特許 7620429 表皮ケラチノサイト前駆細胞におけるサーチュイン遺伝子発現のデカペプチド－１２モジュレーション

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-15

(45)【発行日】2025-01-23

(54)【発明の名称】表皮ケラチノサイト前駆細胞におけるサーチュイン遺伝子発現のデカペプチド－１２モジュレーション

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/08 20190101AFI20250116BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250116BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20250116BHJP

【ＦＩ】

A61K38/08 ZNA

A61K8/64

A61P17/16

A61P43/00 107

A61Q19/08

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2020502526

(86)(22)【出願日】2018-03-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-04-30

(86)【国際出願番号】 US2018025450

(87)【国際公開番号】W WO2018183882

(87)【国際公開日】2018-10-04

【審査請求日】2021-03-26

【審判番号】

【審判請求日】2022-12-14

(31)【優先権主張番号】62/479,248

(32)【優先日】2017-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519350742

【氏名又は名称】エスケープ・セラピューティクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＥＳＣＡＰＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ハンタッシュ，バジル・エム

(72)【発明者】

【氏名】ウベイド，アナン・アブ

【合議体】

【審判長】松波 由美子

【審判官】冨永 みどり

【審判官】吉田 佳代子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００７／０３２０２９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５１６０２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００７－１４５７９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】公益財団法人長寿科学振興財団，健康長寿ネット，早老症とは，［ｏｎｌｉｌｅ］，２０１６年７月２５日公開・２０１９年２月１日更新，公益財団法人長寿科学振興財団，［令和５年１月１１日検索］，インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｙｏｊｙｕ．ｏｒ．ｊｐ／ｎｅｔ／ｂｙｏｕｋｉ／ｗｅｒｎｅｒ／ａｂｏｕｔ．ｈｔｍｌ＞

【文献】Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，２０１４， Ｖｏｌ．１４， Ｎｏ．１２， ｐ．１４１８－１４２４

【文献】「パルミトイル化」、脳科学辞典、２０１２年１月２５日、 ＜ ｈｔｔｐｓ：／／ｂｓｄ．ｎｅｕｒｏｉｎｆ．ｊｐ／ｗｉｋｉ／％Ｅ３％８３％９１％Ｅ３％８３％ＡＢ％Ｅ３％８３％９Ｆ％Ｅ３％８３％８８％Ｅ３％８２％Ａ４％Ｅ３％８３％ＡＢ％Ｅ５％８Ｃ％９６＞

【文献】Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１２， Ｖｏｌ．１８， Ｎｏ．７， ｐ．３８５－３９３

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

A61K

C12N

C07K

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＣＡｐｌｕｓ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

皮膚細胞におけるサーチュイン遺伝子の発現をモジュレートすることによって、対象の皮膚細胞の早期の細胞セネッセンスに関連する皮膚老化障害を治療する方法に用いるための組成物であって、当該方法は対象に当該組成物を投与することを含み、ここにおいて当該組成物は配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸配列からなる、有効量の１つまたは複数のペプチドを含む、組成物。

【請求項2】

前記皮膚細胞が前駆細胞であり、前記前駆細胞が表皮ケラチノサイト前駆細胞、メラノブラスト、線維芽細胞、組織芽細胞、またはデンドロブラストである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記皮膚細胞が最終分化しており、ここにおいて前記皮膚細胞がケラチノサイト、メラニン細胞、線維細胞、組織球、またはデンドロサイトである、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ペプチドが１μＭ以上の濃度で存在する、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

前記サーチュイン遺伝子が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７の塩基配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

オキシレスベラトロールをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

前記皮膚細胞が哺乳動物細胞であり、ここにおいて前記皮膚細胞がヒト皮膚細胞である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

前記ペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチドが修飾基によって修飾されたペプチドであり、前記修飾基がアミノ末端のパルミトイル基もしくはアセチル基、またはカルボキシ末端のアミド化のいずれかであるか、またはその両方である、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項9】

前記ペプチドが、天然に存在するＬアミノ酸または天然には存在しないＤアミノ酸から独立して選択される残基を含み、サーチュイン遺伝子の発現を特異的にモジュレートする能力を維持するものである、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
この出願は、本出願で引用される他のすべての参考文献とともに参照により組み込まれる「表皮ケラチノサイトにおけるサーチュイン遺伝子発現のデカペプチド－１２モジュレーション」の題で２０１７年３月３０日に出願された米国特許出願第６２／４７９，２４８号の利益を主張する。

【0002】

配列表
この出願には、２０１８年３月２１日に作成され、この出願とともに電子的に提出された「ＥＬＩＸＰ００４ＵＳ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（３キロバイト）の題の配列表が参照により組み込まれる。

【0003】

発明の背景
本発明は、新規な生物学的因子の分野に関する。

【背景技術】

【0004】

概要
最近の報告において、早老化の抑制、細胞セネッセンス（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）の遅延、寿命の延長、および幅広い老化障害の軽快においてサーチュイン（ｓｉｒｔｕｉｎ）が果たす多面的な役割について詳述されている。本明細書において、強力なサーチュイン活性化因子であるデカペプチド－１２に関する知見を報告し、その性能を十分に実証されたオキシレスベラトロール（ｏｘｙｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）と比較する。ヒト表皮ケラチノサイト前駆細胞を１００μＭデカペプチド－１２で処理すると、ＳＩＲＴ１の転写が対照細胞と比較して１４１±１１パーセント増加する一方で、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７のレベルは、それぞれ１２１±１３パーセント、１４７±８パーセント、および９５±１４パーセント増加した。デカペプチド－１２は、サーチュイン転写をオキシレスベラトロールと同様のレベルに上方調節したが、細胞毒性は低下した。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

一実施形態によるペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２からなる。

【0006】

特定の実施形態によるペプチドは、修飾基により修飾された配列番号９からなり、その修飾基はアミノ末端のパルミトイル基もしくはアセチル基、またはカルボキシ末端のアミド化のいずれかであるか、またはその両方である。

【0007】

様々な実施形態によるペプチドは、Ｄ－アイソフォームとして６位にチロシンアミノ酸を有し、他のすべてのアミノ酸がＬ－アイソフォームである配列番号１１からなる。

【0008】

一実施形態による組成物は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２からなる第１のペプチドを含む。

【0009】

特定の実施形態による組成物は、修飾基によって修飾された配列番号９からなり、その修飾基はアミノ末端のパルミトイル基もしくはアセチル基、またはカルボキシ末端のアミド化のいずれかであるか、またはその両方である。

【0010】

いくつかの実施形態による組成物は、Ｄ－アイソフォームとして６位にチロシンアミノ酸を有し、他のすべてのアミノ酸がＬ－アイソフォームである配列番号１１からなる。

【0011】

特定の実施形態による組成物は、１μｍ以上の濃度で存在するペプチドを含む。
皮膚細胞におけるサーチュイン遺伝子の発現をモジュレートして皮膚老化の症状を軽減することにより対象を治療する方法の実施形態は、有効量の１つまたは複数のペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、１つまたは複数のペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２からなる。

【0012】

特定の実施形態による方法では、ペプチドは、修飾基によって修飾された配列番号９からなり、その修飾基はアミノ末端のパルミトイル基もしくはアセチル基、またはカルボキシ末端のアミド化のいずれかであるか、またはその両方である。

【0013】

いくつかの実施形態による方法では、ペプチドは、Ｄ－アイソフォームとして６位にチロシンアミノ酸を有し、他のすべてのアミノ酸がＬ－アイソフォームである配列番号１１からなる。

【0014】

様々な実施形態による方法では、皮膚細胞は前駆細胞である。
いくつかの実施形態によれば、前駆細胞は、表皮ケラチノサイト前駆細胞、メラノブラスト、線維芽細胞、組織芽細胞、またはデンドロブラスト（ｄｅｎｄｒｏｂｌａｓｔ）である。

【0015】

特定の実施形態による方法では、皮膚細胞は最終分化している。
様々な方法の実施形態によれば、皮膚細胞は、ケラチノサイト、メラニン細胞、線維細胞、組織球、またはデンドロサイト（ｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）である。

【0016】

方法の特定の実施形態では、ペプチドは１μｍ以上の濃度で存在する。
特定の実施形態では、サーチュイン遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、組成物はオキシレスベラトロールをさらに含む。
特定の実施形態では、皮膚細胞は哺乳動物細胞である。

【0018】

いくつかの実施形態では、皮膚細胞はヒトである。
皮膚細胞におけるサーチュイン遺伝子の発現をモジュレートする方法の実施形態は、有効量の１つまたは複数のペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、１つまたは複数のペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２からなる。

【0019】

本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および添付の図面を考慮することによって明らかになるであろう。そこでは、同様の参照名称は、図面全体を通して同様の特徴を表す。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1A】ＳＩＲＴ１の用量依存的な転写上方調節を示す図である（ａ）。データは、内部対照遺伝子１８Ｓに対する倍増として表され、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。

【図1B】ＳＩＲＴ３の用量依存的な転写上方調節を示す図である（ｂ）。データは、内部対照遺伝子１８Ｓに対する倍増として表され、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。

【図1C】ＳＩＲＴ６の用量依存的な転写上方調節を示す図である（ｃ）。データは、内部対照遺伝子１８Ｓに対する倍増として表され、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。

【図1D】ＳＩＲＴ７の用量依存的な転写上方調節を示す図である（ｄ）。データは、内部対照遺伝子１８Ｓに対する倍増として表され、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。

【図2A】表皮ケラチノサイトにおけるデカペプチド－１２とオキシレスベラトロールの細胞毒性効果を示す図である。データはパーセント対照として表され、３回の別々の実験の平均値±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。

【図2B】表皮ケラチノサイト増殖におけるデカペプチド－１２とオキシレスベラトロールの効果を示す図である。データはパーセント対照として表され、３回の別々の実験の平均値±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。

【発明を実施するための形態】

【0021】

詳細な説明
皮膚は、経時的および光老化での結果を表し、私たちに老化プロセスを常に認識させ、その影響を遅らせるかまたは反転させるような治療法を求めさせる。皮膚老化は伝統的に外因性または内因性によるものに分類されてきた。最近の証拠により、両方のタイプが、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現を促進するシグナル伝達経路の変更、プロコラーゲン合成の減少、および結合組織損傷を含む重要な分子的特徴を共有していることが示されている。

【0022】

ヒト皮膚において、老化は老化細胞の数の増加と細胞の増殖と分化の能力の低下に関連している。老化は主に様々な内因性の活性酸素種（ＲＯＳ）によるフリーラジカル損傷の結果であるという理論が、実質的な証拠により支持されている。Ｖｅｌａｒｄｅらは、ミトコンドリアの酸化的損傷、細胞セネッセンス、および皮膚の老化表現型の間の因果関係のｉｎ ｖｉｖｏにおける証拠を報告した。さらに、紫外線（ＵＶ）放射はＲＯＳ合成を刺激するが、これは突然変異誘発と光老化に関係している。これらの知見と一致して、紫外線照射された皮膚対日光保護された皮膚でのサーチュイン活性の発現の変化がデータにより示唆され、これらの差異が皮膚老化の特定の側面の原因である可能性がある。

【0023】

細胞セネッセンスとは、細胞が分裂を停止し、顕著なクロマチンおよびセクレトームの変化、ならびに腫瘍抑制因子の活性化を含む特徴的な表現型の変化を受けるプロセスと説明される。多数の報告が、細胞セネッセンスと早老化の遅延における多面的な役割を詳述する強力なアンチエイジングタンパク質としてのサーチュインの概念の確立を手助けしている。サーチュインは、ＤＮＡ損傷修復、テロメア短縮、酸化ストレスへの細胞応答、ＲＯＳ誘発性病態の軽快などの経路における重要なエフェクターである。

【0024】

哺乳動物においては、異なる細胞区画に局在し、多様な作用が可能である７つのサーチュイン遺伝子（ＳＩＲＴ１～７）が存在する。生化学的には、サーチュインは主にＮＡＤ^＋依存性リジンデアセチラーゼ活性を持つタンパク質のクラスである。サーチュインは、複数の代謝経路の重要な調節因子、細胞のエネルギーおよび酸化還元状態のセンサー、酸化ストレスのモジュレーターとして広く認識されている。

【0025】

これらの知見は、老化およびその幅広い範囲の加齢関連障害の進行を遅らせるのに役立つ低分子活性化因子または医薬品の開発への関心を引き起こした。７つの哺乳動物サーチュインの中で、ＳＩＲＴ１は老化と寿命に関して最も広く研究されている。例えば、レスベラトロールのアンチエイジング効果は主にＳＩＲＴ１の活性化に起因している。実際、Ｉｄｏらは、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼとサーチュインの活性を高めることにより、レスベラトロールが細胞セネッセンスおよび増殖機能障害を軽快したと報告した。

【0026】

我々は以前、デカペプチド－１２のヒト皮膚における強力な色素沈着低下効果を報告した。さらなる臨床研究により、１日２回、０．０１パーセントのデカペプチド－１２を含む局所クリームで８週間治療された色素異常症患者の顔の皮膚の外観が全体的に改善することが明らかになった。これらの知見により、我々はデカペプチド－１２がサーチュイン活性をモジュレートして全体的な皮膚の外観を改善する可能性があるという仮説を導いた。この可能性を明確にするために、デカペプチド－１２のヒト表皮前駆細胞でのサーチュイン転写における効果を評価した。

【0027】

材料および方法
試薬
デカペプチド－１２（ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹ）配列番号９は、固相ＦＭＯＣ化学を使用してＢｉｏ Ｂａｓｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）により合成された。オキシレスベラトロールは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。

【0028】

細胞培養
ヒト新生児表皮前駆細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＹ）を、２×１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。６０μＭ塩化カルシウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＹ）を含むＥｐｉｌｉｆｅ培地２ｍｌを各ウェルに加えた。プレートを加湿チャンバー中に摂氏３７度、５パーセントＣＯ_２でインキュベートした。２４時間後、５パーセントＤＭＳＯを含むＰＢＳに溶解した様々な濃度のオキシレスベラトロールまたはデカペプチド－１２で細胞を処理した。対照ウェルにはビヒクルのみを加えた（５パーセントＤＭＳＯおよびＰＢＳ）。各ウェル内のＤＭＳＯの最終濃度は０．０５パーセントであった。

【0029】

全ＲＮＡ抽出、定量、およびｃＤＮＡ合成
７２時間のインキュベーション期間後、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用し、製造業者のプロトコルに従って細胞をトリプシン処理し、全ＲＮＡを抽出した。

【0030】

ナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＹ）を使用してＲＮＡ濃度を決定した。オリゴｄＴプライマーとＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＹ）を使用し、２μｇの全ＲＮＡを使用してｃＤＮＡを合成した。ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で反応を行った。アニーリング温度は摂氏２５度で１０分間であり、続いて摂氏４８度で１時間の最初の鎖合成、摂氏９５度で５分間の熱不活性化であった。

【0031】

半定量分析
ＳＩＲＴ１～７プライマー（表１）は、Ｐｒｉｍｅｒ３を使用してデザインされた。半定量ＰＣＲ反応をＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で実行した。ＰＣＲは以下の条件で行われた：ＳＩＲＴ１～７およびハウスキーピング遺伝子１８Ｓについては３４サイクルの摂氏９４度で２分間の変性および摂氏５４度で３０秒間のプライマー伸長。

【0032】

表１：ＳＩＲＴ１～７および１８Ｓについてのプライマー配列

【0033】

【表1】

【0034】

サンプルを実行し、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含む１．５パーセントアガロースゲルで分離し、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ ＨＤ２ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｐｌｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して画像化した。ＡｌｐｈａＥａｓｅ ＦＣソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｐｌｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して、デンシトメトリー分析を行った。強度比は、各遺伝子に対する強度値を内部対照遺伝子１８Ｓの強度値で割って算出した。

【0035】

生存率／増殖および細胞毒性アッセイ
ＴＡＣＳ（登録商標）ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して、増殖率を決定した。摂氏３７度、５パーセントＣＯ_２の加湿雰囲気中で、細胞を９６ウェルプレートに２．５×１０^４／ウェルで播種した。２４時間後、デカペプチド－１２またはオキシレスベラトロールを様々な濃度（０、３、１０、３０、１００、３００、および１０００μＭ）で対応するウェルに加え、その後、培養物を７２時間インキュベートした。残りの手順は、製造業者のプロトコルに従って実行された。

【0036】

トリパンブルー色素排除アッセイを使用して細胞毒性を測定した。６ウェルプレート中、４×１０^５細胞／ウェルの密度で細胞を培養した。各ウェルに、異なる濃度のデカペプチド－１２またはオキシレスベラトロール（０、３、１０、３０、１００、３００、および１０００μＭ）を加えた。プレートを加湿した５パーセントＣＯ_２チャンバー内に摂氏３７度でインキュベートした。７２時間後、アリコートを採取し、血球計を使用して細胞をカウントした。以下の式に従って細胞毒性を測定した：［１－（対照内の細胞数－試験サンプル内の生細胞数）／対照内の細胞数］×１００パーセント。

【0037】

統計分析
平均値とその標準誤差は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用した３回の独立した実行から算出され、統計的有意性は対応のある分散分析を使用して決定された。Ｐ値は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であるとみなした。

【0038】

結果
増殖率と細胞毒性におけるデカペプチドの効果：
まず我々は、ヒト表皮前駆細胞におけるデカペプチド－１２およびオキシレスベラトロールの細胞毒性効果を評価した。図２Ａは、１００μＭデカペプチド－１２またはオキシレスベラトロールでの処理により、それぞれ３±１パーセントまたは６±１パーセントの細胞死をもたらしたことを示している。１ｍＭでは、デカペプチド－１２またはオキシレスベラトロールはそれぞれ７±２パーセントまたは１６±２パーセントの細胞死をもたらした。

【0039】

我々はまた、ヒト表皮前駆細胞の生存率と増殖におけるデカペプチド－１２とオキシレスベラトロールの効果を評価した。図２Ｂは、３００μＭデカペプチド－１２またはオキシレスベラトロールでの処理により、それぞれ細胞増殖が２±１パーセントまたは５±１パーセント減少したことを示している。しかしながら、増殖を３±２パーセント減少させた１ｍＭデカペプチド－１２とは異なり、オキシレスベラトロールとの３日間のインキュベーションでは、増殖が１２±２パーセント減少した。

【0040】

デカペプチド－１２はＳＩＲＴ１～７の転写を上方調節した：
我々は次に、オキシレスベラトロールとデカペプチド－１２がヒト表皮前駆細胞においてサーチュイン発現に及ぼす影響を評価した。図１Ａ～図１Ｄおよび表２は、デカペプチド－１２およびオキシレスベラトロールが用量依存的にＳＩＲＴ１～７の転写をモジュレートしたことを示す。３０μＭのオキシレスベラトロールでは、ＳＩＲＴ１転写レベルは対照細胞と比較して１２５±９パーセント上方調節された一方で、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７はそれぞれ１３３±５パーセント、７３±８パーセント、および９５±７パーセント上方調節された。

【0041】

表２。デカペプチド－１２（ａ）およびオキシレスベラトロール（ｂ）での処理に応答したＳＩＲＴ１～７の遺伝子発現プロファイル。結果は３回の独立した試行の平均である。

【0042】

【表2】

【0043】

【表3】

【0044】

データは、１００μＭデカペプチド－１２が未処理細胞と比較してＳＩＲＴ１の転写を１４１±１１パーセント増加させたのに対し、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ６およびＳＩＲＴ７はそれぞれ１２１±１３パーセント、１４７±８パーセント、および９５±１４パーセント増加したことを示している（図１Ａ～図１Ｄ）。

【0045】

討論
サーチュインの細胞セネッセンスを遅らせ、早老化の進行を阻止することに果たす多面的な役割が、それらが強力なアンチエイジングタンパク質であることを実証することに役立った。ＳＩＲＴ１活性化因子および潜在的なアンチエイジング剤としてのレスベラトロールの治療的使用は、広く研究され、文書化されている。レスベラトロールは、ＳＩＲＴ１の活性化を介して、Ｈ_２Ｏ_２により誘導される酸化ストレスとセネッセンスからヒト内皮を保護する。同様に、オキシレスベラトロールもまた、強力な抗酸化剤およびフリーラジカルスカベンジャーである。しかしながら、それはレスベラトロールとは異なり、細胞毒性がより低く、より良い水溶性である。故に、それをデカペプチド－１２の性能とヒト表皮ケラチノサイトのサーチュイン転写をモジュレートする能力を比較する陽性対照として使用することとした。

【0046】

７つのサーチュインはすべて、デカペプチド－１２での処理後に上方調節されたが、我々の議論は皮膚老化に直接関係するそれらのサーチュインに焦点を当てる。

【0047】

１００μＭまたは１ｍＭで、デカペプチド－１２は、ＳＩＲＴ１転写をそれぞれ印象的に１４１または２１３パーセント増加させた。ＳＩＲＴ１は主に核デアセチラーゼである。それは細胞増殖、分化、アポトーシス、代謝、ストレス応答、ゲノム安定性、および細胞生存などの様々な細胞プロセスを制御する。ＣａｏらはＳＩＲＴ１がＵＶＢおよびＨ_２Ｏ_２により誘導される細胞死に対する保護を培養皮膚ケラチノサイト内のｐ５３およびｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼのモジュレーションを介して付与することを報告しており、ＳＩＲＴ１活性化因子が新しい抗皮膚老化剤として働き得ることが示唆される。他の研究者は、ＳＩＲＴ１がＮＦ－κＢシグナル伝達を抑制することができ、したがって老化プロセスを遅らせ、寿命を延長し得ると報告した。ＳＩＲＴ１の活性化は、ＮＦ－κＢ複合体のｐ６５サブユニットを脱アセチル化することでＮＦ－κＢシグナル伝達を直接阻害し、酸化的代謝と炎症の消散を促進する。故に、ＳＩＲＴ１は、複数の分子経路を調節することにより、早期セネッセンスと促進老化を防ぐその広範な効果を媒介する重要なアンチエイジングタンパク質とみなすことができる。

【0048】

ＳＩＲＴ３転写は、１００μＭデカペプチドでの処理後に１２１パーセント増加した。ＳＩＲＴ３は主に、β酸化、ＡＴＰ生成、ＲＯＳの管理など、様々なミトコンドリアプロセスの調節に関連している。ＳＩＲＴ３は、造血幹細胞の再生能力の維持にも関与している。ＳＩＲＴ３は老化とともに抑制され、老化した造血幹細胞におけるＳＩＲＴ３上方調節は再生能力を改善する。この発見により、ＳＩＲＴ３が幹細胞性の維持に果たす重要な役割を確立され、さらに重要なことに、早老化をもたらす代謝障害に対する将来の幹細胞ベースの介入への道を開く助けとなる。

【0049】

ＳＩＲＴ６は、ＤＮＡ損傷修復、代謝調節、炎症、腫瘍抑制において多面的な役割を持つ重要なアンチエイジングタンパク質とみなすことができる。ＳＩＲＴ６は、そのノックアウトマウスモデルが１カ月以内に死亡する重度の早老化表現型を発症することで有名になった。さらに、ＳＩＲＴ６は、マウスの全身で過剰発現すると寿命の明らかな上昇を示す唯一の哺乳動物サーチュインである。さらに、Ｋａｗａｈａｒａらは、重要な抗炎症タンパク質としてのＳＩＲＴ６の役割を強化するＮＦ－κＢ標的遺伝子のプロモーター上のＫ９でヒストンＨ３を脱アセチル化することにより、ＳＩＲＴ６が活動亢進性ＮＦ－κＢシグナル伝達を減衰させると報告した。

【0050】

Ｂａｏｈｕａらは、皮膚老化のプロセスにおいて、ＳＩＲＴ６がコラーゲン代謝とＮＦ－κＢシグナル伝達のモジュレーションを介して重要な役割を果たすことを示した。彼らは、ＳＩＲＴ６をブロックすると、１型コラーゲンの転写が阻害され、マトリックスメタロプロテイナーゼ１分泌が促進し、ＮＦ－κＢシグナル伝達が増加することにより、ヒドロキシプロリン含量が大幅に減少することを報告した。まとめると、ＳＩＲＴ６は、細胞セネッセンスと促進老化を遅らせる複数の経路を調節することによるアンチエイジングプロセスの重要なモジュレーターとして卓越している。したがって、１００μＭでＳＩＲＴ６転写を１４７パーセント増強したデカペプチド－１２は、しばしば同時に起こる早期皮膚老化と光損傷皮膚の表現型に立ち向かう治療的アンチエイジング候補として大きな期待を有するかもしれない。

【0051】

まとめると、デカペプチド－１２は、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ６の転写レベルを有意に上方調節することがこの報告で示され、これら３つはすべて、皮膚老化やその他の老化に伴う病態に対抗する上で重要な役割を果たす。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの知見をバリデートし、ｉｎ ｖｉｖｏでこの強力なサーチュイン活性化因子の有効性を試験するのを支援するため、デカペプチド－１２を含む様々な局所製剤の臨床研究が現在、デザインされつつある。

【実施例】

【0052】

この例では、以下の表３で詳述するように、Ｐ４デカペプチドに特定の修飾を加えた。

【0053】

【表4】

【0054】

デカペプチドＰ４に対するこれらの修飾は、プロテアーゼに対する安定性を改善し、経皮または経細胞浸透、またはその両方を促進するのに役立ち得る。

【0055】

本発明のペプチドは、天然に存在するアミノ酸のいずれか、または天然に存在しないアミノ酸からの残基を含んでもよい。これらの天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸は、ＤまたはＬ配置であってもよく、または両方の右旋性形態を含んでもよい。用語ＤおよびＬは、当該技術分野において使用されることが知られているので、本出願で使用される。本発明のペプチドには、単一アミノ酸および短いスパン（例えば、１～２０）のアミノ酸が含まれる。さらに、本発明の修飾ペプチドは、モノマーまたはダイマーも含み得る。

【0056】

標準的な１文字と３文字のアミノ酸コードがこの出願で使用され、以下の表Ａにある。

【0057】

【表5】

【0058】

上記のように、示された残基は、天然に存在するＬアミノ酸、またはこれらの修飾、すなわち化学修飾、光学異性体、または修飾基へのリンクであり得る。サーチュイン遺伝子の発現を特異的にモジュレートする本ペプチドの能力を維持するための特定の修飾をペプチド内で行うことができると考えられる。

【0059】

サーチュイン１～７の転写レベルに対するデカペプチドＰ４、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、およびＰ４Ｃの効果を評価した。表４は、１０、３０、５０、１００および３００（すべてμＭ）の試験した濃度で、対応する遺伝子を持つ４つすべてのデカペプチドの転写レベルをまとめたものである。

【0060】

【表6】

【0061】

低濃度では、天然のデカペプチドＰ４は、修飾されたデカペプチドと比較して向上した転写レベルを示した。しかしながら、各々の３つの修飾デカペプチド（Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、およびＰ４Ｃ）は、対照と比較してサーチュイン遺伝子の転写レベルを上方調節した。１００μＭの濃度では、転写レベルへの影響は４つのデカペプチドすべてで同等であった。

【0062】

ＴＡＣＳ（登録商標）ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、３つのヒト細胞株（表皮前駆細胞、メラノブラスト、および線維芽細胞）の増殖率を決定した。９６ウェルプレートに摂氏３７度、５パーセントＣＯ_２の加湿雰囲気中、２．５×１０^４／ウェルで細胞を播種した。２４時間後、対応するウェルにデカペプチドを様々な濃度で加え、７２時間インキュベートした。残りの手順は、製造業者のプロトコルに従って実行された。

【0063】

７２時間後の表皮前駆細胞の増殖率を表５に示す。

【0064】

【表7】

【0065】

７２時間後のメラノブラスト増殖率を表６に示す。

【0066】

【表8】

【0067】

７２時間後の線維芽細胞増殖率を表７に示す。

【0068】

【表9】

【0069】

表皮前駆細胞、メラノブラスト、および線維芽細胞を１００μＭのデカペプチドＰ４Ａと７２時間インキュベートした結果、３つの細胞株すべての増殖率が３パーセント減少した。

【0070】

１０００μＭでは、表皮前駆細胞の増殖率は６パーセント減少した一方で、メラノブラストと線維芽細胞の増殖率はそれぞれ５パーセントと４パーセント減少した。

【0071】

細胞生存率に対する各デカペプチドの効果も試験された。特に、細胞を様々な濃度のデカペプチドとインキュベートし、トリパンブルーを使用して対照（未処理細胞）と比較して生存率をカウントした。以下の式に従って細胞毒性を測定した。

【0072】

［１－（対照内の細胞数－試験サンプル内の生細胞数）／対照内の細胞数］×１００パーセント。

【0073】

７日後の表皮前駆細胞の生存率を表８に示す。

【0074】

【表10】

【0075】

７日後のメラノブラストの生存率を表９に示す。

【0076】

【表11】

【0077】

７日後の線維芽細胞の生存率を表１０に示す。

【0078】

【表12】

【0079】

１００μＭの濃度では、３つの細胞株すべてで細胞生存率が９７パーセントを超えたままであった。１０００μＭでは、細胞生存率は対照と比較して６パーセント低下した。

【0080】

結論として、最近の報告において、早老化の抑制、細胞セネッセンスの遅延、寿命の延長、および幅広い老化障害の軽快においてサーチュインが果たす多面的な役割について詳述されている。本明細書において、強力なサーチュイン活性化因子であるデカペプチド－１２に関する知見を報告し、その性能を十分に実証されたオキシレスベラトロールと比較する。ヒト表皮前駆細胞を１００μＭデカペプチド－１２で処理すると、ＳＩＲＴ１の転写が対照細胞と比較して１４１±１１パーセント増加する一方で、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ６、およびＳＩＲＴ７のレベルは、それぞれ１２１±１３パーセント、１４７±８パーセント、および９５．４±１４パーセント増加した。デカペプチド－１２は、サーチュイン転写をオキシレスベラトロールと同様のレベルに上方調節したが、細胞毒性は低下した。したがって、デカペプチド－１２は、皮膚老化やその他の老化に伴う病態に対抗するためのより安全な治療剤として有望であり得る。

【0081】

上記の説明では、効果が明らかな１００μＭ以上の典型的なデカペプチド濃度に言及しているが、結果は、より低い濃度が陽性効果を持つこともまた実証している。したがって、いくつかの実施形態では、１μＭ以上のデカペプチド濃度を利用し、特定の実施形態では、１００μＭ以上のペプチド濃度範囲を使用してもよい。様々な実施形態によるペプチド濃度範囲の例は、１μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、３０μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、３００μＭ以上、５００μＭ以上、および１０００μＭ以上である。

【0082】

所望の効果を達成するために、特定のデカペプチドを他の成分と組み合わせて使用してもよいことにさらに留意されたい。例えば、特定のデカペプチドは、デカペプチドＰ４Ａ、４Ｂ、および／もしくは４Ｃなどの他のペプチドならびに／またはオキシレスベラトロールなどの他の成分と組み合わせて使用されることがあり得る。そのような実施形態によれば、他の成分を含めることにより実現される相乗効果は、所望の結果を達成するために必要である個々の成分（例えば、デカペプチド他）の濃度を最終的に低下させ得る。

【0083】

上記は可能な追加成分としてデカペプチドおよびオキシレスベラトロールを具体的に含むが、実施形態はこれに限定されない。他の可能な添加物の例としてはとりわけ、α－リポ酸、ビオチン、カフェイン、セラミド、コエンザイムＱ１０、グリコール酸、緑茶、ヒト幹細胞、ヒト幹細胞抽出物、ヒアルロン酸、ハイドロキノン、ホホバ油、コウジ酸、乳酸、リンゴ酸、ナイアシンアミド、オリゴペプチド、ペプチド、植物幹細胞、植物幹細胞抽出物、レスベラトロール、レチノール、ビタミンＣ、ビタミンＥ、およびビタミンＫが含まれるが、これらに限定されない。

【0084】

実施形態は、様々な種類の皮膚細胞を治療するために利用してもよいことに留意されたい。最終分化した皮膚細胞の例には、ケラチノサイト、線維細胞、メラニン細胞、および同様に経時的に老化するランゲルハンス細胞（例えば、組織球またはデンドロサイト）などの免疫細胞が含まれるが、これらに限定されない。

【0085】

実施形態はまた、皮膚前駆細胞を治療して皮膚老化を低減し、その寿命にわたって皮膚の再生を可能にするために利用されてもよい。そのような前駆細胞の例には、表皮ケラチノサイト前駆細胞、線維芽細胞、メラノブラスト、組織芽細胞、または表皮に留まるランゲルハンス細胞の前駆細胞であるデンドロブラストが含まれるが、これらに限定されない。

【0086】

最後に、上記ではヒト皮膚細胞の治療について説明したが、特定の実施形態はそのようなアプローチに限定されない。代替的な実施形態では、ウシ（例えば、革の製造）、ブタ、および他の動物（例えば、犬、猫、および競技の目的で皮膚の外観に基づいて評価され得る他の動物）などの哺乳動物を含むがこれらに限定されない他の生物の皮膚細胞の治療を利用し得る。

【0087】

本発明のこの記載は、例示および説明の目的で提示されている。網羅的であること、または記載された正確な形態に本発明を限定することは意図されておらず、上記の教示に照らして多くの修正および変形が可能である。実施形態は、本発明の原理およびその実際の応用を最もよく説明するために選択および説明された。この説明により、他の当業者は、特定の用途に適した様々な実施形態においておよび様々な修正とともに本発明を最良に利用および実現することが可能になる。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【配列表】

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