特許 7623282 融合によって修飾されたＣＭＶのウイルス様粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-20

(45)【発行日】2025-01-28

(54)【発明の名称】融合によって修飾されたＣＭＶのウイルス様粒子

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20250121BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250121BHJP

   C07K 2/00 20060101ALI20250121BHJP

   C07K 14/08 20060101ALI20250121BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20250121BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20250121BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20250121BHJP

   C07K 14/575 20060101ALI20250121BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20250121BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20250121BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20250121BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20250121BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20250121BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20250121BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20250121BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20250121BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250121BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

C12N15/62 Z

C07K2/00

C07K14/08

C07K14/195

C07K14/435

C07K14/52

C07K14/575

C07K19/00

A61K39/00 G

A61K39/00 Z

A61K35/76

A61P37/08

A61P37/06

A61P33/00

A61P31/12

A61P31/04

A61P35/00

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2021533352

(86)(22)【出願日】2019-12-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-08

(86)【国際出願番号】 EP2019086788

(87)【国際公開番号】W WO2020128037

(87)【国際公開日】2020-06-25

【審査請求日】2022-11-15

(31)【優先権主張番号】18214639.9

(32)【優先日】2018-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】521253756

【氏名又は名称】サイバ アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ゼルティンス、アンドリス

【審査官】田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／０３０６０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／０６２７２０（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ７／０１

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ３５／７６

Ａ６１Ｐ ３７／０８

Ａ６１Ｐ ３７／０６

Ａ６１Ｐ ３３／００

Ａ６１Ｐ ３１／１２

Ａ６１Ｐ ３１／０４

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下を備える、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：
（ａ）少なくとも１つの融合タンパク質、ただし、該少なくとも１つの融合タンパク質は、下記を含む
ａ）以下を含むキメラＣＭＶポリペプチド：
（ｉ）配列番号６２のコートタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＭＶのコートタンパク質を含むＣＭＶポリペプチド；
（ｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドに挿入される抗原性ポリペプチド、ただし該抗原性ポリペプチドは、
（a）アレルゲン；
（b）ウイルス；
（c）細菌；
（d）寄生虫；
（e）腫瘍；
（f）自己分子；
（g）ホルモン；
（h）サイトカイン；及び
（i）ケモカイン；
からなる群に由来し、少なくとも４０アミノ酸の長さを有し、 前記抗原性ポリペプチドの前記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、前記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にある；
（ｉｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換するＴヘルパー細胞エピトープ；及び
（ｂ）少なくとも１つのＣＭＶタンパク質、ただし、該少なくとも１つのＣＭＶタンパク質は、配列番号６２のコートタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＭＶのコートタンパク質、を含み、そして前記ＣＭＶタンパク質は、任意にＴヘルパー細胞エピトープによって修飾されている。

【請求項2】

キメラＣＭＶポリペプチドが第１のアミノ酸リンカーをさらに含み、前記第１のアミノ酸リンカーは、抗原性ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置し、好ましくは前記第１のアミノ酸リンカーは、最大３０アミノ酸の長さを有する、請求項１に記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ。

【請求項3】

キメラＣＭＶポリペプチドが第２のアミノ酸リンカーをさらに含み、第１のアミノ酸リンカーは、抗原性ポリペプチドのＮ末端に位置し、前記第２のアミノ酸リンカーは、前記抗原性ポリペプチドのＣ末端に位置し、好ましくは前記第２のアミノ酸リンカーは、最大３０アミノ酸の長さを有する、請求項２に記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ。

【請求項4】

第１及び第２のアミノ酸リンカーが、以下からなる群から独立して選択される、請求項２又は請求項３に記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ：
（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；
（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは前記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに
（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカー。

【請求項5】

第１及び／又は第２のアミノ酸リンカーが、以下から独立して選択される、請求項２又は請求項３に記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ：
（ｉ）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、前記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）、ならびに
（ｉｉ）少なくとも１つのグリシン、少なくとも１つのセリン、少なくとも１つのグルタミン酸及び少なくとも１つのアスパラギン酸を含むグリシン－セリン－グルタミン酸－アスパラギン酸リンカー（ＧＳＥＤ－リンカー）であって、前記ＧＳＥＤリンカーが、（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝１～５、ｔ＝１～５、ｕ＝０又は１、ｘ＝０又は１、ｙ＝０～５及びｚ＝０又は１）のアミノ酸配列を含むグリシン－セリン－グルタミン酸－アスパラギン酸リンカー（ＧＳＥＤ－リンカー）。

【請求項6】

ＣＭＶポリペプチドが、配列番号６２のコートタンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＭＶのコートタンパク質である、請求項１～５のいずれかに記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ。

【請求項7】

ＣＭＶポリペプチドが、
（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、配列番号６２を含むか、好ましくはそれからなる、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号６２の少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、を含むか、好ましくはそれからなり；
（ｉ）又は（ｉｉ）で定義される前記アミノ配列が、配列番号６３又はアミノ酸配列領域を含み、前記アミノ酸配列領域が、配列番号６３と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１～６のいずれかに記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ。

【請求項8】

ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域が、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応する、請求項１～７のいずれかに記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ。

【請求項9】

Ｔｈ細胞エピトープが、破傷風毒素に由来するか、ＰＡＤＲＥ配列である、請求項１～８のいずれかに記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ。

【請求項10】

Ｔｈ細胞エピトープが、配列番号６４又は配列番号６５のアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれかに記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ。

【請求項11】

キメラＣＭＶポリペプチドが、配列番号５又は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、抗原性ポリペプチドが、配列番号５の８８位のアミノ酸残基と８９位のアミノ酸残基との間に配列番号５の前記キメラＣＭＶポリペプチドに挿入されるか、前記抗原性ポリペプチドが、配列番号６６の８６位のアミノ酸残基と８７位のアミノ酸残基との間に配列番号６６の前記キメラＣＭＶポリペプチドに挿入される、請求項１～１０のいずれかに記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれかに記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰであって、該ＣＭＶタンパク質はＣＭＶのコートタンパク質を含み、
該ＣＭＶのコートタンパク質は、配列番号６２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＣＭＶタンパク質は場合により、Ｔヘルパー細胞エピトープによって修飾され、前記ＣＭＶタンパク質は好ましくは配列番号６２のＣＭＶの前記コートタンパク質を含む、請求項１～１１のいずれかに記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれかに記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰであって、抗原性ポリペプチドがアレルゲンに由来するポリペプチドである、前記修飾ＶＬＰ、ただし前記アレルゲンは、以下からなる群より選択される、アレルゲンである：
（ａ）ハチ毒ホスホリパーゼＡ２；
（ｂ）ブタクサ花粉Ａｍｂ ａ １；
（ｃ）カバノキ花粉Ｂｅｔ ｖ Ｉ；
（ｄ）白頭スズメバチ毒５ ＤｏＩ ｍ Ｖ；
（ｅ）イエダニＤｅｒ ｐ １；
（ｆ）イエダニＤｅｒ ｆ ２；
（ｇ）イエダニＤｅｒ ｐ ２；
（ｈ）イエダニＬｅｐ ｄ．
（ｉ） 真菌アレルゲンＡｌｔ ａ １；
（ｋ） 真菌アレルゲンＡｓｐ ｆ １６；
（ｌ） ピーナッツアレルゲン；
（ｍ） ネコアレルゲンＦｅｌ ｄ１；
（ｎ） イヌアレルゲンＣａｎ ｆ１、Ｃａｎ ｆ２；
（ｏ） ピーナッツ由来アレルゲン；又は
（ｐ） スギアレルゲンＣｒｙ Ｊ２。

【請求項14】

抗原性ポリペプチドが、アレルゲン、自己抗原、腫瘍抗原、又は病原体のポリペプチドである、請求項１～１３のいずれかに記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ。

【請求項15】

前記抗原性ポリペプチドがアレルゲンであり、前記アレルゲンが、
（ａ）花粉抽出物；
（ｂ）ダスト抽出物；
（ｃ）イエダニ抽出物；
（ｄ）真菌抽出物；
（ｅ）哺乳動物表皮抽出物；
（ｆ）羽毛抽出物；
（ｇ）昆虫抽出物；
（ｈ）食品出物；
（ｉ）毛髪抽出物；
（ｊ）唾液抽出物；及び
（ｋ）血清抽出物
からなる群に由来する、請求項１～１４のいずれかに記載のＣＭＶの改変ＶＬＰ。

【請求項16】

前記抗原性ポリペプチドがピーナッツアレルゲンである、請求項１～１５のいずれかに記載のＣＭＶの改変ＶＬＰ。

【請求項17】

前記ピーナッツアレルゲンが、配列番号２７、配列番号７２もしくは配列番号７３から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２７、配列番号７２もしくは配列番号７３と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはこれらからなる、請求項１６に記載のＣＭＶの改変ＶＬＰ。

【請求項18】

キメラＣＭＶポリペプチドが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号１２８、配列番号１３２、配列番号１３４又は配列番号１３９からなる群から選択される、請求項１に記載のＣＭＶの修飾ＶＬＰ。

【請求項19】

前記キメラＣＭＶポリペプチドが配列番号２９からなり、前記ＣＭＶタンパク質が配列番号５からなる、請求項１に記載のＣＭＶの改変ＶＬＰ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、植物ウイルスキュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子に関し、特に、特定の位置でＣＭＶポリペプチドに挿入された抗原性ポリペプチドを含み、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換するＴｈ細胞エピトープをさらに含むキメラＣＭＶポリペプチドを含む、ＣＭＶの修飾ＶＬＰに関する。さらに、これらの修飾ＶＬＰは、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドに融合された上記抗原性ポリペプチドに対する免疫応答、特に抗体応答を生じさせるためのワクチンプラットフォームとして機能する。さらに、本発明は、融合抗原性ポリペプチド（ｉｎ－ｆｕｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を含む上記キメラＣＭＶポリペプチドと、上記抗原性ポリペプチドを含まない追加のＣＭＶタンパク質とを含むモザイクウイルス様粒子である修飾ウイルス様粒子に関する。

【背景技術】

【0002】

植物ウイルス及びそれに由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、特徴的な翻訳後修飾、費用対効果、有益な安全性プロファイル、生産速度及び拡張性をもたらすそれらの能力に照らして、主に、ＶＬＰワクチンを生成するための経済的かつ迅速な代替プラットフォームとしての植物の役割のために、近年注目を集めている（Ｃｈｅｎ Ｑ ａｎｄ Ｌａｉ Ｈ，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１３）９：２６－４９；Ｚｅｌｔｉｎｓ Ａ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３）５３：９２－１０７）。さらに、特に植物ウイルスのＶＬＰは、感染性哺乳動物ウイルスに観察されるものと同様の強力な免疫応答を誘発することを目的として、それらの表面に様々な抗原を提示するための担体構造と考えられている（Ｂａｌｋｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．（２０１８）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１８．０８．００７）。

【0003】

キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ、ブロモウイルス（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）科、ククモウイルス（Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ）属）は、極めて広い宿主範囲を有する線状のポジティブセンス等直径植物ウイルス（ｌｉｎｅａｒ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｓｅｎｓｅ ｉｓｏｄｉａｍｅｔｒｉｃ ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓ）である。ウイルスゲノムは、３つの一本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２及びＲＮＡ３）からなり、コートタンパク質（ＣＰ）遺伝子は、ゲノムＲＮＡ３（約２２００ｎｔ）及びサブゲノムＲＮＡ４（約１０００ｎｔ）の両方に存在する。カプシドは、約２５ｋＤａの単一タンパク質種の１８０コピーを含む。ＣＭＶ－Ｂ株、ＣＭＶ－Ｃ株ＣＭＶ－Ｄ株、ＣＭＶ－Ｌ株、ＣＭＶ－Ｓ株、ＣＭＶ－Ｔ株、ＣＭＶ－ＷＬ株、ＣＭＶ－Ｖ株、ＣＭＶ－Ｆｎｙ株、ＣＭＶ－Ｉｘ株、ＣＭＶ－Ｑ株、ＣＭＶ－Ｒ株など、宿主植物に関する様々な症状に関連するＣＭＶから知られている複数の異なる株が存在する（Ｃａｒｒｅｒｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（１９９９）１４４：１８４６－１８５７；Ｅｄｗａｒｄｓ ＭＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８１９８３）７３：１１１７－１１２０；ｗｗｗ．ｄｐｖｗｅｂ．ｎｅｔ）。

【0004】

近年、表面上に様々な抗原を提示するための化学リンカーカップリング技術を使用した、ＣＭＶ ＶＬＰに基づくワクチンプラットフォームが記載されている。記載されているＣＭＶ ＶＬＰは、Ｔ細胞刺激エピトープが挿入された、ＣＭＶの修飾ＣＰに由来する（Ａ．Ｚｅｌｔｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２（２０１７）３０；国際公開第２０１６／０６２７２０号パンフレット）。

【0005】

ＣＭＶのキメラ形態はまた、提示系として機能し、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来するエピトープをそれらの外面に発現するように操作されている。詳細には、ＣＭＶ擬似組換え型ＣＭＶ－Ｄ／Ｓは、ＣＭＶ－Ｓ株由来のゲノムＲＮＡ３と、ＣＭＶ－Ｄ株由来のＲＮＡ１及びＲＮＡ２とを担持するように操作されている。この系は、クサンシ（Ｘａｎｔｈｉ）タバコ植物では、接種後に軽度のモザイク、及び葉脈の消失などのウイルス症状を発症させた。次いで、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エピトープをコードするように、ＣＰ遺伝子が様々な位置で操作された。選択されたペプチドは、いわゆるＲ９ミモトープ、すなわち、ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ２の多くの超可変領域１（ＨＶＲ１）配列に由来する２７アミノ酸の合成ペプチドであった。ＣＭＶ遺伝子へのＲ９ミモトープの挿入点の選択は、必須の要因、すなわち、ｉ）カプシド内で付加的な安定化の役割を有する独特なＮ末端へリックスを特徴とする（Ｓｍｉｔｈ ＴＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ（２０００）７４：７５７８－７６８６）、ＣＭＶコートタンパク質のＮ末端領域（ＣＭＶを安定化するタンパク質－ＲＮＡ相互作用に関与する内部Ｒドメインとして知られる高濃度の塩基性アミノ酸を含む（Ｗｉｋｏｆｆ ＷＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９７）２３２：９１－９７）を保護する必要性；ｉｉ）その推定される免疫原性能力の可能性を高めるための外来エピトープの表面位置；ｉｉｉ）修飾クローンを産生することができる変異誘発経路の利用可能性を考慮して行われた。これらの考察に基づいて、Ｒ９ミモトープの挿入は、ＣＭＶ－Ｓ ＲＮＡ３のＣＰ遺伝子内の様々な位置で行われている（ＡＦ０６３６１０，ｗｗｗ．ｄｐｖｗｅｂ．ｎｅｔ）。上記ＣＰ遺伝子内に単一のＲ９ミモトープを挿入するために、Ｒ９ミモトープヌクレオチド配列が上記ＣＰ遺伝子の２５３、４７５、５２９位に挿入されたのに対して、２つのＲ９ミモトープを挿入するために、Ｒ９ミモトープヌクレオチド配列が３９２及び５２９位に挿入された。最初の２つの挿入部位の場合、そのように調製されたキメラＣＭＶは、宿主植物内で全身に広がる能力を保持していたものの、ウイルス抽出収率が低下した。したがって、感染組織内でウイルス粒子の濃度を高めることを確実にするために、ＣＰ遺伝子の５２９位に挿入されたＲ９ミモトープを含むモザイクＣＭＶが選択され、ＨＣＶ患者血清反応性について試験された。慢性Ｃ型肝炎患者６０例から得られた血清試料は、上記キメラＣＭＶに感染した粗植物抽出物に対して顕著な免疫反応性を示した（Ｎａｔｉｌｌａ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００４）１４９：１３７－１５４；Ｐｉａｚｚｏｌｌａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５）２５：１４２－１５２；Ｎｕｚｚａｃｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００７）１５２：９１５－９２８；Ｎｕｚｚａｃｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００９）１５５：１１８－１２１；Ｎｕｚｚａｃｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）１６５：２１１－２１５；Ｐｉａｚｚｏｌｌａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２）３２：８６６－８７６）。

【0006】

さらに、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）に基づく発現系が、アルツハイマー病に対する潜在的なワクチンとして、及びブタサーコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）特異的ワクチンの生成に関して記載されている（Ｖｉｔｔｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）１６９：３３２－３４０；Ｇｅｌｌｅｒｔ Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ＯＮＥ（２０１２）７（１２）：ｅ５２６８８）。詳細には、ＣＭＶコートタンパク質（ＣＰ）遺伝子の２４８、３９２又は５２９位に様々な１１～１５アミノ酸長のＡβ由来断片を有するキメラ構築物が作製され、ウイルス生成物がそれらの天然宿主において複製され得ることが証明された。一方、アミノ酸位置１３１以降のキュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）－Ｒ株の植物ウイルスコートタンパク質には、最大２０アミノ酸長のブタサーコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）２型（ＰＣＶ２）カプシドタンパク質エピトープが組み込まれた。この挿入点１３１～１３２は、ＣＭＶ ＣＰのβＥ－αＥＦループの中央に位置し、この位置は、挿入されたエピトープがＣＭＶ ＣＰ三量体の中央に三部分基（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｇｒｏｕｐ）を形成し、抗体をさらに効率的に産生することを可能にするという利点を有するとの結論が下された。

【0007】

さらに、広く使用されている従来の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系によるＣＭＶのウイルスカプシドタンパク質（ＣＰ）の発現は、不溶性封入体又は非常に少量の可溶性タンパク質をもたらしたに過ぎないものの、ＣＭＶのキメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成も記載されている（Ｘｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（２００８）４９－５１）。一方、ジャガイモウイルスＸ（ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ）（ＰＶＸ）に基づくベクターから発現されたキメラＣＭＶコートタンパク質は、ＶＬＰに集合することができた（Ｎａｔｉｌｌａ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００６）１５１：１３７３－１３８６；Ｎａｔｉｌｌａ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２００８）５９：１１７－１２１；Ｃｈｅｎ Ｑ ａｎｄ Ｌａｉ Ｈ，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１３）９：２６－４９）。キメラＣＭＶコートタンパク質は、そのアミノ酸１９４～１９９に対応する、ＣＭＶ ＣＰの内部βＨ－βＩ（モチーフ５）ループに遺伝的に融合したニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＮＤＶ）の１７～２５アミノ酸長のエピトープを含む（Ｈｅ Ｘ，ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７９：３１４５－３１５３）。

【0008】

ＶＬＰに基づくワクチンの開発の過程では進歩があったものの、また別の別個のＶＬＰ系が依然として必要とされている。特に、ワクチンは、免疫された対象及び個体に対して、多くの場合１００倍を超える変動の範囲に及ぶ可変的な抗体応答を誘導する。さらに、Ｂ型肝炎に対するワクチンなどの一部のワクチンは、一定数の非応答者という弱点を有する。非応答性は特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に関連し、良好なＴヘルパー（Ｔｈ）細胞応答を誘導できないことが、これらの個体に見られる不十分な抗体応答の原因であると考えられている（Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００４）３２６：２０－２８）。さらに、高齢者は一般に不十分な抗体応答を示し、不十分なＴｈ細胞応答が、この場合も非効率的な抗体応答の原因であると考えられている。したがって、ワクチン開発の分野では、本質的にあらゆる対象及び個体に対して良好なＴｈ細胞応答を誘導するワクチンが重要な目標である。さらに、ワクチン構築プロセス中の未だ解決されていない１つのまた別の関連する非常に重要な問題が、抗原の空間的立体構造である。ワクチン構築では、ウイルス構造全体に影響を及ぼすことなく粒子表面上に最適なペプチド提示を達成することが重要である。これは、ＶＬＰが５０個又は７０個を超えるか、さらに長いアミノ酸長のタンパク質ドメインを収容し、典型的なＶＬＰ形態を保持することができるのは例外的な場合に限ることから、明らかになる（Ｉ．Ｂａｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．（２０１８），ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１８．０８．００７；Ｉ．Ｋａｌｎｃｉｅｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５２（２０１２）１２９－１３９）。

【発明の概要】

【0009】

本発明者らはここで、驚くべきことに、Ｔヘルパー細胞エピトープの組込みによって既に修飾されたＣＭＶポリペプチドの特定の位置に、様々な非常に異なる長さ及び性質の抗原性ポリペプチドを挿入することができ、上記得られた融合タンパク質が、さらに高度に免疫原性である修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を依然として形成し、それらに集合することができることを見出した。好ましくは、さらに驚くべきことに、融合抗原性ポリペプチドを有する上記融合タンパク質を含み、そのような融合抗原性ポリペプチドを有しないＣＭＶタンパク質をさらに含むモザイク修飾ウイルス様粒子を生成した。これらのモザイク修飾ＣＭＶ ＶＬＰは、最大２００を超えるアミノ酸長の抗原性ポリペプチドの組込みなど、非常に長い抗原性ポリペプチドの組込みに非常に有益であり、かつそれさえも可能にすることが分かった。

【0010】

第１の態様では、本発明は、少なくとも１つの融合タンパク質を含む、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、上記少なくとも１つの融合タンパク質は、
ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、
（ｉ）ＣＭＶポリペプチドであって、上記ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶのコートタンパク質を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくはＣＭＶの上記コートタンパク質が、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、また一層好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９８％、なおまた一層さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなるＣＭＶポリペプチドと；
（ｉｉ）抗原性ポリペプチドであって、上記抗原性ポリペプチドが、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、
上記抗原性ポリペプチドの上記挿入が、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基間にある抗原性ポリペプチドと；
（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープであって、上記Ｔヘルパー細胞エピトープが、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、好ましくは上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域が、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応するＴヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなる。

【0011】

さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つの融合タンパク質を含む、ＣＭＶの修飾ＶＬＰを提供し、上記少なくとも１つの融合タンパク質は、
ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、
（ｉ）ＣＭＶポリペプチドであって、上記ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶのコートタンパク質を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくはＣＭＶの上記コートタンパク質が、配列番号６２；又は上記コートタンパク質と、好ましくは配列番号６２と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、また一層好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９８％、なおまた一層さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなるＣＭＶポリペプチドと；
（ｉｉ）抗原性ポリペプチドであって、上記抗原性ポリペプチドが、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、
上記抗原性ポリペプチドの上記挿入が、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基間にある抗原性ポリペプチドと；
（ｉｉｉ）第１のアミノ酸リンカー、好ましくは第１のアミノ酸リンカー及び第２のアミノ酸リンカーであって、上記第１のアミノ酸リンカーが、上記抗原性ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置し、好ましくは上記第１のアミノ酸リンカーが、
（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；
（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは上記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに
（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーからなる群から選択される第１のアミノ酸リンカー、好ましくは第１のアミノ酸リンカー及び第２のアミノ酸リンカーとを含むか、好ましくはそれらからなる。

【0012】

別の態様では、本発明は、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、
（ａ）少なくとも１つの融合タンパク質であって、上記少なくとも１つの融合タンパク質が、
ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記キメラＣＭＶポリペプチドが、
（ｉ）ＣＭＶポリペプチドであって、上記ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶのコートタンパク質を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくはＣＭＶの上記コートタンパク質が、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、また一層好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９８％、なおまた一層さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなるＣＭＶポリペプチドと；
（ｉｉ）抗原性ポリペプチドであって、上記抗原性ポリペプチドが、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、
上記抗原性ポリペプチドの上記挿入が、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基間にある抗原性ポリペプチドとを含むか、好ましくはそれらからなる少なくとも１つの融合タンパク質；ならびに
（ｂ）少なくとも１つのＣＭＶタンパク質であって、上記ＣＭＶタンパク質が、ＣＭＶのコートタンパク質を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくはＣＭＶの上記コートタンパク質が、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、また一層好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９８％、なおまた一層さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、上記ＣＭＶタンパク質が、場合により、Ｔヘルパー細胞エピトープによって修飾され、上記Ｔヘルパー細胞エピトープが、上記ＣＭＶタンパク質のＮ末端領域を置換し、好ましくは上記ＣＭＶタンパク質の上記Ｎ末端領域が、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応する少なくとも１つのＣＭＶタンパク質を含む。

【0013】

本発明のさらなる態様及び実施形態は、この説明が続くにつれて明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】シングルカット制限酵素部位（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｕｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅ）を有するｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６プラスミドマップの説明。他のマップ（ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１５；ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１６；ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１７）はいずれも、本質的に同じ配列及び遺伝子構成を有する；それらは、アミロイド（β）ペプチドをコードするヌクレオチド配列のみが異なる。

【図2A】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６の発現に由来するＶＬＰの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；Ｓ－スクロース勾配（２０～６０％）前に細胞抽出物中で２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞内の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで。アスタリスク（＊）は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中の対応するＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６キメラＣＭＶポリペプチドの相対位置を示す。

【図2B】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１５の発現に由来するＶＬＰの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；Ｓ－スクロース勾配（２０～６０％）前に細胞抽出物中で２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞内の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで。アスタリスク（＊）は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中の対応するＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１５キメラＣＭＶポリペプチドの相対位置を示す。

【図2C】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１６の発現に由来するＶＬＰの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；Ｓ－スクロース勾配（２０～６０％）前に細胞抽出物中で２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞内の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで。アスタリスク（＊）は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中の対応するＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１６キメラＣＭＶポリペプチドの相対位置を示す。

【図2D】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１７の発現に由来するＶＬＰの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；Ｓ－スクロース勾配（２０～６０％）前に細胞抽出物中で２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞内の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで。アスタリスク（＊）は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中の対応するＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１７キメラＣＭＶポリペプチドの相対位置を示す。

【図3A】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６の発現に由来する精製ＶＬＰの電子顕微鏡分析。白色の水平バーは１００ｎｍに相当する。

【図3B】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１５の発現に由来する精製ＶＬＰの電子顕微鏡分析。白色の水平バーは１００ｎｍに相当する。

【図3C】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１６の発現に由来する精製ＶＬＰの電子顕微鏡分析。白色の水平バーは１００ｎｍに相当する。

【図3D】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１７の発現に由来する精製ＶＬＰの電子顕微鏡分析。白色の水平バーは１００ｎｍに相当する。

【図4】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６ ＶＬＰ、Ａβ１－４２ペプチド及びＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰに対する、アデュカヌマブの可変領域配列を有するモノクローナル抗体の結合。

【図5A】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１６ ＶＬＰ、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１７ ＶＬＰ及びＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６ ＶＬＰは、全長Ａβ１－４２ペプチドを認識する抗体を誘導する。

【図5B】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６ ＶＬＰは、アルツハイマー病患者の脳内のプラークを認識する抗体を誘導する

【図6】シングルカット制限酵素部位を有するｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ２ｘＡｒａｈ２０２－ＣＭＶ－ｔｔプラスミドマップの説明。発現ベクターは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の同時合成を確実にする。

【図7A】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を含むモザイクＶＬＰの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；Ｔ－２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶｘＡｒａｈ２０２－ＣＭＶｔｔ細胞内の総タンパク質；Ｓ－スクロース勾配（２０～６０％）前の細胞抽出物中の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで）。アスタリスク（＊）は、ゲル中のＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２キメラＣＭＶポリペプチドの相対位置を示す。

【図7B】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を含むモザイクＶＬＰの精製のウエスタンブロット分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；Ｔ－２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶｘＡｒａｈ２０２－ＣＭＶｔｔ細胞内の総タンパク質；Ｓ－スクロース勾配（２０～６０％）前の細胞抽出物中の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで）。ウエスタンブロットには、Ａｒａｈ２に対するウサギｐＡｂ（１：１０００；Ｉｎｄｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＰＡ－ＡＨ２）を使用した。ウエスタンブロットにより、ＣＭＶ ＶＬＰ画分中のＡｒａ－ｈ２０２の存在が確認される。アスタリスク（＊）は、ブロットにおけるＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２融合タンパク質の相対位置を示す。

【図8A】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を含むモザイクＶＬＰの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）、１－精製ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰ（対照試料）２－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を含む精製モザイクＶＬＰ。

【図8B】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を含むモザイクＶＬＰの精製の電子顕微鏡分析。ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を含む精製モザイクＶＬＰの電子顕微鏡画像。白色の水平バーは１００ｎｍに相当する。

【図9】Ａｒａ－ｈ２０２、又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を含むモザイクＶＬＰ（ＣＭＶ－Ｍ－Ａｒａｈ２０２）を用いて免疫した１４日後の組換えＡｒａ－ｈ２０２に対するＩｇＧのＥＬＩＳＡ。

【図10A】アレルギーの全身及び局所反応に対するＣＭＶ－Ｍ－Ａｒａｈ２０２を用いたワクチン接種の保護効果を検討するための実験デザイン

【図10B】全身及び局所惹起からの保護。ピーナッツ抽出物を用いた全身惹起。

【図10C】全身及び局所惹起からの保護。ピーナッツ抽出物を用いた皮膚プリック試験。

【図11】シングルカット制限酵素部位を有するｐＥＴ２８－ＣＭＶＢｘＦｅｌｄ１－ＣＭＶ－ｔｔプラスミドマップの説明。発現ベクターは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２及び未修飾ＣＭＶＮｔｔ８３０の同時合成を確実にする。

【図12A】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；０－誘導前の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴ２８－ＣＭＶｘＦｅｌｄ１－ＣＭＶｔｔ細胞内の総タンパク質；Ｔ－２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴ２８－ＣＭＶｘＦｅｌｄ１－ＣＭＶｔｔ細胞内の総タンパク質。Ｓ－スクロース勾配遠心分離前の細胞抽出物中の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで）。アスタリスク（＊）は、ゲル中のＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２キメラＣＭＶポリペプチドの相対位置を示す。

【図12B】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）、１－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含む精製モザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌ。

【図12C】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌの精製の電子顕微鏡分析。ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含む精製モザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌの電子顕微鏡画像。白色の水平バーは１００ｎｍに相当する。

【図13】ＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌは、Ｆｅｌ ｄ１に対する強力な抗体応答を誘導する。Ｆｅｌ ｄ１に対するＩｇＧは、Ｆｅｌ ｄ１と、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２のＶＬＰと、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌとを用いてナイーブマウスを免疫した１４日後の４５０ｎｍでの吸光度として示される。

【図14A】アレルギーの全身及び局所反応に対するＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌを用いたワクチン接種の保護効果を検討するための実験デザイン。

【図14B】ＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌは、Ｆｅｌ ｄ１による全身惹起に対する防御を誘導する。惹起は、３マイクログラムのＦｅｌ ｄ１抽出物、組換え二量体Ｆｅｌ ｄ１を静脈内投与して行った。

【図15】ｐＥＴ２８－ＣＭＶＢ２ｘ１９ｎａｎｐ－ＣＭＶｔｔプラスミドマップの説明。プラスミドは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－１９ＮＡＮＰ及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－ＣＳＰの発現に役立つ。

【図16】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－１９ＮＡＮＰ及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－ＣＳＰの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；Ｓ－スクロース勾配前の細胞抽出物中で２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６内の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで）。アスタリスク（＊）は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中のＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－１９ｎａｎｐの相対位置を示す。

【図17】精製ＣＭＶ－Ｍ－ＣＳＰモザイクＶＬＰの電子顕微鏡画像。白色の水平バーは１００ｎｍに相当する。

【図18】クローン化α－シヌクレインエピトープｃＤＮＡを有するＣＭＶＮｔｔ８３０遺伝子を含むｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｅｇｙプラスミドクローンの説明。このプラスミドの詳細な説明は、いずれも本質的に同じ配列及び遺伝子構成を有するプラスミドクローンｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｅｇｙ、ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｋｎｅ及びｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｍｄｖを説明するための例である。それらは、α－シヌクレインペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列のみが異なる。

【図19A】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｅｇｙの発現に由来するＶＬＰの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；Ｔ－２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞内の総タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで）。

【図19B】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｋｎｅの発現に由来するＶＬＰの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；Ｔ－２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞内の総タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで）。

【図19C】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｍｄｖの発現に由来するＶＬＰの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；Ｔ－２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞内の総タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで）。

【図20A】精製ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０及びα－シヌクレインペプチド融合ＶＬＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；１－精製ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－ｍｄｖ融合タンパク質ＶＬＰ；２－精製ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－ｅｇｙ融合タンパク質ＶＬＰ；３－精製ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－ｋｎｅ融合タンパク質ＶＬＰ；４－精製ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０未修飾ＶＬＰ。

【図20B】精製ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－ｅｇｙ融合タンパク質ＶＬＰの電子顕微鏡画像。白色の水平バーは１００ｎｍに相当する。

【図20C】精製ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－ｋｎｅ融合タンパク質ＶＬＰの電子顕微鏡画像。白色の水平バーは１００ｎｍに相当する。

【図20D】精製ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－ｋｎｅ融合タンパク質ＶＬＰの電子顕微鏡画像。白色の水平バーは１００ｎｍに相当する。

【図21A】ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔプラスミドマップの説明。プラスミドは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５の発現に役立つ。

【図21B】ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ＣＭＶＢ３－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔプラスミドマップの説明。プラスミドは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊の発現に役立つ。

【図22A】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；０－ＩＰＴＧ誘導前の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔ細胞内のタンパク質；Ｔ－２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔ細胞内の総タンパク質。Ｓ－スクロース勾配（２０～６０％）前の細胞抽出物中の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで）。アスタリスク（＊）は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中のＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５の相対位置を示す。

【図22B】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。 Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；０－ＩＰＴＧ誘導前の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔ細胞内のタンパク質；Ｔ－２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔ細胞内の総タンパク質。Ｓ－スクロース勾配（２０～６０％）前の細胞抽出物中の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで）。アスタリスク（＊）は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中のＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊の相対位置を示す。

【図23A】精製ＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５モザイクＶＬＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；１－１３０００ｒｐｍでの清澄化後の精製可溶性ＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５モザイクＶＬＰ；２－１３０００ｒｐｍでの清澄化後の不溶性ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５／ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０。

【図23B】精製ＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５モザイクＶＬＰの電子顕微鏡画像。水平バーは２００ｎｍに相当する。

【図23C】精製ＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊モザイクＶＬＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。 Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；１－１３０００ｒｐｍでの清澄化後の精製可溶性ＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊モザイクＶＬＰ。

【図23D】精製ＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊モザイクＶＬＰの電子顕微鏡画像。

【図24】ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ＣＭＶＢ３ｄ－２ｘｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔプラスミドマップの説明。プラスミドは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５の発現に役立つ。

【図25】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５の精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；０－ＩＰＴＧ誘導前の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－２ｘｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔ細胞内のタンパク質；Ｔ－２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－２ｘｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔ細胞内の総タンパク質。Ｓ－スクロース勾配（２０～６０％）前の細胞抽出物中の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで）。アスタリスク（＊）は、ゲル中のＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５タンパク質の相対位置を示す。

【図26A】精製ＣＭＶ－Ｍ－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５モザイクＶＬＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；１－１３０００ｒｐｍでの清澄化後の精製可溶性ＣＭＶ－Ｍ－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５モザイクＶＬＰ；２－１３０００ｒｐｍでの清澄化後の不溶性ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５／ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０。

【図26B】精製ＣＭＶ－Ｍ－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５モザイクＶＬＰの電子顕微鏡画像。水平バーは２００ｎｍに相当する。

【図27】ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｃＩＬ１ｂ－ＣＭＶｔｔプラスミドマップの説明。プラスミドは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｃＩＬ－１ｂ及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－ｃＩＬ－１ｂの発現に役立つ。

【図28】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｃＩＬ－１ｂ及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－ｃＩＬ－１ｂの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；０－ＩＰＴＧ誘導前の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｃＩＬ１ｂ－ＣＭＶｔｔ細胞内のタンパク質；Ｔ－２０℃で１８時間培養した後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６／ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｃＩＬ１ｂ－ＣＭＶｔｔ細胞内の総タンパク質。Ｓ－スクロース勾配（２０～６０％）前の細胞抽出物中の可溶性タンパク質；Ｐ－不溶性タンパク質；１～６－スクロース勾配画分（チューブの底部での６０％から上部での０％まで）。アスタリスク（＊）は、ゲル中のＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｃＩＬ－１ｂタンパク質の相対位置を示す。

【図29A】精製ＣＭＶ－Ｍ－ｃＩＬ－１ｂモザイクＶＬＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析。Ｍ－タンパク質サイズマーカーＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃２６６２０）；１－１３０００ｒｐｍでの清澄化後の精製可溶性ＣＭＶ－Ｍ－ｃＩＬ－１ｂモザイクＶＬＰ；２－１３０００ｒｐｍでの清澄化後の不溶性ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｃＩＬ－１ｂ／ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０。

【図29B】精製ＣＭＶ－Ｍ－ｃＩＬ－１ｂモザイクＶＬＰの電子顕微鏡画像。水平バーは２００ｎｍに相当する。

【発明を実施するための形態】

【0015】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載及び開示された実施形態、好ましい実施形態及び非常に好ましい実施形態は、具体的に再度言及されるか、簡潔にするためにその繰り返しが回避されるかどうかに関係なく、すべての態様及び他の実施形態、好ましい実施形態及び非常に好ましい実施形態に適用されるべきである。本明細書で使用される冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的対象の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指す。本明細書で使用される用語「又は」は、文脈上別途明確に示されない限り、「及び／又は」を意味すると理解されるべきである。

【0016】

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用される用語「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、非複製的又は非感染性、好ましくは非複製的かつ非感染性ウイルス粒子を指すか、ウイルス粒子、好ましくはウイルスのカプシドに似た非複製的又は非感染性、好ましくは非複製的かつ非感染性構造を指す。本明細書で使用される用語「非複製的」は、ＶＬＰに含まれるゲノムを複製することができないことを指す。本明細書で使用される用語「非感染性」は、宿主細胞に入ることができないことを指す。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノム又はゲノム機能の全部又は一部を欠くため、非複製的かつ非感染性である。本発明によるウイルス様粒子は、それらのゲノムとは異なる核酸を含み得る。組換え生成されたウイルス様粒子は、典型的には、宿主細胞由来のＲＮＡを含む。本発明によるウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、本発明のポリペプチドから構成されるウイルスカプシドである。ウイルス様粒子は、典型的には、ウイルス様粒子１つ当たり６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、又は３６０超のタンパク質サブユニットを典型的に含むウイルスコートタンパク質から構成される巨大分子集合体である。典型的かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用は、固有の反復的構成を有するウイルスカプシド又はウイルスカプシド様構造の形成をもたらす。ウイルス様粒子の１つの特徴は、そのサブユニットの高度に秩序化された反復配列である。

【0017】

ＣＭＶの修飾ウイルス様粒子：用語「ＣＭＶの修飾ウイルス様粒子」は、ＣＭＶポリペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質を含むウイルス様粒子を指す。典型的かつ好ましくは、ＣＭＶの修飾ウイルス様粒子は、ＣＭＶのカプシドの構造に類似する。ＣＭＶの修飾ウイルス様粒子は、非複製的及び／又は非感染性であり、ＣＭＶの複製機構をコードする少なくとも単数又は複数の遺伝子を欠き、典型的には、宿主へのウイルスの付着又は侵入に関与する単数又は複数のタンパク質をコードする単数又は複数の遺伝子も欠く。この定義には、上記の単数又は複数の遺伝子が依然として存在するが不活性である修飾ウイルス様粒子も含まれる。好ましくは、非複製的及び／又は非感染性修飾ウイルス様粒子は、組換え遺伝子技術によって得られ、典型的かつ好ましくはウイルスゲノムを含まない。２つ以上の異なるポリペプチドを含む修飾ウイルス様粒子は、「モザイクＶＬＰ」と呼ばれ、特に本発明に包含される。モザイク修飾ウイルス様粒子は、本発明の非常に好ましい実施形態及び態様である。したがって、一実施形態では、本発明による修飾ウイルス様粒子は、少なくとも２つの異なる種のポリペプチドを含み、非常に好ましくは、上記モザイクＶＬＰは、モザイク修飾ＣＭＣ ＶＬＰをもたらす、本発明に従って場合により修飾された２つの異なる種のＣＭＶポリペプチドを含む。好ましくは、ＣＭＶの修飾ＶＬＰは、典型的にはＶＬＰ１つ当たり１８０のそのようなタンパク質サブユニットを含む、本発明に従って修飾されたＣＭＶポリペプチドから構成される巨大分子集合体である。

【0018】

ポリペプチド：本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結されたアミノ酸モノマーから構成されるポリマーを指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質が、ポリペプチドの定義内に含まれる。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」はまた、典型的かつ好ましくは、以前に定義され、限定するものではないが、グリコシル化を含む翻訳後修飾などの修飾を包含するポリペプチドを指すべきである。好ましい実施形態では、本明細書で使用される上記用語「ポリペプチド」は、以前に定義され、グリコシル化などの翻訳後修飾などの修飾を包含しないポリペプチドを指すべきである。特に、上記生物学的に活性なペプチドについては、上記グリコシル化などの上記修飾は、その後のインビボでも、例えば細菌によって起こり得る。

【0019】

キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）ポリペプチド、ＣＭＶポリペプチド：本明細書で使用される用語「キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）ポリペプチド」は、（ｉ）キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）のコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｉｉ）変異アミノ酸配列であって、変異対象のアミノ酸配列がＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、上記変異アミノ酸配列、及び変異対象の上記アミノ酸配列、すなわち、ＣＭＶの上記コートタンパク質が、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、一層好ましくは少なくとも９８％、またさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す変異アミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなるポリペプチドを指す。典型的かつ好ましくは、ＣＭＶポリペプチドは、自己集合による発現時にＣＭＶのウイルス様粒子を形成することができる。本明細書で使用される場合、用語「キメラ」は、ポリペプチドの文脈で言及する場合、２つ以上の異なる供給源からのポリペプチド成分を含むポリペプチドを指すことを意図している。この用語はさらに、ポリペプチド成分が一緒に、すなわち、それぞれ融合及びペプチド結合によって結合又は付着される特定の様式を付与することを意図している。したがって、用語「キメラＣＭＶポリペプチド」は、そのように定義され、特に本発明に従って定義される。

【0020】

キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）：本明細書で使用される用語「キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）」は、自然に発生する、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）のコートタンパク質を指す。キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）の極めて広い宿主範囲のために、ＣＭＶの多くの異なる株及び分離株が知られており、上記株及び分離株のコートタンパク質の配列が決定されており、したがって当業者にも知られている。ＣＭＶの上記コートタンパク質（ＣＰ）の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ｗｗｗ．ｄｐｖｗｅｂ．ｎｅｔ又はｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／などの公知のデータベースに記載されており、そこから検索可能である。ＣＭＶの具体例ＣＰは、国際公開第２０１６／０６２７２０号パンフレットの１２頁８行～１３頁２５行に記載されており、その開示は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。ＣＭＶコートタンパク質の非常に好ましい例及び実施形態は、配列番号６２に提供されている。したがって、好ましくは、本明細書で使用される用語「キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）のコートタンパク質」は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を指し、上記アミノ酸配列は、配列番号６２、又は配列番号６２の少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、また一層好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９８％、なおまた一層さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。

【0021】

これらの株及び分離株が、コートタンパク質のＮ末端を含む様々なタンパク質ドメインに、高度に類似したコートタンパク質配列を有することは注目に値する。特に、完全に配列決定された全ＣＭＶ分離株の９８．１％が、それらのコートタンパク質配列の最初の２８アミノ酸以内で８５％を超える配列同一性を共有し、完全に配列決定された全ＣＭＶ分離株のなお７９．５％が、それらのコートタンパク質配列の最初の２８アミノ酸以内で９０％を超える配列同一性を共有する。

【0022】

ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域：本明細書で使用される用語「ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域」は、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端、特にＣＭＶのコートタンパク質のＮ末端、又は上記ＣＭＶポリペプチドもしくはＣＭＶの上記コートタンパク質のＮ末端の領域を指すが、上記ＣＭＶポリペプチド又は上記コートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合、上記ＣＭＶポリペプチド又はＣＭＶの上記コートタンパク質のＮ末端の第２のアミノ酸から始まる。好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチド又は上記コートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合、実用的な観点から、開始コドンをコードするメチオニンは、通常欠失され、本発明に従ってＴｈ細胞エピトープのＮ末端に付加される。さらに好ましくは、１つ、２つ又は３つの付加的なアミノ酸、好ましくは１つのアミノ酸が、場合により、クローニング目的のために開始メチオニンとＴｈ細胞エピトープとの間に挿入され得る。本明細書で使用される用語「ＣＭＶポリペプチド又はＣＭＶコートタンパク質の変異アミノ酸配列のＮ末端領域」は、上記ＣＭＶポリペプチドもしくはＣＭＶの上記コートタンパク質の上記変異アミノ酸配列のＮ末端、又は上記ＣＭＶポリペプチドもしくはＣＭＶの上記コートタンパク質の上記変異アミノ酸配列のＮ末端の領域を指すが、上記変異アミノ酸配列がＮ末端メチオニン残基を含む場合、上記ＣＭＶポリペプチド又はＣＭＶの上記コートタンパク質の上記変異アミノ酸配列のＮ末端の第２のアミノ酸から始まる。好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチド又は上記コートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合、実用的な観点から、開始コドンをコードするメチオニンは、通常欠失され、Ｔｈ細胞エピトープのＮ末端に付加される。さらに好ましくは、１つ、２つ又は３つの付加的なアミノ酸、好ましくは１つのアミノ酸が、場合により、クローニング目的のために開始メチオニンとＴｈ細胞エピトープとの間に挿入され得る。

【0023】

組換えポリペプチド：本発明の文脈では、用語「組換え」は、ポリペプチドの文脈で使用される場合、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１つの工程を含むプロセスによって得られるポリペプチドを指す。典型的かつ好ましくは、組換えポリペプチドは原核生物発現系において生成される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物発現系で発現される組換え生成ポリペプチドがＮ末端メチオニン残基を含み得ることは当業者にとって明らかである。Ｎ末端メチオニン残基は、典型的には、組換えポリペプチドの成熟中に発現宿主内の組換えポリペプチドから切断される。ただし、Ｎ末端メチオニンの切断は不完全であり得る。したがって、組換えポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基の有無にかかわらず、普通なら同一のポリペプチドの混合物を含み得る。典型的かつ好ましくは、組換えポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基を有する１０％未満、さらに好ましくは５％未満、さらに一層好ましくは１％未満の組換えポリペプチドを含む。

【0024】

組換え修飾ウイルス様粒子：本発明の文脈では、用語「組換え修飾ウイルス様粒子」は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１つの工程を含むプロセスによって得られる修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を指す。

【0025】

変異アミノ酸配列：用語「変異アミノ酸配列」は、変異対象のアミノ酸配列に規定の変異セットを導入することによって得られるアミノ酸配列を指す。本発明の文脈では、変異対象の上記アミノ酸配列は、典型的かつ好ましくは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列である。したがって、変異アミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸残基が異なり、上記変異アミノ酸配列、及び変異対象の上記アミノ酸配列は、少なくとも９０％の配列同一性を示す。典型的かつ好ましくは、上記変異アミノ酸配列、及び変異対象の上記アミノ酸配列は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。好ましくは、上記変異アミノ酸配列と変異対象の上記配列とは、最大１１、１０、９、８、７、６、４、３、２又は１つのアミノ酸残基が異なり、さらに好ましくは、上記差は、挿入、欠失及びアミノ酸交換から選択される。好ましくは、変異アミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸が異なり、好ましくは上記差はアミノ酸交換である。

【0026】

残基に対応する位置．．．：別のアミノ酸配列の所与の残基に対応する、アミノ酸配列上の位置は、配列アラインメントによって、典型的かつ好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して、最も好ましくは標準設定を使用して同定することができる。典型的かつ好ましい標準設定は、ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔである。

【0027】

配列同一性：２つの所与のアミノ酸配列の配列同一性は、両配列のアラインメントに基づいて決定される。配列同一性を決定するためのアルゴリズムは当業者に利用可能である。好ましくは、２つのアミノ酸配列の配列同一性は、「ＢＬＡＳＴ」プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）又は「ＣＬＵＳＴＡＬＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）などの公的に利用可能なコンピュータ相同性プログラムを使用して、これにより、好ましくはｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉのＮＣＢＩホームページで提供される「ＢＬＡＳＴ」プログラムによって、そこに提供されるデフォルト設定を使用して決定される。典型的かつ好ましい標準設定は、ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３；ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ：０；ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；ｇａｐ ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １；ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔである。

【0028】

アミノ酸交換：アミノ酸交換という用語は、異なる化学構造を有する任意の他のアミノ酸残基による、好ましくは別のタンパク質新生アミノ酸残基による、アミノ酸配列内の所与のアミノ酸残基の交換を指す。したがって、アミノ酸の挿入又は欠失とは対照的に、アミノ酸交換は、上記アミノ酸配列のアミノ酸の総数を変化させない。

【0029】

エピトープ：エピトープという用語は、抗原、好ましくはポリペプチドの連続的又は不連続的な部分を指し、上記部分は、ＭＨＣ分子に関連して抗体又はＴ細胞受容体によって特異的に結合され得る。抗体に関して、特異的結合は非特異的結合を排除するが、交差反応性を必ずしも排除しない。エピトープは、典型的には、抗原部位に固有の空間的立体構造に５～２０個のアミノ酸を含む。

【0030】

Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ：本明細書で使用される用語「Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ」は、ヘルパーＴｈ細胞による認識が可能なエピトープを指す。典型的かつ好ましくは、本明細書で使用される用語「Ｔｈ細胞エピトープ」は、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができるＴｈ細胞エピトープを指す。ペプチド配列がＴｈ細胞エピトープであるかどうかを決定する最も簡単な方法は、ペプチドが個々のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を測定することである。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子への既知のＴｈ細胞エピトープペプチドの結合と競合するペプチドの能力によって測定され得る。ＨＬＡ－ＤＲ分子の代表的な選択は、例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１に記載されている。ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＴｈ細胞エピトープの親和性は、少なくとも１０^－５Ｍであるべきである。異なる個体に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子の代表的な集合は、Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７－２２４２に示されている。結果として、本明細書で使用される用語「Ｔｈ細胞エピトープ」は、好ましくは、免疫化及びブースティング時に測定可能なＴ細胞応答をもたらすＴｈ細胞エピトープを指す。さらに、本明細書で使用されるまたさらに好ましい用語「Ｔｈ細胞エピトープ」は、好ましくは、少なくとも５００ｎＭの親和性で（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１、及び本明細書に引用されている参考文献に記載されているように）、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ３、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲ５２ａ、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択され、また好ましくは、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらになお好ましくは少なくとも３つのＤＲ対立遺伝子に結合することができるＴｈ細胞エピトープを指す。上記親和性を評価するための好ましい結合アッセイには、Ｓｅｔｔｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１４２：３５－４０に記載されているものがある。またさらになお好ましい様式では、本明細書で使用される用語「Ｔｈ細胞エピトープ」は、少なくとも５００ｎＭの親和性で（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１、及び本明細書に引用されている参考文献に記載されているように）、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらになお好ましくは少なくとも３つのＤＲ対立遺伝子に結合することができるＴｈ細胞エピトープを指す。上記親和性を評価するための好ましい結合アッセイには、Ｓｅｔｔｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１４２：３５－４０に記載されているものがある。細胞エピトープは、例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１，Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７－２２４２，Ｃａｌｖｏ－Ｃａｌｌｅ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）１５９：１３６２－１３７３、及びＶａｌｍｏｒｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１４９：７１７－７２１によって記載され、当業者に公知である。

【0031】

抗原性ポリペプチド：本明細書で使用される場合、用語「抗原性ポリペプチド」は、ＭＨＣ分子によって提示されると、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって結合され得る分子を指す。抗原性ポリペプチドはさらに、免疫系によって認識され得、及び／又はＢリンパ球及び／又はＴリンパ球の活性化をもたらす液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導し得る。抗原性ポリペプチドは、１つ以上のエピトープ（Ｂエピトープ及びＴエピトープ）を有することができる。本明細書で使用される抗原性ポリペプチドはまた、いくつかの個々の抗原性ポリペプチドの混合物であり得る。本発明のポリペプチド、特に、本発明の修飾ウイルス様粒子を形成している、本発明の上記融合タンパク質は、抗原性ポリペプチドを含む。

【0032】

ピーナッツアレルゲン：本明細書で使用される用語「ピーナッツアレルゲン」は、ヒトに対してアレルギーを引き起こすことが示唆されるナンキンマメ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）種の任意のタンパク質及びそのアイソフォームを指す。好ましくは、本明細書で使用される用語「ピーナッツアレルゲン」は、ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎ．ｏｒｇの下に検索可能であるように、示唆されるピーナッツアレルゲン及びそのアイソフォームのいずれか、又はそのようなピーナッツアレルゲン及びそのアイソフォームと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。さらに好ましくは、本明細書で使用される用語「ピーナッツアレルゲン」は、ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎ．ｏｒｇの下に検索可能であるように、現在１７の示唆されるピーナッツアレルゲン及びそのアイソフォームのいずれか、又はそのようなピーナッツアレルゲン及びそのアイソフォームと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。またさらに好ましくは、本明細書で使用される用語「ピーナッツアレルゲン」は、Ａｒａ ｈ１、Ａｒａ ｈ２、Ａｒａ ｈ３、Ａｒａ ｈ４、Ａｒａ ｈ５、Ａｒａ ｈ６、Ａｒａ ｈ７、Ａｒａ ｈ８、Ａｒａ ｈ９、Ａｒａ ｈ１０、Ａｒａ ｈ１１、Ａｒａ ｈ１２、Ａｒａ ｈ１３、Ａｒａ ｈ１４、Ａｒａ ｈ１５、Ａｒａ ｈ１６及びＡｒａ ｈ１７から選択されるピーナッツアレルゲン及びそのアイソフォームのいずれか１つ、又はそのようなピーナッツアレルゲン及びそのアイソフォームと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。またさらに好ましくは、本明細書で使用される用語「ピーナッツアレルゲン」は、Ａｒａ ｈ１、Ａｒａ ｈ２、Ａｒａ ｈ３及びＡｒａ ｈ６から選択されるピーナッツアレルゲン及びそのアイソフォームのいずれか１つ、又はそのようなピーナッツアレルゲン及びそのアイソフォームと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。またさらに好ましくは、本明細書で使用される用語「ピーナッツアレルゲン」は、Ａｒａ ｈ１、Ａｒａ ｈ２、Ａｒａ ｈ３及びＡｒａ ｈ６から選択される任意のタンパク質、ならびにそのアイソフォーム、又はそのようなピーナッツアレルゲンと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。またさらに好ましくは、本明細書で使用される用語「ピーナッツアレルゲン」は、Ａｒａ ｈ１、Ａｒａ ｈ２、Ａｒａ ｈ２０１、Ａｒａ ｈ２０２、Ａｒａ ｈ３及びＡｒａ ｈ６から選択される任意のタンパク質、又はそのようなピーナッツアレルゲンと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。

【0033】

Ｆｅｌ ｄ１タンパク質：本明細書で使用される用語「Ｆｅｌ ｄ１タンパク質」は、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１及びＦｅｌ ｄ１の鎖２を含むか、あるいはそれらからなるタンパク質を指す。好ましくは、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１及びＦｅｌ ｄ１の鎖２は共有結合している。好ましい一実施形態では、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１及びＦｅｌ ｄ１の鎖２は、少なくとも１つのジスルフィド結合を介して連結されている。別の好ましい実施形態では、鎖１及び鎖２は、直接又はスペーサーを介して融合され、この場合、上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、スペーサーをさらに含むか、あるいはそれからなる。好ましくは、本明細書で定義されるＦｅｌ ｄ１タンパク質は、合計で最大３００個、さらになお好ましくは最大２００個のアミノ酸からなる。典型的かつ好ましくは、本発明によるＦｅｌ ｄ１タンパク質は、天然に存在するＦｅｌ ｄ１のいずれかに特異的に結合する抗体の産生をインビボで誘導することができる。

【0034】

Ｆｅｌ ｄ１の鎖１：本明細書で使用される用語「Ｆｅｌ ｄ１の鎖１」は、配列番号７６のアミノ酸配列又はその相同配列を含むか、あるいはそれからなるポリペプチドを指す。本明細書で使用される用語「配列番号７６の相同配列」は、８０％超、さらに好ましくは９０％超、さらになお好ましくは９５％超である、配列番号７６との同一性を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される用語「Ｆｅｌ ｄ１の鎖１」はまた、本明細書で定義されるＦｅｌ ｄ１の鎖１の、限定するものではないが、少なくとも１つのグリコシル化を含む少なくとも１つの翻訳後修飾を包含するポリペプチドを指すべきである。好ましくは、本明細書で定義されるＦｅｌ ｄ１の鎖１は、合計で最大１３０個、さらになお好ましくは最大１００個のアミノ酸からなる。

【0035】

Ｆｅｌ ｄ１の鎖２：本明細書で使用される用語「Ｆｅｌ ｄ１の鎖２」は、配列番号７７、配列番号７８もしくは配列番号７９のアミノ酸配列、又はその相同配列を含むか、あるいはそれからなるポリペプチドを指す。本明細書で使用される用語「配列番号７７、配列番号７８又は配列番号７９の相同配列」は、８０％超、さらに好ましくは９０％超、さらになお好ましくは９５％超である、配列番号７７、配列番号７８又は配列番号７９との同一性を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される用語「Ｆｅｌ ｄ１の鎖２」はまた、本明細書で定義されるＦｅｌ ｄ１の鎖２の、限定するものではないが、少なくとも１つのグリコシル化を含む少なくとも１つの翻訳後修飾を包含するポリペプチドを指すべきである。好ましくは、本明細書で定義されるＦｅｌ ｄ１の鎖２は、合計で最大１５０、さらになお好ましくは最大１３０、さらに一層好ましくは最大１００個のアミノ酸からなる。

【0036】

アジュバント：本明細書で使用される用語「アジュバント」は、宿主内でデポーの生成を可能にし、これにより、本発明のワクチン及び医薬組成物とそれぞれ組み合わせた場合にさらになお増強された免疫応答をもたらし得る、免疫応答の非特異的刺激剤、又は物質を指す。好ましいアジュバントは、完全及び不完全フロイントアジュバント、アルミニウム含有アジュバント、好ましくは水酸化アルミニウム、及び修飾ムラミルジペプチドである。さらに好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ））及びコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）である。そのようなアジュバントも当技術分野で周知である。本発明の組成物とともに投与することができる追加のアジュバントには、限定するものではないが、モノホスホリル脂質免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ－２１、ＱＳ－１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩（ミョウバン）、ＭＦ－５９、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７、ＯＭ－２９４及びビロソームアジュバント技術が含まれる。アジュバントはまた、これらの物質の混合物を含み得る。ウイルス様粒子は、一般にアジュバントとして記載されている。ただし、用語「アジュバント」は、本出願の文脈内で使用される場合、本発明の修飾ウイルス様粒子ではないアジュバントを指す。むしろ「アジュバント」は、本発明の組成物、ワクチン又は医薬組成物の追加の異なる成分に関する。

【0037】

アミノ酸リンカー：本明細書で使用される用語「アミノ酸リンカー」は、アミノ酸残基のみからなるリンカーを指す。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、当技術分野で公知の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、全Ｌもしくは全Ｄ又はそれらの混合物から構成される。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、好ましくは天然アミノ酸、全Ｌもしくは全Ｄ又はそれらの混合物である。

【0038】

ＧＳ－リンカー：本明細書で使用される用語「ＧＳ－リンカー」は、グリシン及びセリンアミノ酸残基のみからなるリンカーを指す。本発明によるＧＳ－リンカーは、少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリン残基を含む。典型的かつ好ましくは、本発明によるＧＳ－リンカーは、最大５０アミノ酸の長さを有し、典型的かつさらに好ましくは、本発明によるＧＳ－リンカーは、最大３０アミノ酸の長さを有する。

【0039】

ＧＳＴ－リンカー：本明細書で使用される用語「ＧＳＴ－リンカー」は、グリシン、セリン及びトレオニンアミノ酸残基を含む、好ましくはそれらからなるリンカーを指す。本発明によるＧＳＴ－リンカーは、少なくとも１つのグリシン、少なくとも１つのセリン及び少なくとも１つのトレオニン残基を含む。典型的かつ好ましくは、本発明によるＧＳＴ－リンカーは、最大５０アミノ酸の長さを有し、典型的かつさらに好ましくは、本発明によるＧＳＴ－リンカーは、最大３０アミノ酸の長さを有する。

【0040】

ＧＳＥＤ－リンカー：本明細書で使用される用語「ＧＳＥＤ－リンカー」は、グリシン、セリン、グルタミン酸及びアスパラギン酸アミノ酸残基を含む、好ましくはそれらからなるリンカーを指す。本発明によるＧＳＥＤ－リンカーは、少なくとも１つのグリシン、少なくとも１つのセリン、少なくとも１つのグルタミン酸及び少なくとも１つのアスパラギン酸残基を含む。典型的かつ好ましくは、本発明によるＧＳＥＤ－リンカーは、最大５０アミノ酸の長さを有し、典型的かつさらに好ましくは、本発明によるＧＳＥＤ－リンカーは、最大３０アミノ酸の長さを有する。

【0041】

免疫刺激物質：本明細書で使用される場合、用語「免疫刺激物質」は、免疫応答を誘導及び／又は増強することができる物質を指す。本明細書で使用される免疫刺激物質には、限定するものではないが、トール様受容体活性化物質、及びサイトカイン分泌を誘導する物質が含まれる。トール様受容体活性化物質には、限定するものではないが、免疫刺激核酸、ペプチドグリカン、リポ多糖、リポテイコ酸、イミダゾキノリン化合物、フラジェリン、リポタンパク質、及び免疫刺激有機物質、例えば、タキソールが含まれる。

【0042】

免疫刺激核酸（ＩＳＳ－ＮＡ）：本明細書で使用される場合、免疫刺激核酸という用語は、免疫応答を誘導及び／又は増強することができる核酸を指す。免疫刺激核酸は、リボ核酸、特にデスオキシリボ核酸（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含み、リボ核酸及びデスオキシリボ核酸はともに、二本鎖又は一本鎖のいずれかであり得る。好ましいＩＳＳ－ＮＡは、デスオキシリボ核酸であり、さらに好ましくは、上記デスオキシリボ核酸は一本鎖である。好ましくは、免疫刺激核酸は、非メチル化Ｃを含む少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含有する。非常に好ましい免疫刺激核酸は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含み、上記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、少なくとも１つ、好ましくは１つのＣＧジヌクレオチドを含むか、好ましくはそれからなり、Ｃは非メチル化である。必須ではないが好ましくは、上記ＣＧジヌクレオチドは回文配列の一部である。免疫刺激核酸という用語はまた、修飾塩基、好ましくは４－ブロモ－シトシンを含む核酸を指す。本発明の文脈では、特に好ましいのは、樹状細胞内でＩＦＮ－α産生を刺激することができるＩＳＳ－ＮＡである。本発明の目的に有用な免疫刺激核酸は、例えば、国際公開第２００７／０６８７４７Ａ１号パンフレットに記載されている。

【0043】

オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、２個以上のヌクレオチド、好ましくは約６～約２００個のヌクレオチド、さらに好ましくは２０～約１００個のヌクレオチド、最も好ましくは２０～４０個のヌクレオチドを含む核酸配列を指す。非常に好ましくは、オリゴヌクレオチドは約３０個のヌクレオチドを含み、さらに好ましくはオリゴヌクレオチドは正確に３０個のヌクレオチドを含み、最も好ましくはオリゴヌクレオチドは正確に３０個のヌクレオチドからなる。オリゴヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドであり、好ましくは、（ａ）未修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ、及び（ｂ）修飾ＲＮＡ又はＤＮＡから選択される。修飾体は、骨格又はヌクレオチド類似体を含み得る。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、（ａ）一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、（ｂ）一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、（ｃ）一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、（ｄ）一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ならびに（ｅ）一本鎖、もしくはさらに好ましくは二本鎖、又は一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子からなる群から選択される。好ましいヌクレオチド修飾体／類似体は、（ａ）ペプチド核酸、（ｂ）イノシン、（ｃ）トリチル化塩基、（ｄ）ホスホロチオアート、（ｅ）アルキルホスホロチオアート、（ｆ）５－ニトロインドールデスオキシリボフリラノシル（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｆｌｉｒａｎｏｓｙｌ）、（ｇ）５－メチルデスオキシシトシン（ｍｅｔｈｙｌｄｅｓｏｘｙｃｙｔｏｓｉｎｅ）及び（ｈ）５，６－ジヒドロ－５，６－ジヒドロキシデスオキシチミジン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｅｓｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）からなる群から選択される。ホスホロチオアート化ヌクレオチドは、細胞内又は生物内の分解から保護されるため、好ましいヌクレオチド修飾である。リン酸ジエステル結合ヌクレオチドのみからなる未修飾オリゴヌクレオチドは、典型的には修飾ヌクレオチドよりも活性であるため、本発明の文脈では一般に好ましい。最も好ましいのは、リン酸ジエステル結合デオキシヌクレオチドのみからなるオリゴヌクレオチドであり、さらに好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは一本鎖である。細胞内、好ましくは樹状細胞内でＩＦＮ－α産生を刺激することができるオリゴヌクレオチドがさらに好ましい。細胞内でＩＦＮ－α産生を刺激することができる非常に好ましいオリゴヌクレオチドは、Ａ型ＣｐＧ及びＣ型ＣｐＧから選択される。Ｃａｐを有しないＲＮＡ分子がさらに好ましい。

【0044】

ＣｐＧモチーフ：本明細書で使用される場合、用語「ＣｐＧモチーフは、Ｃが、非メチル化されており、中心ＣｐＧ（の３’及び５’側）に隣接する少なくとも１つの塩基、好ましくは１つ又は２つのヌクレオチドによって囲まれた非メチル化中心ＣｐＧを含むヌクレオチドのパターン、すなわち、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを指す。典型的かつ好ましくは、本明細書で使用されるＣｐＧモチーフは、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド、ならびにその５’及び３’末端の２つのヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる。理論に拘束されるものではないが、ＣｐＧに隣接する塩基は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドに対する活性のかなりの部分を付与する。

【0045】

非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」又は「ＣｐＧ」は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド、好ましくはオリゴデスオキシヌクレオチドを指す。したがって、ＣｐＧは、少なくとも１つの非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチドを含む。好ましいＣｐＧは、脊椎動物骨髄由来細胞に対する分裂促進効果を刺激／活性化し、例えば、有するか、脊椎動物骨髄由来細胞によるサイトカイン発現を誘導又は増加させる。例えば、ＣｐＧは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、単球及びマクロファージを活性化するのに有用であり得る。好ましくは、ＣｐＧは、３’にグアノシンが続く非メチル化シトシンを含むオリゴデスオキシヌクレオチド、好ましくは一本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドに関し、上記非メチル化シトシン及び上記グアノシンは、ホスファート結合によって連結されており、好ましくは上記ホスファート結合は、リン酸ジエステル結合又はホスホロチオアート結合であり、さらに好ましくは上記ホスファート結合はリン酸ジエステル結合である。ＣｐＧは、ヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオエステル結合を含む類似体を含むことができ、二本鎖又は一本鎖であり得る。一般に、二本鎖分子の方がインビボで安定であるが、一本鎖分子は増大した免疫活性を有する。好ましくは、本明細書で使用される場合、ＣｐＧは、少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドであり、さらに好ましくは、上記ＣｐＧは、１０～６０、さらに好ましくは１５～５０、さらに一層好ましくは２０～４０、さらに一層好ましくは約３０、最も好ましくは正確に３０ヌクレオチド長である。ＣｐＧは、メチル化及び／又は非メチル化ヌクレオチドからなり得、上記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、Ｃが非メチル化である少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む。ＣｐＧはまた、メチル化及び非メチル化配列ストレッチを含み得、上記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、Ｃが非メチル化である少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む。非常に好ましくは、ＣｐＧは、３’にグアノシンが続く非メチル化シトシンを含む一本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドに関し、上記非メチル化シトシン及び上記グアノシンは、リン酸ジエステル結合によって連結されている。ＣｐＧは、ヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオエステル結合を含む類似体を含むことができ、二本鎖又は一本鎖であり得る。一般に、リン酸ジエステルＣｐＧは以下に示すようにＡ型ＣｐＧであり、一方、ホスホチオエステル安定化ＣｐＧはＢ型ＣｐＧである。本発明の文脈では、好ましいＣｐＧオリゴヌクレオチドはＡ型ＣｐＧである。

【0046】

Ａ型ＣｐＧ：本明細書で使用される場合、用語「Ａ型ＣｐＧ」又は「Ｄ型ＣｐＧ」は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴデスオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を指す。Ａ型ＣｐＧは、Ｔ細胞の活性化及び樹状細胞の成熟を優先的に刺激し、ＩＦＮ－α産生を刺激することができる。Ａ型ＣｐＧでは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフのヌクレオチドは、少なくとも１つのリン酸ジエステル結合によって連結されている。Ａ型ＣｐＧは、その５’末端及び／又は好ましくはその３’末端にホスホロチオアート結合ヌクレオチドが隣接し得る少なくとも１つのリン酸ジエステル結合ＣｐＧモチーフを含む。好ましくは、ＣｐＧモチーフ、よって、好ましくはＣＧジヌクレオチドと、少なくとも１つ、好ましくは２つのヌクレオチドを含むその直接隣接領域とは、リン酸ジエステルヌクレオチドから構成される。好ましいＡ型ＣｐＧは、リン酸ジエステル（ＰＯ）結合ヌクレオチドのみからなる。典型的かつ好ましくは、ポリＧモチーフは、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のＧ（グアノシン）、最も好ましくは少なくとも１０のＧを含むか、あるいはそれらからなる。好ましくは、本発明のＡ型ＣｐＧは、回文配列を含むか、あるいはそれからなる。

【0047】

パッケージ化：本明細書で使用される用語「パッケージ化」は、それぞれコア粒子及びＶＬＰに関連したポリアニオン性巨大分子又は免疫刺激物質の状態を指す。本明細書で使用される用語「パッケージ化」は、例えば、化学的カップリングによる共有結合であるか、非共有結合、例えば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであり得る結合を含む。この用語はまた、ポリアニオン性巨大分子の封入又は部分的封入を含む。したがって、ポリアニオン性巨大分子又は免疫刺激物質は、実際の結合、特に共有結合の存在を伴わずＶＬＰによって封入され得る。好ましい実施形態では、少なくとも１つのポリアニオン性巨大分子又は免疫刺激物質は、最も好ましくは非共有結合様式でＶＬＰの内部にパッケージ化される。上記免疫刺激物質が核酸、好ましくはＤＮＡである場合、パッケージ化という用語は、上記核酸がヌクレアーゼ加水分解から隔絶されている、好ましくはＤＮＡｓｅ加水分解（例えばＤＮａｓｅＩ又はベンゾナーゼ）から隔絶されていることを意味し、好ましくは、上記接近性は、国際公開第２００３／０２４４８１Ａ２号パンフレットの例１１～１７に記載されているようにアッセイされる。

【0048】

有効量：本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要又は十分な量を指す。組成物あるいは医薬組成物の有効量は、この選択された結果を達成する量であり、そのような量は、当業者が常用的に決定することができる。好ましくは、本明細書で使用される用語「有効量」は、ピーナッツアレルギーによって引き起こされる少なくとも１つの症状を低減させるレベルまで、上記少なくとも１つのピーナッツアレルゲンのレベルを低下させるのに有効であるのに必要又は十分な量を指す。好ましくは、本明細書で使用される用語「有効量」は、少なくとも１つのピーナッツアレルゲンの活性を中和するのに有効であるのに必要又は十分な量を指す。有効量は、投与される特定の組成物、及び対象のサイズに応じて変化し得る。当業者であれば、過度の実験を必要とすることなく、本発明の特定の組成物の有効量を経験的に決定することができる。

【0049】

治療：本明細書で使用される場合、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療された（ｔｒｅａｔｅｄ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、予防及び／又は療法を指す。一実施形態では、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療された（ｔｒｅａｔｅｄ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、治療的処置を指す。別の実施形態では、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療された（ｔｒｅａｔｅｄ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、予防的処置を指す。

【0050】

第１の態様では、本発明は、少なくとも１つの融合タンパク質を含む、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、上記少なくとも１つの融合タンパク質は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドであって、上記ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶのコートタンパク質を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくはＣＭＶの上記コートタンパク質が、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、また一層好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９８％、なおまた一層さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなるＣＭＶポリペプチドと；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドであって、上記抗原性ポリペプチドが、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入が、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基間にある抗原性ポリペプチドと；（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープであって、上記Ｔヘルパー細胞エピトープが、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、好ましくは上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域が、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応するＴヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなる。非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、第１のアミノ酸リンカー、好ましくは第１のアミノ酸リンカー及び第２のアミノ酸リンカーをさらに含み、上記第１のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置し、上記第１のアミノ酸リンカーは、（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは上記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーからなる群から選択される。

【0051】

好ましいアミノ酸リンカー、すなわち、ＧＳ－リンカー又はＧＳＥＤ－リンカーは、本発明の修飾ＶＬＰを形成する集合プロセスを妨げる球状障害（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を克服するため、及び／又は本発明の形成された修飾ＶＬＰ間の凝集傾向を克服するため、及び／又は非常に長い抗原性ポリペプチドの挿入に対する柔軟性を高めるために非常に有益であることが見出された。これは特に、上記ＧＳ－リンカー又はＧＳＥＤ－リンカーが第１のアミノ酸リンカーとして、及び第２のアミノ酸リンカーとしてさらに適用される場合、またさらに、上記第１のアミノ酸リンカー及び上記第２のアミノ酸リンカーが、上記挿入された抗原性ポリペプチドを伴わず存在するアミノ酸配列状況を模倣する場合、これは本発明の好ましいＣＭＶポリペプチドにとって特に有益であった。したがって、上記挿入された抗原性ポリペプチドを伴わず存在するアミノ酸配列状況を模倣することは、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基間、特に、配列番号５のＳｅｒ（８８）及びＴｙｒ（８９）に対応する位置間に抗原性ポリペプチドを挿入するのに特に有益であることが見出された。好ましくはＧＳ－リンカー又はＧＳＥＤ－リンカーを使用することによる、特に抗原性ポリペプチドのＣ末端に位置し、ＧＳ－リンカーであるか、ＧＳで終端するＧＳＥＤ－リンカーである第２のアミノ酸リンカーを使用することによる、ＧＳの後（すなわち、それぞれ配列番号６２の８４位及び配列番号５の８８位の後）及びＹＹの前（すなわち、それぞれ配列番号６２の８５位及び配列番号５の８９位の前）の抗原性ポリペプチドの挿入は、特に有益であることが見出された。

【0052】

さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つの融合タンパク質を含む、ＣＭＶの修飾ＶＬＰを提供し、上記少なくとも１つの融合タンパク質は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドであって、上記ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶのコートタンパク質を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくはＣＭＶの上記コートタンパク質が、配列番号６２；又は上記コートタンパク質と、好ましくは配列番号６２と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、また一層好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９８％、なおまた一層さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなるＣＭＶポリペプチドと；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドであって、上記抗原性ポリペプチドが、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入が、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基間にある抗原性ポリペプチドと；（ｉｉｉ）第１のアミノ酸リンカー、好ましくは第１のアミノ酸リンカー及び第２のアミノ酸リンカーであって、上記第１のアミノ酸リンカーが、上記抗原性ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置し、好ましくは上記第１のアミノ酸リンカーが、（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは上記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーからなる群から選択される第１のアミノ酸リンカー、好ましくは第１のアミノ酸リンカー及び第２のアミノ酸リンカーとを含むか、好ましくはそれらからなる。非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、Ｔヘルパー細胞エピトープをさらに含み、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応する。

【0053】

別の態様では、本発明は、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）のモザイク修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。第１の態様では、本発明は、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、（ａ）少なくとも１つの融合タンパク質であって、上記少なくとも１つの融合タンパク質が、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記キメラＣＭＶポリペプチドが、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドであって、上記ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶのコートタンパク質を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくはＣＭＶの上記コートタンパク質が、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、また一層好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９８％、なおまた一層さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなるＣＭＶポリペプチドと；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドであって、上記抗原性ポリペプチドが、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入が、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基間にある抗原性ポリペプチドとを含むか、好ましくはそれらからなる少なくとも１つの融合タンパク質；ならびに（ｂ）少なくとも１つのＣＭＶタンパク質であって、上記ＣＭＶタンパク質が、ＣＭＶのコートタンパク質を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくはＣＭＶの上記コートタンパク質が、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、また一層好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９８％、なおまた一層さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、上記ＣＭＶタンパク質が、場合により、Ｔヘルパー細胞エピトープによって修飾され、上記Ｔヘルパー細胞エピトープが、上記ＣＭＶタンパク質のＮ末端領域を置換し、好ましくは上記ＣＭＶタンパク質の上記Ｎ末端領域が、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは上記ＣＭＶタンパク質が、配列番号５を含み、好ましくはそれからなる少なくとも１つのＣＭＶタンパク質を含む。非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、Ｔヘルパー細胞エピトープをさらに含み、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応する。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、第１のアミノ酸リンカー、好ましくは第１のアミノ酸リンカー及び第２のアミノ酸リンカーをさらに含み、上記第１のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置し、上記第１のアミノ酸リンカーは、（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは上記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーからなる群から選択される。

【0054】

本発明のすべての態様について、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基間への上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位である上記セリン（Ｓ）残基と配列番号６２の８５位である上記チロシン（Ｙ）残基との間の挿入に対応する。

【0055】

本明細書に記載及び開示された実施形態、好ましい実施形態及び非常に好ましい実施形態は、具体的に再度言及されるか、簡潔にするためにその繰り返しが回避されるかどうかに関係なく、すべての態様及び他の実施形態、好ましい実施形態及び非常に好ましい実施形態に適用されるべきである。

【0056】

好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は変異アミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、変異対象のアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、上記変異アミノ酸配列、及びＣＭＶの上記コートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、またさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示し、好ましくは、上記変異アミノ酸配列と上記変異対象のアミノ酸配列とは、少なくとも１つ、及び最大１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２つのアミノ酸残基が異なり、さらに好ましくは、これらの差は、（ｉ）挿入、（ｉｉ）欠失、（ｉｉｉ）アミノ酸交換、及び（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組合せから選択される。

【0057】

好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも７５％、好ましくは８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２を有する、ＣＭＶのコートタンパク質である。好ましい実施形態では、ＣＭＶの上記コートタンパク質は、配列番号６２を含む。好ましい実施形態では、ＣＭＶの上記コートタンパク質は、配列番号６２からなる。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質を含む。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質からなる。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドはＣＭＶのコートタンパク質を含み、ＣＭＶの上記コートタンパク質は配列番号６２を含む。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドはＣＭＶのコートタンパク質を含み、ＣＭＶの上記コートタンパク質は配列番号６２からなる。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドはＣＭＶのコートタンパク質からなり、ＣＭＶの上記コートタンパク質は配列番号６２からなる。

【0058】

好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６３又はアミノ酸配列領域を含み、上記アミノ酸配列領域は、配列番号６３と少なくとも７５％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６３又はアミノ酸配列領域を含み、上記アミノ酸配列領域は、配列番号６３と少なくとも８０％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６３又はアミノ酸配列領域を含み、上記アミノ酸配列領域は、配列番号６３と少なくとも８５％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６３又はアミノ酸配列領域を含み、上記アミノ酸配列領域は、配列番号６３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６３又はアミノ酸配列領域を含み、上記アミノ酸配列領域は、配列番号６３と少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６３又はアミノ酸配列領域を含み、上記アミノ酸配列領域は、配列番号６３と少なくとも９８％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６３又はアミノ酸配列領域を含み、上記アミノ酸配列領域は、配列番号６３と少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0059】

好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、上記アミノ酸配列が、配列番号６２を含むか、好ましくはそれからなる、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）配列番号６２の少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり；（ｉ）又は（ｉｉ）で定義される上記アミノ配列は、配列番号６３又はアミノ酸配列領域を含み、上記アミノ酸配列領域は、配列番号６３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、上記アミノ酸配列が、配列番号６２を含むか、好ましくはそれからなる、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）配列番号６２の少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり；（ｉ）又は（ｉｉ）で定義される上記アミノ配列は、配列番号６３又はアミノ酸配列領域を含み、上記アミノ酸配列領域は、配列番号６３と少なくとも９５％の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、上記アミノ酸配列が、配列番号６２を含むか、好ましくはそれからなる、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）配列番号６２の少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり；（ｉ）又は（ｉｉ）で定義される上記アミノ配列は、配列番号６３を含む。

【0060】

好ましい実施形態では、置換された上記Ｎ末端領域のアミノ酸の数は、上記Ｔヘルパー細胞エピトープを構成するアミノ酸の数以下である。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドの上記置換されたＮ末端領域は、５～１５個の連続するアミノ酸からなる。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドの上記置換されたＮ末端領域は、９～１４個の連続するアミノ酸からなる。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドの上記置換されたＮ末端領域は、１１～１３個の連続するアミノ酸からなる。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応する。好ましい実施形態では、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、ユニバーサルＴヘルパー細胞エピトープである。好ましい実施形態では、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、最大２０個のアミノ酸からなる。

【0061】

本発明の好ましい実施形態では、Ｔｈ細胞エピトープは、ＨＡ ３０７－３１９（配列番号６７）、ＨＢＶｎｃ ５０－６９（配列番号６８）、ＴＴ ８３０－８４３（配列番号６４）、ＣＳ ３７８－３９８（配列番号６９）、ＭＴ １７－３１（配列番号７０）、ＴＴ ９４７－９６７（配列番号７１）及びＰＡＤＲＥ（配列番号６５）から選択される。非常に好ましい実施形態では、上記Ｔｈ細胞エピトープは、破傷風毒素に由来するＴｈ細胞エピトープであるか、ＰＡＤＲＥ配列である。好ましい実施形態では、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、ヒトワクチンに由来する。非常に好ましい実施形態では、上記Ｔｈ細胞エピトープは、破傷風毒素に由来するＴｈ細胞エピトープである。好ましい実施形態では、上記Ｔｈ細胞エピトープはＰＡＤＲＥ配列である。非常に好ましい実施形態では、上記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５のアミノ酸配列を含む。非常に好ましい実施形態では、上記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５のアミノ酸配列からなる。非常に好ましい実施形態では、上記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、上記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号６４のアミノ酸配列からなる。非常に好ましい実施形態では、上記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。非常に好ましい実施形態では、上記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号６５のアミノ酸配列からなる。

【0062】

好ましい実施形態では、上記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、上記アミノ酸配列は、配列番号６２、又は配列番号６２の少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり；上記アミノ配列は配列番号６３を含み、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記置換されたＮ末端領域は、１１～１３個の連続するアミノ酸、好ましくは１１個の連続するアミノ酸からなり、さらに好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応する。

【0063】

非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

【0064】

非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号５又は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号５の８８位のアミノ酸残基と８９位のアミノ酸残基との間で配列番号５の上記キメラＣＭＶポリペプチドに挿入されるか、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号６６の８６位のアミノ酸残基と８７位のアミノ酸残基との間で配列番号６６の上記キメラＣＭＶポリペプチドに挿入される。

【0065】

非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号６６の８６位のアミノ酸残基と８７位のアミノ酸残基との間で配列番号６６の上記キメラＣＭＶポリペプチドに挿入される。

【0066】

非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号５の８８位のアミノ酸残基と８９位のアミノ酸残基との間で配列番号５の上記キメラＣＭＶポリペプチドに挿入される。

【0067】

好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、第１のアミノ酸リンカーをさらに含み、上記第１のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置し、上記第１のアミノ酸リンカーは、（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは上記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーからなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、第２のアミノ酸リンカーをさらに含み、上記第２のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置し、上記第２のアミノ酸リンカーは、（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは上記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーからなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、第１のアミノ酸リンカー及び第２のアミノ酸リンカーをさらに含み、上記第１のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＮ末端に位置し、上記第２のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＣ末端に位置し、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは、（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは上記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーからなる群から独立して選択される。

【0068】

好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、最大３０アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、最大２０アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、最大１５アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、最大３０アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、最大２０アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、最大１５アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＮ末端に位置する。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＣ末端に位置する。好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、第２のアミノ酸リンカーをさらに含む。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＮ末端に位置する。好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＣ末端に位置する。好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、第１のアミノ酸リンカー及び第２のアミノ酸リンカーを含む。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＮ末端に位置し、上記第２のアミノ酸リンカーは、上記抗原性ポリペプチドのＣ末端に位置する。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは上記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーからなる群から選択され、好ましくは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含む上記アミノ酸リンカーは、ＧＳＴ－リンカー又はＧＳＥＤ－リンカーである。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎである。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）である。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であり、上記第２のアミノ酸リンカーは、そのＮ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒを有する。さらに好ましい実施形態では、上記ＧＳリンカーは、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーはグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であり、上記ＧＳリンカーは、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝３又は４、ｔ＝１、２又は３、及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、上記ＧＳ－リンカーは、最大３０アミノ酸の長さを有する。さらに好ましい実施形態では、上記ＧＳ－リンカーは、最大２０アミノ酸の長さを有する。さらに好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーはグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であり、上記ＧＳリンカーは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、配列番号１０及び配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーである。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくともＴｈｒとを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＴ－リンカー）であり、さらに好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくとも１つのグルタミン酸と、少なくともアスパラギン酸とを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＥＤ－リンカー）であり、好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくともＴｈｒとを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＴ－リンカー）であり、上記第２のアミノ酸リンカーは、そのＮ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒを有する。さらに好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくとも１つのグルタミン酸と、少なくともアスパラギン酸とを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＥＤ－リンカー）であり、上記第２のアミノ酸リンカーは、そのＮ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒを有する。好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのグリシンと、少なくとも１つのセリンとを含む（ＧＳ－リンカー）、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくともＴｈｒとを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＴ－リンカー）、又は少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくとも１つのグルタミン酸と、少なくともアスパラギン酸とを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＥＤ－リンカー）であり、上記第２のアミノ酸リンカーは、そのＮ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒを有する。さらに好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーはＧＳＥＤリンカーであり、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝１～５、ｔ＝１～５、ｕ＝０又は１、ｘ＝０又は１、ｙ＝０～５及びｚ＝０又は１）のアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーはＧＳＥＤリンカーであり、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝３又は４、ｔ＝１、２又は３、ｕ＝０又は１、ｘ＝０、ｙ＝１～５、好ましくはｙ＝３、及びｚ＝１）のアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、最大３０アミノ酸の長さを有する。さらに好ましい実施形態では、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、最大２０アミノ酸の長さを有する。さらに好ましい実施形態では、上記第１のアミノ酸リンカーはＧＳＥＤ－リンカーであり、上記ＧＳＥＤリンカーは、アミノ酸配列として配列番号１２６を含み、好ましくはそれからなる。

【0069】

好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは上記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーからなる群から選択される。好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは上記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーからなる群から選択され、好ましくは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含む上記アミノ酸リンカーは、ＧＳＴ－リンカー又はＧＳＥＤ－リンカーである。好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎである。好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンからなるグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）である。好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であり、上記第２のアミノ酸リンカーは、そのＮ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒを有する。さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーはグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であり、上記ＧＳリンカーは、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝３又は４、ｔ＝１、２又は３、ｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、上記ＧＳ－リンカーは、最大３０アミノ酸の長さを有する。さらに好ましい実施形態では、上記ＧＳ－リンカーは、最大２０アミノ酸の長さを有する。さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーはグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であり、上記ＧＳリンカーは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、配列番号１１、配列番号３１及び配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、上記ＧＳリンカーは、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーである。

【0070】

好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくともＴｈｒとを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＴ－リンカー）であり、さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくとも１つのグルタミン酸と、少なくともアスパラギン酸とを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＥＤ－リンカー）であり、好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくともＴｈｒとを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＴ－リンカー）であり、上記第２のアミノ酸リンカーは、そのＮ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒを有する。さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくとも１つのグルタミン酸と、少なくともアスパラギン酸とを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＥＤ－リンカー）であり、上記第２のアミノ酸リンカーは、そのＮ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒを有する。好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーは、少なくとも１つのグリシンと、少なくとも１つのセリンとを含む（ＧＳ－リンカー）、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくともＴｈｒとを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＴ－リンカー）、又は少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくとも１つのグルタミン酸と、少なくともアスパラギン酸とを含むアミノ酸リンカー（ＧＳＥＤ－リンカー）であり、上記第２のアミノ酸リンカーは、そのＮ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒを有する。さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーはＧＳＥＤリンカーであり、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝１～５、ｔ＝１～５、ｕ＝０又は１、ｘ＝０又は１、ｙ＝０～５及びｚ＝０又は１）のアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーはＧＳＥＤリンカーであり、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝１～５、ｔ＝１～５、ｕ＝０又は１、ｘ＝０又は１、ｙ＝０～５及びｚ＝０又は１）のアミノ酸配列からなる。さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーはＧＳＥＤリンカーであり、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝３又は４、ｔ＝１、２又は３、ｕ＝０又は１、ｘ＝１、ｙ＝０～５、好ましくはｙ＝０、及びｚ＝０）のアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーはＧＳＥＤリンカーであり、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝３又は４、ｔ＝１、２又は３、ｕ＝０又は１、ｘ＝１、ｙ＝０～５、好ましくはｙ＝０、及びｚ＝０）のアミノ酸配列からなる。さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーはＧＳＥＤリンカーであり、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、（ＴＳ）（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝１～５、ｔ＝１～５、ｕ＝０又は１、ｘ＝０又は１、ｙ＝０～５及びｚ＝０又は１）のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーはＧＳＥＤリンカーであり、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、（ＴＳ）（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝３又は４、ｔ＝１、２又は３、ｕ＝０又は１、ｘ＝１、ｙ＝０～５、好ましくはｙ＝０、及びｚ＝０）のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。さらに好ましい実施形態では、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、最大３０アミノ酸の長さを有する。さらに好ましい実施形態では、上記ＧＳＥＤ－リンカーは、最大２０アミノ酸の長さを有する。さらに好ましい実施形態では、上記第２のアミノ酸リンカーはＧＳＥＤ－リンカーであり、上記ＧＳＥＤリンカーは、アミノ酸配列として配列番号１２７を含み、好ましくはそれからなる。

【0071】

好ましい実施形態では、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは、（ａ．）ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎ；（ｂ．）少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であって、好ましくは上記ＧＳリンカーが、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有するグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）；ならびに（ｃ．）少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーからなる群から独立して選択される。好ましい実施形態では、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは、独立して、ｎ＝２～１０の長さのポリグリシンリンカー（Ｇｌｙ）_ｎである。好ましい実施形態では、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは、独立して、少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）である。好ましい実施形態では、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは、独立して、少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であり、上記第２のアミノ酸リンカーは、そのＮ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒを有する。さらに好ましい実施形態では、上記ＧＳリンカーは、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝１～５、ｔ＝１～５及びｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは、独立して、グリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であり、上記ＧＳリンカーは、（ＧＳ）_ｒ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（ＧＳ）_ｕ（ｒ＝０又は１、ｓ＝３又は４、ｔ＝１、２又は３、ｕ＝０又は１）のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは、独立して、グリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であり、上記ＧＳリンカーは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号４７から選択されるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは、独立して、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択される少なくとも１つのアミノ酸とを含むアミノ酸リンカーである。

【0072】

好ましい実施形態では、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは、独立して、少なくとも１つのＧｌｙと、少なくとも１つのＳｅｒと、少なくとも１つのグルタミン酸と、少なくともアスパラギン酸とを含むＧＳＥＤ－リンカー（ＧＳＥＤ－リンカー）であり、上記第２のアミノ酸リンカーは、そのＮ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒを有する。さらに好ましい実施形態では、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは独立してＧＳＥＤ－リンカーであり、上記ＧＳＥＤリンカーは、（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝１～５、ｔ＝１～５、ｕ＝０又は１、ｘ＝０又は１、ｙ＝０～５及びｚ＝０又は１）；又は（ＴＳ）（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝１～５、ｔ＝１～５、ｕ＝０又は１、ｘ＝０又は１、ｙ＝０～５及びｚ＝０又は１）のアミノ酸配列を独立して有する。

【0073】

さらに好ましい実施形態では、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは独立してＧＳＥＤ－リンカーであり、上記ＧＳＥＤリンカーは、（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝３もしくは４、ｔ＝１、２もしくは３、ｕ＝０もしくは１、ｘ＝１、ｙ＝０～５、好ましくはｙ＝０、及びｚ＝０、又はｓ＝３もしくは４、ｔ＝１、２もしくは３、ｕ＝０もしくは１、ｘ＝０、ｙ＝１～５、好ましくはｙ＝３、及びｚ＝１）；又は（ＴＳ）（ＤＥＤ）_ｘ（Ｇ_ｓＳ）_ｔ（Ｇ）_ｙ（ＤＥＤ）_ｚ（ＧＳ）_ｕ（ｓ＝３又は４、ｔ＝１、２又は３、ｕ＝０又は１、ｘ＝１、ｙ＝０～５、好ましくはｙ＝０、及びｚ＝０）のアミノ酸配列を独立して有する。

【0074】

さらに好ましい実施形態では、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは独立してＧＳＥＤ－リンカーであり、上記ＧＳリンカーは、配列番号１２６及び配列番号１２７から選択されるアミノ酸配列を有する。

【0075】

非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号５の上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基８８（Ｓｅｒ）とアミノ酸残基８９（Ｔｈｒ）との間で上記ＣＭＶポリペプチドに挿入される。

【0076】

非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号５の上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基８８（Ｓｅｒ）とアミノ酸残基８９（Ｔｈｒ）との間で上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、第１及び第２のアミノ酸リンカーをさらに含み、上記第１及び上記第２のアミノ酸リンカーは、独立して、少なくとも１つのグリシン及び少なくとも１つのセリンを含むグリシン－セリンリンカー（ＧＳ－リンカー）であり、上記第２のアミノ酸リンカーは、そのＮ末端にＧｌｙ－Ｓｅｒ配列を有する。

【0077】

一態様及び好ましい実施形態では、本発明は、モザイクウイルス様粒子を提供する。したがって、好ましい実施形態では、ＣＭＶの上記修飾ＶＬＰは、少なくとも１つのＣＭＶタンパク質をさらに含み、上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、ＣＭＶの上記コートタンパク質は、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、また一層好ましくは少なくとも９０％、またさらに好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９８％、なおまた一層さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましい実施形態では、ＣＭＶの上記修飾ＶＬＰは、少なくとも１つのＣＭＶタンパク質をさらに含み、上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記ＣＭＶタンパク質は、場合により、Ｔヘルパー細胞エピトープによって修飾され、好ましくはＣＭＶの上記コートタンパク質は配列番号６２を含む。

【0078】

好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質、又は配列番号６２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質を含む。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質からなる。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質はＣＭＶのコートタンパク質を含み、ＣＭＶの上記コートタンパク質は配列番号６２を含む。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質はＣＭＶのコートタンパク質を含み、ＣＭＶの上記コートタンパク質は配列番号６２からなる。好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質はＣＭＶのコートタンパク質からなり、ＣＭＶの上記コートタンパク質は配列番号６２からなる。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、Ｔヘルパー細胞エピトープによって修飾され、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶタンパク質のＮ末端領域を置換する。別の好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質の上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応する。非常に好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、配列番号５を含む。非常に好ましい実施形態では、上記ＣＭＶタンパク質は、配列番号５からなる。

【0079】

好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸及び最大２２５アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸及び最大２００アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、少なくとも４０アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、少なくとも４０アミノ酸及び最大２２５アミノ酸、好ましくは最大２００アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸及び最大２００アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、少なくとも７０アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、少なくとも７０アミノ酸及び最大２００アミノ酸の長さを有する。

【0080】

好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、（ａ）アレルゲン；（ｂ）ウイルス；（ｂ）細菌；（ｃ）寄生虫；（ｄ）腫瘍；（ｅ）自己分子；（ｈ）ホルモン；（ｉ）サイトカイン；（ｋ）ケモカイン；（ｌ）生物学的に活性なペプチドからなる群に由来するポリペプチドである。

【0081】

別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、アレルゲン、自己抗原、腫瘍抗原、又は病原体のポリペプチドである。

【0082】

さらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはアレルゲンであり、好ましくは、上記アレルゲンは、（ａ）花粉抽出物；（ｂ）ダスト抽出物；（ｃ）イエダニ抽出物；（ｄ）真菌抽出物；（ｅ）哺乳動物表皮抽出物；（ｆ）羽毛抽出物；（ｇ）昆虫抽出物；（ｈ）食品抽出物；（ｉ）毛髪抽出物；（ｊ）唾液抽出物；及び（ｋ）血清抽出物からなる群に由来する。さらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはアレルゲンであり、上記アレルゲンは、（ａ）樹木；（ｂ）草；（ｃ）ハウスダスト；（ｄ）イエダニ；（ｅ）アスペルギルス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）；（ｆ）動物の毛；（ｇ）動物の羽毛；（ｈ）ハチ毒；（ｉ）動物性製品；（ｊ）植物製品；（ｋ）動物のふけ；（ｌ）ピーナッツアレルゲンからなる群から選択される。

【0083】

さらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、（ａ）ハチ毒ホスホリパーゼＡ２；（ｂ）ブタクサ（ｒａｇｗｅｅｄ）花粉Ａｍｂ ａ １；（ｃ）カバノキ（ｂｉｒｃｈ）花粉Ｂｅｔ ｖ Ｉ；（ｄ）白頭スズメバチ毒（ｗｈｉｔｅ ｆａｃｅｄ ｈｏｒｎｅｔ ｖｅｎｏｍ）５ ＤｏＩ ｍ Ｖ；（ｅ）イエダニＤｅｒ ｐ １；（ｆ）イエダニＤｅｒ ｆ ２；（ｇ）イエダニＤｅｒ ｐ ２；（ｈ）イエダニＬｅｐ ｄ；（ｉ）真菌アレルゲンＡｌｔ ａ １；（ｊ）真菌アレルゲンＡｓｐ ｆ １；（ｋ）真菌アレルゲンＡｓｐ ｆ １６；（ｌ）ピーナッツアレルゲン（ｍ）ネコアレルゲンＦｅｌ ｄ１；（ｎ）イヌアレルゲンＣａｎ ｆ１、Ｃａｎ ｆ２（ｏ）ピーナッツ由来アレルゲン；又は（ｐ）スギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｅｄａｒ）アレルゲンＣｒｙ Ｊ２からなる群から選択されるアレルゲンに由来する組換えポリペプチドである。

【0084】

さらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは組換えアレルゲンであり、上記アレルゲンは、（ａ）ハチ毒ホスホリパーゼＡ２；（ｂ）ブタクサ（ｒａｇｗｅｅｄ）花粉Ａｍｂ ａ １；（ｃ）カバノキ（ｂｉｒｃｈ）花粉Ｂｅｔ ｖ Ｉ；（ｄ）白頭スズメバチ毒（ｗｈｉｔｅ ｆａｃｅｄ ｈｏｒｎｅｔ ｖｅｎｏｍ）５ ＤｏＩ ｍ Ｖ；（ｅ）イエダニＤｅｒ ｐ １；（ｆ）イエダニＤｅｒ ｆ ２；（ｇ）イエダニＤｅｒ ｐ ２；（ｈ）イエダニＬｅｐ ｄ；（ｉ）真菌アレルゲンＡｌｔ ａ １；（ｊ）真菌アレルゲンＡｓｐ ｆ １；（ｋ）真菌アレルゲンＡｓｐ ｆ １６；（ｌ）ピーナッツアレルゲン（ｍ）ネコアレルゲンＦｅｌ ｄ１；（ｎ）イヌアレルゲンＣａｎ ｆ１、Ｃａｎ ｆ２（ｏ）ピーナッツ由来アレルゲン；又は（ｐ）スギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｅｄａｒ）アレルゲンＣｒｙ Ｊ２からなる群から選択される。

【0085】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはピーナッツアレルゲンである。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号２７、配列番号７２又は配列番号７３から選択されるアミノ酸配列を含むピーナッツアレルゲンである。非常に好ましい実施形態では、上記ピーナッツアレルゲンは、配列番号２７、配列番号７２もしくは配列番号７３から選択されるアミノ配列を有するタンパク質、又は配列番号２７、配列番号７２もしくは配列番号７３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記ピーナッツアレルゲンは、配列番号２７、配列番号７２もしくは配列番号７３から選択されるアミノ配列を有するタンパク質、又は配列番号２７、配列番号７２もしくは配列番号７３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記ピーナッツアレルゲンは、配列番号２７、配列番号７２又は配列番号７３から選択されるアミノ配列を有するタンパク質を含む。さらに非常に好ましい実施形態では、上記ピーナッツアレルゲンは、配列番号２７、配列番号７２又は配列番号７３から選択されるアミノ配列を有するタンパク質からなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記ピーナッツアレルゲンは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。さらに非常に好ましい実施形態では、上記ピーナッツアレルゲンは、配列番号２７のアミノ酸配列からなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列からなる。

【0086】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドはピーナッツアレルゲンであり；上記ピーナッツアレルゲンは、（ａ）配列番号２７；（ｂ）配列番号７２（ｃ）配列番号７３から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、上記ピーナッツアレルゲンは、配列番号２７を含み、好ましくはそれからなり、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

【0087】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドはピーナッツアレルゲンであり；上記ピーナッツアレルゲンは、配列番号２７を含み、好ましくはそれからなり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号２９からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アレルギー、好ましくはピーナッツアレルギーを治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0088】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、少なくとも１つの融合タンパク質を含み、少なくとも１つのＣＭＶタンパク質をさらに含み、上記少なくとも１つの融合タンパク質は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドはピーナッツアレルゲンであり；上記ピーナッツアレルゲンは、配列番号２７を含み、好ましくはそれからなり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなり；上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶの、好ましくは配列番号６２のコートタンパク質を含み、好ましくはそれからなり、上記ＣＭＶタンパク質は、場合により、Ｔヘルパー細胞エピトープによって修飾され、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶタンパク質のＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶタンパク質の上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは配列番号２９からなり、上記ＣＭＶタンパク質は配列番号５からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アレルギー、好ましくはピーナッツアレルギーを治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0089】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、スギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｅｄａｒ）Ｃｒｙ Ｊ ２に由来するアレルゲンである。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号７４のスギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｅｄａｒ）Ｃｒｙ Ｊ ２に由来する。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、スギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｅｄａｒ）Ｃｒｙ Ｊ ２に由来し、配列番号７４のアミノ酸配列を含む。

【0090】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、ブタクサ（ｒａｇｗｅｅｄ）花粉Ａｍｂ ａ１に由来するアレルゲンである。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号７５のブタクサ（ｒａｇｗｅｅｄ）花粉Ａｍｂ ａ １に由来する。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、ブタクサ（ｒａｇｗｅｅｄ）花粉Ａｍｂ ａ１に由来し、配列番号７５のアミノ酸配列を含む。

【0091】

本発明の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、ネコアレルゲンＦｅｌ ｄ１に由来するアレルゲンである。イエネコ（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）は、屋内アレルゲンの重要な供給源である（Ｌａｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｌａｎｃｅｔ ３５６，１３９２－１３９７）。症状の重症度は、比較的軽度の鼻炎及び結膜炎から、潜在的に生命を脅かす喘息増悪まで及ぶ。患者は時折、ネコのふけ及び毛皮内のいくつかの異なる分子に感作されるが、主要なアレルゲンはＦｅｌ ｄ１である。このアレルゲンの重要性は、多くの試験で強調されている。実際、ネコアレルギー患者の８０％超が、この強力なアレルゲンに対するＩｇＥ抗体を示す（ｖａｎ Ｒｅｅ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０４，１２２３－１２３０）。Ｆｅｌ ｄ１は、１０～２０％のＮ結合炭水化物を含有する３５～３９ｋＤａの酸性糖タンパク質であり、ネコの毛皮、唾液及び涙腺に見出される。これは、２つの非共有結合したヘテロ二量体によって形成される。各ヘテロ二量体は、別個の遺伝子によってコードされる１つの７０残基ペプチド（「鎖１」として知られる）と、１つの７８、８５、９０又は９２残基ペプチド（「鎖２」として知られる）とからなる（Ｄｕｆｆｏｒｔ，Ｏ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８，３０１－３０９；Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ；（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，９６９０－９６９４及びＧｒｉｆｆｉｔｈ，Ｉ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ １１３，２６３－２６８を参照）。Ｆｅｌ ｄ１のいくつかの組換え構築物が記載されている（Ｖａｉｌｅｓ ＬＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００２）１１０：７５７－７６２；Ｇｒｏｎｌｕｎｄ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００３）２７８：４０１４４－４０１５１；２００３；Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（２００９）２０６：１９４１－１９５５；国際公開第２００６／０９７５３０号パンフレット；国際公開第２０１７／０４２２４１号パンフレット）。

【0092】

したがって、さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはｒＦｅｌ ｄ１である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＦｅｌ ｄ１タンパク質であり、上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１とＦｅｌ ｄ１の鎖２とを含む融合タンパク質であり、Ｆｅｌ ｄ１の上記鎖２は、そのＣ末端を介してＦｅｌ ｄ１の上記鎖１のＮ末端に、１つのペプチド結合を介して直接、又はスペーサーを介して融合され、上記スペーサーは、１～２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、好ましくは、上記スペーサーは、１０～２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなる。非常に好ましくは、上記スペーサーは１５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、さらに好ましくは、上記スペーサーは配列番号３０のアミノ酸配列を有する。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＦｅｌ ｄ１タンパク質であり、上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１とＦｅｌ ｄ１の鎖２とを含む融合タンパク質であり、Ｆｅｌ ｄ１の上記鎖１は、そのＣ末端を介してＦｅｌ ｄ１の上記鎖２のＮ末端に、１つのペプチド結合を介して直接、又はスペーサーを介して融合され、上記スペーサーは、１～２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、好ましくは、上記スペーサーは、１０～２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなる。好ましくは、Ｆｅｌ ｄ１の上記鎖１は、配列番号７６の配列、又はそのホモログ配列を含み、上記ホモログ配列は、９０％を超える、又はさらになお好ましくは９５％を超える、配列番号７６との同一性を有する。さらに好ましくは、Ｆｅｌ ｄ １の上記鎖２は、配列番号７７、配列番号７８もしくは配列番号７９の配列、又はそのホモログ配列を含み、上記ホモログ配列は、９０％を超える、さらになお好ましくは９５％を超える、配列番号７７、配列番号７８又は配列番号７９との同一性を有する。

【0093】

非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、（ａ）配列番号３８；（ｂ）配列番号８０；又は（ｃ）又は配列番号８１から選択されるアミノ酸配列を含むＦｅｌ ｄ１タンパク質である。別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号３８を含み、好ましくはそれからなる。非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８０を含み、好ましくはそれからなる。別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８１を含み、好ましくはそれからなる。

【0094】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、（ａ）配列番号３８；（ｂ）配列番号８０（ｃ）配列番号８１から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0095】

別の非常に好ましい実施形態では、上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。別の非常に好ましい実施形態では、上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、配列番号８０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。別の非常に好ましい実施形態では、上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、配列番号８１のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

【0096】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、Ｆｅｌ ｄ１タンパク質であり；上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、（ａ）配列番号３８；（ｂ）配列番号８０（ｃ）配列番号８１から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、配列番号３８を含み、好ましくはそれからなり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

【0097】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、Ｆｅｌ ｄ１タンパク質であり；上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、配列番号３８を含み、好ましくはそれからなり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号３９からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アレルギー、好ましくはネコアレルギーを治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0098】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、少なくとも１つの融合タンパク質を含み、少なくとも１つのＣＭＶタンパク質をさらに含み、上記少なくとも１つの融合タンパク質は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、Ｆｅｌ ｄ１タンパク質であり；上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、配列番号３８を含み、好ましくはそれからなり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなり；上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶの、好ましくは配列番号６２のコートタンパク質を含み、好ましくはそれからなり、上記ＣＭＶタンパク質は、場合により、Ｔヘルパー細胞エピトープによって修飾され、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶタンパク質のＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶタンパク質の上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは配列番号３９からなり、上記ＣＭＶタンパク質は配列番号５からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アレルギー、好ましくはネコアレルギーを治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0099】

さらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは腫瘍抗原であり、好ましくは、上記腫瘍抗原は、（ａ）乳癌細胞のポリペプチド；（ｂ）腎癌細胞のポリペプチド；（ｃ）前立腺癌細胞のポリペプチド；（ｄ）皮膚癌細胞のポリペプチド；（ｅ）脳癌細胞のポリペプチド；及び（ｆ）白血病細胞のポリペプチドからなる群から選択される。

【0100】

さらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、（ａ）Ｈｅｒ２；（ｂ）ガングリオシドＧＤ２；（ｃ）ＥＧＦ－Ｒ；（ｄ）癌胎児抗原（ＣＥＡ）；（ｅ）ＣＤ５２；（ｆ）ＣＤ２１；（ｇ）ヒトメラノーマｇｐ１００；（ｈ）ヒトメラノーマｍｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ－１；（ｉ）ヒトメラノーマｍｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ－１類似体；（ｊ）チロシナーゼ；（ｋ）ＮＡ１７－Ａ ｎｔ；（ｌ）ＭＡＧＥ３；（ｍ）ｐ５３タンパク質；及び（ｎ）（ａ）～（ｍ）の腫瘍抗原のいずれかの抗原性断片からなる群から選択される腫瘍抗原である。

【0101】

さらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、（ａ）ＩｇＥ、（ｂ）ＩＬ－６（ｃ）核因子ｋＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）；（ｄ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；（ｅ）血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ－Ｒ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（ｆ）インターロイキン－１α；（ｇ）インターロイキン－１ β；（ｈ）インターロイキン－５；（ｉ）インターロイキン－８；（ｊ）インターロイキン－１３；（ｋ）インターロイキン－１５；（ｌ）インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）；（ｍ）ＩＬ－２３；（ｎ）グレリン；（ｏ）アンジオテンシン；（ｐ）ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）（ＣＣＬ２１）；（ｑ）ケモカイン（Ｃ－Ｘモチーフ）（ＣＸＣＬ １２）；（ｒ）ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ－Ｉ）；（ｓ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）；（ｔ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－Ｉ）；（ｕ）エンドグリン；（ｖ）レジスチン；（ｗ）ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）；（ｘ）成長ホルモン放出（ＧＨＲＨ）；（ｙ）黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）；（ｚ）甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）；（ａａ）マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）；（ｂｂ）グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）；（ｃｃ）エオタキシン；（ｄｄ）ブラジキニン；（ｅｅ）Ｄｅｓ－Ａｒｇブラジキニン；（ｆｆ）Ｂリンパ球走化性因子（ＢＬＣ）；（ｇｇ）マクロファージコロニー刺激因子Ｍ－ＣＳＦ；（ｈｈ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）；（ｉｉ）アミロイドβペプチド（Ａβ１－４２）；（ｊｊ）アミロイドβペプチド（Ａβ３－６）；（ｋｋ）ヒトＩｇＥ；（ｉｉ）ＣＣＲ５細胞外ドメイン；（ｍｍ）ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン；（ｎｎ）ガストリン；（ｏｏ）ＣＥＴＰ；（ｐｐ）Ｃ５ａ；（ｑｑ）上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）；（ｒｒ）ＣＧＲＰ；（ｓｓ）α－シヌクレイン；（ｔｔ）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）（ｕｕ）アミリン；（ｖｖ）ミオスタチン；（ｗｗ）インターロイキン－４；（ｘｘ）胸腺間質性リンパ球新生因子；（ｙｙ）インターロイキン－３３；（ｚｚ）インターロイキン－２５；（ａａａ）インターロイキン－１３又は（ｂｂｂ）ポリペプチド（ａ）～（ａａａ）のいずれか１つの断片；及び（ｃｃｃ）ポリペプチド（ａ）～（ａａａ）のいずれか１つの抗原性突然変異体もしくは断片からなる群から選択されるポリペプチドである。

【0102】

さらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは自己抗原であり、上記自己抗原は、（ａ）ＩｇＥ、（ｂ）ＩＬ－６（ｃ）核因子ｋＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）；（ｄ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；（ｅ）血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ－Ｒ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（ｆ）インターロイキン－１ α；（ｇ）インターロイキン－１ β；（ｈ）インターロイキン－５；（ｉ）インターロイキン－８；（ｊ）インターロイキン－１３；（ｋ）インターロイキン－１５；（ｌ）インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）；（ｍ）ＩＬ－２３；（ｎ）グレリン；（ｏ）アンジオテンシン；（ｐ）ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）（ＣＣＬ２１）；（ｑ）ケモカイン（Ｃ－Ｘモチーフ）（ＣＸＣＬ １２）；（ｒ）ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ－Ｉ）；（ｓ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）；（ｔ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－Ｉ）；（ｕ）エンドグリン；（ｖ）レジスチン；（ｗ）ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）；（ｘ）成長ホルモン放出（ＧＨＲＨ）；（ｙ）黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）；（ｚ）甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）；（ａａ）マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）；（ｂｂ）グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）；（ｃｃ）エオタキシン；（ｄｄ）ブラジキニン；（ｅｅ）Ｄｅｓ－Ａｒｇブラジキニン；（ｆｆ）Ｂリンパ球走化性因子（ＢＬＣ）；（ｇｇ）マクロファージコロニー刺激因子Ｍ－ＣＳＦ；（ｈｈ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）；（ｉｉ）アミロイドβペプチド（Ａβ１－４２）；（ｊｊ）アミロイドβペプチド（Ａβ３－６）；（ｋｋ）ヒトＩｇＥ；（ｉｉ）ＣＣＲ５細胞外ドメイン；（ｍｍ）ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン；（ｎｎ）ガストリン；（ｏｏ）ＣＥＴＰ；（ｐｐ）Ｃ５ａ；（ｑｑ）上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）；（ｒｒ）ＣＧＲＰ；（ｓｓ）α－シヌクレイン；（ｔｔ）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）（ｕｕ）アミリン；（ｖｖ）ミオスタチン；（ｗｗ）インターロイキン－４；（ｘｘ）胸腺間質性リンパ球新生因子；（ｙｙ）インターロイキン－３３；（ｚｚ）インターロイキン－２５；（ａａａ）インターロイキン－１３又は（ｂｂｂ）ポリペプチド（ａ）～（ａａａ）のいずれか１つの断片；及び（ｃｃｃ）ポリペプチド（ａ）～（ａａａ）のいずれか１つの抗原性突然変異体もしくは断片からなる群から選択されるポリペプチドである。

【0103】

好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、インターロイキン１７（ＩＬ－１７）、好ましくはヒトＩＬ－１７である。インターロイキン１７は、広範囲の細胞型で炎症誘発性介在物質の放出を誘導するＴ細胞由来サイトカインである。ＩＬ－１７の異常なＴｈ１７応答及び過剰発現は、関節リウマチ及び多発性硬化症を含むいくつかの自己免疫障害に関与している。ＩＬ－１７を遮断する分子、例えば、ＩＬ－１７特異的モノクローナル抗体は、動物モデルでは疾患の改善に有効であることが証明されている。さらに、組換えＩＬ－１７とコンジュゲートしたウイルス様粒子を使用した、ＩＬ－１７を標的とする能動免疫が近年示唆されている（Ｒｏｈｎ ＴＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）３６：１－１１）。ＩＬ－１７－ＶＬＰによる免疫化は、高レベルの抗ＩＬ－１７抗体を誘導し、それにより、アジュバントを添加しない場合であっても、自己寛容を克服した。ＩＬ－１７－ＶＬＰを用いて免疫したマウスでは、コラーゲン誘導性関節炎及び実験的自己免疫性脳脊髄炎においてはともに、疾患の発生率が低下し、疾患への進行が遅くなり、疾患重症度のスコアが低下していた。したがって、好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８２を含むか、好ましくはそれからなる。さらに、本発明の修飾ＣＭＶ ＶＬＰは、動物又はヒトの炎症性疾患、好ましくは慢性炎症性疾患を治療する方法に使用される。好ましくは、上記炎症性疾患は、ＲＡ、ＭＳ、乾癬、喘息、クローン病、大腸炎、ＣＯＰＤ、糖尿病、神経皮膚炎（アレルギー性皮膚炎）から選択され、また好ましくは、上記炎症性疾患はＭＳであり、さらに好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８２を含むか、好ましくはそれからなる。

【0104】

別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＩＬ－５、好ましくはヒトＩＬ－５である。またさらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８３を含むか、好ましくはそれからなる。さらに、本発明の修飾ＶＬＰは、動物又はヒトの炎症性疾患、好ましくは慢性炎症性疾患を治療する方法に使用される。好ましくは、上記炎症性疾患は、ＲＡ、ＭＳ、乾癬、喘息、クローン病、大腸炎、ＣＯＰＤ、糖尿病、神経皮膚炎（アレルギー性皮膚炎）から選択され、さらに好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８３を含むか、好ましくはそれからなる。

【0105】

別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはイヌＩＬ－５である。またさらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８４、又は配列番号８４と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８４を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号８４からなる。

【0106】

別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはネコＩＬ－５である。非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８５、配列番号１２５、配列番号１４１、又は配列番号８５、配列番号１２５、配列番号１４１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８５、配列番号１２５又は配列番号１４１を含む。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８５、配列番号１２５又は配列番号１４１からなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８５、又は配列番号８５と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１２５、又は配列番号１２５と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８５を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号８５からなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１２５を含む。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１２５からなる。

【0107】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、（ａ）配列番号８５；（ｂ）配列番号１２５（ｃ）配列番号１４１から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１２５を含み、好ましくはそれからなり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

【0108】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１２５を含み、好ましくはそれからなり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号１２８、配列番号１３２又は配列番号１３９からなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号１２８からなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号１３２からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、動物又はヒトの炎症性疾患、好ましくは慢性炎症性疾患を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。好ましくは、上記炎症性疾患は、ＲＡ、ＭＳ、乾癬、喘息、クローン病、大腸炎、ＣＯＰＤ、糖尿病、神経皮膚炎（アレルギー性皮膚炎）から選択される。

【0109】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、少なくとも１つの融合タンパク質を含み、少なくとも１つのＣＭＶタンパク質をさらに含み、上記少なくとも１つの融合タンパク質は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１２５を含み、好ましくはそれからなり、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなり；上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶの、好ましくは配列番号６２のコートタンパク質を含み、好ましくはそれからなり、上記ＣＭＶタンパク質は、場合により、Ｔヘルパー細胞エピトープによって修飾され、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶタンパク質のＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶタンパク質の上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは配列番号１２８からなり、上記ＣＭＶタンパク質は配列番号５からなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは配列番号１３２からなり、上記ＣＭＶタンパク質は配列番号５からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、動物又はヒトの炎症性疾患、好ましくは慢性炎症性疾患を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。好ましくは、上記炎症性疾患は、ＲＡ、ＭＳ、乾癬、喘息、クローン病、大腸炎、ＣＯＰＤ、糖尿病、神経皮膚炎（アレルギー性皮膚炎）から選択される。

【0110】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＩＬ－４、好ましくはヒトＩｌ－４である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８６を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号８６からなる。

【0111】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはイヌＩＬ－４である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８７、又は配列番号８７と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８７を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号８７からなる。

【0112】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはネコＩＬ－４である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８８、又は配列番号８８と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８８を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８８を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号８８からなる。

【0113】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＩＬ－１３、好ましくはヒトＩＬ－１３である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号８９を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号８９からなる。

【0114】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはイヌＩＬ－１３である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９０、又は配列番号９０と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９０を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号９０からなる。

【0115】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはネコＩＬ－１３である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９１、又は配列番号９１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９１を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号９１からなる。

【0116】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはウマＩＬ－１３である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９２、又は配列番号９２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９２を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号９２からなる。

【0117】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＴＮＦαである。

【0118】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＩＬ－１α、好ましくはヒトＩＬ－１αである。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９３を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号９３からなる。

【0119】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはイヌＩＬ－１αである。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９４、又は配列番号９４と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９４を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号９４からなる。

【0120】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはネコＩＬ－１αである。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９５、又は配列番号９５と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９５を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号９５からなる。

【0121】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはウマＩＬ－１αである。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９６、又は配列番号９６と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９６を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号９６からなる。

【0122】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＩＬ－３３、好ましくはヒトＩＬ－３３である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９７を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号９７からなる。

【0123】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはイヌＩＬ－３３である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９８、又は配列番号９８と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９８を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号９８からなる。

【0124】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはネコＩＬ－３３である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９９、又は配列番号９９と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号９９を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号９９からなる。

【0125】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはウマＩＬ－３３である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１００、又は配列番号１００と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１００を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１００からなる。

【0126】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＩＬ－２５、好ましくはヒトＩＬ－２５である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０１を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１０１からなる。

【0127】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはイヌＩＬ－２５である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０２、又は配列番号１０２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０２を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１０２からなる。

【0128】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはネコＩＬ－２５である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０３、又は配列番号１０３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０３を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１０３からなる。

【0129】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはウマＩＬ－２５である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０４、又は配列番号１０４と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０４を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１０４からなる。

【0130】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＩＬ－１β、好ましくはヒトＩＬ－１βである。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０５を含むか、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはイヌＩＬ－１βである。非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１３４、配列番号１４３、配列番号１４４、又は配列番号１３４、配列番号１４３、配列番号１４４と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１３４、配列番号１４３、配列番号１４４を含む。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１３４、配列番号１４３、配列番号１４４からなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１３４、又は配列番号１３４と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１３５を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１３５からなる。

【0131】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、（ａ）配列番号１３４；（ｂ）配列番号１４３（ｃ）配列番号１４４から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１３４を含み、好ましくはそれからなり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

【0132】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１３４を含み、好ましくはそれからなり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号１３５からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、動物又はヒトの炎症性疾患、好ましくは慢性炎症性疾患を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。好ましくは、上記炎症性疾患は、ＲＡ、ＭＳ、乾癬、喘息、クローン病、大腸炎、ＣＯＰＤ、糖尿病、神経皮膚炎（アレルギー性皮膚炎）から選択される。

【0133】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、少なくとも１つの融合タンパク質を含み、少なくとも１つのＣＭＶタンパク質をさらに含み、上記少なくとも１つの融合タンパク質は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１３４を含み、好ましくはそれからなり、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなり；上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶの、好ましくは配列番号６２のコートタンパク質を含み、好ましくはそれからなり、上記ＣＭＶタンパク質は、場合により、Ｔヘルパー細胞エピトープによって修飾され、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶタンパク質のＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶタンパク質の上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは配列番号１３５からなり、上記ＣＭＶタンパク質は配列番号５からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、炎症性疾患を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0134】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはネコＩＬ－１βである。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１４５を含むか、好ましくはそれからなる。

【0135】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＩＬ－３１、好ましくはヒトＩＬ－３１である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０６を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１０６からなる。

【0136】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはイヌＩＬ－３１である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０７、又は配列番号１０７と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０７を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１０７からなる。

【0137】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはネコＩＬ－３１である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０８、又は配列番号１０８と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０８を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１０８からなる。

【0138】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはウマＩＬ－３１である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０９、又は配列番号１０９と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１０９を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１０９からなる。

【0139】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＬＳＰ）、好ましくはヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＬＳＰ）である。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１１０を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１１０からなる。

【0140】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはイヌＴＬＳＰである。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１１１、又は配列番号１１１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１１１を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１１１からなる。

【0141】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはネコＴＬＳＰである。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１１２、又は配列番号１１２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１１２を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１１２からなる。

【0142】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはウマＴＬＳＰである。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１１３、又は配列番号１１３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１１３を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１１３からなる。

【0143】

またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、ＩｇＥ、又はＩｇＥに含まれるペプチドもしくはドメインである。

【0144】

またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、Ａβ－１－４２（配列番号１１４）由来のＮ末端に由来するペプチド、特に最大７個の連続するアミノ酸長のＡβ－１－４２（配列番号１１４）の断片、好ましくは最大６個の連続するアミノ酸長のＡβ－１－４２（配列番号１１４）の断片である。

【0145】

したがって、さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、Ａβ－１－６（配列番号１）、Ａβ－１－７（配列番号２）、Ａβ－３－６（配列番号３）、Ａβ－１－５（配列番号４）、Ａβ－２－６（配列番号１１５）又はＡβ－３－７（配列番号１１６）から選択される。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＡβ－１－６（配列番号１）である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＡβ－１－７（配列番号２）である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＡβ－３－６（配列番号３）である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＡβ－１－５（配列番号４）である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＡβ－２－６（配列番号１１５）である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＡβ－３－７（配列番号１１６）である。

【0146】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、Ａβ－１－６（配列番号１）であり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アルツハイマー病を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0147】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、Ａβ－１－６（配列番号１）であり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号６からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アルツハイマー病を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0148】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、Ａβ－１－７（配列番号２）であり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アルツハイマー病を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0149】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、Ａβ－１－７（配列番号２）であり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号７からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アルツハイマー病を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0150】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、Ａβ－３－６（配列番号３）であり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アルツハイマー病を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0151】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、Ａβ－３－６（配列番号３）であり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号８からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アルツハイマー病を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0152】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、Ａβ－１－５（配列番号４）であり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アルツハイマー病を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0153】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、Ａβ－１－５（配列番号４）であり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号９からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、アルツハイマー病を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0154】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、α－シヌクレイン、又はα－シヌクレインに由来するペプチドであり、好ましくは上記ペプチドは６～１４個のアミノ酸からなり、さらに好ましくは上記抗原性ポリペプチドは、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１及び配列番号１１７のいずれか１つから選択されるα－シヌクレインに由来するペプチドである。α－シヌクレインに由来するさらに好ましいペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０２０１３３号パンフレットに開示されている。

【0155】

α－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）は、複数の生理学的機能及び病理学的機能を有する小さなタンパク質であり、パーキンソン病（ＰＤ）を含むレビー小体病の病理学的特徴である、レビー小体に見られる主要なタンパク質の１つである。さらに最近では、α－Ｓｙｎは、血液及び脳脊髄液を含む体液中に見出されており、末梢組織及び中枢神経系の両方によって産生されている可能性が高い。脳と末梢組織との間のα－Ｓｙｎの交換は、重要な病態生理学的意義及び治療的意義を有する可能性がある（Ｇａｒｄａｉ ＳＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１３）８（８）：ｅ７１６３４）。パーキンソン病（ＰＤ）の病因では、α－シヌクレイン（ａ－ｓｙｎ）を暗示する証拠は圧倒的である。ただし、ａ－ｓｙｎがＰＤ及び他のシヌクレイン病ではどのように病態を引き起こすかに関する明確な意見の一致はない。

【0156】

α－シヌクレインは、レビー小体（ＬＢ）の主要成分であり、凝集をもたらすａ－ｓｙｎ過剰発現に関する記載は豊富である。ヒトの遺伝学的データは、ａ－ｓｙｎ遺伝子でのミスセンス変異及び多重化が家族性ＰＤを引き起こすことを実証している。遺伝子多重化の場合、ａ－ｓｙｎタンパク質のレベルの増加が、病態を引き起こす優勢な機能獲得をもたらすと推定されている。ａ－ｓｙｎのレベルの増加は凝集及び毒性をもたらし得るが、過去数年にわたる研究から、ａ－ｓｙｎの上昇が小胞プールの形成、局在化及び／又は維持を妨げる可能性があることも明らかにされている（Ｇａｒｄａｉ ＳＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１３）８（８）：ｅ７１６３４；及びそこに引用されている参考文献。

【0157】

したがって、さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１及び配列番号１１７から選択される配列のいずれか１つから選択される。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号４９である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号５０である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号５１である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１１７である。

【0158】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは配列番号４９であり、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

【0159】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは配列番号４９であり、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号５２からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、疾患、障害又は生理学的状態を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、上記疾患、障害又は生理学的状態は、レビー小体病から選択され、好ましくは上記疾患、障害又は生理学的状態はパーキンソン病である。

【0160】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは配列番号５０であり、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

【0161】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは配列番号５０であり、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号５３からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、疾患、障害又は生理学的状態を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、上記疾患、障害又は生理学的状態は、レビー小体病から選択され、好ましくは上記疾患、障害又は生理学的状態はパーキンソン病である。

【0162】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは配列番号５１であり、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

【0163】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは配列番号５１であり、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号５４からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、疾患、障害又は生理学的状態を治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、上記疾患、障害又は生理学的状態は、レビー小体病から選択され、好ましくは上記疾患、障害又は生理学的状態はパーキンソン病である。

【0164】

またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはアミリンである。非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、アンジオテンシンＩ、又はアンジオテンシンＩに由来するペプチドである。別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、アンジオテンシンＩＩ、又はアンジオテンシンＩＩに由来するペプチドである。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＧｎＲＨである。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはエオタキシンである。

【0165】

別の非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはミオスタチン、好ましくはウシミオスタチンである。またさらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１１８、又は配列番号１１８と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなる。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、配列番号１１８を含むか、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは配列番号１１８からなる。

【0166】

さらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、寄生虫のポリペプチドであり、好ましくは、上記病原体は、（ａ）トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）種；（ｂ）熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）；（ｃ）三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）；（ｄ）卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）；（ｅ）四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）；（ｆ）リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）；（ｇ）住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）及び（ｈ）線虫（Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）からなる群から選択される。好ましくは、上記抗原性ポリペプチドは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）又は三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）（配列番号１１９）に由来する。

【0167】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に由来する。さらに非常に好ましい実施形態では、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に由来する上記抗原性ポリペプチドは、配列番号４４を含むか、好ましくはそれからなる。

【0168】

非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；又は配列番号６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に由来し、好ましくは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に由来する上記抗原性ポリペプチドは、配列番号４４を含むか、好ましくはそれからなり、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４又は配列番号６５、また好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

【0169】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなる少なくとも１つの融合タンパク質を含み、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、配列番号４４を含むか、好ましくはそれからなり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号４６からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、マラリアを治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0170】

さらに非常に好ましい実施形態では、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、少なくとも１つの融合タンパク質を含み、少なくとも１つのＣＭＶタンパク質をさらに含み、上記少なくとも１つの融合タンパク質は、ａ）キメラＣＭＶポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶポリペプチドと、（ｉｉ）抗原性ポリペプチドと、（ｉｉｉ）Ｔヘルパー細胞エピトープとを含むか、好ましくはそれらからなり；上記ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６２；（ｉｉ）抗原性ポリペプチドを含むか、好ましくはそれからなり、上記抗原性ポリペプチドは、上記ＣＭＶポリペプチドに挿入され、上記抗原性ポリペプチドの上記挿入は、配列番号６２の８４位及び８５位のアミノ酸残基に対応する、上記ＣＭＶポリペプチドのアミノ酸残基の間にあり；上記抗原性ポリペプチドは、配列番号４４を含むか、好ましくはそれからなり；上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶポリペプチドの上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなり；上記ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶの、好ましくは配列番号６２のコートタンパク質を含み、好ましくはそれからなり、上記ＣＭＶタンパク質は、場合により、Ｔヘルパー細胞エピトープによって修飾され、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、上記ＣＭＶタンパク質のＮ末端領域を置換し、上記ＣＭＶタンパク質の上記Ｎ末端領域は、配列番号６２のアミノ酸２～１２に対応し、好ましくは、上記Ｔヘルパー細胞エピトープは、配列番号６４を含み、好ましくはそれからなる。さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは配列番号４６からなり、上記ＣＭＶタンパク質は配列番号５からなる。本明細書のさらに非常に好ましい実施形態及び態様では、本発明は、マラリアを治療する方法に使用するための、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の上記修飾ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。

【0171】

さらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは細菌のポリペプチドであり、好ましくは、上記細菌は、（ａ）クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（ｂ）ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）；（ｃ）肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；（ｄ）ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）；（ｅ）サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；（ｆ）マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）；（ｇ）クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（ｈ）ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）（ｉ）エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（ｋ）髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）（ｌ）ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）からなる群から選択される。

【0172】

さらに好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはウイルス抗原であり、好ましくは、上記ウイルス抗原は、（ａ）ＨＩＶ及び他のレトロウイルス；（ｂ）インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、好ましくはインフルエンザＡ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ）Ｍ２細胞外ドメイン又はＨＡもしくはＨＡ球状ドメイン；（ｃ）Ｂ型肝炎ウイルスのポリペプチド、好ましくはｐｒｅＳｌ；（ｄ）Ｃ型肝炎ウイルス；（ｅ）ＨＰＶ、好ましくはＨＰＶ１６Ｅ７（ｆ）ＲＳＶ、（ｇ）ＳＡＲＳ及び他のコロナウイルス、（ｈ）デング（Ｄｅｎｇｕｅ）及び他のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、例えば、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ）及び手足口病ウイルス（Ｈａｎｄ Ｆｏｏｔ ａｎｄ Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ）、（ｉ）チクングニア（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）及び他のアルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）。（ｋ）ＣＭＶ及び他のヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、（ｌ）ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されるポリペプチドである。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはＲＳＶに由来する。さらに非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドはデングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）に由来する。

【0173】

好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、インフルエンザＡウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ）Ｍ２タンパク質の細胞外ドメイン、又はその抗原性断片である。非常に好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、インフルエンザＡウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ）Ｍ２タンパク質の細胞外ドメインを含むか、好ましくはそれからなり、好ましくは、インフルエンザＡウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ）Ｍ２タンパク質の上記細胞外ドメインは配列番号１２０である。別の好ましい実施形態では、上記抗原性ポリペプチドは、インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）の球状ドメインである。

【0174】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記キメラＣＭＶポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５３又は配列番号５４からなる群から選択される。

【0175】

さらに好ましい実施形態では、上記修飾ＶＬＰは、少なくとも１つの免疫刺激物質をさらに含む。非常に好ましい実施形態では、上記免疫刺激物質は、本発明の修飾ＶＬＰにパッケージ化される。別の好ましい実施形態では、免疫刺激物質は、本発明の修飾ＶＬＰと混合される。本発明に有用な免疫刺激物質は、当技術分野で一般に公知であり、とりわけ、国際公開第２００３／０２４４８１Ａ２号パンフレットに開示されている。

【0176】

本発明の別の実施形態では、上記免疫刺激物質は、非真核生物起源のＤＮＡ又はＲＮＡからなる。さらに好ましい実施形態では、上記免疫刺激物質は、（ａ）免疫刺激核酸；（ｂ）ペプチドグリカン；（ｃ）リポ多糖；（ｄ）リポテイコ酸；（ｅ）イミダゾキノリン化合物；（ｆ）フラジェリン；（ｇ）リポタンパク質；及び（ｈ）（ａ）～（ｇ）の少なくとも１つの物質の任意の混合物からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、上記免疫刺激物質は免疫刺激核酸であり、上記免疫刺激核酸は、（ａ）リボ核酸；（ｂ）デオキシリボ核酸；（ｃ）キメラ核酸；及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の任意の混合物からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、上記免疫刺激核酸はリボ核酸であり、上記リボ核酸は細菌由来ＲＮＡである。さらに好ましい実施形態では、上記免疫刺激核酸は、ポリ（ＩＣ）又はその誘導体である。さらに好ましい実施形態では、上記免疫刺激核酸はデオキシリボ核酸であり、上記デオキシリボ核酸は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。

【0177】

非常に好ましい実施形態では、上記免疫刺激物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。さらに好ましい実施形態では、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＡ型ＣｐＧである。さらに好ましい実施形態では、上記Ａ型ＣｐＧは回文配列を含む。さらに好ましい実施形態では、上記回文配列は、その５’末端及びその３’末端でグアノシン実体に隣接する。さらに好ましい実施形態では、上記回文配列は、その５’末端で、少なくとも３個及び最大１５個のグアノシン実体に隣接し、上記回文配列は、その３’末端で、少なくとも３個及び最大１５個のグアノシン実体に隣接する。

【0178】

別の好ましい実施形態では、上記免疫刺激物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは回文配列を含み、さらに好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフは、回文配列の一部である。

【0179】

さらなる態様では、本発明は、医薬品として使用するための、本発明の修飾ウイルス様粒子を提供する。

【0180】

さらなる態様では、本発明は、本発明の修飾ウイルス様粒子を含むか、あるいはそれからなるワクチンを提供する。単独、又は任意の可能な組合せのいずれかで、上記修飾ＶＬＰが、本明細書に開示される技術的特徴のいずれか１つを含むワクチンが包含される。一実施形態では、ワクチンはアジュバントをさらに含む。さらなる実施形態では、ワクチンはアジュバントを欠く。好ましい実施形態では、上記ワクチンは、本発明の組成物の有効量を含む。

【0181】

さらなる態様では、本発明は、（ａ）本発明の修飾ＶＬＰ又は本発明のワクチンと、（ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物に関する。上記希釈剤は、滅菌水溶液（例えば、生理食塩水）又は非水溶液及び懸濁液を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体又は密封包帯を使用して、皮膚透過性を高め、抗原吸収を増強することができる。本発明の医薬組成物は、塩、緩衝液、アジュバント、又はコンジュゲートの有効性を改善するために望ましい他の物質を含有する形態であり得る。医薬組成物の調製に使用するのに適した材料の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｏｓｏｌ，Ａ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（１９９０））を含む多数の情報源に提供されている。一実施形態では、上記医薬組成物は、本発明のワクチンの有効量を含む。

【0182】

本発明のさらなる態様は、本発明の修飾ＶＬＰ、本発明のワクチン、又は本発明の医薬組成物を動物又はヒトに投与することを含む免疫化の方法である。好ましい実施形態では、上記方法は、本発明の組成物、本発明のワクチン、又は本発明の医薬組成物を動物又はヒトに投与することを含む。

【0183】

本発明のさらなる態様は、動物の疾患、障害又は生理学的状態を治療又は予防する方法であり、上記方法は、本発明の修飾ＶＬＰ、本発明のワクチン、又は本発明の医薬組成物を上記動物に投与することを含み、好ましくは上記動物はヒトであり得る。さらに好ましい実施形態では、上記修飾ＶＬＰ、上記ワクチン又は上記医薬組成物は、上記動物に皮下、静脈内、皮内、鼻腔内、経口、経リンパ節（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）又は経皮的に投与される。

【0184】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記疾患、障害又は生理学的状態は、アレルギー、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患からなる群から選択される。

【0185】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記疾患、障害又は生理学的状態は、ＲＡ、ＭＳ、乾癬、喘息、クローン病、大腸炎、ＣＯＰＤ、糖尿病、神経皮膚炎（アレルギー性皮膚炎）、アルツハイマー病、パーキンソン病、インフルエンザＡウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ）感染症、マラリア、ＲＳＶ感染症からなる群から選択される。

【0186】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記疾患、障害又は生理学的状態は炎症性疾患である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記疾患、障害又は生理学的状態は、ＲＡ、ＭＳ、乾癬、喘息、クローン病、大腸炎、ＣＯＰＤ、糖尿病、神経皮膚炎（アレルギー性皮膚炎）から選択される炎症性疾患である。

【0187】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記疾患、障害又は生理学的状態は感染性疾患である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記疾患、障害又は生理学的状態は、インフルエンザＡウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ）感染症、マラリア、ＲＳＶ感染症から選択される炎症性疾患である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記疾患、障害又は生理学的状態はマラリアである。

【0188】

さらに非常に好ましい実施形態では、上記疾患、障害又は生理学的状態は、アルツハイマー病又はパーキンソン病である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記疾患、障害又は生理学的状態はアルツハイマー病である。さらに非常に好ましい実施形態では、上記疾患、障害又は生理学的状態はパーキンソン病である。

【0189】

例
例１
キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）の修飾コートタンパク質にＡβ１－４２の断片をクローニングし、ＣＭＶ－Ａβ－キメラＣＭＶポリペプチドを生成する
Ａβタンパク質断片Ａβ１－６（配列番号１）、Ａβ１－７（配列番号２）、Ａβ３－６（配列番号３）及びＡβ１－５（配列番号４）を含む、本発明によるＣＭＶ－Ａβ－キメラＣＭＶポリペプチドを調製した。

【0190】

破傷風トキソイド由来のＴヘルパー細胞エピトープを含む非常に好ましい修飾ＣＭＶコートタンパク質であるＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０（配列番号５）のアミノ酸残基Ｓｅｒ（８８）とＴｙｒ（８９）との間に、これらのＡβペプチドを挿入した。本発明によるこれらの好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１６」のアミノ酸配列：配列番号６；
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１７」のアミノ酸配列：配列番号７；
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６」のアミノ酸配列：配列番号８；
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１５」のアミノ酸配列：配列番号９。

【0191】

これらの好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのアミノ酸配列は、両末端に、導入されたＡβペプチドに隣接するグリシン－セリンリンカーをさらに含む。配列番号６～配列番号９の好ましい融合タンパク質はいずれも、導入されたＡβペプチドのＮ末端に直接ＧＧＧＳ－リンカー（配列番号１０）を含み、導入されたＡβペプチドのＣ末端にＧＧＧＳＧＳ－リンカー（配列番号１１）を含む。

【0192】

上記好ましいキメラＣＭＶポリペプチドの対応するヌクレオチド配列は以下の通りである：
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１６」の核酸配列：配列番号１２；
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１７」の核酸配列：配列番号１３；
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６」の核酸配列：配列番号１４；
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１５」の核酸配列：配列番号１５。

【0193】

これらのＡβペプチド、又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の対応するＣＭＶ ＤＮＡ配列内のＤＮＡ配列をコードする他の抗原性ポリペプチドの導入のために、ＢａｍＨＩ部位含有配列をその後のクローニングのために対応する位置に導入した。ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０をコードする核酸配列は、国際公開第２０１６／０６２７２０Ａ１号パンフレットの例３に記載されているように調製し、国際公開第２０１６／０６２７２０Ａ１号パンフレットの配列番号１４に対応する。

【0194】

以下に列挙するオリゴヌクレオチドと、鋳型として以前に構築されたｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０とを使用する２段階ＰＣＲ変異誘発によって、ＢａｍＨＩ部位を導入した。国際公開第２０１６／０６２７２０Ａ１号パンフレットの例３に記載されているように、鋳型ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を調製した。
第１のＰＣＲ：フォワード－ｐＥＴ－９０プライマー（ｐＥＴ２８ａ＋をアニーリング）（配列番号１６）
リバース－ＲＧＳＹｒｅｖ（配列番号１７）
第２のＰＣＲ フォワード－ＲＧＳＹｄｉｒ（配列番号１８）
リバース－ＣＭＶ－ＡｇｅＲ（配列番号１９）

【0195】

両ＰＣＲ産物の精製後、次のＰＣＲを行ってＰＣＲ断片を結合した（プライマーを用いず５サイクル、次いでプライマーｐＥＴ－９０及びＣＭＶ－ＡｇｅＲを使用して２５サイクル）。

【0196】

遺伝子増幅後、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター（ＩｎｓＴＡｃｌｏｎｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＃Ｋ１２１４）に、得られたＰＣＲ産物を直接クローニングした。クローニング及びプラスミド増幅のための宿主として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞を使用した。

【0197】

ＲＴ－ＰＣＲエラーを回避するために、ＢｉｇＤｙｅサイクル配列決定キット及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、いくつかのＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子含有ｐＴＺ５７プラスミドクローンを配列決定した。配列決定後、配列エラーがなく、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ遺伝子を含み、ＢａｍＨＩ部位を導入したｐＴＺ－プラスミドクローンをＮｃｏＩ及びＡｇｅＩ酵素を用いて切断した。次いで、ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０のＮｃｏＩ／ＡｇｅＩ部位に断片をサブクローニングし、ヘルパーベクターｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂを得た。

【0198】

アミロイド－（β）ペプチドをコードするＤＮＡの導入のために、以下のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応に使用した（ＰＣＲではいずれも、鋳型はｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０であった）：
第１のＰＣＲ：フォワード－Ｃ－Ａｂ１５（配列番号２０）
リバース－ＣＭｃｐＲ（配列番号２１）
第２のＰＣＲ：フォワード－Ｃ－Ａｂ１６（配列番号２２）
リバース－ＣＭｃｐＲ（配列番号２１）
第３のＰＣＲ：フォワード－Ｃ－Ａｂ１７（配列番号２３）
リバース－ＣＭｃｐＲ（配列番号２１）
第４のＰＣＲ：フォワード－Ｃ－Ａｂ３６（配列番号２４）
リバース－ＣＭｃｐＲ（配列番号２１）

【0199】

全ＰＣＲ断片をｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターに直接ライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１細胞内での形質転換後に、対応する挿入物含有プラスミドクローンを単離した。ＢｉｇＤｙｅサイクル配列決定キット及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲ産物ＤＮＡを含むいくつかのプラスミドクローンを配列決定した。配列決定後、部位ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ＢヘルパーベクターにＡｂ断片含有ＣＭＶ ３’末端断片をライゲーションした。ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素試験後に正しいクローンを選択した。

【0200】

さらに、プラスミドクローンｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－Ａｂ１５、ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－Ａｂ１６、ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－Ａｂ１７及びｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－Ａｂ３６を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞の形質転換に使用した。ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－Ａｂ３６のプラスミドマップを図１に例示的に示す。

【0201】

例２
ＣＭＶ－ＡβＶＬＰをもたらすＣＭＶ－Ａβ－キメラＣＭＶポリペプチドの発現
ＣＭＶ－ＡβＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１６ ＶＬＰ、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１７ ＶＬＰ、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６ ＶＬＰ又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１５ ＶＬＰを単離するために、対応するプラスミドｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１５、ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１６、ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１７及びｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）コンピテント細胞を形質転換した。

【0202】

標的タンパク質の発現レベルが最も高いクローンを選択した後、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含有する２ＴＹ（トリプトン１．６％、酵母エキス１％、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）培地中で、ロータリーシェーカー上３０℃で、０．８～１．０のＯＤ（６００）値まで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を増殖させた。次いで、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを用いて細胞を誘導し、培地に５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加した。インキュベーションをロータリーシェーカー上２０℃で１８時間続けた。得られたバイオマスを低速遠心分離により回収し、－２０℃で凍結した。

【0203】

ＣＭＶ－ＡβＶＬＰの精製は、以下の工程を含む：
１）３ｇのバイオマスを２０ｍｌの５０ｍＭクエン酸Ｎａ、５ｍＭホウ酸Ｎａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、ｐＨ９．０中に懸濁させ、超音波（ＨｉｅｌｓｃｈｅｒソニケーターＵＰ２００Ｓ、１６分、振幅７０％、周期０．５）を用いて懸濁液を処理する；
２）溶解物を＋４℃、１１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する；
３）５０ｍＭクエン酸Ｎａ、５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＴＸ－１００を含有する緩衝液中で、３５ｍｌチューブ内でスクロース勾配（２０～６０％）を調製する；
４）５ｍｌのＶＬＰ試料をスクロース勾配に重ねる；
５）ＳＷ３２ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ（２５０００ｒｐｍ、＋１８℃）を使用して６時間遠心分離する。
６）各勾配チューブの内容物を６ｍｌの画分に分割する。対応する画分をプールする；
７）ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて勾配画分を分析する（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ）。
８）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、第３のスクロース勾配画分中のＶＬＰの存在を示唆している。２４ｍｌの第３の画分を２４ｍｌの緩衝液（５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）により希釈する；
９）ローターＴｙｐｅ ７０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ、Ｌ１００ＸＰ超遠心機；４時間、５０ ０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１０）ペレットを３ｍｌの５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０に可溶化する；
１１）２０％スクロース「クッション」（５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０緩衝液中）の上部にＶＬＰ懸濁液を重ねる；
１２）ローターＴＬＡ１００．３（Ｂｅｃｋｍａｎ；１時間、７２０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１３）ペレットを２ｍｌの５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０に一晩４℃で可溶化する；
１４）ＥＭ下でＶＬＰを分析する（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ）。

【0204】

図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄに示すように、４つのＣＭＶ－ＡβＶＬＰは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内で首尾よく発現することができ、得られたかなりの部分は可溶性画分中にあり得る。さらに、これらのタンパク質は、スクロース勾配分析（図２Ａ～図２Ｄ）及び電子顕微鏡分析（図３Ａ～図３Ｄ）によって示されるように、等大ＶＬＰの形態で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞抽出物中に直接見出されている。

【0205】

例３
アデュカヌマブの可変領域配列を有するモノクローナル抗体はＣＭＶ－ＡβＶＬＰを認識する
Ａβ_１－４２、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６ ＶＬＰ又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰによりＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、アデュカヌマブの配列を示す可変領域との組換え抗体の結合をＥＬＩＳＡによって試験した。

【0206】

ＥＬＩＳＡ：
１００μｌのＡβ_１－４２、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６ ＶＬＰ又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰ（１μｇ／ｍｌ）のＰＢＳ、ｐＨ７．４溶液により、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を４℃で一晩コーティングした。非特異的結合を回避するために、２００μｌの２％ＢＳＡのＰＢＳＴ溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートをブロックし、室温で２時間インキュベートした。アデュカヌマブの可変領域配列を有するモノクローナル抗体を発現する細胞の上清をコーティングプレートに移した。室温で２時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートを２００μｌのＰＢＳＴで５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって、血清抗体の結合を検出した。検出抗体を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１：１０００に希釈し、１００μｌ／試料の体積を移した。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを前述のように洗浄した。洗浄の前に、基質溶液を調製した。この目的のために、１錠（１０ｍｇ）のＯＰＤ（１，２－フェニレンジアミン二塩酸塩）及び９μｌの３０％Ｈ_２Ｏ_２を２５ｍｌのクエン酸緩衝液（０．０６６Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．０３５Ｍクエン酸、ｐＨ５．０）に溶解させた。１００μｌの体積の基質溶液をプレートにピペッティングし、室温で７分間正確にインキュベートした。反応を停止させるために、５０μｌの停止溶液（Ｈ_２Ｏ中５％Ｈ_２ＳＯ_４）をプレートに直接ピペッティングした。１，２－フェニレンジアミン二塩酸塩呈色反応の４５０ｎｍでの吸光度読取値を分析した。図４は、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ＡβＶＬＰに対する、アデュカヌマブの可変領域配列を有するモノクローナル抗体の結合を示す。

【0207】

例４
ＣＭＶ－ＡβＶＬＰによるマウスの免疫化
ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１６ ＶＬＰ、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１７ ＶＬＰ又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６ ＶＬＰを用いて、雌Ｂａｌｂ／ｃマウス４匹の群を免疫した。ＶＬＰを１５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４及び１５０μｌに配合し、０日目に３０ｕｇの用量で静脈内注射した。０日目（免疫前）及び１４日目にマウスから採血し、Ａβ１－４２コーティングＥＬＩＳＡプレートを使用して血清を分析した。免疫組織化学的検査によって、アルツハイマー病患者から得られた脳切片に対して、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６ ＶＬＰによって誘導された抗体をさらに分析した。

【0208】

ＥＬＩＳＡ：
示された時間に、マウス血清中の抗体応答を分析した。Ａβ１－４２特異的抗体を決定するために、１００μｌのＡβ１－４２（１μｇ／ｍｌ）のＰＢＳ、ｐＨ７．４溶液により、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を４℃で一晩コーティングした。非特異的結合を回避するために、２００μｌの２％ＢＳＡのＰＢＳＴ溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートをブロックし、室温で２時間インキュベートした。血清試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで希釈した。予備希釈した血清をコーティングプレートに移し、さらに連続希釈して、ＯＤ５０計算に基づいて抗体価を得た。室温で２時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートを２００μｌのＰＢＳＴで５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって、血清抗体の結合を検出した。検出抗体を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１：１０００に希釈し、１００μｌ／試料の体積を移した。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを前述のように洗浄した。洗浄の前に、基質溶液を調製した。この目的のために、１錠（１０ｍｇ）のＯＰＤ（１，２－フェニレンジアミン二塩酸塩）及び９μｌの３０％Ｈ_２Ｏ_２を２５ｍｌのクエン酸緩衝液（０．０６６Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．０３５Ｍクエン酸、ｐＨ５．０）に溶解させた。１００μｌの体積の基質溶液をプレートにピペッティングし、室温で７分間正確にインキュベートした。反応を停止させるために、５０μｌの停止溶液（Ｈ_２Ｏ中５％Ｈ_２ＳＯ_４）をプレートに直接ピペッティングした。１，２－フェニレンジアミン二塩酸塩呈色反応の４５０ｎｍでの吸光度読取値を分析した。図５Ａは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１６ ＶＬＰ、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ１７ ＶＬＰ又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６ ＶＬＰに特異的な抗体を示す。

【0209】

免疫組織化学的検査：
ミクロトームを用いて、アルツハイマー病患者のパラフィン包埋脳（海馬）組織の切片を調製した。切片をスライド上に載せ、３％Ｈ_２Ｏ_２と１０分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼをブロックした。次いで、スライドをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、続いてＰＢＳのみで５分間３回洗浄した。ＰＢＳ＋ヤギ血清３％、カゼイン０．５％、ＮａＮ_３０．１％を用いて、スライドを室温で３０分間ブロックした。ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６ ＶＬＰ免疫マウスから得られた１：５０希釈血清とともに、スライドを１時間程度インキュベートした。スライドをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、続いてＰＢＳのみで５分間にわたり３回洗浄した。次いで、スライドを二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（＃１６１）１：１０００とともに室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、続いてＰＢＳのみで５分間３×５洗浄した。結合した抗体をＤＡＢ基質（Ｋｉｔ ａｂｃａｍ ａｂ６４２３８を使用して）によって可視化し、続いて水により洗浄した。ヘマトキシリンを用いて対比染色を３０秒間行い、続いて水中で２分間洗浄した。図５Ｂは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｂ３６ ＶＬＰによって誘導された免疫血清によるプラークの染色を示す。

【0210】

例５
Ａｒａ－ｈ２０２を含む、ＣＭＶの修飾コートタンパク質のクローニング
本発明による単一プラスミド系から抗原を含有するモザイクＶＬＰを得るために、構築の工程は、第２のＴ７プロモーター下のｐＥＴＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ）のポリリンカーへのＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子の挿入であった。ここで、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０核酸配列は、国際公開第２０１６／０６２７２０Ａ１号パンフレットの例３に記載されているように調製し、国際公開第２０１６／０６２７２０Ａ１号パンフレットの配列番号１４に対応する。クローニングのための対応する制限部位を有するＣＭＶ構造遺伝子について、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲ反応で上記ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子を増幅した：
フォワード：ＣＭ－８３０ＮｄｅＦ（配列番号２５）
リバース：ＣＭ－ｃｐＲ（配列番号２６）

【0211】

遺伝子の増幅後、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター（ＩｎｓＴＡｃｌｏｎｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＃Ｋ１２１４）に、対応するＰＣＲ産物を直接クローニングした。クローニング及びプラスミド増幅のための宿主として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ １－Ｂｌｕｅ細胞を使用した。ＲＴ－ＰＣＲエラーを回避するために、ＢｉｇＤｙｅサイクル配列決定キット及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、いくつかのＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子含有ｐＴＺ５７プラスミドクローンを配列決定した。配列決定後、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子を含み、配列エラーのないｐＴＺ－プラスミドクローンをＨｉｎｄＩＩＩ酵素を用いて切断し、クレノウ酵素を用いて処理し、最後にＮｄｅＩ制限酵素を用いて処理した。次いで、ｐＥＴＤｕｅｔ－１のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＶ部位に断片をサブクローニングし、ヘルパーベクターｐＥＴＤｕ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を得た。

【0212】

Ａｒａ－ｈ２０２タンパク質コードＤＮＡ配列をＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０核酸に挿入するために、例えば、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の配列番号５のＳｅｒ（８８）及びＴｙｒ（８９）に対応する位置の間に上記挿入を生成するように、ＢａｍＨＩ部位含有１５及び１０アミノ酸長Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーコード配列を導入した。Ａｒａ－ｈ２０２タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２７に記載されており、対応するＤＮＡ配列は配列番号２８に記載されている。

【0213】

「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２」と呼ばれる、本発明によるこの好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２９である。この好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのこのアミノ酸配列は、両末端に、導入されたＡｒａ－ｈ２０２タンパク質に隣接するグリシン－セリンリンカー、すなわち、導入されたＡｒａ－ｈ２０２タンパク質のＮ末端に直接ある１５アミノ酸長ＧＳ－リンカー（配列番号３０）と、導入されたＡｒａ－ｈ２０２タンパク質のＣ末端にある１０アミノ酸長ＧＳ－リンカー（配列番号３１）とを含む。この好ましいキメラＣＭＶポリペプチドＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２の対応するヌクレオチド配列は、配列番号３２に記載されている。

【0214】

最初に、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子断片及びＡｒａ－ｈ２０２コード配列（ＢａｍＨＩに隣接し、「開始」及び「停止」コドンを有しない）をＰＣＲ反応で増幅した：
ＣＭＶ遺伝子５’末端の第１のＰＣＲ：
フォワード：８３０－ＮｃｏＦ（配列番号３３）
リバース：Ｃ－５ｘｇ４ｓ－Ｒ（配列番号３４）
鋳型：国際公開第２０１６／０６２７２０Ａ１号パンフレットの例３に記載されているように調製したｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を使用した。
ＣＭＶ遺伝子３’末端の第２のＰＣＲ：
フォワード：Ｃ－５ｘｇ４ｓ－Ｆ（配列番号３５）
リバース：ＣＭｃｐＲ（配列番号２１）
鋳型：国際公開第２０１６／０６２７２０Ａ１号パンフレットの例３に記載されているように調製したｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を使用した。
Ａｒａｈ２０２の第３のＰＣＲ：
フォワード：Ａｒａ－ＢａｍＦ２（配列番号３６）
リバース：Ａｒａ－ＢａｍＲ２（配列番号３７）
鋳型：国際公開第２０１７／１８６８０８Ａ１号パンフレットの例１３に記載されているように調製した、ｐＵＣＩＤＴプラスミド内の遺伝子合成Ａｒａ－ｈ２０２遺伝子。

【0215】

全ＰＣＲ断片をｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターに直接ライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１細胞内での形質転換後に、対応する挿入物含有プラスミドクローンを単離した。ＰＣＲエラーを回避するために、ＢｉｇＤｙｅサイクル配列決定キット及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲ産物ＤＮＡを含むいくつかのプラスミドクローンを配列決定した。配列決定後、部位ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでは、ｐＴＺ５７－ＣＭＶ－５－末端ベクターにＣＭＶ ３’末端の断片をライゲーションした。結果として、Ａｒａ－ｈ２０２コード配列のその後のサブクローニングのためにＧｌｙＳｅｒリンカー及びＢａｍＨＩ部位を含むヘルパープラスミドｐＴＺ－ＣＭＶＢ２が得られた。次の工程として、ｐＴＺ－ＣＭＶＢ２ ＢａｍＨＩ部位に、部分的ＢａｍＨＩ処理後のＡｒａ－ｈ２０２断片をサブクローニングした。プライマーＡｒａ－ＢａｍＦ２／ＣＭｃｐＲを使用した「コロニーＰＣＲ」反応では、正しい向きのＡｒａ－ｈ２０２挿入物を含む正しいクローンが見出された。陽性ＰＣＲシグナルを有するプラスミドクローンを再配列決定した。ｐＴＺ－ＣＭＶＢ２－Ａｒａ－ｈ２０２プラスミドクローンの配列決定結果から、ＣＭＶと融合したＡｒａ－ｈ２０２遺伝子の存在が確認された。

【0216】

発現ベクターを構築するために、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ酵素を使用してヘルパープラスミドからＣＭＶＢ２－Ａｒａｈ２０２挿入物を切り出し、構築したヘルパーベクターｐＥＴＤｕ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０にサブクローニングした。得られたｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ２ｘＡｒａｈ２０２－ＣＭＶ－ｔｔのプラスミドマップを図６に示す。

【0217】

例６
ＣＭＶの修飾コートタンパク質と融合Ａｒａ－ｈ２０２とを含むモザイク粒子（ＣＭＶ－Ｍ－Ａｒａｈ２０２）の発現
モザイクＣＭＶ－Ａｒａｈ２０２ ＶＬＰを単離するために、プラスミドｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ２ｘＡｒａｈ２０２－ＣＭＶ－ｔｔを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）コンピテント細胞を形質転換した。

【0218】

標的タンパク質の発現レベルが最も高いクローンを選択した後、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を含有する２ＴＹ（トリプトン１．６％、酵母エキス１％、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）培地中で、ロータリーシェーカー上３０℃で、０．８～１．０のＯＤ（６００）値まで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を増殖させた。次いで、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを用いて細胞を誘導し、培地に５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加した。インキュベーションをロータリーシェーカー上２０℃で１８時間続けた。得られたバイオマスを低速遠心分離により回収し、－２０℃で凍結した。バイオマス排出量－約１２ｇの湿潤バイオマス／１ｌの培養物、ＯＤ（６００）は培養終了時に６．８であった。

【0219】

本発明によるＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ（上記モザイクＶＬＰは「ＣＭＶ－Ｍ－Ａｒａｈ２０２」と呼ばれる）の精製は、以下の工程を含む：
１）６ｇのバイオマスを２０ｍｌの５０ｍＭクエン酸Ｎａ、５ｍＭホウ酸Ｎａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、ｐＨ９．０中に懸濁させ、超音波（ＨｉｅｌｓｃｈｅｒソニケーターＵＰ２００Ｓ、１６分、振幅７０％、周期０．５）を用いて懸濁液を処理する；
２）溶解物を＋４℃、１１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する；
３）５０ｍＭクエン酸Ｎａ、５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｘ－１００を含有する緩衝液中で、３５ｍｌチューブ内でスクロース勾配（２０～６０％）を調製する；
４）５ｍｌのＶＬＰ試料をスクロース勾配に重ねる。４本のチューブを準備する；
５）ＳＷ３２ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ（２５０００ｒｐｍ、＋１８℃）を使用して６時間遠心分離する。
６）各勾配チューブの内容物を６ｍｌの画分に分割する。対応する画分をプールする；
７）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを用いて勾配画分を分析する（図７）。
８）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、第３のスクロース勾配画分中のモザイクＶＬＰの存在を示唆している。２４ｍｌの第３の画分を２４ｍｌの緩衝液（５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）により希釈する；
９）ローターＴｙｐｅ ７０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ、Ｌ１００ＸＰ超遠心機；４時間、５０ ０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１０）ペレットを３ｍｌの５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０に可溶化する；
１１）２０％スクロース「クッション」（５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０緩衝液中）の上部にＶＬＰ懸濁液を重ねる；
１２）ローターＴＬＡ１００．３（Ｂｅｃｋｍａｎ；１時間、７２０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１３）ペレットを２ｍｌの５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０に一晩４℃で可溶化する；
１４）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（図７）を用いて、及びＥＭ下（図８）で、精製後のＶＬＰを分析する。

【0220】

例７
モザイク粒子ＣＭＶ－Ｍ－Ａｒａｈ２０２によるマウスの免疫化
ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ａｒａｈ２０２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むＶＬＰ（ＣＭＶ－Ｍ－Ａｒａｈ２０２）として合計１０μｇのＡｒａ－ｈ２０２量を用いて、又は遊離形態のＡｒａ－ｈ２０２を用いて、雌Ｂａｌｂ／ｃマウス３匹の群を皮下免疫した。ＶＬＰを１５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４に配合し、１０ｕｇを１５０ｕｌの体積で皮下注射した。免疫化の１４日後にマウスから採血し、組換えＡｒａ－ｈ２０２に対するＥＬＩＳＡによって全免疫血清を試験した。

【0221】

ＥＬＩＳＡ：
示された時間に、マウス血清中の抗体応答を分析した。Ａｒａ－ｈ２０２特異的抗体価を決定するために、ピーナッツ抽出物（１μｇ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液から精製した１００μｌのＡｒａ－ｈ２により、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を４℃で一晩コーティングした。非特異的結合を回避するために、２００μｌの２％ＢＳＡのＰＢＳＴ溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートをブロックし、室温で２時間インキュベートした。血清試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで希釈した。予備希釈した血清をコーティングプレートに移し、さらに連続希釈して、ＯＤ５０計算に基づいて抗体価を得た。室温で２時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートを２００μｌのＰＢＳＴで５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって、血清抗体の結合を検出した。検出抗体を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１：１０００に希釈し、１００μｌ／試料の体積を移した。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを前述のように洗浄した。洗浄の前に、基質溶液を調製した。この目的のために、１錠（１０ｍｇ）のＯＰＤ（１，２－フェニレンジアミン二塩酸塩）及び９μｌの３０％Ｈ_２Ｏ_２を２５ｍｌのクエン酸緩衝液（０．０６６Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．０３５Ｍクエン酸、ｐＨ５．０）に溶解させた。１００μｌの体積の基質溶液をプレートにピペッティングし、室温で７分間正確にインキュベートした。反応を停止させるために、５０μｌの停止溶液（Ｈ_２Ｏ中５％Ｈ_２ＳＯ_４）をプレートに直接ピペッティングした。１，２－フェニレンジアミン二塩酸塩呈色反応の４５０ｎｍでの吸光度読取値を分析した。図９は、Ａｒａ－ｈ２に特異的な抗体を示す。

【0222】

Ａｒａ ｈ２０２ ＩｇＧを決定するために、ＰＢＳ緩衝液中の２μｇ／ｍｌ Ａｒａ ｈ２により、９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ／０．１５％カゼイン溶液を用いて２時間ブロッキングした後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。血清の連続希釈物をプレートに加え、４℃で２時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で５回洗浄した。その後、ＨＲＰ０標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）抗体を４℃で１時間インキュベートした。ＴＭＢ（３，３０，５，５０テトラメチル－ベンジジン）及びＨ_２Ｏ_２を用いてＥＬＩＳＡを発色させ、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸を用いて停止させた。光学密度を４５０ｎｍで測定した。最大半量抗体価（ｈａｌｆ－ｍａｘｉｍａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ）は、飽和時に測定されたＯＤの半分をもたらす希釈の逆数として定義される。図９は、Ａｒａ－ｈ２０２に特異的な抗体を示す。

【0223】

例８
ＣＭＶ－Ｍ－Ａｒａｈ２０２による免疫化はアナフィラキシー反応から保護する
感作及びワクチン接種
０及び７日目に、２００μｌのミョウバンに配合したピーナッツ抽出物の腹腔内注射によって、マウスをピーナッツアレルゲンに感作させた。次いで、対照群については、マウスにＣＭＶ－Ｍ－Ａｒａｈ２０２又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰをワクチン接種した（２１日目に２００ｕｌ ＰＢＳ中３０ｕｇ）。図１０Ａは、アレルギーの全身及び局所反応に対するＣＭＶ－Ｍ－Ａｒａｈ２０２を用いたワクチン接種の保護効果を検討するための実験デザインを示す。

【0224】

全身及び局所惹起
感作及びワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃの耳に対して、静脈内投与又は皮膚プリック試験（１８０ｕｇ／２０ｕｌ ＰＢＳ）によってピーナッツ抽出物２０ｕｇによる惹起を行った。それぞれ体温低下（図１０Ｂ；簡潔にするためにＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰはＣＭＶと略される）又は体液組織滲出（点直径、図１０Ｃ、簡潔にするためにＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰはＣＭＶと略される）によって、全身及び局所のアレルギー反応を決定した。グラフは、２つの独立した実験の代表である。１群当たり５匹のマウスの平均値＋／－ＳＥＭを示す。２元配置分散分析検定によって、アナフィラキシー曲線を分析した。両側スチューデントｔ検定によって、皮膚プリック試験を分析した。

【0225】

例９
ＣＭＶの修飾コートタンパク質と融合ＦＥＬ Ｄ １とを含むモザイク粒子（ＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌ）の構築及び発現
最初に、「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２」と呼ばれる、本発明による好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのコード配列を調製する。

【0226】

ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２は、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１及び鎖２と、上記鎖１を上記鎖２に連結する１５アミノ酸のＧＳ－リンカーとの融合タンパク質に対応する、配列番号３８のＦｅｌ ｄ１タンパク質を含む。配列番号３８の構築物は、国際公開第２０１７／０４２２４１号パンフレットの例７に記載されている。さらに、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２内では、配列番号３８の上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質はグリシン－セリンリンカーに隣接しており、詳細には、配列番号３８の上記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、そのＮ末端では配列番号３０の１５アミノ酸長ＧＳ－リンカーに直接隣接し、そのＣ末端では配列番号３１の１０アミノ酸長ＧＳ－リンカーに直接隣接している。さらに、上記の構築物全体、すなわち、記載のグリシン－セリンリンカーに隣接する、配列番号３８の構築物は、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の配列番号５のＳｅｒ（８８）及びＴｙｒ（８９）に対応する位置の間に挿入され、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２をもたらす。

【0227】

「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２」と呼ばれる、本発明によるこの好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３９である。この好ましいキメラＣＭＶポリペプチドＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２の対応するヌクレオチド配列は、配列番号４０に記載されている。

【0228】

ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２遺伝子は、国際公開第２０１７／０４２２４１号パンフレットの例７に記載されているように同様に調製し、その開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる。上記ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２遺伝子を得るために、まず、ＰＣＲによって以下のオリゴヌクレオチドを用いてＦｅｌ ｄ１対応遺伝子を増幅した：
フォワード：ＦＧ４Ｓ－ＢａｍＦ（配列番号４１）
リバース：ＦＧ４Ｓ－ＢａｍＲ（配列番号４２）

【0229】

隣接するＧｌｙ－ＳｅｒリンカーとＢａｍＨＩ部位とを両末端に含むＰＣＲ断片をｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターに直接ライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１細胞内での形質転換後に、対応する挿入物含有プラスミドクローンを単離した。ＰＣＲエラーのない挿入物を見出すために、ＢｉｇＤｙｅサイクル配列決定キット及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲ産物ＤＮＡを含むいくつかのプラスミドクローンを配列決定した。配列決定後、ＢａｍＨＩ部位で、ヘルパーベクターｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂに正しいＦｅｌ ｄ１断片をライゲーションした。プライマーＦＧ４Ｓ－ＢａｍＦ／ＣＭｃｐＲを使用した「コロニーＰＣＲ」反応では、正しい向きのＦｅｌ ｄ１挿入物を含む正しいクローンが見出された。陽性ＰＣＲシグナルを有するプラスミドクローンを再配列決定し、その後のクローニングのために正しいクローンを選択した。その結果、ヘルパープラスミドｐＥＴ－ＣＭＶＢ－Ｆｅｌｄ１を得た。次の工程として、ヘルパーベクターｐＥＴＤｕ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０に、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理後のＣＭＶＢ－Ｆｅｌｄ１断片をサブクローニングした（例５を参照）。Ａｍｐ耐性遺伝子を有しない発現ベクターを構築するために、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２融合物及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子を含むカセット全体を切り出し、ｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローニングし、発現ベクターｐＥＴ２８－ＣＭＶＢｘＦｅｌｄ１－ＣＭＶｔｔを得た。プラスミドマップを図１１に示す。

【0230】

本発明によるモザイクＣＭＶ－Ｆｅｌｄ１ ＶＬＰ、すなわち、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－Ｆｅｌｄ１２及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ（「ＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌ」と呼ばれる）の単離は、以下の工程を含む：
プラスミドｐＥＴ ２８－ＣＭＶＢｘＦｅｌｄ１－ＣＭＶｔｔを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）コンピテント細胞を形質転換した。

【0231】

標的タンパク質の発現レベルが最も高いクローンを選択した後、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含有する２ＴＹ（トリプトン１．６％、酵母エキス１％、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）培地中で、ロータリーシェーカー上３０℃で、０．８～１．０のＯＤ（６００）値まで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を増殖させた。次いで、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを用いて細胞を誘導し、培地に５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加した。インキュベーションをロータリーシェーカー上２０℃で１８時間続けた。得られたバイオマスを低速遠心分離により回収し、－２０℃で凍結した。

【0232】

モザイクＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌ ＶＬＰの精製は、以下の工程を含む：
１）６ｇのバイオマスを２０ｍｌの５０ｍＭクエン酸Ｎａ、５ｍＭホウ酸Ｎａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、ｐＨ９．０中に懸濁させ、超音波（ＨｉｅｌｓｃｈｅｒソニケーターＵＰ２００Ｓ、１６分、振幅７０％、周期０．５）を用いて懸濁液を処理する；
２）溶解物を＋４℃、１１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する；
３）５０ｍＭクエン酸Ｎａ、５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＴＸ－１００を含有する緩衝液中で、３５ｍｌチューブ内でスクロース勾配（２０～６０％）を調製する；
４）５ｍｌのＶＬＰ試料をスクロース勾配に重ねる；
５）ＳＷ３２ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ（２５０００ｒｐｍ、＋１８℃）を使用して６時間遠心分離する。
６）各勾配チューブの内容物を６ｍｌの画分に分割する。対応する画分をプールする；
７）ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて勾配画分を分析する（図１２Ａ）；
８）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、第２のスクロース勾配画分中のモザイクＶＬＰの存在を示唆している。２４ｍｌの第３の画分を２４ｍｌの緩衝液（５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）により希釈する；
９）ローターＴｙｐｅ ７０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ、Ｌ１００ＸＰ超遠心機；４時間、５０ ０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１０）ペレットを３ｍｌの５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０に可溶化する；
１１）２０％スクロース「クッション」（５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０緩衝液中）の上部にＶＬＰ懸濁液を重ねる；
１２）ローターＴＬＡ１００．３（Ｂｅｃｋｍａｎ；１時間、７２０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１３）ペレットを２ｍｌの５ｍＭホウ酸Ｎａ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０に一晩４℃で可溶化する；
１４）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（図１２Ｂ）を用いて、及びＥＭ下（図１２Ｃ）で、精製後のＶＬＰを分析する。

【0233】

例１０
モザイク粒子ＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌによるマウスの免疫化
ＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌ、又はＣＭＶＮｔｔ８３０ ＶＬＰに化学的に結合したＦｅｌ ｄ１、又は組換えＦｅｌ ｄ１抽出物を用いて、雌Ｂａｌｂ／ｃマウス４匹の群を免疫した。ＶＬＰを１５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４に配合し、２５ｕｇを１５０ｕｌの体積で皮下注射した。組換えＦｅｌ ｄ１抽出物をＰＢＳに配合し、１０ｕｇを皮下注射した。２週間後、マウスから採血し、Ｆｅｌ ｄ１に対する抗体レベルをＥＬＩＳＡによって決定した。Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（２００９）２０６：１９４１－１９５５に記載されているように、組換えＦｅｌ ｄ１に対するＥＬＩＳＡによって、全免疫血清を試験した。

【0234】

ＥＬＩＳＡ：
示された時間に、マウス血清中の抗体応答を分析した。Ｆｅｌ ｄ１特異的抗体価を決定するために、１００μｌのＦｅｌ ｄ１（１μｇ／ｍｌ）のＰＢＳにより、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を４℃で一晩コーティングした。非特異的結合を回避するために、２００μｌの２％ＢＳＡのＰＢＳＴ溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートをブロックし、室温で２時間インキュベートした。血清試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで希釈した。予備希釈した血清をコーティングプレートに移し、さらに連続希釈して、ＯＤ５０計算に基づいて抗体価を得た。室温で２時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートを２００μｌのＰＢＳＴで５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって、血清抗体の結合を検出した。検出抗体を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１：１０００に希釈し、１００μｌ／試料の体積を移した。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを前述のように洗浄した。洗浄の前に、基質溶液を調製した。この目的のために、１錠（１０ｍｇ）のＯＰＤ（１，２－フェニレンジアミン二塩酸塩）及び９μｌの３０％Ｈ_２Ｏ_２を２５ｍｌのクエン酸緩衝液（０．０６６Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．０３５Ｍクエン酸、ｐＨ５．０）に溶解させた。１００μｌの体積の基質溶液をプレートにピペッティングし、室温で７分間正確にインキュベートした。反応を停止させるために、５０μｌの停止溶液（Ｈ_２Ｏ中５％Ｈ_２ＳＯ_４）をプレートに直接ピペッティングした。１，２－フェニレンジアミン二塩酸塩呈色反応の４５０ｎｍでの吸光度読取値を分析した。図１３は、Ｆｅｌ ｄ１に特異的な抗体を示す（図１３）。

【0235】

例１１
ＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌによる免疫化はアナフィラキシー反応から保護する
１日目に、ミョウバンに配合したネコの毛から単離された１ｕｇの天然Ｆｅｌ ｄ１を用いて腹腔内感作することによって、Ｆｅｌ ｄ１に対してマウスをアレルギーにした。次いで、ＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌ又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰ（ＰＢＳ中３０ｕｇ、１４日目）を用いてマウスを免疫した後に、体温低下による静脈内全身アナフィラキシー反応を判定した。

【0236】

感作
０日目に、２００μｌのミョウバンに配合した天然Ｆｅｌ ｄ１抽出物（１ｕｇ）（Ｉｎｄｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の腹腔内注射によって、マウスをＦｅｌ ｄ１に感作させた。次いで、対照群については、マウスにＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌ又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰ（２１日目に２００ｕｌ ＰＢＳ中３０ｕｇ）をワクチン接種した。図１４Ａは、アレルギーの全身及び局所反応に対するＣＭＶ－Ｍ－Ｆｅｌを用いたワクチン接種の保護効果を検討するための実験デザインを示す。

【0237】

全身惹起
感作及びワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスを対象に、Ｆｅｌ ｄ１抽出物を静脈内投与して惹起を行った。全身アレルギー反応を体温低下によって判定した（図１４Ｂ）。グラフは、２つの独立した実験の代表である。１群当たり５匹のマウスの平均値＋／－ＳＥＭを示す。２元配置分散分析検定によって、アナフィラキシー曲線を分析した。

【0238】

例１２
ＣＭＶの修飾コートタンパク質と熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）の融合内部反復（ｉｎ－ｆｕｓｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）とを含むモザイク粒子（ＣＭＶ－Ｍ－ＣＳＰ）の構築及び発現
熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳタンパク質断片、すなわち、中央反復領域から配列番号４４（１９ｎａｎｐ）をもたらすＮＡＮＰ（配列番号４３）の１９反復のクローニングのために、配列番号４５の配列を商業的供給源から得た（遺伝子合成）：
配列番号４５の配列は、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子の３’末端部分、ならびに必要な制限部位ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩもコードする。

【0239】

次に、遺伝子合成産物由来のＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて処理し、ヘルパーベクターｐＴＺ－ＣＭＶＢ２にサブクローニングした（例５を参照）。制限部位分析（ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）を使用して、１９ＮＡＮＰ挿入物を含む正しいクローンを見出した。正しい制限酵素パターンを有するプラスミドクローンを再配列決定した。次の工程として、ヘルパーベクターｐＥＴＤｕ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０に、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理後のＣＭＶＢ－１９ＮＡＮＰ断片をサブクローニングした（例５を参照）。Ａｍｐ耐性遺伝子を有しない発現ベクターを構築するために、ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０由来のＣＭＶ－１９ＮＡＮＰ融合物及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子を含むカセット全体を切り出し、ｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏＩ／ＢｌｐＩ部位にサブクローニングし、発現ベクターｐＥＴ２８－ＣＭＶＢ２ｘ１９ｎａｎｐ－ＣＭＶｔｔを得た。プラスミドマップ及び配列の詳細を図１５に示す。

【0240】

「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－１９ＮＡＮＰ」（又は本明細書で区別なく使用される「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－１９ｎａｎｐ」）と呼ばれる、本発明によるこの好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４６である。この好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのこのアミノ酸配列は、両末端に、配列番号４４の導入された１９ｎａｎｐタンパク質に隣接するグリシン－セリンリンカー、すなわち、導入された１９ｎａｎｐタンパク質のＮ末端に直接ある１５アミノ酸長ＧＳ－リンカー（配列番号３０）と、導入された１９ｎａｎｐタンパク質のＣ末端にある１２アミノ酸長ＧＳ－リンカー（配列番号４７）とを含む。この好ましいキメラＣＭＶポリペプチドＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－１９ＮＡＮＰの対応するヌクレオチド配列は、配列番号４８に記載されている。

【0241】

さらに、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－１９ＮＡＮＰ及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－ＣＳＰの合成のために、得られたプラスミドクローンｐＥＴ２８－ＣＭＶＢ２ｘ１９ｎａｎｐ－ＣＭＶｔｔを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞の形質転換に使用した。ＣＭＶ－Ｍ－ＣＳＰの単離のために、例６に記載されているように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の培養、バイオマスの処理、及び精製を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル中のスクロース勾配精製後のＶＬＰの分析を図１６に示す。電子顕微鏡分析後の精製ＣＭＶ－Ｍ－ＣＳＰの画像を図１７に示す。

【0242】

例１３
ＣＭＶ－Ｍ－ＣＳＰの保護効果
ＣＭＶ－Ｍ－ＣＳＰを用いて雌Ｂａｌｂ／ｃマウス４匹の群を免疫する。ＶＬＰを１５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４に配合し、１０ｕｇを１５０ｕｌの体積で皮下注射した。ワクチンの効果を確認するために、１群当たり雌ＢＡＬＢ／ｃ近交系マウス６匹及び１群当たり雌ＣＤ１非近交系マウス８匹（８週齢）を英国のＨａｒｌａｎから購入し、マウス１匹当たり２０μｇ（５０μＬ）のＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０又はＣＭＶ－Ｍ－ＣＳＰを筋肉内（ｉ．ｍ）ワクチン接種する。０及び２１日目にワクチン接種を行う。０、２１、４２日目に、各ワクチン接種前に試料（血液）を採取し、ＥＬＩＳＡによってＣＳＰ特異的免疫応答を測定する。４２日目に、マウスに、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）タンパク質のＣＳＰタンパク質を発現するネズミマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ）置換物を感染させる。マウスが１％の寄生虫血症に達するまで、惹起後４日目から開始して寄生虫血症を連日確認する。

【0243】

ＥＬＩＳＡによるＣＳＰ特異的抗体応答の測定
抗体産生、総ＩｇＧ及びそのサブクラスの評価のために、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を行う。そのために、９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を１μｇ／ｍＬの精製ＣＳＰの濃度で１００μＬ／ウェルでコーティングし、ｐＨ＝９．６．で５０ｍＭの炭酸塩緩衝液（ＣＢＢ）で希釈し、４℃で一晩インキュベートする。翌日、非特異的結合を回避するために、プレートを２００μＬの２％ＢＳＡ－ＰＢＳで満たし、室温で２時間インキュベートする。次いで、免疫マウスから得られた血清を０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳ緩衝液で希釈する。ＥＬＩＳＡプレートで、最初に１００分の１で開始し、続いて１１回１／３連続希釈する。総ＩｇＧ測定のために、１：２０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（二次抗体、ＨＲＰコンジュゲート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）１００μＬ／ウェルを加え、室温で１時間インキュベートする。ＩｇＧサブクラスの評価のために、ヤギ抗マウスＩｇＧサブクラス（ヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ ＨＲＰ結合、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１：２０００の希釈で使用し、室温で１時間インキュベートする。反応を進行させるために、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を適用し、光保護のためにアルミニウム箔の下で室温で１０分間インキュベートする。その後、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４（１００μＬ／ウェル）を用いて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでプレートを読み取る。力価は、最大半量ＯＤ（ＯＤ５０）をもたらす希釈として表される。

【0244】

保護効果の測定
本試験で使用した寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＣＳＰタンパク質を発現するネズミマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ）である（Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｊｕｌ ３；５：１１８２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１１８２０．）。雌のハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）に、感染したＴｕｃｋ－ｏｒｄｉｎａｒｙ（ＴＯ）マウスを食わせる。感染した蚊を、加湿インキュベーター内で１９～２１℃の温度で１２時間の昼夜サイクルで２１日間飼育し、フルクトース－ｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）溶液を与える。２１日後、蚊から唾液腺を解剖してＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れ、ガラスホモジナイザーを使用してスポロゾイトを穏やかに遊離させる。スポロゾイトを１００μＬ中１０００個の寄生虫の濃度に希釈し、マウスの尾静脈に静脈内注射する。寄生虫。マウスが１％の寄生虫血症に達するまで、惹起後４日目から開始して寄生虫血症を連日確認する。

【0245】

例１４
α－シヌクレインペプチドとのＣＭＶ融合物を含むＶＬＰの構築及び発現
α－シヌクレインペプチドｅｇｙ（配列番号４９）、ｋｎｅ（配列番号５０）及びｍｄｖ（配列番号５１）を含む、本発明によるＣＭＶ－α－シヌクレインキメラＣＭＶポリペプチドを調製した。

【0246】

これらのα－シヌクレインペプチドは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０（配列番号５）のアミノ酸残基Ｓｅｒ（８８）とＴｙｒ（８９）との間に挿入されている。本発明によるこれらの好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｅｇｙ」のアミノ酸配列：配列番号５２；
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｋｎｅ」のアミノ酸配列：配列番号５３；
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｍｄｖ」のアミノ酸配列：配列番号５４；

【0247】

これらの好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのアミノ酸配列は、両末端に、導入されたα－シヌクレインペプチドに隣接するグリシン－セリンリンカーをさらに含む。配列番号５２～配列番号５４の好ましい融合タンパク質はいずれも、導入されたα－シヌクレインペプチドのＮ末端に直接ＧＧＧＳ－リンカー（配列番号１０）を含み、導入されたα－シヌクレインペプチドのＣ末端にＧＧＧＳＧＳ－リンカー（配列番号１１）を含む。

【0248】

上記好ましいキメラＣＭＶポリペプチドの対応するヌクレオチド配列は以下の通りである：
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｅｇｙ」の核酸配列：配列番号５５；
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｋｎｅ」の核酸配列：配列番号５６；
「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｍｄｖ」の核酸配列：配列番号５７；

【0249】

α－シヌクレインペプチド変異体をコードするＤＮＡを発現ベクターに導入するために、以下のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応に使用したが、ＰＣＲではいずれも、鋳型はｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０であった：
第１のＰＣＲフォワード：ＣＭ－ｅｇｙＦ（配列番号５８）
リバース：ＣＭｃｐＲ（配列番号５９）
第２のＰＣＲフォワード：ＣＭ－ｋｎｅＦ（配列番号６０）
リバース：ＣＭｃｐＲ（配列番号５９）
第３のＰＣＲフォワード：ＣＭ－ｍｄｖＦ（配列番号６１）
リバース：ＣＭｃｐＲ（配列番号５９）

【0250】

全ＰＣＲ断片をｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターに直接ライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１細胞内での形質転換後に、対応する挿入物含有プラスミドクローンを単離した。ＢｉｇＤｙｅサイクル配列決定キット及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、対応するＰＣＲ産物のＤＮＡを含むいくつかのプラスミドクローンを配列決定した。配列決定後、α－シヌクレイン断片含有ＣＭＶ ３’末端断片をｐＴＺベクターから切り出し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を使用してｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂヘルパーベクター（例１を参照）にライゲーションした。ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ試験後に正しいクローンを選択した。

【0251】

さらに、プラスミドクローンｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－ｅｇｙ、ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－ｋｎｅ及びｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０Ｂ－ｍｄｖを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６細胞の形質転換に使用した。プラスミドマップ及び配列の詳細を図１８に示す。

【0252】

対応するα－シヌクレインペプチド含有ＶＬＰの単離、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞培養、バイオマスの処理、及び精製を例２に記載されているように行った。

【0253】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル中のスクロース勾配精製後のＶＬＰの分析を図１９Ａ、図１９Ｂ及び図１９Ｃならびに図２０Ａに示す。電気顕微鏡画像を図２０Ｂ、図２０Ｃ及び図２０Ｄに示す。

【0254】

例１５
ＣＭＶの修飾コートタンパク質と融合ネコインターロイキン５とを含むモザイク粒子（ＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５）の構築及び発現
ネコＩＬ－５抗原を含む、ＣＭＶの修飾コートタンパク質のクローニングのために、２つの異なるベクターを構築した。

【0255】

以下のようにＰＣＲ変異誘発及びオリゴヌクレオチドを使用して、ｆｅｌ ＩＬ－５抗原の両側に、少なくとも１つのＧｌｙ、少なくとも１つのＳｅｒ及び少なくともＧｌｕを含み、少なくとも１つのＡｓｐをさらに含むアミノ酸リンカーの導入を可能にする第１のベクターを構築した：
第１のＰＣＲ反応：
フォワード：８３０－ＮｃｏＦ（配列番号３３）
リバース：Ｃｍｄｅｄ－ＢａｍＲ（配列番号１２１）
鋳型：ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ２ｘＡｒａｈ２０２－ＣＭＶ－ｔｔ
第２のＰＣＲ反応：
フォワード：ＣＭｄｅｄ－ＢａｍＦ（配列番号１２２）
リバース：ＣＭ－ｃｐＲ（配列番号２６）
鋳型：ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ２ｘＡｒａｈ２０２－ＣＭＶ－ｔｔ

【0256】

遺伝子断片の増幅後、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター（ＩｎｓＴＡｃｌｏｎｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＃Ｋ１２１４）に、対応するＰＣＲ産物を直接クローニングした。クローニング及びプラスミド増幅のための宿主として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞を使用した。ＲＴ－ＰＣＲエラーを回避するために、ＢｉｇＤｙｅサイクル配列決定キット及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、いくつかのＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子含有ｐＴＺ５７プラスミドクローンを配列決定した。配列決定後、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素を用いて、第１のＰＣＲ反応からの産物を含むｐＴＺ－プラスミドクローンを切断し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて第２のＰＣＲからのクローンを切断し、ライゲーション反応で、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断したヘルパーベクターｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ２ｘＡｒａｈ２０２－ＣＭＶ－ｔｔと連結した。ここで、本発明者らは、ヘルパーベクターとしてプラスミドｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ２ｘＡｒａｈ２０２－ＣＭＶ－ｔｔを使用して、新しいＣＭＶベースの発現ベクターを作製した。ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理により、ＣＭＶＢ２ｘＡｒａｈ２０２遺伝子を完全に除去した。３つのＤＮＡ断片のライゲーションにより、ヘルパープラスミドｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ＣＭＶｔｔを得た。ベクターは、コードされた両タンパク質内に破傷風毒素由来のＴｈ細胞エピトープを有するＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子と、少なくとも１つのＧｌｙ、少なくとも１つのＳｅｒ及び少なくともＧｌｕを含み、少なくとも１つのＡｓｐをさらに含み、詳細には、追加のＡｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｓｐストレッチ、及び第１のＴ７プロモーター下のＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子内の抗原ＤＮＡ配列のサブクローニングのためのＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ部位を有するＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含むアミノ酸リンカーをコードする導入された配列とを含む。

【0257】

さらに、以下のようにＰＣＲ変異誘発及びオリゴヌクレオチドを使用して、ｆｅｌ ＩＬ－５抗原のＮ末端上のＧＳ－リンカーと、少なくとも１つのＧｌｙ、少なくとも１つのＳｅｒ及び少なくともＴｈｒを含む、ｆｅｌ ＩＬ－５抗原のＣ末端上のアミノ酸リンカーとの導入を可能にする第２のベクターを構築した：
第３のＰＣＲ反応：
フォワード：ＣＭ－ＢａｍＳｐｅＦ（配列番号１３７）
リバース：ＣＭ－ｃｐＲ（配列番号２６）
鋳型：ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ２ｘＡｒａｈ２０２－ＣＭＶ－ｔｔ

【0258】

第３の反応からのＰＣＲ産物も、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクターに直接クローニングした。得られたライゲーション混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞の形質転換に使用した。プラスミドＤＮＡの単離後、いくつかのクローンを配列決定した。ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて正しいプラスミドクローンを切断し、得られた断片を、同じ酵素を用いて切断したｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ２ｘＡｒａｈ２０２－ＣＭＶ－ｔｔにサブクローニングした。ライゲーション反応により、ヘルパープラスミドｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３－ＣＭＶｔｔを得た。

【0259】

遺伝子合成サービス（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）から、プラスミドｐＥＴ４２－ｆｅｌＩＬ５Ｎの形態でネコインターロイキン５（ＩＬ５）遺伝子を得た。クローニングのために、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲ反応でｆｅｌＩＬ５遺伝子を増幅した：
フォワード：Ｉ５－ＢａｍＦ（配列番号１２３）
リバース：Ｉ５－ＳｐｅＲ（配列番号１２４）
鋳型：ｐＥＴ４２－ｆｅｌＩＬ５Ｎ

【0260】

ＰＣＲ産物をｐＴＺ５７に直接ライゲーションし、プラスミドＤＮＡの単離後、いくつかのクローンを配列決定した。配列エラーのないクローンの同定後、部位ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩでｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ＣＭＶ－ｔｔ又はｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３－ＣＭＶ－ｔｔに、ｆｅｌＩＬ５遺伝子をさらにサブクローニングした。得られたｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶ－ｔｔ及びｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶ－ｔｔのプラスミドマップを図２１Ａ及び図２１Ｂに示す。上記プラスミド及び発現ベクターは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５の発現を確実にし、その発現に役立つ。

【0261】

ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５は、少なくとも１つのＧｌｙ、少なくとも１つのＳｅｒ及び少なくとも１つのＧｌｕを含むアミノ酸リンカーに隣接する、配列番号１２５のネコＩＬ－５タンパク質を含む。詳細には、配列番号１２５の上記ネコＩＬ－５タンパク質は、そのＮ末端では配列番号１２６の１８アミノ酸長ＧＳＥＤ－リンカーに直接隣接し、そのＣ末端では配列番号１２７の１５アミノ酸長ＧＳＥＤ－リンカーに直接隣接する。さらに、上記の構築物全体、すなわち、記載のＧＳＥＤ－リンカーに隣接する、配列番号１２５の構築物は、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の配列番号５のＳｅｒ（８８）及びＴｙｒ（８９）に対応する位置の間に挿入され、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５をもたらす。「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５」と呼ばれる、本発明によるこの好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１２８である。この好ましいキメラＣＭＶポリペプチドＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５の対応するヌクレオチド配列は、配列番号１２９に記載されている。

【0262】

ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊は、Ｎ末端上のＧＳ－リンカー、ならびに少なくとも１つのＧｌｙ、少なくとも１つのＳｅｒ及び少なくともＴｈｒを含む、ｆｅｌ ＩＬ－５抗原のＣ末端上のアミノ酸リンカーに隣接する、配列番号１２５のネコＩＬ－５タンパク質を含む。詳細には、配列番号１２５の上記ネコＩＬ－５タンパク質は、そのＮ末端では配列番号３０の１５アミノ酸長ＧＳ－リンカーに直接隣接し、そのＣ末端では配列番号１３８の１１アミノ酸長ＧＳＴ－リンカーに直接隣接する。さらに、上記の構築物全体、すなわち、記載のＧＳ及びＧＳＴ－リンカーに隣接する、配列番号１２５の構築物は、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の配列番号５のＳｅｒ（８８）及びＴｙｒ（８９）に対応する位置の間に挿入され、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊をもたらす。ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊と呼ばれる、本発明によるこのキメラＣＭＶポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１３９である。このキメラＣＭＶポリペプチドＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊の対応するヌクレオチド配列は、配列番号１４０に記載されている。

【0263】

このように、モザイクＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５及びＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊の発現及び精製のために、プラスミドｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔ及びｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）コンピテント細胞を形質転換した。

【0264】

標的タンパク質の発現レベルが最も高いクローンを選択した後、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を含有する２ＴＹ（トリプトン１．６％、酵母エキス１％、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）培地中で、ロータリーシェーカー上３０℃で、０．８～１．０のＯＤ（６００）値まで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を増殖させた。次いで、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを用いて細胞を誘導し、培地に５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加した。インキュベーションをロータリーシェーカー上２０℃で１８時間続けた。得られたバイオマスを低速遠心分離により回収し、－２０℃で凍結した。バイオマス排出量－約１４ｇの湿潤バイオマス／１ｌの培養物、ＯＤ（６００）は培養終了時に７．６であった。

【0265】

ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ（上記モザイクＶＬＰはＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５及びＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊と呼ばれる）の精製は、以下の工程を含む：
１）１．５ｇのバイオマスを１０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、１０％スクロース中に懸濁させ、超音波（ＨｉｅｌｓｃｈｅｒソニケーターＵＰ２００Ｓ、１６分、振幅７０％、周期０．５）を用いて懸濁液を処理する；
２）溶解物を＋４℃、１１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する；
３）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、０．５％ＴＸ－１００を含有する緩衝液中で、３５ｍｌチューブ内でスクロース勾配（２０～６０％）を調製する；
４）５ｍｌのＶＬＰ試料をスクロース勾配に重ねる。２本のチューブを準備する；
５）ＳＷ３２ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ（２５０００ｒｐｍ、＋１８℃）を使用して６時間遠心分離する。
６）各勾配チューブの内容物を６ｍｌの画分に分割する。対応する画分をプールする；
７）ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて勾配画分を分析する（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。
８）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、第２及び第３のスクロース勾配画分中のモザイクＶＬＰの存在を示唆している。第２及び第３の画分を当量の緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で希釈する；
９）ローターＴｙｐｅ ７０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ、Ｌ１００ＸＰ超遠心機；４時間、５０ ０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１０）ペレットを２ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、１０％スクロースに可溶化する；
１１）２０％スクロース「クッション」（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール緩衝液中）の上部にＶＬＰ懸濁液を重ねる；
１２）ローターＴＬＡ１００．３（Ｂｅｃｋｍａｎ；１時間、７２０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１３）ペレットを２ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、１０％スクロースに一晩４℃で可溶化する；
１４）遠心分離（５分、１３０００ｒｐｍ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１８）によって懸濁液を清澄化する
１５）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（図２３Ａ及び図２３Ｃ）を用いて、及びＥＭ下（図２３Ｂ及び図２３Ｄ）で、精製後のＶＬＰを分析する。

【0266】

ＥＭ写真は、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、したがってモザイクＶＬＰ ＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５が、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、したがってモザイクＶＬＰ ＣＭＶ－Ｍ－ｆｅｌ－ＩＬ－５＊と比較して、顕著に少ない数の凝集ＶＬＰを含むことを示している。この観察結果は、本発明による上記両モザイクＶＬＰの動的光散乱（ＤＬＳ）分析によって確認された。

【0267】

例１６
ＣＭＶの修飾コートタンパク質と融合複製ネコインターロイキン５とを含むモザイク粒子（ＣＭＶ－Ｍ－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５）の構築及び発現
２コピーのネコＩＬ－５抗原を含む、ＣＭＶの修飾コートタンパク質をクローニングするために、以下のようにＰＣＲ変異誘発及びオリゴヌクレオチドを使用して、ｆｅｌ ＩＬ－５抗原の両側に、少なくとも１つのＧｌｙ、少なくとも１つのＳｅｒ及び少なくともＧｌｕを含み、少なくとも１つのＡｓｐをさらに含むアミノ酸リンカーと、両ネコＩｌ－５抗原を接続するアミノ酸リンカーとの導入を可能にする対応するベクターを構築した：
第１のＰＣＲ反応：
フォワード：Ｉ５－ＢａｍＦ（配列番号１２３）
リバース：２ｘＩＬ５－ｇｓＫｐｎＲ（配列番号１３０）
鋳型：ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶ－ｔｔ
第２のＰＣＲ反応：
フォワード：２ｘＩＬ５－ｇｓＫｐｎＦ（配列番号１３１）
リバース：Ｉ５－ＳｐｅＲ（配列番号１２４）
鋳型：ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｆｌＩＬ５－ＣＭＶ－ｔｔ

【0268】

遺伝子断片の増幅後、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター（ＩｎｓＴＡｃｌｏｎｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＃Ｋ１２１４）に、対応するＰＣＲ産物を直接クローニングした。クローニング及びプラスミド増幅のための宿主として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ １－Ｂｌｕｅ細胞を使用した。ＰＣＲエラーのないプラスミドを見出すために、ＢｉｇＤｙｅサイクル配列決定キット及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、いくつかのｆｅｌ－ＩＬ５遺伝子含有ｐＴＺ５７プラスミドクローンを配列決定した。配列決定後、Ｋｐｎ２／ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて、第２のＰＣＲ反応からの産物を含む正しいｐＴＺ－プラスミドクローンを切断し、同じ制限酵素を用いて切断した、第１のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物を含むｐＴＺプラスミドに、得られた断片をライゲーションした。ライゲーション反応により、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーと接続された２コピーのｆｌＩＬ５遺伝子を含むヘルパープラスミドｐＴＺ－２ｘｆｌＩＬ５を得た。複製したｆｅｌＩＬ５を含むプラスミドをＸＬ１細胞から精製した。ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ制限酵素を使用して２ｘｆｅｌ－ＩＬ５遺伝子をさらに切り出し、同じ制限部位で発現ベクターｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ＣＭＶｔｔにライゲーションした。得られたベクターは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーによって分離され、少なくとも１つのＧｌｙ、少なくとも１つのＳｅｒ及び少なくともＧｌｕを含み、少なくとも１つのＡｓｐをさらに含み、詳細には、追加のＡｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｓｐストレッチを有するＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含むアミノ酸リンカーに隣接する２つのネコＩＬ５遺伝子をコードする配列が導入されたＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を含む。得られたｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－２ｘｆｌＩＬ５－ＣＭＶ－ｔｔのプラスミドマップを図２４に示す。上記プラスミド及び発現ベクターは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５の発現を確実にし、その発現に役立つ。

【0269】

ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号３０）と接続され、少なくとも１つのＧｌｙ、少なくとも１つのＳｅｒ及び少なくとも１つのＧｌｕを含むアミノ酸リンカーに隣接する、配列番号１２５のネコＩＬ－５タンパク質の２つのコピーを含む。詳細には、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号３０）と接続された、配列番号１２５のネコＩＬ－５タンパク質の２コピーの上記配列は、そのＮ末端では配列番号１２６の１８アミノ酸長ＧＳＥＤ－リンカーに直接隣接し、そのＣ末端では配列番号１２７の１５アミノ酸長ＧＳＥＤ－リンカーに直接隣接する。さらに、上記の構築物全体、すなわち、配列番号３０と接続され、記載のＧＳＥＤ－リンカーに隣接する、配列番号１２５の２コピーの構築物は、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の配列番号５のＳｅｒ（８８）及びＴｙｒ（８９）に対応する位置の間に挿入され、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５をもたらす。

【0270】

「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５」と呼ばれる、本発明によるこの好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１３２である。この好ましいキメラＣＭＶポリペプチドＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５の対応するヌクレオチド配列は、配列番号１３３に記載されている。

【0271】

このように、モザイクＣＭＶ－Ｍ－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５の発現及び精製のために、プラスミドｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－２ｘｆｌＩＬ５－ＣＭＶｔｔを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）コンピテント細胞を形質転換した。

【0272】

標的タンパク質の発現レベルが最も高いクローンを選択した後、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を含有する２ＴＹ（トリプトン１．６％、酵母エキス１％、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）培地中で、ロータリーシェーカー上３０℃で、０．８～１．０のＯＤ（６００）値まで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を増殖させた。次いで、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを用いて細胞を誘導し、培地に５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加した。インキュベーションをロータリーシェーカー上２０℃で１８時間続けた。得られたバイオマスを低速遠心分離により回収し、－２０℃で凍結した。バイオマス排出量－約１５ｇの湿潤バイオマス／１ｌの培養物、ＯＤ（６００）は培養終了時に８．０であった。

【0273】

本発明によるＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－２ｘｆｅｌ－Ｉｌ５及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ（上記モザイクＶＬＰは「ＣＭＶ－Ｍ－２ｘｆｅｌ－ＩＬ－５」と呼ばれる）の精製は、以下の工程を含む：
１）１．５ｇのバイオマスを１０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、１０％スクロース中に懸濁させ、超音波（ＨｉｅｌｓｃｈｅｒソニケーターＵＰ２００Ｓ、１６分、振幅７０％、周期０．５）を用いて懸濁液を処理する；
２）溶解物を＋４℃、１１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する；
３）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、０．５％ＴＸ－１００を含有する緩衝液中で、３５ｍｌチューブ内でスクロース勾配（２０～６０％）を調製する；
４）５ｍｌのＶＬＰ試料をスクロース勾配に重ねる。２本のチューブを準備する；
５）ＳＷ３２ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ（２５０００ｒｐｍ、＋１８℃）を使用して６時間遠心分離する。
６）各勾配チューブの内容物を６ｍｌの画分に分割する。対応する画分をプールする；
７）ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて勾配画分を分析する（図２５）。
８）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、第２及び第３のスクロース勾配画分中のモザイクＶＬＰの存在を示唆している。第２及び第３の画分をプールし、当量の緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で希釈する；
９）ローターＴｙｐｅ ７０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ、Ｌ１００ＸＰ超遠心機；４時間、５０ ０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１０）ペレットを２ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、１０％スクロースに可溶化する；
１１）２０％スクロース「クッション」（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール緩衝液中）の上部にＶＬＰ懸濁液を重ねる；
１２）ローターＴＬＡ１００．３（Ｂｅｃｋｍａｎ；１時間、７２０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１３）ペレットを２ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、１０％スクロースに一晩４℃で可溶化する；
１４）遠心分離（５分、１３０００ｒｐｍ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１８）によって懸濁液を清澄化する
１５）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（図２６Ａ）を用いて、及びＥＭ下（図２６Ｂ）で、精製後のＶＬＰを分析する。

【0274】

例１７
ＣＭＶの修飾コートタンパク質と融合イヌインターロイキン１ｂとを含むモザイク粒子（ＣＭＶ－Ｍ－ｃＩＬ－１ｂ）の構築及び発現
隣接するＢａｍＨＩ及びＳｐｅ Ｉ部位を有するイヌインターロイキン１ｂ遺伝子を商業的供給源から得た（ｐＵＣｃＩＬ１ｂにおける遺伝子合成産物、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）。プラスミドｐＵＣｃＩＬ１ｂ－ＢＳからＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ断片を切り出し、ヘルパーベクターｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ＣＭＶｔｔ（部位ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩ）にライゲーションした。得られたプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１細胞から単離し、導入されたｃＩＬ－１ｂ配列を確認するために再配列決定した。ｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｃＩＬ１ｂ－ＣＭＶ－ｔｔのプラスミドマップを（図２７）に示す。上記プラスミド及び発現ベクターは、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｃＩＬ－１ｂ及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ、すなわちＣＭＶ－Ｍ－ｃＩＬ－１ｂの発現を確実にし、その発現に役立つ。

【0275】

ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｃＩＬ－１ｂは、少なくとも１つのＧｌｙ、少なくとも１つのＳｅｒ及び少なくとも１つのＧｌｕを含むアミノ酸リンカーに隣接する、配列番号１３４のイヌＩＬ－１ｂタンパク質を含む。詳細には、配列番号１３４の上記イヌＩＬ－１ｂタンパク質は、そのＮ末端では配列番号１２６の１８アミノ酸長ＧＳＥＤ－リンカーに直接隣接し、そのＣ末端では配列番号１２７の１５アミノ酸長ＧＳＥＤ－リンカーに直接隣接する。さらに、上記の構築物全体、すなわち、記載のＧＳＥＤ－リンカーに隣接する、配列番号１３４の構築物は、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の配列番号５のＳｅｒ（８８）及びＴｙｒ（８９）に対応する位置の間に挿入され、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｃＩＬ－１ｂをもたらす。

【0276】

「ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｃＩＬ－１ｂ」と呼ばれる、本発明によるこの好ましいキメラＣＭＶポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１３５である。この好ましいキメラＣＭＶポリペプチドＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｃＩＬ－１ｂの対応するヌクレオチド配列は、配列番号１３６に記載されている。

【0277】

このように、モザイクＣＭＶ－Ｍ－ｃＩＬ－１ｂの発現及び精製のために、プラスミドｐＥＴＤｕ－ＣＭＶＢ３ｄ－ｃＩＬ１ｂ－ＣＭＶｔｔを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ２５６６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）コンピテント細胞を形質転換した。

【0278】

標的タンパク質の発現レベルが最も高いクローンを選択した後、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を含有する２ＴＹ（トリプトン１．６％、酵母エキス１％、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）培地中で、ロータリーシェーカー上３０℃で、０．８～１．０のＯＤ（６００）値まで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を増殖させた。次いで、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを用いて細胞を誘導し、培地に５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加した。インキュベーションをロータリーシェーカー上２０℃で１８時間続けた。得られたバイオマスを低速遠心分離により回収し、－２０℃で凍結した。バイオマス排出量－約１５ｇの湿潤バイオマス／１ｌの培養物、ＯＤ（６００）は培養終了時に８．８であった。

【0279】

本発明によるＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０－ｃＩＬ－１ｂ及び未修飾ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を含むモザイクＶＬＰ（上記モザイクＶＬＰは「ＣＭＶ－Ｍ－ｃＩＬ－１ｂ」と呼ばれる）の精製は、以下の工程を含む：
１）１．５ｇのバイオマスを１０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、１０％スクロース中に懸濁させ、超音波（ＨｉｅｌｓｃｈｅｒソニケーターＵＰ２００Ｓ、１６分、振幅７０％、周期０．５）を用いて懸濁液を処理する；
２）溶解物を＋４℃、１１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する；
３）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、０．５％ＴＸ－１００を含有する緩衝液中で、３５ｍｌチューブ内でスクロース勾配（２０～６０％）を調製する；
４）５ｍｌのＶＬＰ試料をスクロース勾配に重ねる。２本のチューブを準備する；
５）ＳＷ３２ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ（２５０００ｒｐｍ、＋１８℃）を使用して６時間遠心分離する。
６）各勾配チューブの内容物を６ｍｌの画分に分割する。対応する画分をプールする；
７）ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて勾配画分を分析する（図２８）。
８）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、第２及び第３のスクロース勾配画分中のモザイクＶＬＰの存在を示唆している。第２及び第３の画分をプールし、当量の緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で希釈する；
９）ローターＴｙｐｅ ７０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ、Ｌ１００ＸＰ超遠心機；４時間、５０ ０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１０）ペレットを２ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、１０％スクロースに可溶化する；
１１）２０％スクロース「クッション」（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール緩衝液中）の上部にＶＬＰ懸濁液を重ねる；
１２）ローターＴＬＡ１００．３（Ｂｅｃｋｍａｎ；１時間、７２０００ｒｐｍ、５℃）を使用した超遠心分離によってＶＬＰを収集する；
１３）ペレットを２ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭメルカプトエタノール、５％グリセロール、１０％スクロースに一晩４℃で可溶化する；
１４）遠心分離（５分、１３０００ｒｐｍ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１８）によって懸濁液を清澄化する
１５）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（図２９Ａ）を用いて、及びＥＭ下（図２９Ｂ）で、精製後のＶＬＰを分析する。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図24】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図27】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【配列表】

0007623282000001.app