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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-14
(45)【発行日】2025-01-22
(54)【発明の名称】ＨＢＶウイルスに対する治療におけるパロバロテンの使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/415 20060101AFI20250115BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20250115BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20250115BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20250115BHJP
【ＦＩ】
A61K31/415
A61P31/20
A61K9/08
A61K9/14
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2022576131
(86)(22)【出願日】2021-06-01
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-06
(86)【国際出願番号】 CN2021097626
(87)【国際公開番号】W WO2021249240
(87)【国際公開日】2021-12-16
【審査請求日】2023-07-11
(31)【優先権主張番号】202010531845.9
(32)【優先日】2020-06-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】516118327
【氏名又は名称】養生堂有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＹＡＮＧ ＳＨＥＮＧ ＴＡＮＧ ＣＯＭＰＡＮＹ， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】ＲＯＯＭ ２０５， ＮＯ． １７ ＬＵＮＤＵ ＲＯＡＤ， ＳＨＵＡＮＧＰＵ ＴＯＷＮ， ＸＩＨＵ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＨＡＮＧＺＨＯＵ， ＺＨＥＪＩＡＮＧ ３１００００， ＰＥＯＰＬＥ’Ｓ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＣＨＩＮＡ
(73)【特許権者】
【識別番号】504458976
【氏名又は名称】厦▲門▼大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】張 天 英
(72)【発明者】
【氏名】曹 佳 莉
(72)【発明者】
【氏名】施 恬 樹
(72)【発明者】
【氏名】馬 建
(72)【発明者】
【氏名】王 邵 娟
(72)【発明者】
【氏名】袁 權
(72)【発明者】
【氏名】張 軍
(72)【発明者】
【氏名】夏 寧 邵
【審査官】佐々木 大輔
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２１６４３０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／０７９３３９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１９－０９４２６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５１７５５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Antiviral Research，2019年，Vol.169, Article No.104538，pp.1-11，DOI: 10.1016/j.antiviral.2019.104538
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＨＢＶ治療のための、細胞におけるＨＢＶの複製若しくは繁殖の阻害のための、ＨＢＶによって引き起こされる疾患若しくは感染症の治療及び／若しくは予防のための、または抗ＨＢＶ治療若しくは細胞におけるＨＢＶの排除のための組成物であって、式Ｉ【化1】
［式中、Ｒは、ヒドロキシルである］
によって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、または前記薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物を含む、組成物。
【請求項2】
前記細胞が哺乳動物の細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記医薬組成物が薬学的に許容される担体又は賦形剤を更に含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、または前記薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物が治療有効量及び／又は予防有効量で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記医薬組成物が固体製剤、注射剤、外用製剤、噴霧剤、液体製剤又は複合製剤である、請求項１または２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年６月１１日出願された中国出願第２０２０１０５３１８４５．９号に基づき、その優先権の利益を主張する。この出願の開示は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【0002】
技術分野
本出願は、Ｂ型肝炎の抗ウイルス薬治療の分野に、詳細には式Ｉ
本出願は、Ｂ型肝炎の抗ウイルス薬治療の分野に、詳細には式Ｉ
【0003】
【化1】
【0004】
によって表される小分子薬（例えば、パロバロテン）の、抗ＨＢＶ治療における使用に関する。
【背景技術】
【0005】
背景技術
Ｂ型肝炎と略されるウイルス性Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による身体の感染によって引き起こされる疾患である。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）は、世界の人口の３．５％（２億５７００万人）がＢ型肝炎ウイルスに感染しており、毎年約５００万人が新たに感染すると推定している。世界では、毎年８００，０００人超が、慢性活動性肝炎、肝硬変及び肝細胞癌を含むＨＢＶ感染によって引き起こされる種々の肝疾患で死亡している。中国は、Ｂ型肝炎ウイルス感染の中程度の又は高い流行地である。Ｂ型肝炎ワクチンの広範な予防接種により、ＨＢＶの新たな感染数は効果的に減少しているが、中国では慢性ＨＢＶ感染者は依然として７０００万人を超え、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）患者は２０００万～３０００万人に達すると推定されており、毎年約５０万人がＨＢＶ感染で死亡し、毎年約５０万～１００万例のＢ型肝炎の新たな症例が診断されている。Ｂ型肝炎ウイルス感染は、人間の健康を深刻な危険にさらし、長期的な疾病負荷をもたらし、中国では現段階で、最も顕著な公衆衛生問題の１つとなっている。
Ｂ型肝炎と略されるウイルス性Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による身体の感染によって引き起こされる疾患である。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）は、世界の人口の３．５％（２億５７００万人）がＢ型肝炎ウイルスに感染しており、毎年約５００万人が新たに感染すると推定している。世界では、毎年８００，０００人超が、慢性活動性肝炎、肝硬変及び肝細胞癌を含むＨＢＶ感染によって引き起こされる種々の肝疾患で死亡している。中国は、Ｂ型肝炎ウイルス感染の中程度の又は高い流行地である。Ｂ型肝炎ワクチンの広範な予防接種により、ＨＢＶの新たな感染数は効果的に減少しているが、中国では慢性ＨＢＶ感染者は依然として７０００万人を超え、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）患者は２０００万～３０００万人に達すると推定されており、毎年約５０万人がＨＢＶ感染で死亡し、毎年約５０万～１００万例のＢ型肝炎の新たな症例が診断されている。Ｂ型肝炎ウイルス感染は、人間の健康を深刻な危険にさらし、長期的な疾病負荷をもたらし、中国では現段階で、最も顕著な公衆衛生問題の１つとなっている。
【0006】
現在、慢性Ｂ型肝炎患者のための主な治療薬には、ヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体（ＮＡ）及びインターフェロンα（ＩＦＮα）の２種類があり、そのうち、インターフェロンαはペグ化インターフェロンα（ＰＥＧＩＦＮα）である。ＥＵによる承認済みのＨＢＶ治療用ＮＡとしては、アデホビル（ＡＤＶ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（ＬＡＭ）、テルビブジン（ＴＢＶ）、テノホビル（ＴＤＦ）及びテノホビルアベラミド（ＴＡＦ：Ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ ａｖｅｒａｍｉｄｅ）が挙げられる。これらの薬物は、ウイルス複製を阻害し、疾患進行を遅延させ又は抑制し、肝硬変及び肝臓がんの発症リスクを低下させる。
【0007】
しかし、ＰＥＧＩＦＮα／ＮＡ薬及びその最適化された組合せの現在の臨床的使用は、高い割合の「臨床的治癒」（血清Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の排除；ウイルス複製及び患者の抗ウイルス治療の予後の重要な指標であるＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の排除；Ｂ型肝炎表面抗体が陽性であるかないかにかかわらず）を達成することが依然として困難である。既存の研究では、ＰＥＧＩＦＮα／ＮＡはウイルスの複製を防ぐことができるが、ＨＢｓＡｇレベルを効果的に低下させることも、肝臓中に安定的に存在する、共有結合的に閉環した環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ；ＨＢＶの転写及び複製テンプレートと考えられる）に直接影響を与えることもできず、したがって、治療によりウイルスの複製が長期間制御されている状態であっても、ほとんどの患者で退薬直後にウイルス学的なリバウンドが起こると考えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
慢性Ｂ型肝炎患者の血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡのレベルを効果的に低下させることができる抗ウイルス薬の開発には、慢性Ｂ型肝炎患者の抗ウイルス治療及び予後にとって緊急の実際的意義がある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
発明の内容
本発明者らは驚いたことに、自身の研究において、パロバロテン（構造式は図１に示される）治療が、インビトロ研究モデル（感染モデル：ＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１、ＨｅｐａＲＧ Ｍ１４ａ、ＰＨＨ；複製モデル：ＨｅｐＡＤ３８）における、細胞培養物上清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベル、並びに細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡのレベルを有意に低下させることができることを見出した。上記知見に基づいて、本出願を完成させた。
本発明者らは驚いたことに、自身の研究において、パロバロテン（構造式は図１に示される）治療が、インビトロ研究モデル（感染モデル：ＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１、ＨｅｐａＲＧ Ｍ１４ａ、ＰＨＨ；複製モデル：ＨｅｐＡＤ３８）における、細胞培養物上清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベル、並びに細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡのレベルを有意に低下させることができることを見出した。上記知見に基づいて、本出願を完成させた。
【0010】
本出願は、式Ｉ
【0011】
【化2】
【0012】
［式中、Ｒは、ヒドロキシル、アミノ、Ｃ１－６アルキル－アミノ－、ジ（Ｃ１－６アルキル）－アミノ－、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６ハロアルコキシ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、Ｃ３－６シクロアルキル、Ｃ３－６シクロアルコキシ、フェノキシ又はベンジルオキシである］
によって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体の使用に関する。
によって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体の使用に関する。
【0013】
特に、本出願は、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物の、抗ＨＢＶ治療用製品の製造における使用に関する。
【0014】
本出願はまた、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物の、ＨＢＶ阻害薬としての製品の製造における使用に関する。
【0015】
本出願はまた、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物の、細胞（例えば、哺乳動物の細胞）におけるＨＢＶの複製又は繁殖を阻害するための製品の製造における使用に関する。
【0016】
本出願はまた、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物の、ＨＢＶによって引き起こされる疾患又は感染症の治療及び／又は予防のための製品の製造における使用に関する。
【0017】
本出願はまた、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物の、細胞（例えば、哺乳動物の細胞）におけるＨＢＶの排除のための製品の製造における使用に関する。
【0018】
本出願はまた、抗ＨＢＶ治療における使用のための、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物に関する。
【0019】
本出願はまた、ＨＢＶ阻害薬としての使用のための、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物に関する。
【0020】
本出願はまた、細胞（例えば、哺乳動物の細胞）におけるＨＢＶの複製又は繁殖の阻害に使用するための、式Ｉよって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物に関する。
【0021】
本出願はまた、ＨＢＶによって引き起こされる疾患又は感染症の治療及び／又は予防に使用するための、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物に関する。
【0022】
本出願はまた、細胞（例えば、哺乳動物の細胞）におけるＨＢＶの排除における使用のための、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物に関する。
【0023】
本出願は、抗ＨＢＶ治療のための方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、方法に関する。
【0024】
本出願はまた、細胞（例えば、哺乳動物の細胞）においてＨＢＶの複製又は繁殖を阻害するための方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含む、方法に関する。
【0025】
本出願はまた、ＨＢＶによって引き起こされる疾患又は感染症を治療及び／又は予防するための方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物の治療有効量及び／又は予防有効量を投与する工程を含む、方法に関する。
【0026】
本出願はまた、細胞（例えば、哺乳動物の細胞）においてＨＢＶを排除するための方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体、或いは式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含む、方法に関する。
【0027】
本出願はまた、抗ＨＢＶ治療のための組成物であって、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む、組成物に関する。
【0028】
本出願はまた、細胞（例えば、哺乳動物の細胞）においてＨＢＶの複製又は繁殖を阻害するための組成物であって、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む、組成物に関する。
【0029】
本出願はまた、ＨＢＶによって引き起こされる疾患又は感染症の治療及び／又は予防のための組成物であって、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む、組成物に関する。
【0030】
本出願はまた、細胞（例えば、哺乳動物の細胞）におけるＨＢＶの排除のための組成物であって、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体を含む、組成物に関する。
【0031】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載されるＨＢＶによって引き起こされる疾患は、ウイルス性Ｂ型肝炎である。
【0032】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載されるＨＢＶによって引き起こされる疾患は、Ｂ型肝炎関連の肝硬変又は原発性肝臓がんである。
【0033】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載されるウイルス性Ｂ型肝炎は、慢性ウイルス性Ｂ型肝炎、急性ウイルス性Ｂ型肝炎又は慢性活動性肝炎である。
【0034】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される製品は、医薬製品である。
【0035】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤を更に含む。
【0036】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される医薬組成物は、固体製剤（例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤）、注射剤、外用製剤、噴霧剤、液体製剤又は複合製剤である。
【0037】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される医薬組成物は、経口的に、注射によって、植え込みによって、外用によって、噴霧によって又は吸入によって投与することができる。
【0038】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、ヒドロキシ、アミノ、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、直鎖若しくは分枝Ｃ５アルキル、直鎖若しくは分枝Ｃ６アルキル、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジブチルアミノ、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、モノフルオロメチル、クロロメトキシ、クロロエトキシ、ジクロロエトキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ又はモノフルオロメトキシである。
【0039】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはヒドロキシルであり、この場合、化合物はパロバロテンである。
【0040】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ又はジブチルアミノである。
【0041】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはアミノである。
【0042】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、メチルアミノ又はエチルアミノである。
【0043】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、ジメチルアミノ又はジエチルアミノである。
【0044】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ又はヘキシルオキシである。
【0045】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはメトキシである。
【0046】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはエトキシである。
【0047】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはｎ－プロポキシである。
【0048】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはイソプロポキシである。
【0049】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはｎ－ブトキシである。
【0050】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはイソブトキシである。
【0051】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはｔｅｒｔ－ブトキシである。
【0052】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはペンチルオキシである。
【0053】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはヘキシルオキシである。
【0054】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペンチルオキシ又はシクロヘキシルオキシである。
【0055】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、シクロプロポキシ又はシクロブトキシである。
【0056】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはフェノキシ又はベンジルオキシである。
【0057】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、直鎖若しくは分枝Ｃ５アルキル又は直鎖若しくは分枝Ｃ６アルキルである。
【0058】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、メチル又はエチルである。
【0059】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはｎ－プロピルである。
【0060】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシルである。
【0061】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル又はモノフルオロメチルである。
【0062】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはクロロメチル又はクロロエチルである。
【0063】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル又はモノフルオロメチルである。
【0064】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、クロロメトキシ、クロロエトキシ、ジクロロエトキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ又はモノフルオロメトキシである。
【0065】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒは、クロロメトキシ又はクロロエトキシである。
【0066】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物において、Ｒはトリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ又はモノフルオロメトキシである。
【0067】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される薬学的に許容される塩は、無機又は有機酸性塩並びに無機又は有機塩基性塩を含む。例えば、薬学的に許容される塩は、これらに限定されるものではないが、以下を含む：ナトリウム塩、カリウム塩及びリチウム塩を含む、化合物のアルカリ金属塩；カルシウム塩及びマグネシウム塩を含む、化合物のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩及びコバルト塩を含む、化合物の金属塩；メグルミン塩、アンモニウム塩、ｔｅｒｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ビシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－Ｎ－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩を含む、化合物のアミン塩。
【0068】
本出願の一部の実施形態によれば、本出願において記載される式Ｉによって表される化合物中にカルボキシル基がある場合、化合物は、アルコールと薬学的に許容されるエステルを形成でき、薬学的に許容されるエステルは、以下を含む：Ｃ１－６アルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、ｓｅｃ－ブチルエステル、ｔｅｒｔ－ブチルエステル、ペンチルエステル及びヘキシルエステル；Ｃ３－６シクロアルキルエステル、例えば、シクロペンチルエステル及びシクロヘキシルエステル；Ｃ６－１０アリールエステル、例えば、フェニルエステル及びナフチルエステル；Ｃ６－１０アリール－Ｃ１－６アルキルエステル、例えば、ベンジルエステル、フェニルエチルエステル、α－メチルベンジルエステル、３－フェニルプロピルエステル、４－フェニルブチルエステル、６－フェニルヘキシルエステル、ジフェニルメチルエステル及びトリフェニルメチルエステル；又はインビボで加水分解されることができるエステル、例えば、（５－メチル－２－オキソ－１，３－ジオキソール－４－イル）メチルエステル、（ピバロイルオキシ）メチルエステル、ベンゾフラノニルエステル、［（イソプロポキシカルボニル）オキシ］メチルエステル、［（シクロヘキシルオキシカルボニル）オキシ］メチルエステル及び１－［（シクロヘキシルオキシカルボニル）オキシ］エチルエステル。
【0069】
本出願において記載される担体としては、これらに限定されるものではないが、以下が挙げられる：イオン交換体、酸化アルミニウム、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒトアルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリセロール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和（ｓａｔｕｒａｔｅ）植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース材料、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ミツロウ、羊毛脂。
【0070】
本出願において使用する「賦形剤」という用語は、医薬製剤中の主有効成分以外の添加剤を指す。賦形剤は、本質的に安定であり、主有効成分との不適合がなく、副作用をもたらさず、有効性に影響を及ぼさず、室温で容易に変形したり、ひび割れたり、白カビ若しくは虫に食べられたりせず、人体に無害であり、生理作用を有さず、主有効成分との化学的又は物理的相互作用をもたらさず、主有効成分の含量決定に影響を及ぼさないなどである。例としては、錠剤における結合剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤；経口用液体製剤における保存剤、酸化防止剤、矯味剤、香味剤、共溶媒、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節剤、着色剤等が挙げられ、それらの全てを賦形剤と称することができる。
【0071】
本出願において使用する「Ｃ１－６アルキル」という用語は、１～６個の炭素原子を有する直鎖若しくは分枝鎖アルキル、例えば、Ｃ１－４アルキル、Ｃ１－２アルキル、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、直鎖若しくは分枝Ｃ３アルキル、直鎖若しくは分枝Ｃ４アルキル、直鎖若しくは分枝Ｃ５アルキル、又は直鎖若しくは分枝Ｃ６アルキルを指す。具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル及びｎ－ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0072】
本出願において使用する「Ｃ１－６アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子に結合している、上記で定義されるＣ１－６アルキルを指す。Ｃ１－６アルコキシの代表例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペントキシ及びヘキシルオキシが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0073】
本出願において使用する「Ｃ１－６ハロアルキル」という用語は、ハロゲン、例えば、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素で一置換又は多置換されている、上記で定義されるＣ１－６アルキルを指す。Ｃ１－６ハロアルキルの代表例としては、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル及びモノフルオロメチルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0074】
本出願において使用する「Ｃ１－６アルキル－アミノ－」という用語は、上記で定義されるＣ１－６アルキルで一置換されているアミノ基を指す。「Ｃ１－６アルキル－アミノ」の典型例としては、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ及びブチルアミノが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0075】
本出願において使用する「ジ（Ｃ１－６アルキル）－アミノ－」という用語は、上記で定義されるＣ１－６アルキルで二置換されているアミノ基を指す。「ジ（Ｃ１－６アルキル）－アミノ－」の典型例としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ及びジブチルアミノが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0076】
本出願において使用する「Ｃ３－６シクロアルキル」という用語は、３～６個の炭素原子を有し且つ単環若しくは二環構造又は複数の縮合環（縮合及び架橋環系を含む）を有する飽和環状ヒドロカルビルを指す。「Ｃ３－６シクロアルキル」の典型例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0077】
本出願において使用する「Ｃ３－６シクロアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子に結合されている、上記で定義されるＣ３－６シクロアルキルを指す。「Ｃ３－６シクロアルコキシ」の典型例としては、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペンチルオキシ及びシクロヘキシルオキシが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0078】
本出願において使用する「Ｃ１－６ハロアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子に結合されている、上記で定義されるＣ１－６ハロアルキルを指す。Ｃ１－６ハロアルコキシの代表例としては、クロロメトキシ、クロロエトキシ、ジクロロエトキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ及びモノフルオロメトキシが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0079】
本出願において使用する「対象」という用語は哺乳動物を含む。
本出願において記載される哺乳動物は、ウシ、ウマ、ヤギ、イノシシ、イヌ、ネコ、齧歯類及び霊長類を含み、好ましい哺乳動物はヒトである。
本出願において記載される哺乳動物は、ウシ、ウマ、ヤギ、イノシシ、イヌ、ネコ、齧歯類及び霊長類を含み、好ましい哺乳動物はヒトである。
【0080】
本出願において使用する「有効量」という用語は、所望の効果を達成する又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。例えば、治療有効量は、既に疾患に罹患している患者において、疾患及びその合併症を治癒させる又は少なくとも部分的に抑制するのに十分な量を指す。予防有効量は、疾患の発生を効果的に予防する、抑制する又は遅延させることができる量を指す。このような有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、治療的使用に有効な量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の一般的状態、患者の全身状態、例えば、年齢、体重及び性別、薬物の投与経路、並びに同時に投与される他の治療薬などによって決まる。
【0081】
対象に投与される、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体の量は、疾患の種類及び重症度並びに対象の状態及び特性、例えば、全身健康状態、年齢、性別、体重及び薬物に対する耐性によって決まり、製剤の種類、薬物の投与経路、及び投与の持続時間又は間隔等の要因によっても決まる。当業者ならば、これらの及び他の要因に基づいて、適切な投与量を決定できるであろう。一般に、式Ｉによって表される化合物、立体異性体、溶媒和物、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される塩の水和物若しくは溶媒和物、薬学的に許容されるエステル又はそれらの種々の薬学的に許容される修飾体は、治療のための一日量が約０．０００１～１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日であってよく、一日量は、適宜１つ又は複数のバッチで投与できる。
【0082】
本発明の実施形態を、図面及び実施例を参照して以下に詳述するが、当業者ならば、以下の図面及び実施例が、本出願の範囲を限定するのではなく、本出願を例示するためにのみ使用されることがわかるであろう。本出願の種々の目的及び利点は、図面及び好ましい実施形態についての以下の詳細な説明により、当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0083】
【図1】パロバロテンの化学構造式を示す図である。
【図2】感染モデルＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１におけるＨＢＶ感染に対するパロバロテンの阻害効果を示す図である。
【図3】感染モデルＨｅｐＲＧ Ｍ１４ａにおけるＨＢＶ感染に対するパロバロテンの阻害効果を示す図である。
【図4】ＨＢＶに感染した感染モデルＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１に対するパロバロテンの治療効果を示す図である。
【図5】高コピー複製モデルＨｅｐＡＤ３８におけるパロバロテンの評価結果を示す図である。
【図6】ヒト初代培養肝細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）におけるＨＢＶ感染に対するパロバロテンの阻害効果を示す図である。
【図7】ＨＢＶに感染したヒト初代培養肝細胞に対するパロバロテンの治療効果を示す図である。
【図8】インビトロ細胞モデルにおけるパロバロテンの安全性評価の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0084】
発明を実施するための特定のモデル
以下の実施例において特定の技術又は条件が示されていない場合には、当技術分野における文献又は製品仕様書に記載されている技術又は条件に従うものとする。特に明記しない限り、実験方法は従来の方法であり、製造業者の指示なしで使用される材料、試薬又は装置は、商業的に入手可能な従来の製品である。全ての実験は３つのウェルで繰り返し、結果は平均値とした。
以下の実施例において特定の技術又は条件が示されていない場合には、当技術分野における文献又は製品仕様書に記載されている技術又は条件に従うものとする。特に明記しない限り、実験方法は従来の方法であり、製造業者の指示なしで使用される材料、試薬又は装置は、商業的に入手可能な従来の製品である。全ての実験は３つのウェルで繰り返し、結果は平均値とした。
【0085】
以下の実施例において、試験薬物はパロバロテン（ＭＣＥから購入）であり、陽性対照薬物には、エンテカビル（ＥＴＶ、Ｙｕａｎｙｅ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）及びインターフェロンＩＦＮα（Ｓｉｇｍａから購入、ＳＲＰ４５９５－１００ＵＧ）を含めた。実験中に、試験薬物又は陽性対照薬物を培地で所望の最終濃度に希釈し、使用する細胞に応じて培地を決定した。これについては各実施例において具体的に記載した。
【0086】
以下の実施例において、使用した１０ＬのＰＢＳの処方は、ＮａＣｌが８０ｇ、ＫＣｌが２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏが２９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４が２．４ｇであり、これを水とよく混合し、ｐＨが７．４及び計量した容量が１０Ｌとなるように調整した、次いで二重層０．２２μｍ濾過膜で濾過し、サブパッケージに入れ、後で使用するために高圧蒸気で滅菌した。
【0087】
以下の実施例において、使用するＤＭＥＭ培地はＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｄ６４２９）；ＦＢＳはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．１００９９１４１）；ピューロマイシンはＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．ａｎｔ－ｐｒ－１）；ドキシサイクリンはＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｄ９８９１）；ペニシリン及びストレプトマイシンはＳｈａｎｄｏｎｇ Ｌｕｋａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し；４％のＰＥＧ ８０００はＡＭＲＥＳＣＯから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．０１５９）；ＷＭＥ培地はＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｗ１８７８）；グルタミンは、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｇ８５４０）；インスリンは、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｗａｎｂａｎｇ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから購入し；ヒドロコルチゾンはＣａｙｍａｎから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．１８２２６）；テトラサイクリンはＵＳＢから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．２２１０５－２５ｇ）；Ｂ－２７（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）はＧＩＢＣＯから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．１７５０４０４４）；ホルスコリンはＭＣＥから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．ＨＹ－１５３７１）；ＳＢ４３１５４２はＴｏｃｒｉｓから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．１６１４）；ＩＷＰ２はＭＣＥから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．ＨＹ－１３９１２）；ＤＡＰＴはＭＣＥから購入し（Ａｒｔ．Ｎｏ．ＨＹ－１３０２７）；ＬＤＮ１９３１８９は、ＭＣＥから購入した（Ａｒｔ．Ｎｏ．ＨＹ－１２０７１Ａ）。
【0088】
以下の実施例において、使用した培地Ａは、１０％ ＦＢＳ、１μｇ／ｍＬピューロマイシン、１μｇ／ｍＬドキシサイクリン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する、ＤＭＥＭ培地であった。
【0089】
以下の実施例において、使用した培地Ｂは、１０％ ＦＢＳ、１μｇ／ｍＬピューロマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する、ＤＭＥＭ培地であった。
【0090】
以下の実施例において、使用した培地Ｃは、４ｗ／ｖ％ ＰＥＧ ８０００、１μｇ／ｍＬピューロマイシン、１μｇ／ｍＬドキシサイクリン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び５％ ＦＢＳを含有する、ＤＭＥＭ培地（使用直前に新たに調製）であった。
【0091】
以下の実施例において、使用した培地Ｄは、１０％ ＦＢＳ、１００ｍＭグルタミン、５μｇ／ｍＬインスリン、５０μＭヒドロコルチゾン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する、ＷＭＥ培地であった。
【0092】
以下の実施例において、使用した培地Ｅは、４ｗ／ｖ％ ＰＥＧ ８０００、１００ｍＭグルタミン、５μｇ／ｍＬインスリン、５０μＭヒドロコルチゾン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び５％ ＦＢＳを含有する、ＷＭＥ培地（使用直前に新たに調製）であった。
【0093】
以下の実施例において、使用した培地Ｆは、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する、ＤＭＥＭ培地であった。
【0094】
以下の実施例において、使用した培地Ｇは、１０％ ＦＢＳ、１μｇ／ｍＬテトラサイクリン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する、ＤＭＥＭ培地であった。
【0095】
以下の実施例において、使用した培地Ｈは、１ｖ／ｖ％ Ｂ－２７（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（使用時に１：１００の比で希釈、すなわち、培地Ｈの１００ｍＬ毎に、１ｍＬのＢ－２７（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含有する）、２０μｍｏｌ／Ｌホルスコリン、１０μｍｏｌ／Ｌ ＳＢ４３１５４２、０．５μｍｏｌ／Ｌ ＩＷＰ２、５μｍｏｌ／Ｌ ＤＡＰＴ、０．１μｍｏｌ／Ｌ ＬＤＮ１９３１８９、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する、ＷＭＥ培地であった。
【0096】
以下の実施例において、使用した培地Ｉは、４ｗ／ｖ％ ＰＥＧ ８０００、２０μｍｏｌ／Ｌホルスコリン、１０μｍｏｌ／Ｌ ＳＢ４３１５４２、０．５μｍｏｌ／Ｌ ＩＷＰ２、５μｍｏｌ／Ｌ ＤＡＰＴ、０．１μｍｏｌ／Ｌ ＬＤＮ１９３１８９、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び０．５ｖ／ｖ％ Ｂ－２７（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（使用時に１：２００の比で希釈、すなわち、培地Ｉの１００ｍＬ毎に、０．５ｍＬのＢ－２７（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含有する）を含有する、ＷＭＥ培地であった。
【0097】
実施例１：感染モデルＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１におけるＨＢＶ感染に対する試験薬物の阻害効果の評価
テトラサイクリン誘導性プロモーターによって制御されているバイシストロニック発現カセット（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）において、ヒトナトリウムタウロコール酸共輸送ポリペプチド（ｈＮＴＣＰ）遺伝子及び赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）遺伝子を作製し、レンチウイルス系を使用することによって発現カセットをＨｅｐＧ２－Ｔｅｔ Ｏｎ細胞に安定的に組み込み、フローサイトメトリーソーティング技術を使用することによって、ｈＮＴＣＰを高発現する安定な細胞株ＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１を得た。この細胞モデルは、ＨＢＶ感染症を裏付け、ＨＢＶ関連指標を生成した。（この細胞モデルの作製方法については、以下を参照されたい：Ｙａ－Ｌｉ Ｚｈａｎｇ、Ｙｉｎｇ Ｇａｏ、Ｊｉａ－Ｌｉ Ｃａｏ、Ｊｉｎｇ－Ｈｕａ Ｚｈａｏ、Ｔｉａｎ－Ｙｉｎｇ Ｚｈａｎｇ、ＣｈｕａｎＬａｉ Ｙａｎｇ、Ｈｕａ－Ｌｏｎｇ Ｘｉｏｎｇ、Ｙｉｎｇ－Ｂｉｎ Ｗａｎｇ、Ｓｈａｎ－Ｈａｉ Ｏｕ、Ｔｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ、Ｃｈａｎｇ－Ｒｏｎｇ Ｃｈｅｎ、Ｑｕａｎ Ｙｕａｎ ＆ Ｎｉｎｇ－Ｓｈａｏ Ｘｉａ（２０１９年）、Ｒｏｂｕｓｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ， Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、８巻：１号、７２４～７３３頁，ＤＯＩ：１０．１０８０／２２２２１７５１．２０１９．１６１９４８５）。
テトラサイクリン誘導性プロモーターによって制御されているバイシストロニック発現カセット（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）において、ヒトナトリウムタウロコール酸共輸送ポリペプチド（ｈＮＴＣＰ）遺伝子及び赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）遺伝子を作製し、レンチウイルス系を使用することによって発現カセットをＨｅｐＧ２－Ｔｅｔ Ｏｎ細胞に安定的に組み込み、フローサイトメトリーソーティング技術を使用することによって、ｈＮＴＣＰを高発現する安定な細胞株ＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１を得た。この細胞モデルは、ＨＢＶ感染症を裏付け、ＨＢＶ関連指標を生成した。（この細胞モデルの作製方法については、以下を参照されたい：Ｙａ－Ｌｉ Ｚｈａｎｇ、Ｙｉｎｇ Ｇａｏ、Ｊｉａ－Ｌｉ Ｃａｏ、Ｊｉｎｇ－Ｈｕａ Ｚｈａｏ、Ｔｉａｎ－Ｙｉｎｇ Ｚｈａｎｇ、ＣｈｕａｎＬａｉ Ｙａｎｇ、Ｈｕａ－Ｌｏｎｇ Ｘｉｏｎｇ、Ｙｉｎｇ－Ｂｉｎ Ｗａｎｇ、Ｓｈａｎ－Ｈａｉ Ｏｕ、Ｔｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ、Ｃｈａｎｇ－Ｒｏｎｇ Ｃｈｅｎ、Ｑｕａｎ Ｙｕａｎ ＆ Ｎｉｎｇ－Ｓｈａｏ Ｘｉａ（２０１９年）、Ｒｏｂｕｓｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ， Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、８巻：１号、７２４～７３３頁，ＤＯＩ：１０．１０８０／２２２２１７５１．２０１９．１６１９４８５）。
【0098】
この実験は、２４ウェル培養プレートにおいて実施した。実験群の各試験薬物は、１μＭ、５μＭ及び２５μＭの３つの最終濃度を有し、陽性対照群のエンテカビル（ＥＴＶ）は、最終濃度が１μＭであった。ここで、試験薬物及び陽性対照薬物は、所望の濃度まで培地Ａで希釈し、ブランク群には、薬物を含まない同一容量の培地Ａを添加した。
【0099】
約１．５×１０５個のＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１細胞を各ウェルにプレーティングし、５００μＬの培地Ｂを添加した。細胞が付着した後、全実験を通じて、ドキシサイクリンによる誘導を行うために培地Ａを交換のために使用した。
【0100】
７２時間のドキシサイクリンによる誘導後、５００μＬの薬物を含有する培地Ａを各ウェルに添加して、２４時間にわたって薬物処理を行い、次いで細胞にＨＢＶを感染させた。ウェル当たりのウイルス感染量は１００ＭＯＩであった。感染前に、培地ＣでＨＢＶを希釈することによってＨＢＶ溶液を得た。感染容量はウェル当たり２５０μＬであった。感染中に細胞上清を最初に吸引によって除去し、ＨＢＶ溶液を細胞に添加し、次いで細胞を１６～２０時間インキュベートし、次いで上清を０日目の試料として収集した。次いで、細胞を３７℃の浴中で加温したＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な、薬物を含有する培地Ａ（５００μＬ）を交換のために使用し、次いで、検出のために上清を２日毎に収集し、新鮮な、薬物を含有する培地Ａを添加し、８日目に、上清及び細胞を全て、関連する検出のために収集した。検出項目には以下を含めた：ＨＢｓＡｇ／ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ。
【0101】
ＨＢｓＡｇ／ＨＢｅＡｇの検出：
ＨＢｓＡｇ（化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、製品規格番号：ＹＺＢ／Ｇｕｏ ０３４６－２０１４）及びＨＢｅＡｇ（酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、製品規格番号：ＹＺＢ／Ｇｕｏ ０２１６－２０１３）は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｃｏｍｐａｎｙの検出キットを使用して検出し、具体的な検出操作は、キット中の説明書に記載されている検出方法に従って実施した。
ＨＢｓＡｇ（化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、製品規格番号：ＹＺＢ／Ｇｕｏ ０３４６－２０１４）及びＨＢｅＡｇ（酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、製品規格番号：ＹＺＢ／Ｇｕｏ ０２１６－２０１３）は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｃｏｍｐａｎｙの検出キットを使用して検出し、具体的な検出操作は、キット中の説明書に記載されている検出方法に従って実施した。
【0102】
ＨＢＶ ＤＮＡの検出：
収集した細胞をＰＢＳで洗浄後、ウイルスＤＮＡ＆ＲＮＡ抽出キット（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＧｅｎＭａｇＢｉｏ）を使用して、核酸抽出ワークステーション（ＧｅｎＭａｇＢｉｏから購入、モデル：ＤＯＦ－９６９６）で自動抽出を行って（抽出手順については、取扱説明書を参照されたい）、ＨＢＶ ＤＮＡを得た。ＨＢＶ ＤＮＡは、プローブリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲによって定量化した。ここで、使用した試薬はＰｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）（Ｔａｋａｒａ）であり、使用した機器はＲｏｃｈｅのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６であった。蛍光定量化に使用したプライマー配列は表１に示し、蛍光定量的反応系は表２に示した。
収集した細胞をＰＢＳで洗浄後、ウイルスＤＮＡ＆ＲＮＡ抽出キット（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＧｅｎＭａｇＢｉｏ）を使用して、核酸抽出ワークステーション（ＧｅｎＭａｇＢｉｏから購入、モデル：ＤＯＦ－９６９６）で自動抽出を行って（抽出手順については、取扱説明書を参照されたい）、ＨＢＶ ＤＮＡを得た。ＨＢＶ ＤＮＡは、プローブリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲによって定量化した。ここで、使用した試薬はＰｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）（Ｔａｋａｒａ）であり、使用した機器はＲｏｃｈｅのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６であった。蛍光定量化に使用したプライマー配列は表１に示し、蛍光定量的反応系は表２に示した。
【0103】
ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの検出：
改変Ｈｉｒｔ法を使用して、キットを使用することによってＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを抽出した。使用したキットはプラスミドミニキット（ＴＩＡＮＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ（ＢＥＩＪＩＮＧ）ＣＯ．，ＬＴＤ．）であった。このキットに含まれる溶液は、緩衝液Ｉ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）、緩衝液ＩＩ（１．２％ ＳＤＳ）、緩衝液ＩＩＩ（３Ｍ ＣｓＣｌ、１Ｍ酢酸カリウム、０．６７Ｍ酢酸）であった。具体的な方法については、キット説明書に記載されているプラスミド抽出方法を参照されたい。ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡは、プローブリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲによって定量的に検出し、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を内部参照として同時に検出した。ここで、使用した機器は、ＲｏｃｈｅのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６であった。蛍光定量化に使用したプライマーは表１に示し、蛍光定量的反応系は表２に示した。
改変Ｈｉｒｔ法を使用して、キットを使用することによってＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを抽出した。使用したキットはプラスミドミニキット（ＴＩＡＮＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ（ＢＥＩＪＩＮＧ）ＣＯ．，ＬＴＤ．）であった。このキットに含まれる溶液は、緩衝液Ｉ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）、緩衝液ＩＩ（１．２％ ＳＤＳ）、緩衝液ＩＩＩ（３Ｍ ＣｓＣｌ、１Ｍ酢酸カリウム、０．６７Ｍ酢酸）であった。具体的な方法については、キット説明書に記載されているプラスミド抽出方法を参照されたい。ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡは、プローブリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲによって定量的に検出し、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を内部参照として同時に検出した。ここで、使用した機器は、ＲｏｃｈｅのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６であった。蛍光定量化に使用したプライマーは表１に示し、蛍光定量的反応系は表２に示した。
【0104】
定量的検出のための蛍光反応手順は以下の通りであった：
（１）ＨＢＶ ＤＮＡの定量化：定量化プログラムは、９５℃、３０秒；（９５℃、５秒；６０℃、３０秒）を４５サイクル、蛍光チャンネルはＨｅｘであった。
（１）ＨＢＶ ＤＮＡの定量化：定量化プログラムは、９５℃、３０秒；（９５℃、５秒；６０℃、３０秒）を４５サイクル、蛍光チャンネルはＨｅｘであった。
【0105】
（２）ｃｃｃＤＮＡの定量化：定量的プログラムは、９５℃、５分；（９５℃、３０秒；６０℃、６０秒）を４５サイクル、蛍光チャンネルはＦＡＭであった。
【0106】
（３）ｍｔＤＮＡの定量化：定量的プログラムは、９５℃、５分；（９５℃、３０秒；５５℃、４０秒）を４５サイクル、蛍光チャンネルはＨｅｘであった。
【0107】
ｃｃｃＤＮＡ正規化の計算：具体的な式は以下の通りであった：２（ｍｔＤＮＡ－ｃｃｃＤＮＡ）［式中、括弧内の値はそれぞれ、ｍｔＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡのＣｔ値である］。
【0108】
実験結果を図２に示した。結果から、ブランク群と比較して、パロバロテン処理は、細胞上清中のＨＢｓＡｇ（ｐ＜０．０５）及びＨＢｅＡｇ（ｐ＜０．０５）のレベル、細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐ＜０．００１）及びＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ（ｐ＜０．０００１）のレベルを効果的に阻害することができ、阻害度はある程度、用量依存的であることが示された。
【0109】
これにより、パロバロテンがＨＢＶのＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１への感染を有意に阻害できることが示された。
【0110】
【表1】
【0111】
【表2】
【0112】
実施例２：感染モデルＨｅｐａＲＧ Ｍ１４ＡにおけるＨＢＶ感染に対する、試験薬物の阻害効果の評価
ＨｅｐａＲＧは、女性Ｃ型肝炎患者の腫瘍組織から単離された分化能を有する肝前駆細胞株であった。細胞プレーティングの２週間後、細胞分化を２％ ＤＭＳＯ（細胞培養培地１００ｍＬ当たり２ｍＬのＤＭＳＯを添加した）で２週間にわたって誘導した。最終的に、約５０％の細胞が肝細胞様細胞に分化し、その他の５０％の細胞が胆管細胞様細胞に分化した。そのうち、肝細胞様細胞は、約２０％の感染効率でＨＢＶ感染を支持した。ＨｅｐａＲＧの遺伝子改変により、ＨＮＦ４Ａ及びＦｏｘＭ１遺伝子がＨｅｐａＲＧ細胞に組み込まれ、分化を完了させ且つＤＭＳＯとは独立してＨＢＶ感染を支持することができるＨｅｐａＲＧ Ｍ１４Ａ細胞株が、スクリーニングによって得られた。（この細胞モデルの作製方法については、Ｚｈａｏ Ｊｉｎｇｈｕａ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌｓ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ＨＢＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ［Ｄ］． Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、２０１６年を参照されたい）。
ＨｅｐａＲＧは、女性Ｃ型肝炎患者の腫瘍組織から単離された分化能を有する肝前駆細胞株であった。細胞プレーティングの２週間後、細胞分化を２％ ＤＭＳＯ（細胞培養培地１００ｍＬ当たり２ｍＬのＤＭＳＯを添加した）で２週間にわたって誘導した。最終的に、約５０％の細胞が肝細胞様細胞に分化し、その他の５０％の細胞が胆管細胞様細胞に分化した。そのうち、肝細胞様細胞は、約２０％の感染効率でＨＢＶ感染を支持した。ＨｅｐａＲＧの遺伝子改変により、ＨＮＦ４Ａ及びＦｏｘＭ１遺伝子がＨｅｐａＲＧ細胞に組み込まれ、分化を完了させ且つＤＭＳＯとは独立してＨＢＶ感染を支持することができるＨｅｐａＲＧ Ｍ１４Ａ細胞株が、スクリーニングによって得られた。（この細胞モデルの作製方法については、Ｚｈａｏ Ｊｉｎｇｈｕａ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌｓ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ＨＢＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ［Ｄ］． Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、２０１６年を参照されたい）。
【0113】
この実験は、２４ウェル細胞培養プレートにおいて実施した。実験群の各試験薬物は、１μＭ、５μＭ及び２５μＭの３つの最終濃度を有し、陽性対照群のエンテカビル（ＥＴＶ）は、最終濃度が１μＭであった。ここで、試験薬物及び陽性対照薬物は、所望の濃度まで培地Ｄで希釈し、ブランク群には、薬物を含まない同一容量の培地Ｄを添加した。約１．５×１０５個のＨｅｐａＲＧ Ｍ１４Ａ細胞を各ウェルにプレーティングし、５００μＬの培地Ｄを各ウェルに添加した。細胞プレーティング後、培地Ｄを２日毎に交換した。細胞プレーティングの１３日間後、薬物処理のために、培地Ｄを、薬物を含有する培地Ｄと交換した。２４時間の薬物処理後、細胞にＨＢＶを感染させた。各ウェル中の感染のためのＨＢＶの量は１０００ＭＯＩであった。感染前に、ＨＢＶを培地Ｅで希釈することによってＨＢＶ溶液を得た。感染容量はウェル当たり２５０μＬであった。感染中に、細胞上清を最初に吸引によって除去し、ＨＢＶ溶液を細胞に添加し、次いで細胞を２４時間インキュベートし、次いで上清を０日目の試料として収集した。次いで、細胞を３７℃の浴中で加温したＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な、薬物を含有する培地Ｄ（ウェル当たり５００μＬ）を交換のために使用し、次いで、８日目まで、検出のために上清を２日毎に収集し、新鮮な、薬物を含有する培地Ｄを交換のために使用し、上清及び細胞を全て、関連する検出のために収集した。検出項目には、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含めた。検出方法については、実施例１を参照されたい。
【0114】
実験結果を図３に示した。結果から、ＨｅｐａＲＧ Ｍ１４ａ感染細胞モデルにおいて、感染前のパロバロテン処理は、細胞上清中のＨＢｓＡｇ（ｐ＜０．０５）及びＨＢｅＡｇ（ｐ＜０．０５）のレベル並びに細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐ＜０．０００１）及びｃｃｃＤＮＡ（ｐ＜０．０００１）のレベルを有意に低下できることが示された。
【0115】
上記結果により、パロバロテンがＨＢＶのＨｅｐａＲＧ Ｍ１４Ａへの感染を有意に阻害できることが示された。
【0116】
実施例３．ＨＢＶに感染した感染モデルＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１に対する、試験薬物の治療効果の評価
この実験は、２４ウェル培養プレートにおいて実施した。実験群の各試験薬物は、１μＭ、５μＭ及び２５μＭの３つの最終濃度を有し、陽性対照群のＥＴＶは、最終濃度が１μＭであった。ここで、試験薬物及び陽性対照薬物は、所望の濃度まで培地Ａで希釈し、ブランク群には、薬物を含まない同一容量の培地Ａを添加した。約１．５×１０５個のＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１細胞を各ウェルにプレーティングし、５００μＬの培地Ｂを各ウェルに添加した。細胞が付着した後、全実験を通じて、ドキシサイクリンによる誘導を行うために培地Ａを交換のために使用した。
この実験は、２４ウェル培養プレートにおいて実施した。実験群の各試験薬物は、１μＭ、５μＭ及び２５μＭの３つの最終濃度を有し、陽性対照群のＥＴＶは、最終濃度が１μＭであった。ここで、試験薬物及び陽性対照薬物は、所望の濃度まで培地Ａで希釈し、ブランク群には、薬物を含まない同一容量の培地Ａを添加した。約１．５×１０５個のＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１細胞を各ウェルにプレーティングし、５００μＬの培地Ｂを各ウェルに添加した。細胞が付着した後、全実験を通じて、ドキシサイクリンによる誘導を行うために培地Ａを交換のために使用した。
【0117】
ドキシサイクリンによる誘導の４日後に、ＨＢＶ感染を行った。各ウェル中のＨＢＶの量は、１００ＭＯＩであった。感染前に、ＨＢＶを培地Ｃで希釈してＨＢＶ溶液を得た。感染容量はウェル当たり２５０μＬであった。感染中に、細胞上清を最初に吸引によって除去し、ＨＢＶ溶液を細胞に添加し、細胞を２４時間インキュベートし、次いで上清を０日目の試料として収集した。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な培地Ｃを交換のために使用した。その後、検出のために上清を２日毎に収集し、新鮮な培地Ｃを交換のために使用した。６日目に、新鮮な、薬物を含有する培地Ａを、交換のために使用して、薬物処理を開始し、次いで、検出のために上清を２日毎に収集し、新鮮な、薬物を含有する培地Ａを交換のために使用し、１２日目まで、上清及び細胞を全て、関連する検出のために収集した。検出項目には、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含めた。検出方法については、実施例１を参照されたい。
【0118】
サザンブロット実験を、１０ｃｍ２培養プレート上で実施した。約５×１０６個のＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１細胞を各１０ｃｍ２培養プレート中にプレーティングし、培地Ｂを添加した。細胞が付着した後、全実験を通じて、ドキシサイクリンによる誘導を行うために培地Ａを交換のために使用した。ドキシサイクリンによる誘導の４日後に、ＨＢＶ感染を行った。感染のためのＨＢＶの量は、１０００ＭＯＩであった。感染前に、ＨＢＶを培地Ｃで希釈してＨＢＶ溶液を得た。感染容量は５ｍＬであった。感染中に、細胞上清を最初に吸引によって除去し、ＨＢＶ溶液を細胞に添加し、細胞を２４時間インキュベートし、次いで上清を０日目の試料として収集した。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な培地Ａを交換のために使用した。その後、検出のために上清を２日毎に収集し、新鮮な培地Ａを交換のために使用した。６日目に、新鮮な、薬物を含有する培地を、交換のために使用して、薬物処理を開始し（処理のための薬物濃度は５μＭであり、対照群は処理のためにインターフェロンＩＦＮαを５００ＩＵの濃度で使用した）、次いで、検出のために上清を２日毎に収集し、新鮮な、薬物を含有する培地Ａを交換のために使用し、１２日目まで、上清及び細胞を全て、サザンブロット検出及び免疫蛍光検出のために収集した。
【0119】
サザンブロット検出
改変Ｈｉｒｔ法を使用して、キットを使用することによってＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを抽出した。使用したキットは、Ｑｉａｇｅｎプラスミドミディキットであった。具体的な抽出操作については、キットのプラスミッド抽出方法を参照されたい。サザンブロットの具体的な工程は以下の通りであった：
ａ．抽出されたＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ試料にローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ Ｃｏｍｐａｎｙから購入）を添加し、次いで、１×ＴＡＥ緩衝液（４０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ塩基、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム）中で８０Ｖにおける１．２％アガロースゲルによる２時間にわたる電気泳動によって、ＤＮＡを分離させた。次いで、ゲルを脱プリン緩衝液（０．２ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ）に入れ、室温で振盪しながら１５分間浸漬し、次いで、滅菌超純水で２回、各回１分間すすいだ。次いで、ゲルを変性緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ、１．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）中に入れ、室温で振盪しながら３０分間浸漬し、次いで滅菌超純水で２回、各回１分間すすぎ、最後に中和緩衝液（１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ塩基、１．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）中に１０分間浸漬した。
改変Ｈｉｒｔ法を使用して、キットを使用することによってＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを抽出した。使用したキットは、Ｑｉａｇｅｎプラスミドミディキットであった。具体的な抽出操作については、キットのプラスミッド抽出方法を参照されたい。サザンブロットの具体的な工程は以下の通りであった：
ａ．抽出されたＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ試料にローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ Ｃｏｍｐａｎｙから購入）を添加し、次いで、１×ＴＡＥ緩衝液（４０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ塩基、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム）中で８０Ｖにおける１．２％アガロースゲルによる２時間にわたる電気泳動によって、ＤＮＡを分離させた。次いで、ゲルを脱プリン緩衝液（０．２ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ）に入れ、室温で振盪しながら１５分間浸漬し、次いで、滅菌超純水で２回、各回１分間すすいだ。次いで、ゲルを変性緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ、１．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）中に入れ、室温で振盪しながら３０分間浸漬し、次いで滅菌超純水で２回、各回１分間すすぎ、最後に中和緩衝液（１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ塩基、１．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）中に１０分間浸漬した。
【0120】
ｂ．ゲルから膜への転写：ゲルを１０×ＳＳＣ（１．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）に５分間浸漬し、その間にろ紙及びナイロン膜（Ｒｏｃｈｅから購入）を最初に滅菌超純水で湿らせ、次いで１０×ＳＳＣに浸漬した。真空ブロッティング装置を使用して核酸をナイロン膜に転写した（圧力は５ＭＰａに調整し、転写時間は９０分とした）。同時に、ハイブリダイゼーション溶液（ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ（商標）Ｇｒａｎｕｌｅｓ、Ｒｏｃｈｅから購入、Ａｒｔ．Ｎｏ．３８７１６５００）を４２℃において予熱した。転写後、ＵＶ架橋機器ＳｉＧｍＡ ＳＨ４ Ｂ型（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入）を使用して、ブロットされたナイロン膜を１．５Ｊ／ｃｍ２の照射線量下で３分間架橋させた。
【0121】
ｃ．ハイブリダイゼーション：膜を、４２℃の予め加温したハイブリダイゼーション溶液に浸漬し、ハイブリダイゼーションオーブンに入れて、４２℃で２時間インキュベートした。同時に、プローブを９５℃において１０分間加熱し、次いで、氷水混合物中に５分間、素早く挿入し（変性を防止するため）、次いでハイブリダイゼーション溶液で希釈し（ハイブリダイゼーション溶液１０ｍＬ当たり３００ｎｇのプローブを添加した）、４２℃において１２時間、膜とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションが完了した後、膜を洗浄緩衝液Ｉ（２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）で室温において３回、各回５分間洗浄し、次いで洗浄緩衝液ＩＩ（０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）で６５℃において３回、各回１５分間洗浄した。
【0122】
ｄ．抗体のインキュベーション：最初に、膜をマレイン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌマレイン酸、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中に２分間浸漬し、次いで１×遮断緩衝液（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｂ６４２９－５００ＭＬ）（マレイン酸緩衝液で希釈）で室温において１時間遮断した。遮断後、抗Ｄｉｇ－ＡＰ抗体（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｒｏｃｈｅ－１１０９３２７４９１０）を１×遮断緩衝液で希釈し、膜及び抗体を室温で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、膜をすすぎ溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌマレイン酸、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．３容量％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．５）で室温において３回、各回１５分間洗浄した。
【0123】
ｅ．検出：最初に、膜を平衡溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ塩基、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ９．５）中に３分間浸漬し、次いで膜を取り出し、発色基質（ＣＤＰ－ｓｔａｒ、Ｒｏｃｈｅから購入）を膜に添加し、最後に生体分子撮像装置（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ ｍｉｎｉ、ＧＥ）上で露光した。
【0124】
免疫蛍光検出
この実験に関係するＨＢｃＡｇ免疫蛍光染色は、付着細胞に対して直接行った。以下の操作を振盪機上において１００ｒｐｍ／分で行った。細胞培養プレート中の細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した。固定：４％パラホルムアルデヒド（Ｂｅｙｏｔｉｍｅから購入、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｐ００９９－１００ｍｌ）を添加して、細胞を被覆し、次いで、細胞を暗所において室温で１０分間インキュベートした。洗浄：細胞をＰＢＳで３回、各回３分間洗浄した。透過処理：０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＡＭＲＥＳＣＯから購入）を添加し、細胞を室温で１０分間インキュベートした。洗浄：細胞をＰＢＳで３回、各回３分間洗浄した。遮断：３％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入したＢＳＡ粉末を３ｇ秤量し、１００ｍＬのＰＢＳに溶解させた）を添加し、細胞を、室温で６０分間又は４℃で終夜インキュベートした。一次抗体：抗ＨＢｃＡｇ（２Ａ７、マウス抗体）を３％ ＢＳＡで１：１０００の比で希釈し、次いでウェルにウェル当たり２００μＬで添加し、次いで細胞を室温で１時間又は４℃で終夜インキュベートした。洗浄：細胞をＰＢＳで３回、各回３分間洗浄した。二次抗体：二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を３％ＢＳＡで１：１０００の比で希釈し、次いでウェルにウェル当たり２００μＬで添加し、次いで細胞を室温で３０分間インキュベートした。洗浄：細胞をＰＢＳで３回、各回３分間洗浄した。核染色：ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３％ ＢＳＡで１：２０００の比で希釈し、次いでウェルにウェル当たり２００μＬで添加し、次いで細胞を室温で５分間インキュベートした。洗浄：細胞をＰＢＳで３回、各回３分間洗浄した。写真撮影：ハイコンテント共焦点顕微鏡（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｏｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳ）を用いて写真撮影を行い、緑色蛍光の平均蛍光強度を分析した。
この実験に関係するＨＢｃＡｇ免疫蛍光染色は、付着細胞に対して直接行った。以下の操作を振盪機上において１００ｒｐｍ／分で行った。細胞培養プレート中の細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した。固定：４％パラホルムアルデヒド（Ｂｅｙｏｔｉｍｅから購入、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｐ００９９－１００ｍｌ）を添加して、細胞を被覆し、次いで、細胞を暗所において室温で１０分間インキュベートした。洗浄：細胞をＰＢＳで３回、各回３分間洗浄した。透過処理：０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＡＭＲＥＳＣＯから購入）を添加し、細胞を室温で１０分間インキュベートした。洗浄：細胞をＰＢＳで３回、各回３分間洗浄した。遮断：３％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入したＢＳＡ粉末を３ｇ秤量し、１００ｍＬのＰＢＳに溶解させた）を添加し、細胞を、室温で６０分間又は４℃で終夜インキュベートした。一次抗体：抗ＨＢｃＡｇ（２Ａ７、マウス抗体）を３％ ＢＳＡで１：１０００の比で希釈し、次いでウェルにウェル当たり２００μＬで添加し、次いで細胞を室温で１時間又は４℃で終夜インキュベートした。洗浄：細胞をＰＢＳで３回、各回３分間洗浄した。二次抗体：二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を３％ＢＳＡで１：１０００の比で希釈し、次いでウェルにウェル当たり２００μＬで添加し、次いで細胞を室温で３０分間インキュベートした。洗浄：細胞をＰＢＳで３回、各回３分間洗浄した。核染色：ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３％ ＢＳＡで１：２０００の比で希釈し、次いでウェルにウェル当たり２００μＬで添加し、次いで細胞を室温で５分間インキュベートした。洗浄：細胞をＰＢＳで３回、各回３分間洗浄した。写真撮影：ハイコンテント共焦点顕微鏡（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｏｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳ）を用いて写真撮影を行い、緑色蛍光の平均蛍光強度を分析した。
【0125】
実験結果を図４に示した。結果から、ＨＢＶ感染の６日後に行った薬物処理後に、高濃度のパロバロテンはＨＢｅＡｇに対して有意な阻害効果を有し（ｐ＜０．０５）、ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐ＜０．０５）及びＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ（ｐ＜０．０５）のレベルを有意に低下させることができるのに対し、対照群（ＥＴＶ）及びブランク群は有意差を示さないことが示された。サザンブロットの結果から、５μＭの濃度での薬物処理後のＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡのレベルは、対照群及び薬物を含まないブランク群におけるインターフェロン処理のＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡのレベルよりも有意に低いことが示された。免疫蛍光の結果から、パロバロテンは、感染後のＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１細胞中のＨＢｃＡｇの陽性率を有意に低下させることができることが示された。これは、薬物処理がＨＢＶ感染を阻害することができたことを示している。
【0126】
高濃度パロバロテン処理は、感染後のＨＢＶウイルス複製及びｅ抗原レベルを有意に阻害できた。
【0127】
実施例４．高レベルのＨＢＶ ＤＮＡを産生できるＨｅｐＡＤ３８に対する、試験薬物の治療効果の評価
ＨｅｐＡＤ３８はＨＢＶゲノムを安定に組み込む肝細胞癌細胞株（Ｄ遺伝子型）であり、テトラサイクリンで制御され得る条件下でＨＢＶを発現する。テトラサイクリンの存在下では、この細胞株は、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ合成の抑制のため、ウイルス粒子を合成せず、テトラサイクリンの非存在下では、ＨｅｐＡＤ３８細胞株はＨＢＶ ｐｇＲＮＡを転写し、サブウイルス粒子を合成し、細胞上清中にビリオン様粒子を分泌する。ＨｅｐＡＤ３８はＨｅｐＧ２．２．１５の約１０倍のＤＮＡレベルを有し、したがって高コピーＨＢＶインビトロ複製細胞モデルである（この細胞モデルの作製方法については、Ｌａｄｎｅｒ ＳＫ、Ｏｔｔｏ ＭＪ、Ｂａｒｋｅｒ ＣＳら Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ （ＨＢＶ） ｉｎ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ： ａ ｎｏｖｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＨＢＶ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９７年；４１巻（８号）：１７１５～１７２０頁を参照されたい）。
ＨｅｐＡＤ３８はＨＢＶゲノムを安定に組み込む肝細胞癌細胞株（Ｄ遺伝子型）であり、テトラサイクリンで制御され得る条件下でＨＢＶを発現する。テトラサイクリンの存在下では、この細胞株は、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ合成の抑制のため、ウイルス粒子を合成せず、テトラサイクリンの非存在下では、ＨｅｐＡＤ３８細胞株はＨＢＶ ｐｇＲＮＡを転写し、サブウイルス粒子を合成し、細胞上清中にビリオン様粒子を分泌する。ＨｅｐＡＤ３８はＨｅｐＧ２．２．１５の約１０倍のＤＮＡレベルを有し、したがって高コピーＨＢＶインビトロ複製細胞モデルである（この細胞モデルの作製方法については、Ｌａｄｎｅｒ ＳＫ、Ｏｔｔｏ ＭＪ、Ｂａｒｋｅｒ ＣＳら Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ （ＨＢＶ） ｉｎ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ： ａ ｎｏｖｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＨＢＶ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９７年；４１巻（８号）：１７１５～１７２０頁を参照されたい）。
【0128】
この実験は、２４ウェル培養プレートにおいて実施した。実験群の各試験薬物は、１μＭ及び５μＭの２つの最終濃度を有し、陽性対照群のＥＴＶは、最終濃度が１μＭであった。ここで、試験薬物及び陽性対照薬物は、所望の濃度まで培地Ｆ希釈し、ブランク群には、薬物を含まない同一容量の培地Ｆを添加した。約４×１０５個のＨｅｐＡＤ３８細胞を各ウェルにプレーティングし、５００μＬの、テトラサイクリン塩酸塩（テトラサイクリン）を含有する培地Ｇを各ウェルに添加し、細胞をプレーティングしてから４８時間後を０日目と設定し、テトラサイクリン塩酸塩（テトラサイクリン）を含有する培地Ｇを同時に除去し、新鮮な、薬物を含有する培地Ｆを交換のために使用し、次いで、新鮮な、薬物を含有する培地Ｆを８日目まで２日毎に交換のために使用し、細胞上清中のＨＢｓＡｇのレベル及び細胞内ＨＢＶ ＤＮＡのレベルを８日目に検出した。検出のための方法については、実施例１を参照されたい。
【0129】
サザンブロット実験を、６ｃｍ２培養プレート上で行った。約４．２×１０６個のＨｅｐＡＤ３８細胞を各６ｃｍ２培養プレート中にプレーティングし、テトラサイクリン塩酸塩（テトラサイクリン）を含有する培地Ｇを添加した。実験の間に、テトラサイクリン塩酸塩を含有する培地Ｇを除去し、同時に、薬物処理のために、薬物を含有する培地Ｆを添加した。ここで、試験薬物パロバロテンの処理濃度は５μＭであり、対照群は処理のためにエンテカビル（ＥＴＶ）を５μＭの濃度で使用し、処理時間は８日間であった。
【0130】
具体的なサザンブロット検出方法は、実施例３を参照して実施した。
結果を図５に示した。結果から、５μＭの濃度のパロバロテンは複製モデルＨｅｐＡＤ３８の表面抗原産生（ｐ＜０．０１）及びＨＢＶ ＤＮＡ（ｐ＜０．０５）に対して有意な阻害効果を有することが示された。サザンブロットの結果から、この薬物はＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡのレベルを有意に阻害することができるが、阻害効果は対照群（ＥＴＶ）の阻害効果より劣っていることが示された。
結果を図５に示した。結果から、５μＭの濃度のパロバロテンは複製モデルＨｅｐＡＤ３８の表面抗原産生（ｐ＜０．０１）及びＨＢＶ ＤＮＡ（ｐ＜０．０５）に対して有意な阻害効果を有することが示された。サザンブロットの結果から、この薬物はＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡのレベルを有意に阻害することができるが、阻害効果は対照群（ＥＴＶ）の阻害効果より劣っていることが示された。
【0131】
パロバロテン処理は、複製モデルＨｅｐＡＤ３８においてウイルス複製レベルを有意に阻害することができた。
【0132】
実施例５：ヒト初代培養肝細胞における、試験薬物のＨＢＶ感染に対する阻害効果の評価
この実験において、実験群、陽性対照群及びブランク群を設定した。ここで、実験群の各試験薬物（パロバロテン）は、１μＭ、５μＭ及び２５μＭの３つの最終濃度を有し、陽性対照群のＥＴＶは、最終濃度が１μＭであった。ここで、試験薬物及び陽性対照薬物は、所望の濃度まで培地Ｈで希釈し、ブランク群には、薬物を含まない同一容量の培地Ｈを添加した。
この実験において、実験群、陽性対照群及びブランク群を設定した。ここで、実験群の各試験薬物（パロバロテン）は、１μＭ、５μＭ及び２５μＭの３つの最終濃度を有し、陽性対照群のＥＴＶは、最終濃度が１μＭであった。ここで、試験薬物及び陽性対照薬物は、所望の濃度まで培地Ｈで希釈し、ブランク群には、薬物を含まない同一容量の培地Ｈを添加した。
【0133】
初代ヒト培養肝細胞を移植したヒト化マウスから、灌流技術によって初代培養肝細胞を単離し（Ｆｏｑｕｅｔ， Ｌａｎｄｅｒら「Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｕＰＡ－ＳＣＩＤ ａｎｄ ＦＲＧ（登録商標）ＫＯ ｍｉｃｅ」Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０１７年、１１７～１３０頁；Ｗａｎ－Ｃｈｕｎ Ｌｉら「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｍｏｕｓｅ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ」Ｍｏｕｓｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０１０年．１８５～１９６頁を参照のこと）、計数（ウェル当たりの約５×１０５個の初代培養肝細胞）後に２４ウェルプレート（コラーゲンＩプレコート２４ウェルプレート、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）中で直接培養し、肝細胞形態を維持するために培地Ｈを添加した（Ｘｉａｎｇ，Ｃｈｅｎｇａｎｇら「Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６４．６４３８（２０１９年）：３９９～４０２頁を参照のこと）。２４時間培養後に、薬物を含有する培地Ｈを使用して薬物を含有しない培地Ｈを交換して、２４時間にわたって薬物処理を行い、次いでＨＢＶにより感染を実施した。各ウェル中における感染のためのＨＢＶの量は２０００ＭＯＩであった。感染前に、ＨＢＶを最初に培地Ｉで希釈してＨＢＶ溶液を得た。感染容量は２５０μＬ／ウェルであった。感染中に、細胞上清を最初に吸引によって除去し、ＨＢＶ溶液を細胞に添加し、細胞を２４時間インキュベートし、次いで上清を０日目の試料として収集した。次いで、細胞を３７℃の浴中で加温したＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な、薬物を含有する培地Ｈ（ウェル当たり５００μＬ）を交換のために使用し、次いで、検出のために上清を２日毎に収集し、新鮮な、薬物を含有する培地Ｈを交換のために使用し、８日目まで、上清及び細胞を全て、関連する検出のために収集した。検出項目には、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含めた。検出方法については、実施例１を参照されたい。
【0134】
実験結果を図６に示した。結果から、ヒト初代培養肝細胞において、感染前のパロバロテン処理は、細胞上清中のＨＢｓＡｇ（ｐ＜０．０５）及びＨＢｅＡｇ（ｐ＜０．０５）のレベル並びに細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ（ｐ＜０．０５）及びｃｃｃＤＮＡ（ｐ＜０．０５）のレベルを有意に阻害できることが示された。
【0135】
パロバロテン処理は、ＨＢＶの初代ヒト培養肝細胞への感染を有意に阻害することができた。
【0136】
実施例６：ＨＢＶに感染したヒト初代培養肝細胞に対する、試験薬物の治療効果の評価
この実験において、実験群、陽性対照群及びブランク群を設定した。ここで、実験群の各試験薬物（パロバロテン）は、１μＭ、５μＭ及び２５μＭの３つの最終濃度を有し、陽性対照群のＥＴＶは、最終濃度が１μＭであった。試験薬物及び陽性対照薬物は、必要濃度まで培地Ｈで希釈し、ブランク群には、薬物を含まない同一容量の培地Ｈを添加した。
この実験において、実験群、陽性対照群及びブランク群を設定した。ここで、実験群の各試験薬物（パロバロテン）は、１μＭ、５μＭ及び２５μＭの３つの最終濃度を有し、陽性対照群のＥＴＶは、最終濃度が１μＭであった。試験薬物及び陽性対照薬物は、必要濃度まで培地Ｈで希釈し、ブランク群には、薬物を含まない同一容量の培地Ｈを添加した。
【0137】
初代ヒト培養肝細胞を移植したヒト化マウスから、灌流技術によって初代培養肝細胞を単離し、計数（ウェル当たりの５×１０５個の初代培養肝細胞）後に２４ウェルプレート中で直接培養し、肝細胞形態を維持するために培地Ｈを添加した。培養から２４時間後に、ＨＢＶによる感染を行った。各ウェル中における感染のためのＨＢＶの量は２０００ＭＯＩであった。感染前に、ＨＢＶを最初に培地Ｉに溶解させてＨＢＶ溶液を得た。感染容量は２５０μＬ／ウェルであった。感染中に、細胞上清を最初に吸引によって除去し、ＨＢＶ溶液を細胞に添加し、細胞を２４時間インキュベートし、次いで上清を０日目の試料として収集した。次いで、検出のために上清を２日毎に収集し、新鮮な培地Ｈを交換のために使用した。８日目に、新鮮な、薬物を含有する培地Ｈを交換のために使用して、薬物処理を開始し、１４日目まで、上清及び細胞を全て、関連する検出のために収集した。検出項目には、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを含めた。検出方法については、実施例１を参照されたい。
【0138】
実験結果を図７に示した。結果から、感染の８日後に処理のために薬物を添加した場合、パロバロテンが細胞上清中のＨＢｅＡｇ（ｐ＜０．０５）及びＨＢｓＡｇ（ｐ＜０．０５）のレベルを有意に阻害すること、並びに５μＭ及び２５μＭの濃度のパロバロテンの阻害効果がより明白であることが示された。２５μＭの濃度では、パロバロテンはＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ（ｐ＜０．０１）及びＨＢＶ ＤＮＡ（ｐ＜０．０５）に対する有意な阻害効果を有していた。
【0139】
パロバロテン処理は、ＨＢＶウイルス複製並びにＨＢＶに感染したヒト初代培養肝細胞のｅ抗原及び表面抗原レベルを有意に阻害することができた。
【0140】
実施例７：ＨＢＶインビトロ細胞モデルにおける試験薬物の安全性評価
この実験は、９６ウェル培養プレートにおいて実施した。８×１０４個の対応する細胞を各ウェルにプレーティングした。対応する培地容量は１００μＬであった。ここで、ＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１、ＨｅｐａＲＧ Ｍ１４Ａ及び初代培養肝細胞実験群における各試験薬物は１μＭ、５μＭ及び２５μＭの３つの最終濃度を有し、ＨｅｐＡＤ３８細胞実験群における各試験薬物は１μＭ及び５μＭの２つの最終濃度を有し（薬物は、最終濃度まで対応する培地で希釈した；実施例１、実施例２、実施例４及び実施例５を参照されたい）、ブランク群には、薬物を含まない同一容量の培地を添加した。細胞が好適な密度まで増殖した後、薬物を添加して、６日間にわたって処理を行い、その間に、培地を２日毎に新鮮な、薬物を含有する培地と取り替えた。薬物処理後、１１０μＬの、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ ＣＣＫ－８細胞活性検出試薬（Ｂｅｙｏｔｉｍｅから購入、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｃ００３８）（培地対ＣＣＫ－８試薬の容量比は１００：１０であった）を交換のために使用し、細胞を３７℃において３０分間インキュベートし、次いで、全ての上清を吸光度の検出のために収集した。吸光度値は、Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ａｕｔｏｂｉｏから購入したＰＨＯＭＯマイクロプレートリーダーで読み取った。
この実験は、９６ウェル培養プレートにおいて実施した。８×１０４個の対応する細胞を各ウェルにプレーティングした。対応する培地容量は１００μＬであった。ここで、ＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１、ＨｅｐａＲＧ Ｍ１４Ａ及び初代培養肝細胞実験群における各試験薬物は１μＭ、５μＭ及び２５μＭの３つの最終濃度を有し、ＨｅｐＡＤ３８細胞実験群における各試験薬物は１μＭ及び５μＭの２つの最終濃度を有し（薬物は、最終濃度まで対応する培地で希釈した；実施例１、実施例２、実施例４及び実施例５を参照されたい）、ブランク群には、薬物を含まない同一容量の培地を添加した。細胞が好適な密度まで増殖した後、薬物を添加して、６日間にわたって処理を行い、その間に、培地を２日毎に新鮮な、薬物を含有する培地と取り替えた。薬物処理後、１１０μＬの、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ ＣＣＫ－８細胞活性検出試薬（Ｂｅｙｏｔｉｍｅから購入、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｃ００３８）（培地対ＣＣＫ－８試薬の容量比は１００：１０であった）を交換のために使用し、細胞を３７℃において３０分間インキュベートし、次いで、全ての上清を吸光度の検出のために収集した。吸光度値は、Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ａｕｔｏｂｉｏから購入したＰＨＯＭＯマイクロプレートリーダーで読み取った。
【0141】
結果を図８に示した。結果から、ＨｅｐＧ２ ｈＮＴＣＰ ２Ｂ１、ＨｅｐａＲＧ Ｍ１４ａ、ＨｅｐＡＤ３８及びヒト初代培養肝細胞を１μＭ、５μＭ及び２５μＭの濃度の薬物パロバロテンで処理した後、各実験群のＣＣＫ－８吸収度値は、ブランク群の吸光度値と有意差がないことが示された。これは、この薬物がこれらの濃度で細胞活性に対して有意な効果を有さないことを示唆している。
【0142】
本出願の実施例から、式Ｉの化合物（パロバロテンを含む）は、インビトロ研究モデルにおいて、細胞培養物上清におけるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベル並びに細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡ のレベルを有意に低下させることができ、５μＭの薬物用量での処理は細胞の抗ウイルス療法においてより良好な効果を達成できることが示された。この薬物は、Ｂ型肝炎ウイルスに対する治療薬として開発される可能性がある。
【0143】
最後に、上記実施例は、本出願を限定するためではなく本出願の技術的解決法を例示するためにのみ使用されていることに留意すべきである。本出願を、好ましい実施例を参照して詳述したが、当業者ならば、本出願の特定の実施形態は変更し得る又は一部の技術的特徴は均等に置き換え得ることがわかるはずである。本出願の技術的解決法の趣旨から逸脱することなく、それらの全ては、本出願において特許請求の範囲に記載した技術的解決法の範囲に含まれるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】