特許 7621930 遺伝子操作のための方法及び製品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-17

(45)【発行日】2025-01-27

(54)【発明の名称】遺伝子操作のための方法及び製品

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20250120BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20250120BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250120BHJP

   C12N 15/48 20060101ALI20250120BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20250120BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20250120BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250120BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20250120BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20250120BHJP

   C07K 14/005 20060101ALN20250120BHJP

   C07K 14/15 20060101ALN20250120BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20250120BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N7/01 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/48

C12N15/55

C12N15/33

C12N5/10

C12M1/00 A

C07K19/00

C07K14/005

C07K14/15

C12N9/16 Z

【請求項の数】 20

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021212300

(22)【出願日】2021-12-27

(62)【分割の表示】P 2018520155の分割

【原出願日】2016-10-20

(65)【公開番号】P2022046680

(43)【公開日】2022-03-23

【審査請求日】2021-12-27

(31)【優先権主張番号】15306678.2

(32)【優先日】2015-10-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル

(73)【特許権者】

【識別番号】595040744

【氏名又は名称】サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ

(73)【特許権者】

【識別番号】514077888

【氏名又は名称】エコール ノルマル シュペリウール ドゥ リヨン

(73)【特許権者】

【識別番号】523165352

【氏名又は名称】ユニヴェルスィテ クラウド ベルナール リヨン １

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】オールマン，テオフィル

(72)【発明者】

【氏名】マンジョ，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】リッチ，エミリアーノ

【審査官】野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１４／１３１８３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特許第７０５９１７９（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】特表２０１５－５０５２９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５２３８５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／２００６５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】CAI, Y., et al.，"Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nuclease."，eLife，2014年，Vol. 3，e01911(pp.1-19)，DOI:10.7554/elife.01911

【文献】KIM, S., et al.，"Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins."，Genome Res.，2014年，vol.24, no.6，p.1012-1019, Supplemental Information

【文献】HORII, T., et al.，"Efficient generation of knockin mice by CRISPR/Cas system."，Exp. Anim.，2015年，vol.64, supplement，p.S31(O-7)

【文献】KABADI, A.M., et al.，"Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector."，Nucleic Acids Research，2014年，Vol. 42, No. 19，e147，doi: 10.1093/nar/gku749，Published online 13 August 2014

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つ以上の遊離Ｃａｓタンパク質を含む、レトロウイルス由来粒子であって、前記１つ以上の遊離Ｃａｓタンパク質は、前記粒子の内部に含まれており、前記１つ以上の遊離Ｃａｓタンパク質は、１つ以上のＣａｓタンパク質とレトロウイルスｇａｇタンパク質又はそのタンパク質断片との間に位置するタンパク質分解切断部位を含む切断可能な融合タンパク質の切断の結果であり、前記１つ以上の遊離Ｃａｓタンパク質は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡと複合している、前記レトロウイルス由来粒子。

【請求項2】

前記遊離Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９又はその変異体である、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項3】

レンチウイルス由来粒子である、請求項２に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項4】

前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項5】

前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃｐｆ１である、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項6】

ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡが、以下：
（ａ）標的核酸の第１の標的配列とハイブリダイズする第１のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、及び、
（ｂ）前記標的核酸の第２の標的配列とハイブリダイズする第２のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ
を含む、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項7】

レンチウイルス由来粒子である、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項8】

モロニーマウス白血病ウイルス由来ベクター粒子、ウシ免疫不全ウイルス由来粒子、サル免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ネコ免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ヒト免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ウマ感染貧血ウイルス由来ベクター粒子、ヤギ関節炎脳炎ウイルス由来ベクター粒子、ヒヒ内因性ウイルス由来ベクター粒子からなる群から選択される、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項9】

前記レトロウイルス由来粒子が、ヒヒ内因性ウイルス由来ベクター粒子である、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項10】

前記レトロウイルス由来粒子が、モロニーマウス白血病ウイルス由来ベクター粒子である、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項11】

前記レトロウイルス由来粒子が、ヒト免疫不全ウイルス由来ベクター粒子である、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項12】

前記レトロウイルスｇａｇタンパク質が、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項13】

前記レトロウイルスｇａｇタンパク質が、ヒト免疫不全ウイルスに由来する、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項14】

請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子であって、前記レトロウイルス由来粒子が、任意のコードする核酸を含まないか又は実質的に含まない、レトロウイルス由来粒子。

【請求項15】

前記切断可能な融合タンパク質が、核酸によってコードされる、請求項１に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項16】

前記核酸が、ｍＲＮＡである、請求項１５に記載のレトロウイルス由来粒子。

【請求項17】

真核細胞において標的核酸を改変させるための組成物であって、前記組成物は、請求項１～１６のいずれか１項に定義される少なくとも１つのレトロウイルス由来粒子を含む、前記組成物。

【請求項18】

１つ又は複数のトランスダクションヘルパー化合物をさらに含む、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

ａ）少なくとも１つの真核細胞を、請求項１～１６のいずれか１項に定義される１つ又は複数のレトロウイルス由来粒子と接触させる工程であって、前記接触させる工程は、前記レトロウイルス由来粒子が前記少なくとも１つの真核細胞に感染することを可能にする条件下で実行される、工程、
および
ｂ）改変された標的核酸を有する真核細胞を収集する工程
を含む、少なくとも１つの真核細胞において、少なくとも１つの標的配列を含む標的核酸を改変させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法。

【請求項20】

ａ）少なくとも１つの真核細胞を、請求項１～１６のいずれか１項に定義される１つ又は複数のレトロウイルス由来粒子と接触させる工程であって、前記接触させる工程は、前記レトロウイルス由来粒子が前記少なくとも１つの真核細胞に感染することを可能にする条件下で実行される、工程、
および
ｂ）改変された標的核酸を有する真核細胞を収集する工程
を含む、少なくとも１つの真核細胞において、少なくとも１つの標的配列を含む標的核酸を改変させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びその成分に関するウイルス由来ベクター系を使用した方法による遺伝子ターゲティングの分野に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
ターゲティング可能なヌクレアーゼを使用したゲノム編集は、細菌から植物及び動物（ヒトを含む）に及ぶ生物の正確なゲノム改変のための新たな技術である。その魅力は、他の種類の方法ではターゲットゲノム改変が不可能であったほぼ全ての生物に対してそれを使用し得ることである。

【0003】

ヒト細胞内において外因性タンパク質を発現させるためのプロトコールの改善は、研究目的及び医学的目的の大きな関心対象である。ウイルスベクターのトランスフェクション方法及び性能の不断の進化にもかかわらず、特に、その環境の改変に対して非常に感受性な一次細胞であって、トランスフェクション剤／ベクターに応答して変化し得る一次細胞では、これらのアプローチの効率は劇的に変動し得る。また、組込型／非組込型コードＤＮＡの移入を介した遺伝情報の送達は、望ましくないストレスシグナルの誘導又は細胞ゲノム内への外因性遺伝子の予想外の挿入のような有害効果の原因となり得、特に幹細胞の治療用途の場合にはこれは深刻である。

【0004】

ターゲットゲノム改変に関する最近のアプローチ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ））により、研究者は、二本鎖切断を導入して修復経路を活性化することによって、永続的な突然変異を生成することが可能になった。ゲノムにおける所望の位置においてＤＮＡ二本鎖切断を発生させる設計ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ）の能力により、ローカス特異的ゲノム操作の治療応用は楽観視されていた。しかしながら、これらのアプローチは、技術者にとって費用及び時間のかかるものであり、特に大規模なハイスループット研究ではその広範な使用が制限される。

【0005】

より最近では、完全に別個の特異的な系（すなわち、Streptococcus pyogenes由来の細菌ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質－９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９））に基づく新たなツールが大きな関心を集めている。

【0006】

部位特異的なＤＮＡ認識及び切断を達成するために、Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡ及び別個のトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒＲＮＡ）（これは、ｃｒＲＮＡに部分的に相補的である）の両方と複合体形成しなければならない（１１）ｔｒａｃｒＲＮＡは、複数のｐｒｅ－ｃｒＲＮＡをコードする一次転写産物からのｃｒＲＮＡ成熟に必要である。

【0007】

ターゲットＤＮＡの切断中、ＨＮＨ及びＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインは両ＤＮＡ鎖をカットし、関連ｃｒＲＮＡ転写産物内の２０ヌクレオチドのガイド配列（これは、ターゲットＤＮＡと塩基対形成する）によって規定される部位において二本鎖切断（ＤＳＢ）を発生させる。ＨＮＨドメインは、ガイドＲＮＡに相補的なターゲットＤＮＡ鎖を切断するが、ＲｕｖＣドメインは非相補鎖を切断する。Ｃａｓ９の二本鎖エンドヌクレアーゼ活性はまた、プロトスペーサー関連モチーフ（ＰＡＭ）として公知の短い保存配列（２～５ｎｔ）がｃｒＲＮＡ相補配列の３’の直後にあることを必要とする。

【0008】

わずか３つの必須成分（Ｃａｓ９とそれに加えてｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ）を有するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの簡潔性により、この系は、ゲノム編集の適合に適している。この可能性は、２０１２年にDoudna and Charpentier laboratories (Jinek et al., 2012, Science, Vol.337: 816-821)によって実現された。以前に記載されているＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に基づいて、ｔｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを単一の合成単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に合わせることによって、簡潔な二成分系が開発された。ｓｇＲＮＡプログラム化Ｃａｓ９は、ターゲット遺伝子変化をガイドする際に、別個のｔｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡでプログラム化されたＣａｓ９として有効であることが示された。

【0009】

主に、ゲノム編集プロトコールでは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの３つの異なる変異体が採用されている。第１は野生型Ｃａｓ９であり、二本鎖ＤＮＡを部位特異的に切断して、二本鎖切断（ＤＳＢ）修復機構の活性化をもたらし得る。ＤＳＢは、細胞非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって修復されて（Overballe-Petersen et al., 2013, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 110: 19860-19865）、ターゲットローカスを破壊する挿入及び／又は欠失（インデル）が生じ得る。あるいは、ターゲットローカスとの相同性を有するドナーテンプレートが供給される場合、ＤＳＢは、正確な置換突然変異を可能にする相同性特異的修復（ＨＤＲ）経路によって修復され得る（Overballe-Petersen et al., 2013, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 110: 19860-19865; Gong et al., 2005, Nat. Struct Mol Biol, Vol. 12: 304-312）。

【0010】

Cong及び同僚ら（Cong et al., 2013, Science, Vol. 339: 819-823）は、ニッカーゼ活性のみを有する突然変異型（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａとして公知である）を開発することによって、Ｃａｓ９系をより高い精度にさらに発展させた。これは、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａが１本のＤＮＡ鎖のみを切断し、ＮＨＥＪを活性化しないことを意味する。代わりに、相同な修復テンプレートが提供される場合、ＤＮＡ修復は、高忠実度のＨＤＲ経路のみを介して行われ、インデル突然変異が減少する（Cong et al., 2013, Science, Vol. 339: 819-823; Jinek et al., 2012, Science, Vol.337: 816-821; Qi et al., 2013 Cell, Vol. 152: 1173-1183）。隣接ＤＮＡニックを生成するように設計されたペアＣａｓ９複合体によってローカスがターゲティングされる場合、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａは、ターゲット特異性の点でさらに魅力的である。

【0011】

第３の変異体は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９である（Qi et al., 2013 Cell, Vol. 152: 1173-1183）。ＨＮＨドメインにおける突然変異Ｈ８４０Ａ及びＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａは切断活性を不活性化するが、ＤＮＡ結合を防止しない。したがって、この変異体は、切断せずにゲノムの任意の領域を配列特異的にターゲティングするために使用され得る。代わりに、様々なエフェクタードメインと融合することによって、ｄＣａｓ９は、遺伝子サイレンシング又は活性化ツールのいずれかとして使用され得る。さらに、それは、ガイドＲＮＡ又はＣａｓ９タンパク質をフルオロフォア又は蛍光タンパク質にカップリングすることによって、視覚化ツールとして使用され得る。

【0012】

２０１２年におけるその初期実証（９）後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、科学界で広く採用されている。それは、ヒト(Mali et al., 2013, Science, Vol. 339: 823-826)、細菌(Fabre et al., 2014, PLoS Negl. Trop. Dis., Vol. 8:e2671.)、ゼブラフィッシュ(Hwang et al., 2013, PLoS One, Vol. 8:e68708.)、C. elegans (Hai et al., 2014 Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11.)、細菌(Fabre et al., 2014, PLoS Negl. Trop. Dis., Vol. 8:e2671.)、植物(Mali et al., 2013, Science, Vol. 339: 823-826)、Xenopus tropicalis (Guo et al., 2014, Development, Vol. 141: 707-714.)、酵母(DiCarlo et al., 2013, Nucleic Acids Res., Vol. 41: 4336-4343.)、Drosophila (Gratz et al., 2014 Genetics, doi:10.1534/genetics.113.160713)、サル(Niu et al., 2014, Cell, Vol. 156: 836-843.)、ウサギ(Yang et al., 2014, J. Mol. Cell Biol., Vol. 6: 97-99.)、ブタ(Hai et al., 2014, Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11.)、ラット(Ma et al., 2014, Cell Res., Vol. 24: 122-125.)及びマウス(Mashiko et al., 2014, Dev. Growth Differ. Vol. 56: 122-129.)を含む多くの細胞株及び生物において重要な遺伝子をターゲティングするために成功裏に使用されている。現在、いくつかのグループがこの方法を利用して、単一ｇＲＮＡを介して単一点突然変異（欠失又は挿入）を特定のターゲット遺伝子に導入している。代わりにｇＲＮＡ特異的Ｃａｓ９ヌクレアーゼのペアを使用して、逆位又は転座などの大きい欠失又はゲノム再編成を誘導することも可能である。最近の刺激的な発展は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のｄＣａｓ９バージョンを使用して、特定のゲノムローカスの転写レギュレーション、エピジェネティック改変及び顕微鏡での視覚化のためにタンパク質ドメインをターゲティングすることである。

【0013】

ターゲット特異性を変化させるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ｃｒＲＮＡの再設計のみを必要とする。これは、タンパク質－ＤＮＡインターフェースの再設計が必要な他のゲノム編集ツール（ジンクフィンガー及びＴＡＬＥＮを含む）とは対照的である。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ゲノムスクリーニングのための大きいｇＲＮＡライブラリーを生成することによって、遺伝子機能の迅速かつゲノムワイドな調査を可能にする。

【0014】

したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術は目的の任意の遺伝子に容易に適合され得、遺伝子を変化させる比類なき可能性を提供し得る（ノックアウト、ノックイン、正確な突然変異の導入）。科学界におけるその普及は驚くほど速く、それを使用した最近の盛んな科学コミュニケーションをトリガーしている。

【0015】

一般に、ＣＲＩＳＰＲの送達は、ＤＮＡトランスフェクションによって、又はＣａｓ９をコードするウイルスベクターの使用を介して実施され、これらの方法は両方とも便利であるが特定の細胞型に限定され、かなり干渉的である。さらに、Ｃａｓ９媒介性切断は迅速に起こり（Jinek et al., 2013, eLife, Vol. 2, e00471）、長期では毒性にさえなり得るので、Ｃａｓ９発現を長期間維持することはおそらく毒性であり、贔屓目に見ても不要である。他のアプローチは、リコンビナントＣａｓ９及び合成ＲＮＡを利用して、プロテオトランスフェクションによって、又は物理的マイクロインジェクションによってＲＮＰｃを移入することに成功しているが、これらＣＲＩＳＰＲ系は依然として、脆弱な一次細胞のターゲティングに限定される。

【0016】

当技術分野では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を使用することによる遺伝子編集のための改善されたツール及び方法の必要性が存在する。

【発明の概要】

【0017】

本発明は、ゲノム核酸において変化を発生させるための製品及び方法に関する；これらの変化は、ノックイン及びノックアウトゲノム変化を含む核酸挿入及び核酸欠失の導入による突然変異を包含する。

【0018】

より正確には、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体によって引き起こされる、特にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体によって引き起こされる核酸変化事象を発生させることを目的とする製品及びそれの使用方法に関する。

【0019】

本発明は、１つ以上のＣａｓタンパク質、特にＣａｓ９タンパク質を含むウイルス由来粒子に関する。

【0020】

いくつかの実施態様では、前記ウイルス由来粒子は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをさらに含むか、又はそれとさらに複合している。

【0021】

いくつかの実施態様では、前記ウイルス由来粒子は、ターゲティング核酸をさらに含むか、又はそれとさらに複合している。

【0022】

いくつかの実施態様では、前記ウイルス由来粒子は、レトロウイルス由来粒子、例えばレンチウイルス由来ベクター粒子である。

【0023】

本発明はさらに、真核細胞におけるターゲット核酸を変化させるための組成物であって、１つ以上のＣａｓタンパク質、特にＣａｓ９タンパク質を含むウイルス由来粒子を含む組成物に関する。

【0024】

いくつかの実施態様では、前記組成物は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをさらに含むか、又はあるいはそれとさらに複合している。

【0025】

いくつかの実施態様では、前記組成物は、ターゲティング核酸をさらに含む。

【0026】

本発明はまた、上記で定義されるウイルス由来粒子又は組成物を調製するための必要な物質を含むキットに関する。

【0027】

それはまた、本明細書で定義されるウイルス由来粒子を産生する遺伝子改変細胞、特に安定細胞株の形態の細胞に関する。

【0028】

本発明はさらに、（ｉ）ウイルス由来粒子を生成するために自己集合するウイルスタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記ウイルスタンパク質が（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質に融合されている融合タンパク質に関する。いくつかの実施態様では、前記融合タンパク質は、前記ウイルスタンパク質と前記Ｃａｓタンパク質との間に位置する切断可能部位、特にＧａｇタンパク質とＣａｓ９タンパク質との間に位置する切断可能部位を含む。

【0029】

それはまた、前記融合タンパク質をコードする核酸及びベクターに関する。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1A】Ｃａｓ９－ＶＬＰアセンブリの分子基盤及びレシピエント細胞へのＣＲＩＳＰＲ成分の移入。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのＣａｓ９－ＶＬＰアセンブリの概略図。６つの工程が示されている。（１）ガイドＲＮＡをコードする構築物と併せて、ＧＡＧ－ＣＡＳ９、ＧＡＧ ＰｒｏＰｏｌ及びウイルスエンベロープタンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションする。ＧＡＧ及びウイルスエンベロープは、ウイルス由来粒子（本明細書では「ウイルス様粒子」又は「ＶＬＰ」とも称され得る）の集合が起こる膜に局在する傾向がある（２）。ＧＡＧの濃度が増加するにつれて、機械的力は粒子の形成を誘導し（３）、これが、ＣＲＩＳＰＲ機構の全ての参加要素が組み込まれた後に産生細胞から出芽するであろう（４）。これらの粒子は濃縮可能であり、４℃で１５日間超安定である。成熟プロセスにより、ウイルスプロテアーゼは、粒子内のＧＡＧプラットフォームからほとんどのＣａｓ９タンパク質を放出した可能性がある（５）。ターゲット細胞に曝露されると、ＶＬＰは、エンベロープ／レセプター相互作用（したがって、これは、粒子及び検討ターゲット細胞をシュードタイピングするために使用されるエンベロープに依存する）を介して、細胞膜と結合及び融合することができるであろう。細胞膜との融合の後、ＶＬＰは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボヌクレオ複合体（おそらくは非プロテアーゼＧＡＧに会合した遊離ｇＲＮＡ又はＣａｓ９）を含み得るそれらのカーゴをレシピエント細胞内に輸送する（まだ不明確）。それにもかかわらず、完全に活性なＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰｃは、（おそらくはターゲット細胞内におけるＣａｓ９及び遊離ｇＲＮＡの再会合により）レシピエント細胞の核に送達され、ｇＲＮＡによって指定されるまさにその位置においてゲノムＤＮＡの切断を媒介する（６）。（Ｂ）ＧＡＧ－Ｃａｓ９コード構築物の分子設計。ｈＣＭＶｐ（ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーター）は、イントロン（ｒＢＧ）及びポリアデニル化（ｒＢＧｐＡ）シグナル（これらは両方とも、ウサギβグロビン遺伝子配列に由来する）を組み込んだｍＲＮＡの発現を駆動する。この構築物は、ＭＬＶ－ＧＡＧポリタンパク質とStreptococcus pyogenes由来のコドン最適化Ｃａｓ９配列との融合物からなる。両部分は、ＭＬＶプロテアーゼ切断部位（ｐｓ）及びＣａｓ９配列に融合されたｆｌａｇタグ配列によって分離されている。

【図1B】Ｃａｓ９－ＶＬＰアセンブリの分子基盤及びレシピエント細胞へのＣＲＩＳＰＲ成分の移入。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのＣａｓ９－ＶＬＰアセンブリの概略図。６つの工程が示されている。（１）ガイドＲＮＡをコードする構築物と併せて、ＧＡＧ－ＣＡＳ９、ＧＡＧ ＰｒｏＰｏｌ及びウイルスエンベロープタンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションする。ＧＡＧ及びウイルスエンベロープは、ウイルス由来粒子（本明細書では「ウイルス様粒子」又は「ＶＬＰ」とも称され得る）の集合が起こる膜に局在する傾向がある（２）。ＧＡＧの濃度が増加するにつれて、機械的力は粒子の形成を誘導し（３）、これが、ＣＲＩＳＰＲ機構の全ての参加要素が組み込まれた後に産生細胞から出芽するであろう（４）。これらの粒子は濃縮可能であり、４℃で１５日間超安定である。成熟プロセスにより、ウイルスプロテアーゼは、粒子内のＧＡＧプラットフォームからほとんどのＣａｓ９タンパク質を放出した可能性がある（５）。ターゲット細胞に曝露されると、ＶＬＰは、エンベロープ／レセプター相互作用（したがって、これは、粒子及び検討ターゲット細胞をシュードタイピングするために使用されるエンベロープに依存する）を介して、細胞膜と結合及び融合することができるであろう。細胞膜との融合の後、ＶＬＰは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボヌクレオ複合体（おそらくは非プロテアーゼＧＡＧに会合した遊離ｇＲＮＡ又はＣａｓ９）を含み得るそれらのカーゴをレシピエント細胞内に輸送する（まだ不明確）。それにもかかわらず、完全に活性なＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰｃは、（おそらくはターゲット細胞内におけるＣａｓ９及び遊離ｇＲＮＡの再会合により）レシピエント細胞の核に送達され、ｇＲＮＡによって指定されるまさにその位置においてゲノムＤＮＡの切断を媒介する（６）。（Ｂ）ＧＡＧ－Ｃａｓ９コード構築物の分子設計。ｈＣＭＶｐ（ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーター）は、イントロン（ｒＢＧ）及びポリアデニル化（ｒＢＧｐＡ）シグナル（これらは両方とも、ウサギβグロビン遺伝子配列に由来する）を組み込んだｍＲＮＡの発現を駆動する。この構築物は、ＭＬＶ－ＧＡＧポリタンパク質とStreptococcus pyogenes由来のコドン最適化Ｃａｓ９配列との融合物からなる。両部分は、ＭＬＶプロテアーゼ切断部位（ｐｓ）及びＣａｓ９配列に融合されたｆｌａｇタグ配列によって分離されている。

【図2A】ＹＦＰ－ＣＲＩＳＰＲ－ＶＬＰによる遺伝子切断の分子検証 （Ａ）ＹＦＰ遺伝子上のｇＲＮＡ認識部位の局在、使用したプライマー及びsurveyorアッセイの原理。低い感染多重度（ＭＯＩ）で、ＹＦＰコードベクターをＬ９２９マウス細胞にレンチトトランスダクションした。次に、７２時間後、示されている２つの異なる位置でＹＦＰ遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡをロードしたＶＬＰで細胞を処理した。ＹＦＰの切断を確認するために、Ｃａｓ９－ＶＬＰで処理した細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡを抽出し、Ｓ１ヌクレアーゼベースのsurveyorアッセイによって分析した。試験は、２つの近縁ｓｓＤＮＡ分子がハイブリダイゼーションする場合に形成されるヘテロ二重鎖を検出する：したがって、Ｓ１ヌクレアーゼ消化は、Ｃａｓ９によってＤＮＡが切断された証拠である。（Ｂ）ｇＲＮＡ２、１又はそれらの両方の組み合わせをロードしたＶＬＰによって処理したＬ９２９細胞のsurveyorアッセイ。各ｒＲＮＡ条件についてヘテロ二重鎖の形成を検出し、そのサイズがＹＦＰ配列上のｇＲＮＡの位置に依存する短縮型ＹＦＰを明らかにする。

【図2B】ＹＦＰ－ＣＲＩＳＰＲ－ＶＬＰによる遺伝子切断の分子検証 （Ａ）ＹＦＰ遺伝子上のｇＲＮＡ認識部位の局在、使用したプライマー及びsurveyorアッセイの原理。低い感染多重度（ＭＯＩ）で、ＹＦＰコードベクターをＬ９２９マウス細胞にレンチトトランスダクションした。次に、７２時間後、示されている２つの異なる位置でＹＦＰ遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡをロードしたＶＬＰで細胞を処理した。ＹＦＰの切断を確認するために、Ｃａｓ９－ＶＬＰで処理した細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡを抽出し、Ｓ１ヌクレアーゼベースのsurveyorアッセイによって分析した。試験は、２つの近縁ｓｓＤＮＡ分子がハイブリダイゼーションする場合に形成されるヘテロ二重鎖を検出する：したがって、Ｓ１ヌクレアーゼ消化は、Ｃａｓ９によってＤＮＡが切断された証拠である。（Ｂ）ｇＲＮＡ２、１又はそれらの両方の組み合わせをロードしたＶＬＰによって処理したＬ９２９細胞のsurveyorアッセイ。各ｒＲＮＡ条件についてヘテロ二重鎖の形成を検出し、そのサイズがＹＦＰ配列上のｇＲＮＡの位置に依存する短縮型ＹＦＰを明らかにする。

【図3A】Ｃａｓ９－ＶＬＰによるＬ９２９マウス細胞におけるＹＦＰのＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊。（Ａ）ガイドＲＮＡを作って、開始コドンＡＴＧの下流のＹＦＰをターゲティングした。切断後、細胞は、ＮＨＥＪ（小さい欠失及びインデル（いくつかの細胞におけるＹＦＰフレームを変化させ得る傷）を作り得る機構）によってこのギャップを修復することができた。したがって、天然修復機構によって、修復ＹＦＰの３つの異なるバージョンが生成され得るが、それらの１つのみがインフレームＹＦＰを修復し、ＹＦＰ表現型を維持する。したがって、切断は、ターゲット細胞においてＹＦＰの検出可能だが不完全な減少を誘導するはずである。（Ｂ）Ｃａｓ９と、ＹＦＰをターゲティングするガイドＲＮＡとをロードしたＶＬＰを生産し、ＹＦＰ－Ｌ９２９細胞（マウス線維芽細胞株＃）の培地に直接導入し、レンチベクタートランスダクションによってＹＦＰをゲノムに安定に組み込んだ。無エンベロープＶＬＰも生産し、ネガティブコントロールとして使用した。処理の７２時間後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって細胞を分析し、全体的な平均蛍光強度（ＭＦＩ）をモニタリングして、ＹＦＰ Ｌ９２９ターゲット細胞に対するＹＦＰ破壊Ｃａｓ９－ＶＬＰの強い影響を明らかにした。エンベロープＶＬＰによって処理した細胞では、未処理ＹＦＰ細胞又は無エンベロープＶＬＰによる処理と比較して、ＭＦＩの７倍の減少が測定された＊。ここでは、本発明者らは、さらなる濃縮／精製プロセスを用いずに、特定のガイドＲＮＡをロードしたＣａｓ９－ＶＬＰをＣＲＩＳＰＲ送達剤として使用し得ることを示している。

【図3B】Ｃａｓ９－ＶＬＰによるＬ９２９マウス細胞におけるＹＦＰのＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊。（Ａ）ガイドＲＮＡを作って、開始コドンＡＴＧの下流のＹＦＰをターゲティングした。切断後、細胞は、ＮＨＥＪ（小さい欠失及びインデル（いくつかの細胞におけるＹＦＰフレームを変化させ得る傷）を作り得る機構）によってこのギャップを修復することができた。したがって、天然修復機構によって、修復ＹＦＰの３つの異なるバージョンが生成され得るが、それらの１つのみがインフレームＹＦＰを修復し、ＹＦＰ表現型を維持する。したがって、切断は、ターゲット細胞においてＹＦＰの検出可能だが不完全な減少を誘導するはずである。（Ｂ）Ｃａｓ９と、ＹＦＰをターゲティングするガイドＲＮＡとをロードしたＶＬＰを生産し、ＹＦＰ－Ｌ９２９細胞（マウス線維芽細胞株＃）の培地に直接導入し、レンチベクタートランスダクションによってＹＦＰをゲノムに安定に組み込んだ。無エンベロープＶＬＰも生産し、ネガティブコントロールとして使用した。処理の７２時間後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって細胞を分析し、全体的な平均蛍光強度（ＭＦＩ）をモニタリングして、ＹＦＰ Ｌ９２９ターゲット細胞に対するＹＦＰ破壊Ｃａｓ９－ＶＬＰの強い影響を明らかにした。エンベロープＶＬＰによって処理した細胞では、未処理ＹＦＰ細胞又は無エンベロープＶＬＰによる処理と比較して、ＭＦＩの７倍の減少が測定された＊。ここでは、本発明者らは、さらなる濃縮／精製プロセスを用いずに、特定のガイドＲＮＡをロードしたＣａｓ９－ＶＬＰをＣＲＩＳＰＲ送達剤として使用し得ることを示している。

【図4A】従来のＣａｓ９送達方法及びＣａｓ９ ＶＬＰを使用したＭｙｄ８８ローカスの欠失 （Ａ）Ｍｙｄ８８ゲノムＤＮＡ及びＭｙｄ８８切断アッセイに使用した様々なツールの位置の概略図。紫色及び緑色で表されているように、ヒトＭｙｄ８８遺伝子に対して２つの異なるＣＲＩＳＰＲ配列を設計した。灰色の枠は、２つのＰＣＲプライマーがハイブリダイゼーションする領域に対応する。それらは、４２０ｎｔのアンプリコンサイズを生成するｇＭｙｄ８８の増幅に最適化されている。ターゲット細胞においてＣＲＩＳＰＲ系が活性である場合、いくつかの細胞では１６０ｎｔの欠失が起こり、ＮＨＥＪによって修復され得、２６０ｎｔサイズの短縮型遺伝子が生じる。（Ｂ）ｗｔ－ＨＥＫにおける、又はＭｙｄ８８ ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓ９コードプラスミドの両方をトランスフェクションした後におけるｇＭｙｄ８８のＰＣＲ増幅。ゲノムＤＮＡの抽出後、Ｍｙｄ８８プライマーセットを使用してＰＣＲアッセイを実施した。ＣＲＩＳＰＲ成分で処理した集団では、２つのターゲット位置における遺伝子の切断後に、非切断型Ｍｙｄ８８（又は単一ＣＲＩＳＰＲによって切断されたバージョン）及び二重カットバージョンに対応する２つのアンプリコンが生成される。Ｍｙｄ８８欠失は全ての処理細胞に影響を及ぼさないが、これは、トランスフェクションＣＲＩＳＰＲ成分系によって媒介される切断が完全ではないことを示していると認められ得る。（Ｃ）本発明者らはまた、Ｃａｓ９をロードしたＶＬＰによって、両Ｍｙｄ８８ガイドＲＮＡを送達しようと試みた。このために、図１に示されている手順にしたがってＶＬＰを生産し、使用したプラスミドの比及びエンベロープ（Ｒ１～Ｒ４）の性質に応じて、異なる実験手順を検討した。それらを収集及び濃縮した後、ＶＬＰをＨＥＫ又はＨｅｌａ細胞の培地に導入し、次に、ＰＣＲによってＭｙｄ８８切断の効率を評価した。（Ｄ）Ｍｙｄ８８プライマーセットと、ＶＬＰによって処理した細胞から抽出したゲノムＤＮＡとを使用したＭｙｄ８８増幅。ＨＥＫ細胞におけるＭｙｄ８８の切断では、全ての調製物が等しく効率的であったが（左のパネル）、Ｈｅｌａ細胞ではいくつかの差異を認めることができ、使用したエンベロープ／比の重要性を反映している。特定のプロトコールが両細胞型に最適と思われる（Ｒ１）。

【図4B】従来のＣａｓ９送達方法及びＣａｓ９ ＶＬＰを使用したＭｙｄ８８ローカスの欠失 （Ａ）Ｍｙｄ８８ゲノムＤＮＡ及びＭｙｄ８８切断アッセイに使用した様々なツールの位置の概略図。紫色及び緑色で表されているように、ヒトＭｙｄ８８遺伝子に対して２つの異なるＣＲＩＳＰＲ配列を設計した。灰色の枠は、２つのＰＣＲプライマーがハイブリダイゼーションする領域に対応する。それらは、４２０ｎｔのアンプリコンサイズを生成するｇＭｙｄ８８の増幅に最適化されている。ターゲット細胞においてＣＲＩＳＰＲ系が活性である場合、いくつかの細胞では１６０ｎｔの欠失が起こり、ＮＨＥＪによって修復され得、２６０ｎｔサイズの短縮型遺伝子が生じる。（Ｂ）ｗｔ－ＨＥＫにおける、又はＭｙｄ８８ ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓ９コードプラスミドの両方をトランスフェクションした後におけるｇＭｙｄ８８のＰＣＲ増幅。ゲノムＤＮＡの抽出後、Ｍｙｄ８８プライマーセットを使用してＰＣＲアッセイを実施した。ＣＲＩＳＰＲ成分で処理した集団では、２つのターゲット位置における遺伝子の切断後に、非切断型Ｍｙｄ８８（又は単一ＣＲＩＳＰＲによって切断されたバージョン）及び二重カットバージョンに対応する２つのアンプリコンが生成される。Ｍｙｄ８８欠失は全ての処理細胞に影響を及ぼさないが、これは、トランスフェクションＣＲＩＳＰＲ成分系によって媒介される切断が完全ではないことを示していると認められ得る。（Ｃ）本発明者らはまた、Ｃａｓ９をロードしたＶＬＰによって、両Ｍｙｄ８８ガイドＲＮＡを送達しようと試みた。このために、図１に示されている手順にしたがってＶＬＰを生産し、使用したプラスミドの比及びエンベロープ（Ｒ１～Ｒ４）の性質に応じて、異なる実験手順を検討した。それらを収集及び濃縮した後、ＶＬＰをＨＥＫ又はＨｅｌａ細胞の培地に導入し、次に、ＰＣＲによってＭｙｄ８８切断の効率を評価した。（Ｄ）Ｍｙｄ８８プライマーセットと、ＶＬＰによって処理した細胞から抽出したゲノムＤＮＡとを使用したＭｙｄ８８増幅。ＨＥＫ細胞におけるＭｙｄ８８の切断では、全ての調製物が等しく効率的であったが（左のパネル）、Ｈｅｌａ細胞ではいくつかの差異を認めることができ、使用したエンベロープ／比の重要性を反映している。特定のプロトコールが両細胞型に最適と思われる（Ｒ１）。

【図4C】従来のＣａｓ９送達方法及びＣａｓ９ ＶＬＰを使用したＭｙｄ８８ローカスの欠失 （Ａ）Ｍｙｄ８８ゲノムＤＮＡ及びＭｙｄ８８切断アッセイに使用した様々なツールの位置の概略図。紫色及び緑色で表されているように、ヒトＭｙｄ８８遺伝子に対して２つの異なるＣＲＩＳＰＲ配列を設計した。灰色の枠は、２つのＰＣＲプライマーがハイブリダイゼーションする領域に対応する。それらは、４２０ｎｔのアンプリコンサイズを生成するｇＭｙｄ８８の増幅に最適化されている。ターゲット細胞においてＣＲＩＳＰＲ系が活性である場合、いくつかの細胞では１６０ｎｔの欠失が起こり、ＮＨＥＪによって修復され得、２６０ｎｔサイズの短縮型遺伝子が生じる。（Ｂ）ｗｔ－ＨＥＫにおける、又はＭｙｄ８８ ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓ９コードプラスミドの両方をトランスフェクションした後におけるｇＭｙｄ８８のＰＣＲ増幅。ゲノムＤＮＡの抽出後、Ｍｙｄ８８プライマーセットを使用してＰＣＲアッセイを実施した。ＣＲＩＳＰＲ成分で処理した集団では、２つのターゲット位置における遺伝子の切断後に、非切断型Ｍｙｄ８８（又は単一ＣＲＩＳＰＲによって切断されたバージョン）及び二重カットバージョンに対応する２つのアンプリコンが生成される。Ｍｙｄ８８欠失は全ての処理細胞に影響を及ぼさないが、これは、トランスフェクションＣＲＩＳＰＲ成分系によって媒介される切断が完全ではないことを示していると認められ得る。（Ｃ）本発明者らはまた、Ｃａｓ９をロードしたＶＬＰによって、両Ｍｙｄ８８ガイドＲＮＡを送達しようと試みた。このために、図１に示されている手順にしたがってＶＬＰを生産し、使用したプラスミドの比及びエンベロープ（Ｒ１～Ｒ４）の性質に応じて、異なる実験手順を検討した。それらを収集及び濃縮した後、ＶＬＰをＨＥＫ又はＨｅｌａ細胞の培地に導入し、次に、ＰＣＲによってＭｙｄ８８切断の効率を評価した。（Ｄ）Ｍｙｄ８８プライマーセットと、ＶＬＰによって処理した細胞から抽出したゲノムＤＮＡとを使用したＭｙｄ８８増幅。ＨＥＫ細胞におけるＭｙｄ８８の切断では、全ての調製物が等しく効率的であったが（左のパネル）、Ｈｅｌａ細胞ではいくつかの差異を認めることができ、使用したエンベロープ／比の重要性を反映している。特定のプロトコールが両細胞型に最適と思われる（Ｒ１）。

【図4D】従来のＣａｓ９送達方法及びＣａｓ９ ＶＬＰを使用したＭｙｄ８８ローカスの欠失 （Ａ）Ｍｙｄ８８ゲノムＤＮＡ及びＭｙｄ８８切断アッセイに使用した様々なツールの位置の概略図。紫色及び緑色で表されているように、ヒトＭｙｄ８８遺伝子に対して２つの異なるＣＲＩＳＰＲ配列を設計した。灰色の枠は、２つのＰＣＲプライマーがハイブリダイゼーションする領域に対応する。それらは、４２０ｎｔのアンプリコンサイズを生成するｇＭｙｄ８８の増幅に最適化されている。ターゲット細胞においてＣＲＩＳＰＲ系が活性である場合、いくつかの細胞では１６０ｎｔの欠失が起こり、ＮＨＥＪによって修復され得、２６０ｎｔサイズの短縮型遺伝子が生じる。（Ｂ）ｗｔ－ＨＥＫにおける、又はＭｙｄ８８ ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓ９コードプラスミドの両方をトランスフェクションした後におけるｇＭｙｄ８８のＰＣＲ増幅。ゲノムＤＮＡの抽出後、Ｍｙｄ８８プライマーセットを使用してＰＣＲアッセイを実施した。ＣＲＩＳＰＲ成分で処理した集団では、２つのターゲット位置における遺伝子の切断後に、非切断型Ｍｙｄ８８（又は単一ＣＲＩＳＰＲによって切断されたバージョン）及び二重カットバージョンに対応する２つのアンプリコンが生成される。Ｍｙｄ８８欠失は全ての処理細胞に影響を及ぼさないが、これは、トランスフェクションＣＲＩＳＰＲ成分系によって媒介される切断が完全ではないことを示していると認められ得る。（Ｃ）本発明者らはまた、Ｃａｓ９をロードしたＶＬＰによって、両Ｍｙｄ８８ガイドＲＮＡを送達しようと試みた。このために、図１に示されている手順にしたがってＶＬＰを生産し、使用したプラスミドの比及びエンベロープ（Ｒ１～Ｒ４）の性質に応じて、異なる実験手順を検討した。それらを収集及び濃縮した後、ＶＬＰをＨＥＫ又はＨｅｌａ細胞の培地に導入し、次に、ＰＣＲによってＭｙｄ８８切断の効率を評価した。（Ｄ）Ｍｙｄ８８プライマーセットと、ＶＬＰによって処理した細胞から抽出したゲノムＤＮＡとを使用したＭｙｄ８８増幅。ＨＥＫ細胞におけるＭｙｄ８８の切断では、全ての調製物が等しく効率的であったが（左のパネル）、Ｈｅｌａ細胞ではいくつかの差異を認めることができ、使用したエンベロープ／比の重要性を反映している。特定のプロトコールが両細胞型に最適と思われる（Ｒ１）。

【図5】Ｃａｓ９－ＶＬＰによって誘導されるＭｙｄ８８遺伝子の用量依存的切断 Ｍｙｄ８８遺伝子をターゲティングする２つのｇＲＮＡをロードしたＣａｓ９－ＶＬＰを生産し、濃縮し、４℃で１５日間保存した。次に、漸増量のＶＬＰを、１２ｗプレート（細胞 １５００００個／ｗ）にプレーティングしたＨＥＫ２９３Ｔターゲット細胞の培地に追加した。ＶＬＰ処理の２０時間後、細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡを精製して、Ｍｙｄ８８ローカスの遺伝子切断を分析した。Ｍｙｄ８８（２６０ｎｔ）の欠失を示すシグナルは、培地に導入したＶＬＰの量と共に増加する。これは、Ｃａｓ９－ＶＬＰが、それらの導入後２４時間以内はターゲット細胞において活性であることを示している。ＶＬＰ調製物は、４℃で少なくとも１５日間安定であり得ると認められた。

【図6】Ｃａｓ９－ＶＬＰによるＨＥＫターゲット中のＭｙｄ８８遺伝子の切断は、ポリブレンによって増強される。Ｍｙｄ８８遺伝子をターゲティングする２つのｇＲＮＡをロードした準最適用量のＣａｓ９－ＶＬＰを、ヘキサジメトリンブロミド（ポリブレン）（粒子とターゲット細胞との接触を促すポリカチオン）を補充した又は補充していない完全培地中で成長させたＨＥＫターゲット細胞 ３×１０ｅ６個の培地に導入した。ＶＬＰ処理の４８時間後、細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡを精製して、Ｍｙｄ８８ローカスの遺伝子切断を分析した。不飽和量のＶＬＰを使用したこの条件では、Ｍｙｄ－８８切断は、標準培地中で培養した細胞では検出不可能であるが、ポリブレンの追加によって強く増強される。

【図7A】ヒト単球由来マクロファージにおける、Ｃａｓ９－ＶＬＰによって誘導されるＭｙｄ８８遺伝子の切断 遺伝子型 （Ａ）Ｍｙｄ８８遺伝子をターゲティングする２つのｇＲＮＡをロードしたＣａｓ９－ＶＬＰを濃縮し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）による６日間の分化後に、ヒト単球由来マクロファージの培地に導入した（４８ｗプレート中、細胞 １０００００個／ウェル）。ＶＬＰで処理した４８時間後、細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡを精製して、Ｍｙｄ８８ローカスの遺伝子切断を分析した。この条件下では、Ｍｙｄ８８遺伝子は、ＶＬＰによる処理後に、従来のＰＣＲによってｗｔ配列が検出すらできないような高い効率で切断されるが、これは、一次非分裂細胞におけるＭｙｄ８８－ＶＬＰによって媒介される切断がほぼ完全であることを示唆している。 表現型 （Ｂ）Lombardo et al＊によれば、ヒトマクロファージは、ＬＰＳのようなＴＬＲ－４アゴニストによって刺激されない限り、ＧＭＣＳＦなしで培養するとアポトーシスによって大量に死亡する。このアポトーシス耐性は、ＬＰＳ及びＭｙｄ８８依存性である。ＶＬＰ処理細胞がそれらのＭｙｄ８８機能を喪失したかをチェックするために、本発明者らは、（ＲＰＭＩ培地中で）ＧＭＣＳＦなしでそれらを培養し、ＬＰＳでそれらを７２時間刺激した。この処理の下では、ＷＴマクロファージはＧＭＣＳＦ枯渇に対して耐性であったが（条件２と条件３との比較）、Ｍｙｄ８８切断Ｃａｓ９－ＶＬＰで処理したマクロファージは大量に死亡した（条件４）。これは、ＶＬＰ処理が機能レベルでＭｙｄ８８を不活性化したことを強く示唆している。

【図7B】ヒト単球由来マクロファージにおける、Ｃａｓ９－ＶＬＰによって誘導されるＭｙｄ８８遺伝子の切断 遺伝子型 （Ａ）Ｍｙｄ８８遺伝子をターゲティングする２つのｇＲＮＡをロードしたＣａｓ９－ＶＬＰを濃縮し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）による６日間の分化後に、ヒト単球由来マクロファージの培地に導入した（４８ｗプレート中、細胞 １０００００個／ウェル）。ＶＬＰで処理した４８時間後、細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡを精製して、Ｍｙｄ８８ローカスの遺伝子切断を分析した。この条件下では、Ｍｙｄ８８遺伝子は、ＶＬＰによる処理後に、従来のＰＣＲによってｗｔ配列が検出すらできないような高い効率で切断されるが、これは、一次非分裂細胞におけるＭｙｄ８８－ＶＬＰによって媒介される切断がほぼ完全であることを示唆している。 表現型 （Ｂ）Lombardo et al＊によれば、ヒトマクロファージは、ＬＰＳのようなＴＬＲ－４アゴニストによって刺激されない限り、ＧＭＣＳＦなしで培養するとアポトーシスによって大量に死亡する。このアポトーシス耐性は、ＬＰＳ及びＭｙｄ８８依存性である。ＶＬＰ処理細胞がそれらのＭｙｄ８８機能を喪失したかをチェックするために、本発明者らは、（ＲＰＭＩ培地中で）ＧＭＣＳＦなしでそれらを培養し、ＬＰＳでそれらを７２時間刺激した。この処理の下では、ＷＴマクロファージはＧＭＣＳＦ枯渇に対して耐性であったが（条件２と条件３との比較）、Ｍｙｄ８８切断Ｃａｓ９－ＶＬＰで処理したマクロファージは大量に死亡した（条件４）。これは、ＶＬＰ処理が機能レベルでＭｙｄ８８を不活性化したことを強く示唆している。

【図8】新たに精製した一次ヒトリンパ球における、Ｃａｓ９－ＶＬＰによって誘導されるＭｙｄ８８遺伝子の切断。ヒト精製リンパ球（Ｆｉｃｏｌｌ／ｐｅｒｃｏｌｌ）を４８ｗプレートに細胞 ４０×１０ｅ６個／mlで２００μlプレーティングした。次に、Ｍｙｄ８８をターゲティングするＣａｓ９－ＶＬＰの新鮮調製物で細胞を処理し、ポリブレン（４μg/ml）を補充したトランスダクション培地中で、古い方を４℃で２０日間維持した。２時間後、新鮮培地 ５００μlをトランスダクション培地に追加し、培養液中で細胞を４０時間維持してからそれらを溶解し、ゲノムＤＮＡを抽出した。次に、ＰＣＲによってＭｙｄ８８の切断を調査したところ、ｗｔ又は切断型のＭｙｄ８８が明らかになった。両ＶＬＰ条件では、Ｍｙｄ８８遺伝子が切断された。いかなる明らかな毒性も伴わずに、ＶＬＰの単回処理によって、４８時間以内に静止リンパ球 １００万個を遺伝子改変した。

【図9】マウス骨髄由来マクロファージにおける、Ｃａｓ９－ＶＬＰによって誘導されるＭｙｄ８８遺伝子の切断 ＭＣＳＦ含有培地中で８日間インキュベーションしたマウス大腿骨から流し出した骨髄細胞からマクロファージを分化させた。次に、ポリブレン（４μg/ml）を補充した培地中、ｍＭｙｄ８８をターゲティングするＣａｓ９－ＶＬＰの新鮮調製物で細胞を処理した。注目すべきことに、マウス遺伝子を特異的にターゲティングする２つの新たなｇＲＮＡを本実験のために設計した。溶解及びゲノムＤＮＡ抽出の４８時間前に、細胞を培養した。次に、ＰＣＲによってＭｙｄ８８の切断を調査したところ、ｈＭｙｄ８８アッセイの設計に基づいて、ｗｔ又は切断型のマウスＭｙｄ８８遺伝子が明らかになった。ＶＬＰ処理細胞では、非常に効率的な切断がＰＣＲによって検出されたが、完全ｍＭｙｄ８８又は部分切断ｍＭｙｄ８８に対応するバンド（１つのｇＲＮＡのみ）は薄く見える。

【図10A】「オールインワン」Ｃａｓ９－ＶＬＰによって媒介される、内因性ＤＤＸ３ゲノムローカスにおけるｆｌａｇタグ配列のターゲット挿入。（Ａ）ヒトＤＤＸ３ゲノムローカス及び実験において使用した様々なツールの概略図。紫色の矢印は、ＤＤＸ３ ＣＲＩＳＰＲによって切断されるローカスを表し、灰色の領域は、ＤＤＸ３のイントロン領域を表す。ＦＬＡＧ ＩＮ ｒｅｐプライマー（ｓｓＯＤＮ）は、Ｆｌａｇタグ配列に隣接する４０ｎｔの相同修復アーム（これは、ＤＤＸ３ローカスに相同である）を示す一本鎖ＤＮＡとして表されている。ＰＣＲアッセイにおいて使用したプライマーが表されている。（Ｂ）Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ及び修復プライマーを送達する「オールインワン」ＶＬＰの原理。ＤＤＸ３をターゲティングするＶＬＰを生産し、遠心分離し、４℃で保存した。次いで、ＶＬＰと漸増量のｓｓＯＤＮとを組み合わせ、古典的成長培地中で培養したＨＥＫターゲット細胞に追加した。次に、タンパク質抽出物及びゲノムＤＮＡの調製のために、７２時間後にターゲット細胞を溶解した。（Ｃ）「オールインワン」ＤＤＸ３ ＶＬＰで処理した細胞のウエスタンブロット分析。ｆｌａｇ抗体によって明らかになったＤＤＸ３予想分子量（８６KDa）に対応するウエスタンブロットシグナルは、最高濃度のｓｓＯＤＮで検出され得る。これは、Ｆｌａｇ配列がＶＬＰ処理細胞のＤＤＸ３ローカスに成功裏に挿入されたことを示している。これは、ＶＬＰ処理細胞から抽出したゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによってさらに確認された。フォワードプライマーはＦｌａｇ配列にハイブリダイゼーションし、リバースプライマーはＤＤＸ３のイントロンにハイブリダイゼーションするので、Ｆｌａｇ配列がＤＤＸ３遺伝子に挿入された場合にのみ、使用したプライマー（Ａに示されている）はＤＮＡセグメントを増幅するはずである。下のパネルに示されているように、高濃度のプライマーでは遺伝子改変は明らかであり、用量と共に減少するが、０，０１nmol/mlの低濃度では依然としてＤＮＡレベルで検出可能である（レーン４）。（Ｄ）ヒト単球由来樹状細胞（Ｍｏ由来ＤＣ）におけるＤＤＸ３の内因性ローカスの上流へのＦｌａｇ配列の導入。ＶＬＰ及びｓｓＯＤＮ（最終５nmol/μl）を複合体形成させ、この混合物を使用して、ポリブレン（４μg/ml）を含有するトランスダクション培地中でＭｏ由来ＤＣを処理した。ゲノムＤＮＡ分析は、ＶＬＰの単回処理によって、ｆｌａｇ配列が、ヒト一次ＤＣにおけるＤＤＸ３の内因性ローカスに成功裏に付加されたことを示している。

【図10B】「オールインワン」Ｃａｓ９－ＶＬＰによって媒介される、内因性ＤＤＸ３ゲノムローカスにおけるｆｌａｇタグ配列のターゲット挿入。（Ａ）ヒトＤＤＸ３ゲノムローカス及び実験において使用した様々なツールの概略図。紫色の矢印は、ＤＤＸ３ ＣＲＩＳＰＲによって切断されるローカスを表し、灰色の領域は、ＤＤＸ３のイントロン領域を表す。ＦＬＡＧ ＩＮ ｒｅｐプライマー（ｓｓＯＤＮ）は、Ｆｌａｇタグ配列に隣接する４０ｎｔの相同修復アーム（これは、ＤＤＸ３ローカスに相同である）を示す一本鎖ＤＮＡとして表されている。ＰＣＲアッセイにおいて使用したプライマーが表されている。（Ｂ）Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ及び修復プライマーを送達する「オールインワン」ＶＬＰの原理。ＤＤＸ３をターゲティングするＶＬＰを生産し、遠心分離し、４℃で保存した。次いで、ＶＬＰと漸増量のｓｓＯＤＮとを組み合わせ、古典的成長培地中で培養したＨＥＫターゲット細胞に追加した。次に、タンパク質抽出物及びゲノムＤＮＡの調製のために、７２時間後にターゲット細胞を溶解した。（Ｃ）「オールインワン」ＤＤＸ３ ＶＬＰで処理した細胞のウエスタンブロット分析。ｆｌａｇ抗体によって明らかになったＤＤＸ３予想分子量（８６KDa）に対応するウエスタンブロットシグナルは、最高濃度のｓｓＯＤＮで検出され得る。これは、Ｆｌａｇ配列がＶＬＰ処理細胞のＤＤＸ３ローカスに成功裏に挿入されたことを示している。これは、ＶＬＰ処理細胞から抽出したゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによってさらに確認された。フォワードプライマーはＦｌａｇ配列にハイブリダイゼーションし、リバースプライマーはＤＤＸ３のイントロンにハイブリダイゼーションするので、Ｆｌａｇ配列がＤＤＸ３遺伝子に挿入された場合にのみ、使用したプライマー（Ａに示されている）はＤＮＡセグメントを増幅するはずである。下のパネルに示されているように、高濃度のプライマーでは遺伝子改変は明らかであり、用量と共に減少するが、０，０１nmol/mlの低濃度では依然としてＤＮＡレベルで検出可能である（レーン４）。（Ｄ）ヒト単球由来樹状細胞（Ｍｏ由来ＤＣ）におけるＤＤＸ３の内因性ローカスの上流へのＦｌａｇ配列の導入。ＶＬＰ及びｓｓＯＤＮ（最終５nmol/μl）を複合体形成させ、この混合物を使用して、ポリブレン（４μg/ml）を含有するトランスダクション培地中でＭｏ由来ＤＣを処理した。ゲノムＤＮＡ分析は、ＶＬＰの単回処理によって、ｆｌａｇ配列が、ヒト一次ＤＣにおけるＤＤＸ３の内因性ローカスに成功裏に付加されたことを示している。

【図10C】「オールインワン」Ｃａｓ９－ＶＬＰによって媒介される、内因性ＤＤＸ３ゲノムローカスにおけるｆｌａｇタグ配列のターゲット挿入。（Ａ）ヒトＤＤＸ３ゲノムローカス及び実験において使用した様々なツールの概略図。紫色の矢印は、ＤＤＸ３ ＣＲＩＳＰＲによって切断されるローカスを表し、灰色の領域は、ＤＤＸ３のイントロン領域を表す。ＦＬＡＧ ＩＮ ｒｅｐプライマー（ｓｓＯＤＮ）は、Ｆｌａｇタグ配列に隣接する４０ｎｔの相同修復アーム（これは、ＤＤＸ３ローカスに相同である）を示す一本鎖ＤＮＡとして表されている。ＰＣＲアッセイにおいて使用したプライマーが表されている。（Ｂ）Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ及び修復プライマーを送達する「オールインワン」ＶＬＰの原理。ＤＤＸ３をターゲティングするＶＬＰを生産し、遠心分離し、４℃で保存した。次いで、ＶＬＰと漸増量のｓｓＯＤＮとを組み合わせ、古典的成長培地中で培養したＨＥＫターゲット細胞に追加した。次に、タンパク質抽出物及びゲノムＤＮＡの調製のために、７２時間後にターゲット細胞を溶解した。（Ｃ）「オールインワン」ＤＤＸ３ ＶＬＰで処理した細胞のウエスタンブロット分析。ｆｌａｇ抗体によって明らかになったＤＤＸ３予想分子量（８６KDa）に対応するウエスタンブロットシグナルは、最高濃度のｓｓＯＤＮで検出され得る。これは、Ｆｌａｇ配列がＶＬＰ処理細胞のＤＤＸ３ローカスに成功裏に挿入されたことを示している。これは、ＶＬＰ処理細胞から抽出したゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによってさらに確認された。フォワードプライマーはＦｌａｇ配列にハイブリダイゼーションし、リバースプライマーはＤＤＸ３のイントロンにハイブリダイゼーションするので、Ｆｌａｇ配列がＤＤＸ３遺伝子に挿入された場合にのみ、使用したプライマー（Ａに示されている）はＤＮＡセグメントを増幅するはずである。下のパネルに示されているように、高濃度のプライマーでは遺伝子改変は明らかであり、用量と共に減少するが、０，０１nmol/mlの低濃度では依然としてＤＮＡレベルで検出可能である（レーン４）。（Ｄ）ヒト単球由来樹状細胞（Ｍｏ由来ＤＣ）におけるＤＤＸ３の内因性ローカスの上流へのＦｌａｇ配列の導入。ＶＬＰ及びｓｓＯＤＮ（最終５nmol/μl）を複合体形成させ、この混合物を使用して、ポリブレン（４μg/ml）を含有するトランスダクション培地中でＭｏ由来ＤＣを処理した。ゲノムＤＮＡ分析は、ＶＬＰの単回処理によって、ｆｌａｇ配列が、ヒト一次ＤＣにおけるＤＤＸ３の内因性ローカスに成功裏に付加されたことを示している。

【図10D】「オールインワン」Ｃａｓ９－ＶＬＰによって媒介される、内因性ＤＤＸ３ゲノムローカスにおけるｆｌａｇタグ配列のターゲット挿入。（Ａ）ヒトＤＤＸ３ゲノムローカス及び実験において使用した様々なツールの概略図。紫色の矢印は、ＤＤＸ３ ＣＲＩＳＰＲによって切断されるローカスを表し、灰色の領域は、ＤＤＸ３のイントロン領域を表す。ＦＬＡＧ ＩＮ ｒｅｐプライマー（ｓｓＯＤＮ）は、Ｆｌａｇタグ配列に隣接する４０ｎｔの相同修復アーム（これは、ＤＤＸ３ローカスに相同である）を示す一本鎖ＤＮＡとして表されている。ＰＣＲアッセイにおいて使用したプライマーが表されている。（Ｂ）Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ及び修復プライマーを送達する「オールインワン」ＶＬＰの原理。ＤＤＸ３をターゲティングするＶＬＰを生産し、遠心分離し、４℃で保存した。次いで、ＶＬＰと漸増量のｓｓＯＤＮとを組み合わせ、古典的成長培地中で培養したＨＥＫターゲット細胞に追加した。次に、タンパク質抽出物及びゲノムＤＮＡの調製のために、７２時間後にターゲット細胞を溶解した。（Ｃ）「オールインワン」ＤＤＸ３ ＶＬＰで処理した細胞のウエスタンブロット分析。ｆｌａｇ抗体によって明らかになったＤＤＸ３予想分子量（８６KDa）に対応するウエスタンブロットシグナルは、最高濃度のｓｓＯＤＮで検出され得る。これは、Ｆｌａｇ配列がＶＬＰ処理細胞のＤＤＸ３ローカスに成功裏に挿入されたことを示している。これは、ＶＬＰ処理細胞から抽出したゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによってさらに確認された。フォワードプライマーはＦｌａｇ配列にハイブリダイゼーションし、リバースプライマーはＤＤＸ３のイントロンにハイブリダイゼーションするので、Ｆｌａｇ配列がＤＤＸ３遺伝子に挿入された場合にのみ、使用したプライマー（Ａに示されている）はＤＮＡセグメントを増幅するはずである。下のパネルに示されているように、高濃度のプライマーでは遺伝子改変は明らかであり、用量と共に減少するが、０，０１nmol/mlの低濃度では依然としてＤＮＡレベルで検出可能である（レーン４）。（Ｄ）ヒト単球由来樹状細胞（Ｍｏ由来ＤＣ）におけるＤＤＸ３の内因性ローカスの上流へのＦｌａｇ配列の導入。ＶＬＰ及びｓｓＯＤＮ（最終５nmol/μl）を複合体形成させ、この混合物を使用して、ポリブレン（４μg/ml）を含有するトランスダクション培地中でＭｏ由来ＤＣを処理した。ゲノムＤＮＡ分析は、ＶＬＰの単回処理によって、ｆｌａｇ配列が、ヒト一次ＤＣにおけるＤＤＸ３の内因性ローカスに成功裏に付加されたことを示している。

【図11】ナノブレードを使用する一連の可能性及び「ヘルパー」ＶＬＰとの会合 本発明者らは、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡを組み込んだ「オールインワン」ＶＬＰであって、場合により修復ｓｓＤＮＡと組み合わせた「オールインワン」ＶＬＰを作製することができ、完全なパッケージをレシピエント細胞に送達することができることを示した。（ａ）に示されているこの薬剤は、それ自体が非常に多用途である。ＶＬＰはいくつかのｇＲＮＡを組み込むことができ、産生後に異なる修復プライマーと確実に複合体形成し得るので、低コストで専用ツールを作り出すために、多くの可能性が科学者／企業に提供される。(Abe et al. J Virol 1998)で言及されているように、異なる性質のＶＬＰは、産生後に細胞外で複合体形成し得、互いに相補的であり得、例えば、他方が細胞に侵入するのを一方が支援する。ＶＬＰのこの特性を考慮して、本発明者らは、それぞれが特定のカーゴ専用のものである粒子を混合することによって、ＣＲＩＳＰＲ系の参加要素を輸送するための活性剤を調製する他の方法を想像し得る。（ｂ）では、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９－ＶＬＰと、修復プライマーと単に複合体形成した粒子とを混合し得る系が提案されている：この場合、両種類の粒子の混合物が最終活性剤であろう。さらに進むと、ｇＲＮＡを特定の種類の粒子にパッケージングし、産生後に非ロードＣａｓ９－ＶＬＰと組み合わせて、全ての成分を送達することができる粒子混合物を作り出すこともできる。この系は、（ｃ）に示されている。いくつかのｇＲＮＡをＶＬＰに組み込む理論上の可能性を考慮すると、異なるウイルスエンベロープを選択して各種類のＶＬＰをシュードタイピングするために、及びそれらを異なる種類のｓｓＤＮＡと会合させるために、本発明者らは、より複雑な薬剤さえも想像し得る。（ｄ）．異なる種類の粒子におけるＣＲＩＳＰＲ成分のこの隔離は、最終薬剤の全体的な効率に確実に影響を与え得るが、それは、ナノブレードを生産する企業に、ナノブレードサービスを改善してそれを低コストにする広範な可能性を提供し得る。（ｃ）の系が十分に効率的である場合には、十分に滴定された大量の一般的なＣａｓ９－ＶＬＰのバッチを調製して、各用途のために特別にカスタマイズされたｇＲＮＡ粒子と会合させれば十分である。ｇＲＮＡ－ＶＬＰの迅速かつ低コストな調製のみを必要とする非常に正確な分子サービスが提供されるので、この系は、工業的な観点から非常に有益であると思われる。

【図12A】不連続スクロース勾配で分離したＣＡＳ９ウイルス由来粒子のウエスタンブロット分析及び特性評価。図１２Ａは、ウエスタンブロットゲル電気泳動を示す。レーン（左から右に）：（ｉ）抗Ｆｌａｇ抗体と共にインキュベーション；（ｉｉ）抗ＶＳＶ－Ｇ抗体と共にインキュベーション；（ｉｉｉ）抗ＣＡＳ９抗体と共にインキュベーション；（ｉｖ）抗ＧＡＧｍｌｖ抗体と共にインキュベーション。図１２Ｂは、不連続スクロース勾配によるＣＡＳ９ウイルス由来粒子の分離を実施した後に収集した画分１～２４のドットブロットを示す。カラム（左から右に）：画分ｎ°１～ｎ°２４。図１２Ｂのレーン（上から下に）：（ｉ）抗ＶＳＶ－Ｇ抗体と共にインキュベーション；（ｉｉ）抗ＣＡＳ９抗体と共にインキュベーション、（ｉｉｉ）抗ＧＡＧｍｌｖ抗体と共にインキュベーション。

【図12B】不連続スクロース勾配で分離したＣＡＳ９ウイルス由来粒子のウエスタンブロット分析及び特性評価。図１２Ａは、ウエスタンブロットゲル電気泳動を示す。レーン（左から右に）：（ｉ）抗Ｆｌａｇ抗体と共にインキュベーション；（ｉｉ）抗ＶＳＶ－Ｇ抗体と共にインキュベーション；（ｉｉｉ）抗ＣＡＳ９抗体と共にインキュベーション；（ｉｖ）抗ＧＡＧｍｌｖ抗体と共にインキュベーション。図１２Ｂは、不連続スクロース勾配によるＣＡＳ９ウイルス由来粒子の分離を実施した後に収集した画分１～２４のドットブロットを示す。カラム（左から右に）：画分ｎ°１～ｎ°２４。図１２Ｂのレーン（上から下に）：（ｉ）抗ＶＳＶ－Ｇ抗体と共にインキュベーション；（ｉｉ）抗ＣＡＳ９抗体と共にインキュベーション、（ｉｉｉ）抗ＧＡＧｍｌｖ抗体と共にインキュベーション。

【図13】Ｇａｇ／Ｃａｓ９融合は、ガイドＲＮＡをウイルス様粒子（ＶＬＰ）内に能動的にロードする。産生細胞から抽出した全ＲＮＡ（レーン２～４）又は対応する精製ＶＬＰ（レーン５～７）を使用した、ガイドＲＮＡの保存領域に対するノーザンブロット。

【図14A】図１４Ａ：ＭＬＶベースのＶＬＰ又はＨＩＶ－１ベースのＶＬＰの生産のために設計したコードカセットの概略図。初期ｈＣＭＶプロモーター、ウサギＢグロビンイントロン及びウサギｐＡシグナルを備える真核生物発現ベクターを両カセットに組み込んだ。Ｃａｓ９遺伝子からＧＡＧカセットを分離する多様なタンパク質分解部位の探索及び試験によって、両系を最適化した。他の箇所に記載されているようにＭＬＶベースのＶＬＰを生産し、ＧＡＧ ＰＯＬ Ｔａｔ Ｒｅｖタンパク質をコードするＨＩＶ－１ヘルパー構築物をＭＬＶ ＧＡＧ ＰＯＬプラスミドに代えてトランスフェクションした以外は同様に、ＨＩＶ－１ベースのＶＬＰを生産した。ＨＩＶ－１ ＶＬＰの生産は、ＭＬＶベースのＶＬＰと同じ手順に従う。図１４Ｂ：ＧＦＰ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを組み込むように操作した濃縮ＶＬＰを使用して、ＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞 ３００００個をトランスダクションした。同じロードｇＲＮＡ（ターゲット配列：ＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧ－配列番号：３８）を用いて、ＨＩＶ－１及びＭＬＶベースの粒子を生産した。その前日に、レシピエント細胞を９６ｗプレートにプレーティングした。ポリブレン（４μg/ml）をトランスダクション培地に補充した。３つの漸増用量の各ＶＬＰバッチによる処理の７２時間後、蛍光光度計（励起４８８、発光５３５）によって、蛍光強度を測定した。ＶＬＰ処理細胞では、コントロール未処理細胞と比較して、蛍光の減少が明らかであったが（Ｃ）、これは、レシピエント細胞内におけるＧＦＰ遺伝子の切断を示している。結果は、ＨＩＶ－１ベースのＶＬＰが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系をこれらのレシピエント細胞に送達する際に効率的であり、ＭＬＶベースのＶＬＰよりもわずかに低効率のレベルである（１，５～２倍低効率）ことを示している。図１４Ｃ：ＩＬ７で刺激した一次ヒトＴ細胞におけるＷＡＳＰ遺伝子の切断。この実験では、ＩＬ－７で刺激した新鮮精製Ｔ細胞の処理前に、ヒトＷＡＳＰ遺伝子をターゲティングする２つのガイドＲＮＡをＨＩＶ－１又はＭＬＶベースのＶＬＰ内に組み込んだ。２４ｗプレート中、ポリブレン（４μg/ml）及びＩＬ－７を補充したＲＰＭＩ培地 ４００μlに細胞 ５０００００個をプレーティングした。濃縮ＨＩＶ－１又はＭＬＶ ＶＬＰ（１μM ＣＡＳ９で投与したＶＬＰ １０μl）を培養培地に追加した。次に、処理の２４時間後、レシピエント細胞において、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９によるＷＡＳＰ欠失をＰＣＲによって測定した。ゲノムＷＡＳＰ遺伝子の増幅に使用したプライマーは、フォワード：５’－ＡＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＣＴＧ（配列番号：３６） リバース：５’－ＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＴＧＧＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＧ（配列番号：３７）であった。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間、続いて（９５℃で３０秒間－５７℃で３０秒間－７２℃で３０秒間）を２５サイクル、続いて７２℃で５分間である。次に、アンプリコンをゲル上にロードして、ＶＬＰレシピエントＴ細胞におけるＷＡＳＰの状態（ｗｔ又は切断）を明らかにした。ImageJソフトウェアを使用して実施したゲル分析は、ＭＬＶベースのＶＬＰ（３２％）及びＨＩＶ－１ベースのＶＬＰ（６％）の二重カット効率の定量を可能にした。

【図14B】図１４Ａ：ＭＬＶベースのＶＬＰ又はＨＩＶ－１ベースのＶＬＰの生産のために設計したコードカセットの概略図。初期ｈＣＭＶプロモーター、ウサギＢグロビンイントロン及びウサギｐＡシグナルを備える真核生物発現ベクターを両カセットに組み込んだ。Ｃａｓ９遺伝子からＧＡＧカセットを分離する多様なタンパク質分解部位の探索及び試験によって、両系を最適化した。他の箇所に記載されているようにＭＬＶベースのＶＬＰを生産し、ＧＡＧ ＰＯＬ Ｔａｔ Ｒｅｖタンパク質をコードするＨＩＶ－１ヘルパー構築物をＭＬＶ ＧＡＧ ＰＯＬプラスミドに代えてトランスフェクションした以外は同様に、ＨＩＶ－１ベースのＶＬＰを生産した。ＨＩＶ－１ ＶＬＰの生産は、ＭＬＶベースのＶＬＰと同じ手順に従う。図１４Ｂ：ＧＦＰ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを組み込むように操作した濃縮ＶＬＰを使用して、ＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞 ３００００個をトランスダクションした。同じロードｇＲＮＡ（ターゲット配列：ＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧ－配列番号：３８）を用いて、ＨＩＶ－１及びＭＬＶベースの粒子を生産した。その前日に、レシピエント細胞を９６ｗプレートにプレーティングした。ポリブレン（４μg/ml）をトランスダクション培地に補充した。３つの漸増用量の各ＶＬＰバッチによる処理の７２時間後、蛍光光度計（励起４８８、発光５３５）によって、蛍光強度を測定した。ＶＬＰ処理細胞では、コントロール未処理細胞と比較して、蛍光の減少が明らかであったが（Ｃ）、これは、レシピエント細胞内におけるＧＦＰ遺伝子の切断を示している。結果は、ＨＩＶ－１ベースのＶＬＰが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系をこれらのレシピエント細胞に送達する際に効率的であり、ＭＬＶベースのＶＬＰよりもわずかに低効率のレベルである（１，５～２倍低効率）ことを示している。図１４Ｃ：ＩＬ７で刺激した一次ヒトＴ細胞におけるＷＡＳＰ遺伝子の切断。この実験では、ＩＬ－７で刺激した新鮮精製Ｔ細胞の処理前に、ヒトＷＡＳＰ遺伝子をターゲティングする２つのガイドＲＮＡをＨＩＶ－１又はＭＬＶベースのＶＬＰ内に組み込んだ。２４ｗプレート中、ポリブレン（４μg/ml）及びＩＬ－７を補充したＲＰＭＩ培地 ４００μlに細胞 ５０００００個をプレーティングした。濃縮ＨＩＶ－１又はＭＬＶ ＶＬＰ（１μM ＣＡＳ９で投与したＶＬＰ １０μl）を培養培地に追加した。次に、処理の２４時間後、レシピエント細胞において、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９によるＷＡＳＰ欠失をＰＣＲによって測定した。ゲノムＷＡＳＰ遺伝子の増幅に使用したプライマーは、フォワード：５’－ＡＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＣＴＧ（配列番号：３６） リバース：５’－ＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＴＧＧＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＧ（配列番号：３７）であった。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間、続いて（９５℃で３０秒間－５７℃で３０秒間－７２℃で３０秒間）を２５サイクル、続いて７２℃で５分間である。次に、アンプリコンをゲル上にロードして、ＶＬＰレシピエントＴ細胞におけるＷＡＳＰの状態（ｗｔ又は切断）を明らかにした。ImageJソフトウェアを使用して実施したゲル分析は、ＭＬＶベースのＶＬＰ（３２％）及びＨＩＶ－１ベースのＶＬＰ（６％）の二重カット効率の定量を可能にした。

【図14C】図１４Ａ：ＭＬＶベースのＶＬＰ又はＨＩＶ－１ベースのＶＬＰの生産のために設計したコードカセットの概略図。初期ｈＣＭＶプロモーター、ウサギＢグロビンイントロン及びウサギｐＡシグナルを備える真核生物発現ベクターを両カセットに組み込んだ。Ｃａｓ９遺伝子からＧＡＧカセットを分離する多様なタンパク質分解部位の探索及び試験によって、両系を最適化した。他の箇所に記載されているようにＭＬＶベースのＶＬＰを生産し、ＧＡＧ ＰＯＬ Ｔａｔ Ｒｅｖタンパク質をコードするＨＩＶ－１ヘルパー構築物をＭＬＶ ＧＡＧ ＰＯＬプラスミドに代えてトランスフェクションした以外は同様に、ＨＩＶ－１ベースのＶＬＰを生産した。ＨＩＶ－１ ＶＬＰの生産は、ＭＬＶベースのＶＬＰと同じ手順に従う。図１４Ｂ：ＧＦＰ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを組み込むように操作した濃縮ＶＬＰを使用して、ＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞 ３００００個をトランスダクションした。同じロードｇＲＮＡ（ターゲット配列：ＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧ－配列番号：３８）を用いて、ＨＩＶ－１及びＭＬＶベースの粒子を生産した。その前日に、レシピエント細胞を９６ｗプレートにプレーティングした。ポリブレン（４μg/ml）をトランスダクション培地に補充した。３つの漸増用量の各ＶＬＰバッチによる処理の７２時間後、蛍光光度計（励起４８８、発光５３５）によって、蛍光強度を測定した。ＶＬＰ処理細胞では、コントロール未処理細胞と比較して、蛍光の減少が明らかであったが（Ｃ）、これは、レシピエント細胞内におけるＧＦＰ遺伝子の切断を示している。結果は、ＨＩＶ－１ベースのＶＬＰが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系をこれらのレシピエント細胞に送達する際に効率的であり、ＭＬＶベースのＶＬＰよりもわずかに低効率のレベルである（１，５～２倍低効率）ことを示している。図１４Ｃ：ＩＬ７で刺激した一次ヒトＴ細胞におけるＷＡＳＰ遺伝子の切断。この実験では、ＩＬ－７で刺激した新鮮精製Ｔ細胞の処理前に、ヒトＷＡＳＰ遺伝子をターゲティングする２つのガイドＲＮＡをＨＩＶ－１又はＭＬＶベースのＶＬＰ内に組み込んだ。２４ｗプレート中、ポリブレン（４μg/ml）及びＩＬ－７を補充したＲＰＭＩ培地 ４００μlに細胞 ５０００００個をプレーティングした。濃縮ＨＩＶ－１又はＭＬＶ ＶＬＰ（１μM ＣＡＳ９で投与したＶＬＰ １０μl）を培養培地に追加した。次に、処理の２４時間後、レシピエント細胞において、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９によるＷＡＳＰ欠失をＰＣＲによって測定した。ゲノムＷＡＳＰ遺伝子の増幅に使用したプライマーは、フォワード：５’－ＡＴＴＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＣＴＧ（配列番号：３６） リバース：５’－ＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＴＧＧＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＧ（配列番号：３７）であった。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間、続いて（９５℃で３０秒間－５７℃で３０秒間－７２℃で３０秒間）を２５サイクル、続いて７２℃で５分間である。次に、アンプリコンをゲル上にロードして、ＶＬＰレシピエントＴ細胞におけるＷＡＳＰの状態（ｗｔ又は切断）を明らかにした。ImageJソフトウェアを使用して実施したゲル分析は、ＭＬＶベースのＶＬＰ（３２％）及びＨＩＶ－１ベースのＶＬＰ（６％）の二重カット効率の定量を可能にした。

【図15A】Ｃａｓ９含有ウイルス由来粒子によるＴｈｙ１－ＧＦＰマウス胚へのＣＲＩＳＰＲ送達 図１５Ａは、Ｔｈｙ１－ＧＦＰマウス胚の透明帯へのＣＡＳ含有ウイルス由来粒子の注射を示す。図１５Ｂは、ＣＡＳ９含有ウイルス由来粒子を注射したマウス胚に由来する成体マウス（Ｆ０）におけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの切断の結果を示す 図１５Ｃは、図１５Ｂに示されているＦ０マウスに由来するＦ１マウスにおけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの変化を示す。図１５Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ：クロマトグラムから計算した場合の、それぞれマウス＃７８、＃７９、＃２１及び＃２２におけるＧＦＰ変化率（結果は、未処理Ｔｈｙ－ＧＦＰコントロールマウスとの比較である）。横軸：Ｆ１マウスにおけるＧＦＰ変化率。＊選択したＴｈｙ１－ＧＦＰ系統は数コピーのＧＦＰ／アレル（６～１０）を有するという事実により、％は完全ではない。結果は、１アレル当たり１つの構成的ＧＦＰコピーを有するマウス系統において再現されるはずである（準備中）

【図15B-15C】Ｃａｓ９含有ウイルス由来粒子によるＴｈｙ１－ＧＦＰマウス胚へのＣＲＩＳＰＲ送達 図１５Ａは、Ｔｈｙ１－ＧＦＰマウス胚の透明帯へのＣＡＳ含有ウイルス由来粒子の注射を示す。図１５Ｂは、ＣＡＳ９含有ウイルス由来粒子を注射したマウス胚に由来する成体マウス（Ｆ０）におけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの切断の結果を示す 図１５Ｃは、図１５Ｂに示されているＦ０マウスに由来するＦ１マウスにおけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの変化を示す。図１５Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ：クロマトグラムから計算した場合の、それぞれマウス＃７８、＃７９、＃２１及び＃２２におけるＧＦＰ変化率（結果は、未処理Ｔｈｙ－ＧＦＰコントロールマウスとの比較である）。横軸：Ｆ１マウスにおけるＧＦＰ変化率。＊選択したＴｈｙ１－ＧＦＰ系統は数コピーのＧＦＰ／アレル（６～１０）を有するという事実により、％は完全ではない。結果は、１アレル当たり１つの構成的ＧＦＰコピーを有するマウス系統において再現されるはずである（準備中）

【図15D】Ｃａｓ９含有ウイルス由来粒子によるＴｈｙ１－ＧＦＰマウス胚へのＣＲＩＳＰＲ送達 図１５Ａは、Ｔｈｙ１－ＧＦＰマウス胚の透明帯へのＣＡＳ含有ウイルス由来粒子の注射を示す。図１５Ｂは、ＣＡＳ９含有ウイルス由来粒子を注射したマウス胚に由来する成体マウス（Ｆ０）におけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの切断の結果を示す 図１５Ｃは、図１５Ｂに示されているＦ０マウスに由来するＦ１マウスにおけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの変化を示す。図１５Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ：クロマトグラムから計算した場合の、それぞれマウス＃７８、＃７９、＃２１及び＃２２におけるＧＦＰ変化率（結果は、未処理Ｔｈｙ－ＧＦＰコントロールマウスとの比較である）。横軸：Ｆ１マウスにおけるＧＦＰ変化率。＊選択したＴｈｙ１－ＧＦＰ系統は数コピーのＧＦＰ／アレル（６～１０）を有するという事実により、％は完全ではない。結果は、１アレル当たり１つの構成的ＧＦＰコピーを有するマウス系統において再現されるはずである（準備中）

【図15E】Ｃａｓ９含有ウイルス由来粒子によるＴｈｙ１－ＧＦＰマウス胚へのＣＲＩＳＰＲ送達 図１５Ａは、Ｔｈｙ１－ＧＦＰマウス胚の透明帯へのＣＡＳ含有ウイルス由来粒子の注射を示す。図１５Ｂは、ＣＡＳ９含有ウイルス由来粒子を注射したマウス胚に由来する成体マウス（Ｆ０）におけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの切断の結果を示す 図１５Ｃは、図１５Ｂに示されているＦ０マウスに由来するＦ１マウスにおけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの変化を示す。図１５Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ：クロマトグラムから計算した場合の、それぞれマウス＃７８、＃７９、＃２１及び＃２２におけるＧＦＰ変化率（結果は、未処理Ｔｈｙ－ＧＦＰコントロールマウスとの比較である）。横軸：Ｆ１マウスにおけるＧＦＰ変化率。＊選択したＴｈｙ１－ＧＦＰ系統は数コピーのＧＦＰ／アレル（６～１０）を有するという事実により、％は完全ではない。結果は、１アレル当たり１つの構成的ＧＦＰコピーを有するマウス系統において再現されるはずである（準備中）

【図15F】Ｃａｓ９含有ウイルス由来粒子によるＴｈｙ１－ＧＦＰマウス胚へのＣＲＩＳＰＲ送達 図１５Ａは、Ｔｈｙ１－ＧＦＰマウス胚の透明帯へのＣＡＳ含有ウイルス由来粒子の注射を示す。図１５Ｂは、ＣＡＳ９含有ウイルス由来粒子を注射したマウス胚に由来する成体マウス（Ｆ０）におけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの切断の結果を示す 図１５Ｃは、図１５Ｂに示されているＦ０マウスに由来するＦ１マウスにおけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの変化を示す。図１５Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ：クロマトグラムから計算した場合の、それぞれマウス＃７８、＃７９、＃２１及び＃２２におけるＧＦＰ変化率（結果は、未処理Ｔｈｙ－ＧＦＰコントロールマウスとの比較である）。横軸：Ｆ１マウスにおけるＧＦＰ変化率。＊選択したＴｈｙ１－ＧＦＰ系統は数コピーのＧＦＰ／アレル（６～１０）を有するという事実により、％は完全ではない。結果は、１アレル当たり１つの構成的ＧＦＰコピーを有するマウス系統において再現されるはずである（準備中）

【図15G】Ｃａｓ９含有ウイルス由来粒子によるＴｈｙ１－ＧＦＰマウス胚へのＣＲＩＳＰＲ送達 図１５Ａは、Ｔｈｙ１－ＧＦＰマウス胚の透明帯へのＣＡＳ含有ウイルス由来粒子の注射を示す。図１５Ｂは、ＣＡＳ９含有ウイルス由来粒子を注射したマウス胚に由来する成体マウス（Ｆ０）におけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの切断の結果を示す 図１５Ｃは、図１５Ｂに示されているＦ０マウスに由来するＦ１マウスにおけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの変化を示す。図１５Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ：クロマトグラムから計算した場合の、それぞれマウス＃７８、＃７９、＃２１及び＃２２におけるＧＦＰ変化率（結果は、未処理Ｔｈｙ－ＧＦＰコントロールマウスとの比較である）。横軸：Ｆ１マウスにおけるＧＦＰ変化率。＊選択したＴｈｙ１－ＧＦＰ系統は数コピーのＧＦＰ／アレル（６～１０）を有するという事実により、％は完全ではない。結果は、１アレル当たり１つの構成的ＧＦＰコピーを有するマウス系統において再現されるはずである（準備中）

【発明を実施するための形態】

【0031】

発明の詳細な説明
本発明は、真核生物、好ましくは哺乳動物、特にヒト生物のゲノムにおいてターゲット変化を発生させるために、ウイルス由来粒子を使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をターゲット細胞に送達することに関する。

【0032】

驚くべきことに、本発明者らは、Ｃａｓタンパク質がパッケージングされたウイルスベクター粒子の使用を介して、前記Ｃａｓタンパク質をターゲット細胞に送達することによって、部位特異的ゲノム変化、例えば部位特異的ゲノム欠失又は部位特異的ゲノム挿入の発生を成功裏に実施し得ることを示した。

【0033】

本発明者らは、多用途ウイルス由来粒子（本明細書では「ウイルス様粒子」又は「ＶＬＰ」とも称される）を使用することによって、ＣＲＩＳＰＲ活性機構をヒト細胞及び他の哺乳動物細胞（一次細胞型を含む）内に移入する強力な方法を考案した。

【0034】

本発明者らは、これらのＶＬＰが、ターゲット細胞へのＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰｃ（「ＣＲＩＳＰＲ－リボヌクレオタンパク質複合体」とも称される）の用量依存的な一過性送達を確実にし、所望のターゲット遺伝子のロバストかつ迅速な切断を誘導することを示した。実施例で例証されているように、読み取り情報としてＭｙｄ－８８遺伝子を用いた場合、本発明者らは、ヒト細胞において６時間以内に後者の遺伝子の完全な切断を観察したので、本明細書に記載されるウイルス由来粒子系の高い効率に寄与し得る顕著な迅速性によって、前記系は、ほとんどの既知のＣＲＩＳＰＲ送達系の場合のように、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドの核酸移入を実施することに代えて、Ｃａｓタンパク質、最も好ましくはＣａｓ９タンパク質及びＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（本明細書では「ｇＲＮＡ」とも称される）を直接送達することを含む。本明細書の実施例に記載されているように、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、ＣＡＳ含有ＶＬＰに効率的にカプセル化される。実施例にも記載されているように、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡのカプセル化は、ＶＬＰ中のＣＡＳタンパク質の存在に非常に影響される。

【0035】

本発明者らはまた、様々なウイルス由来粒子、特に、その中に含まれるＧＡＧタンパク質が様々なウイルスに由来し得るウイルス由来粒子から、ＣＡＳ含有ＶＬＰを調製し得ることを示した。注目すべきことに、ＭＬＶ由来ＧＡＧタンパク質を含むＣＡＳ含有ウイルス由来粒子と、ＨＩＶ１由来ＧＡＧタンパク質を含むＣＡＳ含有ウイルス由来粒子とが実施例に記載されている。両種類のＣＡＳ含有ウイルス由来粒子がターゲット遺伝子を効率的に操作し、例えばターゲット遺伝子を効率的に切断することが本明細書で示されている。

【0036】

さらに、本発明者らは、ＧＡＧ含有ウイルス由来粒子が、in vivoで所望のターゲット配列を効率的に変化させることを示した。例示的には、ＧＡＧ含有ウイルス由来粒子を使用して、生存胚において所望のゲノム変化を誘導し得る（例えば、ゲノム中の所望の位置において切断を誘導し得る）ことが実施例に示されている。生存胚において実施したゲノム変化が、得られた成体哺乳動物中に存在し、次いで、次世代に受け継がれることも本明細書で示されている。

【0037】

主要な遺伝子発現プロセス（例えば、転写及び翻訳）は、ＣＲＩＳＰＲ戦略の主要なターゲットであり得るいくつかの一次細胞サブセットではあまり活性ではなく、したがって、ＤＮＡトランスフェクション及び従来のレンチウイルスベクターのような従来の送達方法の効率を減少させ得ることを考慮すると、本発明者らの知見は特に重要である。

【0038】

これに関して、本発明者らが考案したＣａｓ９－ウイルス由来粒子技術は、ゲノム編集のための、特に、トランスフェクション／トランスダクション手順に不適であり、活性化前に低い代謝を示すリンパ球のような非活性化非分裂一次細胞におけるゲノム編集のための最適なツールであると思われる。

【0039】

さらに、本発明者の結果によれば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰｃの効果は、レシピエントターゲット細胞では一過性であり、本明細書に記載されるウイルス由来粒子とターゲット細胞との接触を介して、ＲＮＰｃの導入後多くとも数時間にわたってその生物学的活性を発揮すると予想される。

【0040】

ターゲット細胞へのＣＲＩＰＳＲ成分の送達が一過性であること、及びこの技術がプラスミドＤＮＡをターゲット細胞に導入しないという事実から、潜在的な毒性が減少し、オフターゲット切断のリスクも減少すると予想される。

【0041】

さらに、この技術がプラスミドＤＮＡをターゲット細胞に導入しないという事実は、外因性ＤＮＡがターゲットゲノムに組み込まれる可能性を回避することを可能にする。

【0042】

例示的には、実施例に示されているように、本明細書に記載されるウイルス由来粒子による脆弱なヒト幹ＣＤ３４^＋細胞又はヒトリンパ球の処理は検出可能な細胞毒性を誘導せず、前記ウイルス由来粒子を大量に注入した後であっても細胞死をもたらさなかった。

【0043】

注目すべきことに、本発明者らは、マウス白血病ウイルスの構造的ＧＡＧタンパク質との融合により、Ｃａｓ９タンパク質がＭＬＶ由来ＶＬＰ又はＨＩＶ－１由来ＶＬＰにパッケージングされるように、キメラＣａｓ９タンパク質を操作した。

【0044】

したがって、この概念は、ＨＩＶ－１由来のＧＡＧポリタンパク質又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のＧＡＧポリタンパク質のような他のウイルス構造タンパク質に容易に拡大された。

【0045】

本明細書に記載されるように生産されたウイルス由来粒子は、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰｃを所望のターゲット細胞に効率的に移入することが示されている。本明細書に記載されるウイルス由来粒子の技術の利用は、前記ウイルス由来粒子をシュードタイピングするために選択され得る多くのウイルスエンベロープを提供するので、特定の特性（指向性、補体抵抗性、ロバスト性）を調製物に付与する。

【0046】

発現カセットへのＣａｓタンパク質及び１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡのコード配列の挿入、特に、発現カセットへのＣａｓ９及び特別設計ｇＲＮＡのコード配列の挿入はまた、外来配列の組み込みに許容的なリコンビナントウイルス（例えば、麻疹株又は特定のインフルエンザ株）の骨格において実施され得る。これは、検討ウイルスに許容的な特定の細胞／組織／器官における活性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰｃの広範な拡散を可能にする。

【0047】

Ｃａｓ９ Streptococcus pyogenesエンドヌクレアーゼの利用の他に、本明細書に記載される技術は、他の生物由来のＣａｓタンパク質（あるいは、これは構造的ウイルスタンパク質に融合され得る）に容易に拡大される。本明細書に記載されるウイルス由来粒子によって成長中のＣａｓ９誘導体コホートを送達して、１本のＤＮＡ鎖のみの切断、転写の活性化及び正確なゲノムローカスの標識などの多種多様なゲノム変化を達成し得る。O’Connell et al. (2014, Nature, Vol. 516: 263-266)（これは、トランスに提供される小さいＤＮＡ配列（ＰＡＭｍｅｒ）を伴う技術である）に記載されているように、本明細書に記載される技術はまた、細胞内ｍＲＮＡをターゲティングしてそれらの切断を誘導するために、ＣａｓベースのＣＲＩＳＰＲ戦略、特にＣａｓ９ベースのＣＲＩＳＰＲ戦略を可能にする。本明細書に記載されるウイルス由来粒子技術は、実施例に記載されているｆｌａｇｉｎｇ－ＤＤＸ３戦略のモデルにおいて、粒子とｓｓＤＮＡ ＰＡＭｍｅｒとの単純な組み合わせによって、このＲＮＡターゲティングアプローチに適合され得る（本明細書の図１０も参照のこと）。

【0048】

本明細書に記載されるウイルス由来粒子をそれらの産生後にｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡと組み合わせる可能性は、様々な核酸操作目的のための工業的開発及び迅速かつ低コストなカスタマイズの点で広範な可能性を提供する。また、別の技術的文脈でAbe et al. (1998, J Virol, Vol. 72: 6356-6361)に記載されているように、エンベロープ又はタンパク質／核酸カーゴが異なるウイルス由来ナノ粒子は、混合物として組み合わせた場合にはトランス相補性であり得ることに留意すべきである。

【0049】

本発明のウイルス由来粒子を組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲ効果をターゲット細胞に移す複数の方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。これらの様々な実施態様のいくつかは、本明細書の図１１に示されている。予備データは、これらのウイルス由来粒子及びベシクルを調製し、別の技術的文脈でMangeot et al. (2011, Mol Ther J Am Soc Gene Ther, Vol. 19: 1956-1666)に教示されているように使用する場合、Ｃａｓタンパク質、特にＣａｓ９タンパク質を含むウイルス由来粒子と、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡを組み込んだベシクルとを組み合わせることができ、Ｃａｓ含有ウイルス由来粒子とｇＲＮＡ含有ベシクルとの得られた混合物によって処理した細胞では、ＣＲＩＳＰＲ作用が効率的であることを示している。ＣＲＩＳＰＲ成分を異なる種類の粒子に隔離する機会は、工業的観点から非常に興味深いものであり得、所望の核酸変化を発生するための多用途な技術的解決策を提供する。

【0050】

本明細書に記載されるＣａｓ含有ウイルス由来粒子、特にＣａｓ９含有ウイルス由来粒子は、ｇＲＮＡの非存在下で大量に容易に生産され得、慎重に投与される品質コントロールされたＶＬＰバッチを得ることができる。その後、特定のｇＲＮＡ又は特定の修復テンプレート又はその両方によって系を相補するために、これらのＣａｓ９－ＶＬＰは、注文に応じてｇＲＮＡ含有ベシクル及び／又はターゲット核酸含有ベシクルと組み合わされ得る。

【0051】

本明細で詳細に例証されているように、本明細書に記載されるＣａｓ含有ウイルス由来粒子技術は、ＣＲＩＳＰＲコミュニティに新たな可能性を提供し、特に、困難な細胞型をターゲティングする利用可能なツールボックスをアップグレードし、in/ex vivo遺伝子治療のためのＣＲＩＳＰＲベースの革新的な治療アプローチを探求する。

【0052】

したがって、本発明者らは、（ｉ）ウイルス構造タンパク質と（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質との切断可能な融合タンパク質を発現するパッケージング細胞を考案することによって、前記Ｃａｓタンパク質をウイルス由来粒子に成功裏にパッケージングした。したがって、本発明は、１つ以上のＣａｓタンパク質を含むウイルス由来粒子に関する。

【0053】

本明細書で使用されるウイルス由来粒子は、会合して粒子コア（その後、これは膜で包まれる）を形成するウイルス構造タンパク質の集合により形成される粒子を意味する（このウイルス由来粒子は、目的の核酸又はタンパク質をコードするいかなる核酸も含有しない）。したがって、発現核酸をトランスダクション細胞に送達するために設計された当技術分野で公知のウイルス由来粒子の大部分とは対照的に、本明細書に記載されるウイルス由来粒子は、タンパク質及び場合により非コード核酸（すなわち、少なくともＣａｓタンパク質）をトランスダクション細胞に送達するために設計される。本明細書に詳細に記載されているように、本発明のウイルス由来粒子はまた、１つ以上の非コード核酸（この非コード核酸は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ及びターゲティング核酸を包含する）を含有し得る。明確性のために、本明細書に記載されるウイルス由来粒子は、それらを生産するために使用される細胞に由来する微量のコード核酸、例えば、前記産生細胞に由来する微量のｍＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡを含有し得ることが起こり得る。いくつかの場面ではウイルス由来粒子内に存在し得る少量のコード核酸は、一般に、受動的にカプセル化される。しかしながら、本明細書全体を通して詳細に記載されているように、本明細書に記載されるウイルス由来粒子は、目的の任意のコード核酸の輸送に特化したものでは全くないが、対照的に、これらのウイルス由来粒子は、タンパク質（主に、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性を有する１つ以上のタンパク質）及びいくつかの実施態様ではさらに目的の非コード核酸（すなわち（ｉ）１つ以上のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ及び／又は１つ以上のターゲティング核酸）の輸送のみに特化したものであることを明確に理解すべきである。

【0054】

本明細書の実施例に示されているように、（ｉ）ウイルス構造タンパク質と（ｉｉ）前記Ｃａｓタンパク質との前記切断可能な融合タンパク質は、パッケージング細胞によって産生されるウイルス由来粒子に成功裏に組み込まれ、得られたウイルス由来粒子は、ターゲット細胞ゲノムを変化させるために、部位特異的ゲノムＤＮＡ切断及びいくつかの実施態様ではさらに相同組換えによる核酸挿入を介してＣａｓタンパク質をターゲット細胞に成功裏に送達する。本明細書の実施例に示されているように、前記融合タンパク質はウイルス由来粒子の形成に寄与し、そこで、それはウイルス構造タンパク質と会合する。

【0055】

特に、本発明者らは、１つ以上のＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡと組み合わせてこれらのウイルス由来粒子を使用することによって、特に、前記粒子内に前記１つ以上のＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをさらに含有するウイルス由来粒子を使用することによって、ゲノム変化の成功が達成されることを示した。

【0056】

実施例に示されているように、本明細書に記載されるウイルス由来粒子は、in vitro及びin vivoの両方で様々な遺伝子を破壊又は欠失して、前記様々な遺伝子がノックアウトされた生物を作製するために成功裏に使用された。

【0057】

また、実施例に示されているように、本明細書に記載されるウイルス由来粒子は、目的の核酸をターゲット細胞のゲノムにターゲット挿入して、ノックイン生物を作製するために成功裏に使用された。

【0058】

本明細書で実験的に例証されているように、本発明者らは、Ｃａｓ９タンパク質とマウス白血病ウイルスのＧＡＧタンパク質とを融合させ、この構築物を使用して、Ｃａｓ９活性をレシピエント細胞に送達する機能的Ｃａｓ９ロードウイルス由来粒子を生産した。

【0059】

本明細書でさらに実験的に例証されているように、本発明者らは、Ｃａｓ９タンパク質とＨＩＶ－１のＧＡＧタンパク質とを融合させ、この構築物を使用して、Ｃａｓ９活性をレシピエント細胞に送達する機能的Ｃａｓ９ロードウイルス由来粒子を生産した。

【0060】

また、ガイドＲＮＡをウイルス由来粒子に成功裏に組み込んで、完全に活性なＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰｃをウイルス様粒子内に作り出すこともでき、これがレシピエント細胞に伝播され得ることが本明細書の実施例に示されている。本発明者らの実験結果は、これらのＣａｓ含有ウイルス由来粒子の高い効率を例証している。これらのウイルス由来粒子は、明らかな毒性を伴わずに、ＣＲＩＳＰＲを異なる細胞型（初代細胞を含む）に完全に送達することができる。ヒト（ｈＭｙｄ８８）遺伝子を切断する前記ウイルス由来粒子によって単純処理したヒトナイーブリンパ球では、ゲノムターゲット核酸の切断効率は著しく１００％に近い。

【0061】

本発明は、１つ以上のＣａｓタンパク質を含むウイルス由来粒子に関する。本明細書に記載されるウイルス由来粒子の様々な実施態様は、図１１に示されている。

【0062】

ウイルス由来粒子
本明細書で使用されるウイルス由来粒子は、１つ以上のウイルス由来タンパク質によって形成されるウイルス様粒子からなり、このウイルス由来粒子は、目的の核酸若しくはタンパク質をコードするいかなる核酸も実質的に欠くか、又はあるいは、目的の核酸若しくはタンパク質をコードするいかなる核酸も欠く。注目すべきことに、本発明のウイルス由来粒子は、目的のウイルス核酸若しくはウイルスタンパク質をコードするいかなる核酸も実質的に欠くか、又はあるいは、目的のウイルス核酸若しくはウイルスタンパク質をコードするいかなる核酸も欠く。本発明のウイルス由来粒子は、複製不能である。

【0063】

ウイルス由来粒子
限定されないが、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）；アデノウイルス；ヘルペスウイルス；レンチウイルス及びレトロウイルスを含む遺伝子治療に適切な任意のウイルスが使用され得る。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はｒｈ１０を含む群において選択され得、このＡＡＶは、ヒト被験体における使用に特に適切である。

【0064】

目的のコード核酸を一般に含有するウイルスベクター粒子を生産するための当技術分野で公知の一般的な方法もまた、目的のコード核酸を含有しない本発明のウイルス由来粒子を生産するために使用され得る。

【0065】

従来のウイルスベクター粒子は、当技術分野で周知のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスベクター粒子を包含する。使用され得る様々なウイルスベクター粒子の総説について、当業者は、Kushnir et al. (2012, Vaccine, Vol. 31: 58-83), Zeltons (2013, Mol Biotechnol, Vol. 53: 92-107)、Ludwig et al. (2007, Curr Opin Biotechnol, Vol. 18(n°6): 537-55)及びNaskalaska et al. (2015, Vol. 64 (n°1): 3-13)を特に参照し得る。さらに、当業者は、タンパク質を細胞に送達するためにウイルス由来粒子を使用する様々な方法への言及をMaetzigらの論文(2012, Current Gene therapy, Vol. 12: 389-409)及びKaczmarczykらの論文(2011, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 108 (n° 41): 16998-17003)に見出す。

【0066】

一般に、本発明にしたがって使用されるウイルス由来粒子（このウイルス由来粒子は、「ウイルス様粒子」又は「ＶＬＰ」とも称され得る）は、１つ以上のウイルス由来構造タンパク質及び／又は１つ以上の（one more）ウイルス由来エンベロープタンパク質によって形成される。

【0067】

本発明にしたがって使用されるウイルス由来粒子は、それが侵入した宿主細胞において複製不能である。

【0068】

好ましい実施態様では、ウイルス由来粒子は、１つ以上のレトロウイルス由来構造タンパク質及び場合により１つ以上のウイルス由来エンベロープタンパク質によって形成される。

【0069】

好ましい実施態様では、ウイルス由来構造タンパク質は、レトロウイルスｇａｇタンパク質又はそのペプチドフラグメントである。当技術分野で公知のように、Ｇａｇ及びＧａｇ／ｐｏｌ前駆体は、ポリタンパク質（これは、レトロウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）によって媒介されるタンパク質分解切断を必要とする）として全長ゲノムＲＮＡから発現されて、機能的コンフォメーションを獲得する。さらに、Ｇａｇ（これは、レトロウイルス間で構造的に保存されている）は、少なくとも３つのタンパク質ユニット（マトリックスタンパク質（ＭＡ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）及びヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）から構成されるのに対して、Ｐｏｌは、レトロウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）、レトロトランスクリプターゼ（ＲＴ）及びインテグラーゼ（ＩＮ）からなる。

【0070】

いくつかの実施態様では、ウイルス由来粒子は、レトロウイルスＧａｇタンパク質を含むが、Ｐｏｌタンパク質を含まない。

【0071】

当技術分野で公知のように、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターの宿主範囲は、シュードタイピングとして公知のプロセスによってエクスパンション又は変化され得る。シュードタイプレンチウイルスベクターは、他のエンベロープウイルス由来の糖タンパク質を有するウイルスベクター粒子からなる。このようなシュードタイプウイルスベクター粒子は、糖タンパク質が由来するウイルスの指向性を有する。

【0072】

いくつかの実施態様では、ウイルス由来粒子は、特定の真核細胞に対する指向性を前記ウイルス由来粒子に付与する１つ以上のウイルス構造タンパク質又はウイルスエンベロープタンパク質を含むシュードタイプウイルス由来粒子である。本明細書に記載されるシュードタイプウイルス由来粒子は、シュードタイピングに使用されるウイルスタンパク質として、ＶＳＶ－Ｇタンパク質、麻疹ウイルスＨＡタンパク質、麻疹ウイルスＦタンパク質、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、モロニーウイルスＭＬＶ－Ａタンパク質、モロニーウイルスＭＬＶ－Ｅタンパク質、ヒヒ内因性レトロウイルス（ＢＡＥＶ）エンベロープタンパク質、エボラウイルス糖タンパク質及び泡沫状ウイルスエンベロープタンパク質、又はこれらのウイルスエンベロープタンパク質の２つ以上の組み合わせを含む群において選択されるウイルスエンベロープタンパク質を含み得る。

【0073】

ウイルスベクター粒子のシュードタイピングに関する周知の例は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）によるウイルスベクター粒子のシュードタイピングからなる。ウイルスベクター粒子のシュードタイピングについて、当業者は、Yee et al. (1994, ProcNatl Acad Sci, USA, Vol. 91: 9564-9568) Cronin et al. (2005, Curr Gene Ther, Vol. 5(n°4): 387-398)を特に参照し得る。

【0074】

目的のタンパク質をターゲット細胞に送達するためのウイルス由来粒子、より正確にはＶＳＶ－Ｇシュードタイプウイルス由来粒子の生産について、当業者は、Mangeot et al. (2011, Molecular Therapy, Vol. 19 (n°9): 1656-1666)を参照し得る。

【0075】

いくつかの好ましい実施態様では、本発明のウイルス由来粒子をシュードタイピングするために使用されるＶＳＶ－Ｇタンパク質は、配列番号：２８の配列を含む核酸によってコードされ得る配列番号：２３のアミノ酸配列を有する。

【0076】

いくつかの好ましい実施態様では、本発明のウイルス由来粒子をシュードタイピングするために使用されるＢＡＥＶ－Ｇ（ＢＡＥＶ）タンパク質は、配列番号：２７の配列を含む核酸によってコードされ得る配列番号：２５のアミノ酸配列を有する。

【0077】

したがって、いくつかの実施態様では、ウイルス由来粒子は、ウイルスエンベロープタンパク質をさらに含み、（ｉ）前記ウイルスエンベロープタンパク質は、ウイルス構造タンパク質と同じウイルスに由来し（例えば、ウイルスＧａｇタンパク質と同じウイルスに由来し）、又は（ｉｉ）前記ウイルスエンベロープタンパク質は、ウイルス構造タンパク質が由来するウイルスとは異なるウイルスに由来する（例えば、ウイルスＧａｇタンパク質が由来するウイルスとは異なるウイルスに由来する）。

【0078】

当業者によって容易に理解されるように、本発明にしたがって使用されるウイルス由来粒子は、モロニーマウス白血病ウイルス由来ベクター粒子、ウシ免疫不全ウイルス由来粒子、サル免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ネコ免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ヒト免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ウマ感染貧血ウイルス由来ベクター粒子、ヤギ関節炎脳炎ウイルス由来ベクター粒子、ヒヒ内因性ウイルス由来ベクター粒子、狂犬病ウイルス由来ベクター粒子、インフルエンザウイルス由来ベクター粒子、ノロウイルス由来ベクター粒子、呼吸器合胞体ウイルス由来ベクター粒子、Ａ型肝炎ウイルス由来ベクター粒子、Ｂ型肝炎ウイルス由来ベクター粒子、Ｅ型肝炎ウイルス由来ベクター粒子、ニューカッスル病ウイルス由来ベクター粒子、ノーウォークウイルス由来ベクター粒子、パルボウイルス由来ベクター粒子、パピローマウイルス由来ベクター粒子、酵母レトロトランスポゾン由来ベクター粒子、麻疹ウイルス由来ベクター粒子及びバクテリオファージ由来ベクター粒子を含む群において選択され得る。

【0079】

特に、本発明にしたがって使用されるウイルス由来粒子は、レトロウイルス由来粒子である。このようなレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス由来ベクター粒子、ウシ免疫不全ウイルス由来粒子、サル免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ネコ免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ヒト免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ウマ感染貧血ウイルス由来ベクター粒子及びヤギ関節炎脳炎ウイルス由来ベクター粒子の中から選択され得る。

【0080】

別の実施態様では、本発明にしたがって使用されるウイルス由来粒子は、レンチウイルス由来粒子である。レンチウイルスはレトロウイルス科に属し、非分裂細胞に感染することができるというユニークな能力を有する。

【0081】

このようなレンチウイルスは、ウシ免疫不全ウイルス由来粒子、サル免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ネコ免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ヒト免疫不全ウイルス由来ベクター粒子、ウマ感染貧血ウイルス由来ベクター粒子及びヤギ関節炎脳炎ウイルス由来ベクター粒子の中から選択され得る。

【0082】

モロニーマウス白血病ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Sharma et al. (1997, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 94: 10803+-10808)、Guibingua et al. (2002, Molecular Therapy, Vol. 5(n°5): 538-546)に開示されている方法を特に参照し得る。モロニーマウス白血病ウイルス由来（ＭＬＶ由来）ベクター粒子は、ＭＬＶ－Ａ由来ベクター粒子及びＭＬＶ－Ｅ由来ベクター粒子を含む群において選択され得る。

【0083】

ウシ免疫不全ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Rasmussen et al. (1990, Virology, Vol. 178(n°2): 435-451)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0084】

ＶＳＶ－ＧシュードタイプＳＩＶウイルス由来粒子を含むサル免疫不全ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Mangeot et al. (2000, Journal of Virology, Vol. 71(n°18): 8307-8315)、Negre et al. (2000, Gene Therapy, Vol. 7: 1613-1623) Mangeot et al. (2004, Nucleic Acids Research, Vol. 32 (n° 12), e102)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0085】

ネコ免疫不全ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Saenz et al. (2012, Cold Spring Harb Protoc, (1): 71-76; 2012, Cold Spring Harb Protoc, (1): 124-125; 2012, Cold Spring Harb Protoc, (1): 118-123)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0086】

ヒト免疫不全ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Jalaguier et al. (2011, PlosOne, Vol. 6(n°11), e28314)、Cervera et al. (J Biotechnol, Vol. 166(n°4): 152-165)、Tang et al. (2012, Journal of Virology, Vol. 86(n°14): 7662-7676)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0087】

ウマ感染貧血ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Olsen (1998, Gene Ther, Vol. 5(n°11): 1481-1487)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0088】

ヤギ関節炎脳炎ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Mselli-Lakhal ety al. (2006, J Virol Methods, Vol. 136(n°1-2): 177-184)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0089】

ヒヒ内因性ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Girard-Gagnepain et al. (2014, Blood, Vol. 124(n°8): 1221-1231)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0090】

狂犬病ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Kang et al. (2015, Viruses, Vol. 7: 1134-1152, doi:10.3390/v7031134)、Fontana et al. (2014, Vaccine, Vol. 32(n°24): 2799-27804)又はＷＯ２０１２／０６１８で公開されたＰＣＴ出願に開示されている方法を特に参照し得る。

【0091】

インフルエンザウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Quan et al. (2012, Virology, Vol. 430: 127-135)及びLatham et al. (2001, Journal of Virology, Vol. 75(n°13),: 6154-6155)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0092】

ノロウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Tome-Amat et al., (2014, Microbial Cell Factories, Vol. 13: 134-142)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0093】

呼吸器合胞体ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Walpita et al. (2015, PlosOne, DOI:10.1371/journal.pone.0130755)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0094】

Ｂ型肝炎ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Hong et al. (2013, Vol. 87(n°12): 6615-6624)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0095】

Ｅ型肝炎ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Li et al. (1997, Journal of Virology, Vol. 71(n°10): 7207-7213)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0096】

ニューカッスル病ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Murawski et al. (2010, Journal of Virology, Vol. 84(n°2): 1110-1123)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0097】

ノーウォークウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Herbst-Kralovetz et al. (2010, Expert Rev Vaccines, Vol. 9(n°3): 299-307)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0098】

パルボウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Ogasawara et al. (2006, In Vivo, Vol. 20: 319-324)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0099】

パピローマウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Ogasawara et al. (2006, In Vivo, Vol. 20: 319-324)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0100】

酵母レトロトランスポゾン由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Peifang et al. (1994, Clin Exp Immunol, Vol. 97(n°3): 361-366)又は米国特許第６，０６０，０６４号に開示されている方法を参照し得る。

【0101】

麻疹ウイルス由来ベクター粒子の調製について、当業者は、Brandler et al. (2008, Vol. 31(n°2-3): 271-291)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0102】

バクテリオファージ由来ベクター粒子、特にＱ－βウイルス様粒子の調製について、当業者は、Brown et al. (2009, Biochemistry, Vol. 48(n°47): 11155-11157)に開示されている方法を特に参照し得る。

【0103】

本明細書で使用されるウイルス由来粒子は、Ｇａｇタンパク質を含み、最も好ましくは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、モロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２）を含む群において選択されるウイルス、特に１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）に由来するＧａｇタンパク質を含む。

【0104】

いくつかの実施態様では、ウイルス由来粒子はまた、１つ以上のウイルスエンベロープタンパク質を含み得る。当技術分野で公知のように、１つ以上のウイルスエンベロープタンパク質の存在は、ターゲティングされる細胞に対するより特異的な指向性を前記ウイルス由来粒子に付与し得る。１つ以上のウイルスエンベロープタンパク質は、レトロウイルス由来エンベロープタンパク質、非レトロウイルスウイルス由来エンベロープタンパク質、及びこれらのウイルスエンベロープタンパク質と他のペプチド又はタンパク質とのキメラを含む群において選択され得る。目的の非レンチウイルスエンベロープ糖タンパク質の例は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）株ＷＥ５４エンベロープ糖タンパク質である。これらのエンベロープ糖タンパク質は、レトロウイルス由来ベクターでトランスダクションされ得る細胞の範囲を増加させる。

【0105】

いくつかの好ましい実施態様では、ウイルス由来粒子は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）及びモロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）を含む群において選択されるウイルスに由来するＧａｇタンパク質を含む。

【0106】

いくつかの好ましい実施態様では、本明細書で使用されるウイルス由来粒子は、シュードタイピングウイルスエンベロープタンパク質、最も好ましくはＶＳＶ－Ｇタンパク質をさらに含む。

【0107】

Ｃａｓタンパク質
ウイルス由来粒子は、Ｃａｓタンパク質を含む。前記Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型Ｃａｓタンパク質、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質及びＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質を含む群において選択され得る。

【0108】

Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質の使用について、当業者は、Chylinski et al. (2014, Nucleic Acids Research, Vol. 42(n°10): 6091-6105)、Sinkunas et al. (2011, The EMBO Journal, Vol. 30(n°7): 1335-1342)、Aliyari et al. (2009, Immunological Reviews, Vol. 227(n°1): 176-188)、Cass et al. (Biosci Rep, doi:10.1042/BSR20150043)、Makarova et al. (2011, Biology Direct, Vol. 6: 38)、Gasiunas et al. (2012, Proc NatlAcad Sci USA, Vol. 109(n°39): E2579-E2586)、Heler et al. (2015, Nature, Vol. 519(n°7542): 199-202)、Esvelt et al. (2013, Nat Methods, Vol. 10(n°11): doi :10.138/nmeth.2681)又はChylinski et al. (2013, Biology, Vol. 10(n°5): 726-737)を参照し得る。

【0109】

いくつかの実施態様では、ＣＡＳタンパク質は、Zeische et al. (2015, Cell, http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038, in Press)に開示されているＣｐｆ１という名称のＩＩ型Ｃａｓタンパク質からなり得る。

【0110】

好ましくは、ウイルス由来タンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質を含む。ＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、最も好ましくはＣａｓ９タンパク質である。

【0111】

最も好ましくは、本明細書に記載されるウイルス由来粒子内に含まれるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質又はその相同体若しくは誘導体である。Ｃａｓ９タンパク質は、Streptococcus thermophilusに由来するＣａｓ９タンパク質及びStreptococcus pyogenesに由来するＣａｓ９タンパク質、又はその相同体若しくはその誘導体を含む群において選択され得る。Streptococcus thermophilusに由来するＣａｓ９タンパク質は、Gasiunas et al. (2012, Proc NatlAcad Sci USA, Vol. 109(n°39): E2579-E2586)に特に記載されている。Streptococcus pyogenesに由来するＣａｓ９タンパク質は、Heler et al. (2015, Nature, Vol. 519(n°7542): 199-202)及びSanjana et al. (2014, Nat Methods, Vol. 11(n°18): 783-784)に特に記載されている。

【0112】

本発明にしたがって使用され得るＣａｓ９タンパク質は、天然に存在するＣａｓ９タンパク質、例えばCong et al. (2013, Science, Vol. 339: 819-823)に記載されているＣａｓ９タンパク質の相同体、変異体又は誘導体であるタンパク質を包含する。

【0113】

Ｃａｓ９タンパク質及びＣａｓ９タンパク質をコードするベクターは、Sigma-Aldrich Companyから市販されている。本明細書に記載されるウイルス由来粒子において使用され得るＣａｓ９タンパク質及びその変異体はまた、ＷＯ２０１３／１６３６２８、ＷＯ２０１４／０９３５９５、ＷＯ２０１５／０８９２４７及びＷＯ２０１５／０８９４８６で公開されたＰＣＴ出願に記載されている。

【0114】

いくつかの実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、それらの形成中にウイルス由来粒子に組み込まれるように産生される。例示的には、Ｃａｓ９は、ウイルス由来粒子産生細胞に含まれる発現ベクターに挿入された核酸配列によってコードされ得る。好ましい実施態様では、Ｃａｓ９コード核酸は、産生細胞におけるその過剰発現を可能にする調節配列のコントロール下に配置される。いくつかの実施態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号：３２の核酸配列によってコードされる配列番号：３１のタンパク質からなる。

【0115】

本明細書に記載されるウイルス由来粒子のいくつかの実施態様では、Ｃａｓタンパク質は、（ｉ）ウイルス構造タンパク質と（ｉｉ）前記Ｃａｓタンパク質との融合タンパク質として、前記ウイルス由来粒子内で産生及び統合される。これらの実施態様のいくつかでは、Ｃａｓタンパク質は、ＧＡＧ－Ｃａｓ９融合タンパク質として、前記ウイルス由来粒子内で産生及び統合される。本発明者らによって確認されたように、このような融合タンパク質は、得られるウイルス由来粒子内に成功裏に統合され、Ｃａｓ部分は完全に活性である（すなわち、Ｃａｓ部分は、そのエンドヌクレアーゼ活性を有する）。これらの実施態様によれば、埋伏されたＣａｓタンパク質は、ウイルス由来粒子の侵入後にターゲット細胞内に放出される。

【0116】

他の実施態様では、ウイルス由来粒子に含まれるＣａｓタンパク質は、最初に、（ｉ）ウイルス構造タンパク質と（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質との切断可能な融合タンパク質として産生される。このような切断可能な融合タンパク質の例示は、本明細書の実施例に記載されている切断可能なＧＡＧ－Ｃａｓ９タンパク質である。これらの他の実施態様によれば、前記切断可能な融合タンパク質は、産生細胞によるその産生時点で、得られるウイルス由来粒子内に統合される。次いで、前記融合タンパク質の一部又は全部が最終ウイルス由来粒子中で切断されて、（ｉ）前記切断可能な融合タンパク質が切断されていないウイルス由来粒子の一部と、（ｉｉ）前記切断可能な融合タンパク質の少なくとも一部が切断されて、Ｃａｓタンパク質部分がウイルス由来粒子内に放出されたウイルス由来粒子の一部と、（ｉｉｉ）前記切断可能な融合タンパク質の全部又はほぼ全部が切断されて、Ｃａｓタンパク質部分の全部又はほぼ全部がウイルス由来粒子内に放出されたウイルス由来粒子の一部とを含むウイルス由来粒子の集団がもたらされ得る。いくつかの好ましい実施態様では、切断可能なＧＡＧ－Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号：２６の配列によってコードされ得る配列番号：２２のアミノ酸配列を有するＧＡＧ－Ｃａｓ９タンパク質である。他の実施態様では、それは、配列番号：３４の核酸配列によってコードされる切断可能なＧＡＧ－Ｃａｓ９タンパク質として使用され得る（本明細書では「ＫＬＡＰ２２９」と称され得る）。

【0117】

したがって、本発明にしたがって使用され得るウイルス由来粒子では、Ｃａｓタンパク質、典型的にはＣａｓ９タンパク質は、（ｉ）切断不可能な融合タンパク質、典型的には切断不可能なＧａｇ－Ｃａｓ９融合タンパク質として、（ｉｉ）切断可能な融合タンパク質、典型的には切断可能なＧａｇ－Ｃａｓ９融合タンパク質として、（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質、典型的には前記融合タンパク質のタンパク質分解切断から生じるＣａｓ９タンパク質として、又は（ｉｖ）融合タンパク質及びＣａｓタンパク質の両方として存在し得る。本明細書で使用されるウイルス由来粒子は、（ｉ）ウイルス構造タンパク質と（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質とのタンパク質、典型的には切断可能なＧａｇ－Ｃａｓ９融合タンパク質を特に発現するパッケージング細胞において産生され、これは、（ｉ）ウイルス構造タンパク質と（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質との切断可能な融合タンパク質、典型的には切断可能なＧａｇ－Ｃａｓ９融合タンパク質を包含することを理解すべきである。本明細書の実施例に示されているように、切断可能な融合タンパク質は、ウイルス由来粒子にそのまま組み込まれ、次いで、ウイルス由来粒子中で少なくとも部分的に切断されて、ウイルス由来粒子中で機能的なＣａｓタンパク質が放出される。しかしながら、Ｃａｓタンパク質は、最初に、前記切断可能な融合タンパク質の形態でウイルス由来粒子に組み込まれるので、Ｃａｓタンパク質が切断可能な融合タンパク質の形態で部分的に存在し、切断可能な融合タンパク質の切断から生じる遊離Ｃａｓタンパク質として部分的に存在する多くの中間状態が存在する。

【0118】

好ましい実施態様では、融合タンパク質は、ウイルス構造タンパク質部分とＣａｓタンパク質部分との間に、典型的にはＧａｇタンパク質部分とＣａｓ９タンパク質部分との間に位置するタンパク質分解切断部位を含む。プロテアーゼ部位とも称され得るタンパク質分解部位は、当業者に周知である。切断可能な融合タンパク質に含まれ得るプロテアーゼ部位は、トリプシン（ＥＣ３．４．２１．４）、キモトリプシン（ＥＣ３．４．２１．１）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ Ｃ（ＥＣ３．４．２１．１９）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ（ＥＣ３．４．２１．５０）、ペプシン（ＥＣ３．４．２３．１）、エラスターゼ（ＥＣ３．４．２１．３６）及びカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．１）を含む群において選択されるプロテアーゼによって切断可能な部位であり得る。

【0119】

いくつかの実施態様では、プロテアーゼ切断部位は、配列番号：３０を含む配列によってコードされ得るアミノ酸配列ＳＳＬＹＰＡＬＴＰ（配列番号：２９）を含む群において選択される。

【0120】

Ｇａｇと目的のタンパク質とのプロテアーゼ切断可能な融合タンパク質、及びこのような融合タンパク質を発現させるためのベクターは、当業者が参照し得るVoelkel et al. (2010, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 107(n°17): 7805-7810)に特に記載されている。

【0121】

本明細書の実施例に記載されているように、いくつかの実施態様のウイルス由来粒子は、Ｇａｇ－Ｐｒｏ－Ｐｏｌウイルスタンパク質を発現するパッケージング細胞において形成される。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本発明者らは、これらの実施態様では、Ｐｒｏタンパク質（すなわち、ウイルスプロテアーゼ）がウイルス由来粒子中に放出され、融合タンパク質、典型的にはＧａｇ Ｃａｓ融合タンパク質、特にＧａｇ－Ｃａｓ９融合タンパク質を切断して、遊離Ｃａｓタンパク質、特に遊離Ｃａｓ９タンパク質が生成されると考える。いくつかの好ましい実施態様では、Ｇａｇ－Ｐｒｏ－Ｐｏｌタンパク質は、配列番号：２４のアミノ酸配列を有する。

【0122】

しかしながら、本明細書の実施例でも例証されているように、ウイルス由来粒子がいかなるウイルスプロテアーゼも欠く実施態様では、例えば、ウイルス構造タンパク質（例えば、Ｇａｇ）及び場合により１つ以上のウイルスエンベロープタンパク質（例えば、ＶＳＶ－Ｇ及び／又はＢＡＥＶ－Ｇ）を発現するパッケージング細胞中でウイルス由来粒子が形成される場合、機能的Ｃａｓタンパク質、典型的には機能的Ｃａｓ９タンパク質は、ターゲット細胞中に放出される。

【0123】

ガイドＲＮＡ
ターゲット核酸において部位特異的変化を発生させるために、本明細書に記載されるウイルス由来粒子を使用する場合、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡが必要とされる。

【0124】

「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」とも称され得るＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡの数は、探索されるターゲット核酸に対する変化の種類に応じて変動し得る。ターゲット核酸において単一のＤＮＡ切断事象を発生させるために、単一ガイドＲＮＡが、ウイルス由来粒子と組み合わせて使用され得る。ターゲット核酸において２つ以上の切断事象を発生させるために、又はあるいは複数のターゲット核酸において切断事象を発生させるために、２つ以上のガイドＲＮＡが、ウイルス由来粒子と組み合わせて使用され得る。

【0125】

Ｃａｓタンパク質と組み合わせるとターゲット核酸の切断を発生させるガイドＲＮＡを設計するための方法は、当業者に周知である。当技術分野で周知のように、ガイドＲＮＡは、ターゲット核酸と十分な相補性を有するポリヌクレオチドであって、前記ターゲット核酸とハイブリダイゼーションして、前記ターゲット核酸に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するポリヌクレオチドである。

【0126】

ガイドＲＮＡを設計するために、様々なツールが当業者に容易に利用可能であり、Company GenScript (United States)によってGenCRISPR（商標）gRNA constructsという名称で販売されているツールが挙げられる。GenCRISPR（商標）gRNA constructs collectionは、ヒトゲノム中の各遺伝子 約２０，０００個を特異的にターゲティングする約６つのガイドＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡはまた、Ran et al. (2013, Cell, Vol. 154: 1380-1389)、Mail et al. (2013, Science, Vol. 339: 823-826)、Wang et al. (2013, Cell, Vol. 153: 910-918)、Jao et al. (2013, Proc Natl Acad Sic USA, Vol. 110: 13904-13909)、Cong et al. (2013, Science, Vol. 339: 819-823)、Shalem et al. (2014, Science, Vol. 343: 84-87)、Maeder et al. (2013, Nat Methods; Vol. 10: 977-979)、Qi et al. (2013, Cell, Vol. 152: 1173-1183)、Farboud et al. (2015, Genetics, doi 10.1534/genetics.115.175166)又はMa et al. (2013, BioMed research International, Vol. 2013, Article ID 270805, doi.org/10.1155/2013/270805)の教示にしたがって設計され得る。

【0127】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるウイルス由来粒子は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡをさらに含む。各ガイドＲＮＡは、ターゲット核酸に含まれる特定のターゲット配列とハイブリダイゼーションする。

【0128】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるウイルス由来粒子は、単一ガイドＲＮＡを含む。ウイルス由来粒子のこのような実施態様は、ターゲット核酸の所望の位置において単一切断を発生させることを可能にする。

【0129】

いくつかの他の実施態様では、本明細書に記載されるウイルス由来粒子は、２つの異なるガイドＲＮＡを含み、各ガイドＲＮＡは、同じターゲット核酸に含まれる特定のターゲット配列とハイブリダイゼーションして、２つの異なる各ガイドＲＮＡによって認識される部位において２つの切断事象を発生させる。このような実施態様は、ターゲット核酸内の２つの切断部位によってフレーミングされたポリヌクレオチドの欠失を導入することを可能にする。目的のテンプレート核酸がさらに追加される場合、このような実施態様は、核酸ターゲット中の目的の所望の外因性核酸をこれら２つの切断部位間に挿入することを可能にする。

【0130】

いくつかの好ましい実施態様では、１つ以上のガイドＲＮＡが、ウイルス由来粒子内に含まれる。典型的には、ウイルス由来粒子は、（ｉ）必要なウイルス構造タンパク質（例えば、Ｇａｇ）、（ｉｉ）１つ以上のウイルスエンベロープタンパク質（例えば、ＶＳＶ－Ｇ及び／又はＢＡＥＶ－Ｇ）、（ｉｉｉ）Ｃａｓ融合タンパク質（例えば、Ｇａｇ－Ｃａｓ９融合タンパク質）及び（ｉｖ）１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡを発現するパッケージング細胞によって産生される。これらの実施態様によれば、１つ以上のガイドＲＮＡがウイルス由来粒子内に組み込まれるが、これらはパッケージング細胞によって産生される。ウイルス由来粒子がＣａｓタンパク質、特にＣａｓ９タンパク質及び１つ以上のガイドＲＮＡを含むこれらの実施態様では、前記ウイルス由来粒子は、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡとの複合体であるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓリボヌクレオタンパク質複合体を含む。

【0131】

これらの実施態様のいくつかによれば、前記ウイルス由来粒子は、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡとの１種類以上の複合体を含み、各ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、単一ガイドＲＮＡと複合体形成した単一Ｃａｓタンパク質を含む。ターゲット核酸の複数の切断が要求されるこれらの実施態様のいくつかでは、前記ウイルス由来粒子は、同じ数のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体種を含み、各種類のＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓ複合体は、対応するガイドＲＮＡがハイブリダイゼーションするターゲット核酸の所望の位置においてＤＮＡ切断を発生させるために特異的である。

【0132】

さらに好ましい実施態様では、１つ以上のガイドＲＮＡは、最初に、前記１つ以上のガイドＲＮＡを発現する特定のパッケージング細胞であって、他のウイルス粒子又は他のウイルスベシクル（又は他のウイルス様粒子又はＶＬＰ）の産生に必要なウイルスタンパク質も発現する特定のパッケージング細胞によって産生される。次いで、ガイドＲＮＡ含有ウイルス粒子は、Ｃａｓタンパク質を含むウイルス由来粒子と接触して、Ｃａｓタンパク質と、前記他のウイルス粒子に最初に含まれていた１つ以上のガイドＲＮＡとの両方を含む最終ウイルス由来粒子が相補によって生成される。相補によるこれらのウイルス由来粒子の取得について、当業者は、Abe et al. (1998, Journal of Virology, Vol. 72(n°8): 6356-6361)を特に参照し得る。例示的には、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質を含むＧａｇベースのウイルス由来粒子は、１つ以上のＣＲＳＩＰＳ－ＣａｓガイドＲＮＡを含むＶＳＶ－Ｇベースのウイルス粒子と接触して、前記Ｃａｓタンパク質と、前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡとを含む最終ウイルス由来粒子であって、ＧａｇベースのＶＳＶ－ＧシュードタイプＶＬＰからなる最終ウイルス由来粒子が得られ得る。

【0133】

いくつかの他の実施態様では、前記１つ以上のガイドＲＮＡの全部の一部（part of all）はウイルス由来粒子内に含まれないが、代わりに、これらのウイルス由来粒子と複合体形成する。これらの他の実施態様によれば、ウイルス由来粒子と複合体形成したガイドＲＮＡもまた、これらのガイドＲＮＡが複合体形成したウイルス由来粒子と共にターゲット細胞に侵入する。

【0134】

ターゲティング核酸
本明細書に記載されるウイルス由来粒子を使用することによってターゲット核酸を変化させる目的のために、特に、相同組換えによるターゲット核酸の変化が要求される場合、これらのウイルス様粒子と組み合わせてターゲティング核酸をさらに使用する。

【0135】

相同組換えによってそれらの配列を変化させる目的で核酸をターゲティングするための方法は、当業者に周知である。典型的には、相同修復ドナー核酸は、（ｉ）ターゲットゲノム配列の第１のローカスに相同な第１の配列、及び（ｉｉ）ゲノム配列の第２のローカスに相同な第２の配列を含む。一般に、相同組換えによってターゲット核酸を変化させる目的のために、前記第１の配列（ｉ）及び前記第２の配列（ｉｉ）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体によって作り出される切断部位の両側に位置する。

【0136】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用することによって相同組換えを介してターゲット核酸の変化を実施するための方法は、当技術分野で周知である。当業者は、Jinek et al. (2013, eLife, Vol.2: e00471, doi: 10.754/eLife.00471)及びLin et al. (2014, eLife, Vol. 3: e04766, DOI:10.7554/eLife.04766)を特に参照し得る。

【0137】

典型的には、相同組換えテンプレート核酸（これは、本明細書ではテンプレート核酸とも称され得る）は、それぞれその５’末端及び３’末端において、ターゲット核酸にハイブリダイゼーションする配列に隣接する可変長の外因性配列を含む。ゲノムに挿入される外因性配列が５０ｎｔ長未満である場合、相同組換えアームとも称される隣接ハイブリダイゼーション配列は、２０～５０ヌクレオチド長の範囲であるべきである。挿入すべき外因性配列が１００ｎｔ超である場合、相同組換えアームは、かなり長いもの（約８００ｂｐ）であるべきである。

【0138】

ターゲティング核酸又はテンプレート核酸は、任意の適切な長さ、例えば約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００ヌクレオチド長又はそれ以上を有し得る。最適にアライメントされた場合、ターゲティング核酸は、ターゲット配列の１個以上のヌクレオチド、例えば約１個超、５個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上のヌクレオチドと重複し得る。

【0139】

当業者の一般的な知識に基づいて、相同組換えの目的でターゲティング核酸を設計するための事実上唯一の要件は、ターゲット核酸の核酸配列に関する予備知識である。

【0140】

いくつかの実施態様では、ターゲティング核酸は、本明細書に記載されるウイルス由来粒子内に含まれる。これらの実施態様によれば、Ｃａｓタンパク質と、１つ以上のガイドＲＮＡと、１つ以上のターゲティング核酸とを含むウイルス由来粒子は、好ましくは、前記Ｃａｓタンパク質と、必要なウイルスタンパク質と、必要なガイドＲＮＡと、必要なターゲティング核酸とを発現するパッケージング細胞によって産生される。

【0141】

いくつかの他の実施態様では、ターゲティング核酸は、ウイルス由来粒子内に含まれないが、ウイルス由来粒子と複合体形成する。

【0142】

核酸発現ベクター
本明細書の他の箇所で既に述べられているように、本明細書に記載されるウイルス由来粒子は、必要なタンパク質（すなわち、少なくとも融合ウイルス構造タンパク質／Ｃａｓタンパク質及びウイルス粒子（これは、ウイルス様粒子又はＶＬＰとも称され得る）を形成するために必要な１つ以上のタンパク質）を発現する細胞（本明細書では、パッケージング細胞とも呼ばれる）中で産生される。好ましい実施態様では、パッケージング細胞はまた、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡ及び必要に応じてさらにターゲティング核酸（テンプレート核酸とも称される）を発現する。

【0143】

本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列と、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸配列とを含有するリコンビナントＤＮＡ分子を指す。真核細胞における発現に必要な核酸配列は、一般に、プロモーターと、エンハンサーと、終結シグナル及びポリアデニル化シグナルとを含む。いくつかの実施態様では、「発現ベクター」は、ウイルスエンベロープタンパク質のシュードタイピングを可能にするために使用される。

【0144】

一般に、必要なタンパク質又は核酸を発現させるためのベクターは、パッケージング細胞として使用される所望の宿主細胞内で核酸配列を発現させるために適切なベクターである。好ましくは、パッケージング細胞は、哺乳動物細胞である。特に、必要なタンパク質又は核酸を発現させるためのベクターは、それらの発現が要求されるパッケージング細胞において機能的な調節エレメントのコントロール下に配置されたオープンリーディングフレームを含む。特に、これらのベクターは、発現させるべき各タンパク質又は核酸について、適切なプロモーター配列のコントロール下に配置されたオープンリーディングフレーム及びポリアデニル化配列を含む。

【0145】

パッケージング細胞株は、粒子集合に必要なウイルスタンパク質を提供する（Markowitz et al., 1988, J. Virol., Vol. 62 :1120）。

【0146】

当技術分野で周知のように、核酸ベクターは、様々な技術（例えば、リン酸カルシウム共沈、リポフェクション、エレクトロポレーション）のいずれかによってパッケージング細胞に導入される。パッケージング細胞によって産生されるウイルスタンパク質は、ウイルス由来粒子へのウイルスタンパク質及びＣａｓタンパク質の挿入を媒介し、次いで、これらが培養上清に放出される。

【0147】

使用される核酸ベクターは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）に由来し得る。本明細書に記載されるウイルス由来粒子を生産するために適切なレトロウイルスベクターは、（１）パッケージングベクター及びエンベロープベクターを宿主細胞にトランスフェクションして、パッケージングベクターＲＮＡを本質的に含まないウイルス由来粒子を産生するパッケージング細胞株を形成すること、並びに（２）Ｃａｓタンパク質及び場合によりさらにＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをウイルス由来粒子にパッケージングし、最終的にはターゲティング核酸をウイルス由来粒子にパッケージングすることを可能にする。

【0148】

本発明にしたがって使用するためのベクター及びパッケージング細胞は、本明細書の実施例で例証されている。

【0149】

例示的には、ウイルス構造タンパク質／Ｃａｓタンパク質、例えばＧａｇ－Ｃａｓ９タンパク質を発現させるためのベクターは、Voelkel et al. (2010, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 107: 7805-7810)に教示されているように当業者によって調製され得る。

【0150】

例示的には、ウイルス構造タンパク質、例えばＧａｇタンパク質又はＧａｇ－Ｐｒｏ－Ｐｏｌ融合タンパク質及び場合によりさらにウイルスエンベロープタンパク質、例えばＶＳＶ－Ｇタンパク質又はＢＡＥＶ－Ｇタンパク質を発現させるためのベクターは、Negre et al. (2000, Gene Ther, Vol. 7: 1613-1623)及びYee et al. (1994, Methids Cell Biol, Vol. 43 PtA: 99-112)の教示にしたがって当業者によって調製され得る。

【0151】

例示的には、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを発現させるためのベクターは、Kieusseian et al. (2006, Blood, Vol. 107: 492-500)に教示されているように調製され得る。

【0152】

パッケージング細胞
宿主細胞は、目的のベクターが導入されてそれが複製され得る細胞であり、発現ベクターの場合には、１つ以上のベクターに基づく遺伝子が発現され得る細胞である。

【0153】

当技術分野で公知の任意の適切な許容細胞又はパッケージング細胞は、本明細書に記載されるウイルス由来粒子の生産において用いられ得る。哺乳動物細胞又は昆虫細胞が好ましい。本発明の実施においてウイルス由来粒子の生産に有用な細胞の例としては、例えば、ヒト細胞株、例えばＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｂ－５０又は任意の他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７及びＨＴ１０８０細胞株が挙げられる。

【0154】

パッケージング細胞として使用するための例示的な細胞株は、昆虫細胞株である。ＡＡＶの複製を可能にする任意の昆虫細胞であって、培養で維持され得る任意の昆虫細胞が、本発明にしたがって使用され得る。例としては、Spodoptera frugiperda、例えばＳｆ９又はＳｆ２１細胞株、Drosophila種細胞株又は蚊細胞株、例えばAedes albopictus由来細胞株が挙げられる。好ましい昆虫細胞株は、Spodoptera frugiperda Ｓｆ９細胞株である。異種ポリペプチドの発現のための昆虫細胞の使用、核酸をこのような細胞に導入する方法、及び培養でこのような細胞を維持する方法に関する教示について、以下の参考文献が本明細書に組み込まれる：Methods in Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995 ); O’Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994 ); Samulski et al., J. Vir. 63:3822-8 (1989 ); Kajigaya et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991 ); Ruffing et al., J. Vir. 66:6922-30 (1992 ); Kimbauer et al., Vir. 219:37-44 (1996 ); Zhao et al., Vir. 272:382-93 (2000 );及びSamulski et al., U.S. Pat. No. 6,204,059。

【0155】

既に組み込まれた前述の機能のいずれか１つ以上を有する細胞、例えば、染色体外に組み込まれた若しくは細胞の染色体ＤＮＡに統合された１つ以上のベクター機能を有する細胞株、染色体外に組み込まれた若しくは細胞の染色体ＤＮＡに統合された１つ以上のパッケージング機能を有する細胞株、又は染色体外に組み込まれた若しくは細胞の染色体ＤＮＡに統合されたヘルパー機能を有する細胞株が供給され得る。パッケージング細胞株は、１つ以上の核酸ベクターによってトランスフェクションされた適切な宿主細胞であって、達成可能な条件下で、Ｃａｓタンパク質及びいくつかの実施態様ではさらに１つ以上のＣＲＩＰＳＲガイドＲＮＡ及び最終的にはさらにターゲティング核酸を含むウイルス由来粒子を産生する適切な宿主細胞である。

【0156】

本明細書で使用される「パッケージング細胞株」という用語は、典型的には、ウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を発現するが、パッケージングシグナルを含有しない細胞株に関して使用される。例えば、細胞株は、そのゲノム内の１つの染色体部位において、機能的ｐｓｉ＋配列を欠く５’－ＬＴＲ－ｇａｇ－ｐｏｌ－３’－ＬＴＲフラグメント（Δ－ｐｓｉと呼ばれる）を有し、別の染色体部位において５’－ＬＴＲ－ｅｎｖ－３’－ＬＴＲフラグメント（これもΔ－ｐｓｉである）を有するように遺伝子操作されている。

【0157】

以下のものを包含するいくつかの細胞型が使用され得る：
ａ）臨床用途において、リコンビナントレトロウイルスを産生するパッケージング細胞として現在広く使用されているＮＩＨ－３Ｔ３マウス細胞（Takahara et al., Journal of Virology, (June 1992), 66 (6) 3725-32）。
ｂ）ＮＩＨ－３Ｔ３ ＴＫ細胞を含むＴＫ^－細胞株は既に記載されている（F. Wagner et al., EMBO Journal (1985), Vol. 4 (n°3): 663-666）；これらの細胞は、ＨＡＴなどの選択培地で培養すると死滅し得る。キナーゼチミジン機能（例えば、ＨＳＶ１－ＴＫウイルス由来のもの）についてそれらが相補されると、それらは選択培地中で成長し得る；したがって、このような株は、選択遺伝子としてＨＳＶ１－ＴＫ遺伝子を使用する可能性を提供する。ＨＳＶ１のチミジンキナーゼ又はその機能誘導体の１つをコードする遺伝子はまた、ガンシクロビル又はアシクロビルを細胞にとって細胞毒性の薬物にトランスフォーメーションするプロドラッグとしての導入遺伝子として広く使用されているので、それは、例えばガン性細胞の選択的細胞破壊に適用され得る（例えば、国際公開公報第９５／２２６１７号を参照のこと）。

【0158】

例示的には、パッケージング細胞は、本明細書の実施例に示されているように、周知のＨＥＫ２９３Ｔ細胞株であり得る。

【0159】

本発明はまた、本明細書に記載されるウイルス粒子を生産するための細胞株であって、
－前記ウイルス由来粒子を形成するために必要なタンパク質をコードする１つ以上の核酸、及び
－ウイルス構造タンパク質－Ｃａｓ融合タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸
を含む細胞株に関する。

【0160】

いくつかの実施態様では、前記ウイルス由来粒子を形成するために必要なタンパク質をコードする核酸は、Ｇａｇタンパク質などのウイルス構造タンパク質をコードする核酸を包含する。

【0161】

いくつかの実施態様では、前記細胞株はまた、ウイルスエンベロープタンパク質、例えばＶＳＶ－Ｇタンパク質及びＢＡＥＶ－Ｇタンパク質を含む群において選択されるウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む。

【0162】

いくつかの実施態様では、前記細胞株は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードする核酸をさらに含む。

【0163】

いくつかの実施態様では、前記細胞株は、１つ以上のターゲティング核酸をコードする核酸をさらに含む。

【0164】

組成物及びキット
本発明は、本明細書に記載される治療（in vivo又はin vivo）において使用するために適切なウイルス由来粒子組成物及びキットを提供する。

【0165】

いくつかの実施態様では、前記組成物は、Ｃａｓタンパク質、特にＣａｓ９タンパク質を含むウイルス由来粒子を含み、ガイドＲＮＡ及びターゲティング核酸を欠く。これらの実施態様では、ｇＲＮＡ又はターゲティング核酸は、前記ウイルス由来粒子内にある核酸として、又は前記ウイルス由来粒子と複合体形成した核酸として、ウイルス由来粒子に存在しない。

【0166】

本発明は、真核細胞におけるターゲット核酸を変化させるための組成物であって、少なくとも１つの本明細書に記載されるウイルス由来粒子を含む組成物に関する。

【0167】

いくつかの実施態様では、前記組成物は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをさらに含む。

【0168】

これらの実施態様のいくつかでは、前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡは、ウイルス由来粒子に含まれる。

【0169】

いくつかの他の実施態様では、前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡは、前記ウイルス由来粒子と複合している。

【0170】

組成物のいくつかの実施態様では、前記組成物は、（ｉｉ）ｇＲＮＡ及び／又はターゲティング核酸を含むベシクルと組み合わせて（ｉ）Ｃａｓ含有ウイルス由来粒子を含む。これらの実施態様のいくつかによれば、組成物中に存在する各ｇＲＮＡは、特定の種類のベシクルに含まれる。これらの実施態様のいくつかの他のものによれば、全てのｇＲＮＡを含む１つを超えるｇＲＮＡは、特定の種類のベシクルに含まれる。これらの実施態様のいくつかでは、ターゲティング核酸は、特定の種類のベシクルに含まれる。これらの実施態様のいくつかの他のものでは、１つを超えるターゲティング核酸が組成物中に存在する場合、全てのターゲット核酸は全て、特定の種類のベシクルに含まれる。またさらなる実施態様では、組成物中に存在する全ｇＲＮＡ及びターゲティング核酸は全て、同じベシクルに含まれる。

【0171】

本明細書で使用される「特定の種類」のベシクルは、ベシクルそれ自体の構造的特徴にかかわらず、ｇＲＮＡ及び／又はターゲティング核酸のその特定の内容物に関して一義的に定義される。

【0172】

最も好ましくは、前記ベシクルは、ウイルスタンパク質から構成される。いくつかの実施態様では、前記ベシクルは、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質を含有するウイルス由来粒子と同じウイルスタンパク質の構造的特徴を有する。いくつかの他の実施態様では、前記ベシクルは、例えば、ＶＳＶ－Ｇ又はＢＡＥＶ－Ｇなどのウイルスエンベロープタンパク質から主に又は完全に構成される。

【0173】

本発明の組成物中に存在する場合、ＣＡＳ含有ウイルス由来粒子並びにｇＲＮＡ及び／又はターゲティング核酸含有ベシクルはトランスに相補して、ターゲット細胞において所望の核酸変化を効率的に発生させる。別の技術的文脈におけるこのようなトランス相補性は、Mangeot et al. (2011, Ther J am Soc Gene Ther, Vol. 19: 1656-1666)に教示されている。

【0174】

本明細書に記載される組成物は、それを必要とする哺乳動物（これは、それを必要とする非ヒト哺乳動物及びヒト個体を含む）における遺伝子治療の方法を実施する目的で使用される医薬組成物を包含する。

【0175】

本発明の組成物は、獣医用途のための動物（例えば、家畜、例えばウシ、ブタなど）及び他の非ヒト哺乳動物被験体への、並びにヒト被験体への送達のために製剤化され得る。ウイルス由来粒子は、遺伝子移入及び遺伝子治療用途において使用するための生理学的に許容し得る担体を用いて製剤化され得る。

【0176】

いくつかの実施態様では、前記組成物は、１つ以上のトランスダクションヘルパー化合物をさらに含む。Zuris et al. (2015, Nat Biotechnol, Vol. 33(n°1): 73-80)に特に記載されているように、トランスダクションヘルパー化合物は、好ましくは、カチオン性ポリマーを含む群において選択される。トランスダクションヘルパー化合物は、ポリブレン（これは、臭化ヘキサジメトリンとも称され得る）、硫酸プロタミン、１２－ミリスタート１３－アセタート（ホルボールミリスチン酸アセタート又はＰＭＡとも称され得る）(Johnston et al., 2014, Gene Ther, Vol. 21(12): 1008-1020に記載されている)、vectofusin (Fenard et al., 2013, Molecular Therapy Nucleic Acids, Vol. 2: e90に記載されている)、ポロキサマーＰ３３８(Anastasov et al., 2016, Lentiviral vectors and exosomes as gene and protein delivery tools, in Methods in Molecular Biology, Vol. 1448: 49-61に記載されている)、RetroNectin（登録商標）試薬(Clontech Laboratories Inc.によって市販されている)、Viral Plus（登録商標）トランスダクションエンハンサー(Applied Biological Materials Inc.によって市販されている)、TransPlus（登録商標）ウイルストランスダクションエンハンサー(Clinisciencesによって市販されている)、Lentiboost（登録商標）(Sirion Biotechによって市販されている)又はExpressMag（登録商標）トランスダクションシステム(Sigma-Aldrichによって市販されている)を含む群において選択され得る。本明細書の実施例に示されているように、前記カチオントランスダクションヘルパー化合物は、ポリブレンからなり得る。

【0177】

ウイルス由来粒子は、１つ以上の生理学的に許容し得る担体又は賦形剤を使用して従来の方法で製剤化され得る。ウイルス由来粒子は、注射による、例えばボーラス注射又は持続注入による非経口投与のために製剤化され得る。注射のための製剤は、さらなる保存剤と共に単位剤形で、例えばアンプルで又は複数回投与容器で提示され得る。ウイルス由来粒子組成物は、油性ビヒクル又は水性ビヒクルの懸濁液、溶液又はエマルジョンなどの形態をとり得、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの製剤化剤を含有し得る。ウイルス由来粒子組成物の液体調製物は、薬学的に許容し得る添加剤、例えば懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分画植物油）；及び保存剤（例えば、メチル又はプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾアート又はソルビン酸）を用いて従来の手段によって調製され得る。調製物はまた、緩衝塩を含有し得る。あるいは、組成物は、使用前に適切なビヒクル、例えばパイロジェンフリー滅菌水で構成するための粉末形態であり得る。

【0178】

ターゲット細胞に、ターゲット組織若しくは器官に、又はターゲット生物、特にターゲット哺乳動物（これは、ターゲット非ヒト哺乳動物及びヒト個体を包含する）に含まれるターゲット核酸において所望のゲノム変化を発生させるために、本発明のウイルス由来粒子組成物は、治療有効用量で被験体に投与され得る。治療有効用量は、ターゲット核酸における所望のゲノム変化事象の発生によって引き起こされる症候の改善をもたらすために十分な医薬組成物の量を指す。

【0179】

一実施態様では、本発明のウイルス由来粒子組成物の量は、約０．１～５マイクログラム（μg）／キログラム（kg）の範囲内の用量単位で投与される。この目的のために、体重 ７０kgの平均的な被験体を処置するために処置するために、本発明のウイルス由来粒子組成物は、約７mg～約３５０mgの範囲内の用量で製剤化され得る。投与され得る本発明のウイルス由来粒子組成物の量は、０．１mg/kg、０．２mg/kg、０．３mg/kg、０．４mg/kg、０．５mg/kg、０．６mg/kg、０．７mg/kg、０．８mg/kg、０．９mg/kg、１．０mg/kg、１．５mg/kg、２．０mg/kg、２．５mg/kg、３．０mg/kg、３．５mg/kg、４．０mg/kg、４．５mg/kg又は５．０mg/kgを含む群において選択され得る。特に体重 ７０kgの平均的な被験体を処置するために、組成物の単位投与量中のウイルス由来粒子の用量は、７mg、８mg、９mg、１０mg、２０mg、２５mg、３０mg、３５mg、４０mg、４５mg、５０mg、５５mg、６０mg、６５mg、７０mg、７５mg、８０mg、８５mg、９０mg、９５mg、１００mg、１２５mg、１５０mg、１７５mg、２００mg、２２５mg、２５０mg、２７５mg、３００mg、３２５mg、３５０mg、３７５mg、４００mg、４２５mg、４５０mg、４７５mg、５００mg、５２５mg、５５０mg、５７５mg、６００mg、６２５mg、６５０mg、６７５mg、７００mg、７２５mg又は７５０mgを含む群において選択され得る。これらの用量は、１回又は反復、例えば毎日、隔日、毎週、隔週又は毎月投与され得る。いくつかの実施態様では、ウイルス由来粒子組成物は、１回用量で、又は２回用量で、又は３回用量で、又は４回用量で、又は５回用量で、又は６回用量若しくはそれ以上で被験体に投与され得る。投与量間の間隔は、その必要性があるという開業医の決定に基づいて決定され得る。

【0180】

ウイルス由来粒子組成物は、所望により、有効成分を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得るパック又はディスペンサーデバイスで提示され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属又はプラスチックホイルを含み得る。パック又はディスペンサーデバイスは、投与説明書を伴い得る。

【0181】

ウイルス由来粒子組成物は、液体又は固体（例えば、凍結乾燥）形態であり得る。

【0182】

キット
本発明はさらに、本明細書に記載されるウイルス由来粒子を調製するためのキットに関する。

【0183】

本発明は、真核細胞におけるターゲット核酸を変化させるためのウイルス由来粒子を調製するためのキットであって、
－ＧＡＧ－Ｃａｓ融合タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸、及び
－ウイルス様集合タンパク質をコードする１つ以上の発現カセットを含む核酸
を含むキットに関する。

【0184】

いくつかの実施態様では、前記キットは、シュードタイピングウイルスエンベロープタンパク質をコードする発現カセットを含む核酸をさらに含む。

【0185】

前記キットのいくつかの実施態様では、ウイルス由来集合タンパク質は、ウイルス由来Ｇａｇタンパク質である。

【0186】

いくつかの実施態様では、前記Ｇａｇタンパク質は、ＧＡＧ－ＰＲＯ－ＰＯＬポリタンパク質をコードする発現カセット、及びＧＡＧタンパク質をコードする発現カセットを含む群において選択される発現カセットによってコードされる。

【0187】

いくつかの実施態様では、前記キットは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸をさらに含む。

【0188】

前記キットの特定の実施態様では、前記核酸は、前記真核細胞へのそのトランスフェクションの結果として真核細胞において局在する。これらの実施態様のいくつかでは、前記核酸は、前記真核細胞（これらの細胞は、本明細書ではパッケージング細胞とも称され得る）において核酸ベクターの形態である。これらの実施態様のいくつかの他のものでは、これらの核酸の一部又は全部は、これらの真核細胞（これらの細胞は、本明細書ではパッケージング細胞とも称され得る）のゲノムに統合される。

【0189】

したがって、本発明のキットのいくつかの実施態様では、前記真核細胞は、パッケージング細胞株からなる。

【0190】

本発明のキットは、場合により、それに含まれる個々の各組成物又はエレメントのための異なる容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ又はボトル）を含み得る。キットは、個々の成分の製剤化のためのさらなる試薬、例えばバッファー、希釈剤などを含有し得る。各成分は、一般に、その各容器に分注されるものとして、又は濃縮形態で提供されるものとして適切であろう。

【0191】

本明細書に記載される方法にしたがってキットを使用するための説明書が含まれ得る。説明資料は、卵母細胞の品質を評価するためのキットにおいて本発明の方法の有用性を伝えるために使用され得る刊行物、記録、ダイアグラム又は任意の他の表現媒体を含み得る。添付文書は、任意の物理的媒体、例えば紙、厚紙、フィルムに収容されたテキストを含み得るか、又は電子媒体、例えばディスケット、チップ、メモリスティック若しくは他の電子記憶形式に収容され得る。本発明のキットの説明資料は、例えば、キットの他の内容物を含有する容器に添付され得るか、又はキットを含有する容器と一緒に発送され得る。あるいは、受取人が説明資料及びキットの内容物を協調的に使用することを意図して、説明資料は、容器とは別個に発送され得る。

【0192】

ターゲット核酸を変化させるための方法
ウイルス由来粒子及びそれらを含む組成物は、遺伝子治療のために使用され得る。

【0193】

本発明のさらなる態様は、本発明のウイルス由来粒子で、又はそれらを含む組成物で被験体を処置する方法である。

【0194】

ヒト被験体又はそれを必要とする動物へのウイルス由来粒子の投与は、ウイルスベクターを投与するための当技術分野で公知の任意の手段によるものであり得る。

【0195】

例示的な投与様式としては、直腸、経粘膜、局所、経皮、吸入、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内及び関節内）投与など、及び直接組織又は器官注射あるいはくも膜下、直接筋肉内、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内又は眼内注射が挙げられる。注射剤は、液体溶液若しくは懸濁液、注射前の液体の溶液若しくは懸濁液に適切な固体形態として、又はエマルジョンとして、従来の形態で調製され得る。あるいは、例えばデポー又は徐放性製剤で、ウイルスを全身的ではなく局所的に投与し得る。

【0196】

本発明はまた、真核細胞における少なくともターゲット配列を含むターゲット核酸を変化させるための方法であって、
ａ）前記真核細胞と、本明細書に記載されるウイルス由来粒子、又は本明細書に記載される組成物とを接触させる工程、及び
ｂ）変化したターゲット核酸を有する前記真核細胞を収集する工程
を含む方法に関する。

【0197】

いくつかの実施態様では、ウイルス由来粒子又はそれらを含む組成物は、in vivoで被験体に直接投与される。いくつかの他の実施態様では、被験体の細胞を提供し、次いで、ウイルス由来粒子又はそれらを含む組成物をin vitroで前記細胞にトランスダクションする。さらなる方法工程では、トランスダクションした被験体の細胞を被験体の体に投与して戻す。

【0198】

いくつかの実施態様では、前記方法は、in vitro又はex vivoで実施される。

【0199】

本発明はまた、遺伝子治療に適した任意の疾患又は障害を予防又は治療するために使用するための、本明細書に記載される組成物に関する。

【0200】

本発明は、遺伝子治療に適した任意の疾患又は障害を予防又は治療するための方法を提供する。一実施態様では、「処置」又は「処置する」は、疾患若しくは障害又はそれらの少なくとも１つの識別可能な症候の改善を指す。別の実施態様では、「処置」又は「処置する」は、被験体によって必ずしも識別可能ではない疾患又は障害に関連する少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。さらに別の実施態様では、「処置」又は「処置する」は、疾患又は障害の進行を物理的に阻害すること、例えば識別可能な症候の安定化、例えば物理的パラメータの安定化を生理学的に阻害すること、又はその両方を指す。ガン、免疫障害及び獣医学的症状を含む他の症状も処置され得る。

【0201】

本発明の方法によって処置され得る疾患及び障害の種類としては、限定されないが、加齢性黄斑変性症；糖尿病性網膜症；例えば、ＨＩＶ汎発性インフルエンザ、カテゴリー１及び２の生物兵器作用物質、又は任意の新興ウイルス感染症；自己免疫疾患；ガン；多発性骨髄腫；糖尿病；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；Ｃ型肝炎；多発性硬化症；アルツハイマー病；パーキンソン病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病；癲癇；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；関節炎症、関節炎；心筋梗塞（ＭＩ）；鬱血性心不全（ＣＨＦ）；血友病Ａ；又は血友病Ｂが挙げられる。

【0202】

本発明の方法によって治療又は予防され得る感染性疾患は、限定されないが、ウイルス、細菌、真菌、原虫、蠕虫及び寄生虫を含む感染因子によって引き起こされる。本発明は、細胞内病原体によって引き起こされる感染性疾患の治療又は予防に限定されない。多くの医学的に関連する微生物が文献に広範に記載されており、例えば、C. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983（これらの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと。

【0203】

本発明の方法によって治療又は予防され得るガンの種類としては、限定されないが、ヒト肉腫及びガン腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、膵臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、腺ガン、汗腺ガン、皮脂腺ガン、乳頭ガン、乳頭腺ガン、嚢胞腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン腫、腎細胞ガン、肝ガン、胆管ガン、絨毛ガン、セミノーマ、胎児性ガン、ウィルムス腫瘍、子宮頸ガン、精巣腫瘍、肺ガン、小細胞肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば急性リンパ球性白血病及び急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）；及び真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症並びに重鎖疾患が挙げられる。

【0204】

本発明をさらに例証するが、以下の実施例に決して限定されない。

【実施例】

【0205】

Ａ．材料及び方法
Ａ．１．構築物
（Voelkel et al., 2010）に記載されているように、ＧＡＧ－Ｃａｓ９コードプラスミドを設計した。テンプレートとしてｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド４９５３）を使用して、Streptococcus pyogenes由来のｆｌａｇ－Ｃａｓ９のコドン最適化配列をＰＣＲ増幅した。この最後の構築物は、F. Zhang laboratory (Shalem et al., 2014, Science, Vol. 343: 84-87)からの寄贈であった。次に、ｆｌａｇ－Ｃａｓ９をマウス白血病ウイルスＧＡＧ配列（ＭＡ－ＣＡ－ＮＣ）の下流に挿入した。ポリタンパク質を生成するように、フレームをハーモナイゼーションした。ウイルス成熟プロセス中にＧＡＧからｆｌａｇ－Ｃａｓ９を放出するＭＬＶ－プロテアーゼ切断部位によって、両部分を分離した。イントロン及びポリＡシグナル（これらは両方とも、ウサギβ－グロビンｍＲＮＡに由来する）を備えるｈＣＭＶプロモーターのコントロール下で、このキメラタンパク質を発現させた。ＭＬＶのＧａｇＰｒｏＰｏｌポリタンパク質をコードする発現プラスミド（Negre et al., 2000, Gene Ther, Vol. 7: 1613-1623）及びＶＳＶＧコードプラスミド（Yee et al., 1994, Methods Cell Biol, Vol. 43 PtA: 99-112）は、他の箇所に記載されているものであった。

【0206】

＜＜ＣＲＩＺＩ＞＞と称されるｇＲＮＡコードプラスミドは、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲプラスミド由来のＵ６カセットが挿入された以前に記載されているレンチウイルス構築物（Kieusseian et al., 2006, Blood, Vol. 107: 492-500）に由来する。著者らによって記載されている手順にしたがって、Ｕ６プロモーターの上流のＢｓｍＢＩ部位間において、ＣＲＩＺＩへのＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列のクローニングを実施した。Crispseekソフトウェア（潜在的なオフターゲット＞３ミスマッチ）（Zhu et al., 2014, PloS One, Vol. 9: e108424）を使用して、本研究で使用したｇＲＮＡの配列を設計した。各ｇＲＮＡについて、プライマー配列を示す：

【表1】

【表2】

【表3】

【0207】

Ａ．２．ＶＬＰの生産
Ｃａｓ９－ＶＬＰは、特定の遺伝子をターゲティングするいくつかのｇＲＮＡの１つを組み込んだＶＬＰの調製物として言及される。ＶＬＰの調製は、いくつかのプラスミドのコトランスフェクションを必要とする。製造業者の説明書にしたがってJetPei (Polyplus)を使用してLenti-X（商標）293T (Clontech)のトランスフェクションによって、ＶＬＰを生産した。JetPrimeトランスフェクション剤（Polyplus）又はリン酸カルシウム法（CalPhos mammalian kit, Clontech）も同様に使用し得る。

【0208】

JetPeiトランスフェクションレシピで混合したプラスミドの古典的な比は、ＧＡＧ－Ｃａｓ９（２０％）、ＧａｇＰｒｏＰｏｌ（２０％）、ＶＳＶ－Ｇ又は他のエンベロープ（２０％）及びｇＲＮＡをコードする構築物（４０％）である。

【0209】

Ｃａｓ９Ｍｙｄ８８ＶＬＰのために、２つの異なるｇＲＮＡをレシピに導入して、新生ＶＬＰへの両ＲＮＡ種の同時パッケージングを達成した。トランスフェクションの２４時間前に細胞 ３×１０ｅ６個／１０cmプレートでプレーティングしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、以下のものを含有する混合物をトランスフェクションした：
－Ｒ１：ＧＡＧ－Ｃａｓ９ ４μg、ＧａｇＰｒｏＰｏｌ ４μg、ＶＳＶＧ ２μg、ＢａＥＶエンベロープ（Girard-Gagnepain et al., 2014） ２μg、Ｍｙｄ８８－ｇＲＮＡ１コードプラスミド ２μg、Ｍｙｄ８８－ｇＲＮＡ２コードプラスミド ２μg。
－Ｒ２：ＧＡＧ－Ｃａｓ９ ６μg、ＧａｇＰｒｏＰｏｌ ６μg、ＶＳＶＧ ４μg、Ｍｙｄ８８－ｇＲＮＡ１コードプラスミド ４μg、Ｍｙｄ８８－ｇＲＮＡ２コードプラスミド ４μg。
－Ｒ３：ＧＡＧ－Ｃａｓ９ ４μg、ＧａｇＰｒｏＰｏｌ ８μg、ＶＳＶＧ ２μg、ＢａＥＶエンベロープ ２μg、Ｍｙｄ８８－ｇＲＮＡ１コードプラスミド ２μg、Ｍｙｄ８８－ｇＲＮＡ２コードプラスミド ２μg。
－Ｒ４：ＧＡＧ－Ｃａｓ９ ４～６μg、ＶＳＶＧ ２μg、ＢａＥＶエンベロープ ２μg、Ｍｙｄ８８－ｇＲＮＡ１コードプラスミド ５μg、Ｍｙｄ８８－ｇＲＮＡ２コードプラスミド ５μg。

【0210】

トランスフェクションの４０時間後、ＶＬＰ含有上清を収集し、短時間の遠心分離（２０００ｇ、３分間）によって清澄化した。清澄化したＣａｓ９－ＹＦＰＶＬＰを直接使用して、Ｌ９２９細胞をトランスダクションした。SW41ローターによって３５０００rpmで１時間超遠心分離することによってＣａｓ９－ｈ－ｈ／ｍＭｙｄ８８ＶＬＰ及びＣａｓ９－ＤＤＸ３ＶＬＰをペレット化し、穏やかに撹拌して氷冷ＰＢＳに一晩再懸濁した。上清 １０mlを濃縮して、濃縮ＶＬＰの冷ＰＢＳ溶液 １００μlを生産した（濃縮倍率：１００倍）。濃縮ＶＬＰバッチを－８０℃で保存し、解凍後に４℃で少なくとも２週間安定であることが示された。遠心分離／トランスダクションの前に、０．４５μmサイズの細孔フィルタを用いて、ＶＬＰ含有上清のろ過を実施することができる。

【0211】

Ａ．３．Ｃａｓ９－ＶＬＰを使用したプロテオトランスダクション手順
６ウェルプレート中、清澄化ＶＬＰ含有上清 ４００μlを培地 ４００μlに追加することによって、Ｃａｓ９－ＹＦＰＶＬＰをＬ９２９－ＹＦＰ細胞 ３×１０ｅ５個にトランスダクションした。２時間後、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ ２mlを培地に補充した。

【0212】

４８ウェルプレート中、１００×ＶＬＰ ５～２０μlを培地 ３００μlに追加することによって、一次細胞のトランスダクションを通常通りに実施した。２時間後、新鮮培養培地 ０．５mlをこのトランスダクション培地に補充した。トランスダクション培地中で４μg/mlの最終濃度で使用した場合、ポリブレンの追加は、プロテオトランスダクションの可能性を持たせることが示された。

【0213】

Ａ．４．ＰＣＲベースの遺伝子型決定アッセイ
製造業者の説明書にしたがってNucleospin Tissue Kit (Machery Nagel)を使用して、ＶＬＰによって処理した細胞のゲノムＤＮＡ抽出を達成した。ＶＬＰ処理の２４～４８時間後にＤＮＡ調製を実施したが、さらなる実験は、ＨＥＫ２９３Ｔレシピエント細胞では、ＶＬＰ曝露の６時間後直ぐに切断が完了していたことを示している。

【0214】

GOTAQポリメラーゼ(Promega)を使用して、Ｍｙｄ８８のＰＣＲ増幅を５０μlで実施した。以下のようなＰＣＲ反応のためのテンプレートとして、細胞ゲノムＤＮＡ １００ngを使用した：９４℃で５分間、（９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間）を３サイクル、（９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）を３サイクル、（９４℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）を２７サイクル、７２℃で５分間、１２℃。エチジウムブロマイド染色２，５％アガロースゲルで、ＰＣＲアンプリコン分析した。

【0215】

Ａ．５．遺伝子型決定分析に使用したプライマー（５’－ＮＮＮ－３’）：

【表4】

【表5】

【0216】

Ａ．６．Ｃａｓ９－ＤＤＸ３ＶＬＰとｓｓＤＮＡとの組み合わせ
８μg/mlのポリブレンを含有するＰＢＳ １０μl中で、濃縮Ｃａｓ９－ＤＤＸ３ＶＬＰ １５μlを混合した。次に、Ｆｌａｇ－ＤＤＸ３プライマーの各希釈物 ５μlをこの混合物に補充したところ、最良の結果は、より高濃度（１００pmol/μlのプライマー ５μl）で得られた。この「オールインワン」複合体を４℃で１５分間インキュベーションし、１２ウェルプレート中で培養したＨＥＫ２９３Ｔ（前日にプレーティングした細胞 ２０００００個）の培地（４００μl＋ポリブレン ４μg/ml）に３０μlを追加した。２時間後、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ １mlをトランスダクション培地に補充した。ＶＬＰ処理の４０時間後、ＤＤＸ３遺伝子の上流のｆｌａｇ配列の遺伝子挿入の増幅及び分析のために細胞を分割し、７２時間後にＷＢ分析を実施した。

【0217】

Ａ．７．Ｆｌａｇ－ＤＤＸ３プライマーの配列（ＨＰＬＣ精製）：

【表6】

【0218】

実施例１：Ｃａｓ９－ＹＦＰＶＬＰによるＹＦＰ遺伝子の切断
ウイルス構造の分子操作は、目的のタンパク質を組み込み得るウイルス／ＶＬＰの作製を可能にする。多数の例の中でも、感染の容易なモニタリングを可能にする蛍光遺伝子を組み込んだＨＩＶ－１クローン（Dale et al., 2011, Methods San Diego Calif, Vol. 53: 20-26）、動物におけるワクチン接種目的に有用なウイルスエピトープを有するＶＬＰ（Garrone et al., 2011, Sci Transl Med, Vol. 3: 94ra71）、又はタンパク質性機能的カーゴをレシピエント細胞に送達するために使用されるＶＬＰ（Voelkel et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 107: 7805-7810）、（Mangeot et al., 2011, Mol Ther J Am Soc Gene Ther, Vol. 19: 1656-1666）の設計が挙げられ得る。効率的なＣａｓ９－ＶＬＰの生産を達成するために、以前に記載されているように（Voelkel et al., 2010、前掲）、Ｃａｓ９をマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）の構造ＧＡＧタンパク質に融合した。基本的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてウイルスプロテアーゼ（Ｐｒｏ）及びエンベロープと共にこのキメラタンパク質を発現させると、Ｃａｓ９部分がウイルスコアに組み込まれたＶＬＰが産生されると予想され、Ｃａｓ９は、ウイルスプロテアーゼによってＧＡＧプラットフォームから切断される。

【0219】

ｇＲＮＡに対するＣａｓ９の親和性を考慮して、本発明者らはさらに、ＶＬＰ産生細胞におけるｇＲＮＡの発現が、ＣＲＩＳＰＲ機構の全ての成分を運搬することができる粒子内へのそれらの組み込みを可能にするために十分であり得ると仮定した。これらの仮説をチェックするために、本発明者らは、ＹＦＰ遺伝子をターゲティングするようにｇＲＮＡ発現プラスミドを設計し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されたＣａｓ９－ＶＬＰにｇＲＮＡを組み込むことを試みた。このアプローチ及び使用した構築物を要約した概要は、図１に示されている。次に、安定型のＹＦＰを発現するマウスＬ９２９細胞の培地にＶＬＰ含有上清を導入し、次に、surveyorアッセイによって蛍光遺伝子の切断を調査した。図２に示されている結果は、Ｃａｓ９－ＶＬＰがＣＲＩＳＰＲ機構を送達し、組み込まれたｇＲＮＡによって規定される予想位置においてＹＦＰ遺伝子の切断を可能にしたことを示している。この遺伝子の破壊は、ＹＦＰリーディングフレームの予想される破裂に起因する、処理集団における蛍光の劇的かつ不可逆的な消失に関連していた（図３）。これらの所見により、ＣＲＩＳＰＲ成分の強力な送達剤としてのＣａｓ９－ＶＬＰの使用が立証された。

【0220】

実施例２：ＨＥＫ２９３Ｔ及びＨｅｌａレシピエント細胞におけるＭｙｄ８８遺伝子の破壊
ｈＭｙｄ８８遺伝子の欠失を媒介するために、本発明者らはさらに、いくつかのｇＲＮＡを組み込むＶＬＰの能力を調べた。Ｍｙｄ８８は、核因子の転写を活性化するほとんどのＴＬＲのシグナルを伝達する重要なアダプタータンパク質であり、特定の条件下でマクロファージの生存に特に関与する（Lombardo et al., 2007, J Immunol Baltim Md 1950, Vol. 178: 3731-3739）。ヒトＭｙｄ８８遺伝子における２つの異なる切断を媒介して内因性遺伝子の欠失をもたらすように、２つのｇＲＮＡを設計した（図４Ａ～Ｂ）。（材料及び方法に記載されている）異なる組み合わせのプラスミドのトランスフェクションによって、Ｃａｓ９－Ｍｙｄ８８ＶＬＰを生産した。次に、放出された粒子を濃縮し、Ｈｅｌａ及びＨＥＫ２９３Ｔを含む異なるレシピエント細胞におけるＭｙｄ８８遺伝子を変化させるために使用した。図４Ｃ及びＤに示されている結果は、Ｍｙｄ８８ ｇＲＮＡをロードした全てのＣａｓ９－ＶＬＰ型が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭｙｄ８８遺伝子の予想部分を欠失させるのに効率的であったことを示している。しかしながら、Ｈｅｌａ細胞はより消極的であり、特定のＶＬＰ種によってあまり改変されなかった。特に、本発明者らは、プロテアーゼ（Ｒ４）を欠くＶＬＰがＨｅｌａ細胞では非効率的であったが、ＨＥＫ２９３Ｔターゲット細胞では依然として完全に活性であったことに注目した。これらのデータは、ＶＬＰレシピが、ターゲット細胞型について最適化されるべきであることを示唆している。さらなる実験は、Ｃａｓ９－Ｍｙｄ８８ＶＬＰの効果が用量依存的であり（図５）、ポリブレンの追加によって増強される（図６）ことを示している。

【0221】

実施例３：ヒト及びマウス起源の一次細胞におけるＭｙｄ８８遺伝子のＶＬＰ媒介性破壊。
より困難な問題は、従来のトランスフェクション方法にほとんど許容的ではない一次細胞であって、ウイルスベクターによってトランスダクションすることが困難な一次細胞にＣＲＩＳＰＲ成分を送達することである。したがって、生物から新たに単離した異なる細胞型（ヒト単球由来のヒトマクロファージを含む）において、Ｃａｓ９－Ｍｙｄ８８ＶＬＰの有効性をモニタリングした。処理細胞の遺伝子型分析は、培養マクロファージへのＣａｓ９－Ｍｙｄ８８ＶＬＰの単回投与による明白かつ非常に効率的なＭｙｄ８８遺伝子の切断を明らかにしている（図７Ａ）。遺伝子の切断を確認する遺伝子型ＰＣＲベースのアッセイの他に、Ｍｙｄ８８破壊は、図７Ｂに示されている強い表現型の原因であり、Ｍｙｄ８８機能の不活性化を裏付けている。ヒト非活性化リンパ球（典型的には、これはほとんどの既存の遺伝子改変技術に適さない）において、ＣＲＩＳＰＲを一次細胞に送達するＶＬＰの驚くべき効率をさらに検証した（図８）。本発明者らの観察結果を一般化するために、本発明者らは、マウスＭｙｄ８８遺伝子をターゲティングするいくつかの別のｇＲＮＡを設計し、マウス細胞専用のＶＬＰバッチを調製した。図９に示されているように、この新たなＶＬＰバッチを使用して、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰｃをマウス起源のマクロファージに高い効率で送達した。全体として、これらの結果は、Ｃａｓ９－ＶＬＰが、機能的ＣＲＩＳＰＲ機構を一次細胞に導入するための効率的な薬剤であることを立証している。

【0222】

実施例４：Ｃａｓ９－ＶＬＰは修復テンプレートの移入を媒介し得る：「オールインワン」ＶＬＰ複合体の作製。
以前の研究は、ＭＬＶ由来ＶＬＰ及び他のＶＳＶ－Ｇ誘導粒子がヒト細胞へのプラスミドの送達を媒介し、ウイルス由来トランスフェクション剤として機能する能力に関するものであった（Okimoto et al., 2001, Mol Ther J Am Soc Gene Ther, Vol. 4: 232-238）。粒子をｄｓＤＮＡ分子と組み合わせることができるので、本発明者らは、ＭＬＶ由来Ｃａｓ９－ＶＬＰがｓｓＤＮＡとの組み合わせをサポートし、細胞へのそれらの送達を媒介し得ると推測した。本発明者らはこの知識を利用して、Ｃａｓ９－ＶＬＰと、ｓｓＤＮＡから構成される修復プライマーとを組み合わせようと試みた。このアプローチにより、本発明者らは、ＶＬＰを使用して内因性遺伝子を切断し、提供された修復テンプレートを使用して相同組換え様機構（ＨＲ）によって細胞内でそれを修復することを提案する。モデルとしてＤＤＸ３ヒト遺伝子を使用し、内因性ＤＤＸ３遺伝子のＡＴＧコドンの上流にＦＬＡＧ配列を挿入するように設計した修復プライマーを使用して、これを調査した。図１０は、トランスフェクション細胞及び一次細胞の両方において本発明者らが直接調査したこの「オールインワン」ＶＬＰ戦略の原理を示している。Ｆｌａｇ修復プライマーと組み合わせたＣａｓ９－ＤＤＸ３ＶＬＰはＤＤＸ３遺伝子を成功裏に切断し（示さず）、ＤＤＸ３の５’配列の正しい予測部位へのｆｌａｇ配列の遺伝子ターゲット挿入を可能にした。ＰＣＲベースの遺伝子型決定アッセイと、ウエスタンブロットによるｆｌａｇ付ＤＤＸ３タンパク質の検出とによって、これをチェックした（図１０Ｃ）。Ｃａｓ９－ＤＤＸ３ＶＬＰの単回処理に曝露した一次ヒト樹状細胞における遺伝子レベルにおいても、この結果を検証した。

【0223】

実施例５：ＣＡＳ９ウイルス由来粒子の特性評価。
材料及び方法のセクションに開示されているようにＣＡＳ９ ＶＬＰを生産し、２０％スクロースクッションの１回目の超遠心分離によって濃縮した。次に、得られたペレットをＰＢＳに再懸濁し、２つのスクロースクッション（チューブの底の５０％スクロースクッション、及びサンプルから５０％クッションを分離する２０％スクロースクッション）で再遠心分離した。２時間の遠心分離後、５０％と２０％とを分離する界面を採取し、再遠心分離して高純度のＣＡＳ９－ＶＬＰを得、これをＰＢＳに再懸濁した。ＶＬＰ １０μgをLaemlliバッファーに溶解し、ウエスタンブロット分析の前に９５℃で５分間加熱した。

【0224】

ウエスタンブロット分析は、図１２Ａに表されている（１レーン当たり１０μg）。使用した抗体は、ＧＡＧｍｌｖ（ABCAM R187）、ＶＳＶＧ（ABCAM P5D4）、ＣＡＳ９（7A9-3A3 clone Cell SIgnaling）、Ｃａｓ９に付加したＦｌａｇ配列（Sigma）に対するものであった。ウイルスプロテアーゼによってプロセシングされた切断産物に対応する異なる形態のｍｌｖ ＧＡＧが示されている。粒子調製物において、ＶＳＶＧは、予想サイズで明確に検出されている。ＣＡＳ９抗体は、ＧＡＧ－ＣＡＳ９融合物（予想２２５KDA）に対応する２００KDa超のより大きい産物を明らかにしており、このタンパク質はＦｌａｇ抗体によっても検出される（左のパネル）。ＣＡＳ９及びＦＬＡＧ抗体は両方とも、プロテアーゼプロセシング後にＧＡＧから放出された遊離ＣＡＳ９タンパク質又は切断ＣＡＳ９産物に対応し得るより小さいＣＡＳ９産物（１６０～２００KDaの範囲）を明らかにしている。

【0225】

図１２Ｂで例証されているように、全高純度ＶＬＰ ３０μgを、総体積 １２mlで不連続スクロース勾配（ＰＢＳ中１０％～６０％スクロース）にロードした。１６時間の遠心分離（２５０００rpm、ＳＷ４１）後、チューブの先端から画分 ５００μlを収集し、１～２４と命名した。次に、各画分 ２μlをニトロセルロース膜上にスポットし、ミルクの追加（ＴＢＳＴ５％低脂肪乳）によって直ぐにブロッキングした。次に、上記と同様の抗体を使用して、各画分についてＶＳＶＧ ＣＡＳ９及びＧＡＧ ＭＬＶを検出した。結果は、ＣＡＳ９ ＶＬＰが１，１４～１，２１の密度で沈降し、ピークが１，１７にあることを示している。

【0226】

実施例６：ＣＡＳ９ウイルス由来粒子へのガイドＲＮＡのロード
実施例６は、ＣＡＳ９ウイルス由来粒子がガイドＲＮＡを効率的に組み込むことを示す。

【0227】

産生細胞（レーン２～４）又は対応する精製ＶＬＰ（レーン５～７）から抽出した全ＲＮＡを使用した、ガイドＲＮＡの保存領域に対するノーザンブロット。レーン１．ＶＬＰを産生しない細胞の全ＲＮＡに対応するコントロールサンプル。レーン２．Ｇａｇ／Ｃａｓ９融合物と、ウイルスエンベロープと、ガイドＲＮＡとを発現する細胞由来の全ＲＮＡ。レーン３．Ｇａｇ／Ｃａｓ９融合物と、ウイルスエンベロープと、より長いステム構造を有する改変ガイドＲＮＡとを発現する細胞由来の全ＲＮＡ。レーン４．Ｇａｇの非存在下で、野生型Ｃａｓ９と、ガイドＲＮＡとを発現する細胞由来の全ＲＮＡ。レーン５、６及び７．細胞残屑を排除して０．８μmフィルタでろ過した後、対応する産生細胞の上清から抽出した全ＲＮＡ（レーン５は、レーン２の細胞の上清に対応する、など）。レーン７は、Ｇａｇ／Ｃａｓ９融合物が発現されない場合、ガイドＲＮＡが粒子内に効率的に組み込まれないことを示している。興味深いことに、より長いステム構造を有する改変ガイドＲＮＡ（レーン３及び６）は、野生型ガイドＲＮＡ（レーン２及び５）よりも効率的にＶＬＰに組み込まれないようである。

【0228】

実施例７：ＭＬＶベースのウイルス由来粒子とＨＩＶベースのウイルス由来粒子との比較
図１４Ａは、ＭＬＶベースのＶＬＰ又はＨＩＶ－１ベースのＶＬＰの生産のために設計したコードカセットの概略図を示す。初期ｈＣＭＶプロモーター、ウサギＢグロビンイントロン及びウサギｐＡシグナルを備える真核生物発現ベクターを両カセットに組み込んだ。Ｃａｓ９遺伝子からＧＡＧカセットを分離する多様なタンパク質分解部位の探索及び試験によって、両系を最適化した。材料及び方法のセクションに記載されているようにＭＬＶベースのＶＬＰを生産し、ＧＡＧ ＰＯＬ Ｔａｔ Ｒｅｖタンパク質をコードするＨＩＶ－１ヘルパー構築物（配列番号：３３の構築物）をＭＬＶ ＧＡＧ ＰＯＬプラスミドに代えてトランスフェクションした以外は同様に、ＨＩＶ－１ベースのＶＬＰを生産した。ＨＩＶ－１ ＶＬＰの生産は、ＭＬＶベースのＶＬＰと同じ手順に従う。

【0229】

図１４Ｂは、ＧＦＰ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを組み込むように操作した濃縮ＶＬＰを使用して、ＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞 ３００００個をトランスダクションした試験を示す。同じロードｇＲＮＡ（ターゲット配列：ＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧ－配列番号：３５）を用いて、ＨＩＶ－１及びＭＬＶベースの粒子を生産した。その前日に、レシピエント細胞を９６ｗプレートにプレーティングした。ポリブレン（４μg/ml）をトランスダクション培地に補充した。３つの漸増用量の各ＶＬＰバッチによる処理の７２時間後、蛍光光度計（励起４８８、発光５３５）によって、蛍光強度を測定した。ＶＬＰ処理細胞では、コントロール未処理細胞と比較して、蛍光の減少が明らかであったが（Ｃ）、これは、レシピエント細胞内におけるＧＦＰ遺伝子の切断を示している。結果は、ＨＩＶ－１ベースのＶＬＰが、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系をこれらのレシピエント細胞に送達する際に効率的であり、ＭＬＶベースのＶＬＰよりもわずかに低効率のレベルである（１，５～２倍低効率）ことを示している。

【0230】

図１４Ｃは、ＩＬ７で刺激した一次ヒトＴ細胞におけるＷＡＳＰ遺伝子の切断を示す。この実験では、ＩＬ－７で刺激した新鮮精製Ｔ細胞の処理前に、ヒトＷＡＳＰ遺伝子をターゲティングする２つのガイドＲＮＡをＨＩＶ－１又はＭＬＶベースのＶＬＰ内に組み込んだ。次に、処理の２４時間後、レシピエント細胞において、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９によるＷＡＳＰ欠失をＰＣＲによって測定した。ImageJソフトウェアを使用して実施したゲル分析は、ＭＬＶベースのＶＬＰ（３２％）及びＨＩＶ－１ベースのＶＬＰ（６％）の二重カット効率の定量を可能にした。

【0231】

実施例８：Ｃａｓ９含有ウイルス由来粒子によるＴｈｙ１－ＧＦＰマウス胚へのＣＲＩＳＰＲ送達。
ＧＦＰ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡを組み込んだＣａｓ９ ＶＬＰを生産し、マウス胚（１細胞期）の透明帯に注射する前に、高度に精製した。ヘテロ接合性胚は全て、運動ニューロンにおけるＧＦＰ発現に関与するＴｈｙ１－ＧＦＰアレルを有していた。この研究の目的は、胚内でＧＦＰを切断するＶＬＰの能力を評価し、雌性マウスへのＶＬＰ処理胚の再移植後にそれらのＴｈｙ１－ＧＦＰカセットが変化した動物を作製することである。Ａに示されているように、細胞膜をパーフォリン処理せずに実施した２回の注射のために、数ナノリットルの調製物（６，５μM Ｃａｓ９）を使用した。この注射プロトコールによって、いかなる胚も死亡しなかった。再移植後、本発明者らは、合計２０匹の動物（Ｆ０）を得た。新生児の指からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイによって分析して、ＧＦＰカセットの切断を明らかにした。Ｂに示されているように、このアッセイでは２０匹のうちの６匹の動物が陽性であり（矢印）、第１の注射実験では９匹のうちの４匹が陽性であった（左のパネル）：第２の注射では、動物５、７、８、１２並びに動物４０及び４５（弱）。次に、動物７、８及び１２をｗｔ－Ｃ５７Ｂ６動物と交配させて、子孫への切断ＧＦＰアレルの遺伝を評価した。予想通り、Ｆ１子孫のおよそ半分は、（３匹の創始体全てについて）Ｔｈｙ１－ＧＦＰアレルがヘテロ接合性であると認められた。次に、Ｃに示されているＴ７－エンドヌクレアーゼアッセイによって、ヘテロ接合性Ｆ１マウスにおけるＴｈｙ１－ＧＦＰアレルの状態を測定した＊。マウス７及びマウス１２の全てのＦ１ヘテロ接合性子孫並びにマウス８の子孫の３３％において、ＧＦＰが変化していることが示された。次に、動物＃７８、＃７９、＃２１及び＃２２のアレルに対して、Ｔｈｙ１－ＧＦＰアレルの配列決定を実施し、クロマトグラムを、Ｔｈｙ１－ＧＦＰ非処理動物について得られた配列と比較した。この目的のためにTIDEソフトウェアを使用し、各動物のインデルの性質及び配列変化の％を表すヒストグラムを得た＊＊。Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧに示されている結果は、Ｆ１マウスにおけるＧＦＰ変化の％を示している＊＊＊。要するに、これらのデータは、Ｃａｓ９－ＶＬＰが動物遺伝子導入を支援することができ、哺乳動物胚へのＣＲＩＳＰＲ送達剤であって、遺伝物質の移入及び卵細胞への損傷を伴わずに遺伝子を変化させるＣＲＩＳＰＲ送達剤としてＣａｓ９－ＶＬＰを使用することができることを示している。

【0232】

Ｔ７－エンドヌクレアーゼアッセイのプロトコール：
Nucleospin Tissue Kit (Macherey Nagel)を使用して、マウスの指からマウスゲノムＤＮＡを抽出した。次に、ＰＣＲ反応液 ５０μlにおいて、ＤＮＡテンプレート ３μlを使用した（ＰＣＲ条件は、プライマー：
フォワード：５’－ＴＣＴＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＣＣＴＴＡＧＧ（Ｔｈｙ１プライマー－配列番号：３９）
リバース：５’－ＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＴＣＧＧ（ＧＦＰプライマー－配列番号：４０）
を使用して、９５℃で５分間、続いて（９５℃で３０秒間－６４℃で３０秒間－７２℃で３０秒間）を３サイクル及び（９５℃で３０秒間－５７℃で３０秒間－７２℃で３０秒間）を２５サイクル、続いて７２℃で５分間である。

【0233】

次に、４０μl反応チューブ中で、製造業者による説明通りに、Ｔｈｙ１－ＧＦＰアンプリコンをＴ７エンドヌクレアーゼアッセイに供した。（https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i）。最後に、消化液を２，５％－アガロースゲルにロードした。

【0234】

＊＊TIDEソフトウェアは、無料のオンラインツールである：https://tide.nki.nl/。クロマトグラムシーケンス（ａｂｉファイル）をソフトウェアにアップロードし、デフォルト設定を改変せずにＴＩＤＥランを実施した。TIDEヒストグラムが示されている

【0235】

＊＊＊選択したＴｈｙ１－ＧＦＰ系統は数コピーのＧＦＰ／アレル（６～１０）を有するという事実により、％は完全ではない。結果は、１アレル当たり１つの構成的ＧＦＰコピーを有するマウス系統において再現されるはずである（準備中）

【0236】

他の配列
ＧＡＧ－Ｃａｓ９アミノ酸配列（配列番号：２２）：

【表7】

ＶＳＶ－Ｇアミノ酸配列（配列番号：２３）：

【表8】

ＧＡＧ ＰＲＯ ＰＯＬアミノ酸配列（配列番号：２４）：

【表9】

ＢＡＥＶ－Ｇアミノ酸配列（配列番号：２５）

【表10】

ＧＡＧｍｌｖ－ＣＡＳ９配列（配列番号：２６）：

【表11】

Girard-Gagnepain A et al. 2014. Blood. 2014 Aug 21;124(8):1221-31. doi: 10.1182/blood-2014-02-558163. Epub 2014 Jun 20)に言及されているＢＡＥＶ－ＧヒヒエンベロープＲＬＥＳＳ変異体ＢＡＥＶＲｌｅｓｓ：（本文及び図面ではＢＲＬとも記述される）配列番号：２７

【表12】

ＶＳＶ－Ｇ配列（配列番号：２８）：

【表13】

切断部位：
アミノ酸：ＳＳＬＹＰＡＬＴＰ（配列番号：２９）
核酸：ａｇｔｔｃｃｃｔｇｔａｔｃｃａｇｃｃｃｔｃａｃａｃｃｔ（配列番号：３０）
Ｃａｓ９アミノ酸配列（配列番号：３１）

【表14】

Ｃａｓ９核酸配列（配列番号：３２）

【表15】

（ＨＩＶ－１ Ｇａｇ－Ｐｏｌ－Ｔａｔ－Ｒｅｖをコードする）ＨＩＶ－１カプシド形成構築物「ｐ８．９１」（配列番号：３３）

【表16】

ＨＩＶ－１ ＧＡＧ－ＣＡＳ９をコードする核酸「ＫＬＡＰ２２９」（配列番号：３４）

【表17】

【表18】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15A】

【図15B-15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図15G】

【配列表】

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