特許 7619556 動脈病変を検出し、並びに、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌を検出する、体液抗体バイオマーカー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-14

(45)【発行日】2025-01-22

(54)【発明の名称】動脈病変を検出し、並びに、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌を検出する、体液抗体バイオマーカー

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20250115BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20250115BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 N

G01N33/543 501A

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020170489

(22)【出願日】2020-10-08

(65)【公開番号】P2022062465

(43)【公開日】2022-04-20

【審査請求日】2023-09-21

(73)【特許権者】

【識別番号】000224123

【氏名又は名称】藤倉化成株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】304021831

【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学

(74)【代理人】

【識別番号】100103160

【弁理士】

【氏名又は名称】志村 光春

(72)【発明者】

【氏名】黒田 英行

(72)【発明者】

【氏名】中村 利華

(72)【発明者】

【氏名】冨吉 郷

(72)【発明者】

【氏名】日和佐 隆樹

【審査官】大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５１６１５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５１３９５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】LAURIAT, Tara L. et al.，Characterization of KIAA0513, a novel signaling molecule that interacts with modulators of neuroplasticity,apoptosisi, and the cytoskeleton，BRAIN RESEARCH，2016年，Vol.1121, No.1，pp.1-11，doi:10.1016/j.brainres.2006.08.099

【文献】MARCZOK, Stefanie et al.，Comprehensive Analysis of Genome Rearrangements in Eight Human Malignant Tumor Tissues，PLOS ONE，2016年，Vol.11, No.7:e0158995，pp.1-18，doi:10.1371/ journal.pone.0158995

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇データを、動脈病変の存在データとして取得する、データ取得方法。

【請求項2】

ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇データを、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとして取得する、データ取得方法。

【請求項3】

脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データを、これらの疾病に伴う動脈病変のデータとして取得する、請求項２に記載のデータ取得方法。

【請求項4】

生体から分離された体液サンプルは、血液サンプルであることを特徴とする、請求項１－３のいずれか１項に記載のデータ取得方法。

【請求項5】

血液サンプルは、血清又は血漿であることを特徴とする、請求項４に記載のデータ取得方法。

【請求項6】

抗体レベル測定法は、イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、又は、ＣＬＥＩＡ法であることを特徴とする、請求項１－５のいずれか１項に記載のデータ取得方法。

【請求項7】

請求項１－６のいずれか１項に記載のデータ取得方法を行うための、データ取得用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は疾患のデータ取得手段ないし検出手段に関する発明であり、より具体的にはＫＩＡＡ０５１３蛋白質、又はこれらの部分配列を持つペプチド、に対する体液抗体をバイオマーカーとして測定することによる、動脈病変に関するデータ取得手段ないし検出手段、並びに、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、固形癌等に関するデータ取得手段ないし検出手段に関する発明である。

【背景技術】

【0002】

近年はさまざまな疾患バイオマーカーが発見され、簡便な血液検査等により病状把握、発病予測、予後予測、予防／治療標的の同定などの目的で開発が進められている。バイオマーカーも古くは酵素マーカー、抗原マーカー、そして近年ではＤＮＡ／ＲＮＡマーカーが報告されている。一方、体液抗体マーカーはまだ報告例は少なく、実用化された例も少ない。脳心臓血管障害においても抗体マーカーが同定されている。たとえば、急性脳梗塞（ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ；ＡＩＳ）の抗体マーカーとしてＨｓｐ６０（非特許文献１）、ＲＰＡ２（非特許文献２）、ＳＯＳＴＤＣ１（非特許文献３）、ＰＤＣＤ１１（非特許文献４）、ＭＭＰ１、ＣＢＸ１、及びＣＢＸ５（非特許文献５）；アテローム性動脈硬化症のマーカーとしてＡＴＰ２Ｂ４（非特許文献６）、ＢＭＰ－１（非特許文献２、６）、ＤＨＰＳ（非特許文献７）、ＳＨ３ＢＰ５（非特許文献８）、ｐｒｏｌｙｌｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ（非特許文献９）；急性冠症候群のｎａｒｄｉｌｙｓｉｎ（ＮＲＤ１）（非特許文献１０）；糖尿病（ＤＭ）のマーカーとしてＴＵＢＢ２Ｃ（非特許文献１１）、インスリン（非特許文献１２）、ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（非特許文献１３）、アディポネクチン（非特許文献１４）、ＧＡＤＤ３４（非特許文献１５）等がある。

【0003】

また、がんの抗体バイオマーカーとしては、抗ｐ５３抗体が食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）や頭頸部癌の診断、モニタリング、予後予測に役立つマーカーとして実用化されている（非特許文献１６、１７）。本発明者らのグループは組換えｃＤＮＡ発現クローニング（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ； ＳＥＲＥＸ）法によりスクリーニングし、ＥＳＣＣの抗体マーカーとしてＴｒｏｐ２／ＴＡＣＳＴＤ２（非特許文献１８）、ＳＬＣ２Ａ１（非特許文献１９）、ＴＲＩＭ２１（非特許文献２０）、ｍｙｏｍｅｇａｌｉｎ（非特許文献２１）、ｍａｋｏｒｉｎ １（非特許文献２２）、ＥＣＳＡ（非特許文献２３）、及びｃｙｃｌｉｎ Ｌ２（ＣＣＮＬ２）（非特許文献２４）；大腸癌に対するＦＩＲ ／ ＰＵＦ６０（非特許文献２５）；及びグリオーマに対するＳＨ３ＧＬ１（非特許文献２６）及び抗フィラミンＣ（非特許文献２７）を発見し報告した。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Kramer J, Harcos P, Prohaszka Z, et al. Frequencies of certain complement protein alleles and serum levels of anti-heat-shock protein antibodies in cerebrovascular diseases. Stroke. 2000;31:2648-2652. PMID: 11062289

【文献】Machida T, Kubota M, Kobayashi E, et al. Identification of stroke-associated-antigens via screening of recombinant proteins from the human expression cDNA library (SEREX). J Translat Med. 2015;13:71. PMID: 25890248

【文献】Goto K, Sugiyama T, Matsumura R, et al. Identification of cerebral infarction-specific antibody markers from autoantibodies detected in patients with systemic lupus erythematosus. J Mol Biomark Diagnos. 2015;6:2. doi.org/10.4172/2155-9929.1000219

【文献】Yoshida Y, Wang H, Hiwasa T, et al. Elevation of autoantibody level against PDCD11 in patients with transient ischemic attack. Oncotarget. 2018; 9, 8836-8848. PMID: 29507658

【文献】Wang H, Zhang XM, Tomiyoshi G, et al. Association of serum levels of antibodies against MMP1, CBX1, and CBX5 with transient ischemic attack and cerebral infarction. Oncotarget. 2018;9:5600-5613. PMID: 29464021

【文献】Hiwasa T, Machida T, Zhang XM, et al. Elevated levels of autoantibodies against ATP2B4 and BMP-1 in sera of patients with atherosclerosis-related diseases. Immunome Res. 2015;11:097. doi.org/10.4172/1745-7580.1000097

【文献】Nakamura R, Tomiyoshi G, Shinmen N, et al. An anti-deoxyhypusine synthase antibody as a marker of atherosclerosis-related cerebral infarction, myocardial infarction, diabetes mellitus, and chronic kidney disease. SM Atheroscler J. 2017;1:1001. doi: http://smjournals.com/atherosclerosis/in-press.php#x

【文献】Hiwasa T, Tomiyoshi G, Nakamura R, et al. Serum SH3BP5-specific antibody level is a biomarker of atherosclerosis. Immunome Res. 2017;13:132. doi: 10.4172/17457580.1000132

【文献】Zhang XM, Wang H, Mine S, et al. Association of serum anti-prolylcarboxypeptidase antibody marker with atherosclerotic diseases accompanied by hypertension. J Mol Biomark Diagn. 2017;8:361. doi: 10.4172/2155-9929.1000361

【文献】Chen PM, Ohno M, Hiwasa T, et al. Nardilysin is a promising biomarker for the early diagnosis of acute coronary syndrome. Int J Cardiol. 2017;243:1-8. PMID: 28747015

【文献】Hiwasa T, Zhang XM, Kimura R, et al. Association of serum antibody levels against TUBB2C with diabetes and cerebral infarction. Integ Biomed Sci. 2015;1:49-63. doi: 10.18314/gjbs.v1i2.27

【文献】Palmer JP, Asplin CM, Clemons P, et al. Insulin antibodies in insulin-dependent diabetics before insulin treatment. Science. 1983;222:1337-1339. PMID: 6362005

【文献】Baekkeskov S, Aanstoot H, Christgau S, et al. Identification of the 64K autoantigen in insulin dependent diabetes as the GABA-synthesizing enzyme glutamic acid decarboxylase. Nature. 1990;347:151-156. PMID: 1697648

【文献】Hiwasa T, Zhang XM, Kimura R, et al. Elevated adiponectin antibody levels in sera of patients with atherosclerosis-related coronary artery disease, cerebral infarction, and diabetes mellitus. J Circ Biomark. 2016;5:8. doi: 10.5772/63218

【文献】Sugimoto K, Tomiyoshi G, Mori M, et al. Identification of serum anti-GADD34 antibody as a common marker of diabetes mellitus and Parkinson disease. J Alzheimers Dis Parkinsonism. 2017;7:358. doi: 10.4172/2161-0460.1000358

【文献】Shimada H, Takeda A, Arima M, et al. Serum p53 antibody is a useful tumor marker in superficial esophageal squamous cell carcinoma. Cancer. 2000;89:1677-1683. PMID: 11042560

【文献】Shimada H, Ochiai T, Nomura F, et al. Japan p53 Antibody Research Group. Titration of serum p53 antibodies in 1,085 patients with various types of malignant tumors: a multiinstitutional analysis by the Japan p53 Antibody Research Group. Cancer. 2003;97:682-689. PMID: 12548611

【文献】Nakashima K, Shimada H, Ochiai T, et al. Serological identification of TROP2 by recombinant cDNA expression cloning using sera of patients with esophageal squamous cell carcinoma. Int J Cancer. 2004;112:1029-1035. PMID: 15386348

【文献】Kuboshima M, Shimada H, Liu TL, et al. Identification of a novel SEREX antigen, SLC2A1/GLUT1, in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Oncol. 2006;28:463-468. PMID: 16391802

【文献】Kuboshima M, Shimada H, Liu TL, et al. Presence of serum tripartite motif-containing 21 antibodies in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Sci. 2006;97:380-386. PMID: 16630135

【文献】Shimada H, Kuboshima M, Shiratori T, et al. Serum anti-myomegalin antibodies in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Int J Oncol. 2007;30:97-103. PMID: 17143517

【文献】Shimada H, Shiratori T, Yasuraoka M, et al. Identification of makorin 1 as a novel SEREX antigen of esophageal squamous cell carcinoma. BMC Cancer. 2009;9:232. PMID: 19604354

【文献】Kagaya A, Shimada H, Shiratori T, et al. Identification of a novel SEREX antigen family, ECSA, in esophageal squamous cell carcinoma. Proteome Sci. 2011;9:31. PMID: 21696638

【文献】Shimada H, Ito M, Kagaya A, et al. Elevated serum antibody levels against cyclin L2 in patients with esophageal squamous cell carcinoma. J Cancer Sci Ther. 2015;7:60-66. doi:10.4172/1948-5956.1000326

【文献】Kobayashi S, Hoshino T, Hiwasa T, et al. Anti-FIRs (PUF60) auto-antibodies are detected in the sera of early-stage colon cancer patients. Oncotarget. 2016;7:82493-82503. PMID: 27756887

【文献】Matsutani T, Hiwasa T, Takiguchi M, et al. Autologous antibody to src-homology 3-domain GRB2-like 1 specifically increases in the sera of patients with low-grade gliomas. Exp Clin Cancer Res. 2012;31:85. PMID: 23050879

【文献】Adachi-Hayama M, Adachi A, Shinozaki N, et al. Circulating anti-filamin C antibody as a potential serum biomarker for low-grade gliomas. BMC Cancer. 2014;14:452. PMID: 24946857

【文献】Makrilia N, Lappa T, Xyla V, et al. The role of angiogenesis in solid tumours: an overview. Eur J Intern Med. 2009;20:663-671. PMID: 19818284

【文献】Jarvandi S, Davidson NO, Schootman M. Increased risk of colorectal cancer in type 2 diabetes is independent of diet quality. PLoS One. 2013;8:e74616. PMID: 24069323

【文献】Fujihara S, Kato K, Morishita A, et al. Antidiabetic drug metformin inhibits esophageal adenocarcinoma cell proliferation in vitro and in vivo. Int J Oncol. 2015;46:2172-2180. PMID: 25709052

【文献】Berger NA. Young Adult Cancer: Influence of the Obesity Pandemic. Obesity (Silver Spring). 2018;26:641-650. PMID: 29570247

【文献】Hiwasa T, Shimada H. Autoantibody in Cancer. In: Shimada H, ed. Biomarkers in Cancer Therapy (ISBN: 978-981-13-7295-7), Singapore, Springer Nature. 2018:25-40. https://doi.org/10.1007/978-981-13-7295-7_3

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

がん、心疾患、脳血管疾患、腎不全は日本人の死因のそれぞれ第１位、第２位、第４位、第８位を占める（厚生労働省２０１８年人口動態統計）。その他の第３位、第５位、第６位、第７位、第９位、第１０位はそれぞれ老衰、肺炎、不慮の事故、誤嚥性肺炎、認知症、自殺である。すなわち上記死因の中で、がん、心疾患、脳血管疾患、腎不全、さらにこれらの器質的な疾患のリスクファクターとなる糖尿病は早期診断等の健康管理により発症や進行を抑えることができる病気である。従って、疾患マーカーを用いて、それらに対する適切な処置、治療、生活指導等を行うことができれば、ヒトの健康増進に大いに貢献できる。

【0006】

さらに２０２０年現在、新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）が世界的に流行しており、新型コロナウイルスが重篤化する要素として、「糖尿病、心疾患、脳血管疾患、がん、腎臓病等の基礎疾患の有無」が挙げられている。新型コロナウイルスのみならず、これらの基礎疾患の有無は、感染症の重篤化の一般的な要素であるともいえる。従って、かかる感染症の重篤化の要素である「基礎疾患の有無」を手軽に判定するバイオマーカーの提供が急務となっている。

【0007】

このことを踏まえて背景技術についてさらに検討すると、上記のアテローム性動脈硬化症のマーカーであるＡＴＰ２Ｂ４、ＢＭＰ－１、ＤＨＰＳの体液抗体は、食道癌の患者血清においても上昇していた（非特許文献６、７）。このことはアテローム性動脈硬化等の動脈硬化が代表例として挙げられる「動脈の病変」が、発がんを促進することを示している。実際に、「動脈の病変」の例として挙げられる「血管新生」は、固形癌の進展に必須であり（非特許文献２８）、動脈硬化を誘導する糖尿病や肥満は、大腸癌や食道癌のリスクファクターとなっている（非特許文献２９、３０、３１）。そして、体内の臓器や器官は多かれ少なかれ相互に影響を与えている（非特許文献３２）のであるから、動脈硬化や血管新生等の「動脈の病変」を検出することができれば、脳心臓血管障害、糖尿病、腎臓病、固形癌等の徴候を捉えることが可能になり、さらにこれらの疾病の早期発見にも繋がるものと考えられる。これらの疾患は生命に関わる重大疾患であり、単一のバイオマーカーで、その徴候の検出や早期発見が可能となれば、その意義は大きい。

【0008】

また、感染症の重篤化の要素となる「基礎疾患の有無」を、単一のバイオマーカーで簡易に判定する手段を提供する意義も非常に大きい。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、体液中のＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する抗体レベルの上昇を測定することにより、動脈病変の存在を検出し、これを、動脈病変を伴う疾患の兆候若しくは存在のデータとして取得できることを見出した。さらに、上記体液抗体レベルの上昇を測定することにより、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとして取得できることを見出した。さらに、上記脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データは、これらの疾病に伴う動脈病変のデータとすることもできることを見出した。さらに、体液中のＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する抗体レベルの上昇を指標として、動脈病変の存在を検出し、これを、動脈病変を伴う疾患の徴候若しくは存在のデータ、或いは、上記脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとして、感染症の重篤化の要素となる基礎疾患の有無の判断が可能であることを見出した。

【0010】

すなわち本発明は、第１に、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１又は２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇データを、動脈病変の存在データとして取得する、データ取得方法（以下、「本発明のデータ取得方法１」ともいう）を提供する。

【0011】

第２に、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１又は２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇データを、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとして取得する、データ取得方法（以下、「本発明のデータ取得方法２」ともいう）を提供する。

【0012】

本発明のデータ取得方法２で得られる疾病の潜在若しくは顕在データは、これらの疾病に伴う動脈病変のデータとして取得することが可能である。

【0013】

本明細書において、「本発明のデータ取得方法」と記載されている場合は、特に断らない限り、本発明のデータ取得方法１と２を総称するものである。

【0014】

ＫＩＡＡ０５１３蛋白質には３つのスプライシングバリアントが知られている。アイソフォームｃ（３０１アミノ酸、ＮＰ＿００１２８４６９５．１：配列番号１）、アイソフォームｂ（３０１アミノ酸、ＮＰ＿００１２７３４９５．１）、及びアイソフォームａ（４１１アミノ酸、ＮＰ＿０５５５４７．１：配列番号２）である。

【0015】

ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ及びｂの全長３０１アミノ酸は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａの最初の３０１アミノ酸と完全に同じである。ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ及びｂは、各々がコードされるｍＲＮＡ前駆体の塩基配列は異なるが、スプライシングを受けた成熟ｍＲＮＡを鋳型として発現するＫＩＡＡ０５１３蛋白質、としてのアミノ酸配列は同一である。従って、本明細書では、特に断らずに「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質」と記載する場合は、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質アイソフォームｂ及び／又はｃ（配列番号１）を意味し、アイソフォームａの場合は別途明記する。

【0016】

本発明者らはまた、ＧＳＴ－ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃとａを精製し、健常者（ＨＤ）血清、急性脳梗塞（ＡＩＳ）の患者血清、及び心血管障害（ＣＶＤ）の患者血清におけるＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体を調べた（実施例６）。

【0017】

その結果、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃとａは、ＨＤと比較して、ＡＩＳ患者及びＣＶＤ患者の血清において、より高い抗体レベルを示し（図７ａ、ｂ）、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃの反応性は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａの反応性より高かったが、相対的には両者は密接に相関していた（図７ｃ）。

【0018】

これは、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する体液抗体の主要なエピトープ部位は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ、及びａの最初の３０１アミノ酸に位置していることを意味している。このことは、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する体液抗体を、抗原抗体反応を用いて検出するために用いる、「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質の一部」は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ、ｂ、及びａの上記の重複アミノ酸配列の領域を含めることが好適であることがわかる。

【0019】

本発明のデータ取得方法の別の表現として、例えば、「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇を指標として、動脈病変を検出する方法。」、及び、「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質、又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇を指標として、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌を、診断或いは検出する方法。」等が挙げられる。

【0020】

さらに、本発明は、本発明のデータ取得方法１又は２を行うための、データ取得用キット（以下、本発明のキットともいう）を提供する。

【0021】

本発明のデータ取得用キットの別の表現として、例えば、上記の「『ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質、又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇を指標として、動脈病変を検出する方法、』、及び、『ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質又はその一部、に対する生体から分離された体液サンプル中の抗体レベルを測定し、当該抗体レベルの上昇を指標として、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌を、診断或いは検出する方法、』等を行うためのキット。」が挙げられる。

【発明の効果】

【0022】

本発明により、第１に、動脈病変の存在のデータを取得することが可能となる。これらにより、動脈病変を伴う疾患の兆候、存在を把握し、当該データに基づいた生活指導、投薬等の措置を行う途を提供することにより、健康増進や疾病の予防・治療に貢献することが可能である。第２に、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データを取得することが可能になる。これにより、上記重篤疾患の発症予測、及び早期検出を行い、当該データに基づいた生活指導、投薬等の措置を行う途を提供することにより、疾病の予防・治療に貢献することが可能である。

【0023】

さらに本発明により、感染症の重篤化の要素となる基礎疾患の有無を判断する基礎データが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】健常者（ＨＤ）、急性脳梗塞（ＡＩＳ）患者及び一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）患者における、ＫＩＡＡ０５１３血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により定量した結果を示す。ＫＩＡＡ０５１３蛋白質抗原を用いた場合の結果をａに分布図で示している。これらの分布図の縦軸は抗体レベルを示すアルファカウントであり、各分布図のバーは、平均値、及び平均値±ＳＤ値を示す。ＲＯＣ解析の結果をｂとｃに示している。ＲＯＣ図内の数値は、ＡＵＣ値、カットオフ値、感度、特異度、９５％信頼区間である。

【図2】ＨＤ、及び糖尿病（ＤＭ）患者における、ＫＩＡＡ０５１３血清抗体レベルを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。ＫＩＡＡ０５１３蛋白質抗原を用いた場合の結果をａに示している。ＲＯＣ解析の結果をｂに示している。分布図とＲＯＣ図の説明は図１に記載したとおりである。

【図3】ＨＤ、心血管障害（ＣＶＤ）及び睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡＳ）患者における、ＫＩＡＡ０５１３血清抗体レベルを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。分布図をａに、ＲＯＣ解析の結果をｂとｃに示している。分布図とＲＯＣ解析図の説明は図１に記載したとおりである。

【図4】ＨＤと慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者における、ＫＩＡＡ０５１３血清抗体レベルを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。ＫＩＡＡ０５１３蛋白質抗原を用いた場合の結果を示す。分布図をａに、ＲＯＣ解析の結果をｂとｃとｄに示している。分布図とＲＯＣ解析図の説明は図１に記載したとおりである。

【図5】ＨＤと癌患者における、ＫＩＡＡ０５１３血清抗体レベルを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。ＫＩＡＡ０５１３蛋白質抗原を用いた場合のＨＤ、食道癌（ＥＣ）、胃癌（ＧＣ）、大腸癌（ＣＣ）、肺癌（ＬＣ）、及び乳癌（ＭＣ）の血清抗体レベルを示す。分布図をａに、ＲＯＣ解析の結果をｂ－ｆに示している。分布図とＲＯＣ解析図の説明は図１に記載したとおりである。

【図6】食道癌（ＥＣ）及び胃癌（ＧＣ）の術後症例におけるＫＩＡＡ０５１３抗体陽性例と陰性例の生存率の比較。手術後の生存率をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｙｅｒプロットにより比較した。

【図7】ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ、及びアイソフォームａを抗原としたときの血清抗体レベルの比較。ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ（ａ）、及びＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａ（ｂ）に対するＨＤ、及びＡＩＳ、ＣＶＤの患者血清抗体レベルを散布図により示した。（ｃ）は、各検体のＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ、及びアイソフォームａを抗原とした時の抗体レベル（アルファ値）の相関図である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

（１）本発明のデータ取得方法
（ａ）取得データ
本発明のデータ取得方法１における取得データは、「動脈病変の存在データ」である。動脈病変は、動脈の構造又は構成因子の異常であり、閉塞、拡張、瘻形成等の形態がある。動脈硬化（アテローム動脈硬化、細動脈硬化、中膜硬化）、慢性炎症や固形癌における異常な血管新生等が、動脈病変の進行に伴って顕れる。また、動脈硬化は多くの場合、糖尿病や肥満の進行により引き起こされることが知られており、脳心臓血管障害、慢性腎臓病、大動脈瘤、網膜症、足壊疽等は、動脈硬化、特に、アテローム動脈硬化の進行に伴い引き起こされることが知られている。糖尿病や肥満は、固形癌（大腸癌、食道癌等）のリスクファクターでもある。従って、本発明のデータ取得方法１により得られる「動脈病変の存在データ」は、糖尿病、動脈硬化、固形癌等の発生や進行の可能性のデータとして用いることが可能であり、さらに、脳心臓血管障害、慢性腎臓病、大動脈瘤、網膜症、足壊疽等の重篤な循環系疾患の潜在又は顕在のデータとして用いることができる。

【0026】

本発明のデータ取得方法２における取得データは、「糖尿病、脳心臓血管障害、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在のデータ」である。脳心臓血管障害としては、脳梗塞、脳卒中、心筋梗塞、狭心症等が挙げられる。また、固形癌としては、食道癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌等が挙げられ、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する体液抗体レベルの上昇は、食道癌、大腸癌、胃癌、又は肺癌についての潜在若しくは顕在データとしての確度が高く、特に食道癌についての確度が高い。本発明のデータ取得方法２は、データ取得方法１と重なり合う場合が多い。

【0027】

例えば、被験者に対して定期的に本発明のデータ取得方法１又は２を行い、「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質」に対する体液抗体レベルをモニタリングすることにより、上記した疾患の発症の予測を確度良く行うことができる。特に、脳梗塞や心筋梗塞等の循環系の重篤な疾患や、固形癌は一度発症すると生命の危険を伴い、たとえ死に至らなくとも重い後遺症に悩まされる。従って、これらの発症を予測することが最善であり、抗ＫＩＡＡ０５１３体液抗体マーカーはそのような発症予測のデータ取得を行うためのバイオマーカーとして用いることができる。

【0028】

さらに、特定の感染症の流行が認められる際に、その重症化の要素となる基礎疾患の有無を、本発明のデータ取得方法１又は２により得られたデータを基に判断することにより、当該感染症罹患者の扱いをより適切に行うことができる。得られたデータが、例えば動脈病変の存在を示唆する場合には、上記感染症に罹患した被験者の優先的な入院措置を行い、重症化に備えることが可能である。そのような示唆が認められない場合には自宅待機扱いとして、病院の医療担当者やベッド等の効率的な分配を行い、上記の罹患した被験者各々の重症化リスクに応じた処置を行うことが可能であり、感染症流行による医療担当者やベッド不足による医療崩壊リスクを減じることができる。

【0029】

上記の感染症は、各種ウイルス疾患、細菌疾患等であって、基礎疾患の有無が重症化の要素となるものであれば特に限定されないが、特に、流行規模が大きい、気道系の感染症は、集団検診により重症化リスクが見積もられるのが望ましく、特に、イムノクロマト等の簡便な形態とした本発明を適用する対象として好適である。上記の感染症としては、新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）、ＳＡＲＳ、ＭＡＲＳ等のベータコロナウイルスによる感染症；インフルエンザウイルスによる感染症；ＲＳウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス等による感染症等の気道系の感染症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0030】

（ｂ）生体から分離された体液サンプル
本発明のデータ取得方法におけるデータ取得の対象として用いられる「生体から分離された体液サンプル」の体液とは、血液、リンパ液等であり、「サンプル」とは、身体から分離された状態の当該体液そのもの、又は、処理物である。当該体液サンプルの中でも血液サンプルが好適である。血液サンプルとしては、全血、血清、血漿等のサンプルが挙げられるが、血清サンプル又は血漿サンプルが好ましく、血清サンプルが特に好ましい。血液サンプルは、ヘパリン処理等の凝固防止処理が施されていてもよい。

【0031】

（ｃ）体液抗体捕捉抗原（ＫＩＡＡ０５１３抗原）
配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のＫＩＡＡ０５１３蛋白質は、本発明のデータ取得方法における体液抗体を捕捉する基礎である。当該ＫＩＡＡ０５１３蛋白質は、全部を体液抗体捕捉抗原として用いることも、一部を用いることも可能である。さらに、より効率的な検出系の確立のために、短い鎖長のアミノ酸配列（ペプチド）を選択することも可能であり、その場合のアミノ酸配列の個数は、７－３０個程度が好適であり、さらに好適には１０－２０個程度である。

【0032】

また、これらのアミノ酸配列の全部又は一部のうち、１０％以下の個数のアミノ酸残基（小数点以下は切り捨て）が、改変（欠失、置換、又は、追加）されていてもよい。ただし、目的の体液抗体（ＫＩＡＡ０５１３蛋白質、又はそれらの部分配列を持つペプチドに対する体液抗体）の捕捉が可能であること、すなわち、アミノ酸残基を改変した体液抗体捕捉抗原候補が、例えば、本明細書の実施例の手法と同様の手法で体液抗体の捕捉を行った場合に、その捕捉抗体レベルから、目的とする動脈病変や疾患のデータを取得可能であることが必要である。

【0033】

「欠失」とは、対象となるアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が欠失しており、当該欠失したアミノ酸残基のＮ末端側（前）とＣ末端側（後）のアミノ酸残基がペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基の欠失の場合は、当該アミノ酸残基が単に欠失した状態である）、当該欠失残基の個数が「アミノ酸欠失の個数」として数えられる。「置換」とは、対象となるアミノ酸配列におけるいずれかのアミノ酸残基が「他のアミノ酸残基」に入れ替わっており、当該入れ替わったアミノ酸残基が、Ｎ末端側（前）とＣ末端側（後）の各アミノ酸残基とペプチド結合で結ばれた状態であり（Ｎ末端アミノ酸残基の置換の場合はＣ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみであり、Ｃ末端アミノ酸残基の置換の場合はＮ末端側のアミノ酸残基とのペプチド結合のみである）、当該置換残基の個数が「アミノ酸置換の個数」として数えられる。「付加」とは、対象となるアミノ酸配列における、いずれか１箇所以上のペプチド結合の位置に、各々１個以上の新たなアミノ酸残基が挿入された状態で新たなペプチド結合が形成された状態である。Ｎ末端とＣ末端における新たな１個以上のアミノ酸残基の付加も、この「付加」の概念に含まれる。これらの「付加」されたアミノ酸残基の個数が「アミノ酸付加の個数」として数えられる。以下、「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を構成する配列番号１若しくは２のアミノ酸配列の蛋白質、又はその一部、或いは、当該アミノ酸配列の１０％以下の個数（小数点以下切り捨て）のアミノ酸残基が、欠失、置換、若しくは追加されている蛋白質、又はその一部」を「ＫＩＡＡ０５１３抗原」ともいう。

【0034】

所定のアミノ酸配列のＫＩＡＡ０５１３抗原は、常法に従って確保することが可能である。具体的には、例えば、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に基づくＫＩＡＡ０５１３遺伝子の塩基配列に基づいて、これらの塩基配列の全部若しくは一部を有する二本鎖ＤＮＡを増幅するための核酸増幅用プライマーを設計し、当該増幅用プライマーを用いたＰＣＲ法等による遺伝子増幅産物を、ＫＩＡＡ０５１３遺伝子の全部若しくは一部として得て、これを用いてｐＧＥＸ－４Ｔ等の原核細胞発現ベクターに組み込み、当該ベクターが組み込まれて形質転換した形質転換体を選択し、さらにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）等の薬物を添加することにより所定のＫＩＡＡ０５１３遺伝子の全部若しくは一部の発現を誘導し、発現されたＫＩＡＡ０５１３蛋白質の全部若しくは一部を、例えば、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。

【0035】

また、これらのＫＩＡＡ０５１３抗原として用いられる蛋白質又はペプチドには、必要に応じて適宜修飾構造を付加することができる。例えば、後述するように、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法において用いられる、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）－融合化蛋白質又はペプチドや、ビオチン融合化蛋白質又はペプチドとすること等も可能である。

【0036】

（ｄ）データ取得の実際
本発明のデータ取得方法では、血液サンプル等の生体から分離された体液サンプル中のＫＩＡＡ０５１３抗原、に対する抗体レベルを定量し、その定量値が標準値（カットオフ値）よりも大きい場合に、当該体液サンプル提供者におけるＫＩＡＡ０５１３抗原、の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の動脈病変の存在データ、或いは、脳心臓血管障害、糖尿病、慢性腎臓病、又は固形癌の、潜在若しくは顕在データとすることが可能である。

【0037】

被験試料におけるＫＩＡＡ０５１３抗原に対する体液抗体レベルの標準値は、例えば、健康診断において糖尿病、循環系疾患、癌等の異常が認められない者（健常者）からなる対照の標本集団を設定し、当該標本集団における当該被験試料におけるＫＩＡＡ０５１３抗原に対する上記体液抗体の定量値を求め、これに統計処理を施して、平均、標準偏差等を求めることにより、カットオフ値を含めて導き出すことができる。

【0038】

上記体液抗体レベルの測定は、例えば、ＫＩＡＡ０５１３抗原の固定化物に、生体から分離された体液サンプルを接触させ、当該生体から分離された体液サンプル内のＫＩＡＡ０５１３抗原に対する抗体の当該体液抗体捕捉抗原との抗原抗体反応に基づく結合をシグナルとして検出することにより、行うことができる。具体的には、イムノクロマト法、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法、ＥＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、ＣＬＥＩＡ法等の手段を用いて定量測定を行うことができる。ここに例示したいずれの定量測定手段も、定量標的物質を生体から分離された体液サンプル中の抗体とした場合の、確立した定量測定手段である。

【0039】

例えば、イムノクロマト法では、ＫＩＡＡ０５１３抗原を塗布したセルロース膜に、体液、及び、金コロイド結合抗ヒトＩｇＧ抗体を混合した緩衝液を加えてゆっくりと移動させ、体液中にＫＩＡＡ０５１３抗原に対する抗体が存在すれば、塗布した位置にラインが形成されるので、目視で確認できる。イムノクロマト法は、他の定量測定手段と比べて簡便化することが容易であるため、特に集団検診に適している。すなわち、本発明のデータ取得方法をイムノクロマト法に適用することで、診療所（クリニック）等の小規模施設や、保健所等においても、短時間（１０分程度）で所望の疾病関連データの取得を行うことが可能となる。

【0040】

ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法では、ＧＳＴ－融合ＫＩＡＡ０５１３抗原を体液抗体捕捉抗原とする場合は、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－結合ドナービーズを用い、体液抗体捕捉抗原、血液サンプル、及び抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させたアクセプタービーズを混合し、数時間から数日、室温でインキュベートし、形成された抗原抗体複合体に６８０ｎｍの光を照射し、発生した５２０－６２０ｎｍの光を検出することにより、所望の体液抗体の定量を行うことができる。間接蛍光抗体法では、ＫＩＡＡ０５１３抗原を固定化したプロテインアレイに生体から分離された体液サンプルを接触させて、形成されたＫＩＡＡ０５１３抗原－抗ＫＩＡＡ０５１３体液抗体複合体に対して、さらに蛍光標識を施した二次抗体を接触させて、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する体液抗体を定量することができる。ＥＬＩＳＡ法は、間接蛍光抗体法で用いる二次抗体の標識を酵素標識として定量を行うものである。二次抗体の標識は多様に選択可能である。ウェスタンブロット法では、ＫＩＡＡ０５１３抗原をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、ゲルからニトロセルロース膜等の担体に転写させ、生体から分離された体液サンプルを接触させて、生じたＫＩＡＡ０５１３抗原－抗ＫＩＡＡ０５１３体液抗体複合体を、二次抗体を用いて検出することにより定量測定を行うことができる。比濁法や比朧法では、生体から分離された体液サンプルとＫＩＡＡ０５１３抗原を接触させることにより形成されたＫＩＡＡ０５１３抗原－抗ＫＩＡＡ０５１３体液抗体複合体を、濁度（比濁法）や、散乱光強度の変化（比朧法）で検出することにより定量を行うことができる。ラテックス凝集比濁法では、ＫＩＡＡ０５１３抗原を結合させたラテックス粒子と生体から分離された体液サンプルとを接触させることにより、当該ラテックス粒子の凝集体をラテックス粒子に結合した、体液中の抗ＫＩＡＡ０５１３抗体同士の相互作用により形成させて、これを検出することにより定量を行うことができる。ＣＬＥＩＡ法では、ＫＩＡＡ０５１３抗原の結合磁性粒子と生体から分離された体液サンプルを接触させて、磁性粒子上にＫＩＡＡ０５１３抗原－抗ＫＩＡＡ０５１３抗体複合体を形成させて集磁を行い、未反応物を除去して、適切な蛍光化処理等を施して当該複合体を検出することにより定量測定を行うことができる。

【0041】

（２）本発明のキットについて
本発明のキットにおいては、例えば、ＧＳＴ－融合ＫＩＡＡ０５１３抗原、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－結合ドナービーズ、及び抗ヒトＩｇＧ－結合アクセプタービーズの組、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うための構成として挙げることができる。

【0042】

また、上記のＫＩＡＡ０５１３抗原を固定化したプレート、抗ＫＩＡＡ０５１３抗体に対する、標識がなされた二次抗体、当該二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を、ＥＬＩＳＡ法を定量測定手段として行うための、本発明のキットの構成として挙げることができる。

【0043】

また、上記のＫＩＡＡ０５１３抗原を結合させたラテックス粒子を、ラテックス凝集比濁法を行うためのキット構成として挙げることができる。

【0044】

また、上記のＫＩＡＡ０５１３抗原を結合させた磁性粒子と、抗ＫＩＡＡ０５１３抗体に対する標識がなされた二次抗体、当該二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を、ＣＬＥＩＡ法を行うためのキット構成として挙げることができる。

【0045】

ここに挙げたこれらのキットの構成はあくまでも例示であり、他の定量測定手段を行うためのキットも本発明キットの範囲に含まれる。さらに、ここに例示された上記の要素の構成をさらに少なくして、検査の外注又は自己調達の度合いを増やすように設定することも可能であり、逆に、希釈液や試薬用のチューブ等を構成として増やして、本発明のキットの即時使用を設定することも可能である。また、具体的な検査に応じた他の要素を加味することも可能である。

【実施例】

【0046】

以下、本発明の実施例を開示する。

【0047】

［製造例と解析手法］
＜本実施例において用いた抗原蛋白質＞
（１）抗原蛋白質の同定
本実施例においては、ヒト蛋白質マイクロアレイ（ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、アテローム性動脈硬化症患者の血清抗体によって認識される抗原として、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を同定した。

【0048】

「ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａ」（配列番号２）の、Ｎ末端がＧＳＴ修飾された４１１アミノ酸全長領域、又はＮ末端から３０１アミノ酸領域部分を用いた。後者の「Ｎ末端から３０１アミノ酸領域部分」はＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ（配列番号１）である。

【0049】

（２）抗原蛋白質の調製（ＫＩＡＡ０５１３蛋白質の発現と精製）
ヒトＫＩＡＡ０５１３蛋白質は下記の要領で調製した。

【0050】

ヒトＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａ、及びアイソフォームｃをコードするｃＤＮＡを、それぞれ別々にＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）遺伝子部位がクローニングサイトの上流に設けられているプラスミドベクターｐＧＥＸ－４Ｔ－１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位に挿入して、遺伝子発現用の組換えプラスミドであるｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＫＩＡＡ０５１３（アイソフォームａ）と、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ＫＩＡＡ０５１３（アイソフォームｃ）をそれぞれ作製し、これらを大腸菌ＢＬ－２１に導入して形質転換を行い、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）による、２５℃、４時間処理により、それぞれのＫＩＡＡ０５１３ｃＤＮＡの発現を誘導した。誘導後、当該大腸菌を回収し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えて溶解し、蛋白質抽出液を得た。当該蛋白質抽出液中のＧＳＴ－ＫＩＡＡ０５１３蛋白質アイソフォームａとｃは、それぞれ、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムクロマトグラフィーにより精製し、緩衝液をＰＢＳに交換し、これを上記の「ＫＩＡＡ０５１３蛋白質」とした。対照としてＧＳＴを同様に精製した。

【0051】

＜ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析＞
個別の実施例の開示に先立ち、本実施例において用いたＡｌｐｈａＬＩＳＡ法による解析の概要を以下に説明する。

【0052】

ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ）は、具体的には、３８４穴マイクロタイタープレート（ｗｈｉｔｅ ｏｐａｑｕｅ ＯｐｔｉＰｌａｔｅ^ＴＭ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて行った。各ウェルに、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，０．１％ ｃａｓｅｉｎ，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１ｍｇ／ｍＬ ｄｅｘｔｒａｎ－５００，０．０５％ Ｐｒｏｃｌｉｎ－３００）で１００倍希釈した血清を２．５μＬ、及び、抗原となるＧＳＴ、又はＫＩＡＡ０５１３蛋白質（ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａとアイソフォームｃそれぞれ）（１０μｇ／ｍＬ）を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液に希釈して混合した。６－８時間室温でインキュベートした後、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｂｅａｄｓ（２．５μＬ ａｔ ４０μｇ／ｍＬ）、及び、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－、又はｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｏｎｏｒ ｂｅａｄｓ（２．５μＬ ａｔ ４０μｇ／ｍＬ）をＡｌｐｈａＬＩＳＡ専用緩衝液に希釈して混合した。１－１４日間、室温で放置した後、ＥｎＳｐｉｒｅ Ａｌｐｈａ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で生じた光子の数を測定して、「Ａｌｐｈａ Ｃｏｕｎｔ」とした。ＫＩＡＡ０５１３蛋白質の場合はコントロールのＧＳＴを、上記ビオチン化ペプチドの場合は緩衝液コントロールの値を差し引いて、ＫＩＡＡ０５１３抗原に特異的な抗体レベルを算出した。

【0053】

［実施例１］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）患者と急性期脳梗塞（ＡＩＳ）患者における検討
ＡＩＳとは、脳の血流が滞ることにより運動機能や感覚機能に突如大きなダメージが生じる状態を言う。一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）とは、脳梗塞と同様の原因で脳神経細胞が障害を受けるが、２４時間以内、多くは数分以内に回復する疾患である。それぞれの血清検体は発症後２週間以内に採取した。

【0054】

ＡＩＳ、及びＴＩＡ患者のＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ（配列番号１）に対する血清抗体（ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓ：血清ＫＩＡＡ０５１３抗体）のレベルを調べた。健常者（ＨＤ）の血清、ＡＩＳ、及びＴＩＡの患者の血清は、千葉県立佐原病院から入手した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡの結果は、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂのレベルがＨＤよりも、ＴＩＡ及びＡＩＳの患者で有意に高かった（図１）。

【0055】

ＨＤ値の平均プラス２×標準偏差（ＳＤ）のカットオフ値を使用すると、ＨＤ、ＡＩＳ患者、ＴＩＡ患者のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂ陽性率は、それぞれ０．０％、７．６％、１５．６％であった（表１）。

【0056】

ＲＯＣ分析により、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＡＩＳ（図１ｂ）に対して０．６４３９ ［９５％信頼区間（ＣＩ）＝０．５８７３－０．７００４］、及び、ＴＩＡの場合は、０．６６０４（９５％ＣＩ＝０．５６３３－０．７５７５）（図１ｃ）。

【0057】

従って、ＡＩＳの前駆段階であるＴＩＡも同様に、血清ＫＩＡＡ０５１３抗体量と正に連関していた。この結果はｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂがＡＩＳの発症予測に有効であることを示している。

【0058】

【表1】

【0059】

［実施例２］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた糖尿病（ＤＭ）患者における検討
次に、ＤＭ患者のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。

【0060】

ＨＤ及びＤＭ患者の血清サンプルは、千葉大学医学部附属病院から入手した。

【0061】

ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルは、ＨＤのサンプルよりもＤＭの患者のサンプルで有意に高かった（図２ａ）。

【0062】

ＨＤサンプルの値の平均プラス２×ＳＤをカットオフ値とすると、ＨＤ及びＤＭ患者におけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂの陽性率は、それぞれ２．５％及び２６．５％であった（表２）。

【0063】

ＲＯＣ分析を行って、この抗体マーカーがＤＭの存在を示す能力を評価したところ、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓのＡＵＣ値は０．７３６１で、感度と特異度の値はそれぞれ５０．５５％と８７．６５％であった（図２ｂ）。

【0064】

【表2】

【0065】

［実施例３］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた心血管障害（ＣＶＤ）及び睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡＳ）患者における検討
次に、ＣＶＤ及びＯＳＡＳ患者のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。

【0066】

ＣＶＤには、千葉大学医学部附属病院から入手した急性心筋梗塞と不安定狭心症が含まれていた。ＯＳＡＳはアテローム性動脈硬化症に関連し、急性期脳梗塞（ＡＩＳ）及びＣＶＤの高いリスクで関連しているため、千葉大学医学部附属病院から入手したＯＳＡＳ患者の血清も調べた。

【0067】

その結果、ＨＤと比較したｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルは、ＣＶＤ及びＯＳＡＳ患者の双方において高かった（図３ａ）。ＨＤにおけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓの陽性率は５．３％、ＣＶＤ患者におけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓの陽性率は１０．３％、及びＯＳＡＳ患者におけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓの陽性率は１１．６％であった（表３）。

【0068】

ＲＯＣ分析により、ＣＶＤに対するｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓのＡＵＣは、０．６４９２（９５％ＣＩ：０．５８２１－０．７１６３）（図３ｂ）、及び、ＯＳＡＳに対するｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓのＡＵＣは、０．６４６３（９５％ＣＩ：０．５６１６－０．７３０９）（図３ｅ）であることが明らかになった。

【0069】

ＣＶＤのｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂのＰ値が低いこと（０．００１未満）と比較すると、ＯＳＡＳのＰ値は０．００１３であった。これは、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂマーカーとＯＳＡＳの関連がＣＶＤと比べて低いことを示唆している（表３）。すなわち、ＯＳＡＳは、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂマーカーに直接対応しているのではなく、ＯＳＡＳから併発するＣＶＤ等を介して間接的に対応していると推定された。

【0070】

【表3】

【0071】

［実施例４］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者における検討
次に、アテローム性動脈硬化に密接に関連しているＣＫＤ患者のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。

【0072】

ＣＫＤは次のように３つのグループに分けた。

【0073】

すなわち、１型、糖尿病性腎症；２型、腎硬化症；３型、糸球体腎症；と分類した。

【0074】

ＣＫＤ患者の血清サンプルは熊本コホートから、ＨＤの血清サンプルは千葉大学から取得した。

【0075】

ＣＫＤの上記３つのグループすべてにおいて、ＨＤよりもｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓの血清レベルが有意に高かった（図４ａ）。すなわち、ＨＤ、１型ＣＫＤ患者、２型ＣＫＤ患者、３型ＣＫＤ患者におけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂ陽性率は、それぞれ６．１％、２９．０％、３７．５％、及び２０．３％であり（表４）、最も高い陽性率は２型ＣＫＤの患者の血清サンプルにおいて観察された。

【0076】

ＲＯＣ分析により、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓのＡＵＣが、１型ＣＫＤ（図４ｂ）では０．７４３４（９５％ＣＩ：０．６７８３-０．８０８５）、２型ＣＫＤ（図４ｂ）では０．８０８０（９５％ＣＩ：０．７２６４-０．８８９７）（図４ｃ）、及び３型ＣＫＤでは０．６９０６（９５％ＣＩ：０．６１７７-０．７６３５）であることが明らかになった（図４ｄ）。

【0077】

【表4】

【0078】

［実施例５］ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法を用いた癌患者における検討
アテローム性動脈硬化症はしばしば癌に関連しているため、東邦大学病院から入手した食道癌（ＥＣ）、胃癌（ＧＣ）、結腸癌（ＣＣ）、肺癌（ＬＣ）、及び乳癌（ＭＣ）の患者からの血清サンプルにおけるｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルを調べた。

【0079】

その結果、ＨＤの患者に比べ、すべての癌患者の血清サンプルにおいて、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓのレベルが有意に高く、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルの最高平均値は食道癌で観察された（図５ａ、表５）。ＲＯＣ分析においても、食道癌のＡＵＣ値は０．８３００と高かった（図５ｂ－ｆ）。

【0080】

次に、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルが手術後の食道癌（ＥＣ）及び胃癌（ＧＣ）患者の生存に関連しているかどうかを調べた。ＲＯＣ分析によって得られたカットオフ値を使用して、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルを陽性と陰性に分けた（図５ｂ、ｃ）。その結果、食道癌のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂ陽性群と陰性群の間で全生存に有意差はなかったが（Ｐ＝０．３５０９）、抗体陽性群は手術後期（４０－６０週間）で予後不良の傾向を示した（図６ａ）。一方、胃癌のｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂ陽性群と陰性群の間では生存率に明らかな違いは見られなかった（図６ｂ）。

【0081】

【表5】

【0082】

［実施例６］ ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ、及びアイソフォームａを抗原としたときの血清抗体レベルの比較
ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃ（配列番号１）、及びＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａ（配列番号２）に対する健常者（ＨＤ）の血清、急性脳梗塞（ＡＩＳ）の患者血清、及び心血管障害（ＣＶＤ）の患者血清における抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡ法により調べた。

【0083】

その結果、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃとａは同様に、ＨＤと比較して、ＡＩＳ及びＣＶＤ患者の血清でより高い抗体レベルを示した（図７ａ、ｂ）。そして、血清抗体に対するＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃの反応性は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームａの反応性より高かったが、相対的には両者は密接に相関していた（図７ｃ）。

【0084】

これは、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体の主要なエピトープ部位は、ＫＩＡＡ０５１３アイソフォームｃの３０１アミノ酸に位置していることを意味している。

【0085】

［実施例７］血清抗体レベルと被験者データの相関解析
（１）Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ解析
ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルと被験者データの相関解析は、ＨＤ１３９検体、ＡＩＳ患者２２５人、ＴＩＡ患者４４人、無症候性虚血性脳卒中患者の１７検体、深部及び皮質下白質軟化症（ＤＳＷＭＨ）患者の１２２検体、慢性期脳梗塞（ＣＩＳ）患者５９検体、対照検体４１人を含む千葉県立佐原病院の６６５検体を使用して行われた。

【0086】

この分析では、マンホイットニーＵ検定を使用して、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルを、男性／女性間、ＤＭ、高血圧（ＨＴ）、ＣＶＤ、脂質異常症、及び肥満［肥満指数（ＢＭＩ）２５未満で「普通又は痩せ」、２５以上で「肥満」］の有無；喫煙及びアルコール摂取習慣の有無の間で比較した。その結果、有意差は、ＨＴの有無でのみ観察された（表６）。

【0087】

【表6】

【0088】

【表6(continued)】

【0089】

（２）Ｓｐｅａｒｍａｎの相関解析
Ｓｐｅａｒｍａｎ相関解析を用いて、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルと、年齢、身長、体重、ＢＭＩなどの一般的な情報を含む被験者パラメーター、最大内膜中膜肥厚（ｍａｘ－ＩＭＴ）を含む動脈狭窄の程度、喫煙期間（年）やアルコール摂取頻度（回／週）などのライフスタイル要因、血液検査データの連続変数との相関関係を調べた。ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓの有意な相関は、年齢、ｍａｘ－ＩＭＴ、ＡＬＰ、カリウム、Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）、体糖（ＢＳ）、及び喫煙期間との間に認められた（表７）。抗体レベルと、身長及び体重との間には逆関係が見られた。ｍａｘ－ＩＭＴとの相関は、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂレベルが狭窄及びアテローム性動脈硬化に関連していることを示している。

【0090】

同様の結果は、他のコホートを使用しても確認された。ＣＫＤコホート（３００例）のＳｐｅａｒｍａｎ相関解析は、プラークスコア、ｍａｘ－ＩＭＴ、及びＣＡＶＩ（右）との有意な相関を示した。これらはすべてアテローム性動脈硬化症の指標である（表８）。ＣＲＰはＣＫＤコホートのｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓとも関連しており、炎症の関与を示している。一方、ＣＫＤコホートでは、年齢、身長、体重、ＢＭＩ、カリウムはｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓと有意な相関を示さなかった。ＡＩＳは年齢と密接に関連しており、かつ、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－ＡｂｓはＡＩＳとの正の相関が認められるので、ｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓと加齢は、間接的に関連している可能性がある。

【0091】

【表7】

【0092】

【表7(continued)】

【0093】

【表8】

【0094】

【表8(continued)】

【0095】

［実施例のまとめ］
ヒト蛋白質マイクロアレイを用いた一次スクリーニングによって、アテローム性動脈硬化症患者の血清抗体によって認識される抗原として、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質を同定した。その後、組換えＧＳＴタグ付きＫＩＡＡ０５１３蛋白質を精製した。この精製蛋白質を抗原として使用して、血清抗体レベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡで調べた。その結果、ＡＩＳ、ＴＩＡ、ＤＭ、ＣＶＤ、ＯＳＡ、ＣＫＤ、ＥＣ、ＧＣ、ＣＣ、ＬＣ、及びＭＣの患者で、ＨＤよりも有意に高いレベルのｓ－ＫＩＡＡ０５１３－Ａｂｓを示した（図１－５、表１－５）。これらの疾患の中で、特に高いＡＵＣ値は、ＤＭ、タイプ２ ＣＫＤ、及びＥＣで観察された（図２、４、５）。さらに相関分析により、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体レベルがｍａｘ－ＩＭＴ、プラークスコア、及びＣＡＶＩとよく正相関していることがわかった。これらはすべて、アテローム性動脈硬化症関連病変の指標である（表７、８）。一方、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体レベルはＢＳとは弱く相関したが（Ｐ＝０．０２２９）（表７）、典型的なＤＭマーカーであるＨｂＡ１ｃとは相関が認められなかった（表７）。従って、ＤＭ患者はＨＤと比較して高いＫＩＡＡ０５１３蛋白質に対する血清抗体レベルを示したが、この抗体マーカーは、主にＤＭにおける血糖値の上昇を反映しているのではなく、ＤＭによって誘導される動脈硬化病変に対応していると考えられる。また、血管新生はＥＣをはじめとする固形癌の進展に必要不可欠であるので、固形癌における血管の異常形成が、動脈硬化と同じくＫＩＡＡ０５１３蛋白質の発現を促進していると考えられる。実際に、ＤＭや動脈硬化症は癌のリスクファクターとして知られている。

【0096】

現状では、ＫＩＡＡ０５１３蛋白質の機能についてはほとんどわかっていないが、シナプス伝達やアポトーシス誘導に関わる蛋白質と結合すると報告されていることから、少なくともこれらのシグナル伝達に関与していると推定されている。

【0097】

一般に体液抗体マーカーは、体液抗原マーカーよりも、疾患に関連するデータの検出感度が高い。その中でもＫＩＡＡ０５１３抗原は、特に高い抗原性を持っていることから、この抗ＫＩＡＡ０５１３体液抗体マーカーは超高感度である。しかもヒトに対して致命的な結果をもたらす、癌、脳梗塞、心筋梗塞、糖尿病、慢性腎臓病等についての潜在又は顕在の疾病データとして検出できることは勿論のこと、動脈硬化や、固形癌における異常な血管新生等の動脈病変の存在を示すデータを検出することまでもが可能であることが分かった。

【産業上の利用可能性】

【0098】

癌、脳梗塞、心筋梗塞、糖尿病、慢性腎臓病等、命に関わる重篤な疾患であっても、簡便なマーカーは少なく、しかもそれぞれの疾患について個別のマーカーを用いるしかなかった。本発明のデータ取得方法による疾病データの取得を超高感度で行うことが可能であり、かつ、これらの重篤な疾患に関するデータを包括的に検出できると共に、動脈硬化や、固形癌における異常な血管新生等の動脈病変の存在を示すデータを検出することで、疾病の予防の指標とすることも可能であり、集団検診等に最適である。

【0099】

また上記のように、本発明においては単一のバイオマーカーにより、感染症を重症化させる要素である基礎疾患の有無を包括的に検出することが可能である。例えば、新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）やインフルエンザウイルスによる気道系の感染症の流行に合わせて、本発明のデータ取得方法を集団検診において行うことで、医療担当者や病院のベッド等の効率的な分配と、より適切な治療を施すことが可能となる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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