集したＰＢＬを解凍し、洗い、１２ウェル培養プレートにおいて、３７℃、５％ＣＯ２で、ドナーＰＢＬとともに、最終体積が１ｍｌのＣＲＰＭＩ培地中で前インキュベートした。４８時間後、細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗い、培養培地２００μｌに再懸濁させた。細胞を、抗ＩＦＮ－γ抗体でコーティングされた２つのＥＬＩＳＰＯＴウェルに移し、１ウェルあたり最終体積１００μｌ中、３７℃で５時間インキュベートした。続いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｕ－Ｃｙｔｅｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、製造元プロトコルに従って実施した。スポット分析は、Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｐｏｔ ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（ＣＴＬ）で行った。
【0060】
感作化スクリーニング（ドナー特異的抗体、ＤＳＡ）。様々な時点でレシピエントＲＭから血清を採取し、ＤＳＡの存在を、フローサイトメトリーで検出した。簡単に述べると、保存していたドナーＰＢＬを解凍し、完全ＲＰＭＩで洗った後、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）に４×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。調製した細胞浮遊液５０μｌを、Ｕ型９６ウェルプレートの各ウェルに、完全不活性化した（５６℃で４５分間）レシピエント血清５０μｌと合わせて播種し、続いて室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗った。最後に、ＦＡＣＳ緩衝液１００μｌに、ＦＩＴＣ－抗ＩｇＧ、ＰＥ－抗ＣＤ２０、ＰＥ Ｃｙ７－抗ＣＤ３、及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ色素とともに再懸濁させ、続いて室温で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を２回洗い、パラホルムアルデヒドで固定し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＣＤ３＋でゲートされた細胞で検出された抗ＩｇＧレベルは、各レシピエント血清中のＤＳＡ量を表す。
【0061】
免疫調節を調べる抑制アッセイ
計画された制御性サブ集団は全て、コホートＣサルから選別した。採取したばかりの血液から得られたＰＢＬを、滅菌ＰＢＳ中、Ｔｒ１細胞（ＣＤ４＋のうちＬＡＧ－３＋ＣＤ４９ｂ＋）選別用にＣＤ４、ＣＤ４９ｂ、及びＬＡＧ－３で、Ｂｒｅｇ細胞（ＣＤ１９＋のうちＣＤ２４＋ＣＤ３８＋）選別用にＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３８で、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋のうちＣＤ２５ｈｉ＋ＣＤ１２７－）選別用にＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７で標識し、続いて洗った。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩシステムを、８５μｍノズルを用いる選別用に設定した（周波数４７ｋＨｚで４５ｐｓｉ）。選別は全て、１秒あたり８，０００～１０，０００事象で行った。選別された細胞を、ＣＲＰＭＩの入った１２×７５ｍｍ丸底試験管に収集した。純度評価のため、選別後分析を行った。
計画された制御性サブ集団は全て、コホートＣサルから選別した。採取したばかりの血液から得られたＰＢＬを、滅菌ＰＢＳ中、Ｔｒ１細胞（ＣＤ４＋のうちＬＡＧ－３＋ＣＤ４９ｂ＋）選別用にＣＤ４、ＣＤ４９ｂ、及びＬＡＧ－３で、Ｂｒｅｇ細胞（ＣＤ１９＋のうちＣＤ２４＋ＣＤ３８＋）選別用にＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３８で、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋のうちＣＤ２５ｈｉ＋ＣＤ１２７－）選別用にＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７で標識し、続いて洗った。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩシステムを、８５μｍノズルを用いる選別用に設定した（周波数４７ｋＨｚで４５ｐｓｉ）。選別は全て、１秒あたり８，０００～１０，０００事象で行った。選別された細胞を、ＣＲＰＭＩの入った１２×７５ｍｍ丸底試験管に収集した。純度評価のため、選別後分析を行った。
【0062】
枯渇アッセイでは、Ｔｒｅｇ細胞、Ｂｒｅｇ細胞、及びＴｒ１細胞を、移植後１２ヶ月で収集したコホートＣサルのＰＢＬから枯渇させた。図３。同一数のＣＦＳＥ標識化全ＰＢＬ（枯渇させず）またはＴｒｅｇ枯渇（非ＣＤ４＋ｌｙｍプラスＣＤ１２７－ＣＤ２５ｈｉＣＤ４＋ｌｙｍ）ＰＢＬ、Ｂｒｅｇ枯渇（非ＣＤ１９＋ｌｙｍプラスＣＤ２４－ＣＤ３８－ＣＤ１９＋ｌｙｍ）ＰＢＬ、及びＴｒ１枯渇（非ＣＤ４＋ｌｙｍプラスＣＤ４９ｂ－ＬＡＧ３－ＣＤ４＋ｌｙｍ）ＰＢＬを、同数の放射線照射したＶＰＤ４５０標識化ドナーＰＢＬとともに、１－ｗａｙ ＣＦＳＥ Ｆｌｏｗ－ＭＬＲ中、６日間培養した。全てのＣＦＳＥ－ＭＬＲ増殖アッセイについて、応答側及び刺激側細胞の比を１：１に維持した。増殖細胞（ＣＦＳＥ－）のフロー分析中、全ドナー集団を、ＶＰＤ４５０＋陽性に基づいて除外した。
【0063】
選別された細胞の抑制能力を確認するため、ワクチン接種及び移植の前にベースラインで収集されたナイーブなレシピエントＰＢＬに、１－ｗａｙ ＣＦＳＥ Ｆｌｏｗ－ＭＬＲ中、３～４日間、放射線照射したＶＰＤ４５０標識化ドナーＰＢＬ細胞（１：１比）で負荷を与え、続いて、様々な制御性表現型を持つ免疫細胞（Ｔｒ１細胞、Ｔｒｅｇ細胞、及びＢｒｅｇ細胞）のある比（１：５０）での存在下、または不在下で、放射線照射したドナーＰＢＬで再度負荷を与えた。これらの細胞は、移植後９ヶ月から１２ヶ月の間の免疫寛容レシピエントから選別した。Ｔｒ１細胞を調べる抑制アッセイ全てについて、ドナー及び第三者ドナーの存在下でＴｒ１対全ＰＢＬの比に１：５０を用いた。Ｔｒ１介在型抑制が接触依存型であるかどうかを調べるトランスウェル実験を設定した。この実験設定では、ＣＦＳＥ標識化Ｔｒ１枯渇ＰＢＬを、Ｔｒ１細胞の存在下、または不在下で、放射線照射したＶＰＤ４５０標識化ドナー細胞（１：１比）とともに、プレートの底に播種した（３００，０００細胞）。このＴｒ１細胞は、サルのＩＬ－１０と交差反応することが既知でありアイソタイプの一致する抗ヒトＩＬ－１０中和Ａｂの存在（１０μｇ／ｍｌ）下、または不在下いずれかで、膜横断法（４μｍ孔径、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｒｅｆ＃３３９１）により分離させた。
【0064】
Ｔｒ１細胞におけるｓｉＲＮＡ介在型ＳＨ２Ｄ２阻害
フロー選別されたＴｒ１＋細胞（ＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ－３＋ＣＤ４＋）及びＴｒ１－ｌｙｍ細胞（ＣＤ４＋のうちＣＤ４－Ｌｙｍ＋ＣＤ４９ｂ－ＬＡＧ－３－であるプール）は、移植１２ヶ月後に収集されたコホートＣサルのＰＢＬから選別された。ＣＦＳＥ標識化Ｔｒ１－ｌｙｍ細胞（３００，０００）を、放射線照射したＶＰＤ－４５０標識化ドナー細胞（３００，０００）ありまたはなしで、６日間、ＭＬＲ中で培養した。最初に、選別したＴｒ１細胞を、最初の３日間、ＣＲＰＭＩ中で安置し、その後、Ａｃｃｅｌｌ ｓｉＲＮＡ貯蔵原液及びＡｃｃｅｌｌ送達培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号Ｂ－００５０００－５００）を直接、選別されたＴｒ１＋細胞と混合することにより、それらを、１００μＭのＡｃｃｅｌｌヒトＳＨ２Ｄ２Ａ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ａｃｃｅｌｌ、カタログ番号Ｅ－０１７８５１－００－０００５）で処理した。ＳＨ２Ｄ２Ａ ｓｉＲＮＡまたはＡｃｃｅｌｌ送達培地のみで処理されたＴｒ１＋細胞を、最後の３日間、ＭＬＲに加え戻した。ドナー特異的Ｔ及びＢ細胞のＴｒ１介在型抑制に対するｓｉＲＮＡ介在型ＳＨ２Ｄ２阻害の影響を測定するため、６日目、全培養細胞を収集し、Ｔ及びＢ細胞増殖を評価するため染色した。図４。
フロー選別されたＴｒ１＋細胞（ＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ－３＋ＣＤ４＋）及びＴｒ１－ｌｙｍ細胞（ＣＤ４＋のうちＣＤ４－Ｌｙｍ＋ＣＤ４９ｂ－ＬＡＧ－３－であるプール）は、移植１２ヶ月後に収集されたコホートＣサルのＰＢＬから選別された。ＣＦＳＥ標識化Ｔｒ１－ｌｙｍ細胞（３００，０００）を、放射線照射したＶＰＤ－４５０標識化ドナー細胞（３００，０００）ありまたはなしで、６日間、ＭＬＲ中で培養した。最初に、選別したＴｒ１細胞を、最初の３日間、ＣＲＰＭＩ中で安置し、その後、Ａｃｃｅｌｌ ｓｉＲＮＡ貯蔵原液及びＡｃｃｅｌｌ送達培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号Ｂ－００５０００－５００）を直接、選別されたＴｒ１＋細胞と混合することにより、それらを、１００μＭのＡｃｃｅｌｌヒトＳＨ２Ｄ２Ａ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ａｃｃｅｌｌ、カタログ番号Ｅ－０１７８５１－００－０００５）で処理した。ＳＨ２Ｄ２Ａ ｓｉＲＮＡまたはＡｃｃｅｌｌ送達培地のみで処理されたＴｒ１＋細胞を、最後の３日間、ＭＬＲに加え戻した。ドナー特異的Ｔ及びＢ細胞のＴｒ１介在型抑制に対するｓｉＲＮＡ介在型ＳＨ２Ｄ２阻害の影響を測定するため、６日目、全培養細胞を収集し、Ｔ及びＢ細胞増殖を評価するため染色した。図４。
【0065】
四量体の調製及び染色
これらのサルにおいて、ＭＨＣクラスＩＩ四量体を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｒ１細胞、及び間接的アロペプチド特異性を持つＴｒｅｇ細胞の追跡を可能にするため、アカゲザル、カニクイザル、及びヒトのＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合モチーフで観察される高度類似性を、利用した。ＮＣＢＩウェブサイトで、ヒトゲノムを用いてＭａｍｕ ＤＲＢ配列のＳｔ－ＢＬＡＳＴ分析を行い、ヒトホモログを特定した。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１３（受入番号ＣＤＰ３２９０５．１）は、Ｍａｍｕ ＤＲＢ０３ａと９２％同一であり、ポジティブ９６％及びギャップ０％、ｅ値が６ｅ－１７８であった。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１４（受入番号ＡＢＮ５４６８３．１）は、Ｍａｍｕ ＤＲＢ０４と９３％同一であり、ポジティブ９４％及びギャップ０％、ｅ値が２ｅ－１７５であった。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１３またはＨＬＡ ＤＲＢ１＊１４に対して高い結合親和性を持つＭａｍｕ ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ配列由来のペプチドを、Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｎａｙｓｉｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅを利用して特定した。合成ペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ）を、ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１３またはＨＬＡ ＤＲＢ１＊１４四量体に添加した。ＰＢＬを、特異的細胞表面マーカー用の抗体と合わせて、０．５または１μｇ／ｍｌのＨＬＡクラスＩＩ四量体ＰＥとともに２０分間、インキュベートした。染色した細胞を、冷ＰＢＳ／１％ＦＣＳで洗い、１％ＰＢＳ／ホルムアルデヒドで固定し、ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩに付着させ、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．２（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いてデータ分析を行った。図５。
これらのサルにおいて、ＭＨＣクラスＩＩ四量体を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｒ１細胞、及び間接的アロペプチド特異性を持つＴｒｅｇ細胞の追跡を可能にするため、アカゲザル、カニクイザル、及びヒトのＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合モチーフで観察される高度類似性を、利用した。ＮＣＢＩウェブサイトで、ヒトゲノムを用いてＭａｍｕ ＤＲＢ配列のＳｔ－ＢＬＡＳＴ分析を行い、ヒトホモログを特定した。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１３（受入番号ＣＤＰ３２９０５．１）は、Ｍａｍｕ ＤＲＢ０３ａと９２％同一であり、ポジティブ９６％及びギャップ０％、ｅ値が６ｅ－１７８であった。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１４（受入番号ＡＢＮ５４６８３．１）は、Ｍａｍｕ ＤＲＢ０４と９３％同一であり、ポジティブ９４％及びギャップ０％、ｅ値が２ｅ－１７５であった。ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１３またはＨＬＡ ＤＲＢ１＊１４に対して高い結合親和性を持つＭａｍｕ ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ配列由来のペプチドを、Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｎａｙｓｉｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅを利用して特定した。合成ペプチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ）を、ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１３またはＨＬＡ ＤＲＢ１＊１４四量体に添加した。ＰＢＬを、特異的細胞表面マーカー用の抗体と合わせて、０．５または１μｇ／ｍｌのＨＬＡクラスＩＩ四量体ＰＥとともに２０分間、インキュベートした。染色した細胞を、冷ＰＢＳ／１％ＦＣＳで洗い、１％ＰＢＳ／ホルムアルデヒドで固定し、ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩに付着させ、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．２（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いてデータ分析を行った。図５。
【0066】
ドナー反応性Ｔ細胞を追跡するためのＴＣＲ配列決定
ＴＣＲβ鎖ＣＤＲ３領域のＲＮＡに基づく高処理配列決定を用いて、コホートＡサルにおいて、ＡＤＬ注入の前及び後の区間でＴ細胞クローンの全レパートリーを比較した。このアプローチには、全Ｖ遺伝子セグメントにわたる複数のプライマーセットを設計及び最適化する必要があるゲノム法に勝る利点がある。Ｖ遺伝子セグメントは、サルではまだあまり定義されていない。ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを冷凍ＰＢＬから抽出し、第一鎖ｃＤＮＡを、全ＲＮＡのポリＡテイル付画分から作成した。簡単に述べると、特別設計したオリゴｄＴプライマー及びテンプレートスイッチプライマーを逆転写酵素反応に用いて、ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを、Ｍ． ｍｕｌａｔｔａのＴＣＲ定常領域及びテンプレートスイッチ配列に対して特異的なプライマーを用いる、ＴＣＲ ＶＤＪ領域の選択的ＰＣＲ濃縮用のテンプレートとして用いた。各試料から濃縮されたＶＤＪアンプリコンを、配列決定中の適合性を多重化するため、ＰＣＲにより独自に二重インデックス化した。全てのＰＣＲ増幅は、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼレディミックスキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。インデックス化アンプリコンライブラリーを、等モルでプールし、ＳＰＲＩビーズ（Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で浄化した。最終プールを、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）３００ｂｐ対エンドラン（ｖ３キット）で配列決定した。ＴＣＲ ＮＧＳライブラリーの調製及び配列決定は、ミネソタ大学ゲノム科学センターで行った。ＱＣ化ショート読取りの生データを、セットパラメーター（ＩＬＬＵＭＩＮＡＣＬＩＰ：ａｌｌ＿ｉｌｌｕｍｉｎａ＿ａｄａｐｔｅｒｓ．ｆａ：２：３０：１０ＬＥＡＤＩＮＧ：３ＴＲＡＩＬＩＮＧ：３ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：４：１５ＭＩＮＬＥＮ：７０）を使用してｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ６８により明快にした。前処理した読取りを、ＴＣＲプロファイリングのため、初期設定でＭｉＸＣＲ６９に直接入力した（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｉｘｃｒ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／ｒｎａｓｅｑ．ｈｔｍｌ）。アカゲザルで既知のＴＲＢクローン型を、参照として用いた。得られたＴＲＢクローン型を、カスタマイズされた閾値を用い、クローン割合を≧０．５％として、さらにフィルター処理した。個別の時点でのクローン出現率を、同定されマッピングされたＴＣＲクローン全ての平均出現率で除算することにより、クローン増殖の頻度を計算した。ベースラインでのドナー特異的ＴＣＲクローンのほとんどは、極めて少ないか検出不能であったので、本発明者らは、ベースラインとしてピーク増殖を使用して、これら増殖Ｔ細胞クローンの運命を分析した。
ＴＣＲβ鎖ＣＤＲ３領域のＲＮＡに基づく高処理配列決定を用いて、コホートＡサルにおいて、ＡＤＬ注入の前及び後の区間でＴ細胞クローンの全レパートリーを比較した。このアプローチには、全Ｖ遺伝子セグメントにわたる複数のプライマーセットを設計及び最適化する必要があるゲノム法に勝る利点がある。Ｖ遺伝子セグメントは、サルではまだあまり定義されていない。ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを冷凍ＰＢＬから抽出し、第一鎖ｃＤＮＡを、全ＲＮＡのポリＡテイル付画分から作成した。簡単に述べると、特別設計したオリゴｄＴプライマー及びテンプレートスイッチプライマーを逆転写酵素反応に用いて、ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを、Ｍ． ｍｕｌａｔｔａのＴＣＲ定常領域及びテンプレートスイッチ配列に対して特異的なプライマーを用いる、ＴＣＲ ＶＤＪ領域の選択的ＰＣＲ濃縮用のテンプレートとして用いた。各試料から濃縮されたＶＤＪアンプリコンを、配列決定中の適合性を多重化するため、ＰＣＲにより独自に二重インデックス化した。全てのＰＣＲ増幅は、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼレディミックスキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。インデックス化アンプリコンライブラリーを、等モルでプールし、ＳＰＲＩビーズ（Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で浄化した。最終プールを、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）３００ｂｐ対エンドラン（ｖ３キット）で配列決定した。ＴＣＲ ＮＧＳライブラリーの調製及び配列決定は、ミネソタ大学ゲノム科学センターで行った。ＱＣ化ショート読取りの生データを、セットパラメーター（ＩＬＬＵＭＩＮＡＣＬＩＰ：ａｌｌ＿ｉｌｌｕｍｉｎａ＿ａｄａｐｔｅｒｓ．ｆａ：２：３０：１０ＬＥＡＤＩＮＧ：３ＴＲＡＩＬＩＮＧ：３ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：４：１５ＭＩＮＬＥＮ：７０）を使用してｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ６８により明快にした。前処理した読取りを、ＴＣＲプロファイリングのため、初期設定でＭｉＸＣＲ６９に直接入力した（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｉｘｃｒ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／ｒｎａｓｅｑ．ｈｔｍｌ）。アカゲザルで既知のＴＲＢクローン型を、参照として用いた。得られたＴＲＢクローン型を、カスタマイズされた閾値を用い、クローン割合を≧０．５％として、さらにフィルター処理した。個別の時点でのクローン出現率を、同定されマッピングされたＴＣＲクローン全ての平均出現率で除算することにより、クローン増殖の頻度を計算した。ベースラインでのドナー特異的ＴＣＲクローンのほとんどは、極めて少ないか検出不能であったので、本発明者らは、ベースラインとしてピーク増殖を使用して、これら増殖Ｔ細胞クローンの運命を分析した。
【0067】
選別されたＴｒ１細胞における遺伝子発現を調べるためのＲＮＡＳｅｑ法
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ ２５００プラットフォームの５０ｂｐ対エンド読取りを用いて、ＲＮＡ試料を配列決定した。ＣＡＳＡＶ １．８Ｐ／Ｆフィルターを通過した配列生データを、ｆａｓｔｑｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ）で評価した。読取りマッピングを、Ｈｉｓａｔ２（ｖ２．０．２）で、参照としてＵＣＳＣヒトゲノム（ｈｇ３８）を用いて行った。Ｃｕｆｆｄｉｆｆ２．２．１を用いて、ＦＰＫＭ単位（マッピングされた読取り１００万あたりのエキソン１キロ塩基あたりのマッピングされた断片）で、既知の遺伝子それぞれの発現レベルを定量した。示差的に発現する遺伝子を、ＣＬＣＧＷＢ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）中のｅｄｇｅＲ（負の２項式）機能を用いて、読取りカウント数生データを用いて特定した。ＤＥＧは、カラースケールで表される。発現した転写物に、非ヒト霊長類またはヒトゲノムデータベースを用いて、注釈をつけた。結果を、変化倍率の絶対値で順位付けし、コホートＢとコホートＣの間のＤＥＧを特定した。生成したリストを、最小１．５倍の変化倍率絶対値及び生Ｐ値＜０．０１に基づいてフィルターした。経路特定のため、これらのＤＥＧを、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）にインポートした。図１Ｃ。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ ２５００プラットフォームの５０ｂｐ対エンド読取りを用いて、ＲＮＡ試料を配列決定した。ＣＡＳＡＶ １．８Ｐ／Ｆフィルターを通過した配列生データを、ｆａｓｔｑｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ）で評価した。読取りマッピングを、Ｈｉｓａｔ２（ｖ２．０．２）で、参照としてＵＣＳＣヒトゲノム（ｈｇ３８）を用いて行った。Ｃｕｆｆｄｉｆｆ２．２．１を用いて、ＦＰＫＭ単位（マッピングされた読取り１００万あたりのエキソン１キロ塩基あたりのマッピングされた断片）で、既知の遺伝子それぞれの発現レベルを定量した。示差的に発現する遺伝子を、ＣＬＣＧＷＢ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）中のｅｄｇｅＲ（負の２項式）機能を用いて、読取りカウント数生データを用いて特定した。ＤＥＧは、カラースケールで表される。発現した転写物に、非ヒト霊長類またはヒトゲノムデータベースを用いて、注釈をつけた。結果を、変化倍率の絶対値で順位付けし、コホートＢとコホートＣの間のＤＥＧを特定した。生成したリストを、最小１．５倍の変化倍率絶対値及び生Ｐ値＜０．０１に基づいてフィルターした。経路特定のため、これらのＤＥＧを、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）にインポートした。図１Ｃ。
【0068】
ＡＤＬ処理、放出試験、及び注入
膵島移植を基準にして－７日目、脾細胞を、ドナーサル脾臓から単離し、ＲＢＣ溶解させ、ナイロンウールカラム（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いて残存細胞からＢ細胞を濃縮した。細胞（８０％）を、氷上で１時間、ＤＰＢＳ中でＥＣＤＩ（３．２×１０８細胞あたり３０ｍｇ／ｍｌ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）とともに撹拌し、洗い、壊死細胞及び微小凝集物を除去し、ＡＯ／ＰＩ蛍光顕微鏡観察により生存／壊死を評価した。ＥＣＤＩ固定した脾細胞を、レシピエント体重１キログラムあたり０．２５×１０９細胞の目的用量で最大濃度を２０×１０６細胞／ｍＬとしてＩＶ注入するため冷シリンジ（ｎ＝９）またはＩＶバッグ（ｎ＝２）に添加し、レシピエント投与するまで氷上に維持した。ＥＣＤＩ固定化細胞を３７℃で４～６時間インキュベートし、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識することにより、アポトーシスの誘導をｉｎ ｖｉｔｒｏでモニタリングし、蛍光顕微鏡観察で分析した。
膵島移植を基準にして－７日目、脾細胞を、ドナーサル脾臓から単離し、ＲＢＣ溶解させ、ナイロンウールカラム（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いて残存細胞からＢ細胞を濃縮した。細胞（８０％）を、氷上で１時間、ＤＰＢＳ中でＥＣＤＩ（３．２×１０８細胞あたり３０ｍｇ／ｍｌ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）とともに撹拌し、洗い、壊死細胞及び微小凝集物を除去し、ＡＯ／ＰＩ蛍光顕微鏡観察により生存／壊死を評価した。ＥＣＤＩ固定した脾細胞を、レシピエント体重１キログラムあたり０．２５×１０９細胞の目的用量で最大濃度を２０×１０６細胞／ｍＬとしてＩＶ注入するため冷シリンジ（ｎ＝９）またはＩＶバッグ（ｎ＝２）に添加し、レシピエント投与するまで氷上に維持した。ＥＣＤＩ固定化細胞を３７℃で４～６時間インキュベートし、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識することにより、アポトーシスの誘導をｉｎ ｖｉｔｒｏでモニタリングし、蛍光顕微鏡観察で分析した。
【0069】
＋１日目の注入用のＥＣＤＩ固定化ＡＤＬの目的用量に合わせるため、膵島移植を基準に－１５日目及び－７日目にドナーサルから採取した血液及び膵細胞の残部２０％から、非ヒト霊長類ＣＤ２０ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて磁気選別によりＢ細胞を濃縮し、ＧＲＥＸ１００Ｍフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）中、ｒｈＩＬ－１０（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｒＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＢＡＦＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＴＬＲ９ａ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ならびにｒｈＣＤ４０Ｌ－ＭＥＧＡまたはｒｈＣＤ４０Ｌ多量体（５００ｎｇ／ｍｌ）一方あるいは両方、ならびにｒｈＡＰＲＩＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、＋１日目まで、ｅｘ－ｖｉｖｏで増殖させた。増殖させた細胞を、収集の２４時間前に、ｒｈＩＬ－２１（５ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。レシピエントは、注入前に、ジフェンヒドラミン１２．５ｍｇ、アセトアミノフェン１６０ｍｇ、及びオンダンセトロン４ｍｇ ＰＯの組み合わせで前処置した。
【0070】
一過性免疫抑制
免疫抑制剤を、コホートＡ～Ｅの全てのレシピエントサルに投与した。コホートＡ、Ｃ、Ｄ、及びＥのサルにおける全てのＡＤＬ注入を包含するため、各薬物の初回用量は、０日目の膵島移植を基準に－８または－７日目に、コホートＡ～Ｅの全てのレシピエントに投与された。ＮＩＨ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅにより提供されたアンタゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ２Ｃ１０Ｒ４は、－８、－１、７、及び１４日目に、５０ｍｇ／ｋｇでＩＶ投与された。ラパマイシン（ラパミューン（登録商標））は、－７日目から移植後２１日目までＰＯで投与され、目的トラフレベルは、５～１２ｎｇ／ｍｌであった。併用抗炎症治療は、以下からなるものであった：ｉ）αＩＬ－６Ｒ（トシリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））を、－７、０、７、１４、及び２１日目に１０ｍｇ／ｋｇのＩＶで、ならびにｉｉ）ｓＴＮＦＲ（エタネルセプト、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））を－７及び０日目に１ｍｇ／ｋｇのＩＶで、及び３、７、１０、１４、及び２１日目に０．５ｍｇ／ｋｇ／ＳＣで。探索コホートＲＭは、＋７日目に終了させた。したがって、免疫抑制剤の最終用量は、これらのＲＭにおいて＋７日目に投与された。
免疫抑制剤を、コホートＡ～Ｅの全てのレシピエントサルに投与した。コホートＡ、Ｃ、Ｄ、及びＥのサルにおける全てのＡＤＬ注入を包含するため、各薬物の初回用量は、０日目の膵島移植を基準に－８または－７日目に、コホートＡ～Ｅの全てのレシピエントに投与された。ＮＩＨ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅにより提供されたアンタゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ ２Ｃ１０Ｒ４は、－８、－１、７、及び１４日目に、５０ｍｇ／ｋｇでＩＶ投与された。ラパマイシン（ラパミューン（登録商標））は、－７日目から移植後２１日目までＰＯで投与され、目的トラフレベルは、５～１２ｎｇ／ｍｌであった。併用抗炎症治療は、以下からなるものであった：ｉ）αＩＬ－６Ｒ（トシリズマブ、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））を、－７、０、７、１４、及び２１日目に１０ｍｇ／ｋｇのＩＶで、ならびにｉｉ）ｓＴＮＦＲ（エタネルセプト、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））を－７及び０日目に１ｍｇ／ｋｇのＩＶで、及び３、７、１０、１４、及び２１日目に０．５ｍｇ／ｋｇ／ＳＣで。探索コホートＲＭは、＋７日目に終了させた。したがって、免疫抑制剤の最終用量は、これらのＲＭにおいて＋７日目に投与された。
【0071】
膵臓調達、膵島処理及び放出試験、膵島移植、ならびに膵島移植片機能の評価
コホートＣ～Ｅのドナーサルで全膵切除を行い、膵島を単離し、精製し、７日間培養して直接経路刺激性能力を最小化し、品質管理に供した。０日目、ＤＮＡ６４により目的数≧５，０００ＩＥ／ｋｇを、エンドトキシン含有量が≦１．０ＥＵ／レシピエントＢＷのｋｇ、であるように、ＳＴＺ糖尿病性ＲＭに留置した門脈内血管アクセスポートを用いて、手術せずに移植した。保護的外来インスリンを、移植片機能が完全な動物で移植後２１日目に停止した。代謝モニタリングには、毎日のａｍ／ｐｍ血糖、毎週のＣ－ペプチド、毎月のＨｂＡ１ｃ、混合食事試験、ならびにグルコースに反応した急性Ｃ－ペプチドの特定及びグルコース消失速度（Ｋｇ）を伴う２ヶ月ごとのＩＶＧＴＴが含まれていた。
コホートＣ～Ｅのドナーサルで全膵切除を行い、膵島を単離し、精製し、７日間培養して直接経路刺激性能力を最小化し、品質管理に供した。０日目、ＤＮＡ６４により目的数≧５，０００ＩＥ／ｋｇを、エンドトキシン含有量が≦１．０ＥＵ／レシピエントＢＷのｋｇ、であるように、ＳＴＺ糖尿病性ＲＭに留置した門脈内血管アクセスポートを用いて、手術せずに移植した。保護的外来インスリンを、移植片機能が完全な動物で移植後２１日目に停止した。代謝モニタリングには、毎日のａｍ／ｐｍ血糖、毎週のＣ－ペプチド、毎月のＨｂＡ１ｃ、混合食事試験、ならびにグルコースに反応した急性Ｃ－ペプチドの特定及びグルコース消失速度（Ｋｇ）を伴う２ヶ月ごとのＩＶＧＴＴが含まれていた。
【0072】
膵島移植片の組織病理学検査
肝臓検体を、各レシピエントの１０箇所の異なる解剖学的範囲から得て、１０％ホルマリンで固定し、常用の組織学検査用に処理した。１０の塊それぞれから得た切片を、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色またはインスリンについて免疫染色し、移植した膵島を点数化した。無拒絶膵島同種移植片生着は、死体解剖で、移植片組織病理学検査において、相当数の無傷Ａ型及び軽度に浸潤したＢ型膵島が示され、Ｃ～Ｆ型膵島（軽度～重度に浸潤した膵島及び浸潤物または線維症で部分的もしくは全部置き換わった膵島）がほとんどまたは全くないことにより確認した。
肝臓検体を、各レシピエントの１０箇所の異なる解剖学的範囲から得て、１０％ホルマリンで固定し、常用の組織学検査用に処理した。１０の塊それぞれから得た切片を、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色またはインスリンについて免疫染色し、移植した膵島を点数化した。無拒絶膵島同種移植片生着は、死体解剖で、移植片組織病理学検査において、相当数の無傷Ａ型及び軽度に浸潤したＢ型膵島が示され、Ｃ～Ｆ型膵島（軽度～重度に浸潤した膵島及び浸潤物または線維症で部分的もしくは全部置き換わった膵島）がほとんどまたは全くないことにより確認した。
【0073】
ＡＤＬは、ドナー特異的Ｔ及びＢ細胞クローンの不完全な増殖を誘導する
非移植、非糖尿病性、１つのＤＲＢがマッチしたコホートＡのサル３匹で、短期免疫抑制下、ＡＤＬ注入後早期の細胞性免疫をモニタリングすることで、いくつかの知見が得られた。循環ＭＤＳＣの出現率は、顕著に上昇し、上昇は、初回ＡＤＬ注入の１日後（－６日目）から始まり、＋７日目の追跡観察の終わりまで終始上昇したままであった。Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、－５日目に２．６倍に上昇し、続いて３日後に９０％減少し、２回目のＡＤＬ注入の３日後からほぼ完全な不在が始まった。Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現率は、初回ＡＤＬ注入後、１９倍に上昇し、続いて鋭い減少が、初回ＡＤＬ注入の４日後から始まり、２回目のＡＤＬ注入の直後からほぼ完全な不在になった。両方のＡＤＬ注入後、ＣＤ２０＋Ｂ細胞は、似たような動態ならびに増殖及び収縮の程度を示した。インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、顕著に低下し、インターロイキン（ＩＬ）－１０分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、変化のないままであった。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ２０＋細胞のドナー特異的増殖は、顕著に低下し、一方で、第三者ドナーに反応した増殖は、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル混合リンパ球反応（ＣＦＳＥ－ＭＬＲ）アッセイにおいて変化のないままであった。
非移植、非糖尿病性、１つのＤＲＢがマッチしたコホートＡのサル３匹で、短期免疫抑制下、ＡＤＬ注入後早期の細胞性免疫をモニタリングすることで、いくつかの知見が得られた。循環ＭＤＳＣの出現率は、顕著に上昇し、上昇は、初回ＡＤＬ注入の１日後（－６日目）から始まり、＋７日目の追跡観察の終わりまで終始上昇したままであった。Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、－５日目に２．６倍に上昇し、続いて３日後に９０％減少し、２回目のＡＤＬ注入の３日後からほぼ完全な不在が始まった。Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現率は、初回ＡＤＬ注入後、１９倍に上昇し、続いて鋭い減少が、初回ＡＤＬ注入の４日後から始まり、２回目のＡＤＬ注入の直後からほぼ完全な不在になった。両方のＡＤＬ注入後、ＣＤ２０＋Ｂ細胞は、似たような動態ならびに増殖及び収縮の程度を示した。インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、顕著に低下し、インターロイキン（ＩＬ）－１０分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、変化のないままであった。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ２０＋細胞のドナー特異的増殖は、顕著に低下し、一方で、第三者ドナーに反応した増殖は、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル混合リンパ球反応（ＣＦＳＥ－ＭＬＲ）アッセイにおいて変化のないままであった。
【0074】
ミスマッチドナーＨＣ－Ｉ Ｍａｍｕ Ａ００４２７－４１ペプチドに対する間接的特異性を持つＣＤ４＋Ｔ細胞の運命を追跡するため、本発明者らは、これを、コホートＡのサル３匹においてＨＬＡ ＤＲＢ１＊１３（Ｍａｍｕ－ＤＲ０３のヒトホモログ）四量体で試した。細胞は、－５日目に５．６倍に増加し、次いで、０日目に３．６倍に減少した。次いで、２回目のＡＤＬ注入の２日後、四量体陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、１．２４倍に増加したが、７日目には、ナイーブなサルに比べて顕著に収縮した。
【0075】
これらのサルにおけるＶＤＪ領域のクローン型分析から、約３０種のＴ細胞クローンの出現率がＡＤＬ注入後に変化したことが実証された。異なるＶβ鎖（４－Ｖβ５と、Ｖβ４、Ｖβ７、Ｖβ９、Ｖβ１１、Ｖβ１２、及びＶβ２８のうちそれぞれ３つと）を持つ複数のＴ細胞クローンにおける改変は、ＡＤＬ注入が、複数のアロ反応性クローンを標的としたことを示した。アロ反応性がポリクローナルであるという考えと一致する。個別のＴ細胞クローン分析は、複数のクローンの不完全な増殖及び続く５～８倍の収縮を実証した。すなわち、複数の証拠の連なりから、ＡＤＬ注入が、ドナー特異的Ｔ及びＢ細胞の増殖、続いて収縮を引き起こすことが示された。
【0076】
ＡＤＬは、１つのＤＲＢがマッチしたＲＭにおいて安定した膵島同種移植片免疫寛容を促進する
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）糖尿病性の１つのＤＲＢがマッチしたコホートＢサルで短期免疫抑制にある７匹中２匹で、８日間培養した膵島同種移植片の門脈内移植は、３６５日間以上の生着となった（図６ａ及び図６ｂ）。コホートＣサル５匹中５匹で、短期免疫抑制にＡＤＬ注入を追加すると、生着の有意な改善を伴った（Ｐ＝０．０２１）。５匹全てが、移植後３６５日間以上、膵島同種移植片の移植後免疫寛容を呈した（図６ａ、図６ｂ）。コホートＣサル＃１３ＥＰ５は、移植後すぐに正常血糖になり、移植後２１日目に免疫抑制及び外来インスリンを中止した後でさえ、それを維持した。このレシピエントのＨｂＡ１Ｃレベルは、移植後正常になり、それを維持した。移植後の持続した体重増加が、他のコホートＣサルでも観察され、このことは、治療レジメンの総合的な安全性と一致する。移植前血清Ｃ－ペプチドレベル及びグルコース刺激に対する応答は、５匹のレシピエント全てで陰性であった。サル＃１３ＥＰ５では、１年間の追跡観察全体を通じて、移植後の強い陽性の空腹及び無秩序な血清Ｃ－ペプチドレベル及びそれらが刺激後に上昇したことから、安定した膵島同種移植片機能が確認された。このレシピエントは、移植後、グルコースで静脈内負荷をかけた後の安定した血糖消失速度（Ｋｇ）を示し、この速度はＳＴＺ前の速度に匹敵した。マッチング試験に由来するＣ－ペプチドレベルは、移植後過程全体を通じて＞１ｎｇ／ｍｌの実質的上昇を示した。このレシピエントの肝臓を死体解剖で組織病理学的に分析したところ、多数のインタクト膵島が明らかになり、膵島周囲浸潤は、ほとんどまたは全くなかった。移植された肝臓内膵島は、インスリンに関して強い陽性染色を示した。死体解剖で天然の膵臓にインスリン陽性膵島ベータ細胞が存在しなかったことは、移植後正常血糖が、移植片機能を反映したものであり、ＳＴＺ誘導型糖尿病からの寛解によるものではないことを示した。コホートＣサル＃１５ＣＰ１は、移植１年後に屠殺されなかった。膵島同種移植片機能は、このレシピエントにおいて、免疫抑制の中止後２年より長い間、継続した。サル＃１５ＣＰ１の死体解剖で、組織病理学検査から、天然膵臓中に無拒絶膵島同種移植片が生着しており、インスリン陽性ベータ細胞が存在しないことが確認された。比較して、コホートＢサル＃１５ＣＰ３は、移植後正常血糖になったものの、移植片機能の低下が、移植４ヶ月後から明らかとなった。それより１ヶ月後の死体解剖から、拒絶が確認され、これは、少数のインスリン陽性膵島ベータ細胞が、単核球により重度に浸潤されていたことにより裏付けられた。まとめると、これらの結果は、ＡＤＬ処置したＲＭにおいて、１つのＤＲＢがマッチした膵島同種移植片が、免疫抑制の中止後でさえ、機能的及び組織学的に長期生着することを実証し、厳密な翻訳モデルにおける堅固な免疫寛容を示している。
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）糖尿病性の１つのＤＲＢがマッチしたコホートＢサルで短期免疫抑制にある７匹中２匹で、８日間培養した膵島同種移植片の門脈内移植は、３６５日間以上の生着となった（図６ａ及び図６ｂ）。コホートＣサル５匹中５匹で、短期免疫抑制にＡＤＬ注入を追加すると、生着の有意な改善を伴った（Ｐ＝０．０２１）。５匹全てが、移植後３６５日間以上、膵島同種移植片の移植後免疫寛容を呈した（図６ａ、図６ｂ）。コホートＣサル＃１３ＥＰ５は、移植後すぐに正常血糖になり、移植後２１日目に免疫抑制及び外来インスリンを中止した後でさえ、それを維持した。このレシピエントのＨｂＡ１Ｃレベルは、移植後正常になり、それを維持した。移植後の持続した体重増加が、他のコホートＣサルでも観察され、このことは、治療レジメンの総合的な安全性と一致する。移植前血清Ｃ－ペプチドレベル及びグルコース刺激に対する応答は、５匹のレシピエント全てで陰性であった。サル＃１３ＥＰ５では、１年間の追跡観察全体を通じて、移植後の強い陽性の空腹及び無秩序な血清Ｃ－ペプチドレベル及びそれらが刺激後に上昇したことから、安定した膵島同種移植片機能が確認された。このレシピエントは、移植後、グルコースで静脈内負荷をかけた後の安定した血糖消失速度（Ｋｇ）を示し、この速度はＳＴＺ前の速度に匹敵した。マッチング試験に由来するＣ－ペプチドレベルは、移植後過程全体を通じて＞１ｎｇ／ｍｌの実質的上昇を示した。このレシピエントの肝臓を死体解剖で組織病理学的に分析したところ、多数のインタクト膵島が明らかになり、膵島周囲浸潤は、ほとんどまたは全くなかった。移植された肝臓内膵島は、インスリンに関して強い陽性染色を示した。死体解剖で天然の膵臓にインスリン陽性膵島ベータ細胞が存在しなかったことは、移植後正常血糖が、移植片機能を反映したものであり、ＳＴＺ誘導型糖尿病からの寛解によるものではないことを示した。コホートＣサル＃１５ＣＰ１は、移植１年後に屠殺されなかった。膵島同種移植片機能は、このレシピエントにおいて、免疫抑制の中止後２年より長い間、継続した。サル＃１５ＣＰ１の死体解剖で、組織病理学検査から、天然膵臓中に無拒絶膵島同種移植片が生着しており、インスリン陽性ベータ細胞が存在しないことが確認された。比較して、コホートＢサル＃１５ＣＰ３は、移植後正常血糖になったものの、移植片機能の低下が、移植４ヶ月後から明らかとなった。それより１ヶ月後の死体解剖から、拒絶が確認され、これは、少数のインスリン陽性膵島ベータ細胞が、単核球により重度に浸潤されていたことにより裏付けられた。まとめると、これらの結果は、ＡＤＬ処置したＲＭにおいて、１つのＤＲＢがマッチした膵島同種移植片が、免疫抑制の中止後でさえ、機能的及び組織学的に長期生着することを実証し、厳密な翻訳モデルにおける堅固な免疫寛容を示している。
【0077】
ＡＤＬは、エフェクター細胞増殖及びドナー特異的抗体（ＤＳＡ）誘発を抑制する
エフェクター細胞及び抗体応答を、コホートＢ及びＣのレシピエントで比較した。移植後３、６、及び１２ヶ月でのＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにＣＤ２０＋Ｂ細胞の循環出現率は、コホートＣでは、ＡＤＬ注入による影響を受けなかった。しかしながら、ＡＤＬを投与されなかったコホートＢサルとは対照的に、コホートＣの移植時付近ＡＤＬ注入は、循環、肝臓単核球（ＬＭＮＣ）、腸間膜のリンパ節（ＬＮ）、ならびに抗ドナーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔエフェクターメモリー（ＴＥＭ）細胞の増殖の長期抑制を伴った。１２ヶ月の移植後追跡観察全体を通じて、ＡＤＬ注入は、コホートＢサルに比べてコホートＣで、循環Ｔ濾胞ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞の出現率の低さを伴った。ＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞と同様に、ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、コホートＢに比べてコホートＣの方が移植後に高かった。このことは、ＡＤＬによりＴ細胞が、表現型誘導及び除去に枯渇することを示唆する。本発明者らの分析は、コホートＣサルの循環中のＴｂｅｔ＋ＣＤ４＋及びＣＤ４０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が持続して抑制され、第三者ドナーに対するＣＤ４＋Ｔ細胞増殖には影響がないことも示した。Ｔｂｅｔ＋ＣＤ８＋、ＣＤ４０＋ＣＤ８＋、及びＣＤ１０７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の循環出現率は、移植後３ヶ月で、コホートＢサルよりもコホートＣサルの方が低く、第三者に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の不完全な増殖はなかった。酵素関連免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析から、１ヶ月及び屠殺時の、照射ドナー末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に対して応答したことによる、直接及び間接的特異性を持つＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞の出現率に、コホートＢとＣの間で明らかな差はなく、ならびにベースラインと比較した場合にも明らかな差がないことが明らかとなった。循環ＣＤ２０＋Ｂ細胞の出現率は、コホートＢとＣで同様であったが、移植後３ヶ月及び１２ヶ月での循環中のＴｂｅｔ＋Ｂ細胞の割合ならびに屠殺時のＬＭＮＣ内のＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合は、コホートＢサルに比べてコホートＣで顕著に低かった。コホートＢでのみ、レシピエントは、高ＤＳＡレベル（平均蛍光強度（ｍｆｉ）で表される）を発生させ、コホートＣではそうならなかった。本発明者らは、ＤＳＡが、臨床的拒絶の前から存在していたかどうかを判断するのに十分なほど頻繁には、ＤＳＡを測定しなかった。ＤＳＡ陽性レシピエントのそれぞれにおいて、拒絶は、組織病理学的分析により確認した。まとめると、移植時付近ＡＤＬ注入は、短期免疫抑制にある１つのＤＲＢがマッチしたサルにおいて、エフェクターＴ及びＢ細胞の移植後活性化及び増殖、ならびにそれらの同種移植片への動員を妨害した。
エフェクター細胞及び抗体応答を、コホートＢ及びＣのレシピエントで比較した。移植後３、６、及び１２ヶ月でのＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにＣＤ２０＋Ｂ細胞の循環出現率は、コホートＣでは、ＡＤＬ注入による影響を受けなかった。しかしながら、ＡＤＬを投与されなかったコホートＢサルとは対照的に、コホートＣの移植時付近ＡＤＬ注入は、循環、肝臓単核球（ＬＭＮＣ）、腸間膜のリンパ節（ＬＮ）、ならびに抗ドナーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔエフェクターメモリー（ＴＥＭ）細胞の増殖の長期抑制を伴った。１２ヶ月の移植後追跡観察全体を通じて、ＡＤＬ注入は、コホートＢサルに比べてコホートＣで、循環Ｔ濾胞ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞の出現率の低さを伴った。ＰＤ－１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞と同様に、ＰＤ－１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、コホートＢに比べてコホートＣの方が移植後に高かった。このことは、ＡＤＬによりＴ細胞が、表現型誘導及び除去に枯渇することを示唆する。本発明者らの分析は、コホートＣサルの循環中のＴｂｅｔ＋ＣＤ４＋及びＣＤ４０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が持続して抑制され、第三者ドナーに対するＣＤ４＋Ｔ細胞増殖には影響がないことも示した。Ｔｂｅｔ＋ＣＤ８＋、ＣＤ４０＋ＣＤ８＋、及びＣＤ１０７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の循環出現率は、移植後３ヶ月で、コホートＢサルよりもコホートＣサルの方が低く、第三者に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の不完全な増殖はなかった。酵素関連免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析から、１ヶ月及び屠殺時の、照射ドナー末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に対して応答したことによる、直接及び間接的特異性を持つＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞の出現率に、コホートＢとＣの間で明らかな差はなく、ならびにベースラインと比較した場合にも明らかな差がないことが明らかとなった。循環ＣＤ２０＋Ｂ細胞の出現率は、コホートＢとＣで同様であったが、移植後３ヶ月及び１２ヶ月での循環中のＴｂｅｔ＋Ｂ細胞の割合ならびに屠殺時のＬＭＮＣ内のＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合は、コホートＢサルに比べてコホートＣで顕著に低かった。コホートＢでのみ、レシピエントは、高ＤＳＡレベル（平均蛍光強度（ｍｆｉ）で表される）を発生させ、コホートＣではそうならなかった。本発明者らは、ＤＳＡが、臨床的拒絶の前から存在していたかどうかを判断するのに十分なほど頻繁には、ＤＳＡを測定しなかった。ＤＳＡ陽性レシピエントのそれぞれにおいて、拒絶は、組織病理学的分析により確認した。まとめると、移植時付近ＡＤＬ注入は、短期免疫抑制にある１つのＤＲＢがマッチしたサルにおいて、エフェクターＴ及びＢ細胞の移植後活性化及び増殖、ならびにそれらの同種移植片への動員を妨害した。
【0078】
ＡＤＬは、抗原特異的制御性ネットワークを拡大させる
次に、本発明者らは、コホートＢ及びＣのサルにおいて、制御性表現型を持つリンパ系骨髄系細胞の出現率を比較した。無処置のコホートＢサルよりもＡＤＬ処置したコホートＣサルの方が、移植後３、６、及び１２ヶ月での循環中のＴｒ１細胞の出現率、ならびに屠殺時のＬＭＮＣ及びＬＮの出現率が顕著に高いことが明らかとなった。また、移植後追跡観察期間全体を通じて、無処置のコホートＢサルよりもＡＤＬ処置したコホートＣサルの方が、循環ナチュラルサプレッサー（ＮＳ）及びＴｒｅｇ細胞のパーセンテージが顕著に高いことも明らかとなった。制御性Ｂ（Ｂｒｅｇ）細胞、Ｂ１０細胞、及びＭＤＳＣも、コホートＢサルよりもコホートＣサルにおいて、移植後追跡観察期間の間、循環中に、顕著により多く存在し、またＭＤＳＣ以外は、屠殺時、肝臓及びＬＮにおいてそうであった。移植後９ヶ月及び１２ヶ月でのコホートＣのＰＢＬにおいて（未改変レシピエントＰＢＬと比較した場合）、Ｔｒｅｇ、Ｂｒｅｇ、及びＴｒ１細胞の枯渇が、ドナーに対するＣＤ４＋Ｔ（４．９倍、２．１倍、及び８．１倍）、ＣＤ８＋Ｔ（５．３倍、４．３倍、及び１１．１倍）、及びＣＤ２０＋Ｂ（３．１倍、３．０倍、及び５．０倍）細胞増殖の増加と関連していた。再検証中に、移植後１２ヶ月で免疫寛容コホートＣレシピエントから選別したＴｒ１細胞を、ベースラインでレシピエントから収集したＰＢＬに加え戻したところ、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ２０＋細胞のドナー特異的増殖が顕著に抑制されたが、第三者ドナーに対する応答によるＴ及びＢ細胞増殖には識別可能な効果がなかった。トランズウェル実験におけるＴｒ１細胞の分離は、ドナー特異的応答の抑制をブロックしなかった。このことは、Ｔｒ１細胞が、可溶性因子を通じて免疫応答を抑制したことを示めす。ｏｎｅ－ｗａｙ ＣＦＳＥＭＬＲアッセイにおける中和化ＩＬ－１０の添加は、ドナー特異的応答の抑制を顕著に抑止したが、対照アイソタイプ抗体ではそうならなかった。
次に、本発明者らは、コホートＢ及びＣのサルにおいて、制御性表現型を持つリンパ系骨髄系細胞の出現率を比較した。無処置のコホートＢサルよりもＡＤＬ処置したコホートＣサルの方が、移植後３、６、及び１２ヶ月での循環中のＴｒ１細胞の出現率、ならびに屠殺時のＬＭＮＣ及びＬＮの出現率が顕著に高いことが明らかとなった。また、移植後追跡観察期間全体を通じて、無処置のコホートＢサルよりもＡＤＬ処置したコホートＣサルの方が、循環ナチュラルサプレッサー（ＮＳ）及びＴｒｅｇ細胞のパーセンテージが顕著に高いことも明らかとなった。制御性Ｂ（Ｂｒｅｇ）細胞、Ｂ１０細胞、及びＭＤＳＣも、コホートＢサルよりもコホートＣサルにおいて、移植後追跡観察期間の間、循環中に、顕著により多く存在し、またＭＤＳＣ以外は、屠殺時、肝臓及びＬＮにおいてそうであった。移植後９ヶ月及び１２ヶ月でのコホートＣのＰＢＬにおいて（未改変レシピエントＰＢＬと比較した場合）、Ｔｒｅｇ、Ｂｒｅｇ、及びＴｒ１細胞の枯渇が、ドナーに対するＣＤ４＋Ｔ（４．９倍、２．１倍、及び８．１倍）、ＣＤ８＋Ｔ（５．３倍、４．３倍、及び１１．１倍）、及びＣＤ２０＋Ｂ（３．１倍、３．０倍、及び５．０倍）細胞増殖の増加と関連していた。再検証中に、移植後１２ヶ月で免疫寛容コホートＣレシピエントから選別したＴｒ１細胞を、ベースラインでレシピエントから収集したＰＢＬに加え戻したところ、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ２０＋細胞のドナー特異的増殖が顕著に抑制されたが、第三者ドナーに対する応答によるＴ及びＢ細胞増殖には識別可能な効果がなかった。トランズウェル実験におけるＴｒ１細胞の分離は、ドナー特異的応答の抑制をブロックしなかった。このことは、Ｔｒ１細胞が、可溶性因子を通じて免疫応答を抑制したことを示めす。ｏｎｅ－ｗａｙ ＣＦＳＥＭＬＲアッセイにおける中和化ＩＬ－１０の添加は、ドナー特異的応答の抑制を顕著に抑止したが、対照アイソタイプ抗体ではそうならなかった。
【0079】
コホートＢ及びＣのサルからフロー選別したＴｒ１細胞で示差的発現遺伝子（ＤＥＧ）を分析することにより、２５８の遺伝子を特定した。ＤＥＧのグループ分けから、免疫細胞シグナル伝達及びミトコンドリア呼吸が、コホートＣの選別Ｔｒ１細胞では、活性される２大生体経路であるが、コホートＢのＲＭではそうではないことが明らかとなった。本発明者らによるＤＥＧのＺスコアのヒートマップ分析から、Ｔｒ１細胞における免疫シグナル伝達中間体の顕著な上方制御は、コホートＣにおいてのみであることが実証された。免疫細胞シグナル伝達のレギュレータ上位３種、すなわち、ＳＨ２Ｄ２、ＸＢＰ１、及びＳＵＭＯ２の関連転写物は、コホートＢと比較した場合、コホートＣのＴｒ１細胞で顕著に上方制御され、このことは、コホートＣのＴｒ１細胞が活性化状態にあったことを示す。本発明者らによるミトコンドリア呼吸をマッピングしたＤＥＧのヒートマップＺスコア分析は、コホートＣのＴｒ１細胞が１エンドでクラスター形成したことを示し、このことは、細胞が、代謝的に非常に活性であったことを実証する。ミトコンドリア呼吸を調節するＮＤＵＳＦファミリーのメンバー、ＮＤＵＦＳ４及びＮＤＵＦＳ５は、コホートＣのＴｒ１細胞で顕著に上方制御された。移植後１２ヶ月で、免疫寛容コホートＣサルから選別されたＴｒ１細胞を、ＳＨ２Ｄ２転写分子を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で処理すると、ドナーに対する応答によるＣＤ４＋（５９％）、ＣＤ８＋（５３％）、及びＣＤ２０＋（８０．５％）細胞の増殖を抑制するＴｒ１細胞の能力が低下した。すなわち、ＡＤＬは、制御性ネットワークを拡大させ、これには独特の免疫細胞シグナル伝達及び代謝プロファイルを呈する抗原特異的Ｔｒ１細胞が関与する。
【0080】
ＡＤＬの寛容原性有効性は、完全ミスマッチＲＭにおいて鈍化するように思われる。完全ミスマッチのコホートＤサルにＡＤＬ注入すると、レシピエント３匹中２匹で、同種移植片機能の長期化を伴った。しかし第三のレシピエントにおいて、移植片は、移植後１２０～１５０日の間に拒絶された。このレシピエントにおいて、ＴＥＭ細胞の増殖は、このレシピエントで抑制されなかった。ＡＤＬ注入後、コホートＤにおける移植後６ヶ月での、Ｔｒｅｇ（１．４倍）及びＴｒ１（０．９８倍）細胞の増殖は、コホートＣサル（２．３倍及び２．１倍、Ｐ＝０．０４）ほど大きくなかった。そのうえ、移植片が拒絶されたコホートＤレシピエントにおいて、ドナー特異的Ｔ細胞の増殖は、抑制されなかった。３カテゴリーのＴｒ１細胞（ＩＬ－１０、腫瘍成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、及びＩＬ－１０プラスＴＧＦ－β二重産生）の出現率は、コホートＢと比べた場合に、コホートＣでは顕著に上昇したが、コホートＤではそうではなかった。長期同種移植片機能を持つコホートＤレシピエント２匹から屠殺時に単離したＴｒ１細胞は、ＣＦＳＥ－ＭＬＲに同じ比で加えた場合に、コホートＣのＴｒ１細胞では＞７５％であったのに比べて、Ｔ及びＢ細胞のドナー反応性増殖を＞４５％低下させた。屠殺時に得られたＰＢＬからＴｒ１細胞が枯渇していたことで、Ｔ及びＢ細胞両方のドナー特異的増殖が≧４５％増加した。したがって、完全ミスマッチＡＤＬの注入もまた、ドナー特異的調節を確立することができる。
【0081】
１つのＤＲＢがマッチしたＡＤＬは、アロ抗原特異的Ｔｒｅｇ及びＴｒ１細胞を増殖させる
本発明者らは、ＭＨＣ－ＩＩ四量体を用いて、自己（共有された）ＭＨＣ－ＩＩならびにミスマッチドナーＭＨＣ－ＩＩ及びＭＨＣ－Ｉペプチドに対する間接的特異性を持つ循環ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットをモニタリングした。ベースラインでは、コホートＢ～Ｄにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの中でこれらのペプチドに対する間接的特異性を持つＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、１．７２±１．２％～５．２３±３．０％で変化した。ベースラインと比較した場合、自己（共有された）ＭＨＣ－ＩＩペプチドに対する間接的特異性を持つ非制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、コホートＢ、Ｃ、及びＤにおいて、移植後に上昇しなかった。対照的に、その特異性を持つＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（最高２．４３±０．３５倍）及びＴｒ１細胞（最高５．４±１．２倍）のベースラインからの持続的な上昇が、コホートＣで生じたが、コホートＢ及びＤでは生じなかった。コホートＤでは、移植後、ミスマッチドナーＭＨＣ－ＩＩペプチドに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞について、非制御性または制御性いずれにしろ、その出現率に変化は観察されなかった。
本発明者らは、ＭＨＣ－ＩＩ四量体を用いて、自己（共有された）ＭＨＣ－ＩＩならびにミスマッチドナーＭＨＣ－ＩＩ及びＭＨＣ－Ｉペプチドに対する間接的特異性を持つ循環ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットをモニタリングした。ベースラインでは、コホートＢ～Ｄにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの中でこれらのペプチドに対する間接的特異性を持つＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、１．７２±１．２％～５．２３±３．０％で変化した。ベースラインと比較した場合、自己（共有された）ＭＨＣ－ＩＩペプチドに対する間接的特異性を持つ非制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、コホートＢ、Ｃ、及びＤにおいて、移植後に上昇しなかった。対照的に、その特異性を持つＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞（最高２．４３±０．３５倍）及びＴｒ１細胞（最高５．４±１．２倍）のベースラインからの持続的な上昇が、コホートＣで生じたが、コホートＢ及びＤでは生じなかった。コホートＤでは、移植後、ミスマッチドナーＭＨＣ－ＩＩペプチドに対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞について、非制御性または制御性いずれにしろ、その出現率に変化は観察されなかった。
【0082】
逆に、コホートＣでは、ミスマッチドナーＭＨＣ－Ｉペプチドに対する特異性を持つ非制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、移植後変化せず、一方でその特異性を持つＴｒｅｇ細胞（最高１．９３±０．４倍）及びＴｒ１細胞（最高３．９±１．２倍）の出現率は上昇した。ミスマッチＭＨＣ－Ｉ特異的非制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現率は、移植後、コホートＢでのみ上昇（１．６±０．９倍）したが、Ｔｒｅｇ及びＴｒ１細胞の相当するサブセットにどのような変化もなかった。まとめると、ＡＤＬは、１つのＭＨＣ－ＩＩがマッチするＲＭにおいて共有された（自己）ＭＨＣ－ＩＩならびにミスマッチＭＨＣ－Ｉペプチドに対する間接的特異性を持つＴｒｅｇ細胞及びＴｒ１細胞を増殖させた。このことは、免疫寛容の誘導及び維持に寄与している可能性が高い。
【0083】
実施例２
バイオマーカーの不在は、移植された膵島機能の喪失と相関する
移植前ドナー特異的免疫応答の鋭敏化またはその存在は、ヒト及び動物モデルにおいて、移植された固形臓器または細胞移植片の長期機能あるいはそれらに対する免疫寛容の誘導を深刻に妨害することが示されている。本発明の前臨床モデルにおいて、ドナー特異的抗体の存在は、移植された膵島の抗体介在型拒絶の加速をもたらした。ドナー特異的抗体が先に存在している非ヒト霊長類において免疫寛容レジメンを投与した後のＴｒ１細胞の存在について、系列末梢血試料を分析した。末梢血試料の分析から、免疫寛容レジメンを投与した結果、移植後（１４日目）のＴｒ１細胞の出現率が、ナイーブ状態で観察されるレベル（平均０．５９±０．２４）より低いレベルに低下すること、及びＴｒ１細胞の増加がこのようになくなることが実証された。Ｔｒ１細胞の増加は、ドナー特異的免疫寛容の誘導に失敗したことを示し、膵島同種移植片の移植片機能の喪失と相関する。図７。
バイオマーカーの不在は、移植された膵島機能の喪失と相関する
移植前ドナー特異的免疫応答の鋭敏化またはその存在は、ヒト及び動物モデルにおいて、移植された固形臓器または細胞移植片の長期機能あるいはそれらに対する免疫寛容の誘導を深刻に妨害することが示されている。本発明の前臨床モデルにおいて、ドナー特異的抗体の存在は、移植された膵島の抗体介在型拒絶の加速をもたらした。ドナー特異的抗体が先に存在している非ヒト霊長類において免疫寛容レジメンを投与した後のＴｒ１細胞の存在について、系列末梢血試料を分析した。末梢血試料の分析から、免疫寛容レジメンを投与した結果、移植後（１４日目）のＴｒ１細胞の出現率が、ナイーブ状態で観察されるレベル（平均０．５９±０．２４）より低いレベルに低下すること、及びＴｒ１細胞の増加がこのようになくなることが実証された。Ｔｒ１細胞の増加は、ドナー特異的免疫寛容の誘導に失敗したことを示し、膵島同種移植片の移植片機能の喪失と相関する。図７。
【0084】
免疫寛容バイオマーカーの喪失は、移植片機能の喪失に先行する
本発明の非ヒト霊長類における前臨床移植モデルにおいて、ＡＤＬ＋ＴＩＳを完全ミスマッチ膵島同種移植片レシピエントに投与したところ、移植後約３００日で移植片機能が喪失する結果となったが、１つのＤＲＢがマッチするレシピエントでの移植は、移植された膵島が無期限（≧３６５日）に生着及び機能する結果となった。レシピエントのこのサブセットにおいて、Ｔｒ１細胞の喪失が移植片機能の喪失に先行するかどうかを試験する目的で、完全ミスマッチ膵島移植片レシピエントから移植前及び移植後に収集した末梢血試料中のＴｒ１細胞の出現率を、フローサイトメトリーで系列的に分析した。１つのＤＲＢがマッチする群と同様に、ＡＤＬ＋ＴＩＳの投与は、９０日目に、Ｔｒ１細胞の出現率の変化倍率に顕著な上昇をもたらし（３．９８±０．９８）、続いて１８０日目に低下し（１．９８±０．７５）、３００日目には、ナイーブ状態で観察されるレベルに達した（１．１９±０．１）。循環Ｔｒ１細胞の出現率の低下は、移植片機能の完全喪失と相関していた。これらの観察結果は、Ｔｒ１細胞の喪失が、免疫寛容バイオマーカーの喪失を示唆するものであり、移植片機能の喪失に約１２０日先行することを、強力に示唆する。図８。
本発明の非ヒト霊長類における前臨床移植モデルにおいて、ＡＤＬ＋ＴＩＳを完全ミスマッチ膵島同種移植片レシピエントに投与したところ、移植後約３００日で移植片機能が喪失する結果となったが、１つのＤＲＢがマッチするレシピエントでの移植は、移植された膵島が無期限（≧３６５日）に生着及び機能する結果となった。レシピエントのこのサブセットにおいて、Ｔｒ１細胞の喪失が移植片機能の喪失に先行するかどうかを試験する目的で、完全ミスマッチ膵島移植片レシピエントから移植前及び移植後に収集した末梢血試料中のＴｒ１細胞の出現率を、フローサイトメトリーで系列的に分析した。１つのＤＲＢがマッチする群と同様に、ＡＤＬ＋ＴＩＳの投与は、９０日目に、Ｔｒ１細胞の出現率の変化倍率に顕著な上昇をもたらし（３．９８±０．９８）、続いて１８０日目に低下し（１．９８±０．７５）、３００日目には、ナイーブ状態で観察されるレベルに達した（１．１９±０．１）。循環Ｔｒ１細胞の出現率の低下は、移植片機能の完全喪失と相関していた。これらの観察結果は、Ｔｒ１細胞の喪失が、免疫寛容バイオマーカーの喪失を示唆するものであり、移植片機能の喪失に約１２０日先行することを、強力に示唆する。図８。
【0085】
上記の明細書及び例は、本発明を十分に開示し及び実現可能なものにするものの、それらは、本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。
【0086】
全ての刊行物、特許、及び特許出願は、本明細書中参照として援用される。上記の明細書において、本発明は、本発明のある特定の実施形態に関して説明されてきており、解説する目的で多くの詳細が記述されてきたものの、当業者には明らかであるだろうが、本発明は、追加の実施形態の影響を受け入れる余地があり、本明細書中記載される詳細のうちある特定のものは、本発明の基本原則から逸脱することなく大幅に変更される可能性がある。
【0087】
「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語ならびに同様な指示語の使用は、本発明を説明する文脈において、本明細書中特に記載がない限りまたは文脈から明白に否定されない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特に記載がない限り、非制限用語（すなわち、「～を含むが、それらに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書中、値の範囲を記述するのは、本明細書中特に記載がない限り、その範囲内に含まれる個別の値それぞれを個々に言及することの簡略的方法の役割を果たすことを意図するにすぎず、個別の値それぞれは、値が本明細書中個別に記述されたかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書中記載される全ての方法は、本明細書中特に記載がない限りまたは文脈から明白に否定されない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書中提供されるありとあらゆる例、または例示する言語（例えば、「ｓｕｃｈ ａｓ」）の使用は、本発明をより良く強調することを意図するにすぎず、特に主張されていない限り、本発明の範囲に制限をかけない。本明細書中の言語で、特許請求の範囲に含まれていないいずれかの要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈すべきものはない。
【0088】
本発明の実施形態は、本発明者らが知る限り本発明を実行するのに最適の態様のものを含めて、本明細書中記載される。これら実施形態の改変形態は、上記の説明を読むことで、当業者に明らかとなると思われる。本発明者らは、当業者がそのような改変形態を適宜採用することを期待し、また本発明者らは、本発明が本明細書中具体的に記載されるものとは異なるようにして実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用される法律が許すとおりに、本明細書に添付される特許請求の範囲において記述される発明対象の全ての修飾及び等価物を包含する。そのうえ、本明細書中特に記載がない限りまたは文脈から明白に否定されない限り、上記要素の任意の組み合わせが、それらの全ての可能な改変形態において、本発明に包含される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】