特許 7617576 金ナノクラスターを用いてリンパ管新生関連疾患を処置及び／又は予防する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-09

(45)【発行日】2025-01-20

(54)【発明の名称】金ナノクラスターを用いてリンパ管新生関連疾患を処置及び／又は予防する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 33/242 20190101AFI20250110BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20250110BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20250110BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20250110BHJP

   A61P 7/10 20060101ALI20250110BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20250110BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20250110BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250110BHJP

【ＦＩ】

A61K33/242

A61K9/14

A61K45/00

A61K47/20

A61P7/10

A61P9/00

A61P9/04

A61P43/00 121

【請求項の数】 9

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023133202

(22)【出願日】2023-08-18

【審査請求日】2023-08-18

(73)【特許権者】

【識別番号】519316988

【氏名又は名称】台湾基督長老教会馬偕医療財団法人馬偕紀念医院

【氏名又は名称原語表記】ＭａｃＫａｙ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．９２， Ｓｅｃ． ２， Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｎ Ｒｄ．， Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ １０４， Ｔａｉｗａｎ

(73)【特許権者】

【識別番号】523315164

【氏名又は名称】馬偕醫學院

【氏名又は名称原語表記】Ｍａｃｋａｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．４６， Ｓｅｃ． ３， Ｚｈｏｎｇｚｈｅｎｇ Ｒｄ．，Ｓａｎｚｈｉ Ｄｉｓｔ．， Ｎｅｗ Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ ２５２， Ｔａｉｗａｎ

(73)【特許権者】

【識別番号】506255902

【氏名又は名称】中原大學

(73)【特許権者】

【識別番号】519063439

【氏名又は名称】紅嬰生物科技股▲フン▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＧＯＬＤＲＥＤ ＮＡＮＯＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】９Ｆ．，Ｎｏ．１１１－６，Ｘｉｙｕａｎ Ｒｏａｄ，Ｚｈｏｎｇｌｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｔａｏｙｕａｎ，Ｔａｉｗａｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100167689

【弁理士】

【氏名又は名称】松本 征二

(72)【発明者】

【氏名】イェ， ハング・アイ

(72)【発明者】

【氏名】ウー， イー・ジェ

(72)【発明者】

【氏名】ワング， シー・ウェー

(72)【発明者】

【氏名】チャング， チング・フー

(72)【発明者】

【氏名】リン， チェング・ヤング

(72)【発明者】

【氏名】チャン， ウェン・ション

(72)【発明者】

【氏名】リー， クアン・ジュング

(72)【発明者】

【氏名】チャング， ホング・ショング

【審査官】工藤 友紀

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２５０１３２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０８６１９５１２（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０２９５２７７５（ＣＮ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０２０／０２６８７９２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００９／０２９８１１５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Kuo Li et al.，Efficient in vivo wound healing using noble metal nanoclusters，Nanoscale，2021年，13，6531-6537，DOI:10.1039/d0nr07176e

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｌ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検体におけるリンパ管新生関連疾患を処置及び／又は予防するための薬学的組成物の製造のためのジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）で被覆された金ナノクラスターの使用であって、
前記ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、１～１０ｎｍの範囲の粒子サイズを有し、且つ、
前記ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、複数の金ナノ粒子によって形成された金ナノクラスター及び該金ナノクラスター上に被覆された複数のＤＨＬＡからなる、使用。

【請求項2】

前記ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、１～５ｎｍの範囲の粒子サイズを有する、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、２ｎｍの粒子サイズを有する、請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記リンパ管新生関連疾患は、リンパ浮腫及び収縮期心不全である、請求項１に記載の使用。

【請求項5】

前記被検体はヒトである、請求項１に記載の使用。

【請求項6】

被検体におけるリンパ管新生を促進するための薬学的組成物の製造のためのジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）で被覆された金ナノクラスターの使用であって、
前記ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、１～１０ｎｍの範囲の粒子サイズを有し、且つ、
前記ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、複数の金ナノ粒子によって形成された金ナノクラスター及び該金ナノクラスター上に被覆された複数のＤＨＬＡからなる、使用。

【請求項7】

前記ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、１～５ｎｍの範囲の粒子サイズを有する、請求項６に記載の使用。

【請求項8】

前記ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、２ｎｍの粒子サイズを有する、請求項７に記載の使用。

【請求項9】

前記被検体はヒトである、請求項６に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、概略として、被検体におけるリンパ管新生関連疾患を処置してリンパ管新生を促進する分野に関連する。より具体的には、本開示は、ジヒドロリポ酸（ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ；ＤＨＬＡ）で被覆された金ナノクラスターの使用によってリンパ管新生関連疾患を処置してリンパ管新生を促進する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

リンパ管新生関連疾患は、リンパ液排出の低下及びその後の組織の機能不全をもたらす異常なリンパ管成長に特徴付けられる障害の群のことをいう。これらの疾患の病因は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及びアンジオポエチンなど、リンパ管の発育及び再構築に関与する要因の調節不全を伴う。これらの要因は、リンパ内皮細胞の増殖、遊走及び管形成を促進する。機能不全なリンパ管新生は、遺伝子変異、炎症、腫瘍成長又はリンパ浮腫などの慢性的症状からもたらされ得る。

【0003】

疫学的には、リンパ管新生関連疾患は、特定の症状に応じて異なる。例えば、リンパ浮腫には全世界で約１億４０００万～２億５０００万人が罹患し、原発性リンパ浮腫は遺伝子異常によって発生することが多く、続発性リンパ浮腫は外科手術、放射線又は感染によってもたらされる。リンパ管腫、リンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）及びリンパ奇形のような他の症状は、異なる有病率及び臨床像を有する。リンパ管新生関連疾患に現在使用される処置アプローチは、症候を管理して生活の質を向上することを主に目的とする。保存的管理の選択肢は、組織腫脹を減少させ、リンパ浮腫のような状態における合併症を予防する圧迫療法、物理療法及びスキンケア対策を含み得る。リンパ管静脈吻合又はリンパ節移植などの外科的介入は、ある選択された場合に実施され得る。ある事例では、リンパ管新生関連の要因を対象とする薬物療法が利用される。例えば、ＶＥＧＦ－Ｃ／ＶＥＧＦ－Ｄ又はある利尿剤の使用が、リンパ浮腫におけるリンパ管成長を抑制する際に有望であることが示されている。しかし、これらの治療法は、リンパ管成長及び機能を特異的に調整するようには設計されていない。最新の処置は、内在する発症機序を直接対象とするのではなく、症候を管理して生活の質を向上することに注力するものである。さらに、リンパ管新生関連疾患の異質性及び複雑性は、普遍的な処置戦略を開発する際の課題となる。

【0004】

上記に鑑みると、関連技術において、リンパ管新生関連疾患を特異的かつ効果的に処置し、それにより、リンパ管新生関連疾患の患者のニーズに効果的に応える改良された方法に対するニーズがある。

【発明の概要】

【0005】

基本的理解を読者に与えるために、以下に本開示の簡略化した概要を提示する。この概要は、本開示の網羅的な概観ではなく、本発明の主要／重要な要素を特定するものでも本発明の範囲を定めるものでもない。その専らの目的は、ここに開示されるある概念を、より詳細な後述の説明に対する序章として簡略化した形態で提示することである。

【0006】

ここに実現されるとともに広く記載されるように、本開示の一態様は、被検体におけるリンパ管新生関連疾患を処置及び／又は予防する方法に向けられる。方法は、１～１０ｎｍの範囲の粒子サイズ、好ましくは１～５ｎｍの範囲の粒子サイズ、より好ましくは２ｎｍの粒子サイズを有する有効量の、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）で被覆された金ナノクラスターを被検体に投与するステップを備える。ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、複数の金ナノ粒子によって形成された金ナノクラスター及び当該金ナノクラスター上に被覆された複数のＤＨＬＡからなる。

【0007】

本開示の実施形態によると、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの有効量は、１日あたり約０．００１～１０ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは１日あたり約０．０１～１ｍｇ／体重ｋｇである。特定の一実施例によると、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの有効量は、１日あたり約０．０５７ｍｇ／体重ｋｇである。

【0008】

本開示の実施形態によると、ここに記載されるリンパ管新生関連疾患は、リンパ浮腫及び収縮期心不全である。したがって、ある高度な実施例では、本方法は、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターと組み合わせて追加の医薬品を投与して上記の疾患を処置するステップをさらに備え得る。追加の医薬品は、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの投与の前に、それと併せて又はその後に被検体に投与され得る。

【0009】

例えば、リンパ管新生関連疾患がリンパ浮腫である場合、追加の医薬品は、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、アセタゾラミド、フロセミド、アゾセミド、ブメタニド、エタクリン酸、エトゾリン、インダクリノン、ムゾリミン、オゾリノン、ピレタニド、チエニル酸、トラセミド、アルチジド、ベンドロフルメチアジド、ブチジド、クロロチアジド、シクロペンチアジド、シクロチアジド、エピチジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メブチジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、フェンキゾンインダパミド、メフルシド、メチクラン、メトラゾン、キネタゾン、キシパミド、アミロリド、ベンズアミル、トリアムテレン、スピロノラクトン、カンレノン、エプレレノン、カンレノ酸カリウム、フィネレノン、コニバプタン、モザバプタン、サタバプタン及びトルバプタンからなる群から選択された少なくとも１つの薬剤であり得る。

【0010】

あるいは、リンパ管新生関連疾患が収縮期心不全である場合、追加の医薬品は、カルベジロール、メトプロロール、ビソプロロール、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン、サクビトリル、リシノプリル、エナラプリル、ラミプリル、スピロノラクトン、エプレレノン、ジゴキシン、ヒドララジン、硝酸イソソルビド、イバブラジン、アトルバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、クロピドグレル、ワルファリン、アピキサバン、リバーロキサバン、メトラゾン、ネビボロール及びミルリノンからなる群から選択されたいずれか１つの薬剤であり得る。

【0011】

好ましくは、被検体はヒトである。

【0012】

本開示の他の態様は、被検体におけるリンパ管新生を促進する方法に関する。方法は、有効量の、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターを被検体に投与するステップを備える。ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、複数の金ナノ粒子によって形成された金ナノクラスター、及び金ナノクラスター上に被覆された複数のＤＨＬＡからなる。

【0013】

本開示のある実施形態によると、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、直径約１～１０ｎｍ、好ましくは直径約１～５ｎｍ、より好ましくは直径約２ｎｍである。

【0014】

本開示の実施形態によると、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの有効量は、１日あたり約０．００１～１０ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは１日あたり約０．０１～１ｍｇ／体重ｋｇである。特定の一実施例によると、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの有効量は、１日あたり約０．０５７ｍｇ／体重ｋｇである。

【0015】

好ましくは、被検体はヒトである。

【0016】

本開示の付随する特徴及び有利な効果の多くは、添付図面との関連で検討される以下の詳細な説明を参照して、より深く理解されることになる。

【0017】

本発明のこれら及び他の特徴、態様及び有利な効果は、以下の説明、付随する特許請求の範囲及び添付図面を参照して、より深く理解されることになる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】図１Ａは、ヒトリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）における細胞増殖に対するＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスター（図では蛍光金ナノクラスター（ＦＡＮＣ）として示す）の効果を示す図である。データを、少なくとも５個の独立した実験値の平均±ＳＥＭとして表す。＊は、コントロール群と比較してＰ＜０．０５。

【図1B】図１Ｂは、ヒトリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）における遊走（すなわち、創傷治癒）に対するＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスター（図では蛍光金ナノクラスター（ＦＡＮＣ）として示す）の効果を示す図である。データを、少なくとも５個の独立した実験値の平均±ＳＥＭとして表す。＊は、コントロール群と比較してＰ＜０．０５。

【図2】図２は、ヒトＬＥＣにおける管形成に対するＦＡＮＣの効果を示す図である。データを、少なくとも５個の独立した実験値の平均±ＳＥＭとして表す。＊は、コントロール群と比較してＰ＜０．０５。

【図3】図３は、イソプロテレノール（ＩＳＯ）及び／又はＦＡＮＣで処置したマウスにおけるリンパ内皮特異マーカー、リンパ管内皮ヒアルロン酸レセプター１（ＬＹＶＥ－１）の発現を示す図である。データを平均±ＳＥＭとして表す。コントロールはＮ＝４、ＩＳＯはＮ＝３、ＦＡＮＣ＋ＩＳＯはＮ＝６。＊は、ＩＳＯ群と比較してＰ＜０．０５。

【図4A】図４ＡはＩＳＯ、ＦＡＮＣ及び／又はＭＡＺ－５１で処置したマウスにおける心臓超音波検査の結果を示す図であり、ＭＡＺ－５１は（３Ｅ）－３－［［４－（ジメチルアミノ）ナフタレン－１－イル］メチリデン］－１Ｈ－インデン－２－オンである。図４Ａは、左室内径短縮率（ＦＳ）の結果を示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。コントロールはＮ＝３、ＩＳＯはＮ＝３、ＦＡＮＣ＋ＩＳＯはＮ＝３、ＦＡＮＣ＋ＩＳＯ＋ＭＡＺ－５１はＮ＝４。＊は、コントロール群と比較してＰ＜０．０５。†は、ＩＳＯ群と比較してＰ＜０．０５。‡は、ＩＳＯ＋ＦＡＮＣ群と比較してＰ＜０．０５。

【図4B】図４ＢはＩＳＯ、ＦＡＮＣ及び／又はＭＡＺ－５１で処置したマウスにおける心臓超音波検査の結果を示す図であり、ＭＡＺ－５１は（３Ｅ）－３－［［４－（ジメチルアミノ）ナフタレン－１－イル］メチリデン］－１Ｈ－インデン－２－オンである。図４Ｂは、組織ドプラ法（ＴＤＩ－ｓ´）の結果を示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。コントロールはＮ＝３、ＩＳＯはＮ＝３、ＦＡＮＣ＋ＩＳＯはＮ＝３、ＦＡＮＣ＋ＩＳＯ＋ＭＡＺ－５１はＮ＝４。＊は、コントロール群と比較してＰ＜０．０５。†は、ＩＳＯ群と比較してＰ＜０．０５。‡は、ＩＳＯ＋ＦＡＮＣ群と比較してＰ＜０．０５。

【図5】図５は、ＦＡＮＣで処置したゼブラフィッシュにおけるｉｎ ｖｉｖｏリンパ管新生を示す図であり、第５～第１２の体節における体節間リンパ管（ＩＳＬＶ）を含む７体節以上を有する胚の割合を示す。各実験値を２０匹の幼魚から得た。データを、少なくとも３個の独立した実験値からの平均±ＳＥＭとして表す。＊は、コントロール群と比較してＰ＜０．０５。

【発明を実施するための形態】

【0019】

添付図面に関連して以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。この説明は、本実施例の機能及び本実施例を構成して動作させるためのステップの順序を説明する。ただし、同一又は同等の機能及び順序が、異なる実施例によって実現され得る。

【0020】

Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲において採用される特定の用語をここにまとめる。ここに特に断りがない限り、本開示で採用される科学的及び技術的用語は、当業者に一般に理解及び使用される意味を有するものである。また、文脈上特に要件とされない限り、単数形の用語はその複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。具体的には、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、そうでないことを文脈が明示しない限り、複数の参照を含む。また、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「少なくとも１つ」及び「１以上」は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。本発明の実施は、断りがない限り、当業者の技術範囲内である生化学、一般生物学、動物実験などの従来の技術を採用する。文献には、このような技術が充分に説明されている。

【0021】

発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、具体的な実施例で説明される数値は可能な限り厳密に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。また、ここで使用されるように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。運用／実施例以外においても、又は明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及び割合の全ては、いずれの場合においても用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で説明される数値パラメータは、所望のように変わり得る概数である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効桁数を考慮してかつ通常の四捨五入手段を適用して少なくとも解釈されるべきである。

【0022】

ここで使用する用語「処置／処理」及び「処置する／処理する」とは、リンパ管新生関連疾患の亢進を予防し又はその病状を変える意図で行われる介入のことをいう場合がある。処置又は処置することの概念は、最も広い意味で使用され、具体的には、任意のステージのリンパ管新生関連疾患の予防（予防法）、軽減、低減、治癒及び緩和を含む。したがって、「処置／処理」とは、治療的処置及び予防的な若しくは予防の対策の双方のことをいい、又は緩和的対策のこともいい、課題はリンパ浮腫及び収縮期心不全などのリンパ管新生関連疾患を予防、減速（軽減）又は改善することである。処置の必要がある対象体は、既に疾患に罹患している対象体、及び疾患に罹患し易い対象体又は疾患が予防されるべき対象体を含む。疾患は、特発性若しくは心因性の原因、又はこれらの原因又は外科手術、放射線若しくは感染などの他の症状に対して続発的なものを含むあらゆる原因から起こり得る。

【0023】

用語「被検体」又は「患者」とは、本開示の方法によって処置可能なヒト種を含む動物のことをいう。用語「被検体」又は「患者」は、一方の性別が特に示されない限り、雄及び雌の両性別を言うことが意図される。したがって、用語「被検体」又は「患者」は、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの投与の利益を受け得る任意の哺乳動物を含む。「被検体」又は「患者」の例は、これらに限定されないが、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及び家禽を含む。好適な実施形態によると、被検体はヒトである。

【0024】

用語「投与され」、「投与する」又は「投与」は、ここでは互換可能に使用されて、本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターを直接投与すること、又はＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターを含む薬学的組成物を投与することをいう。

【0025】

ここで使用する用語「有効量」とは、被検体におけるリンパ管新生関連疾患の処置又はリンパ管新生を促進することに関して所望の結果を達成するのに必要な投与量及び期間について有効な金ナノクラスターの量のことをいう。治療目的のために、有効量は、成分のいずれかの有毒又は有害な効果を治療上有益な効果が上回るものでもある。具体的な有効量又は充分な量は、処置される特定の症状、患者の体調（例えば、患者の体重、年齢又は性別）、処置される哺乳動物又は動物の種類、処置期間、（もしあれば）同時療法の性質、及び化合物又はその誘導体の採用される具体的な製剤及び構造のような要因によって変化する。有効量は、例えば、グラム、ミリグラム若しくはマイクログラムで又は体重キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）として表現され得る。あるいは、有効量は、モル濃度、質量濃度、体積濃度、重量モル濃度、モル分率、質量分率及び混合比のような活性成分（例えば、本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスター）の濃度で表現され得る。当業者であれば、動物モデルから決定される用量に基づいて（本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターのような）医薬品についてのヒト等価用量（ＨＥＤ）を計算できるはずである。例えば、ヒト被検体での使用に対する最大安全投与量を推定する際に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって発行された「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」と題された工業用ガイダンスに従うことができる。

【0026】

ここで使用する用語「リンパ管新生関連疾患」とは、被検体における損なわれたリンパ管新生に起因する又はそれによって悪化する疾患、症状又は障害のことをいい、リンパ管新生関連疾患は、例えば、リンパ浮腫又は収縮期心不全であり得る。

【0027】

用語「薬学的組成物」とは、そこに含有される有効成分の生物学的活動が有効となることを可能とするような形態にあり、かつ組成物が投与されることになる被検体に対して許容できないほど有毒である追加の成分を含有しない調製物のことをいう。一般的に、活性化合物（すなわち、本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスター）の量は、薬学的組成物の総重量を基準として、約０．０１重量％～９９重量％のレベル、好ましくは少なくとも０．１重量％のレベル、より好ましくは少なくとも１重量％のレベル、より一層好ましくは少なくとも５重量％のレベル、さらにより一層好ましくは少なくとも１０重量％のレベル、さらにより一層好ましくは少なくとも２５重量％のレベルにおいて薬学的組成物に存在する。本発明の臨床的使用のために、本薬学的組成物は、意図された投与経路に適した製剤となるように処方される。

【0028】

ここで使用する文言「薬学的に許容可能な賦形剤」は、ある器官又は身体の部分から他の器官又は身体の部分に対象薬剤を搬送又は輸送する際に関与する液体若しくは固体充填剤、希釈剤、担体、溶媒又はカプセル化材料などの薬学的に許容可能な材料、組成物又はビヒクルを意味する。各賦形剤は、製剤の他の成分に適合しているという意味において「許容可能」でなければならない。薬学的製剤は、１以上の薬学的に許容可能な成分と組み合わせて本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターを含有する。賦形剤は、固体、半固体若しくは液体希釈剤、クリーム又はカプセルであればよい。これらの薬学的な調製物は、本発明の更なる課題である。

【0029】

ＩＩ．本発明の説明
本開示は、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターがｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞増殖、遊走及び管形成の増加など）及びｉｎ ｖｉｖｏ（心臓創傷マウスにおける心機能の向上及びゼブラフィッシュにおけるリンパ管新生の促進など）の双方でリンパ管新生の特徴を高めるものであるとの発見に少なくともある程度基づくものであり、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターがリンパ管新生関連疾患の処置及び／又は予防のための医薬品の開発についての有望な候補であることを示唆する。

【0030】

本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、構造的には、複数の金ナノ粒子によって形成された金ナノクラスター及び金ナノクラスター上に被覆された複数のＤＨＬＡからなる。熟練した専門家は、本開示において利用されるＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスター及びそれらの生成方法（Ｌｉｎ他、ＡＣＳ Ｎａｎｏ２００９、３（２）、ｐｐ３９５－４０１）に精通しているので、それらの調製物の詳細についての更なる詳述は、この点において不要である。ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは約４２０ｎｍの励起波長下で６５０ｎｍでの蛍光発光を有するので、発光した蛍光は赤色から近赤外のスペクトルの範囲にある。ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの各々は、０．１～２０ｎｍの範囲、好ましくは１～１０ｎｍの範囲、より好ましくは１～５ｎｍの範囲、より一層好ましくは２ｎｍの粒子サイズを有する。本開示の金ナノクラスターに関する上記寸法は、乾燥状態にあるものであるが、本開示で使用される金ナノクラスターが水溶性であり又は少なくとも水性媒体及び／若しくは水中に分散可能であれば有利なものとなる。本開示の金ナノクラスターの流体力学的サイズは、水などの周囲の溶媒分子の結合に起因して乾燥状態にあるものよりも大幅に大きくなり得る。具体的な一実施形態例では、金ナノクラスターは、１～３０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に相当する流体力学的サイズを有する（Ｌｉｎ他、ＡＣＳ Ｎａｎｏ２００９、３（２）、ｐｐ３９５－４０１）。

【0031】

本開示の一態様によると、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、被検体において、リンパ管新生関連疾患を処置及び／若しくは予防し、又はリンパ管新生を促進するための組成物を調製するのに使用される。この組成物は、薬学的組成物若しくは医薬品又はその目的に応じた保険機能食品（栄養サプリメントを含む）の形態で利用され得る。組成物は、任意選択的な薬学的に許容可能な賦形剤とともに有効量でのＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターを含む。

【0032】

薬学的組成物を調製する方法は、薬理学の技術において周知である。本発明の適用のために、本開示のＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、特に、不活性で基本的に非毒性の薬学的に適切な賦形剤を用いることによって、錠剤、糖衣錠剤、ピル、顆粒、エアロゾル、シロップ、乳剤、懸濁剤、溶液、軟膏剤、クリーム若しくはゲル又は任意のものなど、所望の製剤に製造され得る。

【0033】

本開示のある実施形態によると、組成物は調剤として使用され、その場合、薬学的組成物は、薬学的組成物の製造において一般的に使用される適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含み得る。薬学的組成物は、従来の方法による粉末、顆粒、錠剤、カプセル、懸濁剤、乳剤、シロップ、エアロゾル、外用剤、坐剤及び滅菌注射液などの経口投与剤の形態で処方及び使用され得る。薬学的組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルを含む。製剤の場合、それは、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤及び界面活性剤などの賦形剤又は希釈剤を用いて調製される。経口投与のための固体調製物は、錠剤、ピル、粉末、顆粒、カプセルなどを含む。これらの固体調製物は、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなど、少なくとも１つの賦形剤を調製物に含む。さらに、ステアリン酸マグネシウム又はタルクなどの潤滑剤が、単純な賦形剤に加えて使用される。経口使用のための液体調製物は、懸濁化剤、溶液、乳剤、シロップなどを含む。単純な希釈液として一般的に使用される水及び液体パラフィンに加えて、湿潤剤、甘味料、香料及び保存料などの種々の賦形剤が調製物に含まれてもよい。非経口的投与のための製剤は、滅菌水溶液、非水性溶媒、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥調製物及び坐剤を含む。非水性溶媒及び懸濁剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの食物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用エステルを含み得る。坐剤のための基剤として、ウイテプゾール、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ－６１、カカオバター、ラウリンバター及びグリセロゼラチンが使用され得る。

【0034】

本開示のある実施形態によると、組成物は保険機能食品として利用され、それは、ヒト及び動物に栄養を与えるため、リンパ管新生関連疾患の処置に利益を与え、及び／又はリンパ管新生関連疾患に関連する症候を改善若しくは緩和するために使用される任意の種類の液体及び固体／半固体の材料であり得る。保険機能食品において一般的に使用される成分は有効成分に加えて含まれてもよく、組成物が保険機能用飲料として製造される場合、例えば、クエン酸、オリゴ糖、タウリン、濃縮果汁などが含まれ得る。保険機能食品は、食品（例えば、茶系飲料、ジュース、ソフトドリンク、コーヒー、牛乳、ゼリー、クッキー、シリアル、チョコレート、スナックバー、ハーブエキス、乳製品（例えば、アイスクリーム及びヨーグルト））、食品／栄養補助食品又は栄養補助食品製剤であり得る。

【0035】

ここに提供されるＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、通常は投与の容易性及び投与量の均一性のために投与量単位形態で処方される。ただし、ここに記載される組成物の一日あたりの合計使用量は適正な医学的判断の範囲内で医師によって決定されることが理解されるはずである。いずれかの特定の被検体又は器官のための具体的な治療上有効な用量レベルは、処置されている疾患及び障害の重症度；採用される特異的有効成分の活性；採用される特異的組成物；被検体の年齢、体重、全体的な健康状態、性別及び食生活；採用される特異的有効成分の投与時間、投与経路及び排出速度；処置の期間；採用される特異的有効成分と組み合わせて又はそれと同時に使用される薬物；並びにその類いの医療技術で周知の同様の要因、を含む様々な要因に依存することになる。

【0036】

本開示の他の態様では、本開示は、被検体においてリンパ管新生関連疾患を処置し、リンパ管新生を促進する方法を提供する。方法は、ここに記載するような有効量の、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスター又はそれを含む組成物を被検体に投与するステップを備える。

【0037】

特定の実施形態では、ここに記載されるＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、有効量の薬学的組成物において提供される。特定の実施形態では、有効量は、治療上有効な量（例えば、リンパ管新生関連疾患を処置するのに有効な量）である。特定の実施形態では、有効量は、予防上有効な量（例えば、それを必要とする被検体においてリンパ管新生関連疾患を予防するのに有効な量）である。

【0038】

有効量を達成するのに必要なＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの正確な量は、例えば、被検体の種、年齢及び全体的状態、副作用又は障害の重症度、投与のモードなどに応じて、被検体間で異なる。有効量は、単回用量（例えば、単回経口用量）又は複数回用量（例えば、複数回経口用量）に含まれ得る。特定の実施形態では、複数回用量が被検体に投与される場合、複数回用量のうちの任意の２回用量は異なる量又は実質的に同じ量の、ここに記載されるＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターを含む。特定の実施形態では、複数回用量が被検体に投与される場合、複数回用量を被検体に投与する頻度は、１日あたり３回用量、１日あたり２回用量、１日あたり１回用量、隔日あたり１回用量、３日あたり１回用量、１週間あたり１回用量、隔週あたり１回用量、月ごとに１回用量、又は隔月ごとに１回用量である。特定の実施形態では、複数回用量を被検体に投与する頻度は、１日あたり１回用量である。特定の実施形態では、複数回用量を被検体に投与する頻度は、１日あたり２回用量である。本開示のある例によると、被検体はマウスである。マウスに対する治療効果を引き出すために、本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、１日あたり約０．０１～１５０ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは１日あたり約０．１～１５ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは１日あたり約０．１～１．５ｍｇ／体重ｋｇの量で被検体に投与される。一実施例によると、本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、１日あたり０．５７ｍｇ／体重ｋｇの量で被検体に投与される。

【0039】

当業者であれば、本出願の実施例において提供される動物での検討から決定された用量に基づいて、本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターのヒト等価用量（ＨＥＤ）を直ちに決定し得る。したがって、ヒト被検体での使用に適した本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの量は、１日あたり０．００１～１０ｍｇ／体重ｋｇの範囲、例えば、１日あたり０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９、０．０２、０．０２１、０．０２２、０．０２３、０．０２４、０．０２５、０．０２６、０．０２７、０．０２８、０．０２９、０．０３、０．０３１、０．０３２、０．０３３、０．０３４、０．０３５、０．０３６、０．０３７、０．０３８、０．０３９、０．０４、０．０４１、０．０４２、０．０４３、０．０４４、０．０４５、０．０４６、０．０４７、０．０４８、０．０４９、０．０５、０．０５１、０．０５２、０．０５３、０．０５４、０．０５５、０．０５６、０．０５７、０．０５８、０．０５９、０．０６、０．０６１、０．０６２、０．０６３、０．０６４、０．０６５、０．０６６、０．０６７、０．０６８、０．０６９、０．０７、０．０７１、０．０７２、０．０７３、０．０７４、０．０７５、０．０７６、０．０７７、０．０７８、０．０７９、０．０８、０．０８１、０．０８２、０．０８３、０．０８４、０．０８５、０．０８６、０．０８７、０．０８８、０．０８９、０．０９、０．０９１、０．０９２、０．０９３、０．０９４、０．０９５、０．０９６、０．０９７、０．０９８、０．０９９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０ｍｇ／体重ｋｇであり得る。好ましくは、ヒト被検体を処置するための本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの量は、１日あたり約０．０１～１ｍｇ／体重ｋｇである。より好ましくは、ヒト被検体を処置するための本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの量は、１日あたり約０．０１～０．１ｍｇ／体重ｋｇである。一実施例によると、ヒト被検体を処置するための本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの量は、１日あたり約０．０４６ｍｇ／体重ｋｇである。一実施例によると、ヒト被検体を処置するための本ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの量は、１日あたり約０．０５７ｍｇ／体重ｋｇである。

【0040】

ここに記載するような用量範囲は、提供された薬学的組成物の成人への投与のためのガイダンスを与える。例えば、小児又は青少年に投与される量は、医師又は当業者によって決定可能であり、成人に投与される量よりも少なく又はそれと同じであり得る。

【0041】

ここに提供されるＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスター及びそれを含む組成物は、経腸（例えば、経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮、経皮間、皮下、皮内、直腸内、腔内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、クリーム及び／又は点滴などによる）など、任意の適切な経路で投与可能である。具体的には、考えられる経路は、経口投与、静脈内投与（例えば、全身静脈注射）、血液及び／若しくはリンパ液供給を介した局所投与、並びに／又は患部への直接投与である。一般的に、最適な投与経路は、薬剤の性質を含む様々な要因（例えば、腸管の環境でのその安定性）及び／又は被検体の状態（例えば、被検体が経口投与を耐えられるか否か）に依存することになる。

【0042】

理解されるように、本方法は、単独で、又はリンパ管新生関連疾患の処置に何らかの有益な効果を有する追加療法と組み合わせて、被検体に適用可能である。意図する目的に応じて、本方法は、追加療法の前に、その間に又はその後に被検体に適用され得る。追加の処置薬の具体的種類は、処置されている特定の状態（すなわち、リンパ浮腫又は収縮期心不全）に応じることになる。

【0043】

リンパ管新生関連疾患がリンパ浮腫である場合には、追加の医薬品は、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、アセタゾラミド、フロセミド、アゾセミド、ブメタニド、エタクリン酸、エトゾリン、インダクリノン、ムゾリミン、オゾリノン、ピレタニド、チエニル酸、トラセミド、アルチジド、ベンドロフルメチアジド、ブチジド、クロロチアジド、シクロペンチアジド、シクロチアジド、エピチジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メブチジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、フェンキゾンインダパミド、メフルシド、メチクラン、メトラゾン、キネタゾン、キシパミド、アミロリド、ベンズアミル、トリアムテレン、スピロノラクトン、カンレノン、エプレレノン、カンレノ酸カリウム、フィネレノン、コニバプタン、モザバプタン、サタバプタン又はトルバプタンのうちのいずれか１つの薬剤であり得る。

【0044】

リンパ管新生関連疾患が収縮期心不全である場合には、追加の医薬品は、カルベジロール、メトプロロール、ビソプロロール、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン、サクビトリル、リシノプリル、エナラプリル、ラミプリル、スピロノラクトン、エプレレノン、ジゴキシン、ヒドララジン、硝酸イソソルビド、イバブラジン、アトルバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、クロピドグレル、ワルファリン、アピキサバン、リバーロキサバン、メトラゾン、ネビボロール又はミルリノンのうちの少なくとも１つの薬剤であり得る。

【0045】

ある実施形態では、被検体は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。

【0046】

以下の実施例は、本発明の特定の態様を詳述し、当業者が当該発明を実施することを補助するために提供される。これらの実施例は、いかなる態様においても本発明の範囲を限定するものと解釈されるものではない。更なる詳述なしに、当業者であれば、ここでの説明に基づいて、本発明をその最大限に利用し得ると考えられる。ここに引用される全ての刊行物は、その全体において参照によりここに取り込まれる。

【実施例】

【0047】

１．ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスター（ＦＡＮＣ）の調製
この研究において使用される蛍光ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターを、前駆体誘導金（Ａｕ）ナノ粒子（ＮＰ）エッチング（Ｌｉｎ他、ＡＣＳ Ｎａｎｏ２００９、３（２）、ｐｐ３９５－４０１）に基づいて調製した。簡潔には、最初に、１ｍｌの新たに調製したテトラブチルアンモニウムボロハイドライド（ＴＢＡＢ）（ＤＤＡＢ溶液中１００ｍｍｏｌ／Ｌ）及び０．６７５ｍｌのデカン酸（トルエン中１００ｍｍｏｌ／Ｌ）を含む還元剤に０．８ｍｌの金前駆体（１００ｍｍｏｌ／ＬのＤＤＡＢ溶液中で調製した７．５ｍｇ／ｍｌのＡｕＣｌ_３）を添加することによって、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）によって安定化した６ｎｍ金ナノ粒子をトルエン中で合成した。色が透明な黄色に変化するまで追加の金前駆体を滴下で添加し、非プラズモニック金ナノクラスターを得た。これは、さらに還元型α－リポ酸との配位子交換によって水相に与えられ得る。５ｍｌのＴＢＡＢ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）のＤＤＡＢ溶液を添加することによって、α－リポ酸（０．２０６ｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国）をジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）に還元した。等量の金前駆体をＤＨＬＡに混合して追加のＵＶ光（３０２ｎｍ）アニーリングを３０分間行うことによって、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターを形成し、安定的な蛍光シグナルが生細胞内に得られた。簡明化のために、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターを「ＦＡＮＣ」と略記する。遠心分離によって上清を除去した後に、ＦＡＮＣを次のメタノール／クロロホルム洗浄ステップによってさらに精製し、５５℃での一晩のインキュベーションのためにホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９）中で再処理し、３０～１００ｋＤａの遠心フィルタ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって回収及びバッファ交換した。

【0048】

２．細胞培養
ヒトリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）を、市販の供給元（Ｌｏｎｚａ；Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）から取得した。ＬＥＣを、ＥＢＭ－２基礎培地に内皮細胞増殖サプリメント（Ｌｏｎｚａ）を加えたものを含む内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ－２ＭＶ培地）中で増殖させた。細胞を、１％ゼラチンで被覆されたプラスチック製品に播種し、後続の処理のために５％ＣＯ_２により３７℃で培養した。

【0049】

３．細胞増殖アッセイ
ＬＥＣを９６ウェルプレートにウェルあたり５×１０^３個の細胞の密度で播種した。２４時間のインキュベーションの後、培養培地を除去し、細胞をさらに２４時間にわたってＦＡＮＣあり又はＦＡＮＣなしでＥＧＭ－２ＭＶ培地で処理した。続いて、細胞を５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で固定して反応を終了させ、１％酢酸中０．４％スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国）によって処理した。１５分間のインキュベーションの後、細胞を含むプレートを１０ｍＭトリス緩衝液で洗浄及び処理した。５１５ｎｍにおけるプレートの吸光率を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）リーダーを用いて測定した。

【0050】

４．細胞遊走アッセイ
ＬＥＣを６ウェルプレートに播種し、９０～１００％コンフルエンスに達するまでそれらを増殖させた。１ｍｍサイズのスクラッチャーチップ（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ポチョン、韓国）を用いてギャップを引っ掻くことによって細胞に創傷を生成し、細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄した。細胞を、指示された濃度において、ＦＡＮＣあり又はＦＡＮＣなしで新鮮な増殖培地内でインキュベートした。処理後０時間、１６時間及び２４時間の時点で顕微鏡によって撮像し、続いて分析を行った。遊走領域をＭＲＩ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ Ｔｏｏｌを有するＩｍａｇｅＪを用いて計算した。

【0051】

５．毛細管形成アッセイ
マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）を４℃で一晩溶解し、９６ウェルプレートを各ウェルにおいて５０μｌのマトリゲルでコーティングし、続いて３７℃で３０分間にわたってインキュベーションを行った。ＬＥＣを、指示されたＦＡＮＣ濃度でウェルあたりＥＧＭ－２ＭＶ培地内で２×１０^４個／２００μｌの密度で播種した。３７℃での２４時間のインキュベーションの後、ＬＥＣの管形成を顕微鏡によって評価し、各ウェルの写真を撮影した。管の分岐数及び合計管長を、ＭａｃＢｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて計算した。

【0052】

６．イソプロテレノール（ＩＳＯ）誘発心不全モデル
雄の７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＢｉｏＬａｓｃｏ Ｉｎｃ．（Ｙｉｌａｎ、台湾）から購入した。０日目に、マウスを、浸透圧ポンプシステムを用いた腹部移植によってＦＡＮＣ（２０μＭ；約０．５７ｍｇ／体重ｋｇ）で処置した。その後、１４日目に、マウスを、ＩＳＯ（１５０ｍｇ／ｋｇ）で皮下処置した。ＩＳＯ注射から１４日後、２８日目に、心臓超音波検査を行い、マウスの心機能を測定した。その後、それらの動物を屠殺し、その心臓を組織学的及び病理学的検査のために収集した。

【0053】

７．免疫組織化学（ＩＨＣ）染色
マウスの左心室の組織切片を、キシレンで脱パラフィン化し、エタノールを添加することによって再水和した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、１０分間にわたってメタノール中で３％過酸化水素によってブロックした。熱誘導抗原賦活化を、全ての切片について０．０１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液中でｐＨ６、９５℃において２５分間にわたって実行した。マウスＬＹＶＥ－１に対する抗体を、１：２００の希釈で適用し、４℃で一晩インキュベートした。抗体結合シグナルをＮｏｖｏＬｉｎｋ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出し、ジアミノベンジジン反応を用いて可視化した。切片をヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）を用いて対比染色した。ＬＹＶＥ－１発現の定量化を、ＭａｃＢｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｉｍａｇｅ－Ｊソフトウェアを用いて分析した。

【0054】

８．心臓超音波検査
マウスをイソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、イングランド；空気とともに５０：５０の比で混合された酸素及び亜酸化窒素の組合せにおいて１～２％の濃度を実現するように送達される）で麻酔した後に、マウスについての実験的な心臓超音波検査を行った。全てのマウスは、Ｖｉｖｉｄ ｉエコーシステム（ＧＥ Ｖｉｎｇｍｅｄ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ、Ｈｏｒｔｅｎ、ノルウェー）に接続された１０ＭＨｚセクタアレイトランスデューサを用いた心臓構造及び機能評価を受けた。マウスを、超音波ゲルを前胸壁上に配置した状態で左側臥位において位置決めした。Ｍ－モードリニアスキャンの深度を、達成可能な最大フレーム速度で１．０～１．５ｃｍに設定した。収縮速度を特定するのに使用される組織ドプラ（ＴＤＩ－Ｓ´）、変形に基づく円周方向収縮期歪み測定、及び動的心筋運動による後方散乱強度を積算した組織構造の定量化指標を含むパラメータを用いて、ＥｃｈｏＰａｃ ＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにおいてＥＣＧゲートによるオフライン分析を用いて収縮期心筋性能を評価した。

【0055】

９．ｉｎ ｖｉｖｏリンパ管新生モデル
遺伝子組み換えゼブラフィッシュ株Ｔｇ（ｌｙｖｅ１：ＴＲＦＰ）を確立するのに使用したＤＮＡ構築物を以下のように生成した。遺伝子組み換えゼブラフィッシュにおける発育中のリンパ管細胞のマーキングを可能とするように、リンパ管内皮ヒアルロン酸レセプター１ｂ（ｌｙｖｅ１ｂ）遺伝子の６．２ｋｂのプロモーター配列を赤色蛍光タンパク質（ＴＲＦＰ）に結合させてその発現を行わせた。それに従って、遺伝子組み換えゼブラフィッシュ系統Ｔｇ（ｌｙｖｅ１：ＴＲＦＰ）を、前述のＤＮＡ構築物を用いて確立した。赤色蛍光シグナルが、受精後１４４時間（ｈｐｆ）においてゼブラフィッシュ胚の頭部及び胴体領域における増殖中のリンパ管細胞の大部分において検出された。５ｎＭの濃度のＦＡＮＣをゼブラフィッシュ系統Ｔｇ（ｌｙｖｅ１：ＴＲＦＰ）７２ｈｐｆの胚に注入し、胴体領域のリンパ管成長を１４４ｈｐｆにおいて観察した。最後に、第５～第１２の体節における体節間リンパ管（ＩＳＬＶ）を含む７体節以上を有する胚の割合を特定してｉｎ ｖｉｖｏリンパ管新生機能を評価した。

【0056】

１０．データ分析
平均±ＳＥＭとして表した実験結果を、一元配置分散分析又はスチューデントのｔ検定を用いて分析した。Ｐ値＜０．０５の場合にデータが統計的に有意であるとみなす。

【0057】

実施例１ リンパ管新生に対するＦＡＮＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ効果
細胞増殖の促進、細胞遊走の強化、及びリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）における毛細管様構造の形成の促進を含むリンパ管新生に対するＦＡＮＣの効果をこの実施例で調査した。結果を図１及び２に与える。具体的には、ＦＡＮＣはＬＥＣの細胞増殖を濃度依存的に増加させることが分かった（図１Ａ）。リンパ管新生時に内皮細胞に重要な遊走及び管形成の能力に対するＦＡＮＣの効果に関して、ＦＡＮＣは、ＬＥＣの創傷治癒領域を濃度及び時間依存的に大幅に増加させ（図１Ｂ）、ＬＥＣにおける毛細管様構造の形成を大幅に誘発することが分かった（図２）。

【0058】

まとめると、結果は、ＦＡＮＣはヒトＬＥＣにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏリンパ管新生を促進する能力を有することを総合的に示唆した。

【0059】

実施例２ イソプロテレノール（ＩＳＯ）誘発心損傷マウスにおけるリンパ管新生及び心機能に対するＦＡＮＣのｉｎ ｖｉｖｏ効果
リンパ管新生に対するＦＡＮＣのｉｎ ｖｉｖｏ効果を、心筋梗塞後（ＭＩ）及び心不全モデルの標準的な発症機序である、イソプロテレノール（ＩＳＯ）誘発心損傷マウスモデルを用いることによって調査した。最初に、ＦＡＮＣによってもたらされる治療効果におけるリンパ管新生の役割を検証するために、免疫組織学的分析を行うことで、リンパ管に対する主要な特異的マーカーであるＬＹＶＥ－１を検査した。なお、ＦＡＮＣは、図３に示すように、ＬＹＶＥ－１の発現をＩＳＯ処置群に由来する心臓組織と比較して大幅に増加させた。結果は、ＦＡＮＣは心損傷マウスにおけるリンパ管新生を強化可能であることを裏付けた。

【0060】

ＦＡＮＣがＩＳＯ誘発心損傷マウスにおけるリンパ管新生を向上させたので、これらのマウスの心機能をさらに調査した。図４Ａ～４Ｂに示すように、ＦＡＮＣによる処置は、ＩＳＯ処置マウスにおける左室内径短縮率（ＦＳ）及び組織ドプラ法（ＴＤＩ－ｓ´）を向上させた。ＦＳは心室収縮機能についてのインジケータとして作用し、一方でＴＤＩ－ｓ´は心筋収縮速度についてのインジケータとして作用する。結果は、ＦＡＮＣによる処置の後に向上した心損傷組織におけるリンパ管新生があれば、向上した心機能が確保されることを明確に実証した。さらに、ＦＡＮＣによって向上した心機能はリンパ管新生抑制剤ＭＡＺ－５１の同時処置によって消失し、ＦＡＮＣにより強化した心機能はそのリンパ管新生を促進する能力に起因することをさらに確認した。まとめると、これらの結果は、ＦＡＮＣは心臓におけるリンパ管新生を促進する能力を有し、同様に心損傷マウスにおける心機能を向上させることを裏付ける。

【0061】

実施例３ ゼブラフィッシュにおけるリンパ管新生に対するＦＡＮＣのｉｎ ｖｉｖｏ効果
この実施例では、リンパ管新生に対するＦＡＮＣのｉｎ ｖｉｖｏ効果をゼブラフィッシュで調べた。この目的のため、遺伝子組み換えゼブラフィッシュ株Ｔｇ（ｌｙｖｅ１：ＴＲＦＰ）を生成した。特に、受精後１４４時間（ｈｐｆ）におけるゼブラフィッシュ胚の頭部及び胴体領域の観察を可能とする際に、発育中のリンパ管細胞の可視化を可能とするように、リンパ管内皮ヒアルロン酸レセプター１ｂ（ｌｙｖｅ１ｂ）遺伝子の６．２ｋｂのプロモーター配列を用いて赤色蛍光タンパク質（ＴＲＦＰ）を発現させた。ＦＡＮＣを７２ｈｐｆにおいてＴｇ（ｌｙｖｅ１：ＴＲＦＰ）ゼブラフィッシュ胚に腹腔内投与し、胴体領域におけるリンパ管の成長を１４４ｈｐｆにおいて観察した。第５～第１２の体節間の８体節のうちの７体節以上でリンパ管（ＩＳＬＶ）成長を有する胚の割合を計算した。未処置のコントロール群は８．３±２．４％の割合を示したのに対して、ＦＡＮＣ処置群は４５．０±１０．８％の割合を示した（図５）。これらの知見に基づくと、ここでも、ＦＡＮＣによるリンパ管成長の促進がゼブラフィッシュモデルにおいて実証された。

【0062】

結論として、実施例におけるデータは、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターがｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでリンパ管新生を促進可能であることを実証した。したがって、必要とする個体への、ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターの投与は、リンパ浮腫及び収縮期心不全などの異常なリンパ管新生からもたらされる症状を潜在的に改善し得る。ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスター及び／又はそれを含む薬学的組成物を投与するステップを備える本方法は、被検体がリンパ管新生関連疾患を患うことを効果的に処置又は予防する有望な手段を提供し得る。

【0063】

実施形態の上記説明は例示としてのみ与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、本発明の例示の実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。本発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述されたが、当業者であれば、この発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。

【要約】      （修正有）

【課題】被検体における、リンパ管新生関連疾患を処置及び／又は予防する方法を提供する。
【解決手段】１～１０ｎｍの範囲の粒子サイズを有する有効量の、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）で被覆された金ナノクラスターを前記被検体に投与するステップを備え、前記ＤＨＬＡで被覆された金ナノクラスターは、複数の金ナノ粒子によって形成された金ナノクラスター及び該金ナノクラスター上に被覆された複数のＤＨＬＡからなる、方法である。
【選択図】図１Ａ

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】