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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-10
(45)【発行日】2025-01-21
(54)【発明の名称】オボアルブミン抗炎症ペプチド及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 5/107 20060101AFI20250114BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20250114BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250114BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20250114BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20250114BHJP
【ＦＩ】
C07K5/107 ZNA
A61K38/07
A61P29/00
A61P39/06
A23L33/18
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2024045450
(22)【出願日】2024-03-21
【審査請求日】2024-03-21
(31)【優先権主張番号】202310811456.5
(32)【優先日】2023-07-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】524109614
【氏名又は名称】杭州佰倍優生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｈａｎｇｚｈｏｕ ＢＩＢＡＵ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ５０１ ａｎｄ ５０２， ５／Ｆ， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３， Ｄｏｎｇｚｈａｎ Ｇａｒｄｅｎ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｎｏ． ７６８ Ｈｕａｎｚｈａｎ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ， Ｓｈａｎｇｃｈｅｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１００００， Ｃｈｉｎａ
(73)【特許権者】
【識別番号】524109625
【氏名又は名称】北京林業大学
【氏名又は名称原語表記】Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３５ Ｑｉｎｇｈｕａ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】王阿琴
(72)【発明者】
【氏名】任迪峰
(72)【発明者】
【氏名】余鈞
(72)【発明者】
【氏名】梁雅馨
【審査官】坂井田 京
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０２２０５４０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１１４９５７３９６（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００ － １９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸配列がＰｈｅ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-ＨｉｓであるＦＧＰＨであることを特徴とする抗炎症活性ペプチド。
【請求項2】
請求項１に記載のＦＧＰＨの抗炎症薬物又は食品の製造における使用。
【請求項3】
ＦＧＰＨのメイラード反応生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの製造方法であって、ＦＧＰＨを秤量して水溶液に調製し、１．５：１割合のペプチド糖質量比にしたがってデキストランを加えて、十分に混合し、８０℃、ｐＨ９．０下で１０ｈ反応させ、反応が終了した後、室温まで冷却すると、ＦＧＰＨのメイラード生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓを得るステップを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、活性ペプチドの技術分野に属し、特に、オボアルブミン抗炎症活性ペプチド及びそのメイラード反応生成物の製造と使用に関する。
【背景技術】
【0002】
生物活性ペプチドは、タンパク質に由来し、そのうち生物活性を持つ断片であり、基本的な栄養要求を超える独特な生物活性を持っており、ヒトの健康への貢献から、ますます注目が高まっている。ペプチドは親タンパク質の中に隠れている複雑な構造であるため、その生物活性の効果的な発揮が難しくなる。外部プロテアーゼの酵素分解、発酵等の生物化学反応又は胃腸管の消化を経た後、複数種類の生理機能を生成することができ、ヒトの健康に肯定的な影響を与える。
【0003】
近年、多くの研究が新型卵白タンパクペプチドの同定に取り組み、鶏のゲノムの公開により、複雑なサンプルからタンパク質とポリペプチドを同定する能力を大幅に向上させた。研究から、卵白タンパクを特定のプロテアーゼで酵素分解した後に同定して、異なる種類の生物活性ペプチドを得ることが分かった。
【0004】
メイラード反応とは、タンパク質、ポリペプチド及びアミノ酸に代表されるアミノ化合物と、還元糖、アルデヒド及びケトンに代表されるカルボニル化合物との間に発生する化学反応をいい、制御されるメイラード反応は、発展して色、風味を含む望ましい感覚属性を形成することができ、生物活性に影響を与えることもできる。
【0005】
現在、生物活性ペプチドは、すでに予防と治療に使用されており、中国は鶏卵産業の大国として、卵の生産量と消費量が世界最大であり、卵白は豊富なタンパク質を含有し、そして大量の生物活性物質を含有しているため、疾患の予防と治療、免疫調節等の生理機能を有している。今のところ、卵白の深層開発と利用が少ないことにより、良質タンパク資源が大量に浪費され、卵白タンパクの抗炎症活性ペプチドの深層加工と利用が欠けている。そのため、卵白タンパクを原料として高品質の卵白ポリペプチド製品を研究開発することは、良い展望と意義がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
鶏卵の卵白は、豊富なタンパク質を含有し、生物活性ペプチドを製造する重要な供給源である。タンパク質／ペプチドがメイラード反応を経た後、活性がさらに向上し、かつ風味が改善される。そのため、本発明は、ポリペプチドが卵白タンパクの酵素分解により製造され、メイラード反応を経た後の活性及び風味の変化を調査する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明にて提供される技術的解決手段１は、卵白抗炎症活性ペプチドであって、前記抗炎症活性ペプチドのアミノ酸配列はＰｈｅ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｉｓであり、以下はＦＧＰＨと略称し、
前記抗炎症ペプチドＦＧＰＨは、卵白に対して酵素分解・スクリーニングを行うことによって取得することができ、人工合成の方式によっても取得できる。
前記抗炎症ペプチドＦＧＰＨは、卵白に対して酵素分解・スクリーニングを行うことによって取得することができ、人工合成の方式によっても取得できる。
【0008】
本発明にて提供される技術的解決手段２は、上記活性ペプチドＦＧＰＨの抗炎症反応における使用であり、特に抗炎症薬物、食品又は他の製品の製造における使用である。
【0009】
本発明にて提供される技術的解決手段３は、ＦＧＰＨのメイラード反応生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓである。
【0010】
さらに、前記ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの製造方法は、次のとおりである。ＦＧＰＨを秤量して水溶液に調製し、１．５：１割合のペプチド糖質量比にしたがってデキストランを加え、十分に混合し、８０℃、ｐＨ９．０下で１０ｈ反応させ、反応が終了した後、室温まで冷却すると、ＦＧＰＨのメイラード生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓを得る。
【0011】
本発明にて提供される技術的解決手段４は、技術的解決手段３に記載のＦＧＰＨのメイラード反応生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの使用であり、特に、抗炎症反応における使用であり、特に抗炎症薬物、食品又は他の製品の製造における使用である。
【発明の効果】
【0012】
本願は、卵白から酵素分解して抗炎症ポリペプチドを製造し、一連の分離・精製・同定・合成を経た後、高い抗炎症活性を有するポリペプチドＦＧＰＨを取得する。ＦＧＰＨを人工合成した後、抗炎症活性を検証することにより、濃度が５００μｇ／ｍＬである場合、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７の炎症性媒体（ＮＯ）、炎症因子（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１β）に対するＦＧＰＨの阻害率は、それぞれ６４．４１±０．４７％、２８．０７±２．１０％、４１．７２±１．８３％、５２．４３±２．２９％であることを発見した。
【0013】
抗炎症活性ペプチドＦＧＰＨの活性と風味に対するメイラード反応の影響をさらに調査した。フーリエ赤外線スペクトル及び走査型電子顕微鏡を利用してメイラード生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓを調査することにより、反応前に比べ、構造及び形態の両方が変化したことを発見し、メイラード反応前後の活性の変化を測定することにより、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量の阻害率は６４．４１±０．４７％から６８．１６±０．４８％まで向上し、ＤＰＰＨ、ＡＢＴＳ、ヒドロキシラジカルのクリアランス率ＥＣ５０値は、それぞれ４．９６±０．０５ｍｇ／ｍＬから４．０７±０．０３ｍｇ／ｍＬまで低下し、０．８１±０．０１ｍｇ／ｍＬから０．６１±０．０１ｍｇ／ｍＬまで低下し、２．０１±０．０３ｍｇ／ｍＬから１．５６±０．０２ｍｇ／ｍＬ低下することを発見し、官能評価及び電子舌測定評価によると、ＦＧＰＨの味が改善され、電子鼻の測定評価によると、特徴的な匂いの応答値が明らかに向上した。これは、メイラード反応により、ＦＧＰＨのＮＯ阻害率、抗酸化活性及び風味が改善されることを説明する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】細胞生存率に対する異なる分子量（＞１０ｋＤａ、５～１０ｋＤａ、３～５ｋＤａ、＜３ｋＤａ）のポリペプチドの影響である。
【図2】ＮＯ生成量に対する分子量＜３ｋＤａのポリペプチドの影響である。
【図3】分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分のトータルイオンクロマトグラムである。
【図4】ＦＧＰＨの化学構造である。
【図5】ＦＧＰＨとｉＮＯＳとの相互作用図である。
【図6】細胞生存率に対するＦＧＰＨの影響である。
【図7】細胞ＮＯ（Ａ）、ＴＮＦ－α（Ｂ）、ＩＬ－６（Ｃ）、ＩＬ－１β（Ｄ）分泌量に対する異なる濃度のＦＧＰＨの影響である。
【図8】ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの赤外線スペクトル分析図である。
【図9】ＦＧＰＨ（Ａ）及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓ（Ｂ）の走査型電子顕微鏡画像である。
【図10】細胞生存率に対するＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの影響である。
【図11】細胞のＮＯ生成量に対するＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの影響である。
【図12】ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの官能評価のレーダーチャートである。
【図13】ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの電子舌味覚指標のレーダーチャートである。
【図14】ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの電子鼻匂い指標のレーダーチャートである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明の目的、技術的解決手段及び利点をより明確にするために、具体的な実施例を参照しながら、本発明について一層詳細に説明する。本明細書に記述する具体的な実施例は、本発明を解釈するためのものにすぎず、本発明を限定するものではない。
【0016】
本発明に記載の抗炎症ペプチドＦＧＰＨは、卵白に対して酵素分解・スクリーニングを行うことによって取得することができ、人工合成の方式によっても取得できる。
【0017】
本発明で採用した一部の試験方法は、以下のとおりである。
【0018】
１．抗炎症活性の測定
１．１ ＲＡＷ２６４．７細胞の培養
１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地を調製し、マウスマクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を活性化させて迅速に培地に加え、顕微鏡下で細胞の形態を観察し、インキュベータに移して培養し、インキュベータの温度を３７℃に設定し、ＣＯ２濃度を５％に設定する。２４ｈ毎に細胞形態を観察し、継代を行い、０．２５％パンクレアチン（０．０１％ＥＤＴＡを含有）を加えることにより細胞を消化してから、ＤＭＥＭ培地を加えて洗浄、細胞の遠心分離を行い、最後に、ＰＢＳを使用した洗浄、遠心分離を行った後、細胞を培養皿に接種して、後続の実験操作に供する。
１．１ ＲＡＷ２６４．７細胞の培養
１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地を調製し、マウスマクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を活性化させて迅速に培地に加え、顕微鏡下で細胞の形態を観察し、インキュベータに移して培養し、インキュベータの温度を３７℃に設定し、ＣＯ２濃度を５％に設定する。２４ｈ毎に細胞形態を観察し、継代を行い、０．２５％パンクレアチン（０．０１％ＥＤＴＡを含有）を加えることにより細胞を消化してから、ＤＭＥＭ培地を加えて洗浄、細胞の遠心分離を行い、最後に、ＰＢＳを使用した洗浄、遠心分離を行った後、細胞を培養皿に接種して、後続の実験操作に供する。
【0019】
１．２ ＲＡＷ２６４．７細胞生存率に対する影響
ＭＴＴ法を用いてＲＡＷ２６４．７細胞の細胞生存率を測定する。１００μＬ／ウェルにしたがって対数増殖期にあるＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに接種し、密度は４×１０４／ウェルである。ＰＢＳ溶液で９６ウェルプレートの最外層を液封し、９６ウェルプレートをインキュベータに移して１２～２４ｈ培養し、インキュベータの温度は３７℃であり、ＣＯ２濃度は５％である。細胞が壁に付着した後、９６ウェルプレート中の廃棄上澄み液を吸引する。ブランク群（培養液を１００μＬ加える）、ＬＰＳ群（最終質量濃度が１μｇ／ｍＬのＬＰＳを１００μＬ加える）及びサンプル群（質量濃度が異なるか又は同じペプチドを１００μＬ加え、２ｈ反応させた後に最終質量濃度が１μｇ／ｍＬのＬＰＳを加える）の３つの群を設定し、群毎に３つの重複ウェルを設計した。２４ｈ培養した後、濃度が５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液を２０μＬ取って、各ウェルに加え、インキュベータで引き続き４ｈ培養してから、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を１００μＬ加えて１０ｍｉｎ軽く振り、マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍでの吸光度値を測定し、細胞生存率（％）は、下式（１）によって算出される。
ＭＴＴ法を用いてＲＡＷ２６４．７細胞の細胞生存率を測定する。１００μＬ／ウェルにしたがって対数増殖期にあるＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに接種し、密度は４×１０４／ウェルである。ＰＢＳ溶液で９６ウェルプレートの最外層を液封し、９６ウェルプレートをインキュベータに移して１２～２４ｈ培養し、インキュベータの温度は３７℃であり、ＣＯ２濃度は５％である。細胞が壁に付着した後、９６ウェルプレート中の廃棄上澄み液を吸引する。ブランク群（培養液を１００μＬ加える）、ＬＰＳ群（最終質量濃度が１μｇ／ｍＬのＬＰＳを１００μＬ加える）及びサンプル群（質量濃度が異なるか又は同じペプチドを１００μＬ加え、２ｈ反応させた後に最終質量濃度が１μｇ／ｍＬのＬＰＳを加える）の３つの群を設定し、群毎に３つの重複ウェルを設計した。２４ｈ培養した後、濃度が５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液を２０μＬ取って、各ウェルに加え、インキュベータで引き続き４ｈ培養してから、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を１００μＬ加えて１０ｍｉｎ軽く振り、マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍでの吸光度値を測定し、細胞生存率（％）は、下式（１）によって算出される。
【数1】
【0020】
式中、Ｖは、細胞生存率（％）を代表し、Ａ１は、ブランク群の５７０ｎｍでの吸光度値であり、Ａ２は、サンプル群の５７０ｎｍでの吸光度値である。
【0021】
１．３ ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量に対する影響
細胞のＮＯ生成量は、Ｇｒｉｅｓｓ法により測定される。群分け、処理及び培養方式は、いずれも１．２と同じであり、２４ｈ培養した後、上澄み液を収集し、ＮＯ検出キットを利用してＮＯの生成量を測定する。５０μＬの細胞上澄み液と５０μＬのＧｒｉｅｓｓＩ試薬と５０μＬのＧｒｉｅｓｓＩＩ試薬とを均一に混合し、５ｍｉｎ静置した後、５４０ｎｍでの吸光度値を測定する。ＮＯキットの説明にしたがって、各サンプルのＮＯ生成量を計算し、ＮＯ生成量の阻害率は、式（２）によって算出される。
細胞のＮＯ生成量は、Ｇｒｉｅｓｓ法により測定される。群分け、処理及び培養方式は、いずれも１．２と同じであり、２４ｈ培養した後、上澄み液を収集し、ＮＯ検出キットを利用してＮＯの生成量を測定する。５０μＬの細胞上澄み液と５０μＬのＧｒｉｅｓｓＩ試薬と５０μＬのＧｒｉｅｓｓＩＩ試薬とを均一に混合し、５ｍｉｎ静置した後、５４０ｎｍでの吸光度値を測定する。ＮＯキットの説明にしたがって、各サンプルのＮＯ生成量を計算し、ＮＯ生成量の阻害率は、式（２）によって算出される。
【数2】
【0022】
式中、Ｂは、ＮＯ阻害率（％）を代表し、Ｂ０は、ブランク群のＮＯ生成量であり、Ｂ１は、ＬＰＳ群のＮＯ生成量であり、Ｂ２は、サンプル群のＮＯ生成量である。
【0023】
１．４ サイトカインＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１βの測定
１００μＬ／ウェルにしたがって、対数増殖期にあるＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに接種し、密度は４×１０４／ウェルであり、ウェル毎に３つの重複を設計した。ブランク群（培養液を１００μＬ加える）、ＬＰＳ群（最終質量濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳを１００μＬ加える）及びサンプル群（濃度がそれぞれ異なるペプチドを１００μＬ加え、２ｈ反応させた後、最終質量濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳを加える）を設定し、３つの群をそれぞれインキュベータ中で２４ｈ培養して、上澄み液を収集する。ＥＬＩＳＡキットの説明にしたがって４５０ｎｍでの吸光度値を測定し、炎症因子ＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１βの分泌量を計算し、３種類の炎症因子の阻害率は、式（３）によって算出される。
１００μＬ／ウェルにしたがって、対数増殖期にあるＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに接種し、密度は４×１０４／ウェルであり、ウェル毎に３つの重複を設計した。ブランク群（培養液を１００μＬ加える）、ＬＰＳ群（最終質量濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳを１００μＬ加える）及びサンプル群（濃度がそれぞれ異なるペプチドを１００μＬ加え、２ｈ反応させた後、最終質量濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳを加える）を設定し、３つの群をそれぞれインキュベータ中で２４ｈ培養して、上澄み液を収集する。ＥＬＩＳＡキットの説明にしたがって４５０ｎｍでの吸光度値を測定し、炎症因子ＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１βの分泌量を計算し、３種類の炎症因子の阻害率は、式（３）によって算出される。
【数3】
【0024】
式中、Ｃは、炎症因子の阻害率（％）を代表し、Ｃ０は、ブランク群の炎症因子分泌量であり、Ｃ１は、ＬＰＳ群の炎症因子分泌量であり、Ｃ２は、サンプル群の炎症因子分泌量である。
【0025】
２．抗酸化活性の測定
２．１ １，１－ジフェニル－２－ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカルのクリアランス率
ＧＢ／Ｔ３９１００－２０２０ポリペプチド抗酸化性を参考してＤＰＰＨを測定する。ＤＰＰＨ溶液の製造：遮光超音波の方法により、５ｍｇのＤＰＰＨを適量の無水エタノールに十分に溶解させ、１００ｍＬに定容し、濃度が５０μｇ／ｍＬのＤＰＰＨ溶液を製造し、使用時に製造して使用する。ポリペプチド溶液の製造：１０ｍｇのポリペプチドを適量の蒸留水に入れて完全に溶解させ、１ｍＬに定容して、濃度が１０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド溶液を製造し、一定の割合にしたがって希釈して、異なる濃度のポリペプチド溶液を得る。番号が１、２、３号である試験管を３本取って、試薬を表１にしたがって試験管に添加し、５１７ｎｍ位置で吸光度値を測定し、ＤＰＰＨフリーラジカルのクリアランス率は式（４）によって算出される。ポリペプチド溶液濃度の自然対数値を横座標とし、ＤＰＰＨフリーラジカルのクリアランス率を縦座標とし、ポリペプチド濃度の自然対数値とクリアランス率との線形方程式を得、ＤＰＰＨフリーラジカルのクリアランス率の最大半分効果濃度ＥＣ５０が算出される。
２．１ １，１－ジフェニル－２－ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカルのクリアランス率
ＧＢ／Ｔ３９１００－２０２０ポリペプチド抗酸化性を参考してＤＰＰＨを測定する。ＤＰＰＨ溶液の製造：遮光超音波の方法により、５ｍｇのＤＰＰＨを適量の無水エタノールに十分に溶解させ、１００ｍＬに定容し、濃度が５０μｇ／ｍＬのＤＰＰＨ溶液を製造し、使用時に製造して使用する。ポリペプチド溶液の製造：１０ｍｇのポリペプチドを適量の蒸留水に入れて完全に溶解させ、１ｍＬに定容して、濃度が１０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド溶液を製造し、一定の割合にしたがって希釈して、異なる濃度のポリペプチド溶液を得る。番号が１、２、３号である試験管を３本取って、試薬を表１にしたがって試験管に添加し、５１７ｎｍ位置で吸光度値を測定し、ＤＰＰＨフリーラジカルのクリアランス率は式（４）によって算出される。ポリペプチド溶液濃度の自然対数値を横座標とし、ＤＰＰＨフリーラジカルのクリアランス率を縦座標とし、ポリペプチド濃度の自然対数値とクリアランス率との線形方程式を得、ＤＰＰＨフリーラジカルのクリアランス率の最大半分効果濃度ＥＣ５０が算出される。
【数4】
【0026】
式中、Ｐ１は、ＤＰＰＨフリーラジカルのクリアランス率（％）を代表し、Ａｓは、ＤＰＰＨ溶液とポリペプチド溶液とを混合した後の５１７ｎｍでの吸光度値であり、Ａｃは、ポリペプチド溶液とエタノール溶液とを混合した後の５１７ｎｍでの吸光度値であり、Ａｂは、ＤＰＰＨ溶液とサンプル試薬溶液とを混合した後の５１７ｎｍでの吸光度値である。
【0027】
[表１]
ＤＰＰＨフリーラジカルクリアランス実験の試薬添加量
ＤＰＰＨフリーラジカルクリアランス実験の試薬添加量
【0028】
２．２ ２，２－アジノ－ビス（３－エチル－ベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）フリーラジカルのクリアランス率
ＧＢ／Ｔ３９１００－２０２０ポリペプチド抗酸化性を参考してＡＢＴＳを測定する。ＡＢＴＳ溶液の製造：ＡＢＴＳ試薬を２００ｍｇ及び過硫酸カリウムを３４．４ｍｇ取って、５０ｍＬの蒸留水に入れて十分に溶解させ、均一に振り、室温の条件下で２４時間遮光保存し、ＡＢＴＳテスト溶液は、９５％エタノールで希釈する方式により、７３４ｎｍでの吸光値が０．７０±０．０２になるように製造したものであり、溶液は、使用時に製造して使用する。１０ｍｇのポリペプチドを適量の蒸留水に入れて完全に溶解させ、１ｍＬに定容して、濃度が１０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド溶液を製造し、９５％のエタノールで溶液を異なる倍数に希釈して、異なる濃度のポリペプチド溶液を得る。番号が１、２である試験管を２本取って、試薬を表２にしたがって試験管に添加し、７３４ｎｍでの吸光度値を測定し、ＡＢＴＳフリーラジカルのクリアランス率は、式（５）によって算出され、ＥＣ５０の計算方法は２．１と同じである。
ＧＢ／Ｔ３９１００－２０２０ポリペプチド抗酸化性を参考してＡＢＴＳを測定する。ＡＢＴＳ溶液の製造：ＡＢＴＳ試薬を２００ｍｇ及び過硫酸カリウムを３４．４ｍｇ取って、５０ｍＬの蒸留水に入れて十分に溶解させ、均一に振り、室温の条件下で２４時間遮光保存し、ＡＢＴＳテスト溶液は、９５％エタノールで希釈する方式により、７３４ｎｍでの吸光値が０．７０±０．０２になるように製造したものであり、溶液は、使用時に製造して使用する。１０ｍｇのポリペプチドを適量の蒸留水に入れて完全に溶解させ、１ｍＬに定容して、濃度が１０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド溶液を製造し、９５％のエタノールで溶液を異なる倍数に希釈して、異なる濃度のポリペプチド溶液を得る。番号が１、２である試験管を２本取って、試薬を表２にしたがって試験管に添加し、７３４ｎｍでの吸光度値を測定し、ＡＢＴＳフリーラジカルのクリアランス率は、式（５）によって算出され、ＥＣ５０の計算方法は２．１と同じである。
【数5】
【0029】
式中、Ｐ２は、ＡＢＴＳフリーラジカルのクリアランス率（％）を代表し、Ａｂは、ＡＢＴＳ溶液とサンプル試薬溶液とを混合した後の７３４ｎｍでの吸光度値であり、Ａｓは、ＡＢＴＳ溶液とポリペプチド溶液とを混合した後の７３４ｎｍでの吸光度値である。
【0030】
[表２]
ＡＢＴＳフリーラジカルのクリアランス実験試薬の添加量
ＡＢＴＳフリーラジカルのクリアランス実験試薬の添加量
【0031】
２．３ ヒドロキシラジカルのクリアランス率
Ｃｈｅｎらの方法を参考してヒドロキシラジカルのクリアランス率を測定する。反応溶液の製造：適量の硫酸第一鉄、過酸化水素及びサリチル酸をそれぞれ蒸留水に十分に溶解させ、９ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸第一鉄溶液、８．８ｍｍｏｌ／Ｌの過酸化水素溶液及び９ｍｍｏｌ／Ｌのサリチル酸溶液を調製する。ポリペプチド溶液の製造：１０ｍｇのポリペプチドを適量の蒸留水に入れて完全に溶解させ、１ｍＬに定容して、濃度が１０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド溶液を製造し、一定の割合にしたがって希釈して、異なる濃度のポリペプチド溶液を得る。試験管に異なる濃度のポリペプチド溶液を１ｍＬ取って、１ｍＬの硫酸第一鉄や１ｍＬのサリチル酸と均一に混合し、１０ｍｉｎ反応させてから、試験管に過酸化水素溶液を１ｍＬ取って、３７℃で３０ｍｉｎ反応させ、５１０ｎｍでの吸光度値を測定する。ポリペプチド溶液の代わりに蒸留水を１ｍＬ取って、上記の操作と同様にし、５１０ｎｍでの吸光度値を測定する。過酸化水素溶液の代わりに蒸留水を１ｍＬ取って、上記の操作と同様にし、５１０ｎｍでの吸光度値を測定し、ヒドロキシラジカルのクリアランス率は、式（６）によって算出され、ＥＣ５０の算出方法は２．１と同じである。
Ｃｈｅｎらの方法を参考してヒドロキシラジカルのクリアランス率を測定する。反応溶液の製造：適量の硫酸第一鉄、過酸化水素及びサリチル酸をそれぞれ蒸留水に十分に溶解させ、９ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸第一鉄溶液、８．８ｍｍｏｌ／Ｌの過酸化水素溶液及び９ｍｍｏｌ／Ｌのサリチル酸溶液を調製する。ポリペプチド溶液の製造：１０ｍｇのポリペプチドを適量の蒸留水に入れて完全に溶解させ、１ｍＬに定容して、濃度が１０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド溶液を製造し、一定の割合にしたがって希釈して、異なる濃度のポリペプチド溶液を得る。試験管に異なる濃度のポリペプチド溶液を１ｍＬ取って、１ｍＬの硫酸第一鉄や１ｍＬのサリチル酸と均一に混合し、１０ｍｉｎ反応させてから、試験管に過酸化水素溶液を１ｍＬ取って、３７℃で３０ｍｉｎ反応させ、５１０ｎｍでの吸光度値を測定する。ポリペプチド溶液の代わりに蒸留水を１ｍＬ取って、上記の操作と同様にし、５１０ｎｍでの吸光度値を測定する。過酸化水素溶液の代わりに蒸留水を１ｍＬ取って、上記の操作と同様にし、５１０ｎｍでの吸光度値を測定し、ヒドロキシラジカルのクリアランス率は、式（６）によって算出され、ＥＣ５０の算出方法は２．１と同じである。
【数6】
【0032】
式中、Ｐ３は、ヒドロキシラジカルのクリアランス率（％）を代表し、Ａｉは、ポリペプチド溶液の５１０ｎｍでの吸光度値であり、Ａｊは、過酸化水素溶液の代わりに蒸留水を使用したものの５１０ｎｍでの吸光度値であり、Ａ０は、ポリペプチド溶液の代わりに蒸留水を使用したものの５１０ｎｍでの吸光度値である。
【0033】
３．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分離同定
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳでポリペプチド成分のアミノ酸配列及び分子量を測定する。サンプルをマシンに置く前に、先に、還元アルキル化及び脱塩処理を行う。採用される毛細血管液体クロマトグラフィーカラムのプレカラムは、３００μｍ×５ｍｍのＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐＲＰＬＣ Ｃ１８分析カラム（５μｍ、１００Å）であり、分析カラムは、１５０μｍ×１５０ｍｍのＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＰＬＣ Ｃ１８分析カラム（１．９μｍ、１００Å）である。移動相Ａは、０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸溶液と２％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル溶液であり、移動相Ｂは、０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸溶液と８０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル溶液であり、流速は６００ｎＬ／ｍｉｎであり、成分毎の分析時間は６０ｍｉｎである。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳでポリペプチド成分のアミノ酸配列及び分子量を測定する。サンプルをマシンに置く前に、先に、還元アルキル化及び脱塩処理を行う。採用される毛細血管液体クロマトグラフィーカラムのプレカラムは、３００μｍ×５ｍｍのＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐＲＰＬＣ Ｃ１８分析カラム（５μｍ、１００Å）であり、分析カラムは、１５０μｍ×１５０ｍｍのＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＰＬＣ Ｃ１８分析カラム（１．９μｍ、１００Å）である。移動相Ａは、０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸溶液と２％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル溶液であり、移動相Ｂは、０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸溶液と８０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル溶液であり、流速は６００ｎＬ／ｍｉｎであり、成分毎の分析時間は６０ｍｉｎである。
【0034】
ＭＳ及びＭＳ／ＭＳパラメータは、下記のとおりである。
（１）ＭＳパラメータ：解像度は７００００であり、最大注入時間は４０ｍｓであり、スキャン範囲は３００～１４００ｍ／ｚである。
（２）ＭＳ／ＭＳパラメータ：解像度は１７５０００であり、最大注入時間は６０ｍｓであり、スキャン範囲は３００～１４００ｍ／ｚであり、Ｔｏｐ Ｎ＝２０で、ＮＣＥ／ｓｔｅｅｐｅｄ ＮＣＥ＝２７である。
（１）ＭＳパラメータ：解像度は７００００であり、最大注入時間は４０ｍｓであり、スキャン範囲は３００～１４００ｍ／ｚである。
（２）ＭＳ／ＭＳパラメータ：解像度は１７５０００であり、最大注入時間は６０ｍｓであり、スキャン範囲は３００～１４００ｍ／ｚであり、Ｔｏｐ Ｎ＝２０で、ＮＣＥ／ｓｔｅｅｐｅｄ ＮＣＥ＝２７である。
【0035】
サンプル種類のＭａｓｃｏｔソフトウェアに基づいてオリジナルＭＳ／ＭＳファイルを分析して、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ（Ｃｈｉｃｋｅｎ）を検索したものを照合して、これでペプチドのアミノ酸配列を決定する。
【0036】
以下、具体的な実施形態により、本発明についてさらに解釈説明する。
【0037】
（実施例１）
卵白タンパクペプチドの酵素分解
１．ポリペプチドの予熱処理と製造
４％（ｗ／ｖ）の基質濃度で卵白タンパクを蒸留水に溶解させ、９０℃の水浴鍋中で２０ｍｉｎ下ごしらえし、下ごしらえした後、温度を４５℃に下げた。タンパク溶液のｐＨ値を７．５に調節し、温度は４５℃であり、基質の質量にしたがって複合プロテアーゼ（Ｃ８８００、Ｓｏｌａｒｂｉｏ）を３０００Ｕ／ｇ加え、１．５ｈ酵素分解し、ｐＨ値を１０．０に調節し、温度は４０℃であり、基質の質量にしたがってアルカリ性プロテアーゼを３０００Ｕ／ｇ加え、１．５ｈ酵素分解し、ｐＨ値を７．５に調節し、温度は５０℃であり、基質の質量にしたがって風味プロテアーゼを３０００Ｕ／ｇ加え、１．５ｈ酵素分解し、酵素分解が終了したのち、１０ｍｉｎ煮沸して酵素を不活性化させ、その後、６０００ｒ／ｍｉｎで酵素分解液を２０ｍｉｎ遠心分離し、残留のタンパクを除去して、上澄み液を取得し、ｐＨを７．０に調製し、凍結乾燥して後続の使用に供した。
卵白タンパクペプチドの酵素分解
１．ポリペプチドの予熱処理と製造
４％（ｗ／ｖ）の基質濃度で卵白タンパクを蒸留水に溶解させ、９０℃の水浴鍋中で２０ｍｉｎ下ごしらえし、下ごしらえした後、温度を４５℃に下げた。タンパク溶液のｐＨ値を７．５に調節し、温度は４５℃であり、基質の質量にしたがって複合プロテアーゼ（Ｃ８８００、Ｓｏｌａｒｂｉｏ）を３０００Ｕ／ｇ加え、１．５ｈ酵素分解し、ｐＨ値を１０．０に調節し、温度は４０℃であり、基質の質量にしたがってアルカリ性プロテアーゼを３０００Ｕ／ｇ加え、１．５ｈ酵素分解し、ｐＨ値を７．５に調節し、温度は５０℃であり、基質の質量にしたがって風味プロテアーゼを３０００Ｕ／ｇ加え、１．５ｈ酵素分解し、酵素分解が終了したのち、１０ｍｉｎ煮沸して酵素を不活性化させ、その後、６０００ｒ／ｍｉｎで酵素分解液を２０ｍｉｎ遠心分離し、残留のタンパクを除去して、上澄み液を取得し、ｐＨを７．０に調製し、凍結乾燥して後続の使用に供した。
【0038】
ポリペプチド収率の測定は、ビウレット法を用いてポリペプチド収率を測定し、結果は４２．０８±０．４８％であった。
【0039】
２．ポリペプチドの限外ろ過分離
卵白タンパク酵素分解液を６０００ｒ／ｍｉｎで２０ｍｉｎ遠心分離して、上澄み液を取得した。まず、０．４５μｍろ過膜でろ過し、ろ過液を収集して次の操作を行った。ろ過液を１０ｋＤａ、５ｋＤａ、３ｋＤａの限外ろ過膜で分離して、異なる分子量（＞１０ｋＤａ、５～１０ｋＤａ、３～５ｋＤａ及び＜３ｋＤａ）のポリペプチドを収集し、異なる分子量の４種類のポリペプチド溶液を真空冷凍乾燥して、－８０℃で保存した。
卵白タンパク酵素分解液を６０００ｒ／ｍｉｎで２０ｍｉｎ遠心分離して、上澄み液を取得した。まず、０．４５μｍろ過膜でろ過し、ろ過液を収集して次の操作を行った。ろ過液を１０ｋＤａ、５ｋＤａ、３ｋＤａの限外ろ過膜で分離して、異なる分子量（＞１０ｋＤａ、５～１０ｋＤａ、３～５ｋＤａ及び＜３ｋＤａ）のポリペプチドを収集し、異なる分子量の４種類のポリペプチド溶液を真空冷凍乾燥して、－８０℃で保存した。
【0040】
３．抗炎症活性の測定
３．１ ＲＡＷ２６４．７細胞生存率に対する影響
分子量＞１０ｋＤａ、５～１０ｋＤａ、３～５ｋＤａ、＜３ｋＤａである酵素分解液の最終濃度を１ｍｇ／ｍＬに設定し、４種類のサンプルの細胞生存率を測定した。図１に示すように、４種類のサンプルを加えた後、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞生存率は、いずれも１００％以上であり、毒性作用がない。ここで、細胞生存率は、分子量＜３ｋＤａの作用後に最高で、１０３．６２±０．８４％に達した。
３．１ ＲＡＷ２６４．７細胞生存率に対する影響
分子量＞１０ｋＤａ、５～１０ｋＤａ、３～５ｋＤａ、＜３ｋＤａである酵素分解液の最終濃度を１ｍｇ／ｍＬに設定し、４種類のサンプルの細胞生存率を測定した。図１に示すように、４種類のサンプルを加えた後、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞生存率は、いずれも１００％以上であり、毒性作用がない。ここで、細胞生存率は、分子量＜３ｋＤａの作用後に最高で、１０３．６２±０．８４％に達した。
【0041】
３．２ ＮＯ生成量に対する分子量＜３ｋＤａのポリペプチドの影響
濃度が２５０～１０００μｇ／ｍＬ範囲内にある分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分の、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞のＮＯ生成量に対する影響である。図２に示すように、濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳに誘導された後、ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量が有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、約ブランク群の５．０８倍であり、これは、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞の炎症モデルが正常に確立されたことを説明する。分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分の濃度が１０００μｇ／ｍＬであると、ＮＯ生成量が最低で、２１．５７±０．４７μＭであった。
濃度が２５０～１０００μｇ／ｍＬ範囲内にある分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分の、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞のＮＯ生成量に対する影響である。図２に示すように、濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳに誘導された後、ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量が有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、約ブランク群の５．０８倍であり、これは、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞の炎症モデルが正常に確立されたことを説明する。分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分の濃度が１０００μｇ／ｍＬであると、ＮＯ生成量が最低で、２１．５７±０．４７μＭであった。
【0042】
３．３ 分子量＜３ｋＤａのポリペプチドの抗酸化活性
分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分の抗酸化能力のＥＣ５０値は表３に示すとおりであり、分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分は、ＤＰＰＨ、ＡＢＴＳ及びヒドロキシラジカルの３種類のフリーラジカルのいずれに対してもクリアランス能力があり、そのため、一定の抗酸化活性を備えている。例えばヒドロキシラジカル、スーパーオキシドアニオンフリーラジカルフリーラジカル、一重項酸素等のフリーラジカルと、炎症反応とは相互関連し、炎症は、活性酸素の過剰生成と放出に関し、抗酸化活性がよいポリペプチドは、通常、よい抗炎症潜在力を有する。また、生物活性ペプチドの抗酸化活性及び抗炎症活性を同時に調査する必要がある。
分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分の抗酸化能力のＥＣ５０値は表３に示すとおりであり、分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分は、ＤＰＰＨ、ＡＢＴＳ及びヒドロキシラジカルの３種類のフリーラジカルのいずれに対してもクリアランス能力があり、そのため、一定の抗酸化活性を備えている。例えばヒドロキシラジカル、スーパーオキシドアニオンフリーラジカルフリーラジカル、一重項酸素等のフリーラジカルと、炎症反応とは相互関連し、炎症は、活性酸素の過剰生成と放出に関し、抗酸化活性がよいポリペプチドは、通常、よい抗炎症潜在力を有する。また、生物活性ペプチドの抗酸化活性及び抗炎症活性を同時に調査する必要がある。
【0043】
[表３]
分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分の抗酸化能力
分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分の抗酸化能力
【0044】
（実施例２）
卵白タンパクペプチドの分離同定
分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分に対してＬＣ－ＭＳ／ＭＳ液体クロマトグラフ質量分析を行い、そのトータルイオンクロマトグラムは図３に示すとおりであり、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析し且つデータベースを検索して照合し、ポリペプチド配列を合計７９０本取得した。
卵白タンパクペプチドの分離同定
分子量＜３ｋＤａのポリペプチド成分に対してＬＣ－ＭＳ／ＭＳ液体クロマトグラフ質量分析を行い、そのトータルイオンクロマトグラムは図３に示すとおりであり、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析し且つデータベースを検索して照合し、ポリペプチド配列を合計７９０本取得した。
【0045】
２．仮想スクリーニングと分子ドッキング
２．１ 仮想スクリーニング
ＣｈｅｍＤｒａｗ ２ＤソフトウェアでＬＣ／ＭＳ－ＭＳによって得られたペプチド配列をペプチドの２Ｄ構造図にプロットしてから、Ｃｈｅｍ３Ｄ Ｕｌｔｒａ １４．０ソフトウェアでペプチドの３Ｄ構造図をプロットして、エネルギーが最小の構造（ｐｄｂｑｔフォーマット）であると設定した。ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋデータベースから誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ、ＰＤＢ ＩＤ：３ｅ６ｔ）のｘ線結晶構造（ＰＤＢ ｆｏｒｍａｔフォーマット）をダウンロードし、Ａｕｔｏｄｏｃｋ ｔｏｏｌｓ１．５．６ソフトウェアを使用して受容体ｉＮＯＳに対して水分子の除去、水素添加及び電荷計算等の操作を行った。ＰｙＲｘ０．８ソフトウェアですべてのペプチド断片を受容体タンパクにそれぞれドッキングし、一般的な状況では、ドッキングエネルギーは０未満であり、数値が小さいほど、ドッキングがタイトになり、抗炎症潜在力が高くなることを説明し、そのため、ドッキングエネルギーの絶対値の大きさにしたがってペプチド断片に順位を付け、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒａｎｋｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｓｔｉｌｌｄｅｅｐ．ｕｃｄ．ｉｅ／ＰｅｐｔｉｄｅＲａｎｋｅｒ／）での順位が前にあるペプチド断片を利用してそれが持つ可能性のある生物活性値を予測した。
２．１ 仮想スクリーニング
ＣｈｅｍＤｒａｗ ２ＤソフトウェアでＬＣ／ＭＳ－ＭＳによって得られたペプチド配列をペプチドの２Ｄ構造図にプロットしてから、Ｃｈｅｍ３Ｄ Ｕｌｔｒａ １４．０ソフトウェアでペプチドの３Ｄ構造図をプロットして、エネルギーが最小の構造（ｐｄｂｑｔフォーマット）であると設定した。ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋデータベースから誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ、ＰＤＢ ＩＤ：３ｅ６ｔ）のｘ線結晶構造（ＰＤＢ ｆｏｒｍａｔフォーマット）をダウンロードし、Ａｕｔｏｄｏｃｋ ｔｏｏｌｓ１．５．６ソフトウェアを使用して受容体ｉＮＯＳに対して水分子の除去、水素添加及び電荷計算等の操作を行った。ＰｙＲｘ０．８ソフトウェアですべてのペプチド断片を受容体タンパクにそれぞれドッキングし、一般的な状況では、ドッキングエネルギーは０未満であり、数値が小さいほど、ドッキングがタイトになり、抗炎症潜在力が高くなることを説明し、そのため、ドッキングエネルギーの絶対値の大きさにしたがってペプチド断片に順位を付け、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒａｎｋｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｓｔｉｌｌｄｅｅｐ．ｕｃｄ．ｉｅ／ＰｅｐｔｉｄｅＲａｎｋｅｒ／）での順位が前にあるペプチド断片を利用してそれが持つ可能性のある生物活性値を予測した。
【0046】
誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）は、炎症反応に密接に関連する神経系酵素として、様々な炎症条件の刺激を受けると、ＬＰＳ又はサイトカインがｉＮＯＳの大量発現を誘導し、さらにＮＯを持続的に生成するため、炎症部位の組織損傷を引き起こすおそれがある。ｉＮＯＳの制御は、各タイプの病理状態での炎症反応を制御する重要なポリシーの１つであり、ｉＮＯＳは、すでに、炎症疾患を治療する重要な標的となっている。ＰｙＲｘソフトウェアは、受容体と異なる配位子とをバッチで模擬的にドッキングすることができ、ドッキングエネルギーの大きさによってその相互作用力の強弱を判断し、仮想スクリーニング効果を実現した。ドッキングエネルギー採点は、受容体と配位子との結合の潜在力を示すことができ、一般的に言えば、スコアが低いと、両者間の結合能力が強いことを表す。表４に示すように、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって得られたペプチド断片は、模擬的な採点とドッキングエネルギーの順位付けを経て、ドッキングエネルギーの順位が前にある６本のペプチド断片のドッキングエネルギーは≦－８．５ｋｃａｌｍｏｌ－１であり、これは、ｉＮＯＳとの結合力が強いことを説明する。６本のペプチド断片をＢＩＯＰＥＰ－ＵＷＭデータベースと照合すると、そのうちのＷＩＮＰＩＧＴやＷＮＩＰは、抗酸化ペプチドに合成・検証され、ＲＡＤＨＰＦＬは、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドに合成・検証された。６本のペプチド断片は、いずれも卵白由来の生物活性ペプチドであり、ここで、ペプチド断片であるフェニルアラニン－グリシン－プロリン－ヒスチジン（ＦＧＰＨ）は、ＢＩＯＰＥＰ－ＵＷＭデータベース中の知られている生物活性ペプチド配列のいずれとも一致せず、且つ、研究されていないペプチド断片のドッキングエネルギーが最低で、－９．３ｋｃａｌ ｍｏｌ－１であり、これは、ＦＧＰＨが強いｉＮＯＳ阻害作用を有するおそれがあり、潜在的な新型抗炎症活性ペプチドであることを説明する。
【0047】
[表４]
仮想スクリーニングとＢＩＯＰＥＰ－ＵＷＭペプチド断片データベースとの照合結果
仮想スクリーニングとＢＩＯＰＥＰ－ＵＷＭペプチド断片データベースとの照合結果
【0048】
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒａｎｋｅｒにより、６本のペプチドが有する可能性のある生物活性に順位を付け、ＴｏｘｉｎＰｒｅｄプログラムを利用して、ポリペプチドの毒性及び物理化学的性質を評価し、結果は表５に示すとおりであり、６本のペプチドは、いずれも毒性がないと予測され、ＦＧＰＨのＰｅｐｔｉｄｅ Ｒａｎｋｅｒにおける生物活性のスコアは０．９３であり、これは、ＦＧＰＨが良好な生物活性を有する可能性があることを説明する。
【0049】
[表５]
ペプチド断片の生物活性のスコア及び物理化学的性質の予測
ペプチド断片の生物活性のスコア及び物理化学的性質の予測
【0050】
潜在的な抗炎症活性ペプチドＰｈｅ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｉｓ（ＦＧＰＨ）の化学構造は、図４に示すとおりである。
【0051】
２．２分子ドッキング
ドッキングしソフトウェアはＡｕｔｏｄｏｃｋ Ｖｉｎａであり、Ｃｈｅｍ ３Ｄによって得られたｐｄｂｑｔフォーマットのペプチド断片を配位子とし、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋからダウンロードしたＰＤＢ ｆｏｒｍａｔフォーマットのｉＮＯＳを受容体とし、両者に対してセミフレキシブルドッキングを行った。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｓｔｕｄｉｏ ２．５ソフトウェアを用いて、単一の小分子と配位子との相互作用に対して可視化分析を行った。
ドッキングしソフトウェアはＡｕｔｏｄｏｃｋ Ｖｉｎａであり、Ｃｈｅｍ ３Ｄによって得られたｐｄｂｑｔフォーマットのペプチド断片を配位子とし、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋからダウンロードしたＰＤＢ ｆｏｒｍａｔフォーマットのｉＮＯＳを受容体とし、両者に対してセミフレキシブルドッキングを行った。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｓｔｕｄｉｏ ２．５ソフトウェアを用いて、単一の小分子と配位子との相互作用に対して可視化分析を行った。
【0052】
分子ドッキングによりＦＧＰＨの抗炎症機序を研究し、ＦＧＰＨを受容体タンパクｉＮＯＳにドッキングした。ＦＧＰＨをｉＮＯＳのキャビティにドッキングし、且つ、水素結合、炭素水素結合、カチオン－πの相互作用がペプチドとｉＮＯＳとの間の主な作用力であり、ドッキング結果から、ＦＧＰＨとｉＮＯＳとのドッキングエネルギー絶対値は９．３ｋｃａｌ ｍｏｌ－１であり、ＦＧＰＨは受容体タンパクと緊密に結合することが分かった。
【0053】
ＦＧＰＨとｉＮＯＳとの間の相互作用は、図５に示すとおりであり、ｉＮＯＳのＧｌｎ２５７は、ＦＧＰＨのＧｌｙのカルボニル酸素原子と１つの水素結合作用を形成し、Ｐｒｏと１つの炭素水素結合を形成し、Ａｒｇ２６０は、Ｈｉｓのカルボキシル基と１つの水素結合作用を形成し、Ａｒｇ３８２は、Ｈｉｓの窒素原子及びＰｒｏのカルボニル酸素原子と２つの水素結合作用を形成し、Ｐｒｏ３４４は、Ｐｈｅのベンゼン環とπ－アルキル基作用を形成し、Ａｒｇ３７５は、Ｈｉｓのイミダゾール環と２つのカチオン－π相互作用を形成する。
【0054】
（実施例３）
ポリペプチド合成及び人工検証
南京源ペプチド生物有限公司に委託して固相合成法によりペプチド断片を合成し、純度≧９５％であり、活性検出に関する実験の要件を満たした。
ポリペプチド合成及び人工検証
南京源ペプチド生物有限公司に委託して固相合成法によりペプチド断片を合成し、純度≧９５％であり、活性検出に関する実験の要件を満たした。
【0055】
１．ＦＧＰＨの抗炎症活性の分析
１．１細胞生存率
濃度が異なるとき、ＦＧＰＨの細胞生存率に対する影響を調査した。図６に示すように、濃度が１２５～１０００μｇ／ｍＬ範囲内にある場合、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞生存率に対するＦＧＰＨの影響は、ペプチド濃度の向上に伴って、先に増加してから低下する傾向を呈した。ＦＧＰＨの濃度が１２５、２５０、５００μｇ／ｍＬであるいずれの場合でも、細胞生存率はいずれも１０９％より高く、細胞増殖促進効果があり、ＦＧＰＨの濃度が１０００μｇ／ｍＬである場合、細胞生存率が９７％より低く、細胞生存率に対する阻害が生じた。そのため、ＦＧＰＨは、一定の細胞増殖促進能力を有し、ＦＧＰＨの濃度が１２５～５００μｇ／ｍＬであることを選択すると、引き続きＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量及び炎症因子分泌量に対する影響を測定した。
１．１細胞生存率
濃度が異なるとき、ＦＧＰＨの細胞生存率に対する影響を調査した。図６に示すように、濃度が１２５～１０００μｇ／ｍＬ範囲内にある場合、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞生存率に対するＦＧＰＨの影響は、ペプチド濃度の向上に伴って、先に増加してから低下する傾向を呈した。ＦＧＰＨの濃度が１２５、２５０、５００μｇ／ｍＬであるいずれの場合でも、細胞生存率はいずれも１０９％より高く、細胞増殖促進効果があり、ＦＧＰＨの濃度が１０００μｇ／ｍＬである場合、細胞生存率が９７％より低く、細胞生存率に対する阻害が生じた。そのため、ＦＧＰＨは、一定の細胞増殖促進能力を有し、ＦＧＰＨの濃度が１２５～５００μｇ／ｍＬであることを選択すると、引き続きＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量及び炎症因子分泌量に対する影響を測定した。
【0056】
１．２ＦＧＰＨの抗炎症活性
濃度が１２５～５００μｇ／ｍＬ範囲内にあるＦＧＰＨの、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量及び炎症因子ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６分泌量に対する影響を調査した。
濃度が１２５～５００μｇ／ｍＬ範囲内にあるＦＧＰＨの、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量及び炎症因子ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６分泌量に対する影響を調査した。
【0057】
図７Ａに示すように、濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳに誘導された後、ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量は、有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、約ブランク群の４．９４倍であり、これは、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞の炎症モデルの確立に成功したことを説明する。ＬＰＳ群と比較して、濃度が１２５、２５０、５００μｇ／ｍＬであるいずれの場合でも、ＦＧＰＨはＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成に対して有意な阻害作用があり（Ｐ＜０．０５）、この３種類の濃度のＦＧＰＨの作用下で、細胞のＮＯ生成量は、それぞれ１８．０７±０．３１、１６．２３±０．３１、１３．８２±０．３１μＭであった。これから分かるように、ＦＧＰＨは、濃度依存性の方式でＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量を有意に阻害し、ＦＧＰＨの濃度の増加に伴って、細胞のＮＯ生成量に対する阻害効果がより明らかになり、ＦＧＰＨの濃度が５００μｇ／ｍＬであると、ＮＯ生成量が最低であり、ＮＯ生成量の阻害率が最高で、６４．４１±０．４７％に達した。
【0058】
図７Ｂに示すように、濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳに誘導された後、ＲＡＷ２６４．７細胞のＴＮＦ－α分泌量が有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、約ブランク群の１１．０３倍であった。３種類の濃度でのＦＧＰＨは、いずれも細胞ＴＮＦ－αの分泌を有意に阻害することができ（Ｐ＜０．０５）、濃度依存性の特徴を呈し、濃度が５００μｇ／ｍＬであるＦＧＰＨの作用下で、最高の阻害率を呈し、２８．０７±２．１０％に達した。
【0059】
図７Ｃに示すように、濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳに誘導された後、細胞のＩＬ－６分泌量は有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、約ブランク群の８．０５倍であった。ＦＧＰＨは、ＬＰＳ群と比較して、濃度が１２５、２５０、５００μｇ／ｍＬである場合、ＬＰＳに誘導されたマクロファージ細胞のＩＬ－６分泌量に対する有意な阻害作用を生じた（Ｐ＜０．０５）。ＦＧＰＨは、濃度依存性の方式でＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞のＩＬ－６分泌量を有意に阻害し、且つ、ＦＧＰＨの濃度が増加するほど、細胞のＩＬ－６分泌量に対する阻害効果がよくなり、ＦＧＰＨの濃度が５００μｇ／ｍＬになると、４１．７２±１．８３％に達した。
【0060】
図７Ｄに示すように、濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳに誘導された後、細胞のＩＬ－１β分泌量が有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、約ブランク群の５．６８倍であった。ＦＧＰＨは、ＬＰＳ群と比較して、濃度が１２５、２５０、５０μｇ／ｍＬである場合、ＬＰＳに誘導された細胞のＩＬ－１β分泌量に対する有意な阻害作用を生じた（Ｐ＜０．０５）。ＦＧＰＨは、濃度依存性の方式でＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞のＩＬ－１β分泌量を有意に阻害し、且つ、ＦＧＰＨの濃度が増加するほど、細胞のＩＬ－１β分泌量に対する阻害効果がよくなり、ＦＧＰＨの濃度が５００μｇ／ｍＬになると、５２．４３±２．２９％に達した。
【0061】
２．ＦＧＰＨ抗酸化活性の分析
ＦＧＰＨの抗酸化能力のＥＣ５０値は、表６に示すとおりである。ＦＧＰＨは、ＤＰＰＨ、ＡＢＴＳ及びヒドロキシラジカルの３種類のフリーラジカルのいずれに対してもクリアランス能力を有しているため、一定の抗酸化活性を備えている。
ＦＧＰＨの抗酸化能力のＥＣ５０値は、表６に示すとおりである。ＦＧＰＨは、ＤＰＰＨ、ＡＢＴＳ及びヒドロキシラジカルの３種類のフリーラジカルのいずれに対してもクリアランス能力を有しているため、一定の抗酸化活性を備えている。
【0062】
[表６]
ＦＧＰＨの抗酸化能力
ＦＧＰＨの抗酸化能力
【0063】
（実施例４）
ＦＧＰＨのメイラード反応
１．製造方法
一定量のＦＧＰＨを秤量して、２０ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、１．５：１割合のペプチド糖質量比にしたがってデキストランを加え、十分に混合し、８０℃の温度、９．０のｐＨ値で１０ｈ反応させ、反応が終了した後、室温まで冷却すると、ＦＧＰＨのメイラード生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓを得た。
ＦＧＰＨのメイラード反応
１．製造方法
一定量のＦＧＰＨを秤量して、２０ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、１．５：１割合のペプチド糖質量比にしたがってデキストランを加え、十分に混合し、８０℃の温度、９．０のｐＨ値で１０ｈ反応させ、反応が終了した後、室温まで冷却すると、ＦＧＰＨのメイラード生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓを得た。
【0064】
２９４ｎｍでの吸光度値が代表するメイラード中間生成物生成量及び４２０ｎｍでの吸光度値が代表する褐変度を指標とし、上記のメイラード生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの２９４ｎｍでの吸光度値は０．７３６±０．０１０であり、４２０ｎｍでの吸光度値は０．６９６±０．０１０であった。
【0065】
２．物理化学的性質の測定
２．１ フーリエ赤外線（ＦＴＩＲ）の分析
ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓのフーリエ赤外線スペクトル写真は図８に示すとおりである。フーリエ赤外線スペクトルは、タンパク質と炭水化物との相互作用及びタンパク質構造を特徴付ける変化の研究によく使用される。タンパク質は、赤外線スペクトル中で特徴的な吸収ピークを複数有し、そのうち、アミドＩバンド、アミドＩＩバンド、アミドＩＩＩバンドは、それぞれ１７００～１６００ｃｍ－１、１６００～１５００ｃｍ－１、１４５０～１２４０ｃｍ－１で吸収がある。タンパク質と比較して、ペプチドはタンパク由来の小分子物質として、タンパク質の二次構造の大部分が消え、アミドＩＩバンド上では、吸収ピークが明確ではなかった。タンパク質／ペプチドは、メイラード反応を経た後、赤外スペクトル上で２つの典型的な特徴を示し、１つは、遊離ヒドロキシル基の引張振動により、赤外線スペクトルの３５００～３０００ｃｍ－１範囲内で広いピークが現れることであり、１つは、Ｃ－Ｏ結合の引張振動により、１２６０～１０００ｃｍ－１範囲内で明確な吸収ピークが現れることである。図８に示すように、３５００～３０００ｃｍ－１及び１２６０～１０００ｃｍ－１での吸収は、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓがＦＧＰＨよりも高く、これは、メイラード反応がすでに発生したことを証明した。
２．１ フーリエ赤外線（ＦＴＩＲ）の分析
ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓのフーリエ赤外線スペクトル写真は図８に示すとおりである。フーリエ赤外線スペクトルは、タンパク質と炭水化物との相互作用及びタンパク質構造を特徴付ける変化の研究によく使用される。タンパク質は、赤外線スペクトル中で特徴的な吸収ピークを複数有し、そのうち、アミドＩバンド、アミドＩＩバンド、アミドＩＩＩバンドは、それぞれ１７００～１６００ｃｍ－１、１６００～１５００ｃｍ－１、１４５０～１２４０ｃｍ－１で吸収がある。タンパク質と比較して、ペプチドはタンパク由来の小分子物質として、タンパク質の二次構造の大部分が消え、アミドＩＩバンド上では、吸収ピークが明確ではなかった。タンパク質／ペプチドは、メイラード反応を経た後、赤外スペクトル上で２つの典型的な特徴を示し、１つは、遊離ヒドロキシル基の引張振動により、赤外線スペクトルの３５００～３０００ｃｍ－１範囲内で広いピークが現れることであり、１つは、Ｃ－Ｏ結合の引張振動により、１２６０～１０００ｃｍ－１範囲内で明確な吸収ピークが現れることである。図８に示すように、３５００～３０００ｃｍ－１及び１２６０～１０００ｃｍ－１での吸収は、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓがＦＧＰＨよりも高く、これは、メイラード反応がすでに発生したことを証明した。
【0066】
ＦＧＰＨのアミドＩバンドにおけるピークは１６６８ｃｍ－１に位置し、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓのアミドＩバンドにおけるピークが１６８３ｃｍ－１にブルーシフトする原因は、主に、－ＮＨと－Ｃ＝Ｏとが反応して、カルボニル電子雲密度の低下によりピークの位置がブルーシフトすることである。芳香族アミノ酸フェニルアラニン構造中でＣ－Ｈ面が外側へ曲がるから、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓは、アミドＩＩＩバンドの１４３５ｃｍ－１位置でＦＧＰＨよりもより明確な吸収ピークが現れ、以上は、同様に、メイラード反応の発生を証明した。
【0067】
２．２ 走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の分析
ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓを走査型電子顕微鏡の下に置いて、同じ倍数に拡大し、ＦＧＰＨのＳＥＭ画像は、図９Ａに示すとおりであり、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの画像は図９Ｂに示すとおりである。メイラード反応を経た後のＦＧＰＨのミクロ形態が明確に変化し、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓは不規則なシート状構造を呈し、細孔を有した。
ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓを走査型電子顕微鏡の下に置いて、同じ倍数に拡大し、ＦＧＰＨのＳＥＭ画像は、図９Ａに示すとおりであり、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの画像は図９Ｂに示すとおりである。メイラード反応を経た後のＦＧＰＨのミクロ形態が明確に変化し、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓは不規則なシート状構造を呈し、細孔を有した。
【0068】
２．３ ＲＡＷ２６４．７細胞生存率に対する影響
ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓが５００μｇ／ｍＬである場合、細胞生存率に対する影響を調査した。図１０に示すように、濃度が５００μｇ／ｍＬである２種類のサンプルの作用下で、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７の細胞生存率はいずれも１１４％以上であり、一定の細胞増殖能力を有し、２種類のサンプルの細胞生存率には有意な差がなかった（Ｐ＞０．０５）。
ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓが５００μｇ／ｍＬである場合、細胞生存率に対する影響を調査した。図１０に示すように、濃度が５００μｇ／ｍＬである２種類のサンプルの作用下で、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７の細胞生存率はいずれも１１４％以上であり、一定の細胞増殖能力を有し、２種類のサンプルの細胞生存率には有意な差がなかった（Ｐ＞０．０５）。
【0069】
２．４ ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量に対する影響
図１１に示すように、濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳに誘導された後、ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量が有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、約ブランク群の４．９４倍であり、これは、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞の炎症モデルの確立に成功したことを説明する。ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓは、ＬＰＳ群と比較して、濃度が５００μｇ／ｍＬである場合、いずれもＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量を有意に阻害した（Ｐ＜０．０５）。メイラード反応後のＮＯ生成量の阻害率は、６４．４１±０．４７％から６８．１６±０．４８％まで向上した。
図１１に示すように、濃度が１μｇ／ｍＬであるＬＰＳに誘導された後、ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量が有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、約ブランク群の４．９４倍であり、これは、ＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞の炎症モデルの確立に成功したことを説明する。ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓは、ＬＰＳ群と比較して、濃度が５００μｇ／ｍＬである場合、いずれもＬＰＳに誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成量を有意に阻害した（Ｐ＜０．０５）。メイラード反応後のＮＯ生成量の阻害率は、６４．４１±０．４７％から６８．１６±０．４８％まで向上した。
【0070】
２．５ メイラード反応の抗酸化活性に対する影響
ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの抗酸化能力は、表７に示すとおりである。ＦＧＰＨは、メイラード反応を経た後、ＤＰＰＨ、ＡＢＴＳ及びヒドロキシラジカルのクリアランス率のＥＣ５０値がある程度低下し（Ｐ＜０．０５）、これは、メイラード反応がＦＧＰＨ抗酸化活性の向上に役立つことを説明する。
ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの抗酸化能力は、表７に示すとおりである。ＦＧＰＨは、メイラード反応を経た後、ＤＰＰＨ、ＡＢＴＳ及びヒドロキシラジカルのクリアランス率のＥＣ５０値がある程度低下し（Ｐ＜０．０５）、これは、メイラード反応がＦＧＰＨ抗酸化活性の向上に役立つことを説明する。
【0071】
[表７]
ＦＧＰＨ、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの抗酸化能力
ＦＧＰＨ、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの抗酸化能力
【0072】
２．６ 官能評価、電子舌、電子鼻によるメイラード反応前後のＦＧＰＨ風味変化の調査
官能評価、電子舌及び電子鼻の評価により、メイラード反応前後のＦＧＰＨ、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの風味をテストし、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの味はＦＧＰＨより明らかに優れ、苦味、渋味、塩味がある程度カバーされ、全体的な受入度がＦＧＰＨより高く、メイラードの特徴的な味である芳醇味を取得し、匂いも明らかに変化して、電子舌と電子鼻が、ＦＧＰＨとＦＧＰＨ－ＭＲＰｓとを明確に区分することができた。
官能評価、電子舌及び電子鼻の評価により、メイラード反応前後のＦＧＰＨ、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの風味をテストし、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの味はＦＧＰＨより明らかに優れ、苦味、渋味、塩味がある程度カバーされ、全体的な受入度がＦＧＰＨより高く、メイラードの特徴的な味である芳醇味を取得し、匂いも明らかに変化して、電子舌と電子鼻が、ＦＧＰＨとＦＧＰＨ－ＭＲＰｓとを明確に区分することができた。
【0073】
２．６．１ 官能評価
官能評価は、食品が呈する味の特性研究において重要な位置を占め、図１２に示すように、２種類のサンプルの官能評価スコアの差が大きく、苦味、渋味、塩味スコアは、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓがＦＧＰＨより低く、メイラード反応は、よくない味をカバーするのに役立ち、芳醇味スコア及び全体的な受入度スコアは、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓがＦＧＰＨより高く、メイラード反応後のサンプルの味が明らかに改善され、メイラードの特徴的な味である芳醇味が明らかに出てきた。
官能評価は、食品が呈する味の特性研究において重要な位置を占め、図１２に示すように、２種類のサンプルの官能評価スコアの差が大きく、苦味、渋味、塩味スコアは、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓがＦＧＰＨより低く、メイラード反応は、よくない味をカバーするのに役立ち、芳醇味スコア及び全体的な受入度スコアは、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓがＦＧＰＨより高く、メイラード反応後のサンプルの味が明らかに改善され、メイラードの特徴的な味である芳醇味が明らかに出てきた。
【0074】
２．６．２ 電子舌による測定評価
電子舌により、ＦＧＰＨとＦＧＰＨ－ＭＲＰｓとの味覚値を比較し、味覚レーダーチャートを作成し、２種類のサンプルのいずれからも酸味と苦味の後味が検出されなかった。図１３に示すように、苦味、渋味、塩味のそれぞれは、メイラード生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓがＦＧＰＨより低く、これは、メイラード反応がよくない味を一定の程度カバーすることができることを説明する。ＦＧＰＨ自体が、一定の旨味及びコクを有し、メイラード反応を経た後、旨味がさらに向上し、これは、メイラード反応がペプチドの特徴的な味を突出させるのに役立つことを説明する。
電子舌により、ＦＧＰＨとＦＧＰＨ－ＭＲＰｓとの味覚値を比較し、味覚レーダーチャートを作成し、２種類のサンプルのいずれからも酸味と苦味の後味が検出されなかった。図１３に示すように、苦味、渋味、塩味のそれぞれは、メイラード生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓがＦＧＰＨより低く、これは、メイラード反応がよくない味を一定の程度カバーすることができることを説明する。ＦＧＰＨ自体が、一定の旨味及びコクを有し、メイラード反応を経た後、旨味がさらに向上し、これは、メイラード反応がペプチドの特徴的な味を突出させるのに役立つことを説明する。
【0075】
２．６．３ 電子鼻による測定評価
ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの電子鼻センサの匂いレーダーチャートは、図１４に示すとおりであり、メイラード反応前後の匂いが明らかに変化した。ＬＹ２／ｇＣＴ、Ｔ３０／１、Ｐ１０／１、Ｐ４０／１、Ｔ７０／２、ＰＡ／２、Ｐ３０／１センサ上の応答値のいずれも、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓがＦＧＰＨより明らかに高く、本発明におけるペプチドＦＧＰＨの遊離アミノ基はフェニルアラニンに位置し、フェニルアラニンメイラード生成物の揮発性風味物質の電子鼻応答値は高く、メイラードの特徴的な匂いを得た。
ＦＧＰＨ及びＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの電子鼻センサの匂いレーダーチャートは、図１４に示すとおりであり、メイラード反応前後の匂いが明らかに変化した。ＬＹ２／ｇＣＴ、Ｔ３０／１、Ｐ１０／１、Ｐ４０／１、Ｔ７０／２、ＰＡ／２、Ｐ３０／１センサ上の応答値のいずれも、ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓがＦＧＰＨより明らかに高く、本発明におけるペプチドＦＧＰＨの遊離アミノ基はフェニルアラニンに位置し、フェニルアラニンメイラード生成物の揮発性風味物質の電子鼻応答値は高く、メイラードの特徴的な匂いを得た。
【0076】
メイラード反応を経たＦＧＰＨの全体的な味が改善され、匂いがより明らかになった。
【0077】
以上に記載の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を表すものにすぎず、その説明は具体的かつ詳細であるが、それにより特許範囲を限定するものと理解すべきではない。当業者であれば、本発明の概念から逸脱することなく、上記各実施形態に対してさらにいくつかの変形、組み合わせ及び改良を行うことができ、これらはいずれも本発明の保護範囲に属することを理解されたい。したがって、本発明の保護範囲は特許請求の範囲を準ずるべきである。
【要約】 （修正有）
【課題】オボアルブミン抗炎症活性ペプチド及びそのメイラード反応生成物の製造と使用を提供する。
【解決手段】抗炎症ペプチドはＦＧＰＨ（Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ）である。ＦＧＰＨのメイラード反応生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの製造方法は、ＦＧＰＨを秤量して水溶液に調製し、１．５：１割合のペプチド糖質量比にしたがってデキストランを加えて、十分に混合し、８０℃、ｐＨ９．０下で１０ｈ反応させ、反応が終了した後、室温まで冷却して、ＦＧＰＨのメイラード生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓを得る。該ＦＧＰＨのメイラード反応生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの抗炎症反応における使用も提供する。
【選択図】図４
【解決手段】抗炎症ペプチドはＦＧＰＨ（Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ）である。ＦＧＰＨのメイラード反応生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの製造方法は、ＦＧＰＨを秤量して水溶液に調製し、１．５：１割合のペプチド糖質量比にしたがってデキストランを加えて、十分に混合し、８０℃、ｐＨ９．０下で１０ｈ反応させ、反応が終了した後、室温まで冷却して、ＦＧＰＨのメイラード生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓを得る。該ＦＧＰＨのメイラード反応生成物ＦＧＰＨ－ＭＲＰｓの抗炎症反応における使用も提供する。
【選択図】図４
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】