特許 7620575 インビボでセロトニンを産生するように設計された高度な微生物叢治療薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-15

(45)【発行日】2025-01-23

(54)【発明の名称】インビボでセロトニンを産生するように設計された高度な微生物叢治療薬

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/74 20150101AFI20250116BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 5/00 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 25/22 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 25/20 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 25/06 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20250116BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250116BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250116BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20250116BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20250116BHJP

   C12N 15/60 20060101ALN20250116BHJP

【ＦＩ】

A61K35/74 A

A61P25/00

A61P1/00

A61P5/00

A61P3/00

A61P1/16

A61P3/06

A61P3/10

A61P25/22

A61P25/24

A61P25/28

A61P25/20

A61P25/06

A61P29/00

A61P37/02

A61P1/04

A61P35/00

C12N1/21 ZNA

C12N1/20 E

C12N15/53

C12N15/60

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2021573417

(86)(22)【出願日】2020-06-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-10

(86)【国際出願番号】 EP2020066383

(87)【国際公開番号】W WO2020249784

(87)【国際公開日】2020-12-17

【審査請求日】2023-06-08

(31)【優先権主張番号】62/861,007

(32)【優先日】2019-06-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】19186680.5

(32)【優先日】2019-07-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】507023887

【氏名又は名称】ダンマークス テクニスク ユニバーシテット

【氏名又は名称原語表記】ＤＡＮＭＡＲＫＳ ＴＥＫＮＩＳＫＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＴ

【住所又は居所原語表記】Ａｎｋｅｒ Ｅｎｇｅｌｕｎｄｓ Ｖｅｊ １０１，ＤＫ－２８００ Ｋｏｎｇｅｎｓ Ｌｙｎｇｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ

(73)【特許権者】

【識別番号】521540656

【氏名又は名称】ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティー オブ ニューヨーク

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ソマー，モーテン オット アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】ボンジャーズ，マレイケ

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ハリス ヘ

(72)【発明者】

【氏名】クシマノ，フランク

【審査官】濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０３２９１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／００２４４４０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５３２４１２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／７４

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ １／２０

Ｃ１２Ｎ １５／５３

Ｃ１２Ｎ １５／６０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

医薬としての使用のための組成物であって、前記組成物が、組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍの細胞を含み、前記細胞が、それぞれ、以下をコードする１つ以上の組換え核酸分子を含み：
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）および
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍは、以下を発現することができる遺伝子を欠き：
ｉ．Ｔｒｐオペロンリプレッサータンパク質、および／または
ｉｉ．トリプトファナーゼ（ＥＣ ４．１．９９．１）
前記細胞は、変異体ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＥＣ ３．５．４．１６）をコードする核酸分子を含み、前記変異体が、非変異体ＧＣＨ１と比較して少なくとも２倍の、前記トリプトファン５－ヒドロキシラーゼの増加したヒドロキシル化活性を提供し、
前記組成物は経口投与されるための、組成物。

【請求項2】

前記変異体ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩが、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸を有し、Ｔ１９８Ｉ、Ｔ１９８Ｓ、Ｆ２１４Ｓ、Ｖ１７９Ａ、Ｍ９９ＩおよびＬ２００Ｐから選択される置換を含む、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項3】

前記トリプトファン５－ヒドロキシラーゼの前記アミノ酸配列が、配列番号６または１２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記トリプトファンデカルボキシラーゼの前記アミノ酸配列が、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ株が、
以下をコードする組換え核酸分子をさらに含み：
（ｃ）セロトニンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．８７）および
（ｄ）アセチルセロトニンＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．１．１．４）、
前記細胞が、メラトニンを産生することができる、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

前記トリプトファン５－ヒドロキシラーゼおよび前記トリプトファンデカルボキシラーゼをコードする前記核酸分子が、それぞれ第１のリボソーム結合部位および第２のリボソーム結合部位に機能的に連結され、前記第１のリボソーム結合部位の翻訳開始強度が、前記第２のリボソーム結合部位よりも少なくとも１０倍大きい、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項6】

前記トリプトファン５－ヒドロキシラーゼおよび前記トリプトファンデカルボキシラーゼをコードする前記核酸分子が、それぞれ第１のリボソーム結合部位および第２のリボソーム結合部位に機能的に連結され、前記第１のリボソーム結合部位の前記翻訳開始強度が、前記第２のリボソーム結合部位よりも少なくとも２倍低い、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項7】

前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株である、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項8】

動物における、中枢神経系（ＣＮＳ）および腸管神経系（ＥＮＳ）のＴＲＭ、５－ＨＴＰ、５－ＨＴ関連障害の予防および／または治療に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項9】

前記中枢神経系の前記障害が、不安および鬱病に関連する行動、記憶、認知、および精神障害、全般性不安障害、恐怖症障害、社交不安障害、パニック障害、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、慢性ストレス障害、分離および状況不安、加齢性記憶低下、認知症および睡眠、空間記憶形成、警戒心、集中力、学習および認知における障害、自閉症および片頭痛からなる群から選択される、請求項８に記載の使用のための組成物。

【請求項10】

前記組成物が、経口投与を必要とする哺乳動物への経口投与用である、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項11】

以下から選択される１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の組換え核酸分子または導入遺伝子を含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍの組換え細胞であって：
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、および
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍは、以下を発現することができる遺伝子を欠き：
ｉ．ｔｒｐオペロンリプレッサータンパク質および
ｉｉ．トリプトファナーゼ（ＥＣ：４．１．９９．１）
前記細胞が、変異体ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＥＣ ３．５．４．１６）をコードする核酸配列を含み、前記変異体が、非変異体ＧＣＨ１と比較して少なくとも２倍の、前記トリプトファン５－ヒドロキシラーゼの増加したヒドロキシル化活性を提供する、組換え細胞。

【請求項12】

前記変異体ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩが、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｔ１９８Ｉ、Ｔ１９８Ｓ、Ｆ２１４Ｓ、Ｖ１７９Ａ、Ｍ９９ＩおよびＬ２００Ｐから選択される置換を含む、請求項１１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍの組換え細胞。

【請求項13】

前記トリプトファン５－ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列が、配列番号６または１２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、前記トリプトファンデカルボキシラーゼの前記アミノ酸配列が、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１１または１２に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍの組換え細胞。

【請求項14】

トリプトファン５－ヒドロキシラーゼおよびトリプトファンデカルボキシラーゼをコードする前記核酸分子が、それぞれ第１のリボソーム結合部位および第２のリボソーム結合部位に機能的に連結され、
前記第１のリボソーム結合部位の翻訳開始強度が、前記第２のリボソーム結合部位よりも少なくとも１０倍大きい、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍの組換え細胞。

【請求項15】

トリプトファン５－ヒドロキシラーゼおよびトリプトファンデカルボキシラーゼをコードする前記核酸分子が、それぞれ第１のリボソーム結合部位および第２のリボソーム結合部位に機能的に連結され、
前記第１のリボソーム結合部位の前記翻訳開始強度が、前記第２のリボソーム結合部位よりも少なくとも２倍低い、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍの組換え細胞。

【請求項16】

以下をコードする組換え核酸分子をさらに含み：
（ｃ）セロトニンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．８７）および
（ｄ）アセチルセロトニンＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．１．１．４）、前記細胞が、メラトニンを産生することができる、請求項１１に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍの組換え細胞。

【請求項17】

前記細胞が、１つ以上の臨床的に使用される抗生物質に対して抗生物質耐性ではない、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の組換え細菌細胞。

【請求項18】

前記細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株である、請求項１１～１７のいずれか一項に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍの組換え細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医薬としての使用のための組成物であって、それが由来した非組換え微生物と比較して増加した量の、５－ヒドロキシトリプトファン（５－ＨＴＰ）、５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）およびトリプタミン（ＴＲＭ）のうちの１つ以上を産生することができる組換え微生物の細胞を含む、組成物を提供する。組成物は、哺乳動物における、中枢神経系（ＣＮＳ）、腸管神経系（ＥＮＳ）、胃腸（ＧＩ）および代謝のＴＲＭ、５－ＨＴＰもしくは５－ＨＴ関連障害の予防および／または治療への使用を見出し、それを必要とする哺乳動物に経口投与され得る。さらに、メラトニンを産生することができる組換え微生物の細胞を含む組成物が、医薬としての使用のために提供される。

【背景技術】

【0002】

生体モノアミンセロトニン（５－ヒドロキシトリプタミン、５－ＨＴ）は、全身の神経伝達および他の多くの機能にとって重要である。体内のセロトニンの最大９５％が、胃腸管で産生される。図１に示すように、セロトニンは、最初にトリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）によって５－ヒドロキシトリプトファン（５－ＨＴＰ）中間体を形成し、次にトリプトファンデカルボキシラーゼ（ＴＤＣ）によって、２段階の反応でトリプトファン（ＴＲＰ）から誘導される。ヒトでは、トリプトファンヒドロキシラーゼは、５－ＨＴ生合成の律速段階であり、ＴＰＨ１およびＴＰＨ２の２つのアイソフォームで作製される。ＴＰＨ２は全身のニューロンで産生されるが、ＴＰＨ１は主に腸内の神経内分泌細胞で発現する。

【0003】

胃腸管では、セロトニンは、腸の運動性、細胞の代謝回転、および恒常性を調節する。脳では、セロトニンレベルの不均衡は不安および鬱病に関連している。治療には、不安および鬱病に関連する広範な疾患を患っている患者においてセロトニンを高めるためのストラテジーが含まれる。

【0004】

選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）は、鬱病の治療に広く処方されている。それらは、シナプス前細胞への再吸収（再取り込み）を制限し、シナプス後受容体に結合するために利用可能なシナプス間隙のセロトニンのレベルを増加させることによって、神経伝達物質セロトニンの細胞外レベルを増加させると考えられている。患者のサブグループは、ＳＳＲＩ治療抵抗性（ＴＲＤ）の症状を示す。哺乳動物モデルで現在臨床試験中のＴＲＤ患者の治療は、ＳＳＲＩ（セロトニン再取り込み阻害剤）およびセロトニン前駆体である５－ヒドロキシトリプトファン（５－ＨＴＰ）の併用療法に基づく。これは、投与された５－ＨＴＰの急速な取り込みにより、５－ＨＴレベルの突然の増加につながるという望ましくない結果を有する。この問題に対処するための努力は、現在、５－ＨＴＰの徐放形態を用いる併用療法に焦点を合わせている。

【0005】

腸内細菌は、胃腸（ＧＩ）の健康および恒常性に重要な役割を果たす。腸内微生物は、腸の恒常性を調節するだけでなく、腸脳軸に沿った腸管神経系（ＥＮＳ）および中枢神経系（ＣＮＳ）による双方向のシグナル伝達経路にも関与すると考えられている。腸内の常在微生物相は、それら自体が５－ＨＴの顕著な供給を提供するよりもむしろ、腸の５－ＨＴ含有量および５－ＨＴ血漿レベルを維持するために宿主粘膜内分泌細胞にシグナルを送ることが知られている。より最近では、動物モデルで特定の細菌を経口摂取すると、宿主の生理機能および行動に変化をもたらすことが示され、このことは、腸脳連関におけるこれらの微生物の役割を示唆する。

【0006】

脳の海馬、線条体、皮質、および歯状回では、セロトニンベースの生合成経路、セロトニンベースの受容体、およびセロトニンベースのシグナル伝達経路が、記憶、認知／加齢関連の空間学習、および記憶形成に関係している。胃腸管からのセロトニン作動性求心性ニューロンは、迷走神経を介して迷走神経の背側運動核および孤束神経の核を変化させるため、腸の５－ＨＴは、ニューロンの記憶、認知、および学習に関与する。

【0007】

哺乳動物の恒常性および不十分な５－ＨＴレベルから生じる病状におけるＴＲＭおよび５－ＨＴの重要な役割を考慮して、患者、特に不安関連疾患、およびＴＲＤを患っている患者の５－ＨＴレベルを上昇させるための新しい治療法が必要とされている。

【0008】

シグナル伝達分子であるメラトニンは、主に夜間に松果体のホルモンとして放出される、多面発現性の高い分子である。メラトニン分泌は加齢とともに減少するが、減少したメラトニンレベルは、いくつかの種類の認知症、一部の気分障害、重篤な疼痛、がん、および２型糖尿病などの様々な疾患でも観察される。メラトニンの機能不全は、振幅の偏差、位相、および概日リズムの結合にしばしば関連する。したがって、治療を必要とする患者のメラトニンのレベルを上昇させる治療が必要とされている。

【発明の概要】

【0009】

第１の実施形態において、本発明は、医薬としての使用のための組成物であって、該組成物が、組換え微生物の細胞を含み、該微生物が、
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、および
（ｃ）トリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）から選択される１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の組換え核酸分子を含む、組成物を提供する。

【0010】

したがって、細胞は、それが由来した非組換え微生物の細胞と比較して、増加した量の５－ヒドロキシトリプトファン、５－ヒドロキシトリプタミンおよびトリプタミンのうちの１つ以上を産生することができる。

【0011】

第２の実施形態において、本発明は、
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、および
（ｃ）トリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）から選択される１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の組換え核酸分子または導入遺伝子を含む、組換え細菌細胞を提供し、
該微生物は、ｔｒｐオペロンリプレッサータンパク質およびトリプトファナーゼ（ＥＣ：４．１．９９．１）を発現することができる遺伝子を欠く。したがって、細胞は、それが由来した非組換え微生物の細胞と比較して、増加した量の５－ヒドロキシトリプトファン、５－ヒドロキシトリプタミンおよびトリプタミンのうちの１つ以上を産生することができる。

【0012】

好ましくは、組換え細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓの中から選択される。

【0013】

第３の実施形態において、本発明は、対象において、ＴＲＭ、５－ＨＴＰ、５－ＨＴ、もしくはメラトニン関連障害を治療および／または予防する方法であって、ＴＲＭ、５－ＨＴＰ、５－ＨＴ、もしくはメラトニン関連障害と診断された対象に、
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、または
（ｃ）トリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）のうち１つ以上を発現するように操作された組換え細菌を投与することを含む、方法を提供する。

【0014】

したがって、細胞は、それが由来する非組換え微生物の細胞と比較して、増加した量の５－ヒドロキシトリプトファン、５－ヒドロキシトリプタミンおよびトリプタミンのうち１つ以上を産生することができる。

【0015】

ＴＲＭ、５－ＨＴＰ、５－ＨＴ、もしくはメラトニン関連障害は、哺乳動物における中枢神経系（ＣＮＳ）、腸管神経系（ＥＮＳ）、胃腸（ＧＩ）または代謝の障害であり得る。

【0016】

第４の実施形態において、本発明は、１つ以上の組換え核酸分子または導入遺伝子を含む組換え微生物であって、該微生物が、
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、およびトリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、または
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）およびトリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）
をコードする組換え核酸分子を含み、かつ
（ｃ）セロトニンアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＮＡＴ）ＥＣ ２．３．１．８７および
（ｄ）アセチルセロトニンＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＡＳＭＴ）（ＥＣ ２．１．１．４）をコードする組換え核酸分子を含み、
細胞が、メラトニンを産生することができる、組換え微生物を提供する。したがって、細胞は、それが由来した非組換え微生物の細胞と比較して、増加した量のメラトニンを産生することができる。

【0017】

第５の実施形態において、本発明は、医薬としての使用のための組成物であって、該組成物が、第４の実施形態によるメラトニンを産生することができる組換え微生物の細胞を含み、以下のメラトニン関連障害：概日リズム障害、不眠症、時差ぼけ、自閉症などのメラトニン欠乏またはメラトニン関連障害、認知症、気分障害、重篤な疼痛、がん、および２型糖尿病を患っている患者の経口送達に好適な、組成物を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

発明の説明
図面の簡単な説明

【図1】５－ＨＴおよびメラトニン生合成経路の触媒作用を示すカートゥーンである。ＴｒｐＲ（トリプトファンオペロンリプレッサータンパク質）、ＴｎａＡ（トリプトファナーゼ）、ＦｏｌＥ（変異体ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（Ｔ１９８Ｉ）をコードする）ＴＲＰ（トリプトファン）、ＴＲＭ（トリプタミン）、５－ＨＴＰ（５－ヒドロキシトリプトファン）、５－ＨＴ（セロトニン）、ＴＰＨ（トリプトファンヒドロキシラーゼ）、ＴＤＣ（トリプトファンデカルボキシラーゼ）、Ｔ５Ｈ（トリプタミン５－ヒドロキシラーゼ）、セロトニンアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＮＡＴ）およびアセチルセロトニンＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＡＳＭＴ）。

【図2】［Ａ］ヒトＴＰＨ１およびイネＴＤＣ（Ｈ１Ｒ）をコードするＴＰＨおよびＴＤＣ遺伝子、ヒトＴＨＰ２（Ｈ２）およびイネＴＤＣ（Ｈ２Ｒ）、ヒトＴＨＰ２（Ｈ２）およびＣａｔａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ ＴＤＣ（Ｈ２Ｃ）、ヒトＴＨＰ２（Ｈ２）およびモルモットＴＤＣ（Ｈ２Ｇ）、マウスＴＰＨ１（Ｍ１）およびイネＴＤＣ（Ｍ１Ｒ）、ならびにマウスＴＨＰ２（Ｍ２）およびイネＴＤＣ（Ｍ２Ｒ）をそれぞれ共発現するように操作された６つのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株の細胞の培養物に由来する培地で測定された、ＴＲＭ（トリプタミン）、５－ＨＴＰ（５－ヒドロキシトリプトファン）、５－ＨＴ（セロトニン）の力価を示すヒストグラムである。［Ｂ］ヒトＴＨＰ２（Ｈ２）およびイネＴＤＣ（Ｈ２Ｒ）をコードするＴＰＨおよびＴＤＣ遺伝子、ヒトＴＨＰ２（Ｈ２）およびＣａｔａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ ＴＤＣ（Ｈ２Ｃ）、ヒトＴＨＰ２（Ｈ２）およびモルモットＴＤＣ（Ｈ２Ｇ）をそれぞれ共発現するように操作された３つのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株の細胞の５－ＨＴＰ供給培養物に由来する培地で測定されたＴＲＭ（トリプタミン）、５－ＨＴＰ（５－ヒドロキシトリプトファン）、５－ＨＴ（セロトニン）の力価を示すヒストグラムである。

【図3】基質を添加した増殖培地でＴＰＨおよびＴＤＣを共発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（ＥｃＮ△２＋ｐＵＣ－Ｈ２Ｒ）の培養後の培地で測定された、ＴＲＭ（トリプタミン）、５－ＨＴＰ（５－ヒドロキシトリプトファン）および５－ＨＴ（セロトニン）の、１０～１００ｍｇトリプトファン／Ｌの範囲での力価を示すヒストグラムである。

【図4】［Ａ］ＯＤ_{６００ｎｍ}での単位として測定された、４つのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株の培養物の細胞密度を示すグラフである。株は、ＥｃＮ△２＋ｐＵＣ－Ｈ２Ｒ、ＥｃＮ△３＋ｐＵＣ－Ｈ２Ｒ、ＥｃＮ△２＋ｐＭＵＴ－Ｈ２Ｒであり、各々ヒトＴＰＨ２（Ｈ２）およびイネＴＤＣ（Ｒ）を共発現する、ＥｃＮ ＋ｐＭＵＴは空のプラスミドである。ＥｃＮ△２は、欠失ΔｔｒｐＲ、ΔｔｎａＡを有し、ＥｃＮ△３は、欠失ΔｔｒｐＲ、ΔｔｎａＡ、ΔｉｎｆＡを有する。［Ｂ］ＯＤ_{６００ｎｍ}の単位として測定された、ヒトＴＰＨ２（Ｈ２）またはマウスＴＰＨ１（Ｍ１）をイネＴＤＣ（Ｒ）とともに共発現する９つのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株の培養物の細胞密度、および空のプラスミドを含む対照株を示すグラフである。［Ｃ］抗生物質を選択せずに１００世代の増殖期間にわたって測定された、ｐＵＣベースまたはｐＭＵＴベースのセロトニン産生プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株の培養で検出されたカナマイシン耐性コロニーの割合を示すグラフである。各時点で、細胞を、ＬＢ寒天プレート＋／－カナマイシンにプレーティングし、コロニーの比率を計算した（ｎ＝６）。［Ｄ］ｐＵＣ（ｐＵＣ－Ｈ２Ｒ）またはｐＭＵＴ（ｐＵＣ－Ｈ２Ｒ）プラスミドにクローン化されたヒトＴＰＨ２（Ｈ２）およびイネＴＤＣ（Ｒ）を共発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株の培養後に培地中で測定された５－ＨＴ（セロトニン）の０－１００細胞世代についての力価を示すヒストグラムである。

【図5】［Ａ］ｐＵＣまたはｐＭＵＣプラスミドでヒトＴＰＨ２およびイネＴＤＣ（Ｈ２Ｒ）、またはマウスＴＰＨ１およびイネＴＤＣ（Ｍ１Ｒ）オペロンを共発現するか、または空のｐＭＵＴプラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株Ｎ、ＮΔ２および「ｏＮ」培養後の培地で測定した、ＴＲＭ（トリプタミン）および５－ＨＴ（セロトニン）の力価を示すヒストグラムである。［Ｂ］マウスＴＰＨ１（ｏＮ１０＝ｏＮ＋ｐＭＵＴＭ１）、イネＴＤＣ（ｏＮ１１＝ｏＮ＋ｐＭＵＴＲ）、マウスＴＰＨ１およびイネＴＤＣ（ｏＮ１４＝ｏＮ＋ｐＭＵＴＭ１Ｒ）を発現するかまたは空のプラスミド（ｏＮ９＝ｐＭＵＴ）を保持するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ「ｏＮ」株培養後の培地で測定した、ＴＲＭ（トリプタミン）、５－ＨＴＰ（ヒドロキシトリプトファン）および５－ＨＴ（セロトニン）の力価を示すヒストグラムである。示される全てのデータは、ｎ＝３の生物学的複製からの標準偏差のエラーバー付きの平均値である。［Ｃ］および［Ｄ］左パネル：広範な翻訳強度を有するＲＢＳ配列に機能的に連結されたプラスミドｐＭＵＴ－Ｈ２ＲおよびｐＭＵＴ－Ｍ１Ｒを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株の培養後の培地で測定された、ＴＲＰ（トリプトファン）、ＴＲＭ（トリプタミン）、５－ＨＴＰ（５－ヒドロキシトリプトファン）および５－ＨＴ（セロトニン）の力価を示すヒストグラムである。右パネル：ある範囲の翻訳強度を有するＲＢＳ配列に機能的に連結されたプラスミドｐＭＵＴ－Ｈ２Ｒを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株について測定された培養培地中の５－ＨＴ、５－ＨＴＰおよびトリプタミンの収量を示す２次元図であり、ｘ軸は、ＴＰＨ遺伝子のＲＢＳ強度に対応し、ｙ軸は、ＴＤＣのＲＢＳ強度に対応し、取り消し線の付いたボックスは、試験されていない組み合わせを示す。［Ｅ］Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅゲノムへの遺伝子改変および［Ｂ］で試験されたプラスミドの遺伝子構造を示すカートゥーンである。［Ｆ］各々がヒトＴＰＨ２ｐＭＵＴプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＮΔ２（＝ｆｏｌＥ ＷＴ）またはｏＮ（＝ｆｏｌＥ（Ｔ１９８１Ｉ））の培養後に培地で測定された５－ＨＴＰの力価を示すヒストグラムである。

【図6】［Ａ］ｐＵＣプラスミドにクローン化された異なる翻訳強度のＲＢＳ配列に機能的に連結されたヒトＴＰＨ２およびイネＴＤＣ（Ｈ２Ｒ）遺伝子を各々共発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＮΔ２または株ｏＮの培養後に培養培地で測定された、５－ＨＴ（セロトニン）およびＴＲＭ（トリプタミン）の力価を示すヒストグラムである。［Ｂ］各々ヒトＴＰＨ２またはマウスＴＰＨ１遺伝子を、ｐＭＵＴプラスミドにクローン化された異なる翻訳強度のＲＢＳ配列に機能的に連結されたイネＴＤＣ（Ｈ２Ｒ）遺伝子と組み合わせて発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＮΔ２または株ｏＮの培養後に培養培地で測定した５－ＨＴ（セロトニン）およびＴＲＭ（トリプタミン）の力価を示すヒストグラムである。［Ｃ］腸内微生物叢の総数のパーセントとして測定された５－ＨＴ産生細菌の存在量に対する、マウス腸内の理論的５－ＨＴ濃度を示すグラフである。腸内の５－ＨＴの理論的生理学的レベルは、示されるように、５～３０ｍｇ／Ｌの範囲にある。治療有効範囲内で５－ＨＴを産生するために必要な５－ＨＴ産生細菌の相対的な存在量を、０．１～１０ｍｇ／Ｌ^＊ＯＤ_６３０ ^＊ｈのインビボ５－ＨＴ産生率（Ｐ）を有する細菌についてプロットする。

【図7】［Ａ］Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ９、ｏＮ１１、ｏＮ１４および対照（ＰＢＳ）の最後の強制経口投与の２４時間後のマウスに由来する中結腸の薄片の画像であり、ここで、切片はＤＡＰＩおよび抗ＧＦＰ抗体で染色された。［Ｂ］いずれかのＥ．ｃｏｌｉ株ｏＮ９、ｏＮ１１、またはｏＮ１４、または対照（ＰＢＳ）による最後の強制経口投与の２４時間後のマウス由来の十二指腸、空腸回盲部、盲腸、近位結腸、遠位結腸、および糞便中のカナマイシン耐性ＧＦＰ陽性細菌濃度を示すグラフである。ＬＢ寒天プレートおよびカナマイシン上にプレートしたサンプル、および糞便１グラム当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として計数測定されたコロニー（ｎ＝６）。ｙ＝０で示されたデータポイントは、１０^３ＣＦＵ／グラムの検出レベルを下回った。

【図8】Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ９、ｏＮ１１、ｏＮ１４、または対照（ＰＢＳ）のいずれかを用いた最後の強制経口投与の２４時間後のマウスに由来する、血清中のｍｇ／Ｌ、洗浄した均質化Ｅ．ｃｏｌｉ組織中のバイオマス中のｍｇ／ｇ、糞便物質中のバイオマスｍｇ／ｇ（ｎ＝７－８））として測定した［Ａ］トリプトファンおよび［Ｂ］５－ＨＴ濃度を示すヒストグラムである。示される全てのｐ値は、多重比較検定のためのテューキーの事後補正を用いる一元配置分散分析からのものである。示されない他の全ての比較は、ｐ＞０．０５で有意ではなかった。データは、平均の標準誤差としてのエラーバー付きの平均値である。［Ｃ］Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ９、ｏＮ１１、ｏＮ１４および対照（ＰＢＳ）を最後に強制経口投与してから２４時間後のマウスに由来する中結腸の薄切片の画像。ここで、切片は、ＤＡＰＩおよび抗セロトニン抗体で染色されており、スケールバーは、１００μｍである。

【図9】［Ａ］Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ９、ｏＮ１１、またはｏＮ１４、または対照（ＰＢＳ）の最後の強制経口投与の２４時間後のマウス由来の結腸組織で、ΔΔＣτ（ｎ＝６）により相対的ｍＲＮＡとして測定された、ＭＵＣ２、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＳＥＲＴ遺伝子発現レベルの相対的発現を示すヒストグラムである。データは、平均の標準誤差としてのエラーバー付きの平均値である。［Ｂ］Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ９、ｏＮ１１、ｏＮ１４および対照（ＰＢＳ）による最後の強制経口投与の２４時間後のマウスに由来する中結腸の薄片の画像。ここで、切片は、ＤＡＰＩおよび抗Ｍｕｃ－２抗体で染色され、スケールバーは、４００μｍである。矢印は、ｏＮ１４中でのＭＵＣ２シグナルの増加を示している。

【図10】Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ９、ｏＮ１１、ｏＮ１４、または対照（ＰＢＳ）のいずれかによる最後の強制経口投与の２４時間後のマウス由来結腸組織におけるＲＴ－ＰＣＲ（ｎ＝６）による結腸内の５－ＨＴ受容体ＨＴＲ１Ｂ ＨＴＲ１Ｄ、ＨＴＲ３、ＨＴＲ４、およびＨＴＲ７の相対的発現を示すヒストグラム［（ａ）－（ｅ）］。対応して処理されたマウスコホートにおける６％カーマインレッド溶液（方法）（ｎ＝７－８）を用いた口から肛門までの総胃腸通過時間を示すヒストグラム（ｆ）。示される全てのｐ値は、多重比較検定のためのテューキーの事後補正を用いる一元配置分散分析からのものである。示されない他の全ての比較は、ｐ＞０．０５で有意ではなかった。データは、平均の標準誤差としてのエラーバー付きの平均値である。

【図11】（ａ）６分間の強制水泳試験（ＦＳＴ）（ｎ＝９－１０）の最後の４分間にマウスが不動で滞在した時間、（ｂ）１０分間のオープンフィールド試験（ＯＦＴ）中に産生された糞便ペレットの数（排泄（ｆｅｃａｌ ｂｏｌｉ）の数）（ｎ＝７－１０）、（ｃ）１０分間のＯＦＴ中にマウスが移動した平均総距離（ｎ＝７－１０）、（ｄ）ＯＦＴ中に内側の４０ｃｍ×４０ｃｍゾーンまたは外側の１０ｃｍリングの両方で滞在した時間（ｎ＝７－１０）、（ｅ）Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ９、ｏＮ１１、ｏＮ１４、または対照（ＰＢＳ）のいずれかを強制経口投与した後の、各マウスコホートからの１匹のマウスの代表的な追跡パターン、を示すヒストグラムである。示される全てのｐ値は、多重比較検定のためのテューキーの事後補正を用いる一元配置分散分析からのものである。示されない他の全ての比較は、ｐ＞０．０５で有意ではなかった。データは、平均の標準誤差としてのエラーバー付きの平均値である。

【図12】（ａ）１０分間のオープンフィールド試験（ＯＦＴ）で産生された排泄の数を示すヒストグラム（ｎ＝７－１０）、（ｂ）ＯＦＴ中に４０ｃｍ×４０ｃｍの内側ゾーンでマウスが滞在した時間（ｎ＝７－１０）、（ｃ）１０分間のＯＦＴ中に内側の４０ｃｍ×４０ｃｍゾーンでマウスが移動した平均距離（ｎ＝７－１０）、（ｄ）１０分間のＯＦＴ中の４０ｃｍ×４０ｃｍの内側ゾーンへのマウスの侵入数（ｎ＝７－１０）、（ｅ）１０分間のＯＦＴ中にマウスが移動した平均総距離（ｎ＝７－１０）、（ｆ）６分間の強制水泳試験（ＦＳＴ）の最後の４分間にマウスが不動で滞在した時間（ｎ＝９－１０）、強制経口投与の２１日後の各マウスコホートについて測定した場合：ＰＢＳ／ＩＰ：生理食塩水（陰性対照）、強制経口投与：ＰＢＳ／ＩＰ：フルオキセチン（ＳＳＲＩ陽性比較対照薬）、強制経口投与：Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ１４／ＩＰ：生理食塩水（ｏＮ１４陽性比較対照薬）、および強制経口投与：Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ１４／ＩＰ：フルオキセチン（陽性組み合わせ比較）。示される全てのｐ値は、多重比較検定のためのテューキーの事後補正を使用した一元配置分散分析からのものである。示されない他の全ての比較は、ｐ＞０．０５で有意ではなかった。データは、平均の標準誤差としてのエラーバー付きの平均値である。

【図13】Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ１０またはＴＰＨ発現を欠くＥ．ｃｏｌｉ株（ＥｃＮ－対照）のいずれかを強制経口投与した後のマウスにおける、末梢血漿サンプル中の（Ａ）５－ＨＴ濃度および（Ｂ）トリプトファン濃度、尿サンプル中のＣ）５－ＨＴ濃度およびＤ）５－ＨＴＰ濃度を示すヒストグラム（ｎ＝８、血漿５－ＨＴの両側ｔ検定によるｐ＜０．００１）。

【図14】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｐＳｃ－１～ｐＳｃ－３）におけるセロトニン経路の発現のためのプラスミドの構造を示すカートゥーン。ＲＴＤＣ＝トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子（イネ）、ｃｋ－ＴＤＣ＝トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ Ｅｌｌｉｎ３４５）、ＴＰＨ＝トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ１（マウス）。

【図15】（Ａ）いずれかのイネ（Ｓｃ－１およびＳｃ－２）由来のまたはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ Ｅｌｌｉｎ３４５（Ｓｃ－３）由来のマウスＴＰＨ１およびＴＤＣ遺伝子を発現するプラスミドを用いてまたは用いずにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを培養した後に培養培地中で測定された５－ＨＴ（セロトニン）の力価を示すヒストグラムである。（Ｂ）いずれかのイネ（ｏＮ１４）由来またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓＥｌｌｉｎ３４５（Ｍ１ｃｋ）由来のマウスＴＰＨ１およびＴＤＣ遺伝子を共発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株の培養後に培養培地中で測定された５－ＨＴ（セロトニン）およびＴＲＭ（トリプタミン）の力価を示すヒストグラムである。（Ｃ）ＯＤ_{６００ｎｍ}での単位として測定された４つのＥ．ｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ株の培養物の細胞密度を示すグラフであり、ｏＮ対照はｐＭｈ－ｅｍｐｔｙを含み、ｏＮ１４はｐＭＵＴ１４－５ＨＴを含み、Ｍ１Ｒ（ｔｒｃ）＝ｔｒｃプロモーターから発現されたマウスＴＰＨ１およびイネＴＤＣ、Ｍ１ｃｋ（ｔｒｃ）＝ｔｒｃプロモーターから発現されたマウスＴＰＨ１およびｃｋ－ＴＤＣ［配列番号１１２］である。

【図16】Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｐＢＳ－Ｍ１Ｒｆ）でのセロトニン経路の発現のためのプラスミドの構造を示すカートゥーンである。Ｒ－ＴＤＣ＝トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子（イネ）、ＴＰＨ＝トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ１遺伝子（マウス）、ＦｏｌＥ＝変異体ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ遺伝子（ＧＣＨ１）。

【0019】

略語、用語および定義：
「それが由来した非組換え微生物」とは、組換え核酸分子を含まない微生物を意味する。

【0020】

「増加した量を産生する」とは、組換え核酸分子を含まない非組換え生物と比較して意味する。例えば、特許請求の範囲の組換え酵素を発現する組換え微生物細胞は、特許請求の範囲中の酵素についての核酸分子を含まない微生物細胞と比較される。図１による生合成経路で酵素を発現するコードされた核酸の発現の結果として、酵素をコードする組換え核酸を有する細胞は、増加した量の５－ヒドロキシトリプトファン、５－ヒドロキシトリプタミン、およびトリプタミンのうちの１つ以上を産生するであろう。

【0021】

ｇｉ番号：（ｇｅｎＩｎｆｏ識別子）は、データベースソースに関係なく特定の配列を識別する独自の整数であり、ＮＣＢＩによって、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ由来のヌクレオチド配列、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ、ＰＩＲおよび他の多くのもの由来のタンパク質配列を含む、Ｅｎｔｒｅｚに処理される全ての配列に割り当てられる。

【0022】

アミノ酸配列同一性：本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、実質的に等しい長さの２つのアミノ酸配列間の相同性の程度の定量的尺度を示す。比較する２つの配列は、ギャップの挿入、またはタンパク質配列の末端でのトランケーションによって、可能な限り最良の適合を与えるように整列させる必要がある。配列同一性は、（（Ｎｒｅｆ－Ｎｄｉｆ）１００）／（Ｎｒｅｆ）として計算され得、式中、Ｎｄｉｆは、２つの配列の整列したときの同一でない残基の総数であり、Ｎｒｅｆは一方の配列の残基の数である。配列同一性の計算は、好ましくは、ＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＰプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ．ＲおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８））（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）を使用して自動化される。マルチプルアラインメントは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能な、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．，ｅｔ ａｌ １９９４によって説明されるデフォルトパラメーターを使用し、シーケンスアラインメントメソッドＣｌｕｓｔａｌＷを使用して実行される。

【0023】

好ましくは、その比較ポリペプチドと比較した、ポリペプチド中のアミノ酸残基のうちの１つ以上の置換、挿入、付加または欠失の数は制限され、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下の置換、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下の挿入、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下の付加、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下の欠失である。好ましくは、置換は保存的アミノ酸置換であり、グループ１：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グループ２：セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン、グループ３：プロリン、グループ４：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、グループ５：アスパラギン酸、グルタメート、アスパラギン、グルタミンのメンバー内の交換に限定される。

【0024】

機能性タンパク質をコードする遺伝子を欠く：機能性タンパク質（例えば、トリプトファンリプレッサーまたはトリプトファナーゼ）を発現することができる遺伝子を欠く微生物は、それぞれの遺伝子を欠くか、または遺伝子ｉｄが改変される（例えば、不活性化されている）ので、機能性タンパク質を発現することができない微生物である。一連の遺伝子改変は、微生物細胞のゲノムからの遺伝子の欠失（ノックアウト）、その同族の調節配列（例えば、プロモーター）の欠失、遺伝子によってコードされる機能的ポリペプチドの発現の喪失をもたらす少なくとも１つのヌクレオチドの置換または付加を含む、遺伝子の不活性化に好適である。コードされたポリペプチドが酵素である場合、遺伝子改変は、微生物細胞におけるそれぞれのポリペプチドの検出可能な酵素活性の喪失をもたらす。

【0025】

ゲノム：細胞または生物に存在する遺伝物質である。該ゲノムは、その細胞または生物を構築および維持するために必要な全ての情報を含み、細胞または生物内に存在する染色体およびプラスミドの両方において遺伝物質を含む。

【0026】

変異体ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＥＣ ３．５．４．１６）：本明細書では変異型ＧＣＨ１と略され、５－ヒドロキシトリプトファン収量で測定されるように、非変異型ＧＣＨ１と比較して、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３倍、または４倍、または５倍、６倍、または、７倍、または、８倍、または、９倍、または１０倍）のトリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）の増加したヒドロキシル化活性をもたらす変異体ＧＣＨ１として理解されるべきである。非変異体ＧＣＨ１は、変異体が由来した親酵素であり得、それにより、変異体に見られる変異が増加した活性をもたらす。

【0027】

ネイティブ遺伝子：微生物細胞ゲノム内の内因性遺伝子で、宿主微生物と相同である。

【0028】

ＲＢＳ：リボソーム結合部位は、ｍＲＮＡ転写産物の開始コドンの上流にあるヌクレオチドの配列であり、タンパク質翻訳の開始時にリボソームの動員に関与する。

【0029】

リボソーム結合部位（ＲＢＳ）カリキュレーター：細菌中の翻訳開始率（ＴＩＲ）を予測または制御する方法を提供する。特定のコード配列の翻訳を制御するために使用される場合、ＲＢＳカリキュレーターは、定義された翻訳開始率（したがって、タンパク質発現強度）をもたらす合成ＤＮＡ配列を生成する。任意のプロモーター配列（転写強度を制御する）について、この転写物から産生されるタンパク質の量を調節するために、多くの異なるＲＢＳ強度を設計することができる（Ｓａｌｉｓ ａｔ ａｌ．，２００９）。

【0030】

ＲＢＳ強度スケールおよび単位：出力値は、発現強度の尺度として蛍光タンパク質の存在量を使用して実験的に検証された任意の単位を有する線形スケール上の１～１００００００の範囲内にある（Ｓａｌｉｓ ａｔ ａｌ．，２００９）。特定の強度の設計された配列は独自のものではない。すなわち、異なるヌクレオチド配列が、同じＲＢＳ強度を有するＲＢＳをコードし得る。さらに、ＲＢＳ強度は常にコンテキスト依存性であるため、定義された強度の設計された配列は、計算されたコーディング配列に対してのみ有効である。ＲＢＳ強度を定義する最小ヌクレオチド配列は、コード配列の開始コドン（ＡＴＧ）の上流に３５塩基対および下流に５０塩基対である。

【0031】

導入遺伝子：ある生物から別の生物に自然に、または多くの遺伝子工学技術のうちのいずれかによって移されている遺伝子または遺伝物質。レシピエントに移される導入遺伝子は、同じ種の他の個体からのものでも、無関係の種からのものでもあり得る。

【発明を実施するための形態】

【0032】

Ｉ：第１の態様において、本発明は、医薬としての使用のための組成物であって、該組成物が、組換え微生物の細胞を含み、該微生物が、
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、および
（ｃ）トリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）から選択される１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の導入遺伝子または組換え核酸分子を含む、組成物を提供する。
したがって、該微生物の細胞は、それが由来した非組換え微生物の細胞と比較して増加した量の、５－ヒドロキシトリプトファン（５－ＨＴ）、５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴＰ）およびトリプタミン（ＴＲＭ）のうちの１つ以上を産生することができる。

【0033】

そのさらなる態様において、該１つ以上の組換え核酸分子は、
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、
（ｃ）トリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）、
（ｄ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）およびトリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、ならびに
（ｅ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）およびトリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）からなる群から選択されるタンパク質をコードする。

【0034】

そのさらなる態様において、該組成物は、哺乳動物において、中枢神経系（ＣＮＳ）、腸管神経系（ＥＮＳ）、胃腸（ＧＩ）のＴＲＭ、５－ＨＴＰまたは５－ＨＴ関連障害、ホルモン不均衡、代謝性疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病を予防および／または治療する際の治療薬として使用するためのものである。

【0035】

より具体的には、本発明の組成物によって治療されるＣＮＳのＴＲＭ、５－ＨＴＰまたは５－ＨＴホメオスタシスには、不安および鬱病に関連する行動、ならびに記憶障害、認知障害、および精神障害、特に、全般性不安障害、恐怖症障害、社交不安障害、パニック障害、強迫性障害、外傷後ストレス障害、慢性ストレス障害、分離および状況不安、加齢性記憶低下、および空間記憶形成、覚醒の障害、集中力、学習と認知、自閉症、片頭痛および免疫関連障害が挙げられる。本発明の組成物によって治療されるＧＩのＴＲＭまたは５－ＨＴ関連療法には、運動障害、メタボリックシンドローム、肥満、体重制御、炎症関連疾患、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、セリアック病、憩室症、および結腸直腸がんが挙げられる。

【0036】

別の態様では、本発明は、組換え微生物を含む医薬としての使用のための組成物であって、微生物が、
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、およびトリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、または
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）およびトリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）、をコードする１つ以上の導入遺伝子または組換え核酸分子の両方、
さらに、
（ｃ）セロトニンアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＮＡＴ）ＥＣ ２．３．１．８７および
（ｄ）アセチルセロトニンＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＡＳＭＴ）（ＥＣ ２．１．１．４）、をコードする導入遺伝子または組換え核酸分子を含み、
細胞が、メラトニンを産生することができる、組成物を提供する。したがって、細胞は、それが由来した非組換え微生物の細胞と比較して、増加した量でメラトニンを産生することができる。

【0037】

そのさらなる態様において、本発明は、医薬としての使用のための組成物であって、該組成物が、メラトニンを産生することができる組換え微生物の細胞を含み、以下のメラトニン関連障害：概日リズム障害、不眠症、時差ぼけ、自閉症などのメラトニン欠乏またはメラトニン関連障害、認知症、気分障害、重篤な疼痛、がん、および２型糖尿病を患っている患者の経口送達に好適な、組成物を提供する。

【0038】

そのさらなる態様において、該組成物は、経口投与を必要とする哺乳動物への経口投与用である。

【0039】

そのさらなる態様において、該組成物中の微生物は、生きている通性嫌気性腸内細菌または酵母（Ｉａｎｉｒｏ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、好ましくは、哺乳動物の腸の１つ以上の領域で生き残るおよび／またはコロニー形成する能力により特徴付けられる共生またはプロバイオティクス株である。例えば、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓから選択されるものである。細菌の好適な種には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（例えば、Ｎｉｓｓｌｅ株）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓが挙げられる。さらに、該組成物中の好適な微生物は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４およびＺｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９（その教示は参照により組み込まれる）によって同定された微生物種から選択することができる。

【0040】

そのさらなる態様において、該組成物中の微生物は、トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）（ＥＣ １．１４．１６．４）をコードする核酸配列を含み、これは、Ｃ５位置でトリプトファンをヒドロキシル化することによる、Ｌ－トリプトファン＋テトラヒドロビオプテリン＋Ｏ（２）＝＞５－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファン＋４ａ－ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンの変換を触媒する（図１）。５－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファン収量のアッセイおよび定量化は、１．１．２および１．１．３にそれぞれ記載されている。哺乳動物への経口投与に続いて、該組成物中の微生物は、５－ＨＴＰを産生および分泌するなど、哺乳動物の腸内でＴＰＨ酵素を発現することができる（図２Ａ）。本発明の微生物で発現される場合、トリプトファンヒドロキシラーゼの両方のアイソフォーム、ＴＰＨ１およびＴＰＨ２は、５－ＨＴＰ、およびＥＣ ４．１．１．２８を有するＴＤＣと共発現する場合の５－ＨＴを産生するのに好適である（図２Ａ）。しかしながら、好ましい実施形態では、哺乳動物の胃腸管に投与するための、組成物中の微生物において発現されるＴＰＨ酵素はＴＰＨ１であるが、これは、腸の低酸素環境およびＴＰＨ１のＴＰＨ２と比較してより高い酸素結合親和性のためである。

【0041】

該組成物中の微生物は、追加的または代替的に、５－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファン＝＞５－ヒドロキシトリプタミン＋ＣＯ_２の変換を触媒する、トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＴＤＣ）（ＥＣ ４．１．１．２８）をコードする核酸分子を含み得る（図１）。５－ヒドロキシトリプタミン収量のアッセイおよび定量化は、１．１．２および１．１．３に記載される。ＴＰＨ酵素およびＴＤＣ酵素の両方を発現することができる微生物の細胞を含む組成物は、哺乳動物の腸で５－ＨＴを産生および分泌することができる（図２Ａ）。対照的に、ＴＤＣ酵素を発現することができる微生物の細胞を含む組成物は、哺乳動物の腸でＴＲＭを産生および分泌することができる（図１、５Ｂ）。微生物の５ＨＴ生産性は、細胞内で発現するＴＰＨ酵素およびＴＤＣ酵素の選択された組み合わせによって調節され得る（例１）。したがって、いくつかの微生物において、発現される酵素の組み合わせは、（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼが、配列番号６または１２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、該トリプトファンデカルボキシラーゼのアミノ酸配列が、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。

【0042】

さらなる態様において、該組成物中の微生物は、トリプタミン５－ヒドロキシラーゼをコードする組換え核酸分子または導入遺伝子を含み、これは、Ｏ２＋還元［ＮＡＤＰＨ－ヘムプロテインレダクターゼ］＋トリプタミン＝＞Ｈ＋＋Ｈ２Ｏ＋酸化［ＮＡＤＰＨ－ヘムプロテインレダクターゼ］＋セロトニンの変換を触媒する（図１）。トリプタミン収量のアッセイおよび定量化は、１．１．２および１．１．３に記載される。好ましくは、該組成物中の微生物は、ＴＤＣをコードする核酸配列をさらに含む。哺乳動物への経口投与に続いて、該組成物中の微生物は、５－ＨＴを産生および分泌するなど、哺乳動物の腸内でＴＰＨおよびＴ５Ｈ酵素を発現することができる（図１）。

【0043】

さらなる態様では、該組成物中の微生物は、ＴＰＨおよびＴＤＣ、またはＴＤＣおよびＴ５Ｈのいずれかをコードする核酸分子または導入遺伝子、ならびに以下の酵素
－セロトニンアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＮＡＴ）ＥＣ ２．３．１．８７（これは、アセチルＣｏＡおよびセロトニンのＣｏＡおよびＮ－アセチルセロトニンへの変換を触媒する）、および
－アセチルセロトニンＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＡＳＭＴ）（ＥＣ ２．１．１．４）（これは、Ｌ－トリプトファンからのメラトニンの産生における最後の反応、Ｎ－アセチル－セロトニンおよびＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）のメラトニンおよびＳ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン（ＳＡＨ）への変換を触媒する）を含む。次に、ＳＡＨは、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニンサイクルがネイティブ（すなわち、外因的に添加）でありかつ構成的に発現される微生物細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（図１）中で、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニンサイクルを介してＳＡＭに再利用され得る。

【0044】

さらなる態様において、微生物は、ＴＰＨ、ＴＤＣ、Ｔ５Ｈ、ＡＡＮＡＴおよびＡＳＭＴ酵素を含む、該５－ＨＴまたはメラトニン経路酵素をコードする異種核酸分子の導入によって遺伝的に改変され、ここで、異種核酸分子は各々、構成的または誘導性プロモーターなどのプロモーターに同族的に連結されている。該酵素をコードする異種核酸分子は、共通の同族プロモーターに連結されたオペロン内にクローン化され得る。異種核酸分子は、微生物に導入された自己複製エピソームにクローン化され得るか、または微生物の染色体にクローン化され得る。エピソームは、微生物の天然プラスミドまたは異種プラスミドであり得る。好ましくは、該プラスミドは、別の微生物細胞への形質導入を促進する遺伝的要素を欠くか、または、プラスミドは、該微生物細胞の生存に必須のタンパク質をコードする遺伝子（すなわち、実施例３に記載の必須遺伝子）を含む。

【0045】

そのさらなる態様において、微生物は、機能的なＴｒｐオペロンリプレッサータンパク質、および／または機能的なトリプトファナーゼ（ＥＣ：４．１．９９．１）を発現することができる遺伝子を欠くという点で、さらに遺伝的に改変される（図１）。機能的なＴｒｐオペロンリプレッサータンパク質を発現することができない微生物は、Ｌ－トリプトファンと複合体を形成しかつｔｒｐオペロンのオペレーター領域（例えば、５’－ＡＣＴＡＧＴ－’３’）に結合するために必要なリプレッサータンパク質を欠くので、トリプトファン生合成経路の転写の開始を防ぐことはできない。機能的なトリプトファナーゼ（ＥＣ ４．１．９９．１）を発現することができない微生物は、反応Ｌ－トリプトファン＋Ｈ（２）Ｏ＜＝＞インドール＋ピルビン酸＋ＮＨ（３）を触媒することができない。機能的なＴｒｐオペロンリプレッサータンパク質および機能的なトリプトファナーゼ（ＥＣ ４．１．９９．１）を発現することができる遺伝子を欠く本発明の微生物は、トリプトファン経路への強化されたフラックスのために、強化されたレベルの５－ＨＴおよびＴＲＭ（実施例２、４および図３、６Ａ）を産生する。

【0046】

そのさらなる態様において、微生物は、変異体ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ ＥＣ ３．５．４．１６（ＧＣＨＩ）をコードする遺伝子を含むようにさらに遺伝子改変され、変異体は、５ＨＴＰ収量で測定して、ネイティブ非変異体ＧＣＨ１（例えば、親ＧＣＨ１）と比較して少なくとも２倍、または３倍、または４倍、または５倍、６倍、または、７倍または、８倍または、９倍または、１０倍増加した該ＴＰＨのヒドロキシル化活性を提供する。ＧＣＨ１は、ＴＰＨ合成に必要とされる、ＧＴＰからのテトラヒドロビオプテリン補因子の再生を触媒する（図１）。ｔｒｐＲおよびｔｎａＡ遺伝子の両方を欠く変異体ＧＣＨ１酵素を発現する本発明の微生物は、５ＨＴＰ合成への増強されたフラックスのために、増加した量の５－ＨＴおよびＴＲＭ（実施例４、図５Ａ、６Ａ）を産生する。

【0047】

そのさらなる態様において、微生物は、（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）および（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．２８）をコードする組換え核酸配列を含み、ＴＲＭ産生を減少させながら、産生される５－ＨＴの量をさらに増加させるなど、５－ＨＴ経路のＴＰＨおよびＴＤＣ酵素の発現レベルを調節するようにさらに遺伝子改変される。例として、ＴＰＨおよびＴＤＣの発現は、それらのそれぞれの核酸コード配列（すなわち遺伝子）の各々に機能的に連結されたＲＢＳによって独立して調節される。実施例４（図５Ｃ、Ｄ、図６Ａ）に示すように、ＴＰＨ遺伝子のＲＢＳがＴＤＣ遺伝子のＲＢＳ（翻訳開始の相対強度として測定）を超える強度を有する場合、５－ＨＴ収量は増加し、ＴＲＭレベルは減少する。ｔｒｐＲおよびｔｎａＡ遺伝子を欠く本発明の微生物の５－ＨＴ生産性は、ＴＰＨ遺伝子転写物の翻訳速度がＴＤＣ遺伝子転写物の翻訳速度を超える場合、それらのそれぞれの機能的に連結されたＲＢＳのおかげで相乗的に増加する（図６Ａ、Ｂ）。

【0048】

本発明による組成物は、動物、特にヒト、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、およびヒツジからなる群から選択される哺乳動物、ならびに家禽（例えば、ニワトリ）のための医薬としての使用するためのものである。一実施形態では、組成物は、妊娠中または授乳中の女性のための医薬としての使用のためのものである。

【0049】

哺乳動物におけるＴＲＭ、５－ＨＴＰ－、または中枢神経系（ＣＮＳ）のＨＴ関連障害、腸管神経系（ＥＮＳ）、胃腸（ＧＩ）および代謝またはメラトニン関連障害治療などの治療用途において、本発明による組成物は、疾患およびその合併症の症状を少なくとも部分的に治癒または阻止するのに十分な量で投与するためのものである。これを達成するのに十分な量は、「治療上有効な用量」として定義される。この目的に有効な量は、疾患の重症度、患者の体重および一般的な状態など、当業者に既知の多くの要因に依存するであろう。

【0050】

同様に、予防的用途では、本発明の組成物は、特定の疾患に感受性があるか、そうでなければ特定の疾患のリスクがある対象に、疾患を発症するリスクを少なくとも部分的に低減するのに十分な量で投与するためのものである。そのような量は「予防的実効用量」と定義される。ここでも、正確な量は、患者の健康状態および体重などの患者に特有の多くの要因に依存する。

【0051】

本発明の微生物は、純粋な形態として提供され得るか、またはマトリックスに組み込まれ得る。そのようなマトリックスは、胃腸管（胃の酸性状態を含む）を通過する間に微生物を有利に保護し、微生物の生細胞が腸に到達することを可能にし得る。このような保護マトリックスは、糖（マルトデキストリンなど）、タンパク質または脂肪成分を含み得る。一実施形態では、保護マトリックスは、植物油を含むか、または植物油である。微生物は、任意の好適な方法に従って培養され得、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥による栄養組成物へのカプセル化または添加のために調製され得る。あるいは、食品に添加するのに好適な形態ですでに調製されたものを購入してもよい。

【0052】

好適な栄養組成物には、乳製品、飲料粉末、脱水スープ、栄養補助食品、ミールリプレイスメント、栄養バー、シリアル、菓子製品、動物飼料サプリメントまたはドライペットフードが含まれる。

【0053】

本発明の組成物は、保護親水コロイド（ガム、タンパク質、修飾デンプンなど）、結合剤、フィルム形成剤、カプセル化剤／材料、壁／シェル材料、マトリックス化合物、コーティング、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ワックス、レシチンなど）、吸着剤、担体、充填剤、複合化合物、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶剤）、流動剤、味覚マスキング剤、加重剤、ゼリー化剤、ゲル形成剤、酸化防止剤および抗菌剤をさらに含み得る。組成物はまた、水、任意の起源のゼラチン、植物性ガム、リグニンスルホン酸塩、タルク、糖、デンプン、アラビアゴム、植物油、ポリアルキレングリコール、香料、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、潤滑剤、着色剤、湿潤剤、充填剤などの従来の医薬添加物ならびに補助剤、賦形剤および希釈剤を含むが、これらに限定されない。全ての場合において、そのような追加の成分は、目的のレシピエントへの適合性を考慮して選択される。

【0054】

本発明の好ましい態様では、組成物は、少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含む。したがって、プレバイオティクスは、経口投与後の対象の腸において、本発明の微生物のコロニー形成を促進し、それにより、本発明による組成物に含まれる微生物の効果を増強し得る。さらに、いくつかのプレバイオティクスは、消化などに正の影響を及ぼす。

【0055】

好ましくは、プレバイオティクスは、オリゴ糖からなる群から選択され得、かつ必要に応じて、フルクトース、ガラクトース、マンノース、大豆および／もしくはイヌリン、食物繊維、またはそれらの混合物を含み得る。本発明の組成物は、水分活性が０．２未満、例えば、０．１９～０．０５の範囲、好ましくは０．１５未満の粉末形態で提供され得る。

【0056】

経口投与後、本発明の微生物は、十二指腸、小腸、盲腸、近位および遠位結腸を含む腸のうちの１つ以上の領域を生存および／またはコロニー形成することができる。実施例６に例示されるように、経口投与された微生物は、主に盲腸、近位および遠位結腸にコロニーを形成した。

【0057】

腸のコロニー形成に続いて、本発明の微生物は、その糞便で検出可能な５－ＨＴを産生し、そして重要なことに、腸の粘膜層における５－ＨＴのレベルの増加を伴うことが示されている（実施例６）。さらに、コロニー形成微生物は、遺伝子発現および腸の生理機能の両方に治療上有益な変化を誘発すると考えられている。特に、腸の生理学で観察される変化には、粘膜層の増加、腸バリア機能のマーカーのレベルの維持、および腸の炎症のマーカーのレベルの低下が挙げられ、その各々が５－ＨＴ関連ＧＩ障害の治療効果に見合っている。腸における５－ＨＴ関連受容体、ＨＴＲ１ＢおよびＨＴＲ１Ｄの発現もまた、片頭痛を含む（実施例８）５－ＨＴ関連ＣＮＳ障害に対する治療効果に見合った高レベルの５－ＨＴまたはＴＲＭを産生する本発明の微生物の投与後に観察された。

【0058】

本発明の組成物の対象への投与は、十分に確立された方法：強制水泳試験（ＦＳＴ）およびオープンフィールド試験（ＯＦＴ）（実施例９および１０）を用いて、本明細書で実施される前臨床試験からのＣＮＳ関連障害に対して予防的および治療的効果を有することが実証される。

【0059】

ＩＩ．第２の態様では、本発明は、
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、および
（ｃ）トリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）から選択される１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の組換え核酸分子または導入遺伝子を含む、組換え細菌を提供し、
該微生物は、ｔｒｐオペロンリプレッサータンパク質およびトリプトファナーゼ（ＥＣ：４．１．９９．１）を発現することができる遺伝子を欠き、細胞が、それが由来した非組換え微生物の細胞と比較して増加した量の５－ヒドロキシトリプトファン、５－ヒドロキシトリプタミンおよびトリプタミンのうちの１つ以上を産生することができる。

【0060】

そのさらなる態様において、該１つ以上の組換え核酸分子または導入遺伝子は、
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、
（ｃ）トリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）、
（ｄ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）およびトリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、および
（ｅ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）およびトリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）からなる群から選択されるタンパク質をコードする。

【0061】

さらなる態様において、該細菌が、
（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、およびトリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）、または
（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）およびトリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）、をコードする組換え核酸分子
さらに、
（ｃ）セロトニンアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＮＡＴ）ＥＣ ２．３．１．８７および
（ｄ）アセチルセロトニンＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＡＳＭＴ）（ＥＣ ２．１．１．４）をコードする組換え核酸分子を含み、
細胞が、それが由来した非組換え細菌の細胞と比較して、増加した量のメラトニンを産生することができる。

【0062】

そのさらなる態様において、細菌が、そのアミノ酸配列が、配列番号２を有する野生型ＧＣＨＩに対して、少なくとも７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する変異体ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨＩ）をコードする遺伝子を含み、かつ１つ以上の変異を含み、変異体が、ネイティブＧＣＨ１と比較して、該ＴＰＨの増加したヒドロキシル化活性を提供する。

【0063】

例として、変異体ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨ１）が、Ｄ９７、Ｍ９９、Ｔ１０１、Ｖ１０２、Ａ１２５、Ｋ１２９、Ｎ１７０、Ｖ１７９、Ｔ１９６、Ｔ１９８、Ｓ１９９、Ｌ２００、Ｓ２０７、Ｈ２１２、Ｅ２１３、Ｆ２１４、Ｌ２１５およびＨ２２１からなる群から選択されるアミノ酸残基に少なくとも１つ以上の変異を有するものであり、Ｎ１７０の変異は、Ｎ１７０Ｋ、Ｎ１７０ＤまたはＮ１７０Ｌであり、Ｖ１７９の変異は、Ｖ１７９Ａであり、Ｈ２１２の変異は、Ｈ２１２ＲまたはＨ２１２Ｋであり、Ｈ２２１の変異は、Ｈ２２１ＲまたはＨ２２１Ｋである。好ましくは、変異が、Ｔ１９８Ｉ、Ｔ１９８Ｓ、Ｆ２１４Ｓ、Ｖ１７９Ａ、Ｍ９９ＩおよびＬ２００Ｐから選択される置換である。

【0064】

当業者は、微生物細胞中で変異体ＧＣＨ１およびトリプトファン５－ヒドロキシラーゼを共発現させることにより、ならびに５－ヒドロキシトリプトファンへのトリプトファンヒドロキシル化の活性の増加を試験することにより、さらなる変異体を試験することができるであろう。好ましくは、変異体ＧＣＨ１が、５－ヒドロキシトリプトファンの収量で測定した場合、トリプトファン５－ヒドロキシラーゼのヒドロキシル化活性を、変異体が由来する非変異体ＧＣＨ１と比較して、少なくとも２倍、または３倍、または４倍、または５倍、６倍または、７倍または、８倍または、９倍または、１０倍増加させる。

【0065】

そのさらなる態様において、該細菌が、トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）活性を有するタンパク質を発現することができ、該タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６、８、または１２に少なくとも７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有する。

【0066】

そのさらなる態様において、該細菌が、トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）活性を有するタンパク質を発現することができ、該タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４または１８に少なくとも７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有する。

【0067】

そのさらなる態様において、該細菌が、トリプタミン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ：１．１４．－．－）活性を有するタンパク質を発現することができ、該タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２０に少なくとも７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有する。

【0068】

そのさらなる態様において、該細菌が、セロトニンアセチルトランスフェラーゼＥＣ ２．３．１．８７活性を有するタンパク質を発現することができ、該タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２２に少なくとも７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有する。

【0069】

そのさらなる態様において、該細菌が、アセチルセロトニンＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．１．１．４）活性を有するタンパク質を発現することができ、該タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２４に少なくとも７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有する。

【0070】

そのさらなる態様において、該細菌が、（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、および（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）をコードする組換え核酸分子を含み、トリプトファン５－ヒドロキシラーゼが、配列番号６または１２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、該トリプトファンデカルボキシラーゼのアミノ酸配列が、配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。

【0071】

そのさらなる態様において、（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、および（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）をコードする組換え核酸分子を含む該細菌は、さらに遺伝的に改変されて、５－ＨＴ経路のＴＤＣ酵素に対するＴＰＨの発現レベルを、例えば、産生される５－ＨＴの量をさらに増やし、ＴＲＭの産生を減らすように、上方調節する。例として、トリプトファン５－ヒドロキシラーゼおよびトリプトファンデカルボキシラーゼをコードする核酸分子は、各々、それらのそれぞれのＲＢＳに機能的に連結されており、それらの強度の比は、少なくとも１．５：１．０、１．７５：１．０、２．０：１．０、２．５：１．０、３．０：１．０、３．５：１．０、４．０：１．０、４．５：１．０、５．０：１．０、５．５：１．０、６．０：１．０、６．５：１．０、７．０：１．０、７．５：１．０、８．０：１．０、８．５：１．０、９．０：１．０、９．５：１．０、１０．０：１．０、２０：１、４０：１、６０：１．０、８０：１．０、１００：１．０、１５０：１．０、２００：１．０、２５０：１．０、および３００：１．０であり、より好ましくは少なくとも２０．０：１．０であり、ＲＢＳ強度は、Ｓａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００９を参照して、上記で定義されたように測定される。

【0072】

あるいは、（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、および（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）をコードする組換え核酸分子を含む該細菌は、５－ＨＴ経路のＴＰＨ酵素に対するＴＤＣの発現レベルを、例えば、ＴＲＭ産生量をさらに増加させるように上方調節するために、さらに遺伝的に改変される。この目的のために、トリプトファンデカルボキシラーゼおよびトリプトファン５－ヒドロキシラーゼをコードする核酸分子は、各々、それらのそれぞれのＲＢＳに機能的に連結されており、それらの強度の比は、少なくとも１．５：１．０、１．７５：１．０、２．０：１．０、２．５：１．０、３．０：１．０、３．５：１．０、４．０：１．０、４．５：１．０、５．０：１．０、５．５：１．０、６．０：１．０、６．５：１．０、７．０：１．０、７．５：１．０、８．０：１．０、８．５：１．０、９．０：１．０、９．５：１．０、１０．０：１．０、２０：１、４０：１、６０：１．０、８０：１．０、１００：１．０、１５０：１．０、２００：１．０、２５０：１．０、および３００：１．０であり、より好ましくは、少なくとも２．０：１．０である。

【0073】

そのさらなる態様において、本発明の細菌における、（ａ）トリプトファン５－ヒドロキシラーゼ（ＥＣ １．１４．１６．４）、および／または（ｂ）トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．２８）をコードする１つ以上の組換え核酸分子が、構成的に発現を調節するかまたは誘導性であるプロモーターに機能的に連結されている。プロモーターが構成的プロモーターである場合、好適なプロモーターは、ｈｔｔｐ：／／ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／Ｃａｔａｌｏｇ／Ａｎｄｅｒｓｏｎに記載されている合成プロモーターの中から選択され得、好ましくは、アンダーソンスケールで０．５以上の測定強度を有する強力なプロモーターを選択する。

【0074】

そのさらなる態様において、該細菌が、機能的なｔｒｐオペロンリプレッサータンパク質を発現することができず、該タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２６に少なくとも７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有する。

【0075】

そのさらなる態様において、該細菌が、トリプトファナーゼ活性（ＥＣ：４．１．９９．１）を有するタンパク質を発現することができず、該タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２９に少なくとも７０、７１、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有する。

【0076】

そのさらなる態様において、該細菌が、１つ以上の臨床的に使用される抗生物質に対して抗生物質耐性ではない。

【0077】

第２の態様による組換え細菌は、その様々な記載された形態で、本発明のさらなる態様の各々による組成物での使用に好適である。

【実施例】

【0078】

実施例１：遺伝子組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞は５－ＨＴ産生のための生合成経路を発現する
５－ＨＴ生合成経路をＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅの細胞に導入して、ＴＲＰを５－ＨＴＰに変換し、次に５－ＨＴＰを５－ＨＴに変換する２つの連続した代謝ステップを触媒する合成セロトニン経路を確立した（図１）。これらの２つの代謝ステップを触媒するための最適な組み合わせ酵素の同定は、ＴＰＨ遺伝子およびＴＤＣ遺伝子の組み合わせから得られる５－ＨＴ収量を発現および決定することによって決定された。

【0079】

１．１方法論
１．１．１改変Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、表１を参照して、次のように操作した。
宿主株であるＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（Ｍｕｔａｆｌｏｒ（登録商標））を、Ａｒｄｅｙｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。緑色蛍光タンパク質の遺伝子（ＧＦＰ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＨ６４８８２．１）を、強力な構成的プロモーター（Ｐａｒｔ ＢＢａ＿Ｊ２３１０１、Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｒｔｓ，ｗｗｗ．ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ）の制御下に置き、ｐＧＲＧ２５を使用して、ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２００６）によて記載されるように、Ｔｎ７付着部位のＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅゲノムに組み込んだ。哺乳動物または植物源に由来するＴＰＨタンパク質をコードする遺伝子：ヒトＴＰＨ１（Ｈ１）、ヒトＴＨＰ２（Ｈ２）、マウスＴＰＨ１（Ｍ１）、マウスＴＨＰ２（Ｍ２）、およびＴＤＣをコードする遺伝子は、イネＴＤＣ（Ｒ）、Ｃａｔａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ（Ｃ）、モルモット（Ｇ）およびＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ Ｅｌｌｉｎ３４５（ｃｋ）に由来し、ＩＤＴのオンラインツール（ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ用に最適化されたコドンを使用して合成した。試験したＴＰＨおよびＴＤＣ遺伝子の組み合わせを、カナマイシン耐性遺伝子を含む自己複製プラスミド（バックボーンとしてｐＵＣを使用）中で、合成プロモーターＢＢａ－Ｊ２３１０７の制御下でオペロンとしてクローン化させた。続いて、当該技術分野で既知の標準的なクローニングおよび形質転換手順を使用することにより、プラスミドを宿主株に形質転換した。

【0080】

１．１．２増殖およびインビトロ代謝産物生産を、以下のように決定した。
株は、特に明記しない限り、１×Ｍ９塩（Ｍ６０３０、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．１％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（カタログ番号Ｃ２０００、Ｔｅｋｎｏｖａ）、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０μＭＦｅＣｌ３、０．２％（ｖ／ｖ）２ＹＴ培地（組成は以下を参照）、および５０ｍｇ／ＬのＬ－トリプトファンを含む改変Ｍ９培地中で増殖させた。特に明記しない限り、カナマイシンを最終濃度５０ｍｇ／Ｌで添加した。各株から３つの単一コロニーを選び、９６ディープウェルプレートで３００μｌの培地で増殖させ、２５０ｒｐｍ、３７℃で１６時間振とうした。この予備培養物を、新鮮な培地に１：１００に希釈することによって主培養物に接種し、細胞を同じ条件下で２４時間増殖させた。基質供給の場合、ＴＲＰおよび５－ＨＴＰを１００ｍｇＴＲＰまたは５－ＨＴＰ／Ｌの量で増殖培地に添加した。その後、０．２μｍポアサイズフィルターを使用して培養上清を細胞から分離し、ＬＣ－ＭＳによる分析まで－２０℃で凍結した。示される全てのデータは、少なくとも３つの生物学的複製からの平均＋／－ＳＤである。

【0081】

１．１．３代謝産物生産を、ＬＣ－ＭＳによって次のように定量化した。
セロトニン、トリプタミン、トリプトファンおよび５－ＨＴＰの検出を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続されたＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）での液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）測定によって行った。システムは、３５℃に保たれたＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ ２．１×１００ｍｍ、１．８μｍカラムを使用した。流速は、０．３５０ｍＬ／分で、移動相として、０．１％ギ酸（Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ギ酸（Ｂ）を用いた。勾配は、５％Ｂとして始まり、１．５分かけて３５％Ｂまで直線勾配をたどった。この溶媒組成物を３．５分間保持した後、すぐに９５％Ｂに変更し、１分間保持した。最後に、勾配を６分まで５％Ｂに変更した。サンプル（１ｕＬ）を、シースガスを６０（ａ．ｕ．）、補助ガスを２０（ａ．ｕ．）、スイープガスを２（ａ．ｕ．）に設定した陽イオンモードの加熱エレクトロスプレーイオン化源（ＨＥＳＩ）を備えたＭＳに通過させた。コーンおよびプローブの温度は、それぞれ３８０℃および３８０℃であり、スプレー電圧は３５００Ｖであった。スキャン範囲は５０～５００Ｄａで、スキャン間の時間は１００ｍｓであった。セロトニン（１６０．０７６４６イオン）、トリプタミン（１４４．０８１５８および１６１．１０７７５イオン）およびトリプトファン（２０５．０９７８５イオン）の検出を、フルスキャンで実行し、一方、５－ＨＴＰ検出を、ＨＣＤフラグメンテーション（２２１．０９＞１６２．０５５５３、２５％ＨＣＤ ＣＥ）の後に実行した。化合物の定量は、２４サンプルのセットの前後に分析されたキャリブレーション標準からの計算に基づいた。使用した試薬は全て、分析グレードのものであった。

【0082】

１．２結果：
マウスＴＰＨ１（Ｍ１）またはヒトＴＰＨ２（Ｈ２）を、イネ（Ｒ）またはＣａｔａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ（Ｃ）のＴＤＣと組み合わせて発現するように操作された、宿主の遺伝子改変株であるＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、測定可能な量のセロトニン産生を産生することが見出された（図２Ａ）。培養中に株に基質５－ＨＴＰを供給すると、イネＴＤＣ（Ｒ）をコードする遺伝子を発現する細胞は、５－ＨＴの最高収量（７９．５±１１．１％収量）を産生したが、このことは、イネＴＤＣが５－ＨＴＰ脱炭酸ステップを触媒するのに最も効率的であったことを示す（図２Ｂ）。したがって、「Ｍ１Ｒ」および「Ｈ２Ｒ」経路を発現し、５－ＨＴプロデューサーであるＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを、さらなる最適化のために選択した。

【0083】

ＴＤＣへの供給は、全ての酵素がいくらかのセロトニンを産生することを示したが、イネ由来の「Ｒ」酵素が最も高い変換率を有した（右パネル）。

【0084】

実施例２．本発明の遺伝子改変Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞による５－ＨＴおよびＴＲＭ産生は、トリプトファン経路フラックスを増加させることによって増強される
トリプトファン経路基質であるトリプトファンの増加したアベイラビリティは、本発明の５－ＨＴ産生株において５－ＨＴ産生を増加させることが示される（図３）。増加この観察に照らして、トリプトファン経路フラックスを増強するなど、トリプトファンリプレッサーｔｒｐＲおよびトリプトファナーゼｔｎａＡをコードする内因性遺伝子を不活性化することによって生成された本発明の遺伝子操作された細胞において、利用可能なＴＲＰの内因性プールを増加させた。

【0085】

２．１方法論：
宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｉｓｓｌｅゲノムからのｔｒｐＲおよびｔｎａＡのノックアウトは、（Ｍｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）に記載されているようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して実行された。簡単に説明すると、誘導性ｃａｓ９／λ－Ｒｅｄ発現プラスミドおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）プラスミドからなる２プラスミドシステムを使用して、宿主ゲノムの所望の遺伝子座に二本鎖切断を導入した。ｇＲＮＡを、ＥｃＮゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００７７９９．１）をアップロードした後、ＣＲＩＳＰｙ－ｗｅｂ（Ｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を使用して設計された。選択した切断部位での相同組換えのテンプレートは、次のように生成された。可能な場合は、ＫＥＩＯ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａ ｅｔ．ａｌ．，２００６）からの所望のノックアウトを有する株（それぞれ、ΔｔｒｐＲ：：ＦＲＴ－ｋａｎ－ＦＲＴまたはΔｔｎａＡ：：ＦＲＴ－ｋａｎ－ＦＲＴ）をｐＳＩＪ８（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）で形質転換し、ＦＬＰリコンビナーゼ遺伝子を誘導してカナマイシン耐性遺伝子を除去した。得られたコロニーを、カナマイシン感受性についてスクリーニングした。ΔｔｒｐＲ：：ＦＲＴまたはΔｔｎａＡ：：ＦＲＴ遺伝子座を、ＦＲＴ部位の上流および下流で５００ｂｐに結合するオリゴを使用して増幅させ、約１ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ発現プラスミドを、以前に記載されているように（Ｍｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、株で処置した。

【0086】

宿主細胞の成長、それらの代謝産物生産および定量化を、例１．１．２および１．１．３に記載されているように実行した。

【0087】

２．２結果：
対応する内因性トリプトファンの流れを５－ＨＴ経路に向けるために、本発明の株を、宿主ゲノムからのｔｒｐＲおよびｔｎａＡをコードする遺伝子のノックアウトによってさらに操作して、ＮΔ２と呼ばれる宿主Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を生成した。トリプトファンの外因性供給は、本発明のそのような遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細胞（図３の株ＥｃＮ△２＋ｐＵＣ－Ｈ２Ｒ）により５ＨＴおよびＴＲＭ産生をさらに増強することが示される。

【0088】

実施例３．本発明の遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ株は、安定した５－ＨＴ産生を示す
５－ＨＴ生合成経路をコードする５－ＨＴオペロンが本発明の宿主細胞のマルチコピープラスミドにクローン化される場合、５－ＨＴの産生はプラスミドの安定性に依存する。安定性は、抗生物質耐性を付与するプラスミド遺伝子に依存しないことが好ましい。ｐＵＣのプラスミドバックボーン（実施例１および２の通り）およびＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ中の２つのネイティブプラスミドのうちの１つであるｐＭＵＴ１（Ｂｌｕｍ－Ｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）に基づき、プラスミドの安定性を与えるための２つの解決策を比較した。

【0089】

３．１方法論：
高コピー数の５－ＨＴ産生プラスミド（ｐＵＣ－Ｈ２Ｒ）を、Ｈ２Ｒ経路オペロンの下流に必須の細菌遺伝子ｉｎｆＡの合成コピーを導入することによって改変した。宿主ゲノム中の対応するｉｎｆＡ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＮΔ３（ΔｔｒｐＲ、ΔｔｎａＡ、ΔｉｎｆＡ）を生成するために、実施例２．１に記載のプロトコルを使用してノックアウトした。

【0090】

Ｈ２Ｒ経路を構成するオペロンもまた、以下のようにプラスミドｐＭＵＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ：Ａ８４７９３．１）にクローン化させた。ｐＭＵＴ１プラスミドを、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分離し、ｐＭＵＴバックボーンとして機能するように増幅した。プラスミド転移を可能にし得る要素を除去してｐＭＵＴ（環状配列Ａ８４７９３．１由来のΔｂｐ１－１３２３および１６６４－３１１７）を生成し、カナマイシン耐性遺伝子およびＨ２ＲまたはＭ１Ｒオペロン（ｉｎｆＡなし）をバックボーンに挿入してｐＭＵＴ－Ｈ２ＲまたはｐＭＵＴ－Ｍ１Ｒをそれぞれ生成した。

【0091】

次の追加バージョンのプラスミドｐＭＵＴ－Ｈ２ＲまたはｐＭＵＴ－Ｍ１Ｒを生成した。ｈｏｋ／ｓｏｋ毒素－抗毒素プラスミド安定性エレメント（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＫ１３４３７６、リージョン５８００２－５８６０１）をｐＭＵＴ－Ｍ１Ｒバックボーンに挿入してプラスミドｐＭＵＴ１４－ｓｅｒを生成した。ＴＰＨ遺伝子をｐＭＵＴ１４－ｓｅｒから削除して、ｐＭＵＴ１１－ｔｒｍを生成し、ＴＰＨおよびＴＤＣの両方を削除して、ｐＭＵＴ０９－ｃｔｒｌを作製した。

【0092】

細胞増殖の測定：細胞を、実施例１．１．２に記載されているように増殖させたが、主培養物の接種後、２００μｌを平底の透明な９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、次いで、ガス透過膜（Ｚ３８００５９、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で密封した。培養物を７００ｒｐｍでオービタル振とうしながら３７℃で増殖させ、それらの増殖をＯＤ_{６３０ｎｍ}でＢｉｏＴｅｋ（商標）ＥＬｘ８００プレートリーダーで１０分ごとに記録した。

【0093】

プラスミド安定性の決定：各試験株から各々６つの単一コロニーを選び、３００μｌの２ＹＴ培地（１．６％（ｗ／ｖ）トリプトン、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含む）中、カナマイシンを用いずに９６ディープウェルプレート中で増殖させ、２５０ｒｐｍ、３７℃で２４時間振とうした。培養物の光学密度（ＯＤ６３０）を測定し、培養物を新鮮な培地で１：１０００に希釈し、細胞を、カナマイシンを含むまたは含まないＬＢ寒天プレートに毎日播種したが、これは２４時間ごとに約１０倍に相当する。ＬＢ寒天プレート＋／－カナマイシン上のコロニー形成単位を毎日カウントした。時点ｔ＝０、５０および１００世代で、培養物を上記の改変Ｍ９培地（カナマイシンを含まない）中に１：１００に希釈し、セロトニン産生を記載のように測定した。

【0094】

３．２結果：
安定している間、Ｈ２Ｒ経路およびｉｎｆＡ遺伝子の両方を発現するｐＵＣベースのプラスミドは、おそらく代謝負荷のために、ＮΔ２およびＮΔ３宿主細胞（ΔｔｒｐＲ、ΔｔｎａＡ、ΔｉｎｆＡを有するＥｃＮ）の両方で望ましくない成長欠陥を引き起こした（図４Ａ、ＢおよびＣ）。

【0095】

対照的に、ｐＭＵＴベースのプラスミド（ｐＭＵＴ－Ｈ２Ｒ）は、ＮΔ２宿主細胞中で安定して維持され（図４Ａ、Ｂ）、選択圧の不在下で、抗生物質耐性の形態で、少なくとも１００世代に対して検出不可能なフィットネス欠陥を示した（図４Ａ、Ｂ、Ｃ）。さらに、ＥｃＮΔ２ｐＭＵＴ－Ｈ２Ｒ細胞による５－ＨＴ産生はこの期間にわたって安定しており、初期のｐＵＣ－Ｈ２Ｒ力価に匹敵した（図４Ｄ）。

【0096】

ｈｏｋ／ｓｏｋ毒素－抗毒素モジュールをｐＭＵＴ－Ｍ１Ｒプラスミドに導入し、ｐＭＵＴ１４－ｓｅｒおよびｐＭＵＴ１１－ｔｒｍ（表１）を産生して、インビボでの安定性をさらに確保した。

【0097】

実施例４．本発明の遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ株による５－ＨＴ産生の最適化
トリプタミン（ＴＲＭ）は、植物ＴＤＣ酵素を発現する本発明の遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ株によって産生される代謝産物の中で検出される重要な副産物である（図２Ａ、３）。５ＨＴＰ合成への流れを強化するように設計された遺伝子組換えは、ＧＴＰグリコヒドロラーゼ（ＧＣＨ１）活性の活性を高め、それによってＴＰＨ合成に必要とされるテトラヒドロビオプテリン補因子の再生を高めるためのものであった。５－ＨＴ産生をさらに増強するために、ＴＰＨおよびＴＤＣの相対的な発現強度を微調整するように設計されたさらなる遺伝子改変を試験した。

【0098】

４．１方法論
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｆｏｌＥ遺伝子のコード配列は、最初にｆｏｌＥ遺伝子を２つの部分に増幅し、次にオーバーラップエクステンションＰＣＲに使用されるオリゴにＴ１９８Ｉコード化変異を導入することによって変異させた。得られたｄｓＤＮＡフラグメントを精製し、ｇＲＮＡプラスミドで同時形質転換して、ＥｃＮの細胞のゲノムにｆｏｌＥ遺伝子のマーカーレス遺伝子変異を生成した。

【0099】

ＲＢＳ強度ライブラリーを、「ＲＢＳカリキュレーターｖ１．１」（Ｓａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）を使用して設計し、ＴＰＨおよびＴＤＣ（Ｍ１ＲおよびＨ２Ｒ）をコードする共発現遺伝子ごとに、５０～５００００の任意の単位の理論強度の範囲内の４～６のバリアントのライブラリーサイズを選択した。ＲＢＳの変異を、縮退塩基を含むオリゴを用い、ギブソンアセンブリを使用して、各遺伝子の上流に導入した（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。株の代謝産物生産プロファイルを試験した後、形質転換体をランダムに選び、ＲＢＳをシーケンシングした。

【0100】

４．２結果
本発明の宿主Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細胞におけるネイティブｆｏｌＥ遺伝子を、テトラヒドロビオプテリン補因子の再生を増強するために、変異体ＧＣＨ１（Ｔ１９８Ｉ）をコードするように変異させた。５－ＨＴ生合成オペロン（ｏＮｐＭＵＴ１Ｈ２ＲまたはｏＮｐＭＵＴＭ１Ｒ）と組み合わせて変異体ＧＣＨ１酵素を発現するこれらの最適化Ｎｉｓｓｌｅ（ｏＮ）株では、この追加の改変を欠く株（ＮΔ２ｐＭＵＴ－Ｈ２ＲまたはＮΔ２ｐＭＵＴ－Ｍ１Ｒ）と比較して、５－ＨＴの産生が増加される。変異体ＧＣＨ１は、ｐＭＵＴ１０－５ｈｔｐを含む株において、ヒトトリプトファン５－ヒドロキシラーゼによって触媒されるトリプトファンの５－ヒドロキシトリプトファンへのヒドロキシル化を４倍増加させる（図５Ｆ）。

【0101】

５－ＨＴＰ生合成経路（ｏＮ１０＝ｏＮ ｐＭＵＴＭ１）またはＴＲＭ経路（ｏＮ１１＝ｏＮ ｐＭＵＴＲ）のいずれかと組み合わせて変異体ＧＣＨ１酵素を発現するｏＮ株は、経路の唯一の検出産物としてそれぞれ５－ＨＴＰおよびＴＲＭを産生した（図５Ｂ）。

【0102】

それぞれの遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の選択された組み合わせを使用するＴＰＨおよびＴＤＣの相対的な発現強度の調節は、５－ＨＴ産生を増強しかつＴＲＭの蓄積を減少させることが示される（図５ＣおよびＤ）。ＴＰＨ遺伝子に機能的に連結したＲＢＳの相対強度がＴＤＣ遺伝子に機能的に連結したＲＢＳの相対強度を超えた場合、増加した５－ＨＴ産生が得られた。

【0103】

５－ＨＴ経路の遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株に導入された遺伝子改変の相乗効果が、それぞれの５－ＨＴ生産性および５－ＨＴ：ＴＲＭ比に対して、図６に示される。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおけるｔｒｐＲおよびｔｎａＡ遺伝子のノックアウトは、ＴＰＨ遺伝子の相対的発現がＴＤＣ遺伝子の相対的発現を上回っていれば、機能的に連結されたＲＢＳのおかげで、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における５－ＨＴ収量および５－ＨＴ：ＴＲＭ比に相乗効果をもたらした（図６Ａ）。ｆｏｌＥゲノム変異（Ｔ１９８Ｉ置換をコードする）の導入により、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株中で前述の変異と組み合わせると、５－ＨＴ収量および５－ＨＴ：ＴＲＭ比がさらに増加した（図６Ｂ）。

【0104】

実施例５ 本発明の遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ株の経口投与は、対象において治療的５－ＨＴレベルを産生すると予測される
腸内の５－ＨＴの治療上有効なレベルは、５～３０ｍｇ／Ｌの範囲にあると報告されている（Ｌｉｕ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，２００８）。マウス腸内で治療有効範囲内で５－ＨＴを産生するために必要な５－ＨＴ産生細菌の相対的存在量は、０．１～１０ｍｇ／Ｌ^＊ＯＤ_６３０ ^＊ｈのインビボ５－ＨＴ産生速度を有する細菌で予測される（図６Ｃ）。これは、以下に示すように、場所（Ｃａｓｔｅｌｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）に応じて、１Ｅ２～Ｅ１１／ｇ（Ｓｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）の範囲であると予測される腸内細菌の密度に関する基本的な仮定に基づく。

【表1】

【0105】

インビトロでは、比生産性（Ｐ）は、１時間当たりの細菌負荷（ＯＤ_{６３０ｎｍ}）当たりのセロトニン力価（ｍｇ／Ｌ）として測定され得る。５－ＨＴの枯渇率は不明であるため、生理学的に適切な濃度（ｍｇ／Ｌ）を決定するために、生産性と等しくなるように設定される。本発明の遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ株（例えば、ｏＮ１４株）は、投与されると、生理学的に適切なレベルの近くで、インビボで５－ＨＴを産生することができると予測される。

【0106】

実施例６ 本発明の遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ株の経口投与は、マウス腸における５－ＨＴ産生を増強する
本発明の遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株の経口送達、ならびにそれらの腸への局在化および５－ＨＴ産生の増強が、マウスにおいて実証された。

【0107】

６．１方法論
６．１．１経口投与：Ｔａｃｏｎｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから供給された６～８週齢の雄のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を、１２時間の明暗サイクル（７：００～１９：００に点灯）で、一定温度で、特定病原体除去（ＳＰＦ）施設内にて、食物および水に自由にアクセスすることができるようにグループ飼育した。搬送の際に、新しい場所に適応するためにマウスに１週間を与え、続いて、７日間、３回転の微生物叢正規化プロトコルを行った。正規化プロトコルの１日目、３日目、および５日目に、マウスをランダムに混合した。６日目に、マウスを最後にもう一度混合し、コホートごとに２～３ケージでそれぞれのコホートに分け、各ケージに３～５匹のマウスを入れた。正確な数は、実験によって異なる。７日目に、マウスを、実験プロトコルのゼロ日目から始めて、識別のためにタグ付けし、ボトル飼育ケージに３～５匹のマウスのグループで収容し、指定されたラックにセットされ、層流フードの下でのみ開いた。糞便サンプルを、実験プロトコルのゼロ日目に収集した。次に、マウスに、２４時間ごとに同じ時刻に１０日間、２００μｌの滅菌ＰＢＳまたは滅菌ＰＢＳ中の新たに増殖させた１０^９細胞の指定されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株：ｏＮ１４（プラスミドｐＭＵＴ１４－ｓｅｒを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ）、ｏＮ１１（プラスミドｐＭＵＴ１１－ｔｒｍを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ）、およびｏＮ９（プラスミド対照プラスミドｐＭＵＴ９－ｃｔｒｌを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ）を経口投与した（図５Ｅ）。最後の強制経口投与の２４時間後、糞便ペレットを収集し、マウスを、血清、腸組織、および管腔内糞便収集のために安楽死させるか、あるいは運動または行動試験に使用した。

【0108】

６．１．２ｏＮ株の腸内局在：５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に、異なる腸領域に由来する消化物をプレーティングし、ＧＦＰ陽性のカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）コロニーの数を定量化することによって決定した。

【0109】

６．１．３薄切片での免疫検出：結腸サンプルを収集し、５ｍｍ切片を結腸中央で切断し、メタノール－カルノイ（６０％メタノール、３０％クロロホルム、１０％酢酸）溶液またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ））中で２４時間固定した。次に、固定したサンプルを３回洗浄し、７０％エタノール中に保存した。サンプルを、消化物とともに内腔中で無傷に保ち、パラフィンに包埋し、管腔内で４μｍで切断し、免疫組織化学用に準備するか、またはヘマトキシリンおよびエオシン染色に供した。免疫組織化学用：セロトニン（５－ＨＴ）抗体染色にＰＦＡ固定スライドを使用し、Ｍｕｃ２、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）抗体染色にメタカーン固定サンプルを使用した。全てのスライドを、５７℃で２時間ベークし、キシレンおよびエタノール－水勾配で脱パラフィンし、再水和した後、ｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸ナトリウムの抗原回収溶液で、９０℃にて３０分間処理した。スライドを、ＰＢＳ中の５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いて室温で３０分間ブロックし、次いで、ＰＢＳ中の５％ＦＢＳ中、一次抗体を用いて４℃で一晩インキュベートした。スライドを、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中で室温にて２時間二次抗体を用いてインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、１０μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を用いて５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、グリセロールを使用してマウントした。Ａｌｅｘａフルオロフォアでプレコンジュゲートされた一次抗体で染色されたスライドは、二次抗体染色を受けなかった。使用した抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４コンジュゲートを含む抗ＧＦＰウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ２１３１２）。抗Ｍｕｃ２ポリクローナルウサギ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｓｃ－１５３３４）。抗クロマグラニンＡポリクローナルウサギ（Ａｂｃａｍ ａｂ１５１６０）。抗セロトニンポリクローナルヤギ（Ａｂｃａｍ ａｂ６６０４７）。二次抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎｏｖｅｘ ａ１１０１１）。二次抗ヤギＩｇＧＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ａｂｃａｍ ａｂ１５００７７）。全ての画像を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２－Ｅ倒立顕微鏡システムで撮影し、画像変換およびセルサイズ（粒子）分析を、Ｍａｃｂｏｏｋバージョン２．０．０－ｒｃ－６９／１．５２ｉ用のＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳｏｆｔｗａｒｅおよびＩｍａｇｅＪ（ＦＩＪＩ）を使用して実行した。

【0110】

６．１．４インビボ代謝産物分析．セロトニン、５－ヒドロキシトリプトファン、トリプタミン、およびトリプトファンについて、血清、組織サンプル、および糞便サンプルを分析した。血清用：安楽死後、血液サンプルを下大静脈から採取し、サンプルを０．９％ＮａＣｌ、０．２％アスコルビン酸と１：１で混合した。サンプルを室温で１０分間保持し、次いで、２０００ｇで４℃で１０分間遠心分離するまで氷上に置いた。上清を、分析のために保存し、すぐに－２０℃で凍結した。組織分析用：結腸組織の重さを量り、収集後すぐに液体窒素で凍結し、ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ １１２０１１）中での６．３４ｍｍのステンレス鋼ビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ １１０７９６３５ｓｓ）を有するステンレス鋼マイクロバイアル（Ｂｉｏｓｐｅｃ ２００７）で３０秒間叩いて凍結破砕した。次いで、組織を、０．９％ＮａＣｌ、０．１％アスコルビン酸に再懸濁し、２０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した。上清を、分析のために保存し、すぐに－２０℃で凍結した。糞便サンプル用：サンプルを秤量し、２００ｍｌのジルコニア／シリカビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ １１０７９１０１ｚ）を含む０．１％アスコルビン酸を含む０．５ｍｌの０．９％ＮａＣｌを含むＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｒｙｏｖｉａｌｓに入れ、ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ中で、４℃で５分間撹拌した。サンプルを、２０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を、分析のために保存し、すぐに－２０℃で凍結した。

【0111】

６．２結果
マウスにＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＯＮ１４、ＯＮ１および対照株ｏＮ９（図５Ｅ）の１０^９個の細胞を経口投与した１０日後、投与された細胞が、主にそれらの大腸に蓄積することが見出された。最高濃度のｏＮ細胞は、近位結腸で＞１０^８ＣＦＵ／ｇで検出されたが（図７Ａ）、小腸で検出されたｏＮ細菌は最も少なかった（＜１０^４ＣＦＵ／ｇ）。結腸の中央では、ｏＮ細胞は、抗ＧＦＰ抗体を用いる免疫組織化学によるそれらの視覚化に基づき、粘膜層に沿って局在していた（図７Ｂ）。

【0112】

ＴＲＰ、５－ＨＴＰ、５－ＨＴおよびＴＲＭのレベルは、経口投与されたマウスに由来する血清、結腸組織、および糞便のサンプルでも測定された。トリプトファンレベルは、結腸組織および糞便で上昇したが、血清では上昇せず、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を経口投与したマウスでのみ上昇した（図８Ａ）。５－ＨＴレベルは、コホート間で血清および結腸組織で統計的に異ならなかった（ＡＮＯＶＡによるｐ＞０．４）。しかしながら、糞便中の５－ＨＴレベルは、他の群と比較して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与したマウスで有意に増加した（１３．４倍の増加、ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０００１）（図８Ｂ）。トリプタミンおよび５－ＨＴＰのレベルは、全てのサンプルで検出限界を下回った。

【0113】

５－ＨＴレベルは、結腸組織自体では上昇しなかったが（残留消化物を除去するための洗浄後）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与したマウスでは、結腸の粘膜層に沿って、上昇したレベルのセロトニンが特異的に検出された（図８Ｃ）。これらの結果は、経口投与されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４の細胞が蓄積し、マウスの結腸の粘膜に沿ってインビボで５－ＨＴを産生することを示す。

【0114】

実施例７ 本発明の遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株の経口投与は、腸において遺伝子発現および生理学の変化を誘発する
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４をマウスに経口投与すると、Ｍｕｃ２の発現が上方調節され、粘膜の肥厚が増加し、次いで、粘膜の完全性が向上することが示された。腸クロム親和性細胞に由来する過剰なセロトニンは、腸炎を刺激する可能性がある。しかしながら、治療されたマウスの結腸の粘膜層で増加したレベルの５－ＨＴが検出されたとしても（実施例６）、これは腸炎、腸の代謝回転または腸のバリア機能のマーカーの発現の変化をもたらさなかった（示されない）。

【0115】

ＴＰＨ１ではないが、宿主（マウス）ＴＰＨ２の発現が、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与したマウスの結腸で増加したが、このことは、細菌由来の５－ＨＴが、マウスのＥＮＳで、ＴＰＨ２を介したニューロン５－ＨＴ生合成を誘導し得ることを示す。しかしながら、これらのマウスのＥＣ細胞（腸内の宿主５－ＨＴの主要な産生細胞）の総数またはサイズは、影響を受けなかった。

【0116】

トリプトファンおよびセロトニンの代謝もまた、キヌレニン経路に影響を与え得、その機能障害は多くの神経障害および代謝障害に関連するが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与したマウスの結腸で、Ｌ－トリプトファンをＮ－ホルミルキヌレニンに変換する律速酵素をコードする遺伝子の発現に変化は検出されなかった。

【0117】

７．１方法論
７．１．１経口投与：６．１．１に記載されている通りである。

【0118】

７．１．２遺伝子発現分析：例６．１．４のプロトコルに従って組織を凍結破壊した。次に、ＲＮＡ単離のための製造業者の説明書に従って、組織をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。全ＲＮＡを、３０μＬのＲＮａｓｅフリー水に再懸濁した。製造業者の説明書に従って、ｉＳｃｒｉｐｔ ｇＤＮＡ Ｃｌｅａｒ ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ １７２５０３５）を使用してＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの３８４ウェルプレート中、製造業者の説明書に従って３回実施した。使用したプライマーを、表３に列挙する。シクロフィリンを、ハウスキーピング遺伝子として使用した。ΔΔＣτ法を使用して、相対的なｍＲＮＡレベルを定量化した。

【0119】

７．１．３薄片での免疫検出：実施例６．１．３に記載の通りである。

【0120】

７．２結果
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与されたマウスに由来する結腸組織におけるＭＵＣ２遺伝子の発現は、対照群と比較して約２倍増加した（ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５）（図９Ａ）。同様に、抗Ｍｕｃ２抗体で免疫組織化学的に染色された結腸組織の切片は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与されたマウスにおいてより顕著な粘膜層を示した（図９Ｂ）。結腸切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色は、腸の炎症と関連する組織病理学的変化の欠如をさらに確認した（示されない）。

【0121】

しかしながら、杯細胞マーカーＣＤＸ２または腸幹細胞マーカーＢＭ１およびＬＧＲ５の発現に違いは観察されず（図示せず）、このことは、Ｍｕｃ２産生杯細胞および一般的な腸の代謝回転が変化していないことを示す。それに対して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与されたマウスの結腸組織で、炎症マーカーＩＬ６、ＩＬ１β、ＮＦＫβ、ＩＬ１７Ａ、およびＴＮＦαのｑＰＣＲによる遺伝子発現レベルの変化は検出されなかった（示されない）。さらに、結腸の長さの変化は観察されなかった（ＡＮＯＶＡによるｐ＝０．６６）が、これは、短縮されたことが判明した場合の慢性腸炎の別の指標である（示されない）。結腸の腸のバリアを維持するためのマーカーであるＴＪＰ１、ＴＪＰ２、またはＯＣＬＮの発現も、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与したマウスでは変化しなかった（データは示されない）。

【0122】

ＴＰＨ１およびＳＥＲＴの発現に違いは観察されなかったが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与したマウスでは、結腸内で、他の群（ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．００１）と比較して予想外の２．８倍のＴＰＨ２発現の増加が検出された（図９Ａ）。しかしながら、ｑＰＣＲおよびＥＣ細胞マーカーであるクロモグラニンＡの免疫組織化学によって定量化されたＥＣ細胞（腸内の宿主５－ＨＴの主要な産生細胞）の総数またはサイズの変化が検出された（示されない）。

【0123】

さらに、Ｌ－トリプトファンをＮ－ホルミルキヌレニンに変換する律速酵素をコードするＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与したマウスでは、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、およびＴＤＯ２の発現に変化は検出されなかった（示されない）。

【0124】

実施例８ 本発明の遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株の経口投与は、腸においてセロトニン受容体の発現および関連する効果を増強する
セロトニンは、ＥＮＳ、ＣＮＳ、および末梢神経系全体の興奮性および抑制性神経伝達を媒介するＧＰＣＲである多くの５－ＨＴ受容体のリガンドである。ＣＮＳにおける５ＨＴ１ｂ受容体のリガンド活性化は、攻撃性の低下に関連しており（ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００２）、５ＨＴｒ１ｄとともに、片頭痛のトリプタミンに基づく治療の標的受容体である（Ｔｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１１およびｏＮ１４の両方をマウスに経口投与すると、ＨＴＲ１ＢおよびＨＴＲ１Ｄの遺伝子発現が増加することが示され、このことは、トリプタミンを介した効果の可能性を示唆する。

【0125】

５ＨＴ３受容体は、嘔吐、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、統合失調症、不安、学習、記憶および依存症に関係する様々な生理学的役割を持ち、制吐剤５ＨＴｒ３拮抗薬によって臨床的に調節される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。５ＨＴ４受容体は、腸管神経系の神経新生を誘発し、胃腸管の蠕動運動の調節、ストレス誘発性の摂食行動、学習と記憶の変化、およびＣＮＳの鬱病に関連する（Ｇｅｒｓｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）、Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，（２００７）、Ｌａｍｉｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，（２００１））。５ＨＴｒ７刺激は、認知および記憶を改善することができ（Ｍｅｎｅｓｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、５ＨＴｒ７拮抗作用は、ＣＮＳの抗鬱および抗精神病薬の行動を解決することができ（Ｒｏｔｈ、Ｂ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９４）るが、腸でのその機能は、ＩＢＳおよび炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に関連してきたにもかかわらず、あまり理解されていない（Ｇｕｓｅｖａ、Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１４）。５－ＨＴ受容体の遺伝子発現で検出された変化の多様性および大きさを考慮すると、Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ１４が宿主で生理学的反応を誘発することは妥当である。

【0126】

ＨＴＲ３、ＨＴＲ４、およびＨＴＲ７遺伝子の上方調節された発現は、ｏＮ１４コホートでのみ検出されたが、このことは、特定のセロトニンを介した応答を示す。

【0127】

さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４の経口投与は、総胃腸通過を減少させることが示されるが、このことは、セロトニンが、蠕動反射を引き起こす管腔内圧および空腹時の間隔に小腸内を通過する腸移動運動複合体の両方を誘導することによって、胃腸運動性を調節することが知られていることと一致する。

【0128】

腸の運動性および細菌によって産生された生物起源のアミンの変化は腸内微生物叢に影響を与える可能性があり得るが、マウスコホートの糞便の１６Ｓメタゲノムシーケンスに基づいた、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４、ｏＮ１１、ｏＮ９またはＰＢＳのみの投与の結果としての、マウスコホート間での腸内微生物叢の有意な変化は検出されなかった（示されない）。同時に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４およびｏＮ１１の投与は、宿主５－ＨＴ受容体遺伝子発現および胃腸運動性を含む腸内での多くの生理学的反応を誘発するが、常在微生物群集を影響されないままにする。

【0129】

８．１方法論
８．１．１経口投与：６．１．１に記載されている通りである。

【0130】

８．１．２遺伝子発現分析：７．１．１に記載されている通りである。

【0131】

８．１．３総胃腸通過：腸の内腔から吸収され得ないカーマインレッドを使用して、総胃腸通過時間を研究した。０．５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に懸濁したカーマインレッド（３００μｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の６％溶液を、２１ゲージの丸い先端の給餌針を通して強制経口投与した。強制経口投与が行われた時刻を、Ｔ０として記録した。強制経口投与後、糞便ペレットを、１０分間隔でカーマインレッドの存在についてモニターした。総胃腸通過時間は、Ｔ０および便中のカーマインレッドが最初に観察された時間の間の間隔と見なされた。

【0132】

８．１．４ メタゲノム１６Ｓシーケンシングと分析：０日目および１０日目にマウスから糞便ペレットを収集し、ペアエンドシーケンシングまで－２０℃で直ちに保存した。ゲノムＤＮＡを、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒグラム陽性キットに加えて、０．１ｍｍジルコニアビーズを用いる最初のビーズビーティングステップを使用して、糞便ペレットから抽出した。サンプルの１６Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ４領域のＰＣＲ増幅およびマルチプレックスバーコーディングを、以前のプロトコル５７に従って行った。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域を、Ｋｏｚｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）の方法に従って、カスタムプライマーを使用して１×ＮＥＢＮｅｘｔ ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘで増幅した。シーケンシングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシステム（３００Ｖ２キット）を用いて行った。シーケンシングされたペアリードを、ＵＳＥＡＲＣＨｖ１０．０．２４０＿ｉ８６ｏｓｘ６４を使用して準備した。順方向および逆方向の読み取りをペアにし、最大予想誤差が１の最小長２４０にフィルタリングした。配列を複製解除し、最小クラスターサイズ２でクラスター化し、９７％の同一性５８でＯＴＵにマッピングした。ＯＴＵ分類法を、ＲＤＰ分類子５９で割り当てた。Ｃｏｎｄａ内でＰｙＮＡＳＴを使用してＱＩＩＭＥ１、ｐｙｔｈｏｎ ２．７、ｍａｔｐｌｏｔｌｉｂ１．４．３で整列された配列。ＲＳｔｕｄｉｏパッケージエイプで読み取ったＦａｓｔＴｒｅｅで構築されたツリー。ｇｇｌｏｔ２およびｐｈｙｌｏｓｅｑパッケージを備えたＧｒａｐｈｐａｄ ＰｒｉｓｍおよびＲＳｔｕｄｉｏを使用して予め形成されたＯＴＵデータ分析および視覚化。ｐｈｙｌｏｓｅｑおよびｖｅｇａｎパッケージでＲＳｔｕｄｉｏを使用してＡＮＩＳＯＭによって実行された統計的有意性。

【0133】

８．２結果
ＨＴＲ１ＢおよびＨＴＲ１Ｄ遺伝子の発現の増加を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ１１およびｏＮ１４を投与されたマウスで検出し（両方ともＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５）（図１０ａ、ｂ）、一方、ＨＴＲ３、ＨＴＲ４、およびＨＴＲ７遺伝子の増加した発現を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ１４を投与したマウスの結腸で観察した（全てＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０１）（図１０ｃ－ｅ）。

【0134】

さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ１４の投与により、対照コホートと比較して、特に、処置したマウスにおいて総胃腸通過時間を１５％も短縮した（ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０５）（図１０）。０日目および１１日目にＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４、ｏＮ１１、ｏＮ９またはＰＢＳのみを投与した後の、マウスコホートに由来する糞便の１６Ｓメタゲノムシーケンシングでは、０日目から１１日目までのコホート間で腸内微生物叢に有意な変化は見られなかった（Ｒ：０．０７４０３、有意性：０．１５５、ＡＮＩＳＯＭによる）（表示されない）。

【0135】

実施例９ 本発明の遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株の経口投与は、マウスにおいて不安を軽減した
本発明の遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ ｏＮ系統の経口投与は、脳腸軸または末梢および／または脳の５－ＨＴレベルの増加を介して媒介され得る、処置されたマウスにおいて行動変化を誘発することが示される。これらの行動の変化を実証するために、２つの確立された方法である強制水泳試験（ＦＳＴ）およびオープンフィールド試験（ＯＦＴ）が採用された。齧歯動物における抗不安薬および抗鬱薬の有効性を評価するために一般的に使用されるＦＳＴは、ストレスの多い環境から逃れるための絶望の尺度として水で満たされた容器中で不動で滞在した時間を記録することによって、行動の諦めを定量化する。ＯＦＴは、総排泄、総移動距離、および５０×５０ｃｍの白く十分に明るいオープンフィールドの内側および外側のゾーンを探索して滞在した時間を検出することにより、不安レベルおよびストレスの多い環境で探索する意欲を測定する。

【0136】

これらの試験の結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ｏＮ１４のマウスへの経口投与が、不安関連障害に対して治療効果を有することを示す。

【0137】

９．１方法論
９．１．１経口投与：６．１．１に記載されている通りである。

【0138】

９．１．２強制水泳試験：Ｆｅｒｇｕｓｏｎ（２００１）による説明に従って、各マウスを１５ｃｍの水を入れた透明な円筒形タンク（高さ３０ｃｍ×２０ｃｍ）に２３～２５℃で６分間入れ、記録した。次に、マウスをタオルで乾燥させ、低体温症を防ぐために熱ランプの下に置いて乾燥させ、次いで、元のケージに戻した。Ｃａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）によって記載されるように、記録を匿名化し、盲検観察者は、６分間の試験の最後の４分間に不動で滞在した時間の記録を採点した。

【0139】

９．１．３オープンフィールド試験：各マウスを白いオープンルーフの十分に明るい５０ｃｍ（長さ）×５０ｃｍ（幅）×３８ｃｍ（高さ）のチャンバーに入れ、前述の方法に従って、１０分間記録した（Ｓｐｏｈｎ、Ｓ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）。次に、マウスを元のケージに戻した。１０分間の試験中に産生された糞便ペレットを数えた。次に、記録を後処理し、前述のようにＢｅｈａｖｉｏｒＣｌｏｕｄを使用して分析した（Ｓｐｏｈｎ、Ｓ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）。マウス追跡ソフトウェアは、各マウスの総移動経路、総移動距離、内側の４０ｃｍの正方形として定義された内側ゾーンおよび壁に最も近い外側の１０ｃｍの境界として定義された外側ゾーンで滞在した時間、内側ゾーンへの侵入回数、および内側ゾーン内を移動した距離を記録した。

【0140】

９．２結果
ＦＳＴおよびＯＦＴを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４、ｏＮ１１、ｏＮ９またはＰＢＳのみを投与した後のマウスコホートで実施した。

【0141】

ＦＳＴでは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与したマウスコホートは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮを投与した対照コホートと比較して、統計的に最長１７％まで短縮したＦＳＴの間の不動時間を示した（ＡＮＯＶＡによるｐ＝０．００４）（図１１ａ）。この結果は、別の独立した動物コホートで確実に再現された（示されない）。

【0142】

ＯＦＴでは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与したマウスコホートは、１０分間の試験中に減少した数の排泄を示した（図１１ｂ）が、これは、減少したストレスまたは低下した総胃腸通過と関連している可能性がある（図１０ｆ）。野生型マウスは、生来、閉じた、暗く、狭い空間を好むが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１４を投与したマウスコホートは、内側の４０×４０ｃｍゾーンを探索して過ごす時間が長くなり、１０×１０ｃｍの外側ゾーンに沿った端の近くで過ごす時間が減少し（図１１ｄ、ｅ）、総移動距離は変化しなかった（図１１ｃ）。ＯＦＴで観察されたこれらの効果は、別のマウスのコホートでのＯＦＴによって確認された（示されない）。異なる初期腸内微生物相を有する異なる供給業者（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手したマウスでの追加のＯＦＴも、上記と同様の生理学的および行動的結果をもたらした（示されない）。

【0143】

実施例１０ 本発明の遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株の経口投与の有効性は、マウスにおけるＳＳＲＩと一致する
とりわけＰｒｏｚａｃおよびＳａｒａｆｅｍのブランド名で販売されているフルオキセチンは、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）クラスの一般的に使用されている抗鬱薬である。これは、大鬱病性障害、心的外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＤ）、およびその他の適応症を治療するのに使用される。本発明の遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ ｏＮ株の経口投与の有効性は、治療されたマウスにおいて不安またはストレスの治療的減少を示す行動変化を誘発する能力によって、フルオキセチンの投与に対応することが示される。

【0144】

１０．１方法論：
１０．１．１投与：以下の変更以外は、６．１．１で経口投与について記載したように行った。マウスに、無菌ＰＢＳのみ（ＰＢＳ）または無菌ＰＢＳ（ｏＮ１４）中で新たに増殖させた１０^９細胞のＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株指定ｏＮ１４（ｐＭＵＴ１４－ｓｅｒを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ）を強制経口投与で投与した。さらに、マウスに、生理食塩水または生理食塩水中のＳＳＲＩ、フルオキセチンの２００μｌ腹腔内（ＩＰ）注射を１０ｍｇ／ｋｇ体重で投与した。マウスは、２１日間同じ時刻に２４時間ごとに経口およびＩＰ投与の同時治療を受けた。したがって、４つのマウス治療群は、ＩＰ：生理食塩水／強制経口投与：ＰＢＳ（陰性対照）、ＩＰ：フルオキセチン／強制経口投与：ＰＢＳ（ＳＳＲＩ陽性比較対照薬）、ＩＰ：生理食塩水／強制経口投与：ｏＮ１４（ｏＮ１４陽性比較対照薬）、およびＩＰ：フルオキセチン／強制経口投与：ｏＮ１４（陽性組み合わせ比較対照薬）を与えられた。最後の投与の２４時間後、マウスを運動性および行動試験に供した。

【0145】

１０．２結果
ｏＮ１４（ＩＰ：生理食塩水／強制経口投与：ｏＮ１４）で２１日間処置した後にマウスが示した表現型は、フルオキセチン（ＩＰ：フルオキセチン／強制経口投与）で処置したものとよく似ている。図１２に示すように、Ａ）ＯＦＴ中に産生される排泄の減少は、ｏＮ１４、フルオキセチンまたは併用療法（ＩＰ：フルオキセチン／強制経口投与：ｏＮ１４）の両方で観察されるが、このことは、ストレスレベルの減少が少ない排便につながることを示す。さらに、図１２Ｂ）～Ｅ）では、内側ゾーンで滞在した時間および移動距離、ならびに内側ゾーンへの侵入の総数は、全て、ｏＮ１４またはフルオキセチン処置によって増加する。これらのパラメータの増加は、不安またはストレスの減少として解釈され、未知の環境で探索する意欲の増加を示す。強制水泳試験（図１２Ｆ）では、不動で滞在した時間は、絶望／鬱の指標として測定される。ｏＮ１４およびフルオキセチンでの処置は、両方とも不動の時間を大幅に短縮し、同様の効果を示す。ｏＮ１４で処置したマウスは、フルオキセチンで治療したマウスと比較して、内側ゾーンで滞在した時間、内側ゾーンへの侵入、および内側ゾーンでの距離への同様の効果を示した（図１２）。ｏＮ１４による処置およびフルオキセチンによる処置の組み合わせは、ｏＮ１４またはフルオキセチンのみで処置された個々のグループと比較した場合、総効果のわずかな減少をもたらした。

【0146】

実施例１１ 本発明の遺伝子改変Ｅ．ｃｏｌｉ株の経口投与は、血漿中および尿中セロトニンを増加させる
５－ＨＴＰ産生Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ｏＮ１０をマウスに経口投与すると、マウスの血漿中セロトニンおよび尿中セロトニンならびに５－ＨＴＰ濃度を上昇させることが示された。

【0147】

１１．１方法論
１１．１．１経口投与：以下の変更を加え、６．１．１に記載される通りである。動物は、強制経口投与の３日前からおよび実験の初めから終わりまで、飲料水中でストレプトマイシン（５ｇ／Ｌ）を与えられた。１０８細胞のｏＮ１０またはトリプトファンヒドロキシラーゼを含まない対照ＥｃＮ株（ＥｃＮ＿対照）のいずれかの単回の強制経口投与。動物を、ＴＤＣ阻害剤カルビドパで２４時間ごとに腹腔内注射（ＩＰ）で処置し、新鮮な糞便サンプルを７日間毎日収集し、その後、動物を安楽死させた。血漿サンプルを、強制経口投与後２日目および７日目に採取した。

【0148】

１１．１．２インビボ代謝産物分析：血漿、組織、腸内容物、尿および糞便サンプルを、セロトニン、５－ヒドロキシトリトファン、トリプタミン、５－ヒドロキシインドール酢酸（５－ＨＩＡＡ）およびトリプトファンについて分析した。血漿用：強制経口投与後２日目（および心臓穿刺８日目）に顎下静脈から血液サンプルを採取し、Ｌｉ－Ｈｅｐａｒｉｎ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒｓで１０分間氷上に保持した後、１００００ｇ、４℃で９０秒遠心分離して血漿を分離し、血漿を、－８０℃で急速凍結した。サンプルを解凍した後、０．９％ＮａＣｌ、０．２％アスコルビン酸、および２０ｍｇ／ＬのＣ－１３標識トリプトファンを含む内部標準緩衝液を添加し、メタノール抽出を使用してタンパク質を沈殿させた。真空遠心機を用いてサンプルを乾燥させた後、それらをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために５０μｌのｄｄＨ_２Ｏ中で再構成した。組織分析用：結腸組織の重さを量り、収集後すぐに液体窒素で凍結し、ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ １１２０１１）中で、単一の６．３４ｍｍのステンレス鋼ビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ １１０７９６３５ｓｓ）を有するステンレス鋼マイクロバイアル（Ｂｉｏｓｐｅｃ ２００７）を用いて３０秒間叩くことにより凍結破砕した。強制経口投与後２日目および６日目に尿を採取し、直ちに－８０℃で急速凍結した。サンプルを解凍した後、０．９％ＮａＣｌ、０．２％アスコルビン酸、および２０ｍｇ／ＬのＣ－１３標識トリプトファンを含む内部標準緩衝液を添加し、メタノール抽出を使用してタンパク質を沈殿させた。真空遠心機を用いてサンプルを乾燥させた後、それらをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために５０μｌのｄｄＨ_２Ｏ中で再構成した。

【0149】

１１．２結果
ＴＰＨ発現のない対照株と比較して、ｏＮ１０を含む血漿で５－ＨＴ濃度の有意な増加が観察され（両側ｔ検定によりｐ＜０．００１）、このことは、インビボでの５－ＨＴＰのｏＮ１０由来の産生の成功を示す（図１３Ａ）。ｏＮ１０により産生される５－ＨＴＰの量は、トリプトファン濃度に影響を与えずに末梢血漿セロトニン濃度を上昇させるのに十分であったが（図１３Ｂ）、このことは、生理学的に適切なレベルの範囲内のセロトニン代謝に対するｏＮ１０の特定の効果を示す。５－ＨＴＰの血漿中濃度は、全てのサンプルで定量レベルを下回った。しかしながら、５－ＨＴＰは血液脳関門を通過することが知られているため、末梢で産生される５－ＨＴＰは、気分、睡眠、不安およびその他の障害への見込みのある治療効果を伴って、脳内のセロトニン生合成を増加させることができる（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ｏＮ１０株は、一定の用量で胃腸管内から５－ＨＴＰを送達するメカニズムを示し、５－ＨＴＰおよび５－ＨＴなどの神経伝達物質の用量依存性の変動の望ましくない影響を回避する。

【0150】

尿中５－ＨＴおよび５－ＨＴＰ濃度も、対照群と比較してｏＮ１０で増加したが（それぞれ図１３ＣおよびＤ）、このことは、ｏＮ１０でセロトニン代謝が増加したことを示す。

【0151】

実施例１２：遺伝子改変されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、５－ＨＴ産生のための生合成経路を発現する
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、組換え遺伝子の導入によって遺伝的に改変することにより、ＴＲＰを５－ＨＴＰに変換し、次に５－ＨＴＰを５－ＨＴに変換する２つの連続した代謝ステップを触媒する酵素を含む合成セロトニン経路を確立した（図１）。これらの２つの代謝ステップを触媒する酵素の最適な組み合わせの特定は、ＴＰＨ遺伝子およびＴＤＣ遺伝子の組み合わせから得られる５－ＨＴ収量を発現および決定することによって決定された。

【0152】

１２．１方法論
改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、表１を参照して、以下のように操作した。
宿主株であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、Ｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）から入手した。哺乳動物、植物または細菌の供給源に由来するＴＰＨタンパク質をコードする遺伝子であるマウスＴＰＨ１（Ｍ１）およびイネＴＤＣ（Ｒ）は、１．１．１におけるものと同じであった。細菌Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ Ｅｌｌｉｎ３４５（ｃｋ）とは異なるＴＤＣ遺伝子もまた試験された。経路遺伝子を、酵母２μプラスミドバックボーン、またはＡＲＳ／ＣＥＮバックボーンのいずれかにクローン化した（図１４を参照）。Ｍ１遺伝子を、ＰＫＧ１プロモーターの制御下でクローン化し、ＴＤＣ遺伝子（イネＴＤＣまたはｃｋ ＴＤＣのいずれか）をＴＥＦ１プロモーターによって制御した。続いて、当該技術分野で既知の標準的なクローニングおよび形質転換手順を使用することにより、プラスミドを宿主株に形質転換した。

【0153】

増殖およびインビトロ代謝産物生産を、以下のように決定した。酵母株を、合成完全ドロップアウト（ＳＣ）培地（アミノ酸を含まない酵母窒素ベース６．７ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ドロップアウトミックス２ｇ／Ｌ）中で増殖させた。使用したドロップアウトミックスは、ヒスチジンを欠くことによってプラスミドを維持した。陰性対照（プラスミドを含まない）を、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンで増殖させた。各株から３つの単一コロニーを選び、２４個のディープウェルプレートで２ｍｌμｌの培地で増殖させ、２５０ｒｐｍ、３０℃で４８時間振とうした。本培養物を、振とうフラスコ中で２５ｍｌＳＣ培地＋５００ｍｇ／Ｌトリプトファン中でＯＤ_６００＝０．０５まで接種し、細胞を、同じ条件下で７２時間増殖させた。その後、培養上清を１７０００×ｇで２分間の遠心分離により細胞から分離し、ＨＰＬＣによる分析まで、－２０℃で凍結した。示される全てのデータは、少なくとも３つの生物学的複製由来の平均＋／－ＳＤである。

【0154】

代謝産物生産を、１．１．３のようにＬＣ－ＭＳによって定量化した。

【0155】

１２．２結果：
イネ由来のＴＤＣ（Ｒ）［またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ Ｅｌｌｉｎ３４５（ｃｋ＿ＴＤＣ）の細菌ＴＤＣ遺伝子と組み合わせてマウスＴＰＨ１（Ｍ１）を発現するように操作された宿主Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子改変株は、顕著な量のセロトニンを産生した（図１５Ａ）。ＴＰＨまたはＴＤＣ遺伝子発現を有しない対照株（Ｓｃ＿Ｃｏｎｔｒｏｌ）では、セロトニン産生は検出されず（ｐ＜０．００１８、ＡＮＯＶＡ）、マウスＴＰＨ１およびＲ－ＴＤＣを発現する株（ｐＳｃ－１およびｐＳｃ－２）またはｃｋ－ＴＤＣ（ｐＳｃ－３）（表１を参照）は、それぞれおよそ０．３８＋／－０．０７ｍｇ／Ｌおよび０．５２＋／－０．０６ｍｇ／Ｌのセロトニンを産生した。ｃｋ－ＴＤＣ遺伝子はまた、Ｒ－ＴＤＣ遺伝子を機能的に置換し得、Ｅ．ｃｏｌｉ構築物におけるセロトニンの産生を可能にする（図１５Ｂ）が、ｃｋ－ＴＤＣの強い過剰発現は、ｏＮにおいて細胞毒性を引き起こし（図１５Ｃ）、Ｒ－ＴＤＣ発現と比較して、増殖率および最終バイオマス収量の減少をもたらす。

【0156】

実施例１３：遺伝子改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８細胞は、５－ＨＴ産生のための生合成経路を発現する
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、組換え遺伝子の導入によって遺伝的に改変することにより、ＴＲＰを５－ＨＴＰに変換し、次に５－ＨＴＰを５－ＨＴに変換する２つの連続した代謝ステップを触媒する酵素を含む合成セロトニン経路を確立した（図１）。これらの２つの代謝ステップを触媒する最適な組み合わせ酵素の同定は、ＴＰＨ遺伝子およびＴＤＣ遺伝子の組み合わせから得られる５－ＨＴ収量を発現および決定することによって決定される。

【0157】

１３．１方法論
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）［ＮＣ＿０００９６４］から入手した宿主株Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８を、表１を参照して、次のように遺伝子操作した。哺乳動物または植物源に由来するＴＰＨタンパク質をコードする遺伝子であるマウスＴＰＨ１（Ｍ１）およびイネＴＤＣ（Ｒ）は、１．１．１におけるものと同じであった。試験されたＴＰＨおよびＴＤＣ遺伝子の組み合わせを、Ｅ．ｃｏｌｉ ｆｏｌＥ遺伝子のＴ１９８Ｉバリアントとともに統合プラスミド（ｐＤＧ３６４に由来、表１を参照）にクローン化することにより、経路オペロンのゲノム統合を促進した。遺伝子を、強力なＢａｃｉｌｌｕｓ特異的プロモーター（Ｐｓ１１）、Ｍ１の強力なＲＢＳ（Ｒ０１）、ＴＤＣの中強度のＲＢＳ（表１のＲＢＳ５０）、およびｆｏｌＥ（Ｔ１９８Ｉ）の強力なＲＢＳ（Ｒ１１）からなる合成オペロンに配置した。プラスミドｐＢｓ－Ｍ１Ｒｆは、マウスＴＰＨ１、イネＴＤＣ、およびｆｏｌＥ（Ｔ１９８Ｉ）遺伝子を含んだ（図１６）。

【0158】

クローニングを、標準的な分子生物学的手法を採用することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０で実施した。続いて、当該技術分野で既知の標準的なクローニングおよび形質転換手順を使用することにより、プラスミドを宿主株に形質転換した。ａｍｙＥ遺伝子座でのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８ゲノムへの正しい経路統合を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって検証した。

【0159】

増殖およびインビトロ代謝産物生産を、以下のように決定した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８株を、０．２％（ｗ／ｖ）グルコースおよび５０ｍｇ／ＬのＬ－トリプトファンを含むＬｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地で増殖させた。各株から３つの単一コロニーを選び、９６ディープウェルプレート中で３００μｌの培地で増殖させ、２５０ｒｐｍ、３７℃で１６時間振とうした。この予備培養物を新鮮な培地に１：１００で希釈することによって主培養物に接種し、細胞を同じ条件下で２４時間増殖させた。その後、０．２μｍ孔サイズのフィルターを使用して培養上清を細胞から分離し、ＬＣ－ＭＳによる分析まで、－２０℃で凍結した。示される全てのデータは、少なくとも３つの生物学的複製由来の平均＋／－ＳＤである。

【0160】

代謝産物生産を、１．１．３と同様に、ＬＣ－ＭＳによって定量化した。

【0161】

１３．２結果：
マウスＴＰＨ１（Ｍ１）を発現するように操作された宿主の遺伝子改変株であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８は、イネ（Ｒ）およびＥ．ｃｏｌｉ ｆｏｌＥ（Ｔ１９８Ｉ）由来のＴＤＣと組み合わせて、セロトニンおよび５－ＨＴＰを産生すると予想される。

【0162】

野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８株を使用して５－ＨＴＰまたは５－ＨＴは産生されないが、トリプトファンヒドロキシラーゼＭ１をｆｏｌＥ（Ｔ１９８Ｉ）と一緒に発現させると、５－ＨＴＰの産生が可能になるであろう。Ｍ１＿ＴＰＨ、ｆｏｌＥ（Ｔ１９８Ｉ）およびＲ＿ＴＤＣの発現は、セロトニンの産生をもたらすと予想される。

【0163】

【表2-1】

【表2-2】

【表3】

【表4】

【0164】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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