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特許7619779海洋深層水を用いた皮膚老化防止剤及び当該皮膚老化防止剤を用いた皮膚老化防止方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-14
(45)【発行日】2025-01-22
(54)【発明の名称】海洋深層水を用いた皮膚老化防止剤及び当該皮膚老化防止剤を用いた皮膚老化防止方法
(51)【国際特許分類】
A61K 8/99 20170101AFI20250115BHJP
A61K 8/19 20060101ALI20250115BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20250115BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20250115BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20250115BHJP
【ＦＩ】
A61K8/99
A61K8/19
A61Q19/08
C12N1/20 A
C12N15/09 Z ZNA
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2020167194
(22)【出願日】2020-10-01
(65)【公開番号】P2021054823
(43)【公開日】2021-04-08
【審査請求日】2023-08-03
(31)【優先権主張番号】P 2019181686
(32)【優先日】2019-10-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【微生物の受託番号】NITE P-03021
(73)【特許権者】
【識別番号】324001723
【氏名又は名称】株式会社ディーエイチシー
(74)【代理人】
【識別番号】100116687
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 爾
(74)【代理人】
【識別番号】100098383
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 純子
(72)【発明者】
【氏名】山田 勝久
(72)【発明者】
【氏名】野村 道康
(72)【発明者】
【氏名】柴田 雄次
(72)【発明者】
【氏名】山本 樹
【審査官】山田 陸翠
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－１９９６２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１０－１８２４１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２７４１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－０７０６２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－００８５６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００１－２７８７３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－０９４３７２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ８／００－ ８／９９
Ａ６１Ｑ １／００－９０／００
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
海洋深層水と乳酸菌発酵液とを含み、海洋深層水は、逆浸透膜ろ過処理海洋深層水又は電気透析処理海洋深層水又はイオン交換処理海洋深層水であって、当該海洋深層水中のカリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、塩素イオンの質量比率が、Ｋ：Ｎａ：Ｃａ：Ｍｇ：Ｃｌ＝１：３０～７０：１０～４０：４０～１５０：２００～５００となるようにイオン選択処理された海洋深層水であり、全体の２０質量％以上で含有され、乳酸菌は海洋深層水由来のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受領番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）であることを特徴とする、皮膚老化防止剤。
【請求項2】
請求項１記載の皮膚老化防止剤において、海洋深層水は全体の４０質量％以上で含有されることを特徴とする、皮膚老化防止剤。
【請求項3】
請求項１又は２記載の皮膚老化防止剤を含む化粧料を皮膚に塗布することを特徴とする、皮膚老化防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、海洋深層水を用いた皮膚老化防止剤及び当該新規な皮膚老化防止剤を用いた皮膚老化防止方法に関し、特に、皮膚のコラーゲンの合成を促進して、更にはプロテオグリカンの分解を抑制して、老化等による皮膚のシワやクマやクスミ等を改善することができる、海洋深層水及び特定の乳酸菌を有効成分とする、新規な皮膚老化防止剤及び当該新規な皮膚老化防止剤を用いた皮膚老化防止方法に関する。
【背景技術】
【0002】
人は加齢とともにコラーゲンやプロテオグリカン等のヒト真皮マトリックス成分の産生が衰え、シワの原因となることが知られている。また、加齢により、生体防御機能も低下し、外部からの刺激に対して細胞を防御する機能も低下し、これらが皮膚の老化症状、特にシワやクスミやクマやタルミ等の発生に深く関与していると言われている。
こうした加齢や、紫外線暴露や乾燥等の影響を含む様々な外部からの刺激によって、皮膚中のコラーゲンやプロテオグリカンの量が減少し、皮膚の保湿機能や弾力性が減少して、皮膚の張りや艶が失われ、シワ、クスミ、クマ等の皮膚の老化症状が促進されることが知られている。特に、シワやタルミ等は日光に曝される部分に著しく、日光に曝された皮膚にシワやタルミ等が発生する現象を特に光老化と呼んでいる。光老化したシワ部分では、真皮中のコラーゲン量が著しく減少していることも知られている。
こうした加齢や、紫外線暴露や乾燥等の影響を含む様々な外部からの刺激によって、皮膚中のコラーゲンやプロテオグリカンの量が減少し、皮膚の保湿機能や弾力性が減少して、皮膚の張りや艶が失われ、シワ、クスミ、クマ等の皮膚の老化症状が促進されることが知られている。特に、シワやタルミ等は日光に曝される部分に著しく、日光に曝された皮膚にシワやタルミ等が発生する現象を特に光老化と呼んでいる。光老化したシワ部分では、真皮中のコラーゲン量が著しく減少していることも知られている。
【0003】
以上のように、加齢や光老化等に伴い、シワ、クスミ、クマ等を予防・改善することは美容上の重要な課題である。
【0004】
コラーゲンは、分子量９５，０００の３本のポリペプチド鎖が絡み合った構造を有しており、皮膚、血管、腱、歯などのほとんどの組織に存在する線維状の蛋白質であり、身体を構成する全蛋白質の約３０％を占めている。また、コラーゲンは真皮マトリックスの９０％以上を占め、紫外線によって活性化されるコラゲナーゼによって分解が亢進されることも知られている。
また、真皮には、真皮マトリックス成分の一つであり、皮膚の水分保持にも寄与する成分であるプロテオグリカンが存在する。プロテオグリカンは老化と共にアグリカナーゼ（プロテオグリカン分解酵素）によって分解され、シワ、クスミ、クマ等の原因となることが知られている。
また、真皮には、真皮マトリックス成分の一つであり、皮膚の水分保持にも寄与する成分であるプロテオグリカンが存在する。プロテオグリカンは老化と共にアグリカナーゼ（プロテオグリカン分解酵素）によって分解され、シワ、クスミ、クマ等の原因となることが知られている。
【0005】
これらのことから、皮膚中のコラーゲンやプロテオグリカンといった真皮マトリックス成分の減少が、皮膚のシワ、クスミ、クマ等を引き起す主な原因であると考えられている。従って、コラーゲンやプロテオグリカンの減少を抑制し得る剤を提供できれば、光老化のみならず、加齢に伴うシワやタルミを始めとしてシミやクスミ等を予防・改善することが可能である。
【0006】
一方、海洋深層水は、有光層（補償深度）である２００ｍ以深の海水であり、光合成による有機物生産がほとんど行われず分解が卓越している。さらに、無機栄養塩を多く含むことなどから、種々の利用が試みられている。
【0007】
海洋深層水を利用した化粧料としては、例えば、本出願人による特開２０１６－９４３７２号公報（特許文献１）に、カロテノイドの生体への吸収性を高めるため、海洋深層水とカロテノイドとを併用する高吸収用組成物が記載されており、好ましくは、カロテノイドは、かんきつ類由来であり、より好ましくはかんきつ類由来のカロテノイドはクリプトキサンチンであり、海洋深層水は原水又は逆浸透法で淡水化して得られた淡水と海洋深層水との原水を混合した水であることを特徴とする、カロテノイド高吸収用組成物が開示されている。
【0008】
また、本出願人による特開２０１８－１９９６２９号公報（特許文献２）には、海洋深層水を全体の３０重量％以上とし、海洋深層水とポリオールとを、海洋深層水とポリオールとの重量比率を９：１～３：７として併用する皮膚の保湿性向上方法であって、ポリオールが、グリセリン、ジグリセリン、ソルビトール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、プロパンジオール、ジプロピレングリコール、グリセレス－２６、ペンチレングリコール、ヘキサンジオール、マルチトール、キシリトール、カプリリルグリコールからなる群より選ばれる少なくとも１種である、皮膚の保湿性向上方法が開示されている。
【0009】
更に、特開２００８－２９７２０５号公報（特許文献３）には、海洋深層水を黒豚由来の動物性コラーゲンとともに使用する化粧品が開示されており、具体的には、海洋深層水を精製水とともに用いて、真皮結合組織を活性化させることが記載されている。
【0010】
しかし、これらの従来のものは、海洋深層水と海洋深層水から分離された乳酸菌あるいはその発酵物とを含むものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【文献】特開２０１６－９４３７２号公報
【文献】特開２０１８－１９９６２９号公報
【文献】特開２００８－２９７２０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の目的は、海洋深層水及び特定の乳酸菌を有効成分として含むことにより、コラーゲン合成を促進させて、シワやクスミやクマを防ぐだけでなく、皮膚の老化防止効果を高めることができる、皮膚老化防止剤及び皮膚老化防止方法を提供することである。
特に、乳酸菌を海洋深層水由来の乳酸菌とすることで海洋深層水とともに、優れたコラーゲン産生促進機能と、プロテオグリカンの分解抑制機能とを有効に発現することができる、皮膚老化防止剤及び皮膚老化防止方法を提供することである。
特に、乳酸菌を海洋深層水由来の乳酸菌とすることで海洋深層水とともに、優れたコラーゲン産生促進機能と、プロテオグリカンの分解抑制機能とを有効に発現することができる、皮膚老化防止剤及び皮膚老化防止方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らが鋭意研究したところ、特定の乳酸菌および／またはその発酵物と海洋深層水とを組み合わせて併用することにより、海洋深層水だけの場合よりも、皮膚へ塗布した場合にコラーゲン合成促進作用が向上し、シワやクスミやクマ等の皮膚の老化が防止されることを見出し、また更には、プロテオグリカンの分解抑制機能を発現することができることを見出し、本発明に至ったものである。
【0014】
請求項１記載の皮膚老化防止剤は、海洋深層水と乳酸菌および／またはその発酵物とを含み、乳酸菌は海洋深層水由来のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）であることを特徴とする、皮膚老化防止剤である。
【0015】
更に、請求項１記載の皮膚老化防止剤は、前記海洋深層水が、逆浸透膜ろ過処理海洋深層水、電気透析処理海洋深層水又はイオン交換処理海洋深層水であり、海洋深層水中のカリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、塩素イオンの質量比率が、Ｋ：Ｎａ：Ｃａ：Ｍｇ：Ｃｌ＝１：３０～７０：１０～４０：４０～１５０：２００～５００となるようにイオン選択処理された海洋深層水であって、全体の２０質量％以上、好ましくは４０質量％以上で含有されるものであることを特徴とする、皮膚老化防止剤である。
【0016】
請求項３記載の皮膚老化防止法は、上記皮膚老化防止剤を含む化粧料を皮膚に塗布することを特徴とする、皮膚老化防止方法である。
【発明の効果】
【0017】
本発明の皮膚老化防止剤によれば、海洋深層水、好ましくはイオン選択処理された海洋深層水と、海洋深層水由来の特定の乳酸菌および／またはその発酵物とを併用することで、皮膚に塗布した際、真皮中のコラーゲンを増加させることで、シワやクスミやクマ等の皮膚の老化を有効に防止することが可能となる。更には、真皮マトリックス成分の一つであるプロテオグリカンの分解を抑制することで、シワやクスミやクマ等の皮膚の老化を有効に防止することができる。
従って、海洋深層水と特定の乳酸菌を有効成分とする本発明の皮膚老化防止剤を用いることで、皮膚に直接塗布する化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、パック、ファンデーションやボディーローション等の化粧料に適用して、皮膚のシワやクスミやクマ等の老化を防止することが可能である。
従って、海洋深層水と特定の乳酸菌を有効成分とする本発明の皮膚老化防止剤を用いることで、皮膚に直接塗布する化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、パック、ファンデーションやボディーローション等の化粧料に適用して、皮膚のシワやクスミやクマ等の老化を防止することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】海洋深層水から本発明の乳酸菌を分離する方法の一例を概略的に示す図である。
【図2】ＥＤミネラル水のコラーゲン合成促進作用の評価の一例を示す図である。
【図3】本発明に用いる乳酸菌の発酵液と既存の乳酸菌の発酵液のコラーゲン合成促進作用の評価の一例を示す図である。
【図4】精製水（ＤＷ）、ＥＤミネラル水、ＥＤミネラル水＋本発明に用いる乳酸菌の発酵液、及び、ＥＤミネラル水＋既存の乳酸菌の発酵液のコラーゲン合成促進作用の評価の一例を示す図である。
【図5】プロテオグリカン分解抑制度合の評価の一例を示す図である。
【図6】グルクロニルトランスフェラーゼ遺伝子発現量の評価の一例を示す図である。
【図7】過酸化水素に対する抗酸化作用の評価の一例を示す図である。
【図8】本発明の皮膚老化防止剤を含有する化粧水のシワ改善効果を評価する一例の線図である。
【図9】本発明の皮膚老化防止剤を含有する化粧水のクマ改善効果を評価する一例の線図である。
【図10】本発明の皮膚老化防止剤を含有する化粧水のクスミ改善効果を評価する一例の線図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明を以下の実施形態に基づき詳細に説明する。
本発明の皮膚老化防止剤は、海洋深層水と乳酸菌および／またはその発酵物とを含み、乳酸菌は海洋深層水由来のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）であることを特徴とする、皮膚老化防止剤である。
なお、特記しない限り、％は質量％を示す。
本発明の皮膚老化防止剤は、海洋深層水と乳酸菌および／またはその発酵物とを含み、乳酸菌は海洋深層水由来のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）であることを特徴とする、皮膚老化防止剤である。
なお、特記しない限り、％は質量％を示す。
【0020】
本発明においては、海洋深層水と海洋深層水由来の前記特定の乳酸菌および／またはその発酵物とを併用することで、皮膚中のコラーゲン産生を促すことができ、皮膚の老化を軽減することができる。また、真皮マトリックス成分であるプロテオグリカンの分解を抑制して、皮膚の老化を軽減することが可能となる。特に、皮膚老化防止剤には、海洋深層水を、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上で含むことが望ましい。
【0021】
本発明の皮膚老化防止剤には、海洋深層水が有効成分として含有される。
本発明における「海洋深層水」には、前記２００ｍ以深の海洋深層水原水自体、さらには、海洋深層水を電気透析処理した水（ＥＤ塩水、ＥＤミネラル水）、逆浸透膜濾過（ＲＯ膜）処理した水、イオン交換膜処理した水、海洋深層水に含まれるミネラル分に相当するミネラルを含む液体であれば任意の処理水も、本発明における「海洋深層水」の概念に含まれるものである。
本発明における「海洋深層水」には、前記２００ｍ以深の海洋深層水原水自体、さらには、海洋深層水を電気透析処理した水（ＥＤ塩水、ＥＤミネラル水）、逆浸透膜濾過（ＲＯ膜）処理した水、イオン交換膜処理した水、海洋深層水に含まれるミネラル分に相当するミネラルを含む液体であれば任意の処理水も、本発明における「海洋深層水」の概念に含まれるものである。
【0022】
海洋深層水(Ｄｅｅｐ ｓｅａｗａｔｅｒ,ＤＳＷ）は、一般に、海面下２００ｍ以深のＮａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇや、無機栄養成分を豊富に含む低温で、清潔且つ衛生的な水であり、安全性、安定性に優れているものである。
海洋深層水を採水するための取水地としては、静岡県伊東市（伊豆赤沢）を始め、現在９都道県で、１５の取水施設が有り（海洋深層水利用学会ＨＰ調べ、２０１７年２月現在）、これらの取水地から採水される海洋深層水のいずれも本発明の適用の対象とすることができ、更には前記取水地以外で採水した海洋深層水を用いることも可能である。
海洋深層水を採水するための取水地としては、静岡県伊東市（伊豆赤沢）を始め、現在９都道県で、１５の取水施設が有り（海洋深層水利用学会ＨＰ調べ、２０１７年２月現在）、これらの取水地から採水される海洋深層水のいずれも本発明の適用の対象とすることができ、更には前記取水地以外で採水した海洋深層水を用いることも可能である。
【0023】
特に好ましくは、伊豆赤沢海洋深層水であり、かかる海洋深層水は、伊豆赤沢沖の水深約８００ｍから汲み上げられるもので、表層水に比べて、微生物の存在比が数千分の一程度のものである。また、伊豆赤沢海洋深層水は、伊豆半島付近の海洋表層で北東方向に向けて流れている黒潮や、伊豆半島南東沖海底の高い海底火山群からなる伊豆・小笠原弧が形成されていることから、伊豆赤沢沖は、首都圏・大都市圏に最も近いにもかかわらず、汚染されていない清浄な海洋深層水を取水することができる場所であり、本発明において、有効に適用することができるものである。
【0024】
本発明において好適に用いられる海洋深層水としては、採水した海洋深層水に含まれるイオンを特定の比率にイオン選択処理した海洋深層水が特に好適であり、このような特定のイオン比率とすることで、本発明の上記効果を特に有効に発現することができ、更に、塩分等の皮膚への刺激を緩和することができるからである。
【0025】
海洋深層水原水中に含まれるイオンを特定の比率に処理する方法としては、下記特定のイオン比率とすることができれば特に限定されず、例えば、公知の逆浸透膜ろ過法、電気透析法やイオン交換膜法等を用いてイオン選択処理することができる。
また、海洋深層水原水をイオン選択処理する公知の方法であれば他の任意の方法も、下記特定のイオン比率とすることができる限り適用することができる。
また、海洋深層水原水をイオン選択処理する公知の方法であれば他の任意の方法も、下記特定のイオン比率とすることができる限り適用することができる。
【0026】
例えば、イオン選択処理する方法としては、電気透析装置「アストム株式会社製、アシライザー２５型 １００対×３段連続式（海水脱塩仕様）」を用いて、電気透析法（イオン交換膜法）によりイオン交換膜と直流電流の作用で、海洋深層水原水中にあるイオン性物質の脱塩・濃縮を行なって脱塩処理をする方法等や、更には、特開２０００－１５９６５５号公報に開示されているように、海洋深層水を逆浸透膜装置（東洋紡株式会社製、ＨＲ５１５５）で脱塩処理した後、電気透析装置（旭ガラス株式会社製、セレミオンＣＭＶ、セレミオンＡＳＶ）によって脱塩処理する方法を適用して、下記特定のイオン比率とすることでもよく、また、特開２０１０－２７４２１４号公報に記載されているような逆浸透膜法で脱塩処理する方法を用いて特定のイオン比率とすることでもよい。
【0027】
イオン選択処理としては、海洋深層水を、例えば、含有されるカリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、塩素イオンの比率が、Ｋ：Ｎａ：Ｃａ：Ｍｇ：Ｃｌ＝１：３０～７０：１０～４０：４０～１５０：２００～５００程度となるようにイオン選択処理することが望ましい。具体的には、例えば海洋深層水１００ｇ中、Ｋが０～０．１ｇ程度、Ｎａが０．０１～０．５０ｇ程度、Ｃａが０．０１～０．０４ｇ程度、Ｍｇが０．０５～０．５ｇ程度、Ｃｌが０．１～１．０ｇ程度となるように処理された海洋深層水であるＥＤミネラル水とすることが望ましい。
前記組成のミネラル分を有するイオン選択処理された海洋深層水（ＥＤミネラル水）を上記特定の乳酸菌（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）と併用することにより、皮膚の角層の水分保持能を高め、保湿性を向上させる機能を特に有効に発現することが可能となる。
なお、伊豆赤沢産の表面海水、伊豆赤沢産の海洋深層水（原水）、一例のＥＤミネラル水の組成の比較を以下の表１に示す。
前記組成のミネラル分を有するイオン選択処理された海洋深層水（ＥＤミネラル水）を上記特定の乳酸菌（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）と併用することにより、皮膚の角層の水分保持能を高め、保湿性を向上させる機能を特に有効に発現することが可能となる。
なお、伊豆赤沢産の表面海水、伊豆赤沢産の海洋深層水（原水）、一例のＥＤミネラル水の組成の比較を以下の表１に示す。
【0028】
【表1】
【0029】
一般に、天然にがりは、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、塩素イオンの比率が、Ｋ：Ｎａ：Ｃａ：Ｍｇ：Ｃｌ＝１：２～２５：０～１：１～５：１０～５０程度であり、天然にがりを用いた水溶液と、イオン選択処理した海洋深層水とはミネラル分の組成が大きく異なり、また、にがりを用いた水溶液を本発明に適用することは望ましくない。
なお、例えば伊豆赤沢産の海洋深層水を上記の電気透析処理方法（電気透析装置「アストム株式会社製、アシライザー２５型」）によってイオン選択処理した海洋深層水（ＥＤミネラル水）、富山県滑川産の海洋深層水（ＥＤミネラル水）及び各種のにがりは、以下の表２に示すイオンの成分の組成を有する。
なお、例えば伊豆赤沢産の海洋深層水を上記の電気透析処理方法（電気透析装置「アストム株式会社製、アシライザー２５型」）によってイオン選択処理した海洋深層水（ＥＤミネラル水）、富山県滑川産の海洋深層水（ＥＤミネラル水）及び各種のにがりは、以下の表２に示すイオンの成分の組成を有する。
【0030】
【表2】
【0031】
また、本発明に適用する海洋深層水の電気伝導度は、０～３０ｍＳ／ｃｍであることが望ましく、更に好ましくは５～１５ｍＳ／ｃｍであることが、上記本発明の効果を、より有効に発現させるため望ましい。
【0032】
本発明の皮膚老化防止剤に含まれる乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍであり、特にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍに属する乳酸菌であって海洋深層水由来の乳酸菌であり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）が好適に用いられる。
ここで、「ＬＰＡＫ１－１３」株は、本出願人により新規菌株に付与した番号である。
ここで、「ＬＰＡＫ１－１３」株は、本出願人により新規菌株に付与した番号である。
【0033】
本発明に用いるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株は、独立法人製品技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、２０１９年９月１９日に受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３０２１で受領され、またＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１で受託されている（受託証通知番号２０１９－０３７３）。
【0034】
上記菌株は、海洋深層水由来のものであり、海洋深層水から分離されて、本発明の皮膚老化防止剤に含有される。
海洋深層水から上記乳酸菌を分離する方法としては、当該乳酸菌を単離できれば特に特定されるものではないが、以下の方法を例示することができ、その概要を図１に示す。
図１に示す一例としては、取水した海洋深層水中の懸濁物をろ過するバッグフィルター（孔径０．５μｍ）の底部を無菌的に３ｃｍ角に切除し、それを滅菌した海洋深層水に入れて攪拌し、懸濁液を調製し、次いで、乳酸菌選択培地であるＭＲＳ海水寒天培地（０．００５％シクロヘキシミド含有：表３）に前記調製した懸濁液を塗抹し、暗所にて、２７℃、静置の条件で培養し、培養後、寒天培地上に出現したコロニーを単離して、１６ＳｒＤＮＡを解析することで乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であることを同定して分離することができる。
かかる分離して得られた乳酸菌をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株とした（ＬＰＡＫ１－１３乳酸菌）。
海洋深層水から上記乳酸菌を分離する方法としては、当該乳酸菌を単離できれば特に特定されるものではないが、以下の方法を例示することができ、その概要を図１に示す。
図１に示す一例としては、取水した海洋深層水中の懸濁物をろ過するバッグフィルター（孔径０．５μｍ）の底部を無菌的に３ｃｍ角に切除し、それを滅菌した海洋深層水に入れて攪拌し、懸濁液を調製し、次いで、乳酸菌選択培地であるＭＲＳ海水寒天培地（０．００５％シクロヘキシミド含有：表３）に前記調製した懸濁液を塗抹し、暗所にて、２７℃、静置の条件で培養し、培養後、寒天培地上に出現したコロニーを単離して、１６ＳｒＤＮＡを解析することで乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であることを同定して分離することができる。
かかる分離して得られた乳酸菌をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株とした（ＬＰＡＫ１－１３乳酸菌）。
【0035】
【表3】
【0036】
本発明に用いるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株の菌学的性質は、以下の表４及び表５に示す通りである。
なお、表４は、本菌株に関する性状等を、表５は糖資化性を試験した結果を示す。
表４において、「＋」は発酵性があり、「－」は発酵性なしを表す。
また、表４中のＬＰＡＫ１－１３株はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）であり、Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ株は基準株を意味し、具体的にはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１１２５株（Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ株）である。
なお、表４は、本菌株に関する性状等を、表５は糖資化性を試験した結果を示す。
表４において、「＋」は発酵性があり、「－」は発酵性なしを表す。
また、表４中のＬＰＡＫ１－１３株はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）であり、Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ株は基準株を意味し、具体的にはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１１２５株（Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ株）である。
【0037】
【表4】
【0038】
【表5】
【0039】
海洋深層水から分離した当該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）は、皮膚中のコラーゲン産生を促すことができ、皮膚の老化を軽減することができる。また、真皮マトリックス成分であるプロテオグリカンの分解を抑制して、皮膚の老化を軽減することが可能となり、抗酸化作用を有するものである。
【0040】
また、海洋深層水から分離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）を用いて発酵液を調製することも可能であり、かかる発酵液を海洋深層水とともに、本発明の皮膚老化防止剤中の有効成分として上記ＬＰＡＫ１－１３乳酸菌そのものに替えて、または併用して用いることもできる。
例えば、一例として、グルコース、酵母エキスおよび精製水を混合した溶液を調製して滅菌した後、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）を植菌し、３０℃で３日間静置培養すること等で発酵液を得ることができる。
前記グルコース、酵母エキスのほかに、例えば豆乳、野菜等を用いて発酵液を調製することも可能である。
例えば、一例として、グルコース、酵母エキスおよび精製水を混合した溶液を調製して滅菌した後、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）を植菌し、３０℃で３日間静置培養すること等で発酵液を得ることができる。
前記グルコース、酵母エキスのほかに、例えば豆乳、野菜等を用いて発酵液を調製することも可能である。
【0041】
また、本発明においては、海洋深層水と、ＬＰＡＫ１－１３乳酸菌及び／又はこの乳酸菌発酵液（乳酸菌として換算）とを組み合わせるものであり、ＬＰＡＫ１－１３乳酸菌または当該乳酸菌発酵液の終濃度が０．０１～５０．００％、好ましくは０．１０～５．００％とすることが、上記本件発明の効果を特に有効に発現させるために望ましい。
【0042】
上記のように、海洋深層水と、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属乳酸菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株とを組み合わせることにより、皮膚中のコラーゲン産生を促進することができ、シワ、クスミ、クマ等の皮膚の老化を防止することが可能となる。また、皮膚の真皮中のマトリックス成分の一つであるプロテオグリカンの分解を抑制することができ、これによっても皮膚の老化を抑制することが可能となる。
【0043】
真皮中には、皮膚の水分保持にも寄与する成分であるプロテオグリカンが存在し、プロテオグリカンは老化と共にアグリカナーゼ（プロテオグリカン分解酵素）によって分解され、シワ、クスミ、クマ等の原因となるが、本発明の皮膚老化防止剤は、アグリカナーゼ遺伝子の発現を抑制して、プロテオグリカンの分解を抑制することができるものである。
また、本発明の皮膚老化防止剤は、ヒアルロン酸等のグルコサミノグリカンの生合成に寄与する酵素であるＧｌｕｃｕｒｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Iの発現量を増大することができ、これにより皮膚の老化を抑制することが可能となる。
また、本発明の皮膚老化防止剤は、ヒアルロン酸等のグルコサミノグリカンの生合成に寄与する酵素であるＧｌｕｃｕｒｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Iの発現量を増大することができ、これにより皮膚の老化を抑制することが可能となる。
【0044】
また、上記本発明の効果を阻害しない限り他の成分を含んでもよく、かかる他の成分としては、公知の紫外線吸収剤や紫外線遮断剤、美白剤、消炎剤、動植物油、ロウ類、多価アルコール、フッ素系の油、高級アルコール、高級脂肪酸、他のノニオン界面活性剤やアニオン界面活性剤や両性界面活性剤等の界面活性剤、酸化防止剤、香料、防腐剤、ｐＨ調製剤等を例示することができる。
【0045】
本発明の皮膚老化防止方法は、上記本発明の皮膚老化防止剤を通常の化粧料組成物に含有させて、皮膚と接触させることにより、皮膚の老化を防止する方法であり、老化した皮膚であっても、まだシワ、タルミ、クスミ、シミ等の老化が発現していない皮膚であっても、いずれの状態の皮膚に適用することができる。
【0046】
本発明の皮膚老化防止剤を含む化粧料を、皮膚と接触させる方法としては、特に限定されず、例えば、本発明の皮膚老化防止剤を含む化粧料を直接当該皮膚に塗布したり、希釈して適用すること等によって実施できる。
【0047】
例えば、本発明の皮膚老化防止剤は、皮膚に直接塗布する化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、パック、ファンデーションやボディーローション等の化粧料の形態として適用することが可能である。
更にはヒトに対して有害でない成分と併用することで食品（特に健康食品等）に適用することも期待される。
更にはヒトに対して有害でない成分と併用することで食品（特に健康食品等）に適用することも期待される。
【実施例】
【0048】
本発明を以下の実施例、比較例、試験例により説明するが、これらに限定されるものではない。
（１）海洋深層水（ＥＤミネラル水）の調製
皮膚老化防止剤に含有される海洋深層水としては、伊豆赤沢沖の水深８００ｍ程度からくみ上げられた海洋深層水（伊豆赤沢産、北緯３４°５０’１９”、東経１３９°０８’１１”、深度８００ｍ、取水後４℃で保存）を、以下の方法でイオン選択処理した海洋深層水の電気透析水（海洋深層水（ＥＤミネラル水））を用いた（電気伝導度は１２．５ｍＳ／ｃｍ）。
具体的には、電気透析装置「アストム株式会社製、アシライザー２５型 １００対×３段連続式（海水脱塩仕様）」を用いて、伊豆赤沢産の海洋深層水を電気透析法（イオン交換膜法）によりイオン交換膜を用いて直流電流を負荷することにより、海洋深層水原水中に存在するイオン性物質の脱塩・濃縮を行ない、脱塩処理をして、イオン処理した海洋深層水（ＥＤミネラル水）を得た。
得られた海洋深層水（ＥＤミネラル水）は、上記表２に示す成分組成（伊豆赤沢産）を有する。
（１）海洋深層水（ＥＤミネラル水）の調製
皮膚老化防止剤に含有される海洋深層水としては、伊豆赤沢沖の水深８００ｍ程度からくみ上げられた海洋深層水（伊豆赤沢産、北緯３４°５０’１９”、東経１３９°０８’１１”、深度８００ｍ、取水後４℃で保存）を、以下の方法でイオン選択処理した海洋深層水の電気透析水（海洋深層水（ＥＤミネラル水））を用いた（電気伝導度は１２．５ｍＳ／ｃｍ）。
具体的には、電気透析装置「アストム株式会社製、アシライザー２５型 １００対×３段連続式（海水脱塩仕様）」を用いて、伊豆赤沢産の海洋深層水を電気透析法（イオン交換膜法）によりイオン交換膜を用いて直流電流を負荷することにより、海洋深層水原水中に存在するイオン性物質の脱塩・濃縮を行ない、脱塩処理をして、イオン処理した海洋深層水（ＥＤミネラル水）を得た。
得られた海洋深層水（ＥＤミネラル水）は、上記表２に示す成分組成（伊豆赤沢産）を有する。
【0049】
また、得られた海洋深層水（ＥＤミネラル水）中のＫ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇのイオン含有量はマルチタイプＩＣＰ発光分光分析装置（株式会社島津製作所製）を用いて測定し、Ｃｌ含有量は高速液体クロマトグラフ（株式会社島津製作所製）を用いて測定した（表２）。
次いで、２０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水は、ＥＤミネラル水：精製水が１：４となるように、４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水は、ＥＤミネラル水：精製水が２：３となるように、６０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水は、ＥＤミネラル水：精製水が３：２となるように、８０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水は、ＥＤミネラル水：精製水が４：１となるように、配合して調製した。
次いで、２０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水は、ＥＤミネラル水：精製水が１：４となるように、４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水は、ＥＤミネラル水：精製水が２：３となるように、６０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水は、ＥＤミネラル水：精製水が３：２となるように、８０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水は、ＥＤミネラル水：精製水が４：１となるように、配合して調製した。
【0050】
（２）海洋深層水からの乳酸菌の分離
１）伊豆赤沢沖の水深８００ｍから取水した海洋深層水をろ過するためのバッグフィルター（孔径０．５μｍ）の底部を無菌的に３ｃｍ角に切除し、それを滅菌した前記海洋深層水に入れて攪拌し、懸濁液を調製した。
２）次に、乳酸菌選択培地であるＭＲＳ海水寒天培地（０．００５％シクロヘキシミド含有：上記表３）で調製した懸濁液を塗抹し、暗所にて温度２７℃で静置して３日間培養した。
３）培養後、前記寒天培地上に出現したコロニーを白金耳（滅菌した棒）で回収し、１６ＳｒＤＮＡを解析することで、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であることを確認した。
このようにして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）乳酸菌を得た。
１）伊豆赤沢沖の水深８００ｍから取水した海洋深層水をろ過するためのバッグフィルター（孔径０．５μｍ）の底部を無菌的に３ｃｍ角に切除し、それを滅菌した前記海洋深層水に入れて攪拌し、懸濁液を調製した。
２）次に、乳酸菌選択培地であるＭＲＳ海水寒天培地（０．００５％シクロヘキシミド含有：上記表３）で調製した懸濁液を塗抹し、暗所にて温度２７℃で静置して３日間培養した。
３）培養後、前記寒天培地上に出現したコロニーを白金耳（滅菌した棒）で回収し、１６ＳｒＤＮＡを解析することで、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であることを確認した。
このようにして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）乳酸菌を得た。
【0051】
（３）乳酸菌発酵液の調製
本発明において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株乳酸菌発酵液は、以下の行程で調製したものを表す。
ア）ＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液
上記（２）で海洋深層水から分離した乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株を、上記（２）の２）に記載したと同じＭＲＳ海水液体培地（上記表３）で培養し、得られた培養液を遠心分離し、上清を除去し、沈査して菌体を得た。
得られた菌体を滅菌生理食塩水で洗浄し、洗浄した菌体を滅菌生理食塩水に懸濁して、菌体懸濁液を得た。
次いで、酵母エキス（大日本明治製糖社製、コクベース）が１％（ｗ／ｗ）、グルコース（和光純薬工業社製、Ｄ－グルコース）が１％（ｗ／ｗ）、リン酸緩衝液が２５μＭ、ＧＰ－１（日清ファルマ社製）が０．０８（ｗ／ｗ）％、水添リゾレシチン（日光ケミカルズ社製、レシノールＬＬ２０）が０．０５（ｗ／ｗ）％とそれぞれなるように精製水に添加し、１２１℃、２０分間加熱殺菌した後、前記菌体懸濁液を用いてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、２７℃で３日間発酵させ、φ０．２μｍのフィルターで菌体を除去することで、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株乳酸菌の発酵液を調製した。
本発明において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株乳酸菌発酵液は、以下の行程で調製したものを表す。
ア）ＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液
上記（２）で海洋深層水から分離した乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株を、上記（２）の２）に記載したと同じＭＲＳ海水液体培地（上記表３）で培養し、得られた培養液を遠心分離し、上清を除去し、沈査して菌体を得た。
得られた菌体を滅菌生理食塩水で洗浄し、洗浄した菌体を滅菌生理食塩水に懸濁して、菌体懸濁液を得た。
次いで、酵母エキス（大日本明治製糖社製、コクベース）が１％（ｗ／ｗ）、グルコース（和光純薬工業社製、Ｄ－グルコース）が１％（ｗ／ｗ）、リン酸緩衝液が２５μＭ、ＧＰ－１（日清ファルマ社製）が０．０８（ｗ／ｗ）％、水添リゾレシチン（日光ケミカルズ社製、レシノールＬＬ２０）が０．０５（ｗ／ｗ）％とそれぞれなるように精製水に添加し、１２１℃、２０分間加熱殺菌した後、前記菌体懸濁液を用いてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、２７℃で３日間発酵させ、φ０．２μｍのフィルターで菌体を除去することで、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株乳酸菌の発酵液を調製した。
【0052】
イ）Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ発酵液
酵母エキス（大日本明治製糖社製、コクベース）が１％（ｗ／ｗ）、グルコース（和光純薬工業社製、Ｄ－グルコース）が１％（ｗ／ｗ）、リン酸緩衝液が２５μＭ、ＧＰ－１（日清ファルマ社製）が０．０８％（ｗ／ｗ）、水添リゾレシチン（日光ケミカルズ社製、レシノールＬＬ２０）が０．０５％（ｗ／ｗ）とそれぞれなるように精製水に添加し、１２１℃、２０分間加熱殺菌した後、Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１１２５）が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、２７℃で３日間発酵させ、φ０．２μｍのフィルターで菌体を除去することで、Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ株乳酸菌の発酵液を調製した。
酵母エキス（大日本明治製糖社製、コクベース）が１％（ｗ／ｗ）、グルコース（和光純薬工業社製、Ｄ－グルコース）が１％（ｗ／ｗ）、リン酸緩衝液が２５μＭ、ＧＰ－１（日清ファルマ社製）が０．０８％（ｗ／ｗ）、水添リゾレシチン（日光ケミカルズ社製、レシノールＬＬ２０）が０．０５％（ｗ／ｗ）とそれぞれなるように精製水に添加し、１２１℃、２０分間加熱殺菌した後、Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１１２５）が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、２７℃で３日間発酵させ、φ０．２μｍのフィルターで菌体を除去することで、Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ株乳酸菌の発酵液を調製した。
【0053】
（４）コラーゲン合成試験（１）（ＥＤミネラル水）
正常ヒト皮膚由来線維芽細胞を用い、当該細胞に上記（１）で得られたＥＤミネラル水を添加することにより、コラーゲン合成に与える影響をＥＬＩＳＡ法（ヒトI型コラーゲン）にて試験した。
具体的には、イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）が０．９４％（ｗ／ｖ）となるように精製水に溶解し、１２１℃、２０分間加熱殺菌した後、φ０．２μｍのフィルターで除菌した炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）が０．２％、Ｌ－グルタミン（和光純薬工業社製）が４ｍＭ、ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）が１０％となるように添加して調製した培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有イーグルＭＥＭ培地）を用いて、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ、理研バイオリソース研究センター）を９６穴マイクロプレート（ＡＧＣテクノグラス（株）社製）に２０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間予備培養した。
正常ヒト皮膚由来線維芽細胞を用い、当該細胞に上記（１）で得られたＥＤミネラル水を添加することにより、コラーゲン合成に与える影響をＥＬＩＳＡ法（ヒトI型コラーゲン）にて試験した。
具体的には、イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）が０．９４％（ｗ／ｖ）となるように精製水に溶解し、１２１℃、２０分間加熱殺菌した後、φ０．２μｍのフィルターで除菌した炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）が０．２％、Ｌ－グルタミン（和光純薬工業社製）が４ｍＭ、ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）が１０％となるように添加して調製した培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有イーグルＭＥＭ培地）を用いて、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ、理研バイオリソース研究センター）を９６穴マイクロプレート（ＡＧＣテクノグラス（株）社製）に２０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間予備培養した。
【0054】
前記予備培養後、当該イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）が０．９４％（ｗ／ｖ）となるように、上記（１）で調製した２０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）の各ＥＤミネラル水に溶解し、１２１℃、２０分間加熱殺菌した後、φ０．２μｍのフィルターで除菌した炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）が０．２％、Ｌ－グルタミン（和光純薬工業社製）が４ｍＭ、ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）が０．５％となるように添加して調製した培地（０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地）で、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１日間の評価培養を行った。
評価培養後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（ヒトI型コラーゲン）によりコラーゲン合成量を評価した。
なお、比較のために、ＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）を用いて、上記と同様の１日間の評価培養を行った。
その結果を図２に示す。
なお、精製水（ＤＷ）を用いた場合の図２中の結果は、コラーゲンが増加しない結果の数値である。
評価培養後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（ヒトI型コラーゲン）によりコラーゲン合成量を評価した。
なお、比較のために、ＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）を用いて、上記と同様の１日間の評価培養を行った。
その結果を図２に示す。
なお、精製水（ＤＷ）を用いた場合の図２中の結果は、コラーゲンが増加しない結果の数値である。
【0055】
図２より、ＥＤミネラル水に、コラーゲン合成促進作用があることがわかる。また含有されるＥＤミネラル水の含有量が多くなるほど、培養線維芽細胞のコラーゲン合成促進作用に優れることがわかる。
【0056】
（５）コラーゲン合成試験（２）（乳酸菌発酵液）
乳酸菌発酵液として、上記（３）で調製したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液及びＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ発酵液を用いて、以下の試験を行った。
正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ、理研バイオリソース研究センター）を２４穴マイクロプレートに１１５，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、前記（４）と同様に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間予備培養した。
乳酸菌発酵液として、上記（３）で調製したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液及びＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ発酵液を用いて、以下の試験を行った。
正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ、理研バイオリソース研究センター）を２４穴マイクロプレートに１１５，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、前記（４）と同様に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間予備培養した。
【0057】
前記予備培養後、
１）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
２）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製し、さらに上記（３）で調製したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液を終濃度が２％（ｗ／ｗ）となるように添加した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地、及び
３）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製し、さらに上記（３）で調製したＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ (Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１１２５)乳酸菌発酵液を終濃度が２％（ｗ／ｗ）となるように添加した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
をそれぞれ用いて、１日間の評価培養を行った。
評価培養後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（ヒトI型コラーゲン）によりコラーゲン合成量を評価した。
これらのコラーゲン合成促進結果を、図３に示し、かかる比較例（ＤＷ）の結果に対する相対値（％）でコラーゲン合成促進結果を示す。
なお、精製水（ＤＷ）を用いた場合の図３中の結果は、コラーゲンが増加しない結果の数値である。
１）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
２）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製し、さらに上記（３）で調製したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液を終濃度が２％（ｗ／ｗ）となるように添加した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地、及び
３）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製し、さらに上記（３）で調製したＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ (Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１１２５)乳酸菌発酵液を終濃度が２％（ｗ／ｗ）となるように添加した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
をそれぞれ用いて、１日間の評価培養を行った。
評価培養後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（ヒトI型コラーゲン）によりコラーゲン合成量を評価した。
これらのコラーゲン合成促進結果を、図３に示し、かかる比較例（ＤＷ）の結果に対する相対値（％）でコラーゲン合成促進結果を示す。
なお、精製水（ＤＷ）を用いた場合の図３中の結果は、コラーゲンが増加しない結果の数値である。
【0058】
図３より、本発明の皮膚老化防止剤であるＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液は、Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ乳酸菌発酵液より、コラーゲン合成促進を有意に増加させたことがわかる。
【0059】
（６）コラーゲン合成試験（３）（ＥＤミネラル水+乳酸菌発酵液）
ＥＤミネラル水として、ＥＤミネラル水４０％のものを代表例として用い、乳酸菌発酵液として、上記（３）で調製したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液及びＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ発酵液を用いて、以下の試験を行った。
正常ヒト皮膚由来線維芽（ＮＨＤＦ、理研バイオリソース研究センター）細胞を２４穴マイクロプレートに１１５，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、前記（４）と同様に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間予備培養した。
ＥＤミネラル水として、ＥＤミネラル水４０％のものを代表例として用い、乳酸菌発酵液として、上記（３）で調製したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液及びＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ発酵液を用いて、以下の試験を行った。
正常ヒト皮膚由来線維芽（ＮＨＤＦ、理研バイオリソース研究センター）細胞を２４穴マイクロプレートに１１５，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、前記（４）と同様に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間予備培養した。
【0060】
前記予備培養後、
１）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）、
２）上記（４）と同様に４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水で調製した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地、
３）上記（４）と同様に４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水で調製し、さらに上記（２）で調製したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液を終濃度が２％（ｗ／ｗ）となるように添加した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地、及び
４）上記（４）と同様に４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水で調製し、さらに上記（２）で調製したＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ (Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１１２５)乳酸菌発酵液を終濃度が２％（ｗ／ｗ）となるように添加した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
をそれぞれ用いて、１日間の評価培養を行った。
評価培養後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（ヒトI型コラーゲン）によりコラーゲン合成量を評価した。
これらのコラーゲン合成促進結果を、図４に示し、かかる比較例（ＤＷ）の結果に対する相対値（％）でのコラーゲン合成促進結果を示す。
なお、精製水（ＤＷ）を用いた場合の図４中の結果は、コラーゲンが増加しない結果の数値である。
１）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）、
２）上記（４）と同様に４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水で調製した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地、
３）上記（４）と同様に４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水で調製し、さらに上記（２）で調製したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液を終濃度が２％（ｗ／ｗ）となるように添加した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地、及び
４）上記（４）と同様に４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水で調製し、さらに上記（２）で調製したＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ (Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ１１１２５)乳酸菌発酵液を終濃度が２％（ｗ／ｗ）となるように添加した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
をそれぞれ用いて、１日間の評価培養を行った。
評価培養後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（ヒトI型コラーゲン）によりコラーゲン合成量を評価した。
これらのコラーゲン合成促進結果を、図４に示し、かかる比較例（ＤＷ）の結果に対する相対値（％）でのコラーゲン合成促進結果を示す。
なお、精製水（ＤＷ）を用いた場合の図４中の結果は、コラーゲンが増加しない結果の数値である。
【0061】
図４より、本発明の皮膚老化防止剤であるＥＤミネラル水＋ＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液のものは、ＥＤミネラル水＋Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ乳酸菌発酵液のものと比較して、コラーゲン合成促進を（ｎ＝３、ｐ＜０．０１）ほぼ同等以上に増加させたことがわかる。
なお、ＥＤミネラル水４０％のものに代えて、２０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、６０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、又は８０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水を用いた場合も、上記と同様の傾向の結果を示した。
なお、ＥＤミネラル水４０％のものに代えて、２０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、６０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、又は８０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水を用いた場合も、上記と同様の傾向の結果を示した。
【0062】
（７）プロテオグリカン分解抑制効果
ＥＤミネラル水として、ＥＤミネラル水４０％のものを代表例として用い、乳酸菌発酵液として、上記（３）で調製したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液及びＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ発酵液を用いて、以下の試験を行った。
正常ヒト皮膚由来線維芽（ＮＨＤＦ、理研バイオリソース研究センター）細胞を９６穴マイクロプレートに２０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、前記（４）と同様に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間予備培養した。
ＥＤミネラル水として、ＥＤミネラル水４０％のものを代表例として用い、乳酸菌発酵液として、上記（３）で調製したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液及びＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ発酵液を用いて、以下の試験を行った。
正常ヒト皮膚由来線維芽（ＮＨＤＦ、理研バイオリソース研究センター）細胞を９６穴マイクロプレートに２０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、前記（４）と同様に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間予備培養した。
【0063】
前記予備培養後、
１）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）、
２）上記（４）と同様に４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水で調製した０．５％（v／v）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地および、
３）上記（４）と同様に４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水で調製し、さらに（２）で調製した乳酸菌発酵液を終濃度が２％（ｖ／ｖ）となるように添加した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
をそれぞれ用いて、１日間の評価培養を行った。
１）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）、
２）上記（４）と同様に４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水で調製した０．５％（v／v）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地および、
３）上記（４）と同様に４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水で調製し、さらに（２）で調製した乳酸菌発酵液を終濃度が２％（ｖ／ｖ）となるように添加した０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
をそれぞれ用いて、１日間の評価培養を行った。
【0064】
前記評価培養後、各ウェルの培地成分を吸引除去し、ＰＢＳ (－)（日水製薬（株）社製）０．１ｍＬ／ウェルで１回洗浄した。ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ＆ ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（東洋紡（株）社製）を使用し、本キットの手順書に従ってＲＮＡの抽出と逆転写を行い、ｃＤＮＡ溶液を調製した。
具体的には、１ウェルあたりＬｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２４．８５μＬ、ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ ０．１５μＬを必要量調製して１ウェルに２５．０μＬを添加し、５分間、室温で静置した。その後に１ウェルあたりＳｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ４．７５μＬ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．２５μＬを必要量調製して１ウェルに５．０μＬ添加し、２分間、室温で静置した後、０．２ｍＬチューブに調製した細胞溶解液３０．０μＬを移した。１反応あたり５×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ４．０μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １２．０μＬを必要量調製して０．２ｍＬチューブに１６．０μＬずつ分注した後、細胞溶解液を４μＬ合わせて２０μＬとなるように各０．２ｍＬチューブに分注した。０．２ｍＬチューブをサーマルサイクラー（ＭｙＣｙｃｌｅｒ、ＢＩＯ－ＲＡＤ）にセットし、３７℃で１５分間、５０℃で５分間、９８℃で５分間の後、４℃まで冷却し、ｃＤＮＡ溶液を調製した。
具体的には、１ウェルあたりＬｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２４．８５μＬ、ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ ０．１５μＬを必要量調製して１ウェルに２５．０μＬを添加し、５分間、室温で静置した。その後に１ウェルあたりＳｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ４．７５μＬ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．２５μＬを必要量調製して１ウェルに５．０μＬ添加し、２分間、室温で静置した後、０．２ｍＬチューブに調製した細胞溶解液３０．０μＬを移した。１反応あたり５×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ４．０μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １２．０μＬを必要量調製して０．２ｍＬチューブに１６．０μＬずつ分注した後、細胞溶解液を４μＬ合わせて２０μＬとなるように各０．２ｍＬチューブに分注した。０．２ｍＬチューブをサーマルサイクラー（ＭｙＣｙｃｌｅｒ、ＢＩＯ－ＲＡＤ）にセットし、３７℃で１５分間、５０℃で５分間、９８℃で５分間の後、４℃まで冷却し、ｃＤＮＡ溶液を調製した。
【0065】
ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡績（株）社製）を使用し、当該キットの手順書に従って定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を行い、各遺伝子のｃＤＮＡ定量を行った。具体的には、1反応あたりＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ ５．０μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．３μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．３μＬ、５０×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ０．２μＬおよび滅菌水２．２μＬを必要量調製した後に０．１ｍＬチューブに８．０μＬずつ注し、１０倍希釈したｃＤＮＡ溶液を２．０μＬずつ添加した。チューブ間のばらつきを低減させるためにｔｒｉｐｌｉｃａｔｅとした。
【0066】
ＰＣＲ条件は、リアルタイムＰＣＲ装置（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９５℃で１分間加温の後、９５℃で３０秒間と６０℃で３０秒間のサイクルを４０サイクル行った。さらに、ＰＣＲ後に融解曲線解析を実施し、非特異的増幅がないことを確認した。
なお、解析した遺伝子および連鎖反応に用いたプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
なお、解析した遺伝子および連鎖反応に用いたプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
【0067】
グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）;
５‘－ＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣＴＴ－３‘
３‘－ＧＧＴＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＡＧＧＣＡＡＣ－５‘
５‘－ＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣＴＴ－３‘
３‘－ＧＧＴＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＡＧＧＣＡＡＣ－５‘
【0068】
ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ ｍｏｔｉｆ ５（ＡＤＡＭＴＳ５）；
５‘－ＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡ－３‘
３‘－ＧＡＣＡＣＣＡＣＡＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＣ－５’
５‘－ＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡ－３‘
３‘－ＧＡＣＡＣＣＡＣＡＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＣ－５’
【0069】
定量解析は、ＧＡＰＤＨの発現量に対するＡＤＡＭＴＳ５の発現量を算出した後、「精製水区の発現量／各試験区の発現量」とすることで、精製水区に対するプロテオグリカン分解抑制効果を相対的に評価した。
【0070】
その結果を図５に示す。
図５より、４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水を添加した場合は、精製水（ＤＷ）の場合と比べて、有意に（ｎ＝３、ｐ<０．０５）プロテオグリカン分解抑制作用が示されており、アグリカナーゼ合成遺伝子（ＡＤＡＭＴＳ-5）の発現を抑制したことがわかる。また４０％（ｖ／ｖ）ＥＤミネラル水に、上記（３）で得られたＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液を加えたものも（ｎ＝３、ｐ<０．０５）、従来のＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ乳酸菌発酵液を加えたものとほぼ同等の効果を保持することができた。したがって、皮膚の老化を抑制することが可能となる。
なお、ＥＤミネラル水４０％のものに代えて、２０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、６０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、又は８０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水を用いた場合も、上記と同様の傾向の結果を示した。
図５より、４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水を添加した場合は、精製水（ＤＷ）の場合と比べて、有意に（ｎ＝３、ｐ<０．０５）プロテオグリカン分解抑制作用が示されており、アグリカナーゼ合成遺伝子（ＡＤＡＭＴＳ-5）の発現を抑制したことがわかる。また４０％（ｖ／ｖ）ＥＤミネラル水に、上記（３）で得られたＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液を加えたものも（ｎ＝３、ｐ<０．０５）、従来のＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ乳酸菌発酵液を加えたものとほぼ同等の効果を保持することができた。したがって、皮膚の老化を抑制することが可能となる。
なお、ＥＤミネラル水４０％のものに代えて、２０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、６０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、又は８０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水を用いた場合も、上記と同様の傾向の結果を示した。
【0071】
（８）Ｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Iの発現促進効果
正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ、理研バイオリソース研究センター）を２４穴マイクロプレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に１１８，７５０ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、前記（４）と同様に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地（日水製薬(株)社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間予備培養した。
正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ、理研バイオリソース研究センター）を２４穴マイクロプレート（ＡＧＣテクノグラス社製）に１１８，７５０ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、前記（４）と同様に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地（日水製薬(株)社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間予備培養した。
【0072】
前記予備培養後、
１）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）、
２）上記（４）と同様に４０％ＥＤミネラル水で調製した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地、
３）上記（４）と同様に４０％ＥＤミネラル水で調製し、さらに前記（３）の方法に準じてＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅで調整した発酵液を１％（ｖ／ｖ）添加した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
４）上記（４）と同様に４０％ＥＤミネラル水で調製し、さらに前記（３）で調整したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液を１％（ｖ／ｖ）添加した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
をそれぞれ用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１日間の評価培養を行った。
１）上記（４）のＥＤミネラル水の代わりに精製水（ＤＷ）で調製した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）、
２）上記（４）と同様に４０％ＥＤミネラル水で調製した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地、
３）上記（４）と同様に４０％ＥＤミネラル水で調製し、さらに前記（３）の方法に準じてＴｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅで調整した発酵液を１％（ｖ／ｖ）添加した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
４）上記（４）と同様に４０％ＥＤミネラル水で調製し、さらに前記（３）で調整したＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液を１％（ｖ／ｖ）添加した０．５％ＦＢＳ含イーグルＭＥＭ培地
をそれぞれ用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１日間の評価培養を行った。
【0073】
前記評価培養後、各ウェルの培地成分を吸引除去し、マイクロピペットでリシスバッファー１．０ｍＬを添加し、数回ピペッティングして培養ＮＨＤＦを溶解した。ＮＨＤＦ溶解液全量を１．５ｍＬチューブに移し、クロロホルム０．２ｍＬを添加して１０秒間ボルテックスミキサーにより攪拌した。１２，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心後、上層（水相）５００μＬを回収し、新しい１．５ｍＬチューブに移した。等量（５００μＬ）の２－プロパノールを加えて転倒混和した後、１０分間、４℃で静置した。１２，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心後、上清を捨て、ゲル状のＲＮＡ沈殿物をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで２００μＬに溶解した。２０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と２００μＬの２－プロパノールを加えて混和した後、１０分間、４℃で静置した。１２，０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心後、ＲＮＡの沈殿物に２５０μＬの７５％エタノールを添加し、持ち込みのグアニジン塩の洗浄を行った。上清を完全に取り除いた後風乾して、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを５０μＬ加えてＲＮＡの沈殿物を完全に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
【0074】
ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ（東洋紡績）を使用し、本キットの手順書に従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、1反応あたり5×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ２．０μＬ、ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ０．５μＬおよびＰｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ ０．５μＬを必要量調製して０．２ｍＬチューブに３．０μＬずつ分注した後、ＲＮＡ溶液をＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒと合わせて７．０μＬとなるように各０．２ｍＬチューブに分注した。０．２ｍＬチューブをサーマルサイクラー（ＭｙＣｙｃｌｅｒ、ＢＩＯ－ＲＡＤ）にセットし、３７℃で１５分間、９８℃で５分間の後、４℃まで冷却し、ｃＤＮＡ溶液を調製した。
【0075】
ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡績）を使用し、当該キットの手順書に従って定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を行い、各遺伝子のｃＤＮＡ定量を行った。具体的には、1反応あたりＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ ５．０μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．３μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．３μＬ、５０×ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ０．２μＬおよび滅菌水２．２μＬを必要量調製した後に０．１ｍＬチューブに８．０μＬずつ分注し、１０倍希釈したｃＤＮＡ溶液を２．０μＬずつ添加した。チューブ間のばらつきを低減させるためにｔｒｉｐｌｉｃａｔｅとした。
【0076】
ＰＣＲ条件は、リアルタイムＰＣＲ装置（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９５℃で１分間加温の後、９５℃で３０秒間と６０℃で３０秒間のサイクルを４０サイクル行った。さらに、ＰＣＲ後に融解曲線解析を実施し、非特異的増幅がないことを確認した。
なお、解析した遺伝子および連鎖反応に用いたプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
なお、解析した遺伝子および連鎖反応に用いたプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
【0077】
グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）;
５‘－ＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣＴＴ－３‘
３‘－ＧＧＴＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＡＧＧＣＡＡＣ－５‘
５‘－ＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣＴＴ－３‘
３‘－ＧＧＴＴＡＴＧＣＴＧＧＴＴＴＡＧＧＣＡＡＣ－５‘
【0078】
Ｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ I；
５‘－ＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＡ－３‘
３‘－ＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＡ－３‘
５‘－ＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＡ－３‘
３‘－ＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＡ－３‘
【0079】
定量解析は、ＧＡＰＤＨの発現量に対するＧｌｕｃｕｒｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの発現量を算出した後、「各試験区の発現量／精製水区の発現量」とすることで、精製水区に対するＧｌｕｃｕｒｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Iの発現量を相対的に評価した。
【0080】
その結果を図６に示す。
図６より、精製水（ＤＷ）、４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水＋Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅの場合と比べて、ＥＤミネラル水＋Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）のものは、ヒアルロン酸等のグルコサミノグリカンの生合成に寄与する酵素であるＧｌｕｃｕｒｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Iの発現量を増大することができた。したがって、皮膚の老化を抑制することが可能となる。
なお、ＥＤミネラル水４０％のものに代えて、２０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、６０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、又は８０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水を用いた場合も、上記と同様の傾向の結果を示した。
図６より、精製水（ＤＷ）、４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、４０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水＋Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅの場合と比べて、ＥＤミネラル水＋Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰＡＫ１－１３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３０２１）のものは、ヒアルロン酸等のグルコサミノグリカンの生合成に寄与する酵素であるＧｌｕｃｕｒｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Iの発現量を増大することができた。したがって、皮膚の老化を抑制することが可能となる。
なお、ＥＤミネラル水４０％のものに代えて、２０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、６０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水、又は８０％（ｗ／ｗ）ＥＤミネラル水を用いた場合も、上記と同様の傾向の結果を示した。
【0081】
（９）過酸化水素に対する抗酸化効果
ヒトの腕内側部剥離角層に対する過酸化水素処理による角層タンパク質のカルボニル化（酸化）について、上記（３）で得られた乳酸菌発酵液の抗酸化（抗老化）作用を、以下に評価した。
具体的には、６０代の日本人男性の左前腕内側部を水道水と石鹸で洗浄した。
その後、セロテープ（登録商標、ニチバン製）を、洗浄した左前腕内側部の３か所に貼り付けした後に剥がして、当該左前内側部の角層を剥離した。
ヒトの腕内側部剥離角層に対する過酸化水素処理による角層タンパク質のカルボニル化（酸化）について、上記（３）で得られた乳酸菌発酵液の抗酸化（抗老化）作用を、以下に評価した。
具体的には、６０代の日本人男性の左前腕内側部を水道水と石鹸で洗浄した。
その後、セロテープ（登録商標、ニチバン製）を、洗浄した左前腕内側部の３か所に貼り付けした後に剥がして、当該左前内側部の角層を剥離した。
【0082】
剥離した角層が貼り付いているセロテープ（登録商標）を予め接着剤を塗抹したスライドガラスに貼り付けて、当該セロテープ（登録商標）が貼り付いたスライドガラスをキシレンに１晩浸漬した後、セロテープ（登録商標）のみを剥がし、角層をスライドガラスに転写した。この剥離角層をエタノール及び精製水で浸水した後、５０ｍＭ過酸化水素（和光純薬工業社製、特級）および５％ＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液または５％Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ乳酸菌発酵液となるように精製水で調製した溶液１００μLを剥離角層に滴下し、室温で２０分間静置した。
【0083】
その後、剥離角層を精製水で洗浄し、５０μＭのＦＴＣＺ（ＡｎａＳｐｅｃ,Ｉｎｃ）
（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－５－ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ）を含有するＭＥＳ緩衝溶液を滴下し、室温で１０分間静置して角層カルボニル化タンパク質を検出した。角層カルボニル化タンパク質は、蛍光画像を撮影し、ＩｍａｇｅＪを用いて一定面積当たりの蛍光強度を数値化して評価した。
なお、比較のために、５％乳酸菌発酵液の代わりに精製水（Ｂｌａｎｋ）を用いた場合も示す。
（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－５－ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ）を含有するＭＥＳ緩衝溶液を滴下し、室温で１０分間静置して角層カルボニル化タンパク質を検出した。角層カルボニル化タンパク質は、蛍光画像を撮影し、ＩｍａｇｅＪを用いて一定面積当たりの蛍光強度を数値化して評価した。
なお、比較のために、５％乳酸菌発酵液の代わりに精製水（Ｂｌａｎｋ）を用いた場合も示す。
【0084】
次いで、一定面積当たりの各試験区の蛍光強度を数値化した後、各試験区の蛍光強度／Ｂｌａｎｋの蛍光強度として抗酸化効果を産出した。なお、Ｂｌａｎｋの抗酸化効果を１００として相対値で示した。
その結果を図７に示す。
剥離角層に過酸化水素を接触させることで、角層の酸化（カルボニル化）が認められ、この角層の酸化に対して、Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅの乳酸菌発酵液には抑制効果はないが、ＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液には有意に高い抑制効果があることがわかる。
その結果を図７に示す。
剥離角層に過酸化水素を接触させることで、角層の酸化（カルボニル化）が認められ、この角層の酸化に対して、Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅの乳酸菌発酵液には抑制効果はないが、ＬＰＡＫ１－１３乳酸菌発酵液には有意に高い抑制効果があることがわかる。
【0085】
（１０）ＥＤミネラル水及び乳酸菌発酵液配合組成物による老化防止作用
４０％ＥＤミネラル水と上記（３）で得られた乳酸菌発酵液を配合した下記に示す配合の複数の化粧料を調製した。
４０％ＥＤミネラル水と上記（３）で得られた乳酸菌発酵液を配合した下記に示す配合の複数の化粧料を調製した。
【0086】
化粧水：
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ４０．０
乳酸菌発酵液 ０．１
グリセリン ５．０
エタノール １０．０
１，３ブチレングリコール ３．０
フェノキシエタノール ０．５
精製水 残余（全量が１００となるように配合）
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ４０．０
乳酸菌発酵液 ０．１
グリセリン ５．０
エタノール １０．０
１，３ブチレングリコール ３．０
フェノキシエタノール ０．５
精製水 残余（全量が１００となるように配合）
【0087】
クリーム１：
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ２０．０
乳酸菌発酵液 ０．１
ＰＯＥ（２０）セチルエーテル ２．０
親油型モノステアリン酸グリセリル ４．０
セタノール ２．０
パルミチン酸セチル ２．０
白色ワセリン ６．０
スクワラン ３０．０
トリ２エチルヘキサン酸グリセリル ８．０
グリセリン １５．０
防腐剤 ０．２
カルボマー ０．２
アルギニン ０．１
精製水 残余（全量が１００となるように配合）
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ２０．０
乳酸菌発酵液 ０．１
ＰＯＥ（２０）セチルエーテル ２．０
親油型モノステアリン酸グリセリル ４．０
セタノール ２．０
パルミチン酸セチル ２．０
白色ワセリン ６．０
スクワラン ３０．０
トリ２エチルヘキサン酸グリセリル ８．０
グリセリン １５．０
防腐剤 ０．２
カルボマー ０．２
アルギニン ０．１
精製水 残余（全量が１００となるように配合）
【0088】
クリーム２：
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ２０．０
乳酸菌発酵液 ０．１
ＰＯＥ（２０）ＰＯＰ（４）セチルエーテル １．０
ＰＯＥ（５０）硬化ヒマシ油 １．０
自己乳化型モノステアリン酸グリセリル １．０
ステアリン酸 ３．０
ベヘニルアルコール ３．０
マイクロクリスタリンワックス ３．０
スクワラン １３．０
エチルヘキサン酸セチル ７．０
ホホバ油 ５．０
ポリエチレングリコール１５００ ５．０
防腐剤 ０．２
キサンタンガム ０．１
１，３ブチレングリコール ４．０
グリセリン ２．０
精製水 残余（全量が１００となるように配合）
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ２０．０
乳酸菌発酵液 ０．１
ＰＯＥ（２０）ＰＯＰ（４）セチルエーテル １．０
ＰＯＥ（５０）硬化ヒマシ油 １．０
自己乳化型モノステアリン酸グリセリル １．０
ステアリン酸 ３．０
ベヘニルアルコール ３．０
マイクロクリスタリンワックス ３．０
スクワラン １３．０
エチルヘキサン酸セチル ７．０
ホホバ油 ５．０
ポリエチレングリコール１５００ ５．０
防腐剤 ０．２
キサンタンガム ０．１
１，３ブチレングリコール ４．０
グリセリン ２．０
精製水 残余（全量が１００となるように配合）
【0089】
乳液：
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ３０．０
乳酸菌発酵液 ０．５
トリ(カプリル酸／カプリン酸)グリセリル ５．０
シア脂 ２．０
トリエチルヘキサン酸グリセリル ２．０
トコフェロール ０．６
エチルヘキシルグリセリン ０．４
１，３ブチレングリコール ５．０
ペンチレングリコール ３．０
ジプロピレングリコール ２．０
グリセリン ２．０
水添リゾレシチン ０．５
(アクリル酸／アクリル酸アルキル(C10－30))
コポリマー ０．４
キサンタンガム ０．１
アルギニン ０．４
精製水 残余（全量が１００となるように配合）
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ３０．０
乳酸菌発酵液 ０．５
トリ(カプリル酸／カプリン酸)グリセリル ５．０
シア脂 ２．０
トリエチルヘキサン酸グリセリル ２．０
トコフェロール ０．６
エチルヘキシルグリセリン ０．４
１，３ブチレングリコール ５．０
ペンチレングリコール ３．０
ジプロピレングリコール ２．０
グリセリン ２．０
水添リゾレシチン ０．５
(アクリル酸／アクリル酸アルキル(C10－30))
コポリマー ０．４
キサンタンガム ０．１
アルギニン ０．４
精製水 残余（全量が１００となるように配合）
【0090】
美容液：
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ４０．０
乳酸菌発酵液 ０．５
カルボキシビニルポリマー（２％水溶液） １０．００
カルボキシエチルセルロース ３．００
グリセリン １０．００
トリエタノールアミン ０．１５
メチルパラベン ０．１０
クインシード液（１％水溶液） １０．００
ヒアルロン酸ナトリウム液（１％水溶液） ４．００
ピルビン酸 １．００
レブリン酸 １．００
Ｌ－アルギニン ２．００
精製水 残余（全量が１００．００となるように配合）
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ４０．０
乳酸菌発酵液 ０．５
カルボキシビニルポリマー（２％水溶液） １０．００
カルボキシエチルセルロース ３．００
グリセリン １０．００
トリエタノールアミン ０．１５
メチルパラベン ０．１０
クインシード液（１％水溶液） １０．００
ヒアルロン酸ナトリウム液（１％水溶液） ４．００
ピルビン酸 １．００
レブリン酸 １．００
Ｌ－アルギニン ２．００
精製水 残余（全量が１００．００となるように配合）
【0091】
パック：
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ２０．０
乳酸菌発酵液 ０．１
ドロキシエトキシセルロース ３．０
カルボキシビニルポリマー（２％水溶液） １０．０
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（１５ＥＯ） １．０
グリオキシル酸 １．０
レブリン酸 １．０
Ｌ－アルギニン ２．０
エタノール ５．０
防腐剤 ０．２
精製水 残余（全量が１００．０となるように配合）
成分 配合量（質量％）
ＥＤミネラル水 ２０．０
乳酸菌発酵液 ０．１
ドロキシエトキシセルロース ３．０
カルボキシビニルポリマー（２％水溶液） １０．０
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（１５ＥＯ） １．０
グリオキシル酸 １．０
レブリン酸 １．０
Ｌ－アルギニン ２．０
エタノール ５．０
防腐剤 ０．２
精製水 残余（全量が１００．０となるように配合）
【0092】
健常な日本人女性１７名に、調製した上記各化粧料を、化粧料ごとに、それぞれ顔の半分だけ８週間連続して、１日３回（朝・昼・夜）塗布した。
化粧水、クリーム、乳液、美容液の塗布は、それぞれ目頭から目じりまで２往復、さらに目頭からこめかみまで２往復の塗布を１日３回おこなって、トントンと軽く皮膚をたたくようになじませて塗布した。パックについても、目頭から目じりまでを被うようにした。
塗布前（Ｗ０）、４週間使用後（Ｗ４）および８週間使用後（Ｗ８）に、シワ改善効果、クマ改善効果、クスミ改善効果の各項目を評価し、化粧料無塗布側との比較を行った。
化粧水、クリーム、乳液、美容液の塗布は、それぞれ目頭から目じりまで２往復、さらに目頭からこめかみまで２往復の塗布を１日３回おこなって、トントンと軽く皮膚をたたくようになじませて塗布した。パックについても、目頭から目じりまでを被うようにした。
塗布前（Ｗ０）、４週間使用後（Ｗ４）および８週間使用後（Ｗ８）に、シワ改善効果、クマ改善効果、クスミ改善効果の各項目を評価し、化粧料無塗布側との比較を行った。
【0093】
【0094】
なお、図８のシワ改善効果は抗シワ製品評価ガイドライン（日本香粧品学会）に従い、各測定ポイントでシワグレード標準写真に基づき、目視による判定スコア付けをした。
また、図９のクマ改善効果はメグザメーター（製品番号：ＭＸ１８、製造会社：Ｃｏｕｒａｇｅ及びＫｈａｚａｋａ社）を用いてメラミン値及びヘモグラビン値の変化量を、図１０のクスミ改善効果は色差計（製品番号：ＣＲ－４００、コニカミノルタジャパン（株）製）を用いてＬ値の評価を行った。
また、図９のクマ改善効果はメグザメーター（製品番号：ＭＸ１８、製造会社：Ｃｏｕｒａｇｅ及びＫｈａｚａｋａ社）を用いてメラミン値及びヘモグラビン値の変化量を、図１０のクスミ改善効果は色差計（製品番号：ＣＲ－４００、コニカミノルタジャパン（株）製）を用いてＬ値の評価を行った。
【0095】
本発明の皮膚改善防止剤を含有する化粧料を連用塗布した結果、図８より、塗布後４週間目から有意（ｐ＜０．０１）なシワ改善効果が得られ、図９より、塗布後４週間目から有意（ｐ＜０．０５）なクマ改善効果が得られ、図１０より、塗布後４週間目から有意（ｐ＜０．０５）に明度が上昇し、クスミ改善効果が得られたことがわかる。
なお、クリーム（クレーム１、クリーム２）、乳液、美容液、パックについても、化粧水の図８～図１０と同様の結果を示した。
なお、クリーム（クレーム１、クリーム２）、乳液、美容液、パックについても、化粧水の図８～図１０と同様の結果を示した。
【産業上の利用可能性】
【0096】
本発明の皮膚老化防止剤は、真皮マトリックス成分のコラーゲン産生促進作用を有しているばかりではなく、プロテオグリカンの分解を抑制することから、シワ、クスミ、クマ等の皮膚の老化を防止することができ、化粧料に配合して適用することが可能となる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】