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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-07
(45)【発行日】2025-01-16
(54)【発明の名称】強化されたＴ細胞受容体ＳＴＡＲ及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20250108BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20250108BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250108BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20250108BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250108BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250108BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20250108BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250108BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250108BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250108BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20250108BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K14/725 ZNA
C12N15/12
C07K19/00
C12N15/63 Z
C12N5/10
C07K16/28
A61K35/17
A61P35/00
A61P35/02
A61K9/10
【請求項の数】
32
(21)【出願番号】P 2022564686
(86)(22)【出願日】2020-07-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-02
(86)【国際出願番号】 CN2020103687
(87)【国際公開番号】W WO2021135178
(87)【国際公開日】2021-07-08
【審査請求日】2022-08-29
(31)【優先権主張番号】201911389706.0
(32)【優先日】2019-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522260986
【氏名又は名称】ブリスター イムノテック リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ルイ， ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ウー， チュンヤン
(72)【発明者】
【氏名】リウ， ファン
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５２７５５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】Blood，2020年，Vol.136, Suppl.1，Article No.4，DOI:10.1182/blood-2020-136833
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／６２
Ｃ０７Ｋ １４／７２５
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ｃ０７Ｋ １９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の抗原結合領域及び第１の定常領域を含有するα鎖、並びに第２の抗原結合領域及び第２の定常領域を含有するβ鎖であるα鎖及びβ鎖を含有する、合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）であって、前記第１の定常領域が、マウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域に由来し、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、Ｎ末端の位置１～４のアミノ酸が欠失しており、Ｎ末端の位置５～位置１８のアミノ酸が、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、且つアミノ酸の番号が配列番号２を参照しており、
前記第２の定常領域がマウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域に由来し、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域と比較して、Ｎ末端の位置１～６のアミノ酸が欠失しており、Ｎ末端の位置７～位置２５のアミノ酸が、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、且つアミノ酸の番号が配列番号１５を参照している、
合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項2】
天然のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、前記第１の定常領域が位置４８にシステイン置換を含有し、アミノ酸の番号が配列番号２を参照している、請求項１に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項3】
天然のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、前記第１の定常領域において位置４８のトレオニンがシステインに変異しており、アミノ酸の番号が配列番号２を参照している、請求項１又は２に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項4】
天然のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、前記第１の定常領域が膜貫通領域において疎水性アミノ酸置換を含有し、膜貫通領域が、位置１１１～位置１１９のアミノ酸配列を含み、アミノ酸の番号が配列番号２を参照している、請求項１～３のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項5】
天然のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、前記第１の定常領域が、位置１１２、位置１１４及び／又は位置１１５に疎水性アミノ酸置換を含有し、アミノ酸の番号が配列番号２を参照している、請求項１～４のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項6】
天然のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、前記第１の定常領域において、位置１１２のセリンがロイシンによって置換されており、位置１１４のメチオニンがイソロイシンによって置換されており、及び／又は位置１１５のグリシンがバリンによって置換されており、アミノ酸の番号が配列番号２を参照している、請求項１～５のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項7】
前記第１の定常領域が、配列番号８として示される膜貫通領域を含有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項8】
前記第１の定常領域が、配列番号１１～１３及び配列番号３４として示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項9】
天然のＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域と比較して、前記第２の定常領域において、位置５６のセリンがシステインに変異しており、アミノ酸の番号が配列番号１５を参照している、請求項１～８のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項10】
前記第２の定常領域が、配列番号２１として示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項11】
ｉ）前記第１の定常領域が配列番号３４として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の定常領域が配列番号３７として示されるアミノ酸配列を含有する、
ｉｉ）前記第１の定常領域が配列番号１１として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の定常領域が配列番号２１として示されるアミノ酸配列を含有する、
ｉｉｉ）前記第１の定常領域が配列番号１２として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の定常領域が配列番号３７として示されるアミノ酸配列を含有する、
又は
ｉｖ）前記第１の定常領域が配列番号１３として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の定常領域が配列番号２１として示されるアミノ酸配列を含有する、
請求項１～１０のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項12】
前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が、独立的に又は組み合わせて標的抗原に特異的に結合する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項13】
標的抗原が疾患関連抗原である、請求項１２に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項14】
前記標的抗原が、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアリルガングリオシドＧＤ２、導管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、プロスターゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、生存及びテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ１）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－１受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンの外部ドメインＡ（ＥＤＡ）及び外部ドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン－Ｃ Ａ１ドメイン（ＴｎＣ Ａ１）、線維芽細胞関連タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、Ｆｏｘｐ３、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＭ－ＣＳＦ、サイトカイン受容体、内皮因子、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ０２２２３）、ＳＬＡＭＦ７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＱ２５）、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＺＤ１）、ＦＫＢＰ１１（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＹＬ４）、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ５３７０８）及びＦＣＲＬ５（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ６８ＳＮ８）から選択されるがん関連抗原である、請求項１３に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項15】
前記第１の抗原結合領域が前記標的抗原に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含有し、前記第２の抗原結合領域が前記抗体の軽鎖可変領域を含有する、又は第１の抗原結合領域が標的抗原に特異的に結合する軽抗体の軽鎖可変領域を含有し、前記第２の抗原結合領域が抗体の重鎖可変領域を含有する、請求項１２～１３のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項16】
前記第１の抗原結合領域が、配列番号２２として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号２３として示されるアミノ酸配列を含む、若しくは第１の抗原結合領域が配列番号２３として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号２２として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記ＳＴＡＲがＥＧＦＲに特異的に結合する、又は前記第１の抗原結合領域が、配列番号４４として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号４５として示されるアミノ酸配列を含む、若しくは第１の抗原結合領域が配列番号４５として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号４４として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記ＳＴＡＲがＣＤ１９に特異的に結合する、又は
前記第１の抗原結合領域が、配列番号４６として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号４７として示されるアミノ酸配列を含む、若しくは第１の抗原結合領域が配列番号４７として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号４６として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記ＳＴＡＲがＣＤ２０に特異的に結合する、又は
前記第１の抗原結合領域が、配列番号４８として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号４９として示されるアミノ酸配列を含む、若しくは第１の抗原結合領域が配列番号４９として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号４８として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記ＳＴＡＲがＣＤ２２に特異的に結合する、又は
前記第１の抗原結合領域が、配列番号２４として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号２５として示されるアミノ酸配列を含む、若しくは第１の抗原結合領域が配列番号２５として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号２４として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記ＳＴＡＲがＧＰＣ３に特異的に結合する、又は
前記第１の抗原結合領域が、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含有し、重鎖可変領域が、配列番号２８として示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９として示される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０として示される重鎖ＣＤＲ３を含有し、前記第２の抗原結合領域が、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号３１として示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２として示される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３として示される軽鎖ＣＤＲ３を含有する、若しくは前記第１の抗原結合領域が、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号３１として示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２として示される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３として示される軽鎖ＣＤＲ３を含有し、前記第２の抗原結合領域が、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含有し、前記重鎖可変領域が、配列番号２８として示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９として示される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０として示される重鎖ＣＤＲ３を含有し、それ故に前記ＳＴＡＲがＣＤ１９に特異的に結合する、又は
前記第１の抗原結合領域が、配列番号２６として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号２７として示されるアミノ酸配列を含み、若しくは前記第１の抗原結合領域が、配列番号２７として示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号２６として示されるアミノ酸配列を含み、それ故に前記ＳＴＡＲがＣＤ１９に特異的に結合する、
請求項１～１５のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項17】
前記第１の抗原結合領域が、前記標的抗原に特異的に結合する単鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含有し、及び／又は前記第２の抗原結合領域が、前記標的抗原に特異的に結合する単鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含有する、請求項１２～１３、及び１５のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項18】
前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が、同一の標的抗原に結合する、請求項１７に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項19】
前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が、同じ標的抗原の異なる領域に結合する、請求項１７に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項20】
前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が、それぞれＣＤ１９及びＣＤ２０、又はそれぞれＣＤ１９及びＣＤ２２、又はそれぞれＣＤ３８及びＢＣＭＡ、又はそれぞれＰＤＬ１及びＥＧＦＲに結合している、請求項１７に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体。
【請求項21】
請求項１～２０のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）のα鎖及びβ鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項22】
同一のリーディングフレーム内に、ｉ）α鎖をコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）β鎖をコードするヌクレオチド配列、及びｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との間にある自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項23】
前記自己切断ペプチドが、２Ａポリペプチドである、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項24】
調節配列に作動可能に連結された、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項25】
ウイルスベクターである、請求項２４に記載の発現ベクター。
【請求項26】
レンチウイルスベクターである、請求項２５に記載の発現ベクター。
【請求項27】
治療用Ｔ細胞を調製する方法であって、請求項１～２０のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）をＴ細胞において発現させるステップを含む、方法。
【請求項28】
請求項２１～２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項２４～２６のいずれか一項に記載の発現ベクターをＴ細胞に導入するステップを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
請求項１～２０のいずれか一項に記載の合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）を含むか、又は請求項２７若しくは２８に記載の方法によって得られる、治療用Ｔ細胞。
【請求項30】
請求項２９に記載の治療用Ｔ細胞及び薬学的に許容できる担体を含む、薬学的組成物。
【請求項31】
対象における疾患を治療するための医薬を調製するための、請求項２９に記載の治療用Ｔ細胞又は請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項32】
前記疾患が、肺がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、黒色腫、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、咽喉がん、子宮頸がん、子宮体部腫瘍、骨肉腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、前立腺がん、子宮がん、肛門がん、精巣がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性又は急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、及び慢性リンパ性白血病を含む）、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓又は尿管がん、腎盂腎がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、及びアスベスト誘発がんを含む環境誘発がん、並びにこれらのがんの組合せからなる群から選択される、請求項３１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学の分野に関し、特に、強化されたＴ細胞受容体ＳＴＡＲ及びその用途に関する。具体的には、改良された合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）、ＳＴＡＲを含有するＴ細胞、及びそれらの使用が開示される。
【背景技術】
【0002】
ヒト体内の免疫細胞による腫瘍細胞の排除は、樹状細胞が腫瘍細胞の変異体遺伝子を認識して、変異体情報をＴ細胞に提示する様式で実現される。続いてＴ細胞が、変異を保有する腫瘍細胞を探し出して死滅させる。時には、腫瘍細胞が、変異したペプチド断片を提示することができるＭＨＣ分子をダウンレギュレートし、その結果、Ｔ細胞による死滅を回避して、制御不能ながんに徐々に進行する。
【0003】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法は、近年、有効性に優れる抗がん免疫療法である。天然のＴ細胞が腫瘍細胞を認識する方法とは異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍細胞の認識のためにＭＨＣ分子に依拠しない。ＣＡＲ分子は主に３つの部分で構成され、これには、抗体に由来する抗原認識構造ドメインであって標的抗原の認識を担う細胞外領域と、膜貫通領域と、Ｔ細胞受容体に由来し、刺激を受けた際にＴ細胞活性化シグナルの伝達を担うシグナル伝達分子及び共刺激シグナル伝達分子である細胞内領域とがある。その作用原理は以下の通りである：ＣＡＲ分子が対応する抗原に結合すると、ＣＡＲ分子は凝集し、それにより局所的リン酸化レベルを上昇させ、下流シグナルを活性化し、最終的にＴ細胞のエフェクター機能を開始させて標的腫瘍細胞を死滅させる。
【0004】
ＣＤ１９タンパク質標的化キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ）療法は、再発・難治性Ｂ細胞リンパ腫の治療に対して、米国で２件の臨床適用が承認されている。しかし、ＣＡＲ－Ｔ療法は固形腫瘍の治療では困難に直面していた。Ｔ細胞療法が固形腫瘍の治療において良好な有効性を達成できていないことには複数の要因があり、重要な理由の１つは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能が腫瘍微小環境で阻害され、Ｔ細胞が枯渇及びアポトーシスを受けやすいことである。最近の研究は、Ｔ細胞の機能障害がキメラ抗原受容体のシグナル伝達経路特性に関連する可能性を示唆している。
【0005】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体分子は複数の鎖を含有し、そのＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖はＭＨＣポリペプチド分子の認識を担い、他の６つのＣＤ３サブユニットはＴＣＲα／β鎖に結合し、シグナル伝達の機能を有する。天然のＴＣＲ複合体はＩＴＡＭシグナル配列を計１０個含有し、ＣＡＲよりも強いシグナルの伝達が理論的には実現可能である。以前の研究により、ＴＣＲシグナルの伝達はＣＡＲシグナルのものよりも遅いが、ＴＣＲシグナルのほうがより持続的であることが示されている。したがって、天然のＴＣＲシグナル伝達機能を使用することによって、Ｔ細胞機能障害を軽減して、より優れた抗固形腫瘍効果を発揮することを可能にする新規受容体を構築することが可能である。
【0006】
ＴＣＲの細胞外領域は抗体のＦａｂドメインと非常に類似しており、そのため、ＴＣＲ可変領域配列を抗体可変領域配列で置換することで、抗体の特異性及び天然ＴＣＲのより優れたシグナル伝達機能の両方を有し、完全なＴ細胞活性化を媒介することができる合成ＴＣＲ及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）を得ることができる。
【0007】
しかし、天然ＴＣＲ由来のＳＴＡＲには、依然として、膜安定性が不良であること、α／β鎖対形成能力が低いこと、内因性ＴＣＲとのミスマッチ、Ｔ細胞への導入が困難であること、などといった問題がある。したがって、改良されたＳＴＡＲに対する需要は今も現場にある。
【発明の概要】
【0008】
他に指示又は定義されない限り、使用されるすべての用語は、当業者に理解されるであろう当技術分野における通常の意味を有する。また、標準的マニュアル、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”；Ｌｅｗｉｎ，“Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ”；及びＲｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、並びに本明細書に引用される一般的な先行技術も参照される。その上、特に指示のない限り、具体的に記載されていないすべての方法、ステップ、技法及び操作は、それ自体が公知である様式で実施することができ、また実施されており、その様式は当業者に知られているであろう。また、例えば、標準的マニュアル、上記の一般的な先行技術及びそこに引用されている他の参考文献も参照される。
【0009】
本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、その用語によって連結される項目のすべての組合せを範囲に含み、各組合せは、本明細書に個々に列挙されていると考えるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、「Ａ」、「Ａ及びＢ」及び「Ｂ」を範囲に含む。例えば、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ及びＢ」、「Ａ及びＣ」、「Ｂ及びＣ」、「Ａ及びＢ及びＣ」を範囲に含む。
【0010】
「含む」という用語が、本明細書でタンパク質又は核酸の配列を記載するために使用される場合、タンパク質若しくは核酸はその配列からなってもよく、又はタンパク質若しくは核酸の一方若しくは両方の末端が追加のアミノ酸若しくはヌクレオチドを有してもよいが、本発明に記載される活性は依然として存在する。さらに、ポリペプチドのＮ末端の開始コドンによってコードされるメチオニンは、特定の現実の状況下（例えば、特定の表現系において発現される場合）では保持されるが、ポリペプチドの機能が実質的に影響されないことは、当業者には明らかである。したがって、特定のポリペプチドのアミノ酸配列が本発明の明細書及び特許請求の範囲に記載されている場合、Ｎ末端の開始コドンによってコードされるメチオニンは含有していなくてもよいが、メチオニンを含む配列もこれに関して範囲に含まれており、したがって、コードするヌクレオチド配列も開始コドンを含むことができ、その逆についても同様である。
【0011】
一態様では、本発明は、α鎖及びβ鎖を含む合成Ｔ細胞受容体及び抗原受容体（ＳＴＡＲ）を提供し、ここでα鎖は第１の抗原結合領域及び第１の定常領域を含み、β鎖は第２の抗原結合領域及び第２の定常領域を含み、
第１の定常領域は、天然のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、ｉ）Ｎ末端改変、ｉｉ）システイン置換；及び／若しくはｉｉｉ）疎水性アミノ酸置換を含む、天然のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域のバリアントであり、及び／又は
第２の定常領域は、天然のＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域と比較して、ｉ）Ｎ末端改変、及びｉｉ）システイン置換を含む、天然のＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域のバリアントである。
第１の定常領域は、天然のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、ｉ）Ｎ末端改変、ｉｉ）システイン置換；及び／若しくはｉｉｉ）疎水性アミノ酸置換を含む、天然のＴ細胞受容体のα鎖の定常領域のバリアントであり、及び／又は
第２の定常領域は、天然のＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域と比較して、ｉ）Ｎ末端改変、及びｉｉ）システイン置換を含む、天然のＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域のバリアントである。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＳＴＡＲの構造を示す。Ａ、ＳＴＡＲのプロトタイプの構造図；Ｂ：改良されたＳＴＡＲの構造図；Ｃ、複数の異なる標的抗原を標的とするデュアルＳＴＡＲの構造図。
【図2】ヒト及びマウスのＴ細胞受容体のα鎖及びβ鎖の定常領域の配列アラインメント結果を示す。
【図3】ヒト及びマウスのＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端の１８アミノ酸の配列アラインメント結果を示す。ＵｓｅｒＳｅｑ１はヒト配列であり、ＵｓｅｒＳｅｑ２はマウス配列である。
【図4】ヒト及びマウスのＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端の２５アミノ酸の配列アラインメント結果を示す。ＵｓｅｒＳｅｑ１はヒト配列であり、ＵｓｅｒＳｅｑ２はマウス配列である。
【図5】複数の異なる改変を組み合わせた定常領域変異体を示す。
【図6】ＥＧＦＲを標的とするＣｅｔｕｘ ＳＴＡＲの様々な変異体の機能を示す。
【図7-1】ＧＰＣ３を標的とするＧＣ３３ ＳＴＡＲの様々な変異体の機能を示す。
【図7-2】ＧＰＣ３を標的とするＧＣ３３ ＳＴＡＲの様々な変異体の機能を示す。
【図8】ＣＤ１９を標的とする３３４ ＳＴＡＲの組込み変異体の機能を示す。
【図9】ＣＤ１９／ＣＤ２０を標的とするＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲの組込み変異体の機能を示す。
【図10】ＣＤ１９／ＣＤ２２を標的とするＦＭＣ６３－Ｍ７９１ ＳＴＡＲの組込み変異体の機能を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
一部の実施形態では、抗原結合領域は、定常領域のＮ末端に融合されている。
【0014】
一部の実施形態では、α鎖及びβ鎖は、Ｔ細胞における発現を受けて機能的ＴＣＲ複合体を形成することができる。例えば、α鎖及びβ鎖は、Ｔ細胞における発現の後に、細胞の内因性ＣＤ３分子（ＣＤ３εδ、ＣＤ３γε、ＣＤ３ζζ）に結合して８サブユニットのＴＣＲ複合体を形成することができ、このＴＣＲ複合体は細胞表面に表示され、標的抗原に結合するとＴ細胞を活性化する。機能的ＴＣＲ複合体は、標的抗原への特異的結合を受けてＴ細胞を活性化することができる。
【0015】
本明細書で使用される場合、「Ｎ末端改変」とは、参照されるアミノ酸配列（ポリペプチド又はタンパク質）のＮ末端が１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を含むことを意味し、この用語は、参照されるアミノ酸配列（ポリペプチド又はタンパク質）のＮ末端からの１つ又は複数の連続したアミノ酸の欠失も含み得る。
【0016】
本明細書で使用される場合、「システイン置換」又は「疎水性アミノ酸置換」は、参照されるアミノ酸配列（ポリペプチド又はタンパク質）における元のアミノ酸のシステイン又は疎水性アミノ酸による置換を指し、ここで疎水性アミノ酸置換は、親水性アミノ酸が疎水性アミノ酸によって置換されていることであり得、また、低疎水性アミノ酸が高疎水性アミノ酸によって置換されていることであり得る。
【0017】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、ヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域、非ヒト霊長類Ｔ細胞受容体のα鎖の定常領域、齧歯類、例えば、マウスのＴ細胞受容体のα鎖の定常領域に由来する。ヒトＴ細胞受容体のα鎖の例示的な定常領域は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を含む。マウスＴ細胞受容体のα鎖の例示的な定常領域は、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含む。一部の好ましい実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域に由来する。
【0018】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、天然のＴ細胞受容体α鎖定常領域と比較してＮ末端に１８アミノ酸以内の改変を含む。一部の実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域に由来し、配列番号３に記載されたアミノ酸配列（ＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱ）が、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失している。一部の特定の実施形態では、Ｎ末端改変を含む第１の定常領域は、配列番号４に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲａＣ－Ｎ．ＤＬＴに対応する）を含む。
【0019】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、天然のＴ細胞受容体α鎖定常領域と比較してＮ末端に改変を含み、ここでＮ末端の位置１５～１８のアミノ酸の１つ若しくは複数又はすべてが欠失しており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１５～１８のアミノ酸の１つ若しくは複数又はすべてが、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１５～１８のアミノ酸の１つ若しくは複数又はすべてが、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置１～１４のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の特定の実施形態では、Ｎ末端改変を含む第１の定常領域は、配列番号５に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４に対応する）を含む。
【0020】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、Ｎ末端からのＸ個の連続したアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、及び／又はＮ末端の位置（Ｘ＋１）～１８からのアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、Ｘは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８である。
【0021】
例えば、一部の好ましい実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～１４のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置５～１８のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の特定の実施形態では、Ｎ末端改変を含む第１の定常領域は、配列番号３４に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１に対応する）を含む。
【0022】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～８のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置９～１８のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の特定の実施形態では、Ｎ末端改変を含む第１の定常領域は、配列番号３５に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２に対応する）を含む。
【0023】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～１２のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置１３～１８のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の特定の実施形態では、Ｎ末端改変を含む第１の定常領域は、配列番号３６に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３に対応する）を含む。
【0024】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、天然のＴ細胞受容体α鎖定常領域と比較して位置４８にシステイン置換を含み、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の実施形態では、天然のＴ細胞受容体α鎖定常領域と比較して、第１の定常領域の位置４８のトレオニンはシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の特定の実施形態では、システイン置換を含む第１の定常領域は、配列番号６（ヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域に由来する）に記載されたアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、システイン置換を含む第１の定常領域は、配列番号７（マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来する）に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓに対応する）を含む。
【0025】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸番号は配列番号ｘを指す」（配列番号ｘは、本明細書に列挙される特定の配列である）は、記載される特定のアミノ酸の位置番号が、配列番号ｘ上の対応するアミノ酸の位置番号であることを意味する。異なる配列におけるアミノ酸の対応関係は、当技術分野で周知の配列アラインメント法に従って決定することができる。例えば、アミノ酸の対応関係は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／）からのオンラインアラインメントツールによって決定することができ、ここで２つの配列のアラインメントは、デフォルトのパラメータを使用することによってＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用することによって行うことができる。例えば、ポリペプチドのＮ末端から位置４６にあるアミノ酸は、配列アラインメントにおいて配列番号ｘの位置４８にあるアミノ酸と整列化され、この場合に、ポリペプチドにおけるアミノ酸を、本明細書で「ポリペプチドの位置４８のアラニンであり、アミノ酸の位置は配列番号ｘを参照している」と記載してもよい。
【0026】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、天然のＴ細胞受容体のα鎖定常領域と比較して膜貫通領域内に疎水性アミノ酸置換を含み、例えば、膜貫通領域は、位置１１１～１１９にアミノ酸配列を含み、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の実施形態では、第１の定常領域は、天然のＴ細胞受容体α鎖定常領域と比較して、位置１１２、１１４及び／又は１１５に疎水性アミノ酸置換を含み、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の実施形態では、天然のＴ細胞受容体α鎖定常領域と比較して、第１の定常領域の位置１１２のセリンはロイシンで置換されており、位置１１４のメチオニンはイソロイシンで置換されており、及び／又は位置１１５のグリシンはバリンで置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の実施形態では、天然のＴ細胞受容体α鎖定常領域と比較して、第１の定常領域の位置１１２のセリンはロイシンで置換されており、位置１１４のメチオニンはイソロイシンで置換されており、及び／又は位置１１５のグリシンはバリンで置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の実施形態では、疎水性アミノ酸置換を含む第１の定常領域は、配列番号８に記載された膜貫通領域（マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来する）を含む。一部の特定の実施形態では、疎水性アミノ酸置換を含む第１の定常領域は、配列番号９（マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来する）に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲａＣ－ＴＭ９に対応する）を含む。
【0027】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～４のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置５～１８のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、位置４８のトレオニンはシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の特定の実施形態では、第１の定常領域は、配列番号１１に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１に対応する）を含む。
【0028】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～４のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置５～１８のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、位置１１２のセリンはロイシンによって置換されており、位置１１４のメチオニンはイソロイシンによって置換されており、位置１１５のグリシンはバリンによって置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の特定の実施形態では、第１の定常領域は、配列番号１２に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲａＣ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１に対応する）を含む。
【0029】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、位置４８のトレオニンはシステインに変異しており、位置１１２のセリンはロイシンに置換されており、位置１１４のメチオニンはイソロイシンに置換されており、位置１１５のグリシンはバリンに置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の特定の実施形態では、第１の定常領域は、配列番号１０に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９に対応する）を含む。
【0030】
一部の実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～４のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置５～１８のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、位置４８のトレオニンはシステインに変異しており、位置１１２のセリンはロイシンによって置換されており、位置１１４のメチオニンはイソロイシンによって置換されており、位置１１５のグリシンはバリンによって置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照している。一部の特定の実施形態では、第１の定常領域は、配列番号１３に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１に対応する）を含む。
【0031】
一部の実施形態では、第２の定常領域は、ヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域、非ヒト霊長類Ｔ細胞受容体のβ鎖定常領域、及び齧歯類、例えばマウスのＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来する。例示的なヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域は、配列番号１４に記載されたアミノ酸配列を含む。例示的なマウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域は、配列番号１５に記載されたアミノ酸配列を含む。一部の好ましい実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来する。
【0032】
一部の実施形態では、第２の定常領域は、天然のＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して、Ｎ末端に２５のアミノ酸以内の改変を含む。一部の実施形態では、第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、配列番号１６に記載されたアミノ酸配列（ＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫ）が、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失している。一部の特定の実施形態では、Ｎ末端改変を含む第２の定常領域は、配列番号１７に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴに対応する）を含む。
【0033】
一部の実施形態では、第２の定常領域は、天然のＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較してＮ末端に改変を含み、ここでＮ末端の位置１７及び２１～２５のアミノ酸の１つ若しくは複数又はすべてが欠失しており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の実施形態では、第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１７及び２１～２５のアミノ酸の１つ若しくは複数又はすべてが、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の実施形態では、第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１７及び位置２１～２５のアミノ酸の１つ若しくは複数又はすべてが、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置１～１６のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸で置換されており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の特定の実施形態では、Ｎ末端改変を含む第２の定常領域は、配列番号１８に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４に対応する）を含む。
【0034】
一部の実施形態では、第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して、Ｎ末端からＸ個の連続したアミノ酸が欠失しており、及び／又はＮ末端の位置（Ｘ＋１）～２５のアミノ酸が、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、Ｘは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５である。
【0035】
一部の実施形態では、第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～６のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置７～２５のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の特定の実施形態では、Ｎ末端改変を含む第２の定常領域は、配列番号３７に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１に対応する）を含む。
【0036】
一部の実施形態では、第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～１２のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置１３～２５のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の特定の実施形態では、Ｎ末端改変を含む第２の定常領域は、配列番号３８に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２に対応する）を含む。
【0037】
一部の実施形態では、第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～１８のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置１９～２５のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の特定の実施形態では、Ｎ末端改変を含む第２の定常領域は、配列番号３９に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３に対応する）を含む。
【0038】
一部の実施形態では、天然のＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して、第２の定常領域は、位置５６にシステイン置換を含み、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の実施形態では、天然のＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して、第２の定常領域の位置５６のセリンはシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の特定の実施形態では、システイン置換を含む第２の定常領域は、配列番号１９（ヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来する）に記載されたアミノ酸配列を含む。一部の特定の実施形態では、システイン置換を含む第２の定常領域は、配列番号２０（マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来する）に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓに対応する）を含む。
【0039】
一部の実施形態では、第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～６のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置７～２５のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、位置５６のセリンはシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の特定の実施形態では、第２の定常領域は、配列番号２１に記載されたアミノ酸配列（ＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１に対応する）を含む。
【0040】
一部の好ましい実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～４のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置５～１８のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照しており、且つ第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～６のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、Ｎ末端の位置７～２５のアミノ酸が、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の特定の実施形態では、第１の定常領域は、配列番号３４に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の定常領域は、配列番号３７に記載されたアミノ酸配列を含む。
【0041】
一部の好ましい実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、位置４８のトレオニンはシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号２を参照しており、且つ第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して、位置５６のセリンはシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の特定の実施形態では、第１の定常領域は、配列番号７に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の定常領域は、配列番号２０に記載されたアミノ酸配列を含む。
【0042】
一部の好ましい実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、位置１１２のセリンはロイシンで置換されており、位置１１４のメチオニンはイソロイシンで置換されており、位置１１５のグリシンはバリンで置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照しており、且つ第２の定常領域は、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域である。一部の特定の実施形態では、第１の定常領域は、配列番号９に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の定常領域は、配列番号１５に記載されたアミノ酸配列を含む。
【0043】
一部の好ましい実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖定常領域に由来し、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、Ｎ末端の位置１～４のアミノ酸は欠失しており、ここでＮ末端の位置５～１８のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、位置４８のトレオニンはシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号２を参照しており、且つ第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～６のアミノ酸は、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置７～２５のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸で置換されており、位置５６のセリンはシステインに変異しており、位置５６のシステインはシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の特定の実施形態では、第１の定常領域は、配列番号１１に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の定常領域は、配列番号２１に記載されたアミノ酸配列を含む。
【0044】
一部の好ましい実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～４のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置５～１８のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、位置１１２のセリンはロイシンで置換されており、位置１１４のメチオニンはイソロイシンで置換されており、位置１１５のグリシンはバリンで置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照しており、且つ第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～６のアミノ酸が、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、Ｎ末端の位置７～２５のアミノ酸が、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の特定の実施形態では、第１の定常領域は、配列番号１２に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の定常領域は、配列番号３７に記載されたアミノ酸配列を含む。
【0045】
一部の好ましい実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域に由来し、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して、位置４８のトレオニンはシステインに変異しており、位置１１２のセリンはロイシンで置換されており、位置１１４のメチオニンはイソロイシンで置換されており、位置１１５のグリシンはバリンで置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照しており、且つ第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、位置５６のセリンは天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較してシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。一部の特定の実施形態では、第１の定常領域は、配列番号１０に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の定常領域は、配列番号２０に記載されたアミノ酸配列を含む。
【0046】
一部の好ましい実施形態では、第１の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～４のアミノ酸は、天然のマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域と比較して欠失しており、ここでＮ末端の位置５～１８のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の対応するアミノ酸によって置換されており、位置４８のトレオニンはシステインに変異しており、位置１１２のセリンはロイシンで置換されており、位置１１４のメチオニンはイソロイシンで置換されており、位置１１５のグリシンはバリンで置換されており、アミノ酸番号は配列番号２を参照しており、且つ
第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～６のアミノ酸は、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、Ｎ末端の位置７～２５のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸で置換されており、位置５６のセリンはシステインに変異しており、位置５６のシステインはシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。
第２の定常領域は、マウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域に由来し、Ｎ末端の位置１～６のアミノ酸は、天然のマウスＴ細胞受容体のβ鎖定常領域と比較して欠失しており、Ｎ末端の位置７～２５のアミノ酸は、天然のヒトＴ細胞受容体のβ鎖定常領域の対応するアミノ酸で置換されており、位置５６のセリンはシステインに変異しており、位置５６のシステインはシステインに変異しており、アミノ酸番号は配列番号１５を参照している。
【0047】
一部の好ましい実施形態では、第１の定常領域は、配列番号１３に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の定常領域は、配列番号２１に記載されたアミノ酸配列を含む。
【0048】
本明細書で使用される場合、「抗原結合領域」は、それが単独で、又は別の抗原結合領域と組み合わせて、標的抗原に特異的に結合し得ることを意味する。
【0049】
本明細書に記載される「抗原」又は「標的抗原」は、抗体によって認識されて結合されることが可能な任意の抗原、好ましくは疾患関連抗原、より好ましくはがん関連抗原であってもよい。例示的ながん関連抗原としては、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアリルガングリオシド（disialylganglioside）ＧＤ２、導管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、プロスターゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、生存及びテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ１）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ１受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンの外部ドメインＡ（ＥＤＡ）及び外部ドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン－Ｃ Ａ１ドメイン（ＴｎＣ Ａ１）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、Ｆｏｘｐ３、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＭ－ＣＳＦ、サイトカイン受容体、内皮因子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ０２２２３）、ＳＬＡＭＦ７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＱ２５）、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＺＤ１）、ＦＫＢＰ１１（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＹＬ４）、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ５３７０８）及びＦＣＲＬ５（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ６８ＳＮ８）が挙げられるが、これらには限定されない。
【0050】
抗原結合領域は、任意の市販の抗体を含む、１つ又は複数の既知の抗体、例えば、ＦＭＣ６３、リツキシマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、トラスツズマブ、ビバツズマブ、セツキシマブ、ラベツズマブ、パリビズマブ、セビルマブ、ツビルマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、インフリキシマブ、オマリズマブ、エファツズマブ、ケリキシマブ、シプリズマブ、ナタリズマブ、クレノリキシマブ、ペムツモマブ、エドレコロマブ、カンツズマブに由来することができる。一部の好ましい実施形態では、抗原結合領域は、受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７０９５（２０１９年１月２１日に、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｔ Ｎｏ．３，Ｙａｒｄ １，Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ，Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇで受託）を有するハイブリドーマ細胞３３４によって産生されるモノクローナル抗体３３４である。
【0051】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域は、標的抗原に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含み、第２の抗原結合領域は、抗体の軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、第１の抗原結合領域は、標的抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含み、第２の抗原結合領域は、抗体の重鎖可変領域を含む。
【0052】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域は配列番号２２に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号２３に記載されたアミノ酸配列を含み、或いは、第１の抗原結合領域は配列番号２３に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号２２に記載されたアミノ酸配列を含み、それによってＳＴＡＲはＥＧＦＲに特異的に結合する。
【0053】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域は配列番号４４に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号４５に記載されたアミノ酸配列を含み、或いは、第１の抗原結合領域は配列番号４５に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号４４に記載されたアミノ酸配列を含み、それによってＳＴＡＲはＣＤ１９に特異的に結合する。
【0054】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域は配列番号４６に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号４７に記載されたアミノ酸配列を含み、或いは、第１の抗原結合領域は配列番号４７に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号４６に記載されたアミノ酸配列を含み、それによってＳＴＡＲはＣＤ２０に特異的に結合する。
【0055】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域は配列番号４８に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号４９に記載されたアミノ酸配列を含み、或いは、第１の抗原結合領域は配列番号４９に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号４８に記載されたアミノ酸配列を含み、それによってＳＴＡＲはＣＤ２２に特異的に結合する。
【0056】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域は配列番号２４に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号２５に記載されたアミノ酸配列を含み、或いは、第１の抗原結合領域は配列番号２５に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号２４に記載されたアミノ酸配列を含み、それによってＳＴＡＲはＧＰＣ３に特異的に結合する。
【0057】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域は、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号２８に記載された重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９に記載された重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０に記載された重鎖ＣＤＲ３を含み、第２の抗原結合領域は、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３１に記載された軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２に記載された軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３に記載された軽鎖ＣＤＲ３を含み、又は、第１の抗原結合領域は、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３１に記載の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２に記載の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含み、第２の抗原結合領域は、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を含み、第２の抗原結合領域は、配列番号２８に記載された重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９に記載された重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０に記載された重鎖ＣＤＲ３を含み、それによってＳＴＡＲはＣＤ１９に特異的に結合する。
【0058】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域は、配列番号２６に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は、配列番号２７に記載されたアミノ酸配列を含み、又は或いは、第１の抗原結合領域は配列番号２７に記載されたアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合領域は配列番号２６に記載されたアミノ酸配列を含み、それによってＳＴＡＲはＣＤ１９に特異的に結合する。
【0059】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域は、標的抗原に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖなど）又は単一ドメイン抗体（ラクダ抗体など）を含む。一部の実施形態では、第２の抗原結合領域は、標的抗原に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖなど）又は単一ドメイン抗体（ラクダ抗体など）を含む。一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、同一の標的抗原に結合する。一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、同一の標的抗原の異なる領域（異なるエピトープなど）に結合する。一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、異なる標的抗原に結合する。例えば、一部の例示的な実施形態では、２つの抗原結合領域は、それぞれＣＤ１９及びＣＤ２０、又はそれぞれＣＤ１９及びＣＤ２２、又はそれぞれＣＤ３８及びＢＣＭＡ、又はそれぞれＰＤＬ１及びＥＧＦＲに結合することができる。
【0060】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号２２に記載されたアミノ酸配列及び配列番号２３に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＥＧＦＲに特異的に結合する。
【0061】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号４４に記載されたアミノ酸配列及び配列番号４５に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＣＤ１９に特異的に結合する。
【0062】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号４６に記載されたアミノ酸配列及び配列番号４７に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＣＤ２０に特異的に結合する。
【0063】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号４８に記載されたアミノ酸配列及び配列番号４９に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＣＤ２２に特異的に結合する。
【0064】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号２４に記載されたアミノ酸配列及び配列番号２５に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＧＰＣ３に特異的に結合する。
【0065】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号２８に記載された重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９に記載された重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０に記載された重鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３１に記載された軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２に記載された軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３に記載された軽鎖ＣＤＲ３を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＣＤ１９に特異的に結合する。
【0066】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号２６に記載されたアミノ酸配列及び配列番号２７に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＣＤ１９に特異的に結合する。
【0067】
別の態様では、本発明は、α鎖及びβ鎖を含み、α鎖が第１の抗原結合領域及び第１の定常領域を含み、β鎖が第２の抗原結合領域及び第２の定常領域を含む、合成Ｔ細胞受容体抗原受容体（ＳＴＡＲ）を提供し、
ここで第１の定常領域は、天然のＴ細胞受容体のα鎖定常領域又は本明細書に開示される天然のＴ細胞受容体のα鎖定常領域のバリアントであり、第２の定常領域は、天然のＴ細胞受容体のβ鎖定常領域又は本明細書に開示される天然のＴ細胞受容体のβ鎖定常領域のバリアントであり、
第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、異なる標的抗原又は同一の標的抗原の異なる領域に特異的に結合する。
ここで第１の定常領域は、天然のＴ細胞受容体のα鎖定常領域又は本明細書に開示される天然のＴ細胞受容体のα鎖定常領域のバリアントであり、第２の定常領域は、天然のＴ細胞受容体のβ鎖定常領域又は本明細書に開示される天然のＴ細胞受容体のβ鎖定常領域のバリアントであり、
第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、異なる標的抗原又は同一の標的抗原の異なる領域に特異的に結合する。
【0068】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、標的抗原に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖなど）又は単一ドメイン抗体（ラクダ抗体など）を含む。
【0069】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号２２に記載されたアミノ酸配列及び配列番号２３に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＥＧＦＲに特異的に結合する。
【0070】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号４４に記載されたアミノ酸配列及び配列番号４５に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＣＤ１９に特異的に結合する。
【0071】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号４６に記載されたアミノ酸配列及び配列番号４７に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＣＤ２０に特異的に結合する。
【0072】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号４８に記載されたアミノ酸配列及び配列番号４９に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＣＤ２２に特異的に結合する。
【0073】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号２４に記載されたアミノ酸配列及び配列番号２５に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＧＰＣ３に特異的に結合する。
【0074】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号２８に記載された重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９に記載された重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０に記載された重鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３１に記載された軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２に記載された軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３に記載された軽鎖ＣＤＲ３を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＣＤ１９に特異的に結合する。
【0075】
一部の実施形態では、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域に含まれる単鎖抗体は、配列番号２６に記載されたアミノ酸配列及び配列番号２７に記載されたアミノ酸配列を含み、それによって第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、ＣＤ１９に特異的に結合する。
【0076】
一部の例示的な実施形態では、２つの抗原結合領域は、それぞれＣＤ１９及びＣＤ２０、又はそれぞれＣＤ１９及びＣＤ２２、又はそれぞれＣＤ３８及びＢＣＭＡ、又はそれぞれＰＤＬ１及びＥＧＦＲに結合することができる。
【0077】
別の態様では、本発明は、本発明の合成Ｔ細胞受容体抗原受容体（ＳＴＡＲ）のα鎖及び／又はβ鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0078】
一部の実施形態では、本ポリヌクレオチドは、１つのリーディングフレーム内に、ｉ）α鎖をコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）β鎖をコードするヌクレオチド配列、及びｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との間に位置する自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。α鎖をコードするヌクレオチド配列は、β鎖をコードするヌクレオチド配列の５’末端又は３’末端に位置していてもよい。
【0079】
本明細書で使用される「自己切断ペプチド」は、細胞内で自己切断を達成し得るペプチドを意味する。例えば、自己切断ペプチドは、細胞内でプロテアーゼによって認識されて特異的に切断されるように、プロテアーゼ認識部位を含むことができる。
【0080】
或いは、自己切断ペプチドは２Ａポリペプチドであってもよい。２Ａポリペプチドは、翻訳中に自己切断が起こるウイルス由来の短いペプチドのクラスである。２Ａポリペプチドを使用して、同一のリーディングフレーム内で発現させようとする２つの異なる標的タンパク質を連結すると、２つの標的タンパク質はほぼ１：１の比で生成される。一般的に使用される２Ａポリペプチドは、ブタテッショウウイルス－１由来のＰ２Ａ、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａ、ウマ鼻炎Ａウイルス由来のＥ２Ａ、及び口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａであり得る。中でも、Ｐ２Ａの開裂効率が最も高く、そのためＰ２Ａが好ましい。これらの２Ａポリペプチドの様々な機能的バリアントも当技術分野において公知であり、そのようなバリアントも本発明に使用することができる。
【0081】
別の態様では、本発明は、調節配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【0082】
本発明の「発現ベクター」は、直鎖状核酸セグメント、環状プラスミド及びウイルスベクターであってもよく、又は翻訳され得るＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）であってもよい。一部の好ましい実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
【0083】
「調節配列」及び「調節エレメント」は互換的に使用され、コード配列の上流（５’非コード配列）、中間、又は下流（３’非コード配列）に位置して、関連するコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。発現調節エレメントは、目的のヌクレオチド配列の転写、ＲＮＡのプロセシング若しくは安定性、又は翻訳を制御することができるヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー及びポリアデニル化認識配列を含み得るが、これらに限定されない。
【0084】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、調節エレメント（例えば、限定されないが、プロモーター配列、転写終結配列など）がヌクレオチド配列の転写が転写調節エレメントによって制御及び調節されるように、核酸配列（例えば、コード配列又はオープンリーディングフレーム）に連結されていることを意味する。調節エレメント領域を核酸分子に作動可能に連結するための手法は、当技術分野において公知である。
【0085】
別の態様では、本発明は、治療用Ｔ細胞を調製する方法であって、Ｔ細胞において本発明の合成Ｔ細胞受容体抗原受容体（ＳＴＡＲ）を発現させるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明の発現ベクターをＴ細胞に導入するステップを含む。
【0086】
別の態様では、本発明は、本発明の合成Ｔ細胞受容体抗原受容体（ＳＴＡＲ）を含むか、又は本発明の方法によって得られる、治療用Ｔ細胞を提供する。
【0087】
本発明のＴ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む多数の非限定的な供給源から、様々な非限定的な方法によって得ることができる。一部の実施形態では、細胞は、健康なドナー又はがんと診断された患者に由来し得る。一部の実施形態では、細胞は、異なる表現型特性を示す細胞の混合集団の一部であり得る。例えば、Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、続いて特異的抗体による活性化及び増殖を実施することによって得ることができる。
【0088】
本発明の諸態様の一部の実施形態において、Ｔ細胞は、対象の自己細胞に由来する。本明細書で使用する場合、「自家」とは、対象を治療するために使用される細胞、細胞株、又は細胞集団が、対象に由来することを指す。一部の実施形態では、Ｔ細胞は異種細胞に由来し、例えば、対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と適合するドナーに由来する。標準的なスキームを使用して、ドナー由来の細胞を非アロ反応性細胞に転換し、必要に応じて細胞を複製して、１人又は複数の患者に投与し得る細胞を生成することができる。
【0089】
別の態様では、本発明は、本発明の治療用Ｔ細胞及び薬学的に許容できる担体を含む薬学的組成物を提供する。
【0090】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」は、生理的に適合性である任意及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（注射又は注入などによる）に好適である。
【0091】
別の態様では、本発明は、対象におけるがんなどの疾患の治療のための医薬の製造における、本発明の治療用Ｔ細胞又は本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【0092】
本明細書で使用する場合、「対象」は、本発明の細胞、方法、又は医薬組成物によって治療することができる、がんなどの疾患に罹患しているか、又は罹患しやすい生物を指す。非限定的な例としては、ヒト、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、シカ、及び他の非哺乳動物が挙げられる。好ましい一実施形態では、対象はヒトである。
【0093】
別の態様では、本発明は、対象におけるがんなどの疾患を治療する方法であって、本発明の治療用Ｔ細胞又は本発明の医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【0094】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」又は「治療有効用量」又は「有効量」は、対象への投与後に治療効果を生じさせるのに少なくとも十分である物質、化合物、材料又は細胞の量を指す。したがって、それは、疾患又は状態の症状の予防、治癒、改善、停止又は部分的な停止のために必要な量である。例えば、本発明の細胞又は医薬組成物の「有効量」は、好ましくは、疾患の症状の重症度の低下、疾患の無症候期の頻度及び期間の増加、又は疾患によって引き起こされる障害若しくは能力障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍の治療に関して、本発明の細胞又は医薬組成物の「有効量」は、好ましくは、治療を受けていない対象と比較して、腫瘍細胞増殖又は腫瘍増殖を、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍に対する治療効果を予測するために使用し得る動物モデル系において評価することができる。或いは、腫瘍細胞増殖を阻害する能力を試験することによってそれを評価することもでき、これは当業者に周知のアッセイによってｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができる。
【0095】
本発明の医薬組成物における細胞の実際の投与量レベルは、患者に毒性を及ぼすことなく、特定の患者、組成物、及び投与様式について、所望の治療応答を達成するのに有効な量の細胞が得られるように変化させることができる。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排出速度、治療の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康状態及び病歴、並びに医療技術分野で周知の同様の要因を含む、種々の薬物動態学的因子に依存すると考えられる。
【0096】
本発明による治療用Ｔ細胞又は医薬組成物又は医薬の投与は、注射、注入、植え込み又は移植を含む、任意の便利な方法で実施することができる。本明細書に記載の細胞又は組成物の投与は、静脈内、リンパ内、皮内、腫瘍内、髄内、筋肉内、又は腹腔内投与によることができる。一実施形態では、本発明の細胞又は組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与することができる。
【0097】
本発明の様々な態様の実施形態では、がんは、肺がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、黒色腫、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、上咽頭がん、咽喉がん、子宮頸がん、子宮体部腫瘍、骨肉腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、前立腺がん、子宮がん、肛門がん、精巣がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性又は急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、及び慢性リンパ性白血病を含む）、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓又は尿管がん、腎盂腎がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、及びアスベスト誘発がんを含む環境誘発がん、並びにこれらのがんの組合せからなる群から選択される。
【実施例】
【0098】
実施例１．ＳＴＡＲ及びその変異体の定常領域ドメインの設計
１．１ ＳＴＡＲのプロトタイプの設計
Ｂ細胞によって産生される分泌型抗体（Ａｂ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）は、遺伝子構造、タンパク質構造及び空間的配座の点で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との類似性が非常に大きい。抗体及びＴＣＲは両方とも、可変領域及び定常領域から構成され、可変領域は抗原認識及び結合に役割を果たし、定常領域ドメインは構造的相互作用及びシグナル伝達に役割を果たす。ＴＣＲα及びβ鎖（又はＴＣＲγ及びδ鎖）の可変領域を抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）に置き換えることにより、合成Ｔ細胞受容体及び抗体受容体（ＳＴＡＲ）と呼ばれる合成キメラ分子を構築することができ、その構造は図１に示されている。
１．１ ＳＴＡＲのプロトタイプの設計
Ｂ細胞によって産生される分泌型抗体（Ａｂ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）は、遺伝子構造、タンパク質構造及び空間的配座の点で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との類似性が非常に大きい。抗体及びＴＣＲは両方とも、可変領域及び定常領域から構成され、可変領域は抗原認識及び結合に役割を果たし、定常領域ドメインは構造的相互作用及びシグナル伝達に役割を果たす。ＴＣＲα及びβ鎖（又はＴＣＲγ及びδ鎖）の可変領域を抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）に置き換えることにより、合成Ｔ細胞受容体及び抗体受容体（ＳＴＡＲ）と呼ばれる合成キメラ分子を構築することができ、その構造は図１に示されている。
【0099】
ＳＴＡＲ分子は２本の鎖を有し、第１の鎖は、抗原認識配列（例えば、抗体の重鎖可変領域ＶＨ）をＴ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα）の定常領域（Ｃα、ヒトＴＣＲａＣ－ＷＴ、配列番号１）に融合させることによって得られ、第２の鎖は、抗原認識配列（例えば、抗体の軽鎖可変領域ＶＬ）をＴ細胞受容体β鎖（ＴＣＲβ）の定常領域（Ｏβ、ヒトＴＣＲｂＣ－ＷＴ、配列番号１４）に融合させることによって得られる。構築物中の抗原認識ドメイン（ＶＨ、ＶＬ又はｓｃＦｖなど）及び定常領域ドメイン（ＴＣＲα、β、γ及びδ定常領域）は、構成は異なるが類似の機能を有する複数の構築物を形成するように配置して組み合わせることができる。
【0100】
ＳＴＡＲ分子の第１の鎖及び第２の鎖がＴ細胞において発現された後、ＳＴＡＲ分子の第１の鎖及び第２の鎖は、小胞体において細胞の内因性ＣＤ３εδ、ＣＤ３γε及びＣＤ３ζζ鎖と組み合わされて８サブユニットの複合体を形成することができ、この複合体は複雑な様式で細胞膜の表面に提示される。免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）は、ＴＣＲ分子内にシグナル伝達効果を有する配列モチーフであり、その保存配列はＹｘｘＬ／Ｖである。ＣＤ３ε、δ、γ及びε鎖の細胞内領域は１つのＩＴＡＭ配列を含有し、ＣＤ３ζ鎖の細胞内領域は３つのＩＴＡＭ配列を含有するため、完全なＳＴＡＲ複合体はＩＴＡＭ配列を計１０個含有する。ＳＴＡＲの抗原認識配列が特異的抗原と組み合わされると、細胞内ＩＴＡＭ配列が徐々にリン酸化され、そのため下流シグナル経路が活性化されて、ＮＦ－κβ、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１などの転写因子が活性化され、Ｔ細胞が誘発されて活性化され、エフェクター機能が生じる。
【0101】
１．２ マウス由来ＳＴＡＲの設計
ＳＴＡＲのプロトタイプの設計には、ヒト起源のＴＣＲα／β鎖（又はＴＣＲγ及びδ鎖）の定常領域配列を使用する。ヒト、霊長類及びマウスのＴＣＲα／β鎖の定常領域配列（マウスＴＣＲａＣ－ＷＴ、配列番号２及びマウスＴＣＲｂＣ－ＷＴ（配列番号１５）（又はＴＣＲγ及びδ鎖）は、機能保存性が高く、重要なアミノ酸配列が同一であるため、互いに置換可能である。
ＳＴＡＲのプロトタイプの設計には、ヒト起源のＴＣＲα／β鎖（又はＴＣＲγ及びδ鎖）の定常領域配列を使用する。ヒト、霊長類及びマウスのＴＣＲα／β鎖の定常領域配列（マウスＴＣＲａＣ－ＷＴ、配列番号２及びマウスＴＣＲｂＣ－ＷＴ（配列番号１５）（又はＴＣＲγ及びδ鎖）は、機能保存性が高く、重要なアミノ酸配列が同一であるため、互いに置換可能である。
【0102】
ひとたびＴ細胞に形質導入されると、ＳＴＡＲ分子は定常領域を介してＴ細胞の内因性ＴＣＲと誤対合を形成する。この誤対合の問題は、一方ではＳＴＡＲ分子が適切に対合する効率を低下させ、その機能を損なうが、他方では誤対合が未知の特異性を生成する可能性を高め、安全性リスクを増大させる。この問題を解決するために、ヒトＴ細胞に移入された後のＳＴＡＲ分子の機能が強化されるように、ＳＴＡＲ分子の定常領域をマウス配列で置換した。ヒト及びマウスの配列のアラインメントは図２に示されている。
【0103】
１．３ ＳＴＡＲの定常領域のＮ末端における改変の設計
ＳＴＡＲ分子の設計をさらに最適化するためにＳＴＡＲ分子内の特定の配列を改変したが、１つの改変スキームは、ＳＴＡＲ分子の定常領域のＮ末端を欠失させたことである。ＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端の１８アミノ酸を欠失させ（このマウス配列は配列番号３のＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱである）（生成された定常領域配列はマウスＴＣＲａＣ－Ｎ．ＤＬＴ、配列番号４である）、ＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端の２５アミノ酸を欠失させた（このマウス配列は配列番号１６のＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫである）（生成された定常領域配列はマウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ、配列番号１７である）。これらの２つの領域は定常領域のＮ末端に位置し、Ｉｇ様Ｃ１型ドメインには属さず、分子内ジスルフィド結合形成にも関与しないが、主としてヒンジとして機能し、異なる欠失スキームが設計されているＳＴＡＲの機能に影響を及ぼす。本発明によれば、より良い効果を得るために、定常領域の特定の配列を再編成させた。再編成は、部分配列が欠失し、部分配列にヒト化変異が加えられたことを意味する。この領域改変は以下の利点を有する：第１に、ヒンジ領域の機能的最適化により、ＳＴＡＲ及び内因性ＴＣＲの誤対合を減少させることができ、第２に、最適化されたＳＴＡＲ分子のサイズが天然のＴＣＲのサイズにより類似していることで、共刺激分子の結合、免疫シナプスの形成及び安定化、Ｔ細胞のその後のエフェクター機能が促進される。
ＳＴＡＲ分子の設計をさらに最適化するためにＳＴＡＲ分子内の特定の配列を改変したが、１つの改変スキームは、ＳＴＡＲ分子の定常領域のＮ末端を欠失させたことである。ＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端の１８アミノ酸を欠失させ（このマウス配列は配列番号３のＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱである）（生成された定常領域配列はマウスＴＣＲａＣ－Ｎ．ＤＬＴ、配列番号４である）、ＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端の２５アミノ酸を欠失させた（このマウス配列は配列番号１６のＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫである）（生成された定常領域配列はマウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ、配列番号１７である）。これらの２つの領域は定常領域のＮ末端に位置し、Ｉｇ様Ｃ１型ドメインには属さず、分子内ジスルフィド結合形成にも関与しないが、主としてヒンジとして機能し、異なる欠失スキームが設計されているＳＴＡＲの機能に影響を及ぼす。本発明によれば、より良い効果を得るために、定常領域の特定の配列を再編成させた。再編成は、部分配列が欠失し、部分配列にヒト化変異が加えられたことを意味する。この領域改変は以下の利点を有する：第１に、ヒンジ領域の機能的最適化により、ＳＴＡＲ及び内因性ＴＣＲの誤対合を減少させることができ、第２に、最適化されたＳＴＡＲ分子のサイズが天然のＴＣＲのサイズにより類似していることで、共刺激分子の結合、免疫シナプスの形成及び安定化、Ｔ細胞のその後のエフェクター機能が促進される。
【0104】
ヒト化変異の意義は、ＳＴＡＲ分子における非ヒト配列を最小化すると同時に、ＳＴＡＲ分子の機能を確保して、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞が臨床応用において受容体によって拒絶される可能性を最大限回避することである。具体的な転位スキームは以下の通りである。
【0105】
ＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端での１８アミノ酸（マウス配列はＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱである）の再編成のためのスキーム：
図３は、マウスＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端での１８アミノ酸のヒト配列とのアラインメントを示しており、ＵｓｅｒＳｅｑ１はヒト配列であり、ＵｓｅｒＳｅｑ２はマウス配列である。アミノ酸特性分析を通じて、マウス由来配列及びヒト由来配列はいずれもＥ６Ｄ、Ｋ１３Ｒ、Ｒ１６Ｋ、Ｑ１８Ｓ部位で同一の性質のアミノ酸置換に属し、Ｐ１５Ｓ部位では極性アミノ酸に置換される非極性アミノ酸に属するため、この部位付近のタンパク質の性質は保存されず、機能に影響を及ぼさずに改変が可能であることが見出された。結論として、マウスＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端の位置１～１４のアミノ酸配列は保持されてヒト化され、位置１５～１８のアミノ酸を欠失させて、マウスＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４、配列番号５が生成された。
図３は、マウスＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端での１８アミノ酸のヒト配列とのアラインメントを示しており、ＵｓｅｒＳｅｑ１はヒト配列であり、ＵｓｅｒＳｅｑ２はマウス配列である。アミノ酸特性分析を通じて、マウス由来配列及びヒト由来配列はいずれもＥ６Ｄ、Ｋ１３Ｒ、Ｒ１６Ｋ、Ｑ１８Ｓ部位で同一の性質のアミノ酸置換に属し、Ｐ１５Ｓ部位では極性アミノ酸に置換される非極性アミノ酸に属するため、この部位付近のタンパク質の性質は保存されず、機能に影響を及ぼさずに改変が可能であることが見出された。結論として、マウスＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端の位置１～１４のアミノ酸配列は保持されてヒト化され、位置１５～１８のアミノ酸を欠失させて、マウスＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４、配列番号５が生成された。
【0106】
さらに、この領域のヒンジ効果を考慮し、すべての切詰めが効果に影響を及ぼす可能性があるため、マウスＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端の位置１～４のアミノ酸を欠失させ、位置５～１８のアミノ酸をヒト化して、この改変をマウスＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１と呼び、生成された定常領域配列は配列番号３４である；マウスＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端の位置１～８のアミノ酸を欠失させ、位置９～１８のアミノ酸をヒト化して、この改変をマウスＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２と呼び、生成された定常領域配列は配列番号３５である；及び、マウスＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端の位置１～１２のアミノ酸を欠失させ、位置１３～１８のアミノ酸をヒト化して、生成された定常領域配列はマウスＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３、配列番号３６であった。対照として、マウスＴＣＲα鎖定常領域のＮ末端における位置１～１８のアミノ酸のランダムな再編成も行ったところ、生成された定常領域配列はマウスＴＣＲａＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ、配列番号４０である。
【0107】
ＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端での２５アミノ酸（マウス配列はＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫである）の再編成のスキーム：
図４は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端での２５アミノ酸のヒト配列とのアラインメントを示しており、ＵｓｅｒＳｅｑ１はヒト配列であり、ＵｓｅｒＳｅｑ２はマウス配列である。アミノ酸特性分析を通じて、マウス由来配列及びヒト由来配列はＲ３ＫとＬ１２Ｖ部位とでのみ同一特性のアミノ酸置換に属し、Ｔ６Ｆ、Ｋ８Ｅ、Ｄ１１Ａ、Ｋ１７Ｅ、Ａ２１Ｓ、Ｎ２２Ｈ、Ｋ２３Ｔ部位ではすべて異なるアミノ酸特性の置換に属しており、その結果、これらの部位付近のタンパク質の特性は保存されず、機能に影響を及ぼさずに改変が可能であることが見出された。結論として、マウスＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端の位置１～１６のアミノ酸配列は保持されてヒト化され、位置１７及び２１～２５のアミノ酸を欠失させて、生成された定常領域配列はマウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４（配列番号１８）である。
図４は、マウスＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端での２５アミノ酸のヒト配列とのアラインメントを示しており、ＵｓｅｒＳｅｑ１はヒト配列であり、ＵｓｅｒＳｅｑ２はマウス配列である。アミノ酸特性分析を通じて、マウス由来配列及びヒト由来配列はＲ３ＫとＬ１２Ｖ部位とでのみ同一特性のアミノ酸置換に属し、Ｔ６Ｆ、Ｋ８Ｅ、Ｄ１１Ａ、Ｋ１７Ｅ、Ａ２１Ｓ、Ｎ２２Ｈ、Ｋ２３Ｔ部位ではすべて異なるアミノ酸特性の置換に属しており、その結果、これらの部位付近のタンパク質の特性は保存されず、機能に影響を及ぼさずに改変が可能であることが見出された。結論として、マウスＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端の位置１～１６のアミノ酸配列は保持されてヒト化され、位置１７及び２１～２５のアミノ酸を欠失させて、生成された定常領域配列はマウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４（配列番号１８）である。
【0108】
さらに、この領域のヒンジ効果を考慮し、すべての切詰めが効果に影響を及ぼす可能性があるため、マウスＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端の位置１～６のアミノ酸を欠失させ、位置１３～２５のアミノ酸をヒト化したところ、生成された定常領域配列はマウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－ｌ、配列番号３７である；マウスＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端の位置１～１２のアミノ酸も欠失させ、位置１３～２５のアミノ酸をヒト化したところ、生成された定常領域配列はマウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２、配列番号３８である；及び、マウスＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端の位置１～１８のアミノ酸も欠失させ、位置１９～２５のアミノ酸をヒト化したところ、生成された定常領域配列はマウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３、配列番号３９である。対照として、マウスＴＣＲβ鎖定常領域のＮ末端における位置１～２５のアミノ酸のランダムな再編成も行ったところ、マウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ、配列番号４１の定常領域配列が生成された。
【0109】
１．４ ＳＴＡＲの定常領域のＣ末端の改変の設計
本発明では、マウスＴＣＲα鎖定常領域のＣ末端の１５アミノ酸を欠失させて、その結果、その定常領域配列はマウスＴＣＲａＣ－Ｃ．ＤＬＴ（配列番号４２）である。
本発明では、マウスＴＣＲα鎖定常領域のＣ末端の１５アミノ酸を欠失させて、その結果、その定常領域配列はマウスＴＣＲａＣ－Ｃ．ＤＬＴ（配列番号４２）である。
【0110】
本発明では、マウスＴＣＲβ鎖定常領域のＣ末端の１５アミノ酸を欠失させて、その結果、その定常領域配列はマウスＴＣＲｂＣ－Ｃ．ＤＬＴ（配列番号４３）である。
【0111】
１．５ 分子間ジスルフィド結合を導入するＳＴＡＲのシステイン点変異の設計
ＳＴＡＲ分子の設計をさらに最適化するために、ＳＴＡＲ分子の特定の配列を改変し、１つの改変スキームは、ＳＴＡＲ分子の２つの鎖間の対合を強化して内因性ＴＣＲとの誤対合を減少させる目的で分子間ジスルフィド結合を導入するために、ＳＴＡＲ分子にシステイン点変異を実施することであった。具体的なスキームを以下に示す。
ＳＴＡＲ分子の設計をさらに最適化するために、ＳＴＡＲ分子の特定の配列を改変し、１つの改変スキームは、ＳＴＡＲ分子の２つの鎖間の対合を強化して内因性ＴＣＲとの誤対合を減少させる目的で分子間ジスルフィド結合を導入するために、ＳＴＡＲ分子にシステイン点変異を実施することであった。具体的なスキームを以下に示す。
【0112】
ＴＣＲα鎖定常領域において、位置４８のトレオニンＴをシステインＣに変異させ（生成された定常領域配列は、ヒトＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ、配列番号６及びマウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ、配列番号７である）、ＴＣＲβ鎖定常領域において位置５６のセリンＳをシステインＣに変異させた（生成された定常領域配列は、ヒトＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ、配列番号１９及びマウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ、配列番号２０である）。新たに追加された２つのシステインはＳＴＡＲの２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成すると考えられ、ＳＴＡＲの２つの鎖と内因性ＴＣＲ鎖との間の誤対合は減少し、ＳＴＡＲ分子がより安定な複合体を形成するのを助け、ひいてはより良好な機能性が得られた。
【0113】
１．６ ＳＴＡＲの膜貫通領域における疎水性アミノ酸置換の設計
ＳＴＡＲ分子の設計をさらに最適化するために、本発明は、ＳＴＡＲ分子内の特定の配列を改変する。１つの改変スキームは、ＳＴＡＲ分子の安定性を高め、ＳＴＡＲ分子がより長く機能するのを助けるために、ＳＴＡＲ分子の膜貫通領域において疎水性アミノ酸置換を実施することである。具体的なスキームは以下の通りである。
ＳＴＡＲ分子の設計をさらに最適化するために、本発明は、ＳＴＡＲ分子内の特定の配列を改変する。１つの改変スキームは、ＳＴＡＲ分子の安定性を高め、ＳＴＡＲ分子がより長く機能するのを助けるために、ＳＴＡＲ分子の膜貫通領域において疎水性アミノ酸置換を実施することである。具体的なスキームは以下の通りである。
【0114】
ＴＣＲα鎖定常領域の膜貫通領域の１１１～１１９のアミノ酸領域において３つのアミノ酸部位を変異させ、位置１１２のセリンＳはロイシンＬに変化させ、位置１１４のメチオニンＭをイソロイシンＩに変化させ、位置１１５のグリシンＧをピリミジンＶに変化させた。この領域の全アミノ酸配列はＬＳＶＭＧＬＲＩＬからＬＬＶＩＶＬＲＩＬに変化し、この改変はマウスＴＣＲａＣ－ＴＭ９と呼ばれ、生成された定常領域配列は配列番号９である。この設計は、膜貫通領域の疎水性を高め、ＴＣＲ膜貫通領域によって保有される正電荷によって引き起こされる不安定性を打ち消し、その結果、ＳＴＡＲ分子が細胞膜上により安定に存在し、それ故により良い機能を得ることができる。
【0115】
１．７ Ｎ末端改変、システイン改変及び膜貫通領域改変の組合せ
本発明者らは、上述のＮ末端改変、システイン改変及び膜貫通領域改変を組み合わせて、マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１（配列番号１１）、マウスＴＣＲａＣ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１（配列番号１２）、マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９（配列番号１０）、マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１（配列番号１３）、及びマウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１（配列番号２１）を設計した。
本発明者らは、上述のＮ末端改変、システイン改変及び膜貫通領域改変を組み合わせて、マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１（配列番号１１）、マウスＴＣＲａＣ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１（配列番号１２）、マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９（配列番号１０）、マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１（配列番号１３）、及びマウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１（配列番号２１）を設計した。
【0116】
１．８ ＳＴＡＲの可変領域及び定常領域の交換配置及び組合せ
ＳＴＡＲ分子は、可変領域ドメイン及び定常領域ドメインという２つの部分に分けることができる。可変領域ドメインは、抗原認識能力を有するアミノ酸配列からなり、一般に、以下の分子クラスで構成される：抗体軽鎖可変領域、抗体重鎖可変領域、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、リガンド受容体結合領域、ナノボディなど。定常領域ドメインは、ＴＣＲ定常領域、又はＣＤ３サブユニットと統合する能力を有する関連配列からなり、典型的には、ＴＣＲα、β、γ及びδ鎖の定常領域を含む。
ＳＴＡＲ分子は、可変領域ドメイン及び定常領域ドメインという２つの部分に分けることができる。可変領域ドメインは、抗原認識能力を有するアミノ酸配列からなり、一般に、以下の分子クラスで構成される：抗体軽鎖可変領域、抗体重鎖可変領域、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、リガンド受容体結合領域、ナノボディなど。定常領域ドメインは、ＴＣＲ定常領域、又はＣＤ３サブユニットと統合する能力を有する関連配列からなり、典型的には、ＴＣＲα、β、γ及びδ鎖の定常領域を含む。
【0117】
ＳＴＡＲ構築物における抗原認識ドメイン及び定常領域ドメインは、構成は異なるが類似の機能を有する種々の構築物を形成するように配置して組み合わせることができる。下の表に、考えられる配置及び組合せのいくつかを示す。
【表1】
【0118】
実施例２．ＳＴＡＲの抗原認識ドメインの設計
１）標的選択
ＳＴＡＲの標的選択は、主として遺伝子発現のバンクによって達成され、一般に、好適なＳＴＡＲ標的の発現レベルは、通常の細胞と比較して、疾患又は関連細胞上で概ね高い発現又は特異的発現を有する。好適な標的が決定された後、標的を認識するための抗原認識ドメインは、一般に抗体、ＳＣＦＶ、ＶＨＨ又は抗原に対応する受容体などである。重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、アルパカ単鎖抗体（ＶＨＨ）、並びに抗体の受容体及びリガンドは、マウス、アルパカ、配列決定又は公表された配列の免疫処置によって得ることができる。得られたマウス由来又はアルパカ配列は、一般に、ヒト細胞における発現及び機能にとってより有益であるように、ヒト化及びコドン最適化を受ける必要がある。好適な配列が得られた後に、得られた配列をレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターに連結し、ベクター構築が正しいか否かを配列決定法によって検出した後に、ウイルスのパッケージング及び感染を介してベクターを体細胞において発現させ、タグタンパク質ＲＦＰ、ＧＦＰ、ＭＹＣ、ＨＩＳなどを使用してＳＴＡＲタンパク質の発現、膜ローディング、抗原結合などを検出する。有用な標的としては、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＭＳＬＮ、ＧＤ２、ＬＩＲＢ４、ＲＯＲ１、クローディン１８．２、ＣＤ７、ＣＤ４７及びＣＤ２４が挙げられるが、これらに限定されない。
１）標的選択
ＳＴＡＲの標的選択は、主として遺伝子発現のバンクによって達成され、一般に、好適なＳＴＡＲ標的の発現レベルは、通常の細胞と比較して、疾患又は関連細胞上で概ね高い発現又は特異的発現を有する。好適な標的が決定された後、標的を認識するための抗原認識ドメインは、一般に抗体、ＳＣＦＶ、ＶＨＨ又は抗原に対応する受容体などである。重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、アルパカ単鎖抗体（ＶＨＨ）、並びに抗体の受容体及びリガンドは、マウス、アルパカ、配列決定又は公表された配列の免疫処置によって得ることができる。得られたマウス由来又はアルパカ配列は、一般に、ヒト細胞における発現及び機能にとってより有益であるように、ヒト化及びコドン最適化を受ける必要がある。好適な配列が得られた後に、得られた配列をレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターに連結し、ベクター構築が正しいか否かを配列決定法によって検出した後に、ウイルスのパッケージング及び感染を介してベクターを体細胞において発現させ、タグタンパク質ＲＦＰ、ＧＦＰ、ＭＹＣ、ＨＩＳなどを使用してＳＴＡＲタンパク質の発現、膜ローディング、抗原結合などを検出する。有用な標的としては、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＭＳＬＮ、ＧＤ２、ＬＩＲＢ４、ＲＯＲ１、クローディン１８．２、ＣＤ７、ＣＤ４７及びＣＤ２４が挙げられるが、これらに限定されない。
【0119】
２）標的細胞株及びツール細胞株の表
本発明では、ＳＴＡＲの機能を説明するために複数の標的細胞株を使用し、標的細胞が遺伝子工学的手段を介してルシフェラーゼ遺伝子を得たことから、ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能検出が容易になった。ルシフェラーゼは、細胞機能を研究するための一般的な物質であり、この酵素活性は系にルシフェラーゼ基質を添加することによって判定され、ルシフェラーゼ活性は標的遺伝子の発現、結合強度、細胞数などと密接に関連している。本発明では、ルシフェラーゼを安定に発現させるための標的細胞株を樹立して、標的細胞の量をルシフェラーゼの量によって示し、その結果、機能性細胞の死滅機能が示された。具体的な細胞は以下の通りであった：
本発明では、ＳＴＡＲの機能を説明するために複数の標的細胞株を使用し、標的細胞が遺伝子工学的手段を介してルシフェラーゼ遺伝子を得たことから、ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能検出が容易になった。ルシフェラーゼは、細胞機能を研究するための一般的な物質であり、この酵素活性は系にルシフェラーゼ基質を添加することによって判定され、ルシフェラーゼ活性は標的遺伝子の発現、結合強度、細胞数などと密接に関連している。本発明では、ルシフェラーゼを安定に発現させるための標的細胞株を樹立して、標的細胞の量をルシフェラーゼの量によって示し、その結果、機能性細胞の死滅機能が示された。具体的な細胞は以下の通りであった：
【表2】
【0120】
３）抗原認識ドメイン（抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨなど）の選択
抗原認識ドメインは、抗原を認識する抗体、抗体の単鎖可変領域、可変領域、ナノボディ、抗原認識のための受容体などに由来し得る。ＳＴＡＲの設計において、ウイルスはＴ細胞形質転換のための主要な経路であり、レンチウイルス又はレトロウイルスのパッケージングはパッケージングのサイズに関連するため、より小さい抗体認識単位が好まれ、例えば、抗体単鎖可変領域及びナノボディはサイズの点でより良い選択である。同一抗原を目標とする場合、従来の抗体は、先行技術として抗体認識ドメインを広くスクリーニングする方法の１つであるが、一方、ファージライブラリー、アフィニティー最適化、マウスハイブリドーマのスクリーニング、アルパカモノクローナル抗体のスクリーニング、ヒト化などによる完全ヒト化抗体ライブラリーの構築の手法によって、抗原を認識する全く新しい抗体が得られた。さらに、抗原を認識し得る特異的分子としての抗原の受容体は、抗原認識ドメインの主要な選択肢の１つである。
抗原認識ドメインは、抗原を認識する抗体、抗体の単鎖可変領域、可変領域、ナノボディ、抗原認識のための受容体などに由来し得る。ＳＴＡＲの設計において、ウイルスはＴ細胞形質転換のための主要な経路であり、レンチウイルス又はレトロウイルスのパッケージングはパッケージングのサイズに関連するため、より小さい抗体認識単位が好まれ、例えば、抗体単鎖可変領域及びナノボディはサイズの点でより良い選択である。同一抗原を目標とする場合、従来の抗体は、先行技術として抗体認識ドメインを広くスクリーニングする方法の１つであるが、一方、ファージライブラリー、アフィニティー最適化、マウスハイブリドーマのスクリーニング、アルパカモノクローナル抗体のスクリーニング、ヒト化などによる完全ヒト化抗体ライブラリーの構築の手法によって、抗原を認識する全く新しい抗体が得られた。さらに、抗原を認識し得る特異的分子としての抗原の受容体は、抗原認識ドメインの主要な選択肢の１つである。
【0121】
実施例３．ＳＴＡＲ及びその変異体のプラスミド構築
１）プラスミドの供給源
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、タンパク質発現ベクター、ファージミド、レンチウイルスパッケージングプラスミド、レトロウイルスパッケージングプラスミドなどを含む、本発明に使用されるベクターはすべて、営利会社から購入されるか、又は営利会社によって合成され、ベクターの完全長配列が得られており、明確な酵素切断部位が公知である。
１）プラスミドの供給源
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、タンパク質発現ベクター、ファージミド、レンチウイルスパッケージングプラスミド、レトロウイルスパッケージングプラスミドなどを含む、本発明に使用されるベクターはすべて、営利会社から購入されるか、又は営利会社によって合成され、ベクターの完全長配列が得られており、明確な酵素切断部位が公知である。
【0122】
２）断片の供給源
本発明に採用される遺伝子セグメントは、シグナルペプチド、抗体結合領域、ヒンジ領域、ＴＣＲ定常領域、タグタンパク質などを含み、これらはすべて、営利会社によって合成された。対応する機能的配列は、プライマー合成ＰＣＲ様式で１つ又は複数の標的断片を連結することによって得られた。
本発明に採用される遺伝子セグメントは、シグナルペプチド、抗体結合領域、ヒンジ領域、ＴＣＲ定常領域、タグタンパク質などを含み、これらはすべて、営利会社によって合成された。対応する機能的配列は、プライマー合成ＰＣＲ様式で１つ又は複数の標的断片を連結することによって得られた。
【0123】
３）プラスミド構築及び配列決定方法
本方法に使用したレンチウイルスベクターはｐＨＡＧＥ－ＥＦ１ａ－ＧＦＰであり、ｐＨＡＧＲ－ＥＦ１Ａ－ＷＰＲＥ－ＡＭＰベクターは、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ Ｉ／Ｃｌａ Ｉを介して得られ、断片遺伝子は合成及びＰＣＲ法を介して得られ、完全なベクターは、Ｇｉｂｓｓｏｎ／ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ及び他の組換え酵素の作用の下での相同組換え法を介して得られた。レトロウイルスベクターＲＶＫＭ－ＣＭＶ－ＧＦＰから制限酵素Ｘｈｏ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉによってベクター断片が得られ、一方、挿入断片遺伝子は合成及びＰＣＲ法によって得て、ベクター及び断片を相同組換え法によって連結した。原核生物発現ベクターはｐＥＴ－２８ａベクターとし、使用する制限エンドヌクレアーゼ部位はＸｈｏＩ及びＮｃｏｌとし、真核生物発現ベクターはＰＶＲＣ８４００とし、使用する制限エンドヌクレアーゼ部位はＸｈｏＩ及びＸｂａＩとして、プライマーをヒト抗原遺伝子に従って設計し、制限エンドヌクレアーゼ消化部位をプライマーの２つの末端に付加し、抗原細胞外セグメント及びＣセグメントの切り詰められたｈｉｓタグを、標的細胞ウェル遺伝子から増幅させて、その後の精製に使用した。プライマーは付着末端ＰＣＲを使用して、酵素消化産物の付着末端のセンス鎖及びアンチセンス鎖に従ってそれぞれ設計し、プライマーをそれぞれ、酵素消化後にベクターとの一段階組換え連結に供されることになるＰＣＲに供し、連結産物の５μＬを形質転換のための連結後に５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加し、３７℃インキュベーター中で転置して１２～１６時間培養した。
本方法に使用したレンチウイルスベクターはｐＨＡＧＥ－ＥＦ１ａ－ＧＦＰであり、ｐＨＡＧＲ－ＥＦ１Ａ－ＷＰＲＥ－ＡＭＰベクターは、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ Ｉ／Ｃｌａ Ｉを介して得られ、断片遺伝子は合成及びＰＣＲ法を介して得られ、完全なベクターは、Ｇｉｂｓｓｏｎ／ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ及び他の組換え酵素の作用の下での相同組換え法を介して得られた。レトロウイルスベクターＲＶＫＭ－ＣＭＶ－ＧＦＰから制限酵素Ｘｈｏ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉによってベクター断片が得られ、一方、挿入断片遺伝子は合成及びＰＣＲ法によって得て、ベクター及び断片を相同組換え法によって連結した。原核生物発現ベクターはｐＥＴ－２８ａベクターとし、使用する制限エンドヌクレアーゼ部位はＸｈｏＩ及びＮｃｏｌとし、真核生物発現ベクターはＰＶＲＣ８４００とし、使用する制限エンドヌクレアーゼ部位はＸｈｏＩ及びＸｂａＩとして、プライマーをヒト抗原遺伝子に従って設計し、制限エンドヌクレアーゼ消化部位をプライマーの２つの末端に付加し、抗原細胞外セグメント及びＣセグメントの切り詰められたｈｉｓタグを、標的細胞ウェル遺伝子から増幅させて、その後の精製に使用した。プライマーは付着末端ＰＣＲを使用して、酵素消化産物の付着末端のセンス鎖及びアンチセンス鎖に従ってそれぞれ設計し、プライマーをそれぞれ、酵素消化後にベクターとの一段階組換え連結に供されることになるＰＣＲに供し、連結産物の５μＬを形質転換のための連結後に５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加し、３７℃インキュベーター中で転置して１２～１６時間培養した。
【0124】
４）プラスミド抽出方法
プラスミド抽出のためにアルカリ溶解法を採用し、プラスミド抽出の後に、２６０ｎｍ光吸収によりプラスミド濃度を検出した。一次配列決定結果が正しいプラスミドの形質転換を行って、抽出に供せられるモノクライン（ｍｏｎｏｃｌｉｎｅ）を選択する必要があり、プラスミドが正しいか否かは酵素消化によって同定された。
プラスミド抽出のためにアルカリ溶解法を採用し、プラスミド抽出の後に、２６０ｎｍ光吸収によりプラスミド濃度を検出した。一次配列決定結果が正しいプラスミドの形質転換を行って、抽出に供せられるモノクライン（ｍｏｎｏｃｌｉｎｅ）を選択する必要があり、プラスミドが正しいか否かは酵素消化によって同定された。
【0125】
プラスミドｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰを上記の方法によって得た。定常領域は、ＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ（ＴＣＲａＣ－ＷＴ及びＴＣＲｂＣ－ＷＴを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ（ＴＣＲａＣ－Ｎ．ＤＬＴ及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃ．ＤＬＴ（ＴＣＲａＣ－Ｃ．ＤＬＴ及びＴＣＲｂＣ－ＣＤＬＴを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ（ＴＣＲａＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９（ＴＣＲａＣ－ＴＭ９及びＴＣＲｂＣ－ＷＴを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｎ－Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ－Ｒｅｃ－１を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１を含む）の様々なｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－Ｃｅｔｕｘ－ＶＬ－ＴＣＲａＣ－Ｐ２Ａ－ＶＨ－ＴＣＲｂＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰ及びｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ＧＣ３３－ＶＬ－ＴＣＲａＣ－Ｐ２Ａ－ＶＨ－ＴＣＲｂＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰプラスミドである；異なる標的について、ＴＣＲ定常領域はすべてｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－３３４－ＶＬ－ＴＣＲｂＣ－Ｐ２Ａ－ＶＨ－ＴＣＲａＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰ、ｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－２Ｃ６－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ－ＴＣＲｂＣ－Ｐ２Ａ－ＦＭＣ６３－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ－ＴＣＲａＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰ、ｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－Ｍ９７１－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ－ＴＣＲｂＣ－Ｐ２Ａ－３３４－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ－ＴＣＲａＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰ及び他のプラスミドである。
【0126】
実施例４．ツールプラスミド及び細胞株の構築
１）プラスミドｐＨＡＧＥ－ルシフェラーゼ－ＧＦＰの構築
レンチウイルスベクターとしてのｐＨＡＧＥは、標的遺伝子を標的細胞ゲノムに安定に挿入することができ、安定な細胞株を構築するための重要な方法である。ルシフェラーゼは触媒活性を有する酵素であり、基質を触媒して化学的自己発光を発生させることができ、標的細胞がルシフェラーゼを安定に発現して基質を添加した後に、標的細胞の数を示すことができるため、標的細胞に対する機能性細胞の影響が反映される。ＰＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａベクターは制限酵素Ｎｏｔ Ｉ／Ｃｌａ Ｉ制限酵素切断部位を保有しており、この２つの酵素を使用することによってベクターを切断し、ＮＣＢＩからルシフェラーゼ及びＧＦＰ配列を入手して、営利会社であるＲｕｉｂｉｏｔｅｃｈにより断片を合成させ、Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ法を使用してルシフェラーゼ遺伝子及びＧＦＰ遺伝子を組み合わせた後に、相同組換え法を使用することによってルシフェラーゼ－ＧＦＰ断片をｐＨＡＧＥベクター中に連結させ、ＥＦ１Ａ及びＷＰＲＥでそれぞれ順方向及び逆方向プライマーを設計し、配列決定を行って、ベクター構築が成功したか否かを判定した。
１）プラスミドｐＨＡＧＥ－ルシフェラーゼ－ＧＦＰの構築
レンチウイルスベクターとしてのｐＨＡＧＥは、標的遺伝子を標的細胞ゲノムに安定に挿入することができ、安定な細胞株を構築するための重要な方法である。ルシフェラーゼは触媒活性を有する酵素であり、基質を触媒して化学的自己発光を発生させることができ、標的細胞がルシフェラーゼを安定に発現して基質を添加した後に、標的細胞の数を示すことができるため、標的細胞に対する機能性細胞の影響が反映される。ＰＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａベクターは制限酵素Ｎｏｔ Ｉ／Ｃｌａ Ｉ制限酵素切断部位を保有しており、この２つの酵素を使用することによってベクターを切断し、ＮＣＢＩからルシフェラーゼ及びＧＦＰ配列を入手して、営利会社であるＲｕｉｂｉｏｔｅｃｈにより断片を合成させ、Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ法を使用してルシフェラーゼ遺伝子及びＧＦＰ遺伝子を組み合わせた後に、相同組換え法を使用することによってルシフェラーゼ－ＧＦＰ断片をｐＨＡＧＥベクター中に連結させ、ＥＦ１Ａ及びＷＰＲＥでそれぞれ順方向及び逆方向プライマーを設計し、配列決定を行って、ベクター構築が成功したか否かを判定した。
【0127】
２）ルシフェラーゼを有する標的細胞株の作製（細胞株の表）
ルシフェラーゼ及びＧＦＰを使用したレンチウイルスベクターの構築に成功した後、レンチウイルスをＬｅｎｔｉｘ－２９３Ｔによってパッケージングし、レンチウイルス溶液をＰＥＧ８０００濃縮法によって濃縮し、勾配希釈法を使用してウイルス力価を測定し、続いて標的細胞を感染させたが、これには以下の表の細胞株が含まれるが、これらに限定されない：
ルシフェラーゼ及びＧＦＰを使用したレンチウイルスベクターの構築に成功した後、レンチウイルスをＬｅｎｔｉｘ－２９３Ｔによってパッケージングし、レンチウイルス溶液をＰＥＧ８０００濃縮法によって濃縮し、勾配希釈法を使用してウイルス力価を測定し、続いて標的細胞を感染させたが、これには以下の表の細胞株が含まれるが、これらに限定されない：
【表3】
【0128】
感染７２時間後に蛍光顕微鏡でＧＦＰ陽性細胞が存在するか否かを観察し、続いてフローソーターでＧＦＰ陽性細胞を選別し、モノクローンを選択し、ライブラリーを構築して貯蔵した。一方、ルシフェラーゼ基質及び標的細胞の共培養を実施して、ルシフェラーゼの発現及び発現量を検出した。
【0129】
３）ＴＣＲａ／ｂノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞株の構築
ＴＣＲの構造及び配列特性に基づいて、α鎖及びβ鎖の定常領域にガイド配列を設計し、ＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞株を構築した。ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の定常領域エクソン配列をそれぞれＮＣＢＩで入手し、α鎖及びβ鎖の定常領域エクソン１配列を、ガイド配列を設計するためにｔｏｏｌｓ．ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇのウェブサイトに提出して、その結果に従ってオリゴ配列を合成した。続いて、ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲレンチウイルスベクターを構築し、ＣＲＩＳＰＲレンチウイルスベクターをＢｓｍＢＩ制限酵素で消化して、フィルター配列を除去し、連結末端を露出させて、自己連結を減少させるためにプラスミドを３７℃で１時間アルカリホスファターゼで処理した。酵素消化に供した系をゲル回収のためアガロースゲル電気泳動に供したところ、標的断片のプラスミド骨格は約１１５００ｂｐであり、一方、切断されたフィルターバンドは－２０００ｂｐの位置に存在した；合成されたガイド配列のオリゴ単鎖をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ４リガーゼ及びＴ４ ＰＮＫを使用することによって処理し、２本鎖にアニーリングさせて、連結のために末端にリン酸基を付加した；アニールした２本鎖ガイド配列を水で２００倍に希釈して、ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲと連結させてＢｓｍＢＩ酵素消化に供し、Ｓｔｂｌ３大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）への形質転換を行って、プラスミドをウイルスコーティング感染のために抽出した。α鎖のガイド配列はＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ｐｕｒｏにリンクし、β鎖のガイド配列はＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ＢＳＤにリンクしていた。ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲレンチウイルスのパッケージング及び濃縮は、以下のステップを含む：あらかじめ１０ｃｍ皿にＨＥＫ－２９３Ｔを播種し、細胞が８０％～９０％に増殖した時点でトランスフェクション系を調製し、トランスフェクション系をＨＥＫ－２９３Ｔに添加し、細胞を３７℃インキュベーターに戻して培養し、時間を０時間として記録する；トランスフェクション後１２時間で、新鮮な１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭに交換する；トランスフェクションの４８時間後及び７２時間後にウイルスを収集する；ウイルス含有培地の遠心分離及び濾過を行い、ＰＥＧ８０００を添加して均一に混合し、４℃で１２時間以上静置し、３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離する；上清を廃棄し、好適な量の培地で再懸濁沈殿を行う；－８０℃での凍結保存を実施するか、又は直接使用を行う。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の感染、薬物死滅スクリーニング、及びモノクローナル細胞株の同定には、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を１２ウェル又は２４ウェルのプレートに接種するステップを含めた；細胞密度は大きすぎてはならない；α鎖及びβ鎖のｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲウイルスを同時に適量添加し、ポリブレン（合計容積に応じて１：１０００で添加）を添加して均一に混合した；１０００ｒｐｍでの遠心感染を実施し、３２℃の遠心分離を９０分間実施し、細胞を取り出して３７℃のインキュベーターに入れ、時間を０時間として記録した；１０～１２時間後に溶液を交換した；４８時間後に、ピューロマイシン及びブラスチシジンを適切な最終濃度で添加したところ、薬物死滅の４８時間後に、非感染対照群の細胞はすべて死滅した。生存細胞を吸引除去し、遠心分離後に完全培地で培養してＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞ライブラリーを得た；ＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞ライブラリーの単一細胞をフロー型Ａｒｉａを使用して９６ウェルプレートに分取し、培養を２週間行い、増殖した単一細胞を吸引して、拡大培養を行った；ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のそれぞれの抗体を使用してモノクローナル細胞株を同定し、この２つの鎖が欠損している細胞株を増幅して、内因性ＴＣＲがノックアウトされたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を得た。
ＴＣＲの構造及び配列特性に基づいて、α鎖及びβ鎖の定常領域にガイド配列を設計し、ＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞株を構築した。ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の定常領域エクソン配列をそれぞれＮＣＢＩで入手し、α鎖及びβ鎖の定常領域エクソン１配列を、ガイド配列を設計するためにｔｏｏｌｓ．ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇのウェブサイトに提出して、その結果に従ってオリゴ配列を合成した。続いて、ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲレンチウイルスベクターを構築し、ＣＲＩＳＰＲレンチウイルスベクターをＢｓｍＢＩ制限酵素で消化して、フィルター配列を除去し、連結末端を露出させて、自己連結を減少させるためにプラスミドを３７℃で１時間アルカリホスファターゼで処理した。酵素消化に供した系をゲル回収のためアガロースゲル電気泳動に供したところ、標的断片のプラスミド骨格は約１１５００ｂｐであり、一方、切断されたフィルターバンドは－２０００ｂｐの位置に存在した；合成されたガイド配列のオリゴ単鎖をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ４リガーゼ及びＴ４ ＰＮＫを使用することによって処理し、２本鎖にアニーリングさせて、連結のために末端にリン酸基を付加した；アニールした２本鎖ガイド配列を水で２００倍に希釈して、ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲと連結させてＢｓｍＢＩ酵素消化に供し、Ｓｔｂｌ３大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）への形質転換を行って、プラスミドをウイルスコーティング感染のために抽出した。α鎖のガイド配列はＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ｐｕｒｏにリンクし、β鎖のガイド配列はＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ＢＳＤにリンクしていた。ｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲレンチウイルスのパッケージング及び濃縮は、以下のステップを含む：あらかじめ１０ｃｍ皿にＨＥＫ－２９３Ｔを播種し、細胞が８０％～９０％に増殖した時点でトランスフェクション系を調製し、トランスフェクション系をＨＥＫ－２９３Ｔに添加し、細胞を３７℃インキュベーターに戻して培養し、時間を０時間として記録する；トランスフェクション後１２時間で、新鮮な１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭに交換する；トランスフェクションの４８時間後及び７２時間後にウイルスを収集する；ウイルス含有培地の遠心分離及び濾過を行い、ＰＥＧ８０００を添加して均一に混合し、４℃で１２時間以上静置し、３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離する；上清を廃棄し、好適な量の培地で再懸濁沈殿を行う；－８０℃での凍結保存を実施するか、又は直接使用を行う。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の感染、薬物死滅スクリーニング、及びモノクローナル細胞株の同定には、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を１２ウェル又は２４ウェルのプレートに接種するステップを含めた；細胞密度は大きすぎてはならない；α鎖及びβ鎖のｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲウイルスを同時に適量添加し、ポリブレン（合計容積に応じて１：１０００で添加）を添加して均一に混合した；１０００ｒｐｍでの遠心感染を実施し、３２℃の遠心分離を９０分間実施し、細胞を取り出して３７℃のインキュベーターに入れ、時間を０時間として記録した；１０～１２時間後に溶液を交換した；４８時間後に、ピューロマイシン及びブラスチシジンを適切な最終濃度で添加したところ、薬物死滅の４８時間後に、非感染対照群の細胞はすべて死滅した。生存細胞を吸引除去し、遠心分離後に完全培地で培養してＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞ライブラリーを得た；ＴＣＲα－β－Ｊｕｒｋａｔ細胞ライブラリーの単一細胞をフロー型Ａｒｉａを使用して９６ウェルプレートに分取し、培養を２週間行い、増殖した単一細胞を吸引して、拡大培養を行った；ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖のそれぞれの抗体を使用してモノクローナル細胞株を同定し、この２つの鎖が欠損している細胞株を増幅して、内因性ＴＣＲがノックアウトされたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を得た。
【0130】
実施例５．Ｔ細胞への形質導入のためのウイルス系の樹立
１）レンチウイルス系及びパッケージング方法（異なる世代）
Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を、５×１０５／ｍＬに従って１０ｃｍ培養皿に接種し、３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーター中で培養し、細胞密度が約８０％に達した時点でトランスフェクトした（顕微鏡下で観察）。３つのプラスミドを５００ｕＬの無血清ＤＭＥＭと、ＰＭＤ２．Ｇ：ＰＳＰＡＸ：伝達プラスミドの比を１：２：３として十分に混合した。５４ｕＬのＰＥＩ－ｍａｘを５００ｕＬの無血清ＤＭＥＭと十分に混合し、室温で５分間放置した（プラスミドに対するＰＥＩ－Ｍａｘの体積対質量比は３：１であった）。プラスミド混合溶液にＰＥＩ－ｍａｘ混合溶液をゆっくりと加え、均一になるようにブロー及び撹拌を少し行って、室温で１５分間放置した。最終的な混合溶液を培地にゆっくりと添加して十分に均一に混合した後、混合溶液をインキュベーターに戻して１２～１６時間連続培養し、６％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に移して連続培養して、４８時間及び７２時間のウイルス溶液を採取した。
１）レンチウイルス系及びパッケージング方法（異なる世代）
Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を、５×１０５／ｍＬに従って１０ｃｍ培養皿に接種し、３７℃で５％ ＣＯ２インキュベーター中で培養し、細胞密度が約８０％に達した時点でトランスフェクトした（顕微鏡下で観察）。３つのプラスミドを５００ｕＬの無血清ＤＭＥＭと、ＰＭＤ２．Ｇ：ＰＳＰＡＸ：伝達プラスミドの比を１：２：３として十分に混合した。５４ｕＬのＰＥＩ－ｍａｘを５００ｕＬの無血清ＤＭＥＭと十分に混合し、室温で５分間放置した（プラスミドに対するＰＥＩ－Ｍａｘの体積対質量比は３：１であった）。プラスミド混合溶液にＰＥＩ－ｍａｘ混合溶液をゆっくりと加え、均一になるようにブロー及び撹拌を少し行って、室温で１５分間放置した。最終的な混合溶液を培地にゆっくりと添加して十分に均一に混合した後、混合溶液をインキュベーターに戻して１２～１６時間連続培養し、６％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に移して連続培養して、４８時間及び７２時間のウイルス溶液を採取した。
【0131】
２）ウイルス力価測定方法
Ｊｕｒｋａｔ－Ｃ５細胞を５×１０５／ｍＬに従って平底９６ウェルプレートに接種し、１０％ ＦＢＳを含有する１００ｕＬの１６４０培地及び０．２ｕＬの１０００×ポリブレンを各ウェルに添加した。ウイルスを希釈する場合には、１６４０完全培地を使用することによって１０倍希釈を実施し、ウイルスがウイルス原液である場合には第１のウェルのウイルス量は１００ｕＬとし、ウイルスが濃縮液である場合には第１のウェルのウイルス量は１ｕＬとした；希釈した細胞を１００ｕＬ／ウェルでウイルスウェルに添加して混合し、３２℃、１５００ｒｐｍで９０分間の遠心分離を実施し、５％ ＣＯ２インキュベーター中で３７℃、７２時間の培養を行った。９６ウェル平底プレート上の細胞を丸底９６ウェルプレート上に吸引し、４℃、１８００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を廃棄した。２００ｕＬの１×ＰＢＳを添加した後、４℃、１８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を実施し、上清を廃棄した。４％組織固定液を２００ｕＬ添加し、暗所での保存を実施して、フローサイトメーターへのローディングを実施した。フローサイトメーターを使用することによって感染効率を測定し、力価を計算する場合には感染率２％～３０％のウェルを選択し、計算式は力価（ＴＵ／ｍＬ）＝１．５×１０４×陽性率／ウイルス体積（ｕＬ）×１０００とした。
Ｊｕｒｋａｔ－Ｃ５細胞を５×１０５／ｍＬに従って平底９６ウェルプレートに接種し、１０％ ＦＢＳを含有する１００ｕＬの１６４０培地及び０．２ｕＬの１０００×ポリブレンを各ウェルに添加した。ウイルスを希釈する場合には、１６４０完全培地を使用することによって１０倍希釈を実施し、ウイルスがウイルス原液である場合には第１のウェルのウイルス量は１００ｕＬとし、ウイルスが濃縮液である場合には第１のウェルのウイルス量は１ｕＬとした；希釈した細胞を１００ｕＬ／ウェルでウイルスウェルに添加して混合し、３２℃、１５００ｒｐｍで９０分間の遠心分離を実施し、５％ ＣＯ２インキュベーター中で３７℃、７２時間の培養を行った。９６ウェル平底プレート上の細胞を丸底９６ウェルプレート上に吸引し、４℃、１８００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を廃棄した。２００ｕＬの１×ＰＢＳを添加した後、４℃、１８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を実施し、上清を廃棄した。４％組織固定液を２００ｕＬ添加し、暗所での保存を実施して、フローサイトメーターへのローディングを実施した。フローサイトメーターを使用することによって感染効率を測定し、力価を計算する場合には感染率２％～３０％のウェルを選択し、計算式は力価（ＴＵ／ｍＬ）＝１．５×１０４×陽性率／ウイルス体積（ｕＬ）×１０００とした。
【0132】
以下のプラスミドのウイルスｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰを、上記の方法によってパッケージングした；定常領域は、ＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ（ＴＣＲａＣ－ＷＴ及びＴＣＲｂＣ－ＷＴを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ（ＴＣＲａＣ－Ｎ．ＤＬＴ及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃ．ＤＬＴ（ＴＣＲａＣ－Ｃ．ＤＬＴ及びＴＣＲｂＣ－ＣＤＬＴを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ（ＴＣＲａＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９（ＴＣＲａＣ－ＴＭ９及びＴＣＲｂＣ－ＷＴを含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１を含む）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓを含む）及びＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１を含む）の様々なｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－Ｃｅｔｕｘ－ＶＬ－ＴＣＲａＣ－Ｐ２Ａ－ＶＨ－ＴＣＲｂＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰ及びｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ＧＣ３３－ＶＬ－ＴＣＲａＣ－Ｐ２Ａ－ＶＨ－ＴＣＲｂＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰプラスミドとした；異なる標的について、ＴＣＲ定常領域はすべて、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１及び他のプラスミドのｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－３３４－ＶＬ－ＴＣＲｂＣ－Ｐ２Ａ－ＶＨ－ＴＣＲａＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰ、ｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－２Ｃ６－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ－ＴＣＲｂＣ－Ｐ２Ａ－ＦＭＣ６３－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ－ＴＣＲａＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰ及びｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－Ｍ９７１－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ－ＴＣＲｂＣ－Ｐ２Ａ－３３４－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ－ＴＣＲａＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－３３４－ＶＬ－ＴＣＲｂＣ－Ｐ２Ａとした。
【0133】
実施例６．Ｔ細胞の培養及び感染方法の樹立
１）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の培養方法
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。培養密度は３×１０５／ｍｌ、最大でも３×１０６／ｍｌを超えないこととし、継代は１日～２日毎に行い、細胞を計数し、必要な量の細胞を採取して、密度を調整するために培地を補充して、細胞をＣＯ２培養ボックスに入れて培養した。
１）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の培養方法
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。培養密度は３×１０５／ｍｌ、最大でも３×１０６／ｍｌを超えないこととし、継代は１日～２日毎に行い、細胞を計数し、必要な量の細胞を採取して、密度を調整するために培地を補充して、細胞をＣＯ２培養ボックスに入れて培養した。
【0134】
２）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の感染方法
本方法は、細胞を計数し、遠心分離及び液体交換のために１×１０６／ｍｌの細胞を採取し、１０％ ＦＢＳを含有する１ ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を使用して再懸濁し、２４ウェルプレートに添加し、好適な量のウイルス液を添加し、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、ＣＯ２インキュベーター中で培養するというステップを含む。感染の１２時間後に、液体を１０％ ＦＢＳを含有する新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地で完全に交換し、陽性率を７２時間後に検出した。
本方法は、細胞を計数し、遠心分離及び液体交換のために１×１０６／ｍｌの細胞を採取し、１０％ ＦＢＳを含有する１ ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を使用して再懸濁し、２４ウェルプレートに添加し、好適な量のウイルス液を添加し、１５００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、ＣＯ２インキュベーター中で培養するというステップを含む。感染の１２時間後に、液体を１０％ ＦＢＳを含有する新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地で完全に交換し、陽性率を７２時間後に検出した。
【0135】
３）ヒト初代Ｔ細胞の培養方法
初代Ｔ細胞はＦｉｃｏｌｌ分離法により入手し、１０％ ＦＢＳ及び１００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含むＸ－ＶＩＶＯ培地中で培養し、ＣＤ３及びレトロネクチンｒ－フィブロネクチン（最終濃度５ｕｇ／ｍｌ）をプレコートしたプレートに添加し、初期培養密度は１×１０６／ｍｌとした。その後の培養密度は５×１０５／ｍｌ、最大でも３×１０６／ｍｌを超えないこととし、継代は１日～２日毎に行った。
初代Ｔ細胞はＦｉｃｏｌｌ分離法により入手し、１０％ ＦＢＳ及び１００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含むＸ－ＶＩＶＯ培地中で培養し、ＣＤ３及びレトロネクチンｒ－フィブロネクチン（最終濃度５ｕｇ／ｍｌ）をプレコートしたプレートに添加し、初期培養密度は１×１０６／ｍｌとした。その後の培養密度は５×１０５／ｍｌ、最大でも３×１０６／ｍｌを超えないこととし、継代は１日～２日毎に行った。
【0136】
４）ヒト初代Ｔ細胞の感染方法
初代Ｔ細胞を４８時間培養した後、ウイルス液を添加し、ＭＯＩ＝２０として１５００ｒｐｍで９０分間の遠心分離を実施し、細胞をＣＯ２インキュベーターに入れて培養した。感染の２４時間後に、１０％ ＦＢＳ及び１００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含有するＸ－ＶＩＶＯ培地を補充し、十分な移行を行い、感染効率を７２時間後にタグタンパク質又は抗体を介して検出した。
初代Ｔ細胞を４８時間培養した後、ウイルス液を添加し、ＭＯＩ＝２０として１５００ｒｐｍで９０分間の遠心分離を実施し、細胞をＣＯ２インキュベーターに入れて培養した。感染の２４時間後に、１０％ ＦＢＳ及び１００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含有するＸ－ＶＩＶＯ培地を補充し、十分な移行を行い、感染効率を７２時間後にタグタンパク質又は抗体を介して検出した。
【0137】
５）感染効率の検出方法
感染の７２時間後、細胞に均等にブローを行って計数し、遠心分離のために５×１０５／ｍｌを採取して、上清を廃棄し、染色溶液をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡとし、対応する抗体をインキュベーションのために添加し、インキュベーションを３０分間実施し、続いて洗浄のためにＰＢＳを２回添加し、検出のためローディングを実施した。
感染の７２時間後、細胞に均等にブローを行って計数し、遠心分離のために５×１０５／ｍｌを採取して、上清を廃棄し、染色溶液をＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡとし、対応する抗体をインキュベーションのために添加し、インキュベーションを３０分間実施し、続いて洗浄のためにＰＢＳを２回添加し、検出のためローディングを実施した。
【0138】
実施例７．Ｔ細胞におけるＳＴＡＲ及びその変異体の発現検出方法
遺伝子形質転換によるＴ細胞形質転換過程において、標的遺伝子の発現、膜ローディング、及び細胞表面での分布はＴ細胞の機能に影響を及ぼすため、蛍光タンパク質を介してウイルス感染効率を検出し、ＳＴＡＲのＮ末端にｍｙｃ抗体を連結させることによって、フロー抗体を介してＳＴＡＲの膜ローディング効率を検出した。ＳＴＡＲの構造はＴＣＲに由来するため、ＳＴＡＲが内因性ＴＣＲと誤対合するかどうかは無傷ＳＴＡＲの発現量に影響し、誤対合効率はＲＦＰ陽性比とＳＴＡＲ ｍｙｃ陽性比とを比較することによって評価した。
遺伝子形質転換によるＴ細胞形質転換過程において、標的遺伝子の発現、膜ローディング、及び細胞表面での分布はＴ細胞の機能に影響を及ぼすため、蛍光タンパク質を介してウイルス感染効率を検出し、ＳＴＡＲのＮ末端にｍｙｃ抗体を連結させることによって、フロー抗体を介してＳＴＡＲの膜ローディング効率を検出した。ＳＴＡＲの構造はＴＣＲに由来するため、ＳＴＡＲが内因性ＴＣＲと誤対合するかどうかは無傷ＳＴＡＲの発現量に影響し、誤対合効率はＲＦＰ陽性比とＳＴＡＲ ｍｙｃ陽性比とを比較することによって評価した。
【0139】
１）ＳＴＡＲの膜ローディング効率の検出
構築したｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ｍｙｃ－ＳＴＡＲ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰプラスミドをＬｅｎｔｉｘ－２９３Ｔによるウイルスパッケージングに供し、ウイルス濃度及び力価検出を行い、続いてＪｕｒｋａｔＣ５及び初代Ｔ細胞を感染させ、感染の７２時間後に感染細胞を収集し、ＦＩＴＣ－抗ｍｙｃ抗体及びＡＰＣ－抗ｍＴＣＲ－β抗体で染色を行い、フローサイトメーター（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）を使用してＲＦＰ／ＦＩＴＣ／ＡＰＣ蛍光チャネルを検出した。ＦＩＴＣ又はＡＰＣが明らかな陽性細胞集団を有する場合には、ＳＴＡＲの膜ローディング発現が可能であり、ＦＩＴＣ及びＡＰＣの両方が発現しない場合には、ＳＴＡＲは膜ローディングを実現しないことが示された。
構築したｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ｍｙｃ－ＳＴＡＲ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰプラスミドをＬｅｎｔｉｘ－２９３Ｔによるウイルスパッケージングに供し、ウイルス濃度及び力価検出を行い、続いてＪｕｒｋａｔＣ５及び初代Ｔ細胞を感染させ、感染の７２時間後に感染細胞を収集し、ＦＩＴＣ－抗ｍｙｃ抗体及びＡＰＣ－抗ｍＴＣＲ－β抗体で染色を行い、フローサイトメーター（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）を使用してＲＦＰ／ＦＩＴＣ／ＡＰＣ蛍光チャネルを検出した。ＦＩＴＣ又はＡＰＣが明らかな陽性細胞集団を有する場合には、ＳＴＡＲの膜ローディング発現が可能であり、ＦＩＴＣ及びＡＰＣの両方が発現しない場合には、ＳＴＡＲは膜ローディングを実現しないことが示された。
【0140】
２）ＳＴＡＲと内因性ＴＣＲとの誤対合の確率の評価
構築されたｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ｍｙｃ－ＳＴＡＲ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰプラスミドをＬｅｎｔｉｘ－２９３Ｔによるウイルスパッケージングに供し、ウイルス濃度及び力価検出を実施し、続いてＪｕｒｋａｔ及び初代Ｔ細胞を感染させ、感染の７２時間後に感染細胞を収集し、ＦＩＴＣ－抗ｍｙｃ抗体及びＡＰＣ－抗－ｍＴＣＲ－β抗体を使用することによって染色を行い、フローサイトメーター（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ｆ４）を使用することによってフローＲＦＰ／ＦＩＴＣ／ＡＰＣ蛍光チャネルを検出した。ＲＦＰ陽性率とＦＩＴＣ又はＡＰＣ陽性率との間に差が検出された。
構築されたｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－ｍｙｃ－ＳＴＡＲ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰプラスミドをＬｅｎｔｉｘ－２９３Ｔによるウイルスパッケージングに供し、ウイルス濃度及び力価検出を実施し、続いてＪｕｒｋａｔ及び初代Ｔ細胞を感染させ、感染の７２時間後に感染細胞を収集し、ＦＩＴＣ－抗ｍｙｃ抗体及びＡＰＣ－抗－ｍＴＣＲ－β抗体を使用することによって染色を行い、フローサイトメーター（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ｆ４）を使用することによってフローＲＦＰ／ＦＩＴＣ／ＡＰＣ蛍光チャネルを検出した。ＲＦＰ陽性率とＦＩＴＣ又はＡＰＣ陽性率との間に差が検出された。
【0141】
実施例８．Ｔ細胞におけるＳＴＡＲ及びその変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏレベルの機能的検出方法
１）Ｔ細胞と標的細胞とのｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
Ｔ細胞はＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５、Ｊｕｒｋａｔを含み、初代細胞株は懸濁細胞であり、標的細胞は異なる抗原及び細胞株に従って懸濁細胞及び接着細胞に分けることができ、ＲＡＪＩなどの懸濁標的細胞をＴ細胞と共培養し、ＲＡＪＩなどの懸濁標的細胞及びＴ細胞を共培養する場合には、対応する数の細胞を同時に採取し、細胞を遠心培養用の標的細胞培地と均一に混合した。また、細胞が接着性の標的細胞である場合には、あらかじめ１日前に標的細胞を接種する必要があるとし、続いて一定数のＴ細胞を添加したが、本方法は、パッケージング及び精製されたＳＴＡＲウイルスを使用することによってＴ細胞株又は初代Ｔ細胞を感染させ、共培養の１日前に感染効率に関するフロー型検出を実施し、機能細胞と標的細胞との比を一般に１０：１、５：１及び１：１の比を使用して決定し、感染効率に応じてＴ細胞の総数を計算するステップを含み、ここで標的細胞の使用量は一般に４Ｅ５／ウェル（２４ウェルプレート）とした。
１）Ｔ細胞と標的細胞とのｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養方法
Ｔ細胞はＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５、Ｊｕｒｋａｔを含み、初代細胞株は懸濁細胞であり、標的細胞は異なる抗原及び細胞株に従って懸濁細胞及び接着細胞に分けることができ、ＲＡＪＩなどの懸濁標的細胞をＴ細胞と共培養し、ＲＡＪＩなどの懸濁標的細胞及びＴ細胞を共培養する場合には、対応する数の細胞を同時に採取し、細胞を遠心培養用の標的細胞培地と均一に混合した。また、細胞が接着性の標的細胞である場合には、あらかじめ１日前に標的細胞を接種する必要があるとし、続いて一定数のＴ細胞を添加したが、本方法は、パッケージング及び精製されたＳＴＡＲウイルスを使用することによってＴ細胞株又は初代Ｔ細胞を感染させ、共培養の１日前に感染効率に関するフロー型検出を実施し、機能細胞と標的細胞との比を一般に１０：１、５：１及び１：１の比を使用して決定し、感染効率に応じてＴ細胞の総数を計算するステップを含み、ここで標的細胞の使用量は一般に４Ｅ５／ウェル（２４ウェルプレート）とした。
【0142】
２）標的抗原によるＴ細胞の刺激方法
適用の標的は一般に細胞表面タンパク質であり、抗原は、Ｔ細胞の機能を検出するためにＴ細胞の活性化のために直接使用することができ、典型的には、５μｇ／ｍｌの抗原（１×コーティング緩衝液希釈、一例として２４ウェルプレートを採用する場合）の３００マイクロリットルを一晩ウェルプレートをコーティングするために使用し、続いて抗原を廃棄し、陽性Ｔ細胞の１Ｅ６／ウェルを添加し、Ｔ細胞の機能を検出するために６、１２及び２４時間の遠心活性化の後にＴ細胞を収集した。
適用の標的は一般に細胞表面タンパク質であり、抗原は、Ｔ細胞の機能を検出するためにＴ細胞の活性化のために直接使用することができ、典型的には、５μｇ／ｍｌの抗原（１×コーティング緩衝液希釈、一例として２４ウェルプレートを採用する場合）の３００マイクロリットルを一晩ウェルプレートをコーティングするために使用し、続いて抗原を廃棄し、陽性Ｔ細胞の１Ｅ６／ウェルを添加し、Ｔ細胞の機能を検出するために６、１２及び２４時間の遠心活性化の後にＴ細胞を収集した。
【0143】
３）Ｔ細胞の分泌サイトカインの分析：ＥＬＩＳＡ
Ｔ細胞は活性化の過程で多数のサイトカイン（一般的な例としては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２が挙げられる）を放出して、Ｔ細胞が標的細胞を死滅させること、又はＴ細胞自身の増殖を促進することの一助とする。標的細胞又は抗原によって刺激された後に、Ｔ細胞を収集して遠心分離し、上清を採取した。ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキットには、それぞれヒトＩＬ－２ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、ヒトＴＮＦ－α Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ及びヒトＩＦＮ－γ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ（物品番号８８－７０２５、８８－７３４６、８８－７３１６）を使用した。具体的なステップは以下の通りである：１０×コーティング緩衝液をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティング抗体（２５０×）を添加して均一に混合し、続いて混合物を１ウェル当たり１００μｌで９６ウェルプレート（ＥＬＩＳＡ専用）に添加した。４℃で一晩静置するために保存フィルムで密封した後、９６ウェルプレートを１×ＰＢＳＴ（洗浄緩衝液とも呼ばれ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０が１×ＰＢＳに添加されている）を各回１ウェル当たり２６０μｌ用いて３回洗浄した；５×ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈剤をｄｄＨ２Ｏで１×に希釈した；産物を１ウェル当たり２００μｌで９６ウェルプレートに添加した；９６ウェルプレートを室温で１時間静置した。９６ウェルプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、希釈して標準曲線（その範囲はそれぞれ２～２５０、４～５００、４～５００であった）を得た；試料を１×希釈液で２０～５０倍に希釈した。試料及び標準曲線に１ウェル当たり１００μｌ及び２つのマルチポアを添加した；常温で２時間インキュベートした後、９６ウェルプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；１×希釈剤で希釈した検出抗体を１時間のインキュベーションのために添加し、続いて９６ウェルプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；続いて、１×希釈剤で希釈したＨＲＰを添加して３０分間インキュベートし、続いて９６ウェルプレートを６回洗浄した；現像用にＴＭＢを添加し、現像時間は１５分を超えないこととした；現像を停止するために２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加した；４５０ｎｍでの光吸収を行うことによって光吸収を検出した。
Ｔ細胞は活性化の過程で多数のサイトカイン（一般的な例としては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２が挙げられる）を放出して、Ｔ細胞が標的細胞を死滅させること、又はＴ細胞自身の増殖を促進することの一助とする。標的細胞又は抗原によって刺激された後に、Ｔ細胞を収集して遠心分離し、上清を採取した。ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキットには、それぞれヒトＩＬ－２ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ、ヒトＴＮＦ－α Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ及びヒトＩＦＮ－γ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ（物品番号８８－７０２５、８８－７３４６、８８－７３１６）を使用した。具体的なステップは以下の通りである：１０×コーティング緩衝液をｄｄＨ２Ｏで１Ｘに希釈し、コーティング抗体（２５０×）を添加して均一に混合し、続いて混合物を１ウェル当たり１００μｌで９６ウェルプレート（ＥＬＩＳＡ専用）に添加した。４℃で一晩静置するために保存フィルムで密封した後、９６ウェルプレートを１×ＰＢＳＴ（洗浄緩衝液とも呼ばれ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０が１×ＰＢＳに添加されている）を各回１ウェル当たり２６０μｌ用いて３回洗浄した；５×ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈剤をｄｄＨ２Ｏで１×に希釈した；産物を１ウェル当たり２００μｌで９６ウェルプレートに添加した；９６ウェルプレートを室温で１時間静置した。９６ウェルプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、希釈して標準曲線（その範囲はそれぞれ２～２５０、４～５００、４～５００であった）を得た；試料を１×希釈液で２０～５０倍に希釈した。試料及び標準曲線に１ウェル当たり１００μｌ及び２つのマルチポアを添加した；常温で２時間インキュベートした後、９６ウェルプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；１×希釈剤で希釈した検出抗体を１時間のインキュベーションのために添加し、続いて９６ウェルプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した；続いて、１×希釈剤で希釈したＨＲＰを添加して３０分間インキュベートし、続いて９６ウェルプレートを６回洗浄した；現像用にＴＭＢを添加し、現像時間は１５分を超えないこととした；現像を停止するために２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加した；４５０ｎｍでの光吸収を行うことによって光吸収を検出した。
【0144】
４）Ｔ細胞の死滅機能の検証：ルシフェラーゼ検出
２４時間の共培養の後、細胞懸濁液をわずかに均一にブローし、各ウェルから１５０μＬの細胞懸濁液を採取して、白色の９６ウェルプレートに添加した；各ウェルから２つのマルチポアを選択した；ルシフェラーゼ基質（ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。振盪（低速）を、１０分間のコインキュベーションのために実施した；続いて、ゲインを１００に固定したマルチモードリーダーを使用して化学ルミネセンス値を検出した。細胞死滅の計算：死滅効率＝１００％－（エフェクター細胞－標的化細胞ウェルの値／対照細胞－標的化細胞ウェルの値）。
２４時間の共培養の後、細胞懸濁液をわずかに均一にブローし、各ウェルから１５０μＬの細胞懸濁液を採取して、白色の９６ウェルプレートに添加した；各ウェルから２つのマルチポアを選択した；ルシフェラーゼ基質（ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。振盪（低速）を、１０分間のコインキュベーションのために実施した；続いて、ゲインを１００に固定したマルチモードリーダーを使用して化学ルミネセンス値を検出した。細胞死滅の計算：死滅効率＝１００％－（エフェクター細胞－標的化細胞ウェルの値／対照細胞－標的化細胞ウェルの値）。
【0145】
実施例９．動物腫瘍モデルのレベルでＴ細胞におけるＳＴＡＲ受容体及びその変異体の機能を検出する方法
１）実験動物モデル
この実験にはモデルとしてＮＳＧ免疫不全マウスを使用した。このマウスは、ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６／Ｎｊｕの遺伝型を有し、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞が欠損している；このマウスはマクロファージ及び樹状細胞にも欠陥がある。ＮＳＧマウスは、最も完全な免疫不全を示すマウス系統に属し、移植腫瘍及びＴ細胞に対する拒絶反応を示さず、Ｔ細胞治療の前臨床研究に広く応用されている。この実験では、６～８週齢の雌性ＮＳＧマウスを使用した。各バッチの実験におけるマウス間の体重差を２ｇ以内に制御した。マウスは、病原体汚染を防ぐために、特定病原体が除去された（ＳＰＦ）クリーングレードバリア下にて個別に換気されたケージ内で飼育され、通常の食餌及びわずかに酸性のｐＨの飲料水を与えられた。
１）実験動物モデル
この実験にはモデルとしてＮＳＧ免疫不全マウスを使用した。このマウスは、ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６／Ｎｊｕの遺伝型を有し、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞が欠損している；このマウスはマクロファージ及び樹状細胞にも欠陥がある。ＮＳＧマウスは、最も完全な免疫不全を示すマウス系統に属し、移植腫瘍及びＴ細胞に対する拒絶反応を示さず、Ｔ細胞治療の前臨床研究に広く応用されている。この実験では、６～８週齢の雌性ＮＳＧマウスを使用した。各バッチの実験におけるマウス間の体重差を２ｇ以内に制御した。マウスは、病原体汚染を防ぐために、特定病原体が除去された（ＳＰＦ）クリーングレードバリア下にて個別に換気されたケージ内で飼育され、通常の食餌及びわずかに酸性のｐＨの飲料水を与えられた。
【0146】
２）腫瘍モデルの樹立
本発明はＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能を検証するために様々な腫瘍モデルを使用しており、その結果、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の効果の普遍性が検証された。血液腫瘍モデルの構築において、この実験には異種移植のためにヒトバーキットリンパ腫細胞株のＲａｊｉ細胞を使用した。Ｒａｊｉ細胞は、レンチウイルスベクターを介してルシフェラーゼ遺伝子を発現させるための細胞株であり、ルシフェリンの化学発光及び生体イメージングの様式で、マウスにおけるＲａｊｉ腫瘍の発生及び変化をリアルタイムでモニターする。本モデルでは、種々の用量（一般に約１～３×１０６個の細胞）のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞を、６～８週齢の雌ＮＳＧマウスに尾静脈再注入によって接種した。３日後にマウスにルシフェリンカリウム塩溶液を腹腔内注射し、体内の腫瘍細胞の蛍光シグナルを生体イメージング様式で検出した。Ｒａｊｉ細胞はマウスの中で急速に増殖し、血液を介して全身に分布しており、その結果、臓器に感染して固形腫瘍を形成し、マウスの体重減少などの症状を引き起こす確率が一定程度ある；治療的処置を行わない場合、Ｒａｊｉ腫瘍負荷は約３０～４０日後にマウスを死亡させる。
本発明はＳＴＡＲ－Ｔ細胞の機能を検証するために様々な腫瘍モデルを使用しており、その結果、ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の効果の普遍性が検証された。血液腫瘍モデルの構築において、この実験には異種移植のためにヒトバーキットリンパ腫細胞株のＲａｊｉ細胞を使用した。Ｒａｊｉ細胞は、レンチウイルスベクターを介してルシフェラーゼ遺伝子を発現させるための細胞株であり、ルシフェリンの化学発光及び生体イメージングの様式で、マウスにおけるＲａｊｉ腫瘍の発生及び変化をリアルタイムでモニターする。本モデルでは、種々の用量（一般に約１～３×１０６個の細胞）のＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞を、６～８週齢の雌ＮＳＧマウスに尾静脈再注入によって接種した。３日後にマウスにルシフェリンカリウム塩溶液を腹腔内注射し、体内の腫瘍細胞の蛍光シグナルを生体イメージング様式で検出した。Ｒａｊｉ細胞はマウスの中で急速に増殖し、血液を介して全身に分布しており、その結果、臓器に感染して固形腫瘍を形成し、マウスの体重減少などの症状を引き起こす確率が一定程度ある；治療的処置を行わない場合、Ｒａｊｉ腫瘍負荷は約３０～４０日後にマウスを死亡させる。
【0147】
固形腫瘍異種移植モデルの構築において、本実験では、ヒト類表皮癌Ａ４３１細胞株、ヒト非小細胞肺がんＡ５４９細胞株、ヒト肝臓がんＨｕｈ－７及びＨｅｐＧ２、ヒト神経膠腫Ｕ８７及びＵ２５１細胞株、並びにヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を含む様々な腫瘍型を選択した。これらの細胞はレンチウイルスベクターを介してルシフェラーゼ遺伝子を発現し、ルシフェリンの化学発光と生体イメージング様式でマウスにおける腫瘍の発生と変化をリアルタイムでモニターした。本モデルでは、種々の用量（悪性度及び腫瘍の異なる特徴に応じて２×１０５～３×１０６個の範囲）の細胞をマトリゲルと混合した後、皮下注射によりマウスに混合物を皮下接種した。３日後にマウスにルシフェリンカリウム塩溶液を腹腔内注射し、体内の腫瘍細胞の蛍光シグナルを生体イメージング様式で検出した。皮下接種された固形腫瘍は一般に侵襲性を有さず、移行が困難であり、通常は皮下に高密度の腫瘍塊を形成する。各腫瘍塊の長さ、幅及び高さをノギスで測定し、腫瘍の進行を各腫瘍のサイズによってさらにモニターした。治療的処置を行わない場合、これらの固形腫瘍細胞によって形成された腫瘍塊は、約２０日～４０日後に動物福祉倫理基準の仕様に達し、すなわち、各腫瘍塊の最大サイズが１５ｍｍを超え、各腫瘍塊のサイズが１５００ｍｍ３を超え、皮下腫瘍領域に発熱が生じるか、又は腫瘍がマウスの活動及び摂食に有意に影響し、その場合には動物を安楽死させるべきである。
【0148】
３）動物実験の操作方法
実験動物としてのマウスに対する操作方法は、捕獲、固定、番号付け、麻酔、剃毛、投与、採血、殺処理及び解剖を含み、この実験において使用される番号付け方法は、足指クリップ法、耳標法及び毛色マーキング法を含む。この実験において、使用される麻酔方法は、イソフルランの吸入麻酔及びアベルチン又はペントバルビタールの注射麻酔を含む。剃毛方法は、マウスの局所部位をハサミ又はカミソリで剃毛することを含む。投与方法は、腹腔内注射、尾静脈注射、皮下注射、眼窩静脈叢注射、頭蓋内注射などを含む。採血方法は、眼窩採血、眼球摘出による採血、尾静脈採血などを含む。殺処理方法は、頸部牽引による殺処理、炭酸ガスによる殺処理などを含む。すべての操作は、実験動物の研究及び使用の計画（動物プロトコール）の承認後に実施した。
実験動物としてのマウスに対する操作方法は、捕獲、固定、番号付け、麻酔、剃毛、投与、採血、殺処理及び解剖を含み、この実験において使用される番号付け方法は、足指クリップ法、耳標法及び毛色マーキング法を含む。この実験において、使用される麻酔方法は、イソフルランの吸入麻酔及びアベルチン又はペントバルビタールの注射麻酔を含む。剃毛方法は、マウスの局所部位をハサミ又はカミソリで剃毛することを含む。投与方法は、腹腔内注射、尾静脈注射、皮下注射、眼窩静脈叢注射、頭蓋内注射などを含む。採血方法は、眼窩採血、眼球摘出による採血、尾静脈採血などを含む。殺処理方法は、頸部牽引による殺処理、炭酸ガスによる殺処理などを含む。すべての操作は、実験動物の研究及び使用の計画（動物プロトコール）の承認後に実施した。
【0149】
４）腫瘍増殖のモニタリング手段
この実験は、主として２つの方法で腫瘍増殖を検出する。第１のものはｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング法であり、ルシフェラーゼ遺伝子を有する腫瘍細胞をコロニー形成のために動物に注入した。マウスにルシフェリンカリウム塩溶液を腹腔内注射して、基質が酵素の作用下で放射する特定の波長の光を、体内の腫瘍細胞の蛍光シグナルを、生体イメージング機器に装着された敏感なＣＣＤ装置で検出した。さらに、専用ソフトウェアを使用して、蛍光シグナルを定量的に分析し、熱画像を描出して、腫瘍の増殖を直感的且つ定量的に反映させることもできる。第２の方法は皮下腫瘍のサイズを測定することであり、各腫瘍の長さ、幅及び高さをノギスにより測定し、各体積値を特別な計算式によって明らかにする。一般的な計算式は、体積＝長さ×幅×高さ、体積＝３×長さ×幅×高さなどである。
この実験は、主として２つの方法で腫瘍増殖を検出する。第１のものはｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング法であり、ルシフェラーゼ遺伝子を有する腫瘍細胞をコロニー形成のために動物に注入した。マウスにルシフェリンカリウム塩溶液を腹腔内注射して、基質が酵素の作用下で放射する特定の波長の光を、体内の腫瘍細胞の蛍光シグナルを、生体イメージング機器に装着された敏感なＣＣＤ装置で検出した。さらに、専用ソフトウェアを使用して、蛍光シグナルを定量的に分析し、熱画像を描出して、腫瘍の増殖を直感的且つ定量的に反映させることもできる。第２の方法は皮下腫瘍のサイズを測定することであり、各腫瘍の長さ、幅及び高さをノギスにより測定し、各体積値を特別な計算式によって明らかにする。一般的な計算式は、体積＝長さ×幅×高さ、体積＝３×長さ×幅×高さなどである。
【0150】
５）動物におけるＴ細胞の生存及び増殖の検出方法
体内でのＴ細胞の生存性及び増殖条件は、Ｔ細胞の最終的な抗腫瘍効果に直接関連する。動物におけるＴ細胞の生存性及び増殖条件を検出するために、この実験ではマウスから定期的に血液を採取し、末梢血中のＳＴＡＲ－Ｔ細胞の比率、細胞状態及び細胞分類を分析した。具体的な操作は以下の通りである：約１週間毎にマウスをイソフルランで麻酔し、約１００μｌの量で眼窩血の採取を行った。血液試料を抗凝固、血漿採取、赤血球溶解などに供した後に、残りの細胞をフロー染色に供し、ＣＤ４／ＣＤ８比、及びＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３などの分子を検出して、Ｔ細胞サブセットの分析及び細胞状態の分析を行った。一方、フローサイトメーター及びデジタルＰＣＲによる計数法により、各マウスの末梢血中のＳＴＡＲ－Ｔ細胞の絶対量値を求めた。さらに、実験の最後にマウスを解剖して、マウスの他の免疫器官におけるＴ細胞の比率を検出した。
体内でのＴ細胞の生存性及び増殖条件は、Ｔ細胞の最終的な抗腫瘍効果に直接関連する。動物におけるＴ細胞の生存性及び増殖条件を検出するために、この実験ではマウスから定期的に血液を採取し、末梢血中のＳＴＡＲ－Ｔ細胞の比率、細胞状態及び細胞分類を分析した。具体的な操作は以下の通りである：約１週間毎にマウスをイソフルランで麻酔し、約１００μｌの量で眼窩血の採取を行った。血液試料を抗凝固、血漿採取、赤血球溶解などに供した後に、残りの細胞をフロー染色に供し、ＣＤ４／ＣＤ８比、及びＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３などの分子を検出して、Ｔ細胞サブセットの分析及び細胞状態の分析を行った。一方、フローサイトメーター及びデジタルＰＣＲによる計数法により、各マウスの末梢血中のＳＴＡＲ－Ｔ細胞の絶対量値を求めた。さらに、実験の最後にマウスを解剖して、マウスの他の免疫器官におけるＴ細胞の比率を検出した。
【0151】
６）動物におけるＴ細胞の安全性に関する評価方法
ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性及び安全性を評価するために、細胞が実験動物に副作用を起こしたか否かを検出することができる。マウスの行動状態を観察すること、マウスの病理学的分析を実施すること、分析のためにマウスの重要臓器をスライスすること、及び他の様式により、再注入したＴ細胞が有意な細胞毒性を有するか否かを評価することができる。一方、マウスの非腫瘍組織におけるＴ細胞浸潤分析により、Ｔ細胞が非腫瘍組織に対してオフターゲット死滅効果を有するか否かをさらに判定することが可能である。さらに、各マウスの血中サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα又はＩＬ－６など）のレベルを検出することによって、Ｔ細胞が全身性サイトカインストームを引き起こすか否かを判定することができる。
ＳＴＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性及び安全性を評価するために、細胞が実験動物に副作用を起こしたか否かを検出することができる。マウスの行動状態を観察すること、マウスの病理学的分析を実施すること、分析のためにマウスの重要臓器をスライスすること、及び他の様式により、再注入したＴ細胞が有意な細胞毒性を有するか否かを評価することができる。一方、マウスの非腫瘍組織におけるＴ細胞浸潤分析により、Ｔ細胞が非腫瘍組織に対してオフターゲット死滅効果を有するか否かをさらに判定することが可能である。さらに、各マウスの血中サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα又はＩＬ－６など）のレベルを検出することによって、Ｔ細胞が全身性サイトカインストームを引き起こすか否かを判定することができる。
【0152】
７）Ｔ細胞の腫瘍浸潤能力の評価方法
Ｔ細胞が腫瘍に浸潤する能力は、固形腫瘍に対処する上で中心となる能力である。Ｔ細胞の浸潤能力を検出するために、腫瘍組織を分離し、消化して、単一細胞を得るために細かく粉砕し、腫瘍組織中のＴ細胞の割合をフロー染色により検出した。一方、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞及び免疫細胞を、密度勾配遠心法（Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配及びＦｉｃｏｌｌ勾配など）によって腫瘍懸濁液からさらに分離して、精製された腫瘍浸潤Ｔ細胞を得た；精製された腫瘍浸潤Ｔ細胞の特性（ケモカイン受容体発現及びＴ細胞消耗度を含む）を、シークエンシング法などを使用することによって詳細に分析した。
Ｔ細胞が腫瘍に浸潤する能力は、固形腫瘍に対処する上で中心となる能力である。Ｔ細胞の浸潤能力を検出するために、腫瘍組織を分離し、消化して、単一細胞を得るために細かく粉砕し、腫瘍組織中のＴ細胞の割合をフロー染色により検出した。一方、腫瘍細胞、腫瘍間質細胞及び免疫細胞を、密度勾配遠心法（Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配及びＦｉｃｏｌｌ勾配など）によって腫瘍懸濁液からさらに分離して、精製された腫瘍浸潤Ｔ細胞を得た；精製された腫瘍浸潤Ｔ細胞の特性（ケモカイン受容体発現及びＴ細胞消耗度を含む）を、シークエンシング法などを使用することによって詳細に分析した。
【0153】
実施例１０．抗ＥＧＦＲ ＳＴＡＲ受容体の構築及び定常領域の改変の同定
１０．１．抗ＥＧＦＲ ＳＴＡＲ受容体の構築
（１）ＥＧＦＲを標的とする抗体の配列に関する決定
抗体重鎖可変領域（抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＨ、配列番号２２）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＬ、配列番号２３）により、センツキシマブ（略してＣｅｔｕｘ）が選択された。コドンを最適化して配列を合成した。
１０．１．抗ＥＧＦＲ ＳＴＡＲ受容体の構築
（１）ＥＧＦＲを標的とする抗体の配列に関する決定
抗体重鎖可変領域（抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＨ、配列番号２２）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＬ、配列番号２３）により、センツキシマブ（略してＣｅｔｕｘ）が選択された。コドンを最適化して配列を合成した。
【0154】
（２）ＥＧＦＲを標的とするＳＴＡＲの設計
ＳＴＡＲは２つのポリペプチド鎖を含有した；抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＬをマウスＴＣＲｂＣ－ＷＴ鎖に融合させて、第１のポリペプチド断片を形成させた；抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＨをマウスＴＣＲａＣ－ＷＴ鎖に融合させて、第２のポリペプチド断片を形成させた。この２つの鎖には両方ともＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチドを使用した。このＳＴＡＲの遺伝子配列は、フューリン－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位でポリペプチドセグメントを介して連結された；２本のポリペプチド鎖は共に転写され、翻訳され、タンパク質として発現されると考えられる；続いてこのタンパク質はフューリン及びｐ２Ａに対応するプロテアーゼによって切断されて、２つの独立したタンパク質鎖を形成する。Ｔ細胞の２つのタンパク質鎖及び内因性ＣＤ３サブユニット（ε、δ、γ、ζ）は複合体を形成し、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチドの誘導下でこの複合体は細胞膜に移行して提示された（図１に示す通り）。
ＳＴＡＲは２つのポリペプチド鎖を含有した；抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＬをマウスＴＣＲｂＣ－ＷＴ鎖に融合させて、第１のポリペプチド断片を形成させた；抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＨをマウスＴＣＲａＣ－ＷＴ鎖に融合させて、第２のポリペプチド断片を形成させた。この２つの鎖には両方ともＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチドを使用した。このＳＴＡＲの遺伝子配列は、フューリン－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位でポリペプチドセグメントを介して連結された；２本のポリペプチド鎖は共に転写され、翻訳され、タンパク質として発現されると考えられる；続いてこのタンパク質はフューリン及びｐ２Ａに対応するプロテアーゼによって切断されて、２つの独立したタンパク質鎖を形成する。Ｔ細胞の２つのタンパク質鎖及び内因性ＣＤ３サブユニット（ε、δ、γ、ζ）は複合体を形成し、ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチドの誘導下でこの複合体は細胞膜に移行して提示された（図１に示す通り）。
【0155】
（３）遺伝子断片のクローニング及び集合
遺伝子合成及びクローニングの様式を通して、４つの断片「抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＬ」、「マウスＴＣＲｂＣ－ＷＴ」、「抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＨ」及び「マウスＴＣＲａＣ－ＷＴ」が得られた。各プライマー対は、前方及び次の塩基に相同な２５ｂｐ塩基を有していた；４つの断片をＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によってさらに組み換えて、レンチウイルスベクターｐＨＡＧＥに連結させ、それによってＳＴＡＲが得られた。
遺伝子合成及びクローニングの様式を通して、４つの断片「抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＬ」、「マウスＴＣＲｂＣ－ＷＴ」、「抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＨ」及び「マウスＴＣＲａＣ－ＷＴ」が得られた。各プライマー対は、前方及び次の塩基に相同な２５ｂｐ塩基を有していた；４つの断片をＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によってさらに組み換えて、レンチウイルスベクターｐＨＡＧＥに連結させ、それによってＳＴＡＲが得られた。
【0156】
（４）ベクターの形質転換及び配列決定
Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙの産物をＤＨ５α株に形質転換導入し、アンピシリンを含有するＬＢプレート上で一晩増殖させた。モノクローナル細菌を配列決定のために選択し、配列決定用プライマーにはｐＨＡＧＥベクター上のｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｆ及びｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｒプライマーを選択した。
Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙの産物をＤＨ５α株に形質転換導入し、アンピシリンを含有するＬＢプレート上で一晩増殖させた。モノクローナル細菌を配列決定のために選択し、配列決定用プライマーにはｐＨＡＧＥベクター上のｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｆ及びｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｒプライマーを選択した。
【0157】
（５）プラスミド抽出
正しいことが配列決定された細菌をＬＢ液体培地に接種して一晩培養した。プラスミドの抽出には、エンドトキシン除去機能を有するキットを使用した。プラスミドの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定したところ、プラスミドの最終濃度は約１０００ｎｇ／ｕｌであり、Ａ２６０／Ａ２８０値は１．８よりも大きかった。このようにして、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴの定常領域を有し、ＥＧＦＲを標的とする、ＳＴＡＲプラスミドｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－Ｃｅｔｕｘ－ＶＬ－ＴＣＲａＣ－Ｐ２Ａ－ＶＨ－ＴＣＲｂＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰが得られた。
正しいことが配列決定された細菌をＬＢ液体培地に接種して一晩培養した。プラスミドの抽出には、エンドトキシン除去機能を有するキットを使用した。プラスミドの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定したところ、プラスミドの最終濃度は約１０００ｎｇ／ｕｌであり、Ａ２６０／Ａ２８０値は１．８よりも大きかった。このようにして、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴの定常領域を有し、ＥＧＦＲを標的とする、ＳＴＡＲプラスミドｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－Ｃｅｔｕｘ－ＶＬ－ＴＣＲａＣ－Ｐ２Ａ－ＶＨ－ＴＣＲｂＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰが得られた。
【0158】
同様に、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ（ＴＣＲａＣ－Ｎ．ＤＬＴ及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴを含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃ．ＤＬＴ（ＴＣＲａＣ－Ｃ．ＤＬＴ及びＴＣＲｂＣ－ＣＤＬＴを含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１を含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２を含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３を含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４（ＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４を含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ（ＴＣＲａＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃを含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓを含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９（ＴＣＲａＣ－ＴＭ９及びＴＣＲｂＣ－ＷＴを含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１を含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１を含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９（ＴＣＲａＣ－ Ｃｙｓ－ＴＭ９及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓを含有する）、ＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１（ＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１及びＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１を含有する）である定常領域を有する、様々なプラスミドｐＨＡＧＥ－ＥＦ１Ａ－Ｃｅｔｕｘ－ＶＬ－ＴＣＲａＣ－Ｐ２Ａ－ＶＨ－ＴＣＲｂＣ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰを構築した。
【0159】
上記のプラスミドをウイルスにパッケージングし、細胞をウイルスに感染させて、ＳＴＡＲの膜形成効率を検出した。結果を図６に示す。
１０．２．抗ＥＧＦＲ ＳＴＡＲ受容体の定常領域のＮ末端改変及び再編成変異体の機能
１）ＳＴＡＲの定常領域のＮ末端の特定の配列を欠失させて、ＳＴＡＲの機能を失わせた。
１０．２．抗ＥＧＦＲ ＳＴＡＲ受容体の定常領域のＮ末端改変及び再編成変異体の機能
１）ＳＴＡＲの定常領域のＮ末端の特定の配列を欠失させて、ＳＴＡＲの機能を失わせた。
【0160】
ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ ＳＴＡＲ及びマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用することによってウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとの比は３：２：１であった；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿におけるプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３であり、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ ＳＴＡＲのウイルスパッケージング効率がマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲのものよりも優れることが示されている。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞を同じＭＯＩ（感染多重度）に供したところ、感染効率に有意差がないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ＤＬＴの膜を形成することができないことが見出された。標的細胞Ａ４３１、Ｂ１６－ｔＥＧＦＲ、Ａ５４９との共培養から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ＤＬＴは死滅能力を有しておらず、ＥＧＦＲ抗原による刺激後にサイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα、及びＩＦＮγを分泌しないことが見出された。
【0161】
２）ＳＴＡＲの定常領域のＣ末端の再編成により、ＳＴＡＲの機能が失われた。
ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃ．ＤＬＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比を３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿におけるプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３であり、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞を感染した；初代Ｔ細胞におけるウエスタンブロット法、ＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃ．ＤＬＴはタンパク質発現を有するが、膜形成を受けないことが見出された；このことは、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃ．ＤＬＴから欠失した配列がＳＴＡＲの機能にとって鍵であり、ＳＴＡＲの再編成はランダムではないことを物語る。
ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃ．ＤＬＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比を３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿におけるプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３であり、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞を感染した；初代Ｔ細胞におけるウエスタンブロット法、ＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃ．ＤＬＴはタンパク質発現を有するが、膜形成を受けないことが見出された；このことは、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃ．ＤＬＴから欠失した配列がＳＴＡＲの機能にとって鍵であり、ＳＴＡＲの再編成はランダムではないことを物語る。
【0162】
３）ＳＴＡＲの定常領域のＮ末端の再編成は極めて重要な役割を果たした。
ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１ ＳＴＡＲ、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２ ＳＴＡＲ、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３ ＳＴＡＲ、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４ ＳＴＡＲ、及びマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比を３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲと比較して、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１は内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が低いことが見出された。標的細胞Ａ４３１、Ｂ１６－ｔＥＧＦＲ及びＡ５４９との共培養から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１は、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。配列分析では、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１が、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも配列のヒト起源においてより高度であることが示されている。免疫原性予測分析では、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ＲｅｃがマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも免疫原性が低いことが示されている。一方、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２ ＳＴＡＲ、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３ ＳＴＡＲ及びマウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４ ＳＴＡＲの欠失は、ＳＴＡＲの機能を失わせた。
４）ＳＴＡＲの定常領域のＮ末端の再編成は配列特異性を有し、他の再編成様式は無効である。
ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１ ＳＴＡＲ、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２ ＳＴＡＲ、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３ ＳＴＡＲ、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４ ＳＴＡＲ、及びマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比を３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲと比較して、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１は内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が低いことが見出された。標的細胞Ａ４３１、Ｂ１６－ｔＥＧＦＲ及びＡ５４９との共培養から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１は、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。配列分析では、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１が、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも配列のヒト起源においてより高度であることが示されている。免疫原性予測分析では、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ＲｅｃがマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも免疫原性が低いことが示されている。一方、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２ ＳＴＡＲ、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３ ＳＴＡＲ及びマウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４ ＳＴＡＲの欠失は、ＳＴＡＲの機能を失わせた。
４）ＳＴＡＲの定常領域のＮ末端の再編成は配列特異性を有し、他の再編成様式は無効である。
【0163】
ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１ ＳＴＡＲ及びマウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比を３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示された。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１と比較して、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃは有意に増加したミスマッチ比を有することが見出された。標的細胞Ａ４３１、Ｂ１６－ｔＥＧＦＲ及びＡ５４９との共培養から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃの死滅機能はほぼ失われており、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ ＳＴＡＲＴの機能よりもはるかに不良であることが見出された。
【0164】
１０．３．抗ＥＧＦＲ ＳＴＡＲ受容体のシステイン点変異の変異体の機能
ＳＴＡＲ受容体にシステイン点変異がある場合には、追加のジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ ＳＴＡＲ及びマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドをｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比を３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴと比較して、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓは内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞Ａ４３１、Ｂ１６－ｔＥＧＦＲ及びＡ５４９との共培養から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＣｙｓはマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓは、ＥＧＦＲ抗原による刺激後のサイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα、ＩＦＮγの分泌レベルがより高かった。
ＳＴＡＲ受容体にシステイン点変異がある場合には、追加のジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓ ＳＴＡＲ及びマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドをｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比を３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴと比較して、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓは内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞Ａ４３１、Ｂ１６－ｔＥＧＦＲ及びＡ５４９との共培養から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＣｙｓはマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓは、ＥＧＦＲ抗原による刺激後のサイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα、ＩＦＮγの分泌レベルがより高かった。
【0165】
１０．４．抗ＥＧＦＲ ＳＴＡＲ受容体の膜貫通領域の特定部位での疎水性アミノ酸置換を実施する機能
ＳＴＡＲ受容体の膜貫通領域の特定部位での疎水性アミノ酸置換は、重要な役割を果たす。ＳＴＡＲ受容体にシステイン点変異がある場合には、追加的なジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９ ＳＴＡＲ及びマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴと比較して、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９は内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞Ａ４３１、Ｂ１６－ｔＥＧＦＲ及びＡ５４９との共培養から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９は、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓは、ＥＧＦＲ抗原による刺激後のサイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα、及びＩＦＮγの分泌レベルがより高かった。
ＳＴＡＲ受容体の膜貫通領域の特定部位での疎水性アミノ酸置換は、重要な役割を果たす。ＳＴＡＲ受容体にシステイン点変異がある場合には、追加的なジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９ ＳＴＡＲ及びマウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴと比較して、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９は内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞Ａ４３１、Ｂ１６－ｔＥＧＦＲ及びＡ５４９との共培養から、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＴＭ９は、マウスＴＣＲａ／ｂＣ－ＷＴよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。マウスＴＣＲａ／ｂＣ－Ｃｙｓは、ＥＧＦＲ抗原による刺激後のサイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα、及びＩＦＮγの分泌レベルがより高かった。
【0166】
１０．５．抗ＥＧＦＲ ＳＴＡＲの包括的変異体の機能
定常領域の改変戦略（Ｎ末端改変、Ｃｙｓ置換、膜貫通領域の疎水性改変）の３つの組合せ、対での組合せ、及び単一改変の効果を比較するために、ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、下表のすべてのＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、Ｔ細胞を同じＭＯＩで感染させた後に、感染効率（すなわち、ＲＦＰ陽性率）に有意差はないことが見出された。ＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ抗体染色から、対の変異組合せのミスマッチ比は単一変異戦略のものよりも有意に低いことが見出された。同じＲＦＰ陽性細胞の場合に、標的細胞Ａ４３１、Ｂ１６－ｈｔＥＧＦＲ及びＡ５４９に対する、対の変異におけるＳＴＡＲ－Ｔ細胞の死滅能力は単一変異戦略のものよりも有意に高かった；サイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα、ＩＦＮγの分泌レベルはさらに高い。しかし、３つの変異戦略を同時に組み合わせた場合には、最も低いミスマッチ比、同時での標的細胞に対するより強い死滅能力、及びサイトカインのより高い分泌レベルが示されている。全体の結果を図６に示す。
定常領域の改変戦略（Ｎ末端改変、Ｃｙｓ置換、膜貫通領域の疎水性改変）の３つの組合せ、対での組合せ、及び単一改変の効果を比較するために、ｐｈｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、下表のすべてのＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、Ｔ細胞を同じＭＯＩで感染させた後に、感染効率（すなわち、ＲＦＰ陽性率）に有意差はないことが見出された。ＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ抗体染色から、対の変異組合せのミスマッチ比は単一変異戦略のものよりも有意に低いことが見出された。同じＲＦＰ陽性細胞の場合に、標的細胞Ａ４３１、Ｂ１６－ｈｔＥＧＦＲ及びＡ５４９に対する、対の変異におけるＳＴＡＲ－Ｔ細胞の死滅能力は単一変異戦略のものよりも有意に高かった；サイトカインＩＬ－２、ＴＮＦα、ＩＦＮγの分泌レベルはさらに高い。しかし、３つの変異戦略を同時に組み合わせた場合には、最も低いミスマッチ比、同時での標的細胞に対するより強い死滅能力、及びサイトカインのより高い分泌レベルが示されている。全体の結果を図６に示す。
【表4】
【0167】
実施例１１．抗ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ受容体の定常領域でのＮ末端改変、及び再編成変異体の機能
実施形態１における変異戦略に基づき、本発明は、定常領域の配列切詰め、再編成及びＣ末端再編成などの最適化ソリューションを実施した。ＧＰＣ３については、抗体配列はＧＰＣ３を目標とするモノクローナル抗体ＧＣ３３を選択した；抗体重鎖可変領域（抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３－ＶＨ、配列番号２５）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３－ＶＬ、配列番号２４）にｐｈａｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用した；Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃ．ＤＬＴ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲなどのベクターを組み換えて構築した。Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドをｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果を図７に示す。
１）ＳＴＡＲの定常領域のＮ末端での特定の配列の切詰めは、ＳＴＡＲの機能を失わせた。
実施形態１における変異戦略に基づき、本発明は、定常領域の配列切詰め、再編成及びＣ末端再編成などの最適化ソリューションを実施した。ＧＰＣ３については、抗体配列はＧＰＣ３を目標とするモノクローナル抗体ＧＣ３３を選択した；抗体重鎖可変領域（抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３－ＶＨ、配列番号２５）及び抗体軽鎖可変領域（抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３－ＶＬ、配列番号２４）にｐｈａｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用した；Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃ．ＤＬＴ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲなどのベクターを組み換えて構築した。Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドをｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果を図７に示す。
１）ＳＴＡＲの定常領域のＮ末端での特定の配列の切詰めは、ＳＴＡＲの機能を失わせた。
【0168】
結果は、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ ＳＴＡＲ及びマウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲを示す。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞を同じＭＯＩに供したところ、感染効率に有意差がないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＧＰＣ３－ＦＩＴＣ染色から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴの膜は形成されないことが見出された。標的細胞Ｈｕｈ－７とＨｅｐＧ２細胞との共培養から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴは死滅能力を有していないことが見出された。
【0169】
２）ＳＴＡＲの定常領域のＣ末端の再編成により、ＳＴＡＲの機能が失われた。
Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞を感染させた；初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＧＰＣ３－ＦＩＴＣ染色から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃ．ＤＬＴは膜形成を受けることができないことが見出された；このことは、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃ．ＤＬＴから欠失した配列がＳＴＡＲの機能にとって鍵であり、ＳＴＡＲの再編成はランダムではなかったことを物語っていた。標的細胞Ｈｕｈ－７とＨｅｐＧ２細胞との共培養から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃ．ＤＬＴは死滅機能を有していないことが見出された。
Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞を感染させた；初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＧＰＣ３－ＦＩＴＣ染色から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃ．ＤＬＴは膜形成を受けることができないことが見出された；このことは、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃ．ＤＬＴから欠失した配列がＳＴＡＲの機能にとって鍵であり、ＳＴＡＲの再編成はランダムではなかったことを物語っていた。標的細胞Ｈｕｈ－７とＨｅｐＧ２細胞との共培養から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃ．ＤＬＴは死滅機能を有していないことが見出された。
【0170】
３）ＳＴＡＲの定常領域のＮ末端の再編成は極めて重要な役割を果たした。
Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１と比較して、内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が低いことが見出された。標的細胞Ｈｕｈ－７とＨｅｐＧ２細胞との共培養から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１は、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。配列分析により、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１が、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも配列のヒト起源においてより高度であることが示されている。免疫原性予測分析からは、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃが、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも免疫原性が低いことが示されている。一方、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３ ＳＴＡＲ及びマウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４ ＳＴＡＲの欠失は、ＳＴＡＲの機能を失わせた。
Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１と比較して、内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が低いことが見出された。標的細胞Ｈｕｈ－７とＨｅｐＧ２細胞との共培養から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１は、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。配列分析により、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１が、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも配列のヒト起源においてより高度であることが示されている。免疫原性予測分析からは、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃが、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲよりも免疫原性が低いことが示されている。一方、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－２ ＳＴＡＲ、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３ ＳＴＡＲ及びマウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４ ＳＴＡＲの欠失は、ＳＴＡＲの機能を失わせた。
【0171】
４）ＳＴＡＲの定常領域のＮ末端の再編成は配列特異性を有し、他の再編成様式は無効である。
初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１と比較して、ＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ、ＧＣ３３ ｓｃＦｖは膜形成を受けることができないことが見出された。標的細胞Ｈｕｈ－７とＨｅｐＧ２細胞との共培養から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃの死滅機能は失われており、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ ＳＴＡＲＴの機能よりもはるかに不良であることが見出された。
初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＥＧＦＲ－ｈｉｓ－ＡＰＣ染色から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－１と比較して、ＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ、ＧＣ３３ ｓｃＦｖは膜形成を受けることができないことが見出された。標的細胞Ｈｕｈ－７とＨｅｐＧ２細胞との共培養から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃの死滅機能は失われており、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ ＳＴＡＲＴの機能よりもはるかに不良であることが見出された。
【0172】
実施例１２．抗ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ受容体のシステイン点変異の変異体の機能
ＳＴＡＲ受容体にシステイン点変異がある場合には、追加のジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。ｐｈａｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ ＳＴＡＲ及びマウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＧＰＣ３－ＦＩＴＣ染色から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴと比較して、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓは、内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞Ｈｕｈ－７とＨｅｐＧ２細胞との共培養から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓは、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。
ＳＴＡＲ受容体にシステイン点変異がある場合には、追加のジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。ｐｈａｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ ＳＴＡＲ及びマウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＧＰＣ３－ＦＩＴＣ染色から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴと比較して、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓは、内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞Ｈｕｈ－７とＨｅｐＧ２細胞との共培養から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓは、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。
【0173】
実施例１３．抗ＧＰＣ３ ＳＴＡＲ受容体の膜貫通領域の特定部位での疎水性アミノ酸置換を実施する機能
ＳＴＡＲ受容体の膜貫通領域の特定部位での疎水性アミノ酸置換は、重要な役割を果たす。ＳＴＡＲ受容体にシステイン点変異がある場合には、追加的なジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。ｐｈａｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＴＭ９ ＳＴＡＲ及びマウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＧＰＣ３－ＦＩＴＣタンパク質染色から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴと比較して、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＴＭ９は内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞Ｈｕｈ－７とＨｅｐＧ２細胞との共培養から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＴＭ９は、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。
ＳＴＡＲ受容体の膜貫通領域の特定部位での疎水性アミノ酸置換は、重要な役割を果たす。ＳＴＡＲ受容体にシステイン点変異がある場合には、追加的なジスルフィド結合が付加されて、複合体のマッチングを高めて安定化する効果を発揮することができる。ｐｈａｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＴＭ９ ＳＴＡＲ及びマウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴ ＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。結果は、ウイルス力価に明らかな差はないことが示されている。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、感染効率に有意差はないことが見出された。初代Ｔ細胞におけるＲＦＰ及びＧＰＣ３－ＦＩＴＣタンパク質染色から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴと比較して、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＴＭ９は内因性ＴＣＲとのミスマッチの点でミスマッチ比が有意に低下していることが見出された。標的細胞Ｈｕｈ－７とＨｅｐＧ２細胞との共培養から、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＴＭ９は、マウスＧＣ３３－ＶＨ ＴＣＲａ－ＧＣ３３－ＶＬ ＴＣＲｂＣ－ＷＴよりも強い標的細胞死滅能力を有することが見出された。
【0174】
実施例１４．抗ＧＰＣ３ ＳＴＡＲの包括的変異体の機能
改変戦略の３つの組合せ、対での組合せ、及び単一改変の効果を比較するために、ｐｈａｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、以下の表のすべてのＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、Ｔ細胞を同じＭＯＩで感染させた後に、感染効率（すなわち、ＲＦＰ陽性率）に有意差はないことが見出された。ＲＦＰ及びＧＰＣ３－ＦＩＴＣタンパク質染色から、対の変異組合せの膜形成効率は、単一変異戦略のものよりも有意に高いことが見出された。同じＲＦＰ陽性細胞の場合に、標的細胞Ｈｕｈ－７及びＨｅｐＧ２細胞に対する、対の変異におけるＳＴＡＲ－Ｔ細胞の死滅能力は単一変異戦略のものよりも有意に高かった；しかし、３つの変異戦略を同時に組み合わせた場合には、最も低いミスマッチ率、同時での標的細胞に対するより強い死滅能力、及びサイトカインのより高い分泌レベルが示された。具体的な結果を図７に示す。
改変戦略の３つの組合せ、対での組合せ、及び単一改変の効果を比較するために、ｐｈａｇｅ－ＥＦ１Ａ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターを使用することによって、Ｇｉｂｓｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、以下の表のすべてのＳＴＡＲベクターを組み換えて構築した；Ｌｅｎｔｉｘ－２９３Ｔ細胞を使用してウイルスをパッケージングし、パッケージングプラスミドはｐＳＰＡＸ及びＰＭＤ２．Ｇとし、トランスファープラスミドとｐＳＰＡＸとＰＭＤ２．Ｇとのパッケージング比は３：２：１とした；１０ｃｍ培養皿のそれぞれに合計１８μｇのプラスミドが存在し、各培養皿のプラスミドとＰＥＩ－ＭＡＸとの比は１：３とし、すなわち５４μＬのＰＥＩを使用した；トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、４８時間後及び７２時間後にウイルス溶液を回収した；２００００ｒｐｍ、４℃で２時間の遠心分離の後、再懸濁のために無血清培地を使用した；ウイルスを１００倍に濃縮して、ウイルス力価を検出した。Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５及び初代Ｔ細胞の感染から、Ｔ細胞を同じＭＯＩで感染させた後に、感染効率（すなわち、ＲＦＰ陽性率）に有意差はないことが見出された。ＲＦＰ及びＧＰＣ３－ＦＩＴＣタンパク質染色から、対の変異組合せの膜形成効率は、単一変異戦略のものよりも有意に高いことが見出された。同じＲＦＰ陽性細胞の場合に、標的細胞Ｈｕｈ－７及びＨｅｐＧ２細胞に対する、対の変異におけるＳＴＡＲ－Ｔ細胞の死滅能力は単一変異戦略のものよりも有意に高かった；しかし、３つの変異戦略を同時に組み合わせた場合には、最も低いミスマッチ率、同時での標的細胞に対するより強い死滅能力、及びサイトカインのより高い分泌レベルが示された。具体的な結果を図７に示す。
【0175】
ＧＰＣ３ ＧＣ３３ ＳＴＡＲ変異体を目標とする戦略を比較した。
【表5】
【0176】
実施例１５．３３４－ｓｃＦｖをベースとする抗ＣＤ１９ ＳＴＡＲの包括的変異体の機能
本発明者は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７０９５の保存番号を有するハイブリドーマ細胞（２０１９年１月２１日に、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｄｒｅｓｓ ｏｆ Ｎｏ．３，Ｃｏｕｒｔｙａｒｄ Ｎｏ．１，Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｏａｄ，Ｃｈａｏｙａｎｇ ｄｉｓｔｒｉｃｔ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇに保存）から産生された、ＣＤ１９を標的とする新規なモノクローナル抗体３３４を入手している。この抗体は、抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬ（配列番号２７）及び抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨ（配列番号２６）を含有し、抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨは、配列番号２８として示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９として示される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０として示される重鎖ＣＤＲ３を含有する。抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬは、配列番号３１として示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２として示される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３として示される軽鎖ＣＤＲ３を含有する。
本発明者は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７０９５の保存番号を有するハイブリドーマ細胞（２０１９年１月２１日に、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｄｒｅｓｓ ｏｆ Ｎｏ．３，Ｃｏｕｒｔｙａｒｄ Ｎｏ．１，Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｏａｄ，Ｃｈａｏｙａｎｇ ｄｉｓｔｒｉｃｔ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇに保存）から産生された、ＣＤ１９を標的とする新規なモノクローナル抗体３３４を入手している。この抗体は、抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬ（配列番号２７）及び抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨ（配列番号２６）を含有し、抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨは、配列番号２８として示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９として示される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０として示される重鎖ＣＤＲ３を含有する。抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬは、配列番号３１として示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２として示される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３として示される軽鎖ＣＤＲ３を含有する。
【0177】
１）抗体３３４によるＣＤ１９の特異的認識
ＥＬＩＳＡ法を使用することによって、標的抗原ＣＤ１９及び非標的抗原ＣＤ２０に対する抗体３３４の認識能力を同定した；トランスフェクション試薬ＰＥＩを使用することによって、抗体３３４を発現するプラスミドを２９３Ｔ細胞に形質転換導入した；７２時間後に細胞上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法を使用することによって抗原－抗体の特異的結合能力を検出した。実験結果から、抗体３３４が標的抗原ＣＤ１９に有意に特異的に結合し、非標的抗原ＣＤ２０に対する結合能力を有していないことが示されている。
ＥＬＩＳＡ法を使用することによって、標的抗原ＣＤ１９及び非標的抗原ＣＤ２０に対する抗体３３４の認識能力を同定した；トランスフェクション試薬ＰＥＩを使用することによって、抗体３３４を発現するプラスミドを２９３Ｔ細胞に形質転換導入した；７２時間後に細胞上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法を使用することによって抗原－抗体の特異的結合能力を検出した。実験結果から、抗体３３４が標的抗原ＣＤ１９に有意に特異的に結合し、非標的抗原ＣＤ２０に対する結合能力を有していないことが示されている。
【0178】
ＣＤ１９－３３４抗体がヒト細胞によって発現される抗原ＣＤ１９を特異的に認識し得ることを確認するために、ＷＢ試験を使用して、ヒト化ＣＤ１９抗体に対するＣＤ１９－３３４抗体の認識能力を検出した。
【0179】
２）ＣＤ１９陽性タンパク質試料の調製
ヒトリンパ腫細胞株においてＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗体に関して高度の陽性発現）を通常通りに培養した；９０％の細胞が融合した後に、６ｃｍ培養皿の懸濁細胞を採取して遠心分離を行い、細胞沈殿物を１．５ｍＬの遠心管に収集した。２００μＬの総タンパク質抽出溶解試薬（ＲＩＰＡ）を添加して十分に撹拌して均一に混合した後、氷上で１５分間溶解を行わせた。４℃に予冷した低温冷却遠心機に遠心管を入れて、４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集した。５×ローディング緩衝液を添加して、１００℃で５分間タンパク質を変性させた。試料を氷上で２０分間予冷した後に遠心分離に供し、続いてＷＢ電気泳動に供した（ＣＤ１９陰性対照群の細胞としてのヒト直腸がん細胞株Ｍ６２と共に）。
（２）ＷＢ電気泳動：４％スペーサーゲルを調製し、分離ゲルは１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥランニングゲルとした。抽出したＣＤ１９陽性タンパク質試料の４０μＬ及び抽出したＣＤ１９陰性タンパク質試料の４０μＬを各ウェルに添加した。電気泳動は８０Ｖで２０分間実施した。電圧を１２０Ｖに調整し、電気泳動を４０～６０分間行った。
（３）膜転写：半乾燥転写システムを使用して、標的タンパク質を０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に転写させた。膜転写条件は１５Ｖ及び１時間とした。
（４）閉鎖：転写された後のＰＶＤＦ膜を、閉鎖のために５％脱脂乳粉末中に置き、振盪器によって室温で１時間振盪した。
（５）一次抗体のインキュベーション：ＰＶＤＦ膜上の残留粉乳をＰＢＳＴで清浄に洗い流し、残留緩衝液を濾紙を使用することによって吸って乾燥させ、ＰＶＤＦ膜を、ＣＤ１９抗体ハイブリドーマ上清（５～８ｍＬ）を含有する一次抗体インキュベーションボックスに入れた。インキュベーションは４℃で一晩行った。
（６）ＰＢＳＴすすぎ洗い：５分間×３回。
（７）二次抗体のインキュベーション：ＰＶＤＦを、ＨＲＰで標識した抗マウス（１：２００００）モノクローナル抗体の中に入れた。室温で１時間インキュベーションを行った。
（８）ＰＢＳＴすすぎ洗い：５分間×３回。
（９）ゲルイメージャーを使用して現像及び写真撮影を行った。
ヒトリンパ腫細胞株においてＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗体に関して高度の陽性発現）を通常通りに培養した；９０％の細胞が融合した後に、６ｃｍ培養皿の懸濁細胞を採取して遠心分離を行い、細胞沈殿物を１．５ｍＬの遠心管に収集した。２００μＬの総タンパク質抽出溶解試薬（ＲＩＰＡ）を添加して十分に撹拌して均一に混合した後、氷上で１５分間溶解を行わせた。４℃に予冷した低温冷却遠心機に遠心管を入れて、４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集した。５×ローディング緩衝液を添加して、１００℃で５分間タンパク質を変性させた。試料を氷上で２０分間予冷した後に遠心分離に供し、続いてＷＢ電気泳動に供した（ＣＤ１９陰性対照群の細胞としてのヒト直腸がん細胞株Ｍ６２と共に）。
（２）ＷＢ電気泳動：４％スペーサーゲルを調製し、分離ゲルは１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥランニングゲルとした。抽出したＣＤ１９陽性タンパク質試料の４０μＬ及び抽出したＣＤ１９陰性タンパク質試料の４０μＬを各ウェルに添加した。電気泳動は８０Ｖで２０分間実施した。電圧を１２０Ｖに調整し、電気泳動を４０～６０分間行った。
（３）膜転写：半乾燥転写システムを使用して、標的タンパク質を０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に転写させた。膜転写条件は１５Ｖ及び１時間とした。
（４）閉鎖：転写された後のＰＶＤＦ膜を、閉鎖のために５％脱脂乳粉末中に置き、振盪器によって室温で１時間振盪した。
（５）一次抗体のインキュベーション：ＰＶＤＦ膜上の残留粉乳をＰＢＳＴで清浄に洗い流し、残留緩衝液を濾紙を使用することによって吸って乾燥させ、ＰＶＤＦ膜を、ＣＤ１９抗体ハイブリドーマ上清（５～８ｍＬ）を含有する一次抗体インキュベーションボックスに入れた。インキュベーションは４℃で一晩行った。
（６）ＰＢＳＴすすぎ洗い：５分間×３回。
（７）二次抗体のインキュベーション：ＰＶＤＦを、ＨＲＰで標識した抗マウス（１：２００００）モノクローナル抗体の中に入れた。室温で１時間インキュベーションを行った。
（８）ＰＢＳＴすすぎ洗い：５分間×３回。
（９）ゲルイメージャーを使用して現像及び写真撮影を行った。
【0180】
実験結果は、抗体３３４が、ヒトリンパ腫細胞株におけるＲａｊｉ細胞内のＣＤ１９タンパク質（標的バンドのサイズが９５ｋＤ）を認識し得ることを示している。
【0181】
３）抗体３３４のＫｄ値の検出
ヒトリンパ腫細胞株においてＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗体に関して高度の陽性発現）を通常通りに培養した；９０％の細胞が融合した後に、６ｃｍ培養皿の懸濁細胞を採取して遠心分離を行い、細胞沈殿物を１．５ｍＬ遠心管に収集した；細胞沈殿物をＰＢＳで再懸濁させ、細胞密度を５×１０６個／ｍＬに調整した。
ヒトリンパ腫細胞株においてＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９抗体に関して高度の陽性発現）を通常通りに培養した；９０％の細胞が融合した後に、６ｃｍ培養皿の懸濁細胞を採取して遠心分離を行い、細胞沈殿物を１．５ｍＬ遠心管に収集した；細胞沈殿物をＰＢＳで再懸濁させ、細胞密度を５×１０６個／ｍＬに調整した。
【0182】
１ウェル当たり５×１０６個のＲａｊｉ細胞を９６ウェルプレートに添加した；抗体３３４を希釈して、３７５ｎＭ、１８７．５ｎＭ、３０ｎＭ、３ｎＭ、０．３ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．００３ｎＭ及び０ｎＭに精製し、９６ウェルプレート中のＲａｊｉ細胞に添加して４℃で３０分間のインキュベーションを行った；続いて、２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を廃棄した；ＰＢＳを添加して細胞を１回洗浄した後に、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５蛍光二次抗体を添加して、Ｒａｊｉ細胞を３０分間インキュベートした。インキュベーションを４℃で３０分間行い、遠心分離を２０００ｒｐｍで５分間行い、上清を廃棄した；ＰＢＳを添加して細胞を１回洗浄した後に、２００μＬのＰＢＳを添加して細胞を再懸濁させた；種々の濃度のＣＤ１９－３３４抗体の下でのＲａｊｉ細胞の蛍光強度を、フローサイトメトリーを使用することによって検出した；ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用することによって計算を行い、ＣＤ１９－３３４抗体のＫｄ値を得た。
【0183】
検出結果は、種々の濃度下でのＲａｊｉ細胞の蛍光強度によってフィッティングされた結合曲線を示す；ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによって算出されたＣＤ１９－３３４抗体のＫｄ値は１．５２８±０．２５ｎＭであった。
【0184】
４）３３４－ｓｃＦｖをベースとする抗ＣＤ１９ ＳＴＡＲの包括的変異体
ｍｙｃ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１－ＴＭ９－ＳＴＡＲ－３３４抗ＣＤ１９ ＳＴＡＲ構造を、ｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターをベースとして構築した。使用した抗体結合配列は抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬ（配列番号２７）及び抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨ（配列番号２６）であり、抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨは、配列番号２８として示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９として示される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０として示される重鎖ＣＤＲ３を含有する。抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬは、配列番号３１として示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２として示される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３として示される軽鎖ＣＤＲ３を含有する。ウイルスを第２世代パッケージングプラスミドによってパッケージングした後に、Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５細胞を感染させた。フローサイトメトリーの結果から、ＳＴＡＲは正常な膜形成に供することができ、標的細胞Ｒａｊｉ及び抗体ＣＤ１９タンパク質に結合することによって、ＣＤ６９及びＣＤ２５などの活性化分子の発現を促進し得ることが見出された。初代Ｔ細胞をウイルスに感染させた後に、Ｔ細胞を標的細胞Ｒａｊｉ、Ｊｅｋｏ－１などと共培養すると、明らかにＴ細胞がＩＬ－２、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮγを分泌するように刺激され、Ｔ細胞を標的細胞を死滅させるように誘導することができる。一方、Ｔ細胞はさらに免疫抑制分子ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３などを発現し、このことはＴ細胞が活性化されて殺細胞機能を発揮することを物語る。Ｒａｊｉ細胞を有するＮＳＧマウスにおいてリンパ腫モデルを樹立した。抗ＣＤ１９ ＳＴＡＲ Ｔ細胞を使用して担がんマウスに作用させた；続いて対照群と比較して、抗ＣＤ１９ ＳＴＡＲ Ｔ細胞は明らかに腫瘍を死滅させる効果を有する可能性がある。結果を図８に示す。
ｍｙｃ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１－ＴＭ９－ＳＴＡＲ－３３４抗ＣＤ１９ ＳＴＡＲ構造を、ｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターをベースとして構築した。使用した抗体結合配列は抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬ（配列番号２７）及び抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨ（配列番号２６）であり、抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨは、配列番号２８として示される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２９として示される重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０として示される重鎖ＣＤＲ３を含有する。抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬは、配列番号３１として示される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２として示される軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３として示される軽鎖ＣＤＲ３を含有する。ウイルスを第２世代パッケージングプラスミドによってパッケージングした後に、Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５細胞を感染させた。フローサイトメトリーの結果から、ＳＴＡＲは正常な膜形成に供することができ、標的細胞Ｒａｊｉ及び抗体ＣＤ１９タンパク質に結合することによって、ＣＤ６９及びＣＤ２５などの活性化分子の発現を促進し得ることが見出された。初代Ｔ細胞をウイルスに感染させた後に、Ｔ細胞を標的細胞Ｒａｊｉ、Ｊｅｋｏ－１などと共培養すると、明らかにＴ細胞がＩＬ－２、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮγを分泌するように刺激され、Ｔ細胞を標的細胞を死滅させるように誘導することができる。一方、Ｔ細胞はさらに免疫抑制分子ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３などを発現し、このことはＴ細胞が活性化されて殺細胞機能を発揮することを物語る。Ｒａｊｉ細胞を有するＮＳＧマウスにおいてリンパ腫モデルを樹立した。抗ＣＤ１９ ＳＴＡＲ Ｔ細胞を使用して担がんマウスに作用させた；続いて対照群と比較して、抗ＣＤ１９ ＳＴＡＲ Ｔ細胞は明らかに腫瘍を死滅させる効果を有する可能性がある。結果を図８に示す。
【0185】
実施例１６．ＣＤ１９－ＣＤ２０に対するＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲの包括的変異体の機能
ＳＴＡＲの構造において、Ｃα及びＣβはｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬに連結させることができ、さらに異なるｓｃＦｖに連結させることができる；したがって、これは二重標的又は単一標的での二重認識部位の態様において可能である。ｍｙｃ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１－ＴＭ９－ＳＴＡＲ－抗ＣＤ１９／ＣＤ２０ ＳＴＡＲ構造をｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターをベースとして構築し、ここで標的にはＣＤ１９に対するＦＭＣ６３モノクローナル抗体（ＦＭＣ６３ ＶＨ、配列番号４４、ＦＭＣ６３ ＶＬ、配列番号４５）及びＣＤ２０に対する２Ｃ６モノクローナル抗体（２Ｃ６ ＶＨ、配列番号４６、２Ｃ６ ＶＬ、配列番号４７）を選択した。ｍｙｃ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１－ＴＭ９－ＳＴＡＲ－ＦＭＣ６３－２Ｃ６構造を構築した；ウイルスを第２世代パッケージングプラスミドによってパッケージングした後に、Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５細胞を感染させた。フローサイトメトリーの結果から、ＳＴＡＲは正常な膜形成に供し得ることが見出された。初代Ｔ細胞をウイルスに感染させた後に、標的細胞Ｒａｊｉ、Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ ＫＯ及びＲａｊｉ－ＣＤ２０ ＫＯをＴ細胞と共培養すると、明らかにＴ細胞がＩＬ－２、ＴＮＦ－α及びＩＦＮγを分泌するように刺激され、Ｔ細胞を標的細胞を死滅させるように誘導することができ、このことは、ＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲが２つの両方の標的に対して良好な死滅能力を有しており、２つの標的のうちの一方の喪失によって引き起こされる腫瘍の再発が臨床的に回避され得ることを物語る。腫瘍担持モデルを、９０％ Ｒａｊｉ＋５％ Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ ＫＯ＋５％ Ｒａｊｉ－ＣＤ２０ ＫＯ細胞を使用して、ＮＳＧマウスにおいて樹立した；ＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲ細胞を使用して担がんマウスに作用させた後に、対照群と比較して、ＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲ細胞は明らかに腫瘍を完全に除去した可能性があり、このことはＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲ細胞が両方の標的に対して死滅作用を有することをさらに証明している。結果を図９に示す。
ＳＴＡＲの構造において、Ｃα及びＣβはｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬに連結させることができ、さらに異なるｓｃＦｖに連結させることができる；したがって、これは二重標的又は単一標的での二重認識部位の態様において可能である。ｍｙｃ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１－ＴＭ９－ＳＴＡＲ－抗ＣＤ１９／ＣＤ２０ ＳＴＡＲ構造をｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターをベースとして構築し、ここで標的にはＣＤ１９に対するＦＭＣ６３モノクローナル抗体（ＦＭＣ６３ ＶＨ、配列番号４４、ＦＭＣ６３ ＶＬ、配列番号４５）及びＣＤ２０に対する２Ｃ６モノクローナル抗体（２Ｃ６ ＶＨ、配列番号４６、２Ｃ６ ＶＬ、配列番号４７）を選択した。ｍｙｃ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１－ＴＭ９－ＳＴＡＲ－ＦＭＣ６３－２Ｃ６構造を構築した；ウイルスを第２世代パッケージングプラスミドによってパッケージングした後に、Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５細胞を感染させた。フローサイトメトリーの結果から、ＳＴＡＲは正常な膜形成に供し得ることが見出された。初代Ｔ細胞をウイルスに感染させた後に、標的細胞Ｒａｊｉ、Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ ＫＯ及びＲａｊｉ－ＣＤ２０ ＫＯをＴ細胞と共培養すると、明らかにＴ細胞がＩＬ－２、ＴＮＦ－α及びＩＦＮγを分泌するように刺激され、Ｔ細胞を標的細胞を死滅させるように誘導することができ、このことは、ＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲが２つの両方の標的に対して良好な死滅能力を有しており、２つの標的のうちの一方の喪失によって引き起こされる腫瘍の再発が臨床的に回避され得ることを物語る。腫瘍担持モデルを、９０％ Ｒａｊｉ＋５％ Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ ＫＯ＋５％ Ｒａｊｉ－ＣＤ２０ ＫＯ細胞を使用して、ＮＳＧマウスにおいて樹立した；ＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲ細胞を使用して担がんマウスに作用させた後に、対照群と比較して、ＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲ細胞は明らかに腫瘍を完全に除去した可能性があり、このことはＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲ細胞が両方の標的に対して死滅作用を有することをさらに証明している。結果を図９に示す。
【0186】
実施例１７．ＣＤ１９－ＣＤ２２に対する３３４－Ｍ９７１ ＳＴＡＲの包括的変異体の機能
ＳＴＡＲの構造において、Ｃα及びＣβはｓｃＦｖのＶＨとＶＬに連結させることができ、さらに異なるｓｃＦｖに連結させることができる；したがって、これは二重標的又は単一標的での二重認識部位の態様において可能である。ｍｙｃ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１－ＴＭ９－ＳＴＡＲ－抗ＣＤ１９／ＣＤ２２ ＳＴＡＲ構造を、ｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターをベースとして構築し、ここで標的にはＣＤ１９に対する３３４モノクローナル抗体（３３４ ＶＨ、配列番号２６、３３４ ＶＬ、配列番号２７）及びＣＤ２２に対するＭ９７１モノクローナル抗体（Ｍ９７１ ＶＨ、配列番号４８、２ Ｍ９７１ ＶＬ、配列番号４９）を選択した。ｍｙｃ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１－ＴＭ９－ＳＴＡＲ－３３４－Ｍ９７１構造を構築した；ウイルスを第２世代パッケージングプラスミドによってパッケージングした後に、Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５細胞を感染させた。フローサイトメトリーの結果から、ＳＴＡＲは正常な膜形成に供し得ることが見出された。初代Ｔ細胞をウイルスに感染させた後に、標的細胞Ｒａｊｉ、Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ ＫＯ及びＲａｊｉ－ＣＤ２２ ＫＯをＴ細胞と共培養すると、Ｔ細胞がＩＬ－２、ＴＮＦ－α及びＩＦＮγを分泌するように明らかに刺激され、Ｔ細胞を標的細胞を死滅させるように誘導することができ、このことは、３３４－Ｍ９７１ ＳＴＡＲが２つの両方の標的に対して良好な死滅能力を有しており、２つの標的のうちの一方の喪失によって引き起こされる腫瘍の再発が臨床的に回避され得ることを物語る。腫瘍担持モデルを、９０％ Ｒａｊｉ＋５％ Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ ＫＯ＋５％ Ｒａｊｉ－ＣＤ２２ ＫＯ細胞を使用してＮＳＧマウスにおいて樹立した；３３４－Ｍ９７１ ＳＴＡＲ細胞を使用して担がんマウスに作用させた後に、対照群と比較して、ＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲ細胞は明らかに腫瘍を完全に除去した可能性があり、このことはＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲ細胞が両方の標的に対して死滅作用を有することをさらに証明している。結果を図１０に示す。
ＳＴＡＲの構造において、Ｃα及びＣβはｓｃＦｖのＶＨとＶＬに連結させることができ、さらに異なるｓｃＦｖに連結させることができる；したがって、これは二重標的又は単一標的での二重認識部位の態様において可能である。ｍｙｃ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１－ＴＭ９－ＳＴＡＲ－抗ＣＤ１９／ＣＤ２２ ＳＴＡＲ構造を、ｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターをベースとして構築し、ここで標的にはＣＤ１９に対する３３４モノクローナル抗体（３３４ ＶＨ、配列番号２６、３３４ ＶＬ、配列番号２７）及びＣＤ２２に対するＭ９７１モノクローナル抗体（Ｍ９７１ ＶＨ、配列番号４８、２ Ｍ９７１ ＶＬ、配列番号４９）を選択した。ｍｙｃ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１－ＴＭ９－ＳＴＡＲ－３３４－Ｍ９７１構造を構築した；ウイルスを第２世代パッケージングプラスミドによってパッケージングした後に、Ｊｕｒｋａｔ Ｃ５細胞を感染させた。フローサイトメトリーの結果から、ＳＴＡＲは正常な膜形成に供し得ることが見出された。初代Ｔ細胞をウイルスに感染させた後に、標的細胞Ｒａｊｉ、Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ ＫＯ及びＲａｊｉ－ＣＤ２２ ＫＯをＴ細胞と共培養すると、Ｔ細胞がＩＬ－２、ＴＮＦ－α及びＩＦＮγを分泌するように明らかに刺激され、Ｔ細胞を標的細胞を死滅させるように誘導することができ、このことは、３３４－Ｍ９７１ ＳＴＡＲが２つの両方の標的に対して良好な死滅能力を有しており、２つの標的のうちの一方の喪失によって引き起こされる腫瘍の再発が臨床的に回避され得ることを物語る。腫瘍担持モデルを、９０％ Ｒａｊｉ＋５％ Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ ＫＯ＋５％ Ｒａｊｉ－ＣＤ２２ ＫＯ細胞を使用してＮＳＧマウスにおいて樹立した；３３４－Ｍ９７１ ＳＴＡＲ細胞を使用して担がんマウスに作用させた後に、対照群と比較して、ＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲ細胞は明らかに腫瘍を完全に除去した可能性があり、このことはＦＭＣ６３－２Ｃ６ ＳＴＡＲ細胞が両方の標的に対して死滅作用を有することをさらに証明している。結果を図１０に示す。
【0187】
配列表
配列番号１ ヒトＴ細胞受容体（ヒトＴＣＲａＣ－ＷＴ）のα鎖の定常領域
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号２ マウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（マウスＴＣＲａＣ－ＷＴ）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号３ マウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域のＮ末端から欠失した配列
DIQNPEPAVYQLKDPRSQ
配列番号４ Ｎ末端改変を含有するマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ｎ．ＤＬＴ）
DSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号５ Ｎ末端改変を含有するマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４）
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号６ システイン置換を含有するヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（ヒトＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ）
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号７ システイン置換を含有するマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号８ 疎水性アミノ酸置換を含有するマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の膜貫通領域
LLVIVLRIL
配列番号９ 疎水性アミノ酸置換を含有するマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（マウスＴＣＲａＣ－ＴＭ９）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号１０ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｍ９
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号１１ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号１２ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号１３ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号１４ ヒトＴ細胞受容体（ヒトＴＣＲｂＣ－ＷＴ）のβ鎖の定常領域
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
配列番号１５ マウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－ＷＴ）
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号１６ マウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域のＮ末端から欠失した配列
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQK
配列番号１７ Ｎ末端欠失を含有するマウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ）
ATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号１８ Ｎ末端改変を含有するマウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－Ｎ－Ｒｅｃ－４）
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号１９ システイン置換を含有するヒトＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（ヒトＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ）
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
配列番号２０ システイン置換を含有するマウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ）
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号２１ Ｎ末端改変及びシステイン置換を含有するマウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ－Ｒｅｃ－１）
PPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号２２ 抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＨ
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKG
配列番号２３ 抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＬ
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVA
配列番号２４ 抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３ ＶＬ
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKR
配列番号２５ 抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３ ＶＨ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS
配列番号２６ 抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨ
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKALGFIFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGAFHPGSGGSAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTFEDSAVYHCTRQLGPDWGQGTLVTVS
配列番号２７ 抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬ
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLESDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCWQGTQFPWTFGGGTKLEIK
配列番号２８ 抗ＣＤ１９ ３３４重鎖ＣＤＲ１
GFIFTDYE
配列番号２９ 抗ＣＤ１９ ３３４重鎖ＣＤＲ２
FHPGSGGS
配列番号３０ 抗ＣＤ１９ ３３４重鎖ＣＤＲ３
TRQLGPD
配列番号３１ 抗ＣＤ１９ ３３４軽鎖ＣＤＲ１
QSLLESDGKTY
配列番号３２ 抗ＣＤ１９ ３３４軽鎖ＣＤＲ２
LVS
配列番号３３ 抗ＣＤ１９ ３３４軽鎖ＣＤＲ３
WQGTQFPWT
配列番号３４ ＴＣＲａＣ－Ｎ・Ｒｅｃ－１
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号３５ ＴＣＲａＣ－Ｎ・Ｒｅｃ－２
VYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号３６ ＴＣＲａＣ－Ｎ・Ｒｅｃ－３
RDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号３７ ＴＣＲｂＣ－Ｎ・Ｒｅｃ－１
PPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号３８ ＴＣＲｂＣ－Ｎ・Ｒｅｃ－２
FEPSEAEISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号３９ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３
EISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号４０ Ｎ末端に１８アミノ酸のランダムな再編成を伴うマウスＴＣＲａＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ
NQSVDPDEQLIPYRKAQPDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号４１ Ｎ末端に２５アミノ酸のランダムな再編成を伴うマウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ
PEKREKSVAPAVKKLNLITFQDSPNATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号４２ マウスＴＣＲのα鎖の定常領域のＣ末端に１５アミノ酸の欠失を伴うマウスＴＣＲａＣ－Ｃ．ＤＬＴ
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLK
配列番号４３ マウスＴＣＲのβ鎖の定常領域のＣ末端に１５アミノ酸の欠失を伴うマウスＴＣＲｂＣ－Ｃ．ＤＬＴ
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVL
配列番号４４ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＨ
AVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSS
配列番号４５ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＬ
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
配列番号４６ 抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＨ
AVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSS
配列番号４７ 抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＬ
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
配列番号４８ 抗ＣＤ２２ Ｍ９７１ ＶＨ
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号４９ 抗ＣＤ２２ Ｍ９７１ ＶＬ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK
配列番号１ ヒトＴ細胞受容体（ヒトＴＣＲａＣ－ＷＴ）のα鎖の定常領域
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号２ マウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（マウスＴＣＲａＣ－ＷＴ）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号３ マウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域のＮ末端から欠失した配列
DIQNPEPAVYQLKDPRSQ
配列番号４ Ｎ末端改変を含有するマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ｎ．ＤＬＴ）
DSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号５ Ｎ末端改変を含有するマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－４）
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号６ システイン置換を含有するヒトＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（ヒトＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ）
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号７ システイン置換を含有するマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号８ 疎水性アミノ酸置換を含有するマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域の膜貫通領域
LLVIVLRIL
配列番号９ 疎水性アミノ酸置換を含有するマウスＴ細胞受容体のα鎖の定常領域（マウスＴＣＲａＣ－ＴＭ９）
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号１０ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｍ９
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号１１ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号１２ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－Ｎ．Ｒｅｃ－１
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号１３ マウスＴＣＲａＣ－Ｃｙｓ－ＴＭ９－Ｎ．Ｒｅｃ－１
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号１４ ヒトＴ細胞受容体（ヒトＴＣＲｂＣ－ＷＴ）のβ鎖の定常領域
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
配列番号１５ マウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－ＷＴ）
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号１６ マウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域のＮ末端から欠失した配列
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQK
配列番号１７ Ｎ末端欠失を含有するマウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．ＤＬＴ）
ATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号１８ Ｎ末端改変を含有するマウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－Ｎ－Ｒｅｃ－４）
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号１９ システイン置換を含有するヒトＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（ヒトＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ）
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
配列番号２０ システイン置換を含有するマウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ）
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号２１ Ｎ末端改変及びシステイン置換を含有するマウスＴ細胞受容体のβ鎖の定常領域（マウスＴＣＲｂＣ－Ｃｙｓ－Ｎ－Ｒｅｃ－１）
PPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号２２ 抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＨ
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKG
配列番号２３ 抗ＥＧＦＲ Ｃｅｔｕｘ－ＶＬ
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVA
配列番号２４ 抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３ ＶＬ
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKR
配列番号２５ 抗ＧＰＣ３ ＧＣ３３ ＶＨ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS
配列番号２６ 抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＨ
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKALGFIFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGAFHPGSGGSAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTFEDSAVYHCTRQLGPDWGQGTLVTVS
配列番号２７ 抗ＣＤ１９ ３３４ ＶＬ
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLESDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCWQGTQFPWTFGGGTKLEIK
配列番号２８ 抗ＣＤ１９ ３３４重鎖ＣＤＲ１
GFIFTDYE
配列番号２９ 抗ＣＤ１９ ３３４重鎖ＣＤＲ２
FHPGSGGS
配列番号３０ 抗ＣＤ１９ ３３４重鎖ＣＤＲ３
TRQLGPD
配列番号３１ 抗ＣＤ１９ ３３４軽鎖ＣＤＲ１
QSLLESDGKTY
配列番号３２ 抗ＣＤ１９ ３３４軽鎖ＣＤＲ２
LVS
配列番号３３ 抗ＣＤ１９ ３３４軽鎖ＣＤＲ３
WQGTQFPWT
配列番号３４ ＴＣＲａＣ－Ｎ・Ｒｅｃ－１
PDPAVYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号３５ ＴＣＲａＣ－Ｎ・Ｒｅｃ－２
VYQLRDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号３６ ＴＣＲａＣ－Ｎ・Ｒｅｃ－３
RDSKSSDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号３７ ＴＣＲｂＣ－Ｎ・Ｒｅｃ－１
PPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号３８ ＴＣＲｂＣ－Ｎ・Ｒｅｃ－２
FEPSEAEISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号３９ ＴＣＲｂＣ－Ｎ．Ｒｅｃ－３
EISHTQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号４０ Ｎ末端に１８アミノ酸のランダムな再編成を伴うマウスＴＣＲａＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ
NQSVDPDEQLIPYRKAQPDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
配列番号４１ Ｎ末端に２５アミノ酸のランダムな再編成を伴うマウスＴＣＲｂＣ－Ｎ．ｒＲｅｃ
PEKREKSVAPAVKKLNLITFQDSPNATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
配列番号４２ マウスＴＣＲのα鎖の定常領域のＣ末端に１５アミノ酸の欠失を伴うマウスＴＣＲａＣ－Ｃ．ＤＬＴ
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLK
配列番号４３ マウスＴＣＲのβ鎖の定常領域のＣ末端に１５アミノ酸の欠失を伴うマウスＴＣＲｂＣ－Ｃ．ＤＬＴ
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVL
配列番号４４ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＨ
AVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSS
配列番号４５ 抗ＣＤ１９ ＦＭＣ６３ ＶＬ
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
配列番号４６ 抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＨ
AVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSS
配列番号４７ 抗ＣＤ２０ ２Ｃ６ ＶＬ
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
配列番号４８ 抗ＣＤ２２ Ｍ９７１ ＶＨ
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号４９ 抗ＣＤ２２ Ｍ９７１ ＶＬ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】