特許 7617023 ヒト制御性Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏにおけるビーズを使用しない増殖

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-08

(45)【発行日】2025-01-17

(54)【発明の名称】ヒト制御性Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏにおけるビーズを使用しない増殖

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20250109BHJP

   A61K 35/17 20250101ALI20250109BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20250109BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20250109BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20250109BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20250109BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20250109BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20250109BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

A61K35/17

A61P37/06

A61P3/10

A61P17/06

A61P25/00

A61P29/00

A61P1/00

【請求項の数】 24

(21)【出願番号】P 2021563598

(86)(22)【出願日】2020-04-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-01

(86)【国際出願番号】 US2020030869

(87)【国際公開番号】W WO2020223568

(87)【国際公開日】2020-11-05

【審査請求日】2023-04-19

(31)【優先権主張番号】62/841,215

(32)【優先日】2019-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】タン， キジ

(72)【発明者】

【氏名】スカルツィス， ニコラオス

(72)【発明者】

【氏名】ビンセンティ， フラビオ

【審査官】平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５１８９７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】Front. Immunol.，2018年，Vol.9, No.573，pp.1-12

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の生成のための方法であって、
ａ）ヒト対象から得られたリンパ球含有生体試料からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴ細胞を単離することと；
ｂ）ＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋、ＨＥＬＩＯＳ＋であり、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）が脱メチル化されているヒトＴｒｅｇの生成において有効な条件下で、ＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＣＤ２８ＳＡ）抗体、インターロイキン２（ＩＬ－２）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）を含む培地中で前記ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴ細胞を培養することと
を含む、方法。

【請求項2】

工程ｂ）が、抗ＣＤ３抗体の使用を含まない、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程ｂ）が、単離Ｔ細胞のＣＤ２８およびＣＤ３を架橋結合させる、磁気ビーズまたはＦｃ受容体発現フィーダー細胞の使用を含まない、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

培地が、腫瘍壊死因子受容体２アゴニスト（ＴＮＦＲ２ａ）およびインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮガンマ）の一方または両方をさらに含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

培地が、ＩＬ－６およびＩＬ－１ベータの一方または両方をさらに含む、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

リンパ球含有生体試料が、全血、白血球除去輸血生成物および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

生体試料が、新鮮であるか、またはヒト対象から得られた後に凍結保存され、その後、工程ａ）の前に解凍される、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

工程ａ）のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴ細胞が、生体試料から蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）により単離される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

工程ｂ）の開始から７～１８日後にヒトＴｒｅｇを回収する工程ｃ）をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

ヒトＴｒｅｇが、工程ａ）開始時のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴ細胞よりも約２００～約２０００倍多い細胞を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法によりヒトＴｒｅｇを生成させることを含む、１０^７～１０^１１個のヒトＴｒｅｇと生理学的に許容される緩衝液とを含む薬学的組成物の製造方法。

【請求項12】

薬学的組成物が、病理学的免疫応答の治療または予防を必要とするヒト対象における、病理学的免疫応答の治療または予防において使用される、請求項１１に記載の製造方法。

【請求項13】

病理学的免疫応答が、自己免疫性または自己炎症性疾患である、請求項１２に記載の製造方法。

【請求項14】

自己免疫性または自己炎症性疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、全身性エリテマトーデス、天疱瘡、乾癬、Ｉ型糖尿病、セリアック病および炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項１３に記載の製造方法。

【請求項15】

薬学的組成物が、自己免疫性または自己炎症性疾患の、症状の軽減において有効であるか、または進行の阻害において有効であり、任意選択で、自己免疫性または自己炎症性疾患の進行の阻害が、組織破壊の阻害を含む、請求項１３に記載の製造方法。

【請求項16】

病理学的免疫応答が、造血系同種移植または実質臓器同種移植の拒絶反応である、請求項１２に記載の製造方法。

【請求項17】

病理学的免疫応答が、造血系同種移植の拒絶反応であり、造血系同種移植が、骨髄移植または末梢血幹細胞移植である、請求項１６に記載の製造方法。

【請求項18】

病理学的免疫応答が、実質臓器同種移植の拒絶反応であり、実質臓器同種移植が、心臓、肺、心臓／肺、腎臓、膵臓、腎臓／膵臓、肝臓、腸管、膵島および皮膚の同種移植からなる群から選択される、請求項１６に記載の製造方法。

【請求項19】

急性および／もしくは慢性拒絶反応の症状の軽減において有効であるか、または臓器同種移植の生存の延長において有効である、請求項１６に記載の製造方法。

【請求項20】

病理学的免疫応答が、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である、請求項１２に記載の製造方法。

【請求項21】

薬学的組成物が、急性および／もしくは慢性ＧｖＨＤの症状の軽減において有効であるか、または宿主の皮膚、肝臓、肺および／もしくは腸への傷害の阻害において有効である、請求項２０に記載の製造方法。

【請求項22】

ヒト対象におけるベースラインを超えるＴｒｅｇの割合の上昇において有効である、請求項１２に記載の製造方法。

【請求項23】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法によりヒトＴｒｅｇを生成させることを含む、ヒトエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆｓ）の増殖を阻害するための医薬の製造方法。

【請求項24】

ヒトＴｒｅｇの生成のための方法が、医薬品の優良製造所基準（ＧＭＰ）に準拠している、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願では、２０１９年４月３０日申請の米国特許仮出願第６２／８４１，２１５号の利益を主張し、この開示は、本明細書によって、この全体が参照により組み込まれる。

【0002】

連邦支援による研究または開発に関する主張
なし。

【0003】

本開示は、養子細胞療法における使用のための制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の製造に一般に関する。特には、本開示は、Ｔｒｅｇのｅｘ ｖｉｖｏにおける増殖のための簡略化された手法に関する。この方法で生成したＴｒｅｇは、種々の免疫療法レジメンにおける使用に適する。

【背景技術】

【0004】

制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、末梢血リンパ球の小型の亜集団であり、免疫系の寛容性、炎症および恒常性の調節に重大な意味を持つ。Ｔｒｅｇの異常は、調節不能の炎症および多様な自己免疫性疾患と関連して観察されている。したがって、Ｔｒｅｇは、自己免疫性および炎症性疾患、骨髄移植後の移植片対宿主病、ならびに実質臓器移植の拒絶反応を治療するための養子細胞療法として開発されている（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｔａｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６２：１５４～１５５、２０１８）。

【0005】

前臨床試験および臨床試験のためのＴｒｅｇを製造する現在の方法は、多様である（Ｒｕｃｈｓら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、８：１８４４、２０１８）。ほとんどの方法は、従来のＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖のために開発された方法を使用する、精製したＴｒｅｇの強力な抗原性または分裂促進性刺激に依存している。特に、このような方法では、ビーズ上に固定化したＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体、人工抗原提示細胞、またはＴｒｅｇを強力に活性化してＩＬ－２の助けにより細胞を増殖させる高分子足場を使用する。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏにおける非天然条件の下に、Ｔｒｅｇは、その独自性および機能を失う危険に冒されている。したがって、Ｔｒｅｇの独自性および機能に負に影響することなく、Ｔｒｅｇの一貫した安定な増殖をもたらすＴｒｅｇを製造する方法の当技術分野における必要性が存在する。その上、出発細胞集団のＴｒｅｇ表現型を維持しながら、細胞製造方法の複雑さを低減し、方法の自動化をより可能とするのに、Ｔｒｅｇ増殖のための簡略化され適応可能なプロトコールの開発が望まれている。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、養子細胞療法における使用のための制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の製造に一般に関する。特には、本開示は、Ｔｒｅｇのｅｘ ｖｉｖｏにおける増殖のための簡略化された手法に関する。この方法で生成したＴｒｅｇは、種々の免疫療法レジメンにおける使用に適する。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】磁気ビーズにコンジュゲートさせた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を含む標準的プロトコールを使用して生成したヒトＴｒｅｇの増殖の程度を、実施例１に記載する本開示のビーズを使用しないプロトコールと比較して示すグラフである。略称は、次の通りである：ＢＦ１＝抗ＣＤ２８ＳＡ ＡｂおよびＩＬ－２を含むプロトコール；ＢＦ２＝抗ＣＤ２８ＳＡ Ａｂ、ＩＬ－２およびＩＬ－６を含むプロトコール；ＢＦ３＝抗ＣＤ２８ＳＡ Ａｂ、ＩＬ－２およびＴＮＦアルファを含むプロトコール；ならびにＢＦ４＝抗ＣＤ２８ＳＡ Ａｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－６およびＴＮＦアルファを含むプロトコール。

【図2】実施例１に記載する本開示のビーズを使用しないプロトコールを使用して生成したヒトＴｒｅｇ上のＴｒｅｇ系統マーカーＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳおよびＣＤ２７の発現レベルを示すグラフである。Ｔｒｅｇは、１４日目に回収した。略称は、図１に記載の通りである。

【図3】実施例１に記載する本開示のビーズを使用しないプロトコールを使用して生成したヒトＴｒｅｇ上のＴｒｅｇ系統マーカーＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ２７の発現レベルを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。Ｔｒｅｇは、１４日目に回収した。略称は、図１に記載の通りである。

【図4】実施例１に記載する本開示のビーズを使用しないプロトコールを使用して生成したヒトＴｒｅｇ上のＴｒｅｇ系統マーカーＨＥＬＩＯＳおよびＣＤ２７の発現レベルを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。Ｔｒｅｇは、１４日目に回収した。略称は、図１に記載の通りである。

【図5】磁気ビーズならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を含む標準的プロトコールを使用して生成したヒトＴｒｅｇの増殖の程度を、本開示のＢＦ４プロトコールと比較して示すグラフである。Ｔｒｅｇは、１４日目に回収した。

【図6】磁気ビーズならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を含む標準的プロトコールを使用して生成したヒトＴｒｅｇ上のＴｒｅｇ系統マーカーＦＯＸＰ３およびＨＥＬＩＯＳの発現レベルを、本開示のＢＦ４プロトコールと比較して示すフローサイトメトリーヒストグラムである。Ｔｒｅｇは、１４日目に回収した。

【図7】磁気ビーズならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を含む標準的プロトコールを使用して生成したヒトＴｒｅｇ上のＴｒｅｇ系統マーカーＨＥＬＩＯＳおよびＣＤ２７の発現レベルを、本開示のＢＦ４プロトコールと比較して示すフローサイトメトリーヒストグラムである。Ｔｒｅｇは、１４日目に回収した。

【図8A】磁気ビーズならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を含む標準的プロトコールを使用して生成したヒトＴｒｅｇによる、予備活性化エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）増殖の抑制レベルを、本開示のＢＦ４プロトコールと比較して示すグラフである。

【図8B】磁気ビーズならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を含む標準的プロトコールを使用して生成したヒトＴｒｅｇによる、自家末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）増殖の抑制レベルを、本開示のＢＦ４プロトコールと比較して示すグラフである。

【図9】磁気ビーズならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を含む標準的プロトコールを使用して生成したヒトＴｒｅｇによる、腫瘍壊死因子アルファの存在および非存在下のエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）増殖の抑制レベルを、本開示のＢＦ４プロトコールと比較して示すグラフである。

【図10】ＩＬ－１（ビーズ）存在下の磁気ビーズならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体による２ラウンドの刺激を使用して生成したヒトＴｒｅｇの増殖レベルを、本開示のＢＦ１０プロトコールと比較して示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本開示は、養子細胞療法における使用のための制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の製造に一般に関する。特には、本開示は、伝統的磁気ビーズまたはフィーダー細胞に基づくプロトコールに対する、Ｔｒｅｇのｅｘ ｖｉｖｏにおける増殖のための代替手法に関する。この方法で生成したＴｒｅｇは、種々の免疫療法レジメンにおける使用に適する。

【0009】

本開示では、ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の生成のための方法であって、ａ）ヒト対象から得られたリンパ球含有生体試料からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴ細胞を単離すること；ならびにｂ）ＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋、ＨＥＬＩＯＳ＋であり、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）が脱メチル化されているヒトＴｒｅｇの生成において有効な条件下でＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＣＤ２８ＳＡ）抗体、インターロイキン２（ＩＬ－２）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）を含む培地中でＴ細胞を培養することを含む、方法を提供する。本開示では、ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇの生成のための方法であって、ａ）ヒト対象から得られたリンパ球含有生体試料からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴ細胞を単離すること；ならびにｂ）ＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋、ＨＥＬＩＯＳ＋であり、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）が脱メチル化されているヒトＴｒｅｇの生成において有効な条件下でＣＤ２８ＳＡ抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－６およびＴＮＦアルファを含む培地中でＴ細胞を培養することを含む、方法をさらに提供する。また、本開示では、ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の生成のための方法であって、ａ）ヒト対象から得られたリンパ球含有生体試料からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴ細胞を単離すること；ならびにｂ）ＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋、ＨＥＬＩＯＳ＋であり、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）が脱メチル化されているヒトＴｒｅｇの生成において有効な条件下でＣＤ２８ＳＡ抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１ベータおよびＴＮＦアルファを含む培地中でＴ細胞を培養することを含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、ヒトＴｒｅｇは、ＣＤ３＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８－およびＣＤ１９－である。ＩＬ－６存在下での細胞培養を含む好ましい刺激条件は、実施例および図においてＢＦ４およびＢＦ４ａと呼ぶ。ＩＬ－１ベータ存在下での細胞培養を含む好ましい刺激条件は、実施例および図においてＢＦ１０と呼ぶ。

【0010】

同一であるが異なる濃度のサイトカインからなる培地中でのＴ細胞培養を含む、ＢＦ４およびＢＦ１０条件ならびにこれらの異形により、ビーズまたは人工抗原提示細胞を利用して抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を固定化する条件下で生成されたＴｒｅｇと比較して有利な特性を有するＴｒｅｇ集団の生成がもたらされると考えられる。理論に拘束されることなく、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の固定化は、Ｔｒｅｇ系統の不安定性と炎症促進性機能の獲得とを生じる過度に強力で非生理学的刺激であることが考えられる。

【0011】

本明細書において使用する場合、「ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体」、「ＣＤ２８ＳＡ抗体」および「スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体」の用語は、Ｔ細胞受容体活性化因子の非存在下でＴ細胞を活性化可能なＣＤ２８特異的モノクローナル抗体を指す。したがって、好ましい実施形態では、工程ｂ）は、抗ＣＤ３抗体の使用を含まず、および／または単離Ｔ細胞の表面上に発現したＣＤ２８およびＣＤ３を架橋結合させる、磁気ビーズもしくはＦｃ受容体発現フィーダー細胞の使用を含まない。一部の実施形態では、培地は、腫瘍壊死因子受容体２アゴニスト（ＴＮＦＲ２ａ）およびインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮガンマ）の一方または両方をさらに含む。一部の実施形態では、ＴＮＦＲ２ａは、抗ＴＮＦＲ２抗体である。

【0012】

従来の抗ＣＤ２８モノクローナル抗体は、ＣＤ２８の露出したＦ’’Ｇループに結合するが、ＣＤ２８ＳＡモノクローナル抗体は、ＣＤ２８の免疫グロブリン様ドメインの露出したＣ’’Ｄループに結合することが見出されており、これは、Ｂ７結合に重大な意味を持つ（Ｌｕｈｄｅｒら、Ｊ ＥｘｐＭｅｄ、１９７：９５５～９６６、２００３）。本開示の方法における使用に適する例示的ＣＤ２８ＳＡ抗体としては、ＴｈｅｒａＭＡＢ ＬＬＣ社（Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）により開発されたセラリズマブ（ＴＡＢ０８としても知られ、かつてはＴＧＮ１４１２として知られる）およびＡｎｃｅｌｌＣｏｒｐ社（Ｂａｙｐｏｒｔ、ＭＮ）により販売されるＡＮＣ２８．１が挙げられるが、これらに限定されない。ＴＧＮ１４１２の可変領域およびこの異形のアミノ酸配列は、米国特許第８，７０９，４１４号に記載されている。

【0013】

本開示のビーズを使用しない方法は、抗原特異的Ｔｒｅｇを生成するための、Ｔｒｅｇの抗原特異的増殖または選択と組み合わせて使用することができる。例えば、ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の生成のための方法は、工程ｂ）の前にＩＬ－２の存在下で、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩペプチド多量体で染色し、および／またはＭＨＣクラスＩＩペプチド多量体の存在下でＴ細胞を培養することにより、抗原特異的Ｔ細胞を単離することをさらに含み得る。ＭＨＣクラスＩＩペプチド多量体を利用する抗原特異的増殖のための方法およびＴｒｅｇの養子移植のための方法は、米国特許第７，７２２，８６２号に記載されている。

【0014】

あるいは、ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の生成のための方法は、工程ｂ）の前および／または工程ｂ）の間にＩＬ－２の存在下で、同種の刺激したＢ細胞（ｓＢｃ）の存在下でＴ細胞を培養することをさらに含み得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、同種ｓＢｃに関連するＨＬＡ－ＤＲにおけるミスマッチを含む。同種ｓＢｃを利用する抗原特異的増殖のための方法および養子移植のための方法は、米国特許第９，８０１，９１１号に記載されており、この実施例は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0015】

本開示の方法は、ヒトＴｒｅｇを回収する工程ｃ）をさらに含んでもよく、これは、一部の実施形態では、工程ｂ）の開始から７～１８日後に開始する。一部の実施形態では、工程ｃ）は、工程ｂ）の開始から最低で７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１７日後および／または工程ｂ）の開始から最高で１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９もしくは８日後に開始する。本開示の方法は、ヒトＴｒｅｇを回収する工程ｃ）をさらに含んでもよく、これは、一部の実施形態では、工程ｂ）の開始から１１～１８日後に開始する。一部の実施形態では、工程ｃ）は、工程ｂ）の開始から最低で１１、１２、１３、１４、１５、１６もしくは１７日後および／または工程ｂ）の開始から最高で１８、１７、１６、１５、１４、１３もしくは１２日後に開始する。本開示の方法は、約２００～約２０００倍のヒトＴｒｅｇの増殖に適する。好ましい実施形態では、方法により、工程ａ）開始時に存在するヒトＴｒｅｇよりも少なくとも２００、６００、１０００、１４００または１８００倍多いヒトＴｒｅｇの生成が生じる。一部の実施形態では、ヒトＴｒｅｇによる種々のマーカーの発現レベルは、回収日にフローサイトメトリーにより評価する。評価するマーカーは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ８を含み得るが、これらに限定されない。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌについては陽性であり、ＣＤ８については陰性である。また、ＴＳＤＲ脱メチル化は、バイサルファイド（ｂｉｓｕｌｆｉｄｅ）変換の後、メチル化特異的ＰＣＲまたはパイロシーケンシングを使用して定量する。高い割合のＴＳＤＲ脱メチル化は、生成された細胞が安定なＴｒｅｇ系統であることを示す。

【0016】

本開示の生成方法を使用して生成したヒトＴｒｅｇを対象に投与することを含む、それを必要とするヒト対象における病理学的免疫応答を治療または予防するための方法の参照および主張は、これらの一般的かつ特異的形態において、
ａ）病理学的免疫応答の治療または予防のための医薬の製造のためのヒトＴｒｅｇの使用；および
ｂ）病理学的免疫応答の治療または予防のためのヒトＴｒｅｇを含む薬学的組成物
に同様に関する。

【0017】

本明細書において使用する場合、「病理学的免疫応答」の用語は、自己免疫性疾患、自己炎症性疾患、同種移植の拒絶反応および移植片対宿主病を包含する。「自己免疫性疾患」は、自己組織に対する直接的傷害および機能障害を生じる免疫認識を含む。病理学的には、自己免疫性疾患は、適応免疫系の細胞により典型的に引き起こされる。自己免疫性疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、天疱瘡、乾癬、Ｉ型糖尿病、セリアック病およびシェーグレン症候群を含むが、これらに限定されない。「自己炎症性疾患」は、自己組織に対する間接的（バイスタンダー）傷害および機能障害を生じる非自己抗原（例えば、環境性、食物性、共生性または他の抗原）に対する免疫系の自発的活性化または過剰反応を含む。病理学的には、自己炎症性疾患は、先天免疫系の細胞により典型的に影響される。自己炎症性疾患の例としては、炎症性腸疾患、筋萎縮性側索硬化症および他の神経変性疾患、アレルギー性気道疾患、ならびに慢性閉塞性肺疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

【0018】

本開示では、ヒトＴｒｅｇおよび生理学的に許容される緩衝液、例えば、食塩水またはリン酸緩衝食塩水を含む、薬学的組成物をさらに提供する。養子細胞療法のための薬学的組成物の有効量は、１０^７～１０^１１（１０００万～１０００億）個のヒトＴｒｅｇを含む（例えば、ＴａｎｇおよびＬｅｅ、ＣｕｒｒＯｐｉｎＯｒｇａｎＴｒａｎｓｐｌａｎｔ、１７：３４９～３５４、２０１２を参照）。一部の例では、ヒトＴｒｅｇは、患部組織に局所的（例えば、関節リウマチを治療する場合、罹患関節への関節内注入により）または全身的（例えば、全身性エリテマトーデスを治療する場合、静脈内注入により）のいずれかにより投与する。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇは、より良い生着および持続的作用のために、単回注入または複数回注入のいずれかとして投与する。局所注入では、１０^７～１０^９個の投与を含んでもよく、一方、全身注入では、１０^９～１０^１１個のＴｒｅｇを含んでもよい。実質臓器移植の治療または予防では、１０^９～１０^１１個のＴｒｅｇの投与を含んでもよく、一方、移植片対宿主病の治療または予防では、１０^１０～１０^１１個のＴｒｅｇの投与を含んでもよい。

【0019】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の単数形は、他に指示しない限り、複数形を含む。例えば、「ａｎ」ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ（添加物）は、１つまたは複数の添加物を含む。

【0020】

「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」の句は、本明細書において使用する場合、非制限的であり、このような実施形態が、さらなる要素を含み得ることを示す。対照的に、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（からなる）」の句は、制限的であり、このような実施形態が、さらなる要素（微量不純物を除く）を含まないことを示す。「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（から本質的になる）」の句は、部分的に制限的であり、このような実施形態が、このような実施形態の基本特性を実質的に変化させない要素をさらに含み得ることを示す。「含む」として本明細書において記載する態様および実施形態が、実施形態「からなる」および実施形態「から本質的になる」を含むことが理解される。

【0021】

「約」の用語は、値に関して本明細書において使用する場合、その値の９０％～１１０％を包含する（例えば、約２００倍は、１８０倍～２２０倍を指し、２００倍を含む）。

【0022】

本明細書において開示する薬剤の「有効量」は、詳述する目的を行うのに十分な量である。「有効量」は、主張する目的に関連して経験的に決定し得る。薬剤の「有効量」または「十分な量」は、所望の生物学的作用、例えば、有益な臨床結果を含む有益な結果に影響するのに適切な量である。「治療有効量」の用語は、対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）における疾患または障害を「治療」するのに有効な薬剤（例えば、ヒトＴｒｅｇ）の量を指す。薬剤の「有効量」または「十分な量」は、１回または複数の用量により投与され得る。

【0023】

疾患の「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療）」または「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」の用語は、疾患の徴候または症状を緩和する試みにおいて、個体（ヒトまたはその他）に１つまたは複数の薬物を投与することを含み得るプロトコールの実行を指す。したがって、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療）」または「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」は、徴候または症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、詳細には、個体に対する一時的緩和作用のみを有するプロトコールを含む。本明細書において使用する場合、および当技術分野において十分に理解されている場合、「治療」は、臨床結果を含む有益または所望の結果を得るための手法である。有益または所望の臨床結果は、１つまたは複数の症状の緩和または改善、疾患の程度の減少、疾患状態の安定（すなわち、悪化しないこと）、疾患蔓延の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または一時的緩和、および寛解を含むが、これらに限定されない。また、「治療」は、治療を受けていない同種移植レシピエントの予測生存と比較した場合の同種移植レシピエントの生存の延長を意味し得る。疾患または障害の「一時的緩和」は、未治療の予測アウトカムと比較して、疾患もしくは障害の程度および／もしくは望ましくない臨床症状が和らぎ、ならびに／または疾患もしくは障害の進行の時間経過が緩徐化することを意味する。

【0024】

実施形態の列挙
下記の実施形態では、実施形態１の任意の参照は、実施形態１Ａおよび実施形態１Ｂの一方または両方を包含する。

【0025】

１Ａ．ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の生成のための方法であって、
ａ）ヒト対象から得られたリンパ球含有生体試料からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴ細胞を単離すること；ならびに
ｂ）ＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋、ＨＥＬＩＯＳ＋であり、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）が脱メチル化されているヒトＴｒｅｇの生成において有効な条件下でＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＣＤ２８ＳＡ）抗体、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン６（ＩＬ－６）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）を含む培地中でＴ細胞を培養すること
を含み、任意選択で、ヒトＴｒｅｇが、ＣＤ６２Ｌ＋およびＴＮＦＲ２＋である、方法。

【0026】

１Ｂ．ヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の生成のための方法であって、
ａ）ヒト対象から得られたリンパ球含有生体試料からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴ細胞を単離すること；ならびに
ｂ）ＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋、ＨＥＬＩＯＳ＋であり、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）が脱メチル化されているヒトＴｒｅｇの生成において有効な条件下でＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＣＤ２８ＳＡ）抗体、インターロイキン２（ＩＬ－２）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）を含む培地中でＴ細胞を培養すること
を含む、ヒトＴｒｅｇの生成のための方法であって、任意選択で、ヒトＴｒｅｇが、ＣＤ６２Ｌ＋およびＴＮＦＲ２＋である、方法。

【0027】

２．工程ｂ）が、抗ＣＤ３抗体の使用を含まない、実施形態１に記載の方法。

【0028】

３．工程ｂ）が、単離Ｔ細胞のＣＤ２８およびＣＤ３を架橋結合させる、磁気ビーズまたはＦｃ受容体発現フィーダー細胞の使用を含まない、実施形態１または実施形態２に記載の方法。

【0029】

４．培地が、腫瘍壊死因子受容体２アゴニスト（ＴＮＦＲ２ａ）およびインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮガンマ）の一方または両方をさらに含み、任意選択で、ＴＮＦＲ２ａが、抗ＴＮＦＲ２抗体である、実施形態１から３のいずれか一項に記載の方法。

【0030】

５．培地が、ＩＬ－６およびＩＬ－１ベータの一方または両方をさらに含み、任意選択で、培地が、ＩＬ－１ベータをさらに含むがＩＬ－６は含まず、任意選択で、培地が、ＩＬ－６、ＩＬ－１ベータをさらに含むがＩＬ－１ベータは含まない、実施形態１Ｂから４のいずれか一項に記載の方法。

【0031】

６．リンパ球含有生体試料が、全血、白血球除去輸血生成物および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる群から選択され、任意選択で、生体試料が、新鮮であるか、またはヒト対象から得られた後に凍結保存され、その後、工程ａ）の前に解凍される、実施形態１から５のいずれか一項に記載の方法。

【0032】

７．工程ａ）のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴ細胞を、生体試料から蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）により単離する、実施形態１から６のいずれか一項に記載の方法。

【0033】

８．ヒトＴｒｅｇを回収する工程ｃ）をさらに含む、実施形態１から７のいずれか一項に記載の方法。

【0034】

９．工程ｃ）が、工程ｂ）の開始から７～１８日後に開始し、任意選択で、工程ｃ）が、工程ｂ）の開始から１１～１８日後に開始する、実施形態８に記載の方法。

【0035】

１０．ヒトＴｒｅｇが、工程ａ）開始時のＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴ細胞よりも約２００～約２０００倍多い細胞を含む、実施形態９に記載の方法。

【0036】

１１．実施形態１から１０のいずれか一項に記載の方法を使用して生成した１０^７～１０^１１個のヒトＴｒｅｇ、および生理学的に許容される緩衝液を含む、薬学的組成物。

【0037】

１２．それを必要とするヒト対象における病理学的免疫応答を治療または予防するための方法であって、有効量の実施形態１１に記載の薬学的組成物をヒト対象に投与することを含み、任意選択で、薬学的組成物の有効量が、１０^７～１０^１１個のヒトＴｒｅｇを含み、２０～４０分間にわたってヒト対象に静脈内注入される、方法。

【0038】

１３．病理学的免疫応答が、自己免疫性または自己炎症性疾患である、実施形態１２に記載の方法。

【0039】

１４．自己免疫性または自己炎症性疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、全身性エリテマトーデス、天疱瘡、乾癬、Ｉ型糖尿病、セリアック病および炎症性腸疾患からなる群から選択され、任意選択で、自己免疫性または自己炎症性疾患が、潰瘍性大腸炎およびクローン病からなる群から選択される炎症性腸疾患である、実施形態１３に記載の方法。

【0040】

１５．自己免疫性または自己炎症性疾患の、症状の軽減において有効であるか、または進行の阻害において有効であり、任意選択で、自己免疫性または自己炎症性疾患の進行の阻害が、組織破壊の阻害を含む、実施形態１３または１４に記載の方法。

【0041】

１６．病理学的免疫応答が、造血系同種移植または実質臓器同種移植の拒絶反応である、実施形態１２に記載の方法。

【0042】

１７．病理学的免疫応答が、造血系同種移植の拒絶反応であり、造血系同種移植が、骨髄移植または末梢血幹細胞移植である、実施形態１６に記載の方法。

【0043】

１８．病理学的免疫応答が、実質臓器同種移植の拒絶反応であり、実質臓器同種移植が、心臓、肺、心臓／肺、腎臓、膵臓、腎臓／膵臓、肝臓、腸管、膵島および皮膚の同種移植からなる群から選択される、実施形態１６に記載の方法。

【0044】

１９．急性および／もしくは慢性拒絶反応の症状の軽減において有効であるか、または臓器同種移植の生存の延長において有効である、実施形態１６に記載の方法。

【0045】

２０．病理学的免疫応答が、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である、実施形態１２に記載の方法。

【0046】

２１．急性および／もしくは慢性ＧｖＨＤの症状の軽減において有効であるか、または宿主の皮膚、肝臓、肺および／もしくは腸への傷害の阻害において有効である、実施形態２０に記載の方法。

【0047】

２２．ヒト対象におけるベースラインを超えるＴｒｅｇの割合の上昇において有効である、実施形態１２に記載の方法。

【0048】

２３．ヒトエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の増殖を阻害するための方法であって、実施形態１から１０のいずれか一項に記載の方法を使用して生成したヒトＴｒｅｇと、ヒトＣＤ４＋、ＣＤ２５－、ＣＤ１２７＋ＴｅｆｆをＴｅｆｆの増殖の阻害において有効な条件下で接触させることを含み、任意選択で、接触がＴＮＦアルファの存在下で行われる、方法。

【0049】

２４．ヒトＴｒｅｇの生成のための方法が、医薬品の優良製造所基準（ＧＭＰ）に準拠している、実施形態１から２３のいずれか一項に記載の方法または組成物。

【実施例】

【0050】

本開示は、以下の実施例において、さらに詳細に記載し、これは、主張する本開示の範囲を制限することを決して意図しない。添付の図は、本開示の明細書および説明の不可欠な部分であると考えられることを意味する。以下の実施例は、主張する開示の制限ではなく、例示のために提供する。

【0051】

以下の実験的開示では、次の略称：Ａｂ（抗体）；ａｌｌｏ（同種の）；ＢＦ（ビーズを使用しない）；ＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＣＤ２８ＳＡ）；ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）；ＩＬ－１β（インターロイキン１ベータ）；ＩＬ－２（インターロイキン２）；ＩＬ－６（インターロイキン６）；ＩＦＮγ（インターフェロン－ガンマ）；ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）；Ｔｅｆｆ（エフェクターＴ細胞）；ＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）；ＴＮＦ受容体ＩＩアゴニスト抗体（ＴＮＦＲ２ａ）；Ｔｒｅｇ（制御性Ｔ細胞）；ＴＳＤＲ（Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域）；およびＵＣＳＦ（カルフォルニア大学サンフランシスコ校）を適用する。

【0052】

実施例１
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）生成のビーズを使用しない方法の開発
この実施例では、ヒトＴｒｅｇ増殖のｅｘ ｖｉｖｏにおけるビーズを使用しない方法の開発について記載する。

【0053】

Ｔｒｅｇの単離。ヒト末梢血単核細胞を末梢血試料からフィコール密度勾配を使用して単離した後、２回洗浄し、ＣＤ４（抗ＣＤ４ＰｅｒＣＰ、クローンＳＫ３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログＮｏ．３４７３２４）、ＣＤ２５（抗ＣＤ２５ＡＰＣ、クローン２Ａ３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログＮｏ．３４０９３９）およびＣＤ１２７（抗ＣＤ１２７ＰＥ、クローンＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログＮｏ．５５７９３８）に対する抗体で染色した。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－／ｌｏｗＴｒｅｇを蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により単離した。

【0054】

ｅｘ－ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの増殖。１×１０^５ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴｒｅｇを４８ウェルプレートの単一のウェル内のＴ細胞培地（５％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、ｇｌｕｔａｍａｘおよび非必須アミノ酸を含むＲＰＭＩ）５００ｍｌ中に播種した。あるいは、ヒトＡＢ血清を含むＸ－ＶＩＶＯ１５を使用する。Ｔ細胞を１～１０μｇ／ｍＬのＣＤ２８ＳＡ Ａｂ（ＡＮＣ２８．１、クローン５Ｄ１０、Ａｎｃｅｌｌ Ｃｏｒｐ．社、カタログＮｏ．１７７－０２０）またはビーズ対細胞比１：１の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体と共役する磁化可能な高分子ビーズ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ）のいずれかで刺激した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズは、Ｔ細胞増殖および活性化用Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ＨｕｍａｎＴ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログＮｏ．１１１．３１Ｄ）である。ビーズを使用しない（ＢＦ）試験条件は、表１－１に示す。細胞には、新鮮培地を２、５、７、９、１１および１３日目に補充した。３００ＩＵ／ｍＬのヒト組換えＩＬ－２を０、２、５、７、９、１１および１３日目に補充した。１５、５０および１５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＩＬ－６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログＮｏ．２００－０６）を０、２および５日目に補充した。５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログＮｏ．３００－０１Ａ）を０、２および５日目に補充した。２．５μｇ／ｍＬのＴＮＦＲ２ａ（クローンＭＲ２－１、ＨｙｃｕｌｔＢｉｏｔｅｃｈ社、カタログＮｏ．ＨＭ２００７－ＦＳ）を０、２および５日目に補充した。４０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＩＦＮγ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログＮｏ．３００－０２）を０、２および５日目に補充した。５０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えＩＬ－１β（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、カタログＮｏ．２００－０１Ｂ）を０、２および５日目に補充した。細胞を５、７、９、１１、１３および１４日目に計数し、１４日目に回収して解析した。

【0055】

フローサイトメトリー。ｅｘ－ｖｉｖｏ増殖Ｔｒｅｇを１×１０^５細胞含む試料を培養から１４日目に回収し、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＦＯＸＰ３およびＨＥＬＩＯＳに対する抗体で染色して免疫表現型検査を行った。

【0056】

Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）の解析。ｅｘ－ｖｉｖｏ増殖Ｔｒｅｇを５×１０^５細胞含む試料を培養から１４日目に回収し、ＦＯＸＰ３遺伝子座のメチル化をパイロシーケンシングにより評価した。

【0057】

ｉｎ－ｖｉｔｒｏにおける抑制アッセイ。種々の条件下で（上記の）培養したｅｘ－ｖｉｖｏ増殖Ｔｒｅｇを回収し、２回洗浄した後、予備活性化Ｔｅｆｆまたは自家ＰＢＭＣのいずれかと共培養した。ＰＢＭＣからＦＡＣＳにより単離したＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏｗＣＤ１２７＋Ｔ細胞を、細胞対ビーズ比１：１の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した。新鮮細胞培養培地を２、５、７、９、１１、１３および１５（または２、５および７）日目に加えて、予備活性化Ｔｅｆｆ集団を得た。ＰＢＭＣは凍結保存して、解凍後に使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抑制アッセイは、５０，０００細胞の予備活性化ＴｅｆｆまたはＰＢＭＣおよび種々の比率のＴｒｅｇを用いて設定した。一部のアッセイでは、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを共培養ウェルに加えた。トリチウム標識チミジンを共培養から４日目に最後の１６～１８時間加え、細胞増殖をトリチウム標識チミジン取込みの測定により判定した。

【0058】

結果
ＢＦ１およびＢＦ１ａ条件を、ＩＬ－２の存在または非存在下で標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件と比較した。ＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＣＤ２８ＳＡ）抗体の刺激によるＴｒｅｇの増殖が、ＣＤ２８ＳＡ Ａｂの濃度およびＩＬ－２の存在に依存することが見出された。簡潔には、Ｔｒｅｇのより良い増殖は、２μｇ／ｍｌではなく４μｇ／ｍｌのＣＤ２８ＳＡ Ａｂが存在する場合に観察された。加えて、ＢＦ１およびＢＦ１ａの両条件により、標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件を適用するよりも良好で長期のＴｒｅｇ増殖が生じた。培養から５日目に撮影した顕微鏡画像では、ＩＬ－２の存在下のＣＤ２８ＳＡ ＡｂによるＴｒｅｇの強力な活性化、およびＩＬ－２の非存在下でクラスター形成する活性化関連細胞の完全な非存在が示された。対照的に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより、ＩＬ－２の存在および非存在の両方においてＴｒｅｇが活性化された。

【0059】

３つの異なるＴ細胞集団をＦＡＣＳにより単離し、ＢＦ１条件または標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件下で７日間刺激した。培養から７日目に撮影した顕微鏡画像では、ＣＤ２８ＳＡ Ａｂによって、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７ｈｉｇｈＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞よりもＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－／ｌｏｗＴｒｅｇが選択的に活性化されることが示された。Ｔｒｅｇの選択的活性化は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを利用した場合には観察されなかった。

【0060】

ＢＦ１およびＢＦ２条件を標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件と比較した。ＣＤ２８ＳＡ Ａｂ刺激Ｔｒｅｇのｅｘ ｖｉｖｏにおける増殖率が、培養物へのＩＬ－６の追加により著しく影響されることは見出されず、ＢＦ１およびＢＦ２の両方の比率は、ビーズ刺激によって観察された比率よりも高かった。

【0061】

ＢＦ１およびＢＦ３条件を標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件と比較した。ＣＤ２８ＳＡ Ａｂ刺激Ｔｒｅｇのｅｘ ｖｉｖｏにおける増殖率が、培養物へのＴＮＦαの追加により著しく影響されることは見出されず、ＢＦ１およびＢＦ３の両方の比率は、ビーズ刺激によって観察された比率よりも高かった。

【0062】

ＢＦ１およびＢＦ４条件を標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件と比較した。ＣＤ２８ＳＡ Ａｂ刺激Ｔｒｅｇのｅｘ ｖｉｖｏにおける増殖率が、培養物へのＩＬ－６およびＴＮＦαの追加により向上した。培養から５日目のビーズ刺激ＴｒｅｇおよびＢＦ４刺激Ｔｒｅｇの顕微鏡画像では、ＢＦ４条件における大規模な細胞クラスター形成が、Ｔｒｅｇの強力な活性化および増殖を意味することが示された。加えて、ＩＬ－６およびＴＮＦαに曝露したＣＤ２８ＳＡ Ａｂ刺激Ｔｒｅｇのｅｘ－ｖｉｖｏにおける増殖が、長期的かつ安定であることが見出された。これは、Ｔｒｅｇを再刺激してＴｒｅｇ不安定化の危険を冒す必要性を除去するために有利である。

【0063】

ＢＦ４、ＢＦ４ａおよびＢＦ４ｂ条件を標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件と比較した。ＩＬ－６は、３人の異なるヒトドナー（５０歳の女性、２１歳の男性および３３歳の男性）の末梢血から単離した細胞による広範な濃度下（１５、５０または１５０ｎｇ／ｍｌ）でのＴｒｅｇの増殖を増強することが見出された。

【0064】

ＢＦ１およびＢＦ６条件を標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件と比較した。ＣＤ２８ＳＡ Ａｂ刺激Ｔｒｅｇのｅｘ ｖｉｖｏにおける増殖率が、培養物へのＩＬ－６およびＴＮＦＲ２ａの追加により向上した。

【0065】

ＢＦ１、ＢＦ２、ＢＦ３、ＢＦ４および標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件下のＴｒｅｇのｅｘ ｖｉｖｏにおける増殖の比較を図１に示す。培養から１４日後のＴｒｅｇのｅｘ ｖｉｖｏにおける全増殖のより大規模な比較を表１－２に示す。

【0066】

ＢＦ８およびＢＦ９条件を標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件と比較した。ＣＤ２８ＳＡ Ａｂ刺激Ｔｒｅｇのｅｘ ｖｉｖｏにおける増殖率が、培養物へのＩＬ－６およびＩＦＮγの一方または両方の追加により向上した。

【0067】

ＢＦ１０条件を標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件と比較した。ＣＤ２８ＳＡ Ａｂ刺激Ｔｒｅｇのｅｘ ｖｉｖｏにおける増殖率が、培養物へのＴＮＦαおよびＩＬ－１βの両方の追加により向上した。加えて、ＣＤ２８ＳＡ ＡｂおよびＩＬ－２の存在下ならびにＴＮＦαおよびＩＬ－１βの非存在下において、ＢＦ１条件下で生成したＴｒｅｇ集団では４７％であるのに対して、ＢＦ１０条件下で生成したＴｒｅｇ集団では６２％が、ＴＮＦＲ２＋、ＣＤ２５＋であった。興味深いことには、ＢＦ１０条件下で生成したＴｒｅｇは、ＢＦ１条件下で生成したＴｒｅｇよりも高レベルのＣＤ７１を発現した。ＣＤ７１は、トランスフェリン受容体であり、これは、活性化Ｔ細胞において上方制御され、増殖に寄与するタンパク質同化状態に入った細胞を意味する。

【0068】

図２に示すように、炎症促進性サイトカインの存在下でのＣＤ２８ＳＡ Ａｂの刺激によるｅｘ ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇ増殖により、Ｔｒｅｇ系統マーカーＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳおよびＣＤ２７が高レベルで発現する細胞集団がもたらされる。加えて、増殖した細胞集団は、ＴＳＤＲが高度に脱メチル化されている。ＢＦ１、ＢＦ２、ＢＦ３およびＢＦ４刺激条件下のｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＴｒｅｇの表現型の比較を図３および図４に示す。ＢＦ４条件下でのＴｒｅｇの増殖では、刺激開始時（０日目）に存在した細胞よりも１０００倍を超える多くの細胞の生成が生じたが、標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件下でのＴｒｅｇ増殖の程度は、図５に示すように、かなり低かった。同様に、ＢＦ１０条件下でのＴｒｅｇの増殖では、図１０に示すように、標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件下で増殖させた場合よりも、はるかに多くの細胞の生成が生じた。ＢＦ４条件および標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件下のｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＴｒｅｇの表現型の比較を図６および図７に示す。

【0069】

ＢＦ４刺激条件下の炎症促進性サイトカインの存在下でのＣＤ２８ＳＡ Ａｂの刺激によるｅｘ ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの増殖により、図８Ａおよび図８Ｂに示すように、予備活性化Ｔｅｆｆおよび自家ＰＢＭＣに対する高い抑制能を有する細胞集団がもたらされる。加えて、ＢＦ４刺激条件下のｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＴｒｅｇは、図９に示すように、炎症性サイトカインＴＮＦアルファ存在下で、標準的抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ条件下のｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＴｒｅｇよりも強力な、Ｔｅｆｆ増殖の抑制因子となる。

【0070】

その上、炎症促進性サイトカイン存在下でのＣＤ２８ＳＡ Ａｂの刺激によるｅｘ ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇの増殖により、炎症促進性サイトカインＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＩＦＮガンマおよびＩＬ－４を生成するＴｒｅｇの発生頻度は上昇しない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】