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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-08
(45)【発行日】2025-01-17
(54)【発明の名称】血液凝固時間測定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/86 20060101AFI20250109BHJP
【ＦＩ】
G01N33/86
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021567661
(86)(22)【出願日】2020-12-25
(86)【国際出願番号】 JP2020048676
(87)【国際公開番号】W WO2021132552
(87)【国際公開日】2021-07-01
【審査請求日】2023-09-07
(31)【優先権主張番号】P 2019237427
(32)【優先日】2019-12-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】390037327
【氏名又は名称】積水メディカル株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】川辺 俊樹
【審査官】大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】特開平０６－２４９８５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／１７０９４４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／１８７２１０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１９－０８６５１７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／８６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
血液凝固時間測定方法であって、〔１〕血液検体の凝固反応についての計測値Ｐ（ｉ）を平滑化及びゼロ点調整して、反応Ｘ（ｉ）を取得すること、
〔２〕該反応Ｘ（ｉ）の積算比Ｚ（ｉ）を取得すること、ここで該Ｚ（ｉ）は、第１の計測区間でのＸの積算値と、該第１の計測区間と隣り合う第２の計測区間でのＸの積算値との比である、
〔３〕パラメータｔｅ［ｋ］、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）、ｔｃ［ｋ］、ｔｅ［ｋ－１］、Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］）、及びｔｃ［ｋ－１］を算出すること、ここで、
ｋは２以上の整数であり；
ｔｅ［ｋ］及びｔｅ［ｋ－１］は、それぞれＺ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ］を満たすｉでの計測時間、及びＺ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ－１］を満たすｉでの計測時間であり、
ここで、Ｚｓ［ｋ］及びＺｓ［ｋ－１］は、該Ｚ（ｉ）の閾値であって、かつＺｓ［ｋ］＜Ｚｓ［ｋ－１］であり；
Ｘ（ｔｅ［ｋ］）及びＸ（ｔｅ［ｋ－１］）は、それぞれｔｅ［ｋ］及びｔｅ［ｋ－１］での反応Ｘであり；
ｔｃ［ｋ］及びｔｃ［ｋ－１］は、それぞれＸ（ｉ）＝｛Ｘ（ｔｅ［ｋ］）×Ｑ％｝を満たすｉでの計測時間、及び｛Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］）×Ｑ％｝を満たすｉでの計測時間であり；
１＜Ｑ＜１００である、
〔４〕指標Ｒ［ｋ］、及び／又は指標ＴＲ［ｋ］を算出すること、
ここで、
Ｒ［ｋ］＝Ｘ（ｔｅ［ｋ］）／Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］） (2)
ＴＲ［ｋ］＝Δｔｃ［ｋ］／Δｔｅ［ｋ］ (5)
Δｔｃ［ｋ］＝ｔｃ［ｋ］－ｔｃ［ｋ－１］ (3)
Δｔｅ［ｋ］＝ｔｅ［ｋ］－ｔｅ［ｋ－１］ (4)
〔５〕該Ｒ［ｋ］及び／又は該ＴＲ［ｋ］が所定の条件を満たす場合、該ｔｃ［ｋ］又は該ｔｃ［ｋ－１］を凝固時間Ｔｃとして決定すること、
ここで、
該Ｒ［ｋ］についての該所定の条件が、該Ｒ［ｋ］が予め定めた基準値Ｒｓであるか又はそれより小さい値であることであり、
該ＴＲ［ｋ］についての該所定の条件が、該ＴＲ［ｋ］が予め定めた基準値ＴＲｓであるか又はそれより小さい値であることである、
を含む、方法。
【請求項2】
工程〔５〕で該Ｒ［ｋ］又はＴＲ［ｋ］が該所定の条件を満たさない場合、ｋ＝ｋ＋１として、工程〔３〕～〔５〕を繰り返す、請求項１記載の方法。
【請求項3】
Ｚｓ［ｋ］が１より大であり、かつＺｓ［１］が１．１００以下である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
ｋが１０以下である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項5】
Ｚｓ［ｋ－１］とＺｓ［ｋ］との差が０．０５０～０．００１である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
Ｚ（ｉ）が下記式：Z(i) = [X(i+1)+X(i+2)+...+X(i+m)]/[X(i-m)+X(i-m+1)+...+X(i-1)] (1)
（m＝10～30）
で表される、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
【請求項7】
工程〔３〕が、ｉが所定の算出開始点ｓに達した以降に行われる、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
【請求項8】
前記算出開始点ｓが凝固反応の速度が最大となる時間より後の計測点である、請求項７記載の方法。
【請求項9】
Ｖ（ｉ）＝Ｖｓである２点間の計測点数が所定の値を超えたときにＶ（ｉ）＝Ｖｓとなる遅いほうの計測点を算出開始点ｓとして検出することをさらに含み、ここで、
Ｖ（ｉ）は前記反応Ｘ（ｉ）の微分値であり、
Ｖｓは、Ｖ（ｉ）がそのピーク値のＳ％となるときの値である、
請求項７又は８記載の方法。
【請求項10】
前記算出開始点ｓが、工程〔２〕で取得したＺ（ｉ）がピークに達した以降の計測点である、請求項７記載の方法。
【請求項11】
工程〔１〕～〔２〕と工程〔３〕～〔５〕が並行して行われる、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項12】
前記工程〔３〕～〔５〕の繰り返しを通じてＴｃが決定されなかったとき、Ｔｃが正常に決定されなかったという結果を取得することをさらに含む、請求項２～１１のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血液凝固時間測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
血液凝固検査は、患者の血液検体に所定の試薬を添加して血液凝固時間等を測定することにより、患者の血液凝固能を診断するための検査である。血液凝固時間の典型的な例としては、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンビン時間などがある。血液凝固検査によって患者の止血能力や線溶能力を調べることができる。血液凝固能の異常は、主に凝固時間の延長を引き起こす。例えば、凝固時間の延長は、凝固阻害薬剤の影響、凝固関与成分の減少、先天的な血液凝固因子の欠乏、後天的な凝固反応を阻害する自己抗体などを原因とする。
【0003】
近年では、血液凝固検査の自動計測を行う自動分析装置が汎用されており、血液凝固検査を簡便に実施することが可能である。例えば、ある種の自動分析装置では、血液検体に試薬を添加して得られる混合液に光を当て、得られた散乱光量の変化に基づいて該血液検体の凝固反応を計測する。通常の血液凝固反応では、試薬添加からある程度の時間が経過した時点で、凝固の進行により散乱光量が急激に上昇し、その後、凝固反応が終了に近づくとともに散乱光量は飽和し、プラトーに達する。このような散乱光量の時間的変化に基づいて血液凝固時間を測定することができる。自動分析装置による凝固時間の算出法としては、パーセント検出法、微分法などいくつかの手法が用いられている。中でもパーセント検出法では、単位時間あたりの散乱光変化量が大きいところ、例えば最大散乱光量の５０％到達点を検出することによって、低フィブリノーゲン検体、乳び検体、溶血検体などの異常検体でもかなり正確に凝固時間の測定が可能である。
【0004】
一方、分析装置での測光データには、装置、試薬、検体の状態などに起因する様々なノイズが含まれ、それらは凝固時間の誤検出をもたらし得る。血液検体の自動分析では、ノイズの悪影響を除去して信頼性のある凝固時間を算出することが求められる。測光データのノイズによる凝固時間の誤検出を回避する方法が考案されている。特許文献１には、分析装置からリアルタイムに得られる散乱光量データを平滑化及び原点調整をして基準データＸとし、該基準データから、更にこれを積分した基準積分データＹと、前記基準データの各隣り合う微小時間での積算値の比である基準比データＺとを演算し、該基準比データＺが予め定めた一定の基準比データ値Ｚｓになる時点のうち、該基準比データＺのピーク以降の時点で且つ該基準積分データＹが予め定めた閾値Ｙｓ以上となる時点における基準データ値Ｘｄを選出し、該Ｘｄの１／Ｎ（Ｎは１以上の一定整数）の値が対応する時点までの混合時点からの時間を凝固時間とする血液凝固時間測定方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開平６－２４９８５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、様々な血液凝固反応曲線を示す血液検体の凝固時間を正確に測定することができる、血液凝固時間測定方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
＜１＞血液凝固時間測定方法であって、
〔１〕血液検体の凝固反応についての計測値Ｐ（ｉ）を平滑化及びゼロ点調整して、反応Ｘ（ｉ）を取得すること、
〔２〕該反応Ｘ（ｉ）の積算比Ｚ（ｉ）を取得すること、ここで該Ｚ（ｉ）は、第１の計測区間でのＸの積算値と、該第１の区間と隣り合う第２の計測区間でのＸの積算値との比である、
〔３〕パラメータｔｅ［ｋ］、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）、ｔｃ［ｋ］、ｔｅ［ｋ－１］、Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］）、及びｔｃ［ｋ－１］を算出すること、
ここで、
ｋは２以上の整数であり；
ｔｅ［ｋ］及びｔｅ［ｋ－１］は、それぞれＺ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ］を満たすｉでの計測時間、及びＺ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ－１］を満たすｉでの計測時間であり；
Ｘ（ｔｅ［ｋ］）及びＸ（ｔｅ［ｋ－１］）は、それぞれｔｅ［ｋ］及びｔｅ［ｋ－１］での反応Ｘであり；
ｔｃ［ｋ］及びｔｃ［ｋ－１］は、それぞれＸ（ｉ）＝｛Ｘ（ｔｅ［ｋ］）×Ｑ％｝を満たすｉでの計測時間、及び｛Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］）×Ｑ％｝を満たすｉでの計測時間であり；
１＜Ｑ＜１００である、
〔４〕指標Ｒ［ｋ］、及び／又は指標ＴＲ［ｋ］を算出すること、
ここで、
Ｒ［ｋ］＝Ｘ（ｔｅ［ｋ］）／Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］） (2)
ＴＲ［ｋ］＝Δｔｃ［ｋ］／Δｔｅ［ｋ］ (5)
Δｔｃ［ｋ］＝ｔｃ［ｋ］－ｔｃ［ｋ－１］ (3)
Δｔｅ［ｋ］＝ｔｅ［ｋ］－ｔｅ［ｋ－１］ (4)
〔５〕該Ｒ［ｋ］及び／又はＴＲ［ｋ］が所定の条件を満たす場合、該ｔｃ［ｋ］又は該ｔｃ［ｋ－１］を凝固時間Ｔｃとして決定すること、
を含む、方法。
＜２＞工程〔５〕で該Ｒ［ｋ］又はＴＲ［ｋ］が該所定の条件を満たさない場合、ｋ＝ｋ＋１として、工程〔３〕～〔５〕を繰り返す、＜１＞記載の方法。
＜３＞Ｚｓ［ｋ］＜Ｚｓ［ｋ－１］であり、Ｚｓ［ｋ］が１より大であり、かつＺｓ［１］が１．１００以下である、＜１＞又は＜２＞記載の方法。
＜４＞ｋが１０以下である、＜１＞～＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞Ｚｓ［ｋ－１］とＺｓ［ｋ］との差が０．０５０～０．００１である、＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞Ｚ（ｉ）が下記式：
Z(i) = {X(i+1)+X(i+2)+...+X(i+m)}/{X(i-m)+X(i-m+1)+...+X(i-1)} (1)
（m＝10～30）
で表される、＜１＞～＜５＞のいずれか１項記載の方法。
＜７＞工程〔３〕が、ｉが所定の算出開始点ｓに達した以降に行われる、＜１＞～＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜８＞前記算出開始点ｓが凝固反応の速度が最大となる時間より後の計測点である、＜７＞記載の方法。
＜９＞Ｖ（ｉ）＝Ｖｓ（Ｖ（ｉ）は前記反応Ｘ（ｉ）の微分値である）である２点間の計測点数が所定の値を超えたときにＶ（ｉ）＝Ｖｓとなる遅いほうの計測点を算出開始点ｓとして検出することをさらに含む、＜７＞又は＜８＞記載の方法。
＜１０＞前記算出開始点ｓが、工程〔２〕で取得したＺ（ｉ）がピークに達した以降の計測点である、＜７＞記載の方法。
＜１１＞工程〔１〕～〔２〕と工程〔３〕～〔５〕が並行して行われる、＜１＞～＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞前記工程〔３〕～〔５〕の繰り返しを通じてＴｃが決定されなかったとき、Ｔｃが正常に決定されなかったという結果を取得することをさらに含む、＜２＞～＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
＜１＞血液凝固時間測定方法であって、
〔１〕血液検体の凝固反応についての計測値Ｐ（ｉ）を平滑化及びゼロ点調整して、反応Ｘ（ｉ）を取得すること、
〔２〕該反応Ｘ（ｉ）の積算比Ｚ（ｉ）を取得すること、ここで該Ｚ（ｉ）は、第１の計測区間でのＸの積算値と、該第１の区間と隣り合う第２の計測区間でのＸの積算値との比である、
〔３〕パラメータｔｅ［ｋ］、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）、ｔｃ［ｋ］、ｔｅ［ｋ－１］、Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］）、及びｔｃ［ｋ－１］を算出すること、
ここで、
ｋは２以上の整数であり；
ｔｅ［ｋ］及びｔｅ［ｋ－１］は、それぞれＺ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ］を満たすｉでの計測時間、及びＺ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ－１］を満たすｉでの計測時間であり；
Ｘ（ｔｅ［ｋ］）及びＸ（ｔｅ［ｋ－１］）は、それぞれｔｅ［ｋ］及びｔｅ［ｋ－１］での反応Ｘであり；
ｔｃ［ｋ］及びｔｃ［ｋ－１］は、それぞれＸ（ｉ）＝｛Ｘ（ｔｅ［ｋ］）×Ｑ％｝を満たすｉでの計測時間、及び｛Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］）×Ｑ％｝を満たすｉでの計測時間であり；
１＜Ｑ＜１００である、
〔４〕指標Ｒ［ｋ］、及び／又は指標ＴＲ［ｋ］を算出すること、
ここで、
Ｒ［ｋ］＝Ｘ（ｔｅ［ｋ］）／Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］） (2)
ＴＲ［ｋ］＝Δｔｃ［ｋ］／Δｔｅ［ｋ］ (5)
Δｔｃ［ｋ］＝ｔｃ［ｋ］－ｔｃ［ｋ－１］ (3)
Δｔｅ［ｋ］＝ｔｅ［ｋ］－ｔｅ［ｋ－１］ (4)
〔５〕該Ｒ［ｋ］及び／又はＴＲ［ｋ］が所定の条件を満たす場合、該ｔｃ［ｋ］又は該ｔｃ［ｋ－１］を凝固時間Ｔｃとして決定すること、
を含む、方法。
＜２＞工程〔５〕で該Ｒ［ｋ］又はＴＲ［ｋ］が該所定の条件を満たさない場合、ｋ＝ｋ＋１として、工程〔３〕～〔５〕を繰り返す、＜１＞記載の方法。
＜３＞Ｚｓ［ｋ］＜Ｚｓ［ｋ－１］であり、Ｚｓ［ｋ］が１より大であり、かつＺｓ［１］が１．１００以下である、＜１＞又は＜２＞記載の方法。
＜４＞ｋが１０以下である、＜１＞～＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞Ｚｓ［ｋ－１］とＺｓ［ｋ］との差が０．０５０～０．００１である、＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞Ｚ（ｉ）が下記式：
Z(i) = {X(i+1)+X(i+2)+...+X(i+m)}/{X(i-m)+X(i-m+1)+...+X(i-1)} (1)
（m＝10～30）
で表される、＜１＞～＜５＞のいずれか１項記載の方法。
＜７＞工程〔３〕が、ｉが所定の算出開始点ｓに達した以降に行われる、＜１＞～＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜８＞前記算出開始点ｓが凝固反応の速度が最大となる時間より後の計測点である、＜７＞記載の方法。
＜９＞Ｖ（ｉ）＝Ｖｓ（Ｖ（ｉ）は前記反応Ｘ（ｉ）の微分値である）である２点間の計測点数が所定の値を超えたときにＶ（ｉ）＝Ｖｓとなる遅いほうの計測点を算出開始点ｓとして検出することをさらに含む、＜７＞又は＜８＞記載の方法。
＜１０＞前記算出開始点ｓが、工程〔２〕で取得したＺ（ｉ）がピークに達した以降の計測点である、＜７＞記載の方法。
＜１１＞工程〔１〕～〔２〕と工程〔３〕～〔５〕が並行して行われる、＜１＞～＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞前記工程〔３〕～〔５〕の繰り返しを通じてＴｃが決定されなかったとき、Ｔｃが正常に決定されなかったという結果を取得することをさらに含む、＜２＞～＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明の方法によれば、正常検体や異常検体を含む様々な血液凝固反応曲線を示す血液検体の凝固時間を正確に測定することができる。また自動分析装置でリアルタイムに多数の検体を分析する場合に、本発明の方法は、凝固時間の誤検出を防止すると共に１検体あたりの分析時間を最適化し、分析効率を向上させる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】本発明による血液凝固時間測定方法の一実施形態の基本フロー。
【図2】Ａ：反応Ｘ及び微分値Ｖ、Ｂ：反応Ｘ及び積算比Ｚ。Ａ、Ｂとも左側は、正常検体、右側はFVIII欠乏検体。
【図3】Ｖのピーク幅に基づく算出開始点ｓの検出手法の概念図。
【図4】Ａ：Ｚｓ［１］と、対応するｔｅ［１］、Ｘ（ｔｅ［１］）、ｔｃ［１］及びＸ（ｔｃ［１］）の例。Ｂ：Ｚｓ［１］～Ｚｓ［３］と、対応するｔｅ［１］～ｔｅ［３］、Ｘ（ｔｅ［１］）～Ｘ（ｔｅ［３］）、ｔｃ［１］～ｔｃ［３］の例。
【図5】本発明による血液凝固時間測定方法の一実施形態の詳細フロー。
【図6】試料１（左）及び試料１０（右）についてのＸの反応曲線。
【図7】異なるＺｓ［ｋ］でのｔｃ［ｋ］（左）及びｔｅ［ｋ］（右）。
【図8】Ａ～Ｂ：ＡＰＴＴに対するＲ［ｋ］（％）のプロット及びその拡大図。Ｃ～Ｄ：Ｒ［ｋ］（％）によるＴｃ算出の正確性を示したプロット及びその拡大図。Ｅ：異なるＺｓ［ｋ］でのＸ（ｔｅ［ｋ］）／Ｘ（ｔｅ［８］）。
【図9】Ａ：異なるＺｓ［ｋ］でのＸ（ｔｅ［ｋ］）／Ｘ（ｔｅ［８］）。Ｂ～Ｄ：ＴＲ［ｋ］（ΔＣ／ΔＥ）（％）、ΔＥ、及びΔＣのＡＰＴＴに対するプロット。
【図10】Ａ～Ｂ：試料１～１０から算出したｔｃ［ｋ］及びｔｅ［ｋ］。本法：Ｔｃが決定されたときの値、１．００１：Ｚｓ＝１．００１での値、１．０３１：Ｚｓ＝１．０３１での値。Ｃ～Ｄ：本法又はＺｓ＝１．０３１とＺｓ＝１．００１とのｔｃ［ｋ］及びｔｅ［ｋ］の差分。
【図11】計測時間内に反応が終了しないＡＰＴＴ延長検体の反応曲線、及び取得されたパラメータと指標を示した表。
【図12】低フィブリノーゲン試料の反応曲線、及び取得されたパラメータと指標を示した表。
【図13】Ｔｃ算出用パラメータに対する、異なる条件１～３下で検出された算出開始点ｓの影響。
【発明を実施するための形態】
【0010】
１．血液凝固反応計測
血液凝固検査では、血液検体に所定の試薬を添加して、その後の血液凝固反応を計測し、凝固反応から血液凝固時間を測定する。凝固反応の計測には、一般的な手段、例えば、散乱光量、透過度、吸光度等を計測する光学的な手段、又は血漿の粘度を計測する力学的な手段などが用いられる。正常な血液検体の凝固反応曲線は、計測手段に依存するが、基本的にはシグモイド形状を示す。例えば、正常検体の散乱光量に基づく凝固反応曲線は、通常、試薬添加からある程度の時間が経過した時点で凝固の進行により急激に上昇し、その後、凝固反応が終了に近づくとともにプラトーに達する。一方で、凝固異常を有する異常検体の凝固反応曲線は、曲線の立ち上がり時間の遅れ、緩やかな上昇など、異常原因に依存して様々な形状を示す。異常検体の凝固反応曲線の多様さは、自動分析装置での凝固時間の正確な測定を困難にしている。
血液凝固検査では、血液検体に所定の試薬を添加して、その後の血液凝固反応を計測し、凝固反応から血液凝固時間を測定する。凝固反応の計測には、一般的な手段、例えば、散乱光量、透過度、吸光度等を計測する光学的な手段、又は血漿の粘度を計測する力学的な手段などが用いられる。正常な血液検体の凝固反応曲線は、計測手段に依存するが、基本的にはシグモイド形状を示す。例えば、正常検体の散乱光量に基づく凝固反応曲線は、通常、試薬添加からある程度の時間が経過した時点で凝固の進行により急激に上昇し、その後、凝固反応が終了に近づくとともにプラトーに達する。一方で、凝固異常を有する異常検体の凝固反応曲線は、曲線の立ち上がり時間の遅れ、緩やかな上昇など、異常原因に依存して様々な形状を示す。異常検体の凝固反応曲線の多様さは、自動分析装置での凝固時間の正確な測定を困難にしている。
【0011】
従来の一般的な血液凝固時間測定では、少なくとも凝固反応終了までのデータを取得し、取得したデータに基づいて凝固時間を算出する。例えば、散乱光量が飽和した時点を凝固反応終了と判断した後、試薬添加時点から凝固反応終了時点までの間で凝固反応曲線が最大速度に達した時点を凝固時間として決定する手法（微分法）、凝固反応終了時点の散乱光量の１／Ｑに達した時点を凝固時間として決定する手法（パーセント検出法、特許文献１参照）、などがある。しかしながら、上述のような異常検体の凝固反応曲線の異常な形状やノイズにより、凝固反応終了の誤検知が起こり、例えば、早過ぎる時点で凝固反応終了が検知されたり、又は凝固反応終了が検知されないことがある。このような凝固反応終了の誤検知の結果、不正確な凝固時間が算出される。
【0012】
自動分析装置では、多数の検体を効率よく分析するため、１つの検体の凝固反応が終了したと判断されたら速やかに計測を終了し、次の検体の計測を開始することが望まれる。しかし、こうした手法には、上述した早過ぎる時点での凝固反応終了の誤検知が、計測中にも係わらず計測を終了させ、必要なデータの取り逃しをもたらすリスクがある。一方、一検体あたりの測定時間を十分に長い時間に固定しておけば、凝固反応終了の誤検知によるデータ取り逃しを防止できるが、こうした手法は、多くの検体にとって測定時間が必要以上に長くなるため、全体的な分析効率を低下させる。
【0013】
例えば、第VIII因子（FVIII）欠乏検体のような凝固反応曲線の変化が小さい検体の凝固時間を特許文献１に記載の方法で測定する場合、基準比データ値Ｚｓの適切な値は比較的小さく（例えば１．０１）、これは、当該検体の凝固時間測定には比較的長時間の凝固反応計測を要することを意味する。一方、正常検体に適切なＺｓはより大きな値（１．０５程度）であり、これは、正常検体ではより短い凝固反応計測で凝固時間の算出が可能であることを意味する。そのため、自動分析装置を用いて特許文献１に記載の方法に従って、正常検体や異常検体を含むあらゆる検体の凝固時間測定を行った場合、一部の異常検体のための比較的長い計測時間を多くの正常検体にも適用しなければならない。これは効率のよい分析方法とはいえない。
【0014】
本発明の血液凝固時間測定方法は、上記のような凝固反応曲線の異常な形状に起因する凝固時間の誤検出を防止し、正確な凝固時間測定を可能にする。また本発明によれば、正常検体や異常検体を含む様々な血液検体に対して、それぞれの凝固時間測定に必要最低限な凝固反応計測時間が適用されるように、計測時間を最適化することができる。
【0015】
本発明の血液凝固時間測定方法（以下、本発明の方法ともいう）では、試薬を混合した被検血液検体の凝固反応を計測する。この計測で得られる凝固反応の時系列データに基づいて、血液凝固時間が測定される。本発明の方法で測定される血液凝固時間の例としては、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、フィブリノーゲン濃度（Ｆｂｇ）測定での凝固時間などが挙げられる。
【0016】
本発明の方法において、被検血液検体としては、被検者の血漿が好ましく用いられる。以下の本明細書において、血液検体を単に検体とも称する。該検体には、凝固検査に通常用いられる抗凝固剤が添加され得る。例えば、クエン酸ナトリウム入り採血管を用いて採血された後、遠心分離されることで血漿が得られる。
【0017】
該被検検体に凝固時間測定試薬が添加され、血液凝固反応を開始させる。試薬添加後の混合液の凝固反応が計測され得る。使用される凝固時間測定試薬は、測定目的に合わせて任意に選択することができる。各種凝固時間測定のための試薬は市販されている（例えば、ＡＰＴＴ測定試薬コアグピア ＡＰＴＴ－Ｎ；積水メディカル株式会社製）。凝固反応の計測には、一般的な手段、例えば、散乱光量、透過度、吸光度等を計測する光学的な手段、又は血漿の粘度を計測する力学的な手段などを用いればよい。凝固反応の反応開始時点は、典型的には、検体に試薬を混合して凝固反応を開始させた時点として定義され得るが、他のタイミングが反応開始時点として定義されてもよい。凝固反応の計測を継続する時間は、例えば、検体と試薬との混合の時点から数十秒～７分程度であり得る。この計測時間は、任意に定めた固定の値でもよいが、各検体の凝固反応の終了を検出した時点までとしてもよい。該計測時間の間、所定の間隔で凝固反応の進行状況の計測（光学的に検出する場合は測光）が繰り返し行われ得る。例えば、０．１秒間隔で計測が行われればよい。該計測中の混合液の温度は、通常の条件、例えば３０℃以上４０℃以下、好ましくは３５℃以上３９℃以下である。また、計測の各種条件は、被検検体や試薬、計測手段等に応じて適宜設定され得る。
【0018】
上述の凝固反応計測における一連の操作は、自動分析装置を用いて行うことができる。自動分析装置の一例として、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）が挙げられる。あるいは、一部の操作が手作業で行われてもよい。例えば、被検検体の調製を人間が行い、それ以降の操作は自動分析装置で行うことができる。
【0019】
１．血液凝固時間の測定
以下、図１に示す本発明による血液凝固時間測定方法の一実施形態の基本フローを参照して、本発明について説明する。
以下、図１に示す本発明による血液凝固時間測定方法の一実施形態の基本フローを参照して、本発明について説明する。
【0020】
１．１ 反応Ｘ、微分値Ｖ、積算比Ｚの取得
本発明の方法では、分析装置により、反応開始時点からの凝固反応についての計測値Ｐ（ｉ）（例えば散乱光量の測光値）を逐次取得する。ここで「ｉ」は、計測点番号を表す。例えば、計測（測光）間隔が０．１秒であれば、Ｐ（ｉ）は計測開始０．１×ｉ秒後の計測値を表わす。
本発明の方法では、分析装置により、反応開始時点からの凝固反応についての計測値Ｐ（ｉ）（例えば散乱光量の測光値）を逐次取得する。ここで「ｉ」は、計測点番号を表す。例えば、計測（測光）間隔が０．１秒であれば、Ｐ（ｉ）は計測開始０．１×ｉ秒後の計測値を表わす。
【0021】
該計測値Ｐ（ｉ）には、測光時のノイズや、測光開始直後に出現する反応とは無関係の変動が含まれているため、該計測値に対して、公知の方法で平滑化処理を行う。また凝固反応を散乱光量で測光する場合は、反応前の反応液由来の散乱光量を差し引くゼロ点調整処理を行う。よって、取得した時系列の計測値Ｐ（ｉ）は逐次に平滑化及びゼロ点調整され、反応Ｘ（ｉ）が取得される（工程Ｓ１）。計測値の平滑化処理には、ノイズ除去に関する種々の公知の方法の何れかが用いられ得る。例えば、平滑化処理としては、フィルタリング処理、又は差分値や後述する区間内平均傾きの演算等により微分値を求めた後それを積分する処理、などが挙げられる。ゼロ点調整では、例えば、平滑化した計測値を計測開始時点での値が０となるように調整すればよい。さらに計測値Ｐ（ｉ）に対して初期変動除去処理を行ってもよい。初期変動除去処理は、測光開始時点から予め定めた初期変動除去時間までの全ての値が０となるようにすればよい。基本的には、図２に示すとおり、反応Ｘ（ｉ）は、平滑化及びゼロ点調整された凝固反応曲線を構成する。
【0022】
次いで、求めた反応Ｘ（ｉ）から、該反応Ｘ（ｉ）の積算比Ｚ（ｉ）を取得する（工程Ｓ２）。さらに、該反応Ｘ（ｉ）の微分値Ｖ（ｉ）を取得してもよい。微分値Ｖ（ｉ）は、後述する算出開始点ｓの検出のために用いることができる。
【0023】
微分値Ｖ（ｉ）は、反応Ｘ（ｉ）を１次微分して得られる。微分処理は任意の手法にて実施できるが、例えば、区間内平均傾き値の算出により行われ得る。区間内平均傾き値の算出では、各計測点ｉの前後の一定数の計測点、例えば、ｉ－Ｋからｉ＋Ｋまでの２Ｋ＋１個の計測点が利用され得る。例えば、ｉ－２，ｉ－１，ｉ，ｉ＋１，ｉ＋２番目の５点の計測点が利用され得る。平均傾き値は、これら複数の計測点を直線近似したときの傾き値を意味する。直線近似の演算方法には、最小二乗法などの定法が利用され得る。これらの計測点の平均傾き値が、計測点ｉでの１次微分値とみなされ得る。
【0024】
積算比Ｚ（ｉ）は、第１の計測区間でのＸの積算値と、該第１の区間と隣り合う第２の計測区間での反応Ｘの積算値との比である。より詳細には、Ｚ（ｉ）は、計測点ｉより前の第１の計測区間での反応Ｘ（例えば計測点[i-m]～[i-1]でのＸ（i-m）～Ｘ（i-1））の積算値と、該計測点ｉより後の第２の計測区間での反応Ｘ（例えば計測点[i+1]～[i+m]でのＸ（i+1）～Ｘ（i+m））の積算値との比である。ここで、第１の計測区間と該第２の計測区間は、好ましくは同じ長さである。すなわち、計測点ｉでの反応ＸをＸ（ｉ）、ｍを定数としたとき、計測点ｉでの積算比Ｚ（ｉ）は、次の式（１）で計算される。
Z(i) = {X(i+1)+X(i+2)+...+X(i+m)}/{X(i-m)+X(i-m+1)+...+X(i-1)} (1)
式（１）において、ｍは、該微小計測区間の時間幅が１秒間から３秒間になるように設定されることが好ましい。すなわち計測（測光）時間間隔が０．１秒ならｍは１０から３０が好ましく、計測（測光）時間間隔が０．２秒ならｍは５から１５が好ましい。計測条件を考慮して適切な凝固時間が算出できるようにｍの最適値を選択すればよい。
したがって、Ｘについての２ｍ＋１個目のデータとして計測点ｉ＋ｍでのＸ（ｉ＋ｍ）が取得された以降に、積算比Ｚ（ｉ）の計算が実行できる。但し、反応初期でのＸの変動の影響を避けるため、Ｘ（ｉ－ｍ）からＸ（ｉ－１）までが全て所定の閾値Ｘｓ以上であることを条件としてＺ（ｉ）の計算を開始することが好ましい。散乱光計測による反応曲線はシグモイド状となるため、通常、Ｘ（ｉ）が一旦Ｘｓを超えると、その後もＸ（ｉ）＞Ｘｓとなる。もし、Ｘ（ｉ）＞Ｘｓとなった後にＸ（ｉ）≦Ｘｓとなった場合は、データは異常とみなされ得る。Ｘｓは、予測される反応Ｘの最大値の１０％から５０％であることが好ましい。例えば、反応Ｘの最大値が約７００と見積もられる場合、Ｘｓは好ましくは７０～３５０である。
Z(i) = {X(i+1)+X(i+2)+...+X(i+m)}/{X(i-m)+X(i-m+1)+...+X(i-1)} (1)
式（１）において、ｍは、該微小計測区間の時間幅が１秒間から３秒間になるように設定されることが好ましい。すなわち計測（測光）時間間隔が０．１秒ならｍは１０から３０が好ましく、計測（測光）時間間隔が０．２秒ならｍは５から１５が好ましい。計測条件を考慮して適切な凝固時間が算出できるようにｍの最適値を選択すればよい。
したがって、Ｘについての２ｍ＋１個目のデータとして計測点ｉ＋ｍでのＸ（ｉ＋ｍ）が取得された以降に、積算比Ｚ（ｉ）の計算が実行できる。但し、反応初期でのＸの変動の影響を避けるため、Ｘ（ｉ－ｍ）からＸ（ｉ－１）までが全て所定の閾値Ｘｓ以上であることを条件としてＺ（ｉ）の計算を開始することが好ましい。散乱光計測による反応曲線はシグモイド状となるため、通常、Ｘ（ｉ）が一旦Ｘｓを超えると、その後もＸ（ｉ）＞Ｘｓとなる。もし、Ｘ（ｉ）＞Ｘｓとなった後にＸ（ｉ）≦Ｘｓとなった場合は、データは異常とみなされ得る。Ｘｓは、予測される反応Ｘの最大値の１０％から５０％であることが好ましい。例えば、反応Ｘの最大値が約７００と見積もられる場合、Ｘｓは好ましくは７０～３５０である。
【0025】
以上の手順で、各計測点ｉにおける反応Ｘ（ｉ）、微分値Ｖ（ｉ）、及び積算比Ｚ（ｉ）を求めることができる。図２を参照して、ＡＰＴＴが正常な正常検体と、ＡＰＴＴが延長する例としてFVIII欠乏検体（以下、延長検体）についての、反応Ｘ、微分値Ｖ、及び積算比Ｚのそれぞれの形状の相対的な差異を説明する。図２Ａは反応Ｘと微分値Ｖを示し、図２Ｂは、反応Ｘ及び積算比Ｚを示す。図２Ａ、Ｂとも、左が正常検体、右が延長検体である。横軸は反応開始時点からの時間に換算されている。
反応Ｘ）図２Ａに示すとおり、Ｘは、平滑化及びゼロ点調整された凝固反応曲線を構成する。正常検体（図２Ａ左）では、Ｘの立ち上がり点は早く、上昇の傾きは大きい。しかし、延長検体（図２Ａ右）では、Ｘの立ち上がり点は遅く、上昇の傾きは小さい。
微分値Ｖ）正常検体（図２Ａ左）では、Ｖのピークのトップ位置は高く、形状はほぼ左右対称である。しかし、延長検体（図２Ａ右）では、Ｖのピークのトップ位置は低く（この例では正常検体の６分の１より小さい）、形状は左右非対称であり、ピークはひとつでなく２峰性形状になっている。
積算比Ｚ）正常検体（図２Ｂ左）では反応曲線の立ち上がり時にＺは最大値が約８になり、その後は１に向かって急激に減少していく。一方で延長検体（図２Ｂ右）ではＺは最大値が約２．５であり、減少も緩やかである。いずれの場合も、積算比Ｚは、凝固反応曲線がプラトーに近づく（血液凝固反応が終了に近づく）とともに１に近づいていく。
反応Ｘ）図２Ａに示すとおり、Ｘは、平滑化及びゼロ点調整された凝固反応曲線を構成する。正常検体（図２Ａ左）では、Ｘの立ち上がり点は早く、上昇の傾きは大きい。しかし、延長検体（図２Ａ右）では、Ｘの立ち上がり点は遅く、上昇の傾きは小さい。
微分値Ｖ）正常検体（図２Ａ左）では、Ｖのピークのトップ位置は高く、形状はほぼ左右対称である。しかし、延長検体（図２Ａ右）では、Ｖのピークのトップ位置は低く（この例では正常検体の６分の１より小さい）、形状は左右非対称であり、ピークはひとつでなく２峰性形状になっている。
積算比Ｚ）正常検体（図２Ｂ左）では反応曲線の立ち上がり時にＺは最大値が約８になり、その後は１に向かって急激に減少していく。一方で延長検体（図２Ｂ右）ではＺは最大値が約２．５であり、減少も緩やかである。いずれの場合も、積算比Ｚは、凝固反応曲線がプラトーに近づく（血液凝固反応が終了に近づく）とともに１に近づいていく。
【0026】
１．２ 凝固時間Ｔｃの算出
１．２．１ 算出開始点の決定
本発明の方法では、上記の反応Ｘ（ｉ）、微分値Ｖ（ｉ）、及び積算比Ｚ（ｉ）の値を用いて凝固時間Ｔｃを算出する。本発明の方法では、Ｘ、Ｖ、Ｚの取得は後述する凝固反応計測手順と並行して行われ得る。まず、これまで取得したＸ、Ｖ、Ｚに基づいて凝固時間Ｔｃの算出処理を開始するタイミング、すなわち算出開始点ｓを決定する。
一例においては、Ｚがピークに達した以降の任意の計測点を算出開始点ｓとすることができる。例えば、Ｚが閾値に達した後、ピークを経て再び該閾値に達した計測点を、算出開始点ｓとすることができる。図２Ｂを例にとると、積算比Ｚが２に達した後、ピークを経て再び２に達した計測点を算出開始点ｓとすることができる。
別の一例においては、凝固反応速度が最大値Ｖｍａｘとなる計測点を求め、算出開始点ｓとする。最も単純には、逐次に取得されるＶ（ｉ）から構成される曲線における最初のピークトップに対応する計測点をＶｍａｘに対応する算出開始点ｓとすることができる。
他方、算出開始点ｓの決定の際には、凝固因子欠乏検体でよく見られるような凝固反応速度曲線が二峰性になる場合（例えば図２Ａ右）に起こり得るＶｍａｘの誤検出やノイズ起因の変動の影響を排除することが望まれる。したがって、好ましい例においては、逐次に取得されるＶ（ｉ）が、所定の値を超えてから、ピークを過ぎて所定の条件に至ったときの計測点を算出開始点ｓとすることができる。図３に算出開始点ｓの決定手法の一例の概念図を示す。図３にはＶ（ｉ）と、算出開始点ｓの決定に用いるパラメータが示されている。Ｖ（ｉ）はピーク値Ｖｍａｘを有する曲線を形成している。Ｖｓは、Ｖｍａｘを１００％と設定した際のＳ％の値である。Ｖ（ｉ）は、一旦Ｖｓに達してから、ピークを過ぎて、Ｖ（ｓ）において再びＶｓに達する。このときＶ（ｉ）＝Ｖｓである２点間の幅（計測点数）であるピーク幅Ｗｓが所定の値を超えていたときに、該Ｖ（ｓ）のときの計測点ｓを算出開始点ｓとして検出する。
１．２．１ 算出開始点の決定
本発明の方法では、上記の反応Ｘ（ｉ）、微分値Ｖ（ｉ）、及び積算比Ｚ（ｉ）の値を用いて凝固時間Ｔｃを算出する。本発明の方法では、Ｘ、Ｖ、Ｚの取得は後述する凝固反応計測手順と並行して行われ得る。まず、これまで取得したＸ、Ｖ、Ｚに基づいて凝固時間Ｔｃの算出処理を開始するタイミング、すなわち算出開始点ｓを決定する。
一例においては、Ｚがピークに達した以降の任意の計測点を算出開始点ｓとすることができる。例えば、Ｚが閾値に達した後、ピークを経て再び該閾値に達した計測点を、算出開始点ｓとすることができる。図２Ｂを例にとると、積算比Ｚが２に達した後、ピークを経て再び２に達した計測点を算出開始点ｓとすることができる。
別の一例においては、凝固反応速度が最大値Ｖｍａｘとなる計測点を求め、算出開始点ｓとする。最も単純には、逐次に取得されるＶ（ｉ）から構成される曲線における最初のピークトップに対応する計測点をＶｍａｘに対応する算出開始点ｓとすることができる。
他方、算出開始点ｓの決定の際には、凝固因子欠乏検体でよく見られるような凝固反応速度曲線が二峰性になる場合（例えば図２Ａ右）に起こり得るＶｍａｘの誤検出やノイズ起因の変動の影響を排除することが望まれる。したがって、好ましい例においては、逐次に取得されるＶ（ｉ）が、所定の値を超えてから、ピークを過ぎて所定の条件に至ったときの計測点を算出開始点ｓとすることができる。図３に算出開始点ｓの決定手法の一例の概念図を示す。図３にはＶ（ｉ）と、算出開始点ｓの決定に用いるパラメータが示されている。Ｖ（ｉ）はピーク値Ｖｍａｘを有する曲線を形成している。Ｖｓは、Ｖｍａｘを１００％と設定した際のＳ％の値である。Ｖ（ｉ）は、一旦Ｖｓに達してから、ピークを過ぎて、Ｖ（ｓ）において再びＶｓに達する。このときＶ（ｉ）＝Ｖｓである２点間の幅（計測点数）であるピーク幅Ｗｓが所定の値を超えていたときに、該Ｖ（ｓ）のときの計測点ｓを算出開始点ｓとして検出する。
【0027】
１．２．２ パラメータ取得
次いで、Ｔｃ算出のために必要なパラメータが取得される（工程Ｓ３）。
まず、算出開始点ｓ以降でＺ（ｉ）が予め定めた１番目の閾値Ｚｓ［１］未満（Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［１］）に初めて達するときの計測点での計測時間（反応開始時点からの時間）ｔｅ［１］を検出する。必要に応じて、Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［１］を満たすまでＺ（ｉ）の取得を続ける。
ｔｅ［１］が検出されたら、ｔｅ［１］での反応Ｘ（ｔｅ［１］）を求める。次に、Ｘ（ｔｅ［１］）のＱ％の値を有するか又はそれに近似するＸ（ｉ）に対応する計測点での計測時間ｔｃ［１］を検出する（ここでｔｃ［１］＜ｔｅ［１］）。例えば、Ｘ（ｔｃ［１］）＝｛Ｘ（ｔｅ［１］）×Ｑ％｝を満たす時間ｔｃ［１］を検出することができる。また例えば、｛Ｘ（ｔｅ［１］）×Ｑ％｝に最も近い値をＸ（ｔｃ［１］）とすることができる。また例えば、Ｘ（ｔｃ’［１］）＜｛Ｘ（ｔｅ［１］）×Ｑ％｝＜Ｘ（ｔｃ”［１］）（ｔｃ’［１］とｔｃ”［１］は隣接する計測点での時間）のとき、ｔｃ’［１］とｔｃ”［１］のいずれかをｔｃ［１］として検出することができる。計測（測光）間隔が十分短い（例えば０．１秒等の）場合は、最終的なＴｃの算出値には大きな違いは生じないため、ｔｃ’［１］とｔｃ”［１］のいずれを選択してもよい。Ｑは、０＜Ｑ＜１００である任意の値であればよく、好ましくは１０～８０、より好ましくは２０～７０（例えば５０）である。
図４Ａに、Ｚｓ［１］と、凝固反応曲線（Ｘ（ｉ）で構成される曲線）上でのｔｅ［１］及びＸ（ｔｅ［１］）と、ｔｃ［１］及びＸ（ｔｃ［１］）との関係を表す概念図を示す。
次いで、Ｔｃ算出のために必要なパラメータが取得される（工程Ｓ３）。
まず、算出開始点ｓ以降でＺ（ｉ）が予め定めた１番目の閾値Ｚｓ［１］未満（Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［１］）に初めて達するときの計測点での計測時間（反応開始時点からの時間）ｔｅ［１］を検出する。必要に応じて、Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［１］を満たすまでＺ（ｉ）の取得を続ける。
ｔｅ［１］が検出されたら、ｔｅ［１］での反応Ｘ（ｔｅ［１］）を求める。次に、Ｘ（ｔｅ［１］）のＱ％の値を有するか又はそれに近似するＸ（ｉ）に対応する計測点での計測時間ｔｃ［１］を検出する（ここでｔｃ［１］＜ｔｅ［１］）。例えば、Ｘ（ｔｃ［１］）＝｛Ｘ（ｔｅ［１］）×Ｑ％｝を満たす時間ｔｃ［１］を検出することができる。また例えば、｛Ｘ（ｔｅ［１］）×Ｑ％｝に最も近い値をＸ（ｔｃ［１］）とすることができる。また例えば、Ｘ（ｔｃ’［１］）＜｛Ｘ（ｔｅ［１］）×Ｑ％｝＜Ｘ（ｔｃ”［１］）（ｔｃ’［１］とｔｃ”［１］は隣接する計測点での時間）のとき、ｔｃ’［１］とｔｃ”［１］のいずれかをｔｃ［１］として検出することができる。計測（測光）間隔が十分短い（例えば０．１秒等の）場合は、最終的なＴｃの算出値には大きな違いは生じないため、ｔｃ’［１］とｔｃ”［１］のいずれを選択してもよい。Ｑは、０＜Ｑ＜１００である任意の値であればよく、好ましくは１０～８０、より好ましくは２０～７０（例えば５０）である。
図４Ａに、Ｚｓ［１］と、凝固反応曲線（Ｘ（ｉ）で構成される曲線）上でのｔｅ［１］及びＸ（ｔｅ［１］）と、ｔｃ［１］及びＸ（ｔｃ［１］）との関係を表す概念図を示す。
【0028】
さらに、Ｚ（ｉ）が予め定めた２番目の閾値Ｚｓ［２］未満（Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［２］）に初めて達するときの計測点での計測時間ｔｅ［２］を検出する（ここでＺｓ［２］＜Ｚｓ［１］）。必要に応じて、Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［２］を満たすまでＺ（ｉ）の取得を続ける。ｔｅ［２］でのＸは、Ｘ（ｔｅ［２］）である。次に、Ｘ（ｔｅ［２］）のＱ％の値を有するか又はそれに近似するＸ（ｉ）に対応する計測点での時間ｔｃ［２］を検出する（このとき、ｔｃ［２］＜ｔｅ［２］）。
【0029】
上記で求めたｔｅは、Ｚ（ｉ）が閾値Ｚｓに到達した時点であり、仮の凝固終了点を表す。一方ｔｃは、Ｘの値が仮の凝固終了点でのＸのＱ％になる時点であり、仮の凝固点を表す。図４Ｂは、Ｚｓ［１］～Ｚｓ［３］、及びこれらに対応する反応曲線Ｘ上の仮の凝固終了点ｔｅ［１］～ｔｅ［３］、及びそのときのＸ（ｔｅ［１］）～Ｘ（ｔｅ［３］）、ならびに仮の凝固点ｔｃ［１］～ｔｃ［３］を示した概念図である。図４Ｂに示したとおり、反応曲線がプラトーに近づく（凝固反応が終了に近づく）につれて、ｔｅの増加幅はより大きくなる一方、Ｘ（ｔｅ）の増加幅は徐々に小さくなる。一方、凝固反応曲線がプラトーに近づくにつれてｔｃも徐々に増加するが、その変化はｔｅと比較して小さい。
【0030】
１．２．３ Ｔｃの算出
本発明の方法では、上記のような凝固反応の進行に伴う仮の凝固終了点ｔｅ及び仮の凝固点ｔｃの変化を利用して、仮の凝固点ｔｃが真の凝固時間Ｔｃであるか否かを決めるＴｃ算出ステップを行う。すなわち、本発明の方法では、上記で求めたＺｓに由来するパラメータｔｅ、ｔｃ、Ｘ（ｔｅ）などを利用して、Ｔｃ算出のための指標を取得する（工程Ｓ４）。
本発明の方法では、上記のような凝固反応の進行に伴う仮の凝固終了点ｔｅ及び仮の凝固点ｔｃの変化を利用して、仮の凝固点ｔｃが真の凝固時間Ｔｃであるか否かを決めるＴｃ算出ステップを行う。すなわち、本発明の方法では、上記で求めたＺｓに由来するパラメータｔｅ、ｔｃ、Ｘ（ｔｅ）などを利用して、Ｔｃ算出のための指標を取得する（工程Ｓ４）。
【0031】
したがって、本発明の方法では、Ｚ（ｉ）がｋ番目の閾値Ｚｓ［ｋ］未満（Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ］）に初めて達するときの計測点を検出する（ここでＺｓ［ｋ］＜Ｚｓ［ｋ－１］、ｋ≧２の整数）。必要に応じて、Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ］を満たすまでＺ（ｉ）の取得を続ける。次いでＺｓ［ｋ］に由来するパラメータ（例えばｔｅ［ｋ］、ｔｃ［ｋ］、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）など）と、その前に取得したｋ－１番目の閾値Ｚｓ［ｋ－１］（ここでＺｓ［ｋ］＜Ｚｓ［ｋ－１］）に由来するパラメータ（例えばｔｅ［ｋ－１］、ｔｃ［ｋ－１］、Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］）など）とを取得する。
【0032】
好ましくは、該指標は、ｔｅ［ｋ］、ｔｃ［ｋ］及びＸ（ｔｅ［ｋ］）のいずれか１つ以上と、ｔｅ［ｋ－１］、ｔｃ［ｋ－１］及びＸ（ｔｅ［ｋ－１］）のいずれか１つ以上とに基づいて取得され得る。
【0033】
Ｔｃ算出ステップでは、該指標が予め定めた基準を満たす場合、仮の凝固点ｔｃ［ｋ］又はｔｃ［ｋ－１］が凝固時間Ｔｃとして決定される。
したがって、該指標の取得は、２つ目の閾値Ｚｓ［２］に由来するｔｅ［２］、ｔｃ［２］、Ｘ（ｔｅ［２］）が取得された以降に行われ得る。好ましくは、最初の指標は、ｋ＝２のときに、Ｚｓ［１］に由来するｔｅ［１］、ｔｃ［１］又はＸ（ｔｅ［１］）と、Ｚｓ［２］に由来するｔｅ［２］、ｔｃ［２］又はＸ（ｔｅ［２］）に基づいて取得され得る。
したがって、該指標の取得は、２つ目の閾値Ｚｓ［２］に由来するｔｅ［２］、ｔｃ［２］、Ｘ（ｔｅ［２］）が取得された以降に行われ得る。好ましくは、最初の指標は、ｋ＝２のときに、Ｚｓ［１］に由来するｔｅ［１］、ｔｃ［１］又はＸ（ｔｅ［１］）と、Ｚｓ［２］に由来するｔｅ［２］、ｔｃ［２］又はＸ（ｔｅ［２］）に基づいて取得され得る。
【0034】
一実施形態においては、該指標は、ｋ番目の閾値Ｚｓ［ｋ］に由来するＸ（ｔｅ［ｋ］）と、その前の閾値Ｚｓ［ｋ－１］に由来するＸ（ｔｅ［ｋ－１］）との差又は比である。好ましくは、下記式（２）に従うＲ［ｋ］がＴｃ算出のための指標として用いられる。
Ｒ［ｋ］＝Ｘ（ｔｅ［ｋ］）／Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］） (2)
該Ｒ［ｋ］は比率で表されても百分率で表されてもよい。Ｒ［ｋ］が予め定めた基準値Ｒｓであるか又はそれより小さければ、該ｔｃ［ｋ］又は該ｔｃ［ｋ－１］を凝固時間Ｔｃとして決定することができる。このとき該ｔｅ［ｋ］又は該ｔｅ［ｋ－１］は真の凝固終了点として決定することができる。
Ｒ［ｋ］＝Ｘ（ｔｅ［ｋ］）／Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］） (2)
該Ｒ［ｋ］は比率で表されても百分率で表されてもよい。Ｒ［ｋ］が予め定めた基準値Ｒｓであるか又はそれより小さければ、該ｔｃ［ｋ］又は該ｔｃ［ｋ－１］を凝固時間Ｔｃとして決定することができる。このとき該ｔｅ［ｋ］又は該ｔｅ［ｋ－１］は真の凝固終了点として決定することができる。
【0035】
別の一実施形態においては、まず、以下の式（３）～（５）に従い、Δｔｃ［ｋ］、Δｔｅ［ｋ］、及びＴＲ［ｋ］を算出する。該ＴＲ［ｋ］がＴｃ算出のための指標として用いられる。
Δｔｃ［ｋ］＝ｔｃ［ｋ］－ｔｃ［ｋ－１］ (3)
Δｔｅ［ｋ］＝ｔｅ［ｋ］－ｔｅ［ｋ－１］ (4)
ＴＲ［ｋ］＝Δｔｃ［ｋ］／Δｔｅ［ｋ］ (5)
該ＴＲ［ｋ］は比率で表されても百分率で表されてもよい。ＴＲ［ｋ］が予め定めた基準値ＴＲｓであるか又はそれより小さければ、該ｔｃ［ｋ］又は該ｔｃ［ｋ－１］を凝固時間Ｔｃとして決定することができる。このとき該ｔｅ［ｋ］又は該ｔｅ［ｋ－１］は真の凝固終了点として決定することができる。
Δｔｃ［ｋ］＝ｔｃ［ｋ］－ｔｃ［ｋ－１］ (3)
Δｔｅ［ｋ］＝ｔｅ［ｋ］－ｔｅ［ｋ－１］ (4)
ＴＲ［ｋ］＝Δｔｃ［ｋ］／Δｔｅ［ｋ］ (5)
該ＴＲ［ｋ］は比率で表されても百分率で表されてもよい。ＴＲ［ｋ］が予め定めた基準値ＴＲｓであるか又はそれより小さければ、該ｔｃ［ｋ］又は該ｔｃ［ｋ－１］を凝固時間Ｔｃとして決定することができる。このとき該ｔｅ［ｋ］又は該ｔｅ［ｋ－１］は真の凝固終了点として決定することができる。
【0036】
基準値Ｒｓ及びＴＲｓは、本発明により決定されるＴｃの正確性が所望の値になるように適宜設定することができる。例えば、各種検体について本発明の方法で決定したＴｃが、実測した凝固時間の９０％以上、好ましくは９５％以上になるようにＲｓ及びＴＲｓを調整することが好ましい。実測の凝固時間は、目測した凝固反応曲線の凝固反応終了点から推定することができる。あるいはＺｓが１に近い場合（例えばＺｓ＝１．００１）に得られるＴｃを実測の凝固時間と推定してもよい。例えば、Ｒｓ（％）は１１０％以下が好ましく、１０５％以下がより好ましく、ＴＲｓ（％）は１５％以下が好ましく、１０％以下がより好ましい。
【0037】
好ましい実施形態においては、上記２つの基準がいずれも満たされた場合、例えばＲ［ｋ］≦Ｒｓであり、かつＴＲ［ｋ］≦ＴＲｓであるとき、該ｔｃ［ｋ］又は該ｔｃ［ｋ－１］を凝固時間Ｔｃとして決定することができる。
【0038】
一方で、該指標が予め定めた基準を満たさない場合、ｋ＝ｋ＋１として上記の手順を繰り返す。基準を満たす指標が取得されるまで、ｋをインクリメントしながらこの手順が繰り返される。
【0039】
指標の取得とＴｃ決定の手順の具体例を以下に説明する。好ましくは、まずＺｓ［１］に関するパラメータｔｅ［１］、ｔｃ［１］、又はＸ（ｔｅ［１］）と、Ｚｓ［２］に関するパラメータｔｅ［２］、ｔｃ［２］、又はＸ（ｔｅ［２］）とを用いてＴｃ算出のための指標が算出される。
【0040】
一実施形態においては、該指標はＸ（ｔｅ［１］）とＸ（ｔｅ［２］）の差又は比である。好ましくは、下記式に従うＲ［２］がＴｃ算出のための指標として用いられる。
Ｒ［２］（％）＝｛Ｘ（ｔｅ［２］）／Ｘ（ｔｅ［１］）｝（％） (2)’
Ｒ［２］（％）＝｛Ｘ（ｔｅ［２］）／Ｘ（ｔｅ［１］）｝（％） (2)’
【0041】
好ましい実施形態においては、まず、以下の式に従い、Δｔｃ［２］、Δｔｅ［２］、及びＴＲ［２］を算出する。該ＴＲ［２］がＴｃ算出のための指標として用いられる。
Δｔｃ［２］＝ｔｃ［２］－ｔｃ［１］ (3)’
Δｔｅ［２］＝ｔｅ［２］－ｔｅ［１］ (4)’
ＴＲ［２］（％）＝｛Δｔｃ［２］／Δｔｅ［２］｝（％） (5)’
Δｔｃ［２］＝ｔｃ［２］－ｔｃ［１］ (3)’
Δｔｅ［２］＝ｔｅ［２］－ｔｅ［１］ (4)’
ＴＲ［２］（％）＝｛Δｔｃ［２］／Δｔｅ［２］｝（％） (5)’
【0042】
該指標が予め定めた基準を満たす場合、ｔｃ［１］又はｔｃ［２］を凝固時間Ｔｃとして決定する。好ましくはｔｃ［２］をＴｃとして決定する。例えば、上記Ｒ［２］が予め定めた基準値Ｒｓであるか又はそれより小さければ、該ｔｃ［２］又は該ｔｃ［１］をＴｃとして決定する。また例えば、上記ＴＲ［２］が予め定めた基準値ＴＲｓであるか又はそれより小さければ、該ｔｃ［２］又は該ｔｃ［１］をＴｃとして決定する。好ましくは、上記２つの基準がいずれも満たされた場合、例えばＲ［２］≦Ｒｓであり、かつＴＲ［２］≦ＴＲｓであるとき、該ｔｃ［２］又は該ｔｃ［１］をＴｃとして決定する。
【0043】
一方、該指標が予め定めた基準を満たさない場合、３番目の閾値Ｚｓ［３］（ここでＺｓ［３］）＜Ｚｓ［２］）について、上記と同様にｔｅ［３］、ｔｃ［３］又はＸ（ｔｅ［３］）を求め、これらとｔｅ［２］、ｔｃ［２］又はＸ（ｔｅ［２］）とから同様の手順で指標を算出する。
例えば、Ｒ［２］がＲｓよりも大きく、かつＴＲ［２］がＴＲｓよりも大きい場合、３番目の閾値Ｚｓ［３］について、上記と同様にＸ（ｔｅ［３］）を求め、次いで上記式（２）に従ってＲ［３］を算出するか、及び／又は、ｔｅ［３］及びｔｃ［３］を求め、次いで上記式（３）～（５）に従ってＴＲ［３］を算出する。
算出した指標が基準を満たしていれば該ｔｃ［２］又は該ｔｃ［３］をＴｃとして決定する。好ましくは、Ｒ［３］≦Ｒｓであるか、及び／又はＴＲ［３］≦ＴＲｓである場合、該ｔｃ［３］又は該ｔｃ［２］をＴｃとして決定する。
例えば、Ｒ［２］がＲｓよりも大きく、かつＴＲ［２］がＴＲｓよりも大きい場合、３番目の閾値Ｚｓ［３］について、上記と同様にＸ（ｔｅ［３］）を求め、次いで上記式（２）に従ってＲ［３］を算出するか、及び／又は、ｔｅ［３］及びｔｃ［３］を求め、次いで上記式（３）～（５）に従ってＴＲ［３］を算出する。
算出した指標が基準を満たしていれば該ｔｃ［２］又は該ｔｃ［３］をＴｃとして決定する。好ましくは、Ｒ［３］≦Ｒｓであるか、及び／又はＴＲ［３］≦ＴＲｓである場合、該ｔｃ［３］又は該ｔｃ［２］をＴｃとして決定する。
【0044】
指標が基準を満たさなかった場合、さらに４番目の閾値Ｚｓ［４］（ここでＺｓ［４］＜Ｚｓ［３］）について同じ手順を繰り返す。
【0045】
このようにして、Ｔｃが決定されるまで、凝固反応の計測とＸ、Ｙ、Ｚの取得とを並行して逐次行いながら、Ｎ番目の閾値Ｚｓ［Ｎ］（ここでＺｓ［Ｎ］＜Ｚｓ［Ｎ－１］；Ｎ≧２）について同じ手順を繰り返す。最終的には、該ｔｃ［Ｎ］又は該ｔｃ［Ｎ－１］がＴｃとして決定される。なお、Ｚｓ［Ｎ］とＺｓ［Ｎ－１］との差を適正な範囲に設定しておけば、Ｒ[Ｎ]≦Ｒｓ及び／又はＴＲ[Ｎ]≦ＴＲｓを満たすときのｔｃ［Ｎ］とｔｃ（Ｎ－１）は比較的近い値を示すため、Ｔｃにｔｃ［Ｎ］を選んでも、該ｔｃ（Ｎ－１）を選んでも、Ｔｃを用いた臨床的判断において実際的な問題は生じない。ただしＴｃの算出値の信頼性を高める観点からは、Ｔｃにはｔｃ［Ｎ］を選択することが望ましい。
【0046】
本発明の方法は、基本的には血液凝固時間の一般的な計算法として従来使用されているパーセント法の応用である。パーセント法では、凝固反応が反応終了時のＱ％（一例としては５０％）まで進行した時点を凝固時間Ｔｃとして決定する。したがって、本発明の方法においても、凝固反応が、積算比Ｚが１又はそれに近いとき（血液凝固反応がほぼ終了したとき）のＱ％となった時点が凝固時間Ｔｃとして算出されることが理想的である。算出条件が適切であれば、ｔｅ[ｋ]はシグモイド状の凝固反応曲線がプラトーに近づく前の時点になるため、本発明の方法で決定した凝固時間Ｔｃが理想値と大きく異なることはない。またパーセント法において、凝固反応が反応終了時の５０％から離れた比率Ｃ％（一例として４５％以下又は５５％以上）を凝固時間とする場合は、Ｑ％＝５０％としての５０％凝固時間を求めてから、同じ反応終了時点を基にＣ％での凝固時間を算出してもよい。
【0047】
１．２．４ 閾値Ｚｓ
図２に示したとおり、Ｚ（ｉ）は、Ｘ（ｉ）から構成される凝固反応曲線がプラトーに近づくとともに１に近づいていく。したがって、Ｚｓ［ｋ］は、１より大きな値である。Ｚｓ［ｋ］が予め設定した最低値Ｚｓｍｉｎに達したとき、上記手順の繰り返しは終了し、該Ｚｓ［ｋ］に基づいて算出された該ｔｃ［ｋ］又は該ｔｃ［ｋ－１］、好ましくはｔｃ［ｋ］が凝固時間Ｔｃとして決定される。Ｚｓｍｉｎは１より大であればよく、測定条件（例えば試薬、分析装置及び分析項目）に応じて適宜設定すればよい。例えばＡＰＴＴ測定の場合、Ｚｓｍｉｎは、好ましくは１．０００１～１．０５であり、より好ましくは１．０００２～１．０１であり、さらに好ましくは１．０００５～１．００２（例えば１．００１）である。
図２に示したとおり、Ｚ（ｉ）は、Ｘ（ｉ）から構成される凝固反応曲線がプラトーに近づくとともに１に近づいていく。したがって、Ｚｓ［ｋ］は、１より大きな値である。Ｚｓ［ｋ］が予め設定した最低値Ｚｓｍｉｎに達したとき、上記手順の繰り返しは終了し、該Ｚｓ［ｋ］に基づいて算出された該ｔｃ［ｋ］又は該ｔｃ［ｋ－１］、好ましくはｔｃ［ｋ］が凝固時間Ｔｃとして決定される。Ｚｓｍｉｎは１より大であればよく、測定条件（例えば試薬、分析装置及び分析項目）に応じて適宜設定すればよい。例えばＡＰＴＴ測定の場合、Ｚｓｍｉｎは、好ましくは１．０００１～１．０５であり、より好ましくは１．０００２～１．０１であり、さらに好ましくは１．０００５～１．００２（例えば１．００１）である。
【0048】
あるいは、インクリメントされる整数ｋが予め設定した最大数Ｎに達したとき、上記手順の繰り返しは終了し、Ｚｓ［Ｎ］に基づいて算出されたｔｃ［Ｎ］又はｔｃ［Ｎ－１］、好ましくはｔｃ［Ｎ］が凝固時間Ｔｃとして決定される。凝固時間算出の効率の観点からは、Ｎは、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは８以下である。
【0049】
１番目の閾値Ｚｓ［１］は測定条件（例えば試薬、分析装置及び分析項目）に応じて適宜設定すればよい。例えばＡＰＴＴ測定の場合、好ましくは１．１００以下、より好ましくは１．０８０以下、さらに好ましくは１．０５０以下である。例えば、FVIII欠乏検体のＡＰＴＴ測定では、凝固反応速度が最大になるあたりでの積算比Ｚは多くは１．０３から１．０４であることから、Ｚｓ［１］には約１．０４を選択すればよい。
【0050】
閾値Ｚｓの刻み幅（Ｚｓ［ｋ－１］とＺｓ［ｋ］の差；ΔＺｓ））は、Ｚｓ［１］、Ｚｓｍｉｎやｋの最大数Ｎ、又は凝固反応の計測頻度（サンプリング周期）などに依存して決定され得るが、凝固時間算出の精度及び効率の観点からは、好ましくは０．０５０～０．００１の範囲、より好ましくは０．０２０～０．００２の範囲、さらに好ましくは０．０１０～０．００５の範囲である。
【0051】
Ｚｓ［１］、Ｚｓｍｉｎ、ｋの最大数Ｎ、及びΔＺｓのそれぞれが上述した適切な範囲になるように、各々の値が設定されることが好ましい。例えば、好ましいＺｓｍｉｎ、ΔＺｓ、及びＮを決定し、それに合わせてＺｓ［１］を決定することができる。あるいは、好ましいＺｓ［１］、Ｚｓｍｉｎ、及びＮを決定し、それに合わせてΔＺｓを決定することができる。
【0052】
例えば、Ｚｓｍｉｎ＝１．００１、ｋ≦８、ΔＺｓ＝０．００５の場合、Ｚｓ［１］＝１．０３６である。ただし、本発明の方法におけるＺｓ［１］、Ｚｓｍｉｎ、ΔＺｓ、及び繰り返し数の組み合わせの例はこれらに限定されず、当業者は適当な値を適宜設定可能である。
【0053】
１．２．５ エラー処理
前記のような手順の繰り返しを通じてＺ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ］を満たすｔｅ［ｋ］が見つからないか、又は指標が基準を満たさなかった場合、前記Ｔｃ算出ステップはＴｃが決定されないまま不完全に終了する。このような場合、本発明の方法では、最後に取得したｔｃ［ｋ］をＴｃとして決定してもよく、又はＴｃが算出不可であるとみなすことができる。いずれの場合でも、Ｔｃが決定されなかったときは、Ｔｃが正常に決定されなかったという結果を取得することができる。
前記のような手順の繰り返しを通じてＺ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ］を満たすｔｅ［ｋ］が見つからないか、又は指標が基準を満たさなかった場合、前記Ｔｃ算出ステップはＴｃが決定されないまま不完全に終了する。このような場合、本発明の方法では、最後に取得したｔｃ［ｋ］をＴｃとして決定してもよく、又はＴｃが算出不可であるとみなすことができる。いずれの場合でも、Ｔｃが決定されなかったときは、Ｔｃが正常に決定されなかったという結果を取得することができる。
【0054】
２．Ｔｃ決定の例示的手順
以下に、本発明による凝固時間Ｔｃ決定のより具体的な手順の例を、図５に示す詳細フローを参照してより詳細に説明する。図５に示す手順は例示であり、例えば演算の順序の入れ替えなど、当業者による通常の変更が可能である。
以下に、本発明による凝固時間Ｔｃ決定のより具体的な手順の例を、図５に示す詳細フローを参照してより詳細に説明する。図５に示す手順は例示であり、例えば演算の順序の入れ替えなど、当業者による通常の変更が可能である。
【0055】
Ｓ００１：下記表１のようにＺｓを段階的に高い値から低い値まで予め設定しておき、変数ｋ（カウンタ）により各Ｚｓを順次選択できるように配列Ｚｓ［ｋ］を作成しておく。ｋは整数であり、初期値として１を設定する。
【0056】
【表1】
【0057】
Ｓ００２：凝固反応に関する計測値Ｐ（ｉ）（ｉは計測点番号を表す）のデータ数が、平滑化処理、初期変動除去処理及びゼロ点調整処理に必要なデータ数（例えば５０個）を超えた以降に、反応Ｘ（ｉ）、微分値Ｖ（ｉ）、及び積算比Ｚ（ｉ）の取得を開始する。
【0058】
Ｓ００３：測光データと、Ｘ（ｉ）、Ｖ（ｉ）及びＺ（ｉ）の取得を続けながら、算出開始点ｓ以降でＺ（ｉ）＜Ｚｓ［１］を満たす最も早いｉでの時間ｔｅ［１］を探索する。探索されたｔｅ［１］から、上記１．２．２で説明したように、Ｘ（ｔｅ［１］）、ｔｃ［１］等のパラメータを求める。
【0059】
Ｓ００４：Ｓ００３においてＺ（ｉ）＜Ｚｓ［１］を満たすｉでの時間ｔｅ［１］を取得不可の場合は、ｉが上限値まで到達したところでＳ０２０に分岐し、「反応未検出」と判断して凝固時間の算出不可とする。例えば、計測（測光）時間を０．１秒間隔で３６０秒間に設定した場合、最大計測点数は３６００であり、これがｉの上限値である。一方、ｔｅ［１］を取得できた場合はＳ００５に分岐する。
【0060】
Ｓ００５：ｋをカウントアップする。
【0061】
Ｓ００６：前の処理がＳ００５の場合はｋ＝２であり、前の処理がＳ０１０の場合はｋは３以上の整数である。次いで、さらにＰ（ｉ）と、Ｘ（ｉ）、Ｖ（ｉ）及びＺ（ｉ）の取得を続けながら、Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ］を満たすｉでの時間ｔｅ［ｋ］を探索する。
【0062】
Ｓ００７：Ｓ００６においてｔｅ［ｋ］を取得不可の場合は、ｉが上限値まで到達したところでＳ０３０に分岐し、「反応途中」と判断して凝固時間の算出不可とする。ｉの上限値はＳ００４と同じである。取得できた場合はＳ００８に分岐する。
【0063】
Ｓ００８：Ｓ００６においてｔｅ［ｋ］が取得できた場合、上記１．２．２で説明したように、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）、ｔｃ［ｋ］等のパラメータを求める。Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ－１］を満たすｔｅ［ｋ－１］からＸ（ｔｅ［ｋ－１］）、ｔｃ［ｋ－１］等のパラメータを求め、Ｔｃ決定のための指標を算出する。該指標としては、例えば、上記式（２）で示されるＲ［ｋ］、及び上記式（５）で示されるＴＲ［ｋ］などが挙げられる。Ｒ［ｋ］とＴＲ［ｋ］はいずれか１つが指標として使用されればよいが、両方を指標として使用してもよい。
次いで、該指標が基準を満たすか否かを調べる。基準としては下記（a）又は（b）があげられ、好ましくは下記（a）及び（b）が両方満たされていることが要求される。
基準（a）：Ｒ［ｋ］≦Ｒｓ
基準（b）：ＴＲ［ｋ］≦ＴＲｓ
上記基準を満たした場合、Ｓ０４０に分岐し、その他の場合はＳ００９に分岐する。
次いで、該指標が基準を満たすか否かを調べる。基準としては下記（a）又は（b）があげられ、好ましくは下記（a）及び（b）が両方満たされていることが要求される。
基準（a）：Ｒ［ｋ］≦Ｒｓ
基準（b）：ＴＲ［ｋ］≦ＴＲｓ
上記基準を満たした場合、Ｓ０４０に分岐し、その他の場合はＳ００９に分岐する。
【0064】
Ｓ００９：Ｓ００８において基準（a）も（b）もが成立しなかった場合、ｋをカウントアップする。
【0065】
Ｓ０１０：カウントアップされたｋが予め設定した最大値を超えたときはＳ０１１に分岐する。ｋが最大値以下のときはＳ００６に分岐し、ｋをカウントアップして新しいｔｅ［ｋ］の探索を続行する。
【0066】
Ｓ０１１：Ｓ００８において基準（a）と（b）が成立せずにｋが最大値を超えてしまったため、Ｔｃ決定手順は不完全終了である。このステップに進んだ場合、Ｔｃを出力してもしなくてもよい。Ｔｃを出力する場合、最後に取得したｔｃ（すなわちｔｃ［ｋ－１］）をＴｃとして決定する。Ｔｃの出力は、自動で出力しても、ボタン操作等で手動により出力してもよい。
【0067】
Ｓ０２０：Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［１］を満たすｔｅ［１］が見つからずに凝固反応計測を終えた場合であり、Ｔｃは算出不可である。このステップに進んだ場合、何らかの理由で凝固反応が無いと判定できるため、「反応未検出」フラグを出力してもよい。
【0068】
Ｓ０３０：Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［ｋ］を満たすｔｅ［ｋ］が見つからなかったため、Ｔｃは算出不可である。このステップに進んだ場合、凝固反応の途中段階で計測を終えたと判定できるため、「反応途中」フラグを出力してもよい。
【0069】
Ｓ０４０：凝固終了点が確認できており、ｔｃ［ｋ－１］又はｔｃ［ｋ］をＴｃとして出力する。好ましくはｔｃ（ｋ）がＴｃとして出力される。フラグはなし、又は「正常終了」フラグを出力してもよい。
【0070】
３．他の凝固反応計測法への応用
本発明の方法は、基本的には、散乱光量に基づく血液凝固反応計測を用いた血液凝固時間測定法であるが、当業者であれば、本発明の方法を他の計測方法、例えば透過度、吸光度などに基づく血液凝固反応計測を用いた血液凝固時間測定法に応用することが可能である。
本発明の方法は、基本的には、散乱光量に基づく血液凝固反応計測を用いた血液凝固時間測定法であるが、当業者であれば、本発明の方法を他の計測方法、例えば透過度、吸光度などに基づく血液凝固反応計測を用いた血液凝固時間測定法に応用することが可能である。
【実施例】
【0071】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0072】
実施例１
１．方法
血液凝固因子に起因して凝固反応異常のある被験者に由来する血液検体（異常検体）と、正常な血液検体（正常検体）とをそれぞれ異なる割合で混合して得た複数の混合試料について、本発明の方法に従って凝固時間の測定を実施した。
１．方法
血液凝固因子に起因して凝固反応異常のある被験者に由来する血液検体（異常検体）と、正常な血液検体（正常検体）とをそれぞれ異なる割合で混合して得た複数の混合試料について、本発明の方法に従って凝固時間の測定を実施した。
【0073】
１）試料
異常検体として、第VIII因子（FVIII）濃度が０．１％以下のＦａｃｔｏｒ VIII Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｌａｓｍａ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．製）（以下、FVIII欠乏血漿）を用いた。正常検体としては、FVIII濃度が１００％とみなされる正常プール血漿（以下、正常血漿）を用いた。FVIII欠乏血漿と正常血漿との混合比率を変えてFVIII濃度がそれぞれ、５０％、２５％、１０％、５％、２．５％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％である混合血漿（順に試料１～試料９）を調製した。また、FVIII欠乏血漿のみ（FVIII濃度０．１％以下）を試料１０とした。
異常検体として、第VIII因子（FVIII）濃度が０．１％以下のＦａｃｔｏｒ VIII Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｌａｓｍａ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．製）（以下、FVIII欠乏血漿）を用いた。正常検体としては、FVIII濃度が１００％とみなされる正常プール血漿（以下、正常血漿）を用いた。FVIII欠乏血漿と正常血漿との混合比率を変えてFVIII濃度がそれぞれ、５０％、２５％、１０％、５％、２．５％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％である混合血漿（順に試料１～試料９）を調製した。また、FVIII欠乏血漿のみ（FVIII濃度０．１％以下）を試料１０とした。
【0074】
２）試薬
ＡＰＴＴ測定用試薬としてコアグピア ＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル株式会社製）を用いた。塩化カルシウム液としてコアグピア ＡＰＴＴ－Ｎ 塩化カルシウム液（積水メディカル株式会社製）を用いた。
ＡＰＴＴ測定用試薬としてコアグピア ＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル株式会社製）を用いた。塩化カルシウム液としてコアグピア ＡＰＴＴ－Ｎ 塩化カルシウム液（積水メディカル株式会社製）を用いた。
【0075】
３）凝固反応計測
凝固反応計測は、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。試料５０μＬをキュベット（反応容器）に分注した後に３７℃で４５秒間加温し、次にキュベットに約３７℃に加温したＡＰＴＴ測定用試薬５０μＬを添加し、さらに１７１秒経過後に２５ｍＭ塩化カルシウム液５０μＬを添加して凝固反応を開始させた。反応は、約３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の計測（測光）は、波長６６０ｎｍのＬＥＤライトを光源とする光をキュベットに照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱光の散乱光量を測光することによって行った。最大計測時間は３６０秒（データ数３６００個、０．１秒間隔）とした。
凝固反応計測は、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。試料５０μＬをキュベット（反応容器）に分注した後に３７℃で４５秒間加温し、次にキュベットに約３７℃に加温したＡＰＴＴ測定用試薬５０μＬを添加し、さらに１７１秒経過後に２５ｍＭ塩化カルシウム液５０μＬを添加して凝固反応を開始させた。反応は、約３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の計測（測光）は、波長６６０ｎｍのＬＥＤライトを光源とする光をキュベットに照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱光の散乱光量を測光することによって行った。最大計測時間は３６０秒（データ数３６００個、０．１秒間隔）とした。
【0076】
４）凝固反応曲線の作成
測光データから測光曲線Ｐを求め、該Ｐに対してノイズ除去を含む平滑化処理を行った後、測光開始時点の散乱光量が０となるようにゼロ点調整処理して反応Ｘを算出した。
測光データから測光曲線Ｐを求め、該Ｐに対してノイズ除去を含む平滑化処理を行った後、測光開始時点の散乱光量が０となるようにゼロ点調整処理して反応Ｘを算出した。
【0077】
５）微分値Ｖ、積算比Ｚの取得
反応Ｘから、一次微分値Ｖ、及び下記式（１）に従い積算比Ｚを算出した。
Z(i) = {X(i+1)+X(i+2)+...+X(i+m)}/{X(i-m)+X(i-m+1)+...+X(i-1)} (1)
m = ２０
Ｚの算出は、Ｘ（ｉ－ｍ）からＸ（ｉ－１）までが全てＸｓ以上であることを条件として開始された。Ｘｓは３５０に設定した。
反応Ｘから、一次微分値Ｖ、及び下記式（１）に従い積算比Ｚを算出した。
Z(i) = {X(i+1)+X(i+2)+...+X(i+m)}/{X(i-m)+X(i-m+1)+...+X(i-1)} (1)
m = ２０
Ｚの算出は、Ｘ（ｉ－ｍ）からＸ（ｉ－１）までが全てＸｓ以上であることを条件として開始された。Ｘｓは３５０に設定した。
【0078】
６）算出開始点
算出開始点ｓは、Ｚ（ｉ）が所定値を上回った後、その所定値を下回った点とした。該所定値は１．２とした。
算出開始点ｓは、Ｚ（ｉ）が所定値を上回った後、その所定値を下回った点とした。該所定値は１．２とした。
【0079】
７）閾値Ｚｓの設定
Ｚｓ［ｋ］を下記表２のとおりに設定した。
Ｚｓ［ｋ］を下記表２のとおりに設定した。
【表2】
【0080】
８）パラメータ
ｔｅ［ｋ］、ｔｃ［ｋ］、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）、ｔｅ［ｋ－１］、ｔｃ［ｋ－１］、Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］）（ｋ＝２～８の整数）。
ｔｅ［ｋ］、ｔｃ［ｋ］、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）、ｔｅ［ｋ－１］、ｔｃ［ｋ－１］、Ｘ（ｔｅ［ｋ－１］）（ｋ＝２～８の整数）。
【0081】
９）凝固時間Ｔｃ算出用指標
指標（a）：Ｒ［ｋ］（％）（= X(te[k])/X(te[k-1]) × 100）
指標（b）：ＴＲ［ｋ］（％）（= ΔC/ΔE × 100）
ΔC = tc[k]-tc[k-1]
ΔE = te[k]-te[k-1]
指標（a）：Ｒ［ｋ］（％）（= X(te[k])/X(te[k-1]) × 100）
指標（b）：ＴＲ［ｋ］（％）（= ΔC/ΔE × 100）
ΔC = tc[k]-tc[k-1]
ΔE = te[k]-te[k-1]
【0082】
１０）算出プロセス
測光データから逐次に反応Ｘ、積算比Ｚ、及び必要に応じて微分値Ｖを取得し、算出開始点ｓ以降、表１に示すＺｓ［ｋ］を用いてパラメータ：ｔｅ［ｋ］、ｔｃ［ｋ］、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）、ｔｅ［ｋ－１］、ｔｃ［ｋ－１］、及びＸ（ｔｅ［ｋ－１］）を算出し、さらに指標（a）：Ｒ［ｋ］（％）及び指標（b）：ＴＲ［ｋ］（％）を算出した。下記基準（a）及び（b）を満たしたときのｔｃ［ｋ］を凝固時間Ｔｃとした。ｋは初期値ｋ＝１として、下記基準（a）及び（b）を満たすまで１ずつ最大８まで増加させながら上記プロセスを繰り返した。ｋ＝８で該基準が満たされなかった場合、ｔｃ［８］をＴｃとした。
基準（a）：Ｒ［ｋ］（％）≦Ｒｓ、Ｒｓ＝１０５％
基準（b）：ＴＲ［ｋ］（％）≦ＴＲｓ、ＴＲｓ＝１０％
なお本実施例及び以下の実施例では、決定したＴｃの評価のため、Ｔｃ決定基準が満たされた（下記基準（a）と基準（b）がともに満たされた）後も最大計測時間まで凝固反応計測を継続し、パラメータと指標を取得した。
測光データから逐次に反応Ｘ、積算比Ｚ、及び必要に応じて微分値Ｖを取得し、算出開始点ｓ以降、表１に示すＺｓ［ｋ］を用いてパラメータ：ｔｅ［ｋ］、ｔｃ［ｋ］、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）、ｔｅ［ｋ－１］、ｔｃ［ｋ－１］、及びＸ（ｔｅ［ｋ－１］）を算出し、さらに指標（a）：Ｒ［ｋ］（％）及び指標（b）：ＴＲ［ｋ］（％）を算出した。下記基準（a）及び（b）を満たしたときのｔｃ［ｋ］を凝固時間Ｔｃとした。ｋは初期値ｋ＝１として、下記基準（a）及び（b）を満たすまで１ずつ最大８まで増加させながら上記プロセスを繰り返した。ｋ＝８で該基準が満たされなかった場合、ｔｃ［８］をＴｃとした。
基準（a）：Ｒ［ｋ］（％）≦Ｒｓ、Ｒｓ＝１０５％
基準（b）：ＴＲ［ｋ］（％）≦ＴＲｓ、ＴＲｓ＝１０％
なお本実施例及び以下の実施例では、決定したＴｃの評価のため、Ｔｃ決定基準が満たされた（下記基準（a）と基準（b）がともに満たされた）後も最大計測時間まで凝固反応計測を継続し、パラメータと指標を取得した。
【0083】
２．Ｔｃ算出基準の評価
１）仮凝固終了点ｔｅ、仮凝固点ｔｃの時間的変化
図６に、計測時間に対する試料１（左、FVIII濃度５０％）及び試料１０（右、FVIII濃度０．１％以下）でのＸの反応曲線を示す。曲線上のマーカーは、白四角が仮凝固終了点ｔｅ［ｋ］、白丸が仮凝固点ｔｃ［ｋ］を示す（ｋ＝２～８、Ｚｓ［ｋ］＝１．０３１～１．００１）。試料１、１０のいずれについても、ｔｃ［２］とｔｅ［２］が最も小さく、ｔｃ［８］とｔｅ［８］が最も大きかった。試料１、１０のいずれについても、仮凝固終了点ｔｅ［８］（Ｚｓ［８］＝１．００１）は、視覚的に真の凝固反応終了点と判定できる値であった。ｔｃ［ｋ］の値は、試料１ではほぼ一致しており、一方試料１０では異なっていた。
１）仮凝固終了点ｔｅ、仮凝固点ｔｃの時間的変化
図６に、計測時間に対する試料１（左、FVIII濃度５０％）及び試料１０（右、FVIII濃度０．１％以下）でのＸの反応曲線を示す。曲線上のマーカーは、白四角が仮凝固終了点ｔｅ［ｋ］、白丸が仮凝固点ｔｃ［ｋ］を示す（ｋ＝２～８、Ｚｓ［ｋ］＝１．０３１～１．００１）。試料１、１０のいずれについても、ｔｃ［２］とｔｅ［２］が最も小さく、ｔｃ［８］とｔｅ［８］が最も大きかった。試料１、１０のいずれについても、仮凝固終了点ｔｅ［８］（Ｚｓ［８］＝１．００１）は、視覚的に真の凝固反応終了点と判定できる値であった。ｔｃ［ｋ］の値は、試料１ではほぼ一致しており、一方試料１０では異なっていた。
【0084】
Ｚ（ｉ）＜Ｚｓ［８］（＝１．００１）を満たす時点を凝固終了点とし、Ｘが凝固終了点の５０％である時点をＡＰＴＴとした。図７に、試料１～１０についてのＺｓ［ｋ］（ｋ＝１～８、Ｚｓ［ｋ］＝１．０３６～１．００１）でのｔｃ［ｋ］（左）及びｔｅ［ｋ］（右）のＡＰＴＴに対するプロットを示す。ＡＰＴＴが延長するほど、仮凝固点ｔｃ［ｋ］の分布幅が広がった。仮凝固終了点ｔｅ［ｋ］についても同様の傾向が確認された。但し、最も遅い点ｔｅ［８］は、他の点より離れた位置にあった。
【0085】
２）指標（a）についてのＴｃ決定基準
図８Ａ、Ｂは、試料１～１０について求めた指標（a）：Ｒ［ｋ］（％）のＡＰＴＴに対するプロット（Ａ）及びその拡大図（Ｂ）である。Ｒ［ｋ］は、同じＺｓ値に由来するものであっても、ＡＰＴＴに応じて分布が異なっていた。図８Ｂより、Ｔｃ決定のための基準値Ｒｓを１０５％にすることで、約９６％のケースでＲ［ｋ］≦Ｒｓとなり、凝固時間Ｔｃ（ＡＰＴＴ）を正確に算出できることが分かった。
図８Ａ、Ｂは、試料１～１０について求めた指標（a）：Ｒ［ｋ］（％）のＡＰＴＴに対するプロット（Ａ）及びその拡大図（Ｂ）である。Ｒ［ｋ］は、同じＺｓ値に由来するものであっても、ＡＰＴＴに応じて分布が異なっていた。図８Ｂより、Ｔｃ決定のための基準値Ｒｓを１０５％にすることで、約９６％のケースでＲ［ｋ］≦Ｒｓとなり、凝固時間Ｔｃ（ＡＰＴＴ）を正確に算出できることが分かった。
【0086】
図８Ｃ、Ｄは、試料１～１０からのＲ［ｋ］（％）によるＴｃ算出の正確性を、対応するＺｓ［ｋ］別に示したプロット（Ｃ）及びその拡大図（Ｄ）である。縦軸は、各試料でのＺｓ＝１．００１（Ｚｓ[８]）でのＴｃ算出値を１００％としたときの、Ｚｓ［１］～［７］での相対Ｔｃ算出値であり、算出値の正確性（％）を表す。正確性が９６％以上となるＺｓ値は、試料１０（ＡＰＴＴ＝約１３０秒）は該当なし（Ｚｓ[７]＝１．００６でも９６％に届かない）で、試料９（ＡＰＴＴ＝約９０秒）ではＺｓ[７]＝１．００６とＺｓ[６]＝１．０１１が該当した。図８Ｅは、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）／Ｘ（ｔｅ［８］）（％）を対応するＺｓ［ｋ］別に示したプロットである。縦軸は、各試料でのＺｓ＝１．００１（Ｚｓ[８]）でのＸ（ｔｅ［８］）を１００％としたときの、Ｚｓ［１］～［７］でのＸ（ｔｅ［１］）～Ｘ（ｔｅ［７］）の相対値であり、反応曲線Ｘの相対高さ（％）を表す。相対高さはＡＰＴＴの大きさに応じた分布となった。図８Ａと対比すると、反応曲線の相対高さが１００％に近づくにつれてＲ［ｋ］も１００％に向かって低下していくことが分かった。
【0087】
以上より、凝固時間Ｔｃを決定する場合において、反応曲線の相対高さが９０％に達していること（すなわち凝固反応が終了段階にあること）を表す基準として、［Ｒ［ｋ］（％）≦１０５％］を設定できることが示された。
【0088】
３）指標（b）についてのＴｃ決定基準
図９Ａは、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）／Ｘ（ｔｅ［８］）（％）を対応するＺｓ［ｋ］別に示したプロット（図８Ｅと同じ）であり、図９Ｂ～Ｄは、指標（b）：ＴＲ［ｋ］（＝ΔＣ／ΔＥ）（％）、ΔＥ及びΔＣのＡＰＴＴに対するプロットである。ΔＥとΔＣは、ＡＰＴＴ値に応じて増加する傾向があり、変化量はΔＥの方がΔＣより大きかった（図９Ｃ～Ｄ）。その結果として、図９Ｂに示すように、両者の変化量の比であるＴＲ［ｋ］（＝ΔＣ／ΔＥ）も、ＡＰＴＴに応じて増加した。ＡＰＴＴに対するＴＲ［ｋ］の分布は、図９Ａ（Ｘ（ｔｅ［ｋ］））の縦軸を逆転したときと同じ挙動を示した。したがって、ＴＲ［ｋ］は間接的に、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）における反応曲線の相対高さを反映していることが示された。
図９Ａは、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）／Ｘ（ｔｅ［８］）（％）を対応するＺｓ［ｋ］別に示したプロット（図８Ｅと同じ）であり、図９Ｂ～Ｄは、指標（b）：ＴＲ［ｋ］（＝ΔＣ／ΔＥ）（％）、ΔＥ及びΔＣのＡＰＴＴに対するプロットである。ΔＥとΔＣは、ＡＰＴＴ値に応じて増加する傾向があり、変化量はΔＥの方がΔＣより大きかった（図９Ｃ～Ｄ）。その結果として、図９Ｂに示すように、両者の変化量の比であるＴＲ［ｋ］（＝ΔＣ／ΔＥ）も、ＡＰＴＴに応じて増加した。ＡＰＴＴに対するＴＲ［ｋ］の分布は、図９Ａ（Ｘ（ｔｅ［ｋ］））の縦軸を逆転したときと同じ挙動を示した。したがって、ＴＲ［ｋ］は間接的に、Ｘ（ｔｅ［ｋ］）における反応曲線の相対高さを反映していることが示された。
【0089】
３．Ｔｃ決定
試料１～１０について取得された各パラメータ及び指標を表３～表６に示す。いずれの試料も最大計測時間に到達することなくＴｃ算出プロセスが終了した。Ｔｃが決定されて以後のパラメータと指標の欄は斜線で示す。灰色の欄は、指標が基準（a）又は（b）を満たしたことを表す。
試料１～１０について取得された各パラメータ及び指標を表３～表６に示す。いずれの試料も最大計測時間に到達することなくＴｃ算出プロセスが終了した。Ｔｃが決定されて以後のパラメータと指標の欄は斜線で示す。灰色の欄は、指標が基準（a）又は（b）を満たしたことを表す。
【0090】
【表3】
【0091】
【表4】
【0092】
【表5】
【0093】
【表6】
【0094】
図１０Ａ、Ｂに、凝固時間Ｔｃが決定されたときの仮凝固点ｔｃ［ｋ］（Ａ）と仮凝固終了点ｔｅ［ｋ］（Ｂ）をＡＰＴＴに対してプロットした（図中、本法）。図中、対照としてＺｓ＝１．００１（ｋ＝８）、及び比較例としてＺｓ＝１．０３１（ｋ＝２）のときのｔｃ［ｋ］、ｔｅ［ｋ］も共にプロットした。また、対照（Ｚｓ＝１．００１、ｋ＝８）でのｔｃ［ｋ］及びｔｅ［ｋ］から本法又は比較例１での値を引いた差分を図１０Ｃ及びＤにそれぞれ示す。
本法でＴｃが決定されたときのｔｃ［ｋ］（＝決定されたＴｃ）は、対照でのｔｃ［ｋ］（ＡＰＴＴとほぼ等しい）と重なっていた。本法と対照とのｔｃ［ｋ］の差は１秒以内であった。一方、本法でのｔｅ［ｋ］はＡＰＴＴが短い場合は比較例に近いが、ＡＰＴＴ９０秒以降では対照と重なっていた。ｔｅ［ｋ］は最短で３３秒であった（右図）。これは、ＡＰＴＴが９０秒より小さい場合は、本法でＴｃを得るのに要する凝固反応計測時間は対照と比べて約２０秒から約３０秒短いことを示している。一方、比較例と対照との間では、ｔｃ［ｋ］（＝決定されたＴｃ）の差は、ＡＰＴＴが５０秒までのときは１秒以内であるが、ＡＰＴＴの延長に伴って大きくなり最大２９秒であり、一方ｔｅ［ｋ］の差は、最小２６秒最大１４２秒であった。すなわち比較例では、凝固反応計測時間は対照と比べて短くなるものの、ＡＰＴＴが５０秒より小さい場合は対照と同等の凝固時間が得られるが、ＡＰＴＴが５０秒より大きくなると、対照と比べて凝固時間が短く算出されていた。以上から、本発明の方法により正確な凝固時間の算出と計測時間の短縮化の両立が可能であることが示された。
本法でＴｃが決定されたときのｔｃ［ｋ］（＝決定されたＴｃ）は、対照でのｔｃ［ｋ］（ＡＰＴＴとほぼ等しい）と重なっていた。本法と対照とのｔｃ［ｋ］の差は１秒以内であった。一方、本法でのｔｅ［ｋ］はＡＰＴＴが短い場合は比較例に近いが、ＡＰＴＴ９０秒以降では対照と重なっていた。ｔｅ［ｋ］は最短で３３秒であった（右図）。これは、ＡＰＴＴが９０秒より小さい場合は、本法でＴｃを得るのに要する凝固反応計測時間は対照と比べて約２０秒から約３０秒短いことを示している。一方、比較例と対照との間では、ｔｃ［ｋ］（＝決定されたＴｃ）の差は、ＡＰＴＴが５０秒までのときは１秒以内であるが、ＡＰＴＴの延長に伴って大きくなり最大２９秒であり、一方ｔｅ［ｋ］の差は、最小２６秒最大１４２秒であった。すなわち比較例では、凝固反応計測時間は対照と比べて短くなるものの、ＡＰＴＴが５０秒より小さい場合は対照と同等の凝固時間が得られるが、ＡＰＴＴが５０秒より大きくなると、対照と比べて凝固時間が短く算出されていた。以上から、本発明の方法により正確な凝固時間の算出と計測時間の短縮化の両立が可能であることが示された。
【0095】
実施例２
検体として、XII因子濃度が０．１％以下のＦａｃｔｏｒ XII Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｌａｓｍａ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．製）と（以下、FXII欠乏血漿、FXII濃度０％）、FXII濃度が１００％と見做される正常プール血漿（以下、正常血漿）とを用い、FXII欠乏血漿と正常血漿との混合比率を１：３９としてFXII濃度が０．２５％の混合血漿（試料１１）を調製した。
検体として、XII因子濃度が０．１％以下のＦａｃｔｏｒ XII Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｌａｓｍａ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．製）と（以下、FXII欠乏血漿、FXII濃度０％）、FXII濃度が１００％と見做される正常プール血漿（以下、正常血漿）とを用い、FXII欠乏血漿と正常血漿との混合比率を１：３９としてFXII濃度が０．２５％の混合血漿（試料１１）を調製した。
【0096】
調製した試料１１について、実施例１の１．１０）と同様の手順で基準（a）及び（b）を満たすＴｃを探索した。しかし、この試料では、ｋ＝６（Ｚｓ＝１．０１１）までｔｅ［ｋ］、ｔｅ［ｋ］が得られたものの、ｋ＝７（Ｚｓ＝１．００６）を取得する前に最大計測時間に到達したためＴｃ算出プロセスが終了した。結果、本例では凝固時間Ｔｃは出力されずに「反応途中」を表すフラグが出力された。試料１１についての反応曲線Ｘ（ｔｅ［ｋ］、ｔｅ［ｋ］が図示されている）、及び算出されたパラメータ及び指標を図１１に示す。
【0097】
実施例３
フィブリノーゲン濃度が低値（６２ｍｇ／ｄＬ）の検体（試料１２）について、実施例１の１．１０）と同様の手順で基準（a）及び（b）を満たすＴｃを探索した。ｋ＝２（Ｚｓ＝１．０３１）で基準（a）及び（b）が満たされ、凝固時間Ｔｃは３０．９秒と決定された。試料１２についての反応曲線Ｘ（ｋ＝１～８のｔｅ［ｋ］、ｔｅ［ｋ］が図示されている）、及び算出されたパラメータ及び指標を図１２に示す。図１２の表中灰色の欄は、指標が基準（a）又は（b）を満たしたことを表す。フィブリノーゲン濃度が正常レベルの図６左と比較すると、図１２での凝固反応の最大値は約８分の１であったが、このようにフィブリノーゲン濃度が低い検体においても本発明の方法で凝固時間Ｔｃを算出できることが確認できた。
フィブリノーゲン濃度が低値（６２ｍｇ／ｄＬ）の検体（試料１２）について、実施例１の１．１０）と同様の手順で基準（a）及び（b）を満たすＴｃを探索した。ｋ＝２（Ｚｓ＝１．０３１）で基準（a）及び（b）が満たされ、凝固時間Ｔｃは３０．９秒と決定された。試料１２についての反応曲線Ｘ（ｋ＝１～８のｔｅ［ｋ］、ｔｅ［ｋ］が図示されている）、及び算出されたパラメータ及び指標を図１２に示す。図１２の表中灰色の欄は、指標が基準（a）又は（b）を満たしたことを表す。フィブリノーゲン濃度が正常レベルの図６左と比較すると、図１２での凝固反応の最大値は約８分の１であったが、このようにフィブリノーゲン濃度が低い検体においても本発明の方法で凝固時間Ｔｃを算出できることが確認できた。
【0098】
実施例４
Ｔｃ算出の算出開始点ｓの条件を評価した。試料には、反応初期に反応曲線の緩やかな上昇が続いた検体（試料１３）を用いた。以下の条件に従って算出開始点ｓを定め、実施例１の１．１０）と同様の手順で基準（a）及び（b）を満たすＴｃを探索した。
条件１（従来技術と同じ）：積算比Ｚがピークを越えた以降、すなわちＺが所定値を上回った後、その所定値を下回った点を算出開始点ｓとした。Ｚの所定値は１．２とした。
条件２：ピークを挟んでＶ（ｉ）＝Ｖｓとなる２点間の計測点数がＷｓを超えたとき、Ｖ（ｉ）＝Ｖｓとなる遅いほうの計測点を算出開始点ｓとした（図３参照）。Ｖｓは９０％Ｖｍａｘ、Ｗｓは１０（１秒）に設定した。
条件３：条件２と同じ、但しＶｓは５０％Ｖｍａｘ、Ｗｓは１０（１秒）に設定した。
Ｔｃ算出の算出開始点ｓの条件を評価した。試料には、反応初期に反応曲線の緩やかな上昇が続いた検体（試料１３）を用いた。以下の条件に従って算出開始点ｓを定め、実施例１の１．１０）と同様の手順で基準（a）及び（b）を満たすＴｃを探索した。
条件１（従来技術と同じ）：積算比Ｚがピークを越えた以降、すなわちＺが所定値を上回った後、その所定値を下回った点を算出開始点ｓとした。Ｚの所定値は１．２とした。
条件２：ピークを挟んでＶ（ｉ）＝Ｖｓとなる２点間の計測点数がＷｓを超えたとき、Ｖ（ｉ）＝Ｖｓとなる遅いほうの計測点を算出開始点ｓとした（図３参照）。Ｖｓは９０％Ｖｍａｘ、Ｗｓは１０（１秒）に設定した。
条件３：条件２と同じ、但しＶｓは５０％Ｖｍａｘ、Ｗｓは１０（１秒）に設定した。
【0099】
図１３に条件１～３下で取得した各パラメータ及び指標を示す。左図は反応曲線Ｘと微分値Ｖを示し、右図はＸと積算比Ｚを示す。図中のマーカーは白四角がＴｅ［ｋ］、白丸がＴｃ［ｋ］を表している。右端は各パラメータ及び指標の表である。表中の灰色の欄は、指標が基準（a）又は（b）を満たしたことを表す。
条件１では、反応初期の反応曲線Ｘの緩やかな上昇部においてＺが所定値を下回ったため、Ｖ（ｉ）が最大になる前にＴｃ算出が開始され、ｋ＝１～４でのＴｅ［ｋ］、Ｔｃ［ｋ］が得られた。しかし基準（a）及び（b）が満たされないままＴｃ算出プロセスが進み、最終的にｋ＝８（Ｚｓ＝１．００１）でＴｃ１６３．６秒が決定された。
条件２、３では、Ｖ（ｉ）がピークを超えた後にＴｃ算出が開始された。図中の黒四角が算出開始点ｓである。条件２、３ともｋ＝８（Ｚｓ＝１．００１）で基準（a）及び（b）が満たされ、Ｔｃ１６３．６秒が決定された。ただし条件３では、ｋ＝１～４でのＴｅ［ｋ］が近接していたことから、ｋ＝１～４での指標はＴｃ算出に採用されないように処理した。
条件１では、反応初期の反応曲線Ｘの緩やかな上昇部においてＺが所定値を下回ったため、Ｖ（ｉ）が最大になる前にＴｃ算出が開始され、ｋ＝１～４でのＴｅ［ｋ］、Ｔｃ［ｋ］が得られた。しかし基準（a）及び（b）が満たされないままＴｃ算出プロセスが進み、最終的にｋ＝８（Ｚｓ＝１．００１）でＴｃ１６３．６秒が決定された。
条件２、３では、Ｖ（ｉ）がピークを超えた後にＴｃ算出が開始された。図中の黒四角が算出開始点ｓである。条件２、３ともｋ＝８（Ｚｓ＝１．００１）で基準（a）及び（b）が満たされ、Ｔｃ１６３．６秒が決定された。ただし条件３では、ｋ＝１～４でのＴｅ［ｋ］が近接していたことから、ｋ＝１～４での指標はＴｃ算出に採用されないように処理した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
