特許 7620293 脳オルガノイド及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-15

(45)【発行日】2025-01-23

(54)【発明の名称】脳オルガノイド及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/079 20100101AFI20250116BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20250116BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250116BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20250116BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20250116BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20250116BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20250116BHJP

【ＦＩ】

C12N5/079

C12N5/071

C12N5/10

C12Q1/04

G01N33/15 Z

G01N33/50 Z

C12N15/12 ZNA

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2021554970

(86)(22)【出願日】2020-11-05

(86)【国際出願番号】 JP2020041351

(87)【国際公開番号】W WO2021090877

(87)【国際公開日】2021-05-14

【審査請求日】2023-06-23

(31)【優先権主張番号】P 2019201231

(32)【優先日】2019-11-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000004178

【氏名又は名称】ＪＳＲ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】598121341

【氏名又は名称】慶應義塾

(74)【代理人】

【識別番号】100149548

【弁理士】

【氏名又は名称】松沼 泰史

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(72)【発明者】

【氏名】平峯 勇人

(72)【発明者】

【氏名】岡野 栄之

(72)【発明者】

【氏名】塩澤 誠司

(72)【発明者】

【氏名】石川 充

【審査官】松井 一泰

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／０６３９８５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／０７６３８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００５／１２３９０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】GARCIA-LEON J. A., et al.，Generation of a human induced pluripotent stem cell-based model for tauopathies combining three micr，Alzheimer's and Dementia，2018年，Vol. 14，pp. 1261-1280，ISSN:1552-5260

【文献】NAKAMURA M., et al.，Pathological progression induced by the frontotemporal dementia-associated R406W tau mutation in pat，Stem Cell Reports，2019年，Vol. 13，pp. 684-699，ISSN:2213-6711

【文献】佐原成彦，タウオパチーマウスモデルを用いた脳タンパク質老化モデル評価系の確立，日本薬理学雑誌，2018年，Vol. 152，pp. 4-9，ISSN:0015-5691

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－ ３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

微小管関連タンパク質タウ（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｕ，ＭＡＰＴ）遺伝子のＮ２７９Ｋ及びＰ３０１Ｓのアミノ酸変異をコードするエクソン１０中の塩基配列の変異、並びにイントロン１０中の塩基配列の変異を有するヒト多能性幹細胞を浮遊培養する工程１を含む、脳オルガノイドの製造方法。

【請求項2】

前記イントロン１０中の塩基配列の変異が、Ｅ１０＋１６の塩基配列の変異である、請求項１に記載の脳オルガノイドの製造方法。

【請求項3】

前記工程１における浮遊培養を、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、及び形質転換因子β（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ β，ＴＧＦ－β）ファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む培地１中で行う、請求項１又は請求項２に記載の脳オルガノイドの製造方法。

【請求項4】

前記工程１の浮遊培養により形成した培養物を、Ｗｎｔシグナル伝達増強剤、及び細胞外マトリックスを含む培地２中で培養する工程２、及び
前記工程２の培養により形成した培養物を、細胞外マトリックスを含まない培地３中で培養する工程３、
を更に含む、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の脳オルガノイドの製造方法。

【請求項5】

請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の脳オルガノイドの製造方法により製造した脳オルガノイドを分散して分散物を得る工程４、及び
前記分散物を、タウタンパク質凝集物の存在下で培養する工程５、
を更に含む、脳オルガノイドの製造方法。

【請求項6】

前記工程５における培養を、前記分散物中に含まれる細胞１個あたり、前記タウタンパク質凝集物０．０００５ｎｇ～０．４ｎｇの存在下で行う、請求項５に記載の脳オルガノイドの製造方法。

【請求項7】

前記タウタンパク質凝集物が、リコンビナントタウタンパク質の凝集物を含む、請求項５又は請求項６に記載の脳オルガノイドの製造方法。

【請求項8】

前記リコンビナントタウタンパク質が、エクソン１０中に塩基配列の変異を有するＭＡＰＴ遺伝子にコードされたものである、請求項７に記載の脳オルガノイドの製造方法。

【請求項9】

前記工程５における培養を、リン酸化亢進試薬の存在下で行う、請求項５～請求項８のいずれか一項に記載の脳オルガノイドの製造方法。

【請求項10】

ミスフォールドした３リピートタウタンパク質及びミスフォールドした４リピートタウタンパク質を有し、
前記ミスフォールドした３リピートタウタンパク質が、リン酸化した３リピートタウタンパク質を含み、前記ミスフォールドした４リピートタウタンパク質が、リン酸化した４リピートタウタンパク質を含み、
ウエスタンブロッティング法で示される、前記リン酸化した４リピートタウタンパク質の検出シグナルが、前記リン酸化した３リピートタウタンパク質の検出シグナル１に対して１．２～３である、脳オルガノイド。

【請求項11】

前記リン酸化した４リピートタウタンパク質が、リン酸化した０Ｎ４Ｒタウタンパク質である、請求項１０に記載の脳オルガノイド。

【請求項12】

前記リン酸化した３リピートタウタンパク質が、リン酸化した０Ｎ３Ｒタウタンパク質である、請求項１０又は請求項１１に記載の脳オルガノイド。

【請求項13】

請求項１０～請求項１２のいずれか一項に記載の脳オルガノイドを被験物質と接触させる工程、及び前記被験物質が前記脳オルガノイドに及ぼす影響を検定する工程、を含む、薬効評価方法。

【請求項14】

前記脳オルガノイドを被験物質と接触させる工程の前に、請求項１０～請求項１２のいずれか一項に記載の脳オルガノイドを非ヒト哺乳動物の脳に移植する工程を含む、請求項１３に記載の薬効評価方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脳オルガノイド及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、脳オルガノイドの製造方法、脳オルガノイド、及び薬効評価方法に関する。本願は、２０１９年１１月６日に、日本に出願された特願２０１９－２０１２３１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

タウタンパク質は、ヒトでは１７番染色体に位置する微小管関連タンパク質タウ（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｕ、略して「ＭＡＰＴ」）遺伝子からの産物であり、神経軸索の構築と維持に寄与している。タウタンパク質は、微小管結合に関わる反復配列を３個有する３リピートタウタンパク質と、４個有する４リピートタウタンパク質に大別される。いずれも過剰にリン酸化されると微小管との結合能を失い、自己凝集する。そして、自己凝集物が脳内に大量に蓄積すると認知症を引き起こすと考えられている。

【0003】

タウタンパク質を有する培養神経細胞としては、ＭＡＰＴ遺伝子にＮ２７９Ｋ、Ｐ３０１Ｌ、及びＥ１０＋１６の３変異を導入した人工多能性幹細胞を２次元培養することで、リン酸化した３リピートタウタンパク質を有する培養神経細胞を製造する方法が知られている（非特許文献１参照）。

【0004】

また、ＭＡＰＴ遺伝子にＰ３０１Ｓ及びＥ１０＋１６の２変異を導入した人工多能性幹細胞を２次元培養することで、リン酸化した３リピートタウタンパク質を有する培養神経細胞を製造する方法が知られている（非特許文献２参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Verheyen A., et al., Genetically Engineered iPSC-Derived FTDP-17 MAPT Neurons Display Mutation-Specific Neurodegenerative and Neurodevelopmental Phenotypes, Stem Cell Reports, 11 (2), 363-379, 2018.

【文献】Garcia-Leon J. A., et al., Generation of a human induced pluripotent stem cell-based model for tauopathies combining three microtubule-associated protein TAU mutations which displays several phenotypes linked to neurodegeneration, Alzheimers Dement., 14 (10), 1261-1280, 2018.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

アルツハイマー病や、タウタンパク質の蓄積を伴う前頭側頭葉変性症（以下、「ＦＴＬＤ－ｔａｕ」ともいう。）の一種である神経原線維変化型老年期認知症では、３リピートタウタンパク質と４リピートタウタンパク質の両方が蓄積することが知られている。このため、培養神経細胞を用いたＦＴＬＤ－ｔａｕの病理解明や薬効評価では、リン酸化した３リピートタウタンパク質とリン酸化した４リピートタウタンパク質の両方が蓄積した脳オルガノイドが必要とされている。

【0007】

本発明は、リン酸化した３リピートタウタンパク質及びリン酸化した４リピートタウタンパク質が蓄積した脳オルガノイド及びその製造方法、並びに前記脳オルガノイドを用いた薬効評価方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は以下の実施形態を含む。
［１］微小管関連タンパク質タウ（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｕ，ＭＡＰＴ）遺伝子のエクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、及びエクソン１３からなる群より選択されるエクソン中の塩基配列の少なくとも１個以上、及びイントロン１０中の塩基配列の少なくとも１個以上に変異を有するヒト多能性幹細胞を浮遊培養する工程１を含む、脳オルガノイドの製造方法。
［２］前記エクソン中の塩基配列の変異が、２個以上の塩基配列の変異である、［１］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［３］前記エクソン中の塩基配列の変異が、Ｎ２７９Ｋ及びＰ３０１Ｓのアミノ酸変異をコードするエクソン１０中の塩基配列の変異を含む、［２］の脳オルガノイドの製造方法。
［４］前記イントロン１０中の塩基配列の変異が、Ｅ１０＋１６の塩基配列の変異を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［５］前記エクソン中の塩基配列の変異が、Ｎ２７９Ｋ及びＰ３０１Ｓのアミノ酸変異をコードするエクソン１０中の塩基配列の変異であり、前記イントロン１０中の塩基配列の変異が、Ｅ１０＋１６の塩基配列の変異である、［１］～［４］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［６］前記工程１における浮遊培養を、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、及び形質転換因子β（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ β，ＴＧＦ－β）ファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む培地１中で行う、［１］～［５］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［７］前記工程１の浮遊培養により形成した培養物を、Ｗｎｔシグナル伝達増強剤、及び細胞外マトリックスを含む培地２中で培養する工程２、及び、前記工程２の培養により形成した培養物を、細胞外マトリックスを含まない培地３中で培養する工程３、を更に含む、［１］～［６］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［８］［１］～［７］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法により製造した脳オルガノイドを分散して分散物を得る工程４、及び、前記分散物を、タウタンパク質凝集物の存在下で培養する工程５、を更に含む、脳オルガノイドの製造方法。
［９］前記工程５における培養を、前記分散物中に含まれる細胞１個あたり、前記タウタンパク質凝集物０．０００５ｎｇ～０．４ｎｇの存在下で行う、［８］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［１０］前記タウタンパク質凝集物が、リコンビナントタウタンパク質の凝集物を含む、［８］又は［９］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［１１］前記リコンビナントタウタンパク質が、エクソン１０中に塩基配列の変異を有するＭＡＰＴ遺伝子にコードされたものである、［１０］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［１２］前記工程５における培養を、リン酸化亢進試薬の存在下で行う、［８］～［１１］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［１３］ミスフォールドした３リピートタウタンパク質及びミスフォールドした４リピートタウタンパク質を有する脳オルガノイド。
［１４］前記ミスフォールドした３リピートタウタンパク質が、リン酸化した３リピートタウタンパク質を含み、前記ミスフォールドした４リピートタウタンパク質が、リン酸化した４リピートタウタンパク質を含む、［１３］に記載の脳オルガノイド。
［１５］ウエスタンブロット法で示される、前記リン酸化した４リピートタウタンパク質の検出シグナルが、前記リン酸化した３リピートタウタンパク質の検出シグナル１に対して０．５以上である、［１４］に記載の脳オルガノイド。
［１６］前記リン酸化した４リピートタウタンパク質が、リン酸化した０Ｎ４Ｒタウタンパク質である、［１４］又は［１５］に記載の脳オルガノイド。
［１７］前記リン酸化した３リピートタウタンパク質が、リン酸化した０Ｎ３Ｒタウタンパク質である、［１４］～［１６］のいずれかに記載の脳オルガノイド。
［１８］［１３］～［１７］のいずれかに記載の脳オルガノイドを被験物質と接触させる工程、及び前記被験物質が前記脳オルガノイドに及ぼす影響を検定する工程、を含む、薬効評価方法。
［１９］前記脳オルガノイドを被験物質と接触させる工程の前に、［１３］～［１７］のいずれかに記載の脳オルガノイドを哺乳動物の脳に移植する工程を含む、［１８］に記載の薬効評価方法。

【0009】

本発明は以下の実施形態を含むものであるということもできる。
［Ｐ１］微小管関連タンパク質タウ遺伝子のエクソン９～エクソン１３中の塩基配列の少なくとも１個以上、及びイントロン１０中の塩基配列の少なくとも１個以上に変異を有するミュータント人工多能性幹細胞又はその細胞凝集塊を浮遊培養する工程を含む、脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ２］前記エクソン９～エクソン１３中の塩基配列の変異が、２個以上の塩基配列の変異である、［Ｐ１］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ３］前記エクソン９～エクソン１３中の塩基配列の変異が、Ｎ２７９Ｋ及びＰ３０１Ｓのアミノ酸変異をコードするエクソン１０中の塩基変異を含む、［２］の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ４］前記イントロン１０中の塩基配列の変異が、１個以上の塩基配列の変異である、［Ｐ１］～［Ｐ３］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ５］前記イントロン１０中の塩基配列の変異が、Ｅ１０＋１６を含む変異である、［Ｐ４］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ６］前記ミュータント人工多能性幹細胞又はその細胞凝集塊を浮遊培養する工程が、前記ミュータント人工多能性幹細胞又はその細胞凝集塊を、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、及び形質転換因子β（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ β，ＴＧＦ－β）ファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む培地で浮遊培養する工程、細胞外マトリックスを含む培地で浮遊培養する工程、及び細胞外マトリックスを含まない培地で浮遊培養する工程、を含む、［Ｐ１］～［Ｐ５］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ７］前記細胞外マトリックスを含む培地が、細胞外マトリックスを混和させた培地である、［Ｐ６］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ８］前記細胞外マトリックスを含む培地が、ＴＧＦ－βファミリーシグナル伝達経路阻害剤、及びＷｎｔシグナル増強剤を含む培地である、［Ｐ７］に記載の脳オルガノイドの製造方法。
［Ｐ９］［Ｐ１］～［Ｐ８］のいずれかに記載の脳オルガノイドの製造方法により製造された脳オルガノイド。
［Ｐ１０］リン酸化した３リピートタウタンパク質及びリン酸化した４リピートタウタンパク質を有する脳オルガノイド。
［Ｐ１１］ウエスタンブロット法で示される前記リン酸化した４リピートタウタンパク質の検出シグナルが、前記リン酸化した３リピートタウタンパク質の検出シグナル１に対して０．５以上である、［Ｐ１０］に記載の脳オルガノイド。
［Ｐ１２］前記リン酸化した４リピートタウタンパク質が、リン酸化した０Ｎ４Ｒタウタンパク質である、［Ｐ１０］は［Ｐ１１］記載の脳オルガノイド。
［Ｐ１３］前記リン酸化した３リピートタウタンパク質が、リン酸化した０Ｎ３Ｒタウタンパク質である、［Ｐ１０］～［Ｐ１２］のいずれかに記載の脳オルガノイド。
［Ｐ１４］［Ｐ９］～［Ｐ１３］のいずれかに記載の脳オルガノイドを被験物質と接触させる工程、及び前記被験物質が前記脳オルガノイドに及ぼす影響を検定する工程、を含む、薬効評価方法。
［Ｐ１５］前記脳オルガノイドを被験物質と接触させる工程の前に、［Ｐ９］～［Ｐ１３］のいずれかに記載の脳オルガノイドを哺乳動物の脳に移植する工程を含む、［Ｐ１４］に記載の薬効評価方法。
［Ｐ１６］微小管関連タンパク質タウ遺伝子のエクソン９～エクソン１３中の塩基配列の少なくとも１個以上、及びイントロン１０中の塩基配列の少なくとも１個以上に変異を有するミュータント人工多能性幹細胞、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、及びＴＧＦ－βファミリーシグナル伝達経路阻害剤を含む培地、細胞外マトリックスを含む培地、及び細胞外マトリックスを含まない培地、を含む、脳オルガノイド製造用キット。

【発明の効果】

【0010】

本発明の１実施形態の脳オルガノイドの製造方法によれば、リン酸化した３リピートタウタンパク質及びリン酸化した４リピートタウタンパク質が蓄積した脳オルガノイドを製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、ヒト脳オルガノイドの作製スケジュールを示す模式図である。

【図2】図２は、実験例１２における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。

【図3】図３は、実験例１２における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。

【図4】図４は、実験例１３におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。

【図5】図５は、実験例１４におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。

【図6】図６（ａ）及び（ｂ）は、実験例１５における蛍光免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。

【図7】図７（ａ）及び（ｂ）は、実験例１５における蛍光免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。

【図8】図８は、実験例２０における蛍光免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。

【図9】図９は、実験例２０において、抗ＭＣ１抗体のシグナル強度（相対値）を数値化した結果を示すグラフである。

【図10】図１０は、実験例２０において、脳オルガノイド中の核の数（ＤＡＰＩ ｃｏｕｎｔｓ）及び抗ＭＣ１抗体により染色された顆粒（ＭＣ１ ｐｕｎｃｔａ）の数を算出した結果を示すグラフである。

【図11】図１１、実験例２０において、脳オルガノイドにおける、１細胞あたりの、抗ＭＣ１抗体により染色された顆粒の個数（ＭＣ１ ｐｕｎｃｔａ／ＤＡＰＩ ｃｏｕｎｔｓ）を算出した結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。

【0013】

本明細書で例示する各成分、例えば、培地中に含まれる成分や各工程で用いられる成分は、特に言及しない限り、それぞれ１種用いることができ、又は２種以上を併用して用いることができる。

【0014】

本明細書で、「Ａ～Ｂ」等の数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義であり、Ａ及びＢをその数値範囲に含むものとする。

【0015】

［脳オルガノイドの製造方法］
本実施形態の脳オルガノイドの製造方法は、ヒト微小管関連タンパク質タウ遺伝子（ＭＡＰＴ遺伝子）のエクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、及びエクソン１３からなる群（以下、「エクソン９～エクソン１３」という場合がある。）より選択されるエクソン中の塩基配列の少なくとも１個以上、及びイントロン１０中の塩基配列の少なくとも１個以上に遺伝子変異を有するヒト多能性幹細胞（ミュータントヒト多能性幹細胞、以下、「ｍｈＰＳＣｓ」ともいう。）を浮遊培養する工程１を有する。

【0016】

工程１の浮遊培養により細胞凝集塊を形成する。細胞凝集塊とは、２個以上の細胞が接着して形成された塊を意味する。細胞凝集塊を分化誘導することにより、脳オルガノイドを製造することができる。細胞凝集塊を分化誘導する方法としては、Ｗｎｔシグナル伝達増強剤、及び細胞外マトリクッス（以下、「ＥＣＭ」ともいう。）を含有する培地２中で培養する工程２、及び工程２の培養により形成した培養物を、ＥＣＭを含まない培地３中で培養する工程３を含む方法を挙げることができる。

【0017】

浮遊培養とは、培養細胞を培養用容器（以下、「培養器」ともいう。）の培養面に接着させない条件で、培養細胞が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養すること、及び当該培養を行う方法をいう。浮遊培養においては、三次元培養を行うことが好ましい。

【0018】

浮遊培養に用いる培養器としては、培養面が細胞非接着性の培養器であることが好ましい。培養面が細胞非接着性の培養器としては、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、スタックプレート、等の培養器の培養面の表面を、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー等で細胞非接着性処理したもの、及び凹凸で形状加工したものが挙げられる。浮遊培養に用いる培養器は、培養した細胞同士が凝集できるように、Ｖ底又はＵ底の培養器であることが好ましい。

【0019】

ｍｈＰＳＣｓは、野生型のヒト多能性幹細胞（以下、「ｈＰＳＣｓ」ともいう。）のゲノム中のＭＡＰＴ遺伝子のエクソン９～エクソン１３中の塩基配列の少なくとも１個（１塩基）以上、及びイントロン１０中の塩基配列の少なくとも１個（１塩基）以上を遺伝子改変することにより得られる。以下、遺伝子改変したＭＡＰＴ遺伝子を「改変ＭＡＰＴ遺伝子」ともいう。ｍｈＰＳＣｓは、拡大培養することができる。

【0020】

ｈＰＳＣｓとしては、ｈＥＳＣｓ（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、ｈｉＰＳＣｓ（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）が挙げられる。これらの中でもｈｉＰＳＣｓが好ましい。

【0021】

改変ＭＡＰＴ遺伝子のｈＰＳＣｓのゲノムへの導入は、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等を用いるゲノム編集技術により行うことができる。これらの中でも高い選択性で目的部位に標的遺伝子を挿入できることからＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が好ましい。

【0022】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、細菌や古細菌が有する、外部から侵入したウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、及びプラスミドＤＮＡ等の核酸に対する一種の獲得免疫として機能する座位を利用したシステムである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにより、改変ＭＡＰＴ遺伝子をホストＤＮＡに導入するには、ホストＤＮＡの導入部位を切断するためのベクターを作製する。そのためには、目的部位にＣａｓ９を誘導するガイドＲＮＡをコードする発現ベクター及びＣａｓ９タンパク質発現ベクターが必要である。これら２種類の発現ベクターと改変ＭＡＰＴ遺伝子を含むドナーＤＮＡとを導入することにより、目的部位が切断され、次いでドナーＤＮＡによる相同組換修復により、改変ＭＡＰＴ遺伝子が導入される。発現ベクターとしては、２種類の発現ベクターの代わりに、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の両方を発現する１種類のベクター（オールインワンベクター）を用いることができる。

【0023】

ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列（ドナーＤＮＡ）は、改変ＭＡＰＴ遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に作動可能に連結されていればよく、その長さは、通常、０．５ｋｂ～８ｋｂである。

【0024】

発現ベクターやドナーＤＮＡのｈＰＳＣｓへの導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気穿孔法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、及びＤＥＡＥ－デキストラン法が挙げられる。

【0025】

発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、及びｐＵＣ５７等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、及びｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、及びｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、及びバキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクターが挙げられる。

【0026】

改変ＭＡＰＴ遺伝子は、タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、薬剤選択マーカー遺伝子、及びそれらの組み合わせとともに導入することができる。タグ配列としては、蛍光タグ、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。特に、改変ＭＡＰＴ遺伝子に薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択により改変ＭＡＰＴ遺伝子導入が起きた細胞を効率よく選択できる。

【0027】

薬剤選択マーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒスティディノール耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられる。薬剤選択マーカー遺伝子をタグ配列に導入する場合、薬剤選択後、薬剤選択マーカー遺伝子タグ配列を除去することができる。

【0028】

ＭＡＰＴ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＧ＿００７３９８．１）は、ヒト１７番染色体長腕１７ｑ２１に存在し１６個のエクソンと、１５個のイントロンを有する。改変ＭＡＰＴ遺伝子は、ＭＡＰＴ遺伝子のエクソン９～エクソン１３中の塩基の少なくとも１個以上及びイントロン１０中の塩基の少なくとも１個以上を改変したものである。

【0029】

タウタンパク質の蓄積を伴う前頭側頭葉変性症の原因として、ＭＡＰＴ遺伝子の塩基配列の変異が複数知られている。そして、ＭＡＰＴ遺伝子の塩基配列変異部位としては、エクソン９～エクソン１３中の塩基配列、及びイントロン１０中の塩基配列の範囲に集中していることが知られている。

【0030】

改変ＭＡＰＴ遺伝子としては、エクソン９～エクソン１３中の塩基配列の少なくとも１個以上、及びイントロン１０中の少なくとも１個以上を改変したものを用いることができる。これらの中でもエクソン９～エクソン１３中の塩基配列の変異が、好ましくは２個以上、より好ましくは２個である。また、イントロン１０中の塩基配列の変異が、好ましくは１個以上、より好ましくは１個である。

【0031】

改変ＭＡＰＴ遺伝子の塩基配列の変異としては、エクソン９中の塩基配列の変異として、例えば、Ｋ２５７Ｖ、Ｋ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｌ２６６Ｖ、及びＧ２７２Ｖのアミノ酸変異をコードする塩基配列の変異；エクソン１０中の塩基配列の変異として、例えば、Ｎ２７９Ｋ、ΔＫ２８０、Ｌ２８４Ｌ、Ｎ２９６Ｎ、Ｎ２９６Ｈ、ΔＮ２９６、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｐ３０１Ｔ、Ｇ３０３Ｖ、Ｓ３０５Ｎ、及びＳ３０５Ｓのアミノ酸変異をコードする塩基配列の変異；エクソン１１中の塩基配列の変異として、例えば、Ｌ３１５Ｌ、Ｌ３１５Ｒ、Ｓ３２０Ｙ及びＳ３１０Ｆのアミノ酸変異をコードする塩基配列の変異；エクソン１２中の塩基配列の変異として、例えば、Ｖ３３７Ｍ、Ｅ３４２Ｖ、Ｇ３３５Ｖ、Ｇ３３５Ｓ、Ｑ３３６Ｒ及びＫ３６９Ｉのアミノ酸変異をコードする塩基配列の変異；エクソン１３中の塩基配列の変異として、Ｇ３８９Ｒ及びＲ４０６Ｗのアミノ酸変異をコードする塩基配列の変異；が挙げられる。また、イントロン１０中の塩基配列の変異としては、Ｅ１０＋３、Ｅ１０＋１１、Ｅ１０＋１２、Ｅ１０＋１３、Ｅ１０＋１４、Ｅ１０＋１６及びＥ１０＋１９が挙げられる。

【0032】

エクソン９～エクソン１３の中の塩基配列の変異としては、エクソン１０の塩基配列の変異が好ましく、エクソン１０中の塩基配列の変異としては、Ｎ２７９Ｋ及びＰ３０１Ｓが好ましい。イントロン１０中の塩基配列の変異としては、Ｅ１０＋１６が好ましい。これらの改変を行った改変ＭＡＰＴ遺伝子を用いることで、効率よくリン酸化した３リピートタウタンパク質及びリン酸化した４リピートタウタンパク質を有する脳オルガノイドを製造することができる。

【0033】

ｈｉＰＳＣｓは、ヒト体細胞を、公知の方法等により初期化することにより、多能性を誘導した細胞を意味する。

【0034】

初期化因子の組み合わせとしては、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃ）の組み合わせ、若しくはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びＬ－Ｍｙｃの組み合わせを挙げることができる。

【0035】

ｈｉＰＳＣｓとして、株化されたｈｉＰＳＣｓを用いることができる。２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、及び１２３１Ａ３細胞等の株化されたｈｉＰＳＣｓが、京都大学又はｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。また、ＰＣＰｈｉＰＳ７７１等の株化されたｈｉＰＳＣｓが、株式会社リプロセスより入手可能である。さらに、ＸＦｉＰＳ－Ｆ４４－３Ｆ－２等の株化されたｈｉＰＳＣｓが、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｌｏｓ ＩＩＩより入手可能である。

【0036】

拡大培養は、ｍｈＰＳＣｓを増殖させる操作である。拡大培養では、好ましくは、接着培養による二次元培養を行う。接着培養とは、細胞凝集塊と培養器の培養面との間に結合を作らせて行う培養である。拡大培養は、通常、３０℃～５０℃、二酸化炭素含有割合１体積％～１５体積％の環境下で行う。

【0037】

接着培養に用いる培養器としては、培養面が細胞接着性の培養器であること以外は上述したものと同様の培養器を用いることができる。接着性を向上させるための表面加工としては、例えば、ラミニンα５β１γ１、ラミニンα１β１γ１、ラミニン５１１Ｅ８等のラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ポリリジン、及びポリオルニチン等のコーティング、並びに正電荷処理が挙げられる。

【0038】

拡大培養に用いる培地（以下、「拡大培養培地」ともいう。）としては、フィーダーフリーの培地が好ましい。フィーダーフリーの培地としては、例えば、ｈＥＳ９培地、ｈＥＳ９ａ培地、及びｈＥＳＦ－ＦＸ培地等公知の培地、並びにＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｅｓ社製品名）、及びＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）等の市販品を挙げることができる。

【0039】

拡大培養培地には、細胞死を抑制するため、前記フィーダーフリーの培地で培養する前に、前記フィーダーフリー培地にＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養することができる。フィーダーフリー培地にＲＯＣＫ阻害剤を添加した培地を用いた場合、その培養期間は、長くとも５日間でよく、その後、ＲＯＣＫ阻害剤を含まないフィーダーフリー培地にて、通常１日間以上、好ましくは３日以上、培養する。

【0040】

ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（ＣＡＳ番号：１２９８３０－３８－２）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（ＣＡＳ番号：１０５６２８－０７－７）、Ｈ－１１５２（ＣＡＳ番号：８７１５４３－０７－６）、及びＷｆ－５３６（ＣＡＳ番号：５３９８５７－６４－２）、並びにこれらの誘導体が挙げられる。

【0041】

ＲＯＣＫ阻害剤の拡大培養培地への含有濃度は、通常、濃度が０．１μＭ～１００μＭ、好ましくは濃度が１μＭ～８０μＭ、より好ましくは濃度が５μＭ～５０μＭとなる量である。

【0042】

拡大培養を行う前に、ｍｈＰＳＣｓを分散することができる。分散とは、細胞を酵素処理や物理処理等の分散処理により、１００個以下の細胞集団、好ましくは５０個以下の細胞集団、より好ましくは単一細胞に分離させることをいう。分散処理としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、及び細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理は組み合わせることができる。これらの中でも、細胞分散液処理が好ましい。

【0043】

細胞分散液処理に用いる細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びパパイン等の酵素類；並びにエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液としては、例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ、及び株式会社ケー・エー・シー社製の神経細胞分散液Ａ（カタログ番号：ＳＢＭＢＸ０８０１Ｄ－２Ａ）が挙げられる。機械的分散処理としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。

【0044】

分散処理する前に、細胞死を防ぐために、細胞保護剤で処理することができる。細胞保護剤としては、例えば、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、以下、「ＦＧＦ」ともいう。）、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、以下「ＩＧＦ」ともいう。）、血清、及び血清代替物が挙げられる。

【0045】

工程１において、ｍｈＰＳＣｓを、培地１中で浮遊培養し、細胞凝集塊を形成する。以下、工程１の浮遊培養により形成される細胞凝集塊を、細胞凝集塊１ともいう。工程１で用いる培養器は、上述したものと同様の、培養面が細胞非接着性の培養器であることが好ましい。

【0046】

培地１は、Ｓｍａｄ１／５／９のリン酸化を伴うＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、及びＳｍａｄ２／３のリン酸化を伴うＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤を含有することが好ましい。培地１は、通常、基礎培地に、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤及びＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤等を添加して調製する。

【0047】

基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地；並びにこれらの混合培地を挙げることができる。

【0048】

ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤としては、例えば、コーディン、ノギン、フォリスタチン、ドルソモルフィン（６－［４－（２－ピペリジン－１－イル－エトキシ）フェニル］－３－ピリジン－４－イル－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン）、ＤＭＨ１（４－［６－（４－イソプロポキシフェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノリン、４－［６－［４－（１－メチルエトキシ）フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］－キノリン）、及びＬＤＮ１９３１８９（４－（６－（４－（ピペリジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリン）が挙げられる。これらの中でも、ドルソモルフィン、及びＬＤＮ１９３１８９が好ましい。

【0049】

培地１中に含まれるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、通常、０．５μＭ～１０μＭ、好ましくは０．７５μＭ～５μＭ、より好ましくは１μＭ～３μＭである。

【0050】

ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ｓｍａｄ２／３のリン酸化により伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質であり、ＴＧＦ－βＩ型受容体キナーゼ（ＡＬＫ５）のキナーゼ活性を選択的に阻害することができる物質が好ましい。ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤としては、例えば、Ａ８３－０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０－４３－６）、ＳＢ－４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、ＳＢ－５０５１２４（ＣＡＳ番号：６９４４３３－５９－５）、ＳＢ－５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９－２０－１）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ番号：３９６１２９－５３－６）、ＳＣ－２０３２９４（ＣＡＳ番号：６２７５３６－０９－０８）、ＳＤ－２０８（ＣＡＳ番号：６２７５３６－０９－８）、及びＳＪＮ２５１１（ＣＡＳ番号：４４６８５９－３３－２）が挙げられる。これらの中でも、Ａ８３－０１、及びＳＢ－４３１５４２が好ましい。

【0051】

培地１中に含まれるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の濃度は、通常、０．５μＭ～１０μＭ、好ましくは０．７５μＭ～５μＭ、より好ましくは１μＭ～３μＭである。

【0052】

培地１は、さらに、神経生物系サプリメント、培地サプリメント、血清、血清代替物、抗菌剤、並びにインスリン及びアルブミン等の血清由来のタンパク質等を含有することができる。

【0053】

神経生物系サプリメントとしては、例えば、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチノール、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＤＬ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、アルブミン、インシュリン及びトランスフェリンを含むＢ２７サプリメント（サーモフィッシャー社製品名）；並びにヒトトランスフェリン、ウシインシュリン、プロゲステロン、プトレシン、及び亜セレン酸ナトリウムを含むＮ２サプリメントが挙げられる。

【0054】

培地サプリメントとしては、例えば、Ｌ－グルタミン酸、及びＬ－グルタミン酸から得たジペプチドを含有する「ＧｌｕｔａＭａｘシリーズ」（サーモフィッシャー社製品名）等のグルタミン酸含有サプリメント、「ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（サーモフィッシャー社製品名）等のアミノ酸水溶液、並びに２－メルカプトエタノールが挙げられる。

【0055】

抗菌剤としては、例えば、ペニシリン系抗生物質、セフェム系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、及びニューキノロン系抗生物質が挙げられる。

【0056】

工程１の培養期間は、通常、１日間以上、好ましくは３日間～１４日間、より好ましくは４日間～１２日間である。

【0057】

工程１の培養は、温度が、通常、３０℃～５０℃、好ましくは３２℃～４８℃より好ましくは３４℃～４６℃、二酸化炭素含有割合が、通常、１体積％～１５体積％、好ましくは２体積％～１４体積％、より好ましくは３体積％～１３体積％の環境下で行う。また、高酸素濃度雰囲気下で培養することもできる。

【0058】

培地１で浮遊培養を行う前に、拡大培養によって形成したｍｈＰＳＣｓの細胞凝集塊を分散することができる。分散の処理方法については、拡大培養で記載した分散の処理方法と同じである。

【0059】

本実施形態の脳オルガノイドの製造方法では、工程１の浮遊培養で形成した培養物（細胞凝集塊１）を、分化誘導することにより、リン酸化した３リピートタウタンパク質及びリン酸化した４リピートタウタンパク質が蓄積した脳オルガノイドを製造することができる。分化誘導する方法としては、細胞凝集塊１を、Ｗｎｔシグナル伝達増強剤、及びＥＣＭを含有する培地２で培養する工程２、及び工程２の培養により形成した培養物を、ＥＣＭを含まない培地３で培養する工程３を含む方法を挙げることができる。

【0060】

工程２は、細胞凝集塊１を培地１から取り出さずに培地１を培地２に入れ替えて連続して行ってもよいし、細胞凝集塊１を培地１から取り出して培地２に播種して行うこともできる。工程２の培養は浮遊培養が好ましい。

【0061】

工程２の培養の培養期間は、通常、１日間以上、好ましくは３日間～１４日間、より好ましくは４日間～１２日間である。

【0062】

工程２の培養は、温度が、通常、３０℃～５０℃、好ましくは３２℃～４８℃、より好ましくは３４℃～４６℃、二酸化炭素含有割合が、通常、１体積％～１５体積％、好ましくは２体積％～１４体積％、より好ましくは３体積％～１３体積％の環境下で行う。また、高酸素濃度雰囲気下で培養することもできる。

【0063】

工程２の培養に用いる培養器としては、工程１と同じく、培養面が細胞非接着性の培養器であることが好ましい。細胞非接着性の培養器の詳細については、工程１と同様である。

【0064】

培地２は、ＥＣＭを含有する培地である。ＥＣＭを含む培地で培養する方法としては、細胞凝集塊１をＥＣＭに包埋して培養する方法、及び細胞凝集塊１をＥＣＭが混和した培地で培養する方法、が挙げられる。これらの中でも、細胞凝集塊１をＥＣＭが混和した培地で培養する方法が好ましい。

【0065】

ＥＣＭが混和した培地は、培地中のＥＣＭ以外の成分の体積に対して、ＥＣＭの体積が、通常、１体積％以上、好ましくは５体積％～１００体積％、より好ましくは１０体積％～９０体積％、となる量のＥＣＭ前駆体とＥＣＭ以外の成分とを混合し、その後、ＥＣＭ前駆体をゲル化することにより調製する。ＥＣＭ前駆体とＥＣＭ以外の成分を混合させる方法としては、氷浴上でピペッティング方法が挙げられる。ＥＣＭが混和した培地とは、目視で培地中にＥＣＭが観察されない状態になることを意味する。

【0066】

培地２は、通常、基礎培地に、ＥＣＭやＥＣＭ前駆体を添加して調製する。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＧＭＥＭ（サーモフィッシャー社製品名）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（サーモフィッシャー社製品名）、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９（サーモフィッシャー社製品名）、イーグルＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ハムＦ－１２培地、及びＲＰＭＩ１６４０培地、並びにこれらを混合した培地が挙げられる。

【0067】

ＥＣＭとしては、例えば、基底膜に含まれる成分、細胞間隙に存在する糖タンパク質が挙げられる。基底膜に含まれる成分としては、例えば、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、及びエンタクチンが挙げられる。ＥＣＭとしては、ＥＣＭを含む市販品を用いることができる。細胞間隙に存在する糖タンパク質としては、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、フィブロネクチン、及びヘパリン硫酸塩等が挙げられる。ＥＣＭを含む市販品としては、例えば、マトリゲル（コーニング社製品名）、及びヒト型ラミニン（シグマ社製品名）が挙げられる。

【0068】

マトリゲルは、Ｅｎｇｌｂｒｅｔｈ Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍマウス肉腫由来の基底膜成分を含有する。マトリゲルの主成分は、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、及びエンタクチンであるが、これらに加えて、上皮成長因子（以下、「ＥＧＦ」ともいう。）、神経成長因子（以下、「ＮＧＦ」ともいう。）、血小板由来成長因子（以下、「ＰＤＧＦ」ともいう。）、（以下、インスリン様成長因子１「ＩＧＦ－１」ともいう。）等の各種増殖因子、並びにＴＧＦ－β等の成分が含まれる。マトリゲルにはこれらの成分の濃度が低いグレードもあり、その濃度はＥＧＦが０．５ｎｇ／ｍＬ未満、ＮＧＦが０．２ｎｇ／ｍＬ未満、ＰＤＧＦが５ｐｇ／ｍＬ未満、ＩＧＦ－１が５ｎｇ／ｍＬ未満、ＴＧＦ－βが１．７ｎｇ／ｍＬ未満である。マトリゲルとしては、これらの成分の含有割合が低いグレードを用いることが好ましい。

【0069】

培地２は、Ｗｎｔシグナル増強剤を含有する。Ｗｎｔシグナル増強剤としては、例えば、ＧＳＫ－３β阻害剤、Ｗｎｔタンパク質、ＬＧＲ５アゴニストが挙げられる。これらの中でもＧＳＫ－３β阻害剤及びＷｎｔタンパク質が好ましい。培地２中に含まれるＷｎｔシグナル増強剤の終濃度は、通常、０．１μＭ～１０μＭ、好ましくは０．２μＭ～５μＭである。

【0070】

ＧＳＫ－３β阻害剤としては、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７－０６－９）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ番号：１４２２７３－２０－９）、及び６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ、ＣＡＳ番号：６６７４６３－６２－９）を挙げることができる。これらの中でも、ＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。

【0071】

Ｗｎｔタンパク質としては、哺乳類動物由来のＷｎｔタンパク質であることが好ましい。哺乳類動物のＷｎｔタンパク質としては、例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６が挙げられる。これらの中でもＷｎｔ３ａが好ましい。Ｗｎｔタンパク質はアファミンとの複合体であることがより好ましい。

【0072】

ＬＧＲ５アゴニストとしては、例えば、Ｒ－スポンジンファミリーが挙げられる。Ｒ－スポンジンファミリーとしては、例えば、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４等が挙げられ、中でも、Ｒ－スポンジン１が好ましい。

【0073】

Ｗｎｔシグナル増強剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、培地２中に含まれるＣＨＩＲ９９０２１の終濃度は、通常、０．１μＭ～３０μＭ、好ましくは０．２μＭ～２０μＭである。

【0074】

Ｗｎｔシグナル増強剤としてＷｎｔ３ａを用いる場合、培地２中に含まれるＷｎｔ３ａの終濃度は、通常、０．１ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬである。

【0075】

培地２は、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤を含有していてもよい。ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤としては、上述の培地１と同様のものが挙げられる。これらの中でも、ＡＬＫ５のキナーゼ活性を選択的に阻害することができるＳＢ－４３１５４２、及びＳＣ－２０３２９４が好ましい。培地２中に含まれるＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤の終濃度は、通常、０．１～２０μＭ、好ましくは０．１μＭ～１０μＭである。

【0076】

培地２は、さらに、神経生物系サプリメント、培地サプリメント、インスリン及びアルブミン等の血清由来のタンパク質、血清、血清代替物等を含有することができる。神経生物系サプリメント、及び培地サプリメントの詳細については、上述の培地１に記載の内容と同じものが挙げられる。

【0077】

工程３は、工程２の培養物を培地２から取り出さずに培地２を培地３に入れ替えて連続して行ってもよいし、工程２の培養物を培地２から取り出して、培養物を培地３に播種して行うこともできる。工程３の培養は浮遊培養が好ましく、浮遊培養は、培地を攪拌しながら行うことが好ましい。

【0078】

工程３の培養期間は、通常、１日間以上、好ましくは２日間～７００日間、より好ましくは１０日間～３６５日間である。工程３の培養は、温度が、通常、３０℃～５０℃、好ましくは３２℃～４８℃、より好ましくは３４℃～４６℃で、二酸化炭素含有割合が、通常、１体積％～１５体積％、好ましくは２体積％～１４体積％、より好ましくは３体積％～１３体積％の環境下で行う。また、高酸素濃度雰囲気下で培養することもできる。

【0079】

工程３の培養に用いる培養器としては、細胞非接着性の培養器が好ましい。細胞非接着性の培養器の詳細については、上述した工程１と同様である。

【0080】

培地３は、ＥＣＭを含有しない。「ＥＣＭを含有しない」とは、培地３にＥＣＭを意図的に添加しないことを意味し、培地中の成分の体積に対して、ＥＣＭの体積が５体積％以下の不可避不純物として混入するＥＣＭは許容される。

【0081】

培地３は、さらに、神経生物系サプリメント、培地サプリメント、インスリン及びアルブミン等の血清由来のタンパク質、血清、血清代替物等を含有することができる。神経生物系サプリメント、及び培地サプリメントの詳細については、上述した培地１と同様のものが挙げられる。

【0082】

培地３は、通常、基礎培地に、神経生物系サプリメント、培地サプリメント、インスリン及びアルブミン等の血清由来のタンパク質、血清、血清代替物等のその他成分を添加して調製する。基礎培地については、上述した培地１と同様のものが挙げられる。

【0083】

本実施形態の脳オルガノイドの製造方法は、工程１の浮遊培養で形成した細胞凝集塊１を、分化誘導することにより形成した脳オルガノイドを分散して分散物を得る工程４、及び、その分散物又は分散物が凝集して形成された細胞凝集塊を、タウタンパク質凝集物の存在下で培養する工程５を更に含むことができる。工程４及び５により、リン酸化した３リピートタウタンパク質及びリン酸化した４リピートタウタンパク質の蓄積が亢進した脳オルガノイドを製造することができる。工程５における培養は、好ましくは浮遊培養である。

【0084】

脳オルガノイドの分散方法としては、上述のｍｈＰＳＣｓの拡大培養を行う前の、ｍｈＰＳＣｓの分散と同様の処理が挙げられる。分散により、脳オルガノイドを、１００個以下の細胞集団、好ましくは５０個以下の細胞集団、より好ましくは単一細胞に分離させ、分散物を形成する。

【0085】

脳オルガノイドの分散物が凝集して形成された細胞凝集塊とは、脳オルガノイドの分散物である２個以上の細胞が接着して凝集塊を形成した状態を示す。脳オルガノイドの分散物が凝集して形成された細胞凝集塊の形成方法としては、脳オルガノイドの分散物を、工程１で用いた培地１中で浮遊培養する方法が挙げられる。この浮遊培養の培養期間は、通常、１日間以上、好ましくは３日間～１４日間、より好ましくは４日間～１２日間である。

【0086】

また、この浮遊培養は、温度が、通常、３０℃～５０℃、好ましくは３２℃～４８℃、より好ましくは３４℃～４６℃、二酸化炭素含有割合が、通常、１体積％～１５体積％、好ましくは２体積％～１４体積％、より好ましくは３体積％～１３体積％の環境下で行う。

【0087】

タウタンパク質凝集物とは、タウタンパク質、タウタンパク質の断片、リコンビナントタウタンパク質、及びリコンビナントタウタンパク質の断片から選ばれる少なくとも１種又は２種以上が凝集した凝集物を示す。

【0088】

これらの中でも、リコンビナントタウタンパク質又はリコンビナントタウタンパク質の断片を含むタウタンパク質凝集物であることが好ましい。また、タウタンパク質凝集物は、タウタンパク質又はリコンビナントタウタンパク質のオリゴマー又はフィラメントを含むことができる。フィラメントとしては、ペアードヘリカルフィラメント、又はストレートフィラメントが挙げられる。

【0089】

リコンビナントタウタンパク質をコードするＭＡＰＴ遺伝子の変異としては、エクソン９～エクソン１３中の塩基配列の少なくとも１個以上の変異が好ましい。

【0090】

エクソン９中の塩基配列の変異として、例えば、Ｋ２５７Ｖ、Ｋ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｌ２６６Ｖ、及びＧ２７２Ｖのアミノ酸変異をコードする塩基配列の変異；エクソン１０中の塩基配列の変異として、例えば、Ｎ２７９Ｋ、ΔＫ２８０、Ｌ２８４Ｌ、Ｎ２９６Ｎ、Ｎ２９６Ｈ、ΔＮ２９６、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｐ３０１Ｔ、Ｇ３０３Ｖ、Ｓ３０５Ｎ、及びＳ３０５Ｓのアミノ酸変異をコードする塩基配列の変異；エクソン１１中の塩基配列の変異として、例えば、Ｌ３１５Ｌ、Ｌ３１５Ｒ、Ｓ３２０Ｙ及びＳ３１０Ｆのアミノ酸変異をコードする塩基配列の変異；エクソン１２中の塩基配列の変異として、例えば、Ｖ３３７Ｍ、Ｅ３４２Ｖ、Ｇ３３５Ｖ、Ｇ３３５Ｓ、Ｑ３３６Ｒ及びＫ３６９Ｉのアミノ酸変異をコードする塩基配列の変異；エクソン１３中の塩基配列の変異として、Ｇ３８９Ｒ及びＲ４０６Ｗのアミノ酸変異をコードする塩基配列の変異；が挙げられる。これらの中でも、エクソン１０の塩基配列の変異が好ましく、Ｐ３０１Ｌが好ましい。

【0091】

タウタンパク質凝集物は、脳オルガノイドの分散物又は前記分散物が凝集して形成された細胞凝集塊に含まれる細胞１個あたり、通常、０．０００５ｎｇ～０．４ｎｇ、好ましくは０．００１ｎｇ～０．２ｎｇ、より好ましくは０．００２ｎｇ～０．１ｎｇの存在下で培養する。

【0092】

工程５の培養は、リン酸化亢進試薬の存在下で行うことが好ましい。リン酸化亢進試薬としては、一般的にトランスフェクション試薬といわれるものを用いることができる。実施例において後述するように、トランスフェクション試薬の添加により、タウタンパク質のリン酸化（及びミスフォールド）を亢進することができる。

【0093】

リン酸化亢進試薬としては、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号「３０１４２５」、キアゲン社）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（ＴＭ）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号「Ｅ２４３１」、プロメガ社）、ＴｆｘＴＭ－２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号「Ｅ２３９１」、プロメガ社）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号「３０１３０５」キアゲン社）、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号「３０１１０５」、キアゲン社）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号「１１６６８－０１９」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号「Ｌ３００００１５」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（カタログ番号「１０１－３０」、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社）、ＥｘＧｅｎ ５００（カタログ番号「Ｒ０５１１」、フェルメンタス社）が挙げられる。

【0094】

リン酸化亢進試薬の量は、タウタンパク質凝集物と同質量又はその±９０％の量であることが好ましい。

【0095】

工程５の培養で用いる培地は、ＥＣＭを含有しない培地であることが好ましい。ＥＣＭを含有しない培地としては、培地３と同様の培地が挙げられる。

【0096】

工程５の培養期間は、通常、０．１日間～１４日間、好ましくは０．３日間～７日間、より好ましくは０．５日間～２日間である。工程５の培養は、温度が、通常、３０℃～５０℃、好ましくは３２℃～４８℃、より好ましくは３４℃～４６℃で、二酸化炭素含有割合が、通常、１体積％～１５体積％、好ましくは２体積％～１４体積％、より好ましくは３体積％～１３体積％の環境下で行う。

【0097】

工程５の培養に用いる培養器としては、細胞非接着性の培養器が好ましい。細胞非接着性の培養器の詳細については、工程１におけるものと同様である。

【0098】

工程５の培養により形成する培養物を、さらに、ＥＣＭを含有しない培地で培養する工程６を有することができる。工程６は、工程３と同様の方法で行うことができる。

【0099】

［脳オルガノイド］
本実施形態の脳オルガノイドは、本実施形態の脳オルガノイドの製造方法によって、製造することができ、ミスフォールドした３リピートタウタンパク質及びミスフォールドした４リピートタウタンパク質を有する。ミスフォールドは、リン酸化等により亢進するため、本実施形態の脳オルガノイドは、好ましくはリン酸化された３リピートタウタンパク質及びリン酸化された４リピートタウタンパク質を有する。

【0100】

抗ＭＣ１抗体は、ミスフォールドした３リピートタウタンパク質及びミスフォールドした４リピートタウタンパク質に特異的に結合する。このため、ミスフォールドした３リピートタウタンパク質及びミスフォールドした４リピートタウタンパク質の存在は、抗ＭＣ１抗体による免疫染色等により検出することができる。なお、ミスフォールドした３リピートタンパク質及びミスフォールドした４リピートタンパク質は、リン酸化していると考えられる。

【0101】

本実施形態の脳オルガノイドは、ウエスタンブロッティング法で示される前記リン酸化した４リピートタウタンパク質の検出シグナル強度が、前記リン酸化した３リピートタウタンパク質の検出シグナル強度１に対して０．１以上、好ましくは０．３以上、より好ましくは０．５～３である。検出シグナル強度は、抗ＰＨＦ１抗体との反応で示される発光強度及び蛍光強度である。

【0102】

ヒトの脳内のタウタンパク質は、選択的スプライシングによって、３５２～４４１個のアミノ酸からなる分子量の異なる６種類のアイソフォームとして発現される。

【0103】

６種類のアイソフォームとしては、０Ｎ３Ｒタウタンパク質（３５２アミノ酸、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０５８５２５．１、ＮＭ＿０１６８４１．４等）、エクソン２及び３を有しない０Ｎ４Ｒタウタンパク質（３８３アミノ酸、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０５８５１８．１、ＮＭ＿０１６８３４．４等）、エクソン２を有する１Ｎ３Ｒタウタンパク質（３８１アミノ酸、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１１９０１８０．１、ＮＭ＿００１２０３２５１．１等）、エクソン２を有する１Ｎ４Ｒタウタンパク質（４１２アミノ酸、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１１１６５３９．１、ＮＭ＿００１１２３０６７．３等）、エクソン２及び３を有する２Ｎ３Ｒタウタンパク質（４１０アミノ酸、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１１９０１８１．１、ＮＭ＿００１２０３２５２．１等）、エクソン２及び３を有する２Ｎ４Ｒタウタンパク質（４４１アミノ酸、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００５９０１．２、ＮＭ＿００５９１０．５等）が挙げられる。

【0104】

本実施形態の脳オルガノイド中に含まれるリン酸化した４リピートタウタンパク質としては、リン酸化した０Ｎ４Ｒタウタンパク質が含まれていることが好ましく、リン酸化した３リピートタウタンパク質としては、リン酸化した０Ｎ３Ｒタウタンパク質が含まれていることが好ましい。

【0105】

［薬効評価方法］
本実施形態の薬効評価方法は、上述した脳オルガノイドを被験物質と接触させる工程（以下、「工程Ａ」ともいう。）、及び被験物質が脳オルガノイドに及ぼす影響を検定する工程（以下、「工程Ｂ」ともいう。）を有する。

【0106】

工程Ａにおいて、被験物質としては、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、及び代謝物ライブラリ等が挙げられる。既存薬には、例えばＡＺＤ２８５８、メチルチオニニウム塩化物水和物等が含まれる。また、被験物質としては、新薬を用いることができる。

【0107】

工程Ｂにおいて、被験物質が脳オルガノイドに及ぼす影響は、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色等により検定又は評価することができる。

【0108】

さらに、工程Ａの前に、脳オルガノイドを哺乳動物の脳に移植する工程（以下、「工程ａ」ともいう。）を有することができる。工程ａを有することで、よりアルツハイマー病を罹患した生体に近い環境で被験物質の薬効を評価することができる。

【実施例】

【0109】

以下、本実施形態を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本実施形態はこれら実施例に限定されるものではない。また、全ての実験は慶應義塾大学医学部倫理委員会で承認された倫理研究計画に基づいて行った。

【0110】

［実験例１］
（改変ＭＡＰＴ遺伝子を導入したｈｉＰＳＣｓ（ｍｈｉＰＳＣｓ）の作製）
ゲノム編集のためのガイドＲＮＡ設計ソフト「ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ」）を用いて、ＭＡＰＴ遺伝子の標的配列を標的とするためのガイドＲＮＡを設計した。

【0111】

設計したガイドＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを合成し、このオリゴヌクレオチドを、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの双方を発現するためのオールインワンベクターである、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）Ｖ２．０のＢｂｓＩサイトに挿入した。

【0112】

ターゲティングベクターとしては、ＭＡＰＴ遺伝子の標的配列付近の５’側１．５ｋｂを５’アームとし、３’側４ｋｂを３’アームとし、ｐｉｇｇｙＢａｃ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓによって挟まれたピューロマイシン耐性カセットと接続したベクターを用いた。ターゲティングベクターは、ＭＡＰＴ遺伝子のＮ２７９Ｋ及びＰ３０１Ｓのアミノ酸変異をコードするエクソン１０中の塩基変異、及びイントロン１０中のＥ１０＋１６の変異を有していた。

【0113】

次いで、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーター（Ｎｅｐａｇｅｎｅ社）を用いて電気穿孔法により、１００万個のｈｉＰＳＣｓ（ＰＣｈｉＰＳ７７１株、Ｌｏｔ．Ａ０１ＱＭ２８、リプロセル社製）に、１０μｇのｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）Ｖ２．０プラスミド、及び１０μｇのターゲティングベクターを導入した。

【0114】

遺伝子導入を始めてから２日目から１２日目まで、ピューロマイシンによる選択を行った。次いで、ピューロマイシン耐性コロニーを選択し、ゲノムＤＮＡ抽出及びＰＣＲによる遺伝子型判定を行った。

【0115】

次いで、ピューロマイシン耐性カセットを除去するために、ネガティブセレクションを行い、ピューロマイシン耐性カセットを除去したコロニーを選択した。得られたコロニーから市販のキット（製品名「ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ キット」、キアゲン社）でゲノムＤＮＡを抽出した後、ピューロマイシンカセットが除去されたことをＰＣＲ増幅後の電気泳動で確認した。また、抽出したゲノムＤＮＡを用いて、改変ＭＡＰＴ遺伝子を有することをサンガーシーケンス解析で確認し、ｍｈｉＰＳＣｓを得た。

【0116】

［実験例２］
（ｍｈｉＰＳＣｓの拡大培養）
実験例１で作製したｍｈｉＰＳＣｓを、フィーダーフリー培養した。具体的には、ｍｈｉＰＳＣｓをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて単一細胞に分散した。続いて、分散したｍｈｉＰＳＣｓを、ラミニン－５１１の活性部位のみを含むヒト組換え型ラミニンフラグメント（製品名「ｉＭａｔｒｉｘ－５１１」、ニッピ社製）をコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地（味の素社製）にてフィーダーフリー培養した。上記のプラスチック培養ディッシュとして、６０ｍｍディッシュ（イワキ社製、細胞培養用）を用いた場合、単一細胞へ分散されたｈｉＰＳＣｓの播種細胞数は３×１０^４個／ディッシュとした。

【0117】

細胞を播種してから１日後に、培地を、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地に交換した。以降、１～２日に１回、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地に培地交換した。その後、細胞を播種してから６日後に８０％コンフルエントになった。

【0118】

［実験例３］
（ｈｉＰＳＣｓの拡大培養）
実験例２において、ｍｈｉＰＳＣｓの代わりに、野生型ｈｉＰＳＣｓ（ＰＣｈｉＰＳ７７１株、リプロセル社製）を用いた以外は、実験例２と同様の操作にて、ｈｉＰＳＣｓを拡大培養した。

【0119】

［実験例４～実験例７］
（脳オルガノイドの製造１）
下記表１に培地１の組成を、下記表２に培地２の組成を、下記表３に培地３の組成を示す。図１は、ヒト脳オルガノイドの培地交換スケジュールを示す模式図である。図１中、「Ｄａｙ」は浮遊培養開始時を０日目とする培養日数を示し、「＋」は培地に添加されていることを示し、「－」は培地に添加されていないことを示し、「ＢＭＰｉ」はＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を示し、「ＴＧＦ－βｉ」はＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤を示し、「ＥＣＭ」は細胞外マトリックス成分を示し、「Ｗｎｔ」はＷｎｔシグナル増強物質を示す。

【0120】

【表1】

【0121】

【表2】

【0122】

【表3】

【0123】

実験例２で得たｍｈｉＰＳＣｓを、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品名）を用いて細胞分散液処理し、更にピペッティング操作により単一細胞に分散した。分散されたｍｈｉＰＳＣｓを、非細胞接着性の９６ウェルプレート（製品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６Ｖ底プレート」、住友ベークライト社製）に、１×１０^４個／ウェルの細胞密度となるように１００μＬ／ウェルの培地１に播種し、３７℃、容器内の二酸化炭素濃度が５体積％で７日間、浮遊培養した。

【0124】

浮遊培養開始後７日目に、各ウェルから培地１を２３０μＬ取り除いた。続いて、培地２を１５０μＬ／ウェル添加し、３７℃、容器内の二酸化炭素濃度が５体積％で７日間、攪拌しながら浮遊培養した。

【0125】

浮遊培養開始後１４日目に、各ウェルの内容物を、１０ｍＬのＰＢＳが入ったＦａｌｃｏｎ（登録商標）コニカルチューブ５０ｍＬ（コーニング社製）に移した。続いて、５回転倒混和し、上清を除去することにより、培地２を除去し、細胞凝集塊を回収した。回収した細胞凝集塊を３０個、及び３０ｍLの培地３を３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）に加えて、攪拌しながら浮遊培養した。培地は４日おきに交換した。浮遊培養開始から５６日目、浮遊培養開始から９１日目、浮遊培養開始から１４０日目、及び浮遊培養開始から１７５日目に脳オルガノイドを回収し、それぞれ、実験例４～実験例７の脳オルガノイドを得た。

【0126】

［実験例８～実験例１１］
（脳オルガノイドの製造２）
実験例４～実験例７において、実験例２で得たｍｈｉＰＳＣｓの代わりに、実験例３で得た野生型ｈｉＰＳＣｓを用いた以外は実験例４～実験例７と同様の操作により、それぞれ実験例８～実験例１１の脳オルガノイドを得た。

【0127】

［実験例１２］
（４リピートタウタンパク質のｍＲＮＡ発現量解析）
実験例４～実験例１１の脳オルガノイドの全ＲＮＡを、市販のキット（製品名「ＲＮｅａｓｙ ＰｌｕｓＭｉｎｉキット」、キアゲン社）を用いてそれぞれ抽出した。また、ＮａｎｏＤｒｏｐ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品名）を用いて全ＲＮＡの濃度を測定した。続いて、全ＲＮＡを、ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡社製品名）とＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒにより逆転写して、ｃＤＮＡを合成した。

【0128】

上記ｃＤＮＡに、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製品名）、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ＩＩ（タカラバイオ社製品名）を加え、反応溶液を調製した。続いて、リアルタイムＰＣＲシステム（製品名「ＶｉｉＡ７」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて上記反応溶液の定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析を行い、ＭＡＰＴ遺伝子のｍＲＮＡの発現量及び４リピートタウのｍＲＮＡの発現量をそれぞれ定量した。ＭＡＰＴ遺伝子のｃＤＮＡの増幅には、センスプライマー（配列番号１）及びアンチセンスプライマー（配列番号２）を使用した。また、４リピートタウのｃＤＮＡの増幅には、センスプライマー（配列番号３）及びアンチセンスプライマー（配列番号４）を使用した。測定結果を図２及び図３に示す。また、測定結果のまとめを下記表４に示す。

【0129】

図２はＭＡＰＴ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果であり、発現量は、実験例４で得た脳オルガノイドにおけるＭＡＰＴ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を１とする相対値で示す。また、図３は４リピートタウタンパク質のｍＲＮＡの発現量の測定結果であり、実験例８で得た脳オルガノイドにおける４リピートタウタンパク質のｍＲＮＡの発現量を１とする相対値を示す。

【0130】

【表4】

【0131】

［実験例１３］
（ウエスタンブロッティング法によるタウタンパク質のアイソフォームの測定）
タウタンパク質のアイソフォームをウエスタンブロット法により観察した。実験例７で得た脳オルガノイド及び実験例１１で得た脳オルガノイドにＲＩＰＡバッファーを添加し、氷上で超音波破砕した。続いて、得られた細胞破砕液を氷上で６０分間静置した。続いて、細胞破砕液を４℃、１００，０００×ｇで遠心し、上清を回収した。続いて、ビシンコニン酸アッセイキットを用いて、上清中のタンパク質濃度を測定した。続いて、上清にλフォスファターゼを添加し、３０℃で３時間反応させた。続いて、上清をそれぞれ等量ずつ２ウェルにアプライしてＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、ポリフッ化ビニリデン膜（以下、「ＰＶＤＦ膜」）に転写した。

【0132】

続いて、ＰＶＤＦ膜をＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡社製品名）に浸し、室温で１時間ブロッキングした後、Ｃａｎ Ｇｅｔ ＳｉｇｎａｌＩｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１（東洋紡社製品名）で１０００倍希釈したマウス抗タウ５抗体反応液と４℃で一晩反応させた。続いて、ＴＢＳＴバッファーで３回洗浄し、Ｃａｎ Ｇｅｔ ＳｉｇｎａｌＩｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１（東洋紡社製品名）で１０００倍希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」）標識抗マウスＩｇＧ抗体反応液と室温で１時間反応させた。

【0133】

続いて、ＴＢＳＴバッファーで３回洗浄し、ＰＶＤＦ膜にＣｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（バイオラッド社製品名）を液盛して２分間静置した。続いて、発光検出装置（製品名「ＡｍｅｒｓｈａｍＩｍａｇｅｒ ６００」、ＧＥヘルスケア社）を用いてタウタンパク質のアイソフォームのバンドを検出した。図４はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。

【0134】

図４中、「ＷＴ」は実験例１１で得た脳オルガノイドの結果であることを示し、「Ｍｕｔａｎｔ」は実験例７で得た脳オルガノイドの結果であることを示し、「＋」はλフォスタファターゼを反応させた結果であることを示し、「－」はλフォスタファターゼを反応させなかった結果であることを示す。また、図４中、最も左のレーンは各タウタンパク質アイソフォームのマーカーである。また、下記表５に、実験例７で得た脳オルガノイドにおける３リピートタウタンパク質（０Ｎ３Ｒ）の検出シグナルを１とした場合の、４リピートタウタンパク質（０Ｎ４Ｒ）の検出シグナルの強度（相対値）を示す。

【0135】

【表5】

【0136】

［実験例１４］
（ウエスタンブロッティング法によるリン酸化タウタンパク質の測定）
リン酸化タウタンパク質の発現をウエスタンブロッティング法により測定した。実験例７で得た脳オルガノイド及び実験例１１で得た脳オルガノイドにプロテアーゼ阻害剤及びフォスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡバッファーを添加し、氷上で超音波破砕した。続いて、得られた細胞破砕液を氷上で６０分間静置した。続いて、細胞破砕液を４℃、１００，０００×ｇで遠心し、上清を回収した。続いて、ビシンコニン酸アッセイキットを用いて、上清中のタンパク質濃度を測定した。続いて、上清をウェルにアプライしてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜に転写した。

【0137】

続いて、ＰＶＤＦ膜をＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（東洋紡社製品名）に浸し、室温で１時間ブロッキングした後、Ｃａｎ Ｇｅｔ ＳｉｇｎａｌＩｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１（東洋紡社製品名）で１０００倍希釈したマウス抗ＰＨＦ１抗体反応液と４℃で一晩反応させた。なお、抗ＰＨＦ１抗体は、タウタンパク質の３９６番目のリン酸化されたセリン及び４０４番目のリン酸化されたセリンを認識する抗体である。

【0138】

続いて、ＴＢＳＴバッファーで３回洗浄し、Ｃａｎ Ｇｅｔ ＳｉｇｎａｌＩｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１（東洋紡社製品名）で１０００倍希釈した、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体反応液と室温で１時間反応させた。

【0139】

続いて、ＴＢＳＴバッファーで３回洗浄し、ＰＶＤＦ膜に ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社製品名）を添加して２分間静置した。続いて、発光検出装置（製品名「ＡｍｅｒｓｈａｍＩｍａｇｅｒ ６００」、ＧＥヘルスケア社）を用いて発光を検出した。続いて、得られたバンドのシグナル強度を検出した。図５はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。

【0140】

図５中、「ＷＴ」は実験例１１で得た脳オルガノイドの結果であることを示し、「Ｍｕｔａｎｔ」は実施例７で得た脳オルガノイドの結果であることを示し、「３Ｒ ｔａｕ」はリン酸化した３リピートタウタンパク質のバンドであることを示し、「４Ｒ ｔａｕ」はリン酸化した４リピートタウタンパク質のバンドであることを示す。また、下記表６に、実験例７で得た脳オルガノイドにおけるリン酸化３リピートタウタンパク質の検出シグナルを１とした場合の、リン酸化４リピートタウタンパク質の検出シグナルの強度（相対値）を示す。

【0141】

【表6】

【0142】

［実験例１５］
（ＭＣ１抗体、ＲＴＭ３８抗体による脳オルガノイドの免疫染色）
ＭＣ１抗体を用いた免疫染色により、脳オルガノイド中に含まれるミスフォールドした３リピートタウタンパク質及びミスフォールドした４リピートタウタンパク質を評価した。また、ＲＴＭ３８抗体（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いた免疫染色により、タウタンパク質を評価した。

【0143】

実験例７で得た脳オルガノイド及び実験例１１で得た脳オルガノイドの切片の蛍光免疫染色により、ミスフォールドしたタウタンパク質の存在を評価した。また、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）により核を染色した。図６（ａ）及び（ｂ）に実験例７で得た脳オルガノイドの蛍光免疫染色像を示し、図７（ａ）及び（ｂ）に実験例１１で得た脳オルガノイドの蛍光免疫染色像を示す。

【0144】

図６（ａ）は、実験例７で得た脳オルガノイドについての、ＤＡＰＩによる蛍光染色画像、ＭＣ１抗体による蛍光染色画像及びＲＴＭ３８抗体による蛍光染色画像をマージした画像である。図６（ｂ）は、図６（ａ）と同一視野におけるＭＣ１抗体による蛍光染色画像である。

【0145】

図７（ａ）は、実験例１１で得た脳オルガノイドについての、ＤＡＰＩによる蛍光染色画像、ＭＣ１抗体による蛍光染色画像及びＲＴＭ３８抗体による蛍光染色画像をマージした画像である。図７（ｂ）は、図７（ａ）と同一視野におけるＭＣ１抗体による蛍光染色画像である。

【0146】

その結果、実験例７で得た脳オルガノイド及び実験例１１で得た脳オルガノイドでは、ＭＣ１抗体のシグナルは確認できず、ミスフォールドしたタウタンパク質は存在しないことが確認された。しかしながら、ＲＴＭ３８抗体のシグナルは確認でき、タウタンパク質は発現していることが示された。

【0147】

［実験例１６～実験例１９］
（タウタンパク質凝集物を用いた脳オルガノイドの製造）
実験例２で得たｍｈｉＰＳＣｓを、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品名）を用いて細胞分散液処理し、更にピペッティング操作により単一細胞に分散した。分散されたｍｈｉＰＳＣｓを非細胞接着性の９６ウェルプレート（製品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６Ｖ底プレート」、住友ベークライト社製）に、１×１０^４個／ウェルの細胞密度となるように１００μＬ／ウェルの培地１に播種し、３７℃、容器内の二酸化炭素濃度が５体積％で７日間、浮遊培養した。

【0148】

浮遊培養開始後７日目に、各ウェルから培地１を２３０μＬ取り除いた。続いて、培地２を１５０μＬ／ウェル添加し、３７℃、容器内の二酸化炭素濃度が５体積％で７日間、攪拌しながら浮遊培養した。

【0149】

浮遊培養開始後１４日目に、各ウェルの内容物を、１０ｍＬのＰＢＳが入ったＦａｌｃｏｎ（登録商標）コニカルチューブ５０ｍＬ（コーニング社製）に移した。続いて、５回転倒混和し、上清を除去することにより、培地２を除去し、細胞凝集塊を回収した。回収した細胞凝集塊を３０個、及び３０ｍLの培地３を３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）に加えて、攪拌しながら浮遊培養した。培地は４日おきに交換した。浮遊培養開始から１０週間目に脳オルガノイドを回収した。

【0150】

回収した脳オルガノイドを、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品名）を用いて細胞分散液処理し、更にピペッティング操作により単一細胞に分散した。分散した脳オルガノイドを非細胞接着性の９６ウェルプレート（製品名「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６Ｖ底プレート」、住友ベークライト社製）に、１×１０^４個／ウェルの細胞密度となるように１００μＬ／ウェルの培地１に採種し、３７℃、容器内の二酸化炭素濃度が５体積％で１週間浮遊培養し、細胞凝集塊を形成した。

【0151】

続いて、培地１に、フィブリル型タウリコンビナントタンパク質凝集物Ｋ１８型（商品コード「＃ＳＰＲ－３３０」、ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．社製）を０．２μｇ／ウェル、及びリン酸化亢進試薬として（製品名「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を０．２μＬ／ウェル加え、３７℃、容器内の二酸化炭素濃度が５体積％で１日間、浮遊培養した。

【0152】

フィブリル型タウリコンビナントタンパク質凝集物Ｋ１８型は、ヒトタウタンパク質のエクソン１０におけるＰ３０１Ｌの変異を有する、ヒトリコンビナントタウタンパク質の断片が凝集した凝集物である。フィブリル型タウリコンビナントタンパク質凝集物Ｋ１８型に含まれるリコンビナントタウタンパク質の断片のアミノ酸配列を配列番号５に示す。

【0153】

続いて、ウェルから浮遊培養物を回収し、回収した細胞凝集塊を３０個、及び３０ｍＬの培地３を３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）に加え、攪拌しながら１０週間浮遊培養し、実験例１６の脳オルガノイドを得た。培地は４日おきに交換した。

【0154】

また、下記表７に示す条件で、実験例１７～実験例１９の脳オルガノイドを得た。実験例１７ではフィブリル型タウリコンビナントタンパク質凝集物Ｋ１８型及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を使用しない点、実験例１８では実験例２のｍｈｉＰＳＣｓの代わりに実験例３のｈｉＰＳＣｓを使用した点、実験例１９ではフィブリル型タウリコンビナントタンパク質凝集物Ｋ１８型及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００を使用せず、且つ実験例２のｍｈｉＰＳＣｓの代わりに実験例３のｈｉＰＳＣｓを使用した点以外は、実験例１６と同様の方法で、それぞれ脳オルガノイドを得た。

【0155】

【表7】

【0156】

［実験例２０］
（タウタンパク質凝集物を用いた脳オルガノイドにおけるタウタンパク質のミスフォールドの確認）
抗ＭＣ１抗体を用いた免疫染色により、実験例１６～実験例１９で得た脳オルガノイド中に含まれる、ミスフォールドした３リピートタウタンパク質及びミスフォールドした４リピートタウタンパク質の存在を確認した。

【0157】

まず、実験例１６～実験例１９で得た脳オルガノイドの切片を作製した。続いて、各切片を抗ＭＣ１抗体で免疫染色した。また、同時に、ＤＡＰＩにより核を染色した。続いて、各切片を蛍光顕微鏡で観察した。

【0158】

図８は、実験例１６で得た脳オルガノイドの蛍光免疫染色像を示す代表的な顕微鏡写真であり、ＤＡＰＩによる蛍光染色画像及びＭＣ１抗体による蛍光染色画像をマージした画像である。

【0159】

図９は、実験例１６～実験例１９で得た脳オルガノイドの蛍光免疫染色像に基づいて、抗ＭＣ１抗体のシグナル強度（相対値）を数値化した結果を示すグラフである。この結果、実験例１６で得た脳オルガノイドは、実験例１７～実験例１９で得た脳オルガノイドと比較して、ミスフォールドした３リピートタウタンパク質及びミスフォールドした４リピートタウタンパク質の蓄積量が顕著に多いことが明らかとなった。

【0160】

続いて、実験例１６～実験例１９で得た脳オルガノイドの蛍光免疫染色像を画像処理し、ＤＡＰＩにより染色された核の数（ＤＡＰＩ ｃｏｕｎｔｓ）及び抗ＭＣ１抗体により染色された顆粒（ＭＣ１ ｐｕｎｃｔａ）の数を算出した。図１０は、結果を示すグラフである。ＤＡＰＩにより染色された核の数は細胞数に対応する。

【0161】

また、実験例１６～実験例１９で得た脳オルガノイドの蛍光免疫染色像の画像処理により、１細胞あたりの、抗ＭＣ１抗体により染色された顆粒の個数（ＭＣ１ ｐｕｎｃｔａ／ＤＡＰＩ ｃｏｕｎｔｓ）を算出した。図１１は、結果を示すグラフである。

【0162】

画像処理は次のようにして行った。まず、得られた蛍光免疫染色像における、バックグラウンドのノイズをカットした。続いて、バックグラウンドの輝度に合わせて画像を補正し、二値化によりＤＡＰＩ及びＭＣ１の顆粒をそれぞれ特定した。続いて、ＤＡＰＩ陽性領域及びＭＣ１陽性領域中の隙間を塞いだ。続いて、ＤＡＰＩ陽性領域及びＭＣ１陽性領域のサイズ（同一面積の円を想定した場合の当該円の直径）が０．１μｍ以下の領域を除去した。続いて、残ったＤＡＰＩ陽性領域の個数（核の数すなわち細胞数に対応する。）、及びＭＣ１陽性領域（抗ＭＣ１抗体により染色された顆粒）の個数を計測した。

【産業上の利用可能性】

【0163】

本発明によれば、リン酸化した３リピートタウタンパク質及びリン酸化した４リピートタウタンパク質が蓄積した脳オルガノイド及びその製造方法、並びに前記脳オルガノイドを用いた薬効評価方法を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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