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特許7618299免疫チェックポイント阻害剤を発現するがん特異的トランス－スプライシングリボザイム及びこの用途｛ＴＵＭＯＲ－ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＴＲＡＮＳ－ＳＰＬＩＣＩＮＧ ＲＩＢＯＺＹＭＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＩＭＭＵＮＥ ＣＨＥＣＫＰＯＩＮＴ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ ＡＮＤ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ｝
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-10
(45)【発行日】2025-01-21
(54)【発明の名称】免疫チェックポイント阻害剤を発現するがん特異的トランス－スプライシングリボザイム及びこの用途｛ＴＵＭＯＲ－ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＴＲＡＮＳ－ＳＰＬＩＣＩＮＧ ＲＩＢＯＺＹＭＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＩＭＭＵＮＥ ＣＨＥＣＫＰＯＩＮＴ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ ＡＮＤ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ｝
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20250114BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20250114BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250114BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20250114BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20250114BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250114BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250114BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250114BHJP
C12N 15/38 20060101ALN20250114BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20250114BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/85 Z
C12N5/10
C12N9/00
A61K31/7105
A61K48/00
A61P35/00
A61P35/02
C12N15/38
C12N15/12
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2023530894
(86)(22)【出願日】2022-01-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-01
(86)【国際出願番号】 KR2022001088
(87)【国際公開番号】W WO2022158891
(87)【国際公開日】2022-07-28
【審査請求日】2023-05-22
(31)【優先権主張番号】10-2021-0010416
(32)【優先日】2021-01-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0193826
(32)【優先日】2021-12-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】520062823
【氏名又は名称】アールズィーノミクス・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ソン－ウク・イ
(72)【発明者】
【氏名】ウン・イ・チョ
(72)【発明者】
【氏名】テ・ヨン・キム
(72)【発明者】
【氏名】ヘ・リム・パク
【審査官】上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５２４２５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５３１５６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０２０－１４６０３３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３２０３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Human Gene Therapy，2013年，Vol.24, No.12，p.A169
【文献】Molecular Therapy，2013年，Vol.21, No.3，pp.688-695
【文献】Nature Biotechnology，2004年，Vol.22, No.5，pp.589-594
【文献】Scientific Reports，2015年，Vol. 5, Article Number 16273，pp.1-10
【文献】Scientific Reports，2015年，Vol.5, Article Number 12315，pp.1-13
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ９／００
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）ｍＲＮＡを標的とするトランススプライシングリボザイムであって、前記リボザイムは、［５’－ＴＥＲＴ ｍＲＮＡ標的トランススプライシングリボザイム－がん治療用遺伝子－自己切断ペプチド遺伝子－免疫チェックポイント阻害剤遺伝子－３’］の構造を有し、
前記トランススプライシングリボザイムは、グループ１イントロンリボザイムであり、
前記がん治療用遺伝子は、免疫チェックポイント阻害剤遺伝子とは区別されるものである、トランススプライシングリボザイム。
【請求項2】
前記治療用遺伝子は、薬剤感受性遺伝子、アポトーシス遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞毒性遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、サイトカイン遺伝子及び抗新生血管生成遺伝子からなる群より選ばれる１種の遺伝子である、請求項１に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項3】
前記薬剤感受性遺伝子は、ＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）である、請求項２に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項4】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、ＫＩＲ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４７、ＶＩＳＴＡ又はＡ２ａＲの阻害剤である、請求項１に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項5】
前記トランススプライシングリボザイムは、３’末端位置にマイクロＲＮＡ－１２２ａ（ｍｉＲ－１２２ａ）の一部又は全部と相補的な配列を１コピー（ｃｏｐｙ）以上さらに含むものである、請求項１に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項6】
前記自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａである、請求項１に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項7】
請求項１、２、５及び６のいずれか一項に記載のトランススプライシングリボザイムを含む非ウイルス性遺伝子送達システム。
【請求項8】
請求項１、２、５及び６のいずれか一項に記載のトランススプライシングリボザイムを発現できる発現ベクター。
【請求項9】
前記発現ベクターは、前記リボザイム遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターをさらに含むものである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項10】
請求項８又は９に記載の発現ベクターを発現する遺伝子送達システム。
【請求項11】
請求項８又は９に記載の発現ベクターに形質転換された細胞。
【請求項12】
請求項１に記載のトランススプライシングリボザイム；請求項７に記載の非ウイルス性遺伝子送達システム；請求項８又は請求項９に記載の発現ベクター；及び請求項１０に記載の遺伝子送達システム；からなる群より選ばれるいずれか１つを有効成分として含むがん治療用医薬組成物。
【請求項13】
前記医薬組成物は、経口又は注射剤の形態で静脈内、動脈内、がん組織内、又は皮下の経路で投与されるものである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記がんは、肝がん、膠芽腫、胆道がん、肺がん、膵膓がん、黒色腫、骨がん、乳房がん、大膓がん、胃がん、前立腺がん、白血病、子宮がん、卵巣がん、リンパ腫、及び脳がんからなる群より選ばれる１種以上のがんである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記がんは免疫チェックポイント阻害剤耐性がんであることを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項16】
請求項１２に記載の組成物をヒトを除く個体に投与するステップを含む、がん治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、がん細胞で免疫チェックポイント阻害剤を発現するがん特異的トランス－スプライシングリボザイム及びこの用途に関する。
【背景技術】
【0002】
医学技術の発展に伴い、がん治療技術も引き続き開発されている。特に、最近、人体の免疫システムを用いて開発されたがん免疫療法の治療効果が立証され、既存の化学治療剤及び標的治療剤を使用していた抗がん治療療法は、免疫治療剤を利用するがん免疫療法にパラダイム転換が進められている。
【0003】
通常行われている抗がん治療は、手術による腫瘍切除法である。このとき、切除前の腫瘍サイズの縮小又は切除後の残存がん細胞の死滅及び再発防止を目的として放射線治療及び化学治療が併行される。第１世代抗がん剤（１９７０年代以降）と呼ばれる放射線治療及び化学治療は、がん細胞が無限に分裂増幅する過程を妨害してがん細胞の死滅を誘導する。しかし、放射線治療と化学治療法は、がん細胞だけでなく、正常細胞の死滅も誘導する副作用があった。
【0004】
２０００年代に入って正常細胞と区分してがん細胞のみを選択的に攻撃する標的抗がん剤が開発され、前記第１世代抗がん治療剤の副作用を大幅に減らすことができる第２世代抗がん剤と呼ばれた。特定の標的タンパク質にのみ作用する標的抗がん剤は、がんを誘発するタンパク質にのみ作用してがん細胞を選択的に抑制することで治療効果を示す。したがって、がんの種類によって誘発タンパク質又は治療効果を示すタンパク質が異なるため、標的タンパク質の種類に合う抗がん剤を使用しなければならない。標的抗がん剤のもう一つの限界点は、がん細胞が標的抗がん剤に対して耐性を獲得する機作を有することである。すなわち、がん細胞自身が標的抗がん剤の標的にならないように突然変異を起こし、抗がん剤回避能力を獲得するため、標的抗がん剤ががん細胞として認識されないこともある。
【0005】
第３世代抗がん剤である免疫抗がん剤は、人体の免疫体系を活性化させて自己免疫力を高め、兔疫細胞ががん細胞を攻撃して除去するようにする。免疫抗がん剤によってがん細胞攻撃機能が向上した兔疫細胞は、がん細胞がその機能及び性質を完全に変えない限り、初めて攻撃したがん細胞を記憶し、持続的に攻撃する。
【0006】
免疫抗がん剤は、大きく免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、兔疫細胞治療剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）、治療用抗体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）及び抗がんワクチン（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ）に分類することができる。免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞抑制に関与する免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）の活性を遮断してＴ細胞を活性化させることでがん細胞を攻撃する薬剤であって、代表的にＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１などを認識する抗体を使用する。
【0007】
しかし、免疫抗がん剤に対するがん患者の反応率はまだ１５～４５％のレベルにとどまっており、がんの種類及び患者によって反応率が異なり、がんだけでなく、皮膚及び胃腸関係、甲状腺及び副腎など体内の様々な臓器に影響を及ぼし、副作用がますます報告されている実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、上記のような問題を解決するためのものであって、免疫チェックポイント阻害剤遺伝子を含む２以上の異なるがん治療用遺伝子を含むトランススプライシングリボザイム、前記リボザイムを発現できるベクター及び遺伝子送達システムを提供することに目的がある。
【0009】
また、前記トランススプライシングリボザイムは、がん特異的遺伝子を標的してがん細胞で能動的に作動できるところ、本発明は、前記リボザイム、ベクター、又は遺伝子送達システムのがん治療用途提供を目的とする。
【0010】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、上記で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当該技術分野における通常の技術者に明確に理解できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【0011】
上記課題を解決するために、本発明は、がん特異的遺伝子を標的とするトランススプライシングリボザイムであって、前記リボザイムは、３’エクソンに連結された目的遺伝子を含み、前記目的遺伝子は免疫チェックポイント阻害剤遺伝子を含む２以上のがん治療用遺伝子であることを特徴とする、トランススプライシングリボザイムを提供する。
【0012】
本発明の一実施形態として、前記トランススプライシングリボザイムは、５’－ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅ－がん治療用遺伝子－免疫チェックポイント阻害剤遺伝子－３’の構造を有し得る。
【0013】
本発明の他の実施形態として、前記２以上のがん治療用遺伝子のうち１種は、免疫チェックポイント阻害剤を暗号化する遺伝子であり、もう一つは、これと区別されるがん治療用遺伝子であって、薬剤感受性遺伝子、アポトーシス遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞毒性遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、サイトカイン遺伝子及び抗新生血管生成遺伝子からなる群より選ばれる１種であってもよい。
【0014】
本発明の他の実施形態として、前記薬剤感受性遺伝子は、ＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）であってもよく、配列番号５の塩基配列からなるか、これを含んでもよい。
【0015】
本発明の他の実施形態として、前記がん特異的遺伝子は、ＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡ、ＡＦＰ（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｍＲＮＡ、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＣＫＡＰ２（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）ｍＲＮＡ及び突然変異ＲＡＳ（Ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ）ｍＲＮＡからなる群より選ばれる１種であってもよい。
【0016】
本発明の一実施例によると、前記ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅは、ＴＥＲＴ遺伝子を標的とすることができ、配列番号４の塩基配列からなるか、これを含んでもよい。
【0017】
本発明の他の実施形態として、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、ＫＩＲ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４７、ＶＩＳＴＡ又はＡ２ａＲの阻害剤であってもよい。
【0018】
本発明の他の実施形態として、前記トランススプライシングリボザイムは、３’末端位置にマイクロＲＮＡ－１２２ａ（ｍｉＲ－１２２ａ）の一部又は全部と相補的な配列をさらに含んでもよく、配列番号６の塩基配列を含んでもよく、前記配列が２～１０回繰り返された配列を含んでもよい。
【0019】
本発明の他の実施形態として、前記トランススプライシングリボザイムにおいて免疫チェックポイント阻害剤遺伝子とこれを除くがん治療用遺伝子は、自己切断ペプチド（ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）を暗号化する遺伝子に連結され得る。
【0020】
本発明の他の実施形態として、前記自己切断ペプチドはＰ２Ａであってもよく、配列番号７の塩基配列で暗号化されてもよい。
【0021】
また、本発明は、前記トランススプライシングリボザイムを発現できる発現ベクターを提供する。
【0022】
本発明の一実施形態として、前記発現ベクターは、前記リボザイム遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターをさらに含むことができ、前記プロモーターは組職特異的に作動するプロモーターであってもよい。
【0023】
また、本発明は、前記発現ベクターを含む遺伝子送達システムと前記発現ベクターに形質転換された細胞を提供する。
【0024】
また、本発明は、前記トランススプライシングリボザイム、前記発現ベクター、及び前記遺伝子送達システムからなる群より選ばれる１種以上を有効成分として含むがん治療用医薬組成物を提供する。
【0025】
また、本発明は、前記トランススプライシングリボザイム、前記発現ベクター、及び前記遺伝子送達システムからなる群より選ばれる１種以上を個体に投与するステップを含むがん治療方法を提供する。
【0026】
さらに、本発明は、抗がん剤製造のための前記トランススプライシングリボザイム、前記発現ベクター、及び／又は前記遺伝子送達システムの用途を提供する。
【0027】
本発明の一実施形態として、前記医薬組成物及び抗がん剤は、経口又は注射剤の形態で静脈内、動脈内、がん組織内及び／又は皮下を経路で投与されるものであってもよく、前記がん治療方法においても個体への投与は前記の経路で投与されるものであってもよい。
【0028】
本発明の他の実施形態として、前記がんは、肝がん、膠芽腫、胆道がん、肺がん、膵膓がん、黒色腫、骨がん、乳房がん、大膓がん、胃がん、前立腺がん、白血病、子宮がん、卵巣がん、リンパ腫、及び脳がんからなる群より選ばれる１種以上のがんであってもよい。
【0029】
本発明の他の実施形態として、前記がんは、免疫チェックポイント阻害剤耐性がんであってもよい。
【発明の効果】
【0030】
本発明によるトランス－スプライシングリボザイムは、正常組職には作用せず、がん組職で特異的に発現して安全性が高く、転写後レベルで発現効率に優れた特徴がある。また、本発明のリボザイムの３’エクソンには、１つ以上の目的遺伝子が連結されており、体内に導入するとがん治療遺伝子及び免疫チェックポイント阻害剤を発現して兔疫細胞の作用と活性を増加させ、発現したがん治療遺伝子と共に抗がん効能にシナジー効果を奏し、がん治療に有用に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】本発明のＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩの基本構成及び抗がんメカニズムを概略的に示す図である。ＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩとは、がん治療用遺伝子（ＨＳＶｔｋ）と免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）をがん特異的に発現し、３’末端にｍｉＲ－１２２ａに対する相補的配列（ｍｉｒ－Ｔ）を有するＴＥＲＴ標的トランス－スプライシングリボザイムを発現できるベクターである。
【図2】ＰＤ１ｓｃＦｖ（ＰＤ１に対するｓｃＦｖ）又はＰＤＬ１ｓｃＦｖ（ＰＤＬ１に対するｓｃＦｖ）を発現するＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩの構成を概略的に示す図である。
【図3】肝がん細胞株における多様なＲＺ－００１＋の細胞死誘導活性を確認し、ＲＺ－００１と同等性を確認した結果である。ＲＺ－００１＋とは、ＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩを含むベクターを発現できるウイルスベクターである。ＲＺ－００１とは、がん治療用遺伝子（ＨＳＶｔｋ）をがん特異的に発現し、３’末端にｍｉＲ－１２２ａに対する相補的配列（ｍｉｒ－Ｔ）を有するｈＴＥＲＴ標的トランス－スプライシングリボザイムを発現できるウイルスベクターである（特許登録番号；１０－２２５２４２３）。
【図4】脳腫瘍細胞株における多様なＲＺ－００１＋の細胞死誘導活性を確認し、ＲＺ－００１と同等性を確認した結果である。
【図5】肺がん細胞株及び黒色腫細胞株における多様なＲＺ－００１＋の細胞死誘導活性を確認し、ＲＺ－００１と同等性を確認した結果である。
【図6】免疫チェックポイント阻害剤であるｓｃＦｖＰＤ１（Ｎ）又はｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ）を発現する安定化細胞株を作製した後、免疫チェックポイント阻害剤の発現レベルを確認した結果である。
【図7】ヒトＰＤ１（ｈＰＤ１）又はマウスＰＤ１（ｍＰＤ１）を発現する細胞溶解物とｓｃＦｖＰＤ１を発現する安定化細胞株から回収したｓｃＦｖＰＤ１を反応させた結果である。
【図8】マウス肝がん細胞株であるＨｅｐａ１－６細胞でマウスＰＤ１（ｍＰＤ１）を発現する安定化細胞株を作製した後、ｍＰＤ１の発現如何を確認した結果である。
【図9】Ｈｅｐａ１－６細胞及びマウスＰＤ１（ｍＰＤ１）を発現するＨｅｐａ１－６細胞（Ｈｅｐａ１－６／ｍＰＤ１）各々にｍＲＺ－００１＋を処理した後、ウイルス感染の程度を確認した結果である。ｍＲＺ－００１＋とは、がん治療用遺伝子（ＨＳＶｔｋ）と免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）をがん特異的に発現し、３’末端にｍｉＲ－１２２ａに対する相補的配列（ｍｉｒ－Ｔ）を有するｍｏｕｓｅ ＴＥＲＴ標的トランス－スプライシングリボザイムを発現できるウイルスベクターである。
【図10】Ｈｅｐａ１－６、Ｈｅｐａ１－６／ｍＰＤ１及びＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞の各々にｍＲＺ－００１＋を処理した後、細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を確認した結果である。
【図11】Ｈｅｐａ１－６、Ｈｅｐａ１－６／ｍＰＤ１及びＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞の各々にｍＲＺ－００１＋を処理した後、免疫チェックポイント阻害剤の発現レベルを確認した結果を示す。
【図12】Ｈｅｐａ１－６細胞にｍＲＺ－００１＋を処理した後、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）レベルをフローサイトメーターで確認した結果を示す。
【図13】Ｈｅｐａ１－６／ｍＰＤＬ１細胞にｍＲＺ－００１＋を処理した後、アポトーシスレベルをフローサイトメーターで確認した結果を示す。
【図14】Ｈｅｐ３ｂ及びＳＮＵ３９８細胞にＲＺ－００１＋を処理した後、各細胞における目的遺伝子（ＨＳＶｔｋ及びｓｃＦｖ）の発現レベルを測定した結果である。
【図15】ＲＺ－００１＋を処理した肝がん細胞株で発現したリボザイムによってＴＥＲＴ ｍＲＮＡを標的としてトランススプライシングが発生したか否かとその発生位置を確認した結果である。
【図16】Ｈｅｐ３ｂ及びＳＮＵ３９８細胞にＲＺ－００１＋を処理し、ＰＤ１／ＰＤＬ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙを行った結果である。
【図17】ヒト肝がん細胞株であるＳＮＵ３９８とヒト脳腫瘍細胞株であるＵ８７ＭＧ各細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現を確認した結果である。
【図18】１０ＭＯＩ又は２０ＭＯＩ濃度でＲＺ－００１＋を処理したＵ８７ＭＧ細胞において免疫チェックポイント阻害剤の発現レベルを確認した結果である。
【図19】Ｕ８７ＭＧ細胞にＲＺ－００１＋の量を増加しながら処理し、ＰＤ１／ＰＤＬ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙを行った結果である。対照群としてＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（ａｎｔｉ－ＰＤＬ１）によるＰＤ１／ＰＤＬ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙを行った。
【図20】図２０Ａ～図２０Ｃは、ＰＢＭＣ－ヒト化肝がんモデルにおけるＲＺ－００１投与、ＲＺ－００１＋＿Ａｔ投与、又はＲＺ－００１とＡｔ併用投与（ＲＺ－００１／Ａｔ）による腫瘍の成長阻害及び重量減少と各投与薬物の肝毒性を確認した結果である。
【図21】oｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍ｓｙｎｇｅｎｅｉｃモデルの各薬物投与群のＭＲＩ写真である。
【図22】oｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍ｓｙｎｇｅｎｅｉｃモデルにおけるｍＲＺ－００１投与とｍＲＺ－００１＋投与による腫瘍サイズ減少の程度を比較して確認した結果である。
【図23】oｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍ｓｙｎｇｅｎｅｉｃモデルにおけるｍＲＺ－００１とｍＲＺ－００１＋投与群の血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルを確認した結果である。
【図24】xｅｎｏｇｒａｆｔ oｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍モデルにおけるＲＺ－００１＋の効果確認のための実験概略図である。
【図25】xｅｎｏｇｒａｆｔ oｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍モデルにＲＺ－００１又はＲＺ－００１＋を投与したマウスの実験経過によるＩＶＩＳ撮影イメージである。
【図26】xｅｎｏｇｒａｆｔ oｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍モデルにおけるＲＺ－００１又はＲＺ－００１＋を投与したマウスの実験経過による体重変化を確認した結果である。
【図27】xｅｎｏｇｒａｆｔ oｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍モデルにおけるＲＺ－００１又はＲＺ－００１＋の抗がん効果を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0032】
本発明者らは、以前の研究でがん特異的遺伝子、具体的には、ＴＥＲＴ ｍＲＮＡを標的とするトランススプライシングリボザイムを用いてがんの増殖及び成長を抑制し、前記リボザイムに目的遺伝子、特にがん治療用遺伝子を結合してがん細胞の死滅を誘導することによってがんを治療し得るトランススプライシングリボザイムとこれを発現するベクターを作製したことがある。
【0033】
以前の研究でトランススプライシングリボザイム発現ベクターはＣＲＴ－１２２Ｔと命名し、その基本的な構造は以下のような構造を含む。
［５’－プロモーター－ＴＥＲＴ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅ－目的遺伝子（ＨＳＶｔｋ）－ｍｉＲ－１２２Ｔ－３’］
［５’－プロモーター－ＴＥＲＴ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅ－目的遺伝子（ＨＳＶｔｋ）－ｍｉＲ－１２２Ｔ－３’］
【0034】
ＣＲＴ－１２２ＴでＳＤ／ＳＡ及びＷＰＲＥ配列が追加されたベクターを発現できるウイルスベクターをＲＺ－００１と明記し（ＫＲ１０－２２５２４２３）、ＲＺ－００１は多様ながん腫に作用して細胞死を誘導し、腫瘍の成長を抑制してがんの治療に適用可能である。
【0035】
本発明者らは、以前の研究に進み、より効果的にがんの治療が可能なトランススプライシングリボザイム開発のためにリボザイムによって発現する目的遺伝子を２種に拡大し、前記目的遺伝子に免疫チェックポイント阻害剤遺伝子を含めており、前記リボザイムを発現できるベクターとしてＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩを開発した。本発明のＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩの基本構造は、以下の通りである（図１）。
［５’－プロモーター－ＴＥＲＴ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅ－目的遺伝子－自己切断ペプチド遺伝子－免疫チェックポイント阻害剤遺伝子－ｍｉＲ－１２２Ｔ－３’］
［５’－プロモーター－ＴＥＲＴ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅ－目的遺伝子－自己切断ペプチド遺伝子－免疫チェックポイント阻害剤遺伝子－ｍｉＲ－１２２Ｔ－３’］
【0036】
一方、本明細書においてＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩが暗号化する免疫チェックポイント阻害剤によって「／」を基準として後段にターゲット免疫チェックポイントタンパク質又は免疫チェックポイント阻害剤を表記した。例えば、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）を発現するベクターはＣＲＴ－１２２Ｔ／Ａｔと表示する。
【0037】
本発明者らは、具体的な実験によってＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩは肝がん細胞株、脳腫瘍細胞株、肺がん細胞株及び黒色腫細胞株においてＣＲＴ－１２２Ｔと類似のレベルの細胞死誘導活性を示した（実施例２）。
【0038】
さらに、本発明者らは、ＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩを発現するアデノウイルス（以下、「ＲＺ－００１＋」と命名する）を作製し、具体的な実験によって多様な細胞株における作用を確認した。
【0039】
一方、本明細書においてＲＺ－００１＋はロードされたＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩの種類によって、ＲＺ－００１＋＿（ターゲット免疫チェックポイントタンパク質又は免疫チェックポイント阻害剤）に区分して表記した。例えば、ＣＲＴ－１２２Ｔ／Ａｔを含むアデノウイルスはＲＺ－００１＋＿Ａｔと表示する。
【0040】
具体的には、ＲＺ－００１＋でがん細胞を感染させた後、前記がん細胞の生存率を測定してＲＺ－００１＋感染によるアポトーシスの程度を確認し、前記ＲＺ－００１＋感染によるＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩ導入が免疫チェックポイントタンパク質と結合してその機能を遮断できる抗体を発現するのか確認し、続いて前記抗体が円滑に分泌されて作用できるのか確認した。その結果、ＲＺ－００１＋感染によってがん細胞の細胞死が増加し、前記抗体の発現が増加し、発現した抗体が十分に分泌されることを確認した（実施例５及び６）。
【0041】
続いて、本発明者らは、細胞実験で確認したＲＺ－００１＋の抗がん活性が生体内においても同様に発現できることを確認するために多様ながん動物モデルを作製してＲＺ－００１＋を投与し、腫瘍のサイズ及び重量を測定した。特に、脳腫瘍の治療薬物としての有効性評価のために、ＢＢＢなどの脳内微小環境を模倣するＯｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍モデルを作製し、脳腫瘍治療剤としてのＲＺ－００１＋の可能性を確認しようとした。その結果、肝がん動物モデル及び脳腫瘍動物モデルの両方において、ＲＺ－００１＋の処理によって腫瘍のサイズ及び重量が減少した。特に、ヒト化肝がん動物モデルにおいてＲＺ－００１＋＿Ａｔ投与群は、ＲＺ－００１とＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの併用投与群と比較して類似のレベルで腫瘍のサイズを減少させたが、肝毒性において併用投与群よりも低い肝毒性を示したところ、副作用がない、又は少ない抗がん剤として提供され得ることを確認した（実施例７）。さらに、ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ同モデルでは、ｍＲＺ－００１＋＿Ｉ（ｍＣＲＴ－１２２Ｔ＿ｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ））投与群がｍＲＺ－００１投与群と比較してより効果的な抗がん能を示した。また、ヒト由来脳腫瘍細胞を移植したＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍モデルにおいてもＲＺ－００１＋の有効な抗がん活性を確認したところ、本発明者らは細胞内でがん特異的遺伝子をターゲットとし、免疫チェックポイント阻害剤とがん治療物質を発現できるトランススプライシングリボザイムをがん治療のために提供する。
【0042】
本発明のトランススプライシングリボザイムが含む各構成とその基本構造は、以下の通りである。
［５’－がん特異的遺伝子を標的するリボザイム－目的遺伝子－自己切断ペプチド遺伝子－免疫チェックポイント阻害剤遺伝子－ｍｉＲ－１２２Ｔ－３’］
［５’－がん特異的遺伝子を標的するリボザイム－目的遺伝子－自己切断ペプチド遺伝子－免疫チェックポイント阻害剤遺伝子－ｍｉＲ－１２２Ｔ－３’］
【0043】
前記トランススプライシングリボザイムは、標的する細胞内でがん特異的遺伝子のｍＲＮＡと相補結合してその遺伝子を切断し、目的遺伝子以下の転写物を発現させ得る。
【0044】
本発明のトランススプライシングリボザイムは、５’→３’の順にがん特異的遺伝子を標的するリボザイム、目的遺伝子、自己切断ペプチド遺伝子、免疫チェックポイント阻害剤遺伝子、及びｍｉＲ－１２２Ｔを含み、各構成は、その機能を維持する範囲内で直接的又は間接的な方法で作動可能に連結されたものであってもよく、前記トランススプライシングリボザイムは、特に目的遺伝子の機能を向上させるために各構成間に調節因子をさらに含んでもよい。
【0045】
本発明で使用された「リボザイム」という用語は、酵素のように作用するＲＮＡ分子又はそのＲＮＡ分子を含むタンパク質で構成される分子であって、ＲＮＡ酵素又は触媒的ＲＮＡとも呼ばれる。明確な三次構造を有するＲＮＡ分子で化学反応を行い、触媒的又は自己触媒的特性を有する。いくつかのリボザイムは自己又は他のＲＮＡ分子を切断して活性を阻害し、他のリボザイムはリボソームのアミノトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を触媒することと知られている。このようなリボザイムには、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイム、ＶＳリボザイム及びヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）リボザイムなどが含まれ得る。
【0046】
本発明によるリボザイムは、グループＩイントロンのトランス－スプライシング反応によってがん特異的遺伝子の活性を阻害させ、選択的な抗がん効果を示すことができるだけでなく、がん治療遺伝子と接合された形態で発現してがん治療遺伝子を活性化できる。したがって、がん特異的遺伝子を不活性化し、がん治療遺伝子を活性化できる特性を示すと、いかなる形態のものも使用可能である。
【0047】
本発明によるリボザイムは、好ましくは、上述したｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを標的するリボザイムであってもよく、ｈＴＥＲＴが過剰発現するがん細胞を標的としてｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを特異的に切断して発現を抑制させ、目的遺伝子を特異的に発現させる役割を果たすことができる。
【0048】
本発明で使用された用語「トランス－スプライシング（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ）」は、異なる遺伝子からのＲＮＡを互いに連結することを意味する。好ましくは、がんに特異的なｈＴＥＲＴのｍＲＮＡを認知してトランス－スプライシングする能力が検証されたｈＴＥＲＴ標的トランス－スプライシンググループＩリボザイムを使用するものであってもよい。
【0049】
本発明で使用された「目的遺伝子」という用語は、前記リボザイムによってがん特異的遺伝子のｍＲＮＡと連結されて発現が誘導される遺伝子を意味する。
【0050】
本発明による目的遺伝子は、好ましくは、がん治療用遺伝子又はレポーター遺伝子であってもよく、最も好ましくは、がん治療用遺伝子であってもよい。
【0051】
本発明で使用された「がん治療遺伝子（ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｅ）」という用語は、がん細胞において発現時治療効果を示すポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド配列を意味する。前記がん治療遺伝子は、前記リボザイムと接合された形態で発現、又は独立して発現し、抗がん活性を示すことができる。このようながん治療遺伝子は、好ましくは、薬剤感受性遺伝子、アポトーシス遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞毒性遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、サイトカイン遺伝子、及び抗新生血管生成遺伝子からなる群より選ばれる１つ以上であってもよく、最も好ましくは、薬剤感受性遺伝子であってもよい。
【0052】
本発明では、前記がん治療遺伝子を単独で使用してもよく、又は２つ以上の遺伝子を複合的に使用してもよい。
【0053】
本発明による薬剤感受性遺伝子（ｄｒｕｇ－ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ ｇｅｎｅ）は、毒性のない前駆体（ｐｒｏｄｒｕｇ）を毒性物質に変換する酵素をコードする遺伝子であって、遺伝子が導入された細胞が死滅するため、自殺遺伝子（ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ）とも呼ばれる。すなわち、正常細胞には毒性のない前駆体を全身的に投与したとき、がん細胞のみに前駆体が毒性代謝体（ｔｏｘｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）に転換され、薬剤に対する感受性を変化させることでがん細胞を破壊させる方法である。このような薬剤感受性遺伝子は、好ましくは、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）を前駆体とするＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）遺伝子、又は５－フルオロシトシン（５－ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ、５－ＦＣ）を前駆体とする大膓菌のサイトシン脱アミノ酵素（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＣＤ）遺伝子であってもよく、最も好ましくは、ＨＳＶｔｋ遺伝子であってもよい。
【0054】
本発明によるアポトーシス遺伝子（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｇｅｎｅ）は、発現するとプログラムされた細胞死を誘導するヌクレオチド配列を指す。当業者に公知されたアポトーシス遺伝子であって、ｐ５３、アデノウイルスＥ３－１１．６Ｋ（Ａｄ２及びＡｄ５由来）又はアデノウイルスＥ３－１０．５Ｋ（Ａｄ由来）、アデノウイルスＥ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子及びカスパーゼをコードする遺伝子が含まれ得る。
【0055】
本発明による細胞増殖抑制遺伝子（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現して細胞週期途中に細胞週期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。その例として、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ－Ｒｂ融合タンパク質遺伝子、サイクリン－従属性カイネーゼ抑制因子をコードする遺伝子（例えば、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８及びｐ１９）、成長中止特異的ホメオボックス（ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｏｍｅｏｂｏｘ、ＧＡＸ）遺伝子などがあり、これらに制限されるものではない。
【0056】
本発明による細胞毒性遺伝子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現して毒性効果を示すヌクレオチド配列を指す。その例として、シュードモナス外毒素（ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、リジン毒素、ジフテリア毒素などをコードするヌクレオチド配列などがあり、これらに制限されるものではない。
【0057】
本発明による腫瘍抑制因子遺伝子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）は、標的細胞内で発現して腫瘍表現型を抑制することができるかアポトーシスを誘導することができるヌクレオチド配列を意味する。代表的には、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ－α、ＴＮＦ－α）、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ－４／Ｓｍａｄ４遺伝子、ＢＲＣＡ－１遺伝子、ＢＲＣＡ－２遺伝子、ＷＴ－１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子、ＭＭＡＣ－１遺伝子、腺腫瘍ポリープ症コイルタンパク質（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｉｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、欠損結腸腫瘍（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＭＳＣ－２遺伝子、ＮＦ－１遺伝子、染色体３ｐ２１．３に位置する鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ－１遺伝子、ＮＦ－２遺伝子、ＶＨＬ遺伝子又はｓＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１）が含まれ得る。
【0058】
本発明による抗原性遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅ）は、標的細胞内で発現し、免疫システムで認識できる細胞表面抗原性タンパク質を生産するヌクレオチド配列を指す。当業者に公知された抗原性遺伝子の例として、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）及びｐ５３が含まれ得る。
【0059】
本発明によるサイトカイン遺伝子（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現し、サイトカインを生成するヌクレオチド配列を意味する。代表的には、ＧＭＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０）、インターフェロンα、β、γ（インターフェロンα－２ｂ）及びインターフェロンα－２α－１などの融合体などが含まれ得る。
【0060】
本発明による抗－新生血管生成遺伝子（ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅ）は、発現して抗－新生血管生成因子を細胞外に放出するヌクレオチド配列を指す。その例として、アンジオスタチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれ得る。
【0061】
本発明で使用された用語「ＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）」は、単純ヘルペスウイルスから由来するチミジンリン酸化酵素を意味する。この酵素は、毒性のない前駆体（ｐｒｏｄｒｕｇ）を毒性物質に変換することによって、その遺伝子が移入された細胞を死滅させる薬剤感受性遺伝子の代表的な例である。本発明において、ＨＳＶｔｋ遺伝子は、本発明によるリボザイムに接合した形態で発現し、抗がん活性を示すがん治療遺伝子として使用され得る。このようなＨＳＶｔｋ遺伝子は、好ましくは、ジンバンク（ｇｅｎｂａｎｋ）登録番号ＡＡＰ１３９４３、Ｐ０３１７６、ＡＡＡ４５８１１、Ｐ０４４０７、Ｑ９ＱＮＦ７、ＫＩＢＥＴ３、Ｐ１７４０２、Ｐ０６４７８、Ｐ０６４７９、ＡＡＢ３０９１７、Ｐ０８３３３、ＢＡＢ８４１０７、ＡＡＰ１３８８５、ＡＡＬ７３９９０、ＡＡＧ４０８４２、ＢＡＢ１１９４２、ＮＰ＿０４４６２４、ＮＰ＿０４４４９２、ＣＡＢ０６７４７などに記載されたものであってもよい。
【0062】
本発明で使用された用語「レポーター遺伝子」は、本発明の一例による組換えベクターの導入如何又はリボザイムの発現効率をモニターするために使用される遺伝子であって、感染細胞又は組職の損傷なしにモニターすることができる遺伝子であれば制限なく使用され得る。好ましくは、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、変形された緑色蛍光タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｍＧＦＰ）、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、変形された赤色蛍光タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｍＲＦＰ）、増強された赤色蛍光タンパク質（ＥＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強された青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強された黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、藍色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）又は増強された藍色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）であってもよい。
【0063】
目的遺伝子としてレポーター遺伝子を挿入してがん細胞特異的なリボザイムの発現の程度を観察することができ、特に、本発明のリボザイムは、プロモーター及びマイクロＲＮＡ標的サイトを含んでおり、正常細胞では発現せず、がん細胞特異的に発現できる。これを用いて特定の組職でがんが発生したか否かを診断するのに適用できることは当業者に自明である。
【0064】
本明細書においてｍｉＲ－１２２の一部又は全部と相補的な塩基配列は、ｍｉＲ－１２２Ｔ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１２２ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）と命名される。本発明においてｍｉＲ－１２２Ｔは、ｍｉＲ－１２２と相補結合してｄｓＲＮＡを形成することができれば、具体的な配列に差があっても構わない。ｍｉＲ－１２２Ｔは、前記ｍｉＲ－１２２の一部又は全部と相補的な塩基配列を１回以上含むことができ、例えば、１回～１０回、好ましくは１回～５回、さらに好ましくは１回～３回繰り返して含むことができる。ｍｉＲ－１２２は正常肝細胞では正常に発現するが、肝がん細胞では発現量が減少する特徴がある。これを用いて肝がん細胞に対する敏感度及び特異度を増加させた治療剤を開発することができ、本発明では、目的遺伝子が連結されたリボザイムにｍｉＲ－１２２を認識する核酸配列を連結することで肝がん細胞特異的なリボザイムの発現が行われるようにした。
【0065】
本発明で使用された「がん特異的遺伝子」という用語は、がん細胞においてのみ特異的に発現する、又は著しく過剰発現する遺伝子を意味する。前記がん特異的遺伝子は、本発明によるリボザイムががん特異的に作用し得る特徴を付加することができる。このようながん特異的遺伝子は、好ましくは、ＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡ、ＡＦＰ（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｍＲＮＡ、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＣＫＡＰ２（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）ｍＲＮＡ、又はｍｕｔａｎｔ ＲＡＳ（Ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ）ｍＲＮＡであってもよく、さらに好ましくは、ＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡであってもよく、最も好ましくは、ｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡ配列であってもよい。本発明のトランススプライシングリボザイムは、前記がん特異的遺伝子を標的としてトランススプライシングを誘導してリボザイムと連結された目的遺伝子を発現させることで、膠芽腫細胞株、黒色腫細胞株、肝がん細胞株、及び肺がん細胞株における細胞死誘導効果を確認した。
【0066】
本発明で使用された用語「ＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）」は、がん細胞の永続性（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙ）及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）能力を調節する最も重要な酵素の１つであって、染色体に末端小粒（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）構造を形成して染色体末端を保護する役割を通じて細胞の老化を抑制する酵素を意味する。正常な細胞では、細胞が分裂するたびに末端小粒の長さが少しずつ短くなり、結局、遺伝物質が失われ、細胞が死滅する。しかし、がん細胞では、この酵素が末端小粒を継続的に延長させるため、細胞が死滅せず、がん細胞の不滅性に直接寄与することでがんを治療するのに重大な障害要素として知られている。本発明では、がん特異的遺伝子としてｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを使用することができるが、これに制限されない。
【0067】
本発明で使用された用語「遺伝子送達システム（ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）」は、目的する遺伝子及び／又は核酸配列の細胞内部への送達効率を高め、発現効率を増加させ得るシステムを意味し、ウイルス媒介システム及び非ウイルスシステムに分類することができる。
【0068】
ウイルス媒介システムは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどのウイルス性ベクターを使用し、ヒト細胞に感染を引き起こすウイルス固有の細胞内浸透メカニズムを利用するので、非ウイルス性システムよりも細胞内遺伝子送達効率が比較的高いと知られている。また、細胞内に入った後、非ウイルス性ベクターはエンドソームがリソソームと融合してからエンドリソソームで遺伝子が分解する問題点があるが、ウイルス性ベクターはリソソームを通過せず、核内に遺伝子を送達するメカニズムによって遺伝子の損失が小さいため、遺伝子送達効率が高い長所がある。
【0069】
本発明で使用され得るウイルス性ベクターは、前記組換えベクターで説明したように、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどに由来したベクターであり得る。このようなウイルス性ベクターは、ウイルス粒子に組み立てられた後、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）などの形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）方法によって細胞内部に導入することができる。
【0070】
本発明の一実施例において、遺伝子トランスポーターの例として、上述した組換えベクターを含む組換えアデノウイルスを考案した。すなわち、前記組換えアデノウイルスは、がん特異的遺伝子に特異的なトランス－スプライシングリボザイムを発現する組換えベクターを目的とする細胞（例えば、がん細胞）に送達する機能を行い、細胞内に送達された組換えベクターは、細胞内転写システムによって発現する。発現したトランス－スプライシングリボザイムは、がん細胞内に多く存在するがん特異的遺伝子の転写物にリボザイムに連結された目的遺伝子を挿入することができる。
【0071】
本明細書において、ＲＺ－００１はＣＲＴ－１２２Ｔを発現するアデノウイルスを意味し、ＲＺ－００１＋はＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩを発現するアデノウイルスを意味する。
【0072】
前記非ウイルス性システムは、核酸及び／又は遺伝子の送達媒介体としてカチオン性脂質トランスポーター又はカチオン性高分子トランスポーターなどを利用するか電気穿孔法を使用する方法である。
【0073】
カチオン性脂質トランスポーターは、主にカチオン性脂質からなるナノメートルサイズのリポソームや脂質素材ナノ粒子の正電荷を利用して負電荷である遺伝子、遺伝子を含む発現ベクター又は核酸と複合体を形成させた後、この複合体を貪食作用として細胞内に送達する方法である。細胞内に送達された複合体は、エンドソームからリソソームに一次送達された後、細胞質に出て発現する。カチオン性高分子トランスポーターは、脂質の代わりに高分子を使用することを除いて、カチオン性脂質トランスポーターと同様の方式で遺伝子を送達し、代表的なカチオン性高分子としては、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）などがある。
【0074】
したがって、本発明の組換えベクターがカチオン性脂質トランスポーター又はカチオン性高分子トランスポーターと結合して形成された複合体は、遺伝子トランスポーターとして使用され得る。
【0075】
本発明において、前記遺伝子送達システムは、上述した組換えベクターを含み、ウイルス媒介システム及び非ウイルスシステムの両方が使用されるが、ウイルス媒介システムを使用するのが望ましい。
【0076】
本発明で使用された用語「ベクター」は、過度な宿主細胞において目的遺伝子を発現できる発現ベクターであって、ベクター内に含まれた遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された調節要素を含む遺伝子構造物を指す。
【0077】
本発明で使用された用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、一般的な機能を行う核酸発現調節配列と目的とする遺伝子をコードする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることを指す。本発明のリボザイム又はベクターにおける各構成は、直接的な連結であると明示しない限り、互いに作動可能に連結されたものとみなされる。
【0078】
例えば、リボザイム暗号化配列をプロモーターに作動可能に連結させると、リボザイム暗号化配列の発現はプロモーターの影響又は調節下にあるようになる。２つの核酸配列（リボザイム暗号化配列及びこの配列の５’末端のプロモーター部位配列）は、プロモーター作用が誘導されてリボザイム暗号化配列が転写されると作動可能に連結されたものであり、前記２つの配列間の連結特性がフレーム変更突然変異（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を誘導せず、発現調節配列がリボザイムの発現を阻害しないと作動可能に連結されたものとみることができる。組換えベクターとの作動可能な連結は、当該技術分野において周知の遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位－特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術分野において一般的に知られている酵素などを用いることができる。
【0079】
本発明によるベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーなどの発現調節要素に加えて、膜標的化又は分泌のためのシグナル配列又はリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造され得る。また、本発明のベクターは、細胞内でトランススプライシングリボザイムの発現レベルを増加させ得る調節因子をさらに含むことができる。リボザイムの発現増加のための調節因子の非制限的な例としては、スプライシング供与／スプライシング授与配列（ＳＤ／ＳＡ）及びＷＰＲＥがある。ベクターのプロモーターは構成的又は誘導的であり得る。さらに、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起点を含むことができる。ベクターは自己複製するか宿主ＤＮＡに統合され得る。
【0080】
本発明によるベクターは、好ましくは、プラスミドベクター、コズミドベクター又はウイルスベクターなどであってもよく、最も好ましくは、ウイルスベクターであってもよい。前記ウイルスベクターは、好ましくは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ、ＭＬＶ）、鳥肉腫／白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＡＳＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（Ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＳＮＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ、ＭＭＴＶ）など、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）、又はヘルペスシンプレックスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ、ＨＳＶ）などに由来するベクターであってもよいが、これらに制限されない。本発明による組換えベクターは、最も好ましくは、組換えアデノウイルスベクターであってもよい。
【0081】
本発明で使用された「プロモーター」という用語は、ＤＮＡの一部として転写を開示することができるようにＲＮＡ重合酵素の結合に関与する。一般的に、標的遺伝子に隣接してこの上流に位置し、ＲＮＡ重合酵素又はＲＮＡ重合酵素を誘導するタンパク質である転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）が結合する部位であって、前記酵素又はタンパク質が正しい転写開始部位に位置するように誘導することができる。すなわち、センス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）から転写しようとする遺伝子の５’部位に位置し、ＲＮＡ重合酵素が直接又は転写因子を介して該当位置に結合して標的遺伝子に対するｍＲＮＡ合成を開示するように誘導することで特定の遺伝子配列を有する。
【0082】
一方、本発明のトランススプライシングリボザイムは、様々ながん腫において細胞死誘導活性を有し、肝毒性がないか非常に低いので、がんの治療のために利用することができる。
【0083】
本発明で使用された「がん」という用語は、細胞の正常的な分裂、分化及び死滅の調節機能に問題が生じ、非正常的には過剰増殖して周囲組職及び臓器に浸潤して塊を形成し、既存の構造を破壊するか変形させた状態を意味する。
【0084】
本発明によるがんは、好ましくは、肝がん、膠芽腫、胆道がん、肺がん、膵膓がん、黒色腫、骨がん、乳房がん、大膓がん、胃がん、前立腺がん、白血病、子宮がん、卵巣がん、リンパ腫、又は脳がんであってもよく、さらに好ましくは、肝がん、肺がん、黒色腫、膠芽腫、及び／又は胆道がんであってもよく、最も好ましくは、肝がん及び／又は脳がんであってもよい。
【0085】
また、本発明によるがんは、好ましくは、がん組職で発現するｍｉＲ－１２２のコピー数（発現量）が前記医薬組成物によってがん組職で発現するリボザイムのコピー数の１００倍未満であってもよい。
【0086】
一方、本発明者らは、以前の研究で細胞死を誘導し得るｍｉＲ－１２２Ｔを保有したｈＴＥＲＴ標的リボザイムの発現量と細胞内ｍｉＲ－１２２の発現量を比較した結果、リボザイムに対するｍｉＲ－１２２の比率が高くなるほどリボザイムの発現が減少し、細胞死誘導効果が減少することを確認した。したがって、がん組職内のｍｉＲ－１２２発現量によって抗がん効果を示すためのリボザイムの量を類推してリボザイムを発現するアデノウイルスの注入量を決定することができる。具体的には、ｍｉＲ－１２２の最小コピー数がリボザイムコピー数の約１００倍以上であれば、ｍｉＲ－１２２標的部位を有するリボザイムの機能（発現）が弱くなるので、がん組職で発現するｍｉＲ－１２２のコピー数が本発明による医薬組成物によってがん組職で発現するリボザイムのコピー数の１００倍未満であれば、高い抗がん効能が得られることが分かる。
【0087】
さらに、本発明によるがんは、好ましくは、がん組職でｍｉＲ－１２２が実質的に発現しないがんであってもよい。前記「がん組職でｍｉＲ－１２２が実質的に発現しないがん」とは、がん組職でｍｉＲ－１２２が発現するが、ｍｉＲ－１２２標的部位を有するリボザイムの機能に実質的な影響を及ぼさない程度にがん組職で発現するｍｉＲ－１２２のコピー数が少ないがんを意味する。
【0088】
本発明者らは、既研究によってがん組職でｍｉＲ－１２２が実質的に発現しない大膓がん、膠芽腫、黒色腫、子宮頸部がん、肺がん、骨肉種、乳房がん及び胆道がん細胞株において本発明によるリボザイムの抗がん効能を確認した。
【0089】
本発明において免疫チェックポイント阻害剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＩＣＩ）は、Ｔ細胞の免疫機能維持のためのＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の結合阻害機能などを行うものであって、腫瘍内部に浸潤されたＴ－ｃｅｌｌの活性を抑制するＰＤ－１又はＰＤＬ－１を阻害するので、Ｔ－ｃｅｌｌの活性を最大化して抗がん効果を高めることができる。本発明は、具体的な実験で本発明のリボザイムに配列番号１～３の免疫チェックポイント阻害剤発現配列を含ませて細胞内で発現を誘導し、その機能を確認したが、Ｔ－ｃｅｌｌ活性のために免疫チェックポイントタンパク質を標的とする免疫チェックポイント阻害剤であれば制限されない。
【0090】
本発明で使用された「予防」という用語は、本発明による併用物又は医薬組成物の投与でがんを抑制するか発症を遅延させるあらゆる行為を意味する。
【0091】
本発明で使用された「治療」という用語は、本発明による併用物又は医薬組成物の投与でがんが好転するかその症状を有利に変更するあらゆる行為を意味する。
【0092】
本発明による医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。本発明の医薬組成物に使用され得る薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、カルシウムシリケート、カルシウムカーボネート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。
【0093】
本発明の医薬組成物は、目的とする方法によって経口投与又は非経口投与することができるが、非経口投与することが好ましい。
【0094】
本発明の一実施例によると、本発明による医薬組成物は、静脈内、動脈内、がん組織内又は皮下に直接投与することができ、注射剤として投与することができる。本発明による注射剤は、患者に投与時、そのまま利用できるように滅菌媒質に分散した形態であってもよく、投与時に注射用蒸溜水を加えて適切な濃度で分散させた後、投与する形態であってもよい。また、注射剤として製造されるとき、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などと混合することができ、単位投薬アンプル又は多重投薬形態で製造され得る。
【0095】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切に選択される。一方、本発明による医薬組成物は、単独で使用されるか、又は外科的手術療法などの補助治療方法と並行して使用され得る。
【0096】
以下、添付の図面を参照して実施例を詳細に説明する。しかし、実施例には様々な変更が加えられるので、特許出願の権利範囲がこれらの実施例によって制限又は限定されるものではない。実施例に対する全ての変更、均等物ないし代替物が権利範囲に含まれると理解されるべきである。
【0097】
実施例で使用した用語は単に説明を目的として使用されたものであり、限定しようとする意図として解釈されるべきではない。単数の表現は、文脈上明らかに異なる意味がない限り、複数の表現を含む。本明細書において、「含む」又は「有する」などの用語は、本明細書に記載の特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、部品又はこれらを組み合わせたものが存在することを指定しようとするものであり、１つ又はそれ以上の他の特徴や数字、ステップ、動作、構成要素、部品又はこれらを組み合わせたものの存在又は付加可能性を予め排除しないことを理解されたい。
【0098】
別途の定義がない限り、技術的又は科学的な用語を含み、ここで使用される全ての用語は、実施例が属する技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有している。一般的に使用される辞書で定義されているような用語は、関連技術の文脈上の意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本出願で明らかに定義されていない限り、理想的又は過度に形式的な意味として解釈されない。
【0099】
なお、添付図面を参照して説明するにあたって、図面符号にかかわらず同一の構成要素には同一の参照符号を付し、これに対する重複する説明は省略する。実施例を説明する際に関連した公知技術についての具体的な説明が実施例の要旨を不要に濁す恐れがあると判断される場合、その詳細な説明は省略する。
【0100】
実施例１．免疫チェックポイント阻害剤発現トランス－スプライシングリボザイムの作製
既存に作製したトランス－スプライシングリボザイムを変形した組換えベクターを考案した。具体的には、ＣＭＶプロモーターを含み、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの＋２１番ｕｒｉｄｉｎｅを含む部位を標的とし、３２６ヌクレオチド長のアンチ－センス（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ）を保有し、ｍｉＲ１２２標的部位であるｍｉＲ－１２２Ｔを有し、治療遺伝子としてＨＳＶ－ｔｋを保有するトランス－スプライシングリボザイム発現コンストラクトでＨＳＶ－ｔｋの末端にペプチド切断部位をコードする核酸配列であるＰ２Ａと免疫チェックポイント阻害剤発現配列をさらに導入した。
既存に作製したトランス－スプライシングリボザイムを変形した組換えベクターを考案した。具体的には、ＣＭＶプロモーターを含み、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの＋２１番ｕｒｉｄｉｎｅを含む部位を標的とし、３２６ヌクレオチド長のアンチ－センス（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ）を保有し、ｍｉＲ１２２標的部位であるｍｉＲ－１２２Ｔを有し、治療遺伝子としてＨＳＶ－ｔｋを保有するトランス－スプライシングリボザイム発現コンストラクトでＨＳＶ－ｔｋの末端にペプチド切断部位をコードする核酸配列であるＰ２Ａと免疫チェックポイント阻害剤発現配列をさらに導入した。
【0101】
免疫チェックポイント阻害剤としては、当技術分野で公知されたＰＤ１抗体、ＰＤＬ１抗体配列を応用して作製したｓｃＦｖＰＤ１（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＰＤ１）とｓｃＦｖＰＤＬ１を利用した。本発明では、ｓｃＦｖＰＤ１はアミノ酸配列に差がある２種抗体を使用し、各２種抗体を暗号化する遺伝子は、配列番号１及び２に示した（以下、各々ｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ）及びｓｃＦｖＰＤ１（Ｎ）と記載する）。また、ｓｃＦｖＰＤＬ１を暗号化する遺伝子配列は、配列番号３に示した（以下、ｓｃＦｖＰＤＬ１（Ａ）と記載する）。
【0102】
免疫チェックポイント阻害剤の末端には、フラッグタッグ（ＦＬＡＧ Ｔａｇ）配列を導入し、コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の３’末端部位には３コピー（ｃｏｐｙ）のｍｉＲ－１２２Ｔを挿入してｍｉＲ－１２２によってリボザイムの発現が調節できるようにした。
【0103】
一方、リボザイムがマウスＴＥＲＴ（ｍＴＥＲＴ）ｍＲＮＡの＋６７番ｕｒｉｄｉｎｅを含む部位を標的し、１００ヌクレオチド長のアンチ－センスを保有することのみを除いて、前記と同一の構成を含む組換えベクター（ｍＣＲＴ－１２２Ｔ／免疫チェックポイント阻害剤）も作製した。
【0104】
考案されたトランス－スプライシングリボザイムの発現ベクターはｍＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩと命名し、このベクター構造を図２に示した。
【0105】
一方、以下の実験では、以前の研究で作製されたｍＣＲＴ－１２２ＴとｍＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩの活性を比較して確認し、ｍＣＲＴ－１２２Ｔの構造は以下の通りである。
５’－ＣＭＶプロモーター－ｍＴＥＲＴ ｒｉｂｏｚｙｍｅ－ＨＳＶｔｋ－ｍｉＲ－１２２Ｔ（３Ｘ）－３’
５’－ＣＭＶプロモーター－ｍＴＥＲＴ ｒｉｂｏｚｙｍｅ－ＨＳＶｔｋ－ｍｉＲ－１２２Ｔ（３Ｘ）－３’
【0106】
一方、ＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩベクターを発現するアデノウイルスは、ＲＺ－００１＋と、ｍＣＲＴ－１２２Ｔ／ＩＣＩベクターを発現するアデノウイルスはｍＲＺ－００１＋と各々命名し、ＣＲＴ－１２２Ｔベクターを発現するアデノウイルスは、ＲＺ－００１と命名した。
【0107】
実施例２．ＲＺ－００１＋細胞死誘導実験によるＲＺ－００１と同等性の確認
２－１．ヒト肝がん細胞株における同等性の確認
以前の研究で作製されたＲＺ－００１と同等性を比較するために、ヒト肝がん細胞株における細胞死誘導実験を行った。
２－１．ヒト肝がん細胞株における同等性の確認
以前の研究で作製されたＲＺ－００１と同等性を比較するために、ヒト肝がん細胞株における細胞死誘導実験を行った。
【0108】
具体的には、ＳＮＵ３９８及びＨｅｐ３ｂを９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／１００ｕｌで分注し、翌日使用した培地を除去した後、ＦＢＳ２％培地でＲＺ－００１とＲＺ－００１＋を異なる感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、ＭＯＩ）で処理した（０．０１～１０ＭＯＩ）。ウイルス処理２４時間後、２日間隔で３回１００ｕＭ ＧＣＶを処理した。最後にＧＣＶを処理した翌日、各ウェルごとに１０ｕｌ ＥＺ－Ｃｙｔｏｘ ｒｅｇｅｎｔ（ＤＯＧＥＮ、ＥＺ－１０００）を処理し、３７℃で培養後、Ａｂｓ４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0109】
その結果、ＲＺ－００１又はＲＺ－００１＋処理濃度が増加するにつれて肝がん細胞のアポトーシスが増加することを確認し、免疫チェックポイント阻害剤遺伝子追加によるｈＴＥＲＴ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅによる細胞死誘導活性に問題がないことが分かった。また、免疫システムの部材条件であるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞株レベルでＲＺ－００１＋はＲＺ－００１とｈＴＥＲＴ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅによる活性が同等であることが分かった（図３）。
【0110】
２－２．ヒト脳腫瘍細胞株における同等性の確認
ヒト脳腫瘍細胞株Ｕ８７ＭＧを９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／１００ｕｌで分注し、翌日使用した培地を除去した後、ＦＢＳ２％培地でＲＺ－００１とＲＺ－００１＋を各々様々な濃度で処理した（０．０１～１０ＭＯＩ）。ウイルス処理２４時間後、２日間隔で３回１００ｕＭ ＧＣＶを処理した。最後にＧＣＶを処理した翌日、各ウェルごとに１０ｕｌ ＥＺ－Ｃｙｔｏｘ ｒｅｇｅｎｔ（ＤＯＧＥＮ、ＥＺ－１０００）を処理し、３７℃で培養後、Ａｂｓ４５０ｎｍで吸光度を測定した。
ヒト脳腫瘍細胞株Ｕ８７ＭＧを９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／１００ｕｌで分注し、翌日使用した培地を除去した後、ＦＢＳ２％培地でＲＺ－００１とＲＺ－００１＋を各々様々な濃度で処理した（０．０１～１０ＭＯＩ）。ウイルス処理２４時間後、２日間隔で３回１００ｕＭ ＧＣＶを処理した。最後にＧＣＶを処理した翌日、各ウェルごとに１０ｕｌ ＥＺ－Ｃｙｔｏｘ ｒｅｇｅｎｔ（ＤＯＧＥＮ、ＥＺ－１０００）を処理し、３７℃で培養後、Ａｂｓ４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0111】
Ｍｏｃｋは、ｔｒａｎｓｇｅｎｅが含まれないのでｔｒａｎｓｇｅｎｅを発現しないａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌとして使用され、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ感染による非特異的な細胞死誘導がないことを確認するためのｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして使用した。また、ＣＴは、ＣＭＶ－ＨＳＶｔｋとして、ＨＳＶｔｋによるＧＣＶリン酸化によって発生する細胞死誘導確認のためのｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして使用した。
【0112】
吸光度測定結果から、ＲＺ－００１及び全てのＲＺ－００１＋処理群で細胞死が誘導されることが確認できた。上記から全てのＲＺ－００１＋は脳腫瘍細胞においても細胞死誘導活性を示しており、特に、０．５ＭＯＩ以上では全てのＲＺ－００１＋がＲＺ－００１と同一の効果を示すことが分かる（図４）。
【0113】
２－３．肺がん細胞株及び黒色腫細胞株における同等性の確認
ヒト肺がん細胞株であるＡ５４９細胞株とヒト黒色腫細胞株Ａ３７５Ｐ及びＡ３７５ＳＭを対象にＲＺ－００１＋のアポトーシス効果を確認しようとした。各細胞株を９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／１００ｕｌで分注し、翌日使用培地をＦＢＳ２％培地に交換した後、ＲＺ－００１＋を濃度を異にして処理した。ウイルス処理翌日から２日間隔で３回１００ｕＭ濃度のＧＣＶを処理し、最後にＧＣＶ処理２４時間後、各ウェルに１０ｕｌ ＥＺ－Ｃｙｔｏｘ ｒｅｇｅｎｔ（ＤＯＧＥＮ、ＥＺ－１０００）を処理して３７℃で培養し、Ａｂｓ４５０ｎｍで吸光度を測定した。
ヒト肺がん細胞株であるＡ５４９細胞株とヒト黒色腫細胞株Ａ３７５Ｐ及びＡ３７５ＳＭを対象にＲＺ－００１＋のアポトーシス効果を確認しようとした。各細胞株を９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／１００ｕｌで分注し、翌日使用培地をＦＢＳ２％培地に交換した後、ＲＺ－００１＋を濃度を異にして処理した。ウイルス処理翌日から２日間隔で３回１００ｕＭ濃度のＧＣＶを処理し、最後にＧＣＶ処理２４時間後、各ウェルに１０ｕｌ ＥＺ－Ｃｙｔｏｘ ｒｅｇｅｎｔ（ＤＯＧＥＮ、ＥＺ－１０００）を処理して３７℃で培養し、Ａｂｓ４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0114】
その結果、ＲＺ－００１＋は黒色腫細胞と肺がん細胞のアポトーシスを誘導し、１ＭＯＩ以上でＲＺ－００１＋＿ＰＤ１（Ｉ）を除くＲＺ－００１＋がＲＺ－００１と類似のレベルの細胞死誘導活性を示すことが分かった（図５）。
【0115】
実施例３．免疫チェックポイント阻害剤発現安定化細胞株の作製
３－１．安定化細胞株の作製
上記実施例１で作製したベクターの効果を確認する前に、免疫チェックポイント阻害剤を発現する安定化細胞株（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を下記のように作製した。
３－１．安定化細胞株の作製
上記実施例１で作製したベクターの効果を確認する前に、免疫チェックポイント阻害剤を発現する安定化細胞株（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を下記のように作製した。
【0116】
２９３Ａ細胞を３５ｍｍの培養皿に２×１０５個分注した後、３７℃５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。その後、各々の免疫チェックポイント阻害剤発現ベクター１μｇとＯｐｔｉ－ＭＥＭ １００ｕｌを１．５ｍｌチューブに入れて混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ５ｕｌと無血清培地１００ｕｌを別の１．５ｍｌチューブに入れて混合した後、５分間常温に放置した。その後、前記２つのチューブの内容物を混合し、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）形態の複合体を形成するために２０分間常温で保管した。２０分後、チューブを１０秒間遠心分離した後、各々の細胞の上に振りかけて形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、４時間後、新しい培地に交換した。３７℃５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した後、１Ｘ ＰＢＳで細胞を洗浄し、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）を処理して細胞を引き離した後、１００ｍｍの培養皿に移して培養した。２日～３日に一回ずつ、抗生剤であるジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｇ４１８）を５μｇ／ｍｌの濃度で含む培地に交換した。細胞クローンを選別して各々を育てた後、免疫チェックポイント阻害剤の発現如何を確認した。
【0117】
細胞上澄み液からタンパク質を分離してウエスタンブロッティングを行い、細胞からＲＮＡを抽出してＲＴ－ＰＣＲで免疫チェックポイント阻害剤の発現レベルを確認した。
【0118】
３－２．免疫チェックポイント阻害剤の発現如何及び親和度の確認
前記３－１で作製した安定化細胞株を培養した後、細胞上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）からタンパク質を分離してウエスタンブロッティングを行い、細胞からＲＮＡを抽出してＲＴ－ＰＣＲで免疫チェックポイント阻害剤の発現如何を確認した。
前記３－１で作製した安定化細胞株を培養した後、細胞上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）からタンパク質を分離してウエスタンブロッティングを行い、細胞からＲＮＡを抽出してＲＴ－ＰＣＲで免疫チェックポイント阻害剤の発現如何を確認した。
【0119】
【0120】
３－３．発現したｓｃＦｖＰＤ１の親和度の確認
ヒトＰＤ１（ｈＰＤ１）又はマウスＰＤ１（ｍＰＤ１）を発現する細胞を培養して細胞溶解物を製造し、これを９６－ウェルプレートに付着させた。その後、前記２－１の安定化細胞株培養液から回収したｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ）と反応させて抗体親和度をＥＬＩＳＡ方法で確認した。対照群としては２９３Ａ細胞培養液を使用した。その結果、細胞溶解物の濃度が増加するほど吸光度が増加することを確認し、ｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ）が抗体としてよく機能することが分かった（図７）。
ヒトＰＤ１（ｈＰＤ１）又はマウスＰＤ１（ｍＰＤ１）を発現する細胞を培養して細胞溶解物を製造し、これを９６－ウェルプレートに付着させた。その後、前記２－１の安定化細胞株培養液から回収したｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ）と反応させて抗体親和度をＥＬＩＳＡ方法で確認した。対照群としては２９３Ａ細胞培養液を使用した。その結果、細胞溶解物の濃度が増加するほど吸光度が増加することを確認し、ｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ）が抗体としてよく機能することが分かった（図７）。
【0121】
３－４．マウスＰＤＬ１発現安定化細胞株の作製
がん治療遺伝子と免疫チェックポイント阻害剤同時発現の併用効果を確認するために、上記実施例２－１と同一の方法でマウスＰＤＬ１（ｍＰＤＬ１）を発現する安定化細胞株を作製した。簡単に説明すると、マウス由来肝がん細胞株であるＨｅｐａ１－６細胞株にｍＰＤＬ１／ｐＣＭＶ６を導入し、ジェネティシンを処理して３週間細胞クローンを選別した。選別された細胞クローンを培養してｍＰＤＬ１の発現レベルを確認した結果、他のマウス肝がん細胞株（Ｈｅｐａ１－６、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７）と比較して高レベルでｍＰＤＬ１が発現することが確認できた（図８）。
がん治療遺伝子と免疫チェックポイント阻害剤同時発現の併用効果を確認するために、上記実施例２－１と同一の方法でマウスＰＤＬ１（ｍＰＤＬ１）を発現する安定化細胞株を作製した。簡単に説明すると、マウス由来肝がん細胞株であるＨｅｐａ１－６細胞株にｍＰＤＬ１／ｐＣＭＶ６を導入し、ジェネティシンを処理して３週間細胞クローンを選別した。選別された細胞クローンを培養してｍＰＤＬ１の発現レベルを確認した結果、他のマウス肝がん細胞株（Ｈｅｐａ１－６、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７）と比較して高レベルでｍＰＤＬ１が発現することが確認できた（図８）。
【0122】
以下、ｍＰＤＬ１が導入されたＨｅｐａ１－６安定化細胞株は、Ｈｅｐａ１－６／ｍＰＤＬ１と記載する。
【0123】
実施例４．Ｈｅｐａ１－６安定化細胞株におけるＲＺ－００１＋発現ベクターの効果の確認
４－１．感染テスト
Ｈｅｐａ１－６又はＨｅｐａ１－６／ｍＰＤＬ１細胞株に、上記実施例１で作製したｍＲＺ－００１＋を１０ＭＯＩ濃度で処理した。
４－１．感染テスト
Ｈｅｐａ１－６又はＨｅｐａ１－６／ｍＰＤＬ１細胞株に、上記実施例１で作製したｍＲＺ－００１＋を１０ＭＯＩ濃度で処理した。
【0124】
使用したベクターは、以下の通りである。
ｍＣＲＴ－１２２Ｔ（ＣＭＶプロモーター＋ｍＴＥＲＴリボザイム＋ＨＳＶｔｋ＋ｍｉＲ－１２２Ｔ（３Ｘ））、
ｍＣＲＴ－１２２Ｔ／ｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ）（ＣＭＶプロモーター＋ｍＴＥＲＴリボザイム＋ＨＳＶｔｋ＋ｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ）＋ｍｉＲ－１２２Ｔ（３Ｘ））、
ウイルス処理２４時間後に細胞からｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを抽出し、Ｅ４を標的するＲＴ－ＰＣＲを行ってウイルス感染の程度を確認した。
ｍＣＲＴ－１２２Ｔ（ＣＭＶプロモーター＋ｍＴＥＲＴリボザイム＋ＨＳＶｔｋ＋ｍｉＲ－１２２Ｔ（３Ｘ））、
ｍＣＲＴ－１２２Ｔ／ｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ）（ＣＭＶプロモーター＋ｍＴＥＲＴリボザイム＋ＨＳＶｔｋ＋ｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ）＋ｍｉＲ－１２２Ｔ（３Ｘ））、
ウイルス処理２４時間後に細胞からｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを抽出し、Ｅ４を標的するＲＴ－ＰＣＲを行ってウイルス感染の程度を確認した。
【0125】
その結果、各試験群においてＥ４のＣｔ平均値が類似のレベルで現れることが確認できた（図９）。
【0126】
４－２．細胞生存率の確認
Ｈｅｐａ１－６、Ｈｅｐａ１－６／ｍＰＤＬ１及びＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞の各々を９６－ウェルに１×１０４個分注した後、上記実施例１で作製したｍＲＺ－００１＋発現ベクターを含むアデノウイルスを異なるＭＯＩで処理した。アデノウイルス処理２４時間後、ＧＣＶ（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）を細胞培養液に希釈して最終濃度１００μＭにした後、各ウェルに添加した。２日間隔で合計３回のＧＣＶを処理し、最後にＧＣＶ処理２４時間後にＭＴＳ ａｓｓａｙ試薬を入れた後、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定して細胞生存率を確認した。
Ｈｅｐａ１－６、Ｈｅｐａ１－６／ｍＰＤＬ１及びＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞の各々を９６－ウェルに１×１０４個分注した後、上記実施例１で作製したｍＲＺ－００１＋発現ベクターを含むアデノウイルスを異なるＭＯＩで処理した。アデノウイルス処理２４時間後、ＧＣＶ（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）を細胞培養液に希釈して最終濃度１００μＭにした後、各ウェルに添加した。２日間隔で合計３回のＧＣＶを処理し、最後にＧＣＶ処理２４時間後にＭＴＳ ａｓｓａｙ試薬を入れた後、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定して細胞生存率を確認した。
【0127】
確認の結果、対照群（ＥＧＦＰ）と比較してリボザイム発現ベクターを処理した実験群でアポトーシスが増加することが分かり、特に、ｍＣＲＴ－１２２Ｔ処理群と比較して免疫チェックポイント阻害剤発現ベクター処理群（ｍＣＲＴ－１２２Ｔ／ｓｃＦｖＰＤ１（Ｉ））でアポトーシスレベルが著しく高いことが確認できた（図１０）。
【0128】
４－３．ＰＤ１又はＰＤＬ１抗体の発現比較
Ｈｅｐａ１－６、Ｈｅｐａ１－６／ｍＰＤＬ１及びＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞に免疫チェックポイント阻害剤発現ベクターを含むアデノウイルスを５０ＭＯＩで処理し、２４時間後に細胞からタンパク質を分離して免疫チェックポイント阻害剤の発現レベルを確認した。タンパク質の予想サイズは、シグナルペプチドを含めて約２８ｋＤａである。
Ｈｅｐａ１－６、Ｈｅｐａ１－６／ｍＰＤＬ１及びＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞に免疫チェックポイント阻害剤発現ベクターを含むアデノウイルスを５０ＭＯＩで処理し、２４時間後に細胞からタンパク質を分離して免疫チェックポイント阻害剤の発現レベルを確認した。タンパク質の予想サイズは、シグナルペプチドを含めて約２８ｋＤａである。
【0129】
確認の結果、３種の細胞株のいずれにも免疫チェックポイント阻害剤が発現した（図１１）。
【0130】
４－４．アポトーシスの効能
Ｈｅｐａ１－６及びＨｅｐａ１－６／ｍＰＤＬ１細胞の各々を６－ウェルプレートに２×１０５個ずつ分注し、ｍＲＺ－００１＋発現ベクターを含むアデノウイルスを５ＭＯＩで処理した。ウイルス処理２４時間後にＧＣＶを細胞培養液に希釈して最終濃度１００μＭにした後、各ウェルに添加した。２４時間さらに培養した後、プロピジウムヨージド（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、ＰＩ）を各ウェルに処理してフローサイトメーターでアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の程度を分析した。
Ｈｅｐａ１－６及びＨｅｐａ１－６／ｍＰＤＬ１細胞の各々を６－ウェルプレートに２×１０５個ずつ分注し、ｍＲＺ－００１＋発現ベクターを含むアデノウイルスを５ＭＯＩで処理した。ウイルス処理２４時間後にＧＣＶを細胞培養液に希釈して最終濃度１００μＭにした後、各ウェルに添加した。２４時間さらに培養した後、プロピジウムヨージド（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、ＰＩ）を各ウェルに処理してフローサイトメーターでアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の程度を分析した。
【0131】
分析の結果、Ｈｅｐａ１－６及びＨｅｐａ１－６／ｍＰＤＬ１細胞のいずれもｍＣＲＴ－１２２Ｔベクター処理群ではＧＣＶ処理によって初期アポトーシスレベルはほとんど変化がないが、免疫チェックポイント阻害剤発現ベクター処理群では、ＧＣＶ処理後、初期アポトーシスが著しく増加することが分かった（図１２及び図１３）。
【0132】
実施例５．ヒト肝がん細胞株におけるＲＺ－００１＋発現ベクターの導入
５－１．ＲＺ－００１＋導入による免疫チェックポイント阻害剤分泌の確認
ヒト肝がん細胞株であるＨｅｐ３ｂとＳＮＵ３９８細胞を６０π ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに１×１０６ｃｅｌｌｓ分注し、翌日使用培地をＦＢＳ２％培地に交換した後、ＲＺ－００１＋発現ベクターを含むアデノウイルスを３０ＭＯＩ処理した。ウイルス処理後、４８時間経過時の培地を１５ｍｌチューブに入れ、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離してｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅして細胞残渣を除去した。各々のサンプルを１０ｋ ｃｅｎｔｒｉｃｏｎに移し、３，０００ｒｐｍで１５～３０分間濃縮し、サンプルの総容積が５００ｕｌになるようにした。濃縮されたサンプルを５ｘ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを使用してサンプルを作製し、１００℃で５ｍｉｎの間ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎを誘導した。用意したサンプルを１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥに４０ｕｌずつロードした。各細胞はＰＢＳで洗浄して収穫し、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒを入れて４℃で２０分間処理後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上層液を取り、前記上層液を新しいチューブに移し、ＢＣＡ定量法によって定量した。定量したタンパク質は３０ｕｇ／ｗｅｌｌになるようにサンプルを作製し、上記と同様にＳＤＳ－ＰＡＧＥロードした。ＰＡＧＥ分離が終わったら、ＰＶＤＦに移し、５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｉｎ ＰＢＳ－Ｔで３０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇを進行し、ａｎｔｉ－ＦＬＡＧを１：１，０００に希釈して４℃、Ｏ／Ｎ反応させた。翌日、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、二次抗体ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ／ＨＲＰを１：２，０００に希釈して１時間反応後、ＥＣＬ ｓｏｌｕｔｉｏｎで発現量を検出した。
５－１．ＲＺ－００１＋導入による免疫チェックポイント阻害剤分泌の確認
ヒト肝がん細胞株であるＨｅｐ３ｂとＳＮＵ３９８細胞を６０π ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに１×１０６ｃｅｌｌｓ分注し、翌日使用培地をＦＢＳ２％培地に交換した後、ＲＺ－００１＋発現ベクターを含むアデノウイルスを３０ＭＯＩ処理した。ウイルス処理後、４８時間経過時の培地を１５ｍｌチューブに入れ、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離してｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅして細胞残渣を除去した。各々のサンプルを１０ｋ ｃｅｎｔｒｉｃｏｎに移し、３，０００ｒｐｍで１５～３０分間濃縮し、サンプルの総容積が５００ｕｌになるようにした。濃縮されたサンプルを５ｘ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを使用してサンプルを作製し、１００℃で５ｍｉｎの間ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎを誘導した。用意したサンプルを１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥに４０ｕｌずつロードした。各細胞はＰＢＳで洗浄して収穫し、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒを入れて４℃で２０分間処理後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上層液を取り、前記上層液を新しいチューブに移し、ＢＣＡ定量法によって定量した。定量したタンパク質は３０ｕｇ／ｗｅｌｌになるようにサンプルを作製し、上記と同様にＳＤＳ－ＰＡＧＥロードした。ＰＡＧＥ分離が終わったら、ＰＶＤＦに移し、５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｉｎ ＰＢＳ－Ｔで３０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇを進行し、ａｎｔｉ－ＦＬＡＧを１：１，０００に希釈して４℃、Ｏ／Ｎ反応させた。翌日、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、二次抗体ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ／ＨＲＰを１：２，０００に希釈して１時間反応後、ＥＣＬ ｓｏｌｕｔｉｏｎで発現量を検出した。
【0133】
その結果、ＲＺ－００１＋を処理した肝がん細胞株からｓｃＦｖが分泌されることを確認した。特に、ＲＺ－００１＋＿ＰＤＬ１（Ａｔ）で最も高いｓｃＦｖ分泌レベルを確認することができた。上記から、ＲＺ－００１＋発現ベクターが導入された細胞がｓｃＦｖを活発に分泌し、ＲＺ－００１＋ががん細胞に適用され得ることが分かる（図１４）。
【0134】
５－２．ＲＺ－００１＋導入によるトランススプライシング反応の確認
実施例５－１でアデノウイルスを処理した肝がん細胞株において、ＲＺ－００１＋がターゲットとするＴＥＲＴ ｍＲＮＡを効果的にトランススプライシングするかを確認しようとした。実施例５－１で３０ＭＯＩウイルスを処理した細胞をウイルス処理４８時間後、ＴＲＩｚｏｌを使用してＲＮＡを用意して定量した。ＲＴ ｋｉｔ（Ｇｅｎｅｔ ｂｉｏ ＃ＳＲ３０００）を使用して３ｕｇ ＲＮＡと１ｕＬ ＲＴ ｐｒｉｍｅｒを混合して反応させた（５０℃６０ｍｉｎ、７０℃１０ｍｉｎ）。下記表１のプライマープリミクス（バイオニア、＃ｋ－２６１１）を使用してＰＣＲを進行し、ＰＣＲは、９５℃３０ｓｅｃ、５９℃３０ｓｅｃ、７２℃３０ｓｅｃ条件で４０ｃｙｃｌｅを行った。次いで、増幅産物を２％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌに電気泳動してターゲットサイズのバンドを確認した。前記ターゲットサイズバンドでｇｅｌ ｅｌｕｔｉｏｎを通じてＴＡ ｖｅｃｔｏｒを使用してクローニングを進行し、塩基配列分析を行った。
実施例５－１でアデノウイルスを処理した肝がん細胞株において、ＲＺ－００１＋がターゲットとするＴＥＲＴ ｍＲＮＡを効果的にトランススプライシングするかを確認しようとした。実施例５－１で３０ＭＯＩウイルスを処理した細胞をウイルス処理４８時間後、ＴＲＩｚｏｌを使用してＲＮＡを用意して定量した。ＲＴ ｋｉｔ（Ｇｅｎｅｔ ｂｉｏ ＃ＳＲ３０００）を使用して３ｕｇ ＲＮＡと１ｕＬ ＲＴ ｐｒｉｍｅｒを混合して反応させた（５０℃６０ｍｉｎ、７０℃１０ｍｉｎ）。下記表１のプライマープリミクス（バイオニア、＃ｋ－２６１１）を使用してＰＣＲを進行し、ＰＣＲは、９５℃３０ｓｅｃ、５９℃３０ｓｅｃ、７２℃３０ｓｅｃ条件で４０ｃｙｃｌｅを行った。次いで、増幅産物を２％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌに電気泳動してターゲットサイズのバンドを確認した。前記ターゲットサイズバンドでｇｅｌ ｅｌｕｔｉｏｎを通じてＴＡ ｖｅｃｔｏｒを使用してクローニングを進行し、塩基配列分析を行った。
【0135】
【表1】
【0136】
その結果、ＲＺ－００１＋を処理した肝がん細胞株サンプルでトランス－スプライシングが起こったときに生じ得るｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅのバンドを確認することができ、前記バンドのｐｒｏｄｕｃｔ塩基配列は標的遺伝子のターゲット部位でトランススプライシングが発生したことが確認された。上記から、ＲＺ－００１＋は導入された肝がん細胞において標的遺伝子と標的部位に正確に反応してトランス－スプライシング反応が誘導できることが分かる（図１５）。
【0137】
５－３．分泌された免疫チェックポイント阻害剤のｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙの確認
続いて、ＲＺ－００１＋が導入された肝がん細胞株が分泌する免疫チェックポイント阻害剤が効果的に免疫チェックポイントタンパク質と結合してそのシグナルを遮断できるかを確認するために、ＰＤ１／ＰＤＬ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｊ１２５０）を行った。ＰＤ１／ＰＤＬ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙは、ＰＤ－１又はＰＤＬ－１免疫抗がん剤がない条件でＰＤ－１ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌの表面にあるＰＤ－１とＡＰＣ細胞又はがん細胞に存在するＰＤＬ１を結合すると、ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用がＴＣＲ媒介発光を抑制してルシフェラーゼシグナルが検出されないが、免疫抗がん剤がある条件では免疫抗がん剤の結合によってＰＤＬ１とＰＤ１の結合が妨げられ、ＴＣＲが活性化され、ＮＦＡＴ ｓｉｇｎａｌの活性化によってルシフェラーゼ遺伝子発現を誘導してルシフェラーゼシグナルが増加するシステムを利用するものである。実験は製造社の推奨プロトコルに従って行った。具体的には、ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅにＰＤＬ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を解放して用意した。翌日、細胞の培地を除去し、実施例４－１の濃縮サンプル４０ｕｌをプレートにロードし、濃縮サンプルをロードしたプレートにＰＤ－１ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌを解放し、３７℃で６時間反応を誘導した。続いて、ｂｉｏ－Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔを添加して常温で５～１０分間培養した後、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで蛍光を測定した。
続いて、ＲＺ－００１＋が導入された肝がん細胞株が分泌する免疫チェックポイント阻害剤が効果的に免疫チェックポイントタンパク質と結合してそのシグナルを遮断できるかを確認するために、ＰＤ１／ＰＤＬ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｊ１２５０）を行った。ＰＤ１／ＰＤＬ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙは、ＰＤ－１又はＰＤＬ－１免疫抗がん剤がない条件でＰＤ－１ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌの表面にあるＰＤ－１とＡＰＣ細胞又はがん細胞に存在するＰＤＬ１を結合すると、ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用がＴＣＲ媒介発光を抑制してルシフェラーゼシグナルが検出されないが、免疫抗がん剤がある条件では免疫抗がん剤の結合によってＰＤＬ１とＰＤ１の結合が妨げられ、ＴＣＲが活性化され、ＮＦＡＴ ｓｉｇｎａｌの活性化によってルシフェラーゼ遺伝子発現を誘導してルシフェラーゼシグナルが増加するシステムを利用するものである。実験は製造社の推奨プロトコルに従って行った。具体的には、ｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅにＰＤＬ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を解放して用意した。翌日、細胞の培地を除去し、実施例４－１の濃縮サンプル４０ｕｌをプレートにロードし、濃縮サンプルをロードしたプレートにＰＤ－１ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌを解放し、３７℃で６時間反応を誘導した。続いて、ｂｉｏ－Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔを添加して常温で５～１０分間培養した後、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで蛍光を測定した。
【0138】
ＲＺ－００１＋を処理した肝がん細胞株サンプルの培養液を用いて分泌された免疫抗がん剤の活性を測定した結果、ＲＺ－００１＋を処理した全ての細胞においてｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙの増加を確認することができ、上記からＲＺ－００１＋ウイルス感染によって細胞内で免疫チェックポイント阻害剤が生成され分泌されることが分かる。特に、実施例５－１の結果と対応するように、ＲＺ－００１＋＿Ａｔの場合、ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙが最も多く増加したところ、最も多い免疫抗がん剤が生成及び分泌されており、分泌された免疫抗がん剤の活性に優れていることが分かる（図１６）。
【0139】
実施例６．ヒト脳腫瘍細胞株におけるＲＺ－００１＋発現ベクターの導入
６－１．ＲＺ－００１＋が導入された細胞株におけるＰＤ－Ｌ１発現の確認
ヒト肝がん細胞株であるＳＮＵ３９８とヒト脳腫瘍細胞株であるＵ８７ＭＧを１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／１ｍＬで分注し、２日間培養する。ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒを使用して細胞をｌｙｓｉｓさせ、ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎを抽出する。抽出したｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎをＢＣＡ定量法で定量を進行し、全てのサンプルが同一のタンパク質量になるように用意し、用意したタンパク質サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードした後、ＰＶＤＦに移して５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｉｎ ＴＢＳ－Ｔで抗原抗体反応を進行し、目的とするタンパク質の発現量を測定した。
６－１．ＲＺ－００１＋が導入された細胞株におけるＰＤ－Ｌ１発現の確認
ヒト肝がん細胞株であるＳＮＵ３９８とヒト脳腫瘍細胞株であるＵ８７ＭＧを１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／１ｍＬで分注し、２日間培養する。ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒを使用して細胞をｌｙｓｉｓさせ、ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎを抽出する。抽出したｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎをＢＣＡ定量法で定量を進行し、全てのサンプルが同一のタンパク質量になるように用意し、用意したタンパク質サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードした後、ＰＶＤＦに移して５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｉｎ ＴＢＳ－Ｔで抗原抗体反応を進行し、目的とするタンパク質の発現量を測定した。
【0140】
その結果、肝がん細胞株であるＳＮＵ３９８と脳腫瘍細胞株であるＵ８７ＭＧの両方でＰＤ－Ｌ１タンパク質の発現を確認することによって、免疫チェックポイント阻害剤を発現するＲＺ－００１＋＿ＰＤＬ１の肝がん及び脳がんへの適用において有効性を提示することができる（図１７）。
【0141】
６－２．ＲＺ－００１＋導入による免疫チェックポイント阻害剤分泌の確認
上記実施例５－１と同様に、ＲＺ－００１＋発現ベクターを含むアデノウイルスに感染した脳腫瘍細胞株においてｓｃＦｖの分泌を確認した。ウイルス処理濃度のみ１０ＭＯＩ及び２０ＭＯＩで実験方法は、上記実施例５－１と同様に行った。
上記実施例５－１と同様に、ＲＺ－００１＋発現ベクターを含むアデノウイルスに感染した脳腫瘍細胞株においてｓｃＦｖの分泌を確認した。ウイルス処理濃度のみ１０ＭＯＩ及び２０ＭＯＩで実験方法は、上記実施例５－１と同様に行った。
【0142】
その結果、Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ細胞株であるＵ８７ＭＧにおいてもＲＺ－００１＋発現ベクター導入によって細胞からｓｃＦｖの分泌を確認することができ、特に、ＲＺ－００１＋＿Ａｔ発現ベクターを導入した細胞から最も多いｓｃＦｖの分泌を確認することができた（図１８）。
【0143】
６－３．分泌された免疫チェックポイント阻害剤のｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙの確認
続いて、ＲＺ－００１＋＿ＰＤＬ１（Ａｔ）発現ベクターを含むウイルスを処理した細胞の上澄み液を分離し、実施例５－３と同様にＰＤ１／ＰＤＬ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｊ１２５０）を行った。対照群としては、常用化されたａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂを利用した。
続いて、ＲＺ－００１＋＿ＰＤＬ１（Ａｔ）発現ベクターを含むウイルスを処理した細胞の上澄み液を分離し、実施例５－３と同様にＰＤ１／ＰＤＬ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｊ１２５０）を行った。対照群としては、常用化されたａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂを利用した。
【0144】
その結果、高いＭＯＩでウイルスを処理した細胞から獲得した濃縮サンプルを処理するほどｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性が増加することを確認した（図１９）。
【0145】
実施例７．ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＺ－００１＋の抗がん効果の確認
７－１．ＰＢＭＣ－ヒト化肝がんモデルにおけるＲＺ－００１＋の効果の確認
マウス異種移植皮下モデル（ｍｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｏｄｅｌ：６週齢の雄ＮＯＧ）ｍｏｕｓｅにｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ ５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄを注入してＰＢＭＣヒト化マウス（ＰＢＭＣ－ｈｕｍｉｃｅ）を作製し、７～１０日間マウスの体重及び状態を確認した後、ＳＮＵ－３９８細胞５×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μｌをｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎし、２週間飼育して肝がん腫瘍モデルを構築した。次いで、腫瘍の成長及び重量を測定し、群分離を進行して各グループ別に薬物投与を進行した。さらに、薬物の肝毒性を確認するために、ＡＳＴ／ＡＬＴレベルを測定した。
７－１．ＰＢＭＣ－ヒト化肝がんモデルにおけるＲＺ－００１＋の効果の確認
マウス異種移植皮下モデル（ｍｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｏｄｅｌ：６週齢の雄ＮＯＧ）ｍｏｕｓｅにｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ ５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄを注入してＰＢＭＣヒト化マウス（ＰＢＭＣ－ｈｕｍｉｃｅ）を作製し、７～１０日間マウスの体重及び状態を確認した後、ＳＮＵ－３９８細胞５×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μｌをｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎし、２週間飼育して肝がん腫瘍モデルを構築した。次いで、腫瘍の成長及び重量を測定し、群分離を進行して各グループ別に薬物投与を進行した。さらに、薬物の肝毒性を確認するために、ＡＳＴ／ＡＬＴレベルを測定した。
【0146】
各グループは、対照群、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ａｔ）投与群、ＲＺ－００１投与群、ＲＺ－００１＋＿Ａｔ投与群、及びＲＺ－００１及びＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ併用投与群に区分し、薬物の投与は１×１０９ＶＰ／ｈｅａｄ、４８時間の間隔で２回腫瘍内に直接投与（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ併用投与は、５ｍｇ／ｋｇ容量でウイルス投与２日後から２日間隔で３回、静脈投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。
【0147】
その結果、ＲＺ－００１、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ各々単独投与に比べて、ＲＺ－００１＋＿Ａｔで投与した場合、腫瘍サイズや重量が減少することを確認し、ＲＺ－００１及びＡｔ併用投与と同様に腫瘍が多く減少することを確認した。一方、肝毒性測定結果、ＲＺ－００１＋＿Ａｔ投与群はＡｔｚｏｌｉｚｕｍａｂ単独又は併用投与群に比べてＡＳＴ／ＡＬＴのレベルが減少し、Ａｄ－Ｍｏｃｋに比べて類似のレベルを示したところ、肝毒性が著しく抑制されることが分かる（図２０）。
【0148】
７－２．Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍モデルにおけるＲＺ－００１＋の効果の確認
免疫活性を有する５週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを痲酔し、定位的ツールを用いて頭皮を１ｃｍ正中切開した後、ブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）を基準としてａｎｔｅｒｉｏｒ １ｍｍ、ｌａｔｅｒａｌ ２．３ｍｍ、３ｍｍ深さにマウス由来脳がん細胞株（ＧＬ２６１）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄを移植してＯｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍モデルを作製した。７日後、腫瘍の成長を測定し、群分離を進行して各グループ別に薬物投与を進行した。
免疫活性を有する５週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを痲酔し、定位的ツールを用いて頭皮を１ｃｍ正中切開した後、ブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）を基準としてａｎｔｅｒｉｏｒ １ｍｍ、ｌａｔｅｒａｌ ２．３ｍｍ、３ｍｍ深さにマウス由来脳がん細胞株（ＧＬ２６１）１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄを移植してＯｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍モデルを作製した。７日後、腫瘍の成長を測定し、群分離を進行して各グループ別に薬物投与を進行した。
【0149】
薬物の投与は、以下のような容量及び用法で進行した。
【0150】
ｍＲＺ－００１とｍＲＺ－００１＋は、３×１０９ＶＰ／５ｕＬを１回腫瘍内に直接投与する。
【0151】
ＧＣＶは１００ｕｌの液量で５０ｍｇ／ｋｇ投与し、ウイルス投与終了時の翌日から１日１回、合計１０回投与する。
【0152】
実験動物群はｍＲＺ－００１投与群及びｍＲＺ－００１＋投与群に区分し、対照群としてＰＢＳ投与群に区分した。
【0153】
腫瘍サイズを測定するために、薬物投与の翌日を含む３日周期でＭＲＩ撮影を行い、腫瘍移植位置を基準として５枚のｓｌｉｃｅを選択し、ＩｍａｇｅＪシステムを用いて経時的な腫瘍の関心領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ：ＲＯＩ）分析を行った（図２１）。具体的には、ＭＲＩ映像は、Ｂｉｏｓｐｅｃ ４７／４０ ＵＳＲ（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｂｏｒｅ ｍａｇｎｅｔを使用した。撮影中、動物は痲酔された状態で映像獲得中の呼吸数、心拍数及び体温は、ａｎｉｍａｌ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ－ｇａｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを用いて観察し、体温維持のためにｗａｒｍ ｂｅｄを使用した。腫瘍成長及び成長抑制確認のための映像は１５枚の連続したａｘｉａｌ ｓｌｉｃｅをＲＡＲＥ ｓｅｑｕｅｎｃｅを使用して撮影され、関連条件は以下の通りである。
ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（ＴＲ）＝２２００ｍｓ
ｅｃｈｏ ｔｉｍｅ（ＴＥ）＝４０ｍｓ
ｓｌｉｃｅ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ＝０．７５ｍｍ
ｍａｔｒｉｘ＝１９２×１９２
ｆｌｉｐ ａｎｇｌｅ（ＦＡ）＝９０
ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｖｉｅｗ（ＦＯＶ）＝１８×１８ｍｍ２
ａｖｅｒａｇｅ＝４
ｅｃｈｏ ｔｒａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ（ＥＴＬ）＝８
ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（ＴＲ）＝２２００ｍｓ
ｅｃｈｏ ｔｉｍｅ（ＴＥ）＝４０ｍｓ
ｓｌｉｃｅ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ＝０．７５ｍｍ
ｍａｔｒｉｘ＝１９２×１９２
ｆｌｉｐ ａｎｇｌｅ（ＦＡ）＝９０
ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｖｉｅｗ（ＦＯＶ）＝１８×１８ｍｍ２
ａｖｅｒａｇｅ＝４
ｅｃｈｏ ｔｒａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ（ＥＴＬ）＝８
【0154】
腫瘍のサイズは、ｍＲＺ－００１を基準として翌日をＤａｙ １に設定し、ＧＣＶ処理と共にＤａｙ １０まで合計１０回処理による結果であり、ＰＢＳ投与群と比較して腫瘍のサイズ減少の程度を確認した。その結果、ウイルス感染によって腫瘍のサイズが減少し、ｍＲＺ－００１＋の投与は、ｍＲＺ－００１投与よりも腫瘍のサイズがより大幅に減少した（図２２）。
【0155】
一方、ｍＲＺ－００１＋投与群は対照群よりも低いＡＳＴ、ＡＬＴレベルを示したところ、処理された試料の生体内毒性が著しく低い状態であることが分かった（図２３）。
【0156】
７－３．Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ脳腫瘍モデルにおける ＲＺ－００１＋の効果の確認
上記実施例７－３に続いて、ヒト由来脳腫瘍細胞が移植された動物モデルにおいてＲＺ－００１＋の抗がん効果を確認しようとした。これに、５週齢の雄ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕｄｅマウスにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを安定的に発現するヒト由来脳腫瘍細胞Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃｉを用いて上記実施例７－３と同様の方法でマウスに移植してＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃマウス脳腫瘍モデルを作製した。７日後、ＩＶＩＳ撮影を通じて腫瘍の成長を測定し、群分離を進行して各グループ別に薬物投与を進行した（図２４）。
上記実施例７－３に続いて、ヒト由来脳腫瘍細胞が移植された動物モデルにおいてＲＺ－００１＋の抗がん効果を確認しようとした。これに、５週齢の雄ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕｄｅマウスにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを安定的に発現するヒト由来脳腫瘍細胞Ｕ８７ＭＧ－Ｌｕｃｉを用いて上記実施例７－３と同様の方法でマウスに移植してＸｅｎｏｇｒａｆｔ Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃマウス脳腫瘍モデルを作製した。７日後、ＩＶＩＳ撮影を通じて腫瘍の成長を測定し、群分離を進行して各グループ別に薬物投与を進行した（図２４）。
【0157】
薬物の投与は、以下のような容量及び用法で進行した。
【0158】
ＲＺ－００１とＲＺ－００１＋＿ＡＴは、１×１０１０ＶＰ／Ｈｅａｄを１回腫瘍内に直接投与する。
【0159】
ＧＣＶはウイルス投与終了時の翌日から１日１回、合計１０回５０ｍｇ／ｋｇ投与する。
【0160】
ウイルス投与後３日間隔でＩＶＩＳ撮影を行い、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現する腫瘍細胞の成長を追跡しており、ウイルス投与１９日後、最後にＩＶＩＳ撮影後翌日（Ｄａｙ ２０）にマウスを犠牲して剖検を行った（図２５）。各薬物の投与群のマウスは実験期間中に安定した体重を維持したところ、ＲＺ－００１＋の毒性がないか、非常に低いことが分かった（図２６）。一方、抗がん効果においてＲＺ－００１とＲＺ－００１＋の両方に優れており、特にＲＺ－００１＋＿Ａｔの抗がん能がＲＺ－００１よりも優れていることが確認できたところ、脳腫瘍においてもＲＺ－００１＋に優れた抗がん効果があることが分かる（図２７）。
【0161】
以上のように、実施例がたとえ限定された図面によって説明されているが、該当技術分野における通常の知識を有する者であれば、上記に基づいて様々な技術的修正及び変形を適用することができる。例えば、説明された技術が説明された方法とは異なる順序で行われる、及び／又は説明されたシステム、構造、装置、回路などの構成要素が説明された方法とは異なる形態で結合又は組み合わされるか、他の構成要素又は均等物によって代替又は置換されても、適切な結果が達成できる。
【0162】
したがって、他の実施形態、他の実施例及び特許請求の範囲と均等なものも、後述する特許請求の範囲に属する。
【産業上の利用可能性】
【0163】
本発明は、がん特異的遺伝子をターゲットとするトランススプライシングリボザイムは、がん治療遺伝子と免疫チェックポイント阻害剤を同時に発現して抗がん効能にシナジー効果を奏するところ、がん治療に有用に利用できると期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】