特許 7614650 核酸、薬物組成物及び複合体並びに調製方法と使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-07

(45)【発行日】2025-01-16

(54)【発明の名称】核酸、薬物組成物及び複合体並びに調製方法と使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20250108BHJP

   A61K 47/56 20170101ALI20250108BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20250108BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20250108BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20250108BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 130Z

A61K47/56

A61K31/713 ZNA

A61P29/00

A61P7/02

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2021569555

(86)(22)【出願日】2020-05-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-27

(86)【国際出願番号】 CN2020091606

(87)【国際公開番号】W WO2020238758

(87)【国際公開日】2020-12-03

【審査請求日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】201910441597.6

(32)【優先日】2019-05-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】517452453

【氏名又は名称】スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＵＺＨＯＵ ＲＩＢＯ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ホンイェン

(72)【発明者】

【氏名】カオ、シャン

(72)【発明者】

【氏名】カン、タイウー

【審査官】西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５１９７９７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

肝細胞における血漿プレカリクレイン（ＰＫＫ）遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ複合体であって、
前記ｓｉＲＮＡ複合体は式（３０８）に示される構造を有し、

【化1】

式中、
ｎ１は、１～２から選択される整数であり、ｎ３は、０～１から選択される整数であり、ｎ１＋ｎ３＝２～３であり、
各ｍ１、ｍ２又はｍ３はそれぞれ独立して、２～１０から選択される整数であり、
各Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４又はＲ_１５は、それぞれ独立して、Ｈ、メチル基及びエチル基からなる群より選択され、
Ｒ_３は式（Ａ５９）に示される構造の基であり、

【化2】

式中、Ｅ_１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ_２であり、
ＮｕはｓｉＲＮＡであり、
前記ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであって、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、同一又は異なる長さを有し、
前記センス鎖は１９～２３ヌクレオチドの長さを有し、前記アンチセンス鎖は１９～２６ヌクレオチドの長さを有し、
前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である二本鎖領域を形成し、
前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、
５’－ＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵＺ_１－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ_２ＡＡＣＵＧＡＡＵＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣ－３’（配列番号２）
ただし、Ｚ_１はＵであり、Ｚ_２はＡであり、
前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_１に対応するヌクレオチドＺ_３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_２に対応するヌクレオチドＺ_４が含まれ、前記Ｚ_４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２で示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチドの相違は、Ｚ_４の位置における相違であり、Ｚ_４はＵ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号６１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、
５’－ＧＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＧＡＵＡＧＵＧＺ_５－３’（配列番号６１）、
５’－Ｚ_６ＣＡＣＵＡＵＣＵＵＵＣＡＡＧＡＡＧＣ－３’（配列番号６２）
ただし、Ｚ_５はＵであり、Ｚ_６はＡであり、
前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_５に対応するヌクレオチドＺ_７が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_６に対応するヌクレオチドＺ_８が含まれ、前記Ｚ_８は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２で示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチドの相違は、Ｚ_８の位置における相違であり、Ｚ_８はＵ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、
５’－ＧＡＡＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＣＡＵＣＡＺ_９－３’（配列番号１２１）、
５’－Ｚ_１０ＵＧＡＵＧＡＣＣＡＣＡＵＵＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１２２）
ただし、Ｚ_９はＡであり、Ｚ_１０はＵであり、
前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_９に対応するヌクレオチドＺ_１１が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_１０に対応するヌクレオチドＺ_１２が含まれ、前記Ｚ_１２は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２で示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチドの相違は、Ｚ_１２の位置における相違であり、Ｚ_１２はＡ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、
５’－ＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＵＧＵＵＵＧＵＣＺ_１３－３’（配列番号１８１）、
５’－Ｚ_１４ＧＡＣＡＡＡＣＡＵＵＵＣＵＵＵＧＵＧ－３’（配列番号１８２）
ただし、Ｚ_１３はＵであり、Ｚ_１４はＡであり、
前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_１３に対応するヌクレオチドＺ_１５が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_１４に対応するヌクレオチドＺ_１６が含まれ、前記Ｚ_１６は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２で示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチドの相違は、Ｚ_１６の位置における相違であり、Ｚ_１６はＵ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、
５’－ＧＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＵＡＺ_１７－３’（配列番号２４１）、
５’－Ｚ_１８ＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＧＡＡＵＵＣ－３’（配列番号２４２）
ただし、Ｚ_１７はＵであり、Ｚ_１８はＡであり、
前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_１７に対応するヌクレオチドＺ_１９が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_１８に対応するヌクレオチドＺ_２０が含まれ、前記Ｚ_２０は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２で示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチドの相違は、Ｚ_２０の位置における相違であり、Ｚ_２０はＵ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が１つ以下であり、
５’－ＧＧＵＣＵＧＵＧＣＵＧＧＣＵＡＵＡＡＺ_２１－３’（配列番号３０１）、
５’－Ｚ_２２ＵＵＡＵＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣ－３’（配列番号３０２）
ただし、Ｚ_２１はＡであり、Ｚ_２２はＵであり、
前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_２１に対応するヌクレオチドＺ_２３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_２２に対応するヌクレオチドＺ_２４が含まれ、前記Ｚ_２４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２で示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチドの相違は、Ｚ_２４の位置における相違であり、Ｚ_２４はＡ、Ｃ又はＧから選択され、
Ｒ_２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）_２、Ｃ_２－Ｃ_１０アルケニレン基、Ｃ_２－Ｃ_１０アルキニレン基、Ｃ_６－Ｃ_１０アリーレン基、Ｃ_３－Ｃ_１８ヘテロシクリレン基及びＣ_５－Ｃ_１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_６－Ｃ_１０アリール基、Ｃ_５－Ｃ_１０ヘテロアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＯＣ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＳＣ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ_２、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＮＨ_２、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＳＯ_２（フェニル基）、－ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＳＯ_２ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＳＯ_２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ_２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各Ｌ_１は独立して、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレンであり、１又は複数の炭素原子は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）_２、Ｃ_２－Ｃ_１０アルケニレン基、Ｃ_２－Ｃ_１０アルキニレン基、Ｃ_６－Ｃ_１０アリーレン基、Ｃ_３－Ｃ_１８ヘテロシクリレン基及びＣ_５－Ｃ_１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ_１は、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_６－Ｃ_１０アリール基、Ｃ_５－Ｃ_１０ヘテロアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＯＣ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＳＣ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ_２、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＮＨ_２、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＳＯ_２（フェニル基）、－ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＳＯ_２ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＳＯ_２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ_２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、

は、基が共有結合的に結合する部位を表し、
Ｍ_１は標的基を表す、ｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項2】

前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵＺ_３－３’（配列番号３）、
５’－Ｚ_４ＡＡＣＵＧＡＡＵＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣ－３’（配列番号４）
ただし、Ｚ_４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_３は、Ｚ_４と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＧＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＧＡＵＡＧＵＧＺ_７－３’（配列番号６３）、
５’－Ｚ_８ＣＡＣＵＡＵＣＵＵＵＣＡＡＧＡＡＧＣ－３’（配列番号６４）
ただし、Ｚ_８は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_７は、Ｚ_８と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＧＡＡＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＣＡＵＣＡＺ_１１－３’（配列番号１２３）、
５’－Ｚ_１２ＵＧＡＵＧＡＣＣＡＣＡＵＵＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１２４）
ただし、Ｚ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_１１は、Ｚ_１２と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＵＧＵＵＵＧＵＣＺ_１５－３’（配列番号１８３）、
５’－Ｚ_１６ＧＡＣＡＡＡＣＡＵＵＵＣＵＵＵＧＵＧ－３’（配列番号１８４）
ただし、Ｚ_１６は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_１５は、Ｚ_１６と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号２４３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号２４４に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＧＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＵＡＺ_１９－３’（配列番号２４３）、
５’－Ｚ_２０ＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＧＡＡＵＵＣ－３’（配列番号２４４）
ただし、Ｚ_２０は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_１９は、Ｚ_２０と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３０３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号３０４に示されるヌクレオチド配列であり、
５’－ＧＧＵＣＵＧＵＧＣＵＧＧＣＵＡＵＡＡＺ_２３－３’（配列番号３０３）、
５’－Ｚ_２４ＵＵＡＵＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣ－３’（配列番号３０４）
ただし、Ｚ_２４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_２３は、Ｚ_２４と相補的なヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項3】

前記センス鎖がヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶの長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩがヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、ヌクレオチド配列ＩＶがヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項4】

前記ヌクレオチド配列Ｉが配列番号１に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＣＡＡであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉが配列番号６１に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＵＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧＵＵであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉが配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＣＵＵであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉが配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＡＧＵであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉが配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＣＵであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列Ｉが配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＡＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧＡＵである、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項5】

前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’突出端を構成する、請求項１～４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項6】

前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵＺ_３－３’（配列番号５）、
５’－Ｚ_４ＡＡＣＵＧＡＡＵＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＵ－３’（配列番号６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＡＡＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵＺ_３－３’（配列番号７）、
５’－Ｚ_４ＡＡＣＵＧＡＡＵＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＵＧＧ－３’（配列番号８）
ただし、前記Ｚ_４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_４は、Ｚ_３と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＧＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＧＡＵＡＧＵＧＺ_７－３’（配列番号６５）、
５’－Ｚ_８ＣＡＣＵＡＵＣＵＵＵＣＡＡＧＡＡＧＣＡＡ－３’（配列番号６６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号６８に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＵＵＧＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＧＡＵＡＧＵＧＺ_７－３’（配列番号６７）、
５’－Ｚ_８ＣＡＣＵＡＵＣＵＵＵＣＡＡＧＡＡＧＣＡＡＣＣ－３’（配列番号６８）
ただし、前記Ｚ_８は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_７は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_８は、Ｚ_７と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号１２５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＧＡＡＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＣＡＵＣＡＺ_１１－３’（配列番号１２５）、
５’－Ｚ_１２ＵＧＡＵＧＡＣＣＡＣＡＵＵＧＣＵＵＣＡＡ－３’（配列番号１２６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号１２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＵＵＧＡＡＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＣＡＵＣＡＺ_１１－３’（配列番号１２７）、
５’－Ｚ_１２ＵＧＡＵＧＡＣＣＡＣＡＵＵＧＣＵＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１２８）
ただし、前記Ｚ_１２は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_１１は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_１２は、Ｚ_１１と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＵＧＵＵＵＧＵＣＺ_１５－３’（配列番号１８５）、
５’－Ｚ_１６ＧＡＣＡＡＡＣＡＵＵＵＣＵＵＵＧＵＧＡＣ－３’（配列番号１８６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＧＵＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＵＧＵＵＵＧＵＣＺ_１５－３’（配列番号１８７）、
５’－Ｚ_１６ＧＡＣＡＡＡＣＡＵＵＵＣＵＵＵＧＵＧＡＣＵＣ－３’（配列番号１８８）
ただし、前記Ｚ_１６は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_１５は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_１６は、Ｚ_１５と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＧＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＵＡＺ_１９－３’（配列番号２４５）、
５’－Ｚ_２０ＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＧＡＡＵＵＣＡＧ－３’（配列番号２４６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号２４７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号２４８に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＣＵＧＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＵＡＺ_１９－３’（配列番号２４７）、
５’－Ｚ_２０ＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧ－３’（配列番号２４８）
ただし、前記Ｚ_２０は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_１９は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_２０は、Ｚ_１９と相補的なヌクレオチドであり、
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号３０５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号３０６に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＧＧＵＣＵＧＵＧＣＵＧＧＣＵＡＵＡＡＺ_２３－３’（配列番号３０５）、
５’－Ｚ_２４ＵＵＡＵＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＡＵ－３’（配列番号３０６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号３０７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号３０８に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’－ＡＵＧＧＵＣＵＧＵＧＣＵＧＧＣＵＡＵＡＡＺ_２３－３’（配列番号３０７）、
５’－Ｚ_２４ＵＵＡＵＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＡＵＣＣ－３’（配列番号３０８）
ただし、前記Ｚ_２４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_２３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_２４は、Ｚ_２３と相補的なヌクレオチドである、請求項１～５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項7】

前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項8】

各非フルオロ修飾ヌクレオチドがいずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドが、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項７に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項9】

５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第７、８及び９位のヌクレオチドが－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである請求項８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項10】

前記ｓｉＲＮＡにおいて、少なくとも１つのリン酸エステル基がチオリン酸エステル基であり、該チオリン酸エステル基が、
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項１～９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項11】

前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドが、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、前記５’－リン酸ヌクレオチドが、式（２）に示される構造を有するヌクレオチドであり、前記５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが、式（３）～式（６）のいずれか１つに示される構造のヌクレオチドから選択され、

【化3】

式中、Ｒが、Ｈ、ＯＨ、メトキシ基又はフッ素から選択され、Ｂａｓｅが、塩基を表し、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される、請求項１～１０に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項12】

前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号６９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号７０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号７１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号７２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１２９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１３０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１３２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１８９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１９０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１９１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１９２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２４９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２５０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２５１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２５２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３０９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３１０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３１１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３１２に示されるヌクレオチド配列を含む、或いは、
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号７３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号７４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号７５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号７６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号７７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号７８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号７９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号８０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号８１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号８２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号８３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号８４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１３４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１３６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１３８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１３９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１４０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１４１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１４２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１４３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１４４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１９３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１９４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１９５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１９６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１９７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１９８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１９９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２００に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２０１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２０２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２０３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２０４に示されるヌクレオチド配列を含み
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２５３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２５４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２５５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２５６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２５７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２５８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２５９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２６０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２６１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２６２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２６３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２６４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３１３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３１４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３１５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３１６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３１７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３１８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３１９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３２０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３２１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３２２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３２３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３２４に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号８５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号８６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号８７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号８８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号８９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号９０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号９１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号９２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号９３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号９４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号９５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号９６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１４５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１４６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１４７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１４８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１４９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１５０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１５１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１５２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１５３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１５４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１５５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１５６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２０５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２０６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２０７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２０８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２０９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２１０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２１１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２１２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２１３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２１４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２１５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２１６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２６５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２６６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２６７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２６８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２６９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２７０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２７１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２７２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２７３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２７４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２７５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２７６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３２５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３２６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３２８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３２９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３３０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３３１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３３２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３３３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３３４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３３５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３３６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号４０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号４１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号４２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号４４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号４５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号４６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号４７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号４８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号４９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号５０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号５２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号５４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号５６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号５８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号９７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号９８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号９９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１００に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１０１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１０２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１０３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１０４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１０５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１０６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１０７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１０８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１０９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１１１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１１２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１１３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１１４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１１５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１１６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１１７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１１８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１１９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１２０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１５７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１５８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１５９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１６０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１６１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１６２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１６３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１６４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１６５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１６６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１６７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１６８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１６９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１７０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１７１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１７３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１７４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１７５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１７６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１７７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１７８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２１７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２１８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２１９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２２０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２２１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２２２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２２３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２２４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２２５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２２６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２２８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２２９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２３０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２３１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２３２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２３３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２３４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２３５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２３６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２３７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２３８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２３９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２４０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２７７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２７８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２７９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２８０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２８１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２８２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２８３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２８４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２８５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２８６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２８７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２８８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２８９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２９０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２９１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２９２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２９３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２９４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２９５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２９６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２９７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２９８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２９９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３００に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３３７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３３８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３３９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３４０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３４１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３４２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３４３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３４４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３４５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３４６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３４７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３４８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３４９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３５０に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３５１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３５２に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３５３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３５４に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３５５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３５６に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３５７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３５８に示されるヌクレオチド配列を含み、
又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３５９に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号３６０に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項13】

各Ｌ_１は、独立して式Ａ１～Ａ２６の基及びその任意の組合せからなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【化4】

（式中、各ｊ１は、独立して１～２０の整数であり、
各ｊ２は、独立して１～２０の整数であり、
各Ｒ’は、独立してＣ_１－Ｃ_１０アルキル基であり、
各Ｒａは、式Ａ２７～Ａ４５の基又はその任意の組合せからなる群から選択され、

【化5】

各Ｒｂは、独立してＣ_１－Ｃ_１０アルキル基であり、

は、基が共有結合部分に結合される部位を表す。）

【請求項14】

Ｌ_１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３の基及びその結合の組合せからなる群から選択される、又は、
Ｌ_１は、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである、請求項１３に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項15】

Ｌ_１の長さが３～２５個の原子である、請求項１～１４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項16】

Ｌ_１の長さが４～１５個の原子である、請求項１５に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項17】

ｍ１、ｍ２及びｍ３は、それぞれ独立して２～５の整数である、又は、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項１～１６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項18】

各前記標的基は、独立して哺乳動物の肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体と親和性のあるリガンドである、又は、少なくとも１つの標的基若しくはそれぞれの標的基がガラクトース若しくはＮ－アセチルガラクトサミンである、請求項１～１７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項19】

式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【化6】

【請求項20】

式Ａ５９におけるＰ原子が前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項１～１９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。

【請求項21】

請求項１～２０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体を含む、炎症性疾患又は血栓塞栓性疾患の治療、予防又は軽減用組成物。

【請求項22】

請求項１～２０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体を含む、細胞におけるＰＫＫ遺伝子の発現の抑制用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、血漿プレカリクレイン（ＰＫＫ）遺伝子発現を抑制できる核酸、核酸を含む薬物組成物とｓｉＲＮＡ複合体に関する。本開示は、さらに、これらの核酸、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の調製方法と使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ブラジキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ、ＢＫ）は、血管透過性を高めるための主な調節因子である。ＢＫが多すぎると、血管の漏出が増加し、炎症が悪化する。研究によると、ＢＫの主な天然阻害剤であるＣ１－エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）における遺伝的欠陥は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を引き起こす。稀な疾患であるＨＡＥの患者は、未知のトリガーによって引き起こされる有痛性浮腫の急性発作に苦しむことが多く、喉頭部位の発作は生命を脅かす可能性がある。

【0003】

プレカリクレイン（ＰＫＫ）は、血漿カリクレイン（ＰＫ）の前駆体であり、第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）の活性化によってＰＫに変換され、ＰＫは、高分子キニノゲン（ｈｉｇｈ ｍｏｖｅ ｗｅｉｇｈｔ ｋｉｎｃｈｇｅｎ）を切断してブラジキニンを血管内に放出する。したがって、ＰＫＫ遺伝子の発現を抑制することにより、過剰なＢＫを細胞レベルで抑制し、さらに、過剰なＢＫによって引き起こされる炎症等の疾患又は症状、特に遺伝性血管性浮腫を予防及び治療することができる。また、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）というメカニズムに基づき、関心対象の任意の目的遺伝子の発現を配列特異的に抑制又は遮断し、疾患を治療する目的を達成することができる。

【0004】

ＰＫＫ遺伝子発現を抑制し、遺伝性血管性浮腫を治療するｓｉＲＮＡ薬物を開発する１つの鍵は、適切なｓｉＲＮＡ及びその修飾並びに効果的な送達系を探すことである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本開示の発明者は、驚くべきことに、本開示により提供される以下のｓｉＲＮＡ及びその修飾配列がＰＫＫ遺伝子発現を特異的に抑制することができ、当該ｓｉＲＮＡを含有する薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体が肝臓を特異的に標的とすることにより、肝臓中のＰＫＫ遺伝子の発現を抑制し、炎症性疾患、特に遺伝性血管性浮腫の治療又は予防を実現できることを発見し、それによって本発明を完成するに至った。

【課題を解決するための手段】

【0006】

いくつかの実施形態において、本開示は、ＰＫＫ遺伝子発現を抑制できるｓｉＲＮＡを提供する。当該ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、ｉ）～ｖ）から選択される１組であり、
ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵＺ_１－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ_２ＡＡＣＵＧＡＡＵＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣ－３’（配列番号２）
ただし、Ｚ_１はＵであり、Ｚ_２はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_１に対応するヌクレオチドＺ_３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_２に対応するヌクレオチドＺ_４が含まれ、前記Ｚ_４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号６１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＧＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＧＡＵＡＧＵＧＺ_５－３’（配列番号６１）、
５’－Ｚ_６ＣＡＣＵＡＵＣＵＵＵＣＡＡＧＡＡＧＣ－３’（配列番号６２）
ただし、Ｚ_５はＵであり、Ｚ_６はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_５に対応するヌクレオチドＺ_７が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_６に対応するヌクレオチドＺ_８が含まれ、前記Ｚ_８は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＧＡＡＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＣＡＵＣＡＺ_９－３’（配列番号１２１）、
５’－Ｚ_１０ＵＧＡＵＧＡＣＣＡＣＡＵＵＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１２２）
ただし、Ｚ_９はＡであり、Ｚ_１０はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_９に対応するヌクレオチドＺ_１１が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_１０に対応するヌクレオチドＺ_１２が含まれ、前記Ｚ_１２は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＵＧＵＵＵＧＵＣＺ_１３－３’（配列番号１８１）、
５’－Ｚ_１４ＧＡＣＡＡＡＣＡＵＵＵＣＵＵＵＧＵＧ－３’（配列番号１８２）
ただし、Ｚ_１３はＵであり、Ｚ_１４はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_１３に対応するヌクレオチドＺ_１５が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_１４に対応するヌクレオチドＺ_１６が含まれ、前記Ｚ_１６は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＧＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＵＡＺ_１７－３’（配列番号２４１）、
５’－Ｚ_１８ＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＧＡＡＵＵＣ－３’（配列番号２４２）
ただし、Ｚ_１７はＵであり、Ｚ_１８はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_１７に対応するヌクレオチドＺ_１９が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_１８に対応するヌクレオチドＺ_２０が含まれ、前記Ｚ_２０は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
ｖｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＧＧＵＣＵＧＵＧＣＵＧＧＣＵＡＵＡＡＺ_２１－３’（配列番号３０１）、
５’－Ｚ_２２ＵＵＡＵＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣ－３’（配列番号３０２）
ただし、Ｚ_２１はＡであり、Ｚ_２２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_２１に対応するヌクレオチドＺ_２３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_２２に対応するヌクレオチドＺ_２４が含まれ、前記Ｚ_２４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。

【0007】

いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。

【0008】

いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体を提供する。

【0009】

いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、炎症性疾患、特に遺伝性血管性浮腫の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。

【0010】

いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、炎症性疾患、特に遺伝性血管性浮腫の治療及び／又は予防方法を提供する。

【0011】

いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を細胞と接触させることを含む、前記細胞におけるＰＫＫ遺伝子発現の抑制方法を提供する。

【0012】

いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を含むキットを提供する。

【0013】

＜引用による本明細書への組み込み＞
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許及び特許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。

【発明の効果】

【0014】

本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、当該ｓｉＲＮＡを含む組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、安定性に優れ、ＰＫＫ ｍＲＮＡ抑制活性が高く、オフターゲット効が低減され、及び／又はＰＫＫ関連疾患の症状を顕著に治療、予防又は軽減することができる。

【0015】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体外細胞実験において優れた標的ｍＲＮＡ抑制活性を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、肝細胞において少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の標的ｍＲＮＡ発現抑制率を示す。本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系においてＰＫＫ ｍＲＮＡに対して高い抑制活性を示し、異なるｓｉＲＮＡ濃度でＰＫＫ目的配列に対していずれも一定の抑制効果を示し、特に０．１ｎＭ濃度で、ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ１Ｍ１Ｓ及びｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓによる目的配列に対する抑制率は９０％程度の高さに達することができる。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、体外においてヒトＰＫＫ遺伝子断片を安定的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞においてＰＫＫ ｍＲＮＡに対していずれも高い抑制作用を示し、特に、ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ及びｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１ＳによるＰＫＫ ｍＲＮＡ抑制率がいずれも約８０％に達する。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、体外においてヒトＰＫＫ遺伝子断片を安定的にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞においてＰＫＫ ｍＲＮＡに対していずれも高い抑制作用を示し、抑制率が少なくとも５３．２％であり、ひいては８３．１％にも達する。

【0016】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内における安定性及び／又は活性がより高い。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内において少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の標的ｍＲＮＡ発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内において少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＰＫＫ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内において少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝臓内ＰＫＫ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、動物モデルの体内において少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝臓内ＰＫＫ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト被験体の体内において少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝臓内ＰＫＫ遺伝子発現抑制率を示す。

【0017】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、顕著なオフターゲット効果を示していない。オフターゲット効果は、例えば、非標的ｍＲＮＡの遺伝子の正常発現を抑制することであってよい。オフターゲットｍＲＮＡ発現の結合／抑制が標的ｍＲＮＡの効果と比較して５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％未満である場合、当該オフターゲット効果は顕著ではないと見なされる。

【0018】

このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、ＰＫＫ遺伝子の発現を抑制し、炎症性疾患又は塞栓性疾患や生理学的症状、特に遺伝性血管性浮腫及びその関連症状を効果的に治療及び／又は予防することができ、応用において明るい見通しを有している。

【0019】

本開示の他の特徴及び利点については、発明を実施するための形態において詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】様々な濃度の異なるｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクションした後の、体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系における目的配列の相対的発現レベルのヒストグラムである。

【図2】異なるｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後の、体外ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞におけるＰＫＫ ｍＲＮＡの相対的発現レベルのヒストグラムである。

【図3】異なるｓｉＲＮＡ複合体をトランスフェクションした後の、体外ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞におけるＰＫＫ ｍＲＮＡの相対的発現レベルのヒストグラムである。

【図4A】Ｃ５７マウスに５ｍｌ／ｋｇの１×ＰＢＳ、３ｍｇ／ｋｇのＣｙ５－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ又は３ｍｇ／ｋｇのＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰ（ｓｉＲＮＡの量として）を投与してから４８ｈ後のマウス体内の各臓器の蛍光イメージング画像である。

【図4B】Ｃ５７マウスに５ｍｌ／ｋｇの１×ＰＢＳ、３ｍｇ／ｋｇのＣｙ５－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓ又は３ｍｇ／ｋｇのＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓ（ｓｉＲＮＡの量として）を投与してから４８ｈ後のマウス体内の各臓器の蛍光イメージング画像である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下に本開示の発明を実施するための形態を詳しく説明する。また、ここで説明される発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、本開示を制限するためのものではないと理解すべきである。

【0022】

本開示において、ＰＫＫ ｍＲＮＡとは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００８９２．４、ＮＭ＿００１３１８３９４．１又はＮＭ＿００１３１８３９６．１に示される配列を有するｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ＰＫＫ ｍＲＮＡとは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００８９２．４に示される配列を有するｍＲＮＡを指す。さらに、特に説明がない限り、本開示において用いられる用語「標的遺伝子」とは、上記ＰＫＫ ｍＲＮＡを転写する遺伝子を指し、用語「標的ｍＲＮＡ」とは、上記ＰＫＫ ｍＲＮＡを指す。

【0023】

（定義）
文脈において、特に説明がない限り、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字ＶＰは、当該組合せ文字ＶＰの右側に隣接する１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字Ｐｓは、当該組合せ文字Ｐｓの右側に隣接する１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表す。

【0024】

文脈において、前記「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。「ヌクレオチドアナログ」とは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指し、例えば、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＢＮＡ）又は非環式ヌクレオチドがある。前記「メトキシ修飾ヌクレオチド」とは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。

【0025】

本明細書の文脈において、「相補」又は「逆相補」という表現は、互換的に使用されてもよく、当業者に周知の意味、すなわち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基と他方の鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。ＤＮＡにおいて、プリン塩基であるアデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）（又は、ＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）である）と対合し、プリン塩基であるグアニン（Ｃ）は、常にピリミジン塩基であるシトシン（Ｇ）と対合する。各塩基対は、いずれも１つのプリンと１つのピリミジンを含む。一方の鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン（又はウラシル）と対合するとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖同士が相補的である、またその相補鎖の配列から当該鎖の配列を推定できると考えられる。これに応じて、「ミスマッチ」は、本分野では、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合して存在しないことを意味する。

【0026】

文脈において、特に説明がない限り、「基本的に逆相補的」とは、関連する２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「実質的に逆相補的」とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「完全に逆相補的」とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチが存在しないことを指す。

【0027】

文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列に「ヌクレオチド差異」が存在するとは、前者が後者に比べて、同じ位置のヌクレオチドの塩基種類が変化したことを指し、例えば、後者において１つのヌクレオチド塩基がＡであるとき、前者の同じ位置での、対応するヌクレオチド塩基がＵ、Ｃ、Ｇ又はＴである場合に、当該位置で２つのヌクレオチド配列間にヌクレオチド差異が存在すると認められている。いくつかの実施形態において、元の位置のヌクレオチドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はその等価物を用いる場合、当該位置でヌクレオチド差異が生じたとも考えられる。

【0028】

文脈において、特に本開示のｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む組成物又はｓｉＲＮＡ複合体の調製方法を説明する際に、特に説明がない限り、前記ヌクレオシドモノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｎｏｍｅｒ）とは、調製するｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体におけるヌクレオチドの種類と順序に応じてホスホルアミダイト固相合成に用いられる修飾又は未修飾のヌクレオシドホスホルアミダイトモノマー（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ。ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓをＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓということもある）を指す。ホスホルアミダイト固相合成は、当業者に公知のＲＮＡ合成に用いられる方法である。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品を購入可能である。

【0029】

本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」とは、それぞれ特定の機能を有する２つ以上の化学部分間が共有結合的に互いに結合することを指し、これに応じて、「複合体」とは、当該各化学部分間が共有結合的に結合することにより形成された化合物を指す。さらには、「ｓｉＲＮＡ複合体」は、特定の機能を有する１又は複数の化学部分がｓｉＲＮＡに共有結合的に結合して形成された化合物を表す。以下の文章では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を単に「複合体」ともいうことがある。ｓｉＲＮＡ複合体は、文脈により、複数のｓｉＲＮＡ複合体の総称又はある化学式に示されるｓｉＲＮＡ複合体であると理解される。本開示の文脈において、「複合分子」は、反応させることによりｓｉＲＮＡに複合され、最終的に本開示のｓｉＲＮＡ複合体を形成することができる特定の化合物であると理解すべきである。

【0030】

本明細書で用いられる場合、「任意の」又は「任意に」とは、続いて記載する事象又は状況が発生してもよく、発生しなくてもよいこと、並びに当該記載が事象又は状況が発生した場合と発生しない場合を含むことを指す。例えば、「任意に置換され」た「アルキル」は、以下の文章で定義される「アルキル」及び「置換アルキル」を含む。１又は複数の置換基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及び／又は本質的に不安定ないかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されないと、当業者に理解される。

【0031】

本明細書で用いられる場合、「アルキル」とは、特定の数の炭素原子を有する直鎖と分岐鎖を指し、前記特定の数は、通常１～２０個の炭素原子、例えば、１～１０個の炭素原子、１～８個又は１～６個の炭素原子である。例えば、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルは、１～６個の炭素原子の直鎖と分岐鎖アルキルを含む。特定の数の炭素を有するアルキル残基を言及する場合、当該数の炭素を有する全ての分岐鎖及び直鎖形式を含むことを意図する。したがって、例えば、「ブチル」は、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ－ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、ｎ－プロピル及びイソプロピルを含む。アルキレンは、アルキルのサブセットであり、アルキルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。

【0032】

本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素－炭素二重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から１つの水素分子を除去することにより得られる。当該基は、二重結合のシス又はトランス配置にあってもよい。典型的なアルケニルとしては、ビニルと、プロパ－１－エン－１－イル、プロパ－１－エン－２－イル、プロパ－２－エン－１－イル（アリル）、プロパ－２－エン－２－イル等のプロペニルと、ブタ－１－エン－１－イル、ブタ－１－エン－２－イル、２－メチルプロパ－１－エン－１－イル、ブタ－２－エン－１－イル、ブタ－２－エン－２－イル、ブタ－１，３－ジエン－１－イル、ブタ－１，３－ジエン－２－イル等のブテニルとを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルケニルは、２～２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２～１０個、２～８個又は２～６個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニルのサブセットであり、アルケニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。

【0033】

本明細書で用いられる場合、「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキル基を指し、前記炭素－炭素三重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から２つの水素分子を除去することにより得られる。典型的なアルキニルとしては、エチニルと、プロパ－１－イン－１－イル、プロパ－２－イン－１－イル等のプロピニルと、ブタ－１－イン－１－イル、ブタ－１－イン－３－イル、ブタ－３－イン－１－イル等のブチニルとを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルキニルは、２～２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２～１０、２～８又は２～６個の炭素原子を有する。アルキニレンは、アルキニルのサブセットであり、アルキニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。

【0034】

本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、酸素橋により結合した特定の数の炭素原子のアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、２－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２－ヘキシルオキシ、３－ヘキシルオキシ、３－メチルペンチルオキシ等がある。アルコキシは、通常１～１０個、１～８個、１～６個又は１～４個の、酸素橋により結合した炭素原子を有する。

【0035】

本明細書で用いられる場合、「アリール」とは、芳香族単環式又は多環式炭化水素環系から誘導される、環炭素原子から水素原子を除去して形成された基を指す。前記芳香族単環式又は多環式炭化水素環系は、水素及び６～１８個の炭素原子の炭素のみを含有し、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、すなわち、それは、ヒュッケル理論に従う環状、非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。アリールとしては、フェニル、フルオレニル及びナフチル等の基を含むが、これらに限定されない。アリーレンは、アリールのサブセットであり、アリールと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。

【0036】

本明細書で用いられる場合、「ハロゲン置換基」又は「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを指し、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を含む。

【0037】

本明細書で用いられる場合、「ハロゲン化アルキル」とは、特定の数の炭素原子が１又は複数、最大許容数までのハロゲン原子で置換された、上記のように定義されるアルキル基を指す。ハロゲン化アルキルの実例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２－フルオロエチル及びペンタフルオロエチルを含むが、これらに限定されない。

【0038】

「複素環基」とは、２～１２個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１～６個のヘテロ原子とを含む、安定した３～１８員非芳香族環状基を指す。明細書において特に説明がない限り、複素環基は、単環、二環、三環又は四環系であり、縮合環又は架橋環系を含んでもよい。複素環基におけるヘテロ原子は、任意に酸化されてもよい。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。複素環基は、一部飽和又は完全飽和である。複素環基は、環の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。このような複素環基の実例としては、ジオキサニル、チオフェニル［１，３］ジスルホニル（ｔｈｉｅｎｙｌ［１，３］ｄｉｔｈｉａｎｙｌ）、デカヒドロイソキノリニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドール、オクタヒドロイソインドール、２－オキサピペラジニル、２－オキサピペリジル、２－オキサピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、４－ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフラン、トリスルホニル（ｔｒｉｔｈｉａｎｙｌ）、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル（ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、チアモルホリニル（ｔｈｉａｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、１－オキソチオモルホリニル（１－ｏｘｏ－ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）及び１，１－ジオキソチオモルホリニル（１，１－ｄｉｏｘｏ－ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）を含むが、これらに限定されない。

【0039】

「ヘテロアリール」とは、２個～１７個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１～６個のヘテロ原子とを含む、３～１８員芳香環ラジカルから誘導される基を指す。本明細書で用いられる場合、ヘテロアリールは、単環、二環、三環又は四環系であってもよく、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、すなわち、それは、ヒュッケル理論に従う環状非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合環又は架橋環系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子は任意に酸化される。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。ヘテロアリールは、環中の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合される。ヘテロアリールの実例としては、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドール、１，３－ベンゾジオキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル（ｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｄｉｏｘｅｐｉｎｙｌ）、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジニル（ｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｏｘａｚｉｎｙｌ）、１，４－ベンゾジオキサン（１，４－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｎｙｌ）、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｙｌ）、ベンゾジオキシニル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎｙｌ）、ベンゾピラニル、ベンゾピロニル、ベンゾフリル、ベンゾフラノニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２－ａ］ピリジル、カルバゾリル、シンノリル（ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、シクロペンタ［ｄ］ピリミジニル、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル（５，６－ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｈ］ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｙｌ）、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ］シンノリニル（５，６－ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｈ］ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２－ｃ］ピリダジニル、ジベンゾフリル、ジベンゾチオフェニル、フリル、フラノニル、フロ［３，２－ｃ］ピリジル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル（ｉｎｄａｚｏｌｙｌ）、インドール、イソインドール、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル（ｉｎｄｏｌｉｚｉｎｙｌ）、イソオキサゾリル、５，８－メタノ－５，６，７，８－テトラヒドロキナゾリニル（５，８－ｍｅｔｈａｎｏ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｙｌ）、ナフチリジニル（ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｙｌ）、１，６－ナフチリジノニル（１，６－ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｏｎｙｌ）、オキサジアゾリル、２－オキソアゼピニル（２－ｏｘｏａｚｅｐｉｎｙｌ）、オキサゾリル、オキシラニル（ｏｘｉｒａｎｙｌ）、５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロベンゾ［Ｈ］キナゾリニル、１－フェニル－１Ｈ－ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、プテリジニル（ｐｔｅｒｉｄｉｎｙｌ）、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジニル、ピリジル、ピリド［３，２－ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４－ｄ］ピリミジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル（ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｙｌ）、キノリル、テトラヒドロキノリル、５，６，７，８－テトラヒドロキナゾリニル、５，６，７，８－テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、６，７，８，９テトラヒドロ－５Ｈ－シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８－テトラヒドロピリド［４，５－ｃ］ピリダジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、チエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３－ｃ］プリジニル（ｔｈｉｅｎｏ［２，３－ｃ］ｐｒｉｄｉｎｙｌ）及びチオフェニル（ｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ／ｔｈｉｅｎｙｌ）を含むが、これらに限定されない。

【0040】

本開示において各種のヒドロキシ保護基を用いることができる。一般的には、保護基は、化学官能性を特定の反応条件に不敏感にすることができ、かつ分子の残りの部分を実質的に損傷することなく分子中の当該官能性に付加する、及びそれから除去することができる。代表的なヒドロキシ保護基は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，２２２３～２３１１、及びＧｒｅｅｎｅａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２， ２ｄ ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に開示されており、引用により、上記文献は、それぞれ全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル、９－フェニルキサンテン－９－イル（Ｐｉｘｙｌ）及び９－（ｐ－メトキシフェニル）キサンテン－９－イル（Ｍｏｘ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、Ｔｒ（トリチル）、ＭＭＴｒ（４－メトキシトリチル）、ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）及びＴＭＴｒ（４，４’，４’’－トリメトキシトリチル）を含む。

【0041】

「被験体」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋動物を指す。本開示の被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル又は他の種類のマカク属のサル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。

【0042】

本明細書で用いられる場合、「治療」は、有益な又は所望の結果を得る方法を指し、治療効果を含むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根絶又は改善することを意味する。また、治療効果は、被験体が依然として潜在的障害の苦痛を受ける可能性があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する１又は複数の生理学的症状を根絶又は改善することにより、被験体に改善が観察されて得られる。

【0043】

本明細書で用いられる場合、「予防」は、有益又は所望の結果を得る方法を指し、予防効果を含むが、これに限定されない。「予防効果」を得るために、当該疾患に対する診断が行われていないかもしれないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ複合体又は薬物組成物を特定の疾患に罹患するリスクのある被験体に投与、又は疾患の１又は複数の病理学的症状が報告された被験体に投与することができる。

【0044】

一態様では、本開示は、ＰＫＫ遺伝子発現を抑制することができる第１～第６のｓｉＲＮＡを提供する。以下、順に詳細に説明する。

【0045】

本開示のｓｉＲＮＡは、基本的な構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオチド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知であるので、ここで説明を省略する。

【0046】

本開示のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが１９～２６ヌクレオチドである。このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は、１９／１９、１９／２０、１９／２１、１９／２２、１９／２３、１９／２４、１９／２５、１９／２６、２０／２０、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２０／２４、２０／２５、２０／２６、２１／２０、２１／２１、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２１／２５、２１／２６、２２／２０、２２／２１、２２／２２、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２２／２６、２３／２０、２３／２１、２３／２２、２３／２３、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は、１９／２１、２１／２３又は２３／２５である。

【0047】

＜第１のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第１のｓｉＲＮＡであってもよい。

【0048】

前記第１のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第１のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵＺ_１－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ_２ＡＡＣＵＧＡＡＵＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣ－３’（配列番号２）
ただし、Ｚ_１はＵであり、Ｚ_２はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_１に対応するヌクレオチドＺ_３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_２に対応するヌクレオチドＺ_４が含まれ、前記Ｚ_４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。

【0049】

文脈において、「位置が対応する」とは、ヌクレオチド配列の同一端から、ヌクレオチド配列において同じ位置にあることを指す。例えば、ヌクレオチド配列Ｉの３’端の１番目のヌクレオチドは、位置が配列番号１の３’端の１番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドである。

【0050】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。

【0051】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。

【0052】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_４の位置での差異を含み、Ｚ_４がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ_４の位置での差異であり、Ｚ_４がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ_３は、Ｚ_４と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。

【0053】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチがないことを指す。

【0054】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵＺ_３－３’（配列番号３）、
５’－Ｚ_４ＡＡＣＵＧＡＡＵＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣ－３’（配列番号４）
ただし、前記Ｚ_４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_３は、Ｚ_４と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ_３はＵであり、Ｚ_４はＡである。

【0055】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと第２のヌクレオチド配列は、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、かつ長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと同じであるヌクレオチド配列を指す。

【0056】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＣＡＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＵＧＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。

【0057】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。

【0058】

＜第２のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第２のｓｉＲＮＡであってもよい。

【0059】

前記第２のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第２のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＧＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＧＡＵＡＧＵＧＺ_５－３’（配列番号６１）、
５’－Ｚ_６ＣＡＣＵＡＵＣＵＵＵＣＡＡＧＡＡＧＣ－３’（配列番号６２）
ただし、Ｚ_５はＵであり、Ｚ_６はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_５に対応するヌクレオチドＺ_７が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_６に対応するヌクレオチドＺ_８が含まれ、前記Ｚ_８は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。

【0060】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。

【0061】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号６１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。

【0062】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_８の位置での差異を含み、Ｚ_８がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ_８の位置での差異であり、Ｚ_８がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ_７は、Ｚ_８と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。

【0063】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。

【0064】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＧＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＧＡＵＡＧＵＧＺ_７－３’（配列番号６３）、
５’－Ｚ_８ＣＡＣＵＡＵＣＵＵＵＣＡＡＧＡＡＧＣ－３’（配列番号６４）
ただし、前記Ｚ_８は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_８は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_７は、Ｚ_８と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ_７はＵであり、Ｚ_８はＡである。

【0065】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと第２のヌクレオチド配列は、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、かつ長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと同じであるヌクレオチド配列を指す。

【0066】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。

【0067】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。

【0068】

＜第３のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第３のｓｉＲＮＡであってもよい。

【0069】

前記第３のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第３のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＧＡＡＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＣＡＵＣＡＺ_９－３’（配列番号１２１）、
５’－Ｚ_１０ＵＧＡＵＧＡＣＣＡＣＡＵＵＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１２２）
ただし、Ｚ_９はＡであり、Ｚ_１０はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_９に対応するヌクレオチドＺ_１１が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_１０に対応するヌクレオチドＺ_１２が含まれ、前記Ｚ_１２は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。

【0070】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。

【0071】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。

【0072】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_１２の位置での差異を含み、Ｚ_１２がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ_１２の位置での差異であり、Ｚ_１２がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ_１１は、Ｚ_１２と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。

【0073】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。

【0074】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＧＡＡＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＣＡＵＣＡＺ_１１－３’（配列番号１２３）、
５’－Ｚ_１２ＵＧＡＵＧＡＣＣＡＣＡＵＵＧＣＵＵＣ－３’（配列番号１２４）
ただし、前記Ｚ_１２は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_１１は、Ｚ_１２と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ_１１はＡであり、Ｚ_１２はＵである。

【0075】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと第２のヌクレオチド配列は、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける、配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、かつ長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと同じであるヌクレオチド配列を指す。

【0076】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＣＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡＧＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。

【0077】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。

【0078】

＜第４のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第４のｓｉＲＮＡであってもよい。

【0079】

前記第４のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第４のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＵＧＵＵＵＧＵＣＺ_１３－３’（配列番号１８１）、
５’－Ｚ_１４ＧＡＣＡＡＡＣＡＵＵＵＣＵＵＵＧＵＧ－３’（配列番号１８２）
ただし、Ｚ_１３はＵであり、Ｚ_１４はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_１３に対応するヌクレオチドＺ_１５が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_１４に対応するヌクレオチドＺ_１６が含まれ、前記Ｚ_１６は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。

【0080】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。

【0081】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。

【0082】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_１６の位置での差異を含み、Ｚ_１６がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ_１６の位置での差異であり、Ｚ_１６がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ_１５は、Ｚ_１６と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。

【0083】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。

【0084】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＵＧＵＵＵＧＵＣＺ_１５－３’（配列番号１８３）、
５’－Ｚ_１６ＧＡＣＡＡＡＣＡＵＵＵＣＵＵＵＧＵＧ－３’（配列番号１８４）
ただし、前記Ｚ_１６は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_１６は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_１５は、Ｚ_１６と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ_１５はＵであり、Ｚ_１６はＡである。

【0085】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと第２のヌクレオチド配列は、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、かつ長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと同じであるヌクレオチド配列を指す。

【0086】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＡＧＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＣＵＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。

【0087】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。

【0088】

＜第５のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第５のｓｉＲＮＡであってもよい。

【0089】

前記第５のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第５のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＧＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＵＡＺ_１７－３’（配列番号２４１）、
５’－Ｚ_１８ＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＧＡＡＵＵＣ－３’（配列番号２４２）
ただし、Ｚ_１７はＵであり、Ｚ_１８はＡであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_１７に対応するヌクレオチドＺ_１９が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_１８に対応するヌクレオチドＺ_２０が含まれ、前記Ｚ_２０は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。

【0090】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。

【0091】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。

【0092】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_２０の位置での差異を含み、Ｚ_２０がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ_２０の位置での差異であり、Ｚ_２０がＵ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ_１９は、Ｚ_２０と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。

【0093】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。

【0094】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号２４３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号２４４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＧＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＵＡＺ_１９－３’（配列番号２４３）、
５’－Ｚ_２０ＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＧＡＡＵＵＣ－３’（配列番号２４４）
ただし、前記Ｚ_２０は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_１９は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_２０は、Ｚ_１９と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ_１９はＵであり、Ｚ_２０はＡである。

【0095】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと第２のヌクレオチド配列は、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける、配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、かつ長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと同じであるヌクレオチド配列を指す。

【0096】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＣＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＧＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＣＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＧＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。

【0097】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。

【0098】

＜第６のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第６のｓｉＲＮＡであってもよい。

【0099】

前記第６のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第６のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＧＧＵＣＵＧＵＧＣＵＧＧＣＵＡＵＡＡＺ_２１－３’（配列番号３０１）、
５’－Ｚ_２２ＵＵＡＵＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣ－３’（配列番号３０２）
ただし、Ｚ_２１はＡであり、Ｚ_２２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ_２１に対応するヌクレオチドＺ_２３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ_２２に対応するヌクレオチドＺ_２４が含まれ、前記Ｚ_２４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。

【0100】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。

【0101】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。

【0102】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ_２４の位置での差異を含み、Ｚ_２４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ_２４の位置での差異であり、Ｚ_２４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ_２３は、Ｚ_２４と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡ複合体も、本開示の保護範囲内にある。

【0103】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。

【0104】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３０３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号３０４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＧＧＵＣＵＧＵＧＣＵＧＧＣＵＡＵＡＡＺ_２３－３’（配列番号３０３）、
５’－Ｚ_２４ＵＵＡＵＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣ－３’（配列番号３０４）
ただし、前記Ｚ_２４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_２４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_２３は、Ｚ_２４と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ_２３はＡであり、Ｚ_２４はＵである。

【0105】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと第２のヌクレオチド配列は、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該第２のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける、配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、かつ長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと同じであるヌクレオチド配列を指す。

【0106】

いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＡＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＵＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧＡＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＵＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。

【0107】

以下に、ヌクレオチド配列Ｖ、核酸配列、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド修飾、及び修飾配列の説明は、上記第１～第６のｓｉＲＮＡのいずれか１つに適用可能である。すなわち、特に明記されていない場合、以下のｓｉＲＮＡの説明は、第１のｓｉＲＮＡ、第２のｓｉＲＮＡ、第３のｓｉＲＮＡ、第４のｓｉＲＮＡ、第５のｓｉＲＮＡ及び第６のｓｉＲＮＡを１つずつ説明したものと見なされるべきである。例えば、特定のｓｉＲＮＡが指定されていない場合、「前記ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含む」とは、「第１のｓｉＲＮＡ、第２のｓｉＲＮＡ、第３のｓｉＲＮＡ、第４のｓｉＲＮＡ、第５のｓｉＲＮＡ及び第６のｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含む」ことを意味する。

【0108】

いくつかの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’突出端(オーバーハング末端)を構成する。これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は、１９／２０、１９／２１、１９／２２、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｖは、長さが２ヌクレオチドであり、これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は、１９／２１、２１／２３又は２３／２５であってもよい。

【0109】

前記ヌクレオチド配列Ｖにおける各ヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであってもよく、合成しやすく合成コストを節約するために、前記ヌクレオチド配列Ｖは、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド（ｄＴｄＴ）又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチド（ＵＵ）であり、或いは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡとの親和力を向上させるために、ヌクレオチド配列Ｖは、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的である。したがって、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比は１９／２１又は２１／２３であり、このとき、本開示のｓｉＲＮＡはより高いｍＲＮＡサイレンシング活性を有する。

【0110】

標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドとは、５’末端で標的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指す。当該標的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列ＩＩと実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であるヌクレオチド配列であるか、又はヌクレオチド配列ＩＩ及びヌクレオチド配列ＩＶから構成されるヌクレオチド配列と実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であるヌクレオチド配列である。

【0111】

いくつかの実施形態において、前記第１のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵＺ_３－３’（配列番号５）、
５’－Ｚ_４ＡＡＣＵＧＡＡＵＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＵ－３’（配列番号６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＡＧＧＵＧＵＵＵＧＣＵＡＵＵＣＡＧＵＵＺ_３－３’（配列番号７）、
５’－Ｚ_４ＡＡＣＵＧＡＡＵＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣＵＵＧＧ－３’（配列番号８）
ただし、前記Ｚ_４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_３は、Ｚ_４と相補的なヌクレオチドである。

【0112】

いくつかの実施形態において、前記第２のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＧＡＵＡＧＵＧＺ_７－３’（配列番号６５）、
５’－Ｚ_８ＣＡＣＵＡＵＣＵＵＵＣＡＡＧＡＡＧＣＡＡ－３’（配列番号６６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号６８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＵＵＧＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＧＡＵＡＧＵＧＺ_７－３’（配列番号６７）、
５’－Ｚ_８ＣＡＣＵＡＵＣＵＵＵＣＡＡＧＡＡＧＣＡＡＣＣ－３’（配列番号６８）
ただし、前記Ｚ_８は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_８は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_７は、Ｚ_８と相補的なヌクレオチドである。

【0113】

いくつかの実施形態において、前記第３のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１２５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＡＡＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＣＡＵＣＡＺ_１１－３’（配列番号１２５）、
５’－Ｚ_１２ＵＧＡＵＧＡＣＣＡＣＡＵＵＧＣＵＵＣＡＡ－３’（配列番号１２６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＵＵＧＡＡＧＣＡＡＵＧＵＧＧＵＣＡＵＣＡＺ_１１－３’（配列番号１２７）、
５’－Ｚ_１２ＵＧＡＵＧＡＣＣＡＣＡＵＵＧＣＵＵＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１２８）
ただし、前記Ｚ_１２は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_１２は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_１１は、Ｚ_１２と相補的なヌクレオチドである。

【0114】

いくつかの実施形態において、前記第４のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＵＧＵＵＵＧＵＣＺ_１５－３’（配列番号１８５）、
５’－Ｚ_１６ＧＡＣＡＡＡＣＡＵＵＵＣＵＵＵＧＵＧＡＣ－３’（配列番号１８６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＵＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＵＧＵＵＵＧＵＣＺ_１５－３’（配列番号１８７）、
５’－Ｚ_１６ＧＡＣＡＡＡＣＡＵＵＵＣＵＵＵＧＵＧＡＣＵＣ－３’（配列番号１８８）
ただし、前記Ｚ_１６は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_１６は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_１５は、Ｚ_１６と相補的なヌクレオチドである。

【0115】

いくつかの実施形態において、前記第５のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＵＡＺ_１９－３’（配列番号２４５）、
５’－Ｚ_２０ＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＧＡＡＵＵＣＡＧ－３’（配列番号２４６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２４７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号２４８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＣＵＧＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＵＡＺ_１９－３’（配列番号２４７）、
５’－Ｚ_２０ＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧ－３’（配列番号２４８）
ただし、前記Ｚ_２０は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_２０は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_１９は、Ｚ_２０と相補的なヌクレオチドである。

【0116】

いくつかの実施形態において、前記第６のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３０５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号３０６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＧＵＣＵＧＵＧＣＵＧＧＣＵＡＵＡＡＺ_２３－３’（配列番号３０５）、
５’－Ｚ_２４ＵＵＡＵＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＡＵ－３’（配列番号３０６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３０７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号３０８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＵＧＧＵＣＵＧＵＧＣＵＧＧＣＵＡＵＡＡＺ_２３－３’（配列番号３０７）、
５’－Ｚ_２４ＵＵＡＵＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＡＵＣＣ－３’（配列番号３０８）
ただし、前記Ｚ_２４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ_２４は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ_２３は、Ｚ_２４と相補的なヌクレオチドである。

【0117】

いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡは、表１ａ～表１ｆに列挙されたｓｉＰＫＫａ１、ｓｉＰＫＫａ２、ｓｉＰＫＫｂ１、ｓｉＰＫＫｂ２、ｓｉＰＫＫｃ１、ｓｉＰＫＫｃ２、ｓｉＰＫＫｄ１、ｓｉＰＫＫｄ２、ｓｉＰＫＫｅ１、ｓｉＰＫＫｅ２、ｓｉＰＫＫｆ１及びｓｉＰＫＫｆ２である。

【0118】

前述したように、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、それぞれ非修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの一部又は全部は、修飾ヌクレオチドであり、ヌクレオチド基上のこれらの修飾により、本開示のｓｉＲＮＡがＰＫＫ遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることはない。

【0119】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。本開示の文脈において、用いられる用語「修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が他の基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、或いは、修飾された塩基を有するヌクレオチドを指す。前記修飾ヌクレオチドにより、ｓｉＲＮＡが遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることはない。例えば、Ｊ．Ｋ． Ｗａｔｔｓ，Ｇ．Ｆ． Ｄｅｌｅａｖｅｙ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ． Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ： ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２００８，１３（１９－２０）： ８４２－５５に開示された修飾ヌクレオチドを選択してもよい。

【0120】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖又は前記アンチセンス鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である。言い換えれば、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基及び／又はリボース基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基及び／又は修飾基を有するリボース基である。

【0121】

いくつかの実施形態において、前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖におけるヌクレオチドは、全て修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである。

【0122】

本開示の発明者は、驚くべきことに、本開示に記載されたｓｉＲＮＡにより、動物実験において血漿中安定性と遺伝子サイレンシング効率の高度なバランスが取られていることを見出した。

【0123】

いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの少なくとも第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの少なくとも第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。

【0124】

いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、前記ヌクレオチド配列Ｉにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの少なくとも第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩの少なくとも第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。

【0125】

いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである。

【0126】

本開示の文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換された、以下の式（７）に示される構造を有するヌクレオチドを指す。「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである。

【0127】

これらのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチドは、当業者に公知であり、これらのヌクレオチドは、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであってもよい。

【0128】

いくつかの実施形態において、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（８）に示されるメトキシ修飾ヌクレオチド（２’－ＯＭｅ）である。いくつかの実施形態において、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチドは、例えば、式（９）に示される２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド（２’－ＭＯＥ）であってもよい。いくつかの実施形態において、２’－アミノ修飾ヌクレオチド（２’－ＮＨ_２）は式（１０）に示される。いくつかの実施形態において、２’－デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）は式（１１）に示される。

【0129】

【化1】

【0130】

ヌクレオチドアナログとは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指す。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＢＮＡ）又は非環式ヌクレオチドであってもよい。

【0131】

ＢＮＡとは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。ＢＮＡは、五員環、六員環、又は七員環の、「固定された」Ｃ３’－エンド糖パッカリングを有する架橋構造を含んでもよい。通常当該橋を当該リボースの２’－、４’－位に導入して２’，４’－ＢＮＡヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＢＮＡは、式（１２）に示されるＬＮＡ、式（１３）に示されるＥＮＡ、式（１４）に示されるｃＥＴ ＢＮＡ等であってもよい。

【0132】

【化2】

【0133】

非環式ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖環が開環されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、非環式ヌクレオチドは、式（１５）に示されるアンロックド核酸（ＵＮＡ）、又は式（１６）に示されるグリセロール核酸（ＧＮＡ）であってもよい。

【0134】

【化3】

【0135】

上記式（１５）及び式（１６）において、Ｒは、Ｈ、ＯＨ又はアルコキシ（Ｏ－アルキル）から選択される。

【0136】

イソヌクレオチドとは、ヌクレオチドにおいて塩基のリボース環における位置が変化した化合物を指す。いくつかの実施形態において、イソヌクレオチドは、式（１７）又は（１８）に示される、塩基がリボース環の１’－位から２’－位又は３’－位に移行した化合物であってもよい。

【0137】

【化4】

【0138】

上記式（１７）～式（１８）の化合物において、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ又はＴ等の核酸塩基を表し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ又は上述した非フッ素基から選択される。

【0139】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択されるいずれか１つである。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、文脈において、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。

【0140】

文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」、「２’－フルオロ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’－ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチド」及び「２’－フルオロリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドの２’－ヒドロキシ基がフッ素で置換された、式（７）に示される構造を有する化合物を指し、「メトキシ修飾ヌクレオチド」、「２’－メトキシ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチド」及び「２’－メトキシリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドのリボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換された、式（８）に示される構造を有する化合物を指す。

【0141】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。

【0142】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第７、８及び９位のヌクレオチドが－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。

【0143】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、表１ａ～表１ｆに列挙されたｓｉＰＫＫａ１－Ｍ１、ｓｉＰＫＫａ１－Ｍ２、ｓｉＰＫＫａ１－Ｍ３、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ１、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ２、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ３、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ１、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ２、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ３、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ１、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ２、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ３、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ１、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ２、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ３、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ１、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ２、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ３、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ１、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ２、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ３、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ１、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ２、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ３、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ１、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ２、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ３、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ１、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ２、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ３、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ１、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ２、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ３、ｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ１、ｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ２及びｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ３のいずれか１つである。

【0144】

上記修飾を有するｓｉＲＮＡは、コストが低いだけでなく、血中のリボヌクレアーゼで核酸を切断しにくくすることができ、これにより、核酸の安定性を向上させ、核酸のヌクレアーゼ加水分解耐性という特性をより高めている。また、上記修飾ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ抑制活性が高い。

【0145】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖において、少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である。

【0146】

【化5】

【0147】

このような修飾により、ｓｉＲＮＡの二本鎖構造を安定化させ、塩基対合の高い特異性と高い親和力を維持することができる。

【0148】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せからなる群より
選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の５’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の３’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のうち少なくとも一箇所に結合されて存在する。
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間。

【0149】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、表１ａ～表１ｆに列挙されたｓｉＰＫＫａ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫａ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＰＫＫａ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ２Ｓ及びｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ３Ｓのいずれか１つである。

【0150】

いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである。

【0151】

慣用の前記５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、当業者に公知であり、例えば、５’－リン酸ヌクレオチドは、以下の構造を有してもよい。

【0152】

【化6】

【0153】

また、例えば、Ａｎａｓｔａｓｉａ Ｋｈｖｏｒｏｖａ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｋ． Ｗａｔｔｓ，Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５（３）： ２３８～４８には、以下の４種類の５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが開示されている。

【0154】

【化7】

式中、ＲはＨ、ＯＨ、メトキシ、フッ素から選択され、Ｂａｓｅは核酸塩基を表し、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される。

【0155】

いくつかの実施形態において、５’－リン酸ヌクレオチドは、式（２）に示される、５’－リン酸修飾を含むヌクレオチドであり、５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（３）に示される、ビニルリン酸エステル（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－ＶＰ）修飾を含むヌクレオチドであり、又は、式（５）に示される、チオリン酸エステル修飾ヌクレオチドである。

【0156】

いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、表１ａ～表１ｆに列挙されたｓｉＰＫＫａ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫａ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫａ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫａ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫａ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＰＫＫａ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＰＫＫａ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｂ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｂ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｃ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｃ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｄ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｄ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｅ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｅ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｆ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ２ＳＰ１及びｓｉＰＫＫｆ２－Ｍ３ＳＰ１のいずれか１つである。

【0157】

本開示の発明者は、本開示により提供される上記ｓｉＲＮＡの血漿とリソソーム安定性が顕著に向上しているだけでなく、標的ｍＲＮＡ抑制活性が高いことを意外にも見出した。

【0158】

本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、本分野における通常のｓｉＲＮＡ調製方法（例えば、固相合成方法及び液相合成方法）により得ることができる。ここで、固相合成は、既に商用カスタマイズサービスが行われている。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができ、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。

【0159】

＜薬物組成物＞
本開示は、活性成分として上述したｓｉＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。

【0160】

前記薬学的に許容可能な担体は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられる担体であってもよく、例えば、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、例えば、Ｆｅ_３Ｏ_４又はＦｅ_２Ｏ_３に基づくナノ粒子）、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、メソポーラスシリコン（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃｏｎ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）、ポリアミドアミンデンドリマー（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ （ＰＡＭＡＭ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬＬ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、ポリＤ－又はＬ－乳酸／グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（Ｄ＆Ｌ－ｌａｃｔｉｃ／ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＬＧＡ）、ポリ（アミノエチルエチレンリン酸エステル）（ｐｏｌｙ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＰＥＥＡ）及びポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（２－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＤＭＡＥＭＡ）並びにこれらの誘導体の１又は複数があるが、これらに限定されない。

【0161】

いくつかの実施形態において、前記薬物組成物におけるｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体の含有量に対して特段の要件はないが、いくつかの実施形態においては、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体との重量比が、１：（１～５００）であってもよい。いくつかの実施形態においては、上記重量比が１：（１～５０）である。

【0162】

いくつかの実施形態において、前記薬物組成物には、薬学的に許容できる他の添加剤が含まれてもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよい。例えば、前記薬学的に許容できる他の添加剤は、ｐＨ緩衝液、保護剤及び浸透圧調節剤の少なくとも１種を含んでもよい。

【0163】

前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．５～８．５のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｂｕｆｆｅｒ）及び／又はｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよく、例えば、ｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよい。

【0164】

前記保護剤は、イノシトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース及びグルコースの少なくとも１種であってもよい。前記薬物組成物の全重量を基準とし、前記保護剤の含有量は０．０１～３０重量％であってもよい。

【0165】

前記浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムであってもよい。前記浸透圧調節剤の含有量は、前記薬物組成物の浸透圧が２００～７００ミリオスモル／キログラム（ｍＯｓｍ／ｋｇ）となるように決定される。所望の浸透圧により、当業者は、前記浸透圧調節剤の含有量を容易に決定することができる。

【0166】

いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、注射液等の液体製剤であってもよく、凍結乾燥粉末注射剤として、投与時に液体添加剤と混合し、液体製剤としてもよい。前記液体製剤は、皮下、筋肉又は静脈注射投与に用いることができるが、これらに限定されず、噴霧により肺に投与、或いは、噴霧により肺を通して他の臓器組織（例えば、肝臓）に投与することもできるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、静脈注射投与に用いられる。

【0167】

いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、リポソーム製剤の形式であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リポソーム製剤に用いられる薬学的に許容可能な担体は、アミン含有トランスフェクション化合物（以下、有機アミンともいう）、補助脂質及び／又はＰＥＧ化（ポリエチレングリコール化）脂質を含む。ここで、前記有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質は、中国特許出願ＣＮ１０３３８０１１３Ａ（引用によりその全体を本明細書に組み込む）に記載されたアミン含有トランスフェクション化合物又はその薬学的に許容できる塩又は誘導体、補助脂質及びＰＥＧ化脂質からそれぞれ選択される１種又は複数種であってもよい。

【0168】

いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、ＣＮ１０３３８０１１３Ａに記載された式（２０１）に示される化合物又はその薬学的に許容できる塩であってもよい。

【0169】

【化8】

式中、
Ｘ_１０１及びＸ_１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ－Ａ又はＣ－Ａであり、Ａは水素又はＣ_１－Ｃ_２０炭化水素鎖であり、
Ｙ_１０１及びＺ_１０１はそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ－ＯＨ又はＳＯ_２であり、
Ｒ_１０１、Ｒ_１０２、Ｒ_１０３、Ｒ_１０４、Ｒ_１０５、Ｒ_１０６及びＲ_１０７はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
ｘが１～１０の整数であり、
ｎが１～３の整数であり、ｍが０～２０の整数であり、ｐが０又は１であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ_１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ_１０３と式（２０１）における窒素とが、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成する。

【0170】

【化9】

式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各^＊Ｎは式（２０１）における窒素原子を表す。

【0171】

いくつかの実施形態において、Ｒ_１０３はポリアミンである。他の実施形態において、Ｒ_１０３はケタールである。いくつかの実施形態において、式（２０１）におけるＲ_１０１及びＲ_１０２のそれぞれは、独立して、任意に置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アルキル又はアルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは、３～約２０個の炭素原子、例えば、８～約１８個の炭素原子、及び０～４個の二重結合、例えば、０～２個の二重結合を有する。

【0172】

いくつかの実施形態において、ｎとｍのそれぞれが独立して１又は３の値である場合、Ｒ_１０３は、下記式（２０４）～式（２１３）のいずれか１つであってもよい。

【0173】

【化10】

式（２０４）～式（２１３）において、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり、各「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各^＊はＲ_１０３と式（２０１）における窒素原子との結合可能点を示し、任意の^＊位置上の各Ｈは、式（２０１）における窒素原子と結合するために置換されてもよい。

【0174】

式（２０１）に示される化合物は、ＣＮ１０３３８０１１３Ａの記載により調製されてもよい。

【0175】

いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンである。

【0176】

【化11】

【0177】

前記補助脂質は、コレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、
前記ＰＥＧ化脂質は、１，２－ジパルミトアミド－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）］－２０００（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］－２０００）である。

【0178】

いくつかの実施形態において、前記薬物組成物において、前記有機アミン、前記補助脂質、前記ＰＥＧ化脂質のモル比は、（１９．７～８０）：（１９．７～８０）：（０．３～５０）であり、例えば、（５０～７０）：（２０～４０）：（３～２０）であってもよい。

【0179】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物粒子は、約３０ｎｍ～約２００ｎｍの平均径を有し、一般に約４０ｎｍ～約１３５ｎｍであり、より一般的には、当該リポソーム粒子の平均径は、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、例えば、当該リポソーム粒子の平均径は、約３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０又は１６０ｎｍである。

【0180】

いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物において、ｓｉＲＮＡと全脂質（例えば有機アミン、補助脂質及び／又はＰＥＧ化脂質）の重量比（重量／重量比）は、約１：１～約１：５０、約１：１～約１：３０、約１：３～約１：２０、約１：４から約１：１８、約１：５～約１：１７、約１：５～約１：１５、約１：５～約１：１２、約１：６～約１：１２又は約１：６～約１：１０の範囲内にあり、例えば、本開示のｓｉＲＮＡと全脂質の重量比は約１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７又は１：１８である。

【0181】

いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、市販時に各成分が独立して存在してもよく、使用時に液体製剤として存在してもよい。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡと上記薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物は、既知の各種の方法に従い調製されてもよく、従来のｓｉＲＮＡの代わりに本開示により提供されるｓｉＲＮＡを用いればよい。いくつかの実施形態において、以下の方法に従い調製されてもよい。

【0182】

有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を上記モル比でアルコールに懸濁させ均一に混合して脂質溶液を得る。アルコールの用量は、得られた脂質溶液の総質量濃度が２～２５ｍｇ／ｍＬ、例えば、８～１８ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記アルコールは、薬学的に許容できるアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００など、室温付近で液体であるアルコールから選択される１種又は複数種であり、例えばエタノールであってもよい。

【0183】

本開示により提供されるｓｉＲＮＡを緩衝塩溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡ水溶液を得る。緩衝塩溶液の濃度が０．０５～０．５Ｍであり、例えば、０．１～０．２Ｍであってもよく、緩衝塩溶液のｐＨを４．０～５．５に調節し、例えば、５．０～５．２であってもよく、緩衝塩溶液の用量は、ｓｉＲＮＡの濃度が０．６ｍｇ／ｍＬ以下、例えば、０．２～０．４ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記緩衝塩は、可溶性酢酸塩、可溶性クエン酸塩から選択される１種又は複数種であり、例えば、酢酸ナトリウム及び／又は酢酸カリウムであってよい。

【0184】

脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液を混合した後、得られた生成物を４０～６０℃で少なくとも２分間、例えば、５～３０分間培養し、培養したリポソーム製剤を得る。脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液の体積比は１：（２～５）であり、例えば、１：４であってもよい。

【0185】

培養したリポソーム製剤を濃縮又は希釈し、不純物を除去し、除菌し、本開示により提供される薬物組成物を得る。その物理化学的パラメーターは、ｐＨが６．５～８であり、封入効率が８０％以上であり、粒子径が４０～２００ｎｍであり、多分散指数が０．３０以下であり、浸透圧が２５０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇである。例えば、物理化学的パラメーターは、ｐＨが７．２～７．６、封入効率が９０％以上、粒子径が６０～１００ｎｍ、多分散指数が０．２０以下、浸透圧が３００～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。

【0186】

ここで、濃縮又は希釈は、不純物を除去する前、不純物を除去した後又は同時に行われてもよい。不純物を除去する方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、タンジェンシャルフロー系、中空糸カラムを用い、１００ＫＤａの条件で限外濾過し、限外濾過交換溶液をｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）としてもよい。除菌方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、０．２２μｍのフィルターで濾過して除菌してもよい。

【0187】

＜ｓｉＲＮＡ複合体＞
本開示は、上記ｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体を提供する。

【0188】

一般的には、前記複合基は、薬学的に許容できる少なくとも１つの標的基及び任意のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含み、前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基は順に結合されている。いくつかの実施形態において、前記標的基は１～６個である。いくつかの実施形態において、前記標的基は２～４個である。前記ｓｉＲＮＡ分子は、前記複合基に非共有結合的又は共有結合的に複合されてもよく、例えば、前記複合基に共有結合的に複合されてもよい。ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端にある。

【0189】

いくつかの実施形態において、前記複合基は、ヌクレオチドのリン酸基、２’－位のヒドロキシ基又は塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、前記複合基は、３’－位のヒドロキシ基に結合されてもよく、この場合、ヌクレオチド間が２’－５’リン酸ジエステル結合により結合されている。複合基は、ｓｉＲＮＡ鎖の末端に結合される場合、通常ヌクレオチドのリン酸基に結合され、ｓｉＲＮＡの内部配列に結合される場合、通常リボース糖環或いは塩基に結合される。各種の結合方法については、Ｍｕｔｈｉａｈ Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ．ａｌ． ｓｉＲＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｅｌｉｃｉｔ ｒｏｂｕｓｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１０ （５）： １１８１～７．を参照することができる。

【0190】

いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との間が酸不安定又は還元可能な化学結合により結合されてもよく、細胞エンドソームの酸性環境で、これらの化学結合が分解され、ｓｉＲＮＡが遊離状態になることができる。分解できない複合方法については、複合基は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され、複合によるｓｉＲＮＡ活性への影響をできるだけ低下させることができる。

【0191】

いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられるリガンド、例えば、ＷＯ２００９０８２６０７Ａ２に記載された各種のリガンドであってもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。

【0192】

いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、コレステロール、胆汁酸、ビタミン（例えば、トコフェロール）、鎖長が異なる脂質分子等の親油性分子と、ポリエチレングリコール等のポリマーと、膜透過性ペプチド等のポリペプチドと、アプタマーと、抗体と、量子ドットと、ラクトース、ポリラクトース、マンノース、ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等の糖類と、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）と、アシアロ糖タンパク質、アシアロ糖残基、リポタンパク（例えば、高密度リポタンパク、低密度リポタンパク等）、グルカゴン、神経伝達物質（例えば、アドレナリン）、成長因子、トランスフェリン等の肝実質細胞に発現する受容体リガンド等の標的分子又はその誘導体により形成されたリガンドから選択される１種又は複数種であってもよい。

【0193】

いくつかの実施形態において、前記各リガンドは、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、哺乳動物の肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、ヒト肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合できるリガンドである。これらのリガンドの種類は、当業者に公知であり、その作用として、一般的に標的細胞表面の特異的受容体と結合し、リガンドに結合されるｓｉＲＮＡの標的細胞への送達を媒介する。

【0194】

いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合するいずれか１種のリガンドであってもよい。いくつかの実施形態において、各リガンドは、独立してアシアロ糖タンパク質、例えば、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ、ＡＳＯＲ）又はアシアロフェチュイン（ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ、ＡＳＦ）である。いくつかの実施形態において、前記リガンドは、糖又は糖の誘導体である。

【0195】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドはいずれも糖である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、単糖、多糖、修飾単糖、修飾多糖又は糖誘導体である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの前記リガンドは、単糖、二糖又は三糖であってもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも独立して多糖、修飾多糖、単糖、修飾単糖、多糖誘導体又は単糖誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、リガンドのそれぞれ又は少なくとも１つは、グルコース及びその誘導体、マンナン及びその誘導体、ガラクトース及びその誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその誘導体、フコース及びその誘導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導体、アラビノース及びその誘導体、フルクトース及びその誘導体並びにシアル酸からなる群から選択される。

【0196】

いくつかの実施形態において、各前記リガンドは、Ｄ－マンノピラノース、Ｌ－マンノピラノース、Ｄ－アラビノース、Ｄ－キシロフラノース、Ｌ－キシロフラノース、Ｄ－グルコース、Ｌ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－ガラクトース、α－Ｄ－マンノフラノース、β－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－マンノピラノース、β－Ｄ－マンノピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－グルコフラノース、β－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、α－Ｄ－フルクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトフラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニルガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブチリルガラクトサミン、Ｎ－イソブチリルガラクトサミン、２－アミノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－１－カルボキシエチル］－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノース、２－デオキシ－２－メチルアミノ－Ｌ－グルコピラノース、４，６－ジデオキシ－４－ホルムアミド－２，３－ジ－Ｏ－メチル－Ｄ－マンノピラノース、２－デオキシ－２－スルホアミノ－Ｄ－グルコピラノース、Ｎ－グリコリル－α－ノイラミン酸、５－チオ－β－Ｄ－グルコピラノース、メチル２，３，４－トリス－Ｏ－アセチル－１－チオ－６－Ｏ－トリチル－α－Ｄ－グルコピラノシド、４－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－１，５－ジチオ－α－Ｄ－グルコヘプトピラノシド、２，５－アンヒドロ－Ｄ－アロニトリル、リボース、Ｄ－リボース、Ｄ－４－チオリボース、Ｌ－リボース又はＬ－４－チオリボースから独立して選択されてもよい。前記リガンドの他の選択肢は、例えば、ＣＮ１０５３７８０８２Ａの記載を参照してもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。

【0197】

いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体における、薬学的に許容できる標的基は、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンであってもよく、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子は、１価、２価、３価、４価であってもよい。ここでいう１価、２価、３価、４価は、それぞれｓｉＲＮＡ分子と、標的基としてのガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子を含む複合基から形成されたｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ分子とガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子とのモル比が１：１、１：２、１：３又は１：４であることを指すと理解すべきである。いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基はＮ－アセチルガラクトサミンである。いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ－アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合する場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価又は４価である。いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ－アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合する場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価である。

【0198】

標的基は、適切なリンカーを介してｓｉＲＮＡ分子に結合されてもよく、当業者は、標的基の具体的な種類により適切なリンカーを選択することができる。これらのリンカー、標的基の種類及びｓｉＲＮＡへの結合方法については、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２の開示内容を参照してもよく、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。

【0199】

いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０１）に示される構造であってもよい。

【0200】

【化12】

式中、
ｋは１～３の整数であり、
Ｌ^Ａは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記Ｌ^Ａは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記Ｌ^Ｃ部にエーテル結合により結合される。

【0201】

【化13】

Ｌ^Ｂは、式（３０３）に示される構造を有するＮ－アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記Ｌ^Ｃ部にアミド結合により結合され、他端に酸素基を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合される。

【0202】

【化14】

Ｌ^Ｃは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２～４価のリンカー基であり、前記Ｌ^Ｃは、酸素原子を介してエーテル結合により各前記Ｌ^Ａ部に結合されるとともに、窒素原子を介してアミド結合により前記Ｌ^Ｂ部に結合される。

【0203】

いくつかの実施形態において、ｎ＝３であり、Ｌ^Ｃがトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく４価のリンカー基である場合、リンカーとしての－（Ｌ^Ａ）_３トリヒドロキシメチルアミノメタン－Ｌ^Ｂ－によりＮ－アセチルガラクトサミン分子とｓｉＲＮＡ分子を結合して形成されたｓｉＲＮＡ複合体は、その構造が以下の式（３０４）に示される。

【0204】

【化15】

式中、二重螺旋構造はｓｉＲＮＡを表す。

【0205】

同様に、ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。

【0206】

いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は、リンカー－（Ｌ^Ａ）_３トリヒドロキシメチルアミノメタン－Ｌ^Ｂ－により３個のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）分子に共有結合的に複合され、ｓｉＲＮＡ分子とＧａｌＮＡｃ分子とのモル比が１：３である、構造が以下の式（３０５）に示されるｓｉＲＮＡ複合体（以下、（ＧａｌＮＡｃ）_３－ｓｉＲＮＡともいう）を得る。

【0207】

【化16】

式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。

【0208】

いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０６）に示される構造であってもよい。

【0209】

【化17】

式中、
ｌは０～３の整数であり、
^＊は、リンカーにおいてエーテル結合により標的基に結合される部位を表し、
^＃は、リンカーにおいてリン酸エステル結合によりｓｉＲＮＡに結合される部位を表す。

【0210】

いくつかの実施形態において、ｌ＝２である場合、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０７）に示される構造を有する。

【0211】

【化18】

式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。

【0212】

上記ｓｉＲＮＡ複合体は、従来技術において既に詳しく記載された方法により合成されてもよい。例えば、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２には、複数種のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法が詳しく記載されている。当業者によく知られている方法により、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を得る。例えば、ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１には、式（３０５）に示される構造の調製方法が記載されており、Ｒａｊｅｅｖらは、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６，９０３－９０８に式（３０７）に示される構造の調製方法を記載した。

【0213】

いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０８）に示される構造を有する。

【0214】

【化19】

式中、
ｎ１は、１～３から選択される整数であり、ｎ３は、０～４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２～１０から選択される整数であり、
Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４及びＲ_１５は、それぞれ独立して、Ｈであり、又はＣ_１－Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基及びＣ_１－Ｃ_１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ_３は式Ａ５９に示される構造の基である。

【0215】

【化20】

式中、Ｅ_１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ_２であり、Ｎｕは本開示のｓｉＲＮＡである。

【0216】

Ｒ_２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）_２、Ｃ_２－Ｃ_１０アルケニレン基、Ｃ_２－Ｃ_１０アルキニレン基、Ｃ_６－Ｃ_１０アリーレン基、Ｃ_３－Ｃ_１８ヘテロシクリレン基及びＣ_５－Ｃ_１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ_２は、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_６－Ｃ_１０アリール基、Ｃ_５－Ｃ_１０ヘテロアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＯＣ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＳＣ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ_２、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＮＨ_２、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基）、ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＳＯ_２（フェニル基）、－ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＳＯ_２ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＳＯ_２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ_２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各Ｌ_１は、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）_２、Ｃ_２－Ｃ_１０アルケニレン基、Ｃ_２－Ｃ_１０アルキニレン基、Ｃ_６－Ｃ_１０アリーレン基、Ｃ_３－Ｃ_１８ヘテロシクリレン基及びＣ_５－Ｃ_１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ_１は、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_６－Ｃ_１０アリール基、Ｃ_５－Ｃ_１０ヘテロアリール基、Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＯＣ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＳＣ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ_２、－Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル－ＮＨ_２、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基）、ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ_２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、－ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＳＯ_２（フェニル基）、－ＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ_２ＮＨ_２、－ＳＯ_２ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＳＯ_２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ_２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ_２（Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
いくつかの実施形態において、Ｌ_１は、Ａ１～Ａ２６の基又はその任意の組合せからなる群から選択されてもよく、Ａ１～Ａ２６の構造と定義は以下のとおりである。

【0217】

【化21】

式中、ｊ１は１～２０の整数であり、ｊ２は１～２０の整数であり、
Ｒ’はＣ_１－Ｃ_１０アルキル基であり、
Ｒａは、式Ａ２７～Ａ４５の基又はその任意の組合せからなる群から選択される。

【0218】

【化22】

ＲｂはＣ_１－Ｃ_１０アルキル基であり、

は、基が共有結合的に結合する部位を表す。

【0219】

便宜上、Ｌ１は、線形アルキレン基として定義されるが、例えば上述の取替及び／又は置換によって生じるアミンやアルケニル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。本開示内容の目的のために、Ｌ_１の長さは、２つの結合点を結合する鎖における原子数である。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環（例えば、ヘテロシクリレン又はヘテロアリーレン）を、１個の原子とする。

【0220】

Ｍ_１は、標的基を表し、その定義と選択可能な範囲は上記標的基と同じである。いくつかの実施形態において、各Ｍ_１は、哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドから独立して選択される１つである。

【0221】

Ｍ_１が哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドである場合、いくつかの実施形態において、ｎ１は、１～３の整数であってもよく、ｎ３は、０～４の整数であってもよく、前記ｓｉＲＮＡ複合体におけるＭ_１標的基の個数が少なくとも２であることを確保する。いくつかの実施形態において、ｎ１＋ｎ３≧２であり、これにより、Ｍ_１標的基の個数が少なくとも３であり、Ｍ_１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、さらに前記ｓｉＲＮＡ複合体がエンドサイトーシス（細胞内取込み）作用により細胞に取り込まれることを促進することができる。実験から分かるように、Ｍ_１標的基の個数が３個以上である場合、Ｍ_１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容易さ、構造／プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの実施形態において、ｎ１は１～２の整数であり、ｎ３は０～１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２～３である。

【0222】

いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２又はｍ３は、独立して２～１０の整数から選択される場合、複数のＭ_１標的基間の空間位置をＭ_１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に適合させることができる。本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体をより簡略化し、より合成しやすく、及び／又はコストを低下させるために、いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、それぞれ独立して２～５の整数であり、いくつかの実施形態において、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である。

【0223】

Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４及びＲ_１５が、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１－Ｃ_１０ハロゲン化アルキル基及びＣ_１－Ｃ_１０アルコキシからそれぞれ独立して選択される１つである場合、いずれも本開示のｓｉＲＮＡ複合体の性質を変化させることなく、本開示の目的を実現することができることは、当業者に理解され得る。いくつかの実施形態において、Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４及びＲ_１５は、それぞれ独立してＨ、メチル基又はエチル基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４及びＲ_１５は、いずれもＨである。

【0224】

Ｒ_３は、式Ａ５９に示される構造の基であり、ここで、Ｅ_１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ_２であり、調製原料の入手しやすさを考慮し、いくつかの実施形態において、Ｅ_１はＯＨ又はＳＨである。

【0225】

Ｒ_２は、窒素含有骨格上のＮ原子とＡ５９との結合を実現するために選択される。本開示の文脈において、「窒素含有骨格」とは、Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４及びＲ_１５が結合された炭素原子とＮ原子が互いに結合している鎖状構造を指す。したがって、Ｒ_２は、適当な方法でＡ５９基を窒素含有骨格上のＮ原子に結合することができる任意のリンカー基であってもよい。いくつかの実施形態において、固相合成プロセスにより式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を調製する場合に、Ｒ_２基には、窒素含有骨格上のＮ原子に結合される結合部位及びＲ_３におけるＰ原子に結合される結合部位がともに含まれる必要がある。いくつかの実施形態において、Ｒ_２における前記窒素含有骨格中のＮ原子に結合される部位は、Ｎ原子とアミド結合を形成し、前記Ｒ_３上のＰ原子に結合される部位は、Ｐ原子とリン酸エステル結合を形成し、いくつかの実施形態において、Ｒ_２は、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’であってもよい。

【0226】

【化23】

式中、

は、基が共有結合的に結合する部位を表す。

【0227】

ｑ_２の値の範囲は、１～１０の整数であってもよく、いくつかの実施形態において、ｑ_２は１～５の整数である。

【0228】

Ｌ_１は、Ｍ_１標的基と窒素含有骨格上のＮを結合し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体に肝標的機能を提供するという役割を果たす。いくつかの実施形態において、Ｌ_１は、式Ａ１～Ａ２６の基から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ_１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１及びＡ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ_１は、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ_１は、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。

【0229】

いくつかの実施形態において、Ｌ_１の長さは、３～２５個の原子、３～２０個の原子、４～１５個の原子又は５～１２個の原子であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｌ_１の長さは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個の原子である。

【0230】

いくつかの実施形態において、ｊ１は２～１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ１は３～５の整数である。いくつかの実施形態において、ｊ２は２～１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ２は３～５の整数である。Ｒ’はＣ_１－Ｃ_４アルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つである。Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、いくつかの実施形態において、Ｒａは、Ａ２７又はＡ２８である。Ｒｂは、Ｃ_１－Ｃ_５アルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである。いくつかの実施形態において、式Ａ１～Ａ２６においてそれぞれｊ１、ｊ２、Ｒ’、Ｒａ、Ｒｂを選択することにより、Ｍ_１標的基と窒素含有骨格上のＮ原子との結合を実現し、Ｍ_１標的基間の空間位置をＭ_１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合にさらに適合させる。

【0231】

いくつかの実施形態において、当該ｓｉＲＮＡ複合体は、式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する。

【0232】

【化24】

【0233】

いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡ配列における任意の可能な位置に結合されてもよく、例えば、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合されてもよく、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の端部に結合される。前記端部とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖の上記位置に結合される場合に、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、細胞に入り込んだ後、巻き戻されるときに、単独のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を放出し、ＰＫＫ ｍＲＮＡがタンパク質を翻訳する過程を遮断し、ＰＫＫ遺伝子発現を抑制することができる。

【0234】

いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド上の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチドの５’位、ヌクレオチドの２’位、ヌクレオチドの３’位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基を脱水素した酸素原子に結合され（このとき、Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡに含まれるリン酸基のＰ原子と見なすこともできる）、或いは、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における１つのヌクレオチドの２’－ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合される。

【0235】

本開示の発明者は、本開示のｓｉＲＮＡ複合体が、血漿中安定性が顕著に向上し、オフターゲット効果が低減され、高いＰＫＫ ｍＲＮＡサイレンシング活性をさらに示すことを、意外にも見出した。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、表１ａ～１ｆに示されるｓｉＲＮＡの１つであってもよい。これらのｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ複合体は、より高いＰＫＫ ｍＲＮＡサイレンシング活性を示す。

【0236】

【表1a】

【0237】

【表1b】

【0238】

【表1c】

【0239】

【表1d】

【0240】

【表1e】

【0241】

【表1f】

大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。いくつかの実施形態において、Ｐ１は、特定の修飾がＶＰ、Ｐｓ又はＰであることを表し、組合せ文字ＶＰは、当該組合せ文字ＶＰの右側に隣接する１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－ＶＰ）修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字Ｐｓは、当該組合せ文字Ｐｓの右側に隣接する１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表す。

【0242】

本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体において、各隣接するヌクレオチド間がリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合により結合され、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、負電荷を帯び、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）として存在してもよく、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基における水素イオンは、一部又は全部がカチオンで置換されてもよい。前記カチオンは、任意のカチオン、例えば、金属カチオン、アンモニウムイオンＮＨ_４ ^＋、有機アンモニウムカチオンの１つであってもよい。溶解性の向上を考慮し、１つの実施形態において、前記カチオンは、アルカリ金属イオン、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン及び４級アンモニウムカチオンから選択される１種又は複数種である。アルカリ金属イオンは、Ｋ^＋及び／又はＮａ^＋であってもよく、第３級アミンにより形成されたカチオンは、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン、及び／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンであってもよい。したがって、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、少なくとも一部が塩として存在してもよい。いくつかの実施形態において、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、少なくとも一部がナトリウムイオンに結合され、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、ナトリウム塩又は部分ナトリウム塩として存在する。

【0243】

当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌクレオシドモノマーは、市販品を購入してもよく、既知の方法により調製されてもよい。

【0244】

＜式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製＞
任意の合理的な合成経路により式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を調製してもよい。

【0245】

いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、以下の方法により調製することができる。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、アニールを行うことを含み、前記ｓｉＲＮＡは、上記本開示のｓｉＲＮＡである。

【0246】

また、当該方法は、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチド配列と接触させ、式（３２１）に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチド配列に結合することをさらに含む。以下に、式（３２１）に示される化合物は、複合分子とも呼ばれる。

【0247】

【化25】

式中、
Ｒ_４は、式（３０８）に示される化合物におけるＮｕに示されるｓｉＲＮＡに結合可能な基である。いくつかの実施形態において、Ｒ_４は、共有結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡに結合可能な基である。いくつかの実施形態において、Ｒ_４は、反応を経てリン酸ジエステル結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡの任意の官能基に複合可能な基であり、
各Ｓ_１は、独立してＭ_１において全ての活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ－基で置換された基であり、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つであり、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。

【0248】

ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４、Ｒ_１５、Ｌ_１、Ｍ_１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。

【0249】

Ｒ_４は、窒素含有骨格上のＮ原子との結合を実現し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の合成に適切な反応部位を提供するために選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ_４には、Ｒ_２リンカー基又は保護されたＲ_２リンカー基、及び反応させることによりｓｉＲＮＡとＡ５９に示される構造を形成することができる官能基が含まれる。

【0250】

いくつかの実施形態において、Ｒ_４は、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡ又はヌクレオシドモノマー上の基と亜リン酸エステルを形成することができる第１の官能基と、ヒドロキシ基又はアミノ基と反応させて共有結合を形成することができる第２の官能基又は前記共有結合により結合された固相担体とを含む。いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、ホスホルアミダイト、カルボキシ基又はカルボン酸塩である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、共有結合を介して分子の他の部分に結合される固相担体であり、前記共有結合は、ヒドロキシ基又はアミノ基により形成されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は、リン酸エステル結合、カルボン酸エステル結合又はアミド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は樹脂である。

【0251】

いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基、－ＯＲ_ｋ又は式（Ｃ３）に示される基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を含む。

【0252】

【化26】

式中、ｑ_１は１～４の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒ_ｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、

は、基が共有結合部分に結合される部位を表す。

【0253】

いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、式（Ｃ３）に示されるように、ホスホルアミダイト基を含み、当該ホスホルアミダイト基は、ヌクレオチド上の任意位置のヒドロキシ基、例えば、２’位のヒドロキシ基又は３’位のヒドロキシ基とカップリング反応させて亜リン酸エステルを形成し、酸化又は硫化されて式Ａ５９に示されるリン酸ジエステル結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、複合分子をｓｉＲＮＡに複合することができる。この場合、前記第２の官能基が存在しなくても、式（３２１）に示される化合物は、ヌクレオチドに複合することができ、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の取得に影響することはない。この場合に、ホスホルアミダイト固相合成等の方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得た後、式（３２１）に示される化合物と、ヌクレオチド配列において末端ヌクレオチド上のヒドロキシ基を反応させ、後の酸化又は硫化過程においてリン酸ジエステル結合による結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、式（３２１）に示される化合物をｓｉＲＮＡに複合させる。

【0254】

いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、保護されたヒドロキシ基を含む。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、固相担体と反応できる基を含み、前記反応により固相担体を含む複合分子を提供する。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）又は（Ｃ３）に示されるように、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホスホルアミダイトを含む。前記第２の官能基がカルボキシ基又はカルボン酸塩を含む場合、式（３２１）に示される化合物と固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基又はアミノ基をエステル化反応又はアミド化反応させ、カルボン酸エステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。前記第２の官能基がホスホルアミダイト官能基を含む場合、式（３２１）に示される化合物と汎用の固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基をカップリング反応させ、酸化されてリン酸ジエステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。その後、上記固相担体が結合された生成物を出発とし、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。ホスホルアミダイト固相合成過程において、前記第１の官能基は、脱保護され、その後、カップリング反応条件下でヌクレオシドモノマーにおけるホスホルアミダイト基とカップリングさせる。

【0255】

いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示されるように、カルボン酸エステル結合により結合された固相担体又はアミド結合により結合された固相担体、又はリン酸エステル結合により結合された固相担体を含む。この場合、出発として固相担体の代わりに式（３２１）に示される化合物を用い、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。

【0256】

いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、－ＣＯＯ^－Ｍ^＋で表されてもよく、ここで、Ｍ^＋はカチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンＮＨ_４ ^＋、有機アンモニウムカチオンから選択される１つである。１つの実施形態において、前記金属イオンは、アルカリ金属イオンから選択される１つであり、例えば、Ｋ^＋又はＮａ^＋である。溶解性を向上させ、反応をスムーズに行うことを考慮して、いくつかの実施形態において、有機アンモニウムイオンは、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン又は４級アンモニウムカチオン、例えば、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンである。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、トリエチルアミンカルボン酸塩又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である。

【0257】

いくつかの実施形態において、Ｒ_４は、式（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ９’）、（Ｂ１０’）、（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ１１’）又は（Ｂ１２’）に示される構造を含む。

【0258】

【化27】

式中、ｑ_１は１～４の整数であり、ｑ_２は１～１０の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ^＋はカチオンであり、Ｒ_ｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、

は、基が共有結合部分に結合される部位を表す。いくつかの実施形態において、ｑ_１は１又は２である。いくつかの実施形態において、ｑ_２は１～５の整数である。いくつかの実施形態において、Ｒ_４は、式（Ｂ９）又は（Ｂ１０）に示される構造を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ_４は、式（Ｂ１１）又は（Ｂ１２）に示される構造を含む。

【0259】

いくつかの実施形態において、Ｒ_ｋは、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４－メトキシトリチル基）、ＤＭＴｒ（４，４’－ビスメトキシトリチル基）、ＴＭＴｒ（４，４’，４’－トリメトキシトリチル基）の１又は複数である。いくつかの実施形態において、Ｒ_ｋは、ＤＭＴｒ、すなわち、４，４’－ビスメトキシトリチル（４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であってもよい。

【0260】

Ｌ_１の定義は、前述したとおりである。

【0261】

いくつかの実施形態において、Ｌ_１は、Ｍ_１標的基を窒素含有骨格上のＮ原子に結合し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体に肝標的機能を提供するために用いられる。いくつかの実施形態において、Ｌ_１は、Ａ１～Ａ２６のいずれか１つ又はその組合せを含む。

【0262】

上記記載により、当業者であれば容易に理解できるように、本分野で公知のホスホルアミダイト固相合成方法と比較して、上記第１の官能基及び任意の第２の官能基により、複合分子がヌクレオチド配列の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチド配列の端部、ヌクレオチド配列の末端に結合された、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。これに応じて、特に説明がない限り、以下にｓｉＲＮＡ複合体及び／又は複合分子の調製に関する記載において、「脱保護」、「カップリング」、「キャッピング」、「酸化」、「硫化」等の反応に言及する場合、本分野で公知のホスホルアミダイト核酸の固相合成方法に係る反応条件と試薬もまた同様にこれらの反応に適用されると理解すべきである。例示的な反応条件と試薬は、以下に詳細に説明する。

【0263】

いくつかの実施形態において、各Ｓ_１は、独立してＭ_１である。いくつかの実施形態において、各Ｓ_１は、独立してＭ_１において少なくとも１つの活性ヒドロキシ基がヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、各Ｓ_１は、独立してＭ_１に存在する活性ヒドロキシ基が全てヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、当業者に既知のあらゆるヒドロキシ保護基を、Ｍ_１における活性ヒドロキシ基を保護するために用いることができる。いくつかの実施形態において、保護されたヒドロキシ基は、式ＹＣＯＯ－で表されてもよく、各Ｙは、独立してＣ_１－Ｃ_１０アルキル基及びＣ_６－Ｃ_１０アリール基からなる群から選択され、前記Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル基及びＣ_６－Ｃ_１０アリール基は、１又は複数の置換基で任意に置換され、前記置換基は、ハロゲン及びＣ_１－Ｃ_６アルキル基からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、各Ｙは、独立して、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びＣ_１－Ｃ_６アルキルフェニル基からなる群から選択される。

【0264】

いくつかの実施形態において、各Ｓ_１は、それぞれ独立して式Ａ４６～Ａ５４からなる群から選択される。

【0265】

【化28】

【0266】

いくつかの実施形態において、Ｓ_１は式Ａ４９又はＡ５０である。

【0267】

いくつかの実施形態において、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つであり、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。

【0268】

前述したように、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、ｓｉＲＮＡの他方の鎖を合成し（例えば、上記工程で、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成した場合、固相合成方法に従いｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成することをさらに含み、その逆も同様である）、センス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、かつ、アニールを行う工程をさらに含む。具体的には、単離工程において、ヌクレオチド配列及び／又は複合分子に結合される固相担体が切断されるとともに、必要な保護基が除去され（この場合、式（３２１）に示される化合物における各Ｓ１基が、対応するＭ１標的基に変換される）、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖（又はアンチセンス鎖）及び対応するアンチセンス鎖（又はセンス鎖）が得られ、センス鎖とアンチセンス鎖をアニールして二本鎖ＲＮＡ構造を形成し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得る。

【0269】

いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’端の１番目のヌクレオシドモノマーと接触させ、式（３２１）に示される化合物を配列における１番目のヌクレオチドに結合させ、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、所望のセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、（３２１）に示される化合物は、Ｒ_４に、保護されたヒドロキシ基を含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる、式（３２１）に示される化合物であり、１番目のヌクレオシドモノマーと結合する前に、式（３２１）に示される化合物を脱保護し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、複合基が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程；ホスホルアミダイト固相合成の条件で、アンチセンス鎖又はセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、核酸のアンチセンス鎖又はセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精製してセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。

【0270】

いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、当該二本鎖ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、センス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、固相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体に結合されたアンチセンス鎖を得る工程；カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固相担体に結合されたアンチセンス鎖と接触させ、Ｒ_４にホスホルアミダイト基である第１の官能基が含まれる式（３２１）に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させ、保護基を除去して固相担体から切断し、それぞれ単離精製し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。

【0271】

いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖の３’末端に結合され、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、
（１）式（３２１）に示される化合物（式（３２１）に示される化合物は、Ｒ_４に、保護されたヒドロキシ基ＯＲ_ｋを含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる化合物である）におけるヒドロキシ保護基Ｒ_ｋを除去し、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシドモノマーと接触させ、複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
（２）当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’－５’の方向に、ホスホルアミダイト固相合成方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成すること、
（３）ホスホルアミダイト固相合成方法により、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成すること、
（４）ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることを含む。

【0272】

工程（１）において、上記式（３２１）に示される化合物における保護基Ｒ_ｋを除去する方法は、脱保護条件で、式（３２１）に示される化合物を脱保護試薬と接触させることを含む。脱保護条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒、いくつかの実施形態では５０～１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態ではジクロロ酢酸である。脱保護試薬と式（３２１）に示される化合物とのモル比は１０：１～１０００：１であり、いくつかの実施形態では５０：１～５００：１である。

【0273】

前記カップリング反応条件とカップリング試薬は、上記カップリング反応に適した任意の条件と試薬を用いてもよい。いくつかの実施形態において、採用される固相合成方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いてもよい。

【0274】

いくつかの実施形態において、前記カップリング反応の条件は、反応温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃である。式（３２１）に示される化合物とヌクレオシドモノマーとのモル比は１：１～１：５０であり、いくつかの実施形態では１：２～１：５である。式（３２１）に示される化合物とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：５０であってもよく、いくつかの実施形態では１：３～１：１０であり、反応時間は２００～３０００秒、いくつかの実施形態では５００～１５００秒である。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、いくつかの実施形態では５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、いくつかの実施形態では無水アセトニトリルである。式（３２１）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量は３～５０Ｌ／ｍｏｌ、いくつかの実施形態では５～２０Ｌ／ｍｏｌである。

【0275】

工程（２）において、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、上記工程で調製された複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’－５’の方向に、第２のｓｉＲＮＡ複合体のセンス鎖ＳＳを合成する。この場合、複合基は、得られたセンス鎖の３’末端に結合される。

【0276】

工程（２）及び（３）における前記固相合成の他の条件は、ヌクレオシドモノマーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応条件、酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬の種類と用量を含み、本分野で通常用いられる各種の試薬、用量及び条件を採用する。

【0277】

例えば、いくつかの実施形態において、工程（２）及び（３）において、前記固相合成では、以下の条件を用いてもよい。

【0278】

ヌクレオシドモノマーの脱保護条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒、いくつかの実施形態では５０～１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態ではジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における４，４’－ジメトキシトリチル保護基とのモル比は２：１～１００：１であってもよく、いくつかの実施形態では３：１～５０：１である。

【0279】

カップリング反応条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比は１：１～１：５０であってもよく、いくつかの実施形態では１：５～１：１５であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：１００、いくつかの実施形態では１：５０～１：８０であり、反応時間とカップリング試薬の選択は、前記と同じである。

【0280】

キャッピング反応条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が５～５００秒、いくつかの実施形態では１０～１００秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１：１００～１００：１、いくつかの実施形態では１：１０～１０：１である。キャッピング試薬として等モル量の酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾールを用いる場合、酢酸無水物、Ｎ－メチルイミダゾール、固相担体に結合される核酸配列のモル比は、１：１：１０～１０：１０：１であってもよく、いくつかの実施形態では１：１：２～２：２：１である。

【0281】

酸化反応条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が１～１００秒、いくつかの実施形態では５～５０秒であり、酸化試薬は、いくつかの実施形態ではヨウ素である（いくつかの実施形態ではヨウ素水として提供される）。酸化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は、１：１～１００：１であってもよく、いくつかの実施形態では５：１～５０：１である。いくつかの実施形態では、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３の混合溶剤で行われる。硫化反応条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が５０～２０００秒、いくつかの実施形態では１００～１０００秒であり、硫化試薬は、いくつかの実施形態ではキサンタンヒドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１０：１～１０００：１であり、いくつかの実施形態では１０：１～５００：１である。いくつかの実施形態では、前記硫化反応は、アセトニトリル：ピリジン＝１：３～３：１の混合溶剤で行われる。

【0282】

全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、アニールする前に、当該方法は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさらに含む。単離方法は、当業者に公知であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩することを含む。

【0283】

合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去するには、ｓｉＲＮＡ合成において通常の切断と脱保護方法により行われてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を濃アンモニア水と接触させ、脱保護過程において、Ａ４６～Ａ５４基の保護基ＹＣＯＯ－をヒドロキシ基に変換させ、Ｓ_１基を対応するＭ_１基に変換させ、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を生成する。ここで、前記濃アンモニア水は、２５～３０重量％のアンモニア水であってもよく、濃アンモニア水の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．２ｍｌ／μｍｏｌ～０．８ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。

【0284】

合成されたヌクレオチド配列に少なくとも１つの２’－ＴＢＤＭＳ保護がある場合、前記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素酸塩と接触させることにより、当該２’－ＴＢＤＭＳ保護を除去することをさらに含む。この場合、得られた目的とするｓｉＲＮＡ配列における対応するヌクレオチドには、遊離の２’－ヒドロキシ基を有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．４ｍｌ／μｍｏｌ～１．０ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。このように式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。

【0285】

精製及び脱塩する方法は、当業者によく知られている。例えば、分取用イオンクロマトグラフィー精製カラムを用いて、ＮａＢｒ又はＮａＣｌの勾配溶出によって、核酸の精製を完了し、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩することができる。

【0286】

このように得られた式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体において、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、基本的にナトリウムイオンに結合されており、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、基本的にナトリウム塩として存在する。よく知られたイオン交換方法により、水素イオン及び／又は他のカチオンで前記ナトリウムイオンを置換し、他の形式の式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。前記カチオンは、前述したとおりである。

【0287】

合成過程において、常に核酸配列の純度と分子量を検出し、合成品質をよりよく制御することができる。このような検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を測定することができる。

【0288】

アニール方法も、当業者によく知られているものである。例えば、簡単に合成されたセンス鎖（Ｓ鎖）とアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）を等モル比で注射用水に混合して７０～９５℃に加熱し、その後室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このように式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。

【0289】

前記ｓｉＲＮＡ複合体を得た後、いくつかの実施形態において、例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等により合成された式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の特徴を明らかにし、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、目的設計の式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体であるとともに、合成されたｓｉＲＮＡの配列が、所望のｓｉＲＮＡの配列、例えば表１に示される配列の１つであると確認することもできる。

【0290】

式（３２１）に示される化合物は、有機溶剤において、エステル化反応条件下及び塩基とエステル化触媒の存在下で、式（３１３）に示される化合物を環状酸無水物と接触させ、イオン交換を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。

【0291】

【化29】

式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４、Ｒ_１５、Ｌ_１、Ｓ_１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりであり、
Ｒ_６は、式（３２１）におけるＲ_４を提供する基である。いくつかの実施形態において、Ｒ_６は、式（Ａ６１）に示される構造を有する。

【0292】

【化30】

式中、Ｒ_ｉは、窒素含有骨格上のＮ原子との結合を実現できる、Ｒ_ｋＯと結合して１つの遊離ヒドロキシ基が結合されている任意の基であり、Ｒ_ｋはヒドロキシ保護基である。この場合、Ｒ_４にヒドロキシ保護基としての第１の官能基と第２の官能基が含まれ、前記第２の官能基が式（Ｃ１）又は（Ｃ２）に示される構造を含む式（３２１）に示される化合物が得られる。

【0293】

前記エステル化反応条件は、反応温度が０～１００℃、反応時間が８～４８時間であり、いくつかの実施形態においては、前記エステル化反応条件は、反応温度が１０～４０℃、反応時間が２０～３０時間である。

【0294】

いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種を含む。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。前記式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。

【0295】

いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物は、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の１つであり、いくつかの実施形態において、コハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。

【0296】

前記エステル化触媒は、当該エステル化反応を触媒する任意の触媒であってもよく、例えば、当該触媒は、４－ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。

【0297】

いくつかの実施形態において、前記塩基は、任意の無機塩基、有機塩基又はこれらの組合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、前記塩基は、例えば、第３級アミンであってもよい。いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミンと式（３１３）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１～１０：１である。

【0298】

前記イオン交換作用は、式（３２１）に示される化合物を所望のカルボン酸又はカルボン酸塩の形式に変換することであり、イオン交換方法は、当業者に公知である。適切なイオン交換溶液と交換条件を用いて、Ｍ^＋カチオンを有する複合分子を得ることができるが、ここでは詳しい説明を省略する。いくつかの実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエチルアミンリン酸塩溶液を用いて行われ、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度は０．２～０．８Ｍであり、いくつかの実施形態においては、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度は０．４～０．６Ｍであり、式（３１３）に示される化合物に対して、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の用量は３～６Ｌ／ｍｏｌであり、更なる実施形態においては４～５Ｌ／ｍｏｌである。

【0299】

任意の適切な単離方法によって、反応混合物から式（３２１）に示される化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３２１）に示される化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出すること、又は、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３２１）に示される化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。

【0300】

いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される化合物の調製方法は、縮合反応条件下で、有機溶剤において、縮合剤、縮合触媒と第３級アミンの存在下で、上記イオン交換反応により得られた生成物を、さらにアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させることをさらに含む。この場合、Ｒ_４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ１’）に示される構造を含む式（３２１）に示される化合物が得られる。

【0301】

前記固相担体は、ｓｉＲＮＡの固相合成に用いられる担体の１つであり、そのうちのいくつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキシ基又はアミノ官能基を含む固相担体から選択されてもよく、いくつかの実施形態において、前記固相担体は、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。いくつかの実施形態において、前記アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂は、粒子径１００～４００メッシュ（ｍｅｓｈ）、表面におけるアミノ基又はヒドロキシ基の担持量０．２～０．５ｍｍｏｌ／ｇというパラメーターを有する。前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は１０～４００μｍｏｌ化合物／グラムの固相担体（μｍｏｌ／ｇ）である。いくつかの実施形態において、前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は５０～２００μｍｏｌ／ｇである。

【0302】

前記有機溶剤は、当業者に既知の任意の適切な溶剤又は混合溶剤であってもよい。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量は２０～２００Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５０～１００Ｌ／ｍｏｌである。

【0303】

いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート塩／エステル（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ－ｏｘｙｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰｙＢｏｐ）、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（３－（Ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）－１，２，３－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｉｎ－４（３Ｈ）－ｏｎｅ、ＤＥＰＢＴ）及び／又はＯ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート塩／エステル（Ｏ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であってもよく、いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート塩／エステルである。前記縮合剤と式（３２１）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、他の実施形態において１：１～５：１である。

【0304】

いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン及び／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、前記第３級アミンと式（３２１）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、１：１～５：１である。

【0305】

いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される化合物の調製方法は、キャッピング反応条件下で、有機溶剤において、得られた縮合生成物をキャッピング試薬及びアシル化触媒と接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることをさらに含んでもよい。前記キャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避けるために、まだ完全に反応していないあらゆる活性反応官能基を除去することである。前記キャッピング反応の条件は、反応温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が１～１０ｈ、いくつかの実施形態では３～６ｈである。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、ｓｉＲＮＡ固相合成に用いられるキャッピング試薬を用いてもよい。

【0306】

いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬１（ｃａｐ１）及びキャッピング試薬２（ｃａｐ２）からなり、キャッピング試薬１は、Ｎ－メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比は１：１０～１：１であり、いくつかの実施形態において、１：３～１：１であり、ピリジンとアセトニトリルの総体積とＮ－メチルイミダゾールとの体積は１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１～７：１である。前記キャッピング試薬２は、酢酸無水物である。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬２は、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積が１：１～１：１０であり、更なる実施形態において１：２～１：６である。

【0307】

いくつかの実施形態において、前記Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液の体積と式（３２１）に示される化合物の質量との比は５ｍｌ／ｇ～５０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態では１５ｍｌ／ｇ～３０ｍｌ／ｇである。前記酢酸無水物のアセトニトリル溶液の体積と式（３２１）に示される化合物の質量との比は０．５ｍｌ／ｇ～１０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態では１ｍｌ／ｇ～５ｍｌ／ｇである。

【0308】

いくつかの実施形態において、キャッピング試薬としては、等モル量の酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾールを用いる。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量は１０～５０Ｌ／ｍｏｌ、いくつかの実施形態では５～３０Ｌ／ｍｏｌである。

【0309】

いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、エステル化縮合又はアミド化縮合に使用できる任意の触媒、例えばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、４－ジメチルアミノピリジンである。前記触媒と式（３２１）に示される化合物との質量比は０．００１：１～１：１であり、いくつかの実施形態では０．０１：１～０．１：１である。

【0310】

いくつかの実施形態において、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）に示される化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗浄し、濾過し、未反応の反応物、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去することにより、式（３２１）に示される化合物を得ることができる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、ジクロロメタン、メタノールから選択され、いくつかの実施形態において、アセトニトリルである。

【0311】

いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される複合分子の調製方法は、有機溶剤において、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３１３）に示される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む。この場合、Ｒ_４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能が式（Ｃ３）に示される構造を含む式（３２１）に示される化合物が得られる。

【0312】

いくつかの実施形態において、カップリング反応条件は、温度が０～５０℃であってもよく、例えば１５～３５℃である。式（３１３）に示される化合物とホスホルジアミダイトとのモル比は１：１～１：５０であってもよく、例えば１：５～１：１５であり、式（３１３）に示される化合物とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：１００であってもよく、例えば１：５０～１：８０である。反応時間は２００～３０００秒であってもよく、例えば５００～１５００秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス（ジイソプロピルアミノ）（２－シアノエトキシ）ホスフィンを用いてもよく、市販品を購入してもよく、又は本分野で公知の方法により合成されてもよい。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、例えば、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、例えば無水アセトニトリルである。いくつかの実施形態において、式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、例えば、５～２０Ｌ／ｍｏｌであってもよい。当該カップリング反応を行うことにより、式（３１３）に示される化合物におけるヒドロキシ基とホスホルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３２１）に示される化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。

【0313】

いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される化合物の調製方法は、カップリング反応条件下で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離して得られた生成物を、さらにヒドロキシ基含有固相担体と接触させる工程をさらに含む。その後、キャッピング反応、酸化反応を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得る。この場合、Ｒ_４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能が式（Ｃ３）に示される構造を有する式（３２１）に示される化合物が得られる。

【0314】

いくつかの実施形態において、前記固相担体は、本分野で公知の核酸固相合成に使用できる固相担体であり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ^ＴＭ ３００ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｕｐｐｏｒｔ，Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、構造が式Ｂ８０に示される）であってもよい。

【0315】

【化31】

【0316】

脱保護反応は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、脱保護条件は、温度が０～５０℃、例えば１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒、例えば５０～１５０秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固定相における－ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）保護基とのモル比が２：１～１００：１であり、例えば３：１～５０：１である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担体の表面に反応活性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、後続のカップリング反応を行いやすくする。

【0317】

カップリング反応条件及びカップリング試薬の選択は、以上のとおりである。当該カップリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホルアミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。

【0318】

いくつかの実施形態において、キャッピング反応条件は、温度が０～５０℃、例えば１５～３５℃であり、反応時間が５～５００秒、例えば１０～１００秒であり、前記キャッピング反応をキャッピング試薬の存在下で行う。キャッピング試薬の選択と用量は、以上のとおりである。

【0319】

酸化反応条件は、温度が０～５０℃、例えば１５～３５℃であってもよく、反応時間が１～１００秒、例えば５～５０秒であってもよく、酸化試薬は、例えばヨウ素であってもよい（いくつかの実施形態ではヨウ素水として提供する）。いくつかの実施形態では、酸化試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１：１～１００：１であり、例えば、５：１～５０：１であってもよい。いくつかの実施形態では、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３の混合溶剤で行われる。

【0320】

いくつかの実施形態において、Ｒ_６は、式Ｂ７又はＢ８の基の１つである。

【0321】

【化32】

式中、ｑ_２の定義は、前述したとおりである。

【0322】

この場合、式（３１３）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件下及びアミド化反応縮合剤と第３級アミンの存在下で、式（３１４）に示される化合物を式（Ａ－１）に示される化合物又は式（Ａ－２）に示される化合物と接触させ、その後単離する、という調製方法により得ることができる。

【0323】

【化33】

式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４、Ｒ_１５、Ｌ_１、Ｓ_１、ｑ_２及びＲ_ｋそれぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。

【0324】

前記アミド化反応条件は、反応温度が０～１００℃、反応時間が１～４８時間であってもよく、いくつかの実施形態では、前記アミド化反応条件は、反応温度が１０～４０℃、反応時間が２～１６時間である。

【0325】

いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アルコール類溶剤、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記アルコール類溶剤は、いくつかの実施形態において、メタノール、エタノール、プロパノールの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、エタノールである。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランである。前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルである。前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１４）に示される化合物に対して、有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、更なる実施形態において３～２０Ｌ／ｍｏｌである。

【0326】

いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート塩／エステル、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン、４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩（４－（４，６－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）又はＯ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート塩／エステルであり、更なる実施形態において、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オンである。前記アミド化反応縮合剤と式（３１４）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１～５：１である。

【0327】

いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、更なる実施形態において、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミン基と式（３１４）に示される化合物とのモル比が３：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、５：１～１０：１である。

【0328】

いくつかの実施形態において、式（Ａ－１）及び式（Ａ－２）に示される化合物は、任意の適当な方法により調製されてもよい。例えば、Ｒ_ｋがＤＭＴｒ基である場合、グリセリン酸カルシウムとＤＭＴｒＣｌを反応させて式（Ａ－１）に示される化合物を調製することができる。同様に、３－アミノ－１，２－プロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、ＤＭＴｒＣｌと反応させて式（Ａ－２）に示される化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭素原子数４～１３、いくつかの実施形態において４～８の環状酸無水物であってもよい。当業者であれば容易に理解できるように、前記環状酸無水物の選択は、（Ａ－２）に示される化合物におけるｑ_２の異なる値に対応しており、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水物である場合、ｑ_２＝１であり、前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、ｑ_２＝２であり、類推してもよい。

【0329】

いくつかの変形において、式（３１４）に示される化合物を、前記環状酸無水物、３－アミノ－１，２－プロパンジオール及びＤＭＴｒＣｌと順に反応させることにより、式（３１３）に示される化合物を調製することもできる。当業者であれば理解されるように、これらの変形は式（３１３）に示される化合物の構造及び機能に影響を与えず、かつこれらの変形は当業者が上記方法に基づいて実現しやすいことである。

【0330】

上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１３）に示される化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１３）に示される化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出すること、及び、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３１３）に示される化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。

【0331】

いくつかの実施形態において、式（３１４）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応縮合剤と第３級アミンの存在下で、縮合反応条件下で、式（３２０）に示される化合物を式（３１６）に示される化合物と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。

【0332】

【化34】

式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４、Ｒ_１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。

【0333】

式（３１６）に示される化合物としては、例えば、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１４，１３６，１６９５８－１６９６１に開示された化合物を用いてもよく、或いは、式（３１６）に示される化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、米国特許ＵＳ ８，１０６，０２２ Ｂ２の実施例１に開示された方法を参照していくつかの式（３１６）に示される化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細書に組み込まれる。

【0334】

いくつかの実施形態において、前記縮合反応条件は、反応温度が０～１００℃、反応時間が０．１～２４時間であり、いくつかの実施形態では、反応温度が１０～４０℃、反応時間が０．５～１６時間である。

【0335】

所望の生成物である式（３１４）に示される化合物の構造を考慮すると、前記式（３１６）に示される化合物と前記式（３２０）に示される化合物とのモル比は、式（３２０）におけるｎ１とｎ３の和に基づいて決定されるべきである。いくつかの実施形態において、例えば、ｎ１＋ｎ３＝３の場合、反応が完全であり、過剰ではないことを確保するために、式（３１６）に示される化合物と式（３２０）に示される化合物とのモル比が３：１～３．５：１であってもよく、いくつかの実施形態において、３．０１：１～３．１５：１である。

【0336】

いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であり、前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３２０）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量は３～５０Ｌ／ｍｏｌ、いくつかの実施形態では５～２０Ｌ／ｍｏｌである。

【0337】

いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート塩／エステル、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート塩／エステル、４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩又は１－ヒドロキシベンゾトリアゾールの１種又は複数種であり、更なる実施形態において、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート塩／エステルと１－ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物であり、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート塩／エステルと１－ヒドロキシベンゾトリアゾールが等モル量で使用される。前記全アミド化反応縮合剤と式（３１６）に示される化合物とのモル比は１：１～３：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１．０５：１～１．５：１である。

【0338】

前記第３級アミンは、Ｎ－メチルモルホリン、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであってもよく、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチルモルホリンであり、前記第３級アミンと式（３１６）に示される化合物とのモル比は２：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。

【0339】

上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１４）に示される化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１４）に示される化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５～１００：７で勾配溶出すること、及び、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３１４）に示される化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。

【0340】

式（３２０）に示される化合物は、市販品を購入するか、又は当業者により既知の方法を用いて得ることができる。例えば、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３＝３、ｎ１＝１、ｎ３＝２であり、Ｒ_１０、Ｒ_１１、Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４、Ｒ_１５がいずれもＨである場合、式（３２０）に示される化合物は、アルファ・エイサー社から市販品を購入することができる。

【0341】

本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、薬学的に許容できる他の添加剤と併用してもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよく、詳細は、上述した本開示の薬物組成物に関する記載を参照のこと。

【0342】

＜本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の使用＞
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、ＰＫＫ関連疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。

【0343】

いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含むＰＫＫ関連疾患の予防及び／又は治療方法を提供する。

【0344】

本開示のｓｉＲＮＡ活性成分を、それを必要とする被験体に投与することにより、ＲＮＡ干渉のメカニズムによってＰＫＫ関連疾患を予防及び／又は治療する目的を達成することができる。したがって、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体は、ＰＫＫ関連疾患の予防又は治療に用いられ、又はＰＫＫ関連疾患の予防及び／又は治療のための薬物の調製に用いることができる。

【0345】

いくつかの実施形態において、前記ＰＫＫ関連疾患は、炎症性疾患又は血栓塞栓性疾患である。いくつかの実施形態において、前記炎症性疾患は、慢性炎症性疾患又は急性炎症性疾患であってもよい。いくつかの実施形態において、前記炎症性疾患は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、浮腫、血管性浮腫、腫脹、眼瞼の血管性浮腫、眼球浮腫、黄斑浮腫又は脳浮腫を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記血栓塞栓性疾患は、血栓症、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、脳卒中又は脳梗塞を含むが、これらに限定されない。

【0346】

前記疾患は、共通の１つ以上のリスク因子、原因又は結果を有する可能性がある。

【0347】

炎症性疾患の発症のある特定のリスク因子及び原因は、炎症性疾患に対する遺伝的素因及び環境因子を含む。いくつかの実施形態において、被験体は、変異補体１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）遺伝子又は変異因子１２（ＦＸＩＩ）遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、被験体は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、又はアンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬（ＡＲＢ）を摂取したことがあるか、摂取している。いくつかの実施形態において、被験体は、血管性浮腫を引き起こすアレルギー反応があった。いくつかの実施形態において、被験体は、Ｉ型ＨＡＥを有する。いくつかの実施形態において、被験体は、ＩＩ型ＨＡＥを有する。いくつかの実施形態において、被験体は、ＩＩＩ型ＨＡＥを有する。炎症性疾患の発症に関連するある特定の転帰として、四肢（すなわち、手、足、腕、脚）、腸（腹部）、顔、性器、喉頭（すなわち、発声器）を含む様々な身体部分の浮腫／腫脹、血管透過性、血管漏出、一般的な炎症、腹痛、膨満感、嘔吐、下痢、皮膚のかゆみ、呼吸器（喘息）反応、鼻炎、アナフィラキシー、気管支収縮、低血圧、昏睡、及び死が挙げられる。

【0348】

血栓塞栓性疾患の発症のある特定のリスク因子及び原因として、血栓塞栓性疾患に対する遺伝的素因、外科手術（特に整形外科）、悪性腫瘍、妊娠、高齢、経口避妊薬の使用、心房細動、以前の血栓塞栓性病態、慢性炎症性疾患、及び遺伝性又は後天性の血栓性凝固障害が挙げられる。血栓塞栓症の病態の発症に関連するある特定の転帰として、病変血管の血流の減少、組織の死、及び死亡が挙げられる。

【0349】

本明細書で用いられる用語「薬剤投与／投与」とは、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化して所望の効果を生じさせる方法又は経路により、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を被験体の体内に入れることを指す。本開示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与を含む。一般的には、局所投与により、被験体の体循環よりも多くのｓｉＲＮＡ複合体が特定の部位に送達されるが、全身投与により、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体が被験体の基本体循環に送達される。本開示が炎症性疾患及び／又は血栓塞栓性疾患の予防及び／又は治療手段を提供することを意図することを考慮すると、いくつかの実施形態において、薬物を肝臓に送達することができる投与方法を採用する。

【0350】

本分野で既知の任意の適切な経路で被験体に投与することができ、前記経路としては、経口投与又は胃腸外経路、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気管内投与（エアロゾル）、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与（口腔内投与と舌下投与を含む）を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、１日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、四半期、半年又は１年に１回又は複数回であってもよい。

【0351】

本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体の用量は、本分野における通常の用量であってもよく、前記用量は、各種のパラメーター、特に被験体の年齢、体重及び性別により決定してもよい。細胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定し、例えば、ＬＤ_５０（５０％の群体を死亡させる致死用量）及びＥＤ_５０（定量的反応において、５０％の最大反応強度を引き起こすことができる用量を指し、定性的反応において、５０％の実験対象に陽性反応が発生する場合の用量を指す）を測定してもよい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデータに基づいて、ヒト用量の範囲を得ることができる。

【0352】

本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、薬物組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を投与する場合、例えば、雄性又は雌性、６～１２週齢、体重１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ又は３０～４５ｇのｏｂ／ｏｂマウスに対して、ｓｉＲＮＡの量として、（ｉ）ｓｉＲＮＡ複合体について、そのｓｉＲＮＡ用量は０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、いくつかの実施形態では０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施形態では０．０５～２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの別の実施形態では０．１～１５ｍｇ／ｋｇ体重であり、さらにいくつかの実施形態では０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物に対して、そのｓｉＲＮＡ用量は０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、いくつかの実施形態では０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施形態では０．０５～５ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施形態では０．１～３ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0353】

いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量をＰＫＫ高発現細胞と接触させ、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を前記細胞に導入し、ＲＮＡ干渉のメカニズムによって細胞におけるＰＫＫ遺伝子の発現を抑制する目的を達成することを含む、ＰＫＫ遺伝子の発現の抑制方法を提供する。前記細胞は、ＳＭＭＣ－７７２１、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７等の肝がん細胞系又は単離した初代肝細胞から選択されてもよく、ＩＭＲ－３２ヒト神経芽細胞腫細胞から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ＰＫＫ ｍＲＮＡ又はその配列断片を発現するプラスミドをトランスフェクションした細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ＰＫＫ ｍＲＮＡ又はその配列断片を発現するプラスミドをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞である。

【0354】

本開示により提供される方法により細胞におけるＰＫＫ遺伝子の発現を抑制する。提供される修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ用量は、一般的に、標的ｍＲＮＡの発現を低減でき、標的細胞表面では１ｐＭ～１μＭ、０．０１ｎＭ～１００ｎＭ、０．０５ｎＭ～５０ｎＭ、又は０．０５ｎＭ～約５ｎＭの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を達成するのに必要な量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細胞層の数、送達するのが局所か全身か等を含む、各種の因子により変化する。送達部位における濃度は、標的細胞又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。

【0355】

＜キット＞
本開示は、本開示の修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の少なくとも１種の有効量を含むキットを提供する。

【0356】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、容器で修飾ｓｉＲＮＡを提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、薬学的に許容できる賦形剤を提供する容器を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットには、他の成分、例えば、安定化剤又は防腐剤等が含まれてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、本明細書に記載された修飾ｓｉＲＮＡを提供する容器とは別の容器で少なくとも１種の他の治療剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットは、修飾ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤又は他の成分（存在する場合）を混合するための説明書を含んでもよい。

【0357】

本開示のキットにおいて、前記修飾ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体、及び／又は薬学的に許容できる添加剤は、任意の形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍結乾燥形式として提供されてもよい。いくつかの実施形態において、前記修飾ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記薬物組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体及び薬学的に許容できる任意の添加剤は、基本的にクリーン及び／又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示のキットで無菌水を提供することができる。

【0358】

以下に実施例により本開示をさらに説明するが、本開示は、これによって何ら制限されない。

【実施例】

【0359】

特に説明がない限り、以下の実施例で用いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ、プラスミド構築等の操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載された方法を参照して行われる。

【0360】

本開示により合成されたＰＫＫ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ複合体又は陰性対照であるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ複合体で細胞をトランスフェクションした場合、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、具体的な操作については、メーカーにより提供される説明書を参照のこと。

【0361】

別に説明がない限り、以下で提供される試薬割合は、いずれも体積比（ｖ／ｖ）として計算される。

【0362】

特に断らない限り、以下の体内／体外効果実験データは、いずれも

【数1】

で表され、データ分析では、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ５．０統計分析ソフトウェアを採用した。

【0363】

（調製例１）
＜ｓｉＲＮＡ複合体であるＬ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰの調製＞
本調製例は、ｓｉＲＮＡ複合体であるＬ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰを合成した。当該ｓｉＲＮＡ複合体に複合されたｓｉＲＮＡは、表３における、ｓｉＲＮＡ複合体であるＬ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰに対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を有する。

【0364】

（１－１）Ｌ－１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｌ－１０化合物を合成した。

【0365】

【化35】

【0366】

（１－１－１）複合末端セグメントＧＡＬ－５の合成

【化36】

【0367】

（１－１－１ａ）ＧＡＬ－２の合成
１００．０ｇのＧＡＬ－１（Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン塩酸塩、ＣＡＳ番号：１７７２－０３－８、寧波弘翔生化公司から購入、４６３．８ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で５４０ｍｌの酢酸無水物（Ｅｎｏｘ社から購入、５５６５．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌反応した。反応液を１０Ｌの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを２Ｌの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセトニトリル／トルエン混合溶剤（アセトニトリル：トルエンの体積比＝１：１）を加え、溶剤を蒸発乾固し、１３０．０ｇの白色固形製品ＧＡＬ－２を得た。

【0368】

（１－１－１ｂ）ＧＡＬ－３の合成
工程（１－１－１ａ）で得られたＧＡＬ－２（３５．１ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を２１３ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴及び窒素保護条件で、２４．０ｇのＴＭＳＯＴｆ（ＣＡＳ番号：２７６０７－７７－８、マックリン社から購入、１０８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。

【0369】

反応液に４００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、１Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、均一に攪拌し、有機相を分離し、水相をジクロロエタンにより１回あたり３００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、２６．９ｇの淡黄色の粘稠な水飴状製品ＧＡＬ－３を得た。

【0370】

（１－１－１ｃ）ＧＡＬ－４の合成
工程（１－１－１ｂ）で得られたＧＡＬ－３（２６．９ｇ、８１．７ｍｍｏｌ）を１３６ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した４Å分子篩粉３０ｇを加え、９．０ｇの５－ヘキセン－１－オール（ＣＡＳ番号：８２１－４１－０、Ａｄａｍａｓ－ｂｅｔａ社から購入、８９．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、氷浴下で窒素保護下で９．０８ｇのＴＭＳＯＴｆ（４０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に３００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて１０分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、水相を３００ｍｌのジクロロエタンで１回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、４１．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ－４を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。

【0371】

（１－１－１ｄ）ＧＡＬ－５の合成
工程（１－１－１ｃ）に記載された方法により得られたＧＡＬ－４（１４．９ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）を７７ｍｌのジクロロメタンと７７ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ１０３ｍｌの脱イオン水及び２９．７ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：７７９０－２８－５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１３８．８ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（ＣＡＳ番号：１４８９８－６７－０、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２３８ｍｇ、１．１４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液に３００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを約７．５に調整し、有機相を分離して捨て、水相をジクロロメタンで、１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を捨てた。固形クエン酸で水相のｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで、１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．８５ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ－５を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ １２．０１ （ｂｒ， １Ｈ）， ７．８３ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．９６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．２， ３．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０７ － ３．９５ （ｍ， ３Ｈ）， ３．９２ － ３．８５ （ｍ， １Ｈ）， ３．７４ － ３．６７ （ｍ， １Ｈ）， ３．４８ － ３．３９ （ｍ， １Ｈ）， ２．２０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．００ （ｓ， ３Ｈ）， １．９０ （ｓ， ３Ｈ）， １．７７ （ｓ， ３Ｈ）， １．５５ － １．４５ （ｍ， ４Ｈ）。

【0372】

（１－１－２）Ｌ－８の合成

【0373】

【化37】

Ｊ－０（９．８８６ｇ、５２．５ｍｍｏｌ、アルファ・エイサー社から購入）と工程（１－１－１）で得られたＧＡＬ－５（７２．８１９ｇ、１６２．７５ｍｍｏｌ、複数のロットの製品を組み合わせた）を５２５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、４４．７８２ｇ、３４６．５０ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート塩／エステル（ＰｙＢＯＰ、９０．１５８ｇ、１７３．２５ｍｍｏｌ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、２３．４１０ｇ、１７３．２５ｍｍｏｌ）を加え、室温で４ｈ反応させ、２０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム及び２００ｍｌの飽和食塩水を加えて洗浄し、水相をジクロロメタンで、１回あたり１００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。精製には、２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：２５～１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３８．８ｇの純粋なＬ－８を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ７．８４ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．２７ － ７．２３ （ｍ， １Ｈ）， ７．１３ － ７．１８ （ｍ， １Ｈ）， ５．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ３．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．９７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．３， ３．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．４８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．０９ － ３．９８ （ｍ， ９Ｈ）， ３．８８ （ｄｄ， Ｊ ＝ １９．３， ９．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．７５ － ３．６６ （ｍ， ３Ｈ）， ３．４４ － ３．３８ （ｍ， ３Ｈ）， ３．１７ － ３．３０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．１０ － ２．９７ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３５ － ２．２０ （ｍ， ６Ｈ）， ２．１５ － ２．０８ （ｍ， ９Ｈ）， ２．０７ － １．９８ （ｍ， １３Ｈ）， １．９４ － １．８７ （ｍ， ９Ｈ）， １．８１ － １．７４ （ｍ， ９Ｈ）， １．６５ － １．４２ （ｍ， １８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ_８５Ｈ_１１９Ｎ_７Ｏ_３０，［Ｍ＋Ｈ］^＋、理論値：１４７７．５９、実測値：１４７７．２３。

【0374】

（１－１－３ａ）Ａ－１の合成

【0375】

【化38】

ＤＭＴｒＣｌ（４，４’－ビスメトキシトリチルクロリド、１０１．６５ｇ、３００ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、ＤＬ－グリセリン酸カルシウム水和物（２８．６３ｇ、１００ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で２０ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキを２００ｍｌのＤＣＭでリンスし、濾液を乾燥まで減圧濃縮し、残りを５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩（ｐＨ＝７～８）で、１回あたり２００ｍｌで２回洗浄し、水相をジクロロメタンで、１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．３５～１：１：１：０．５５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、６００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、２００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で１回洗浄し、２００ｍｌのジクロロメタンで水相を１回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩減圧し、５０．７ｇの白色固形製品Ａ－１を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．４６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ６．５， ２．３， １．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４０ － ７．２８ （ｍ， ７Ｈ）， ６．８９ － ６．８１ （ｍ， ４Ｈ）， ４．８４ （ｄ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３６ － ４．２４ （ｍ， １Ｈ）， ４．２９ （ｓ， ６Ｈ）， ３．９２ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．４， ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．３， ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．５２ （ｑ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ６Ｈ）， １．０３ （ｔ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ_２４Ｈ_２３Ｏ_６，［Ｍ－Ｈ］^－、理論値：４０７．１５、実測値：４０６．９２。

【0376】

（１－１－３ｂ）Ｌ－７の合成

【化39】

工程（１－１－２）で得られたＬ－８（４０ｇ、２７．０９ｍｍｏｌ、複数のロットの製品を組み合わせた）と工程（１－１－３ａ）で得られたＡ－１（４１．４１８ｇ、８１．２７ｍｍｏｌ）とを混合し、２７１ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）（２４．３１８ｇ、８１．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（２１．００７ｇ、１６２．５４ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１．５ｈ攪拌反応させ、８００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで、１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、１５０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、５０ｍｌのジクロロメタンで水相を１回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、粗製品を得た。カラム精製には、２ｋｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２００ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して４０．４ｇの純粋なＬ－７を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ７．９０ － ７．７８ （ｍ， ４Ｈ）， ７．７５ － ７．６４ （ｍ， １Ｈ）， ７．３８ － ７．１８ （ｍ， ９Ｈ）， ６．９１ － ６．８３ （ｍ， ４Ｈ）， ５．２５ － ５．１０ （ｍ， ４Ｈ）， ４．９７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．２， ３．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．４８ － ４．３０ （ｍ， ４Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ９Ｈ）， ３．９３ － ３．８４ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７６ － ３．６６ （ｍ， ９Ｈ）， ３．４５ － ３．３５ （ｍ， ３Ｈ）， ３．２４ － ２．９８ （ｍ， １０Ｈ）， ２．３０ － ２．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１１ － １．８８ （ｍ， ３１Ｈ）， １．８０ － １．４０ （ｍ， ２８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ_９０Ｈ_１２８Ｎ_７Ｏ_３５，［Ｍ－ＤＭＴｒ］^＋、理論値：１５６４．６５、実測値：１５６４．８８。

【0377】

（１－１－４）Ｌ－９の合成

【0378】

【化40】

工程（１－１－３ｂ）で得られたＬ－７（４０ｇ、２１．４２４７ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（４．２８８ｇ、４２．８４９４ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、５．２３５ｇ、４２．８４９４ｍｍｏｌ）を混合して２１５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１３．８４５ｇ、１０７．１２３５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌し、８００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで、１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１ｋｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３１．０ｇの純粋なＬ－９複合分子を得た。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．５８ （ｄ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９４ － ７．８２ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４１ － ７．２９ （ｍ， ５Ｈ）， ７．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， ５Ｈ）， ６．８９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ， ４Ｈ）， ５．４９ － ５．３７ （ｍ， １Ｈ）， ５．２１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．９７ （ｄ， Ｊ ＝ １１．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．４９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ９Ｈ）， ３．８８ （ｄｄ， Ｊ ＝ １９．４， ９．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．７７ － ３．６５ （ｍ， ９Ｈ）， ３．５０ － ３．３９ （ｍ， ６Ｈ）， ３．１１ － ２．９０ （ｍ， ５Ｈ）， ２．６１ － ２．５４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４７ － ２．４１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２６ － ２．１７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１５ － １．９５ （ｍ， ２２Ｈ）， １．９２ － １．８４ （ｍ， ９Ｈ）， １．８０ － １．７０ （ｍ， １０Ｈ）， １．６５ － １．３５ （ｍ， １７Ｈ）， １．３１ － １．１９ （ｍ， ４Ｈ）， ０．９６ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ９Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ_９４Ｈ_１３２Ｎ_７Ｏ_３８，［Ｍ－ＤＭＴｒ］^＋、理論値：１６６４．７２、実測値：１６６５．０３。

【0379】

（１－１－５）Ｌ－１０化合物の合成

【0380】

【化41】

この工程において、Ｌ－９複合分子を固相担体に結合することにより、Ｌ－１０化合物を調製した。

【0381】

工程（１－１－４）で得られたＬ－９複合分子（２２．７５１ｇ、１１ｍｍｏｌ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート塩／エステル（ＨＢＴＵ、６．２５７ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２．８４３ｇ、２２ｍｍｏｌ）を混合し、９００ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、室温で５分間攪拌し、反応液にアミノメチル樹脂（８８ｇ、１００～２００メッシュ、アミノ基担持量４００μｍｏｌ／ｇ、南開和成社から購入）を加え、２５℃で、シェーカーで反応を行い、回転数１５０回転／分間、１８ｈ反応させた後濾過し、ケーキをＤＣＭで１回あたり３００ｍｌで２回リンスし、アセトニトリルで、１回あたり３００ｍｌで３回リンスし、真空油ポンプで１８ｈ乾燥させ、その後、表２に示す配合割合に従い原料（ＣａｐＡ、ＣａｐＢ、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びアセトニトリル）を加えてキャッピング反応を行った。２５℃でシェーカーに静置し、回転数１５０回転／分間で５ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキをアセトニトリルで、１回あたり３００ｍｌで３回リンスし、乾燥まで溶剤を減圧蒸発させ、真空油ポンプで一晩減圧乾燥させ、１０２ｇ、担持量９０．８μｍｏｌ／ｇのＬ－１０化合物（即ち、固相担体に結合されたＬ－９複合分子）を得た。

【0382】

【表2】

ここで、ＣａｐＡとＣａｐＢは、キャッピング試薬溶液であり、ＣａｐＡは、２０体積％のＮ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液であり、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が３：５であり、ＣａｐＢは、２０体積％酢酸無水物のアセトニトリル溶液である。

【0383】

（１－２）ｓｉＲＮＡ複合体であるＬ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰのセンス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたＬ－１０化合物を出発として循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’－５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、保護、カップリング、キャッピング、硫化の４つの反応を行った。合成条件は、以下のように規定した。

【0384】

ヌクレオシドモノマーを０．１Ｍ濃度のアセトニトリル溶液で提供し、各脱保護反応の条件は同じであり、即ち、温度が２５℃、反応時間は７０秒とし、脱保護試薬はジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％ｖ／ｖ）であり、ジクロロ酢酸と固相担体における４，４’－ジメトキシトリチル保護基とのモル比は５：１である。

【0385】

各カップリング反応条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比は１：１０、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比は１：６５である。反応時間は６００秒とし、カップリング試薬は、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（５－（Ｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）－１Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｅ、ＥＴＴ）の０．５Ｍアセトニトリル溶液である。

【0386】

各キャッピング条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃、反応時間は１５秒とした。キャッピング試薬溶液は、モル比が１：１であるＣａｐＡとＣａｐＢの混合溶液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比は、酢酸無水物：Ｎ－メチルイミダゾール：固相担体に結合される核酸配列＝１：１：１である。

【0387】

各酸化反応条件は同じであり、温度が２５℃、反応時間は１５秒とし、酸化試薬は濃度０．０５Ｍのヨウ素水である。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は３０：１である。反応はテトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１の混合溶剤で行った。

【0388】

各硫化反応の条件は同じであり、温度が２５℃、反応時間は３００秒とし、硫化試薬はキサンタンヒドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１２０：１である。反応はアセトニトリル：ピリジン＝１：１の混合溶剤で行った。

【0389】

最後のヌクレオシドモノマーの結合が完了した後、固相担体に結合された核酸配列に対して切断、脱保護、精製、脱塩を順に行い、次に凍結乾燥させてセンス鎖を得た。

【0390】

切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を、濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量は０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、残りの液体を濾過除去し、上清を乾燥まで真空濃縮した。

【0391】

精製と脱塩条件は以下のとおりである。分取用イオンクロマトグラフィー精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ）により、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸の精製を完了した。具体的には、溶出剤Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤Ｂ＝１００：０～５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、デキストランゲルカラムにより脱塩し、充填剤がデキストランゲルＧ２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）であり、脱イオン水で溶出した。

【0392】

検出方法は以下のとおりである。イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）を用いて上記センス鎖の純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を分析した。実測値は理論値に一致しており、３’末端にＬ－９複合分子が複合されたセンス鎖ＳＳが合成されたことを示した。

【0393】

（１－３）ｓｉＲＮＡ複合体であるＬ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰのアンチセンス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ^ＴＭ ｌｏａｄｅｄ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、ｓｉＲＮＡ複合体であるＬ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰのアンチセンス鎖を合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化反応条件は、センス鎖の合成と同じとした。アンチセンス鎖の最後のヌクレオシドモノマーを結合した後、さらに脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行ってＣＰＲ－Ｉモノマー（蘇州吉瑪、番号Ｃａｔ＃１３－２６０１－ＸＸ）をアンチセンス鎖の５’末端に結合し、５’－リン酸ヌクレオチドを形成した。

【0394】

【化42】

当該結合において用いられた脱保護、カップリング、キャッピング、酸化反応条件は、センス鎖の合成と同じとした。当該結合が完了した後、さらに切断と脱保護、精製と脱塩工程を行い、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合成と同じとした。最後に凍結乾燥させてアンチセンス鎖ＡＳを得た。

【0395】

イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）によりアンチセンス鎖の純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によりアンチセンス鎖の分子量を分析した。その結果、実測値が理論値に一致しており、目的配列を有するアンチセンス鎖ＡＳが合成されたことを示した。

【0396】

（１－４）ｓｉＲＮＡ複合体であるＬ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰの合成
ｓｉＲＮＡ複合体であるＬ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰに対して、工程（１－２）及び（１－３）で合成されたセンス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、４０ｍｇ／ｍＬの溶液を得、等モル比で混合し、５０℃で１５ｍｉｎ加熱し、室温で冷却した後、水素結合により二本鎖構造を形成した。超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超純水装置、抵抗率１８．２ＭΩ＊ｃｍ（２５℃））を用いて複合体を濃度が０．２ｍｇ／ｍＬになるまで希釈した後、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。実測値が理論値と一致しており、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、Ｌ－９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。その構造を、式（４０３）に示した。前記ｓｉＲＮＡは、表３に示される、ｓｉＲＮＡ複合体であるＬ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰに対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を有する。

【0397】

【表3】

大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド修飾ヌクレオチドであることを表す。

【0398】

（調製例２～６）
＜本開示のｓｉＲＮＡ複合体の合成＞
調製例１と同じ方法により、さらに、以下の本開示のｓｉＲＮＡ複合体であるＬ１０－ｓｉＰＫＫｂ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｃ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｄ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｅ１Ｍ１Ｓ及びＬ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓをそれぞれ合成した。これらのｓｉＲＮＡ複合体に含まれるｓｉＲＮＡは、それぞれ表３に列挙された、番号がＬ１０－ｓｉＰＫＫｂ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｃ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｄ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｅ１Ｍ１Ｓ及びＬ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１ＳのｓｉＲＮＡ複合体に対応するセンス鎖とアンチセンス鎖の配列を有する。調製方法の相違点は単に以下のとおりである。（ｉ）それぞれ表３における各ｓｉＲＮＡ複合体に対応するｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の配列に従ってセンス鎖及びアンチセンス鎖を合成した。（２）ｓｉＲＮＡ複合体であるＬ１０－ｓｉＰＫＫｅ１Ｍ１Ｓ及びＬ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓに対して、それらのアンチセンス鎖の５’－末端が５’－リン酸を含まず、これに応じて、前述したＣＰＲ－Ｉモノマーを結合する工程を行う必要がなくなる。

【0399】

調製が完了した後、調製例１の方法により調製された各ｓｉＲＮＡ複合体の分子量をそれぞれ検出し、実測値が理論値と一致しており、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、Ｌ－９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。その構造は、いずれも式（４０３）に示した。これらのｓｉＲＮＡ複合体に含まれるｓｉＲＮＡは、それぞれ表３に示される、ｓｉＲＮＡ複合体である１０－ｓｉＰＫＫｂ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｃ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｄ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｅ１Ｍ１Ｓ及びＬ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓに対応する配列であった。

【0400】

（調製例７～１２）
＜本開示により提供されるｓｉＲＮＡの合成＞
固相合成方法により、表４に列挙されたｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、ＤＥＰＣ水を用いて、等モルの表４における相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれ溶解させ、その後にアニールして、本開示により提供されるｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｂ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｃ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｅ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓを得、以上のｓｉＲＮＡの配列は、表４に示した。

【0401】

（比較調製例１）
＜参照ｓｉＲＮＡの合成＞
固相合成方法により、表４における、ｓｉＲＮＡ番号がＮＣのｓｉＲＮＡに対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれ合成した。ＤＥＰＣ水を用いて、得られた等モルのセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれ溶解させ、その後にアニールして、参照ｓｉＲＮＡを得、番号をＮＣとした。

【0402】

【表4】

大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表す。

【0403】

上記配列の調製過程において、目的配列に未修飾のヌクレオチドが含まれる場合、切断と脱保護条件で、アンモニア水で処理した後、一本鎖核酸の量に対して、０．４ｍｌ／μｍｏｌのＮ－メチルピロリドンで生成物を溶解させ、次に０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン及び０．６ ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加えることにより、リボース上の２’－ＴＢＤＭＳ保護を除去した。調製例１の方法により上記ｓｉＲＮＡの分子量をそれぞれ検出し、実測値が理論値と一致しており、得られたｓｉＲＮＡが、それぞれ表４に示される各ｓｉＲＮＡに対応する配列を有することが確認された。

【0404】

（調製例１３～１６）
Ｃｙ５で標識されたｓｉＲＮＡ複合体（Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰ及びＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓ）及びＣｙ５で標識されたｓｉＲＮＡ（Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ及びＣｙ５－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓ）の合成
（１）ｓｉＲＮＡ複合体であるＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰ及びＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓの合成
（ｉ）センス鎖の最後のヌクレオシドモノマーを結合した後、追加のＣｙ５蛍光基をセンス鎖に結合し、（ｉｉ）センス鎖の切断と脱保護条件が異なること以外は、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰの調製と同じ方法により、Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰを調製した。

【0405】

具体的には以下のとおりである。

【0406】

（ｉ）において、調製例（１～２）で説明された固相ホスホルアミダイト法によりセンス鎖を調製する過程において、センス鎖の最後のヌクレオシドモノマーを結合した後、さらに脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応によりＣｙ５ホスホルアミダイトモノマー（上海兆維科技発展有限公司から購入、番号ＯＰ－０５７）をセンス鎖の５’末端に結合した。１）脱保護反応時間を３００秒まで延長し、２）Ｃｙ５カップリング反応時間を９００秒まで延長すること以外は、用いた脱保護、カップリング、キャッピング、酸化反応条件は、（１－２）センス鎖の合成と同じとした。

【0407】

【化43】

【0408】

（ｉｉ）において、切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配列をＡＭＡ溶液（４０ｗｔ％のメチルアミン水溶液と２５ｗｔ％アンモニア水との体積比が１：１である混合溶液）に加え、ＡＭＡ溶液の用量が０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、２５℃の水浴条件下で２ｈ反応させ、残りの担体を濾過除去し、上清を乾燥まで真空濃縮した。

【0409】

センス鎖の精製と脱塩条件は、それぞれ調製例の工程（１－２）におけるセンス鎖を合成する場合の精製と脱塩条件と同じとした。その後に凍結乾燥させて、Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰのセンス鎖を得た。

【0410】

それにより、ｓｉＲＮＡ複合体であるＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰを得、当該ｓｉＲＮＡ複合体のｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端には、Ｃｙ５蛍光基が共有結合され、表５に示される、ｓｉＲＮＡ複合体であるＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰに対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を有する。

【0411】

合成において根拠となるｓｉＲＮＡセンス鎖とアンチセンス鎖の核酸配列が、それぞれ表５に示される、Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓに対応するｓｉＲＮＡセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列であること以外は、Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰの調製と同じ方法により、Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓを調製した。それにより、ｓｉＲＮＡ複合体であるＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓを得、当該ｓｉＲＮＡ複合体のｓｉＲＮＡセンス鎖の５’末端には、Ｃｙ５蛍光基が共有結合された。

【0412】

（４－２）Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ及びＣｙ５－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓの合成
汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ^ＴＭ ｌｏａｄｅｄ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓのセンス鎖を合成したこと以外は、Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰの調製と同じ方法により、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓを調製した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓのセンス鎖の合成と同じとした。

【0413】

合成において根拠となるｓｉＲＮＡ配列が、表５に示される、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓに対応するｓｉＲＮＡ配列であること以外は、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓの調製と同じ方法により、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓを調製した。

【0414】

Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰ、Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓ、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ及びＣｙ５－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１ＳにおけるｓｉＲＮＡ配列は、表５に示した。

【0415】

【表5】

大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表す。

【0416】

調製が完了した後、調製例１の方法により調製されたｓｉＲＮＡ複合体又はｓｉＲＮＡの分子量をそれぞれ検出し、実測値が理論値と一致しており、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、Ｌ－９複合分子及びＣｙ５蛍光基を含む目的設計の二本鎖核酸配列であり、合成されたｓｉＲＮＡが、表５における対応する二本鎖核酸配列を有することが示された。

【0417】

上記本開示のｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体の調製が完了した後、固体粉末に凍結乾燥して使用に備えた。使用中に、例えば注射用水、生理食塩水（ＮＳ）、リン酸緩衝液（ＰＢ）又はリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）等を用いて、それを所望の濃度の溶液に再溶解させて使用することができる。

【0418】

「実験例１」
ｓｉＲＮＡの体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系における抑制活性
１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）でＨＥＫ２９３Ａ細胞（南京科佰生物技術有限公司から購入）を３７℃で５％ＣＯ_２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。

【0419】

Ｋｕｍｉｃｏ Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ．ａｌ．， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ＤＮＡ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ： ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ ｓｅｅｄ ａｒｍ ｉｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００８．３６（７）， ２１３６－２１５１に記載された方法に基づいて、ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ検出プラスミドを構築し、評価対象ｓｉＲＮＡと共にＨＥＫ２９３Ａ細胞に共トランスフェクションし、二重ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルにより、ｓｉＲＮＡの抑制活性を反映した。

【0420】

具体的工程は以下のとおりである。

【0421】

［１］検出プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫ^ＴＭ－２（Ｐｒｏｍｅｇａ^ＴＭ）プラスミドを用いて検出プラスミドを構築し、当該プラスミドが１つの目的配列を含み、すなわちｓｉＲＮＡ標的配列を含む。測定対象ｓｉＲＮＡに対して、目的配列は以下のとおりである。

【0422】

ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓの目的配列：
ＧＧＴＧＴＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＧＴＴＴ（配列番号３９５）
ｓｉＰＫＫｂ１Ｍ１Ｓの目的配列：
ＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＧＡＴＡＧＴＧＴ（配列番号３９６）
ｓｉＰＫＫｃ１Ｍ１Ｓの目的配列：
ＧＡＡＧＣＡＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡ（配列番号３９７）
ｓｉＰＫＫｄ１Ｍ１Ｓの目的配列：
ＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧＴＣＴ（配列番号３９８）
ｓｉＰＫＫｅ１Ｍ１Ｓの目的配列：
ＧＡＡＵＵＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＵＡＵ（配列番号３９９）
ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓの目的配列：
ＧＧＵＣＵＧＵＧＣＵＧＧＣＵＡＵＡＡＡ（配列番号４００）
目的配列をｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ－２プラスミドのＸｈｏ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ部位にクローニングした。

【0423】

［２］トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を８×１０^３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、１６ｈ後に細胞増殖密度が７０～８０％に達したとき、培養ウェル中のＨ－ＤＭＥＭ完全培地をすべて吸引し、各ウェルに８０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）を加えて培養を１．５ｈ継続した。

【0424】

各ｓｉＲＮＡに対して、ＤＥＰＣ水を用いて上記検出プラスミドを希釈して２００ｎｇ／μｌの検出プラスミド希釈標準溶液とした。各ｓｉＲＮＡに対して、ｓｉＲＮＡ及びＤＥＰＣ水を用いて、濃度がそれぞれ１０ｎＭ、１ｎＭ及び０．１ｎＭ（ｓｉＲＮＡの量として）のｓｉＲＮＡ希釈標準溶液を調製した。

【0425】

１Ａ１溶液を調製し、１部の１Ａ１溶液は、濃度が１０ｎＭのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液１μｌ、検出プラスミド希釈標準溶液０．０５μｌ（検出プラスミド１０ｎｇを含む）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１０μｌを含む。

【0426】

１Ａ２溶液を調製し、１部の１Ａ２溶液は、濃度が１ｎＭのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液１μｌ、検出プラスミド希釈標準溶液０．０５μｌ（検出プラスミド１０ｎｇを含む）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１０μｌを含む。

【0427】

１Ａ３溶液を調製し、１部の１Ａ３溶液は、濃度が０．１ｎＭのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液１μｌ、検出プラスミド希釈標準溶液０．０５μｌ（検出プラスミド１０ｎｇを含む）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１０μｌを含む。

【0428】

１Ｂ溶液を調製し、１部の１Ｂ溶液は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ２０００を０．２μｌ及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１０μｌを含む。

【0429】

１Ｃ溶液を調製し、１部の１Ｃ溶液は、検出プラスミド希釈標準溶液０．０５μｌ（検出プラスミド１０ｎｇを含む）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１０μｌを含む。

【0430】

各ｓｉＲＮＡに対して、それぞれ１部の１Ｂ溶液を１部の１Ａ１溶液、１部の１Ａ２溶液、１部の１Ａ３溶液と混合し、室温で２０ｍｉｎ培養し、それぞれトランスフェクション複合体１Ｘ１、１Ｘ２又は１Ｘ３を得た。１部の１Ｂ溶液を１部の１Ｃ溶液と混合し、室温で２０ｍｉｎ培養してトランスフェクション複合体１Ｘ４を得た。

【0431】

各ｓｉＲＮＡに対して、３つの培養ウェル中に、それぞれトランスフェクション複合体１Ｘ１を加え、均一に混合し、添加量が２０μｌ／ウェルであり、ｓｉＲＮＡの最終濃度が約０．１ｎＭの共トランスフェクション混合物を得、試験群１と記す。

【0432】

各ｓｉＲＮＡに対して、別の３つの培養ウェル中に、それぞれトランスフェクション複合体１Ｘ２を加え、均一に混合し、添加量が２０μｌ／ウェルであり、ｓｉＲＮＡの最終濃度が約０．０１ｎＭの共トランスフェクション混合物を得、試験群２と記す。

【0433】

各ｓｉＲＮＡに対して、別の３つの培養ウェル中に、それぞれトランスフェクション複合体１Ｘ３を加え、均一に混合し、添加量が２０μｌ／ウェルであり、ｓｉＲＮＡの最終濃度が約０．００１ｎＭの共トランスフェクション混合物を得、試験群３と記す。

【0434】

別の３つの培養ウェル中に、それぞれトランスフェクション複合体１Ｘ４を加え、ｓｉＲＮＡを含まない共トランスフェクション混合物を得、添加量が２０μｌ／ウェルであり、対照群と記す。

【0435】

ｓｉＲＮＡを含む共トランスフェクション混合物とｓｉＲＮＡを含まない共トランスフェクション混合物を培養ウェル中に４ｈ共トランスフェクションした後、各ウェルに２０％ＦＢＳを含むＨ－ＤＭＥＭ完全培地を１００μｌ追加した。９６ウェルプレートをＣＯ_２インキュベーターに置いて、共トランスフェクションを２４ｈ継続した。

【0436】

［３］検出
培養ウェル中の培地を吸引し、各ウェルに１５０μｌのＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬とＨ－ＤＭＥＭ混合溶液（体積比１：１）を加え、十分かつ均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ培養した後、１２０μｌの混合溶液を９６ウェルの酵素標識プレートに移し、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＩＩ多機能マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて各培養ウェル中のＦｉｒｅｆｌｙ化学発光値（Ｆｉｒ）を読み取り、さらに各ウェルに６０μｌのＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ（登録商標）試薬を加え、十分かつ均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ培養した後、Ｆｉｒを読み取る並び順に従って、マイクロプレートリーダーを用いて各培養ウェル中のＲｅｎｉｌｌａの化学発光値（Ｒｅｎ）を読み取った。

【0437】

各ウェルの発光比Ｒａｔｉｏ＝Ｒｅｎ／Ｆｉｒを算出し、各試験群又は対照群の発光比Ｒａｔｉｏ（試験）又はＲａｔｉｏ（対照）は三つの培養ウェルＲａｔｉｏの平均値である、対照群の発光比を基準とし、各試験群の発光比を正規化し、Ｒｅｎｉｌｌａレポーター遺伝子の相対的発現レベル、すなわち残留活性を示すためのＲａｔｉｏ（試験）／Ｒａｔｉｏ（対照）の比Ｒを得た。ｓｉＲＮＡによる目的配列に対する抑制率＝（１－Ｒ）×１００％である。

【0438】

図１は、それぞれｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｂ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｃ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｅ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓをトランスフェクションした後のＨＥＫ２９３Ａ細胞におけるＲｅｎｉｌｌａレポーター遺伝子の残留活性を示す。

【0439】

比較実験例１
参照ｓｉＲＮＡ ＮＣの体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における抑制活性。
試験されるｓｉＲＮＡが参照ｓｉＲＮＡ ＮＣであること以外は、実験例１の方法により参照ｓｉＲＮＡ ＮＣのｐｓｉＣＨＥＣＫ系における抑制活性を同時に考察した。結果を図１に示した。

【0440】

結果から明らかなように、ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｂ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｃ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｅ１Ｍ１Ｓ及びｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓは、いずれも目的配列抑制活性が高く、かつ濃度依存性を示した。特に、０．１ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で、ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ１Ｍ１Ｓ及びｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓによる抑制率が９０％程度に達し、高いＰＫＫ遺伝子発現抑制効果を示した。

【0441】

「実験例２」
ｈＰＫＫ安定トランスフェクション細胞株の構築とｓｉＲＮＡの活性分析
配列、例えば配列番号４０１に示される遺伝子断片をｐｃＤＮＡ３．１汎用担体に構築して、ｐｃＤＮＡ３．１組換えプラスミドを得、当該遺伝子断片は、ヒトＰＫＫ ｍＲＮＡをコードする遺伝子の配列であった。この構築プロセスは、金唯智生物技術有限公司に依頼した。

【0442】

ＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＣＡＡＧＣＡＡＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣＴＡＣＡＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＡＡＣＴＣＴＡＴＧＡＡＡＡＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＴＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＡＡＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＴＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＴＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＧＴＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＡＴＣＡＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＧＴＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＧＡＴＡＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧＡＣＡＴＴＣＣＴＴＧＡＡＧＣＡＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＡＧＴＧＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＣＡＴＴＴＡＴＡＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＴＡＴＧＡＧＡＧＧＡＧＴＣＡＡＴＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＣＴＡＡＧＧＴＴＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＣＡＴＴＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＣＧＣＡＡＡＣＡＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＡＧＴＡＣＣＧＧＡＡＣＡＡＴＴＧＣＣＴＡＴＴＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＣＣＣＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＴＡＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＡＣＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＣＡＣＴＧＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＴＴＴＣＡＧＡＡＡＴＴＧＧＴＴＧＣＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧＣＧＴＴＣＴＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＧＴＴＧＣＣＡＧＧＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＣＧＧＡＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＣＣＣＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＴＡＣＡＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＡＡＴＣＧＡＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＡＧＣＣＴＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＴＴＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＣＣＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＡＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＧＴＧＡＡＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＧＡＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＴＣＧＣＴＧＴＣＡＧＴＴＴＴＴＣＡＣＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＧＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＴＴＡＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＧＧＡＴＴＧＣＧＴＡＴＧＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＴＴＴＧＡＧＡＴＴＧＴＧＴＡＡＣＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＣＧＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＣＡＴＡＧＧＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＧＴＣＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＣＧＣＡＴＣＴＡＴＡＧＴＧＧＣＡＴＴＴＴＡＡＡＴＣＴＧＴＣＡＧＡＣＡＴＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴＣＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＡＣＣＡＡＡＡＣＴＡＴＡＡＡＧＴＣＴＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＴＣＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＴＴＧＡＴＡＡＡＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＴＴＧＡＡＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＧＣＣＴＡＣＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧＴＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡＣＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＣＧＧＡＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡＡＴＡＴＴＣＴＡＣＡＡＡＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＣＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＡＡＣＧＧＡＴＧＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＴＴＧＴＡＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＡＡＴＧＴＧＧＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＧＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＡＴＣＣＴＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＴＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＴＣＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＣＡＡＴＧＣＧＡＧＧＴＣＧＣＡＡＣＴＧＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＴＣＡ （配列番号４０１）

【0443】

１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）でＨＥＫ２９３Ａ細胞（南京科佰生物技術有限公司から購入）を３７℃で５％ＣＯ_２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。使用前に、ＤＭＥＭ完全培地でＨＥＫ２９３Ａ細胞を１×１０^５細胞／ｍＬ濃度の細胞懸濁液に調製した。

【0444】

ＨＥＫ２９３Ａ細胞懸濁液を２５ｃｍ^３のプラスチック培養フラスコ中に接種し、各瓶に５ｍＬ接種し、約７０％コンフルエントになるまで培養したとき、培養フラスコ中のＤＭＥＭ完全培地をすべて吸引し、培養フラスコ中に５ｍＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）を加えて培養を１．５ｈ継続した。

【0445】

１Ａ溶液を調製し、１部の１Ａ溶液が３μｇのｐｃＤＮＡ３．１組換えプラスミドと５００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含み、均一に混合した。

【0446】

１Ｂ溶液を調製し、１部の１Ｂ溶液が９μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ２０００及び５００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含み、軽く均一に混合した。

【0447】

１部の１Ｂ溶液と１部の１Ａ溶液を室温で２０ｍｉｎ共同培養して、１部のトランスフェクション複合体１Ｘを得た。

【0448】

ＨＥＫ２９３Ａ細胞を培養するための前述した培養フラスコのそれぞれに、１部のトランスフェクション複合体１Ｘを加え、均一に混合し、４ｈ後に新しい培地を交換し、４８ｈ培養して、選別されるＨＥＫ２９３Ａ細胞を得た。

【0449】

１×ＰＢＳで抗生物質Ｇ４１８（索莱宝公司、番号Ｇ８１６０－１ｇ）を７０ｍｇ／ｍｌの溶液に溶解させ、次にＧ４１８濃度が７００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌになるまでＨ－ＤＭＥＭ完全培地でそれぞれ希釈して、Ｇ４１８培地及び半選別濃度のＧ４１８培地を得た。

【0450】

前述した選別されるＨＥＫ２９３Ａ細胞に対し、培養フラスコ中の培地を吸引し、Ｇ４１８培地を加えて選別し、２日ごとに新しいＧ４１８培地を１回交換し、毎日細胞の死亡状況を観察し、細胞数が２回の観察期間に顕著に減少しなかった場合（正常細胞が完全に死亡したと考えられる）、新しいＨ－ＤＭＥＭ完全培地を交換して培養した。

【0451】

細胞が６０％コンフルエントに達したとき、培養フラスコ中の培地を吸引し、新しいＧ４１８培地を加えて培養した。４日後に、新しいＧ４１８培地を再び交換した。トランスフェクション後の１５日目に、培養した細胞を収集し、安定トランスフェクション細胞株ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａを得た。半選別濃度のＧ４１８培地で当該安定トランスフェクション細胞株ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａの培養を継続した。

【0452】

定量的リアルタイムＰＣＲにより得られた安定トランスフェクション細胞株ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａを分析して分かるように、得られた安定トランスフェクション細胞株ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａは、ｈＰＫＫ遺伝子を高コピーで成功して組み込んだ。一般的なＰＣＲで遺伝子全長の長さを増幅し、増幅断片の大きさを検出し、結果から明らかなように、安定トランスフェクション細胞株ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａに前述した配列番号４０１に示される配列全長を有する転写産物を組み込んだ。

【0453】

以下、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）により本開示のｓｉＲＮＡ化合物による安定トランスフェクション細胞株ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３ＡにおけるＰＫＫ ｍＲＮＡに対する相対的抑制レベルを測定した。

【0454】

Ｈ－ＤＭＥＭ完全培地でｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞を１．５×１０^５細胞／ｍｌに希釈して、ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞懸濁液を得、１０００μｌ／ウェルの量で当該細胞懸濁液を１２ウェルプレートに接種し、１４．５ｈ培養した。培養ウェル内のＨ－ＤＭＥＭ完全培地をすべて吸引し、各ウェルに１０００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を加え、培養を１．５ｈ継続した。

【0455】

ＤＥＰＣ水を用いて、ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｂ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｃ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｄ１Ｍ１Ｓ、ｓｉＰＫＫｅ１Ｍ１Ｓ又はｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓを、それぞれ濃度が２０μＭのｓｉＲＮＡ希釈標準溶液に溶解させた。

【0456】

１Ａ溶液を調製し、各ｓｉＲＮＡに対して、それぞれ１Ａ溶液を調製し、１部の１Ａ溶液は、順に上記ｓｉＲＮＡ希釈標準溶液３μｌ及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１００μｌを含む。

【0457】

１Ｂ溶液を調製し、１部の１Ｂ溶液は、２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ２０００及び１００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を含む。

【0458】

それぞれ１部の１Ｂ溶液を得られた各ｓｉＲＮＡの１Ａ溶液と混合し、それぞれ室温で２０ｍｉｎ培養して、各ｓｉＲＮＡのトランスフェクション複合体１Ｘを得た。

【0459】

１部の１Ｂ溶液を１００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合し、室温で２０ｍｉｎ培養して、対照複合体１Ｘ’を得た。

【0460】

ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞を接種した上記異なる培養ウェルにそれぞれ各ｓｉＲＮＡのトランスフェクション複合体１Ｘを加え、添加量が２００μｌ／ウェルであり、均一に混合した。各ｓｉＲＮＡの最終濃度がそれぞれ約５０ｎＭの混合物を得、各ｓｉＲＮＡのトランスフェクション複合体１Ｘがそれぞれ２つの培養ウェルをトランスフェクションして、ｓｉＲＮＡを含むトランスフェクション混合物を得、試験群と記す。

【0461】

ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞を接種した別の２つの培養ウェルに、それぞれトランスフェクション複合体１Ｘ’を加え、添加量が２００μｌ／ウェルであり、ｓｉＲＮＡを含まないトランスフェクション混合物を得、ブランク対照群と記す。

【0462】

ｓｉＲＮＡを含むトランスフェクション混合物とｓｉＲＮＡを含まないトランスフェクション混合物を培養ウェル中で４ｈ培養した後、各ウェルに２０％ＦＢＳ（ＲＭＢＩＯ社から購入、番号ＦＢＳ－Ｐ５００）を含むＨ－ＤＭＥＭ完全培地を１０００μｌ追加し、次に１２ウェルプレートを５％ＣＯ_２／９５％空気を含むインキュベーターにおいて３７°Ｃで２４ｈ培養を継続した。

【0463】

その後、ＵＮＩＱカラム式全ＲＮＡ抽出キット（生工、Ｂ５１１３６１－０１００）を用いて、キットの説明書に記載の方法に基づいて各ウェルの細胞中の全ＲＮＡを抽出し、各ウェルの細胞に対して、１．２×１０^５個の細胞を抽出に用いた。

【0464】

各細胞サンプルの全ＲＮＡに対して、逆転写キットＧｏｌｄｅｎｓｔａｒ^ＴＭ ＲＴ６ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（北京ケイ科新業生物技術有限公司から購入、番号ＴＳＫ３０１Ｍ）により提供された試薬を使用し、Ｇｏｌｄｅｎｓｔａｒ^ＴＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_１７をプライマーとして選択し、キットの説明書における逆転写操作工程に従って逆転写反応系２０μｌを調製した。逆転写条件は以下のとおりである。各逆転写反応系に対して、逆転写反応系を５０℃で５０ｍｉｎ培養し、次に８５℃で５ｍｉｎ培養し、最後に４℃で３０ｓ培養し、反応が終了した後、各逆転写反応系にＤＥＰＣ水８０μｌを加えて、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。

【0465】

各逆転写反応系に対して、５μｌの上記ｃＤＮＡを含む溶液をそれぞれテンプレートとし、ＮｏｖｏＳｔａｒｔ（登録商標） ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｐｌｕｓキット（近岸蛋白質科技有限公司から購入、番号Ｅ０９６－０１Ｂ）により提供された試薬を用いてｑＰＣＲ反応系２０μｌを調製した。目的遺伝子ＰＫＫ及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨを増幅するためのＰＣＲプライマー配列を表６に示す。各プライマーの最終濃度は０．２５μＭであった。各ｑＰＣＲ反応系をＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置に置き、３段階法を用いて増幅し、増幅プロセスは、９５℃で１０ｍｉｎ予め変性し、次に９５℃で３０ｓ変性し、６０℃で２５ｓアニールし、７２℃で３０ｓ伸長し、上記変性、アニール、伸長工程を合計３５回繰り返して、目的遺伝子ＰＫＫ及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨを増幅した生成物Ｗ２を得た。生成物Ｗ２を直ちに順に９５℃で１５ｓ、６０℃で１ｍｉｎ、９５℃で１５ｓ培養し、定量的リアルタイムＰＣＲ装置により生成物Ｗ２中の目的遺伝子ＰＫＫ及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨの融解曲線をそれぞれ収集し、目的遺伝子ＰＫＫ及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨのＣｔ値を得た。

【0466】

【表6】

【0467】

比較Ｃｔ（ΔΔＣｔ）法を採用し、各試験群と対照群における目的遺伝子ＰＫＫの発現量を相対的かつ定量的に算出し、算出方法は以下のとおりである。

【0468】

ΔＣｔ（試験群）＝Ｃｔ（試験群の目的遺伝子）－Ｃｔ（試験群の内因性参照遺伝子）
ΔＣｔ（対照群）＝Ｃｔ（対照群の目的遺伝子）－Ｃｔ（対照群の内因性参照遺伝子）
ΔΔＣｔ（試験群）＝ΔＣｔ（試験群）－ΔＣｔ（対照群の平均値）
ΔΔＣｔ（対照群）＝ΔＣｔ（対照群）－ΔＣｔ（対照群の平均値）
ここで、各試験群は、それぞれ各ｓｉＲＮＡで処理されたｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞であり、対照群は、ｓｉＲＮＡで処理されていないｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞である。ΔＣｔ（対照群の平均値）は、対照群の２つの培養ウェルのそれぞれのΔＣｔ（対照群）の算術平均値である。それにより、試験群及び対照群の各培養ウェルは、いずれも１つのΔΔＣｔ値に対応している。

【0469】

対照群を基準として、試験群ＰＫＫ ｍＲＮＡの発現レベルを正規化し、対照群ＰＫＫ ｍＲＮＡの発現レベルを１００％と定義し、
試験群ＰＫＫ ｍＲＮＡの相対的発現レベル＝２^{－ΔΔＣｔ（試験群）}×１００％。

【0470】

同一の試験群ｓｉＲＮＡに対して、各濃度での試験群ＰＫＫ ｍＲＮＡの相対的発現レベルの平均値は、当該濃度の２つの培養ウェルの相対的発現レベルの算術平均値である。

【0471】

ｓｉＲＮＡによるＰＫＫ ｍＲＮＡ発現量に対する抑制率は、抑制率＝（１－試験群ＰＫＫ ｍＲＮＡの相対的発現レベル）×１００％という等式により算出された。

【0472】

ＰＫＫ ｍＲＮＡの相対的発現レベルは、図２に示した。

【0473】

図２の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡは、ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞においてＰＫＫ ｍＲＮＡに対していずれも高い抑制作用を示し、特にｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ及びｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１ＳによるＰＫＫ ｍＲＮＡ抑制率がいずれも約８０％に達した。

【0474】

「実験例３」
ｓｉＲＮＡ複合体によるｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞におけるＰＫＫ ｍＲＮＡに対する抑制
実験例２で用いられたｓｉＲＮＡの代わりにそれぞれ以下のｓｉＲＮＡ複合体の１つを用い、ｓｉＲＮＡ複合体の濃度をｓｉＲＮＡで算出したこと以外は、実験例２の方法によりｓｉＲＮＡ複合体によるｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞におけるＰＫＫ ｍＲＮＡに対する抑制効率を測定した。前記ｓｉＲＮＡ複合体は、それぞれＬ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｂ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｃ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｄ１Ｍ１ＳＰ、Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｅ１Ｍ１Ｓ及びＬ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓであった。結果は、図３に示した。

【0475】

図３の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、ｈＰＫＫ－ＨＥＫ２９３Ａ細胞においてＰＫＫ ｍＲＮＡに対していずれも高い抑制作用を示し、抑制率が少なくとも５３．２％であり、さらに８３．１％に達した。以上より、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、ＰＫＫ関連疾患を抑制するための優れた応用の可能性を備えている。

【0476】

「実験例４」
ｓｉＲＮＡ複合体のＣ５７マウスの各臓器での分布状況
１×ＰＢＳ溶液を用いて、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ、Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰ、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓ又はＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓを０．６ｍｇ／ｍｌの濃度（ｓｉＲＮＡの量として）の溶液にそれぞれ溶解させた。

【0477】

６～７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス（北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）１０匹を選択してランダムに分け、各群に２匹のマウスを含み、それぞれ１×ＰＢＳ及び上記調製されたＣｙ５－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ、Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰ、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓ又はＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓ溶液を皮下注射した。全ての動物に対して体重に応じて投与用量を算出し、投与体積は、ｓｉＲＮＡの量としていずれも５ｍｌ／ｋｇ、各動物の投与量は３ｍｇ／ｋｇ体重（ｓｉＲＮＡの量として）とした。

【0478】

投与した２ｈ、６ｈ、２４ｈ、４８ｈ後、各群のマウスを順に小動物生体光学イメージングシステムＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩに入れ、イソフルランガスでマウスを麻酔し、麻酔後のマウスの腹部を上に向けて小動物生体光学イメージングシステムに入れて生体イメージングを行い、Ｃｙ５蛍光シグナルを動的に検出し、Ｃｙ５で標識されたｓｉＲＮＡ又はＣｙ５で標識されたｓｉＲＮＡ複合体の動物生体での分布状況を追跡した。４８ｈ後、全てのマウスを殺し、各マウスの心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓の５つの臓器をそれぞれ取り出し、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩにおいて蛍光イメージングを行った。各群から１つのマウスを選択し、上記５つの臓器を順に縦方向に配置し、１×ＰＢＳ、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ又はＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰを投与したマウスの臓器を同じ視野に置いて撮影し、結果が図４Ａに示した。１×ＰＢＳ、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓ又はＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓを投与したマウスの臓器を同じ視野に置いて撮影し、結果を図４Ｂに示した。

【0479】

図４Ａ及び図４Ｂから分かるように、Ｃｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１ＳＰ及びＣｙ５－Ｌ１０－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓのみが肝臓に大量に凝集し、Ｃｙ５－ｓｉＰＫＫａ１Ｍ１Ｓ及びＣｙ５－ｓｉＰＫＫｆ１Ｍ１Ｓは腎臓に少量凝集しているが、他の臓器には凝集しておらず、本開示のｓｉＲＮＡ複合体が、ｓｉＲＮＡを肝臓に効果的かつ特異的に送達できることを示した。したがって、図４Ａ及び図４Ｂから、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体が肝臓を特異的に標的できることは明らかであり、肝臓におけるＰＫＫ遺伝子の発現を特異的に抑制することが期待できる。さらに、実験例３の結果を組み合わせて、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体が、肝臓におけるＰＫＫ遺伝子の発現を特異的に抑制できることは明らかである。

【0480】

以上、本開示のいくつかの実施形態を詳しく記載したが、本開示は、上記実施形態の具体的な細部に限定されず、本開示の技術的思想の範囲で、本開示の技術的解決手段に対して複数種の簡単な変形をすることができ、これらの簡単な変形は、いずれも本開示の保護範囲に属する。

【0481】

このほかに説明すべきこととして、上記いくつかの実施形態に記載された各具体的な技術的特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要な重複を避けるために、本開示では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。

【0482】

また、本開示の各種の異なる実施形態は任意に組み合わせることもでき、本開示の精神から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本開示に開示された内容とみなすべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【配列表】

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