特許 7614648 バチルス・ハロサッカロボランス株、それを含む組成物、およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-07

(45)【発行日】2025-01-16

(54)【発明の名称】バチルス・ハロサッカロボランス株、それを含む組成物、およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20250108BHJP

   A01N 25/04 20060101ALI20250108BHJP

   A01N 63/22 20200101ALI20250108BHJP

   A01P 5/00 20060101ALI20250108BHJP

   A01P 7/04 20060101ALI20250108BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

A01N25/04 102

A01N63/22

A01P5/00

A01P7/04

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2021549602

(86)(22)【出願日】2020-03-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-18

(86)【国際出願番号】 EP2020055801

(87)【国際公開番号】W WO2020178368

(87)【国際公開日】2020-09-10

【審査請求日】2023-02-28

(31)【優先権主張番号】19382164.2

(32)【優先日】2019-03-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【微生物の受託番号】CECT  CECT 9165

(73)【特許権者】

【識別番号】519345852

【氏名又は名称】フツレコ バイオサイエンス，エセ．ア．

【氏名又は名称原語表記】ＦＵＴＵＲＥＣＯ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ，Ｓ．Ａ．

【住所又は居所原語表記】Ｐｏｌｉｇｏｎｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓａｎｔ Ｐｅｒｅ Ｍｏｌａｎｔａ，Ａｖｄａ．ｄｅｌ Ｃａｄｉ １９－２３，０８７９９ ＯＬＥＲＤＯＬＡ（ＥＳ）

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ララ サンチェス，ホセ マニュエル

(72)【発明者】

【氏名】フェルナンデス カスティリョ，カロリナ

【審査官】坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０６１８７６１４（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０６４９５８２７（ＣＮ，Ａ）

【文献】Metabacillus halosaccharovorans strain 18JY1-1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence [online]，2018年，Retrieved from Genbank on 2024.2.29，Accession No. MH497631

【文献】Metabacillus halosaccharovorans strain FJAT-46987 16S ribosomal RNA gene, partial sequence [online]，2017年，Retrieved from Genbank on 2024.2.29，Accession No. MG651593

【文献】Metabacillus halosaccharovorans strain MER_TA_181 16S ribosomal RNA gene, partial sequence [online]，2015年，Retrieved from Genbank on 2024.2.29，Accession No. KT719583

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８

Ａ０１Ｎ ６３／００－６３／６０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

受託番号ＣＥＣＴ９１６５で「Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ」（ＣＥＣＴ）に寄託されたバチルス・ハロサッカロボランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｓａｃｃｈａｒｏｖｏｒａｎｓ）の菌株。

【請求項2】

請求項１に記載の菌株を含む、細菌培養物。

【請求項3】

請求項１に記載のバチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株、または請求項２に記載の細菌培養物の有効量と、植物強化剤、栄養素、湿潤剤、付着性を改善する化合物、緩衝化合物、安定剤、酸化防止剤、浸透圧保護剤および日焼け止め剤からなる群から選択される１または複数の農業的に許容される化合物とを含む、組成物。

【請求項4】

前記菌株が１０^５ＣＦＵ／ｍｌ～１０^１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

油性懸濁（ｏｉｌ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）製剤として製剤化されている、請求項３または４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

油性成分、有機エステルおよびシリカを含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

少なくとも１種の追加の農薬を含む、請求項３から６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

請求項１に記載のバチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株に由来する生細胞懸濁液を得るための方法であって、（ｉ）前記菌株を培地に接種すること、および（ｉｉ）工程（ｉ）の接種された培地を前記菌株の増殖に適した条件に供すること、を含む方法。

【請求項9】

更に、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた前記培地を濃縮工程に供することを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

植物における線虫および／またはアブラムシ感染を防除するための、請求項１に記載のバチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株、請求項２に記載の細菌培養物、または請求項３から７のいずれか一項に定義される組成物の使用。

【請求項11】

植物において線虫および／またはアブラムシによって引き起こされる感染を防除する方法であって、請求項１に記載のバチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株、または請求項３から７のいずれか一項に定義される組成物を、植物の一部または前記植物を成長させるために使用される基質に施用することを含む、方法。

【請求項12】

線虫が、メロイドギン（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属およびグロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）属から選択される、請求項１０に記載の使用、または請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

線虫が、メロイドギン・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、メロイドギン・ヤバニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）、グロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）およびグロボデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用。

【請求項14】

アブラムシがアフィス（Ａｐｈｉｓ）属のものである、請求項１０に記載の使用、または請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

アブラムシがアフィス・ゴシピイである、請求項１４に記載の使用。

【請求項16】

請求項１に記載のバチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株、請求項２に記載の細菌培養物、または請求項３から７のいずれか一項に定義される組成物の有効量を含む、キット。

【請求項17】

植物において線虫および／またはアブラムシによって引き起こされる感染を防除するための、請求項１６に記載のキットの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月５日に出願の欧州特許出願第１９３８２１６４．２号明細書の利益を主張するものである。

【0002】

本発明は、植物衛生製品の分野に関する。本発明は、微生物バチルス・ハロサッカロボランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｓａｃｃｈａｒｏｖｏｒａｎｓ）の新規な単離株、それを含む組成物、ならびに植物において寄生性線虫およびアブラムシによって引き起こされる疾患の生物学的防除におけるそれらの使用を提供する。

【背景技術】

【0003】

植物寄生性線虫および昆虫は、作物および園芸作物に経済的に重大な損傷を引き起こし、それらが根絶されない場合、農業収量を著しく減少させ、収穫量を減少させる。

【0004】

植物寄生性線虫は、ジャガイモ、テンサイおよびトマト作物などの作物植物の根系に感染する。寄生性線虫には、ネコブセンチュウ、例えばメロイドギン（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属；グロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）属などのシストセンチュウ；およびプラチレンクス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属などのネグサレセンチュウが含まれる。

【0005】

穿刺吸引性の昆虫であるアブラムシは、その口部を内部に（柄、葉または根に）挿入することによって植物の樹液を摂取する。これらは、ほとんどすべての植物種を攻撃する。損傷は、通常、葉の下側に現れる黄色がかった斑点状の変色の形態で見ることができ、これがその後乾燥して死滅する。いくつかのアブラムシ種は、虫こぶを形成するか、葉を巻き取るかまたは変形させる。茎または枝などの植物の他の部分に定着したアブラムシは、成長を遅らせ、急速な葉の喪失または枝の死を引き起こし得る。アブラムシはまた、多数のウイルス性疾患のキャリアである。

【0006】

最も一般的に使用される線虫およびアブラムシの管理戦略は化学的防除であるが、それは効果的ではあるが、土壌汚染の問題につながり、生物多様性に影響を及ぼし、ヒトの健康に悪影響を及ぼす可能性がある。

【0007】

過去数十年にわたって、研究者らは、非化学的かつ環境に優しいアプローチの開発を試みてきた。植物線虫の防除に関連して、メロイドギン・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）に対する特定の細菌株の殺線虫活性が報告されている（例えば、非特許文献１）。バチルス属の細菌を含む植物線虫を防除するための市販製品、例えば、ＢｉｏＮｅｍ－ＷＰ／ＢｉｏＳａｆｅ（Ｂ．フィルムス（Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ））、ＢｉｏＹｉｅｌｄ（Ｂ．ベレゼンシス（Ｂ．ｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）およびＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｎｅｍｉｘ（バチルス属菌種）、ＶＯＴｉＶＯ（登録商標）（Ｂ．フィルムス）およびＰａｔｈｗａｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉａ（登録商標）（Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトマイセス属菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）およびトリコデルマ属菌種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．））が開発されている。残念なことに、細菌株を使用して先行技術で報告された殺線虫効果は、特定の作物植物および特定の寄生性線虫に限定される。

【0008】

特定の細菌はまた、例えばバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）殺ダニ毒素またはこの毒素を含むトランスジェニック植物を使用することによって、アブラムシ科のメンバーに対して使用されている（特許文献１）。

【0009】

環境条件および宿主条件が細菌株の生物学的活性に影響を及ぼし、その有効性を一般的に変動させ、参照化学製品よりも有意に低くすることを指摘することが重要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【文献】国際公開ＷＯ９４／０４６８４号パンフレット

【非特許文献】

【0011】

【文献】Ｘｉａｎｇ Ｎ ｅｔ ａｌ．‘Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ ｂｙ Ｓｐｏｒｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎ Ｃｏｔｔｏｎ’ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１７（１０１）７７４－７８４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

したがって、努力にもかかわらず、線虫およびアブラムシに対して広い作用スペクトルを有する細菌株が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0013】

驚くべきことに、本発明者らは、活性を有する農薬であるバチルス・ハロサッカロボランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｓａｃｃｈａｒｏｖｏｒａｎｓ）種の１つの菌株（以下、「細菌株Ｂ４１０」とも称される）が、ネコブセンチュウおよびシストセンチュウなどの植物寄生性線虫に対して、さらにアブラムシ昆虫に対しても活性を有することを見出した。

【0014】

以下に示すように、本発明の菌株は、増殖チャンバおよび温室試験で試験されており、トマト植物におけるネコブセンチュウ（ＲＫＮ）のメロイドギン・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）およびメロイドギン・ジャバニカス（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）ならびにジャガイモシストセンチュウ（ＰＣＮ）のグロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）およびグロボデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）に対して、線虫防除の点で効率的であることが実証されている。ＲＫＮ卵孵化阻害に関して、試験した線虫に対する本発明の株のインビトロ有効性が、参照殺線虫化学物質オキサミルを用いて達成されたもの（図２）よりも良好であったこと、または別の参照殺線虫化学物質フェナミホスを用いて達成されたもの（図１）と同様であったことは注目に値する。ＲＫＮの幼虫では、生存に関するインビトロ有効性は、フェナミホスによって示された有効性と同様であった（図３）。

【0015】

この抗線虫効果は、植物あたりの卵の最終個体数およびＲＫＮの繁殖を測定する線虫防除に関して、インビボでも検出された。これは、いくつかの形態：ペレット（実施例５．１）として、農薬原体（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）（ＴＧＡＩ）（実施例５．２）として、およびプロトタイプ製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）（油性懸濁剤（ｏｉｌ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ））（実施例５．３）として、本発明の細菌を使用して達成された。

【0016】

ジャガイモシストセンチュウに関連して、本発明の細菌株はまた、処理終了時に卵孵化の阻害パーセントがほぼ１００％であることを示した（図４および図５）。

【0017】

抗線虫効果に加えて、本発明の菌株は、アブラムシのアフィス・ゴシピイ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）に対する殺虫剤としても有効であることが示されている。以下に示すように、Ｂ４１０株は、ＴＧＡＩとして作用して、アブラムシのアフィス・ゴシピイの有意な死亡率を達成した（図６および図７）。

【0018】

これらの実験データから、本発明の細菌株は、線虫およびアブラムシを防除する二重の効果を有すると結論付けることができた。このような特定の二重効果を有するＢ．ハロサッカロボランスの菌株が報告されたのはこれが初めてである。さらに、それがインビトロで参照化学物質と比較してより良い効果を有することは驚くべきことである。

【0019】

さらに、このような顕著な活性プロファイルに対して、本発明の菌株は、マウスにおいてインビボで急性経口毒性を示さないことも見出された。結果は、動物が目に見える臨床的有害作用を有さず、病原性の感染性が見られないことを示した。

【0020】

本発明者らはさらに、同定された菌株が中温性（ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ）、好中性性（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、耐塩性および強いバイオフィルム産生性であることを見出した。耐塩性微生物は、乾燥地帯の農業地域などの地域に施用可能であり、土壌塩分の影響を受ける、または塩水のみが利用可能な地域の農業生産性を高めることができるため、農業上かなり重要である。さらに、多くの環境ストレス要因は浸透圧変化を伴うかまたは誘発する。したがって、耐塩性は有利な特徴である。Ｂ４１０は強力なバイオフィルム産生株であり、これは好ましくない環境下での微生物のコロニー形成および生存に際して重要な特徴である。

【0021】

したがって、本発明の菌株は、細菌の影響を受けやすい植物の成長に有益である。

【0022】

線虫および／または昆虫感染を防除するための本発明の菌株の使用は、環境に優しい。

【0023】

全体として、本発明の菌株は、バイオ農薬の分野における大きな進歩を意味する。

【0024】

したがって、本発明の第１の態様は、受託番号ＣＥＣＴ９１６５で「Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ」（ＣＥＣＴ）に寄託されたバチルス・ハロサッカロボランスの菌株、または出発材料としてバチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５を使用して得られ、ＣＥＣＴ９１６５の殺線虫効果および殺アブラムシ効果を維持するその変異体を指す。

【0025】

本発明では、本発明の菌株を指す「Ｂ４１０」と「ＣＥＣＴ９１６５」という用語は同義に使用される。

【0026】

本発明の菌株はアルメリア（スペイン）の農業土壌から単離され、ブダペスト条約に従って、受託番号ＣＥＣＴ ９１６５で、Ｅｄｉｆｉｃｉｏ ３ ＣＵＥ，Ｐａｒｃ Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｖａｌｅｎｃｉａ Ｃ．Ｐ ４６９８０ Ｃａｔｅｄｒａｔｉｃｏ Ａｇｕｓｔｉｎ Ｅｓｃａｒｄｉｎｏ Ｎ°９ Ｐａｔｅｒｎａ，Ｖａｌｅｎｃｉａ（Ｓｐａｉｎ）のＣＥＣＴに寄託された。これは、寄託者Ｆｕｔｕｒｅｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｓ．Ａ．，Ａｖ．Ｄｅｌ Ｃａｄｉ １９－２３ Ｐ．ｌ．Ｓａｎｔ Ｐｅｒｅ Ｍｏｌａｎｔａ ０８７９９ Ｏｌｅｒｄｏｌａ Ｂａｒｃｅｌｏｎａによって、２０１６年７月１３日に寄託された。この菌株は寄託者によって参照番号Ｂ４１０として同定され、受託番号ＣＥＣＴ９１６５を与えられた。さらに、それは生存可能であると宣言された。

【0027】

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様で定義される菌株を含む細菌培養物を指す。

【0028】

本発明の菌株の農薬効果により、これは植物衛生製品として使用することができる。以下の実施例に例示するように、本発明の第１の態様の菌株は、国際連合食糧農業機関（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ）によって発行されたガイドラインであるＦＡＯガイドラインに従って植物衛生製品として使用することができる。本発明の第１の態様で定義される単離細菌は、植物衛生組成物の成分として使用することができる。

【0029】

したがって、本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様で定義される菌株または本発明の第２の態様で定義される細菌培養物の有効量と、１または複数の農業的に許容される化合物とを含む組成物を指す。

【0030】

本発明の第４の態様は、バチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株の変異体を得る方法であって、寄託された菌株を出発材料として使用すること、および突然変異誘発を適用することを含み、得られた変異体が、植物における線虫およびアブラムシ感染を防除する親寄託株の活性を維持する方法を指す。

【0031】

本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様のＢ．ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株またはその変異体に由来する生細胞懸濁液を得るための方法であって、（ｉ）菌株を培地に接種すること、（ｉｉ）工程（ｉ）の接種された培地を菌株の増殖に適した条件に供すること、および（ｉｉｉ）場合により、工程（ｉｉ）から得られた培地を濃縮工程に供すること、を含む方法を指す。

【0032】

Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株によって示された植物寄生性線虫およびアブラムシに対する二重活性を、Ｂ．ハロサッカロボランスの他の株に外挿することができた。

【0033】

したがって、本発明の第６の態様は、植物における線虫および／または昆虫感染を防除するための、殺線虫効果および殺虫効果を有するバチルス・ハロサッカロボランスの単離株の使用を指す。

【0034】

本発明の第７の態様は、植物において線虫および/または昆虫によって引き起こされる感染を防除する方法であって、殺線虫効果および殺虫効果を有するバチルス・ハロサッカロボランスの菌株を、植物の一部またはこの植物の栽培に使用される基質に施用することを含む方法を指す。

【0035】

本発明の第８の態様は、本発明の第１の態様の菌株、または本発明の第２の態様の細菌培養物、または本発明の第３の態様の組成物の有効量を含むキットに関する。

【0036】

本発明の第９の態様は、植物における線虫感染および/またはアブラムシ感染を防除するための、本発明の第８の態様のキットの使用に関する。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】メロイドギン・ヤバニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）およびＭ．インコグニタ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）の卵に対する、Ｂ．ハロサッカロボランス（Ｂ．ｈａｌｏｓａｃａｒｏｖｏｒａｎｓ）Ｂ４１０株およびＮｅｍａｃｕｒ（登録商標）（「化学物質」）のインビトロ殺線虫活性の比較を示す図である。

【図2】Ｍ．ヤバニカ（Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ）およびＭ．インコグニタの卵に対する、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株およびＶｙｄａｔｅ（登録商標）（「化学物質」）のインビトロ殺線虫活性の比較を示す図である。

【図3】Ｍ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの幼虫（Ｊ２）に対する、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株およびＶｙｄａｔｅ（登録商標）（「化学物質」）のインビトロ殺線虫活性の比較を示す図である。

【図4】グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダの卵に対する、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビトロ殺線虫活性を示す図である。

【図5】参照化学物質（Ｖｙｄａｔｅ（登録商標））と比較した、グロボデラ・ロストキエンシスの卵に対するＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビトロ殺線虫活性を示す図である。

【図6】他の細菌株による処理と比較した、実験室条件で記録されたアブラムシ生存パーセントを示す図である。

【図7】実験室条件下での処理後４８時間および９６時間のアブラムシ防除についての、他の細菌株の有効性と比較したＢ４１０の有効性のパーセントを示す図である。 すべての図において、異なる文字（「ａ」または「ｂ」）で表されたデータは、それらの間に統計学的有意差があったことを示す（データを、Ｒプログラムを使用して分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供した；Ｐ＝０．０５でフィッシャーの制約付最小有意差検定（ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｓｔ）（ＬＳＤ）を用いて処置手段を比較した）。「対照」：陰性対照。「卵孵化率（％）」：卵孵化のパーセント。

【発明を実施するための形態】

【0038】

発明の詳細な説明
本出願において本明細書で使用されるすべての用語は、特に明記しない限り、当技術分野で公知の通常の意味で理解されるものとする。本出願で使用される特定の用語の他のより具体的な定義は以下に示すとおりであり、特に明示的に述べた定義がより広い定義を提供しない限り、本明細書および特許請求の範囲全体を通して一律に適用されることを意図している。本明細書で与えられる定義は、理解の目的のために含まれ、説明、特許請求の範囲および図面を通して適用されることが期待される。

【0039】

本発明の第１の態様は、受託番号ＣＥＣＴ９１６５で「Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ」（ＣＥＣＴ）に寄託されたバチルス・ハロサッカロボランスの単離株、またはバチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５を使用して得られ、ＣＥＣＴ９１６５の殺線虫効果および殺アブラムシ効果の両方を維持するその変異体。

【0040】

本発明の第１の態様の特定の実施形態では、任意選択で下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、バチルス・ハロサッカロボランスの単離株は、受託番号ＣＥＣＴ９１６５で「Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ（ＣＥＣＴ）」に寄託されたＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０株である。

【0041】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、この菌株は、出発株の殺線虫効果および殺アブラムシ効果を維持する、ＣＥＣＴ９１６５株の変異体である。

【0042】

ＣＥＣＴ９１６５株の「変異体」という用語は、また、ＣＥＣＴ９１６５株の「変種」としても本発明により理解される。

【0043】

寄託株を出発材料として使用することにより、当業者は、突然変異誘発または細菌組換え技術などの遺伝子工学技術によって、本発明の菌株の本明細書に記載の関連する特徴および利点を維持する変異体を日常的に得ることができる。本発明の一実施形態では、変異体は、ランダム突然変異誘発（すなわち、化学的または物理的な薬剤を使用すること）によって、または部位特異的突然変異誘発、コンビナトリアル突然変異誘発もしくは挿入突然変異誘発によって得られた遺伝子改変突然変異体である。本発明の第１の態様の別の実施形態では、変異体は、組換え技術、例えば形質転換（例えば、エレクトロポレーション、ヒートショックによって、または塩化カルシウムなどの二価カチオン溶液を使用することによって）、形質導入または接合技術を使用することによって得られる。組換え技術を使用することにより、プラスミドを細菌株に含めることができる。プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子または変異体の選択に役立つ遺伝子を含み得る。遺伝子工学技術の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｈａｐｔｅｒ１３，“Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，３ｒｄ Ｅｄ，２００１に見出すことができる。

【0044】

上述のように、本発明によって提供される変異体は、ＣＥＣＴ９１６５株によって示される二重効果、すなわち抗線虫活性および抗アブラムシ活性を維持しなければならない。本発明において、用語「維持する」は、変異体に言及する場合、抗線虫活性および抗アブラムシ活性の両方を示さなければならないことを意味する。当然のことながら、菌株における突然変異の結果として、本発明によって包含される得られた変異体は、ＣＥＣＴ９１６５株よりも効率的に両方の活性を示すことができる。

【0045】

変異体が抗線虫および抗アブラムシとして二重プロファイルを維持するかどうかを決定するために、いくつかの周知のプロトコルに従うことができる。これらの方法は、一般に、菌株と接触している病原体の増殖能力の分析、または該菌株への曝露後の病原体感染によって引き起こされる疾患の重症度の評価に基づく。活性を決定するための本明細書の実施例に含まれるプロトコルは、例示的かつ非限定的な例である。手短に言えば、それらは、インビトロでの線虫の卵孵化および線虫の生存、ならびにインビボでの線虫の繁殖分析に基づく。

【0046】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、バチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株の変異体は、バチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株と少なくとも９９．８％（９９．８％または９９．９％）のゲノム配列同一性を有する。

【0047】

本発明において、「同一性」という用語は、配列が最適にアラインメントされたときに２つの配列において同一である残基のパーセンテージを指す。最適なアラインメントにおいて、第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められている場合、配列は、その位置に関して同一性を示す。２つの配列間の同一性のレベル（または「配列同一性パーセント」）は、配列のサイズに対して配列が共有する同一の位置の数の比として測定される（すなわち、配列同一性パーセント＝（同一の位置の数／位置の総数）×１００）。

【0048】

最適なアラインメントを迅速に得て、２つ以上の配列間の同一性を計算するためのいくつかの数学的アルゴリズムが公知であり、いくつかの利用可能なソフトウェアプログラムに組み込まれている。そのようなプログラムの例としては、とりわけ、アミノ酸配列分析のためのＭＡＴＣＨ－ＢＯＸ、ＭＵＬＴＡＩＮ、ＧＣＧ、ＦＡＳＴＡおよびＲＯＢＵＳＴプログラムが挙げられる。好ましいソフトウェア分析プログラムには、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、およびＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ２．１、ＢＬ２ＳＥＱおよびそれらの後期バージョン）が含まれる。

【0049】

アミノ酸配列分析のために、ＢＬＯＳＵＭ行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ５０、ＢＬＯＳＵＭ６２およびＢＬＯＳＵＭ８０行列）、Ｇｏｎｎｅｔ行列、またはＰＡＭ行列（例えば、ＰＡＭ３０、ＰＡＭ７０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ１６０、ＰＡＭ２５０、およびＰＡＭ３５０行列）などの重み行列を同一性の判定に使用することができる。

【0050】

ＢＬＡＳＴプログラムは、選択された配列をデータベース（例えば、ＧｅｎＳｅｑ）内の複数の配列に対して、またはＢＬ２ＳＥＱを用いて２つの選択された配列間でアラインメントすることによって、少なくとも２つの配列の分析を提供する。ＢＬＡＳＴプログラムは、好ましくはＢＬＡＳＴプログラム動作に統合される、ＤＵＳＴまたはＳＥＧプログラムなどの低複雑度フィルタリングプログラムによって改変されることが好ましい。ギャップ存在コスト（またはギャップスコア）が使用される場合、ギャップ存在コストは、好ましくは約－５～－１５の間に設定される。同様のギャップパラメータは、必要に応じて他のプログラムと共に使用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびその基礎となる原理は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ”，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，ｖ．２１５，ｐａｇｅｓ４０３－４１０にさらに記載されている。

【0051】

多重配列分析には、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムを用いることができる。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムは、「動的」（「ｆａｓｔ」に対して）設定を使用して実行されることが望ましい。配列は、配列間の同一性のレベルに応じてＢＬＯＳＵＭ行列の可変セットを使用して評価される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムおよび基本的な動作原理は、例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ”，１９９２，ＣＡＢＩＯＳ，８（２），ｐａｇｅｓ１８９－１９１にさらに記載されている。

【0052】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、バチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株の変異体は、バチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株と少なくとも９９．８％（９９．８％または９９．９％）の平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）を有する。

【0053】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の変異体のＡＮＩを決定する方法は、Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．２０１５ ＪＳｐｅｃｉｅｓＷＳ：ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｉｒｃｕｍｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐａｉｒｗｉｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１５ Ｎｏｖ１６．ｐｉｉ：ｂｔｖ６８１に記載されている方法「ＡＮＩｍ」である。

【0054】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の菌株の変異体、例えばバチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株と少なくとも９９．８％のゲノム配列同一性を有する変異体を得る方法は、Ａｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｇｒａｍ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ” Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１４；１１９７：３１１－２７に記載されている突然変異誘発方法である。

【0055】

本発明の第１の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、殺線虫効果は、少なくともメロイドギン属およびグロボデラ属の線虫に対するものである。別の実施形態では、殺線虫効果は、メロイドギン・インコグニタ、メロイドギン・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダの１つまたは複数に対するものである。別の実施形態では、本発明の第１の態様で定義される菌株は、メロイドギン・インコグニタ、メロイドギン・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダに対して殺線虫効果を有する。

【0056】

本発明の第１の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の第１の態様で定義される菌株は、少なくともアブラムシ上科に対して殺虫効果を有する。別の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の第１の態様で定義される菌株は、少なくともアブラムシ科に対して殺虫効果を有する。別の実施形態では、本発明の第１の態様で定義される株は、アフィス・ゴシピイに対して殺虫効果を有する。

【0057】

本発明の第１の態様の別の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の第１の態様で定義される菌株は、メロイドギン・インコグニタ、メロイドギン・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダに対して殺線虫効果を有し、殺アブラムシ効果はアフィス・ゴシピイに対するものである。

【0058】

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様で定義される菌株を含む細菌培養物を指す。

【0059】

本発明の第２の態様の一実施形態では、細菌培養物は、本発明の第１の態様で定義される生存可能な菌株を含む。

【0060】

本発明の第２の態様の別の実施形態では、細菌培養物は、不活性化された本発明の菌株を含む。

【0061】

「不活性化」という用語は、微生物がコロニーを形成することができないことを意味する。一実施形態では、不活性化微生物は、細胞膜が無傷であるか、または破壊されている。

【0062】

本発明の第２の態様の一実施形態では、細菌培養物は接種製品である。

【0063】

「接種製品」とは、菌株を適切な培地に接種し、接種した培地を適切な増殖条件に供した後に得られる製品と理解される。

【0064】

本発明の第２の態様の別の実施形態では、本発明の菌株を含む接種製品が不活性化される。

【0065】

「不活化された本発明の菌株を含む接種製品」とは、該菌株を適切な培地に接種し、接種した培地を適切な増殖条件に供し、次いでこの菌株を不活化した後に得られる製品を指す。

【0066】

有害生物防除における実用的な使用を目的として、農薬剤は通常、農業的に許容される化合物も含む組成物に製剤化される。したがって、本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様で定義される菌株または本発明の第２の態様で定義される細菌培養物の有効量と、１つまたは複数の農業的に許容される化合物とを含む組成物を指す。

【0067】

本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の利益、線虫およびアブラムシの防除をもたらすのに十分高いが、重篤な副作用を回避するのに十分低い活性薬剤（成分；すなわち、細菌株、本発明においては、Ｂ．ハロサッカロボランスＣＥＣＴ９１６５株またはその変異体である）の量を意味する。

【0068】

本発明の第３の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、菌株は１０^５ｃｆｕ／ｍｌ～１０^１２ｃｆｕ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の第３の態様の別の実施形態では、菌株は、１０^５ｃｆｕ／ｍＬ、１０^６ｃｆｕ／ｍＬ、１０^７ｃｆｕ／ｍＬ、１０^８ｃｆｕ／ｍＬ、１０^９ｃｆｕ／ｍＬ、１０^１０ｃｆｕ／ｍＬ、１０^１１ｃｆｕ／ｍＬまたは１０^１２ｃｆｕ／ｍＬの濃度で存在する。

【0069】

本発明の目的のために、任意の所与の範囲は、その範囲の下限および上限の両方の終点を含む。

【0070】

ｃｆｕ／用量として示される量は、用量あたりの本発明の菌株のコロニー形成単位（ＣＦＵ）に関する。ｃｆｕ／ｍＬとして示される量は、ミリリットルあたりの本発明の菌株のコロニー形成単位に関する。

【0071】

本明細書で使用される「有効量」という用語は、植物疾患の治療または予防のいずれかの所望の利益を提供するのに十分高いが、重篤な副作用を回避するのに十分低い、本発明の第１の態様で定義されるＢ．ハロサッカロボランスＣＥＣＴ９１６５株の量を意味する。本発明に従って投与される化合物の特定の用量は、当然のことながら、投与される化合物、投与経路、治療される特定の状態、および同様の考慮事項を含む、症例を取り巻く特定の状況によって決定される。

【0072】

本発明の第３の態様の別の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、組成物は植物衛生組成物である。

【0073】

本発明の第３の態様の別の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、農業的に許容される化合物は、植物強化剤、栄養素、湿潤剤、付着性を改善する化合物、緩衝化合物、安定剤、酸化防止剤、浸透圧保護剤および日焼け止め剤からなる群から選択される。

【0074】

本発明の第３の態様の別の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、組成物は、少なくとも１種の追加の農薬を含む。

【0075】

本発明の第３の態様の別の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、追加の農薬は、農薬特性を有する別の細菌株、殺真菌剤、殺菌剤、除草剤、化学殺虫剤または化学殺線虫剤からなる群から選択される。追加の農薬は、組成物に含まれる本発明の菌株の活性/生存率に悪影響を及ぼしてはならない。

【0076】

本発明において、「農薬」という用語は、有害生物と見なされる生物の殺滅、忌避、調節または成長の妨害を意図した製品としての、農学の分野におけるその通常の意味によって理解される。明らかに、Ｂ．ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株またはその変異体の性質のために、本明細書では、「農薬」は生物農薬とも呼ばれる生物学的または生態学的（有機）農薬であると理解される。本発明の範囲において、「農薬」という用語は、「植物衛生」という用語と同じ意味を有する。

【0077】

本発明の第３の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、溶液、ペレット、懸濁液、凍結乾燥組成物または他の乾燥組成物（例えば、フリーズドライ組成物）の形態であり得る。凍結乾燥または乾燥された組成物は、その使用前に液体担体で再構成するか、または直接使用することができる。組成物は、植物衛生用途に適した様々な製剤に従って調製することができ、例えば、以下のタイプの製剤からなる群から選択される：希釈なしでの使用を意図とした液体（ＡＬ）、希釈なしでの使用を意図とした粉末（ＡＰ）、カプセル化粒剤（ＣＧ）、接触性の液体またはゲル（ＣＬ）、接触性粉末（ＣＰ）、散粉性粉末（ｐｏｗｄｅｒｉｎｇ ｐｏｗｄｅｒ）（ＤＰ）、乳剤（ＥＣ）、乳化性粒剤（ＥＧ）、油型エマルジョン（ＥＯ）、水型エマルジョン（ＥＷ）、細粒剤（ＦＧ）、大型粒剤（ＧＧ）、乳化性ゲル剤（ＧＬ）、噴霧用粉末（ＧＰ）、粒剤（ＧＲ）、グリース（ＧＳ）、水溶性ゲル（ＧＷ）、マイクロエマルジョン剤（ＭＥ）、微粒剤（ＭＧ）、水希釈用濃縮懸濁液（ＯＦ）、油性懸濁剤（ｏｉｌ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）（ＯＤ）、水混和性懸濁剤（ＯＬ）、油に分散させるための粉末（ＯＰ）、ゲルまたはペースト状の濃縮物（ＰＣ）、スティック（農業用医薬用途）（ＰＲ）、濃縮懸濁剤（ＳＣ）、サスポエマルジョン製剤（ＳＥ）、水溶性粒剤（ＤＧ）、液剤（ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）（ＳＬ）、フィルム形成油（ＳＯ）、水溶剤（ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒ）（ＳＰ）、水溶性錠剤（ＳＴ）、錠剤（ＴＢ）、顆粒水和剤（ｗａｔｅｒ－ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｌｅ ｇｒａｎｕｌｅｓ）（ＷＧ）、水和剤（ｗｅｔｔａｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒ）（ＷＰ）、水分散性錠剤（ＷＴ）（２つの大文字からなるコードは植物衛生製剤の国際コードに対応している）。

【0078】

本発明の第３の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、組成物は油性懸濁（ＯＤ）組成物である。

【0079】

本発明の第３の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、組成物はＯＤ製剤であり、本発明の第１の態様で定義される菌株を１０^５～１０^１２ＣＦＵ／ｍＬ（１０^５ｃｆｕ／ｍＬ、１０^６ｃｆｕ／ｍＬ、１０^７ｃｆｕ／ｍＬ、１０^８ｃｆｕ／ｍＬ、１０^９ｃｆｕ／ｍＬ、１０^１０ｃｆｕ／ｍＬ、１０^１１ｃｆｕ／ｍＬまたは１０^１２ｃｆｕ／ｍＬ）の範囲の濃度で含む。

【0080】

本発明の第３の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、組成物はＯＤ製剤であり、本発明の第１の態様で定義される菌株を１０^９ＣＦＵ／ｍＬの濃度で含む。

【0081】

本発明の第３の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、組成物はＯＤ製剤であり、本発明の第１の態様で定義される菌株を１．０×１０^５～１．０×１０^１２ＣＦＵ／ｍＬの範囲の濃度で含み、油性成分をさらに含み、該油性成分は、一実施形態では植物油であり、別の実施形態ではダイズ油または大豆油（ｓｏｙ ｏｉｌまたはｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ）である。

【0082】

本発明の第３の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、組成物はＯＤ製剤であり、本発明の第１の態様で定義される菌株を１．０×１０^５～１．０×１０^１２ＣＦＵ／ｍＬの範囲の濃度含み、油性成分、有機エステルおよびシリカをさらに含む。別の実施形態では、油性成分は植物油であり、別の実施形態では、ダイズ油である。別の実施形態では、大豆油が６９％であり、有機エステル（例えば、エトキシル化脂肪酸のエステル）が２０％であり、シリカが１％であり、菌株がＴＧＡＩとして１０％である。

【0083】

「農業的に許容される化合物」とは、農業での使用に適した化合物および/または材料を指す。一般に、この化合物はヒトに対して非毒性であるべきであり、好ましくは環境に優しくあるべきである。

【0084】

本発明の第３の態様の特定の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の組成物は、処理される植物における菌株の付着を改善するための化合物、ならびに植物強化剤化合物、栄養素、湿潤剤、安定剤、浸透圧保護剤、酸化防止剤、日焼け止め剤、緩衝化合物またはそれらの組み合わせを含有し得る。

【0085】

付着製品の例は、ゼラチン、デンプン、ペクチン、アルギネートおよびキサンタンなどの様々な種類のガムである。これらの化合物の多くは湿潤剤でもある。日焼け止め剤の場合、コンゴーレッド、炭酸カルシウムおよびワックスエマルジョンを使用することができる。植物強化剤は、作物に病原体または有害な環境条件に対する堅牢性または耐性を発達させるのを容易にすることができる化合物であり、例えば、ジャスモン酸類似体およびいくつかの植物防御刺激剤、例えば、ハルピン、キトサンおよびラミナリンである。さらに、浸透圧保護剤の例は、トレハロース、ベタインおよびアミノ酸である。最後に、アスコルビン酸およびグルタチオンが酸化防止剤の中に含まれる。

【0086】

本発明の第３の態様の組成物は、通常のプロトコルによって、例えばさまざまな成分を混合することによって調製することができる。

【0087】

本発明の第４の態様は、バチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株の、ＣＥＣＴ９１６５の殺線虫効果および殺虫効果を維持する変異体を得る方法であって、ＣＥＣＴ９１６５株を遺伝子工学技術に供する工程を含む方法に関する。

【0088】

本発明の第４の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、遺伝子工学技術は、部位特異的突然変異誘発、コンビナトリアル突然変異誘発もしくは挿入突然変異誘発によるランダム突然変異誘発（すなわち、化学的または物理的な薬剤を使用すること）などの突然変異誘発であるか、または組換え技術、例えば形質転換（例えば、エレクトロポレーション、ヒートショックによって、または塩化カルシウムなどの二価カチオン溶液を使用することによって）、形質導入もしくはコンジュゲーション技術である。本発明の第４の態様の別の実施形態では、遺伝子工学技術は突然変異誘発である。

【0089】

本発明の第４の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、この菌株の変異体は、バチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ ９１６５株と少なくとも９９．８％（９９．８％または９９．９％）のゲノム配列同一性を有する。

【0090】

本発明の第４の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、バチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株の変異体は、バチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株と少なくとも９９．８％（９９．８％または９９．９％）の平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）を有する。

【0091】

本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様のＢ．ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株またはその変異体に由来する生細胞懸濁液を得るための方法であって、（ｉ）菌株を培地に接種すること、（ｉｉ）工程（ｉ）の接種された培地をこの菌株の増殖に適した条件に供すること、および（ｉｉｉ）場合により、工程（ｉｉ）から得られた培地を濃縮工程に供すること、を含む方法を指す。

【0092】

「ＣＥＣＴ９１６５株に由来する」という用語は、懸濁液が本発明の第１の態様で定義される菌株から得られることを意味する。

【0093】

本発明の菌株は、５～７ｖ／ｖ％を含む最終濃度で培地に接種することができる。好ましくは、接種された培養物は指数増殖期にある。本発明の菌株の増殖に適した培地は、合成培地、例えばＬＢ（溶原性ブロス）およびＰＭ（生理食塩生成生培地）、または植物起源の培地、例えば糖蜜（例えばサトウキビ、ビートなどに由来）である。菌株の増殖に適した条件は、温度４～４５℃、ｐＨ６～９、および酸素濃度５０～１００％である。本発明の菌株の増殖は、撹拌によって行われる。

【0094】

本発明の第５の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、菌株の増殖のための条件は、温度２８～３０℃、ｐＨ７～８．５、および酸素濃度８５～１００％である。

【0095】

懸濁液を得るための方法の別の実施形態では、細胞を培地から分離して濃縮懸濁液を得る。適切な分離技術としては、培養物の遠心分離または濾過が挙げられる。培養物の遠心分離を、例えば、最低５０００ｒｐｍで行うとペレット中に細胞が得られ、これを培地の一部または適切な緩衝培地に、菌株濃度がおよそ１×１０^５～１×１０^１２ＣＦＵ／ｍＬ（１０^５ｃｆｕ／ｍＬ、１０^６ｃｆｕ／ｍＬ、１０^７ｃｆｕ／ｍＬ、１０^８ｃｆｕ／ｍＬ、１０^９ｃｆｕ／ｍＬ、１０^１０ｃｆｕ／ｍＬ、１０^１１ｃｆｕ／ｍＬまたは１０^１２ｃｆｕ／ｍｌ）になるように再懸濁する。

【0096】

懸濁液が得られたら、それを脱水工程に供することができる。脱水は、凍結乾燥方法によって行うことができる。あるいは、懸濁液を流動床乾燥によって脱水することができる。別の選択肢は、噴霧乾燥または真空下のオーブン中での乾燥によって懸濁液を脱水することである。これに関して、本発明の菌株の別の有利な特徴は、該菌株が工業規模で微生物を得る際に日常的である脱水方法に対して高い耐性を示すことである。細胞生存率を改善するために、脱水方法を実施する前に不活性浸透圧保護剤成分を懸濁液に添加することができる。

【0097】

本発明の第５の態様の別の特定の実施形態では、本方法は、分離工程から得られた細胞を適切な緩衝液に再懸濁して、細胞濃縮懸濁液を得ることを含む。

【0098】

本発明の別の態様は、本発明の第１の態様で定義されるＢ．ハロサッカロボランスＣＥＣＴ９１６５株またはその変異体に由来する無細胞抽出物を提供し、この抽出物は、（ｉ）菌株を適切な培地に接種すること、（ｉｉ）接種された培地を適切な増殖条件に供すること、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の培地から細胞を分離すること、（ｉｖ）無細胞抽出物を回収すること、および（ｖ）場合により、この無細胞抽出物を濃縮工程に供すること、を含む方法によって得ることができる。

【0099】

上記の分離方法によって得られた無細胞培地は、適切な製剤に直接使用および/または含めることができ、またはより適切な組成物に到達するための濃縮工程に供することができる。したがって、本発明の第４の態様の一実施形態では、脱水、濾過、限外濾過、遠心分離、超遠心分離、沈殿またはクロマトグラフィーによって実施することができる無細胞抽出物の濃縮工程に関する。

【0100】

本発明の第６の態様は、植物における線虫および/または昆虫感染を防除するための、殺線虫効果および殺虫効果を有するバチルス・ハロサッカロボランスの単離株の使用を指す。

【0101】

本発明の第６の態様の一実施形態では、植物における線虫および／またはアブラムシ感染を防除するための、殺線虫効果および殺アブラムシ効果を有するバチルス・ハロサッカロボランスの単離株の使用を指す。

【0102】

本発明の第７の態様は、植物において線虫および/またはアブラムシによって引き起こされる感染を防除する方法であって、殺線虫効果および殺虫効果を有するバチルス・ハロサッカロボランスの菌株を、植物の一部またはこの植物を成長させるために使用される基質に施用することを含む方法を指す。

【0103】

本発明の第７の態様の一実施形態では、それは、植物において線虫および／またはアブラムシによって引き起こされる感染を防除する方法であって、殺線虫効果および殺アブラムシ効果を有するバチルス・ハロサッカロボランスの菌株を、植物の一部またはこの植物を成長させるために使用される基質に施用することを含む方法を指す。

【0104】

本発明の第６および第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、単離株は、本発明の第１の態様で定義されるＢ．ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株またはその変異体である。

【0105】

本発明の第６および第７の態様の菌株は、細菌培養物または組成物として使用することができる。したがって、菌株は本発明の第１の態様で定義されるものであり、細菌培養物は本発明の第２の態様で定義される細菌培養物であり、この組成物は本発明の第３の態様で定義される組成物である。

【0106】

本発明の第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の第１の態様で定義されるＢ．ハロサッカロボランス株またはその変異体は、数週間に１回、１日当たり１０^５～１０^１２ＣＦＵ／ｍＬ（１０^５ｃｆｕ／ｍＬ、１０^６ｃｆｕ／ｍＬ、１０^７ｃｆｕ／ｍＬ、１０^８ｃｆｕ／ｍＬ、１０^９ｃｆｕ／ｍＬ、１０^１０ｃｆｕ／ｍＬ、１０^１１ｃｆｕ／ｍＬまたは１０^１２ｃｆｕ／ｍｌ）の投与計画で植物に投与される。本発明の第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の第１の態様で定義されるＢ．ハロサッカロボランスの菌株またはその変異体は、数週間に１回、１日当たり１０^７ｃｆｕ／ｍＬの投与計画で植物に投与される。

【0107】

用量は、本発明の第３の態様の組成物および使用される組成物の製剤に従って、また気象条件、任意の抵抗現象または他の自然因子、処理の性質または外寄生の程度に従って、および処理される植物または部位に従って適合させることができる。

【0108】

本発明の第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、菌株、細菌培養物または組成物は、植物育苗箱に、種子処理、種子粉衣、種子消毒、苗根浸漬処理、植え穴処理、株元処理、作条処理、表面噴霧、土壌混和の間に、または水耕栽培における水培養培地への施用によって、施用される。

【0109】

本発明の第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、処理される植物の部分は種子である。この処理は、通常の方法、例えば、種子を本発明の第３の態様の組成物に浸漬する方法によって達成することができる。

【0110】

植物、すなわち根および/または種子の処理は、根－線虫に対する本発明の菌株の殺線虫作用を可能にする。

【0111】

「植物」という用語は、ヒトによって栽培される全ての植物種、特に穀類、飼料、野菜、果実作物、蔓植物などの食品または動物飼料を目的とした、および／または全ての目的（暖房、住宅建築用家具、および／または装飾品など）のための木材の供給を目的とした、全ての植物種を含む。植物の例としては、穀類（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、エンバクおよびトウモロコシ）、マメ類（例えば、大豆、アズキ、そらまめ、エンドウ豆およびピーナッツ）、果樹・果実類（例えば、リンゴ、ナシ、柑橘類、ブドウ、モモ、アンズ、サクランボ、オリーブ、ナッツ、アーモンド、バナナ、ベリーおよびイチゴ）、野菜類（例えば、トマト、キャベツ、ホウレンソウ、ブロッコリー、レタス、タマネギ、ニンニク、ニラおよびペッパー）、根菜類（例えば、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、ダイコン、レンコンおよびカブ）、工業作物（例えば、綿、麻、カジノキ、三ツ又、アブラナ、ビート、ホップ、サトウキビ、テンサイ、ゴム、コーヒー、タバコ、茶）、ウリ状果（例えば、カボチャ、キュウリ、スイカ、メロン）、牧草類（例えば、オーチャードグラス、モロコシ、オオアワガエリ、クローバー、アルファルファ）、芝草（例えば、マスカレーングラス、ベントグラス）、香味料作物（例えば、ラベンダー、ローズマリー、タイム、パセリ、バシリカ（ｂａｓｉｌｉｃａ）、ミント、コリアンダー、ペッパー、ショウガ）、および観花植物（例えば、キク、バラ、ラン）が挙げられる。

【0112】

用語「植物の一部」は、根、茎、葉および種子などの植物の任意の部分を含む。

【0113】

「種子」という用語は、いわゆる種子の他、球根、塊茎、種芋等の栄養繁殖用の植物体を含む。

【0114】

本発明の第６または第７の態様の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、植物はトマト、キュウリまたはジャガイモ植物である。

【0115】

「基質」という用語は、植物を栽培するための任意の支持体を含み、その材料は、植物がその中で成長することができる限り、特に限定されない。例えば、苗床マット、水、砂、土壌、バーミキュライト、綿、紙、珪藻土、寒天、ゲル物質、高分子物質、ロックウール、グラスウール、ウッドチップ、樹皮および軽石である。

【0116】

本発明の第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、施用方法は、植物または苗を育成するための苗床の近傍で実施される。

【0117】

本発明の第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、施用方法は植物に直接実施される。

【0118】

以下の実施例は、線虫およびアブラムシ感染の防除における、生物農薬としてのＢ．ハロサッカロボランスの菌株の使用を実証する。

【0119】

Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株によって示されたアブラムシに対する殺虫活性を、半翅目の他の昆虫に外挿することができた。

【0120】

本発明の第６および第７の態様の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、昆虫は半翅目昆虫である。

【0121】

本発明の第６および第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、昆虫は、アブラムシ科（Ａｐｈｉｄｉｄａｅ）、カサアブラムシ科（Ａｄｅｌｇｉｄａｅ）、ネアブラムシ科（Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒｉｄａｅ）および/またはコナジラミ科（Ａｌｅｙｒｏｄｉｄａｅ）の半翅目昆虫である。

【0122】

本発明の第６および第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、コナジラミ科の半翅目昆虫は、トリアレウロデス・バポラリオルム（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ）（コナジラミ）である。

【0123】

本発明の第６および第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、昆虫はアブラムシ科のものである。

【0124】

本発明の第６および第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、第６の態様の使用および第７の態様の方法は、有害な線虫および/またはアブラムシのコロニー形成を予防するため、または外寄生された植物を治療するためのものである。特に、本発明は、これらの植物有害生物を防除するための使用に関する。

【0125】

したがって、「治療する」という用語は、外寄生された植物に対することを指す。防除という用語は、有害生物による植物の外寄生を予防すること、有害生物を忌避または排除することを含む。

【0126】

本発明の第６および第７の態様の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、第６の態様の使用および第７の態様の方法は、有害な線虫またはアブラムシに感染した植物を治療するためのものである。

【0127】

本発明の第６および第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、線虫はネコブセンチュウまたはシストセンチュウである。

【0128】

本発明の第６および第７の態様の実施形態において、任意選択で上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、線虫は、メロイドギン属の線虫、例えば、メロイドギン・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）（ミナミネコブセンチュウ）、メロイドギン・ヤバニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）（ジャワネコブセンチュウ）、メロイドギン・ハプラ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ）（キタネコブセンチュウ）、およびメロイドギン・アレナリア（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ）（ピーナッツネコブセンチュウ）；グロボデラ属の線虫、例えば、グロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）（ゴールデンネマトーデ）およびグロボデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）（ジャガイモシストセンチュウ）；ジチレレンクス（Ｄｉｔｙｌｅｌｅｎｃｈｕｓ）属の線虫、例えば、ジチレレンクス・デストラクタ（Ｄｉｔｙｌｅｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（イモクサレセンチュウ）およびジチレレンクス・ジプサシ（Ｄｉｔｙｌｅｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）（ナミクキセンチュウ（ｂｕｌｂ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｎｅｍａｔｏｄｅ））；プラチレンクス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属の線虫、例えば、プラチレンクス・ペネトランス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）（キタネグサレセンチュウ（ｃｏｂｂ ｒｏｏｔ－ｌｅｓｉｏｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ））プラチレンクス・ファラックス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｆａｌｌａｘ）（キクネグサレセンチュウ）、プラチレンクス・コフェアエ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｃｏｆｆｅａｅ）（ミナミネグサレセンチュウ（ｃｏｆｆｅｅ ｒｏｏｔ－ｌｅｓｉｏｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、プラチレンクス・ロオシ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｌｏｏｓｉ）（チャネグサレセンチュウ）およびプラチレンクス・ブルヌス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｖｕｌｎｕｓ）（クルミネグサレセンチュウ）；ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）属の線虫、例えば、ヘテロデラ・グリシンズ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（大豆シストセンチュウ）およびヘテロデラ・シャクチイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｈａｃｈｔｏｉｉ）（テンサイシストセンチュウ）；アフェレンコイデス（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ）属の線虫、例えば、アフェレンコイデス・ベッセイ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｂｅｓｓｅｙｉ）（イネシンガレセンチュウ）、アフェレンコイデス・リッツェマボッシ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｒｉｔｚｅｍａｂｏｓｉ）（ハガレセンチュウ（ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｆｏｌｉａｒ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、およびアフェレンコイデス・フラガリエアエ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｆｒａｇａｒｉｅａｅ）（イチゴセンチュウ）；アフェレンクス（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ）属の線虫、例えば、アフェレンクス・アベネ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ａｖｅｎａｅ）（ニセネグサレセンチュウ（ｍｙｃｏｐｈａｇｏｕｓ ｎｅｍａｔｏｄｅ）；ラドホルス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ）属の線虫、例えば、ラドホルス・シミリス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ）（ネモグリセンチュウ）；チレンクルス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）属の線虫、例えば、チレンクルス・セミペネトランス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ）（ミカンセンチュウ）；ロチレンクルス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）属の線虫、例えば、ロチレンクルス・レニフォルミス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（腎形センチュウ）；または、樹木に発生する線虫、例えばブルサフェレンクス・キシロフィルス（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）（マツノザイセンチュウ）である。

【0129】

本発明の第６および第７の態様の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、線虫は、メロイドギン属およびグロボデラ属から選択される。

【0130】

本発明の第６および第７の態様の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、線虫は、メロイドギン・インコグニタ、メロイドギン・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｉｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）およびグロボデラ・パリダからなる群から選択される。

【0131】

「アブラムシ」という用語は、アブラムシ上科、アブラムシ科の昆虫を指す。

【0132】

本発明の第６および第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、アブラムシは、アフィス・ゴシピイ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（ワタアブラムシおよびメロンアブラムシ）、ミズス・ペルシカエ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）（モモアカアブラムシ（ｇｒｅｅｎ ｐｅａｃｈ ａｐｈｉｄ））、ミズス・バリアンス（Ｍｙｚｕｓ ｖａｒｉａｎｓ）（モアカアブラムシ（ｐｅａｃｈ－ｃｌｅｍａｔｉｓ ａｐｈｉｄ））、ミズス・セラシ（Ｍｙｚｕｓ ｃｅｒａｓｉ）（ブラックチェリーアブラムシ）、ブラキカウダス・ペルシカエ（Ｂｒａｃｈｙｃａｕｄｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）（ブラックピーチアブラムシ（ｂｌａｃｋ ｐｅａｃｈ ａｐｈｉｄ））、アフィス・ポミ（Ａｐｈｉｓ ｐｏｍｉ）（ヨーロッパリンゴアブラムシ（ｇｒｅｅｎ ａｐｐｌｅ ａｐｈｉｄ））、ブラキカウダス・ヘリクリシ（Ｂｒａｃｈｙｃａｕｄｕｓ ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｉ）（ムギワラギクオマルアブラムシ（ｌｅａｆ－ｃｕｒｌｉｎｇ ｐｌｕｍ ａｐｈｉｄ））、ヒアロプテルス・プルニ（Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ ｐｒｕｎｉ）（モモコフキアブラムシ（ｍｅａｌｙ－ｐｌｕｍ ａｐｈｉｄ））、ジサフィス・プランタギネア（Ｄｙｓａｐｈｉｓ ｐｌａｎｔａｇｉｎｅａ）（オオバコアブラムシ（ｒｏｓｙ ａｐｐｌｅ ａｐｈｉｄ））、ジサフィス・ピリ（Ｄｙｓａｐｈｉｓ ｐｙｒｉ）（ｐｅａｒ ｂｅｄｓｔｒａｗ ａｐｈｉｄ）、アクリトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ ｐｉｓｕｍ）（エンドウヒゲナガアブラムシ（ｐｅａ ａｐｈｉｄ））、マクロシフム・ユーホルビアエ（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｖｍ ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ）（チューリップヒゲナガアブラムシ（ｐｉｎｋ ａｎｄ ｇｒｅｅｎ ｐｏｔａｔｏ ａｐｈｉｄ））、アフィス・スピラエコラ（Ａｐｈｉｓ ｓｐｉｒａｅｃｏｌａ）（アフィス・シトリコラ（Ａ．ｃｉｔｒｉｃｏｌａ）（ユキヤナギアブラムシ（ｇｒｅｅｎ ｃｉｔｒｕｓ ａｐｈｉｄ））、アフィス・ファバエ（Ａｐｈｉｓ ｆａｂａｅ）（マメクロアブラムシ（ｂｌａｃｋ ｂｅａｎ ａｐｈｉｄ））、ロパロシフム・マイディス（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ）（トウモロコシアブラムシ（ｃｏｒｎ ａｐｈｉｄ））、ロパロシフム・パジ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ）（ムギクビレアブラムシ（ｂｉｒｄ ｃｈｅｒｒｙ－ｏａｔ ａｐｈｉｄ））、シトビオン・アベナエ（Ｓｉｔｏｂｉｏｎ ａｖｅｎａｅ）（英国穀物アブラムシ（Ｅｎｇｌｉｓｈ ｇｒａｉｎ ａｐｈｉｄ））、ジウラフィス・ノキシア（Ｄｉｕｒａｐｈｉｓ ｎｏｘｉａ）（ロシアコムギアブラムシ（Ｒｕｓｓｉａｎ ｗｈｅａｔ ａｐｈｉｄ））、ブレビリコネ・ブラシカエ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）（キャベツアブラムシ）、エリオソマ・ラニゲルム（Ｅｒｉｏｓｏｍａ ｌａｎｉｇｅｒｕｍ）（リンゴワタムシ（ｗｏｏｌｌｙ ａｐｐｌｅ ａｐｈｉｄ））、ナソノビア・リビスニグリ（Ｎａｓｏｎｏｖｉａ ｒｉｂｉｓｎｉｇｒｉ）（レタスヒゲナガアブラムシ）、アンフォロフォラ・イダエイ（Ａｍｐｈｏｒｏｐｈｏｒａ ｉｄａｅｉ）（ラージラズベリーアブラムシ（ｌａｒｇｅ ｒａｓｐｂｅｒｒｙ ａｐｈｉｄ））、トキソプテラ・アウランチイ（Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ ａｕｒａｎｔｉｉ）（コミカンアブラムシ（ｂｌａｃｋ ｃｉｔｒｕｓ ａｐｈｉｄ）およびコーヒーアブラムシ（ｃｏｆｆｅｅ ａｐｈｉｄ））、エラトビウム・アビエチヌム（Ｅｌａｔｏｂｉｕｍ ａｂｉｅｔｉｎｕｍ）（グリーンスプルスアブラムシ（ｇｒｅｅｎ ｓｐｒｕｃｅ ａｐｈｉｄ）、およびペムフィガス・ブルサリウス（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｂｕｒｓａｒｉｕｓ）（レタスルートアブラムシ（ｌｅｔｔｕｃｅ ａｐｈｉｄ））からなる群から選択される。

【0133】

本発明の第６および第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、アブラムシはアフィス属のものである。

【0134】

本発明の第６および第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、アブラムシはアフィス・ゴシピイである。

【0135】

本発明の第６および第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、線虫は、メロイドギン属およびグロボデラ属から選択され、アブラムシはアフィス属のものである。

【0136】

本発明の第６および第７の態様の実施形態では、任意選択で、上または下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、線虫は、メロイドギン属およびグロボデラ属から選択される；あるいは、メロイドギン・インコグニタ、メロイドギン・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダからなる群から選択される；あるいは、アブラムシはアフィス属のものである；あるいは、アブラムシはアフィス・ゴシピイである；あるいは、線虫はメロイドギン属から選択され、アブラムシはアフィス属のものである；あるいは、線虫はグロボデラ属から選択され、アブラムシはアフィス属のものである；あるいは、線虫はメロイドギン・インコグニタまたはメロイドギン・ヤバニカであり、アブラムシはアフィス属のものである；あるいは、線虫はグロボデラ・ロストキエンシスまたはグロボデラ・パリダであり、アブラムシはアフィス属のものである；あるいは、線虫はメロイドギン属から選択され、アブラムシはアフィス・ゴシピイである；あるいは、線虫はグロボデラ属から選択され、アブラムシはアフィス・ゴシピイである；あるいは、線虫はメロイドギン・インコグニタ、メロイドギン・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダからなる群から選択され、アブラムシはアフィス属のものである；あるいは、線虫はメロイドギン・インコグニタであり、アブラムシはアフィス属のものである；あるいは、線虫はメロイドギン・ヤバニカであり、アブラムシはアフィス属のものである；あるいは、線虫はグロボデラ・ロストキエンシスであり、アブラムシはアフィス属のものである；あるいは、線虫はグロボデラ・パリダであり、アブラムシはアフィス属のものである；あるいは、線虫はメロイドギン・インコグニタ、メロイドギン・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダからなる群から選択され、アブラムシはアフィス・ゴシピイである；あるいは、線虫はメロイドギン・インコグニタであり、アブラムシはアフィス・ゴシピイである；あるいは、線虫はメロイドギン・ヤバニカであり、アブラムシはアフィス・ゴシピイである；あるいは、線虫はグロボデラ・ロストキエンシスであり、アブラムシはアフィス・ゴシピイである；あるいは、線虫はグロボデラ・パリダであり、アブラムシはアフィス・ゴシピイである。

【0137】

本発明において、「感染」という用語は、線虫によって引き起こされる植物の無症候性感染または症候性感染を含む。

【0138】

本発明の第６および第７の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、防除は任意の植物において実行することができる。

【0139】

本発明の第８の態様は、本発明の第１の態様で定義される菌株もしくはその変異体、または本発明の第２の態様の細菌培養物、または本発明の第３の態様の組成物の有効量を含むキットに関する。

【0140】

菌株、細菌培養物および組成物について上記に提供される全ての実施形態は、本発明の第８の態様のキットの実施形態でもある。

【0141】

本発明の第８の態様の一実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、キットは、本発明の第１の態様の菌株の毎週、毎月、または他の周期の用量を含み得る。例示的な例として、毎週の用量を含むキットは、菌株を含む７つの個別の組成物（７つの１日用量）を含み得る。別の例として、毎月用量を含むキットは、本発明の第１の態様の菌株を含む３０の組成物を含み得る。

【0142】

本発明の第１の態様の菌株が凍結乾燥される場合、本発明の第８の態様のキットは、水などの食用再懸濁剤を含有することができる。

【0143】

本発明の第８の態様の別の実施形態では、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、キットは服薬コンプライアンスを容易にする手段を含む。例えば、キットは、それを使用した人が適切に規定されたスケジュールで有効量の本発明の菌株の植物への正しい投与を行うことを確実にする目的で特に有利であり得る。ブリスターカードまたは適切に構成された他の収容装置は、様々な構成要素の投与の順序またはタイミングを明確に示すのに特に適し得る。キットは、１枚のカードとして、または４枚、６枚、７枚（例えば、毎週の供給）、または８枚のカードが一緒に同梱されたケースとして入手することができる。さらに、毎月または他の種類のキットを入手することができる。

【0144】

本発明の第１の態様の単離株または変異体を含むキットは、本発明の菌株の正しい培養を可能にする任意の手段、例えば培地、サプリメントまたは抗生物質、ならびに正しい調製および/または植物への施用のための説明書を含むことができる。

【0145】

本発明の第９の態様は、植物における線虫感染および／またはアブラムシ感染を防除するための、本発明の第８の態様のキットの使用に関する。

【0146】

とりわけ、特定の感染および植物に関して、本発明の第７および第８の態様の下で上記に提供された全ての実施形態は、第９の態様の実施形態でもある。

【0147】

説明および特許請求の範囲を通して、「含む」という単語およびその単語の変形は、他の技術的特徴、添加物、成分または工程を除外することを意図するものではない。さらに、「含む」という言葉は、「からなる」という場合も包含する。本発明の追加の目的、利点および特徴は、説明を検討することにより当業者に明らかになるか、または本発明の実施により習得することができる。以下の実施例および図面は例示のために提供されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。図面に関連し、特許請求の範囲の中で括弧内に配置された参照符号は、特許請求の範囲の明瞭度を高めるための試みであり、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。さらに、本発明は、本明細書に記載された特定の好ましい実施形態のすべての可能な組み合わせを網羅する。

【実施例】

【0148】

実施例１．ハロサッカロボランスＢ４１０株の特性評価

【0149】

実施例１．１．
本発明の菌株を配列決定し、その温度範囲、ｐＨ範囲、および塩分範囲ならびにバイオフィルム産生に関して特性評価した。

【0150】

材料および方法
Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株は、アルメリア（スペイン南部）から有機農業体制の農業土壌において単離された。細菌単離株の同定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列分析を使用して達成した。

【0151】

Ｆｕｔｕｒｅｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅコレクション由来の他の菌株およびＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）コレクションから購入した菌株を含む、他のバチルス単離株を比較として使用した。Ｆｕｔｕｒｅｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ由来の他の菌株は以下の通りであった：Ｂ２３９９、バチルス・リトラリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）；Ｂ２３０９、バチルス・リトラリス／ナイアベンシス（ｎｉａｂｅｎｓｉｓ）／シンプレックス（ｓｉｍｐｌｅｘ）；Ｂ２５２５、バチルス・ナイアベンシス；Ｂ１４５、バチルス・ナイアベンシス；Ｂ１４９、バチルス・ナイアベンシス/リトラリス／バチルス属菌種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）；およびＢ１２０３、バチルス・ナイアベンシス。ＤＳＭＺコレクション由来の菌株は、参照として含まれており、以下の通りであった：ＤＳＭ１７７２３（バチルス・ナイアベンシス）、ＤＳＭ２５３８７（バチルス・ハロサッカロボランス）およびＤＳＭ１６３０３（バチルス・リトラリス）であった。

【0152】

細菌単離株の同定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列分析を使用して達成した。培養物を、Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ培地中２８℃において、回転シェーカー上２００ｒｐｍで日常的に増殖させた。製造者の説明書（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従って、Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｋｉｔを用いて鋳型ＤＮＡを単離した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定を次に記載のように行った。２．５μＬの１０×ＮＨ_４緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、０．７５μＬの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．６２５μＬのｄＮＴＰミックス１０ｍＭ、０．５μＬのプライマー８ｆ １０μＭ（配列番号１：５’－ＡＧＡＧＴＴＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＧＣＴ ＣＡＧ－３’）、０．８μＬのプライマー１４９２ｒ １０μＭ（配列番号２：５’－ＡＣＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧＡＣＴＴ－３’）、０．２５μＬのＢｉｏｔａｑ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ；Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１７．８７５μＬのナノ純水および２μＬの鋳型ＤＮＡからなるＰＣＲ反応ミックスを以下のプログラムに従って増幅させた：９５℃ ５分；９５℃３０秒、５４℃３０秒および７２℃６０秒を３５サイクル、ならびに７２℃５分。ＰＣＲ産物を、ＥＺＮＡ Ｃｙｃｌｅ Ｐｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）を使用して、製造者の説明書に従って精製した。精製されたＰＣＲ産物を、製造者の説明書に従って、外部配列決定サービス（Ｓｅｃｕｇｅｎ）によって、プライマー１４９２ｒ（配列番号２）およびＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＳａｎｇｅｒ法を使用して、配列決定した。

【0153】

選択したバチルス単離株の増殖の至適温度を決定するために、各菌株をニュートリエント寒天プレートの表面に画線接種し、次いで４℃、４０℃、４２℃、４５℃および５０℃の温度でインキュベートした。細菌増殖を６日間のインキュベーション中に毎日評価した。

【0154】

菌株の２８℃における増殖のｐＨ範囲を滅菌９６ウェルプレートで決定した。実験用に、細菌を最初にＭａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈで一晩増殖させた。その後、６００ｎｍでの最終光学密度（ＯＤ_６００）が０．０１の細菌懸濁液１００μＬを、以下のｐＨ：６．４８、７．０３、９．３３、１０．０４および１０．９８でＬＢ培地に添加した。次いで、２００μＬの各バチルス単離株をｐＨに対して接種した（ｐＨあたり２ウェル）。

【0155】

プレートを２８℃で２４時間インキュベートした後に読み取った。エンドポイントを決定するために、いくつかのアプローチを考慮に入れた。細菌増殖は、６２０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ_６２０）によって評価した。３０μＬの０．０１％レサズリンを添加することによって、細胞生存率を確認した。青紫色からピンク色へのあらゆる色の変化を陽性として記録した。

【0156】

２８℃におけるコレクション菌株の増殖速度に対する塩分の影響を、ＮａＣｌを含まない１００μＬのＬＢ中のＮａＣｌの二倍連続希釈によって滅菌９６ウェルプレートで決定した。実験用に、細菌を最初にＭａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈで一晩増殖させた。その後、６００ｎｍでの最終光学密度（ＯＤ６００）が０．０１の細菌懸濁液１００ｍｌを、以下のＮａＣｌ希釈液：１５、１０、７．５、５、３．７５、２．５、１．８７５、１．２５、０．９３、０．６５、０．４６５および０％を含むウェルに添加した。プレートを２８℃で４８時間インキュベートした後に読み取った。ＭＩＣエンドポイントを決定するために、いくつかのアプローチを考慮に入れた。目視検査で細菌増殖を示さない最低濃度を最初にＭＩＣ値とし、３０μＬの０．０１％レサズリンを添加して細胞生存率を確認した。青紫色からピンク色へのあらゆる色の変化を陽性として記録し、この場合、ＭＩＣを、この色の変化を欠く最も低いＮａＣｌ濃度として定義した。視覚的ＭＩＣ評価に加えて、レサズリンを添加する前に、各ウェルでＯＤ_６２０を決定した。

【0157】

コレクション菌株の２８℃におけるバイオフィルム産生を、滅菌９６ウェルプレートで２１ウェルの複製によって測定した。実験用に、細菌を最初にＭａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈで一晩増殖させた。その後、Ｍａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ中の６００ｎｍでの最終光学密度（ＯＤ_６００）が０．１の細菌懸濁液２００μＬをウェルに添加した。プレートを２８℃で７２時間インキュベートした後に読み取った。バイオフィルムの産生を、相対バイオフィルムとして報告した。インキュベーション後、プレートの光学密度を６２０ｎｍで読み取り、その後、バイオフィルムをクリスタルバイオレット０．１％で染色し、エタノールで希釈して６２０ｎｍでの光学密度を得た。相対バイオフィルムは、クリスタルバイオレットによるバイオフィルム染色の６２０ｎｍでのＯＤを、初期細胞増殖の６２０ｎｍでのＯＤで割った比率であった。

【0158】

結果：
配列決定により、Ｂ．ハロサッカロボランスＥ３３株（ＮＣＢＩ受託番号ＮＲ＿１０９１１６．１；データベース受託日２０１８年１０月１日）の配列と９８％同一の配列（配列番号３）が明らかになった（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ＳＦ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１５Ｊａｎ；４３：Ｄ５９３－８）。

【0159】

すべてのバチルス単離株の増殖温度範囲は、５０℃で増殖することができたＤＳＭ１７７２３を除いて、それらのほとんどが４℃～４５℃で増殖し、同様であった。それらはすべて中温菌（ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｂａｃｔｅｒｉａ）と見なされた。

【0160】

Ｂ４１０の増殖ｐＨ範囲は６．４８～９．３３であったため、Ｂ２５２５株およびＤＳＭ２５３８８７株と同じ好中性株と見なされた。Ｂ１４５、Ｂ１４９、Ｂ１２０３、ＤＳＭ１７７２３は６．４８～７．０３で増殖し、これらの菌株も好中性細菌と見なされた。Ｂ２３９９およびＢ２３０９は、これらのアッセイ条件で増殖しなかった。このアッセイでは、ＤＳＭ１６０３０３は９．３３でのみ増殖し、好アルカリ菌と見なされた。

【0161】

Ｂ４１０は、ＮａＣｌ０％～１０％で増殖できる唯一の試験菌株であり、耐塩性株と見なされた。増殖の至適塩分範囲は１．２５％～３．７５％であった。Ｂ２３９９、Ｂ１４５、Ｂ１４９、Ｂ１２０３およびＤＳＭ１７７２３の増殖塩分濃度範囲はより限定されており、０％～３．７５％であり、それらの全てが非耐塩性細菌であった。Ｂ１４５、Ｂ１４９およびＤＳＭ１７７２３は、ＮａＣｌ０％で増殖しなかったため、増殖にいくらかのＮａＣｌを必要としたことは言及する価値がある。Ｂ２３０９、Ｂ２５２５、ＤＳＭ２５３８７およびＤＳＭ１６３０３は、このアッセイ条件では増殖しなかった。

【0162】

Ｂ４１０は、Ｂ２３０９、Ｂ２５２５、Ｂ１４９、ＤＳＭ１７７２３、ＤＳＭ２５３８７およびＤＳＭ１６３０３株と同じバイオフィルム産生株であった。Ｂ２５２５およびＤＳＭ２５３８７は、非常に高いバイオフィルム産生株であった。

【0163】

この研究のバチルス単離株は近い種由来のものであったにもかかわらず、評価された全ての株は互いに異なるものであるという結果となり、このことによりそれらの増殖条件が異なることが説明された。結果を全体的に見ると、一方では、Ｂ４１０、Ｂ１４５、Ｂ１４９、Ｂ１２０３およびＤＳＭ１７７２３がすべてのアッセイ条件で増殖しており、したがって、これらの菌株について本研究のすべてのパラメータを評価することができたことが分かる。しかしながら、他方では、Ｂ２３０９、Ｂ２５２５、ＤＳＭ２５３８７およびＤＳＭ１６３０３は、いくつかのアッセイ条件において増殖の問題を示した。菌株の全体の結果はいずれも他のいずれとも一致しなかったため、すべての菌株は互いに異なっていた。

【0164】

Ｂ４１０は、中温性（ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ）、好中性性（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、耐塩性およびバイオフィルム形成性の菌株として評された。実施したアッセイにより、Ｂ４１０株が、ＮａＣｌに対するその高い耐性のため、および全てのアッセイ条件で増殖することができたため、試験した他の株とは異なることが実証された。

【0165】

【表1-1】

【0166】

実施例１．２．
本発明の菌株を、その生化学的特性に関して特性評価した。

【0167】

材料および方法
使用した菌株は、Ｆｕｔｕｒｅｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅコレクション由来のバチルス・ハロサッカロボランス単離株（Ｂ４１０）であり、参照としてのＤＳＭ２５３８７株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）コレクション由来であった。

【0168】

酵素活性を、ＡＰＩ－５０ＣＨ（登録商標）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）を使用して、製造者の説明書に従って決定した。手短に言えば、細菌をＡＰＩ（登録商標）－５０ＣＨＬ培地またはＡＰＩ（登録商標）５０ＣＨＢ／Ｅ培地に再懸濁した。この懸濁液を使用して、ＡＰＩ（登録商標）ストリップ上のチューブ（杯状体）を満たした。ＡＰＩ（登録商標）ストリップのインキュベーション中、発酵が、酸の生成によって引き起こされ、培地中に存在するｐＨ指示薬によって検出されるチューブの色の変化によって明らかにされた。

【0169】

オキシダーゼ活性を、Ｂａｃｔｉｄｅｎｔ（登録商標）Ｏｘｉｄａｓｅストリップ（Ｍｅｒｋ－ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、製造者の説明書に従って測定した。カタラーゼ活性を、Ｖａｓｈｉｓｔ Ｈｅｍｒａｊ ｅｔ ａｌ．２０１３ “Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ” Ｉｎｎｏｖａｒｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １（１）：１－７に記載のプロトコルに従って測定した。

【0170】

結果：
ＡＰＩ－５０ＣＨ（登録商標）によれば、Ｂ４１０は、以下の基質を炭水化物源として利用した：グリセロール、Ｌ－アラビノース、Ｄ－キシロース、メチル－Ｄ－キシロピラノシド、Ｄ－ガラトース、Ｄ－グルコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－マンノース、Ｌ－ラムノース、イノシトール、Ｄ－マンニトール、メチル－ａＤ－マンノピラノシド、メチル－ａＤ－グルコピラノシド、Ｎ－アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、Ｄ－セロビオース、Ｄ－マルトース、Ｄ－ラクトース、Ｄ－メリビオース、Ｄ－サッカロース、Ｄ－トレハロース、Ｄ－メレチトース、Ｄ－ラフィノース、デンプン、グリコーゲン、ゲンチオビオース、Ｄ－ツラノースおよびＤ－アラビトール。一方、Ｂ４１０は、エリスリトール、Ｄ－アラビノース、Ｄ－リボース、Ｌ－キシロース、Ｄ－アドニトール、Ｌ－ソルボース、ズルシトール、Ｄ－ソルビトール、イヌリン、キシリトール、Ｄ－リキソース、Ｄ－タガトース、Ｄ－フコース、Ｌ－フコース、Ｌ－アラビトール、グルコン酸カリウム、２－ケトグルコン酸カリウムおよび５－ケトグルコン酸カリウムを利用しなかった（表１ｂ）。

【0171】

Ｂ４１０およびＤＳＭ２５３８７は、カタラーゼおよびオキシダーゼを産生した。これらの試験では、Ｂ４１０とＤＳＭ２５３８７型株との間に、具体的にはメチル－αＤ－マンノピラノシド資化において、ただ１つの相違が見出された。

【0172】

【表1-2】

【0173】

実施例２．「ネコブセンチュウ」の卵に対するバチルス・ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビトロ殺線虫活性

【0174】

ネコブセンチュウ（ＲＫＮ）の卵であるＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの卵に対するバチルス・ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビトロ殺線虫活性を性能評価し、２つの参照化学物質：Ｎｅｍａｃｕｒ（登録商標）（実施例２．１．）またはＶｙｄａｔｅ（登録商標）（実施例２．２．）と比較した。

【0175】

材料および方法
試験は、インキュベータ（ＩＮＣＵＢＩＧ２８８Ｌ２０００２３７、ＪＰ Ｓｅｌｅｃｔａ、Ｓｐａｉｎ）において、土壌条件を模倣するために暗所で行った。インキュベーション温度は２６℃であった。

【0176】

ＲＫＮの卵（Ｍ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタ）の混合物（トマト植物培養物から得られたもの）に対する細菌Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビトロ殺線虫能力を、予め滅菌した砂２ｇを入れた孵化チャンバ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｓｕｒｆａｃｅマルチウェルプレート、Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）において評価した。次いで、基質に、前述のＲＫＮの卵１２０個（各線虫種６０個の卵）を含有する水性懸濁液を接種した。直後に、２００ｍｌの生物学的防除剤Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を、実施例２．１では７．０×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ、実施例２．２では４．５×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで施用した。

【0177】

商業的に推奨される用量の参照化学物質を含む対照（実施例２．１では０．０１２５％で施用されたＮｅｍａｃｕｒ（登録商標）、有効成分：フェナミホス２４％、Ｂａｙｅｒ、および実施例２．２では０．２％で施用されたＶｙｄａｔｅ（登録商標）、有効成分：オキサミル２４％、ＤｕＰｏｎｔ）および滅菌蒸留水を含む対照（結果を通常の孵化パーセントと比較するための参照を確立するため）を含めた。

【0178】

孵化チャンバを２６℃で３週間インキュベートし、生物学的防除剤を施用した後７、１４および２１日目に定期的な読み取りを行い、孵化パーセントを決定した（カウントは、Ｈａｗｋｓｌｅｙ（登録商標）チャンバ、顕微鏡ＯＰＴＥＣＦＩ ＢＩＯＳＴＡＲ Ｂ４、Ｏｐｔｅｃｈ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った）。各処理を６回繰り返した。

【0179】

結果：

【0180】

実施例２．１：フェナミホスとの比較：
Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株で処理したＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの卵は、対照と比較して卵孵化の有意な減少を示した（図１）。

【0181】

異なる処理を適用した３週間後、未処理卵（対照）の２７．３８％が孵化したが、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株で処理したものの５．６８％が孵化し、Ｎｅｍａｃｕｒ（登録商標）（参照化学物質）で処理したものの２．５０％が孵化した。処置後２１日目に、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株は、インビトロ条件下で対照と比較して孵化を減少させる有効性が７９．２５％に達した。孵化を減少させる有効性は、孵化を減少させる有効性が９０．８６％である参照化学物質と類似していた（統計学的に有意差はなかった）。

【0182】

実施例２．２：オキサミルとの比較：
Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株で処理したＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの卵は、対照と比較して孵化の有意な減少を示した（図２）。

【0183】

異なる処理を適用した３週間後、未処理卵（対照）の３４．７４％が孵化したが、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株で処理したものの３．４３％が孵化し、Ｖｙｄａｔｅ（登録商標）（参照化学物質）で処理したものの２１．８４％が孵化した。したがって、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株は、インビトロ条件下で対照と比較して孵化を減少させる有効性が９０．１３％に達したが、参照化学物質では、孵化を減少させる有効性は有意に大きく低かった（３７．１３％）。

【0184】

実施例３．ＲＫＮの幼虫（Ｊ２）に対するバチルス・ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビトロ殺線虫活性

【0185】

細菌Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビトロ殺線虫能力を、ＲＫＮのＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの幼虫（感染態幼虫期 Ｊ２）の混合物に対して評価した。

【0186】

材料および方法：
試験は、インキュベータ（ＩＮＣＵＢＩＧ２８８Ｌ２０００２３７、ＪＰ Ｓｅｌｅｃｔａ、Ｓｐａｉｎ）において、土壌条件を模倣するために暗所で行った。インキュベーション温度は２６℃であった。ＲＫＮのＭ．ヤバニカおよびＭ．インコグニタの幼虫（感染態幼虫期、Ｊ２）の混合物をトマト植物中で培養し、それらを、２ｇの予め殺菌された土壌を添加した孵化チャンバ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｓｕｒｆａｃｅマルチウェルプレート、Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に入れた。

【0187】

Ｍ．ヤバニカ＋Ｍ．インコグニタの幼虫２００匹（各種１００匹の線虫）の混合物を含む水性懸濁液を加え、次いで、２００μＬの生物学的防除剤Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を４．５×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで施用した。各処理を４回繰り返した。

【0188】

孵化チャンバを２６℃で１４日間インキュベートし、７日後および１４日後にＨａｗｋｓｌｅｙ（登録商標）チャンバによってカウントを行い、生存幼虫の数（生存％）を決定した（顕微鏡ＯＰＴＥＣＨ ＢＩＯＳＴＡＲ Ｂ４、Ｏｐｔｅｃｈ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。滅菌蒸留水を用いた陰性対照および市販用量の参照化学物質（Ｖｙｄａｔｅ（登録商標）を０．２％で施用、有効成分：オキサミル２４％、ＤｕＰｏｎｔ）を含めた。

【0189】

結果：

【0190】

Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株で処理したＲＫＮの幼虫は、４．５×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ用量で施用した場合、対照と比較して幼虫の生存率の有意な低下を示した（図３）。

【0191】

異なる処理を適用した２週間後、幼虫（陰性対照）の８７．４５％が生存したが、４．５×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで施用したＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０株で処理したものの０％が生存し、参照化学物質で処理したものの３．５５％が生存した。したがって、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株は、インビトロ条件下で対照と比較して幼虫の生存を減少させる有効性が１００％に達したが、化学処理の有効性は約９７．４５％であった。本発明の微生物対象によって達成される有効性と参照化学物質によるものとの間に統計的差異はなかった。

【0192】

実施例４．「ジャガイモシストセンチュウ」のグロボデラ・ロストキエンシスおよびＧ．パリダの卵に対するバチルス・ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビトロ殺線虫活性

【0193】

ジャガイモシストセンチュウ（ＰＣＮ）グロボデラ・ロストキエンシスおよびクロボデラ・パリダの卵に対する細菌Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビトロ殺線虫活性を評価した。

【0194】

材料および方法
試験は、インキュベータ（ＩＮＣＵＢＩＧ ２８８Ｌ２０００２３７、ＪＰ Ｓｅｌｅｃｔａ、Ｓｐａｉｎ）において、土壌条件を模倣するために暗所で行った。インキュベーション温度は２６℃であった。２ｇの予め滅菌した砂を加えた孵化チャンバ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｓｕｒｆａｃｅマルチウェルプレート、Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた。

【0195】

シストセンチュウのグロボデラは、Ｆｅｎｗｉｃｋ Ｃａｎ（浮選法）を使用して外寄生土壌から得た。シストセンチュウを２％漂白剤で２分間消毒し、滅菌蒸留水ですすいだ。次いで、内部からグロボデラの卵を放出するために、シストセンチュウを機械的に破砕した。実施例４．１では、インビトロ試験は、それぞれ４回の反復による２つの処理でからなっていた：１）対照卵；２）Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株（６．２×１０^７ＣＦＵ／ｍＬで施用）で処理した卵。実施例４．２では、インビトロ試験は、それぞれ４回の反復による３つの処理からなっていた：１）対照卵；２）ＴＧＡＩとして施用したＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０株（７．０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）で処理した卵、および３）市販の用量０．２％で施用した化学物質防除剤（Ｖｙｄａｔｅ（登録商標）、オキサミル２４％、ＤｕＰｏｎｔ）。

【0196】

ＰＣＮの混合物の３００個の卵（スペインのガルシアにおけるジャガイモ商業地から単離されたＧＧＡＬ－１７０１と呼ばれる集団由来の１５０匹のＧ．パリダおよび１５０匹のＧ．ロストキエンシス）を実施例４．１の各ウェルに入れた。一方、実施例４．２では、Ｇ．ロストキエンシス（スペイン、カタロニア州のジャガイモ商業地から単離された、ＧＰＲＡ－１８０３と命名された集団）の２５０個の卵を各ウェルに注いだ。次いで、卵を孵化させるために、両方の実施例において、４．５ｍＬ／ウェルの１０％ジャガイモ根拡散液（ＰＲＤ）溶液を添加した。

【0197】

ＰＲＤを調製するために、Ｋｅｎｎｅｂｅｃ品種のジャガイモの芽を、滅菌基質（泥炭／バーミキュライト；１／１、ｖ／ｖ）を含むトレイに播種した。発芽したジャガイモを気候室に３週間放置した。次いで、３週齢の植物の根を２５℃で２４時間、滅菌蒸留水に浸した。２４時間後、根に接触させた蒸留水を遠心分離し（４０００ｒｐｍ、１５分）、濾過し（２２μｍ）、必要になるまで冷凍庫で保存した。

【0198】

ＰＲＤを添加したら、６．２×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（実施例４．１）または７．０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（実施例４．２）の濃度のＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０株の溶液を添加した（２００μＬ／ウェル）。孵化チャンバは、評価期間を通して２６℃に維持した。試験測定は１４、２８および３５日目（Ｈａｗｋｓｌｅｙ（登録商標）チャンバを使用）に行い、新しい１０％ ＰＲＤ １ｍＬを毎週添加した。

【0199】

結果：

【0200】

Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株で処理したＰＣＮの卵は、施用した場合、対照（図４、実施例４．１；および図５、実施例４．２）および参照化学物質（図５）と比較して、孵化の有意な減少を示した。

【0201】

実施例５．ネコブセンチュウ（メロイドギン・ヤバニカおよびＭ．インコグニタ）に対するバチルス・ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビボ殺線虫活性

【0202】

Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を使用して、「ペレット（実施例５．１）として、ＴＧＡＩ（実施例５．２）として、およびプロトタイプ製剤（実施例５．３）として、３つの実施例を行った。すべての結果をこのセクションの最後に示す。

【0203】

材料および方法
５．１ Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株の「ペレット」のインビボ殺線虫活性
細菌Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビボ殺線虫能力を、温室内での２つの実験：実施例５．１．１（Ｍ．ヤバニカ＋Ｍ．インコグニタに対して）および実施例５．１．２（Ｍ．ヤバニカに対して）で評価した。両方の実験において、植物を、細菌Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株の最初の施用から３９日間、温室（温度２２＋２℃、相対湿度ＲＨ：５０＋１０）に置いた。

【0204】

実験計画は、２つの異なる処理によって構成された：１）未処理植物による対照；２）Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株の懸濁液を「ペレット」として施用して処理した植物。各処理は、１回の反復実験につき３つの植物を用いる３回の反復実験からなっていた。

【0205】

ペレットを以下のようにして得た：Ｂ４１０株のクライオバイアルの凍結試料１ｍＬ（－８０℃）を解凍し、１００ｍＬフラスコ中のＴｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）中で３０℃でおよそ３日間増殖させた。これを遠心分離し、残った「ペレット」（微生物自体）をこのアッセイで試験した。

【0206】

砂とパーライトとの混合物からなる基質（３：１；体積：体積）を充填した３０００ｃｍ^３のポットに、３～４週齢の２７個のトマト苗（「Ｄｕｒｉｎｔａ」品種）を移植した。移植の３日前に、１／３の植物を、１．０４×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ（例５．１．１．）または７．１×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（実施例５．１．２）の用量でＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を含有する１０ｍＬの水溶液で処理した（予防処理）。移植の１日後、全てのトマト植物に、ネコブセンチュウを含む水懸濁液、実施例５．１．１ではＭ．ヤバニカ＋Ｍ．インコグニタ（感染態幼虫１００匹／基質１００ｃｍ^３の用量で、トマト植物から得られた各種５０％の混合物）、実施例５．１．２ではＭ．ヤバニカ（感染態幼虫１００匹／基質１００ｃｍ^３の用量で）を接種した。次いで、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を含有する２０ｍＬの水溶液を植物の同じ３分の１に、線虫の接種から７日後（７ＤＡＩ）には、１．１６×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ（実施例５．１．１）または８．９×１０^５ＣＦＵ／ｍＬ（実施例５．１．２）の用量で、および３５ＤＡＩには１．８９×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ（実施例５．１．１）または４．１×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ（実施例５．１．２）の用量で施用した（実施例５．１．１および５．１．２の概要については表２を参照されたい）。

【0207】

【表2】

【0208】

５．２：バチルス・ハロサッカロボランスＢ４１０株のＴＧＡＩのインビボ殺線虫活性

【0209】

細菌Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株のインビボ殺線虫能力を、２つの実験：実施例５．２．１および実施例５．２．２（以下に説明する）で評価した。

【0210】

実験計画は、３つの異なる処理によって構成された：１）未処理植物による対照；２）「農薬原体（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」（「ＴＧＡＩ」は３０％の細胞および７０％のスクロースからなった）として施用された、（平均で）約１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（ＴＧＡＩ－１０^７）の用量でＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０株の懸濁液を用いて処理された植物。３）ＴＧＡＩとして施用された、（平均で）約１０^６ＣＦＵ／ｍＬ（ＴＧＡＩ－１０^６）の用量でＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０株の懸濁液を用いて処理された植物。各処理は、１回の反復実験につき３つの植物を用いる３回の反復実験からなっていた。

【0211】

砂との混合物からなる基質（３：１；体積：体積）を充填した３０００ｃｍ^３のポットに、３～４週齢の２７個のトマト苗（「Ｄｕｒｉｎｔａ」品種）を移植した。移植の１日後、全てのトマト植物に、ネコブセンチュウのＭ．ヤバニカ＋Ｍ．インコグニタの混合物を含む水懸濁液を接種した（感染態幼虫１００匹／基質１００ｃｍ^３の用量）。これは、Ｍ．ヤバニカ（集団ＡＬ０５）５０％＋Ｍ．インコグニタ（集団ＡＬ０９）５０％のこの線虫の混合物であった。２つの集団は（ＩＦＡＰＡによって）スペインのアルメリアから単離された。植物には３つの異なるセットがあった：

【0212】

実施例５．２．１
植物の１／３は未処理であった（Ｂ４１０株を用いない対照植物）。

【0213】

移植の３日前に、別の１／３の植物を、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を１．３０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの用量で含有する水溶液１０ｍＬで１回処理した（予防処理）。次いで、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を、線虫の接種から７日後（７ＤＡＩ）には４．９０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ、２１ＤＡＩには１．５７×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ、および３５ＤＡＩには６．００×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの用量で含有する水溶液２０ｍＬを、植物の同じ３分の１に施用した。

【0214】

また、移植の３日前に、植物の最後の３分の１を、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を２．１６×１０^６ＣＦＵ／ｍＬの用量で含有する水溶液１０ｍＬで１回処理した（予防処理）。次いで、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を、線虫の接種から７日後（７ＤＡＩ）には４．４０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ、２１ＤＡＩには１．７５×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ、および３５ＤＡＩには４．３０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬの用量で含有する水溶液２０ｍＬを、植物の同じ３分の１に施用した。

【0215】

実施例５．２．２：
植物の１／３は未処理であった（Ｂ４１０株を用いない対照植物）。

【0216】

移植の３日前に、別の１／３の植物を、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を１．３６×１０^８ＣＦＵ／ｍＬの用量で含有する水溶液１０ｍＬで１回処理した（予防処理）。次いで、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を、線虫の接種から７日後（７ＤＡＩ）には３．３６×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ、２１ＤＡＩには５．４０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ、および３５ＤＡＩには６．６０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの用量で含有する水溶液２０ｍＬを、植物の同じ３分の１に施用した。

【0217】

また、移植の３日前に、植物の最後の３分の１を、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を１．７６×１０^７ＣＦＵ／ｍＬの用量で含有する水溶液１０ｍＬで１回処理した（予防処理）。次いで、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株を、線虫の接種から７日後（７ＤＡＩ）には２．６０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ、２１ＤＡＩには４．１０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ、および３５ＤＡＩには７．６０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬの用量で含有する水溶液２０ｍＬを、植物の同じ３分の１に施用した。

【0218】

【表3】

【0219】

５．３：バチルス・ハロサッカロボランスＢ４１０株の「プロトタイプ製剤」のインビボ殺線虫活性

【0220】

細菌Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株に基づく殺線虫製剤のインビボ殺線虫能力を、２つの実験、実施例５．３．１および実施例５．３．２で評価し、これらの実験は両方ともＭ．ヤバニカとＭ．インコグニタとの混合物（トマト植物から得らた）に対するものであった。

【0221】

材料および方法
実験計画は、２つの異なる処理によって構成された：１）未処理植物による対照；２）「製剤」（ＯＤ）として施用された、（平均で）実施例５．３．１では３．３６×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ（製剤－１０^７）または実施例５．３．２では２．６１×１０^７ｃｆｕ／ｍＬ（製剤－１０^７）の用量でＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０株の懸濁液を用いて処理された植物。両方の処理は、１回の反復実験につき３つの植物を用いる３回の反復実験からなっていた。

【0222】

砂とパーライトとの混合物からなる基質（３：１；体積：体積）を充填した３０００ｃｍ^３のポットに、３～４週齢の１８個のトマト苗（「Ｄｕｒｉｎｔａ」品種）を移植した。移植の１日後、全てのトマト植物に、ネコブセンチュウを含む水懸濁液、実施例５．３．１ではＭ．ヤバニカ＋Ｍ．インコグニタ（感染態幼虫１００匹／基質１００ｃｍ^３の用量で）、または実施例５．３．２ではＭ．ヤバニカ（感染態幼虫およそ１００匹／基質１００ｃｍ^３の用量）を接種した。植物には２つの異なるセットがあった：

【0223】

植物の半分を未処理（対照植物）とした。植物の他の半分を、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株に基づく製剤を１％含有する２０ｍＬの水溶液で、２．９２×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（実施例５．３．１）または２．６４×１０^７（実施例５．３．２）の用量で移植日に１回処理した（予防処理）。次いで、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株に基づく製剤を１％を含有する水溶液２０ｍＬを植物の同じ半分に、線虫の接種から７日後（７ＤＡＩ）には３．６０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（実施例５．３．１）または４．２０×１０^７（実施例５．３．２）の用量で、２１ＤＡＩには３．３０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（実施例５．３．１）または１．８０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（実施例５．３．２）；および３５ ＤＡＩには３．６０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（実施例５．３．１）または１．８０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ（実施例５．３．２）の用量で施用した。実施例５．３．１および５．３．２の概要については表４を参照されたい。

【0224】

製剤は、ダイズ植物油（Ｇｕｓｔａｖｅ Ｈｅｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）６９０ｇ／Ｌ＋シリカ（Ｓｉｌｙｓｉａｍｏｎｔ、Ｉｔａｌｙ）（１０ｇ／Ｌ）＋エトキシル化脂肪酸エステル（Ｌａｍｂｅｒｔｉ－Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ、Ｉｔａｌｙ）（２００ｇ／Ｌ）＋ＴＧＡＩ（本発明の株）（１００ｇ／Ｌ）の混合物からなっていた。材料を、油用に設計された高速撹拌機を使用して実験用反応器内で混合した。

【0225】

【表4】

【0226】

全ての事例において、植物は温室内に置いた。実施例５．１では、苗を移植してから１０週間の間温度（Ｔ）：２２±２℃－相対湿度（ＨＲ）：５０±１０；実施例５．２および５．３では、苗を移植してから９週間の間Ｔ：２５±２－ＨＲ：５０±１０）であった。

【0227】

すべての実験（実験５．１、５．２および５．３）について、バイオアッセイの最後に、植物当たりの卵の総数および根当たりの卵のグラム数を各処理で決定した：卵を機械的破壊によって根系から抽出し、２００メッシュ（７５μｍ）～５００メッシュ（２５μｍ）の異なるふるいに通した（カウントは、Ｈａｗｋｓｌｅｙ（登録商標）チャンバを用い、顕微鏡Ｏｐｔｅｃｈ ｂｉｏｓｔａｒ Ｂ４、Ｏｐｔｅｃｈ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。

【0228】

移植後１０または９週間（「ペレット」の場合は１０週間、ＴＧＡＩおよびＯＤ製剤の場合は９週間）のすべての処理において、卵/植物の数の平均Ｐｆおよび線虫の繁殖（卵／新鮮な根のグラム）を評価した。

【0229】

処理を行った後の全ての事例において、データを、Ｒソフトウェア（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２０１３年、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供した。処理間の有意差を、Ｐ＜０．０５での最小有意差（ＬＳＤ）検定によって決定した。

【0230】

ペレット、ＴＧＡＩおよびＯＤ製剤を使用したインビボ実験の結果：

【0231】

インビボアッセイで得られた結果は、ペレットとして、ＴＧＡＩとして、または１％ ＯＤ製剤として施用されたＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０株がＲＫＮに対して殺線虫活性を有することを示し、それらはすべての場合において対照と比較して両方のパラメータで有意な減少を示した（以下の表５を参照された）。

【0232】

【表5】

【0233】

ＴＧＡＩの場合、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０－株ＴＧＡＩ １０^７で処理した植物では、低用量（Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株－ＴＧＡＩ １０^６）で処理した植物と比較して、有効性の％が有意に高かった（最終個体数および繁殖）。

【0234】

実施例６．アブラムシに対するバチルス・ハロサッカロボランスＢ４１０株の殺虫有効性の実験室研究

【0235】

ワタアブラムシ、メロンアブラムシ（アフィス・ゴシピイ）に対するＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０株の殺虫有効性を決定するために、実験室研究を行った。

【0236】

材料および方法：
実験はｉ２ＬＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｔｄ．（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ、ＵＫ）の試験施設で、制御された実験室条件下で行った。

【0237】

Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株の殺虫活性を、Ｆｕｔｕｒｅｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ由来の他の細菌株における同じ活性と比較した。これらの微生物は、Ｂ１３２５（バチルス・サフェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ））、Ｂ７８８（カウロバクター属菌種（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ）／カウロバクター・セグニス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｅｇｎｉｓ））、Ｂ９６（リシニバチルス・スフェリカス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）/リシニバチルス・フシフォルミス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ））およびＢ１００１（バチルス・フミ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｕｍｉ））であり、これらは潜在的な殺虫効果によって選択された。４種の微生物（ＴＧＡＩ）を標準的な比率（５Ｅ＋０７ＣＦＵ／ｍＬ、施用量２ｍＬ）で試験した。試験した生成物を試験開始前に水で希釈し、溶液を十分に撹拌してそれらの均一性を確保した。陰性対照（水のみ）も比較目的のために含めた。処理を、以下の表によって指定される比率で植物材料上の昆虫に直接施した。各処理は３回の反復実験で構成された。

【0238】

昆虫（ワタアブラムシ、メロンアブラムシであるアフィス・ゴシピイ）は、社内の実験室培養物から供給された。性別および年齢が混合された成虫を実験に使用した。

【0239】

ペトリ皿に、レタス（ラクトゥカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ））から切りとって、湿った綿毛パッドに載せた葉のディスク/断片を敷いた。１０匹のアブラムシを各ペトリ皿内に数えた（そして植物材料上に直接置いた）。次いで、植物材料およびアブラムシに処理剤を噴霧した。小型アトマイザーを用いて処理を施した。すべての噴霧機器は、使用前に完全に較正された。

【0240】

アブラムシを処理の４８、９６および１４４時間後に評価した。各観察期間において、以下の基準に従って昆虫を採点した：
１．影響なし/健康－個体は影響を受けておらず正常な行動を示した。
２．ノックダウン－個人は指向性運動および/または飛行することができないが、付属器官はプロービングの有無にかかわらず激しく動いている。
３．死亡－触覚刺激に対する応答がない。

【0241】

処理適用時の条件は、温度１５．０℃；湿度（％）、該当なし；および葉の水分、乾燥であった。

【0242】

すべての統計分析を、Ｍｉｎｉｔａｂ（バージョン１６）を使用して行った。各評価からのデータを、処理を因子として分散分析に供した。続いて、テューキーＨＳＤ比較検定を用いて平均を区別した。分析前に、統計モデルの仮定が保持されていることを確認するためにデータをチェックした。データが正常に分布していない場合、変換されたデータセットに対してＡＮＯＶＡを実施した。

【0243】

全ての分析において、処理間に有意差が生じない確率を確率値Ｆ（ｐ（Ｆ））として計算した。全ての試験を９５％信頼区間で行った。

【0244】

結果：

【0245】

Ｂ４１０は最も速く作用するＴＧＡＩであり、曝露４８時間後に有意なアブラムシ死亡率をもたらした。ＡＮＯＶＡからの結果は、試験生成物への曝露の４８時間後、Ｂ４１０が、水対照と比較した場合に有意な死亡率を与える唯一の処理であることを示した。９６時間曝露後、全ての生成物は、水対照と比較して有意なアブラムシ死亡率を示した（図６および図７参照）。この傾向は１４４時間での最終評価まで継続した。

【0246】

試験期間を通して植物毒性効果は記録されなかった。

【0247】

実施例７．マウスにおけるバチルス・ハロサッカロボランスの急性経口毒性の評価

【0248】

材料および方法：
Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株が安全であるかどうかを決定するために、マウスにおけるその経口毒性を試験した。

【0249】

材料および方法：
４～５週齢の３匹の雄および３匹の雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（ＱＣ’ｄアルビノ病原体フリーマウス；Ｅｎｖｉｇｏ）を使用した。動物は、投与前に一晩絶食させた。実験の前日に、動物の体重を記録し、個々の動物から糞便試料を採取した。各動物は、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０株：１０^９ＣＦＵ Ｂ４１０ＴＧＡＩ（ビヒクル２００μＬの滅菌Ｈ_２Ｏ）（前述のように調製）の経口単回投与を受けた。滅菌水（ビヒクル対照）を投与したマウスも試験全体を通して維持した。マウスを制御された環境下に収容し、２１日間モニタリングし、観察を記録した。毎日、１回、各動物について以下を観察した：皮膚および毛皮、目および粘膜、呼吸系、循環系、自律神経系および中枢神経系、体動活動、行動パターン、振戦、痙攣、下痢、嗜眠、唾液分泌およびもしあれば昏睡の観察。個々の動物の体重を、週に１回、経管栄養の前および後に調べた。組織中の細菌株の有無を評価するために、経口経管栄養後２１日目の最後に剖検を行った。交差汚染を避けるために、組織採取および血液培養を無菌的に行った。

【0250】

剖検：腎臓、脳、肝臓、肺、脾臓、血液および腸リンパ節を各動物から採取し、直ちにドライアイス中に保持し、さらなる処理まで－２０℃で保存した。ＲＮＡを上記組織から抽出し、特異的プライマーを使用してＲＴ－ＰＣＲを行い、Ｂ４１０ ＴＧＡＩの存在を決定した：「Ｂ ｎｅｏｂｅｎ Ｆ１、Ｆ１」５’－ＣＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧ－３’（配列番号４）；「Ｂ ｎｅｏｂｅｎ Ｒ１」、５’－ＣＣＣＡＡＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＡＣＣＴ－３’（配列番号５）；「Ｂ ｎｅｏｂｅｎ Ｆ２」、５’－ＴＣＧＧＧＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＴＴ－３’（配列番号６）；および「Ｂ ｎｅｏｂｅｎ Ｒ２」、５’－ＴＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡ－３’（配列番号７）。増幅産物がＢ．ハロサッカロボランスの１６Ｓであることを確実にするために、これらの２対のプライマーを使用した。

【0251】

血液処理：剖検時に、無菌全血試料を各動物から採取した。

【0252】

採取直後に、各血液試料１００μＬを寒天プレート上に置き、広げ、２８℃で１２０時間維持した。プレートを定期的に分析して、細菌増殖を評価した。

【0253】

微生物有害生物防除剤（ＭＰＣＡ）のクリアランス：投与時ならびに７、１４および２１日目の糞便採取物を、さらなるＲＮＡ抽出およびＲＴ－ＰＣＲ分析のために４℃に維持した。

【0254】

血液／細菌培養培地：肉エキス１ｇ、酵母エキス２ｇ、ペプトン５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１５ｇを添加し（１０００ｍｌ中）、１２１℃で２０分間滅菌し、その後、プレートに注ぎ、血液培養およびＢ４１０ＴＧＡＩ ＣＦＵ／ｇの測定に使用した。ＲＮＡ抽出プロトコル：５０ｍｇの組織を、製造者の説明書（ＲＮＡ単離キットＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｒ１０５０）に従ってＲＮＡ抽出に使用した。

【0255】

スパイク対照：１００μＬの１０^９ＣＦＵのＴＧＡＩを５０ｍｇの脳および肝臓組織にスパイクし、全ＲＮＡを、製造業者の説明書（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従ってＱｕｉｃｋ ＲＮＡ 全ＲＮＡ抽出キットを使用して、細菌ＲＮＡを含む全ＲＮＡを単離するための、上記キットに含まれるプロテイナーゼＫの添加およびリゾチーム消化工程によって抽出した。

【0256】

陽性対照：０．２ｇのＢ４１０ ＴＧＡＩを滅菌水中で７回連続希釈し、プレーティングし（１００μＬ）、試料１ｇあたりのＣＦＵを再確認した。寒天プレート上で増殖させた細菌コロニーを収集し、全ＲＮＡ抽出および試験の陽性対照として直接使用した。

【0257】

ｃＤＮＡ合成：組織および糞便由来の全ＲＮＡをマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）で測定した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ合成キット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１８０９１０５０）を使用することによって、２μｇの全ＲＮＡ（糞便試料の場合は１μｇ）をｃＤＮＡ合成のために使用した。適切な陽性対照（Ｂ４１０ ＴＧＡＩ）および陰性対照（Ｈ_２Ｏ）も維持した。

【0258】

ＲＴ－ＰＣＲアッセイ：ｃＤＮＡ混合物の合計２０μＬを１：１０倍（組織試料）および１：５倍（糞便試料ｃＤＮＡ）に希釈し、ＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを製造者の説明書（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ２５７７６）に従って使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）リアルタイムＰＣＲ装置を用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、５μＬのＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、０．５μＬの各特異的プライマー（Ｆ１およびＲ１、またはＦ２およびＲ２）、および鋳型として１０ｎｇのｃＤＮＡからなり、総反応体積は２０μＬであった。熱サイクル条件は以下の通りであった：５０℃で２分、９５℃で２分、ならびに９５℃で１５秒、６０℃で１５秒、および７２℃で１分を４０サイクル。

【0259】

結果：

【0260】

対照動物およびＢ．ハロサッカロボランスＢ４１０経管栄養動物の体重は有意に異ならなかった。２８℃で１２０時間インキュベートした血液培養プレートは目に見える増殖を示さず、陰性と結論付けられた。モニターされた臨床症状は有害な変化を示さなかった。ＲＴ－ＰＣＲデータにより、１６ｓｒＤＮＡ特異的プライマーが、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０経管栄養動物由来の組織または糞便試料のいずれにおいても増幅されなかったことが明らかになった（平均Ｃｔ値３３）。Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０ＴＧＡＩをスパイクした組織試料を、Ｂ．ハロサッカロボランス特異的プライマーを陽性対照（脳については平均スパイクＣｔ値２０および肝臓については２５）と共に使用して増幅させた。陰性対照（水を経管栄養）は、ＲＴ－ＰＣＲで増幅を有していなかった（平均Ｃｔ値３２）。陽性対照の１６ｓ ｒＤＮＡプライマーは、６サイクルで増幅した（Ｃｔ値１２）。データは、特異的ＲＴ－ＰＣＲプライマーを使用してスクリーニングした試料のいずれにおいても、Ｂ．ハロサッカロボランスＢ４１０が存在しないことを明らかにしている。

【0261】

動物は目に見える臨床的有害作用を有さず、感染性または病原性は見られなかった。菌株を経管栄養された動物には目に見える臨床的有害作用はなく、細菌株は、検査した血液、糞便または他の器官で検出されなかった。

【0262】

本願で引用された参照文献
WO9404684
Xiang N et al. "Biological control of Meloidogyne incognita by Spore-forming Plant Growth-promoting Rhizobacteria on Cotton” Plant Disease 2017(101)774-784.
Sambrook, J. and Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Chapter 13, "Mutagenesis", Cold Spring Harbor, 3rd Ed, 2001.
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Altschul et al., "Basic local alignment search tool”, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, pages 403-410.
Higgins et al., "CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment”, 1992, CABIOS, 8(2), pages 189-191
Richter M, et al. 2015 JSpeciesWS: a web server for prokaryotic species circumscription based on pairwise genome comparison. Bioinformatics. 2015 Nov 16. pii: btv681
Aubert et al., "A Markerless Deletion Method for Genetic Manipulation of Burkholderia cenocepacia and Other Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacteria” Methods Mol Biol 2014;1197:311-27.

【0263】

完全を期すために、本願発明の種々の面を以下の番号の項に提示する。
第１項．受託番号ＣＥＣＴ９１６５で「Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ」（ＣＥＣＴ）に寄託されたバチルス・ハロサッカロボランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｓａｃｃｈａｒｏｖｏｒａｎｓ）の菌株、または出発材料としてバチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５を使用して得られ、ＣＥＣＴ９１６５の殺線虫効果および殺アブラムシ効果を維持するその変異体。

第２項．第１項に記載の菌株またはその変異体を含み、好ましくは接種製品である細菌培養物。
第３項．第１項に記載のバチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株、または第２項に記載の細菌培養物の有効量と、１または複数の農業的に許容される化合物とを含む組成物。
第４項．前記菌株が１０^５ＣＦＵ／ｍｌ～１０^１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度で存在する、第３項に記載の組成物。
第５項．油性懸濁（ｏｉｌ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）製剤として製剤化され、好ましくは油性成分、有機エステルおよびシリカを含む、第３項または第４項に記載の組成物。
第６項．少なくとも１種の追加の農薬を含む、第３項～第５項のいずれか一項に記載の組成物。
第７項．ＣＥＣＴ９１６５の殺線虫効果および殺虫効果を維持するＢ．ハロサッカロボランス（Ｂ．ｈａｌｏｓａｃｃｈａｒｏｖｏｒａｎｓ）のＣＥＣＴ９１６５の菌株の変異体を得る方法であって、ＣＥＣＴ９１６５株をＤＮＡ組換え技術、好ましくは突然変異誘発に供する工程を含む方法。
第８項．第１項に定義されるバチルス・ハロサッカロボランスのＣＥＣＴ９１６５株またはその変異体に由来する生細胞懸濁液を得るための方法であって、（ｉ）前記菌株を培地に接種すること、（ｉｉ）工程（ｉ）の接種された培地を前記菌株の増殖に適した条件に供すること、および（ｉｉｉ）場合により、工程（ｉｉ）から得られた前記培地を濃縮工程に供すること、を含む方法。
第９項．植物における線虫および／またはアブラムシ感染を防除するための、殺線虫効果および殺虫効果を有するバチルス・ハロサッカロボランスの単離株の使用。
第１０項．植物において線虫および／またはアブラムシによって引き起こされる感染を防除する方法であって、殺線虫効果および殺虫効果を有するバチルス・ハロサッカロボランスの単離株を、植物の一部または前記植物を成長させるために使用される基質に施用することを含む方法。
第１１項．前記単離株が細菌培養物の形態または組成物の形態で施用され、前記組成物が１または複数の農業的に許容される化合物をさらに含む、第９項に記載の使用または第１０項に記載の方法。
第１２項．線虫が、メロイドギン（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属およびグロボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）属から選択される；あるいは、メロイドギン・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、メロイドギン・ヤバニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）、グロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）およびグロボデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｌｌｉｄａ）からなる群から選択される；あるいは、アブラムシがアフィス（Ａｐｈｉｓ）属のものである；あるいは、アブラムシがアフィス・ゴシピイ（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｒ）である；あるいは、線虫がメロイドギン属から選択され、アブラムシがアフィス属のものである；あるいは、線虫がグロボデラ属から選択され、アブラムシがアフィス属のものである；あるいは、線虫がメロイドギン属から選択され、アブラムシがアフィス・ゴシピイである；あるいは、線虫がグロボデラ属から選択され、アブラムシがアフィス・ゴシピイである；あるいは、線虫がメロイドギン・インコグニタ、メロイドギン・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダからなる群から選択され、アブラムシがアフィス属のものである；あるいは、線虫がメロイドギン・インコグニタ、メロイドギン・ヤバニカ、グロボデラ・ロストキエンシスおよびグロボデラ・パリダからなる群から選択され、アブラムシがアフィス・ゴシピイである、第９項もしくは第１１項のいずれか一項に記載の使用、または第１０項もしくは第１１項のいずれか一項に記載の方法。
第１３項．前記単離株が、第１項に定義される菌株である、第９項、第１１項、もしくは第１２項のいずれか一項に記載の使用、または第１０項、第１１項もしくは第１２項のいずれか一項に記載の方法。
第１４項．第１項の菌株、第２項の細菌培養物または第３項～第６項のいずれか一項に定義される組成物の有効量を含むキット。
第１５項．植物において線虫および／またはアブラムシによって引き起こされる感染を防除するための、第１４項に記載のキットの使用。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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