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特許7618600キャリブレータルシフェラーゼを用いるルシフェラーゼアッセイのレシオメトリック検出
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-10
(45)【発行日】2025-01-21
(54)【発明の名称】キャリブレータルシフェラーゼを用いるルシフェラーゼアッセイのレシオメトリック検出
(51)【国際特許分類】
G01N 33/532 20060101AFI20250114BHJP
C12Q 1/66 20060101ALI20250114BHJP
【ＦＩ】
G01N33/532 B
C12Q1/66 ZNA
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021576408
(86)(22)【出願日】2020-06-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-29
(86)【国際出願番号】 NL2020050406
(87)【国際公開番号】W WO2020256558
(87)【国際公開日】2020-12-24
【審査請求日】2023-04-03
(31)【優先権主張番号】62/864,583
(32)【優先日】2019-06-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/893,322
(32)【優先日】2019-08-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】501276430
【氏名又は名称】テクニーシェ・ユニバーシタイト・アイントホーベン
(74)【代理人】
【識別番号】100105924
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 賢樹
(72)【発明者】
【氏名】メルクス、マールテン
(72)【発明者】
【氏名】ニー、ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ファン イジェンドルン、レオナルドゥス ヨセフス
【審査官】北条 弥作子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０３７６３３２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１４６７９４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２００７－３３０１８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】Aldo Roda，Analytical Strategies for Improving the Robustness and reproducibility of Bioluminescent Microbial Bioreporters，Analytical and Bioanalytical Chemistry，2011年，401(1)，pp.201-211，doi: 10.1007/s00216-011-5091-3
【文献】Kazushi Suzuki，Five colour variants of bright luminescent protein for real-time multicolour bioimaging，Nat Commun.，2016年12月14日，7:13718，pp.1-10，doi: 10.1038/ncomms13718
【文献】Yan Ni，Ratiometric Bioluminescent Sensor Proteins Based on Intramolecular Split Luciferase Complementation，ACS Sens.，2019年01月25日，4(1)，pp.20-25，Published online 2018 Dec 11. doi: 10.1021/acssensors.8b01381
【文献】Amanda C. Stacer，NanoLuc Reporter for Dual Luciferase Imaging in Living Animals，12(7)，Mol Imaging.，2013年10月，12(7)，pp.1-13，available in PMC 2014 October 01
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８～３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
基質に反応して第１の波長で光を発し、所望の被検物質に反応する検出器ルシフェラーゼを含み、キャリブレータルシフェラーゼをさらに含む前記所望の被検物質のレシオメトリック定量化のための生物発光アッセイキットであって、前記キャリブレータルシフェラーゼは前記検出器ルシフェラーゼと同じルシフェラーゼドメインを有するルシフェラーゼからなる群より選択され、前記キャリブレータルシフェラーゼは同じ基質に反応して、第２の波長で光を発し、前記第２の波長は前記検出器ルシフェラーゼによって発せられる第１の波長と異なることを特徴とする生物発光アッセイキット。
【請求項2】
前記キャリブレータルシフェラーゼは、前記キャリブレータルシフェラーゼのルシフェラーゼドメインから蛍光受容体へのエネルギー移動が可能となるように前記蛍光受容体で官能化されている請求項１に記載の生物発光アッセイキット。
【請求項3】
前記蛍光受容体は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質、蛍光のタンパク質、Ｃｙ３、蛍光の染料、蛍光の量子ドット、蛍光のナノ粒子、または炭素ドットからなる群より選択される請求項２に記載の生物発光アッセイキット。
【請求項4】
前記キャリブレータルシフェラーゼは前記所望の被検物質に反応しない請求項１～３のいずれかに記載の生物発光アッセイキット。
【請求項5】
前記生物発光アッセイキットは生物発光サンドイッチイムノアッセイキット、競合イムノアッセイキット、ルシフェラーゼ活性のアロステリック調節もしくはルシフェラーゼ阻害の可逆制御に基づくセンサタンパク質、転写制御アッセイキット、タンパク質間相互作用のためのアッセイスクリーニングキット、およびＤＮＡまたはＲＮＡ検出アッセイキットからなる群より選択される請求項１～４のいずれかに記載の生物発光アッセイキット。
【請求項6】
前記検出器ルシフェラーゼおよび前記キャリブレータルシフェラーゼのルシフェラーゼドメインは、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、ＴｕｒｂｏＬｕｃルシフェラーゼおよびＡｌｕｃルシフェラーゼのルシフェラーゼドメインからなる群より選択される請求項１～５のいずれかに記載の生物発光アッセイキット。
【請求項7】
前記所望の被検物質は抗原、抗体、およびリガンドからなる群より選択される請求項１～６のいずれかに記載の生物発光アッセイキット。
【請求項8】
サンプル中の所望の被検物質を定量する方法における請求項１～７のいずれかに記載の生物発光アッセイキットの使用。
【請求項9】
サンプル中の所望の被検物質を定量する方法であって、ｉ）前記所望の被検物質を含むサンプルを提供するステップと、
ｉｉ）基質に反応して第１の波長で光を発し、前記所望の被検物質に反応する検出器ルシフェラーゼと、前記検出器ルシフェラーゼと同じルシフェラーゼドメインを有するルシフェラーゼからなる群より選択され、同じ基質に反応して第２の波長で光を発し、前記第２の波長は前記検出器ルシフェラーゼによって発せられる第１の波長と異なるキャリブレータルシフェラーゼを提供するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉ）で提供されたサンプルについて前記検出器ルシフェラーゼの生物発光強度および前記キャリブレータルシフェラーゼの生物発光強度を測定するステップと、
ｉｖ）前記検出器ルシフェラーゼの測定した生物発光強度と前記キャリブレータルシフェラーゼの生物発光強度との比率の数値を較正するステップと、
ｖ）ステップｉｖ）で較正した比率の数値に基づいて前記所望の被検物質を定量するステップと、を含む方法。
【請求項10】
前記キャリブレータルシフェラーゼは、前記キャリブレータルシフェラーゼのルシフェラーゼドメインから蛍光受容体へのエネルギー移動が可能となるように前記蛍光受容体で官能化されている請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記蛍光受容体は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質、蛍光のタンパク質、Ｃｙ３、蛍光の染料、蛍光の量子ドット、蛍光のナノ粒子、または炭素ドットからなる群より選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記キャリブレータルシフェラーゼは前記所望の被検物質に反応しない請求項９～１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
前記検出器ルシフェラーゼおよび前記キャリブレータルシフェラーゼのルシフェラーゼドメインは、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、ＴｕｒｂｏＬｕｃルシフェラーゼおよびＡｌｕｃルシフェラーゼのルシフェラーゼドメインからなる群より選択される請求項９～１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、所望の被検物質に反応する検出器ルシフェラーゼを含む所望の被検物質のレシオメトリック定量化のための生物発光アッセイに関する。本発明は、本発明の生物発光アッセイを用いてサンプル中の所望の被検物質を定量する方法、およびサンプル中の所望の被検物質を定量する方法における本発明の生物発光アッセイの使用にさらに関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質バイオマーカーなどのバイオマーカーの検出は、疾患診断および治療のモニタリングに有用なツールをもたらす。ＥＬＩＳＡなどの古典的なイムノアッセイは、多数の洗浄およびインキュベーションステップを伴う労力を要する手順に頼る。一工程の均質のイムノアッセイを与える代替の方法が、非熟練使用者による実験環境の外側で実施され得るポイント・オブ・ケア試験にとって魅力的かつ望ましい。
【0003】
スプリットタンパク質補完は、タンパク質間相互作用を調べるのに広く有効であり、抗原標的にそれぞれ結合する抗体の対にレポーター断片を配置することによってサンドイッチイムノアッセイを開発する興味深い代替法である。そのような方法では、抗原結合が断片を近づくようにし、活性レポーターを再構築させ、これが定量的に抗原の存在を示す。スプリットレポーター酵素、特にスプリットルシフェラーゼが、大きい感度により利益を得る有用な発光レポーターである。特定の有用なスプリットルシフェラーゼが、２つの断片（二元技術と呼ばれる（「ＢｉＴ」とも呼ばれる））、１８ｋＤａラージＢｉＴ（ＬＢ）および１．３ｋＤａスモールＢｉＴ（ＳＢ）に分割できる非常に安定かつ明るい青色光を生じるルシフェラーゼであるスプリットＮａｎｏＬｕｃであり、タンパク質相互作用を調べる二元補完レポーターとして設計されたものである。
【0004】
そのようなスプリットレポーター酵素、特にスプリットルシフェラーゼは、タンパク質間の相互作用およびハイスループット薬剤スクリーニングを調べる重要なレポーターシステムになっている。より一般的には、ルシフェラーゼを用いる生物発光検出は、生体内イメージングおよびポイント・オブ・ケア診断においての使用が増えている。異なった蛍光検出、生物発光は、外部励起を必要とせず、複合培地における敏感な検出に非常に適したものである。生物発光検出の難点は、信号強度が、ルシフェラーゼおよび基質の両方の濃度、生成物、並びに環境条件（温度、ｐＨおよびイオン強度を含む）を含む多くの因子によって決定されることである。基質やがて反転されることから、信号は時間に依存し、それによって、定量的な測定が困難となる。
【0005】
生物発光活性に基づく定量測定では、活性酵素量、緩衝条件、基質濃度、温度およびインキュベーション時間など、アッセイの条件に近い条件下で検量線を測定することが必要である。しかしながら、多くの用途において、これらのパラメータは正確に知られていないか、あるいは容易に制御することができない。特に、発光シグナルの時間依存性は、特にルシフェラーゼ活性が高いと、制御が困難である。そのため、酵素濃度を低くするか、または活性基質を時間と共にゆっくりと放出するケージド基質を使用することによって、ルシフェラーゼ活性を低く保つようなアッセイ条件を選択することが一つの解決策となっている。しかしながら、前者ではルシフェラーゼ濃度およびシグナル強度の範囲が限定され、後者ではさらに別の時間依存的なプロセスに依存するため、理想的な解決策にはほど遠い。このため、生物発光アッセイはこれまで半定量的であり、スクリーニングベースのアプローチには適しているが、正確な分析アプリケーションには困難であった。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、（スプリット）ルシフェラーゼに基づく生物発光アッセイの内部較正を可能にする方法を提供し、これらのアッセイが定量的な測定に使用できるようにする。本発明は、第１のルシフェラーゼ（本明細書で「レポータールシフェラーゼ」または「検出器ルシフェラーゼ」とも称される）の生物発光強度を、同じサンプルに添加され、同じルシフェラーゼドメインおよび基質を使用するが、異なる波長で光を発する第２のルシフェラーゼ（本明細書で「キャリブレータルシフェラーゼ」とも称される）に較正することによって解決法を提供する。
【0007】
アイディアは、蛍光受容体によって官能化されているアッセイに使用されるルシフェラーゼのバリアント、すなわちキャリブレータルシフェラーゼをアッセイに含ませることである。このキャリブレータルシフェラーゼは、アッセイに使用されるが、そのエネルギーは蛍光受容体に移動し、アッセイに使用される検出器ルシフェラーゼと異なる波長で発光する同じルシフェラーゼドメインを含む。キャリブレータルシフェラーゼは標的被検物質に反応しないことから、その活性（蛍光受容体の波長で発光を測定することによって決定される）は、検出器ルシフェラーゼの発光を標準化するのに使用され得る。本発明は、異なる波長で検出したキャリブレータルシフェラーゼ発光に対して１つの波長での検出器ルシフェラーゼ発光のレシオメトリック検出を用いて、生物発光アッセイおよびイメージングをより定量的なものとする一般的な解決法を提供する。このアプローチの背後の前提は、基質濃度、生成物阻害、マトリックス組成および温度の差異が、検出器ルシフェラーゼおよびキャリブレータルシフェラーゼに同程度で影響を与えることである。
【0008】
（説明）
本発明は、所望の被検物質のレシオメトリック定量化のための生物発光アッセイを提供する。所望の被検物質の時間および濃度の独立した定量化を提供するために、本発明の生物発光アッセイは、基質に反応して第１の波長で光を発する検出器ルシフェラーゼを含み、検出器ルシフェラーゼは、所望の被検物質に反応するおよびキャリブレータルシフェラーゼ。本発明のキャリブレータルシフェラーゼは同じ基質に反応して、第２の波長で光を発し、第２の波長は検出器ルシフェラーゼによって発せられる第１の波長と異なる。本発明の変形例では、キャリブレータルシフェラーゼは検出器ルシフェラーゼのバリアントであり、検出器ルシフェラーゼと同じルシフェラーゼドメインを含有する。
本発明は、所望の被検物質のレシオメトリック定量化のための生物発光アッセイを提供する。所望の被検物質の時間および濃度の独立した定量化を提供するために、本発明の生物発光アッセイは、基質に反応して第１の波長で光を発する検出器ルシフェラーゼを含み、検出器ルシフェラーゼは、所望の被検物質に反応するおよびキャリブレータルシフェラーゼ。本発明のキャリブレータルシフェラーゼは同じ基質に反応して、第２の波長で光を発し、第２の波長は検出器ルシフェラーゼによって発せられる第１の波長と異なる。本発明の変形例では、キャリブレータルシフェラーゼは検出器ルシフェラーゼのバリアントであり、検出器ルシフェラーゼと同じルシフェラーゼドメインを含有する。
【0009】
所望の被検物質に反応する検出器ルシフェラーゼと、検出器ルシフェラーゼと同じ基質に反応するキャリブレータルシフェラーゼとを含む生物発光アッセイを提供することによって、キャリブレータルシフェラーゼは、検出器ルシフェラーゼによって触媒される同じ基質の酸化を触媒することができる。例えば、検出器ルシフェラーゼが基質フリマジンの酸化（青色光を生成する）を触媒するＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼである場合、キャリブレータルシフェラーゼの対応するルシフェラーゼドメイン、例えばＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質が、同じ基質フリマジンの酸化を触媒する（緑色光を生成する）。同じルシフェラーゼドメインを有する検出器ルシフェラーゼおよびキャリブレータルシフェラーゼを用いることによって、例えば基質濃度の偏差は、検出器ルシフェラーゼの測定した生物発光強度とキャリブレータルシフェラーゼの測定した生物発光強度との比率を較正することによって、自動的に訂正される。本発明に従う検出器ルシフェラーゼを用いることによって、検出器ルシフェラーゼの測定した生物発光強度とキャリブレータルシフェラーゼの測定した生物発光強度との発光比率が経時的に安定なままであり、それ故に、検出器ルシフェラーゼおよびキャリブレータルシフェラーゼの両方によって十分な光が発せられる限り確実に検出され得る。
【0010】
検出器ルシフェラーゼと異なる波長で光を発するために、キャリブレータルシフェラーゼ蛍光受容体で官能化されて、キャリブレータルシフェラーゼのルシフェラーゼドメインから蛍光受容体へのエネルギー移動が可能となり得る。そのような蛍光受容体は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質、蛍光のタンパク質、Ｃｙ３、蛍光の染料、蛍光の量子ドット、蛍光のナノ粒子、または炭素ドットからなる群より選択され得る。例えば、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ検出器およびキャリブレータルシフェラーゼが選択される場合、青色／緑色シフトされたキャリブレータルシフェラーゼを提供するために、好ましい蛍光受容体はｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質である。代替として、青色／赤色シフトされたＮａｎｏＬｕｃキャリブレータルシフェラーゼを提供するために、好ましい蛍光受容体はＣｙ３である。
【0011】
検出器ルシフェラーゼの検出器活性による干渉を避けるために、キャリブレータルシフェラーゼは所望の被検物質に反応しない。好ましくは、最適なシステムを提供するために、応答性を除いて検出器ルシフェラーゼが所望の被検物質に反応する際に、キャリブレータルシフェラーゼは分析すべきサンプルに含まれる同じ成分に反応する。そのようなキャリブレータルシフェラーゼを提供することによって、検出器ルシフェラーゼによるサンプルに含まれる他の検体または成分へのいずれの反応も、検出器ルシフェラーゼの測定した生物発光強度とキャリブレータルシフェラーゼの測定した生物発光強度との比率を較正することによって自動的に訂正される。
【0012】
ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼドメインの使用がその明るい青色発光特性から好ましいが、他のルシフェラーゼドメインが同様に適し得る。例えば、検出器ルシフェラーゼおよびキャリブレータルシフェラーゼのルシフェラーゼドメインは、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、ＴｕｒｂｏＬｕｃルシフェラーゼおよびＡｌｕｃルシフェラーゼのルシフェラーゼドメインからなる群より選択され得る。
【0013】
分析すべきサンプルの所望の被検物質は、いずれの所望の被検物質であり得、診断または治療モニタリングに関連し得る。しかしながら、食物毒、水質および同種のものの検出などの他の用途も可能であり得る。所望の好ましい検体は、抗原、抗体、およびリガンドからなる群より選択され得る。
【0014】
生物発光アッセイのいずれのタイプも、本発明の時間独立および濃度独立定量化アッセイを提供するために使用し得る。検出器ルシフェラーゼの同じルシフェラーゼドメインを有するキャリブレータルシフェラーゼが選択される限り、分析すべきサンプルの所望の被検物質の検出および定量を確実に実施し得る。例えば、生物発光アッセイは生物発光サンドイッチイムノアッセイ、または他のタイプのイムノアッセイ（競合イムノアッセイなど）、ルシフェラーゼ活性のアロステリック調節もしくはルシフェラーゼ阻害の可逆制御に基づくセンサタンパク質、転写制御アッセイ、タンパク質間相互作用のアッセイスクリーニング、ＤＮＡもしくはＲＮＡ検出アッセイであり得る。
【0015】
本発明の態様では、本発明は、サンプル中の所望の被検物質を定量する方法における本発明に従う生物発光アッセイの使用に関する。
【0016】
本発明の更なる態様では、本発明は、サンプル中の所望の被検物質を定量する方法における本発明に従う生物発光アッセイのキャリブレータルシフェラーゼの使用に関する。
本発明の別の態様では、本発明は、サンプル中の所望の被検物質を定量する方法に関する。該方法は、
ａ）所望の被検物質を含むサンプルを提供するステップと、
ｂ）本発明に従う生物発光アッセイを提供するステップと、
ｃ）ステップａ）で提供されたサンプルについて検出器ルシフェラーゼの生物発光強度およびキャリブレータルシフェラーゼの生物発光強度を測定するステップと、
ｄ）検出器ルシフェラーゼの測定した生物発光強度とキャリブレータルシフェラーゼの生物発光強度との比率を較正するステップと、
ｅ）ステップｄ）で較正した比率に基づいて所望の被検物質を定量するステップと、を含む。
本発明の別の態様では、本発明は、サンプル中の所望の被検物質を定量する方法に関する。該方法は、
ａ）所望の被検物質を含むサンプルを提供するステップと、
ｂ）本発明に従う生物発光アッセイを提供するステップと、
ｃ）ステップａ）で提供されたサンプルについて検出器ルシフェラーゼの生物発光強度およびキャリブレータルシフェラーゼの生物発光強度を測定するステップと、
ｄ）検出器ルシフェラーゼの測定した生物発光強度とキャリブレータルシフェラーゼの生物発光強度との比率を較正するステップと、
ｅ）ステップｄ）で較正した比率に基づいて所望の被検物質を定量するステップと、を含む。
【0017】
既に上記で説明したように、上述した方法が、を提供するサンプル中の所望の被検物質を定量する着実で、信頼性のある、時間独立したおよび濃度－独立した方法を提供することを見出した。
【0018】
本発明は、サンプル中の所望の被検物質を定量する方法をさらに提供する。該方法は、
ｉ）所望の被検物質を含むサンプルを提供するステップと、
ｉｉ）基質に反応して第１の波長で光を発し、所望の被検物質に反応する検出器ルシフェラーゼと、同じ基質に反応して第２の波長で光を発し、第２の波長は検出器ルシフェラーゼによって発せられる第１の波長と異なるキャリブレータルシフェラーゼ提供するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉ）で提供されたサンプルについて検出器ルシフェラーゼの生物発光強度およびキャリブレータルシフェラーゼの生物発光強度を測定するステップと、
ｉｖ）検出器ルシフェラーゼの測定した生物発光強度とキャリブレータルシフェラーゼの生物発光強度との比率を較正するステップと、
ｖ）ステップｉｖ）で較正した比率に基づいて所望の被検物質を定量するステップと、を含む。
ｉ）所望の被検物質を含むサンプルを提供するステップと、
ｉｉ）基質に反応して第１の波長で光を発し、所望の被検物質に反応する検出器ルシフェラーゼと、同じ基質に反応して第２の波長で光を発し、第２の波長は検出器ルシフェラーゼによって発せられる第１の波長と異なるキャリブレータルシフェラーゼ提供するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉ）で提供されたサンプルについて検出器ルシフェラーゼの生物発光強度およびキャリブレータルシフェラーゼの生物発光強度を測定するステップと、
ｉｖ）検出器ルシフェラーゼの測定した生物発光強度とキャリブレータルシフェラーゼの生物発光強度との比率を較正するステップと、
ｖ）ステップｉｖ）で較正した比率に基づいて所望の被検物質を定量するステップと、を含む。
【0019】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法で使用されるキャリブレータルシフェラーゼは検出器ルシフェラーゼのバリアントであり、検出器ルシフェラーゼと同じルシフェラーゼドメインを含有する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図１Ａは、均質生物発光サンドイッチイムノアッセイの略図である。抗原の存在下、抗体結合したセンサタンパク質は抗原に結合し、活性ＮａｎｏＬｕｃの再構成を駆動する。図１Ｂは、ＴＮＦα結合抗体のスプリット－ルシフェラーゼに基づく検出を示す図である。ＮａｎｏＬｕｃのＳＢ断片は、セミフレキシブルリンカーを介して組み換え発現したＴＮＦαに融合している一方で、ＬＢ断片は光架橋性Ｇタンパク質に融合しており、アダリムマブ－ＴＮＦα複合体に特異的に結合する検出抗体への結合を可能にしている。
【図2】ＴＮＦα－ＳＢ精製および抗体－ｐＧ－ＬＢの光架橋のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図3A】アダリムマブについてのインテンシメトリックイムノアッセイを示す図である。（図３Ａ）を用いる２．５ｎＭ抗ＡＴ－ＬＢおよび２５ｎＭのＴＮＦα－ＳＢ原理証明である。青線は、すべての成分を有するアッセイを示し、他の色はコントロールを示す。すべてのアッセイは５００倍希釈したフリマジンを用いてＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液にて行った。エラーバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【図3B】アダリムマブについてのインテンシメトリックイムノアッセイを示す図である。（図３Ｂ）抗ＡＴ－ＬＢおよびＴＮＦα－ＳＢの異なる濃度を用いるアダリムマブ反応曲線である。すべてのアッセイは、５００倍希釈したフリマジンを用いてＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液にて行った。エラーバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【図4】１０ｎＭの抗ＡＴ－ＬＢおよび１００ｎＭのＴＮＦα－ＳＢを用いる１：３で希釈した血漿におけるアダリムマブについてのインテンシメトリックイムノアッセイを示す図である。青線はすべての成分を有するアッセイを示し、他の色はコントロールを示す。すべてのアッセイは、５００倍希釈したフリマジンを用いて、１：３の比率で血漿と混合したＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液にて行った。エラーバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【図5A】１０ｎＭ抗ＡＴ－ＬＢ、１００ｎＭのＴＮＦα－ＳＢおよび１００ｐＭのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを用いる１：５で希釈した血漿におけるアダリムマブのためのレシオメトリックイムノアッセイを示す図である。異なるＡＤＬ濃度での発光スペクトルを示す（図５Ａ）。青線はすべての成分を有するアッセイを示し、他の色はコントロールを示す。すべてのアッセイは、５００倍希釈したフリマジンを用いて１：５の比率で血漿と混合したＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液にて行った。エラーバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【図5B】１０ｎＭ抗ＡＴ－ＬＢ、１００ｎＭのＴＮＦα－ＳＢおよび１００ｐＭのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを用いる１：５で希釈した血漿におけるアダリムマブのためのレシオメトリックイムノアッセイを示す図である。ＡＤＬ濃度の関数としてプロットした発光比率を示す（図５Ｂ）。青線はすべての成分を有するアッセイを示し、他の色はコントロールを示す。すべてのアッセイは、５００倍希釈したフリマジンを用いて１：５の比率で血漿と混合したＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液にて行った。エラーバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【図6】種々のＡＤＬ濃度での複合体形成の反応速度をモニターするレシオメトリックアッセイを示す図である。すべてのアッセイは、５００倍希釈したフリマジンを用いて１：５の比率で血漿と混合したＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液において１０ｎＭ抗ＡＴ－ＬＢ、１００ｎＭのＴＮＦα－ＳＢおよび１００ｐＭのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを用いて行った。
【図7】ｐＧ－ＬＢのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す図である。Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（灰色）、Ｇタンパク質（赤色）、アンバー停止コドン（黄色）、ＬＢ（シアン）、Ｈｉｓ－タグ（暗赤色）。
【図8】Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＴＮＦα－ＳＢのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す図である。Ｈｉｓ－タグ（暗赤色）、ＳＵＭＯ－タグ（黄色）、ＴＮＦα（桃色）、ＳＢ（シアン）、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（灰色）。
【図9】ｐＧ－ＳＢのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す図である。Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（灰色）、Ｇタンパク質（赤色）、アンバー停止コドン（黄色）、ＳＢ（青色）、Ｈｉｓ－タグ（暗赤色）。
【図10】ｐＧ－ＳＢバリアントにおけるＳＢのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す図である。
【図11】センサタンパク質の光結合を示す図である。ＵＶ照明によるＧタンパク質媒介部位特異的な結合を示す（図１１Ａ）。Ｇタンパク質は非天然アミノ酸ＢＰＡ（赤色）を含み、セミフレキシブルリンカーを介してスプリットＮａｎｏＬｕｃ（ＬＢまたはＳＢ）に融合されている。抗体のＦｃドメインに結合し、ＵＶ光によって活性化された際、Ｇタンパク質融合タンパク質は抗体に共有結合する。１つまたは２つのＧタンパク質アダプターをＦｃドメインに光架橋できる。精製した光結合した生成物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す（図１１Ｂ）。レーン１、抗ｃＴｎＩ１９Ｃ７または４Ｃ２；レーン２、光結合した生成物；レーン３、精製した光結合したタンパク質。
【図12】抗体に対するｐＧＬＢ／ＳＢの異なるモル比を用いる光結合した生成物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１、抗体；レーン２、ｐＧ－ＬＢ／ＳＢに対する抗体の等しいモル比を用いる光結合した生成物；レーン３、抗体：ｐＧ－ＬＢ／ＳＢの１：２モル比を用いる光結合した生成物。
【図13】ｃＴｎＩのインテンシメトリックイムノアッセイを示す図である。図１３Ａは１ｎＭの１９Ｃ７－ＬＢおよび４Ｃ２－ＳＢを用いるｃＴｎＩ用量依存性を示す図である。インサートはサンプルの写真である。図１３Ｂは検出限界を示す図である。図１３Ｃは異なるセンサ濃度を用いるｃＴｎＩ用量依存性を示す図である。（黒四角）０．１ｎＭの１９Ｃ７－ＬＢおよび０．１ｎＭの４Ｃ２－ＳＢ；（黒三角）０．１ｎＭの１９Ｃ７－ＬＢおよび１ｎＭの４Ｃ２－ＳＢ；（黒丸）１ｎＭの１９Ｃ７－ＬＢおよび１ｎＭの４Ｃ２－ＳＢ；（黒菱形）１ｎＭの１９Ｃ７－ＬＢおよび１０ｎＭの４Ｃ２－ＳＢ。図１３Ｄは、異なる濃度のｃＴｎＩの存在下での発光信号の経時変化を示す図である。エラーバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【図14】図１４Ａは、キャリブレータルシフェラーゼとしてＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質を用いるレシオメトリックアッセイの略図である。図１４Ｂは、５ｐＭのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質をスパイクした１ｎＭの１９Ｃ７－ＬＢおよび４Ｃ２－ＳＢを用いるｃＴｎＩ用量依存性を示す図である。インサートはサンプルの写真である。図１４Ｃは異なる濃度のｃＴｎＩの存在下での発光比率の経時変化を示す図である。
【図15】ＣＲＰの生物発光イムノアッセイを示す図である。図１５Ａは、１ｎＭのＣ６－ＬＢおよび１０ｎＭのＣ１３５－ＳＢを用いるＣＲＰ用量依存性を示す図である。図１５Ｂは、異なる濃度のＣＲＰの存在下での発光信号の経時変化を示す図である。図１５Ｃは、緩衝液中２ｐＭのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質をスパイクした１ｎＭのＣ６－ＬＢおよび１０ｎＭのＣ１３５－ＳＢを用いるＣＲＰ用量依存性を示す図である。図１５Ｄは、異なる濃度のＣＲＰの存在下での発光比率の経時変化を示す図である。
【図16】ＥＬＩＳＡおよび本発明者らのアッセイによって測定したＣＲＰ濃度の相関を示す図である。サンプルを、緩衝液に１／５０希釈した血漿において調製し、緩衝液で得られた較正曲線を用いて定量した。エラーバーは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）を表す。
【図17】抗セツキシマブの生物発光イムノアッセイを示す図である。図１７Ａは１ｎＭセツキシマブ－ＬＢおよびセツキシマブ－ＳＢを用いるインテンシメトリックアッセイを示す図である。図１７Ｂは異なる濃度の抗セツキシマブでのインテンシメトリックアッセイの反応速度を示す図である。図１７Ｃは、１ｐＭのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質をスパイクした１ｎＭセツキシマブ－ＬＢおよびセツキシマブ－ＳＢを用いるレシオメトリックアッセイを示す図である。図１７Ｄは異なる濃度の抗セツキシマブでのレシオメトリックアッセイの反応速度を示す図である。
【図19】１ｎＭの赤色にシフトしたＮａｎｏＬｕｃをスパイクした１ｎＭの１９Ｃ７－ＬＢおよび４Ｃ２－ＳＢを用いる心臓トロポニンＩのレシオメトリックアッセイを示す図である。図１９Ａはデジタルカメラで撮影したサンプルの写真である。図１９Ｂはプレートリーダーによって測定した標準化した青色／赤色比率を示す図である。
【図20】Ｋ９Ｃ／Ｄ１５７Ｃ／Ｇ１９１ＣバリアントのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す図である。Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（灰色）、ＮａｎｏＬｕｃ（シアン）、システイン（赤色）、Ｈｉｓ－タグ（暗赤色）。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の一実施形態では、本発明は、洗浄またはインキュベーションステップのいずれもなしで溶液中で直接実施し得る生物発光サンドイッチ免疫アッセイに関する。そのようなアッセイでは、所望の被検物質における異なるエピトープを認識する２つの抗体が、スプリットＮａｎｏＬｕｃ部分に融合したＧタンパク質ドメインの柔軟なペプチドリンカーを介した光架橋によって、スプリットＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼの大きい部分または小さい部分に結合されている。所望の被検物質の存在下で、三重複合体が被検物質と２つの抗体とから形成され、２つのスプリットルシフェラーゼ部分の補完およびルシフェラーゼ活性の再構成が可能となる。このシステムそれ自体が、再構成したルシフェラーゼによって発せられる青色光の強度被検物質の量の尺度であるインテンシメトリック信号を生じる。しかしながら、青色発光の強度は一定ではなく、特に高い被検物質濃度ではやがて低下する。青色光（４６０ｎｍ）を発しないが緑色光（５１５ｎｍ）を発する低濃度のＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質でのスパイクによって課題は解決された。緑色光および青色光の比率が時間において安定であり、発光比率が被検物質濃度の信頼性のある尺度として使用できるようにすることを見出した。スプリットＮａｎｏＬｕｃ補完と組み合わせたレシオメトリック検出は、現在使用される異種サンドイッチイムノアッセイの非常に魅力的かつ速い代替手段を提供する。方法は、心臓トロポニンＩ（心臓発作のマーカー）、Ｃ－反応性タンパク質および抗セツキシマブ抗体の検出に使用され得るが、他の抗体およびタンパク質バイオマーカーの検出を含めた方法の他の用途が同様に適し得る。
【0022】
スプリットレポータールシフェラーゼの他の興味深い用途は、タンパク質間相互作用のハイスループット検出である。一般に、方法は、いずれの生物発光アッセイも較正する簡便かつさらに着実な方法を提供する。
【0023】
本発明の実施形態は、いくつかの他の興味深いバイオマーカーのためのアッセイおよびポイント・オブ・ケア診断を開発し、アッセイと、レシオメトリック検出が重要であるペーパーまたはスレッドベースの診断デバイスとを組み合わせるセンサ戦略として適用され得る。方法それ自体は、より赤色にシフトした発光信号（検出器ルシフェラーゼ）の信号とのより良好な分離）を有するキャリブレータバリアントを探すことによって、さらに改変できる。また、インテンシメトリック生物発光信号を較正する一般的な原理を提供することから、本発明は、生体外のアッセイ（ルシフェラーゼを有する）を超えてより広く適用され得る。考えられる用途としては、細胞ベースのハイスループットスクリーニング、転写レポーターアッセイ、（生体内）生物発光イメージング用途およびレシオメトリック生物発光センサタンパク質を開発する新規方法への使用が挙げられる。
【0024】
本明細書で提供される例はスプリットルシフェラーゼを含むが、検出器ルシフェラーゼは、活性または濃度が被検物質の存在によって調整されるいずれのルシフェラーゼでもあり得る。そう言って、本発明は、一部の非スプリットルシフェラーゼにも適用できる。
【0025】
本発明は、スプリットレポータールシフェラーゼの補完に基づく代替のレシオメトリック生物発光サンドイッチイムノアッセイ形式に関し、ルシフェラーゼの２つの断片が、標的分子の異なるエピトープをそれぞれ認識する一対の抗体に結合されており、溶液中の均質サンドイッチイムノアッセイを可能にする（Ｎｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｍ．Ｍｅｒｋｘ，Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ６２／８６４５８３，ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，２０２０も参照）。Ｇタンパク質媒介光結合戦略（Ｈｕｉ，Ｊ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，ＬＡＳＩＣ：Ｌｉｇｈｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ ＩｇＧｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，８，ｐ．１４５６－１４６０も参照）が、天然抗体とスプリットＮａｎｏＬｕｃ断片との間の部位特異的な共有結合形成を可能にするように導入され（Ｄｉｘｏｎ，Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮａｎｏＬｕｃ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ レポーター Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｓ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６．１１（２）：ｐ．４００－４０８も参照）、幅広い範囲の市販のモノクローナル抗体に適用できる一般的および直接的な方法を提供する（図１Ａ）。また、システムは、ＮａｎｏＬｕｃ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｖｅ ｃｏｌｏｕｒ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｂｒｉｇｈｔ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｕｒ ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１６．７：ｐ．１－１０も参照）をキャリブレータルシフェラーゼとして導入して時間独立および濃度独立測定を可能にすることによって、レシオメトリックとされている。このシステムは抗体検出にも使用できる一方で、その場合、アッセイはルシフェラーゼ補完の比較的小さい増加および釣鐘状抗体反応曲線（フック効果としても既知）を示した。これらの性質は、同じ検出抗体内の２つの抗原結合部位を標的とする溶液サンドイッチイムノアッセイに固有であり、アッセイの分析性能を制限する（Ｎｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｍ．Ｍｅｒｋｘ，Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ．仮特許出願６２／８６４５８３，準備中の原稿，２０２０も参照）。代替のアッセイ形式はこれらの欠点をうまく対処する。この新しいアッセイ形式の鍵は、スプリットルシフェラーゼの１つの部分が標的抗原に遺伝的に融合されている一方で、補完部分が、抗体または抗体－抗原複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体に融合されていることである。このアッセイ形式の原理の証明は、アダリムマブの検出のためのレシオメトリック生物発光アッセイを開発することによって提供される。
【0026】
更なる実施形態では、本発明は、ＴＮＦα結合抗体のためのレシオメトリック生物発光イムノアッセイに関する。ＴＮＦα、炎症疾患において過剰に発現される炎症性サイトカインに結合する抗体は、治療抗体の重要な例である。ＴＮＦαは溶液中でホモトリマーを実際には形成し、アダリムマブなどの治療抗体は、２つの単量体の接触面によって形成される複雑な不連続エピトープを認識することによって、ＴＮＦαに結合する。インフリキシマブおよびアダリムマブなどのＴＮＦαを標的とする治療抗体は、リウマチ関節炎および炎症性腸疾患などの疾患を治療するのに非常に成功しており、ベストセラーの薬の一部である。
【実施例】
【0027】
実施例１．心臓トロポニンＩ、Ｃ－反応性タンパク質および抗セツキシマブ抗体の検出のための生物発光サンドイッチ免疫アッセイ
クローニング
Ｇ－ＳＢタンパク質をコードするＤＮＡを含むｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（ｐＧ－ＳＢ）およびＧ－ＬＢタンパク質をコードするＤＮＡを含むｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（ｐＧ－ＬＢ）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔに発注した。ＳＢ配列を変更する部位特異的な変異誘発を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的変異誘発キットを用いて実施した（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて特異的なプライマー。すべてのクローニングおよび変異誘発結果をサンガー配列決定（ＳｔａｒＳｅｑ）によって確認した。図７、９および１０は、ｐＧ－ＳＢ（バリアント）およびｐＧ－ＬＢのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
クローニング
Ｇ－ＳＢタンパク質をコードするＤＮＡを含むｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（ｐＧ－ＳＢ）およびＧ－ＬＢタンパク質をコードするＤＮＡを含むｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（ｐＧ－ＬＢ）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔに発注した。ＳＢ配列を変更する部位特異的な変異誘発を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的変異誘発キットを用いて実施した（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて特異的なプライマー。すべてのクローニングおよび変異誘発結果をサンガー配列決定（ＳｔａｒＳｅｑ）によって確認した。図７、９および１０は、ｐＧ－ＳＢ（バリアント）およびｐＧ－ＬＢのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【0028】
タンパク質発現
ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢＰＡ）を組み込むために、ｐＧ－ＬＢまたはｐＧ－ＳＢをコードするｐＥＴ２８ａプラスミドを、ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼ対をコードするｐＥＶＯＬベクターと共にＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に共形質転換した。ｐＥＶＯＬベクターはＰｅｔｅｒ Ｓｃｈｕｌｔｚ（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃３１１８６）からいただいたものであった。３０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する２ＹＴ培地（１６ｇペプトン、５ｇ ＮａＣｌ、１０ｇ酵素抽出物／Ｌ）で細胞を培養した。タンパク質発現を、１ｍＭのｐＢＰＡ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｆ－２８００．０００１）の存在下、０．１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．２％アラビノースを用いて誘導した。一晩発現後、細胞を回収し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶解した。製造者の説明書に従って、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製した後、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ精製を行った。タンパク質純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。ｐＢＰＡの正しい組み込みをＱ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳによって確認した。精製したタンパク質を－８０℃で使用まで保存した。
ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢＰＡ）を組み込むために、ｐＧ－ＬＢまたはｐＧ－ＳＢをコードするｐＥＴ２８ａプラスミドを、ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼ対をコードするｐＥＶＯＬベクターと共にＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に共形質転換した。ｐＥＶＯＬベクターはＰｅｔｅｒ Ｓｃｈｕｌｔｚ（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃３１１８６）からいただいたものであった。３０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する２ＹＴ培地（１６ｇペプトン、５ｇ ＮａＣｌ、１０ｇ酵素抽出物／Ｌ）で細胞を培養した。タンパク質発現を、１ｍＭのｐＢＰＡ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｆ－２８００．０００１）の存在下、０．１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．２％アラビノースを用いて誘導した。一晩発現後、細胞を回収し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶解した。製造者の説明書に従って、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製した後、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ精製を行った。タンパク質純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。ｐＢＰＡの正しい組み込みをＱ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳによって確認した。精製したタンパク質を－８０℃で使用まで保存した。
【0029】
ＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質を先に記載されているように調製した（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｖｅ ｃｏｌｏｕｒ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｂｒｉｇｈｔ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｕｒ ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１６．７：ｐ．１－１０）。Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーおよびＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ精製を用いて、タンパク質を精製した。精製したタンパク質を－８０℃で使用まで保存した。
【0030】
光結合
心臓トロポニンＩ抗体１９Ｃ７（４Ｔ２１）および４Ｃ２（４Ｔ２１）、およびＣ－反応性タンパク質抗体Ｃ６（４Ｃ２８ｃｃ）およびＣ１３５（４Ｃ２８）をＨｙＴｅｓｔに発注した。治療抗体セツキシマブをＣａｔｈｅｒｉｎａ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｐｈａｒｍａｃｙ（オランダ国アイントホーフェン）によって入手した。光結合反応を、Ｐｒｏｍｅｄ ＵＶＬ－３０ＵＶ光源（４×９Ｗ）を用いて実施した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中抗体およびｐＧ－ＬＢまたはｐＧ－ＳＢを含むサンプルを３６５ｎｍの光で３０～１８０分間照射した。サンプルを光結合中氷上で保持した。Ｎｉ－ＮＴＡスピンカラムを用いて、光結合した生成物をさらに精製した後、ＰＤＧ１０脱塩カラムまたはＧタンパク質スピンカラムによって精製した。
心臓トロポニンＩ抗体１９Ｃ７（４Ｔ２１）および４Ｃ２（４Ｔ２１）、およびＣ－反応性タンパク質抗体Ｃ６（４Ｃ２８ｃｃ）およびＣ１３５（４Ｃ２８）をＨｙＴｅｓｔに発注した。治療抗体セツキシマブをＣａｔｈｅｒｉｎａ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｐｈａｒｍａｃｙ（オランダ国アイントホーフェン）によって入手した。光結合反応を、Ｐｒｏｍｅｄ ＵＶＬ－３０ＵＶ光源（４×９Ｗ）を用いて実施した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中抗体およびｐＧ－ＬＢまたはｐＧ－ＳＢを含むサンプルを３６５ｎｍの光で３０～１８０分間照射した。サンプルを光結合中氷上で保持した。Ｎｉ－ＮＴＡスピンカラムを用いて、光結合した生成物をさらに精製した後、ＰＤＧ１０脱塩カラムまたはＧタンパク質スピンカラムによって精製した。
【0031】
発光アッセイ
心臓トロポニンＩ（８Ｔ５３）およびＣ－反応性タンパク質（８Ｃ７２）をＨｙＴｅｓｔに発注した。抗セツキシマブ（ＨＣＡ２２１）をＢｉｏ－Ｒａｄに発注した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ｆｌａｔ ｗｈｉｔｅ ３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅにおいて合計容量１５μＬで、０．１～１０ｎＭのセンサタンパク質濃度でインテンシメトリックアッセイを実施した。センサタンパク質および検体の０．５時間のインキュベーション後、ＮａｎｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ１１１０）を３００～１０００倍の最終希釈で添加した。１００ｍｓの積分時間でＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍプレートリーダーで発光強度を記録した。レシオメトリックアッセイでは、１～１０ｐＭのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質をサンプルに添加し、３９８ｎｍ～６５３ｎｍ、ステップサイズ１５ｎｍ、帯域幅２５ｎｍおよび積分時間１０００ｍｓで、発光スペクトルを記録した。
心臓トロポニンＩ（８Ｔ５３）およびＣ－反応性タンパク質（８Ｃ７２）をＨｙＴｅｓｔに発注した。抗セツキシマブ（ＨＣＡ２２１）をＢｉｏ－Ｒａｄに発注した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ｆｌａｔ ｗｈｉｔｅ ３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅにおいて合計容量１５μＬで、０．１～１０ｎＭのセンサタンパク質濃度でインテンシメトリックアッセイを実施した。センサタンパク質および検体の０．５時間のインキュベーション後、ＮａｎｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ１１１０）を３００～１０００倍の最終希釈で添加した。１００ｍｓの積分時間でＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍプレートリーダーで発光強度を記録した。レシオメトリックアッセイでは、１～１０ｐＭのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質をサンプルに添加し、３９８ｎｍ～６５３ｎｍ、ステップサイズ１５ｎｍ、帯域幅２５ｎｍおよび積分時間１０００ｍｓで、発光スペクトルを記録した。
【0032】
デジタルカメラを用いて発光信号も記録した。プレートを発砲スチレン箱に配置して、周囲の光を除いた。ＳＯＮＹ ＤＳＣ－ＲＸ１００デジタルカメラを用いて、暴露時間３０ｓ、Ｆ値１．８およびＩＳＯ値１６００～３２００で箱のホールを通して写真を撮影した。ＩｍａｇｅＪを用いて画像を分析して、絶対強度と、青色および緑色のチャネルの平均強度の間の比率の値を計算した。
【0033】
実施例１ａ．センサ設計および特徴付け（心臓トロポニンＩ）
概念実証を確立するために、標的抗原として、心臓障害の重要なマーカーであり、ｐＭ濃度での高感度な検出を必要とする心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を選択した。スプリットＮａｎｏＬｕｃのＬＢ断片およびＫｄ２．５μＭのＳＢ断片を、それぞれセミフレキシブルリンカーを介してＧタンパク質に融合した。Ｎ末端にＨｉｓ－タグ、Ｃ末端にｓｔｒｅｐ－タグが含まれていて、融合タンパク質の精製を促進する。プラスミドは、Ｇタンパク質の位置２４にＴＡＧアンバー停止コドンを含み、直交ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対との共発現によって、光反応基である非天然アミノ酸ｐ－ベンゾイル－フェニルアラニン（ＢＰＡ）が望ましい位置で組み込まれるようにできた（Ｈｕｉ，Ｊ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，ＬＡＳＩＣ：Ｌｉｇｈｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ ＩｇＧｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，８，ｐ．１４５６－１４６０も参照）。ＢＰＡが組み込まれたＧタンパク質ドメインは、抗体のＦｃドメインに３６５ｎｍの光照射で架橋できる。精製したｐＧ－ＬＢおよびｐＧ－ＳＢタンパク質を、サンドイッチイムノアッセイにおいて相性がよい一対の抗ｃＴｎＩ抗体、１９Ｃ７および４Ｃ２に光結合した、（図１１Ａ）。Ｇタンパク質ベースの結合の１つの特徴は、両方のＩｇＧ重鎖を改変できることであり、それ故に、モノ結合、ジ結合および非結合抗体並びにｐＧ－ＬＢ／ＳＢの混合物が得られた。抗体に対するアダプタータンパク質の種々のモル比を用いて、結合効率に影響を与えた（図１２）。ｐＧ－ＬＢおよびｐＧ－ＳＢの存在がバックグランドシグナルに寄与することから、抗体に対するタンパク質の等しいモル比を使用して、混合物中の非結合ｐＧ－ＬＢおよびｐＧ－ＳＢを最小限にした。Ｎｉアフィニティクロマトグラフィーのステップを使用して非結合抗体を除去した（図１１Ｂ）。
概念実証を確立するために、標的抗原として、心臓障害の重要なマーカーであり、ｐＭ濃度での高感度な検出を必要とする心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を選択した。スプリットＮａｎｏＬｕｃのＬＢ断片およびＫｄ２．５μＭのＳＢ断片を、それぞれセミフレキシブルリンカーを介してＧタンパク質に融合した。Ｎ末端にＨｉｓ－タグ、Ｃ末端にｓｔｒｅｐ－タグが含まれていて、融合タンパク質の精製を促進する。プラスミドは、Ｇタンパク質の位置２４にＴＡＧアンバー停止コドンを含み、直交ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対との共発現によって、光反応基である非天然アミノ酸ｐ－ベンゾイル－フェニルアラニン（ＢＰＡ）が望ましい位置で組み込まれるようにできた（Ｈｕｉ，Ｊ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，ＬＡＳＩＣ：Ｌｉｇｈｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ ＩｇＧｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，８，ｐ．１４５６－１４６０も参照）。ＢＰＡが組み込まれたＧタンパク質ドメインは、抗体のＦｃドメインに３６５ｎｍの光照射で架橋できる。精製したｐＧ－ＬＢおよびｐＧ－ＳＢタンパク質を、サンドイッチイムノアッセイにおいて相性がよい一対の抗ｃＴｎＩ抗体、１９Ｃ７および４Ｃ２に光結合した、（図１１Ａ）。Ｇタンパク質ベースの結合の１つの特徴は、両方のＩｇＧ重鎖を改変できることであり、それ故に、モノ結合、ジ結合および非結合抗体並びにｐＧ－ＬＢ／ＳＢの混合物が得られた。抗体に対するアダプタータンパク質の種々のモル比を用いて、結合効率に影響を与えた（図１２）。ｐＧ－ＬＢおよびｐＧ－ＳＢの存在がバックグランドシグナルに寄与することから、抗体に対するタンパク質の等しいモル比を使用して、混合物中の非結合ｐＧ－ＬＢおよびｐＧ－ＳＢを最小限にした。Ｎｉアフィニティクロマトグラフィーのステップを使用して非結合抗体を除去した（図１１Ｂ）。
【0034】
１ｎＭの精製した抗体結合センサタンパク質をｃＴｎＩとｐＭ～ｎＭでインキュベートした場合、記録された発光強度は、ｃＴｎＩの非常に高い濃度でのフック効果によって釣鐘状のｃＴｎＩ－依存曲線に従った（図１３Ａ）。１０ｎＭのｃＴｎＩで見られた最大発光強度は、ブランクと比較して３００倍高かった。検出限界が５ｐＭであると決定した（図１３Ｂ）。信号応答を、センサタンパク質の濃度を変動させることによって変調できた（図１３Ｃ）。より高い濃度の４Ｃ２－ＳＢを使用することで、「フック」を比較的高い被検物質濃度に効果的にシフトできた。１ｎＭの１９Ｃ７－ＬＢおよび１０ｎＭの４Ｃ２－ＳＢを用いて、５０ｎＭのｃＴｎＩで最大強度が得られた。これらの強度はデジタルカメラによって検出するには低すぎたが、０．１ｎＭの１９Ｃ７－ＬＢおよび１ｎＭの４Ｃ２－ＳＢを用いて、低い被検物質濃度でのより高いＳ／Ｂ比率が得られた。したがって、１ｎＭの各センサタンパク質を更なる実験で採用した。信号応答に対するスプリットＮａｎｏＬｕｃ相互作用親和性の効果をさらに調査した。この目的のためにＫｄが１９０μＭおよび０．２８μＭである他の２つのＳＢバリアントを試験した。Ｓ／Ｂ比率が最も高いＫｄ２．５μＭのＳＢを用いて最も高い信号強度が得られた（図１４）。
【0035】
絶対発光強度を用いる１つの欠点は、信号強度が基質濃度、ｐＨ、温度およびイオン強度を含む多くの因子に依存し、基質ターンオーバーの結果として通常はやがて減少することである。実際に、３０分間の絶対発光強度のモニタリングは、信号が時間内に変化することを明らかにした（図１３Ｄ）。これは、センサ濃度、基質ターンオーバーおよび環境条件の差異についてアッセイを注意深く較正するのが困難であり得るポイント・オブ・ケア用途にとって特に問題である。レシオメトリックシステムを、追加のキャリブレータルシフェラーゼを追加することによってさらに開発した。アッセイ混合物に、同じ基質フリマジンの酸化を触媒し得、緑色光を生じ得る生物発光ＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質をスパイクした（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｖｅ ｃｏｌｏｕｒ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｂｒｉｇｈｔ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｕｒ ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１６．７：ｐ．１－１０）。そのような方法で、抗原濃度の関数としての発光比率は、基質濃度および反応条件の影響を無効にする。図１４Ａに示すように、レシオメトリックシステムは、インテンシメトリックアッセイによって得られたものと類似の抗原用量依存性を表した。より興味深いことに、発光比率は経時的に安定なままであり（図１４Ｂ）、したがって、十分な光が発せられる限り確実に検出できる。レシオメトリックシステムの時間独立は、実際の用途にとってセンサ性能の重要な態様を表す。
【0036】
実施例１ｂ．センサ設計および特徴付け（Ｃ－反応性タンパク質）
例２のアッセイ形式も炎症マーカーＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の検出に適用された。ｐＧ－ＳＢおよびｐＧ－ＬＢタンパク質を一対の抗ＣＲＰ抗体Ｃ１３５（ｍＩｇＧ２ｂ）およびＣ６（ｍＩｇＧ２ａ）に結合した。抗体とｐＧ－ＳＢおよびｐＧ－ＬＢとの光結合に成功し、一工程ニッケル親和性精製を行った後、ＣＲＰのためのインテンシメトリックアッセイを実施し、５６の最大Ｓ／Ｂ比率を得た（図１５Ａ）。ＮＬ－ｍＮＧキャリブレータの追加は、検出限界および計画に影響を与えることなく、アッセイを経時的な変動が少ないものとした（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）。２ｐＭのＮＬ－ｍＮＧキャリブレータを追加することによって、１８の最大比率変化および３ｐＭのＬＯＤをレシオメトリックアッセイで達成した。
例２のアッセイ形式も炎症マーカーＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の検出に適用された。ｐＧ－ＳＢおよびｐＧ－ＬＢタンパク質を一対の抗ＣＲＰ抗体Ｃ１３５（ｍＩｇＧ２ｂ）およびＣ６（ｍＩｇＧ２ａ）に結合した。抗体とｐＧ－ＳＢおよびｐＧ－ＬＢとの光結合に成功し、一工程ニッケル親和性精製を行った後、ＣＲＰのためのインテンシメトリックアッセイを実施し、５６の最大Ｓ／Ｂ比率を得た（図１５Ａ）。ＮＬ－ｍＮＧキャリブレータの追加は、検出限界および計画に影響を与えることなく、アッセイを経時的な変動が少ないものとした（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）。２ｐＭのＮＬ－ｍＮＧキャリブレータを追加することによって、１８の最大比率変化および３ｐＭのＬＯＤをレシオメトリックアッセイで達成した。
【0037】
アッセイ評価
アッセイの分析性能を、ヒト血漿中のＣＲＰの定量のための市販のＥＬＩＳＡと比較した。心臓血管リスク評価に臨床的に使用される高感度ＣＲＰ（ｈｓＣＲＰ）を指す低いｍｇＬ－１レベルで試験ＣＲＰサンプルを調製した。発明者らのアッセイが高感度であるために、試験血漿サンプルを５０倍に緩衝液で希釈し、その後、測定した青色／緑色比率を図１５Ｃで得られた較正曲線と比較することによって測定した。並行して、試験サンプル中のＣＲＰ濃度をＥＬＩＳＡによって適切な希釈後に決定した。良好な相関（Ｒ２＝０．９９０６）がＥＬＩＳＡと発明者らのアッセイとの間に見られ（図１６）、発明者らのアッセイの精度および臨床サンプルの分析のその優れた可能性を指す。発明者らのアッセイの単純な「混合および測定」ワークフローは、多数の洗浄ステップの必要性をなくし、それ故に、アッセイの合計時間をＥＬＩＳＡより１時間少なくすることに言及する価値がある。
アッセイの分析性能を、ヒト血漿中のＣＲＰの定量のための市販のＥＬＩＳＡと比較した。心臓血管リスク評価に臨床的に使用される高感度ＣＲＰ（ｈｓＣＲＰ）を指す低いｍｇＬ－１レベルで試験ＣＲＰサンプルを調製した。発明者らのアッセイが高感度であるために、試験血漿サンプルを５０倍に緩衝液で希釈し、その後、測定した青色／緑色比率を図１５Ｃで得られた較正曲線と比較することによって測定した。並行して、試験サンプル中のＣＲＰ濃度をＥＬＩＳＡによって適切な希釈後に決定した。良好な相関（Ｒ２＝０．９９０６）がＥＬＩＳＡと発明者らのアッセイとの間に見られ（図１６）、発明者らのアッセイの精度および臨床サンプルの分析のその優れた可能性を指す。発明者らのアッセイの単純な「混合および測定」ワークフローは、多数の洗浄ステップの必要性をなくし、それ故に、アッセイの合計時間をＥＬＩＳＡより１時間少なくすることに言及する価値がある。
【0038】
実施例１ｃ．センサ設計および特徴付け（抗セツキシマブ）
例１の一般的なセンサ形式を、抗抗体モニタリングに拡大できるかどうか調査した。癌または炎症治療のための治療抗体の投与は、免疫応答を誘導し得、治療の治療効果を不活性化する抗抗体の生成をもたらす。したがって、抗抗体を検出する単純かつ速いアッセイの開発が、治療抗体に対する免疫原性評価するのに重要である。抗癌治療の抗体セツキシマブを、ｐＧ－ＬＢおよびｐＧ－ＳＢと別々に光結合した検出分子として選択した。その後、スプリットＮａｎｏＬｕｃ官能化セツキシマブを抗セツキシマブの発光検出に使用し、最大Ｓ／Ｂ比率が８である釣鐘状用量依存曲線が得られた（図１７Ａ）。レシオメトリックシステムへのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質の追加で類似のアッセイ曲線が得られたが（図１７Ｃ）、経時的に発光比率のより安定なセンサ信号が得られた（図１７Ｄ）。
例１の一般的なセンサ形式を、抗抗体モニタリングに拡大できるかどうか調査した。癌または炎症治療のための治療抗体の投与は、免疫応答を誘導し得、治療の治療効果を不活性化する抗抗体の生成をもたらす。したがって、抗抗体を検出する単純かつ速いアッセイの開発が、治療抗体に対する免疫原性評価するのに重要である。抗癌治療の抗体セツキシマブを、ｐＧ－ＬＢおよびｐＧ－ＳＢと別々に光結合した検出分子として選択した。その後、スプリットＮａｎｏＬｕｃ官能化セツキシマブを抗セツキシマブの発光検出に使用し、最大Ｓ／Ｂ比率が８である釣鐘状用量依存曲線が得られた（図１７Ａ）。レシオメトリックシステムへのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質の追加で類似のアッセイ曲線が得られたが（図１７Ｃ）、経時的に発光比率のより安定なセンサ信号が得られた（図１７Ｄ）。
【0039】
結論
スプリットＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼの補完に基づく一般的な均質イムノアッセイ形式を、溶液中のタンパク質バイオマーカーの直接検出のために開発した。ｐＭ濃度でのｃＴｎＩの検出に成功することによって、概念実証が得られた。センサ形式の高いモジュール方式は、スプリットＮａｎｏＬｕｃ断片を標的結合抗体に配置することによって、種々のタンパク質ターゲットのアッセイを可能にする。また、キャリブレータルシフェラーゼを追加することによって、時間および基質濃度の独立した測定を可能にするレシオメトリックアッセイシステムを開発した。
スプリットＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼの補完に基づく一般的な均質イムノアッセイ形式を、溶液中のタンパク質バイオマーカーの直接検出のために開発した。ｐＭ濃度でのｃＴｎＩの検出に成功することによって、概念実証が得られた。センサ形式の高いモジュール方式は、スプリットＮａｎｏＬｕｃ断片を標的結合抗体に配置することによって、種々のタンパク質ターゲットのアッセイを可能にする。また、キャリブレータルシフェラーゼを追加することによって、時間および基質濃度の独立した測定を可能にするレシオメトリックアッセイシステムを開発した。
【0040】
実施例２．ＴＮＦα結合抗体のためのレシオメトリック生物発光イムノアッセイ
クローニング
ｐＥＴ２８ａ（＋）Ｇタンパク質－Ｌａｒｇｅ ＢｉｔをコードするＤＮＡを含むベクター（ｐＧ－ＬＢ）およびｐＥＴ２８ａ（＋）Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＴＮＦα－リンカー－ＳＢをコードするＤＮＡを含むベクターをＧｅｎＳｃｒｉｐｔに発注した。図７および図８は、それぞれｐＧ－ＬＢおよびＳＵＭＯ－ＴＮＦα－ＳＢのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
クローニング
ｐＥＴ２８ａ（＋）Ｇタンパク質－Ｌａｒｇｅ ＢｉｔをコードするＤＮＡを含むベクター（ｐＧ－ＬＢ）およびｐＥＴ２８ａ（＋）Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＴＮＦα－リンカー－ＳＢをコードするＤＮＡを含むベクターをＧｅｎＳｃｒｉｐｔに発注した。図７および図８は、それぞれｐＧ－ＬＢおよびＳＵＭＯ－ＴＮＦα－ＳＢのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【0041】
タンパク質発現および精製
ｐ－ベンゾイル－フェニルアラニン（ｐＢＰＡ）を組み込むために、ｐＥＴ２８ａｐＧ－ＬＢをコードするプラスミドを、ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼ対をコードするｐＥＶＯＬベクターと共にＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に共形質転換した。ｐＥＶＯＬベクターは、Ｐｅｔｅｒ Ｓｃｈｕｌｔｚ（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃３１１８６）からいただいた。３０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する２ＹＴ培地（１６ｇ ペプトン、５ｇ ＮａＣｌ、１０ｇ 酵素抽出物／Ｌ）で細胞を培養した。１ｍＭのｐＢＰＡ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｆ－２８００．０００１）の存在下、０．１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．２％アラビノースを用いて、タンパク質発現を誘導した。一晩発現後、細胞を回収し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶解した。Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製した後、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ精製を行った製造者の説明書に従って。タンパク質純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。ｐＢＰＡの正しい組み込みをＱ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳによって確認した。精製したタンパク質を－８０℃で使用まで保存した。
ｐ－ベンゾイル－フェニルアラニン（ｐＢＰＡ）を組み込むために、ｐＥＴ２８ａｐＧ－ＬＢをコードするプラスミドを、ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼ対をコードするｐＥＶＯＬベクターと共にＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に共形質転換した。ｐＥＶＯＬベクターは、Ｐｅｔｅｒ Ｓｃｈｕｌｔｚ（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃３１１８６）からいただいた。３０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する２ＹＴ培地（１６ｇ ペプトン、５ｇ ＮａＣｌ、１０ｇ 酵素抽出物／Ｌ）で細胞を培養した。１ｍＭのｐＢＰＡ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｆ－２８００．０００１）の存在下、０．１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．２％アラビノースを用いて、タンパク質発現を誘導した。一晩発現後、細胞を回収し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶解した。Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製した後、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ精製を行った製造者の説明書に従って。タンパク質純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。ｐＢＰＡの正しい組み込みをＱ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳによって確認した。精製したタンパク質を－８０℃で使用まで保存した。
【0042】
ｐＥＴ２８ａＳＵＭＯ－ＴＮＦα－ＳＢ融合タンパク質をコードするプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地（１０ｇペプトン、１０ｇ ＮａＣＬ、５ｇ酵素抽出物／Ｌ）で細胞を培養した。０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した。一晩発現後に細胞を回収し、ベンゾナーゼ酵素を含有する結合緩衝液（４０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ＰＨ８．０）に再懸濁した。その後、振幅５０％に設定した２０ｓの５パルスでの氷上の超音波処理によって細胞を破壊した。タンパク質を最初にＮｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーを用いて４℃で精製した。１．５ｍｌの溶出画分に２μＬのＳＵＭＯプロテアーゼを添加し、５ｋＤａ透析膜を用いて、ＳＵＭＯプロテアーゼ反応緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、ＰＨ８．０）に対して溶液を一晩４℃で透析することによってことによって、Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－タグをＴＮＦα－ＳＢから切断した。切断したＨｉｓ－ＳＵＭＯ－タグを除去するのにＮｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーを用いて、切断したＴＮＦα－ＳＢが得られた。タンパク質純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。精製したタンパク質を－８０℃で使用まで保存した。
【0043】
ＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質を先に記載されているように調製した（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋら，Ｆｉｖｅ ｃｏｌｏｕｒ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｂｒｉｇｈｔ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｕｒ ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１６．７：ｐ．１－１０）。Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーおよびＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ精製を用いて、タンパク質を精製した。精製したタンパク質を－８０℃で使用まで保存した。
【0044】
光結合
抗アダリムマブ／ＴＮＦαモノクローナル抗体（ＡＴ抗体）はＢｉｏＲａｄ（ＨＣＡ２０７）から入手した。光結合反応を、Ｐｒｏｍｅｄ ＵＶＬ－３０ＵＶ光源（４ｘ９Ｗ）を用いて実施した。ＰＢＳ緩衝液（ＰＨ７．４）中抗体およびｐＧ－ＬＢの２等価物を含むサンプルを３６５ｎｍの光で２時間照射した。サンプルを光結合中氷上で保持した。光結合した生成物は、非結合ｐＧ－ＬＢと、ｐＧ－ＬＢタンパク質の１つまたは２つのコピーと結合したＡＴ抗体との混合物を含み、更なる精製なしで使用した。
抗アダリムマブ／ＴＮＦαモノクローナル抗体（ＡＴ抗体）はＢｉｏＲａｄ（ＨＣＡ２０７）から入手した。光結合反応を、Ｐｒｏｍｅｄ ＵＶＬ－３０ＵＶ光源（４ｘ９Ｗ）を用いて実施した。ＰＢＳ緩衝液（ＰＨ７．４）中抗体およびｐＧ－ＬＢの２等価物を含むサンプルを３６５ｎｍの光で２時間照射した。サンプルを光結合中氷上で保持した。光結合した生成物は、非結合ｐＧ－ＬＢと、ｐＧ－ＬＢタンパク質の１つまたは２つのコピーと結合したＡＴ抗体との混合物を含み、更なる精製なしで使用した。
【0045】
発光アッセイ
アダリムマブはＧｅｎｔａｕｒ（Ａ１０４８－１００）に発注した。Ｇｒｅｉｎｅｒ ｆｌａｔ白色３８４ウェルプレートにおける１５μＬの合計容量で、２．５～３０ｎＭのＨＣＡ２０７－ｐＧ－ＬＢ濃度および２５～３００ｎＭのＴＮＦα－ＳＢ濃度でインテンシメトリックアッセイを実施した。センサタンパク質および検体の０．５時間のインキュベーション後、ＮａｎｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ１１１０）を５００倍の最終希釈で添加した。１００ｍｓの積分時間でＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーで発光強度を記録した。レシオメトリックアッセイでは、１０～１００ｐＭのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質をサンプルに添加し、３９８ｎｍ～６５３ｎｍ、ステップサイズ１５ｎｍ、帯域幅２５ｎｍおよび積分時間１００ｍｓで発光スペクトルを記録した。緩衝液（１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）またはＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液で希釈した血漿で実験を行った。
アダリムマブはＧｅｎｔａｕｒ（Ａ１０４８－１００）に発注した。Ｇｒｅｉｎｅｒ ｆｌａｔ白色３８４ウェルプレートにおける１５μＬの合計容量で、２．５～３０ｎＭのＨＣＡ２０７－ｐＧ－ＬＢ濃度および２５～３００ｎＭのＴＮＦα－ＳＢ濃度でインテンシメトリックアッセイを実施した。センサタンパク質および検体の０．５時間のインキュベーション後、ＮａｎｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ１１１０）を５００倍の最終希釈で添加した。１００ｍｓの積分時間でＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーで発光強度を記録した。レシオメトリックアッセイでは、１０～１００ｐＭのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質をサンプルに添加し、３９８ｎｍ～６５３ｎｍ、ステップサイズ１５ｎｍ、帯域幅２５ｎｍおよび積分時間１００ｍｓで発光スペクトルを記録した。緩衝液（１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）またはＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液で希釈した血漿で実験を行った。
【0046】
センサ成分のセンサ設計合成
概念実証を確立するために、標的抗体としてアダリムマブ（ＡＤＬ）を選択した。アダリムマブは現在、最も広く使用される抗ＴＮＦα抗体であり、インフリキシマブおよびそのバイオシミラー、並びにハイブリッドタンパク質を含有する非抗体受容体ドメインも含む炎症疾患を治療するのに広く使用されているＴＮＦα阻害バイオ医薬品のファミリーの代表である。本実施例に従うセンサは２つの部品；（１）ＴＮＦαのＣ末端が柔軟なリンカーを介してＳＢに結合しているＴＮＦα融合タンパク質と、２）先に報告された光架橋性タンパク質－リンカー－ＬＢ融合タンパク質を用いてＬＢ断片で官能化されたＡＤＬ－ＴＮＦα複合体に結合するモノクローナル抗体とを有する。天然ＴＮＦα三量体に対するＡＤＬの高い親和性（Ｋｄ＝０．１１ｎＭ）は、過剰なＴＮＦαがアッセイに使用される場合、すべてのＡＤＬがＴＮＦαと複合体を形成するのを確実にする。ここで使用される抗ＡＤＬ－ＴＮＦα抗体は、６７ｎＭのＫｄで複合体に結合することが報告されており（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｂｉｏ－ｒａｄ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｃｏｍ／ａｎｔｉａｄａｌｉｍｕｍａｂ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｈｕｍｉｒａ．ｈｔｍｌ）、治療薬モニタリングにとって興味深い濃度範囲でアッセイがよく反応できるようにした（０．１～２２ｍｇ／Ｌまたは１～２００ｎＭ）。
概念実証を確立するために、標的抗体としてアダリムマブ（ＡＤＬ）を選択した。アダリムマブは現在、最も広く使用される抗ＴＮＦα抗体であり、インフリキシマブおよびそのバイオシミラー、並びにハイブリッドタンパク質を含有する非抗体受容体ドメインも含む炎症疾患を治療するのに広く使用されているＴＮＦα阻害バイオ医薬品のファミリーの代表である。本実施例に従うセンサは２つの部品；（１）ＴＮＦαのＣ末端が柔軟なリンカーを介してＳＢに結合しているＴＮＦα融合タンパク質と、２）先に報告された光架橋性タンパク質－リンカー－ＬＢ融合タンパク質を用いてＬＢ断片で官能化されたＡＤＬ－ＴＮＦα複合体に結合するモノクローナル抗体とを有する。天然ＴＮＦα三量体に対するＡＤＬの高い親和性（Ｋｄ＝０．１１ｎＭ）は、過剰なＴＮＦαがアッセイに使用される場合、すべてのＡＤＬがＴＮＦαと複合体を形成するのを確実にする。ここで使用される抗ＡＤＬ－ＴＮＦα抗体は、６７ｎＭのＫｄで複合体に結合することが報告されており（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｂｉｏ－ｒａｄ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｃｏｍ／ａｎｔｉａｄａｌｉｍｕｍａｂ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｈｕｍｉｒａ．ｈｔｍｌ）、治療薬モニタリングにとって興味深い濃度範囲でアッセイがよく反応できるようにした（０．１～２２ｍｇ／Ｌまたは１～２００ｎＭ）。
【0047】
ＴＮＦαのＤＮＡ配列はＨｏｆｆｍａｎｎらから取得し（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－α ｂｙ ＳＵＭＯ－ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ－Ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄｓ ｆｒｏｍ ｓｈａｋｅ－ｆｌａｓｋ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，５ ２０１０．７２（２）：ｐ．２３８－２４３）、Ｈｏｆｆｍａｎｎらは、Ｎ末端Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－タグを使用して、高い収量の適切に折り畳まれたタンパク質を得た。このＤＮＡ配列をｐＥＴ２８ａベクターにクローニングして、ＴＮＦαのＣ末端が長い柔軟なグリシン－セリンリンカーを介してＳＢバリアントにＬＢ断片に対する中程度の親和性（２．５μＭのＫｄ）で融合している。タンパク質のＣ末端への結合によって、断片のいずれの立体障害もなしで天然三量体複合体が形成できるようになるべきである。また、十分な両方の断片の間の立体自由をもたらして、ルシフェラーゼ補完が生じることができるようにするのも重要であった。Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＴＮＦα－ＳＢ融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉにて組み換え発現し、ニッケル－アフィニティクロマトグラフィーを用いて良好な収量で精製した（図２参照）。Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＴＮＦα－ＳＢとＳＵＭＯプロテアーゼとを一晩インキュベーションした後、第２のニッケルアフィニティクロマトグラフィーステップでＴＮＦα－ＳＢをＨｉｓ－ＳＵＭＯおよび非切断ＨＩＳ－ＳＵＭＯ－ＴＮＦα－ＳＢタンパク質から分離することによって、Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグを除去した。このカラムを通る流れは、予想した分子量（２８ｋＤａ）の本質的に純粋なＴＮＦα－ＳＢ融合を含んでいた。３６５ｎｍ、氷上でｐＧ－ＬＢタンパク質の２等価物で抗体を２時間光架橋することによって、抗ＡＤＬ－ＴＮＦα抗体へのＬＢの結合を達成した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、大部分の抗体が１または２コピーのｐＧ－ＬＢタンパク質と結合するのに成功したことを明らかにした。結合生成物はさらに精製せず、生物発光アッセイに直接使用した。
【0048】
センサ濃度の原理証明および効果
新しいセンサ原理の実現可能性を試験するために、２．５ｎＭ抗ＡＴ－ＬＢおよび２５ｎＭのＴＮＦα－ＳＢを用いて、緩衝液中アダリムマブ滴定実験を実施した。発光強度の大きい、８０倍増加が０．０１～１０ｎＭのＡＤＬで見られ、その後、強度が一定なままであった。この発光の目覚ましい増加は、アッセイの原理が働き、ＴＮＦα－ＳＢタンパク質が正しく折り畳まれ、それらの天然三量体構造に自己集合したことを実証する。次に、抗ＡＴ－ＬＢおよびＴＮＦα－ＳＢの濃度を系統的に変化させて、信号増加およびＡＤＬ感度の増加に関して最適なアッセイ条件を見つけた。図３Ａ、図３Ｂは、動的範囲に顕著に影響することなく、抗ＡＴ－ＬＢ濃度の増加が信号およびバックグランド発光シグナル両方を増加させることを示す。ＴＮＦα－ＳＢの濃度を１００～３００ｎＭから増加させても、アッセイ性能に影響を与えなかった。
新しいセンサ原理の実現可能性を試験するために、２．５ｎＭ抗ＡＴ－ＬＢおよび２５ｎＭのＴＮＦα－ＳＢを用いて、緩衝液中アダリムマブ滴定実験を実施した。発光強度の大きい、８０倍増加が０．０１～１０ｎＭのＡＤＬで見られ、その後、強度が一定なままであった。この発光の目覚ましい増加は、アッセイの原理が働き、ＴＮＦα－ＳＢタンパク質が正しく折り畳まれ、それらの天然三量体構造に自己集合したことを実証する。次に、抗ＡＴ－ＬＢおよびＴＮＦα－ＳＢの濃度を系統的に変化させて、信号増加およびＡＤＬ感度の増加に関して最適なアッセイ条件を見つけた。図３Ａ、図３Ｂは、動的範囲に顕著に影響することなく、抗ＡＴ－ＬＢ濃度の増加が信号およびバックグランド発光シグナル両方を増加させることを示す。ＴＮＦα－ＳＢの濃度を１００～３００ｎＭから増加させても、アッセイ性能に影響を与えなかった。
【0049】
希釈した血漿の測定およびレシオメトリック検出
理想的に、アッセイは、血漿中３～７０ｎＭのＡＤＬ濃度で測定できるべきである。緩衝液中のアッセイが０．１～１０ｎＭのＡＤＬで最も感度高いことから、血漿サンプルを１：３の比率で（４倍希釈に対応）緩衝液で希釈したプロトコルを確立した。図４は、希釈した血漿のＡＤＬ滴定実験の結果を示し、Ｘ軸のＡＤＬの濃度は希釈後の最終濃度を表す。反応曲線および動的範囲は、純粋な緩衝液で得られたものと非常に類似しており、アッセイが２５％（ｖ／ｖ）の血漿の存在によって影響を受けないことを示す。
理想的に、アッセイは、血漿中３～７０ｎＭのＡＤＬ濃度で測定できるべきである。緩衝液中のアッセイが０．１～１０ｎＭのＡＤＬで最も感度高いことから、血漿サンプルを１：３の比率で（４倍希釈に対応）緩衝液で希釈したプロトコルを確立した。図４は、希釈した血漿のＡＤＬ滴定実験の結果を示し、Ｘ軸のＡＤＬの濃度は希釈後の最終濃度を表す。反応曲線および動的範囲は、純粋な緩衝液で得られたものと非常に類似しており、アッセイが２５％（ｖ／ｖ）の血漿の存在によって影響を受けないことを示す。
【0050】
したがって、示されたデータは、青色発光信号の絶対強度を複合体形成のための信号として測定するインテンシメトリックデータを大いに表す。しかしながら、絶対信号強度は、ＡＤＬの量に依存するのみならず、ｐＨ、温度およびイオン強度などの環境パラメータによって影響を受ける。しかしながら、最も重要なことは、信号はフリマジン基質の濃度に依存し、これは、基質ターンオーバーの結果として、信号が、やがてより高いＡＤＬ濃度で最も顕著に低下することを意味する。これは、センサ濃度、基質ターンオーバーおよび環境条件の差異についてアッセイを注意深く較正するのが困難であり得るポイント・オブ・ケア用途にとって特に問題である。最近、追加のキャリブレータルシフェラーゼを追加することによって、インテンシメトリックルシフェラーゼアッセイをレシオメトリックアッセイへ変換するといった新しいアプローチが報告された。アッセイ混合物に同じ基質フリマジンを使用でき、緑色光を生成できる生物発光ＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ融合タンパク質をスパイクした（Ｎｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｍ．Ｍｅｒｋｘ，Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ６２／８６４５８３，ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，２０２０）。このように、ＡＤＬ濃度の関数としての発光比率は基質濃度および反応条件の影響を無効にする。
【0051】
図５Ａ～図５Ｂは、１０ｎＭ抗ＡＴ－ＬＢおよび１００ｎＭのＴＮＦα－ＳＢに加えて、キャリブレータルシフェラーゼとして１００ｐＭのＮａｎｏＬｕＣ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを用いる、１：５で希釈した血漿におけるＡＤＬ滴定実験を示す。図５Ａは、再構成したスプリットＮａｎｏＬｕｃの青色ピークをＡＤＬ濃度の関数として増加させる一方で、キャリブレータルシフェラーゼからの５１３ｎｍのピークが一定なままであることを示す。ＡＤＬ濃度の関数として青色および緑色発光ピークの比率をプロットすることによって得られた滴定曲線は、生理学的に関連した濃度範囲における大きい応答を示し、発光比率およびおよそ２５ｐＭ（血漿中０．１５ｎＭに対応）のＬＯＤにおける１５～２０倍の全体の変化を示す。
【0052】
また、レシオメトリック信号は、複合体形成の反応速度を確実にモニターできるようにして、最適なインキュベーション時間を確立する。図６は、すべてのセンサ成分および基質を含む混合物への０、０．７５、３または１５ｎＭのＡＤＬの添加後の発光比率の増加を示す。予想したように、複合体形成の反応速度は濃度依存的であり、より高い濃度では約１０分で平衡に達した。ＡＤＬの非存在下で発光比率は一定である。
【0053】
結論
上述のように、ＴＮＦα結合抗体の直接検出のために、スプリットＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼの補完に基づく一般的な均質イムノアッセイ形式を開発した。２５ｐＭのＬＯＤおよび大きい動的範囲で希釈した血漿におけるアダリムマブのレシオメトリック検出に成功したことによって概念実証をもたらした。２つの抗体に基づくサンドイッチイムノアッセイ形式に対して、ここで導入されたアッセイ形式は、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼのＳＢ断片と、アダリムマブ－ＴＮＦα複合体に結合する単一の検出抗体であってＮａｎｏＬｕｃのＬＢ断片に結合している検出抗体と、標的抗原との融合タンパク質を有する。この新しいアッセイ形式は、大きいおよび／または構造的に複雑な不連続エピトープに結合する治療抗体の検出に特に魅力的である。ここで報告されたアッセイは、標的抗体－ＴＮＦα－複合体に特異的な検出抗体を用いて、他のＴＮＦα－結合抗体の検出のために容易に補正できる。センサ原理は、他の抗体にさらに拡大でき、抗原－ＳＢ融合タンパク質を生成でき、標的抗体に特異的に結合するか（抗原結合部位にではない）、または標的抗体およびその抗原の複合体に結合する特異的な検出抗体が利用可能である。
上述のように、ＴＮＦα結合抗体の直接検出のために、スプリットＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼの補完に基づく一般的な均質イムノアッセイ形式を開発した。２５ｐＭのＬＯＤおよび大きい動的範囲で希釈した血漿におけるアダリムマブのレシオメトリック検出に成功したことによって概念実証をもたらした。２つの抗体に基づくサンドイッチイムノアッセイ形式に対して、ここで導入されたアッセイ形式は、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼのＳＢ断片と、アダリムマブ－ＴＮＦα複合体に結合する単一の検出抗体であってＮａｎｏＬｕｃのＬＢ断片に結合している検出抗体と、標的抗原との融合タンパク質を有する。この新しいアッセイ形式は、大きいおよび／または構造的に複雑な不連続エピトープに結合する治療抗体の検出に特に魅力的である。ここで報告されたアッセイは、標的抗体－ＴＮＦα－複合体に特異的な検出抗体を用いて、他のＴＮＦα－結合抗体の検出のために容易に補正できる。センサ原理は、他の抗体にさらに拡大でき、抗原－ＳＢ融合タンパク質を生成でき、標的抗体に特異的に結合するか（抗原結合部位にではない）、または標的抗体およびその抗原の複合体に結合する特異的な検出抗体が利用可能である。
【0054】
実施例３．赤色にシフトしたキャリブレータルシフェラーゼの開発
赤色にシフトしたＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを開発するために、ＮａｎｏＬｕｃからフルオロフォアへ非常に効率的な生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）をするフルオロフォア標識ＮａｎｏＬｕｃコンストラクトを開発した。Ｃｙ３フルオロフォアは５６３ｎｍで発光が最大となり、その励起スペクトルは、ＮａｎｏＬｕｃ発光と重複するスペクトルを有し、それ故に、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼにマレイミド－チオールカップリングによって組み込むのに選択した。これを達成するために、ＮａｎｏＬｕｃの天然システイン（Ｃｙｓ１７５）を最初にセリンで置換した後、部位特異的な変異誘発して、Ｎ末端近く、Ｃ末端近く、またはタンパク質折り畳みおよび生物発光適合が破壊されないと思われる利用可能なループにシステイン残基を導入した。その後、Ｃｙ３で標識した後、各変異体についてＢＲＥＴ効率を決定し、可能性のあるＣｙ３結合部位としてＫ９Ｃ、Ｄ１５７ＣおよびＧ１９１Ｃを示した。次いで、ＢＲＥＴ効率をさらに改善するために、これらの変異位置を組み合わせることによる二重および三重の部位変異体を、複数のＣｙ３を１つのＮａｎｏＬｕｃタンパク質にカップリングするために構築した。三重変異体Ｋ９Ｃ／Ｄ１５７Ｃ／Ｇ１９１Ｃが、およそ１４０％の適切なＣｙ３標識収量および高いＢＲＥＴ効率で最終的に得られた。Ｋ９Ｃ／Ｄ１５７Ｃ／Ｇ１９１Ｃバリアントは、デジタルカメラによって補足される橙色発光を発し（図１８Ａ）、発光は５６８ｎｍで最大である（図１８Ｂ）。
赤色にシフトしたＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを開発するために、ＮａｎｏＬｕｃからフルオロフォアへ非常に効率的な生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）をするフルオロフォア標識ＮａｎｏＬｕｃコンストラクトを開発した。Ｃｙ３フルオロフォアは５６３ｎｍで発光が最大となり、その励起スペクトルは、ＮａｎｏＬｕｃ発光と重複するスペクトルを有し、それ故に、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼにマレイミド－チオールカップリングによって組み込むのに選択した。これを達成するために、ＮａｎｏＬｕｃの天然システイン（Ｃｙｓ１７５）を最初にセリンで置換した後、部位特異的な変異誘発して、Ｎ末端近く、Ｃ末端近く、またはタンパク質折り畳みおよび生物発光適合が破壊されないと思われる利用可能なループにシステイン残基を導入した。その後、Ｃｙ３で標識した後、各変異体についてＢＲＥＴ効率を決定し、可能性のあるＣｙ３結合部位としてＫ９Ｃ、Ｄ１５７ＣおよびＧ１９１Ｃを示した。次いで、ＢＲＥＴ効率をさらに改善するために、これらの変異位置を組み合わせることによる二重および三重の部位変異体を、複数のＣｙ３を１つのＮａｎｏＬｕｃタンパク質にカップリングするために構築した。三重変異体Ｋ９Ｃ／Ｄ１５７Ｃ／Ｇ１９１Ｃが、およそ１４０％の適切なＣｙ３標識収量および高いＢＲＥＴ効率で最終的に得られた。Ｋ９Ｃ／Ｄ１５７Ｃ／Ｇ１９１Ｃバリアントは、デジタルカメラによって補足される橙色発光を発し（図１８Ａ）、発光は５６８ｎｍで最大である（図１８Ｂ）。
【0055】
次に、Ｃｙ３で標識したＫ９Ｃ／Ｄ１５７Ｃ／Ｇ１９１Ｃをキャリブレータルシフェラーゼとして使用して、１９Ｃ７－ＬＢおよび４Ｃ２－ＳＢセンサタンパク質を用いてｃＴｎＩのレシオメトリックアッセイを実施した。この赤色にシフトしたキャリブレータは、緑色キャリブレータＮＬ－ｍＮＧより優れている４５の最大比率変化を可能にし、ｃＴｎＩのレシオメトリックアッセイにおいて２５の最大比率変化を与えた（図１９）。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】