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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-16
(45)【発行日】2025-01-24
(54)【発明の名称】抗ＳＩＲＰα抗体およびその適用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20250117BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250117BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250117BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20250117BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250117BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250117BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250117BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250117BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250117BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250117BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250117BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N1/15
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P35/02
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2023558929
(86)(22)【出願日】2021-12-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-25
(86)【国際出願番号】 CN2021136763
(87)【国際公開番号】W WO2022121980
(87)【国際公開日】2022-06-16
【審査請求日】2023-06-09
(31)【優先権主張番号】202011464010.2
(32)【優先日】2020-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】523220581
【氏名又は名称】浙江博鋭生物製薬有限公司
(73)【特許権者】
【識別番号】523220592
【氏名又は名称】杭州博之鋭生物製薬有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏｒａｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉａｃａｌ （Ｈａｎｇｚｈｏｕ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】呉振華
(72)【発明者】
【氏名】聶磊
(72)【発明者】
【氏名】梅小芬
(72)【発明者】
【氏名】王海彬
(72)【発明者】
【氏名】陳娟
(72)【発明者】
【氏名】李娜
(72)【発明者】
【氏名】王暁澤
(72)【発明者】
【氏名】周雅▲クィオン▼
(72)【発明者】
【氏名】陳瑶
(72)【発明者】
【氏名】▲ジァン▼美珠
【審査官】上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１９０７１９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】米国特許出願公開第２０２０／０２９７８４２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５１０２５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５２００３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５３４８４５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １６／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
３つのＣＤＲ、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、３つのＣＤＲ、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、前記ＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号３３に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３４に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３５に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号３８に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３９に記載されており；および、
前記ＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号４０に記載されている、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３１に記載されているか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有しており；前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３６に記載されているか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有している、請求項１に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
重鎖定常領域、軽鎖定常領域およびＦｃ領域のうちの１つ以上をさらに含み；好ましくは、前記軽鎖定常領域がλ鎖またはκ鎖定常領域であり；より好ましくは、前記抗体またはその抗原結合断片がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４タイプのものであり；さらにより好ましくは、前記抗体またはその抗原結合断片がキメラ抗体もしくはヒト化抗体またはそれらの抗原結合断片である、請求項１または２に記載の抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって；好ましくは、前記核酸分子が前記抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれコードするヌクレオチド配列を含み；より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号３２に記載されているか、もしくはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し；および前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号３７に記載されるか、もしくはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、核酸分子。
【請求項5】
生体材料であって、前記生体材料が以下である生体材料：（１）請求項４に記載の核酸分子を含むベクター、宿主細胞もしくは微生物；または、
（２）請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗体結合断片を含む、上記（１）の発現産物、懸濁液または上清。
【請求項6】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物であって；好ましくは、前記組成物が、薬学的に許容可能な担体をさらに含む医薬組成物である、組成物。
【請求項7】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片の調製方法であって、請求項５に記載の宿主細胞を培養して、前記抗体または前記抗原結合断片を発現させる工程と、前記抗体または前記抗原結合断片を単離する工程とを含む、調製方法。
【請求項8】
腫瘍を治療するための薬剤の調製における、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項４に記載の核酸分子、請求項５に記載の生体材料または請求項６に記載の組成物の使用であって；好ましくは、前記腫瘍はＣＤ４７陽性腫瘍であり；より好ましくは、前記腫瘍が白血病、リンパ腫、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、胃癌、黒色腫、膵臓癌、結腸直腸癌、食道癌、肝臓癌、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、甲状腺癌、神経膠腫および他の固形腫瘍などの血液学的腫瘍または固形腫瘍である、使用。
【請求項9】
ＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合を遮断する製剤の調製における、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項４に記載の核酸分子、請求項５に記載の生体材料、または請求項６に記載の組成物の使用。
【請求項10】
腫瘍を治療するための薬剤の調製における、１つ以上の追加の癌治療剤と組み合わせた、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項４に記載の核酸分子、請求項５に記載の生体材料、または請求項６に記載の組成物の使用であって；好ましくは、前記腫瘍はＣＤ４７陽性腫瘍であり；好ましくは、前記追加の癌治療剤としては化学療法剤、放射線治療剤、および生体高分子薬物が挙げられるが、これらに限定されず；より好ましくは、前記生体高分子薬物が抗ＣＤ２０抗体、セツキシマブ、またはトラスツズマブなどの腫瘍細胞表面抗原を標的とするモノクローナル抗体薬物であり；より好ましくは、前記抗ＣＤ２０抗体がズベリタマブまたはリツキシマブである、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
本発明は生物学の分野に属し、抗ＳＩＲＰα抗体に関する。
本発明は生物学の分野に属し、抗ＳＩＲＰα抗体に関する。
【0002】
〔背景〕
ＳＩＲＰαはマクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球などの骨髄細胞の表面に発現する膜貫通タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである。ＳＩＲＰαは、Ｎ末端細胞外領域、膜貫通領域およびＣ末端細胞内領域から構成される。細胞外領域は３つのＩｇＳＦドメイン（Ｎ末端はＩｇ－Ｖドメインである）を含み、細胞内領域は免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。ＳＩＲＰαの主要なリガンドはＣＤ４７であり、これは、正常組織および病変において広く発現される膜貫通糖蛋白のグループである。マクロファージなどの骨髄細胞上のＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合は、ＳＩＲＰα細胞内領域におけるＩＴＩＭのリン酸化をもたらし、このことは次に、ホスファターゼＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２を動員および活性化し、それによって、下流のシグナル伝達を介してマクロファージの食作用を阻害する。正常組織はＣＤ４７を発現し、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル伝達を誘導することによって、自己防御機構として「私を食べるな」というシグナルを放出する。
ＳＩＲＰαはマクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球などの骨髄細胞の表面に発現する膜貫通タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである。ＳＩＲＰαは、Ｎ末端細胞外領域、膜貫通領域およびＣ末端細胞内領域から構成される。細胞外領域は３つのＩｇＳＦドメイン（Ｎ末端はＩｇ－Ｖドメインである）を含み、細胞内領域は免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。ＳＩＲＰαの主要なリガンドはＣＤ４７であり、これは、正常組織および病変において広く発現される膜貫通糖蛋白のグループである。マクロファージなどの骨髄細胞上のＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合は、ＳＩＲＰα細胞内領域におけるＩＴＩＭのリン酸化をもたらし、このことは次に、ホスファターゼＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２を動員および活性化し、それによって、下流のシグナル伝達を介してマクロファージの食作用を阻害する。正常組織はＣＤ４７を発現し、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル伝達を誘導することによって、自己防御機構として「私を食べるな」というシグナルを放出する。
【0003】
ＣＤ４７は、ほとんど全ての腫瘍細胞上で過剰発現されることが見出されている。腫瘍細胞は、ＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合を介して「私を食べるな」というシグナルを送ることによって、免疫細胞の監視から逃れる。臨床的には、ＣＤ４７発現レベルが患者の予後不良と密接に関連している。インビトロおよびインビボの研究はまた、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαを遮断することが、動物モデルにおいて腫瘍細胞の食作用を促進し、腫瘍増殖を阻害し得ることを実証した。上記のことは、標的化ＣＤ４７／ＳＩＲＰαが腫瘍免疫療法を開発するための新しいアプローチとして使用され得ることを示す。ＣＤ４７が正常な細胞または組織、特に赤血球および血小板上で広く発現されることを考慮すると、ＣＤ４７を標的とすることは、血液学的毒性を引き起こし得る。さらに、ＳＩＲＰαに加えて、ＣＤ４７はまた、ＴＳＰ－１およびインテグリンと相互作用し得る。ＣＤ４７は様々なシグナル伝達経路に関与し、ＣＤ４７を標的とすることは、多くの安全性の懸念につながり得る。したがって、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαシグナル伝達経路を遮断するための抗ＳＩＲＰα抗体の開発は、癌治療のためのより有効な戦略であり得る。
【0004】
〔概要〕
本発明はＳＩＲＰαに特異的に結合することができ、腫瘍治療の大きな可能性を有する新規な抗ＳＩＲＰα抗体を提供することを目的とする。
本発明はＳＩＲＰαに特異的に結合することができ、腫瘍治療の大きな可能性を有する新規な抗ＳＩＲＰα抗体を提供することを目的とする。
【0005】
第１の態様において、本発明は、ＳＩＲＰαもしくはその断片に結合する抗ＳＩＲＰα抗体、またはその抗原結合断片を提供する。前記抗体またはその抗原結合断片は、３つのＣＤＲ、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに３つのＣＤＲ、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
前記ＶＨ ＣＤＲ１が配列番号３、１３、２３または３３に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号４、１４、２４または３４に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号５、１５、２５または３５に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号８、１８、２８または３８に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号９、１９、２９または３９に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１０、２０、３０または４０に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
前記ＶＨ ＣＤＲ１が配列番号３、１３、２３または３３に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号４、１４、２４または３４に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号５、１５、２５または３５に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号８、１８、２８または３８に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号９、１９、２９または３９に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号１０、２０、３０または４０に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【0006】
好ましい実施形態では、前記抗体がＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、
前記ＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号３に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号４に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号５に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号８に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており；および、
前記ＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１０に記載されている。
前記ＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号３に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号４に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号５に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号８に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号９に記載されており；および、
前記ＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１０に記載されている。
【0007】
好ましい実施形態では、前記抗体がＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、
前記ＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１３に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１４に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１５に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１８に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１９に記載されており；および、
前記ＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２０に記載されている。
前記ＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１３に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１４に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１５に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１８に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１９に記載されており；および、
前記ＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２０に記載されている。
【0008】
好ましい実施形態では、前記抗体がＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、
前記ＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２３に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２４に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２５に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２８に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２９に記載されており；および、
前記ＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３０に記載されている。
前記ＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２３に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２４に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２５に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号２８に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２９に記載されており；および、
前記ＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３０に記載されている。
【0009】
好ましい実施形態では、前記抗体がＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、
前記ＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号３３に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３４に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３５に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号３８に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３９に記載されており；および、
前記ＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号４０に記載されている。
前記ＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号３３に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３４に記載されており；
前記ＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号３５に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号３８に記載されており；
前記ＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号３９に記載されており；および、
前記ＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号４０に記載されている。
【0010】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１、１１、２１、もしくは３１に記載されているか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有している。
【0011】
いくつかの実施形態では、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６、１６、２６もしくは３６に記載されているか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有している。
【0012】
特定の好ましい実施形態では、重鎖可変領域における３つのＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域における３つのＣＤＲは、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムに従って定義される。
【0013】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片は、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、およびＦｃ領域のうちの１つ以上をさらに含み得る。さらに好ましい実施形態では、軽鎖定常領域は、λ鎖またはκ鎖定常領域である。いくつかの好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合断片がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４タイプのものである。
【0014】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片がキメラ抗体もしくはヒト化抗体、またはそれらの抗原結合断片である。
【0015】
第２の態様では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチドを含む核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする。
【0016】
好ましい実施形態では、核酸分子は重鎖可変領域をコードし、対応するヌクレオチド配列が配列番号２、１２、２２もしくは３２に記載されているか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の好ましい実施形態では、核酸分子は軽鎖可変領域をコードし、対応するヌクレオチド配列が配列番号７、１７、２７、もしくは３７に記載されるか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0017】
第３の態様では、本発明は、以下である生体材料を提供する：
（１）本明細書に開示される核酸分子を含むベクター、宿主細胞、微生物など；または、
（２）上記（１）の発現産物、懸濁液、上清など。
（１）本明細書に開示される核酸分子を含むベクター、宿主細胞、微生物など；または、
（２）上記（１）の発現産物、懸濁液、上清など。
【0018】
当業者は抗体のアミノ酸配列に従って、抗体のコード配列を含むベクター、宿主細胞または微生物を容易に選択および調製することができ、対応する発現産物、懸濁液、上清などを得るために、そのような宿主細胞または微生物をどのように培養するかを知ることができ、対応する抗体を得ることができる。これらは全て、当該技術分野における従来技術である。
【0019】
第４の態様では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片を含む組成物が提供され、好ましくは前記組成物が薬学的に許容可能な担体をさらに含む医薬組成物である。
【0020】
第５の態様では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片の調製方法であって、上記宿主細胞を培養して、抗体または抗原結合断片を発現させる工程と、前記抗体または抗原結合断片を単離する工程とを含む調製方法が提供される。
【0021】
第６の態様では、腫瘍を治療するための薬剤の調製における、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合断片、核酸分子、生体材料、または組成物の使用が提供され；好ましくは、腫瘍はＣＤ４７陽性腫瘍であり；より好ましくは、腫瘍が白血病、リンパ腫、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、胃癌、黒色腫、膵臓癌、結腸直腸癌、食道癌、肝臓癌、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、甲状腺癌、神経膠腫、および他の固形腫瘍などの血液学的腫瘍または固形腫瘍である。
【0022】
第７の態様では、ＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合を遮断する製剤の調製における、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合断片、核酸分子、生体材料または組成物の使用が提供される。
【0023】
第８の態様では、腫瘍を治療するための薬剤の調製における、１つ以上の追加の癌治療剤と組み合わせた、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合断片、核酸分子、生体材料、または組成物の使用が提供され；好ましくは、腫瘍はＣＤ４７陽性腫瘍である。
【0024】
いくつかの好ましい実施形態では、追加の癌治療剤としては化学療法剤、放射線治療剤、および生体高分子薬物が挙げられるが、これらに限定されない。さらに好ましくは、生体高分子薬物が抗ＣＤ２０抗体（例えば、ズベリタマブまたはリツキシマブ）、セツキシマブおよびトラスツズマブを含む、腫瘍細胞表面抗原を標的とするモノクローナル抗体薬物である。
【0025】
第９の態様では、腫瘍を治療するための方法が提供され、腫瘍はＣＤ４７陽性腫瘍であり；好ましくは、腫瘍が、白血病、リンパ腫、膀胱癌、乳癌、頭頸部癌、胃癌、黒色腫、膵臓癌、結腸直腸癌、食道癌、肝臓癌、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、甲状腺癌、神経膠腫および他の固形腫瘍などの血液学的腫瘍または固形腫瘍であり；前記方法は、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合断片、核酸分子、生体材料または組成物を必要とする個体に投与する工程を含む。
【0026】
第１０の態様では、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合断片、核酸分子、生体材料または組成物を使用する工程を含む、ＣＤ４７へのＳＩＲＰαの結合を遮断するための方法が提供される。
【0027】
第１１の態様では、併用療法で腫瘍を治療するための方法が提供され、ここで、腫瘍はＣＤ４７陽性腫瘍であり；この方法は、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合断片、核酸分子、生体材料または組成物、および１つ以上の追加の癌治療剤を必要とする個体に投与する工程を含み；好ましくは、追加の癌治療剤が化学療法剤、放射線治療剤、および生体高分子薬物を含むが、これらに限定されず；より好ましくは生体高分子薬物が抗ＣＤ２０抗体（例えば、ズベリタマブまたはリツキシマブ）、セツキシマブおよびトラスツズマブを含む、腫瘍細胞表面抗原を標的とするモノクローナル抗体薬物である。
【0028】
本明細書に開示される抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片はＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合を効果的に遮断することができ、それによって腫瘍細胞へのマクロファージの食作用を効果的に促進し、腫瘍の成長を効果的に阻害し、良好な薬学的見通しを有する遮断抗体である。
【0029】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、ＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合に対するマウスモノクローナル抗体の遮断効果を示す。
図１は、ＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合に対するマウスモノクローナル抗体の遮断効果を示す。
【0030】
図２は、ＳＩＲＰαへのヒト化モノクローナル抗体の結合を示す。
【0031】
図３は、ＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合に対するヒト化モノクローナル抗体の遮断効果を示す。
【0032】
図４Ａは、ＣＤ４７へのＳＩＲＰα（Ｖ１）の結合に対する＃１４抗体およびＫＷＡＲ２３の遮断効果を示す。
【0033】
図４Ｂは、ＣＤ４７へのＳＩＲＰα（Ｖ１）の結合に対する＃１４抗体、１８Ｄ５および１Ｈ９の遮断効果を示す。
【0034】
図４Ｃは、ＣＤ４７へのＳＩＲＰα（Ｖ２）の結合に対する＃１４抗体、ＫＷＡＲ２３、１８Ｄ５および１Ｈ９の遮断効果を示す。
【0035】
図４Ｄは、ＣＤ４７へのＳＩＲＰα（Ｖ８）の結合に対する＃１４抗体、ＫＷＡＲ２３、１８Ｄ５および１Ｈ９の遮断効果を示す。
【0036】
図５は、組換えＳＩＲＰαタンパク質に対する＃１４抗体およびＫＷＡＲ２３の結合動態を示す。
【0037】
【0038】
図７は、ＭＣ３８腫瘍モデルにおける＃１４抗体の抗腫瘍有効性を示す。
【0039】
図８は、＃１４抗体および抗ＣＤ２０抗体が腫瘍増殖を相乗的に阻害できることを示す。
【0040】
〔詳細な説明〕
本発明は、以下の具体的な実施例を参照して説明されるであろう。以下の手順で使用される試薬および器具は特に明記しない限り、当技術分野で従来のものであり、市販されている；使用される方法は当技術分野では全て従来のものであり、当業者は本方法を確実に実施し、実施例の説明に従って、対応する結果を得ることができる。
本発明は、以下の具体的な実施例を参照して説明されるであろう。以下の手順で使用される試薬および器具は特に明記しない限り、当技術分野で従来のものであり、市販されている；使用される方法は当技術分野では全て従来のものであり、当業者は本方法を確実に実施し、実施例の説明に従って、対応する結果を得ることができる。
【0041】
定義：
本発明において、用語「抗体」は抗原を特異的に認識して結合することができる免疫グロブリンであり、様々な抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体または抗体断片、合成抗体、組換えにより産生された抗体、ヒト抗体、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）、ヒト化抗体、キメラ抗体、ならびに細胞内抗体および抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗体断片としては例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、または上記抗体のいずれかの抗原結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供される抗体は任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ）、任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ｌｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２）またはタイプ（例えば、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）の免疫グロブリンのメンバーを含む。好ましい態様において、本明細書に開示される抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
本発明において、用語「抗体」は抗原を特異的に認識して結合することができる免疫グロブリンであり、様々な抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体または抗体断片、合成抗体、組換えにより産生された抗体、ヒト抗体、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）、ヒト化抗体、キメラ抗体、ならびに細胞内抗体および抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗体断片としては例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、または上記抗体のいずれかの抗原結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供される抗体は任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ）、任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ｌｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、またはＩｇＡ２）またはタイプ（例えば、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）の免疫グロブリンのメンバーを含む。好ましい態様において、本明細書に開示される抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
【0042】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗体断片」または「抗原結合断片」は全長未満であるが、抗原に結合する抗体の可変領域の少なくとも一部（例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲおよび／または１つ以上の結合部位）を含み、したがって、結合特異性ならびに全長抗体の特異的結合能力の少なくとも一部を保持する、全長抗体の任意の部分を指す。したがって、抗原結合断片は、抗体断片が由来する抗体と同じ抗原に結合する抗原結合部分を含む抗体断片を指す。抗体断片は全長抗体の酵素処理によって産生された抗体誘導体、ならびに合成された誘導体、例えば、組換えによって産生された誘導体を含む。抗体は抗体断片を含む。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、ならびに修飾断片を含む他の断片が挙げられる（例えば、Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov）。断片は例えば、ジスルフィド結合および／またはペプチドリンカーによって互いに連結された複数の鎖を含み得る。抗体断片は一般に、少なくともまたは約５０個のアミノ酸、典型的には少なくともまたは約２００個のアミノ酸を含む。抗原結合断片は（例えば、対応する領域を置換することによって）抗体フレームワークに挿入されると、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生じる任意の抗体断片を含む。
【0043】
本明細書で使用される場合、「従来の抗体」は２つの重鎖（ＨおよびＨ’と命名され得る）、２つの軽鎖（ＬおよびＬ’と命名され得る）および２つの抗原結合部位を含む抗体を指し、ここで、各重鎖は抗原結合能力を保持する全長免疫グロブリン重鎖またはその任意の機能領域（例えば、重鎖はＶＨ鎖、ＶＨ－ＣＨ１鎖およびＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３鎖を含むが、これらに限定されない）であり得、各軽鎖は全長軽鎖またはその任意の機能領域（例えば、軽鎖はＶＬ鎖およびＶＬ－ＣＬ鎖を含むが、これらに限定されない）であり得る。各重鎖（ＨまたはＨ’）は、１つの軽鎖（それぞれＬまたはＬ’）と対になっている。
【0044】
本明細書で使用される場合、全長抗体は２つの全長重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）および２つの全長軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）、ならびにヒンジ領域を有する抗体、例えば、抗体分泌Ｂ細胞によって天然に産生される抗体、および同じドメインを有する合成的に産生される抗体である。
【0045】
本明細書で使用される場合、ｄｓＦｖは、ＶＨ－ＶＬペアを安定化する改変された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖを指す。
【0046】
本明細書で使用される場合、Ｆａｂ断片は、全長免疫グロブリンをパパインで消化することによって得られる抗体断片、または例えば組換え法によって、合成的に産生された同じ構造の断片である。Ｆａｂ断片は、Ｌ鎖（ＶＬおよびＣＬを含む）と、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および重鎖の１つの定常ドメイン（ＣＨ１）を含む別の鎖とを含む。
【0047】
本明細書で使用される場合、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ｐＨ４．０～４．５にてペプシンで免疫グロブリンを消化することによって得られる抗体断片、または例えば組換え法によって、合成的に産生される同じ構造の断片である。Ｆ（ａｂ’）２断片は実質的に２つのＦａｂ断片を含み、ここで、各重鎖部分は、２つの断片を連結するジスルフィド結合を形成するシステインを含む、いくつかの追加のアミノ酸を含む。
【0048】
本明細書で使用される場合、Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片の半分（１つの重鎖および１つのＬ鎖）を含む断片である。
【0049】
本明細書で使用される場合、ＳｃＦｖ断片は、ポリペプチドリンカーによって任意の順序で共有結合された軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗体断片を指す。
【0050】
「可変領域」という用語は、抗原エピトープを認識し、それに特異的に結合する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指し、これは、異なる抗体間で変化するアミノ酸配列を含む。各軽鎖または各重鎖は、それぞれ可変領域ドメインＶＬまたはＶＨを有する。可変ドメインは抗原特異性を提供し、したがって、抗原認識に関与する。各可変領域はＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、ＣＤＲは、抗原結合部位ドメインの一部である。
【0051】
ＣＤＲ領域または「相補性決定領域」は配列が超可変であり、構造的に定義されたループを形成し、かつ／または抗原接触アミノ酸残基を含む、抗体可変領域中の領域を指す。ＣＤＲは抗原エピトープへの抗体の結合に主に関与し、抗体の特異性を決定する。重鎖可変領域または軽鎖可変領域の所与のアミノ酸配列において、ＣＤＲの特定のアミノ酸配列は例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｏｎｔａｃｔ、ＡｂＭおよびＣｈｏｔｈｉａを含む多くの周知のナンバリングスキームのいずれか１つまたは組み合わせを用いて決定される。本発明の抗体のＣＤＲは、当技術分野の任意のスキームまたはその組み合わせに従って決定することができる。
【0052】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は互換的に使用することができ、抗体の抗原結合部位を共に形成する各可変領域内の複数の部分のうちの１つを指す。各可変領域ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲを含む。例えば、軽鎖可変領域ドメインはＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲを含み；重鎖可変領域ドメインはＨ ＣＤＲ１（またはＶＨ ＣＤＲ１）、Ｈ ＣＤＲ２（またはＶＨ ＣＤＲ２）およびＨ ＣＤＲ３（またはＶＨ ＣＤＲ３）と称される３つのＣＤＲを含む。可変領域中の３つのＣＤＲは直鎖状アミノ酸配列に沿って連続していないが、折り畳まれたポリペプチド中に近接している。ＣＤＲは、可変ドメインのβシートを接続する平行鎖のループ内に位置する。本明細書に記載されるように、ＣＤＲは当業者に公知であり、当業者によるＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｎｉａナンバリングに基づいて同定することができる（例えば、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, AIH Publication No. 91-3242, およびChothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917）。
【0053】
本明細書において、フレームワーク領域（ＦＲ）はβシート内に位置する抗体の可変領域ドメイン内のドメインであり、ＦＲ領域は、アミノ酸配列に関して超可変領域と比較してより保存されている。
【0054】
本明細書で使用される場合、「定常領域」ドメインは抗体の重鎖または軽鎖中のドメインであり、可変領域ドメインのアミノ酸配列と比較してより保存されているアミノ酸配列を含む。従来の全長抗体分子において、各軽鎖は単一の軽鎖定常領域（ＣＬ）ドメインを有し、各重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む１つ以上の重鎖定常領域（ＣＨ）ドメインを含む。抗体定常領域は例えば、様々な細胞、生体分子、および組織と相互作用することによって、抗体が特異的に結合する抗原、病原体、および毒素を排除するなどのエフェクター機能を果たすことができるが、これらに限定されない。
【0055】
本明細書で使用される場合、ＶＨドメインの機能領域は（例えば、インタクトなＶＨドメインの１つ以上のＣＤＲを保持することによって）インタクトなＶＨドメインの結合特異性の少なくとも一部を保持するインタクトなＶＨドメインの少なくとも一部であり、ＶＨドメインの機能領域は単独で、または別の抗体ドメイン（例えば、ＶＬドメイン）もしくはその領域との組み合わせで抗原に結合する。ＶＨドメインの例示的な機能領域は、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含む領域である。
【0056】
本明細書で使用される場合、ＶＬドメインの機能領域は（例えば、インタクトなＶＬドメインの１つ以上のＣＤＲを保持することによって）インタクトなＶＬドメインの結合特異性の少なくとも一部を保持するインタクトなＶＬドメインの少なくとも一部であり、ＶＬドメインの機能領域は単独で、または別の抗体ドメイン（例えば、ＶＨドメイン）もしくはその領域との組み合わせで抗原に結合する。ＶＬドメインの例示的な機能領域は、ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含む領域である。
【0057】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、典型的にはホスホジエステル結合によって共に連結されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、少なくとも２つの連結されたヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含むオリゴマーまたはポリマーを指す。
【0058】
本明細書中で使用される場合、単離された核酸分子は、核酸分子の天然源中に存在する他の核酸分子から単離された核酸分子である。ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技術によって調製される場合、他の細胞材料または培養培地を実質的に含まなくてもよく、または化学的に合成される場合、化学前駆体または他の化学成分を実質的に含まなくてもよい。本明細書において提供される例示的な単離された核酸分子は、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸分子を含む。
【0059】
配列「同一性」は当技術分野で周知の意味を有し、２つの核酸分子、ペプチド分子、または領域の間の配列同一性のパーセンテージは、当技術分野で開示される技術を使用して計算することができる。配列同一性は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全長に沿って、または分子の領域に沿って測定することができる。（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991参照）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の同一性を測定するための多くの方法があるが、用語「同一性」は当業者に周知である（Carrillo, H. & Lipman, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)）。
【0060】
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドの転写および翻訳によってポリペプチドを産生するプロセスを指す。ポリペプチドの発現レベルは例えば、宿主細胞において産生されるポリペプチドの量を決定するための方法を含む、当技術分野において公知の任意の方法を用いて評価することができる。そのような方法としてはＥＬＩＳＡ、ゲル電気泳動後のクマシーブルー染色、ローリータンパク質アッセイおよびブラッドフォードタンパク質アッセイによる細胞溶解物中のポリペプチドの定量が挙げられるが、これらに限定されない。
【0061】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」はベクターを受容し、維持し、複製し、増幅するために使用される細胞である。宿主細胞はまた、ベクターによってコードされるポリペプチドを発現するために使用され得る。宿主細胞が分裂すると、ベクター中の核酸が複製し、したがって増幅される。宿主細胞は、真核細胞または原核細胞であり得る。適切な宿主細胞としてはＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ ２９３細胞などのＨＥＫ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ベクターが適切な宿主細胞に形質転換される場合に、１つ以上の異種タンパク質が発現され得る複製可能な核酸である。ベクターには、典型的には制限酵素消化およびライゲーションによって、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸が導入され得るものが含まれる。ベクターはまた、ポリペプチドをコードする核酸を含むものを含む。ベクターは核酸を増幅するために、または核酸によってコードされるポリペプチドを発現／提示するために、ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入するために使用される。ベクターは通常、遊離状態にあるが、遺伝子またはその一部をゲノムの染色体に組み込むように設計することができる。酵母人工ベクターおよび哺乳動物人工染色体などの人工染色体ベクターも考えられる。そのような輸送手段の選択および使用は、当業者に周知である。
【0063】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、そのようなＤＮＡ断片の発現に影響を及ぼすことができる、プロモーター領域などの調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡを発現することができるベクターを含む。そのような追加の断片はプロモーターおよびターミネーター配列を含み得、任意に、１つ以上の複製起点、１つ以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは一般に、プラスミドもしくはウイルスＤＮＡに由来するか、またはそれらの要素を含み得る。したがって、発現ベクターは組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または適切な宿主細胞に導入されるとクローニングされたＤＮＡの発現を引き起こす他のベクターを指す。適切な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞および／または原核細胞において複製可能な発現ベクター、ならびに遊離状態を維持する発現ベクターまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれる発現ベクターを含む。
【0064】
本明細書で使用される場合、疾患または状態を有する個体を「治療する」とは、その個体の症状が治療後に部分的または完全に軽減されるか、または変化しないままであることを意味する。したがって、治療は、予防、治療および／または治癒を含む。予防は、基礎疾患の予防および／または症状の悪化もしくは疾患進行の予防を指す。治療はまた、任意の抗体またはその抗原結合断片ならびに本明細書に提供される組成物の任意の薬学的使用を含む。
【0065】
本明細書で使用される場合、「有効性」は、疾患もしくは状態の症状を変化させる、典型的には良くする、もしくは改善する、または疾患もしくは状態を治癒する、個々の治療から生じる効果を意味する。
【0066】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」または「治療有効用量」は、対象に投与された後に治療効果を生じるのに少なくとも十分な、物質、化合物、材料、または化合物を含む組成物の量を指す。したがって、当該量は、疾患または状態の症状を予防、治癒、改善、抑止、または部分的に抑止するのに必要な量である。また、本明細書で使用される場合、「予防有効量」または「予防有効用量」は対象に投与された場合に、所望の予防効果、例えば、疾患もしくは状態の発生もしくは再発を予防もしくは遅延させるか、または疾患もしくは状態の発生もしくは再発の可能性を低減する効果を有し得る、物質、化合物、材料または化合物を含む組成物の量を指す。完全予防有効用量は必ずしも１回の用量の投与によって達成されるわけではないが、一連の用量の投与後に達成され得る。したがって、予防有効量は、１回以上の用量を通して投与され得る。
【0067】
本明細書で使用される場合、「個体」という用語は、ヒトなどの哺乳動物を指す。
【0068】
〔本明細書に開示される抗ＳＩＲＰα抗体〕
本発明は、ヒトＳＩＲＰαタンパク質に対して高い親和性を有する抗ＳＩＲＰα抗体を提供する。抗体はＳＩＲＰαのそのリガンドＣＤ４７への結合を効果的に阻害し、それによってＣＤ４７／ＳＩＲＰαへの下流のシグナル伝達を遮断し、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を促進し、さらに腫瘍細胞の排除を実現することができる。細胞表面上のＳＩＲＰαタンパク質に結合する場合、本明細書に記載される抗ＳＩＲＰα抗体はエンドサイトーシスを引き起こし得、細胞表面上のＳＩＲＰαタンパク質の発現の低減をもたらし、それによって、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαシグナル伝達をさらに低減させる。
本発明は、ヒトＳＩＲＰαタンパク質に対して高い親和性を有する抗ＳＩＲＰα抗体を提供する。抗体はＳＩＲＰαのそのリガンドＣＤ４７への結合を効果的に阻害し、それによってＣＤ４７／ＳＩＲＰαへの下流のシグナル伝達を遮断し、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を促進し、さらに腫瘍細胞の排除を実現することができる。細胞表面上のＳＩＲＰαタンパク質に結合する場合、本明細書に記載される抗ＳＩＲＰα抗体はエンドサイトーシスを引き起こし得、細胞表面上のＳＩＲＰαタンパク質の発現の低減をもたらし、それによって、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαシグナル伝達をさらに低減させる。
【0069】
本明細書に開示される抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片は、置換、挿入または欠失を含む。本明細書に開示される抗ＳＩＲＰα抗体は軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖または重鎖に対する修飾を含み、その修飾されたアミノ酸配列は、抗体が由来するアミノ酸配列とは異なる。例えば、同じ所与のタンパク質に由来するアミノ酸配列は初期配列と類似していてもよく、例えば、特定のパーセントの同一性を有していてもよい。例えば、前記アミノ酸配列は、初期配列に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し得る。
【0070】
本明細書で使用される場合、「同一性」は、２つのペプチドまたは２つの核酸分子の配列がアラインされる場合、２つの比較される配列における同一の塩基（またはアミノ酸）のパーセントを指す。そのようなアライメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性は、Ausubel et al., eds., (2007), Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているものなどの当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを用いて決定することができる。好ましくは、アライメントがデフォルトパラメータを使用して実行される。１つのアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、プログラムはＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰである。
【0071】
特定の実施形態では、１つ以上であり得るアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによってＦｃバリアントを生成することができる。Ｆｃバリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾を含むヒトＦｃ領域配列を含み得る。
【0072】
本発明における適切な「抗体およびその抗原結合断片」にはポリクローナル、モノクローナル、一価、二重特異性、多重特異性、組換え、異種、キメラ、ヒト化もしくは脱免疫原性抗体、またはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体、ナノボディ、および前述の任意のエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されない。
【0073】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。抗ＳＩＲＰα抗体は、別の抗体または抗体断片に連結されて、二次またはそれ以上の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性の抗体を産生し得る。
【0074】
特定の実施形態では、抗体は、機能的成分を付加するためにさらに修飾され得る。抗体誘導体化のための適切な部分としてはＰＥＧ、デキストラン、タンパク質、脂質、治療剤および毒素が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、ペグ化、アミド化、他のタンパク質へのライゲーションなどによって修飾され得る。
【0075】
〔腫瘍治療および抗体の使用〕
本明細書で提供される抗ＳＩＲＰα抗体およびその抗原結合断片およびそれを含む医薬組成物は、癌を診断、予後診断、治療または阻害するために使用することができる。本発明は、本明細書に開示される抗ＳＩＲＰα抗体またはその断片を、必要とする対象に投与することによって、対象における癌を治療するための方法に関する。本明細書に記載される治療化合物には本明細書に開示される抗体（本明細書に開示されるバリアントおよび誘導体を含む）および本明細書に開示される抗体をコードする核酸またはポリヌクレオチド（本明細書に開示されるバリアントおよび誘導体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で提供される抗ＳＩＲＰα抗体およびその抗原結合断片およびそれを含む医薬組成物は、癌を診断、予後診断、治療または阻害するために使用することができる。本発明は、本明細書に開示される抗ＳＩＲＰα抗体またはその断片を、必要とする対象に投与することによって、対象における癌を治療するための方法に関する。本明細書に記載される治療化合物には本明細書に開示される抗体（本明細書に開示されるバリアントおよび誘導体を含む）および本明細書に開示される抗体をコードする核酸またはポリヌクレオチド（本明細書に開示されるバリアントおよび誘導体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【0076】
本発明は本明細書に開示される抗ＳＩＲＰα抗体と、化学療法剤、放射線治療剤および生体高分子薬物を含むが、これらに限定されない少なくとも１つの追加の治療剤との併用を含む併用療法をさらに提供する。一実施形態では、生体高分子薬物が抗ＣＤ２０抗体（例えば、ズベリタマブまたはリツキシマブ）、セツキシマブおよびトラスツズマブを含む、腫瘍細胞表面抗原を標的とするモノクローナル抗体薬物である。
【0077】
本明細書に開示される抗体（および任意のさらなる治療剤）は限定されないが、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内および筋肉内注射を含む、任意の適切な手段を通して投与され得る。抗体およびそのバリアントまたは組成物は任意の好都合な経路によって、例えば、ボーラス注射もしくは注入、または上皮もしくは皮膚粘膜を介する吸収によって投与され得る。
【0078】
〔本明細書に例示される抗ＳＩＲＰα抗体配列〕
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【0079】
〔実施例１：マウス抗ＳＩＲＰαモノクローナル抗体の調製〕
本実施例は、ハイブリドーマ技術を用いたマウス抗ヒトＳＩＲＰαモノクローナル抗体の調製について記載する。ＳＩＲＰαタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ７８３２４）の細胞外領域を免疫原として発現させた。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグを、ＳＩＲＰαタンパク質細胞外領域のアミノ酸配列（Ｇｌｕ３１－Ａｒｇ３７０）のＣ末端に融合させた。次いで、この遺伝子をベクターＶ１５２（Ｈｕａｂｉｏから入手）へとクローニングして、ベクターＶ１５２－ＳＩＲＰα ＥＣＤ－Ｆｃを作製した。このベクターを、２９３細胞（入手元：ＡＴＣＣ）へと一過性にトランスフェクトした。５日後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡ（製造元：Ｓｏｌａｒｂｉｏ、カタログ番号Ｉ８０９０）で精製した。マウス抗ヒトＳＩＲＰαモノクローナル抗体を調製するために、４週齢のＢＡＬ Ｂ／ｃマウス（Ｈｕａｂｉｏ社製）に対して、１００μｇのＳＩＲＰαタンパク質により免疫化した。最初の免疫化から１４日目および２８日目に、免疫化したマウスを５０μｇのＳＩＲＰαタンパク質で再び免疫化した。免疫化したマウスの血清力価を、ＥＬＩＳＡにより測定した。９６ウェルプレートを、ＰＢＳ（製造元：ＺＳＧＢ－ＢＩＯ、カタログ番号ＺＬＩ－９０６２）に希釈したＳＩＲＰα（１μｇ／ｍＬ）により、４℃で一晩コーティングした。プレートを１％ＢＳＡ－ＰＢＳブロッキング溶液により、３７℃で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで洗浄した。免疫化したマウスからの血清希釈物をプレートに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（製造元：Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ２０５７１９、１：１００００希釈）を添加した。３７℃で０．５時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ溶液（製造元：ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＴＭＢ－Ｓ－００）を加えた。室温、暗所にて５分間インキュベートした後、２ＮのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにより読み取った。十分な力価の抗ＳＩＲＰα抗体を有するマウスを、４２日目に追加投与として５０μｇのＳＩＲＰαタンパク質により免疫化した。３～５日後、マウスを屠殺した。脾臓細胞を回収し、遠心分離によってＩＭＤＭ基礎培地（製造元：ＢａｓａｌＭｅｄｉａ、カタログ番号Ｌ６１０ＫＪ）で２～３回洗浄し、次いで、１：１の比率でマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０（Ｈｕａｂｉｏにから入手）と混合した。混合した細胞にＰＥＧ（製造元：Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号２５７７１７００）を加え、穏やかに攪拌し、３７℃で３０秒、混合物を静置した。融合細胞を、１５％ウシ胎仔血清（製造元：Ｔｉａｎｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１１０１１－８６１１）および１×ＨＡＴ（製造元：Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ２６２－１ＶＬ）を含むＩＭＥＭ選択培地中で希釈し、２００μＬ／ウェルを９６ウェル細胞培養板に添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中にて、３７℃でインキュベートした。１０～１４日後、ハイブリドーマ細胞の上清中の抗ＳＩＲＰα抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。１１種の異なるハイブリドーマクローン、１０Ｆ１１－５－６、１Ｂ６－１－１、２７Ａ１１－１－８、１４Ｂ１１－５－４、３１Ｄ４－４－５、７Ｃ２－３－８、３０Ｃ１－６－４、４Ａ３－５－１、６Ｈ１－８－６、９Ａ１２－５および１０Ｆ４－１５を同定し、さらなる分析を行った。
本実施例は、ハイブリドーマ技術を用いたマウス抗ヒトＳＩＲＰαモノクローナル抗体の調製について記載する。ＳＩＲＰαタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ７８３２４）の細胞外領域を免疫原として発現させた。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグを、ＳＩＲＰαタンパク質細胞外領域のアミノ酸配列（Ｇｌｕ３１－Ａｒｇ３７０）のＣ末端に融合させた。次いで、この遺伝子をベクターＶ１５２（Ｈｕａｂｉｏから入手）へとクローニングして、ベクターＶ１５２－ＳＩＲＰα ＥＣＤ－Ｆｃを作製した。このベクターを、２９３細胞（入手元：ＡＴＣＣ）へと一過性にトランスフェクトした。５日後、細胞培養上清を回収し、プロテインＡ（製造元：Ｓｏｌａｒｂｉｏ、カタログ番号Ｉ８０９０）で精製した。マウス抗ヒトＳＩＲＰαモノクローナル抗体を調製するために、４週齢のＢＡＬ Ｂ／ｃマウス（Ｈｕａｂｉｏ社製）に対して、１００μｇのＳＩＲＰαタンパク質により免疫化した。最初の免疫化から１４日目および２８日目に、免疫化したマウスを５０μｇのＳＩＲＰαタンパク質で再び免疫化した。免疫化したマウスの血清力価を、ＥＬＩＳＡにより測定した。９６ウェルプレートを、ＰＢＳ（製造元：ＺＳＧＢ－ＢＩＯ、カタログ番号ＺＬＩ－９０６２）に希釈したＳＩＲＰα（１μｇ／ｍＬ）により、４℃で一晩コーティングした。プレートを１％ＢＳＡ－ＰＢＳブロッキング溶液により、３７℃で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで洗浄した。免疫化したマウスからの血清希釈物をプレートに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（製造元：Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ２０５７１９、１：１００００希釈）を添加した。３７℃で０．５時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ溶液（製造元：ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＴＭＢ－Ｓ－００）を加えた。室温、暗所にて５分間インキュベートした後、２ＮのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにより読み取った。十分な力価の抗ＳＩＲＰα抗体を有するマウスを、４２日目に追加投与として５０μｇのＳＩＲＰαタンパク質により免疫化した。３～５日後、マウスを屠殺した。脾臓細胞を回収し、遠心分離によってＩＭＤＭ基礎培地（製造元：ＢａｓａｌＭｅｄｉａ、カタログ番号Ｌ６１０ＫＪ）で２～３回洗浄し、次いで、１：１の比率でマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０（Ｈｕａｂｉｏにから入手）と混合した。混合した細胞にＰＥＧ（製造元：Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号２５７７１７００）を加え、穏やかに攪拌し、３７℃で３０秒、混合物を静置した。融合細胞を、１５％ウシ胎仔血清（製造元：Ｔｉａｎｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１１０１１－８６１１）および１×ＨＡＴ（製造元：Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ２６２－１ＶＬ）を含むＩＭＥＭ選択培地中で希釈し、２００μＬ／ウェルを９６ウェル細胞培養板に添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中にて、３７℃でインキュベートした。１０～１４日後、ハイブリドーマ細胞の上清中の抗ＳＩＲＰα抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。１１種の異なるハイブリドーマクローン、１０Ｆ１１－５－６、１Ｂ６－１－１、２７Ａ１１－１－８、１４Ｂ１１－５－４、３１Ｄ４－４－５、７Ｃ２－３－８、３０Ｃ１－６－４、４Ａ３－５－１、６Ｈ１－８－６、９Ａ１２－５および１０Ｆ４－１５を同定し、さらなる分析を行った。
【0080】
〔実施例２：ＳＩＲＰαに対するマウス抗体の結合〕
ＳＩＲＰαタンパク質に対するマウス抗体の結合能をＥＬＩＳＡによって検出した。具体的な方法は、実施例１に記載の通りである。マウス抗体を１μｇ／ｍＬのＰＢＳで３倍に連続希釈し、合計で７つの濃度勾配を調製した。結果は表５のとおりであった。
ＳＩＲＰαタンパク質に対するマウス抗体の結合能をＥＬＩＳＡによって検出した。具体的な方法は、実施例１に記載の通りである。マウス抗体を１μｇ／ｍＬのＰＢＳで３倍に連続希釈し、合計で７つの濃度勾配を調製した。結果は表５のとおりであった。
【0081】
【表5】
【0082】
ＳＩＲＰαを内因的に発現するヒト骨髄性白血病単球（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手したＴＨＰ－１）上の膜ＳＩＲＰαへのマウスモノクローナル抗体の結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分析した。種々の濃度（１μｇ／ｍＬから３倍連続希釈、合計で７つの濃度勾配）のマウスモノクローナル抗体とＴＨＰ－１細胞を４℃で３０分間共インキュベートした。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（製造元：Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５－０９５－００３、１：１０００希釈）を添加する前に細胞を２回洗浄し、次いで暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞をフローサイトメーターＢＤ Ｃ６により検出した。結果は表６のとおりであった。
【0083】
【表6】
【0084】
〔実施例３：ＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合に対する、マウス抗ＳＩＲＰα抗体の遮断効果〕
実施例２の結果によれば、ＳＩＲＰαに対するマウスモノクローナル抗体の結合能と、ＴＨＰ－１細胞に対する結合能とを組み合わせると、ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４が最良の活性を有する分子である。したがって、ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４を、これらのマウスｍＡｂがＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合を遮断できるかどうかを決定するために選択した。９６ウェルプレートをＣＤ４７－Ｆｃ（製造元：Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）により、４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴブロッキング溶液でブロッキングした。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、異なる濃度の抗体（６６．７ｎＭから３倍希釈、合計で７つの濃度勾配）およびビオチン標識ＳＩＲＰα（製造元：Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＤＡ－Ｈ８２Ｆ２）をプレートに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（製造元：Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ７４０３）を加えた。３７℃で０．５時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ溶液を加えた。室温の暗所にて０．５時間インキュベートした後、２ＮのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにより、読み取った。対照としてＩｇＧ（製造元：ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用した。結果は、図１に示されるように、これらのマウス抗体が全て、様々な程度でＳＩＲＰαのＣＤ４７に対する結合を阻害することができることが実証された。
実施例２の結果によれば、ＳＩＲＰαに対するマウスモノクローナル抗体の結合能と、ＴＨＰ－１細胞に対する結合能とを組み合わせると、ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４が最良の活性を有する分子である。したがって、ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４を、これらのマウスｍＡｂがＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合を遮断できるかどうかを決定するために選択した。９６ウェルプレートをＣＤ４７－Ｆｃ（製造元：Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＤ７－Ｈ５２５６）により、４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴブロッキング溶液でブロッキングした。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、異なる濃度の抗体（６６．７ｎＭから３倍希釈、合計で７つの濃度勾配）およびビオチン標識ＳＩＲＰα（製造元：Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＤＡ－Ｈ８２Ｆ２）をプレートに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（製造元：Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ７４０３）を加えた。３７℃で０．５時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ溶液を加えた。室温の暗所にて０．５時間インキュベートした後、２ＮのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにより、読み取った。対照としてＩｇＧ（製造元：ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用した。結果は、図１に示されるように、これらのマウス抗体が全て、様々な程度でＳＩＲＰαのＣＤ４７に対する結合を阻害することができることが実証された。
【0085】
〔実施例４：マウス抗体のヒト化〕
実施例２および実施例３の結果に基づいて、ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４をヒト化のために選択した。これらの抗体の重鎖および軽鎖可変領域を、ヒトＩｇＧ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、最適なヒト生殖系列Ｉｇ遺伝子配列一致を同定した。具体的にはｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４について選択されたヒト生殖系列ＩｇＧ重鎖は、それぞれＩＧＨＶ１－６９－２＊０１、ＩＧＨＶ２－２６＊０１、ＩＧＨＶ７－４－１＊０１およびＩＧＨＶ４－３１＊０２であり、ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４について選択されたヒト生殖系列ＩｇＧＬ鎖はそれぞれＩＧＫＶ４－１＊０１、ＩＧＫＶ１－９＊０１、ＩＧＫＶ４－１＊０１およびＩＧＫＶ４－１＊０１であった。ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４の重鎖ＣＤＲをヒト生殖系列ＩｇＧ重鎖のフレームワーク領域に移植し、ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４の軽鎖ＣＤＲをヒト生殖系列ＩｇＧＬ鎖フレームワーク領域に移植した。新しいヒト化分子を、それぞれ＃４、＃１１、＃１３および＃１４と命名した。構築されたヒト化抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域およびＣＤＲ領域の配列を表３に示す。＃１４抗体の重鎖および軽鎖配列を表４に示す。＃４、＃１１および＃１３抗体の重鎖および軽鎖定常領域は、＃１４抗体の重鎖および軽鎖定常領域と一致する。＃４、＃１１、および＃１３抗体の重鎖および軽鎖の完全なアミノ酸配列は、上記で開示した情報に基づいて当業者に公知である。
実施例２および実施例３の結果に基づいて、ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４をヒト化のために選択した。これらの抗体の重鎖および軽鎖可変領域を、ヒトＩｇＧ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、最適なヒト生殖系列Ｉｇ遺伝子配列一致を同定した。具体的にはｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４について選択されたヒト生殖系列ＩｇＧ重鎖は、それぞれＩＧＨＶ１－６９－２＊０１、ＩＧＨＶ２－２６＊０１、ＩＧＨＶ７－４－１＊０１およびＩＧＨＶ４－３１＊０２であり、ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４について選択されたヒト生殖系列ＩｇＧＬ鎖はそれぞれＩＧＫＶ４－１＊０１、ＩＧＫＶ１－９＊０１、ＩＧＫＶ４－１＊０１およびＩＧＫＶ４－１＊０１であった。ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４の重鎖ＣＤＲをヒト生殖系列ＩｇＧ重鎖のフレームワーク領域に移植し、ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１３およびｍＡｂ＃１４の軽鎖ＣＤＲをヒト生殖系列ＩｇＧＬ鎖フレームワーク領域に移植した。新しいヒト化分子を、それぞれ＃４、＃１１、＃１３および＃１４と命名した。構築されたヒト化抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域およびＣＤＲ領域の配列を表３に示す。＃１４抗体の重鎖および軽鎖配列を表４に示す。＃４、＃１１および＃１３抗体の重鎖および軽鎖定常領域は、＃１４抗体の重鎖および軽鎖定常領域と一致する。＃４、＃１１、および＃１３抗体の重鎖および軽鎖の完全なアミノ酸配列は、上記で開示した情報に基づいて当業者に公知である。
【0086】
本明細書に開示される抗体は、２９３個の細胞（ＡＴＣＣから入手）において発現され、精製された。抗体重鎖およびＬ鎖のコード配列を、Ｖ１５２ベクター（Ｈｕａｂｉｏから入手）にクローニングした。抗体重鎖およびＬ鎖のコード配列を有するＶ１５２ベクターを、トランスフェクション試薬ＰＥＩ（製造元：Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号２３９６６－２）を用いて２９３細胞に移した。プラスミドＤＮＡおよびトランスフェクション試薬をバイオセーフティキャビネット中で調製した。プラスミドＤＮＡとＰＥＩ（質量比＝０．１５：１．７５）を均一に混合し、１０分間放置した。混合物を２９３個の細胞に穏やかに添加し、穏やかに混合した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて５日間培養した後、細胞培養上清を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をタンパク質Ａ（製造元：Ｓｏｌａｒｂｉｏ、カタログ番号Ｉ８０９０）により精製して、９５％を超える抗体純度を得た。
【0087】
〔実施例５：ＳＩＲＰαタンパク質へのヒト化抗体の結合〕
ＳＩＲＰαタンパク質に対するヒト化抗体の結合をＥＬＩＳＡによって検出した。９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中、ＳＩＲＰα（製造元：Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＳＩＡ－Ｈ５２２５）（１μｇ／ｍＬ）にて、４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを１％ＢＳＡ－ＰＢＳブロッキング溶液により、３７℃で１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。ヒト化抗体を異なる濃度に希釈し（６６．７ｎＭから３倍連続希釈し、全体で１１の濃度勾配）、プレートに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（製造元：Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ９８５９５、１：１００００希釈）を添加した。３７℃で０．５時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ溶液を加えた。室温の暗所にて５分間インキュベートした後、２ＮのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにより読み取った。結果を図２に示す。＃４、＃１１、＃１３および＃１４抗体のＳＩＲＰαに対する結合についてのＥＣ５０はそれぞれ１．８３３ｎＭ、０．４６４２ｎＭ、０．９５１７ｎＭおよび０．６８３１ｎＭであり、これらのヒト化分子は全てＳＩＲＰαへの高結合活性を有することが示された。
ＳＩＲＰαタンパク質に対するヒト化抗体の結合をＥＬＩＳＡによって検出した。９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中、ＳＩＲＰα（製造元：Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＳＩＡ－Ｈ５２２５）（１μｇ／ｍＬ）にて、４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを１％ＢＳＡ－ＰＢＳブロッキング溶液により、３７℃で１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。ヒト化抗体を異なる濃度に希釈し（６６．７ｎＭから３倍連続希釈し、全体で１１の濃度勾配）、プレートに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（製造元：Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ９８５９５、１：１００００希釈）を添加した。３７℃で０．５時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ溶液を加えた。室温の暗所にて５分間インキュベートした後、２ＮのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにより読み取った。結果を図２に示す。＃４、＃１１、＃１３および＃１４抗体のＳＩＲＰαに対する結合についてのＥＣ５０はそれぞれ１．８３３ｎＭ、０．４６４２ｎＭ、０．９５１７ｎＭおよび０．６８３１ｎＭであり、これらのヒト化分子は全てＳＩＲＰαへの高結合活性を有することが示された。
【0088】
〔実施例６：ＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合に対するヒト化抗ＳＩＲＰα抗体の遮断効果〕
ＣＤ４７へのＳＩＲＰαの結合に対するヒト化抗ＳＩＲＰα抗体である、＃４、＃１１、＃１３および＃１４のブロッキング効果を、実施例３に記載のように試験した。抗体を６６．７ｎＭから３倍連続希釈し、合計で１１の濃度勾配を調製した。結果を図３に示します。＃４、＃１１、＃１３および＃１４のＩＣ５０値は、それぞれ６．０３ｎＭ、０．２０８６ｎＭ、１．５ｎＭおよび０．１３１５ｎＭであった。これは、これらのヒト化抗体の全てが、ＳＩＲＰαのＣＤ４７に対する結合を効果的に遮断することができ、＃１１および＃１４抗体が他の２つのヒト化抗体よりも強い遮断効果を有したことを示す。
ＣＤ４７へのＳＩＲＰαの結合に対するヒト化抗ＳＩＲＰα抗体である、＃４、＃１１、＃１３および＃１４のブロッキング効果を、実施例３に記載のように試験した。抗体を６６．７ｎＭから３倍連続希釈し、合計で１１の濃度勾配を調製した。結果を図３に示します。＃４、＃１１、＃１３および＃１４のＩＣ５０値は、それぞれ６．０３ｎＭ、０．２０８６ｎＭ、１．５ｎＭおよび０．１３１５ｎＭであった。これは、これらのヒト化抗体の全てが、ＳＩＲＰαのＣＤ４７に対する結合を効果的に遮断することができ、＃１１および＃１４抗体が他の２つのヒト化抗体よりも強い遮断効果を有したことを示す。
【0089】
ＫＷＡＲ２３、１８Ｄ５および１Ｈ９を対照として使用した。ＫＷＡＲ２３はＵＳ２０１８０３７６５２（配列番号１および配列番号２）に開示される配列に従って調製され、１８Ｄ５はＵＳ２０１９０１２７４７７（配列番号２４および配列番号３１）に開示される配列に従って調製され、１Ｈ９はＵＳ２０１９０１１９３９６（配列番号７および配列番号８）に開示される配列に従って調製された。ヒトＳＩＲＰαタンパク質は細胞外領域において高度に多形型であり、共通の遺伝子型はＶ１、Ｖ２およびＶ８を含む。そのため、共通のＳＩＲＰα遺伝子型の、ＣＤ４７への結合に対する＃１４抗体および上記対照抗体の遮断効果をさらに比較した（他の実施例では、特定の遺伝子型を有さないＳＩＲＰαタンパク質はすべてＶ１遺伝子型である）。
【0090】
ＣＤ４７へのＳＩＲＰα（Ｖ１）の結合に対する、異なる抗体のブロッキング効果を、実施例３に記載するように試験した。抗体を８３．４ｎＭから２倍連続希釈し、合計で９つの濃度勾配を調製した。結果を図４Ａに示す。＃１４抗体のＩＣ５０は３．４０４ｎＭであり、ＫＷＡＲ２３のＩＣ５０は１３．５４ｎＭであり、＃１４抗体は、ＫＷＡＲ２３よりもＣＤ４７へのＳＩＲＰα（Ｖ１）の結合に対するより強い遮断作用を有することが示された。図４Ｂにおいて、＃１４抗体、１８Ｄ５および１Ｈ９のＩＣ５０はそれぞれ４．４ｎＭ、４．１ｎＭおよび４．２ｎＭであり、ＳＩＲＰα（Ｖ１）のＣＤ４７への結合に対する＃１４抗体、１８Ｄ５および１Ｈ９の遮断活性が類似していることを示している。
【0091】
使用したビオチン標識ＳＩＲＰαをＳＩＲＰα（Ｖ２）（製造元：Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＳＩ２－Ｈ８２Ｗ８）とした実施例３に記載の方法により、ＣＤ４７へのＳＩＲＰα（Ｖ２）の結合に対する異なる抗体のブロッキング効果を決定した。抗体を２００ｎＭから３倍連続希釈し、合計で９つの濃度勾配を調製した。結果を図４Ｃに示す。＃１４抗体、ＫＷＡＲ２３および１Ｈ９はＳＩＲＰα（Ｖ２）のＣＤ４７への結合を遮断することができるが、１８Ｄ５はＳＩＲＰα（Ｖ２）のＣＤ４７への結合を遮断することができない。＃１４抗体のブロッキング活動は、１Ｈ９のブロッキング活動よりも強い。＃１４抗体のＩＣ５０値は７．８ｎＭであり、ＫＷＡＲ２３のＩＣ５０値は６．４ｎＭであり、＃１４抗体およびＫＷＡＲ２３がＳＩＲＰα（Ｖ２）に対して同様の遮断活性を有することが示された。
【0092】
使用したビオチン標識ＳＩＲＰαをＳＩＲＰα（Ｖ８）（製造元：Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＳＩ８－Ｈ８２Ｗ６）とした実施例３に記載の方法により、ＣＤ４７へのＳＩＲＰα（Ｖ８）の結合に対する異なる抗体のブロッキング効果を決定した。抗体を２００ｎＭから３倍連続希釈し、合計で９つの濃度勾配を調製した。結果を図４Ｄに示す。＃１４抗体、ＫＷＡＲ２３および１Ｈ９はＳＩＲＰα（Ｖ８）のＣＤ４７への結合を遮断することができるが、１８Ｄ５はＳＩＲＰα（Ｖ８）のＣＤ４７への結合を遮断することができない。＃１４抗体のブロッキング活動は、１Ｈ９のブロッキング活動よりも強い。＃１４抗体のＩＣ５０値は１１．５ｎＭであり、ＫＷＡＲ２３のＩＣ５０値は１０．８ｎＭであり、＃１４抗体およびＫＷＡＲ２３がＳＩＲＰα（Ｖ８）に対して同様の遮断活性を有することが示された。
【0093】
上記の結果によれば、＃１４抗体は共通のＳＩＲＰα遺伝子型（Ｖ１、Ｖ２およびＶ８）のＣＤ４７への結合を遮断することができ、ＳＩＲＰα（Ｖ１）に対して、ＫＷＡＲ２３よりも強い遮断活性を有し、ＳＩＲＰα（Ｖ２）およびＳＩＲＰα（Ｖ８）に対して、１８Ｄ５および１Ｈ９よりも強い遮断活性を有する。
【0094】
〔実施例７：ＳＩＲＰαに対する抗体の結合動態〕
抗体－抗原結合動態を、Ｈ１Ｓ１Ｋバイオセンサー（製造元：ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を備えたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム（製造元：ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて決定した。バイオセンサを直接用いて抗原を捕捉し、その直後に検体試料（抗体）に浸漬した。実験は、以下の５つの手順から構成されている：１．ベースライン（１００秒）、２．ローディング（抗原ＳＩＲＰαの捕捉）（５００秒）、３．ベースライン（１００秒）、４．会合（抗体への結合）（５００秒）、５．解離（抗体解離）（１０００秒）。試験終了後、再生緩衝液（グリシン、ｐＨ１．５）と中和緩衝液（ＰＢＳ）とに交互に５秒間浸漬することによりセンサーを再生し、合計５サイクルを実施してセンサーを再生した。この実験における操作バッファはＰＢＳであった。
抗体－抗原結合動態を、Ｈ１Ｓ１Ｋバイオセンサー（製造元：ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を備えたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム（製造元：ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて決定した。バイオセンサを直接用いて抗原を捕捉し、その直後に検体試料（抗体）に浸漬した。実験は、以下の５つの手順から構成されている：１．ベースライン（１００秒）、２．ローディング（抗原ＳＩＲＰαの捕捉）（５００秒）、３．ベースライン（１００秒）、４．会合（抗体への結合）（５００秒）、５．解離（抗体解離）（１０００秒）。試験終了後、再生緩衝液（グリシン、ｐＨ１．５）と中和緩衝液（ＰＢＳ）とに交互に５秒間浸漬することによりセンサーを再生し、合計５サイクルを実施してセンサーを再生した。この実験における操作バッファはＰＢＳであった。
【0095】
試料処理：抗原ＳＩＲＰαタンパク質（製造元：Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＳＩＡ－Ｈ５２２５）を、操作バッファを用いて２．５μｇ／ｍＬの作業濃度に希釈し、分析対象物試料（＃１４抗体およびＫＷＡＲ２３）を、５つの作業濃度：１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．１２５μｇ／ｍＬおよび０．０６２５μｇ／ｍＬに連続希釈した。データ分析のために、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（バージョン７．０または最新）を用いて応答信号値（ブランク分析対象物サンプル信号によって差し引かれた結合分析対象物サンプル信号）を計算し、１：１関連モデルを用いて、データをフィッティングした。
【0096】
結合動態のフィッティングダイアグラムを図５に示し、会合、解離および平衡定数を表７に示す。＃１４抗体は、陽性対照の抗体であるＫＷＡＲ２３に匹敵する非常に高い親和性を有することが分かる。
【0097】
【表7】
【0098】
〔実施例８：本明細書に開示される抗ＳＩＲＰα抗体のマクロファージによる腫瘍細胞の食作用に対する促進効果〕
ＰＢＭＣ細胞（製造元：Ａｌｌｃｅｌｌｓ、カタログ番号ＰＢ００４Ｆ－Ｃ）を、１６４０基本培地（製造元：Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２２４００－０８９）中にて、３７℃、５％ＣＯ２で２～３時間培養した。非接着細胞をピペットで除去し、誘導培地（８０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ）を誘導のために添加した。十分なサイトカインを含む新鮮な培地を３日ごとに取り換えた。細胞を７日間培養し、マクロファージを得た。Ｒａｊｉ細胞（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）を、ＣＦＳＥ試薬（製造元：Ａｂｃａｍ、カタログ番号ＡＢ１１３８５３）の指示に従って蛍光標識した。標識Ｒａｊｉ標的細胞と上記分化マクロファージを３：１の比率で均一に混合し、抗ＣＤ２０抗体（ズベリタマブ、CAS RN: 2251143-19-6,WHO Drug Information,Vol.33,No.4,2019,914-915;濃度：０．０５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ；製造元：ＢｉｏＲａｙ）、抗ＣＤ２０抗体（濃度：０．０５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ）と＃１４抗体（濃度：１０μｇ／ｍＬ）の組み合わせ、または抗ＣＤ２０抗体（濃度：０．０５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ）とＫＷＡＲ２３抗体（濃度：１０μｇ）を加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、抗ＣＤ１４－ＡＰＣ（製造元：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５３９９）を加えた。暗所にて、４℃、３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。食作用率（ＡＤＣＰ）は、以下の式に従って計算した：食作用率（％）＝（ＡＰＣ＋ＣＦＳＥ）陽性細胞の比率／ＡＰＣ陽性細胞の比率×１００％。図６Ａは、＃１４抗体が抗ＣＤ２０抗体によって誘導されるＲａｊｉ細胞の食作用を増強することができることを示す。
ＰＢＭＣ細胞（製造元：Ａｌｌｃｅｌｌｓ、カタログ番号ＰＢ００４Ｆ－Ｃ）を、１６４０基本培地（製造元：Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２２４００－０８９）中にて、３７℃、５％ＣＯ２で２～３時間培養した。非接着細胞をピペットで除去し、誘導培地（８０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ）を誘導のために添加した。十分なサイトカインを含む新鮮な培地を３日ごとに取り換えた。細胞を７日間培養し、マクロファージを得た。Ｒａｊｉ細胞（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）を、ＣＦＳＥ試薬（製造元：Ａｂｃａｍ、カタログ番号ＡＢ１１３８５３）の指示に従って蛍光標識した。標識Ｒａｊｉ標的細胞と上記分化マクロファージを３：１の比率で均一に混合し、抗ＣＤ２０抗体（ズベリタマブ、CAS RN: 2251143-19-6,WHO Drug Information,Vol.33,No.4,2019,914-915;濃度：０．０５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ；製造元：ＢｉｏＲａｙ）、抗ＣＤ２０抗体（濃度：０．０５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ）と＃１４抗体（濃度：１０μｇ／ｍＬ）の組み合わせ、または抗ＣＤ２０抗体（濃度：０．０５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ）とＫＷＡＲ２３抗体（濃度：１０μｇ）を加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、抗ＣＤ１４－ＡＰＣ（製造元：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５３９９）を加えた。暗所にて、４℃、３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。食作用率（ＡＤＣＰ）は、以下の式に従って計算した：食作用率（％）＝（ＡＰＣ＋ＣＦＳＥ）陽性細胞の比率／ＡＰＣ陽性細胞の比率×１００％。図６Ａは、＃１４抗体が抗ＣＤ２０抗体によって誘導されるＲａｊｉ細胞の食作用を増強することができることを示す。
【0099】
＃１４抗体および抗Ｈｅｒ２抗体の組み合わせの、Ｈｅｒ２を過剰発現するＳＫ－ＢＲ－３細胞のマクロファージ食作用に対する促進効果も調べた。上記の方法に従い、標識ＳＫ－ＢＲ－３細胞（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）と分化マクロファージとを２：１の比率で均等に混合し、抗Ｈｅｒ２抗体（濃度：０．５μｇ／ｍＬ；製造元：ＢｉｏＲａｙ）または抗Ｈｅｒ２抗体（濃度：０．５μｇ／ｍＬ）と＃１４抗体（濃度：１０μｇ／ｍＬ）との組み合わせを添加した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で２時間培養した。食作用速度を分析し、フローサイトメトリーにより計算した。図６Ｂは、＃１４抗体が抗Ｈｅｒ２抗体によって誘導されるＳＫ－ＢＲ－３細胞の食作用を増強し得ることを示す。
【0100】
〔実施例９：本明細書に開示される抗ＳＩＲＰα抗体は、細胞表面上のＳＩＲＰαのエンドサイトーシスを誘導する〕
ＴＨＰ－１ 細胞（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）を、１０μｇ／ｍＬ抗体と４℃で３０分間共インキュベートした。細胞を２回洗浄し、２つに分けた。一方を３７℃で４時間インキュベートし、もう一方を対照として４℃でさらにインキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（製造元：Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９７２２４）を添加した。暗所にて４℃、３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、次いでフローサイトメトリーによって分析した。エンドサイトーシス速度は、３７℃対４℃での細胞表面蛍光の低下から計算した。エンドサイトーシス速度は、以下の式によって計算した：エンドサイトーシス速度（％）＝（４℃における蛍光強度ＭＦＩ－３７℃における蛍光強度ＭＦＩ）／４℃における蛍光強度ＭＦＩ×１００％。
ＴＨＰ－１ 細胞（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）を、１０μｇ／ｍＬ抗体と４℃で３０分間共インキュベートした。細胞を２回洗浄し、２つに分けた。一方を３７℃で４時間インキュベートし、もう一方を対照として４℃でさらにインキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（製造元：Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９７２２４）を添加した。暗所にて４℃、３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、次いでフローサイトメトリーによって分析した。エンドサイトーシス速度は、３７℃対４℃での細胞表面蛍光の低下から計算した。エンドサイトーシス速度は、以下の式によって計算した：エンドサイトーシス速度（％）＝（４℃における蛍光強度ＭＦＩ－３７℃における蛍光強度ＭＦＩ）／４℃における蛍光強度ＭＦＩ×１００％。
【0101】
表８において、＃１４抗体のエンドサイトーシス速度が５２．９％であったのに対し、ＫＷＡＲ２３のエンドサイトーシス速度は３４．７％であることより、＃１４抗体が細胞表面ＳＩＲＰαの発現レベルを低下させるのにより有効であることが示されている。
【0102】
【表8】
【0103】
〔実施例１０：本明細書に開示される抗ＳＩＲＰα抗体によって誘導される腫瘍増殖阻害〕
＃１４抗体の抗腫瘍有効性を、ｈＣＤ４７－ＭＣ３８マウス結腸癌モデルにおいて評価した。ｈＣＤ４７－ＭＣ３８細胞（上海モデル生物から入手）を、ｈＳＩＲＰα／ｈＣＤ４７二重ヒト化Ｃ５７ＢＬ／６マウス（上海モデル生物から入手）に接種した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３に達した段階で、＃１４抗体（２００μｇ／マウス）を１週間に２回腹腔内注射によりマウスに投与し、対照群には同量のＰＢＳを投与した。結果を図７に示す。＃１４抗体は、対照群と比較して、腫瘍増殖を連続的に阻害することができる。
＃１４抗体の抗腫瘍有効性を、ｈＣＤ４７－ＭＣ３８マウス結腸癌モデルにおいて評価した。ｈＣＤ４７－ＭＣ３８細胞（上海モデル生物から入手）を、ｈＳＩＲＰα／ｈＣＤ４７二重ヒト化Ｃ５７ＢＬ／６マウス（上海モデル生物から入手）に接種した。腫瘍体積が約１５０ｍｍ３に達した段階で、＃１４抗体（２００μｇ／マウス）を１週間に２回腹腔内注射によりマウスに投与し、対照群には同量のＰＢＳを投与した。結果を図７に示す。＃１４抗体は、対照群と比較して、腫瘍増殖を連続的に阻害することができる。
【0104】
リンパ腫モデルにおける＃１４抗体と抗ＣＤ２０抗体（ズベリタマブ、ＢｉｏＲａｙより入手）との組み合わせの抗腫瘍有効性も評価した。Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎから入手）を、尾静脈を介してＢ－ＮＤＧ－ｈＳＩＲＰαマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎから入手）に接種した。平均腫瘍イメージング信号強度が約１×１０６ｐ／秒に達した段階で、マウスに、ＩｇＧ対照（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎから入手、２００μｇ／マウス）、＃１４抗体単独（２００μｇ／マウス）、抗ＣＤ２０抗体単独（２μｇ／マウス）または＃１４抗体（２００μｇ／マウス）＋抗ＣＤ２０抗体（２μｇ／マウス）を指定用量投与した。図８に示すように、＃１４抗体および抗ＣＤ２０抗体は、相乗的な抗腫瘍効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【0105】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【配列表】