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特許7614690腫瘍微小環境をターゲットとする光免疫療法に用いる医薬組成物、治療効果確認のためのマーカー、及び検査方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-07
(45)【発行日】2025-01-16
(54)【発明の名称】腫瘍微小環境をターゲットとする光免疫療法に用いる医薬組成物、治療効果確認のためのマーカー、及び検査方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20250108BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 Y
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2024187290
(22)【出願日】2024-10-24
(62)【分割の表示】P 2022563666の分割
【原出願日】2021-10-29
【審査請求日】2024-10-24
(31)【優先権主張番号】P 2020190697
(32)【優先日】2020-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】504139662
【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構
(74)【代理人】
【識別番号】100167689
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 征二
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 和秀
【審査官】中村 直子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／１７９７４９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／２４６３２２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／１９９７５１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】韓国公開特許第１０－２０２０－０００８８２３（ＫＲ，Ａ）
【文献】長屋匡信，新規癌治療法である近赤外光線免疫療法（NIR-PIT），信州医学雑誌，2020年04月10日，68(2)，83-95
【文献】NAGAYA, Tadanobu et al.，Near infrared photoimmunotherapy with avelumab, an anti-programmed death-ligand 1(PD-L1) antibody，Oncotarget，2017年，8(5)，8807-8817
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の腫瘍免疫を増強する医薬組成物の効果を確認するための検査方法であって、前記医薬組成物が近赤外光線免疫療法に用いる医薬組成物であり、
近赤外光線照射前と照射後に対象から得られた末梢血中のＢ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＭＤＳＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＩＬ－６、ＫＣ（ケラチノサイト由来ケモカイン）、ＭＩＰ－２（マクロファージ炎症タンパク質２）のいずれか１つ以上のマーカーを測定し、
近赤外光線照射前の値と照射後の値を比較して、
Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞の減少、又は、
ＭＤＳＣ、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＩＰ－２の増加のいずれか１つ以上が認められた場合には、
治療効果があると判定する
近赤外光線照射前と照射後のマーカーの変動により治療効果を確認する検査方法。
【請求項2】
前記医薬組成物が、腫瘍細胞で発現している免疫チェックポイント分子に特異的に結合するものである請求項１記載の検査方法。
【請求項3】
前記免疫チェックポイント分子がＰＤ－Ｌ１であることを特徴とする請求項２記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
免疫チェックポイント分子、特に腫瘍で発現している免疫チェックポイント分子を標的とした光免疫療法及びその治療効果を確認するためのバイオマーカー、検査方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近赤外光線免疫療法（Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｐｈｏｔｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＮＩＲ－ＰＩＴ、以下、ＮＩＲ－ＰＩＴ、あるいは光免疫療法と記載することもある。）は、近赤外光線を照射することによって、腫瘍細胞などの標的細胞を特異的に死滅させる治療法である。周囲の細胞を障害することなく、標的細胞のみを局所から取り除くことができる新しい治療法であり、患者の負担も少ないことから注目を集めている。具体的には、標的細胞に特異的に発現している標的分子に結合する抗体等の特異的結合性分子に、近赤外光線によって励起する分子を結合させた複合体を作製する。作製した複合体を標的分子に結合させ、光照射を行い光化学反応によって標的細胞に壊死性の細胞死と誘導するという治療法である。
【0003】
ＮＩＲ－ＰＩＴは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする抗体であるセツキシマブにＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ（ＩＲ７００）を結合させた複合体、ＲＭ－１９２９で臨床試験が実施されている。ＲＭ－１９２９は、第ＩＩＩ相試験へと進んでおり、２０２０年９月には世界に先駆けて日本で承認された。ＥＧＦＲは、臨床試験の対象となっている頭頸部癌の他、食道癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌など様々な固形癌で発現が認められており、ＥＧＦＲが発現しているこれらの癌に適用することができる。
【0004】
また、ＮＩＲ－ＰＩＴは、腫瘍細胞の細胞表面で発現している標的分子に特異的に結合する抗体などの分子と、ＩＲ７００を結合させた複合体を作製すればよいことから、様々な標的分子を対象とし適用することが可能である。したがって、現在臨床試験が行われているＥＧＦＲだけではなく、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡなど腫瘍に特異的に発現している、いわゆる癌抗原を標的分子とすることが可能であり、種々の腫瘍に広く適用され得る治療法である（特許文献１、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特表２０１８－５２８２６８号公報
【文献】国際公開第２０００／０３１５８８号
【非特許文献】
【0006】
【文献】Kobayashi, H. & Choyke, P.L., 2019, Acc. Chem. Res., Vol.52,pp.2332-2339.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、ＮＩＲ－ＰＩＴによる効果を得るためには、ＥＧＦＲなど標的分子が細胞表面で高発現している必要がある。標的分子を発現していない、あるいは弱い発現しか認められない細胞には、複合体が結合しない、または結合が十分量ではなく効果を得ることができないからである。そのため、ＮＩＲ－ＰＩＴが適用できる患者は腫瘍表面で標的分子が高発現している患者に限られる。また、腫瘍は、一つの腫瘍内であっても新たなゲノム異常が蓄積するため不均一性が生じることが知られている。そのため、標的分子の高発現が認められる細胞のみを死滅させるＮＩＲ－ＰＩＴでは、全ての腫瘍細胞に細胞死を誘導することができず、標的分子が発現していないために細胞死が誘導されなかった腫瘍細胞による再発を招くことになる。また、従来のＮＩＲ－ＰＩＴは、光を照射した腫瘍に対する局所療法であり、転移性腫瘍に対する効果はほとんどない。本発明は、免疫反応を誘導することによって、従来のＮＩＲ－ＰＩＴや抗体による治療では抗原の発現量が低く効果を奏さなかった患者に対しても効果を奏する治療法や、光照射を行った局所だけではなく転移性腫瘍に対しても効果を及ぼす治療法の創生を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、以下の医薬組成物、検査方法、及びマーカーに関する。
（１）対象の腫瘍免疫を増強する医薬組成物の効果を確認するための検査方法であって、前記医薬組成物が近赤外光線免疫療法に用いる医薬組成物であり、近赤外光線照射前と照射後に対象から得られた試料中のＢ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＭＤＳＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＩＬ－６、ＫＣ（ケラチノサイト由来ケモカイン）、ＭＩＰ－２（マクロファージ炎症タンパク質２）のいずれか１つ以上のマーカーを測定し、近赤外光線照射前と照射後のマーカーの変動により治療効果を確認する検査方法。
（２）前記医薬組成物が、腫瘍細胞で発現している免疫チェックポイント分子に特異的に結合するものである（１）記載の検査方法。
（３）前記免疫チェックポイント分子がＰＤ－Ｌ１であることを特徴とする（２）記載の検査方法。
（４）前記試料が末梢血である（１）～（３）いずれか１つ記載の検査方法。
（５）近赤外光線免疫療法前と後の試料中のＢ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＭＤＳＣ、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＩＰ－２の少なくともいずれか１つの変動を評価する腫瘍免疫を増強する近赤外光線免疫療法の効果を確認するためのマーカー。
（６）前記近赤外光線免疫療法が、ＰＤ－Ｌ１を標的とする医薬組成物を用いて行われることを特徴とする（５）記載の近赤外光線免疫療法の効果を確認するためのマーカー。
（７）転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物であって、特異的結合性分子に近赤外光線感受性物質が結合した複合体を有効成分とし、前記特異的結合性分子が腫瘍細胞で発現している免疫チェックポイント分子に結合する分子であることを特徴とする転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（８）前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－Ｌ１である（７）記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（９）前記特異的結合性分子が抗体又は機能的抗体断片である（７）又は（８）記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１０）近赤外光線感受性物質がフタロシアニン色素である（７）～（９）いずれか１つ記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１１）前記フタロシアニン色素がＩＲ７００であることを特徴とする（１０）記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１２）複数回の光照射を行うための医薬組成物である（７）～（１１）いずれか１つ記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１３）免疫チェックポイント分子以外の標的分子に結合する特異的結合性分子に近赤外光線感受性物質が結合した複合体を有効成分とする医薬組成物と併用することを特徴とする（７）～（１２）いずれか１つ記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１４）化学療法剤と併用することを特徴とする（７）～（１３）いずれか１つ記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１５）対象の腫瘍免疫を増強するための医薬組成物であって、特異的結合性分子に近赤外光線感受性物質が結合した複合体を有効成分とし、前記特異的結合性分子が腫瘍細胞で発現している免疫チェックポイント分子であることを特徴とする医薬組成物。
（１６）前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－Ｌ１である（１５）記載の医薬組成物。
（１７）前記特異的結合性分子が抗体又は機能的抗体断片である（１５）又は（１６）記載の医薬組成物。
（１８）近赤外光線感受性物質がフタロシアニン色素である（１５）～（１７）いずれか１つ記載の医薬組成物。
（１９）前記フタロシアニン色素がＩＲ７００であることを特徴とする（１８）記載の医薬組成物。
（２０）複数回の光照射を行うための医薬組成物である（１５）～（１９）いずれか１つ記載の医薬組成物。
（２１）免疫チェックポイント分子以外の標的分子に結合する特異的結合性分子に近赤外光線感受性物質が結合した複合体を有効成分とする医薬組成物と併用することを特徴とする（１５）～（２０）いずれか１つ記載の医薬組成物。
（２２）化学療法剤と併用することを特徴とする（１５）～（２１）いずれか１つ記載の医薬組成物。
（２３）腫瘍微小環境をターゲットとする近赤外光線免疫療法であって、対象に（７）～（２２）いずれか１つ記載の医薬組成物を投与し、光照射前と光照射後に対象から試料を得て、前記試料中のＢ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＭＤＳＣ、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＩＰ－２のいずれか１つ以上のマーカーを測定し、光照射前と照射後のマーカーの変動により治療効果を確認し、治療が有効であると判断した場合には、複数回の光照射を行うことを特徴とする近赤外光線免疫療法。
（２４）近赤外光線免疫療法であって、（７）～（１２）、（１５）～（２０）いずれか１つ記載の腫瘍微小環境をターゲットとする医薬組成物と、免疫チェックポイント分子以外の標的分子に結合する特異的結合性分子に近赤外光線感受性物質が結合した複合体を有効成分とする医薬組成物とを対象に投与し、光照射を行うことを特徴とする近赤外光線免疫療法。
（２５）腫瘍微小環境をターゲットとする近赤外光線免疫療法と化学療法の併用療法であって、対象に化学療法を行うとともに、（７）～（１３）、（１５）～（２１）いずれか１つ記載の医薬組成物を投与し、近赤外光線免疫療法により腫瘍の治療と骨髄抑制の改善を行うことを特徴とする併用療法。
（２６）（２４）又は（２５）の近赤外光線免疫療法であって、光照射前と光照射後に対象から試料を得て、前記試料中のＢ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＭＤＳＣ、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＩＰ－２のいずれか１つ以上のマーカーを測定し、光照射前と照射後のマーカーの変動により免疫チェックポイント分子を標的とする近赤外光線免疫療法の治療効果を確認し、治療が有効であると判断した場合には、複数回の光照射を行うことを特徴とする近赤外光線免疫療法。
（１）対象の腫瘍免疫を増強する医薬組成物の効果を確認するための検査方法であって、前記医薬組成物が近赤外光線免疫療法に用いる医薬組成物であり、近赤外光線照射前と照射後に対象から得られた試料中のＢ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＭＤＳＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＩＬ－６、ＫＣ（ケラチノサイト由来ケモカイン）、ＭＩＰ－２（マクロファージ炎症タンパク質２）のいずれか１つ以上のマーカーを測定し、近赤外光線照射前と照射後のマーカーの変動により治療効果を確認する検査方法。
（２）前記医薬組成物が、腫瘍細胞で発現している免疫チェックポイント分子に特異的に結合するものである（１）記載の検査方法。
（３）前記免疫チェックポイント分子がＰＤ－Ｌ１であることを特徴とする（２）記載の検査方法。
（４）前記試料が末梢血である（１）～（３）いずれか１つ記載の検査方法。
（５）近赤外光線免疫療法前と後の試料中のＢ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＭＤＳＣ、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＩＰ－２の少なくともいずれか１つの変動を評価する腫瘍免疫を増強する近赤外光線免疫療法の効果を確認するためのマーカー。
（６）前記近赤外光線免疫療法が、ＰＤ－Ｌ１を標的とする医薬組成物を用いて行われることを特徴とする（５）記載の近赤外光線免疫療法の効果を確認するためのマーカー。
（７）転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物であって、特異的結合性分子に近赤外光線感受性物質が結合した複合体を有効成分とし、前記特異的結合性分子が腫瘍細胞で発現している免疫チェックポイント分子に結合する分子であることを特徴とする転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（８）前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－Ｌ１である（７）記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（９）前記特異的結合性分子が抗体又は機能的抗体断片である（７）又は（８）記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１０）近赤外光線感受性物質がフタロシアニン色素である（７）～（９）いずれか１つ記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１１）前記フタロシアニン色素がＩＲ７００であることを特徴とする（１０）記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１２）複数回の光照射を行うための医薬組成物である（７）～（１１）いずれか１つ記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１３）免疫チェックポイント分子以外の標的分子に結合する特異的結合性分子に近赤外光線感受性物質が結合した複合体を有効成分とする医薬組成物と併用することを特徴とする（７）～（１２）いずれか１つ記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１４）化学療法剤と併用することを特徴とする（７）～（１３）いずれか１つ記載の転移がん用及び／又は再発防止用医薬組成物。
（１５）対象の腫瘍免疫を増強するための医薬組成物であって、特異的結合性分子に近赤外光線感受性物質が結合した複合体を有効成分とし、前記特異的結合性分子が腫瘍細胞で発現している免疫チェックポイント分子であることを特徴とする医薬組成物。
（１６）前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－Ｌ１である（１５）記載の医薬組成物。
（１７）前記特異的結合性分子が抗体又は機能的抗体断片である（１５）又は（１６）記載の医薬組成物。
（１８）近赤外光線感受性物質がフタロシアニン色素である（１５）～（１７）いずれか１つ記載の医薬組成物。
（１９）前記フタロシアニン色素がＩＲ７００であることを特徴とする（１８）記載の医薬組成物。
（２０）複数回の光照射を行うための医薬組成物である（１５）～（１９）いずれか１つ記載の医薬組成物。
（２１）免疫チェックポイント分子以外の標的分子に結合する特異的結合性分子に近赤外光線感受性物質が結合した複合体を有効成分とする医薬組成物と併用することを特徴とする（１５）～（２０）いずれか１つ記載の医薬組成物。
（２２）化学療法剤と併用することを特徴とする（１５）～（２１）いずれか１つ記載の医薬組成物。
（２３）腫瘍微小環境をターゲットとする近赤外光線免疫療法であって、対象に（７）～（２２）いずれか１つ記載の医薬組成物を投与し、光照射前と光照射後に対象から試料を得て、前記試料中のＢ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＭＤＳＣ、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＩＰ－２のいずれか１つ以上のマーカーを測定し、光照射前と照射後のマーカーの変動により治療効果を確認し、治療が有効であると判断した場合には、複数回の光照射を行うことを特徴とする近赤外光線免疫療法。
（２４）近赤外光線免疫療法であって、（７）～（１２）、（１５）～（２０）いずれか１つ記載の腫瘍微小環境をターゲットとする医薬組成物と、免疫チェックポイント分子以外の標的分子に結合する特異的結合性分子に近赤外光線感受性物質が結合した複合体を有効成分とする医薬組成物とを対象に投与し、光照射を行うことを特徴とする近赤外光線免疫療法。
（２５）腫瘍微小環境をターゲットとする近赤外光線免疫療法と化学療法の併用療法であって、対象に化学療法を行うとともに、（７）～（１３）、（１５）～（２１）いずれか１つ記載の医薬組成物を投与し、近赤外光線免疫療法により腫瘍の治療と骨髄抑制の改善を行うことを特徴とする併用療法。
（２６）（２４）又は（２５）の近赤外光線免疫療法であって、光照射前と光照射後に対象から試料を得て、前記試料中のＢ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＭＤＳＣ、単球／マクロファージ、樹状細胞、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＩＰ－２のいずれか１つ以上のマーカーを測定し、光照射前と照射後のマーカーの変動により免疫チェックポイント分子を標的とする近赤外光線免疫療法の治療効果を確認し、治療が有効であると判断した場合には、複数回の光照射を行うことを特徴とする近赤外光線免疫療法。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００の作製を示す。（Ａ）抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体からＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２を精製し、（Ｂ）精製したＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２、及びコントロールＩｇＧＦ（ａｂ’）２にＩＲ７００を結合させ作製した複合体の検証結果を示す図。
【図2】種々のマウス癌細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現をＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００の結合により確認した結果を示す図。
【図3】種々のマウス癌細胞におけるＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００によるＮＩＲ－ＰＩＴの効果を示す図。光照射後の細胞の変化を示す顕微鏡像。
【図4】種々のマウス癌細胞にＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を結合させ、近赤外光線照射後の死細胞数の割合によりＮＩＲ－ＰＩＴの効果を解析した図。
【図5】ルシフェラーゼアッセイによるＮＩＲ－ＰＩＴの効果を解析した図。
【図6】ＡＴＰアッセイによるＮＩＲ－ＰＩＴの自然免疫活性化に対する効果を解析した図。
【図7】マウスｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルを用い、ＮＩＲ－ＰＩＴの効果を検討した結果を示す図。大腸癌細胞株ＭＣ３８を用いた検討結果。ＩＶＩＳイメージを示す。
【図8】マウスｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルでのＮＩＲ－ＰＩＴの効果を示す図。（Ａ）ルシフェラーゼ活性、（Ｂ）腫瘍体積による解析結果を示す。
【図9】マウスｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルでのＮＩＲ－ＰＩＴの生存に対する効果を示す図。
【図10】マウスｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルを用い、ＮＩＲ－ＰＩＴの効果を検討した結果を示す図。肺癌細胞株ＬＬ／２を用いた検討結果。（Ａ）ＩＶＩＳイメージ、（Ｂ）ルシフェラーゼ活性、（Ｃ）腫瘍体積による解析結果を示す。
【図11】マウスｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルを用い、ＮＩＲ－ＰＩＴの効果を検討した結果を示す図。前立腺癌細胞株Ｔｒａｍｐ－Ｃ２を用いた検討結果。（Ａ）ＩＶＩＳイメージ、（Ｂ）ルシフェラーゼ活性、（Ｃ）腫瘍体積による解析結果を示す。
【図12】ＰＤ－Ｌ１を標的としたＮＩＲ－ＰＩＴが転移部に対しても効果があることを示す図。（Ａ）ＩＶＩＳイメージ、（Ｂ）ルシフェラーゼ活性、（Ｃ）腫瘍体積、（Ｄ）生存曲線による解析結果を示す。
【図13】ＮＩＲ－ＰＩＴ後に、反対側に再接種した腫瘍細胞に対する増殖抑制効果の解析結果を示す図。（Ａ）実験スケジュールを模式的に示す図。（Ｂ）ＮＩＲ－ＰＩＴ後に、反対側に接種した腫瘍細胞の腫瘍体積を示す図。
【図14】ＮＩＲ－ＰＩＴ後のＰＤ－Ｌ１発現を解析した図。（Ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ、（Ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏ実験系での結果を示す。
【図15】ＰＤ－Ｌ１を標的としたＮＩＲ－ＰＩＴによる腫瘍内部のＴ細胞、ＮＫ細胞の活性化を示す図。
【図16】ＰＤ－Ｌ１を標的としたＮＩＲ－ＰＩＴによる血液中のＴ細胞、ＮＫ細胞の活性化を示す図。
【図17】ＰＤ－Ｌ１を標的としたＮＩＲ－ＰＩＴによる脾臓内のＴ細胞、ＮＫ細胞の活性化を示す図。
【図18】ＮＩＲ－ＰＩＴにより変動する血球細胞の解析結果を示す図。
【図19】ＮＩＲ－ＰＩＴにより変動するサイトカインの解析結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0010】
上述のように、従来のＮＩＲ－ＰＩＴは腫瘍細胞の表面に高発現している分子を標的分子とする治療方法である。特許文献１や非特許文献１にも、ＥＧＦＲをはじめ、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡなど癌細胞に特異的に発現する多くの分子が記載されている。さらに、ＣＤ２５、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４など免疫チェックポイントに関与する分子を標的にすることについても記載されている。
【0011】
しかしながら、上記文献に記載されているＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などの免疫チェックポイント分子は、ＥＧＦＲなどの分子と同様、癌細胞表面で発現している腫瘍抗原の一つとして考えられているに過ぎない。すなわち標的分子としてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などの免疫チェックポイント分子が高発現している癌を対象とした局所療法として考えられている。本発明者は、ＰＤ－Ｌ１を標的分子としたＮＩＲ－ＰＩＴは、光照射した部位において腫瘍細胞を死滅させるという従来の効果だけではなく、細胞死に至らなかった腫瘍細胞でのＰＤ－Ｌ１の発現増強、免疫反応の誘導、がん微小環境の改変が生じ、相乗的に抗腫瘍免疫を活性化することを見出した。すなわち、従来の癌抗原を対象としたＮＩＲ－ＰＩＴの効果に加えて、抗ＰＤ－Ｌ１抗体自体による治療効果を増強するとともに、ＰＤ－Ｌ１の発現が低い場合でも、複数回のＮＩＲ－ＰＩＴを行うことにより治療効果が生じる治療法となり得ることを見出した。また、免疫反応を誘導することにより光照射を行わなかった部位の腫瘍にも効果を及ぼす、すなわち転移部に対しても効果が及ぶことを見出した。さらに、光照射時には存在しなかった腫瘍に対しても効果が及ぶこと、すなわち免疫記憶によるものであり、再発を予防する効果も期待できることを見出した。これらの効果は、標的分子が高発現している腫瘍に局所的な効果を奏する従来のＮＩＲ－ＰＩＴの効果に加えて、免疫反応を誘導するという全く質の違う効果である。
【0012】
ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴの作用機序から、腫瘍細胞で発現している免疫チェックポイントに関与する分子を標的にするＮＩＲ－ＰＩＴであれば、同様の効果を得ることができると考えられる。そのような分子としては、ＰＤ－Ｌ１以外に、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ７８、Ｂ７（ＣＤ８０／ＣＤ８６）、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－９、ＨＶＥＭ、ＣＤ１３７Ｌ、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ２００Ｒ、ＶＩＳＴＡ、ＶＳＩＧ３、ＬＳＥＣｔｉｎ、ＣＥＡＣＡＭ１、Ａ２ａＲ、Ｂ７ＲＰ１、ＦＧＬ１、ＣＤ４８のように抑制シグナルを伝達する分子、あるいはＣＤ７０、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＤＳＬ、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌのように活性化シグナルを伝達する分子がある。また、今後免疫チェックポイント分子として同定される分子にも適用できることは言うまでもない。
【0013】
ＰＤ－Ｌ１をはじめとする腫瘍で発現が認められる免疫チェックポイント分子に結合する特異的結合性分子としては、抗体、アプタマーなどが例示される。特異的結合性分子は標的分子に特異的に結合する物質であればどのようなものを使用してもよいが、特に抗体を好ましく用いることができる。抗体は、インタクトな抗体に限らず、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´断片、Ｆ（ａｂ´）２断片、一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、ｒＩｇＧ断片、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｉａｂｏｄｙもしくはＣＤＲを含むペプチドなど、抗原に特異的に結合する領域を含むものであればよい。しかし、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：抗体依存性細胞障害）活性による副作用を抑制するためにＦａｂ断片、Ｆａｂ´断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）などＦｃ領域を有さない抗体を使用する方が好ましい。Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´断片、Ｆ（ａｂ’）２断片等、Ｆｃ領域を有さない抗体を以下では機能的抗体断片と称する。
【0014】
以下の実施例では抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体を使用しているが、抗ＰＤ－Ｌ１抗体に限らず、腫瘍細胞に発現が認められる免疫チェックポイントに関与する分子であれば、標的として用いることができることは上述のとおりである。ヒトＰＤ－Ｌ１に対する抗体は、すでに各国で承認を受け治療に用いられているデュルバルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブがある。これら抗体は、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、胃癌、悪性胸膜中皮腫等の治療に用いられているが、これらの癌種に限らずＰＤ－Ｌ１の発現が少しでも認められる腫瘍であれば、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴの対象となる。さらに、今後開発される抗ＰＤ－Ｌ１抗体、腫瘍細胞に発現が認められる免疫チェックポイント分子に対する抗体もＮＩＲ－ＰＩＴに応用できる。
【0015】
ＮＩＲ－ＰＩＴに使用する複合体には、上述の特異的結合性分子に光感受性物質を結合させる。光感受性物質は、光化学反応により標的細胞に細胞死を誘導させる物質である。光化学反応を効率的に生じさせるためにはエネルギーの高い光子、すなわち波長の短い光を使用する必要がある。しかし、一方で腫瘍細胞の周囲に存在する正常細胞のＤＮＡに非特異的な損傷を生じさせるのを防ぐ必要があることから紫外線より長い波長を使用する必要がある。そのため近赤外光線感受性物質を選択するのが好ましい。また、抗体などの特異的結合性分子に連結させて用いるためには小分子である必要がある。この条件に適合する化合物として、フタロシアニン系の光増感剤がある。
【0016】
フタロシアニン色素としては、６００ｎｍ～９５０ｎｍ、好ましくは６６０ｎｍ～７４０ｎｍ、より好ましくは６８０ｎｍ～７２０ｎｍに吸収ピークがあるものを好適に用いることができる。特に好ましいフタロシアニン色素として、ＲＭ－１９２９にも用いられているＩＲ７００（ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、ＬＩ-ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を挙げることができる（特許文献２）。ＩＲ７００のＮＨＳエステルを用い、共有結合によって特異的結合性分子に共役結合させることができる。
【0017】
複合体は任意の方法を用いて局所投与、あるいは全身投与することができる。具体的には患部への注射による筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、静脈内投与、あるいは腹腔内投与、吸入、軟膏、貼付、塗布、点鼻、点眼による非経口的手段により投与されるが、経口投与によってもよい。対象とする腫瘍によって、適宜選択することができるが、通常静脈内投与などによる全身投与を行うことが好ましい。
【0018】
通常非経口製剤は、ビヒクルとしての水、生理食塩液、平衡塩類溶液、水性デキストロース、またはグリセロールなどのような、薬学的に許容される流体および生理学的に許容される流体が含まれる注射用流体を含む。防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなど、少量の非毒性補助物質を含有しうる。
【0019】
複合体の治療有効用量は、対象疾患によるが、疾患、症状に合わせて適宜設定することができる。例えば、体重６０ｋｇ当たり０．１ｍｇ～１０００ｍｇの間で適宜設定することができる。静脈内投与、局所投与、腹腔内投与など投与方法によっても投与量は異なることから適宜設定すればよい。また、投与は単回投与、あるいは複数回投与など、疾患、症状、治療効果に合わせて選択すればよい。
【0020】
以下の実施例で示すように、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体を用いたＮＩＲ－ＰＩＴは、治療の結果、腫瘍細胞でＰＤ－Ｌ１発現が増強される。すなわち、初回の治療で腫瘍細胞においてＰＤ－Ｌ１の発現を誘導することができる。したがって、複数回ＮＩＲ－ＰＩＴを行うことによって、初回の治療ではＰＤ－Ｌ１発現が低く、大きな効果を得ることができなかった場合でもその後の光照射による治療効果が期待できる。さらに自然免疫も誘導することから、複数回の治療によって、顕著な効果が得られる可能性が高い。一般に抗体医薬は、２～３週間有効量が体内に維持されると言われている。したがって、１回の投与の後、２～３週間の内に複数回光照射を行って、強い効果を得ることが可能である。
【0021】
複数回の光照射の場合、照射間隔は特に限定されないが、腫瘍細胞でのＰＤ－Ｌ１の発現増強、自然免疫の誘導を待ってから照射することが好ましい。腫瘍にもよるが、連日、あるいは隔日又は数日から１週間毎に照射する等、様々な照射スケジュールを設定することができる。
【0022】
近赤外光の照射にはＬＥＤ、ＬＥＤレーザー、フィルターを通過させた光線等を利用して、適切な波長の治療線量を照射すればよい。治療線量としては、１～１０００Ｊ／ｃｍ２の線量と、照射時間も５秒から１時間程度で適宜定めればよい。体外から直接照射してもよいが、疾患幹部に導入して照射するデバイスとして、導光カテーテル、内視鏡導光ファイバー、穿刺照射ファイバー、血管導光カテーテル、ドレーン留置型導光デバイス、あるいは体内埋め込み型、貼付型、ブレスレット型などの光照射装置を用いることができる。複合体を医薬組成物として静脈注射により全身投与する場合には、複合体が病変部に集積する時間を考慮し病変部に集積後に近赤外光線を照射すればよい。複合体が病変部に集積するための時間は例えば５分～４８時間程度である。局所投与の場合には、全身投与の場合よりも、投与後短時間で光照射を行うことができる。
【実施例】
【0023】
以下に実施例を示しながら、詳細に説明する。
［抗マウスＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２、ＩＲ７００を用いた複合体の作製］
特異的結合性分子として抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体、近赤外光線感受性物質としてＩＲ７００を用い、複合体を作製し、ＮＩＲ－ＰＩＴの効果の確認を行った。ＰＤ－Ｌ１はリンパ球でも発現が認められることから、ＡＤＣＣによる副作用を抑制するために、Ｆ（ａｂ’）２を精製し、ＩＲ７００との複合体を作製した（図１）。
［抗マウスＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２、ＩＲ７００を用いた複合体の作製］
特異的結合性分子として抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体、近赤外光線感受性物質としてＩＲ７００を用い、複合体を作製し、ＮＩＲ－ＰＩＴの効果の確認を行った。ＰＤ－Ｌ１はリンパ球でも発現が認められることから、ＡＤＣＣによる副作用を抑制するために、Ｆ（ａｂ’）２を精製し、ＩＲ７００との複合体を作製した（図１）。
【0024】
抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体（Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｍａｂ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＰＤ－Ｌ１ （Ｂ７－Ｈ１）、ＢＩＯ ＸＣＥＬＬ社）をペプシンで切断し、Ｆ（ａｂ’）２を精製した（図１（Ａ））。抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体から精製したＦ（ａｂ’）２及び同様にコントロールＩｇＧ（Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ａｎｔｉ ＫＬＨ）、ＢＩＯ ＸＣＥＬＬ社）から精製したＦ（ａｂ’）２にＩＲ７００を結合させ、複合体を作製した。ＩＲ７００を結合した複合体Ｆ（ａｂ’）２は、近赤外光照射による蛍光が観察された（図１（Ｂ））。以下、抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体Ｆ（ａｂ’）２にＩＲ７００を結合させた複合体をＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００、コントロールＩｇＧ抗体Ｆ（ａｂ’）２にＩＲ７００を結合させた複合体をコントロールＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００と記載する。
【0025】
［種々の癌細胞での抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００によるＮＩＲ－ＰＩＴの効果］
１．顕微鏡観察による検討
作製した複合体を用い、種々のマウス癌細胞でＮＩＲ－ＰＩＴの効果を確認した。まず、用いるマウス癌細胞にＰＤ－Ｌ１が発現しているか確認を行った。マウス大腸癌細胞ＭＣ３８（ＡＴＣＣより入手）、マウス肺癌細胞ＬＬ／２（ＡＴＣＣより入手）、マウス前立腺癌細胞Ｔｒａｍｐ－Ｃ２（ＡＴＣＣより入手）、マウスメラノーマＢ１６Ｆ０細胞（ＡＴＣＣより入手）にルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞を樹立した。それぞれＭＣ３８ ｌｕｃ、ＬＬ／２ ｌｕｃ、Ｔｒａｍｐ－Ｃ２ ｌｕｃ、Ｂ１６Ｆ０ ｌｕｃと称する。各細胞のＰＤ－Ｌ１発現をＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を結合させ、フローサイトメトリーによって確認した（図２）。由来の異なるいずれの癌細胞株においても、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００の結合が認められ、ＰＤ－Ｌ１が発現していることが確認された。ＰＤ－Ｌ１は臓器横断的に発現していることから、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴは種々の癌に広く適用できることを示唆している。
１．顕微鏡観察による検討
作製した複合体を用い、種々のマウス癌細胞でＮＩＲ－ＰＩＴの効果を確認した。まず、用いるマウス癌細胞にＰＤ－Ｌ１が発現しているか確認を行った。マウス大腸癌細胞ＭＣ３８（ＡＴＣＣより入手）、マウス肺癌細胞ＬＬ／２（ＡＴＣＣより入手）、マウス前立腺癌細胞Ｔｒａｍｐ－Ｃ２（ＡＴＣＣより入手）、マウスメラノーマＢ１６Ｆ０細胞（ＡＴＣＣより入手）にルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞を樹立した。それぞれＭＣ３８ ｌｕｃ、ＬＬ／２ ｌｕｃ、Ｔｒａｍｐ－Ｃ２ ｌｕｃ、Ｂ１６Ｆ０ ｌｕｃと称する。各細胞のＰＤ－Ｌ１発現をＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を結合させ、フローサイトメトリーによって確認した（図２）。由来の異なるいずれの癌細胞株においても、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００の結合が認められ、ＰＤ－Ｌ１が発現していることが確認された。ＰＤ－Ｌ１は臓器横断的に発現していることから、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴは種々の癌に広く適用できることを示唆している。
【0026】
これらの細胞株を用いてＮＩＲ－ＰＩＴの効果の検討を行った。ＭＣ３８、ＬＬ／２、Ｔｒａｍｐ－Ｃ２細胞株を１２ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、２４時間培養後、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を１０μｇ／ｍｌになるように添加し、６時間後に発光波長６９０ｎｍのＬＥＤを用いて０～１２８Ｊ／ｃｍ２まで強度を変えて近赤外光線を照射した。近赤外光線照射前及び照射後の微分干渉顕微鏡像、ＩＲ７００、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）、Ｈｏｅｃｈｓｔによる染色と、各染色の重ね合わせを示す（図３）。写真は１６Ｊ／ｃｍ２で近赤外光線を照射した例を示す。いずれの細胞株を用いた場合も、光照射後はＰＩにより核が染色され、Ｈｏｅｃｈｓｔによる染色が消失していることから、光照射によって細胞死が誘導されていることが示された。
【0027】
ＭＣ３８ ｌｕｃ、ＬＬ／２ ｌｕｃ、Ｔｒａｍｐ－Ｃ２ ｌｕｃ、Ｂ１６Ｆ０ ｌｕｃ細胞株において、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、光強度を０～１２８Ｊ／ｃｍ２まで変えて照射し、死細胞の割合をＰＩ染色によって解析した（図４）。いずれの細胞株においても、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００（図中、ＡＰＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を添加しない場合には光照射を行っても細胞死は誘導されない。これに対し、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を添加して光照射を行った場合には、光強度に応じてＰＩ染色陽性細胞が増加し細胞死が誘導されることが示された。しかし、ＥＧＦＲなど高発現の腫瘍抗原に対するＰＩＴでは、１６Ｊ／ｃｍ２で８０％～１００％の細胞死が誘導できるのに比べて、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴは、細胞死効果を得ることができるもののその効果は限定的といえた。
【0028】
２．ルシフェラーゼアッセイによる検討
ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞株、ＭＣ３８ ｌｕｃ、ＬＬ／２ ｌｕｃを用いてルシフェラーゼ活性により細胞死が誘導されているか解析を行った（図５）。顕微鏡観察と同条件で細胞を播種、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を添加、光照射を行い、ＰＢＳで洗浄後、Ｄ－ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、１５０μｇ／ｍｌ ２００μｌを添加し、ルシフェラーゼ活性を測定した。どちらの細胞株を用いた場合でもＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を添加し、光を照射した場合は光エネルギー強度異存的にルシフェラーゼ活性の減少が認められた。すなわちＮＩＲ－ＰＩＴにより、細胞死が誘導されることを示している。ＰＩ染色、ルシフェラーゼアッセイいずれの解析方法によっても、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を細胞に結合させ、近赤外光を照射することによって、細胞死が誘導されることが示された。しかし、ＥＧＦＲなど腫瘍で高発現する抗原に対するＰＩＴと同程度の細胞死を誘導するためにはより強い光エネルギーを必要とする。ここでは示さないが、他の細胞株でも同様の結果が得られている。
ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞株、ＭＣ３８ ｌｕｃ、ＬＬ／２ ｌｕｃを用いてルシフェラーゼ活性により細胞死が誘導されているか解析を行った（図５）。顕微鏡観察と同条件で細胞を播種、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を添加、光照射を行い、ＰＢＳで洗浄後、Ｄ－ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、１５０μｇ／ｍｌ ２００μｌを添加し、ルシフェラーゼ活性を測定した。どちらの細胞株を用いた場合でもＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を添加し、光を照射した場合は光エネルギー強度異存的にルシフェラーゼ活性の減少が認められた。すなわちＮＩＲ－ＰＩＴにより、細胞死が誘導されることを示している。ＰＩ染色、ルシフェラーゼアッセイいずれの解析方法によっても、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を細胞に結合させ、近赤外光を照射することによって、細胞死が誘導されることが示された。しかし、ＥＧＦＲなど腫瘍で高発現する抗原に対するＰＩＴと同程度の細胞死を誘導するためにはより強い光エネルギーを必要とする。ここでは示さないが、他の細胞株でも同様の結果が得られている。
【0029】
３．ＡＴＰアッセイによる自然免疫の誘導の検討
ＭＣ３８細胞を上記と同様に播種し、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を添加、１２８Ｊ／ｃｍ２で光照射を行い、上清を採取し、ＡＴＰ濃度を測定した（図６）。コントロール、光照射のみ（ｌｉｇｈｔ ｏｎｌｙ）、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００添加のみ（ＡＰＣ ｏｎｌｙ）では、細胞内のＡＴＰの放出は見られないが、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を添加し、光照射を行った場合（ＰＩＴ）には有意なＡＴＰの放出が認められた。ＡＴＰの放出により自然免疫が活性化することが知られているので、培養上清でのＡＴＰ濃度の増加は自然免疫の誘導に寄与すると考えられる。したがって、ＰＤ－Ｌ１を標的とした光免疫療法を行うことによって、細胞死が誘導されるだけではなく自然免疫が活性化することが示唆された。
ＭＣ３８細胞を上記と同様に播種し、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を添加、１２８Ｊ／ｃｍ２で光照射を行い、上清を採取し、ＡＴＰ濃度を測定した（図６）。コントロール、光照射のみ（ｌｉｇｈｔ ｏｎｌｙ）、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００添加のみ（ＡＰＣ ｏｎｌｙ）では、細胞内のＡＴＰの放出は見られないが、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を添加し、光照射を行った場合（ＰＩＴ）には有意なＡＴＰの放出が認められた。ＡＴＰの放出により自然免疫が活性化することが知られているので、培養上清でのＡＴＰ濃度の増加は自然免疫の誘導に寄与すると考えられる。したがって、ＰＤ－Ｌ１を標的とした光免疫療法を行うことによって、細胞死が誘導されるだけではなく自然免疫が活性化することが示唆された。
【0030】
［ｉｎ ｖｉｖｏモデルでのＮＩＲ－ＰＩＴの効果の検討］
１．マウス大腸癌ＭＣ３８細胞を用いた検討
マウスｉｎ ｖｉｖｏモデルを用いて、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を用いた光免疫療法の効果を解析した。腫瘍細胞を皮下に移植した無治療群をコントロールとし、コントロールＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注し、光を照射した群（Ｃｏｎｔ-Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００ ｉｖ + ＮＩＲ－ｌｉｇｈｔ）、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注しただけの群（ＰＤ－Ｌ１-Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００ ｉｖ）、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注後、光照射を行った群（ＰＩＴ）の４群に分け、光免疫療法の効果を検討した。
１．マウス大腸癌ＭＣ３８細胞を用いた検討
マウスｉｎ ｖｉｖｏモデルを用いて、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を用いた光免疫療法の効果を解析した。腫瘍細胞を皮下に移植した無治療群をコントロールとし、コントロールＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注し、光を照射した群（Ｃｏｎｔ-Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００ ｉｖ + ＮＩＲ－ｌｉｇｈｔ）、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注しただけの群（ＰＤ－Ｌ１-Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００ ｉｖ）、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注後、光照射を行った群（ＰＩＴ）の４群に分け、光免疫療法の効果を検討した。
【0031】
９週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の背臀側の皮下に２×１０６個のＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を接種した。３日後に、抗体－ＩＲ７００複合体を投与する群には、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００、あるいはコントロールＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を一個体あたり１００μｇ尾静注し、光照射を行う群に対しては、抗体投与１日後に７５Ｊ／ｃｍ２で光照射を行った。光照射を行った日をｄａｙ０とする。各群７～９匹で実験を行っている。
【0032】
治療効果は、推定腫瘍体積と腫瘍のルシフェラーゼ活性を測定することによって行った。推定腫瘍体積は、腫瘍の長径及び短径を計測し、長径×短径２×１／２として算出した。ルシフェラーゼ活性は、Ｄ-ルシフェリン（７．５ｍｇ／ｍｌ、２００μｌ）を腹腔内投与し、ＩＶＩＳ（登録商標） ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを用いて計測した。測定する発光単位は放射輝度とし、解析はＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）で行った。
【0033】
ＩＶＩＳによるイメージを図７に示す。腫瘍細胞を皮下に移植したコントロール群、コントロールＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を投与し光を照射した群、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注しただけの群では、いずれもルシフェラーゼ活性の減弱はなく、ｄａｙ１からｄａｙ３まで強い発光が認められた。これに対し、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注し、近赤外光線を照射した群（ＰＩＴ）では、ルシフェラーゼ活性の顕著な減少が認められた。
【0034】
ルシフェラーゼ活性の放射輝度、腫瘍体積の経時的な変化を図８に示す。Ｄａｙ０の近赤外光線照射を行う前の値をそれぞれ１として相対的な変化を示している。ルシフェラーゼ活性は、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注し、近赤外光線を照射した光免疫療法を行った群（ＰＩＴ）では光照射３日目まで顕著に低い値を維持しているが、コントロール、コントロールＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を投与し光照射した群、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００投与のみの群ではルシフェラーゼ活性の減少は見られず、経時的に活性の増加、すなわち腫瘍細胞の増殖が認められた（図８（Ａ））。腫瘍体積についても、光免疫療法を行った群では、光照射１日目で腫瘍体積の顕著な減少が認められ、１０日目まで緩やかな増加が認められるのみであり、光照射１０日目においてもＤａｙ０とほぼ同等の腫瘍体積を維持していた。一方、他の群ではＤａｙ０と比較して１５倍から２０倍、腫瘍体積の増加が認められた（図８（Ｂ））。
【0035】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系であるＰＩ染色による顕微鏡観察、ルシフェラーゼアッセイの結果からは、７５Ｊ／ｃｍ２という光エネルギーでは、細胞死を強く誘導することはできない（図４、５参照）。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏの実験系においてはルシフェラーゼ活性、腫瘍体積、いずれも顕著な効果が認められた。ｉｎ ｖｉｖｏ実験系において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系より強い効果が認められたことは、従来の光免疫療法の効果に加えて、免疫チェックポイント分子を標的としていることによる特有の効果であると考えられる。
【0036】
各群の生存曲線を示す（図９）。光免疫療法を行った群（ＰＩＴ）では顕著な生存の延長が認められ、２ヶ月を経過しても生存している個体が認められた。この個体は観察期間にわたり腫瘍の再発はなく、さらに数ヶ月に渡り生存していた。一方、コントロール、及びコントロールＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を投与し光照射を行った群では２０日前後で全ての個体の死亡が確認された。ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を投与し、光照射を行わなかった群、すなわち抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫療法を行った群では、コントロール群と比べて有意な差はないものの、約４０日生存している個体が認められた。抗ＰＤ－Ｌ１抗体投与による効果は幾分あると考えられるが、光免疫療法を行った群に見られるように６０日以上に渡って生存が認められる個体はなかった。
【0037】
２．マウス肺癌ＬＬ／２細胞を用いた検討
ＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を用いた実験と同様に、２×１０６個のＬＬ／２ ｌｕｃ細胞をマウス背臀側皮下に接種し、３日後にＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注し、１日後に光照射を行った（光免疫治療群、ＰＩＴ）。コントロールは上記と同様、ＬＬ／２ ｌｕｃ細胞を皮下に摂取した無治療群である。光免疫治療群とコントロールのＩＶＩＳイメージ（図１０（Ａ））、ルシフェラーゼ活性（図１０（Ｂ））、腫瘍体積（図１０（Ｃ））の経時的変化を示す。光照射を行った日をｄａｙ０としている。
ＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を用いた実験と同様に、２×１０６個のＬＬ／２ ｌｕｃ細胞をマウス背臀側皮下に接種し、３日後にＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注し、１日後に光照射を行った（光免疫治療群、ＰＩＴ）。コントロールは上記と同様、ＬＬ／２ ｌｕｃ細胞を皮下に摂取した無治療群である。光免疫治療群とコントロールのＩＶＩＳイメージ（図１０（Ａ））、ルシフェラーゼ活性（図１０（Ｂ））、腫瘍体積（図１０（Ｃ））の経時的変化を示す。光照射を行った日をｄａｙ０としている。
【0038】
マウス肺癌細胞ＬＬ／２ ｌｕｃを用いた系でも、ＰＩＴ治療群では、ルシフェラーゼ活性は光照射３日目までほとんど観察されず、コントロールに対して有意な差が認められた。また、腫瘍体積の増加も抑制され、光免疫治療８日目まで、コントロールと有意な差が認められた。
【0039】
３．マウス前立腺癌Ｔｒａｍｐ－Ｃ２細胞を用いた検討
上記と同様に、２×１０６個のＴｒａｍｐ－Ｃ２ ｌｕｃ細胞をマウス背臀側皮下に接種し、３日後にＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２-ＩＲ７００を尾静注し、１日後に光照射を行った（光免疫治療群、ＰＩＴ）。光免疫治療群とコントロールである無治療群のＩＶＩＳイメージ（図１１（Ａ））、ルシフェラーゼ活性（図１１（Ｂ））、腫瘍体積（図１１（Ｃ））の経時的変化を示す。光照射を行った日をｄａｙ０としている。
上記と同様に、２×１０６個のＴｒａｍｐ－Ｃ２ ｌｕｃ細胞をマウス背臀側皮下に接種し、３日後にＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２-ＩＲ７００を尾静注し、１日後に光照射を行った（光免疫治療群、ＰＩＴ）。光免疫治療群とコントロールである無治療群のＩＶＩＳイメージ（図１１（Ａ））、ルシフェラーゼ活性（図１１（Ｂ））、腫瘍体積（図１１（Ｃ））の経時的変化を示す。光照射を行った日をｄａｙ０としている。
【0040】
マウス前立腺癌細胞Ｔｒａｍｐ－Ｃ２ ｌｕｃを用いた系でも、ＰＩＴ治療群では、ルシフェラーゼ活性は光照射３日目までほとんど観察されなかった。また、腫瘍体積の増加も抑制され、光免疫治療６日目まで確認したところ、コントロール群と有意な差が認められた。
【0041】
上記結果から、癌で発現している免疫チェックポイント分子、ＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法は、癌種に関わらず効果を及ぼすものと認められる。従来の光免疫療法は癌細胞表面に高発現している癌マーカーを標的としており、標的分子が発現していない、あるいは低発現の腫瘍に対しては適用することができなかった。しかしながら、免疫チェックポイント分子を標的にする場合には、免疫チェックポイント分子が発現さえしていれば、仮に相当低発現であったとしても、また、由来する臓器を問わずどのような腫瘍であっても治療を行うことが可能であり、より多くの患者に対して適用できるものと考えられる。この点が従来の近赤外光線免疫療法と決定的に異なる点である。
【0042】
［転移部に対する効果］
癌で発現している免疫チェックポイント分子を標的とした光免疫治療が、光照射を行った部位に局所的に作用するだけではなく、他の部位、すなわち転移部にも効果があるか解析を行った。９週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の両背臀側皮下にそれぞれ２×１０６個のＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を接種した。３日後に、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００、あるいはコントロールＩｇＧ-Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を１００μｇ尾静注し、１日後に右側のみに７５Ｊ／ｃｍ２で光照射を行った。光照射を行った日をｄａｙ０とする。光照射を行う日の光照射前、光照射後１～３日目までのＩＶＩＳイメージ（図１２（Ａ））、ルシフェラーゼ活性（図１２（Ｂ））、１３日目までの腫瘍体積（図１２（Ｃ））、生存曲線（図１２（Ｄ））を示す。各群３匹で実験を行っている。
癌で発現している免疫チェックポイント分子を標的とした光免疫治療が、光照射を行った部位に局所的に作用するだけではなく、他の部位、すなわち転移部にも効果があるか解析を行った。９週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の両背臀側皮下にそれぞれ２×１０６個のＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を接種した。３日後に、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００、あるいはコントロールＩｇＧ-Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を１００μｇ尾静注し、１日後に右側のみに７５Ｊ／ｃｍ２で光照射を行った。光照射を行った日をｄａｙ０とする。光照射を行う日の光照射前、光照射後１～３日目までのＩＶＩＳイメージ（図１２（Ａ））、ルシフェラーゼ活性（図１２（Ｂ））、１３日目までの腫瘍体積（図１２（Ｃ））、生存曲線（図１２（Ｄ））を示す。各群３匹で実験を行っている。
【0043】
３日目までのルシフェラーゼ活性は、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００投与群（ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００）では、光照射を行わなかった左側（Ｌ）は、コントロールＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００投与群（Ｃｏｎｔ－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００）と比較してルシフェラーゼ活性が減少する傾向はあったものの、有意差は認められなかった（図１２（Ｂ））。しかし、腫瘍体積は、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００投与群では光照射を行わなかった左側（Ｌ）についても、コントロールＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００投与群に対して、１、３、６日目に有意な差が認められた。ＮＩＲ－ＰＩＴにより光照射を行わなかった腫瘍に対しても腫瘍体積を減少させる効果が認められたことは、転移部に対しても治療効果が生じることを示している。放射線治療では、放射線を照射した部位だけではなく、離れた転移巣にも効果を及ぼすアブスコパル効果が知られている。免疫チェックポイントに関わる分子を標的とした近赤外光線免疫療法では、転移巣にも効果が及ぶ、光アブスコパル効果とも言うべき効果が生じていた。光アブスコパル効果は、ＥＧＦＲなど高発現している標的に対する従来の近赤外光線免疫療法では生じない、免疫チェックポイントに関わる分子を標的とする近赤外光線免疫療法に特有の効果である。治療効果は予後も改善し、コントロールＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００投与群は１５日目に全ての個体が死亡したのに対し、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００投与群では、２５日目まで生存していた個体があり、有意な予後の改善も認められた。
【0044】
［ＮＩＲ－ＰＩＴ後に、反対側に接種した腫瘍細胞に対する増殖抑制効果］
ＮＩＲ－ＰＩＴによる腫瘍退縮効果が免疫を介したものであることをさらに確認するために、ＮＩＲ－ＰＩＴ後に、反対側に癌細胞を接種し、増殖に対する効果を解析した。図１３（Ａ）に模式的に示すように、９週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の右背臀側皮下にそれぞれ２×１０６個のＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を接種し、３日後に、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００、あるいはコントロールＩｇＧ-Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を１００μｇ尾静注し（ｄａｙ －１）、１日後に７５Ｊ／ｃｍ２で光照射を行った（ｄａｙ ０）。翌日、２×１０６個のＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を左背臀側皮下に接種し（ｄａｙ １）、経時的に左背臀側の腫瘍体積の測定を行った（図１３（Ｂ））。コントロールであるＩｇＧ-Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注した群と比較して、ＮＩＲ－ＰＩＴを行った群は、いずれの個体もＮＩＲ－ＰＩＴ後に接種した腫瘍細胞の増殖が抑制されていた。ＮＩＲ－ＰＩＴ後に接種した腫瘍細胞に対しても増殖抑制があることから、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴは、免疫記憶応答が介在していることを示唆する。したがって、腫瘍の再発予防を期待することができる。
ＮＩＲ－ＰＩＴによる腫瘍退縮効果が免疫を介したものであることをさらに確認するために、ＮＩＲ－ＰＩＴ後に、反対側に癌細胞を接種し、増殖に対する効果を解析した。図１３（Ａ）に模式的に示すように、９週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の右背臀側皮下にそれぞれ２×１０６個のＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を接種し、３日後に、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００、あるいはコントロールＩｇＧ-Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を１００μｇ尾静注し（ｄａｙ －１）、１日後に７５Ｊ／ｃｍ２で光照射を行った（ｄａｙ ０）。翌日、２×１０６個のＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を左背臀側皮下に接種し（ｄａｙ １）、経時的に左背臀側の腫瘍体積の測定を行った（図１３（Ｂ））。コントロールであるＩｇＧ-Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を尾静注した群と比較して、ＮＩＲ－ＰＩＴを行った群は、いずれの個体もＮＩＲ－ＰＩＴ後に接種した腫瘍細胞の増殖が抑制されていた。ＮＩＲ－ＰＩＴ後に接種した腫瘍細胞に対しても増殖抑制があることから、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴは、免疫記憶応答が介在していることを示唆する。したがって、腫瘍の再発予防を期待することができる。
【0045】
［免疫反応とターゲットする分子発現の誘導］
ＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法によって、光照射を行っていない腫瘍に対しても効果が認められたことから、抗腫瘍免疫の活性化が誘導されている可能性が示唆された。そこで、ＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法によるＰＤ－Ｌ１の発現の変化をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ両方の系を用いて解析を行った。
ＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法によって、光照射を行っていない腫瘍に対しても効果が認められたことから、抗腫瘍免疫の活性化が誘導されている可能性が示唆された。そこで、ＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法によるＰＤ－Ｌ１の発現の変化をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ両方の系を用いて解析を行った。
【0046】
マウス大腸癌細胞ＭＣ３８ ｌｕｃを１２ウェルプレートに１×１０５／ウェルで播種し、２４時間後に１０μｇ／ｍＬになるようにＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を添加し、６時間後に３２Ｊ／ｃｍ２光照射し、５日後にフローサイトメトリーによりＰＤ－Ｌ１の発現を評価した。ＰＤ－Ｌ１の検出は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いて行った。図１４（Ａ）に示すように、コントロール（ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００無添加、光照射なし）、光照射のみ（ｌｉｇｈｔ）、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００添加のみ（ＡＰＣ ｏｎｌｙ）では、平均蛍光強度に変化が認められないが、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００添加、光照射群、すなわちＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法を行った群（ＰＩＴ）は、コントロールに対して有意に平均蛍光強度の低下が認められた。ｉｎ ｖｉｔｒｏの系では、ＰＤ－Ｌ１の発現の高いものが光免疫療法によって死滅し、発現の低い細胞のみが選択的に生存していることを示している。
【0047】
次に、ｉｎ ｖｉｖｏの系において、光免疫療法のＰＤ－Ｌ１発現に対する効果を解析した。マウス背臀側の皮下にそれぞれ２×１０６個のＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を接種し、３日後にＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を１００μｇ尾静注し１日後に３２Ｊ／ｃｍ２で光照射を行った。照射エネルギーの３２Ｊ／ｃｍ２は、上記実施例において腫瘍退縮を観察した光強度である７５Ｊ／ｃｍ２の約１／２の弱い光エネルギーである。この強度の光エネルギーは、腫瘍部において弱く細胞死を誘導し、炎症を惹起する光エネルギーであると考えられる。光照射７日後にマウスを安楽殺し、腫瘍細胞を取り出しＰＤ－Ｌ１発現の解析をｉｎ ｖｉｔｒｏの系と同様にフローサイトメトリーを用いて行った（図１４（Ｂ））。光免疫療法を行わなかったコントロール群と比較して、光免疫療法を行った群では腫瘍細胞のＰＤ－Ｌ１に有意な発現増強が認められた。ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を用いたＮＩＲ－ＰＩＴにより、腫瘍部位に強度の炎症が惹起され、残存する腫瘍にＰＤ－Ｌ１発現を誘導したと考えられた。このことは、本治療の免疫編集機能といえる。
【0048】
ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴは、腫瘍においてＰＤ－Ｌ１の発現を誘導する。すなわち、腫瘍免疫機構としては負に作用する。しかし、ＰＤ－Ｌ１の発現を誘導することにより、ＰＤ－Ｌ１が発現していない、あるいは発現の低い腫瘍であっても、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴを行うことにより、ＰＤ－Ｌ１の発現が増強することを示している。発現増強後に、再度ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を用いた光免疫療法を行えば、初回治療で死滅させることができなかった腫瘍細胞の細胞死をさらに誘導することが可能となる。くわえて、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００自身の免疫チェックポイント阻害作用の相乗効果も、発現増強により期待できると考えられる。これらのポジティブフィードバック機構による癌免疫の増強は、本治療のユニークな特筆すべき機構といえる。
【0049】
免疫チェックポイント分子を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴによる癌免疫の増強効果は、他のＮＩＲ－ＰＩＴとの併用により、より高い効果を得ることが期待できる。例えば、ＥＧＦＲなど腫瘍で高発現している標的に対するＮＩＲ－ＰＩＴと、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴを併用すれば、近赤外光を照射した腫瘍においてＥＧＦＲを高発現している腫瘍細胞をまず死滅させることができる。さらに、ＥＧＦＲを発現していない、あるいは低発現の腫瘍細胞、さらには転移部の腫瘍細胞に対しては、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴにより死滅させることができる。さらに、複数回の治療により、ＰＤ－Ｌ１発現が誘導されることから、変異によりＥＧＦＲが発現していない腫瘍細胞も完全に取り除くことができる。その結果、従来のＮＩＲ－ＰＩＴでは再発の可能性がある腫瘍に対しても、寛解が得られる可能性がある。
【0050】
ＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法の腫瘍免疫に対する効果をさらに解析するために、光照射後のＣＤ８（+）Ｔ細胞、ＮＫ細胞の活性化マーカーの測定を行った。マウス背臀側の皮下に２×１０６個のＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を接種した。３日後に、ＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を１００μｇ尾静注し、１日後に７５Ｊ／ｃｍ２で光照射を行い、１．５時間後に安楽殺し、腫瘍内部（図１５）、血液中（図１６）、脾臓（図１７）中のＣＤ８（+）Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、及びＮＫ細胞（ＣＤ３-ＮＫ１．１＋）のＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１０７ａ発現をフローサイトメトリーにより解析した。
【0051】
解析に用いた抗体は下記のとおりである。
ＣＤ４：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ ｃｌｏｎｅＲＭ４－５、ＣＤ８：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａ ｃｌｏｎｅ５３．６７、ＣＤ３：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３ｅ ｃｌｏｎｅ１４５－２ｃ１１、ＮＫ：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＮＫ１．１ ｃｌｏｎｅＰＫ１３６、ＩＦＮγ：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩＦＮγ ｃｌｏｎｅＸＭＧ１．２、ＩＬ－２：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩＬ－２ ｃｌｏｎｅＪＥＳ６－５Ｈ４、ＣＤ６９：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ６９ ｃｌｏｎｅＨ１．２Ｆ３、ＣＤ２５：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ２５ ｃｌｏｎｅ ｅＢｉｏ３Ｃ７、ＣＤ１０７ａ：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１０７ａ ｃｌｏｎｅ １Ｄ４Ｂ。
ＣＤ４：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ ｃｌｏｎｅＲＭ４－５、ＣＤ８：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａ ｃｌｏｎｅ５３．６７、ＣＤ３：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３ｅ ｃｌｏｎｅ１４５－２ｃ１１、ＮＫ：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＮＫ１．１ ｃｌｏｎｅＰＫ１３６、ＩＦＮγ：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩＦＮγ ｃｌｏｎｅＸＭＧ１．２、ＩＬ－２：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩＬ－２ ｃｌｏｎｅＪＥＳ６－５Ｈ４、ＣＤ６９：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ６９ ｃｌｏｎｅＨ１．２Ｆ３、ＣＤ２５：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ２５ ｃｌｏｎｅ ｅＢｉｏ３Ｃ７、ＣＤ１０７ａ：ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１０７ａ ｃｌｏｎｅ １Ｄ４Ｂ。
【0052】
腫瘍内部では、ＩＦＮγの発現がＮＫ細胞で、ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現がＣＤ８（＋）Ｔ細胞及びＮＫ細胞で、光免疫療法により有意に増加しているのが認められた（図１５）。また、血中では、ＩＦＮγ及びＩＬ－２発現がＮＫ細胞で、ＣＤ６９発現がＣＤ８（＋）Ｔ細胞及びＮＫ細胞で有意に増加しているのが認められた（図１６）。さらに、脾臓でもＩＦＮγの発現がＮＫ細胞で、ＣＤ６９発現がＣＤ８（＋）Ｔ細胞及びＮＫ細胞で有意に増加していた。その他の活性化マーカーも有意差はないものの光免疫療法後に発現増加が認められたことから、自然免疫が活性化していることが明らかとなった。特に、血液中のＣＤ８（＋）Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化が認められたことは、先に示した転移部における腫瘍細胞の退縮やＮＩＲ－ＰＩＴ後に反対側に接種した腫瘍の増殖抑制と呼応するデータである。
【0053】
［マーカーの検討］
ある治療が患者に対して有効であるか早期に判断することは、患者に最適な治療を行う上で重要であるだけではなく、医療経済の面からも重要である。そこで、患者がＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法に対して治療効果を有するかを判定するマーカーについて検討を行った。ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴを行い、末梢血のＣｙＴＯＦ解析によって光照射後に変化するマーカーを網羅的に解析した。マウス背臀側皮下に２×１０６個のＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を接種し、３日後にＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を１００μｇ尾静注し、１日後に７５Ｊ／ｃｍ２で光照射を行った。光照射前、６時間後、２４時間後に血液を採取しＣｙＴＯＦで解析を行った（図１８）。
ある治療が患者に対して有効であるか早期に判断することは、患者に最適な治療を行う上で重要であるだけではなく、医療経済の面からも重要である。そこで、患者がＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法に対して治療効果を有するかを判定するマーカーについて検討を行った。ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴを行い、末梢血のＣｙＴＯＦ解析によって光照射後に変化するマーカーを網羅的に解析した。マウス背臀側皮下に２×１０６個のＭＣ３８ ｌｕｃ細胞を接種し、３日後にＰＤ－Ｌ１－Ｆ（ａｂ’）２－ＩＲ７００を１００μｇ尾静注し、１日後に７５Ｊ／ｃｍ２で光照射を行った。光照射前、６時間後、２４時間後に血液を採取しＣｙＴＯＦで解析を行った（図１８）。
【0054】
Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、光照射６時間後、２４時間後ともに、照射前（ｎａｉｖｅ）に比べて有意に減少が認められた。これらの細胞は、光照射した腫瘍部に移動したために、血中で減少が生じるのではないかと考えられる。一方、ＭＤＳＣ（Ｍｙｅｌｏｉｄ-ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌ：骨髄由来サプレッサー細胞）は６時間後に、単球／マクロファージ（Ｍｏｎｏ／ＭΦ）、樹状細胞（ＤＣ）は２４時間後に照射前に比べて有意に増加していた。
【0055】
有意差が認められた血球はいずれも、ＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法の治療効果を確認するマーカーとして使用することができる。特に、ＭＤＳＣは、光免疫療法開始前はほとんど血中に認められないことから、これを治療効果の指標とすれば、光免疫療法を適用して効果のある患者を判別することができる。すなわち、光免疫療法を行った後、ＭＤＳＣの増加が認められれば、治療効果を奏する患者だと予測することができる。
【0056】
ＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法は、最初の治療後にＰＤ－Ｌ１が発現上昇し、さらに治療効果が高まることが予測されることから、複数回の光治療を行うことが望ましい。通常、抗体医薬は２～３週間体内に留まることから、上記血球マーカーの変動が認められた患者に対し、この期間内に複数回の光照射を行うことにより、光照射を行った腫瘍部、転移部での奏効が期待できる。また、ヒトでは通常３００Ｊ／ｃｍ２で光照射を行うが、効果の弱い場合は、さらに強い光照射を行ってもよい。光照射後のＭＤＳＣをはじめとする血球マーカーの変動を指標として、治療回数、治療間隔、照射エネルギーを適切に設定することができる。
【0057】
さらに、血清サイトカインの変化はＣｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙを用いて、ＥＬＩＳＡにより解析した。Ｇ－ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：顆粒球コロニー刺激因子）、ＩＬ－６、ＫＣ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ：ケラチノサイト由来ケモカイン）、ＭＩＰ－２（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ－２：マクロファージ炎症タンパク質２）量を測定した（図１９）。いずれも光免疫治療６時間後に上昇が認められた。これらサイトカインの上昇を指標として治療を行ってもよい。
【0058】
ＰＤ－Ｌ１を標的とした光免疫療法によって変化が認められた血球、サイトカインのマーカーはいずれも末梢血で測定が可能であること、また、６時間という早期に確認が可能であることから、ＰＤ－Ｌ１を標的とする光免疫療法の治療効果の確認には非常に有効な手段である。
【0059】
また、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴによるＧ－ＣＳＦの増加が認められたが、Ｇ－ＣＳＦは骨髄を刺激して血球数を増加させる効果があることから、骨髄抑制が頻繁に生じる化学療法の副作用を抑制する効果も期待できる。骨髄抑制は骨髄幹細胞がダメージを受け、血球成分である白血球、血小板、赤血球を生成する機能が正常に作用しなくなり、血球成分が減少する副作用である。具体的な症状として、感染症、貧血、出血などが現れるが自覚しづらく、感染症などを合併した場合には、治療を継続できないなどの問題が生じる。骨髄抑制は、ほとんどすべての抗がん剤に副作用として出現する可能性があるが。特に壊死起因性抗がん剤として分類されている薬剤による副作用として多く認められる、壊死起因性抗がん剤としては、例えば、タキサン系の薬剤である、パクリタキセル、ドセタキセル等、アントラサイクリン系の薬剤であるダウノルビシン、エピルビシン等、ビンカアルカロイド系の薬剤であるビンブラスチン、ビンクリスチン等、抗がん抗生物質であるマイトマイシンＣ等がある。さらに、分子標的薬の一部、また、放射線治療も照射部位によっては骨髄抑制が出現する可能性がある。ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴはＧ－ＣＳＦを増加させ血球数を増加させることから、これら化学療法剤、あるいは骨髄抑制が生じる可能性のある放射線療法と併用することによって、副作用である骨髄抑制を抑える可能性がある。
【0060】
ＰＤ－Ｌ１などの腫瘍細胞に特異的に発現する免疫チェックポイント分子であれば、癌種、臓器によらず、どのような癌であってもある程度の発現が認められる。したがって、腫瘍細胞に発現する免疫チェックポイント分子を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴは、あらゆる癌に適用することができる。さらに、上記実施例で示したように、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と光感受性物質との複合体は、初回のＮＩＲ－ＰＩＴ後にＰＤ－Ｌ１の発現を誘導することから、ＰＤ－Ｌ１の発現が低い症例に対しても複数回の光照射により治療効果が期待できる。従来のＮＩＲ－ＰＩＴは標的分子を細胞表面に高発現していなければ効果を奏せず、これまで治療が困難な症例も多かった。しかし、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴは、治療開始時のＰＤ－Ｌ１発現が低くても治療によってＰＤ－Ｌ１発現を誘導することから、多くの症例に適用できるものと考えられる。また、従来のＮＩＲ－ＰＩＴのように、光照射を行った部位で細胞死を誘導するだけではなく、自然免疫を誘導することから、全身的な治療効果、すなわち転移部に対する効果、さらに再発を予防する効果を有する点で優れている。また、腫瘍免疫の増強が期待できることから、他の免疫チェックポイント阻害薬の効果を高める手法としても使用することができる。
【0061】
また、ＥＧＦＲ等、腫瘍細胞で高発現している分子を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴと併用すれば、標的分子に対して細胞死を誘導するとともに、標的分子に遺伝子変異が生じ、標的分子が発現していない、あるいは抗体が標的分子に結合しないように変異した腫瘍細胞に対しても効果を期待することができる。従来の高発現している分子を標的としたＮＩＲ－ＰＩＴでは、細胞死を誘導することができなかった腫瘍細胞に対しても、免疫チェックポイント分子を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴと併用することにより、細胞死を誘導できる可能性があることから、予後の改善、再発の防止を期待することができる。さらに、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴでは、Ｇ－ＣＳＦの増加が認められることから、血球数を増加させる効果を期待することができるので、骨髄抑制が生じる化学療法や放射線治療と併用することにより、副作用を減弱させる効果を期待することができる。
【要約】
【課題】抗体による治療や従来の近赤外光線免疫療法（ＮＩＲ－ＰＩＴ）による治療では効果を奏さなかった特異的癌抗原が不明ないしは低発現な腫瘍に対しても治療効果を奏する治療法を提供することを課題とする。
【解決手段】腫瘍で発現している免疫チェックポイント分子を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴは、腫瘍細胞に細胞死を誘導するだけではなく、免疫チェックポイント分子の発現を増強させる。その結果、複数回の治療によって強い効果を生じさせることができる。また、免疫反応を誘導することから、光照射部の局所的な効果だけではなく、全身的な効果、すなわち転移部に対しても効果を奏する。
【選択図】図９
【解決手段】腫瘍で発現している免疫チェックポイント分子を標的とするＮＩＲ－ＰＩＴは、腫瘍細胞に細胞死を誘導するだけではなく、免疫チェックポイント分子の発現を増強させる。その結果、複数回の治療によって強い効果を生じさせることができる。また、免疫反応を誘導することから、光照射部の局所的な効果だけではなく、全身的な効果、すなわち転移部に対しても効果を奏する。
【選択図】図９
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
