特許 7619810 インビボ翻訳後修飾のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-14

(45)【発行日】2025-01-22

(54)【発明の名称】インビボ翻訳後修飾のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20250115BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20250115BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250115BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250115BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250115BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20250115BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250115BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20250115BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250115BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20250115BHJP

   A61K 38/45 20060101ALI20250115BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20250115BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20250115BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20250115BHJP

   C07K 14/73 20060101ALN20250115BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

C12N15/54 ZNA

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

A61K39/00 Z

A61K39/395

A61K39/395 Z

A61P31/00

A61P43/00 111

A61K31/7088

A61K38/45

C12N9/10

C07K19/00

C07K16/00

C07K14/73

【請求項の数】 21

(21)【出願番号】P 2020568742

(86)(22)【出願日】2019-06-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-10-11

(86)【国際出願番号】 US2019036470

(87)【国際公開番号】W WO2019241193

(87)【国際公開日】2019-12-19

【審査請求日】2022-06-10

(31)【優先権主張番号】62/683,344

(32)【優先日】2018-06-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516142001

【氏名又は名称】ザ ウィスター インスティテュート オブ アナトミー アンド バイオロジー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100134784

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和美

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド ウェイナー

(72)【発明者】

【氏名】ミーガン ワイズ

(72)【発明者】

【氏名】ツーヤン シュイ

【審査官】横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１１８８１５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００３／０１７０８４９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０３４０４０５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００９／００６９２５６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】MABS，2016年，vol. 8, no. 4，p.761-774

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＧｅｎｅＣａｒｄｓ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象において合成タンパク質を翻訳後修飾するためのワクチンであって、
（ａ）前記合成タンパク質をコードする第１の組換え核酸配列、ここで、前記合成タンパク質は配列番号１又は３の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）修飾タンパク質をコードする第２の組換え核酸配列、ここで、前記修飾タンパク質が、配列番号５又は７の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ２（ＴＰＳＴ２）である、
を含む、ワクチン。

【請求項2】

前記翻訳後修飾が、硫酸化、アセチル化、Ｎ結合グリコシル化、ミリストイル化、パルミトイル化、ＳＵＭＯ化、ヒドロキシル化、メチル化、Ｏ結合グリコシル化、ユビキチル化、酸化、およびパルミトイル化からなる群から選択される、請求項１に記載のワクチン。

【請求項3】

前記翻訳後修飾が、硫酸化である、請求項２に記載のワクチン。

【請求項4】

ＴＰＳＴ２が、ＩｇＥリーダーを含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項5】

前記第２の組換え核酸配列が、配列番号６または８の配列に少なくとも９０％同一である核酸配列を含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項6】

前記合成タンパク質が、抗原、抗体、またはイムノアドヘシンである、請求項１に記載のワクチン。

【請求項7】

前記イムノアドヘシンが、ｅＣＤ４－Ｉｇである、請求項６に記載のワクチン。

【請求項8】

前記第１の組換え核酸配列が、配列番号２または４に少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項9】

前記翻訳後修飾が、硫酸化であり、前記修飾タンパク質が、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ２（ＴＰＳＴ２）であり、前記合成タンパク質が、ｅＣＤ４－Ｉｇであり、ｅＣＤ４－Ｉｇが、前記対象において硫酸化される、請求項１に記載のワクチン。

【請求項10】

対象における合成タンパク質を翻訳後修飾するための組成物であって、
（ａ）前記合成タンパク質をコードする第１の組換え核酸配列、ここで、前記合成タンパク質は配列番号１又は３の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）修飾タンパク質をコードする第２の組換え核酸配列、ここで、修飾タンパク質が前記対象における合成タンパク質を翻訳後に修飾し、前記修飾タンパク質が配列番号５又は７の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ２（ＴＰＳＴ２）である、
を含む、組成物。

【請求項11】

前記修飾タンパク質が、前記合成タンパク質上の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を触媒し、前記ＰＴＭが、硫酸化、アセチル化、Ｎ結合グリコシル化、ミリストイル化、パルミトイル化、ＳＵＭＯ化、ヒドロキシル化、メチル化、Ｏ結合グリコシル化、ユビキチル化、酸化、およびパルミトイル化からなる群から選択される翻訳後修飾からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

ＰＴＭが、硫酸化である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

ＴＰＳＴ２が、ＩｇＥリーダーを含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項14】

前記第２の組換え核酸配列が、配列番号６または８の配列に少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項15】

前記合成タンパク質が、抗原、抗体またはイムノアドヘシンである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項16】

前記イムノアドヘシンが、ｅＣＤ４－Ｉｇである、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記第１の組換え核酸配列が、配列番号２または４に少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項18】

前記１つ以上の核酸分子が、発現ベクター内にあるように操作される、請求項１０～１５及び１７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項19】

薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症を治療するための、請求項１１～１５及び１７～１９のいずれか１項に記載の組成物であって、前記組成物が前記対象に投与される、組成物。

【請求項21】

前記組成物を投与することが、エレクトロポレーションステップを含む、請求項２０に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年６月１１日に出願された米国仮出願第６２／６８３，３４４号に対する優先権の権利があり、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

多くのタンパク質の活性は、翻訳後修飾によって改善され得る。翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、タンパク質への異なる官能基の共有結合をもたらす化学変化である。これらの修飾は、当該タンパク質を特定の細胞経路に特異的に標的化する、全体的な機能および効力を改善する、安定性もしくは半減期を変化させる、または折り畳みおよび他のタンパク質相互作用の違いをもたらすことができる。異なる標的タンパク質をコードする能力は、ＤＮＡプラスミドを使用して十分に確立されている。しかしながら、これらのＤＮＡコードされたタンパク質をさらに改善することが必然的に必要とされている。翻訳後修飾を行うことができる異なる酵素をコードすることによって、標的タンパク質を修飾することができ、したがって全体的な所望の転帰を改善する。この追加の調節ステップは、コードされたタンパク質の特異的な調整を可能にし、ワクチンならびに他のＤＮＡコードされたタンパク質の両方に使用することができる。

【0003】

現在、医薬品として使用される生物製剤（抗体、エリスロポエチン、凝固因子）は、哺乳動物細胞株（ＣＨＯ）においてしばしば産生され、ＰＴＭの位置および程度の点で不均一性を示し、そのうちのいくつかは、生物製剤の機能を低下させる可能性がある（Ｈａｒｒｉｓ、２００５）。したがって、高度なＤＮＡ／エレクトロポレーション（ＥＰ）技術を使用して、これらの複雑な生物学的分子のインビボ送達および修飾を容易にするための単純なアプローチを有することが大きな利点となるであろう。

【発明の概要】

【0004】

本発明は、対象において合成タンパク質を翻訳後修飾する方法を提供する。一実施形態では、方法は、合成タンパク質をコードする第１の組換え核酸配列と、修飾タンパク質をコードする第２の組換え核酸配列とを含む組成物を対象に投与することを含み、修飾タンパク質は、対象において合成生物製剤を翻訳後修飾する。

【0005】

一実施形態では、翻訳後修飾は、硫酸化、アセチル化、Ｎ結合グリコシル化、ミリストイル化、パルミトイル化、ＳＵＭＯ化、ヒドロキシル化、メチル化、Ｏ結合グリコシル化、ユビキチル化、酸化、およびパルミトイル化からなる群から選択される。

【0006】

一実施形態では、翻訳後修飾は、硫酸化であり、修飾タンパク質は、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ１（ＴＰＳＴ１）およびＴＰＳＴ２からなる群から選択される。

【0007】

一実施形態において、修飾タンパク質は、ＴＰＳＴ２である。一実施形態において、ＴＰＳＴ２は、ＩｇＥリーダーを含む。一実施形態では、ＴＰＳＴ２は、配列番号５または７に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号６または８に少なくとも９０％相同な配列を含む。

【0008】

一実施形態では、合成タンパク質は、抗原、抗体またはイムノアドヘシンである。一実施形態では、イムノアドヘシンは、ｅＣＤ４－Ｉｇである。一実施形態では、ｅＣＤ４－Ｉｇは、配列番号１または３に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第１の組換え核酸配列は、配列番号２または４に少なくとも９０％相同な配列を含む。

【0009】

一実施形態では、翻訳後修飾は、硫酸化であり、修飾タンパク質は、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ１（ＴＰＳＴ２）であり、合成タンパク質は、ｅＣＤ４－Ｉｇであり、ｅＣＤ４－Ｉｇは、対象において硫酸化される。

【0010】

本発明はまた、対象における合成タンパク質を翻訳後修飾するための組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、合成タンパク質をコードする第１の組換え核酸配列と、修飾タンパク質をコードする第２の組換え核酸配列とを含む。

【0011】

一実施形態では、修飾タンパク質は、合成タンパク質上の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を触媒し、ＰＴＭは、硫酸化、アセチル化、Ｎ結合グリコシル化、ミリストイル化、パルミトイル化、ＳＵＭＯ化、ヒドロキシル化、メチル化、Ｏ結合グリコシル化、ユビキチル化、酸化、およびパルミトイル化からなる群から選択される翻訳後修飾からなる群から選択される。

【0012】

一実施形態では、翻訳後修飾は、硫酸化であり、修飾タンパク質は、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ１（ＴＰＳＴ１）およびＴＰＳＴ２からなる群から選択される。

【0013】

一実施形態では、修飾タンパク質は、ＴＰＳＴ２である。一実施形態では、ＴＰＳＴ２は、ＩｇＥリーダーを含む。一実施形態では、ＴＰＳＴ２は、配列番号５または７に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号６または８に少なくとも９０％相同な配列を含む。

【0014】

一実施形態では、合成タンパク質は、抗原、抗体またはイムノアドヘシンである。一実施形態では、イムノアドヘシンは、ｅＣＤ４－Ｉｇである。一実施形態では、ｅＣＤ４－Ｉｇは、配列番号１または３に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第１の組換え核酸配列は、配列番号２または４に少なくとも９０％相同な配列を含む。

【0015】

一実施形態では、１つ以上の核酸分子は、発現ベクター内にあるように操作される。一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。

【0016】

一実施形態では、本発明は、疾患、障害または感染を治療することを必要とする対象においてそれを行うための方法を提供する。一実施形態では、方法は、本発明の組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、方法は、エレクトロポレーションステップを含む。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1A-F】図１Ａ－図１Ｆを含み、ＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビトロ発現および硫酸化を示す図である。図１Ａは、総タンパク質濃度に正規化されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション溶解物中のＲｅＣＤ４－Ｉｇの発現を示す。図１Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション上清におけるＲｅＣＤ４－Ｉｇの発現を示す。図１Ｃは、ｐ－ＲｅＣＤ４－ＩｇまたはｐＶＡＸ（プラスミド骨格ベクター）のいずれかでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清のウェスタンブロットを示す。図１Ｄは、トランスフェクション上清中のＲｅＣＤ４－Ｉｇのチロシン硫酸化を検出するための結合ＥＬＩＳＡを示す。図１Ｅは、ｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇおよび様々な用量のｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清中のＲｅＣＤ４－Ｉｇの定量化を示す。酵素群を有さない各群間のレベルを比較するために対Ｔ検定を使用し、１：２０ ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２群において有意な低下（ｐ＜０．０５）が検出された。図１Ｆは、ｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独またはｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇおよび１：１０００プラスミド酵素のいずれかでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清のウェスタンブロットを示す。下部パネルは、トランスフェクション上清中の同じ量のＲｅＣＤ４－Ｉｇを実証するための負荷対照である。

【図2A-C】図２Ａ－図２Ｃを含み、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の細胞下標的化を示す実験結果を示す図である。図２Ａは、ＴＰＳＴ２バリアント（赤色）とゴルジン９７（緑色）との間の局在化を決定するための共焦点顕微鏡法を示す。核は、ＤＡＰＩ（青色）で染色される。ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２は、ＴＰＳＴ２と比較してＴＧＮへの増加したトラフィックを示す。ΔＴＭ－ＴＰＳＴ２の拡散した細胞質分布は、最後のパネルで観察され得る。図２Ｂは、ＴＰＳＴ２バリアントとゴルジン９７との間の局在化が関心領域分析で定量化されたことを示す（ｎ＝１６）。一元配置分散分析（Ｆ－統計値＝７９．６７、ｐ値＜０．０００１）および事後対Ｔ検定（Ｈｏｌｍの調整による）を使用して、異なる群間のピアソン相関係数を比較した。Ｐ値は、示される通りである。図２Ｃは、ｐＧＸ００００１骨格プラスミド単独でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはプラスミドにコードされた酵素でトランスフェクトされたｐＧＸ００００１の蛍光顕微鏡画像を示す。３つのチャネルのオーバーレイは、ＴＰＳＴ２およびΔＴＭ－ＴＰＳＴ２と比較して、ＴＧＮへのＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の強化されたトラフィックを示す。

【図3A-F】図３Ａ－図３Ｆを含み、ＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビボ発現および硫酸化を示す図である。図３Ａは、筋肉ホモジネート７ｄ．ｐ．ｉのウェスタンブロットを示し、対側脚と比較した注射された脚におけるＩｇＥ－ＴＰＳＴ２（４３ｋＤａ）の発現を示す。ＧＡＰＤＨ（３７ｋＤａ）は、負荷対照の役割を果たす。図３Ｂは、単回用量のＤＮＡを注射した一時的に免疫調節されたＢ６．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｊおよびｂａｌｂ／ｃにおけるＲｅＣＤ４－Ｉｇの血清発現を示す。図３Ｃは、マウス血清中のＲｅＣＤ４－Ｉｇチロシン硫酸化を決定するための結合ＥＬＩＳＡを示す。一時的に枯渇したｂａｌｂ／ｃマウスに、ｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇおよび様々な用量のｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２を注射し、分析のために血清７ｄ．ｐ．ｉを収集した。各群のＯＤ４５０を、無酵素および１：２０ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２群と比較して、硫酸化に必要なＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の最小用量を決定した。図３Ｄは、ｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇおよび様々なプラスミド酵素用量７ｄ．ｐ．ｉで共処理したマウスにおけるＲｅＣＤ４－Ｉｇの血清発現レベルを示す。ｐ値は、対Ｔ検定で計算した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊＊ｐ＜０．００００５、＊＊＊＊＊ｐ＜０．０００００５。図３Ｅは、ｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇまたはｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇのいずれかおよび１：１０００用量のｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２で処理した一時的に枯渇したｂａｌｂ／ｃ中の異なる時点におけるＲｅＣＤ４－Ｉｇの血清発現レベルを示す。各線は、個々のマウスを表す。図３Ｆは、ｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独またはｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇ＋ｐ－ＴＰＳＴ１／ｐ－ＨＳ３ＳＡを注射した一時的に枯渇したｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＲｅＣＤ４－Ｉｇ７ｄ．ｐ．ｉの血清濃度を示す。ＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独群と比較した場合、両群において発現レベルの有意な低下（ｐ＜０．０５、Ｈｏｌｍ調整を伴う対Ｔ検定）が観察された。＊、ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．００５。

【図4A-F】図４Ａ－図４Ｆを含み、ＲｅＣＤ４－ＩｇのＩｇＥ－ＴＰＳＴ２媒介性硫酸化の機能的特徴付けを示す。図４Ａは、ｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独またはｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇ＋ｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２を注射した一時的に枯渇したｂａｌｂ／ｃマウスにおける末端出血時のＲｅＣＤ４－Ｉｇの血清濃度（７ｄ．ｐ．ｉ）を示す。図４Ｂは、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの２５７１０偽型ウイルス対血清濃度の中和を示す実験結果を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。図４Ｃは、ＨＩＶ偽型ウイルスに対する硫酸化を伴う、または伴わないＲｅＣＤ４－ＩｇＩＣ５０の比較を示す。図４Ｄは、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２処置を伴う、または伴わないマウスの血清中のＲｅＣＤ４－ＩｇのＩＣ５０値（平均±標準偏差）を示す。比較のために、パネル全体のＩＣ５０の幾何平均（ＭＬＶを除く）も示されている。図４Ｅおよび図４Ｆは、エクスビボ中和アッセイにおける硫酸化を伴う、または伴わないＲｅＣＤ４－ＩｇのＩＣ５０値を示す。各ドットは、単一のマウスから計算されたＩＣ５０値を表し、各ウイルスのｐ値は、複数の比較のためのＨｏｌｍ調整を伴う対Ｔ検定で計算される。０．０５未満のｐ値は有意であるとみなされる。図４Ｅは、硫酸化ＲｅＣＤ４－Ｉｇが有意に強化された効力を有するウイルスのＩＣ５０値を示す。図４Ｆは、硫酸化ＲｅＣＤ４－Ｉｇの効力が有意に高くないＩＣ５０値を示す。

【図5A-D】図５Ａ－図５Ｄを含み、ヒト胎児胸腺インプラントの移植および一連のＤＮＡコードサイトカインの投与を介してヒト免疫系で再構成されたＮＳＧ ＳＣＩＤマウスの代替モデルにおけるイムノアドヘシンの発現の実験結果を示す図である。図５Ａは、様々な時点からの血清を使用したＪＲ－ＦＬ ＧＰ１２０へのＥＬＩＳＡ結合によって実証されるように、３２０μｇのＤＮＡコードＲｅＣＤ４－Ｉｇと０．３２μｇのｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２を受けたこれらのヒト化マウスにおけるＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビボ発現を示す。図５Ｂは、注射後３５日間にわたる各個々のマウスにおけるＲｅＣＤ４－Ｉｇの血清濃度を示し（ｄ．ｐ．ｉ）、ピーク発現は１４ｄ．ｐ．ｉで観察され、各線は個々のマウスを表す。図５Ｃは、ＤＮＡ処理前（青色）およびＤＮＡ処理後（赤色）のマウス血清によるＴｉｅｒ １ ＳＦ１６２偽ウイルスのエクスビボ中和を示す。図５Ｄは、ＩＣ５０中和力価に関して、マウスのＤ７血清によるＴｉｅｒ １ウイルスＳＦ１６２、ならびにＴｉｅｒ ２ウイルスＴＨＲＯおよびＪＲ－ＦＬの中和を示し、各マウスは、個々のマウスを表し、力価の平均および標準偏差も示されている。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は、インビボで直接産生するための標的タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）用の酵素をコードするための核酸配列の使用に部分的に基づく。一実施形態では、本発明は、対象において合成タンパク質を翻訳後修飾するための組成物および方法に関する。一態様では、本発明は、合成タンパク質をコードする第１の組換え核酸配列と、修飾タンパク質をコードする第２の組換え核酸配列とを含む組成物を提供する。

【0019】

組成物は、合成タンパク質のインビボ発現、形成、および翻訳後修飾を容易にするために、それを必要とする対象に投与され得る。

【0020】

特に、組換え核酸配列からの合成タンパク質および修飾タンパク質が発現され、修飾タンパク質は、合成タンパク質を翻訳後修飾する。翻訳後修飾合成タンパク質は、本明細書に記載されるように発現および修飾されていないタンパク質と比較して増加した生物学的活性を有する。

【0021】

一実施形態では、修飾タンパク質は、合成タンパク質上の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を触媒し、ＰＴＭは、硫酸化、アセチル化、シアリル化およびフコシル化／脱フコシル化を含むＮ結合グリコシル化、ミリストイル化、パルミトイル化、ＳＵＭＯ化、ヒドロキシル化、メチル化、Ｏ結合グリコシル化、ユビキチル化、酸化、アミド化、ならびにパルミトイル化からなる群から選択される翻訳後修飾からなる群から選択される。ＰＴＭの例としては、表１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0022】

【表1】

【0023】

一態様では、本発明は、操作された合成タンパク質（例えば、合成核酸プラスミドの形態の合成タンパク質および修飾タンパク質）を投与することによって疾患または障害を治療するために使用することができる組成物に関する。

【0024】

一態様では、本発明は、合成ｅＣＤ４－Ｉｇをコードする第１の組換え核酸配列、および合成チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ）をコードする第２の組換え核酸配列を含む組成物に関する。一実施形態では、ＴＰＳＴは、ＴＰＳＴ１またはＴＰＳＴ２である。一実施形態では、ＴＰＳＴは、ＴＰＳＴ２である。一実施形態において、ＴＰＳＴは、ＩｇＥリーダーを含む。組成物は、ｅＣＤ４－Ｉｇのインビボ発現、形成および硫酸化を容易にするために、それを必要とする対象に投与され得る。

【0025】

一実施形態では、合成ｅＣＤ４－Ｉｇをコードする第１の組換え核酸配列は、配列番号１もしくは３、またはその断片に少なくとも９０％相同な配列をコードする。一実施形態では、第１の組換え核酸配列は、配列番号２もしくは４、またはその断片に少なくとも９０％相同な配列を含む。

【0026】

一実施形態では、ＴＰＳＴ２をコードする第２の組換え核酸配列は、配列番号５もしくは７、またはその断片に少なくとも９０％相同な配列をコードする。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号６もしくは８、またはその断片に少なくとも９０％相同な配列を含む。

【0027】

一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号５もしくは７、またはその断片に少なくとも９０％相同なポリペプチド配列をコードする配列を含む。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、本明細書に記載されるＤＮＡ配列から転写されるＲＮＡ配列を含む。例えば、一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号５もしくは７、またはその断片に少なくとも９０％相同なポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列によって転写されるＲＮＡ配列を含む。

【0028】

一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号５または７に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号５または７に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列の断片をコードする。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号６もしくは８、またはその断片に少なくとも９０％相同な配列を含む。

【0029】

本明細書に提供される組成物はまた、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。

【0030】

本発明の態様はまた、本明細書で提供される組成物のいずれかを対象に投与することによって、疾患、障害または感染症を治療することを必要とする対象においてそれらを行う方法を含む。一実施形態では、感染症は、ＨＩＶ感染症である。免疫応答を増加させる方法はまた、エレクトロポレーションステップを含むことができる。

【0031】

１．定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先するであろう。本発明の実施または試験において本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を使用することができるが、例示的な方法および材料が本明細書に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、例示的のみであり、限定的であることを意図しない。

【0032】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有すること」、「有する」、「できる」、「含有する」という用語およびそれらの変形は、本明細書で使用される場合、追加の行為または構造の可能性を妨げない、オープンエンドな移行句、用語、または語であることを意図する。「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈が別段に明示しない限り、複数の参照物を含む。本開示はまた、明示的に記載されるか否かにかかわらず、本明細書で提示される実施形態または要素「を含む」、「からなる」、および「から本質的になる」他の実施形態を企図する。

【0033】

「抗体」とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、または断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む、その断片もしくは誘導体、ならびに一本鎖抗体、およびそれらの誘導体を意味し得る。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはそれらの混合物であり得、これは、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示す。

【0034】

「抗原」とは、宿主において免疫応答を生成する能力を有するタンパク質を指す。抗原は、抗体によって認識され、結合され得る。抗原は、体内から、または外部環境が起源であり得る。

【0035】

「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７）を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分に３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）がある。したがって、本明細書で使用される「ＣＤＲ」は、３つ全ての重鎖ＣＤＲ、または３つ全ての軽鎖ＣＤＲ（または適切な場合、全ての重鎖ＣＤＲおよび全ての軽鎖ＣＤＲの両方）を指す。抗体の構造およびタンパク質折り畳みは、他の残基が抗原結合領域の一部と見なされ、当業者によってそうであると理解されることを意味し得る。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ；Ｎａｔｕｒｅ ３４２，ｐ８７７－８８３を参照されたい。

【0036】

本明細書で互換的に使用される「抗体断片」または「抗体の断片」とは、抗原結合部位または可変領域を含む無傷の抗体の一部分を指す。部分は、無傷の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）を含まない。抗体断片の例は、これらに限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つの軽鎖可変ドメインのみを含む一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含む一本鎖ポリペプチド、１つの重鎖可変領域のみを含む一本鎖ポリペプチド、および重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む一本鎖ポリペプチドを含む。

【0037】

本明細書で使用される「アジュバント」とは、抗原の免疫原性を増強するために本明細書に記載のワクチンに添加される任意の分子を意味する。

【0038】

本明細書で使用される「コード配列」または「コード核酸」とは、本明細書に示されるように、抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を指し得る。コード配列はまた、ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含み得る。コード配列は、プロモーターを含む制御エレメントに作動可能に連結した開始および終結シグナル、ならびに核酸を投与される個体または哺乳動物の細胞における発現を誘導することができるポリアデニル化シグナルをさらに含み得る。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。

【0039】

本明細書で使用される「補体」または「相補的」とは、核酸が核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を有し得ることを意味し得る。

【0040】

本明細書で使用される「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、特定の抗原の複数のサブタイプの複数の配列のアラインメントの分析に基づくポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列を調製することができる。コンセンサス配列および／またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を含むタンパク質を含むワクチンまたは免疫学的組成物は、特定の抗原の複数のサブタイプまたは血清型に対して広範な免疫性を誘導するために使用され得る。

【0041】

本明細書で使用される「定電流」とは、組織、または当該組織を画定する細胞が、電気パルスが同組織に送達される期間にわたって受けるか、または経験する電流を定義する。電気パルスは、本明細書に記載されるエレクトロポレーションデバイスから送達される。本明細書で提供されるエレクトロポレーションデバイスは、好ましくは、即時フィードバックを有する、フィードバックエレメントを有するので、この電流は、電気パルスの寿命にわたって当該組織において定アンペア数に留まる。フィードバックエレメントは、パルスの持続期間を通して組織（または細胞）の抵抗を測定し、エレクトロポレーションデバイスにその電気エネルギー出力を変更させる（例えば、電圧を増加させる）ことができ、したがって同じ組織における電流は、電気パルス（マイクロ秒台）を通して、およびパルス間で一定のままである。いくつかの実施形態では、フィードバックエレメントは、コントローラを含む。

【0042】

本明細書で使用される「電流フィードバック」または「フィードバック」とは、互換的に使用され得、提供されたエレクトロポレーションデバイスの活性応答を意味し得、これは、電流を一定のレベルで維持するために、電極間の組織における電流を測定し、適宜にＥＰデバイスによって送達されるエネルギー出力を変更することを含む。この一定のレベルは、パルス配列または電気処理の開始前にユーザによって予め設定される。その中の電気回路が、電極間の組織における電流を連続的に監視し、その監視された電流（または組織内の電流）を予め設定された電流と比較し、エネルギー出力調節を連続的に行って、監視される電流を予め設定されたレベルに維持することができるように、フィードバックは、エレクトロポレーションデバイスのエレクトロポレーションコンポーネント、例えば、コントローラによって達成され得る。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるので、即時であり得る。

【0043】

本明細書で使用される「分散電流」とは、本明細書に記載されるエレクトロポレーションデバイスの様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、パターンは、エレクトロポレートされる組織の任意の領域上でのエレクトロポレーション関連熱ストレスの発生を最小化するか、または好ましくは排除する。

【0044】

本明細書で互換的に使用される「エレクトロポレーション」、「電気透過化」、または「電気運動向上」（「ＥＰ」）とは、生体膜において微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電場パルスの使用を指し得、それらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水などの生体分子が細胞膜の一方の側から他方へと通過することを可能にする。

【0045】

本明細書で使用される「内因性抗体」とは、体液性免疫応答の誘導のために有効用量の抗原が投与される対象において生み出された抗体を指し得る。

【0046】

本明細書で使用される「フィードバックメカニズム」とは、ソフトウェアまたはハードウェア（もしくはファームウェア）のいずれかによって行われるプロセスを指し得、そのプロセスは、（エネルギーのパルスの送達の前、その間、および／またはその後）所望の組織のインピーダンスを受け、現在値、好ましくは電流と比較し、予め設定された値を達成するために送達されるエネルギーのパルスを調節する。フィードバックメカニズムは、アナログ閉ループ回路によって行われ得る。

【0047】

本明細書で使用される「断片」または「免疫原性断片」は、核酸配列またはアミノ酸配列を意味する。一実施形態では、断片は、抗体または抗原などのタンパク質の断片をコードする核酸配列である。断片は、その生物学的活性を保持するタンパク質、抗体、または抗原の断片であってもよい。「断片」または「免疫原性断片」はまた、核酸分子の断片を意味し得る。断片は、タンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列のＤＮＡ断片であってもよい。断片は、以下に記載されるタンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つと相同性を有するＤＮＡ配列のＤＮＡ断片であってもよい。タンパク質または核酸の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１つのアミノ酸／核酸が欠損している場合を除いて、完全長と１００％同一であってもよく、各場合において、１位にシグナルペプチドおよび／またはメチオニンが存在するかまたは存在しない。断片は、追加される任意の異種シグナルペプチドを除く、特定の完全長タンパク質または核酸の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含み得る。断片は、タンパク質または核酸と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一であるポリペプチドの断片を含み得、さらに、同一性パーセントを計算するときに含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドを含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、抗体の断片に連結され得る。

【0048】

核酸配列の断片は、５’末端および／または３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドを欠損していることを除いて、完全長と１００％同一であってもよい。核酸配列がタンパク質をコードする場合、核酸配列の断片は、各場合において、１位にシグナルペプチドおよび／またはメチオニンをコードする配列が存在してもよく、または存在しなくてもよい。断片は、追加される任意の異種シグナルペプチドを除く、特定の完全長コード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含み得る。断片は、抗体と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一であるポリペプチドをコードする断片を含み得、さらに、任意に、同一性パーセントを計算するときに含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に連結され得る。

【0049】

本明細書で使用される「遺伝子コンストラクト」は、抗体などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。遺伝子コンストラクトはまた、ＲＮＡを転写するＤＮＡ分子を指し得る。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞における発現を指示することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された開始および終結シグナルを含む。本明細書で使用される場合、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞に存在する場合、コード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結した必要な制御エレメントを含む遺伝子コンストラクトを指す。

【0050】

本明細書で使用される「相同性」という用語は、ある程度の相補性を指す。部分的相同性または完全相同性（すなわち同一性）が存在し得る。標的核酸にハイブリダイゼーションする完全相補配列を少なくとも部分的に阻害する部分相補配列は、機能的用語「実質的に相同な」を使用して言及される。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して使用される場合、本明細書で使用される「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の鎖にハイブリダイズすることができるプローブを指す。一本鎖核酸配列に関して使用される場合、本明細書で使用される「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸テンプレート配列にハイブリダイズすることができる（すなわちその相補体である）プローブを指す。

【0051】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される「同一」または「同一性」は、配列が特定された領域にわたって同じである残基の特定されたパーセントを有することを意味し得る。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、指定された領域で２つの配列を比較し、両方の配列で同一の残基が発生する位置の数を決定して、一致する位置の数を算出し、一致する位置の数を指定された領域内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算できる。２つの配列の長さが異なる場合、またはアラインメントによって１つ以上の千鳥末端が産生され、指定された比較領域に単一の配列のみが含まれる場合、単一の配列の残基は分母に含まれるが、計算の分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等とみなされる場合がある。同一性は、手動で実行することも、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用して実施することもできる。

【0052】

本明細書で使用される「インピーダンス」とは、フィードバックメカニズムを議論する場合に使用され得、オームの法則に従って電流値に変換することができ、したがって、予め設定された電流との比較を可能にする。

【0053】

本明細書で使用される「免疫応答」は、１つ以上の核酸および／またはペプチドの導入に応答した、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味し得る。免疫応答は、細胞性もしくは体液性応答、または両方の形態であり得る。

【0054】

本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸はまた、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントは、所与の核酸と同じ目的で使用することができる。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。

【0055】

核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖と一本鎖配列の両方の部分を含み得る。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、核酸は、デオキシリボ－およびリボ－ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得られ得る。

【0056】

本明細書で使用される「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現が、これによって空間的に接続される、プロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に配置され得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御するプロモーターと遺伝子との間の距離とおよそ同じであり得る。当該技術分野で知られているように、この距離における変動は、プロモーター機能の喪失なしに順応され得る。

【0057】

本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結配列を意味することができ、天然、合成、または天然および合成の修飾もしくは組み合わせであり得る。

【0058】

本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を与え、活性化し、または向上させることができる合成または天然由来分子を意味し得る。プロモーターは、その発現をさらに向上させるため、ならびに／または空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つ以上の特異的転写制御配列を含み得る。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対ほどに配置することができる、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、細胞、発現が起こる組織もしくは器官に対して、または発現が起こる発生段階に対して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、構成的にまたは差別的に遺伝子構成要素の発現を制御し得る。プロモーターの代表的な例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータ－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。

【0059】

「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載されるタンパク質のアミノ末端で連結することができるアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を誘導する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、それが産生される細胞からのタンパク質の分泌を容易にし得る。シグナルペプチド／リーダー配列は、多くの場合、タンパク質の残部から開裂され、多くの場合、細胞からの分泌後、成熟タンパク質と称される。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端で連結される。

【0060】

本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）に、核酸の複合体混合物のようにハイブリダイズするであろう平均条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況では異なるであろう。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨでの特定の配列についての熱融解点（Ｔ_ｍ）よりも約５～１０℃低くなるように選択され得る。Ｔ_ｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下）であり得る（標的配列が過剰に存在するので、Ｔ_ｍでは、プローブの５０％は平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０～８．３で約０．０１～１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）などの、約１．０Ｍナトリウムイオン未満であり、温度が、短いプローブ（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃および長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド超）について少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成され得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについて、正のシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２～１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下を含む：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で６５℃で洗浄。

【0061】

本明細書で使用される「対象」および「患者」は、これらに限定されないが、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザルなどのサル、チンパンジーなど）、ならびにヒト）を含む、任意の脊椎動物を互換的に指す。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の治療を受けていてもよい。

【0062】

本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の補体に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であること、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。

【0063】

本明細書で使用される「実質的に同一」とは、第１の配列が、第２の配列の補体に実質的に相補的である場合、第１および第２の配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、または核酸に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味し得る。

【0064】

本明細書で使用される「合成抗体」は、本明細書に記載される組換え核酸配列によってコードされ、かつ対象において生成される抗体を指す。

【0065】

本明細書で使用される「合成生物学的」は、本明細書に記載される組換え核酸配列によってコードされ、かつ対象において生成されるタンパク質、または対象に投与される組換え核酸配列を指す。

【0066】

本明細書で使用される「治療」または「治療すること」は、疾患を予防、抑制、抑圧、または完全に排除する手段を通した疾患からの対象の保護を意味し得る。疾患を予防することは、本発明のワクチンを、疾患の発症前に対象に投与することを含む。疾患を抑制することは、本発明のワクチンを、疾患の誘導後であるがその臨床的出現前に対象に投与することを含む。疾患を抑圧することは、本発明のワクチンを、疾患の臨床的出現後に対象に投与することを含む。

【0067】

核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参照されたヌクレオチド配列の部分もしくは断片、（ｉｉ）参照されたヌクレオチド配列もしくはその部分の補体、（ｉｉｉ）参照された核酸もしくはその補体に実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）参照された核酸、その補体、もしくはそれに実質的に同一である配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味し得る。

【0068】

ペプチドまたはポリペプチドに対する「バリアント」は、ペプチドまたはポリペプチドが、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列において異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持することを示し得る。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されたタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、典型的には小さな変更を含むものとして当該技術分野で認識される。これらの小さな変更は、当該技術分野で理解されるように、部分的に、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮することによって特定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシーインデックスは、その疎水性および電荷の考慮に基づく。類似のハイドロパシーインデックスのアミノ酸は、置換され、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが当該技術分野で知られている。一態様では、±２のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用することができる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最も大きな局所平均親水性、抗原性および免疫原性と十分に相関することが報告されている有用な尺度の計算を可能にする。米国特許第４，５５４，１０１号は、参照によって本明細書に完全に組み込まれる。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該技術分野で理解されるように、生物学的活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行われ得る。アミノ酸の疎水性インデックスおよび親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察と一貫して、生物学的機能と適合性であるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性によって明らかになるように、アミノ酸、および特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対類似性に依存することが理解される。

【0069】

バリアントは、完全遺伝子配列またはその断片の完全長にわたって実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列またはその断片の完全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列またはその断片の完全長にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の完全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。

【0070】

本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに統合するベクターのいずれかであり得る。

【0071】

本明細書における数値範囲の列挙について、同じ精度でその間に介在する各数が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲について、６および９に加えて数７および８が企図され、６．０～７．０の範囲について、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に企図される。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0072】

２．組成物
一態様では、本発明は、対象において生物製剤を生成し、対象において生物製剤を翻訳後修飾するための組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む。

【0073】

一実施形態では、第１の核酸は、生物製剤をコードする。一実施形態では、第１の核酸配列は、タンパク質をコードする。一実施形態では、第１の核酸配列は、合成抗原、合成抗体、または合成タンパク質をコードする。一実施形態では、第１の核酸配列は、イムノアドヘシンをコードする。

【0074】

一実施形態では、第２の核酸は、修飾タンパク質をコードする。一実施形態では、修飾タンパク質は、第１の核酸配列によってコードされたタンパク質を翻訳後修飾する。一実施形態では、修飾タンパク質は、第１の核酸配列を修飾する。

【0075】

一態様では、本発明は、合成ｅＣＤ４－Ｉｇをコードする第１の組換え核酸配列と、合成チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ）をコードする第２の組換え核酸配列とを含む組成物に関する。一実施形態では、ＴＰＳＴは、ＴＰＳＴ１またはＴＰＳＴ２である。一実施形態では、ＴＰＳＴは、ＴＰＳＴ２である。一実施形態では、ＴＰＳＴは、ＩｇＥリーダーを含む。組成物は、ｅＣＤ４－Ｉｇのインビボ発現、形成および硫酸化を容易にするために、それを必要とする対象に投与され得る。

【0076】

一実施形態では、合成ｅＣＤ４－Ｉｇをコードする第１の組換え核酸配列は、配列番号１もしくは３、またはその断片に少なくとも９０％相同な配列をコードする。一実施形態では、第１の組換え核酸配列は、配列番号２もしくは４、またはその断片に少なくとも９０％相同な配列を含む。

【0077】

一実施形態では、第１の組換え核酸配列は、配列番号１もしくは３、またはその断片に少なくとも９０％相同なポリペプチド配列をコードする配列を含む。一実施形態では、第１の組換え核酸配列は、本明細書に記載されるＤＮＡ配列から転写されるＲＮＡ配列を含む。例えば、一実施形態では、第１の組換え核酸配列は、配列番号１もしくは３、またはその断片に少なくとも９０％相同なポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列によって転写されるＲＮＡ配列を含む。

【0078】

一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号１または３に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号１または３に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列の断片をコードする。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号２または４に少なくとも９０％相同な配列を含む。

【0079】

一実施形態では、ＴＰＳＴ２をコードする第２の組換え核酸配列は、配列番号５もしくは７、またはその断片に少なくとも９０％相同な配列をコードする。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号６もしくは８、またはその断片に少なくとも９０％相同な配列を含む。

【0080】

一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号５もしくは７、またはその断片に少なくとも９０％相同なポリペプチド配列をコードする配列を含む。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、本明細書に記載されるＤＮＡ配列から転写されるＲＮＡ配列を含む。例えば、一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号５もしくは７、またはその断片に少なくとも９０％相同なポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列によって転写されるＲＮＡ配列を含む。

【0081】

一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号５または７に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号５または７に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列の断片をコードする。一実施形態では、第２の組換え核酸配列は、配列番号６また８に少なくとも９０％相同な配列を含む。

【0082】

本明細書に提供される組成物はまた、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。

【0083】

３．修飾タンパク質
対象のタンパク質または核酸を翻訳後修飾することができるタンパク質が本明細書に提供される。例えば、一実施形態では、本明細書に記載される修飾タンパク質は、生物学的活性に必要とされるタンパク質を翻訳後修飾するために使用され得る。一実施形態では、本明細書に記載の修飾タンパク質は、タンパク質を翻訳後修飾することができ、修飾は、硫酸化、アセチル化、シアリル化およびフコシル化／脱フコシル化を含むＮ結合グリコシル化、ミリストイル化、パルミトイル化、ＳＵＭＯ化、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化、Ｏ結合グリコシル化、ユビキチル化、ピロリドンカルボン酸、脱アミノ化、異性化、酸化、パルミトイル化、および環化を含むが、これらに限定されない（表１）。

【0084】

例示的な硫酸化酵素には、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ）が含まれる。例示的なアセチル化酵素には、ＮａｔＡ、ＮａｔＢ、ＮａｔＣ、ＮａｔＤ、ＮａｔＥ、ＮａｔＦ、アセチル－コエンザイムＡ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼが含まれるが、これらに限定されない。例示的な脱アミド酵素には、Ｏ－アシルトランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。例示的なミリストイル化酵素には、Ｎ－ミリストイルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）が含まれるが、これらに限定されない。例示的なユビキチル化酵素には、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン共役酵素、およびユビキチンリガーゼが含まれるが、これらに限定されない。例示的なＳＵＭＯ化酵素には、ＳＵＭＯ－１、ＳＵＭＯ－２、ＳＵＭＯ－３、およびＳＵＭＯ－４が含まれるが、これらに限定されない。例示的なメチル化酵素には、カテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、５－メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ、およびコリノイド－鉄硫黄タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。例示的なヒドロキシル化酵素には、プロリル４－ヒドロキシラーゼ、プロリル３－ヒドロキシラーゼ、およびリシル５－ヒドロキシラーゼが含まれるが、これらに限定されない。リン酸化酵素には、ＭＡＰキナーゼ、ＡＧＣキナーゼ、ＣａＭキナーゼ、ＣＫ１、ＣＤＫ、ＧＳＫ３ ＣＬＫ、ＳＴＥ、チロキシンキナーゼ、およびＴＫＬなどのキナーゼが含まれる。例示的なＮ－グリコシル化エクシムには、Ｆｕｔ８、ＧＭＤＳ、ＧＮＴ－ＩＩＩ Ｂ４Ｇａｌｔ１、ＳＬＣ３５Ａ２、ＳＴ６Ｇａｌ１、およびＭＧＡＴ３が含まれるが、これらに限定されない。

【0085】

一実施形態では、修飾タンパク質は、細胞の分泌区画に移動するように修飾され得る。一実施形態では、修飾タンパク質は、インビボで修飾される標的生物学的タンパク質または核酸と局在化するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの異なるタンパク質からのシグナルペプチドを含み得る。一実施形態では、ＩｇＥシグナルペプチドは、配列ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号１１）を含む。

【0086】

一実施形態では、修飾タンパク質は、ミトコンドリアに移動するように修飾され得る。一実施形態において、修飾タンパク質は、両親媒性螺旋を形成する１０～７０個のアミノ酸を含むＮ末端ペプチドを含み得る。一実施形態では、修飾タンパク質は、Ｎ末端ペプチドジロイシンモチーフ（ＤＸＸＬＬ（配列番号１２））を含み得る。一実施形態では、修飾タンパク質は、Ｎ末端ペプチドチロシンベースのモチーフ（ＹＸＸО（配列番号１３））を含んでもよい。

【0087】

一実施形態では、修飾タンパク質は、リソソームに移動するように修飾され得る。一実施形態では、修飾タンパク質は、膜貫通タンパク質の細胞質尾部を含み得る。一実施形態では、修飾タンパク質は、Ｎ末端上の膜貫通タンパク質の細胞質尾部を含んでもよい。一実施形態では、修飾タンパク質は、Ｃ末端上の膜貫通タンパク質の細胞質尾部を含んでもよい。

【0088】

一実施形態では、修飾タンパク質は、核に移動するように修飾され得る。一実施形態では、修飾タンパク質は、５個の塩基性正荷電アミノ酸を含んでもよい。一実施形態では、修飾タンパク質は、Ｎ末端上に５個の塩基性正荷電アミノ酸を含んでもよい。一実施形態では、修飾タンパク質は、Ｃ末端上に５個の塩基性正荷電アミノ酸を含んでもよい。

【0089】

一実施形態では、修飾タンパク質は、硫酸化酵素である。一実施形態では、硫酸化酵素は、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ）である。一実施形態では、硫酸化酵素は、ＴＰＳＴ１またはＴＰＳＴ２である。一実施形態では、硫酸化酵素は、ＴＰＳＴ２である。

【0090】

一実施形態では、ＴＰＳＴ２は、細胞の分泌区画に移動するように修飾される。一実施形態では、ＴＰＳＴ２は、細胞の分泌区画に移動し、インビボで修飾される標的生物学的タンパク質または核酸と局在化するように修飾される。一実施形態において、ＴＰＳＴ２は、Ｎ末端ＩｇＥペプチドを含むように修飾される。

【0091】

一実施形態では、ＴＰＳＴ２は、配列番号５または７に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＴＰＳＴ２は、配列番号５または７で記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＴＰＳＴ２は、配列番号５または７で記載されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0092】

ＴＰＳＴ２の断片は、ＴＰＳＴ２のアミノ配列の１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含むことができる。一実施形態では、ＴＰＳＴ２は、ＴＰＳＴ２の断片を含む。一実施形態では、ＴＰＳＴ２の断片は、配列番号５または７の断片を含み得る。一実施形態では、ＴＰＳＴ２の断片は、配列番号５または７で記載されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するタンパク質の断片を含み得る。

【0093】

本明細書に記載の修飾タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子もまた、本明細書に提供される。本明細書に示されるタンパク質をコードするコード配列は、ルーチン方法を使用して生成され得る。タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸も本明細書に記載される。

【0094】

一実施形態では、修飾タンパク質のコード配列が提供される。修飾タンパク質は、標的生物学的タンパク質または核酸を修飾し得る少なくとも１つの翻訳後修飾活性を有し得る。核酸配列は、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードするコード配列を任意に含み得る。

【0095】

核酸配列は、完全長タンパク質をコードし得る。例えば、核酸配列は、完全長硫酸化酵素をコードし得る。一実施形態では、核酸配列は、ＴＰＳＴ２をコードする配列を含み得る。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５もしくは７、そのバリアント、またはその断片をコードする配列を含み得る。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６または８に少なくとも９０％相同な配列を含み得る。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６または８を含み得る。一実施形態では、核酸配列は、完全長タンパク質をコードするＲＮＡ配列を含む。例えば、核酸は、硫酸化酵素をコードするＲＮＡ配列を含み得る。一実施形態では、核酸配列は、ＴＰＳＴ２をコードするＲＮＡ配列を含み得る。一実施形態では、核酸は、配列番号５もしくは７、そのバリアント、その断片、またはその任意の組み合わせのうちの１つ以上をコードするＲＮＡ配列を含み得る。

【0096】

核酸配列は、タンパク質の断片をコードし得る。完全長タンパク質の断片は、完全長タンパク質の１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。例えば、ｅＣＤ４－Ｉｇをコードする核酸の断片は、本明細書に記載の核酸配列の１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。

【0097】

核酸配列は、生物学的タンパク質に相同なタンパク質をコードし得る。例えば、核酸配列は、ｅＣＤ４－Ｉｇに相同なタンパク質をコードし得る。核酸配列は、配列番号５または７と相同なタンパク質をコードする配列を含み得る。一実施形態では、配列は、配列番号５または７で記載されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するタンパク質をコードする配列を含み得る。一実施形態では、配列は、配列番号６または８で記載されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含み得る。

【0098】

４．生物製剤
本明細書では、生物製剤および生物製剤をコードする核酸が提供される。一実施形態では、生物製剤は、タンパク質または核酸である。一実施形態では、生物製剤は、核酸である。一実施形態では、生物製剤は、タンパク質である。一実施形態では、生物製剤は、タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸である。例えば、一実施形態では、第１の核酸配列は、合成抗原、合成抗体、または合成タンパク質をコードする。

【0099】

一実施形態では、第１の核酸配列は、イムノアドヘシンをコードする。例えば、一実施形態では、イムノアドヘシンは、ｅＣＤ４－Ｉｇである。一実施形態では、ｅＣＤ４－Ｉｇは、配列番号１または３に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ｅＣＤ４－Ｉｇは、配列番号１または３で記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ｅＣＤ４－Ｉｇは、配列番号１または３で記載されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号２または４で記載されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。

【0100】

イムノアドヘシンの断片は、ｅＣＤ４－Ｉｇのアミノ配列の１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。一実施形態では、ｅＣＤ４－Ｉｇは、ｅＣＤ４－Ｉｇの断片を含む。一実施形態では、ｅＣＤ４－Ｉｇの断片は、配列番号３の断片を含み得る。一実施形態では、ｅＣＤ４－Ｉｇの断片は、配列番号１または３で記載されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するタンパク質の断片を含み得る。

【0101】

ａ．タンパク質
本明細書では、生物学的機能を実行することができる生物学的タンパク質が提供される。タンパク質は、本発明の組成物を投与された対象において疾患または感染症に対し治療、予防、および／または保護することができる。一実施形態では、生物学的タンパク質は、哺乳動物において免疫応答を誘発することができる抗原である。

【0102】

いくつかの実施形態では、生物学的タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質、例えばＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの異なるタンパク質からのシグナルペプチドを含み得る。

【0103】

完全長生物学的タンパク質の断片は、完全長配列の１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。

【0104】

（１）タンパク質をコードする核酸およびコード配列
本明細書では、生物学的機能を実行することができるタンパク質のコード配列が提供される。本明細書に記載されるタンパク質をコードするコード配列は、慣例的方法を使用して生成され得る。タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸も本明細書に記載される。

【0105】

一実施形態では、免疫応答を誘発することができる抗原のコード配列が提供される。抗原は、これに対して免疫応答を誘導することができる特定の免疫原に対して効果的であり得る少なくとも１つの抗原エピトープを含み得る。核酸配列は、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードするコード配列を任意に含み得る。

【0106】

核酸配列は、完全長タンパク質をコードし得る。例えば、核酸配列は、完全長イムノアドヘシンタンパク質をコードし得る。一実施形態では、核酸配列は、配列番号３、そのバリアント、またはその断片をコードする配列を含み得る。一実施形態では、核酸配列は、完全長タンパク質をコードするＲＮＡ配列を含む。例えば、核酸は、イムノアドヘシンをコードするＲＮＡ配列を含み得る。一実施形態では、核酸は、ｅＣＤ４－ＩｇをコードするＲＮＡ配列を含み得る。一実施形態では、核酸は、配列番号３、そのバリアント、その断片、またはその任意の組み合わせのうちの１つ以上をコードするＲＮＡ配列を含み得る。

【0107】

核酸配列は、タンパク質の断片をコードし得る。完全長タンパク質の断片は、完全長タンパク質の１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。例えば、ｅＣＤ４－Ｉｇをコードする核酸の断片は、本明細書に記載の核酸配列の１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。

【0108】

核酸配列は、生物学的タンパク質に相同なタンパク質をコードし得る。例えば、核酸配列は、ｅＣＤ４－Ｉｇに相同なタンパク質をコードし得る。核酸配列は、配列番号３と相同なタンパク質をコードする配列を含み得る。

【0109】

ｂ．抗原
本明細書では、免疫応答を誘発することができる免疫原性組成物が提供される。タンパク質は、本発明の組成物を投与された対象において疾患または感染症に対し治療、予防、および／または保護することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、哺乳動物において免疫応答を誘発することができる抗原である。

【0110】

一実施形態では、免疫原性組成物は、抗原またはその断片もしくはバリアントも含み得る。抗原は、対象において免疫応答を誘導する任意のものであり得る。抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、またはこれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列はまた、ペプチド結合によって抗原に連結しているリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列を含むことができる。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0111】

抗原は、任意の数の生物、例えばウイルス、寄生虫、細菌、真菌、または哺乳動物からのタンパク質、核酸、またはその断片、またはそのバリアント、またはその組み合わせに含まれ得る。抗原は、自己免疫疾患、アレルギー、または喘息に関連し得る。他の実施形態では、抗原は、がん、ヘルペス、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連し得る。

【0112】

（１）ウイルス抗原
抗原は、ウイルス抗原、またはその断片、またはそのバリアントであり得る。ウイルス抗原は、以下の科のうちの１つからのウイルス由来であり得る：Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅ。ウイルス抗原は、乳頭腫ウイルス、例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－Ｉ）、毛細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－ＩＩ）、単純ヘルペス１（ＨＳＶ１；経口ヘルペス）、単純ヘルペス２（ＨＳＶ２；性器ヘルペス）、帯状疱疹（ＶＺＶ；水痘帯状疱疹、水痘としても知られる）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、またはがんを引き起こすウイルス由来であり得る。

【0113】

（ａ）肝炎抗原
肝炎抗原は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、および／またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）由来の抗原または免疫原であり得る。いくつかの実施形態では、肝炎抗原は、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、およびＨＥＶ由来の抗原の１つ以上をコードするプラスミド（複数可）などの核酸分子（複数可）であり得る。肝炎抗原は、完全長タンパク質の完全長または免疫原性断片であり得る。

【0114】

肝炎抗原は、改善した発現のためのコンセンサス配列および／または修飾を含み得る。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、およびコンストラクトの免疫原性を増加させるための高効率免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝子修飾が、修飾コンセンサス配列に含まれ得る。コンセンサス肝炎抗原は、シグナルペプチド、例えばＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドを含み得、いくつかの実施形態では、ＨＡタグを含み得る。免疫原は、対応するコドン最適化免疫原よりも強く広い細胞性免疫応答を誘発するように設計され得る。

【0115】

肝炎抗原は、ＨＡＶ由来の抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＡＶキャプシドタンパク質、ＨＡＶ非構造タンパク質、それらの断片、それらのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0116】

肝炎抗原は、ＨＣＶ由来の抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＣＶヌクレオキャプシドタンパク質（すなわちコアタンパク質）、ＨＣＶエンベロープタンパク質（例えばＥ１およびＥ２）、ＨＣＶ非構造タンパク質（例えばＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂ）、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせであり得る。

【0117】

肝炎抗原は、ＨＤＶ由来の抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＤＶデルタ抗原、その断片、またはそのバリアントであり得る。

【0118】

肝炎抗原は、ＨＥＶ由来の抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＥＶキャプシドタンパク質、その断片、またはそのバリアントであり得る。

【0119】

肝炎抗原は、ＨＢＶ由来の抗原であり得る。肝炎抗原は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ、遺伝子ＸによってコードされるＨＢＶタンパク質、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせであり得る。肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせであり得る。肝炎抗原は、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質、またはコンセンサスＨＢＶ表面タンパク質であり得る。

【0120】

いくつかの実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＡコンセンサスコアＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。

【0121】

他の実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＢコンセンサスコアＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。

【0122】

さらに他の実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＣコンセンサスコアＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。

【0123】

いくつかの実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＤコンセンサスコアＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。

【0124】

他の実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＥコンセンサスコアＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。

【0125】

いくつかの実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＦコンセンサスコアＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。

【0126】

他の実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＧコンセンサスコアＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。

【0127】

いくつかの実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＨコンセンサスコアＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサスコアタンパク質配列であり得る。

【0128】

さらに他の実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサス表面ＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。

【0129】

いくつかの実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサス表面ＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。

【0130】

他の実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス表面ＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。

【0131】

さらに他の実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサス表面ＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。

【0132】

いくつかの実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサス表面ＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。

【0133】

他の実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサス表面ＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。

【0134】

さらに他の実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサス表面ＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。

【0135】

他の実施形態では、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサス表面ＤＮＡ配列コンストラクト、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサス表面タンパク質配列であり得る。

【0136】

（ｂ）ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原
ＨＰＶ抗原は、子宮頸癌、直腸癌、および／または他の癌を引き起こすＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、４５、５２、および５８に由来し得る。ＨＰＶ抗原は、生殖器疣贅を引き起こすＨＰＶ型６および１１由来であってもよく、頭頸部癌の原因であることが知られている。

【0137】

ＨＰＶ抗原は、各ＨＰＶ型由来のＨＰＶ Ｅ６またはＥ７ドメインであり得る。例えば、ＨＰＶ型１６（ＨＰＶ１６）の場合、ＨＰＶ１６抗原は、ＨＰＶ１６ Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６ Ｅ７抗原、断片、バリアント、またはこれらの組み合わせを含み得る。同様に、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ６ Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ１１ Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ１８ Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ３１ Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ３３ Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ５２ Ｅ６および／もしくはＥ７、またはＨＰＶ５８ Ｅ６および／もしくはＥ７、フラグメント、バリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0138】

（ｃ）ＲＳＶ抗原
ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ融合タンパク質（本明細書では「ＲＳＶ Ｆ」、「ＲＳＶ Ｆタンパク質」および「Ｆタンパク質」とも称される）、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ヒトＲＳＶ融合タンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢとの間で保存され得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９４．１）由来のＲＳＶ Ｆタンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ａ２株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＢ５９８５８．１）由来のＲＳＶ Ｆタンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の単量体、二量体もしくは三量体、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＲＳＶ抗原は、最適化アミノ酸ＲＳＶ Ｆアミノ酸配列、またはその断片もしくはバリアントであり得る。

【0139】

ＲＳＶ Ｆの融合後形態は、免疫化された動物において高力価中和抗体を誘発し、動物をＲＳＶチャレンジから保護する。本発明は、特許請求されたワクチンにおけるこの免疫応答を利用する。本発明によれば、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前形態または融合後形態であり得る。

【0140】

ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶ結合糖タンパク質（本明細書では「ＲＳＶ Ｇ」、「ＲＳＶ Ｇタンパク質」および「Ｇタンパク質」とも称される）、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ヒトＲＳＶ Ｇタンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢとの間で異なる。抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９３）由来のＲＳＶ Ｇタンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５６０１、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１０６８、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５５９８、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１１２３、またはその断片もしくはバリアント由来のＲＳＶ Ｇタンパク質であり得る。ＲＳＶ抗原は、最適化アミノ酸ＲＳＶ Ｇアミノ酸配列、またはその断片もしくはバリアントであり得る。

【0141】

他の実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ非構造タンパク質１（「ＮＳ１タンパク質」）、またはその断片もしくはバリアントであり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９８７．１）由来のＲＳＶ ＮＳ１タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＲＳＶ抗原ヒトはまた、ＲＳＶ非構造タンパク質２（「ＮＳ２タンパク質」）、またはその断片もしくはバリアントであり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９８８．１）由来のＲＳＶ ＮＳ２タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＲＳＶ抗原はさらに、ヒトＲＳＶヌクレオキャプシド（「Ｎ」）タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９８９．１）由来のＲＳＶ Ｎタンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶリンタンパク質（「Ｐ」）タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９０．１）由来のＲＳＶ Ｐタンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶマトリックスタンパク質（「Ｍ」）タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９１．１）由来のＲＳＶ Ｍタンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。

【0142】

さらに他の実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ小疎水性（「ＳＨ」）タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９２．１）由来のＲＳＶ ＳＨタンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶマトリックスタンパク質２－１（「Ｍ２－１」）タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９５．１）由来のＲＳＶ Ｍ２－１タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＲＳＶ抗原はさらに、ヒトＲＳＶマトリックスタンパク質２－２（「Ｍ２－２」）タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９７．１）由来のＲＳＶ Ｍ２－２タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＲＳＶ抗原ヒトは、ＲＳＶポリメラーゼＬ（「Ｌ」）タンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＸ２３９９６．１）由来のＲＳＶ Ｌタンパク質、またはその断片もしくはバリアントであり得る。

【0143】

さらなる実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２－１、Ｍ２－２、またはＬタンパク質の最適化されたアミノ酸配列を有し得る。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶタンパク質または組換え抗原、例えば、ヒトＲＳＶゲノムによってコードされるタンパク質のいずれか１つであり得る。

【0144】

他の実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ Ｆタンパク質、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ Ｇタンパク質、最適化アミノ酸ＲＳＶ Ｇアミノ酸配列、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株のヒトＲＳＶゲノム、最適化アミノ酸ＲＳＶ Ｆアミノ酸配列、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ ＮＳ１タンパク質、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ ＮＳ２タンパク質、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株由来のＲＳＶ Ｎタンパク質、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ Ｐタンパク質、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ Ｍタンパク質、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ ＳＨタンパク質、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ Ｍ２－１タンパク質、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ Ｍ２－２タンパク質、ＲＳＶ Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ Ｌタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５６０１からのＲＳＶ Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１０６８からのＲＳＶ Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ５５９８からのＲＳＶ Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ分離株Ｈ１１２３からのＲＳＶ Ｇタンパク質、またはその断片、またはそのバリアントであり得るが、これらに限定されない。

【0145】

（ｄ）インフルエンザ抗原
インフルエンザ抗原は、１つ以上のインフルエンザ血清型に対して哺乳動物において免疫応答を誘発することができるものである。抗原は、完全長翻訳産物ＨＡＯ、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、そのバリアント、その断片、またはその組み合わせを含み得る。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、Ａ型インフルエンザ血清型Ｈ１の複数株に由来するコンセンサス配列、Ａ型インフルエンザ血清型Ｈ２の複数株に由来するコンセンサス配列、異なるセットのＡ型インフルエンザ血清型Ｈ１の複数株に由来する２つの異なるコンセンサス配列の一部を含有するハイブリッド配列、またはＢ型インフルエンザの複数株に由来するコンセンサス配列であり得る。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、Ｂ型インフルエンザに由来してもよい。

【0146】

インフルエンザ抗原はまた、これに対して免疫応答を誘導することができる特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的であり得る少なくとも１つの抗原エピトープを含み得る。抗原は、無傷のインフルエンザウイルスに存在する免疫原性部位およびエピトープの全レパートリーを提供し得る。抗原は、血清型Ｈ１または血清型Ｈ２の複数のインフルエンザＡウイルス株などの１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列に由来し得るコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であり得る。抗原は、２つの異なるコンセンサスヘマグルチニン抗原配列またはその一部を組み合わせることから得ることができるハイブリッドコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であり得る。２つの異なるコンセンサスヘマグルチニン抗原配列のそれぞれは、血清型Ｈ１の複数のインフルエンザＡウイルス株などの、１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株の異なるセットに由来し得る。抗原は、複数のインフルエンザＢウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列に由来し得るコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であり得る。

【0147】

いくつかの実施形態では、インフルエンザ抗原は、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ２ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｈ５ ＨＡ、またはＢＨＡ抗原であり得る。あるいは、インフルエンザ抗原は、コンセンサスＨ１アミノ酸配列またはコンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むコンセンサスヘマグルチニン抗原であり得る。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、各々が他方とは異なる配列のセットに由来する、２つの異なるコンセンサスＨ１配列の部分を含む合成ハイブリッドコンセンサスＨ１配列であり得る。合成ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質であるコンセンサスＨＡ抗原の一例は、Ｕ２アミノ酸配列を含むタンパク質である。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質などの、インフルエンザＢ株からのヘマグルチニン配列に由来するコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であり得る。

【0148】

コンセンサスヘマグルチニン抗原は、１つ以上の追加のアミノ酸配列要素をさらに含み得る。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、そのＮ末端にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列をさらに含み得る。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、容易に入手可能な抗体によって検出され得る独自の免疫原性エピトープである免疫原性タグをさらに含み得る。そのような免疫原性タグの一例は、コンセンサスヘマグルチニンＣ末端上に連結され得る９個のアミノ酸インフルエンザＨＡタグである。いくつかの実施形態では、コンセンサスヘマグルチニン抗原は、そのＮ末端にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列を、およびそのＣ末端にＨＡタグをさらに含み得る。

【0149】

コンセンサスヘマグルチニン抗原は、コンセンサスインフルエンザアミノ酸配列またはその断片およびバリアントからなるコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であり得る。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、非インフルエンザタンパク質配列ならびにインフルエンザタンパク質配列、またはそれらの断片およびバリアントを含むコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であり得る。

【0150】

コンセンサスＨ１タンパク質の例には、コンセンサスＨ１アミノ酸配列からなり得るもの、またはＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列およびＨＡタグの両方などの追加の要素をさらに含むものが含まれる。

【0151】

コンセンサスＨ２タンパク質の例には、コンセンサスＨ２アミノ酸配列からなり得るもの、またはＩｇＥリーダー配列もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列およびＨＡタグの両方をさらに含むものが含まれる。

【0152】

ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質の例には、コンセンサスＵ２アミノ酸配列からなり得るもの、またはＩｇＥリーダー配列もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列およびＨＡタグの両方をさらに含むものが含まれる。

【0153】

ハイブリッドコンセンサスインフルエンザＢヘマグルチニンタンパク質の例には、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列からなり得るものが含まれ、またはＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列およびＨＡタグの両方を含み得る。

【0154】

コンセンサスヘマグルチニンタンパク質は、コンセンサスヘマグルチニン核酸、そのバリアント、またはその断片によってコードされ得る。異なる株およびバリアントからの複数の異なるヘマグルチニン配列に由来するコンセンサス配列であり得るコンセンサスヘマグルチニンタンパク質とは異なり、コンセンサスヘマグルチニン核酸は、コンセンサスタンパク質配列をコードする核酸配列を指し、使用されるコード配列は、コンセンサスヘマグルチニンタンパク質配列が由来する複数の異なるヘマグルチニン配列中の特定のアミノ酸配列をコードするために使用されるものと異なり得る。コンセンサス核酸配列は、コドン最適化および／またはＲＮＡ最適化され得る。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、５’非翻訳領域中のコザックの配列を含み得る。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、リーダー配列をコードする核酸配列を含んでもよい。Ｎ末端リーダー配列のコード配列は、ヘマグルチニンコード配列の５’である。Ｎ末端リーダーは、分泌を容易にすることができる。Ｎ末端リーダーは、ＩｇＥリーダーまたはＩｇＧリーダーであり得る。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、免疫原性タグをコードする核酸配列を含み得る。免疫原性タグは、タンパク質のＣ末端上にあり得、それをコードする配列はＨＡコード配列の３’である。免疫原性タグは、そのような抗体をアッセイで使用してタンパク質の発現を検出および確認することができるように、容易に入手可能な抗体が存在する独自のエピトープを提供する。免疫原性タグは、タンパク質のＣ末端のＨタグであり得る。

【0155】

（ｅ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原
ＨＩＶ抗原は、免疫原のための修飾コンセンサス配列を含み得る。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、およびコンストラクトの免疫原性を増加させるための高効率免疫グロビンリーダー配列の付加を含む遺伝子修飾が、修飾コンセンサス配列に含まれ得る。新規免疫原は、対応するコドン最適化免疫原よりも強く広い細胞性免疫応答を誘発するように設計され得る。

【0156】

いくつかの実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列コンストラクト、サブタイプＡエンベロープタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＡコンセンサスエンベロープタンパク質配列であり得る。

【0157】

他の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＢコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列コンストラクト、サブタイプＢエンベロープタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＢコンセンサスエンベロープタンパク質配列であり得る。

【0158】

さらに他の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＣコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列コンストラクト、サブタイプＣエンベロープタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＣコンセンサスエンベロープタンパク質配列であり得る。

【0159】

さらなる実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＤコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列コンストラクト、サブタイプＤエンベロープタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＤコンセンサスエンベロープタンパク質配列であり得る。

【0160】

いくつかの実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＢ Ｎｅｆ－ＲｅｖコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列コンストラクト、サブタイプＢ Ｎｅｆ－Ｒｅｖタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＢ Ｎｅｆ－Ｒｅｖコンセンサスタンパク質配列であり得る。

【0161】

他の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ ＤＮＡ配列コンストラクトのＧａｇコンセンサスＤＮＡ配列、ＧａｇコンセンサスサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤタンパク質のコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはコンセンサスＧａｇサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤタンパク質配列であり得る。

【0162】

さらに他の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、Ｐｏｌ ＤＮＡ配列またはＰｏｌタンパク質配列であり得る。ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ Ａ、Ｅｎｖ Ｂ、Ｅｎｖ Ｃ、Ｅｎｖ Ｄ、Ｂ Ｎｅｆ－Ｒｅｖ、Ｇａｇ、またはこれらの任意の組み合わせの核酸またはアミノ酸配列であり得る。

【0163】

（ｆ）ヘルペス抗原
一実施形態において、ヘルペス抗原は、ＨＣＭＶ、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣｅＨＶ１、ＶＺＶ、またはＥＢＶに由来する。ヘルペス抗原は、ＨＣＭＶ、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＣｅＨＶ１、ＶＺＶ、またはＥＢＶに由来するかどうかにかかわらず、ｇＢ、ｇＭ、ｇＮ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＥ、ｇＩ、ｇＫ、ｇＣ、ｇＤ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ－１３１Ａ、ＵＬ－８３（ｐｐ６５）を含む免疫原性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、ＨＳＶ１－ｇＨ、ＨＳＶ１－ｇＬ、ＨＳＶ１－ｇＣ、ＨＳＶ１－ｇＤ、ＨＳＶ２－ｇＨ、ＨＳＶ２－ｇＬ、ＨＳＶ２－ｇＣ、ＨＳＶ２－ｇＤ、ＶＺＶ－ｇＨ、ＶＺＶ－ｇＬ、ＶＺＶ－ｇＭ、ＶＺＶ－ｇＮ、ＣｅＨＶ１－ｇＨ、ＣｅＨＶ１－ｇＬ、ＣｅＨＶ１－ｇＣ、ＣｅＨＶ１－ｇＤ、ＶＺＶ－ｇＥ、またはＶＺＶ－ｇＩであり得る。

【0164】

（２）寄生虫抗原
一実施形態では、寄生虫は、原虫、蠕虫、またはエクトパラサイトであり得る。蠕虫（すなわちワーム）は、扁平虫（例えば吸虫および条虫）、棘頭虫、または回虫（例えば蟯虫）であり得る。エクトパラサイトは、シラミ、ノミ、マダニ、およびダニであり得る。

【0165】

寄生虫は、以下の疾患を引き起こす任意の寄生虫であり得る：アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、ベイリーサスカリア症、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ症、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、糸状虫症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエウジ症、オンコセルカ症、シラミ症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、テニア症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、および鞭虫症。

【0166】

寄生虫は、アカントアメーバ、アニサキス、ヒト回虫、ウマバエ、大腸バランチジウム、ナンキンムシ、条虫類（条虫）、ツツガムシ、ラセンウジバエ、赤痢アメーバ、肝蛭、ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、鼻腔舌虫、肝吸虫、ロア糸状虫、肺吸虫、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、ダニ、条虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ、鞭虫、またはバンクロフト糸状虫であり得る。

【0167】

（ａ）マラリア抗原
一実施形態では、抗原は、マラリアを引き起こす寄生虫由来であり得る。マラリアを引き起こす寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫であり得る。熱帯熱マラリア原虫抗原は、ポロゾイト周囲（ＣＳ）抗原を含み得る。

【0168】

いくつかの実施形態では、マラリア抗原は、熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１の１つ以上をコードするプラスミドなどの核酸分子であり得る。免疫原は、完全長タンパク質または完全長タンパク質の免疫原性断片であり得る。免疫原は、改善した発現のためのコンセンサス配列および／または修飾を含む。

【0169】

他の実施形態では、マラリア抗原は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（合計２８個の配列）における全ての完全長熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ／ＳＳＰ２配列のコンパイルから設計されたＴＲＡＰのコンセンサス配列であり得、これはＳＳＰ２とも称される。コンセンサスＴＲＡＰ免疫原（すなわちＣｏｎＴＲＡＰ免疫原）は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含み得、いくつかの実施形態では、ＨＡタグを含み得る。

【0170】

さらに他の実施形態では、マラリア抗原は、Ａｇ２とも称され、高度に保存されたマラリア原虫抗原であるＣｅｌＴＯＳであり得る。コンセンサスＣｅｌＴＯＳ抗原（すなわちＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原）は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含み得、いくつかの実施形態では、ＨＡタグを含み得る。

【0171】

さらなる実施形態では、マラリア抗原は、高度に保存されたマラリア原虫抗原であるＡｍａ１であり得る。マラリア抗原はまた、いくつかの事例において、シグナルペプチド、例えばＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドを含むＡｍａ１（すなわちＣｏｎＡｍａｌ免疫原）のコンセンサス配列であり得、いくつかの実施形態では、ＨＡタグを含み得る。

【0172】

いくつかの実施形態では、マラリア抗原は、いくつかの事例において、シグナルペプチド、例えばＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドを含むコンセンサスＣＳ抗原（すなわち、コンセンサスＣＳ免疫原）であり得、いくつかの実施形態では、ＨＡタグを含み得る。

【0173】

他の実施形態では、マラリア抗原は、本明細書に記載のＰＦタンパク質の２つ以上の組み合わせを含む融合タンパク質であり得る。例えば、融合タンパク質は、互いに直接隣接して連結されるか、または間にスペーサーもしくは１つ以上のアミノ酸と連結されたコンセンサスＣＳ免疫原、ＣｏｎＬＳＡ１免疫原、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原、およびＣｏｎＡｍａ１免疫原の２つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、２つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、３つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、４つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、５つのＰＦ免疫原を含む。２つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳおよびＬＳＡ１；ＣＳおよびＴＲＡＰ；ＣＳおよびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳおよびＡｍａ１；ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ；ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１およびＡｍａ１；ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；またはＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含み得る。３つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ；ＣＳ、ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１およびＡｍａ１；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；またはＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含み得る。４つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１；ＣＳ、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１；またはＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含み得る。５つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳまたはＣＳ－ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含み得る。

【0174】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端に結合したシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結した複数のシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、融合タンパク質のＰＦ免疫原の間に含まれ得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＰＦ免疫原間のスペーサーは、タンパク質分解性切断部位であり得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、免疫原性組成物が投与される、および／または取り込まれることが意図される細胞で見出されるプロテアーゼによって認識されるタンパク質分解性切断部位であり得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、融合タンパク質のＰＦ免疫原の間に含まれ得、スペーサーは、免疫原性組成物が投与されるおよび／または取り込まれることが意図される細胞で見出されるプロテアーゼによって認識されるタンパク質分解性切断部位であり、融合タンパク質は、切断時に、各コンセンサスＰＦ免疫原のシグナルペプチドが、コンセンサスＰＦ免疫原を細胞の外側に転座するように、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結された複数のシグナルペプチドを含む。

【0175】

（３）細菌抗原
一実施形態では、細菌は、以下の門の任意の１つからものであり得る：Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、およびＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ。

【0176】

細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であり得る。細菌は、好気性細菌または嫌気性細菌であり得る。細菌は、自己栄養細菌またはヘテロ栄養細菌であり得る。細菌は、中温菌、好中球、好極限性細菌、好酸球、好アルカリ球、好熱球、低温菌、好塩菌、または好濃菌であり得る。

【0177】

細菌は、炭疽菌、抗生物質耐性細菌、疾患を引き起こす細菌、食中毒細菌、感染性細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌、または破傷風細菌であり得る。細菌は、マイコバクテリア、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅであり得る。細菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであり得る。

【0178】

（ａ）結核菌抗原
一実施形態において、ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＡｇ８５ファミリー、例えばＡｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂに由来し得る。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＥｓｘファミリー、例えばＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓｘＥ、ＥｓｘＦ、ＥｓｘＨ、ＥｓｘＯ、ＥｓｘＱ、ＥｓｘＲ、ＥｓｘＳ、ＥｓｘＴ、ＥｓｘＵ、ＥｓｘＶ、およびＥｓｘＷ由来であり得る。ＴＢ抗原は、蘇生因子ＲｐｆＡ、ＲｐｆＢ、およびＲｐｆＤを含み得る。ＴＢ抗原はまた、ＲＶ１７３３ｃ、ＥＳＡＴ６、ＰＰＥ５１、ＲＶ２６２６ｃ、ＲＶ２６２８、ＲＶ２０３４、Ｒｖ０９９５、ＲＶ０９９０ｃ、ＲＶ００１２、ＲＶ１８７２ｃ、ＲＶ００１０ｃ、ＲＶ２７１９ｃ、およびＲＶ３４０７を含み得る。

【0179】

いくつかの実施形態では、ＴＢ抗原は、Ａｇ８５ファミリーおよびＥｓｘファミリー由来の結核菌免疫原のうちの１つ以上をコードするプラスミドなどの核酸分子であり得る。免疫原は、完全長タンパク質の完全長または免疫原性断片であり得る。免疫原は、改善した発現のためのコンセンサス配列および／または修飾を含み得る。コンセンサス免疫原は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含み得、いくつかの実施形態では、ＨＡタグを含み得る。

【0180】

（４）真菌抗原
一実施形態では、真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ酵母（例えばＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ、白癬菌、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、ケカビ亜門、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ、またはＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍであり得る。

【0181】

（５）腫瘍抗原
本発明の文脈において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、がんなどの特定の過剰増殖性障害に共通の抗原を指す。本明細書で論じられる抗原は、単に例として含まれる。リストは排他的であることを意図するものではなく、さらなる実施例は、当業者には容易に明らかになるであろう。

【0182】

腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の抗原結合部分の選択は、治療されるがんの特定の種類に依存する。腫瘍抗原は当該技術分野において周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺－癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラーゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、およびメソセリンを含む。

【0183】

一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として機能することができる多数のタンパク質を発現する。これらの分子は、これらに限定されないが、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、およびＧＰ１００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）などの組織特異的抗原を含む。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、癌胚性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍胎児抗原である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に固有の真の腫瘍特異的免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）のいくつかは、モノクローナル抗体を用いた受動免疫療法の標的として使用されているが、成功は限定されている。

【0184】

本発明で言及される腫瘍抗原の種類はまた、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に固有であり、体内の他の細胞では発生しない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に固有ではなく、代わりに、抗原に対する免疫学的耐性の状態を誘導することができない条件下で、正常細胞上でも発現される。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟で応答できないときに胎児発達中に正常細胞上に発現される抗原であってもよく、または正常細胞上に通常極めて低いレベルで存在するが、腫瘍細胞上ではるかに高いレベルで発現される抗原であってもよい。

【0185】

ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例は、以下を含む：ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、および腫瘍特異的多系統抗原、例えばＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５などの分化抗原；過剰発現胚抗原、例えばＣＥＡ；過剰発現癌遺伝子および変異腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕなど；染色体転座から生じる独自の腫瘍抗原、例えばＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えばエプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７など。他の大きなタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトタンパク質、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼サイクロフィンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳが含まれる。

【0186】

がんマーカーは、ある特定のがん細胞に対して存在するか、または上方制御される既知のタンパク質である。自己に対する耐性を破壊する方法でそのようなマーカーを表す抗原を生成する方法によって、がんワクチンを生成することができる。そのようながんワクチンは、ＣＴＬＡ４抗体、および任意選択で、免疫応答を向上させるための１つ以上の追加の免疫チェックポイントタンパク質を標的とする１つ以上の抗体を含むことができる。以下は、いくつかの例示的な腫瘍抗原である。

【0187】

（ａ）ＴＥＲＴ
ＴＥＲＴは、染色体短縮による細胞死を防止するために、テロメアの末端にあるＴＴＡＧＧＧタグを合成するテロメラーゼ逆転写酵素である。ＴＥＲＴの異常に高い発現を有する過増殖細胞は、免疫療法によって標的化され得る。最近の研究は、ＴＥＲＴ遺伝子でトランスフェクトされた樹状細胞におけるＴＥＲＴ発現が、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、抗原特異的な様式でＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発することができることを実証している。

【0188】

（ｂ）前立腺抗原
以下は、前立腺抗原に対して哺乳動物において免疫応答を誘発することができる抗原である。コンセンサス抗原は、前立腺癌細胞に対する免疫原を誘導することができるので、それらを特に効果的にするエピトープを含むことができる。コンセンサス前立腺抗原は、完全長翻訳産物、そのバリアント、その断片、またはその組み合わせを含み得る。

【0189】

前立腺抗原は、以下の１つ以上を含み得る：ＰＳＡ抗原、ＰＳＭＡ抗原、ＳＴＥＡＰ抗原、ＰＳＣＡ抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）抗原、および他の既知の前立腺腫瘍抗原。タンパク質は、前立腺抗原に相同の配列、前立腺抗原の断片、および前立腺抗原の断片に相同の配列を有するタンパク質を含み得る。

【0190】

（ｃ）ＷＴ１
抗原は、ウィルムの腫瘍サプレッサー遺伝子１（ＷＴ１）、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせであり得る。ＷＴ１は、Ｎ末端、プロリン／グルタミン富化ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣ末端、４つのジンクフィンガーモチーフを含有する転写因子である。ＷＴ１は、泌尿器系の正常な発達において役割を果たし、細胞傷害性薬物での治療後に複数の部位でＷＴ１を切断する多くの因子、例えばｐ５３、既知の腫瘍抑制因子およびセリンプロテアーゼＨｔｒＡ２と相互作用する。

【0191】

ＷＴ１の変異は、腫瘍またはがん形成、例えばウィルムス腫瘍またはＷＴ１を発現する腫瘍をもたらし得る。ウィルムス腫瘍は、他の組織、例えば、これらに限定されないが、肝臓組織、尿路系組織、リンパ組織、および肺組織に転移する前に、一方または両方の腎臓で形成されることが多い。したがって、ウィルムス腫瘍は、転移性腫瘍と見なされ得る。ウィルムス腫瘍は、通常、若い子供（例えば５歳未満）、ならびに散発的および遺伝的形態の両方で発生する。したがって、免疫原性組成物は、ウィルムス腫瘍に罹患している対象を治療するために使用することができる。免疫原性組成物はまた、対象におけるかかる腫瘍の発症を防止するために、ＷＴ１を発現するがんまたは腫瘍を有する対象を治療するために使用することができる。ＷＴ１抗原は、天然の「正常」ＷＴ１遺伝子と異なることができ、したがって、ＷＴ１抗原発現腫瘍に対する療法または予防を提供し得る。タンパク質は、ＷＴ１抗原に相同の配列、ＷＴ１抗原の断片、およびＷＴ１抗原の断片に相同の配列を有するタンパク質を含み得る。

【0192】

（ｄ）チロシナーゼ抗原
抗原チロシナーゼ（Ｔｙｒ）抗原は、（１）Ｂ細胞応答を介して体液性免疫性を誘導して、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）産生を遮断し、これによって骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を遅らせ、腫瘍成長を抑制する抗体を生み出し、（２）細胞傷害性Ｔリンパ腫、例えば、ＣＤ８^＋（ＣＴＬ）を増加させて、腫瘍細胞を攻撃および殺滅し、（３）Ｔヘルパー細胞応答を増加させ、（４）ＩＦＮ－γおよびＴＦＮ－αを介して炎症性応答を増加させるか、または前述の全てによる、免疫媒介クリアランスに対する重要な標的である。

【0193】

チロシナーゼは、動植物組織に見出すことができる銅含有酵素である。チロシナーゼは、チロシン等のフェノールの酸化によってメラニンおよび他の顔料の産生を触媒する。黒色腫では、チロシナーゼは調節されなくなり、メラニン合成の増加をもたらすことができる。チロシナーゼはまた、黒色腫に罹患している対象における細胞傷害性Ｔ細胞認識の標的でもある。したがって、チロシナーゼは、黒色腫に関連する抗原であり得る。

【0194】

抗原は、それらを特に免疫原として有効にするタンパク質エピトープを含むことができ、これに対して抗Ｔｙｒ免疫応答を誘導することができる。Ｔｙｒ抗原は、完全長翻訳産物、そのバリアント、その断片、またはその組み合わせを含み得る。

【0195】

Ｔｙｒ抗原は、コンセンサスタンパク質を含み得る。Ｔｙｒ抗原は、全てのがんおよび腫瘍関連細胞に対して全身的に抗原特異的Ｔ細胞および高力価抗体応答を誘導する。したがって、Ｔｙｒコンセンサス抗原を含むワクチンによる腫瘍形成に対する保護免疫応答が提供される。したがって、任意の使用者は、本発明の免疫原性組成物をＴｙｒ抗原を含むように設計して、腫瘍形成、腫瘍の転移、および腫瘍成長に対する広範な免疫を提供することができる。タンパク質は、Ｔｙｒ抗原に相同の配列、Ｔｙｒ抗原の断片、およびＴｙｒ抗原の断片に相同の配列を有するタンパク質を含み得る。

【0196】

（ｅ）ＮＹ－ＥＳＯ－１
ＮＹ－ＥＳＯ－１は、細胞性免疫および体液性免疫の両方を誘導することができる様々ながんにおいて発現されるがん－精巣抗原である。遺伝子発現研究は、粘液質および円形細胞リポ肉腫におけるＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＴＡＧ１Ｂの遺伝子の上方制御を示している。

【0197】

様々な実施形態では、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原は、コンセンサスＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質またはコンセンサスＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質をコードする核酸分子を含む。ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原に相同の配列、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原の断片、およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原の断片に相同の配列を有するタンパク質を含む。

【0198】

（ｆ）ＰＲＡＭＥ
腫瘍において優先的に発現される黒色腫抗原（ＰＲＡＭＥ抗原）は、ヒトにおいてＰＲＡＭＥ遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子は、ヒト黒色腫において主に発現され、細胞溶解性Ｔリンパ球によって認識される抗原をコードする。精巣を除き、正常組織では発現されない。遺伝子はまた、急性白血病においても発現される。同じタンパク質をコードする５つの代替スプライシング転写バリアントが、この遺伝子について観察されている。タンパク質は、ＰＲＡＭＥ抗原に相同の配列、ＰＲＡＭＥ抗原の断片、およびＰＲＡＭＥ抗原の断片に相同の配列を有するタンパク質を含み得る。

【0199】

（ｇ）ＭＡＧＥ
ＭＡＧＥは、黒色腫関連抗原、特に黒色腫関連抗原４（ＭＡＧＥＡ４）を表す。ＭＡＧＥ－Ａ４は、男性生殖細胞ならびに胃腸癌、食道癌および肺癌などの様々な組織学的種類の腫瘍細胞において発現される。ＭＡＧＥ－Ａ４は、癌タンパク質、ガンキリンと結合する。このＭＡＧＥ－Ａ４特異的結合は、そのＣ末端によって媒介される。研究では、外因性ＭＡＧＥ－Ａ４が、インビトロでガンキリン過剰発現細胞の接着非依存性成長を部分的に阻害し、ヌードマウスにおけるこれらの細胞からの移行腫瘍の形成を抑制することができることが示されている。この阻害は、ＭＡＧＥ－Ａ４とガンキリンとの間の結合に依存し、ガンキリンとＭＡＧＥ－Ａ４との間の相互作用がガンキリン媒介発癌を阻害することを示唆している。腫瘍組織におけるＭＡＧＥ発現は腫瘍発生の原因ではなく結果である可能性が高く、ＭＡＧＥ遺伝子は早期の腫瘍細胞を破壊のために標的化することによって免疫プロセスに関与する。

【0200】

黒色腫関連抗原４タンパク質（ＭＡＧＥＡ４）は、胚発育ならびに腫瘍形質転換および／または進行に関与し得る。ＭＡＧＥＡ４は通常、睾丸および胎盤で発現される。しかしながら、ＭＡＧＥＡ４は、多くの異なる種類の腫瘍、例えば黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、肺癌、および乳癌において発現し得る。したがって、ＭＡＧＥＡ４は、様々な腫瘍に関連する抗原であり得る。

【0201】

ＭＡＧＥＡ４抗原は、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価抗体応答を誘導することができ、それによって、抗原を発現するがんまたは腫瘍に対して指向される、または反応性である免疫応答を誘導または誘発することができる。いくつかの実施形態では、誘導または誘発された免疫応答は、細胞性、体液性、または細胞性および体液性免疫応答の両方であり得る。いくつかの実施形態では、誘導または誘発された細胞性免疫応答は、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）の誘導または分泌を含むことができる。他の実施形態では、誘導または誘発免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、これらに限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０およびＴＦＧ－β、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞を上方制御する因子を低減または阻害することができる。

【0202】

ＭＡＧＥＡ４抗原は、それらを特に免疫原として有効にするタンパク質エピトープを含むことができ、これに対して抗ＭＡＧＥＡ４免疫応答を誘導することができる。ＭＡＧＥＡ４抗原は、完全長翻訳産物、そのバリアント、その断片、またはその組み合わせを含み得る。ＭＡＧＥＡ４抗原は、コンセンサスタンパク質を含み得る。

【0203】

コンセンサスＭＡＧＥＡ４抗原をコードする核酸配列は、コドン使用および対応するＲＮＡ転写物に関して最適化され得る。コンセンサスＭＡＧＥＡ４抗原をコードする核酸は、発現のために最適化されたコドンおよびＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、コンセンサスＭＡＧＥＡ４抗原をコードする核酸配列は、翻訳の効率を増加させるために、コザック配列（例えばＧＣＣ ＡＣＣ）を含み得る。コンセンサスＭＡＧＥＡ４抗原をコードする核酸は、翻訳終結の効率を増加させるために複数の終止コドン（例えばＴＧＡ ＴＧＡ）を含み得る。

【0204】

（ｈ）ＦＳＨＲ
卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）は、卵巣顆粒腫細胞内の女性において選択的に発現される抗原であり（Ｓｉｍｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ．１９９７，１８：７３９－７７３）、卵巣内皮で低レベル発現される（Ｖａｎｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５：１３５８－１３６６）。最も重要なことは、この表面抗原は、卵巣癌の５０～７０％で発現する。

【0205】

様々な実施形態では、ＦＳＨＲ抗原は、コンセンサスタンパク質またはコンセンサスタンパク質をコードする核酸分子を含む。ＦＳＨＲ抗原には、ＦＳＨＲ抗原に相同の配列、ＦＳＨＲ抗原の断片、およびＦＳＨＲ抗原の断片に相同の配列を有するタンパク質が挙げられる。

【0206】

（ｉ）腫瘍微小環境抗原
いくつかのタンパク質は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－β）、およびグリピカン－１（ＧＰＣ１）を含むがこれらに限定されない、腫瘍微小環境において過剰発現される。ＦＡＰは、ヒト癌の９０％を超えるがん関連線維芽細胞において上方制御されるゼラチナーゼおよびペプチダーゼ活性を有する膜結合酵素である。ＰＤＧＦＲ－βは、胚発生、血管新生、細胞増殖および分化を含む多くの生物学的プロセスの調節における役割を有する細胞表面チロシンキナーゼ受容体である。ＧＰＣ１は、がん細胞で濃縮された細胞表面プロテオグリカンである。

【0207】

ｃ．抗体
本明細書により詳細に記載される所望の抗原と結合または反応し得る抗体が、本明細書に提供される。抗体は、重鎖および軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得、それぞれ、ＣＤＲに支持を提供し、互いに対してＣＤＲの空間関係を画定する重鎖および軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間に挿入される。ＣＤＲセットは、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含み得る。重鎖または軽鎖のＮ末端から進行すると、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含み得る。

【0208】

抗体は、本発明の組成物を投与された対象において疾患または感染症に対し治療、予防、および／または保護することができる。抗体は、抗原と結合することによって、組成物を投与された対象において疾患または感染症に対し治療、予防、および／または保護することができる。抗体は、組成物を投与された対象において疾患の生存期間を促進することができる。一実施形態では、抗体は、抗体を投与されていない疾患を有する対象の予想される生存期間よりも、対象における疾患の増加した生存期間を提供することができる。様々な実施形態では、抗体は、組成物の不在下で予想される生存期間よりも、組成物を投与された対象における疾患の生存期間に少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％増加を提供することができる。一実施形態では、抗体は、抗体を投与されていない対象の予想される保護よりも、対象における疾患に対して増加した保護を提供することができる。様々な実施形態では、抗体は、組成物の不在下で予想される保護よりも、組成物を投与された対象の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％における疾患に対して保護することができる。

【0209】

タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を得、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）はそれぞれ、無傷の抗原結合部位を含む共有ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）_２断片を含むいくつかの断片を提供することができる。したがって、抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。

【0210】

抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。

【0211】

抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原と結合する非ヒト種由来の抗体であり得る。

【0212】

抗体は、本明細書により詳細に記載される二重特異性抗体であり得る。抗体は、また本明細書により詳細に記載される二機能性抗体であり得る。

【0213】

上に記載されるように、抗体は、組成物を対象に投与すると、対象において生成され得る。抗体は、対象内で半減期を有し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、対象内のその半減期を延長または短縮するように修飾されてもよい。そのような修飾は、本明細書により詳細に記載される。

【0214】

抗体は、本明細書により詳細に記載されるように脱フコシル化され得る。

【0215】

抗体は、本明細書により詳細に記載されるように、抗原に関連する疾患の抗体依存性増強（ＡＤＥ）を低減または予防するために修飾され得る。

【0216】

（１）核酸合成抗体
また、抗体を産生するために使用するための核酸配列抗体が本明細書に提供される。一実施形態において、抗体は、哺乳動物細胞中で産生され得るか、または細菌、酵母、およびウイルスベクターを含むＤＮＡまたはＲＮＡベクター中で送達され得る。

【0217】

一実施形態では、組成物は、抗体、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む。組成物は、それを必要とする対象に投与される場合、対象における合成抗体の生成をもたらすことができる。合成抗体は、対象に存在する標的分子（すなわち、抗原）と結合することができる。そのような結合は、抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸による抗原の認識をブロックし、抗原に対する免疫応答を誘発または誘導することができる。

【0218】

一実施形態では、組成物は、合成抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、組成物は、第１の合成抗体をコードする第１のヌクレオチド配列および第２の合成抗体をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。一実施形態では、核酸分子は、切断ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0219】

組成物は、それを必要とする対象に投与される場合、体液性免疫応答を誘導するために抗原を投与される対象における内因性抗体の生成よりも、対象における合成抗体の生成をより迅速にもたらすことができる。組成物は、体液性免疫応答を誘導するために抗原を投与された対象における内因性抗体の生成の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日前に合成抗体の生成をもたらすことができる。

【0220】

組換え核酸配列は、異種核酸配列であり得る。組換え核酸配列は、１つ以上の異種核酸配列を含み得る。

【0221】

組換え核酸配列は、最適化核酸配列であり得る。そのような最適化は、抗体の免疫原性を増加または変化させることができる。最適化はまた、転写および／または翻訳を改善することができる。最適化は、以下：転写を増加させるための低ＧＣ含量リーダー配列、ｍＲＮＡ安定性およびコドン最適化、増加した翻訳のためのｋｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣ ＡＣＣ）の付加、シグナルペプチドをコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列の付加、内部ＩＲＥＳ配列の付加、ならびに可能な限りのｃｉｓ作用配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）の排除のうちの１つ以上を含み得る。

【0222】

組換え核酸配列コンストラクトは、重鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含み得る。組換え核酸配列コンストラクトは、軽鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含み得る。組換え核酸配列コンストラクトはまた、プロテアーゼまたはペプチダーゼ切断部位をコードする異種核酸配列も含み得る。組換え核酸配列コンストラクトはまた、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする異種核酸配列も含み得る。ＩＲＥＳは、ウイルスＩＲＥＳまたは真核ＩＲＥＳのいずれかであり得る。組換え核酸配列コンストラクトは、各リーダー配列がシグナルペプチドをコードする１つ以上のリーダー配列を含み得る。組換え核酸配列コンストラクトは、１つ以上のプロモーター、１つ以上のイントロン、１つ以上の転写終結領域、１つ以上の開始コドン、１つ以上の終結もしくは停止コドン、および／または１つ以上のポリアデニル化シグナルを含み得る。組換え核酸配列コンストラクトはまた、１つ以上のリンカーまたはタグ配列を含み得る。タグ配列は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグをコードすることができる。

【0223】

発現すると、例えば、これらに限定されないが、細胞、生物、または哺乳動物において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、合成抗体に組み立てることができる。特に、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、組み立てによって抗原に結合することができる合成抗体がもたらされるように互いに相互作用することができる。他の実施形態では、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、組み立てによって、本明細書に記載されるように組み立てられていない抗体と比較してより免疫原性である合成抗体がもたらされるように互いに相互作用することができる。さらに他の実施形態では、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、組み立てによって抗原に対する免疫応答を誘発または誘導することができる合成抗体がもたらされるように互いに相互作用することができる。

【0224】

５．ベクター
上に記載される組換え核酸配列コンストラクトは、１つ以上のベクターに配置することができる。１つ以上のベクターは、複製起点を含み得る。１つ以上のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。１つ以上のベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに統合するベクターのいずれかであり得る。

【0225】

ベクターは、これらに限定されないが、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、組換え「裸のＤＮＡ」ベクターの任意の形態などを含む。「ベクター」は、細胞に感染、トランスフェクト、一時的または永久的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは、裸の核酸、またはタンパク質もしくは脂質と複合体化された核酸であり得ることが認識されるであろう。ベクターは任意に、ウイルスもしくは細菌核酸および／もしくはタンパク質、ならびに／または膜（例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど）を含む。ベクターは、これに限定されないが、ＤＮＡの断片が付着し、複製され得る、レプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）を含む。ベクターはよって、これらに限定されないが、ＲＮＡ、自律自己複製環状または線状ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、プラスミド、ウイルスなど、例えば、米国特許第５，２１７，８７９号を参照されたい）を含み、発現および非発現プラスミドの両方を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、直鎖ＤＮＡ、酵素ＤＮＡ、または合成ＤＮＡを含む。組換え微生物または細胞培養物が「発現ベクター」の宿主となるものとして記載される場合、これは、染色体外環状および線状ＤＮＡならびに宿主染色体（複数可）に組み込まれたＤＮＡの両方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持されている場合、ベクターは、自律構造として有糸分裂中に細胞によって安定に複製され得るか、または宿主のゲノム内に組み込まれるかのいずれかである。

【0226】

１つ以上のベクターは、異種発現コンストラクトであり得、これは一般的には、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドである。発現ベクターが細胞内に入ると、組換え核酸配列コンストラクトによってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドが、細胞転写および翻訳機構リボソーム複合体によって産生される。１つ以上のベクターは、多量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、およびしたがってタンパク質を発現することができる。

【0227】

ａ．発現ベクター
１つ以上のベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であり得る。環状プラスミドおよび線状核酸は、適切な対象細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を誘導することができる。組換え核酸配列コンストラクトを含む１つ以上のベクターは、キメラであり得、その構成要素のうちの少なくとも１つが、その他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して異種であることを意味する。

【0228】

ｂ．プラスミド
１つ以上のベクターは、プラスミドであり得る。プラスミドは、細胞を組換え核酸配列コンストラクトでトランスフェクトするために有用であり得る。プラスミドは、組換え核酸配列コンストラクトを対象に導入するために有用であり得る。プラスミドはまた、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現に十分に適し得る、制御配列を含み得る。

【0229】

プラスミドはまた、プラスミドを染色体外に維持し、細胞においてプラスミドの複数のコピーを産生するために、哺乳動物の複製起点を含み得る。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐＶＡＸ、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であり得、これは、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス複製起点および核抗原ＥＢＮＡ－１コード領域を含み得、これは、統合なしに高コピーエピソーム複製を産生し得る。プラスミドの骨格は、ｐＡＶ０２４２であり得る。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであり得る。

【0230】

プラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生に使用され得る、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。プラスミドはまた、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生に使用され得る、ｐ ＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。プラスミドは、昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用され得る、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものであり得る。プラスミドはまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるタンパク質産生に使用され得る、ｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。

【0231】

ｃ．ＲＮＡ
一実施形態では、核酸は、ＲＮＡ分子である。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるＤＮＡ配列から転写される。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、配列番号１、３、５、７、もしくはそのバリアント、またはその断片のうちの１つに少なくとも９０％相同なＤＮＡ配列によってコードされる。したがって、一実施形態では、本発明は、ＭＡｂまたはＤＭＡｂのうちの１つ以上をコードするＲＮＡ分子を提供する。ＲＮＡは、プラス鎖であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、逆転写などの任意の介在複製ステップを必要とすることなく細胞によって翻訳することができる。本発明で有用なＲＮＡ分子は、５′キャップ（例えば、７－メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、ＲＮＡのインビボ翻訳を向上させることができる。本発明で有用なＲＮＡ分子の５′ヌクレオチドは、５′三リン酸基を有し得る。キャップＲＮＡでは、これは、５′－５′架橋を介して７－メチルグアノシンに連結され得る。ＲＮＡ分子は、３′ポリ－Ａテールを有し得る。それはまた、その３′末端近くにポリ－Ａポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。本発明で有用なＲＮＡ分子は、一本鎖であり得る。本発明で有用なＲＮＡ分子は、合成ＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、裸ＲＮＡ分子である。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、ベクター内に含まれる。

【0232】

一実施形態では、ＲＮＡは、５’および３’ＵＴＲを有する。一実施形態では、５’ＵＴＲは、０～３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加される５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、これらに限定されないが、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲのプライマーを設計することを含む、異なる方法によって変更することができる。このアプローチを用いて、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後の最適な翻訳効率を達成するために必要な５’および３’ＵＴＲ長を修飾することができる。

【0233】

５’および３’ＵＴＲは、目的の遺伝子についての天然発生型、内因性５’および３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の遺伝子に内因性ではないＵＴＲ配列は、ＵＴＲ配列をフォワードおよびリバースプライマーに組み込むことによって、またはテンプレートの任意の他の修飾によって付加することができる。目的の遺伝子に内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を修飾するために有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列におけるＡＵ富化エレメントは、ＲＮＡの安定性を増加させることができることが知られている。したがって、３’ＵＴＲは、当該技術分野において周知であるＵＴＲの特性に基づいて転写されたＲＮＡの安定性を増加させるように選択または設計することができる。

【0234】

一実施形態では、５’ＵＴＲは、内因性遺伝子のＫｏｚａｋ配列を含み得る。あるいは、目的の遺伝子に内因性ではない５’ＵＴＲが、上記のＰＣＲによって付加されている場合、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、５’ＵＴＲ配列を付加することによって再設計することができる。Ｋｏｚａｋ配列は、いくつかのＲＮＡ転写物の翻訳の効率を増加させることができるが、全てのＲＮＡについて効率的な転写を可能にするために必要とされるわけではないようである。多くのＲＮＡのＫｏｚａｋ配列の要件は、当該技術分野において知られている。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡウイルスに由来し得、このＲＮＡゲノムは、細胞において安定である。他の実施形態では、様々なヌクレオチド類似体は、ＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために３’または５’ＵＴＲにおいて使用することができる。

【0235】

一実施形態では、ＲＮＡは、５’末端および３’ポリ（Ａ）テールの両方にキャップを有し、これは、リボソーム結合、翻訳の開始、および細胞におけるＲＮＡの安定性を決定する。

【0236】

一実施形態では、ＲＮＡは、ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、例えば、安定性の増加、自然免疫原性の低さまたは不在、および翻訳の向上を含む、非修飾ＲＮＡに対する特定の利点を有する。

【0237】

ｄ．環状および線状ベクター
１つ以上のベクターは、細胞ゲノムへの統合によって標的細胞を形質転換するか、または染色体外に存在し得る、１つ以上の環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）であり得る。ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであるか、または組換え核酸配列コンストラクトによってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／もしくは軽鎖ポリペプチドを発現することができる任意の他の発現ベクターであり得る。

【0238】

エレクトロポレーションを介して対象に効率的に送達し、かつ組換え核酸配列コンストラクトによってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現することができる、線状核酸、または線状発現カセット（「ＬＥＣ」）もまた本明細書に提供される。ＬＥＣは、リン酸骨格が全くない任意の線状ＤＮＡであり得る。ＬＥＣは、任意の抗生物質耐性遺伝子および／またはリン酸骨格を含まない場合がある。ＬＥＣは、所望の遺伝子発現に関連していない他の核酸配列を含まない場合がある。

【0239】

ＬＥＣは、線状化することができる任意のプラスミドに由来し得る。プラスミドは、組換え核酸配列コンストラクトによってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現することができる場合がある。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであるか、または組換え核酸配列コンストラクトによってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／もしくは軽鎖ポリペプチドを発現することができる任意の他の発現ベクターであり得る。

【0240】

ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）およびｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。

【0241】

ｅ．ウイルスベクター
一実施形態では、本発明の核酸を細胞に送達することができるウイルスベクターが本明細書において提供される。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）、ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載される。ベクターとして有用であるウイルスは、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスを含む。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択可能なマーカーを含む。（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、および米国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい。）ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および５，５８５，３６２号を参照されたい。

【0242】

ｆ．ベクターを調製する方法
組換え核酸配列コンストラクトが配置されている１つ以上のベクターを調製するための方法が本明細書に提供される。最終サブクローニングステップ後、ベクターは、当該技術分野における既知の方法を用いて、大規模発酵タンクにおける細胞培養物を接種するために使用することができる。

【0243】

他の実施形態では、最終サブクローニングステップ後、ベクターは、１つ以上のエレクトロポレーション（ＥＰ）デバイスで使用することができる。ＥＰデバイスは、本明細書でより詳細に本明細書に記載される。

【0244】

１つ以上のベクターは、既知のデバイスおよび技法の組み合わせを用いて製剤化または製造することができ、２００７年５月２３日に出願された、米国仮特許出願米国特許出願第６０／９３９，７９２号に記載されるプラスミド製造技法を用いて製造され得る。いくつかの例では、本明細書に記載されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化することができる。製造技術はまた、２００７年７月３日に発行された、米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般に知られている様々なデバイスおよびプロトコルを含むか、または組み込む。上記の出願および特許、それぞれ米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それらの全体において本明細書に組み込まれる。

【0245】

６．合成抗体の生成方法
本発明はまた、合成抗体の生成方法に関する。方法は、組成物を、それを必要とする対象に、本明細書により詳細に記載される送達方法を使用することによって投与することを含み得る。したがって、合成抗体は、対象に組成物を投与すると、対象においてまたはインビボで生成される。

【0246】

方法はまた、組成物を１つ以上の細胞に導入することを含み得、したがって、合成抗体は、１つ以上の細胞内で生成または産生され得る。方法は、組成物を１つ以上の組織、例えば、これらに限定されないが、皮膚および筋肉に導入することをさらに含み得、したがって、合成抗体は、１つ以上の組織において生成または産生され得る。

【0247】

７．組成物の賦形剤および他の構成成分
組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得、これは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。

【0248】

トランスフェクション促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含む、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸であり、ポリ－Ｌ－グルタミン酸は、組成物中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在し得る。トランスフェクション促進剤はまた、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞を含み得、ヒアルロン酸はまた、組成物と共に投与されて使用され得る。組成物はまた、脂質などのトランスフェクション促進剤、レシチンリポソームもしくは、ＤＮＡ－リポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照されたい）として、当該技術分野で知られている他のリポソームを含む、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。トランスフェクション促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含む、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。組成物中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。

【0249】

薬学的に許容される賦形剤は、本発明のチェックポイント阻害剤抗体に加えてアジュバントであり得る。追加のアジュバントは、代替的なプラスミドで発現されるか、または組成物において上記のプラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される他の遺伝子であり得る。アジュバントは、α－インターフェロン（ＩＦＮ－α）、β－インターフェロン（ＩＦＮ－β）、γ－インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、シグナル配列が削除され、任意選択的にＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ－１５を含むＣＤ８６からなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＰＤ－１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0250】

本発明の抗体に加えて有用なアジュバントとなり得る他の遺伝子には、以下をコードするものが含まれる：ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｐ、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１８の変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ－７、ＩＬ－２２、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、非アクティブＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的フラグメント。

【0251】

組成物は、参照により完全に組み込まれる、１９９４年４月１日に出願された米国特許出願第０２１，５７９号に記載される遺伝子促進剤をさらに含み得る。

【0252】

組成物は、ＤＮＡを約１ナノグラム～１００ミリグラム、約１マイクログラム～約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム～約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム～約２ミリグラムの量で含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による組成物は、約５ナノグラム～約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、約１０ナノグラム～約８００マイクログラムのＤＮＡを含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、約０．１～約５００マイクログラムのＤＮＡを含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、約１～約３５０マイクログラムのＤＮＡを含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、約２５～約２５０マイクログラム、約１００～約２００マイクログラム、約１ナノグラム～１００ミリグラム、約１マイクログラム～約１０ミリグラム、約０．１マイクログラム～約１０ミリグラム、約１ミリグラム～約２ミリグラム、約５ナノグラム～約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム～約８００マイクログラム、約０．１～約５００マイクログラム、約１～約３５０マイクログラム、約２５～約２５０マイクログラム、約１００～約２００マイクログラムのＤＮＡを含み得る。

【0253】

組成物は、使用される投与の様式に従って製剤化され得る。注射可能な薬学的組成物は、滅菌、パイロジェンフリー、および無粒子であり得る。等張性製剤または溶液が使用され得る。等張性のための添加剤は、塩化物、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。組成物は、血管収縮剤を含み得る。等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。組成物は、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定化剤をさらに含み得る。安定化剤は、ＬＧＳまたはポリカチオンもしくはポリアニオンを含む製剤が室温または周囲温度で長時間にわたって安定であることを可能にし得る。

【0254】

８．インビボ翻訳後修飾の方法
本発明はまた、対象における合成タンパク質を翻訳後修飾する方法に関する。対象における合成タンパク質の翻訳後修飾は、生物学的に活性なタンパク質を提供することによって対象における疾患を治療および／または予防するために使用することができる。方法は、本明細書に開示される組成物を対象に投与することを含み得る。組成物を投与された対象は、翻訳後修飾なしで投与された対象と比較して増加または増強されたタンパク質活性を有することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質活性は、約０．５倍～約１５倍、約０．５倍～約１０倍、または約０．５倍～約８倍増加させることができる。あるいは、組成物が投与された対象におけるタンパク質活性は、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、または少なくとも約１５．０倍増加させることができる。

【0255】

さらに他の代替の実施形態では、組成物が投与された対象におけるタンパク質活性は、約５０％～約１５００％、約５０％～約１０００％、または約５０％～約８００％増加させることができる。他の実施形態では、組成物が投与された対象におけるタンパク質活性は、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、少なくとも約１０００％、少なくとも約１０５０％、少なくとも約１１００％、少なくとも約１１５０％、少なくとも約１２００％、少なくとも約１２５０％、少なくとも約１３００％、少なくとも約１３５０％、少なくとも約１４５０％、または少なくとも約１５００％増加させることができる。

【0256】

用量は、１μｇ～１０ｍｇの活性成分／ｋｇ体重／回であり得、２０μｇ～１０ｍｇの成分／ｋｇ体重／回であり得る。組成物は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のための用量の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。

【0257】

９．組成物の送達方法
本発明はまた、組成物をそれを必要とする対象に送達する方法に関する。送達方法は、組成物を対象に投与することを含み得る。投与は、これらに限定されないが、インビボエレクトロポレーションを伴う、および伴わないＤＮＡ注入、リポソーム媒介送達、ならびにナノ粒子促進送達を含み得る。

【0258】

組成物の送達を受ける哺乳動物は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ（ｃｏｗ）、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、バイソン、ウシ（ｂｏｖｉｄ）、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリであり得る。

【0259】

組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、口腔内投与を介した、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、鼻腔内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせを含む、異なる経路によって投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的診療に従って、適切に許容される製剤として投与され得る。獣医は、特定の動物に最も適切な投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「微粒子衝撃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎ）」、またはエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与されてもよい。

【0260】

ａ．エレクトロポレーション
エレクトロポレーションを介した組成物の投与は、可逆的な孔を細胞膜内に形成させるのに有効なエネルギーのパルスを、哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得るエレクトロポレーションデバイスを使用して達成することができ、好ましくは、エネルギーのパルスは、使用者による予め設定された電流入力と同様の定電流である。エレクトロポレーションデバイスは、エレクトロポレーション構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを備え得る。エレクトロポレーション構成要素は、コントローラ、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力エレメント、状態報告エレメント、通信ポート、メモリ構成要素、電源、および電源スイッチを含む、エレクトロポレーションデバイスの様々なエレメントのうちの１つ以上を含み、組み込み得る。エレクトロポレーションは、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にするために、インビボエレクトロポレーションデバイス、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレータ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）を使用して達成され得る。

【0261】

エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーションデバイスの１つのエレメントとして機能し得、他のエレメントは、エレクトロポレーション構成要素と通信する別個のエレメント（または構成要素）である。エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーションデバイスの２つ以上のエレメントとして機能し得、エレクトロポレーション構成要素とは別個のエレクトロポレーションデバイスのさらに他のエレメントと通信し得る。１つの電気機械デバイスまたは機械デバイスの一部として存在するエレクトロポレーションデバイスのエレメントは、エレメントが１つのデバイスとして、または互いに通信する別個のエレメントとして機能することができるため、限定されなくてもよい。エレクトロポレーション構成要素は、所望の組織内に定電流を生成するエネルギーのパルスを送達することが可能であってもよく、フィードバックメカニズムを含む。電極アセンブリは、空間的に配置された複数の電極を有する電極アレイを含んでよく、電極アセンブリは、エレクトロポレーション構成要素からエネルギーのパルスを受信し、電極を通じて所望の組織にそれを送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中に中性であり、所望の組織のインピーダンスを測定し、そのインピーダンスをエレクトロポレーションコンポーネントに伝達する。フィードバックメカニズムは、測定されたインピーダンスを受信し得、エレクトロポレーション構成要素によって送達されるエネルギーのパルスを調節して、定電流を維持することができる。

【0262】

複数の電極は、分散パターンでエネルギーのパルスを送達し得る。複数の電極は、プログラムされた配列下で電極の制御を通じて分散パターンのエネルギーのパルスを送達し得、プログラムされた配列は、使用者によってエレクトロポレーション構成要素に入力される。プログラムされた配列は、配列中に送達される複数のパルスを含んでもよく、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスのその後のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つによって送達される。

【0263】

フィードバックメカニズムは、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実行され得る。フィードバックメカニズムは、アナログ閉ループ回路によって実行され得る。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に発生するが、好ましくは、リアルタイムフィードバックまたは即時（すなわち、応答時間を決定するための利用可能な技法によって決定されるように実質的に即時）である。中性電極は、所望の組織内のインピーダンスを測定し、フィードバックメカニズムにインピーダンスを伝達し得、フィードバックメカニズムは、インピーダンスに応答し、定電流を予め設定された電流と同様の値に維持するためにエネルギーパルスを調節する。フィードバックメカニズムは、エネルギーのパルスの送達中に連続的かつ即時的に定電流を維持し得る。

【0264】

本発明の組成物の送達を促進し得るエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション方法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらによって提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されるものを含み、それらの内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。組成物の送達を促進するために使用され得る他のエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション方法は、米国特許法第１１９条（ｅ）下で、２００６年１０月１７年に出願された、米国仮特許出願第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日に出願された、同第６０／９７８，９８２号の優先権を主張する、２００７年１０月１７日に出願された、同時係属中の、共同所有される米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されるものを含み、これらの全ては、それらの全体において本明細書に組み込まれる。

【0265】

Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、モジュラー電極システムと、生体または植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのそれらの使用について記載している。モジュラー電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極までの導電リンクを提供する電気コネクタ、および電源を含み得る。オペレータは、支持構造に取り付けられた複数の針電極をつかみ、それらを生体または植物の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次いで、生体分子は皮下注射針を介して選択された組織に送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラが作動し、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0266】

Ｓｍｉｔｈらによって提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に容易にするために使用され得るエレクトロポレーションデバイスを記載している。エレクトロポレーションデバイスは、その操作がソフトウェアまたはファームウェアによって特定される電気運動装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤデバイスは、ユーザ制御とパルスパラメータの入力に基づいて、アレイ内の電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを産生し、電流波形データの保存及び取得を可能にする。エレクトロポレーションデバイスはまた、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注射チャネル、および取り外し可能なガイドディスクを含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0267】

米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または器官への深部浸透のために適合され得る。電極アレイの構成のため、注射針（選択した生体分子を送達するため）も標的器官中に完全に挿入され、注射は、電極によって予め線引きされた領域で標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは長さ２０ｍｍおよび２１ゲージである。

【0268】

加えて、エレクトロポレーションデバイスおよびその使用を組み込むいくつかの実施形態で企図されるものには、以下の特許に記載されるものであるエレクトロポレーションデバイスがある：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日に発行された第６，９５８，０６０号、および２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号。さらに、様々なデバイスのうちのいずれかを用いるＤＮＡの送達に関する、２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡを注射する方法に注目した、２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号で提供される主題を包含する特許が、本明細書において企図される。上記の特許は、それらの全体が参照により組み込まれる。

【0269】

１０．治療方法
本明細書に記載される１つ以上の組成物を投与することによって、疾患、障害または感染症を治療、保護、および／または予防することを必要とする対象においてそれらを行う方法もまた本明細書に提供される。一実施形態では、方法は、合成タンパク質が対象において生成されるように、１つ以上の合成タンパク質コンストラクトを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、分泌タンパク質または合成抗原が免疫系によって異物として認識されるように、１つ以上の遺伝子コンストラクトおよびタンパク質を投与することを含み、免疫系は、１つ以上の抗原に対して作られた抗体を含むことができる免疫応答を組み込む。一実施形態において、方法は、１つ以上のＤＭＡｂコンストラクトを投与することを含む。一実施形態において、方法は、１つ以上の修飾タンパク質コンストラクトを投与することを含む。

【0270】

一実施形態では、合成タンパク質をコードする核酸および修飾タンパク質をコードする核酸を投与することは、生物学的に活性な翻訳後修飾された合成タンパク質を提供する。方法は、組成物を対象に投与することを含み得る。対象への組成物の投与は、上に記載される送達方法を使用して行われ得る。

【0271】

一態様では、本発明は、疾患または障害を治療、保護、および／または予防する方法を提供し、合成タンパク質は、疾患または障害を治療する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＩＶウイルス感染症を治療、保護、および／または予防する方法を提供する。一実施形態では、方法は、ＨＩＶに関連する疾患を治療、保護、および／または予防する。一実施形態では、ＨＩＶを治療または予防する方法は、合成ｅＣＤ４－Ｉｇタンパク質をコードする核酸、および本明細書の他の箇所に記載されるＴＰＳＴ２をコードする核酸を投与することを含む。

【0272】

対象における合成タンパク質および修飾タンパク質の生成時、修飾抗体は、合成タンパク質を翻訳後修飾することができる。そのような修飾は、合成タンパク質の酵素、結合、または抗原提示活性を活性化し、それによって対象において疾患を治療、保護、および／または予防することができる。

【0273】

組成物用量は、１μｇ～１０ｍｇの活性成分／ｋｇ体重／回であり得、２０μｇ～１０ｍｇの成分／ｋｇ体重／回であり得る。組成物は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のための組成物用量の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。

【0274】

組成物は、タンパク質をコードする１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上の核酸を含み得る。組成物は、修飾タンパク質をコードする１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上の核酸を含み得る。

【0275】

合成タンパク質をコードする核酸および修飾タンパク質をコードする核酸は、同時にまたは異なる時間に投与され得る。一実施形態では、合成タンパク質をコードする核酸および修飾タンパク質をコードする核酸は、同時に投与される。一実施形態では、合成タンパク質をコードする核酸は、修飾タンパク質をコードする核酸の前に投与される。一実施形態では、修飾タンパク質をコードする核酸は、合成タンパク質をコードする核酸の前に投与される。

【0276】

ある特定の実施形態において、合成タンパク質をコードする核酸は、修飾タンパク質をコードする核酸が投与されてから１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、または１４日以上後に投与される。ある特定の実施形態では、合成タンパク質をコードする核酸は、修飾タンパク質をコードする核酸が投与されてから１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上、９週間以上、または１０週間以上後に投与される。ある特定の実施形態において、合成タンパク質をコードする核酸は、修飾タンパク質をコードする核酸が投与されてから１ヶ月以上、２ヶ月以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上、５ヶ月以上、６ヶ月以上、７ヶ月以上、８ヶ月以上、９ヶ月以上、１０ヶ月以上、１１ヶ月以上、または１２ヶ月以上後に投与される。

【0277】

ある特定の実施形態において、修飾タンパク質をコードする核酸は、合成タンパク質をコードする核酸が投与されてから１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、または１４日以上後に投与される。ある特定の実施形態では、修飾タンパク質をコードする核酸は、合成タンパク質をコードする核酸が投与されてから１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上、９週間以上、または１０週間以上後に投与される。ある特定の実施形態において、修飾タンパク質をコードする核酸は、合成タンパク質をコードする核酸が投与されてから、１ヶ月以上、２ヶ月以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上、５ヶ月以上、６ヶ月以上、７ヶ月以上、８ヶ月以上、９ヶ月以上、１０ヶ月以上、１１ヶ月以上、または１２ヶ月以上後に投与される。

【0278】

ある特定の実施形態では、修飾タンパク質をコードする核酸および合成タンパク質をコードする核酸は、１回投与される。ある特定の実施形態では、修飾タンパク質をコードする核酸および／または合成タンパク質をコードする核酸は、２回以上投与される。ある特定の実施形態では、修飾タンパク質をコードする核酸および合成タンパク質をコードする核酸の投与は、即時、持続的、および全身的免疫応答を提供する。

【0279】

組成物用量は、１μｇ～１０ｍｇの活性成分／ｋｇ体重／回であり得、２０μｇ～１０ｍｇの成分／ｋｇ体重／回であり得る。組成物は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のための組成物用量の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。

【実施例】

【0280】

実施例１：エレクトロポレーションによる合成ＤＮＡ送達は、広範に中和する抗ＨＩＶイムノアドヘシンＥＣＤ４－ＩＧの強固なインビボ硫酸化を促進する
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションは、インビトロでのＲｅＣＤ４－Ｉｇの発現および分泌を可能にする
Ｎ末端ＩｇＧカッパリーダー配列を有するＲｅＣＤ４－Ｉｇをコードする導入遺伝子を設計し、次いでデノボで合成し、ｐＧＸ００００１骨格プラスミドにクローニングした。導入遺伝子ヌクレオチド配列を、マウスおよびヒトならびにｍＲＮＡ転写産物構造および安定性の両方におけるコドンバイアスについて最適化した（Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。Ｎ末端ＩｇＧリーダー配列は、導入遺伝子の小胞体への標的化を容易にするために組み込まれ、分泌を促進する。（Ｈａｒｙａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＲｅＣＤ４－Ｉｇの強固な発現が、細胞溶解物および上清中で観察された（図１Ａ～Ｂ）。抗ヒトＩｇＧによるトランスフェクト上清のウェスタンブロットは、トランスフェクト細胞によるＲｅＣＤ４－Ｉｇの分泌を裏付けている（図１Ｃ）。

【0281】

ＤＮＡコードＲｅＣＤ４－ＩｇおよびＴＰＳＴ２バリアントによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共トランスフェクションにより、ＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビトロ硫酸化が可能になる
チロシン硫酸化は、特定のチロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ）酵素の独自の集合によって触媒される特定の翻訳後修飾である。ヒトには、２つの異なるＴＰＳＴアイソフォーム（ＴＰＳＴ１およびＴＰＳＴ２）が存在する。それらの機能は完全には理解されていないが、これらの酵素は、タンパク質半減期の修飾、タンパク質処理、およびタンパク質－タンパク質相互作用の修飾を含むいくつかの重要なタンパク質生物学的活性化の変化に関与する。関連性として、ＣＣＲ５の硫酸化は、細胞表面におけるＨＩＶ結合および侵入修飾において重要な役割を果たす。生物学的折り畳み、ｅＣＤ４－Ｉｇの結合、およびｇｐ１２０に対する活性に重要なＲｅＣＤ４－Ｉｇが硫酸化されるように誘導され得るかどうかを決定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、プラスミドをコードするＲｅＣＤ４－Ｉｇ（ｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇ）、ならびにｐ－ＴＰＳＴ２、ｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２、ｐ－ΔＴＭ－ＴＰＳＴ２、およびｐ－ＨＳ３ＳＡをコードする４つの異なるヒト酵素コンストラクトで共トランスフェクトした。ＲｅＣＤ４－Ｉｇは、ＩｇＧリーダー配列による翻訳プロセスの初期に分泌経路を標的とするため、ＲｅＣＤ４－Ｉｇのチロシン硫酸化は、ＴＰＳＴ２バリアントが細胞分泌区画のうちの少なくとも１つで発現される場合にのみ生じるべきである。ＴＰＳＴ２を右細胞下区画に標的化する能力を強調するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐ－ＲｅＣＤ４－ＩｇおよびＴＰＳＴ２酵素バリアントをコードするプラスミドで共トランスフェクトした。Ｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２は、ＴＰＳＴ２の上流に組み込まれたＩｇＥリーダー配列を有するコンストラクトであり、ＩｇＥリーダー配列が翻訳中にＴＰＳＴ２の小胞体への輸送を容易にするため、ＲｅＣＤ４－Ｉｇを硫酸化することが予測された。膜貫通（ＴＭ）モチーフ、ｐ－ΔＴＭ－ＴＰＳＴ２に欠失を有する第２のＴＰＳＴ２コンストラクトは、硫酸ＲｅＣＤ４－ＩｇがＴＰＳＴ２を分泌区画に標的化するのに必要なシグナルアンカー配列を除去するため、ＲｅＣＤ４－Ｉｇを硫酸化するとは予測されなかった。最後に、対照プラスミド、ｐ－ＨＳ３ＳＡを試験した。ＨＳ３ＳＡは、硫酸基をヘパリン硫酸塩に移行することができ、ＴＰＳＴ２と比較して同様の触媒部位を有するゴルジ耐性酵素である（Ｔｅｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。様々な用量のＤＮＡにコードされた酵素（１：５０００～１：２０、酵素：ＲｅＣＤ４－Ｉｇ）を使用して、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの硫酸化を最大化するために必要な酵素の最小用量を決定した。細胞上清に抗スルホチロシン結合ＥＬＩＳＡを使用して、ベースラインのＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独群と比較して、１：５０００の最低酵素用量であってもＴＰＳＴ２およびＩｇＥ－ＴＰＳＴ２群の両方においてより高い硫酸化が観察された（図１Ｄ）。さらに、ＴＰＳＴ２およびＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の両方において、硫酸化シグナルは顕著な１：１０００酵素用量で飽和し、より高い用量のＤＮＡにコードされた酵素は、硫酸化の増加に寄与しなかった。比較すると、仮説と一致して、ΔＴＭ－ＴＰＳＴ２およびＨＳ３ＳＡ群の両方においてＲｅｃＣＤ４－Ｉｇ硫酸化は、最も高い１：２０酵素用量であってもベースラインよりも高くはなかった。ＨＳ３ＳＡ基による硫酸化の欠如は、スルホトランスフェラーゼの顕著な特異性を示す。ＲｅＣＤ４－Ｉｇの酵素媒介性硫酸化をさらに確認するために、上清をウェスタンブロットで分析したが、下のパネル内の抗ヒトＩｇＧバンドが負荷対照として役立つ（図１Ｆ）。再び、１：１０００ＴＰＳＴ２およびＩｇＥ－ＴＰＳＴ２基について、ＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独、ΔＴＭ、およびＨＳ３ＳＡ基よりも強いスルホチロシンバンドが観察された。まとめると、これらの結果は、ＤＮＡコードＴＰＳＴ２およびＩｇＥ－ＴＰＳＴ２が、ＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビトロ硫酸化を著しく低い用量で媒介し得ることを示唆している。

【0282】

Ｎ末端ＩｇＥリーダー配列の組み込みは、ＴＰＳＴ２のＴＧＮへの標的化を増強する
蛍光顕微鏡を使用して、ＤＮＡにコードされた酵素が細胞分泌区画に移動できるかどうか、およびＩｇＥ配列が標的化を改善するかどうかを判定した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独、またはＴＰＳＴ２、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２、もしくはΔＴＭ－ＴＰＳＴ２と組み合わせたＲｅＣＤ４－Ｉｇでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を回収し、ＤＡＰＩ（青色）、抗ＴＰＳＴ２（赤色）、および抗ゴルジン９７（緑色）で染色した。採取した細胞の共焦点顕微鏡画像は、トランスフェクション時のＴＰＳＴ２、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２およびΔＴＭ－ＴＰＳＴ２の強固な発現を示す（図２Ａ）。より重要なことに、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２は、ＴＰＳＴ２よりも大きくゴルジン９７で局在化するように見えるが、ΔＴＭ－ＴＰＳＴ２は、ゴルジン９７で局在化しない。ゴルジン９７バリアントとＴＰＳＴ２バリアントとの間で共局在化の程度を定量化するために、赤色チャネルと緑色チャネルとの間のピアソン相関係数を、各群に対し１６個の関心領域について分析した（図２Ｂ）。ΔＴＭ－ＴＰＳＴ２、ＴＰＳＴ２およびＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の平均ピアソン係数は、それぞれ、０．１６１、０．２７５、および０．５４２である。一元配置分散分析からの計算されたＦ統計は、７９．６７であり、これは、２および４５の処置ならびに残存自由度を有するｐ値＜０．０００１にそれぞれ対応する。Ｈｏｌｍ調整を用いた事後対Ｔ検定は、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２群のピアソン係数が、ＴＰＳＴ２群のピアソン係数より有意に高いことを示している（ｐ＜１０^－６）。さらに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は酵素のみでトランスフェクトされ、ゴルジン９７によるＴＰＳＴ２、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２、およびΔＴＭ－ＴＰＳＴ２の局在化パターンは、細胞をＲｅＣＤ４－Ｉｇで共トランスフェクトしたときのパターンと同様であることが決定された（図２Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＴＰＳＴ２およびＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の両方がＴＧＮに移動し得るが、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２は、ＴＰＳＴ２よりも効率的に分泌区画を標的化し得ることを示唆している。この知見は、ＴＰＳＴ２（その膜貫通ドメインでもある）の内部シグナルアンカー配列よりも効率的に、Ｎ末端ＩｇＥリーダー配列がシグナル認識粒子（ＳＲＰ）により認識されることを裏付けている。ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２コンストラクトを、インビボ実験におけるさらなる研究のために選択した。分泌区画へのＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の改善された標的化、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の細胞質発現、およびオフターゲット効果は、おそらく低減された。

【0283】

ＤＮＡ／ＥＰは、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２およびＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビボ発現を可能にする
次に、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２およびＲｅＣＤ４－Ｉｇが、ＤＮＡの筋肉内注入、続いてエレクトロポレーションによってインビボで発現され得るかどうかを決定した。一時的に枯渇したｂａｌｂ／ｃマウスに対してＤＮＡコードＩｇＥ－ＴＰＳＴ２を脛骨前筋（ＴＡ）に注射し、続いて、前述のように、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）３Ｐデバイスを使用して筋肉内エレクトロポレーション（ＩＭ－ＥＰ）を行った。注射の１週間後、マウスを屠殺し、ウェスタンブロットで筋肉内のＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の発現を検出した。対側脚のＴＡ筋肉もまた、比較のために分析した。注射筋肉における約４３ｋＤａのＩｇＥ－ＴＰＳＴ２（ヒト形態）の強い発現、および約４２ｋＤａの対側ＴＡにおける内因性マウスＴＰＳＴ２の発現が観察された（図３Ａ）。結果は、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２発現が治療される全ての動物において一貫して観察されるため、ＤＮＡ／ＥＰ媒介送達の堅牢性を実証している。ＲｅＣＤ４－Ｉｇが再送達され得るかどうかを決定するために、Ｂ６．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｊ（ヌード）マウスにｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇを注射した。ＲｅＣＤ４－Ｉｇ配列はＲｈＭベースであるため、強力な抗薬物抗体は、免疫能のあるマウスにおいて発達し、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの発現プロファイルに影響を及ぼし得る。したがって、免疫不全Ｂ６．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｊ（ヌード）を使用して、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの初期インビボ発現を決定した。ＲｅＣＤ４－Ｉｇの高レベルの発現が観察され、これは、注射後１４日目に３５ｕｇ／ｍＬでピークに達した（ｄ．ｐ．ｉ）（図３Ｂ）。顕著なことに、５．７ｕｇ／ｍＬの３ｄ．ｐ．ｉのレベルが検出され、発現が少なくとも１５０日間続き、最後の時点で３．１ｕｇ／ｍＬのレベルであった。ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＲｅＣＤ４－Ｉｇの同様の発現プロファイルは、ヌードマウスと比較して、特に早い時点で観察された（４２ｄ．ｐ．ｉまで）。ｂａｌｂ／ｃにおけるＲｅＣＤ４－Ｉｇ発現は、後の時点でヌードマウスよりもわずかに低いが、ｂａｌｂ／ｃにおける発現は、１５０日間検出可能である。

【0284】

低用量のＤＮＡコードＩｇＥ－ＴＰＳＴ２は、ＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビボ硫酸化を可能にし得る
次に、ＲｅＣＤ４－Ｉｇを硫酸化するＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の能力をインビボで試験した。ｂａｌｂ／ｃマウスを一時的に枯渇させ、様々な用量のｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２と共製剤化したｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇを筋肉内に与え、続いてＩＭ－ＥＰを行った。インビトロ実験と同一のＩｇＥ－ＴＰＳＴ２のＤＮＡ用量（ＲｅＣＤ４－Ｉｇ用量に対して１：５０００～１：２０）を使用して、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの硫酸化を最適化するのに必要な最小レベルの酵素を研究した。１：１０００用量のＩｇＥ－ＴＰＳＴ２は、１：２０ ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２群と比較して検出された硫酸化ＯＤ４５０シグナルを飽和させることができる（図３ｃ）。さらに、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの硫酸化は、ベースラインのＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独群と比較して、より低い１：５０００用量の酵素であっても有意に高かった。以前の研究では、高用量のＴＰＳＴ２およびその標的タンパク質（ｅＣＤ４－Ｉｇまたはトリプシノゲン）のインビトロでの共トランスフェクションは、標的タンパク質の分泌の減少をもたらすことが報告されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｒｏｎａｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。インビトロおよびインビボ実験の両方で同様の現象が観察された（図１Ｅおよび図３Ｄ）。ＲｅＣＤ４－Ｉｇと共トランスフェクトした高用量（１：２０）のＩｇＥ－ＴＰＳＴ２は、ＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独群と比較して、トランスフェクション上清およびマウス血清中のＲｅＣＤ４－Ｉｇの発現をそれぞれ６７％および７０％減少させた。さらに、ＲｅＣＤ４－Ｉｇ分泌の抑制は、ＲｅＣＤ４－Ｉｇと、ＲｅＣＤ４－Ｉｇを硫酸化できない酵素であるＨＳ３ＳＡ（図１Ｄ）の１：２０ＤＮＡ用量との同時投与が依然として、ＲｅＣＤ４－Ｉｇ発現の５２％の減少をもたらすため、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２媒介性硫酸化によって直接駆動されない（図３Ｆ）。しかしながら、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの最適な硫酸化に必要な１：１０００の最小用量では、ＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独とＲｅＣＤ４－Ｉｇ＋１：１０００ ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２群７ｄ．ｐ．ｉとの間のＲｅＣＤ４－Ｉｇ発現において差は観察されなかった（図３Ｄ）。ＲｅＣＤ４－Ｉｇ発現が低用量でＩｇＥ－ＴＰＳＴ２との共トランスフェクションの影響を受けなかったことを確認するために、注射されたマウスにおけるＲｅＣＤ４－Ｉｇの血清発現を、経時的にｐＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独またはｐＲｅＣＤ４－Ｉｇ＋１：１０００ ｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２のいずれかで追跡した（図３ｅ）。再び、両群において同様のＲｅＣＤ４－Ｉｇ発現プロファイルが観察された。まとめると、これらの結果は、エレクトロポレーションによって送達されるプラスミドにコードされた酵素が、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの発現プロファイルに影響を及ぼさない、著しく低い用量でのＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビボ硫酸化を可能にし得ることを示している。

【0285】

インビボ硫酸化は、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの効力を増加させる
次に、エクスビボ中和アッセイにおいて注射されたマウスの血清を分析することによって、ＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビボ硫酸化がその効力を増強し得るかどうかを判定した。十分なマウス血清を収集するために、ｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇ単独で、または１：１０００用量のｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２と組み合わせてｂａｌｂ／ｃに注射し、７ｄ．ｐ．ｉで末端で出血させた。再び、両群のマウス血清中に同様のレベルのＲｅＣＤ４－Ｉｇ（４０ｕｇ／ｍＬ）が観察された。まず、マウス血清中のＲｅＣＤ４－Ｉｇがグローバルパネルからの偽ウイルスのうちの１つを中和する能力（２５７１０、Ｔｉｅｒ ２、分岐群Ｃ）を、標準的なＴＺＭ－ｂｌアッセイを使用して試験した（ｄｅＣａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２によって媒介される硫酸化は、中和曲線の右方向のシフトによって証明されるように、ＲｅＣＤ４－Ｉｇがこの分離株を中和する能力を著しく増強することが見出された（図４Ｂ）。具体的には、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２によって媒介される硫酸化は、中和２５７１０におけるＲｅＣＤ４－ＩｇのＩＣ５０を１．０９±０．１２ｕｇ／ｍＬから０．１６±０．０６ｕｇ／ｍＬ（６．８倍の低下）に減少させ、ＩＣ８０を３．２７±０．６８ｕｇ／ｍＬから１．３５±０．２０ｕｇ／ｍＬ（２．４倍の低下）に減少させる。次に、ＲｅＣＤ４－Ｉｇがグローバルパネルからの他の分離株を中和することができるかどうか、およびｔｉｅｒ３分離株ＳＩＶ_{ｍａｃ２３９}を中和することができるかどうか、ならびにＩｇＥ－ＴＰＳＴ２媒介性硫酸化がＲｅＣＤ４－Ｉｇの効力を増強することができるかどうかを評価した。ＲｅＣＤ４－Ｉｇは、５ｕｇ／ｍＬ未満のＩＣ５０および０．８３ｕｇ／ｍＬの平均ＩＣ５０でパネル内の１３個全てのウイルスを中和することができることが観察された（図４Ｃ～Ｆ）。比較すると、ナイーブマウスの血清は、１：２０の力価でパネル内のウイルスを中和しなかった。さらに、血清中のＲｅＣＤ４－Ｉｇは、１：８の力価で（または同等には５ｕｇ／ｍＬのＲｅＣＤ４－Ｉｇ用量で）マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を非特異的に中和しなかった。これらの結果は、ｅＣＤ４－Ｉｇの顕著な幅を検証した。さらに、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの硫酸化は、グローバルパネル（ＣＥ１１７６、２５７１０、Ｘ２２７８、ＴＲＯ、ＢＪＯＸ、Ｘ１６３２、ＣＨ１１９、ＣＮＥ５５）およびＭａｃ２３９（図４Ｅ）における８／１２偽ウイルスの中和におけるその効力を増強する。硫酸化は、ＩＣ５０（０．５７±０．２７ｕｇ／ｍＬ～０．０５±０．０２ｕｇ／ｍＬ）の１０倍の低下を示すＣＥ１１７６の中和に最も劇的な効果を示す。全体的に、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２媒介性硫酸化は、ウイルスパネルに対するＩＣ５０の幾何平均の０．８３ｕｇ／ｍＬから０．２７ｕｇ／ｍＬへの低下をもたらす。まとめると、これらの結果は、機能的観点からＩｇＥ－ＴＰＳＴ２によるＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビボ硫酸化を検証し、ＤＮＡにコードされた酵素が翻訳後修飾を介して標的タンパク質の生物学的機能を調節する能力を実証した。

【0286】

インビボ翻訳後修飾
ｅＣＤ４Ｉｇ分子ならびに酵素ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の両方をコードするためのプラットフォームとしてＤＮＡ技術を使用して実験を設計し、インビボでＲｅＣＤ４－Ｉｇのチロシン硫酸化を行った。本明細書に提示される結果は、免疫アドヘシンの効力が著しく増加していることを実証し、そのような複合体分子の個別化された産生のための独自の方法を提供する。

【0287】

重要なことに、これは、インビボで直接産生するための標的タンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）のための酵素をコードするのにＤＮＡを使用する最初の報告である。したがって、これらの研究は、ＤＮＡ／ＥＰが、タンパク質が合成された後であってもタンパク質の機能を調節するための優れたプラットフォームを提供することを裏付けている。例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分のグリコシル化を修飾することは、潜在的に、エフェクター機能のインビボ微調整を可能にし得る。例えば、エンドグリコシダーゼ／フコシダーゼによるＩｇＧ１ Ｆｃのフコシル化は、修飾抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を潜在的に増強することができるが、一方で、コアフコシル化に関連して、末端シアリル化は逆の効果を示すことが報告されている（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ワクチン設計に関連して、抗原の翻訳後修飾は、免疫系による認識のための新しいエピトープを形成することができる。例えば、（ＨＩＶエンベロープのＮ１６０またはＮ１５６位での）シアル酸担持グリカンは、ＣＡＰ２５６．ＶＲＣ２６ ａｂ系統において、生殖細胞系コード化および体細胞変異抗体の両方によって認識され得る（Ａｎｄｒａｂｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。あるいは、ワクチン抗原の翻訳後修飾は、有効な免疫応答の組み込みを容易にするために、天然状態でそれらの立体構造を潜在的に安定化させることができる。ＨＩＶ－１ ＢａＬ上のＶ２残基のチロシン硫酸化は、Ｖ２－Ｖ３相互作用を強化し、トリマー優先抗体ＰＧ９、ＰＧ１６、およびＰＧＴ１４５による認識を改善し、抗Ｖ３抗体による中和に対するその感受性を低下させる一方で、そのチロシン硫酸化の減少は逆の効果を有する（Ｃｉｍｂｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。したがって、高度のＤＮＡ／ＥＰによってコードされる標的タンパク質の酵素媒介性翻訳後修飾により、様々な重要なタンパク質のインビボ活性の調節にアプローチすることができる可能性が高い。

【0288】

ＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビボ硫酸化には、１：１０００ｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の著しく低い用量が必要であることが実証されている。酵素の単一分子は、標的タンパク質の複数のコピーをターンオーバーすることができるはずであるため、この発見は予想された。具体的には、ＴＰＳＴ２は、５．１×１０^－３ｓ^－１（単硫酸化ＣＣＲ８ペプチドの場合）のターンオーバー数（ｋ_ｃａｔ）を有し、ゴルジ耐性酵素の半減期は約２０時間であるため、ＴＰＳＴ２酵素の単一コピーは、少なくとも数百コピーのＲｅＣＤ４－Ｉｇをターンオーバーすることができるはずである（Ｄａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｓｔｒｏｕｓ，１９８６）。注目すべきことに、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの硫酸化に必要な用量は、ＤＮＡコードＩｇＥ－ＴＰＳＴ２（１：１０００）において、ＡＡＶコードＴＰＳＴ２（１：４）よりもはるかに低い。これは、ＤＮＡ／ＥＰ媒介酵素送達の高効率を意味し、筋肉細胞が、ｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２およびｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇの両方の別個のコピーを同時に受容したことを意味する。これは、パルス電界が形質膜に一時的な細孔を形成し、ポリアニオンプラスミドＤＮＡを細胞内に直接移動させ、トランスフェクション効率が１００～１０００倍増加する可能性があるためである（Ｓａｒｄｅｓａｉ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，２０１１）。比較すると、ＡＡＶコード遺伝子材料（ＲｅＣＤ４－ＩｇおよびＴＰＳＴ２）の細胞への取り込みは、クラスリン依存性エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスを必要とし（Ｓｔｏｎｅｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、ＡＡＶ－ＴＰＳＴ２およびＡＡＶ－ｅＣＤ４－Ｉｇの両方による筋肉細胞の形質導入は、確率的な様式で生じ得る。

【0289】

結果はまた、酵素を特定の細胞下区画に標的化してその機能を最大化するアプローチを裏付けている。ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２媒介性硫酸化の効率は、ＴＰＳＴ２媒介性硫酸化の効率と同様に見えるが（図１Ｄ）、ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２の選択的標的化は、潜在的に、酵素の細胞質発現およびオフターゲット硫酸化を低減することができる。このアプローチは、治療および研究目的のために、他の細胞下区画までタンパク質を標的化するようにさらに拡張され得る。例えば、１０～７０個のアミノ酸からなるＮ末端配列は、タンパク質をミトコンドリアに標的化することができ、膜貫通タンパク質の細胞質尾部におけるジロイシンモチーフＤＸＸＬＬまたはチロシンベースのモチーフＹＸＸＯは、タンパク質をリソソームに標的化することができ、一方、ポプリペプチド鎖上の５個の塩基性正荷電アミノ酸の単位は、タンパク質を核に標的化することができる（Ｂｒａｕｌｋｅ ａｎｄ Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，２００９；Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｒｅｇｅｖ－Ｒｕｄｚｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0290】

最後に、ＤＮＡ／ＥＰが、ＲｅＣＤ４－Ｉｇのようなイムノアドヘシンの強固かつ長期のインビボ発現を可能にすることが本明細書で実証される。１ラウンドの注射で、マウスにおいて８０～１００ｕｇ／ｍＬのピーク発現レベルが観察され、レベルは１５０日間３ｕｇ／ｍＬ超を維持した。このインビボ送達は、５ｕｇ／ｍＬ未満のＩＣ５０および０．２７ｕｇ／ｍＬの平均ＩＣ５０でグローバルパネルからの全ての分離株を中和することができる、ＲｅＣＤ４－Ｉｇの妥当な幅および有効性をもたらす。

【0291】

要約すると、細胞の分泌区画に酵素を標的化するためのいくつかの進歩、ならびにそのインビボ発現のためのＤＮＡ／ＥＰの使用が説明され、有意なインビボ効力がもたらされる。重要なことに、送達されるＤＮＡ／ＥＰのＩｇＥ－ＴＰＳＴ２は、インビボでの翻訳後硫酸化を通じてｅＣＤ４－Ｉｇの効力を有意に増強することができ、ＨＩＶ感染を標的とするためのツールとしてのさらなる研究を必要とする可能性が高い。

【0292】

材料および方法をここで説明する。

【0293】

動物
６～８週齢の雌ｂａｌｂ／ｃおよびＢ６．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１ｎｕＪを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｉｍｇｔｏｎ、ＭＡ）またはＪａｃｋｓｏｎ研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）のいずれかから入手した。ＤＮＡ送達のために、一時的免疫調節用の５００ｕｇの抗マウスＣＤ４０Ｌ（クローンＭＲ－１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）をマウスに単回腹腔内注射した。次いで、１２Ｕのヒアルロニダーゼ（Ｈｙｌｅｎｅｘ、カタログ：１８６５７－１１７－０４）と共製剤化したＤＮＡ １６０ｕｇ（２回の注射、左および右ＴＡ）または３２０ｕｇ（４回の注射、左および右四頭筋、左および右ＴＡ）を投与した（２６，２７）。注射の１分後、Ｃｅｌｌｅｃｔｒａ ３Ｐデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で各注射部位にＩＭ－ＥＰを行った（Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ ａｎｄ Ｈｕｍｅａｕ，２０１５）。

【0294】

ＤＮＡ設計およびプラスミド合成
ＲｅＣＤ４－Ｉｇのタンパク質配列を、前述のように入手した（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ヒトＴＰＳＴ２およびＨＳ３ＳＡのタンパク質配列を、ＵｎｉＰｒｏｔ（受託番号：０６０７０４およびＱ９Ｙ６６３）から入手した。ＳＩＶ_{ｍａｃ２３９}のタンパク質配列をＧｅｎＢａｎｋ（受託番号Ｍ３３２６２）入手した。タンパク質配列をコードするＤＮＡを、前述のようにコドンおよびＲＮＡ最適化した（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。最適化された導入遺伝子をデノボ合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ヒトＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの制御下でｐＶＡＸ骨格にクローニングした。ＴＲＯ１１、２５７１０、３９８Ｆ１、ＣＮＥ８、Ｘ２２７８、ＢＪＯＸ２０００、Ｘ１６３２、ＣＥ１１７６、２４６Ｆ３、ＣＨ１１９、ＣＥ０２１７、およびＣＮＥ５５のＨＩＶエンベロープｇｐ１６０をコードするプラスミドをＮＩＨ－ＡＩＤＳ試薬から得、Ａｌｄｅｖｒｏｎ ＬＬＣ（Ｆａｒｇｏｎ、ＮＤ）で増幅した。

【0295】

細胞株、トランスフェクション、およびＲｅＣＤ４－Ｉｇ精製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＣＲＬ－３２１６、ＡＴＣＣ）およびＴＺＭ－ｂｌ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で維持し、３７℃および５％ＣＯ_２で増殖させた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をＥｘｐｉ２９３発現培地中で３７℃および８％ＣＯ_２で維持した。ＲｅＣＤ４－Ｉｇのインビトロ硫酸化を決定するために、細胞を６ウェルプレート中０．５×１０^６細胞／ｍＬの密度で播種し、１．０μｇのｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇおよび様々な用量のプラスミドにコードされた酵素をＧｅｎｅＪａｍｍｅｒでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、上清を収集し、１５００ｇで５分間遠心分離して、細胞残渣を除去した。付着細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いた１×細胞溶解緩衝液で溶解した。定量ＥＬＩＳＡのＲｅＣＤ４－Ｉｇ標準を得るために、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をＥｘｐｉ２９３発現培地中で２．５×１０^６細胞／ｍＬの密度でプレーティングし、一晩休息させ、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ中でｐ－ＲｅＣＤ４－ＩｇおよびＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後にトランスフェクションエンハンサーを添加し、トランスフェクションの５日後に上清を採取した。磁気タンパク質Ｇビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をＲｅＣＤ４－Ｉｇの精製に使用し、純度をＳＤＳ－ＰａｇｅゲルのＣｏｍｍａｓｓｉｅ染色で確認した。

【0296】

ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡに基づくＲｅＣＤ４－Ｉｇの定量化のために、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを４℃で一晩、ｌｕｇ／ｍＬのＪＲ－ＦＬ ｇｐ１４０でコーティングした。プレートをリン酸緩衝生理食塩水＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ－Ｔ）で４回洗浄し、室温で１時間、ＰＢＳ中１０％ＦＢＳでブロックした。その後、プレートを洗浄し、ＰＢＳ－Ｔ中に希釈した血清試料と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、２次ヤギ抗ヒトＦｃ ＨＲＰと１：５０００希釈液で１時間インキュベートした。その後、プレートをＳｉｇｍａＦａｓｔ ＯＰＤで１０分間発色させた後、ＯＤ４５０測定をＳｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダーで行った。

【0297】

トランスフェクション上清または血清中のＲｅＣＤ４－Ｉｇの硫酸化を検出するために、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを４℃で一晩、５ｕｇ／ｍＬのＪＲ－ＦＬ ｇｐ１４０でコーティングした。プレートを洗浄し、室温で３時間、１０％ＦＢＳ／ＰＢＳでブロックした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ－Ｔ中で希釈した試料を室温で１時間インキュベートするために添加した。プレートを再び洗浄し、１：２５０希釈のマウス抗スルホチロシン抗体（クローン１Ｃ－Ａ２、ＭｉｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）と共に室温で１時間インキュベートした。このステップでの長時間のインキュベーションは、バックグラウンドを増加させ得ることを発見した。最後に、プレートを洗浄し、１：５０００希釈の抗マウスＩｇＧ２ａ ＨＲＰ二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。プレートをＳｉｇｍａＦａｓｔ ＯＰＤで１０分間発色し、ＯＤ４５０シグナルを測定した。

【0298】

ウェスタンブロット
図１ＣにおけるＲｅＣＤ４－Ｉｇの検出のために、１０μＬのトランスフェクション上清を、非還元条件下でプレキャストの４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上に充填し、湿潤移送によりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＦＬ ＰＶＤＦ膜に移した。ＲｅＣＤ４－Ｉｇを、１：１０，０００希釈でＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｒｈｅｓｕｓ ＩｇＧ２ Ｆｃと交差反応する）と共に同定した。ＲｅＣＤ４－Ｉｇ中の硫酸化チロシンの検出のために（図１Ｅ）、膜を１：１０００マウス抗スルホチロシン（１Ｃ－Ａ２）と共に４℃で一晩インキュベートし、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤヤギ抗マウスＩｇＧで発色させた。抗マウス抗体および抗ヒト抗体が異なる色を有する染料にコンジュゲートされるため、単一の膜において同時にＲｅＣＤ４－Ｉｇおよびスルホチロシンバンドを可視化することが可能である。ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２発現の検出のために、ＤＮＡ注入／ＩＭ－ＥＰの７日後にマウスを屠殺した。ＴＡ筋肉を採取し、Ｔ－ＰＥＲ抽出緩衝液およびプロテアーゼ阻害剤中で均質化した。５０μｇの筋肉ホモジネートを還元条件下で４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上に充填し、湿潤移送によりＰＶＤＦ膜に移した。膜を、ポリクローナルウサギ抗ＴＰＳＴ２抗体、およびモノクローナルマウス抗ＧＡＰＤＨ抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。その後、膜をＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧで発色させた。全ての膜をＯｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘでスキャンした。

【0299】

蛍光顕微鏡
８ウェルチャンバスライド（Ｎｕｎｃ）をポリ－Ｌ－リシン溶液で事前コーティングした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１ウェル当たり２×１０^５の密度で一晩播種した。次いで、細胞を、１．０ｕｇのｐ－ＲｅＣＤ４－Ｉｇおよび０．０５ｕｇのｐ－ＴＰＳＴ２、ｐ－ＩｇＥ－ＴＰＳＴ２、またはｐ－ΔＴＭ－ＴＰＳＴ２でＧｅｎｅＪａｍｍｅｒでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を固定し、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００で透過させ、室温で１時間ＰＢＳ中３％ＢＳＡでブロックした。次いで、細胞を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ－Ｔ中の抗ゴルジン９７抗体の１：２００希釈、およびポリクローナルウサギ抗ＴＰＳＴ２抗体の１：２００希釈で４℃で一晩染色した。次いで、細胞をＰＢＳ－Ｔで洗浄し、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４およびヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の１：５００希釈で染色した。核染色のために、細胞をＰＢＳ－Ｔ中０．５ｕｇ／ｍＬのＤＡＰＩとインキュベートし、Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｄｉａｍｏｎｄ ＡｎｔｉＦａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔを使用してカバースリップで取り付けた。次いで、６４×対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ ＩＩ走査共焦点顕微鏡でＺスタック画像を取得した。Ｚスタックの最大投影、デコンボリューション、および関心領域分析を、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳＸソフトウェアを用いて行い、ピアソン相関係数を取得して、ＴＰＳＴ２およびゴルジン９７の共局在化を定量化した。

【0300】

エクスビボ中和アッセイ
ＨＩＶ Ｅｎｖ偽型ウイルスおよびＴＺＭ－ｂｌアッセイの合成を、前述のように行った（Ｓａｒｚｏｔｔｉ－Ｋｅｌｓｏｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、４ｕｇのＨＩＶエンベロープをコードするプラスミドおよび８ｕｇのＨＩＶ骨格をコードするプラスミド（ｐＳＧ３Δｅｎｖ）を、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、上清をＳｔｅｒｉｆｌｉｐで濾過し、－８０℃で保管した。Ｂｒｉｔｅｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓを使用したＴＺＭ－ｂｌルシフェラーゼレポーターアッセイで偽ウイルスを滴定して、少なくとも１５０，０００ＲＬＵに対応する力価を決定した。マウス血清をＴＺＭ－ｂｌ中和アッセイのために５６℃で１０分間加熱不活性化して、５０％のウイルス中和（ＩＣ５０）をもたらす血清濃度／力価を決定した。

【0301】

統計学
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０で（複数の比較の場合はＨｏｌｍ－Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いて）一元配置分散分析および対Ｔ検定を行った。Ｐｒｉｓｍ ７．０を使用して、中和パーセンテージ対対数（血清希釈の逆数）の非線形回帰モデルでＩＣ_５０値を計算した。０．０５未満のｐ値は統計的に有意であるとみなされた。

【0302】

参考文献
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【0303】

本明細書で引用される各特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0304】

本発明は、特定の実施形態を参照して開示されたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態および変形形態が当業者によって案出され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような実施形態および等価の変形形態を含むように解釈されることを意図する。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【配列表】

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