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▶ リパブリック オブ コリア（アニマル アンド プラント クオレンティン エージェンシー）の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-20
(45)【発行日】2025-01-28
(54)【発明の名称】新規な免疫増強剤及びこれを含むワクチン組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/39 20060101AFI20250121BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250121BHJP
A61K 39/135 20060101ALI20250121BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20250121BHJP
A61K 38/16 20060101ALN20250121BHJP
【ＦＩ】
A61K39/39
A61P37/04
A61K39/135
A61P31/14
A61K38/16
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2024040258
(22)【出願日】2024-03-14
(62)【分割の表示】P 2022572763の分割
【原出願日】2020-06-26
(65)【公開番号】P2024069480
(43)【公開日】2024-05-21
【審査請求日】2024-03-15
(73)【特許権者】
【識別番号】520130373
【氏名又は名称】リパブリック オブ コリア（アニマル アンド プラント クオレンティン エージェンシー）
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ（ＡＮＩＭＡＬ ＡＮＤ ＰＬＡＮＴ ＱＵＡＲＡＮＴＩＮＥ ＡＧＥＮＣＹ）
(74)【代理人】
【識別番号】110003074
【氏名又は名称】弁理士法人須磨特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リー ミン ザ
(72)【発明者】
【氏名】チョ ヒョン ドン
(72)【発明者】
【氏名】キム ス ミ
(72)【発明者】
【氏名】キム ビョウン ハン
(72)【発明者】
【氏名】パク ジョン ヒョン
【審査官】池上 文緒
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５０７９５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５３０２９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５４１３２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５０５０８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】Tae-Yoon Park et al.，RORγt-specific transcriptional interactomic inhibition suppresses autoimmunity associated with TH17 cells，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2014年，Vol.111, No.52，Pages 18673-18678
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／００
Ａ６１Ｐ ３７／０４
Ａ６１Ｐ ３１／１２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞アゴニストであるＲＯＲγｔ（ＲＡＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ｔ）を有効成分として含む免疫増強剤組成物。
【請求項2】
前記有効成分は、免疫増強剤組成物の０．０１～１重量％含まれることを特徴とする、請求項１に記載の免疫増強剤組成物。
【請求項3】
前記有効成分の他に、添加剤、賦形剤又は担体がさらに含まれることを特徴とする、請求項１に記載の免疫増強剤組成物。
【請求項4】
前記免疫増強剤組成物は、オイル剤形またはノンオイル剤形であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫増強剤組成物。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫増強剤組成物を含むワクチン組成物。
【請求項6】
前記免疫増強剤組成物は、ワクチン組成物の３０～７０重量％で含まれることを特徴とする、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項7】
前記ワクチン組成物は、口蹄疫ワクチン組成物であることを特徴とする、請求項５に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な免疫増強剤に関し、より具体的には、非典型的Ｔ細胞アゴニスト及び典型的Ｔ細胞アゴニストを含む新規な免疫増強剤及びこれを含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
口蹄疫（ＦＭＤ）は、偶蹄類（二つに割れた蹄を持つ動物）、とりわけ牛と豚において非常に速やかに伝播される急性伝染病であって、深刻な動物の生産性の低下と経済的損失の原因となる。ＦＭＤに対する大部分の臨床研究は、豚よりは牛でのワクチン効能を向上させるのに重点を置いたものであった。ＦＭＤワクチン生産のためのＯＩＥ（Ｏｆｆｉｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｐｉｚｏｏｔｉｅｓ）指針は、豚ではなく、牛についての効能試験手順のみを定義している。しかし、ＦＭＤの重症度は、ウイルス菌株及び影響を受ける宿主種の双方に大きく依存する。急性臨床ＦＭＤは、他の反芻動物よりも豚において一層深刻であり、感染した豚は、多量のエアロゾルウイルスを排出することができ、深刻な疾病の伝播危険が高い。
【0003】
近年、韓国のワクチン接種動向によれば、ＦＭＤワクチンは、牛の免疫反応を効果的に誘導するが、その一方で、豚においては、血清内における高いウイルス中和抗体力価（Ｖｉｒｕｓ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ（ＶＮ） Ｔｉｔｅｒ）にもかかわらず、口蹄疫ウイルス感染への完全な防御のための十分な免疫反応をもたらさない。このような違いは、畜種別のＦＭＤウイルスに対する感受性または予防接種に対する宿主の免疫反応で説明することができる。
【0004】
不活性化口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、すなわち、不活化抗原を含有するワクチン接種は、主に宿主防御及びＦＭＤ制御に用いられる。ワクチンの免疫原性及び効能を向上させるために、オイルエマルジョンなどのアジュバント（補助剤）及びサポニン、ゲルなどのような免疫増強剤などがワクチン成分として添加される。最近、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８及びＩＦＮα）並びにＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）－３アゴニストとしてのポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ－９アゴニストとしてのＣｐＧ及びＴＬＲ－７／８アゴニストとしてのＲ８４８（Ｒｅｓｑｕｉｍｏｄ）を含むパターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンドが、新しいＦＭＤワクチンアジュバントとして提案された。しかし、このような研究は、基本的な水準で進められ、ＦＭＤＶ抗原またはＦＭＤワクチンが媒介する細胞性免疫反応及び体液性免疫反応に対する理解を一層深めるためのメカニズム研究はほとんど行われてこなかった。
【0005】
本発明の目的は、先天性免疫反応と体液性免疫反応のリンカーとして作用し、宿主（ｈｏｓｔ）防御において「新しい保護者」として提案されたγδ（ｇａｍｍａ ｄｅｌｔａ）Ｔ細胞、ｉＮＫ（ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）Ｔ細胞、ＭＡＩＴ（ｍｕｃｏｓａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｔ）細胞を含む非典型的（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）Ｔ細胞及びＴ細胞のような典型的（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）Ｔ細胞のアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）をワクチンアジュバントとして使用し、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ＤＣｓ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、ＭΦｓ）、及びモノサイト（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）などのような抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣｓ）の刺激なしにＴ細胞を直接的に刺激して、より速やかで且つより強い細胞性免疫反応を導くことで、ワクチン接種時の宿主の初期防御に重要な役割をし、細胞性・体液性免疫反応を同時に刺激して、動物、特に豚における強力なメモリー反応（ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）及びその抗体力価を誘導する免疫増強用補助物質及びこれを含む口蹄疫ワクチン組成物を開発することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Lee, M. J. et al. Mincle and STING-stimulating adjuvants elicit robust cellular immunity and drive long-lasting memory responses in a foot-and-mouth disease vaccine. Front. Immunol. 10, 2509 (2019).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上述した問題点を解決するために、本発明は、牛と豚の免疫細胞における非典型的Ｔ細胞及び典型的Ｔ細胞の直接的な活性化によって強力な細胞性免疫反応を誘導する新規な免疫増強剤組成物を提供することを課題とする。
【0008】
また、本発明は、前記免疫増強剤組成物を含むワクチン組成物を提供することを他の一つの課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記の課題を達成するために、本発明は、牛と豚の免疫細胞において強力な細胞性免疫反応を誘導する新規な免疫増強剤組成物を提供する。
【0010】
前記新規な免疫増強剤は、非典型的Ｔ細胞アゴニスト（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ａｇｏｎｉｓｔ）及び典型的Ｔ細胞アゴニスト（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ａｇｏｎｉｓｔ）を有効成分として含む。
【0011】
本発明における免疫増強剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ）またはアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）は、抗原が起こす免疫反応を増強させる物質を意味する。該免疫増強剤は、ワクチンにおいて少量の抗原でも同一の効力を奏することができるので、従前の半分ないし３分の１程度の抗原でワクチンを作ることができる。
【0012】
本発明における典型的Ｔ細胞アゴニストは、ＲＯＲγｔ（ＲＡＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ｔ）を含む。
【0013】
本発明における非典型的Ｔ細胞アゴニストは、上述したように既に公知されている典型的Ｔ細胞アゴニストを除いたＴ細胞アゴニストを意味する。前記非典型的Ｔ細胞アゴニストは、望ましくは、γδＴ細胞アゴニスト、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、ＭＡＩＴ細胞アゴニストであり得るが、これらに限定されるものではない。
【0014】
前記非典型的Ｔ細胞アゴニストまたは典型的Ｔ細胞アゴニストは、免疫増強剤組成物の０．０１～１重量％、望ましくは、０．１～０．５重量％、より望ましくは、０．２～０．３重量％含まれ得る。前記範囲未満であれば、免疫増強の効果が現われないことがあり、前記範囲を超えると毒性が誘発される可能性がある。
【0015】
本発明の免疫増強剤または免疫増強剤組成物は、前記成分以外に当業界で広く知られているオイル（またはオイルエマルジョン）、乳化剤、及びゲルなどをさらに含むことができる。
【0016】
前記オイル（またはオイルエマルジョン）は、ＩＳＡ２０１、ＩＳＡ６１、ＩＳＡ５０、ＩＳＡ２０６、またはＩＳＡ２０７であり得るが、これらに限定されない。
【0017】
前記乳化剤は、一般に乳化剤と認められる物質、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）またはＳＰＡＮ（登録商標）製品ラインの他の製品（それぞれポリエトキシル化ソルビトール脂肪酸エステル、及び脂肪酸置換のソルビタン界面活性剤）及びＰＥＧ－４０ヒマシ油または他のＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）水素化オイルのような他の溶解性改善剤を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【0018】
また、免疫増強剤（またはアジュバント）組成物は、通常、オイル剤形で免疫増強の効果に優れるが、本発明による免疫増強剤組成物は、ノンオイル剤形でも免疫増強の効果に優れる。
【0019】
前記免疫増強剤を製造するために、当業界で通常用いられる添加剤、賦形剤、担体などをさらに含むことができ、当業界で免疫増強剤を製造するために用いる通常的な製造方法によって製造されることができる。
【0020】
本発明の免疫増強剤組成物の投与後に現われる免疫増強の効果は、免疫媒介物質または細胞によるものであることができ、具体的には、細胞性免疫、粘膜免疫、体液性免疫増強効果を含み得るが、これらに限定されない。
【0021】
前記免疫は、ウイルス、かび、バクテリア及び寄生虫のうちのいずれか一つの病原体に対する感染または癌に対する免疫を含むことができるが、これらに限定されない。
【0022】
前記ウイルスは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ、ＨＣＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ、ＨＥＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ、ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ、ＨＳＶ）、マラリア原虫（ｍａｌａｒｉａ ｃａｕｓｉｎｇ ｐａｒａｓｉｔｅｓ）、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ、ＨＰＶ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、はしかウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ムンプスウイルス（ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ）、呼吸器多核体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）、ウエストナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ、ＷＮＶ）などを含むが、これらに限定されない。
【0023】
また、本発明は、前記免疫増強剤組成物を含むワクチン組成物を提供する。
【0024】
前記免疫増強剤組成物は、ワクチン組成物の全重量に対して３０～７０重量％、望ましくは、４０～５０重量％含まれることができるが、これに限定されるものではない。前記範囲未満であればワクチンの効果が現われないことがあり、前記範囲を超える場合、投与時に毒性が現われることができる。
【0025】
前記ワクチン組成物は、当業界でワクチン組成物を製造する際に通常使われる添加剤、賦形剤、担体などをさらに含むことができる。
【0026】
また、前記ワクチン組成物は、当業界でワクチン組成物を製造するために使う通常の製造方法によって製造されることができる。
【0027】
本発明において、前記ワクチンの種類は制限されるものではないが、望ましくは、ウイルスワクチン、より望ましくは、口蹄疫ワクチンであることができる。
【0028】
口蹄疫ワクチン組成物に本発明による免疫増強剤が含まれる場合、前記口蹄疫ワクチン組成物は、血清型Ｏ、血清型Ａ、血清型Ａｓｉａ１、血清型Ｃ、血清型ＳＡＴ１、血清型ＳＡＴ２、血清型ＳＡＴ３の口蹄疫ウイルスなどに対して免疫効果を発揮し得る。望ましくは、血清型Ｏ、血清型Ａの口蹄疫ウイルスに対してより強い免疫効果を発揮し得る。
【0029】
前記ワクチン組成物は、舌下投与、経皮投与、直腸投与、経粘膜投与、局所的投与、口腔投与、胸膜内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、脊椎腔内投与、関節内投与などの方法で投与されることができる。
【発明の効果】
【0030】
本発明は、牛、豚の先天性細胞性免疫反応を強化して体液性免疫反応をより効率的に向上させることができる新しい免疫増強剤及びこれを含むワクチン組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図6】図６ａは、牛と豚での免疫反応の違いを究明するための実験過程を示す図であり、図６ｂ及び図６ｃは、豚で非正常的に過発現された先天性免疫反応及びＦＭＤワクチン予防接種によるＴ細胞の疲弊の経路（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）の誘導結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0032】
以下、本発明を実施例及び実験例によって詳しく説明する。
ただし、下記実施例及び実験例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例及び実験例に限定されるものではない。
ただし、下記実施例及び実験例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例及び実験例に限定されるものではない。
【0033】
＜実験材料及び方法＞
１．抗原の精製及び不活性化
精製された不活性化ウイルス抗原を、逆遺伝学的手法によるＰ１の表現型切り替え（リファレンス配列）用に構築されたＦＭＤＶ Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ５９３８２３；Ｐ１）に感染されたＢＨＫ－２１細胞で製造した。
１．抗原の精製及び不活性化
精製された不活性化ウイルス抗原を、逆遺伝学的手法によるＰ１の表現型切り替え（リファレンス配列）用に構築されたＦＭＤＶ Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ５９３８２３；Ｐ１）に感染されたＢＨＫ－２１細胞で製造した。
【0034】
ウイルス感染の場合、培養培地を無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）に切り替え、細胞を３７℃、５％二酸化炭素で１時間の間インキュベーションすることでウイルスに接種した。次いで、細胞外ウイルスを除去した。感染後２４時間に、振とう培養器で２４時間の間０．００３Ｎバイナリーエチレンイミンを２回処理してウイルスを不活性化させた後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）に濃縮させた。得られたウイルス濃縮物と１５－４５％ショ糖密度勾配を重層して遠心分離した。
【0035】
超遠心分離後、遠心分離チューブの底を穿孔して１ｍＬ分画を収集した。それぞれの分画のサンプルにおけるＦＭＤＶ粒子の存在は、側方流動装置であるＵＡ－６（ＢｉｏＳｉｇｎ ＦＭＤＶ Ａｇ；Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ＢｉｏＭｅｄｉｔｅｃｈ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて、光学密度に基づいて確認された。現場実験に使用するに先立って、ＰＥＧで前処理された上清液をＺＺ－Ｒ１２７及びＢＨＫ－２１細胞を少なくとも２回通過させて細胞変性効果（ＣＰＥ）が発生しなかったことを確認することで、上清液に生ウイルスの不在を確認した。
【0036】
２．ＰＢＭＣｓの分離
抗原媒介免疫反応を調べるために、豚と牛の全血を、韓国の京畿道動物衛生試験所から寄贈してもらった。全血（１５ｍＬ）をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒヘパリンチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に収集して、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）で勾配、遠心分離し、次いで、残留赤血球を塩化アンモニウム・カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で処理して溶解させた。ＰＢＭＣｓを２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）が補充された、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋（Ｇｉｂｃｏ）が含まれないダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のＰＢＳに懸濁させ、フローサイトメーター（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計数した。すべての細胞は使用直前に新たに分離し、凍結保存された細胞は、如何なる実験にも使用しなかった。精製されたＰＢＭＣｓを１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ、ＵＳＡ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地に再懸濁させた。次いで、精製されたＰＢＭＣｓを２５ｃｍ２組職培養フラスコ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に分注して、５％ＣＯ２、３７℃の環境で培養して新たに分離された単球を付着させた。３時間の培養後、リンパ球分離のために非接着細胞を収集した。残りの接着細胞は、それぞれのフラスコに４ｍＬのＲＰＭＩ １６４０成長培地を添加する前にダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）で幅広く洗浄し、次いで５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。
抗原媒介免疫反応を調べるために、豚と牛の全血を、韓国の京畿道動物衛生試験所から寄贈してもらった。全血（１５ｍＬ）をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒヘパリンチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に収集して、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）で勾配、遠心分離し、次いで、残留赤血球を塩化アンモニウム・カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で処理して溶解させた。ＰＢＭＣｓを２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）が補充された、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋（Ｇｉｂｃｏ）が含まれないダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のＰＢＳに懸濁させ、フローサイトメーター（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計数した。すべての細胞は使用直前に新たに分離し、凍結保存された細胞は、如何なる実験にも使用しなかった。精製されたＰＢＭＣｓを１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ、ＵＳＡ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地に再懸濁させた。次いで、精製されたＰＢＭＣｓを２５ｃｍ２組職培養フラスコ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に分注して、５％ＣＯ２、３７℃の環境で培養して新たに分離された単球を付着させた。３時間の培養後、リンパ球分離のために非接着細胞を収集した。残りの接着細胞は、それぞれのフラスコに４ｍＬのＲＰＭＩ １６４０成長培地を添加する前にダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）で幅広く洗浄し、次いで５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。
【0037】
３．磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）による細胞分離
単球、リンパ球及びＴ細胞をＰＢＭＣｓから分離した。１次免疫細胞の分離のために、付着性ＰＢＭＣｓから単球を、及び非接着細胞からＴ細胞をＭＡＣＳにより精製した。ＰＢＭＣｓから得られた接着細胞及び非接着細胞をＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ ＥＤＴＡが補充された１×ＰＢＳ）に簡単に再懸濁させた。単球及びＴ細胞は、それぞれ製造社の指示に従って単球単離キット及びＰａｎＴ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と磁気マイクロビーズを用いて分離し、更に、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ、ＭｏＦｌｏ（登録商標）ＡｓｔｒｉｏｓＴＭＣｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて追加で分離した。分離された細胞の精製は、フローサイトメーター（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって確認され、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョンｖＸ．０．７（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）で分析された。分離された細胞の純度は９５％よりも高かった。
単球、リンパ球及びＴ細胞をＰＢＭＣｓから分離した。１次免疫細胞の分離のために、付着性ＰＢＭＣｓから単球を、及び非接着細胞からＴ細胞をＭＡＣＳにより精製した。ＰＢＭＣｓから得られた接着細胞及び非接着細胞をＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ ＥＤＴＡが補充された１×ＰＢＳ）に簡単に再懸濁させた。単球及びＴ細胞は、それぞれ製造社の指示に従って単球単離キット及びＰａｎＴ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と磁気マイクロビーズを用いて分離し、更に、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ、ＭｏＦｌｏ（登録商標）ＡｓｔｒｉｏｓＴＭＣｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて追加で分離した。分離された細胞の精製は、フローサイトメーター（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって確認され、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョンｖＸ．０．７（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）で分析された。分離された細胞の純度は９５％よりも高かった。
【0038】
４．Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓの生成
Ｍｏ－ＤＣｓの分化のために、分離された単球を１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）が補充された完全なＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で７日間培養して、未成熟ＤＣｓを生成させた。３日目に、同一体積の前記言及された培地を添加して、７日目には、細胞溶解前に激しい洗浄によって非接着汚染細胞を除去した。純粋なＤＣｓの分離のために、製造社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の指示に従って、抗ＣＤ１１ｃ磁性ビーズを用いた。ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣＩＩ＋細胞の純度は９５％以上であり、細胞は５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃の環境で維持された。
Ｍｏ－ＤＣｓの分化のために、分離された単球を１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）が補充された完全なＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で７日間培養して、未成熟ＤＣｓを生成させた。３日目に、同一体積の前記言及された培地を添加して、７日目には、細胞溶解前に激しい洗浄によって非接着汚染細胞を除去した。純粋なＤＣｓの分離のために、製造社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の指示に従って、抗ＣＤ１１ｃ磁性ビーズを用いた。ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣＩＩ＋細胞の純度は９５％以上であり、細胞は５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃の環境で維持された。
【0039】
Ｍｏ－ＭΦｓの分化のために、単離された単球を１０６個／ｍＬで１２ウェルプレートに分注して１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５０ｎｇ／ｍＬ マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）が補充されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で６日間培養した。更なるＭ－ＣＳＦを２日目に添加し、全ての培地を４日目に新たに交換した。ＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４／８０＋細胞の純度は９５％超であった。細胞は５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃の環境で維持された。
【0040】
５．成熟したＤＣｓの準備
成熟したＤＣｓは、次のような６つの処理中のいずれか一つを追加して生成された：処理なし（刺激しない）、ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ ０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ［１００ｎｇ／ｍＬ］）＋ｒｐＩＦＮ－γ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＬＬＣ．、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、ＵＳＡ［２０ｎｇ／ｍＬ］）、ｒｐＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ ［２０ｎｇ／ｍＬ］）、抗原単独（抗原［１μｇ／ｍＬ］）、ＬＰＳ＋ｒｐＩＦＮγ＋抗原（ＬＰＳ［１００ｎｇ／ｍＬ］、ｒｐＩＦＮ－γ［２０ｎｇ／ｍＬ］及び抗原［１μｇ／ｍＬ］）またはｒｐＴＮＦα＋抗原（ｒｐＴＮＦα［２０ｎｇ／ｍＬ］及び抗原［１μｇ／ｍＬ］）。処理後の特定時点（０、６、１２、２４、４８、７２及び９６ｈ）で、ＥＬＩＳＡのために細胞培養上清液を回収した。
成熟したＤＣｓは、次のような６つの処理中のいずれか一つを追加して生成された：処理なし（刺激しない）、ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ ０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ［１００ｎｇ／ｍＬ］）＋ｒｐＩＦＮ－γ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＬＬＣ．、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、ＵＳＡ［２０ｎｇ／ｍＬ］）、ｒｐＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ ［２０ｎｇ／ｍＬ］）、抗原単独（抗原［１μｇ／ｍＬ］）、ＬＰＳ＋ｒｐＩＦＮγ＋抗原（ＬＰＳ［１００ｎｇ／ｍＬ］、ｒｐＩＦＮ－γ［２０ｎｇ／ｍＬ］及び抗原［１μｇ／ｍＬ］）またはｒｐＴＮＦα＋抗原（ｒｐＴＮＦα［２０ｎｇ／ｍＬ］及び抗原［１μｇ／ｍＬ］）。処理後の特定時点（０、６、１２、２４、４８、７２及び９６ｈ）で、ＥＬＩＳＡのために細胞培養上清液を回収した。
【0041】
６．Ｍ１／Ｍ２ＭΦｓの分極化
７日の成長後、Ｍｏ－ＭΦｓを６つの処理中のいずれか一つで処理した：処理なし（刺激しない）、Ｍ１ＭΦｓ（ＬＰＳ［１００ｎｇ／ｍＬ］及びｒｐＩＦＮ－γ［２０ｎｇ／ｍＬ］）、Ｍ２ＭΦｓ（ｒｐＩＬ－４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ［２０ｎｇ／ｍＬ］）、抗原単独（１μｇ／ｍＬ）、Ｍ１ＭΦｓ＋抗原（ＩＦＮ－γ［２０ｎｇ／ｍＬ］及びＬＰＳ［１００ｎｇ／ｍＬ］及び抗原［１μｇ／ｍＬ］）またはＭ２ＭΦｓ＋抗原（ＩＬ－４［２０ｎｇ／ｍＬ］＋抗原［１μｇ／ｍＬ］）。処理後の特定時点（０、６、１２、２４、４８、７２及び９６ｈ）で、細胞培養上清液をＥＬＩＳＡのために回収した。
７日の成長後、Ｍｏ－ＭΦｓを６つの処理中のいずれか一つで処理した：処理なし（刺激しない）、Ｍ１ＭΦｓ（ＬＰＳ［１００ｎｇ／ｍＬ］及びｒｐＩＦＮ－γ［２０ｎｇ／ｍＬ］）、Ｍ２ＭΦｓ（ｒｐＩＬ－４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ［２０ｎｇ／ｍＬ］）、抗原単独（１μｇ／ｍＬ）、Ｍ１ＭΦｓ＋抗原（ＩＦＮ－γ［２０ｎｇ／ｍＬ］及びＬＰＳ［１００ｎｇ／ｍＬ］及び抗原［１μｇ／ｍＬ］）またはＭ２ＭΦｓ＋抗原（ＩＬ－４［２０ｎｇ／ｍＬ］＋抗原［１μｇ／ｍＬ］）。処理後の特定時点（０、６、１２、２４、４８、７２及び９６ｈ）で、細胞培養上清液をＥＬＩＳＡのために回収した。
【0042】
７．牛及び豚ＰＢＭＣｓにおける細胞培養、抗原処理及びＢｒｄＵの統合分析
分離されるか分化された細胞（１×１０６個／ウェル）を１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）からなる完全培地で５％ＣＯ２、３７℃インキュベーターで培養した（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。刺激のために、細胞は各抗原１μｇで処理された。処理後の特定時点（０、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６及び２４０ｈ）で、ＤＮＡ合成の間のＢｒｄＵの取り込みに基づくＢｒｄＵ細胞増殖分析キット（細胞Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造社の指示に従って用いて、細胞増殖を試験した。簡略には、１０μＭ ＢｒｄＵを細胞培養液に添加して３７℃で４時間の間培養した。次いで、細胞を固定させて、抗ＢｒｄＵマウスモノクローナル抗体とともに培養した後、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を用いて処理した。発色基質であるテトラメチルベンジジンを発色に用いた。４５０／５５０ｎｍの二つの波長で吸光度を測定した。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－ＢｌｕｅＴＭ分析キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて細胞生存力をモニタリングした。培地単独対照処理と比較して、実験処理は、細胞生存力に影響を及ぼさなかった。
分離されるか分化された細胞（１×１０６個／ウェル）を１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）からなる完全培地で５％ＣＯ２、３７℃インキュベーターで培養した（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。刺激のために、細胞は各抗原１μｇで処理された。処理後の特定時点（０、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６及び２４０ｈ）で、ＤＮＡ合成の間のＢｒｄＵの取り込みに基づくＢｒｄＵ細胞増殖分析キット（細胞Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造社の指示に従って用いて、細胞増殖を試験した。簡略には、１０μＭ ＢｒｄＵを細胞培養液に添加して３７℃で４時間の間培養した。次いで、細胞を固定させて、抗ＢｒｄＵマウスモノクローナル抗体とともに培養した後、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウス抗体を用いて処理した。発色基質であるテトラメチルベンジジンを発色に用いた。４５０／５５０ｎｍの二つの波長で吸光度を測定した。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－ＢｌｕｅＴＭ分析キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて細胞生存力をモニタリングした。培地単独対照処理と比較して、実験処理は、細胞生存力に影響を及ぼさなかった。
【0043】
８．ＥＬＩＳＡ
牛及び豚ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２／２３ｐ４０、ＩＬ－２３及びＴＮＦαに対するＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ；Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）は、製造社の指示に従って、細胞培養上清液を用いて行った。
牛及び豚ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２／２３ｐ４０、ＩＬ－２３及びＴＮＦαに対するＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ；Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）は、製造社の指示に従って、細胞培養上清液を用いて行った。
【0044】
９．食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）の阻害
食作用を阻害するため、Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓを抗原処理前に４５分間５μｇ／ｍＬのサイトカラシンＤ（ＣｙｔＤ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベーションした。次いで、ＣｙｔＤ処理されたＭｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓを１μｇ／ｍＬの抗原とともに培養した。６時間後、培養された上清液をＥＬＩＳＡのために収集した。
食作用を阻害するため、Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓを抗原処理前に４５分間５μｇ／ｍＬのサイトカラシンＤ（ＣｙｔＤ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベーションした。次いで、ＣｙｔＤ処理されたＭｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓを１μｇ／ｍＬの抗原とともに培養した。６時間後、培養された上清液をＥＬＩＳＡのために収集した。
【0045】
１０．牛と豚
牛と豚の自然状態での免疫反応の根本的な違いと、ＦＭＤＶ Ｏ抗原により媒介される免疫反応及び関連メカニズムを理解するために、牛と豚を用いた現場実験は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．に説明された方法によって行われた。ＦＭＤ抗体陰性動物を用いた（牛は５ヶ月齢、豚は１０～１２週齢）。牛と豚を２グループに分けた（ｎ＝５／グループ）。試験の間、動物は隔離された状態で維持された。試験は、農林畜産検疫本部の動物実験倫理委員会（承認番号ＩＡＣＵＣ－２０１８－８００及びＩＡＣＵＣ－２０１９－１８５）の承認を得て機関指針に従い遂行された。
牛と豚の自然状態での免疫反応の根本的な違いと、ＦＭＤＶ Ｏ抗原により媒介される免疫反応及び関連メカニズムを理解するために、牛と豚を用いた現場実験は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．に説明された方法によって行われた。ＦＭＤ抗体陰性動物を用いた（牛は５ヶ月齢、豚は１０～１２週齢）。牛と豚を２グループに分けた（ｎ＝５／グループ）。試験の間、動物は隔離された状態で維持された。試験は、農林畜産検疫本部の動物実験倫理委員会（承認番号ＩＡＣＵＣ－２０１８－８００及びＩＡＣＵＣ－２０１９－１８５）の承認を得て機関指針に従い遂行された。
【0046】
１１．ワクチン接種及びサンプリング
ＦＭＤ抗原としてＯ／ＴＷＮ／９７－Ｒ Ａｇを使用した。陽性対照群に対するワクチン組成物は次のとおりである：１５μｇのＯ／ＴＮＷ／９７－Ｒ抗原（牛及び豚に使用する場合の１回用量）、ＩＳＡ２０６（５０％、ｗ／ｗ）、１０％Ａｌ（ＯＨ）３及び１５０μｇ Ｑｕｉｌ－Ａを含む単一用量で製造された１ｍＬのワクチン。ナイーブ（ｎａｉｖｅ）ＰＢＭＣｓ分離のために、全血をナイーブ対照群（口蹄疫抗体陰性）の牛、豚から収集した。ワクチン接種は、２８日間隔で２回行い、陽性対照群動物の首に筋肉内経路を介して１ｍＬのワクチン（１回用量）を注射した。血清学的分析のために、牛及び豚から０、１４、２８、４２、５６、７０及び８４ｄｐｖで血液サンプルを収集し、牛及び豚からＰＢＭＣｓ分離のために２８ｄｐｖ（１回接種後２８日目、２回ワクチン接種前）に血液サンプルを収集した。当該動物の体温、ワクチン接種部位の症状及び食欲について、毎日モニタリングした。テストが遂行されるまで血清サンプルを－８０℃で保管した。
ＦＭＤ抗原としてＯ／ＴＷＮ／９７－Ｒ Ａｇを使用した。陽性対照群に対するワクチン組成物は次のとおりである：１５μｇのＯ／ＴＮＷ／９７－Ｒ抗原（牛及び豚に使用する場合の１回用量）、ＩＳＡ２０６（５０％、ｗ／ｗ）、１０％Ａｌ（ＯＨ）３及び１５０μｇ Ｑｕｉｌ－Ａを含む単一用量で製造された１ｍＬのワクチン。ナイーブ（ｎａｉｖｅ）ＰＢＭＣｓ分離のために、全血をナイーブ対照群（口蹄疫抗体陰性）の牛、豚から収集した。ワクチン接種は、２８日間隔で２回行い、陽性対照群動物の首に筋肉内経路を介して１ｍＬのワクチン（１回用量）を注射した。血清学的分析のために、牛及び豚から０、１４、２８、４２、５６、７０及び８４ｄｐｖで血液サンプルを収集し、牛及び豚からＰＢＭＣｓ分離のために２８ｄｐｖ（１回接種後２８日目、２回ワクチン接種前）に血液サンプルを収集した。当該動物の体温、ワクチン接種部位の症状及び食欲について、毎日モニタリングした。テストが遂行されるまで血清サンプルを－８０℃で保管した。
【0047】
１２．ＲＮＡ配列分析（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）
ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析のために、ナイーブ対照群（ｎ＝３／グループ）及び陽性対照群（ｎ＝３／グループ）（２８ｄｐｖ）の牛及び豚の全血からのＰＢＭＣｓを、Lee, M.J. et al. Mincle and STING-Stimulating Adjuvants Elicit Robust cellular Immunity and Drive Long-Lasting Memory Responses in a Foot-and-Mouth Disease Vaccine. Front Immunol, 2509 (2019) (（以下、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．という）に記述された方法に従って、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ.、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて密度勾配遠心法により遠心分離した。
ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析のために、ナイーブ対照群（ｎ＝３／グループ）及び陽性対照群（ｎ＝３／グループ）（２８ｄｐｖ）の牛及び豚の全血からのＰＢＭＣｓを、Lee, M.J. et al. Mincle and STING-Stimulating Adjuvants Elicit Robust cellular Immunity and Drive Long-Lasting Memory Responses in a Foot-and-Mouth Disease Vaccine. Front Immunol, 2509 (2019) (（以下、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．という）に記述された方法に従って、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ.、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて密度勾配遠心法により遠心分離した。
【0048】
１３．ライブラリ（Ｌｉｂｒａｒｙ）構築及びシーケンシング
高い処理量の牛及び豚転写体データを得るために、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）を実施した。製造社のプロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて牛及び豚のＰＢＭＣｓから総ＲＮＡをそれぞれ抽出した。次いで、総ＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いて定量し、ＲＮＡ６０００Ｎａｎｏ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって、その品質を評価した。ＮＧＳシーケンシングライブラリは、製造社のプロトコールに従って、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡサンプル準備キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて１μｇの総ＲＮＡから生成された。すなわち、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ分子は、ポリＴオリゴ結合磁性ビーズを用いて精製された。精製後、総ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを高温で２価陽イオンを用いて小片に断片化した。切断されたｍＲＮＡ断片をランダムプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡに逆転写させた。短い断片をＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ抽出キットで精製し、最終回収及びポリ（Ａ）の付加のために溶離緩衝液に分解した。それから、短い断片をシーケンシングアダプダと連結した。各ライブラリは、相異なるＭＩＤタグを隣接させて分離された。次いで、生成されたｃＤＮＡライブラリをＮｏｖａＳｅｑＴＭ６０００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でサンプルに対してペアードエンドシーケンシング（２×１０１ｂｐ）した。
高い処理量の牛及び豚転写体データを得るために、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）を実施した。製造社のプロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて牛及び豚のＰＢＭＣｓから総ＲＮＡをそれぞれ抽出した。次いで、総ＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いて定量し、ＲＮＡ６０００Ｎａｎｏ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって、その品質を評価した。ＮＧＳシーケンシングライブラリは、製造社のプロトコールに従って、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡサンプル準備キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて１μｇの総ＲＮＡから生成された。すなわち、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ分子は、ポリＴオリゴ結合磁性ビーズを用いて精製された。精製後、総ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを高温で２価陽イオンを用いて小片に断片化した。切断されたｍＲＮＡ断片をランダムプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡに逆転写させた。短い断片をＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ抽出キットで精製し、最終回収及びポリ（Ａ）の付加のために溶離緩衝液に分解した。それから、短い断片をシーケンシングアダプダと連結した。各ライブラリは、相異なるＭＩＤタグを隣接させて分離された。次いで、生成されたｃＤＮＡライブラリをＮｏｖａＳｅｑＴＭ６０００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でサンプルに対してペアードエンドシーケンシング（２×１０１ｂｐ）した。
【0049】
１４．遺伝子発現の分析
低品質塩基（ＰＨＥＲＤ ｓｃｏｒｅ（Ｑ）＜２０）及びアダプダーの汚染は、媒介変数として「ＩＬＬＵＭＩＮＡＣＬＩＰ：ＴｒｕＳｅｑ３－ＳＥ：２：３０：１０ ＬＥＡＤＩＮＧ：３ ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：４：１５ ＭＩＮＬＥＮ：３６」を用いてＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖ．０．３６によって除去された。品質点数の確認及び読み出し長さの確認後に、ＲＮＡ－Ｓｅｑ読み出し値（リード）はＳＴＡＲを基本媒介変数として使用して期待値最大化（ＲＳＥＭ、ＲＮＡ－Ｓｅｑ）を用いてリファレンスのＢｏｓｔａｕｒｕｓゲノム（２０１８年４月発行；ＡＲＳ－ＵＣＤ１．２；ＧＣＡ＿００２２６３７９５．２）にマッピング（Ｍａｐｐｉｎｇ）された。ゲノムから各遺伝子／転写体に対する発現値を得るために、期待値最大化方法による発現を推定した。ＲＳＥＭによって推定された読み出しカウントはｅｄｇｅＲ ｖ３．２２．５に適用されて統計的有意性とともに微分発現点数を得た。また、フィルター、すなわちＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）≧０．３、読み出し回数≧５及びｌｏｇ２フォルド（ｆｏｌｄ）変化≧１が差等的に表現された転写体の選択に適用された。最後に、発現された転写体（すなわち、ＴＰＭ≧０．３及び読み出し回数≧５）を分析して各条件及び遺伝子ファミリ（免疫遺伝子、Ｔ細胞マーカー及びＴＬＲ、ＣＤＳ、ＣＬＲ信号伝達経路遺伝子）での発現パターンを示した。
低品質塩基（ＰＨＥＲＤ ｓｃｏｒｅ（Ｑ）＜２０）及びアダプダーの汚染は、媒介変数として「ＩＬＬＵＭＩＮＡＣＬＩＰ：ＴｒｕＳｅｑ３－ＳＥ：２：３０：１０ ＬＥＡＤＩＮＧ：３ ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：４：１５ ＭＩＮＬＥＮ：３６」を用いてＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖ．０．３６によって除去された。品質点数の確認及び読み出し長さの確認後に、ＲＮＡ－Ｓｅｑ読み出し値（リード）はＳＴＡＲを基本媒介変数として使用して期待値最大化（ＲＳＥＭ、ＲＮＡ－Ｓｅｑ）を用いてリファレンスのＢｏｓｔａｕｒｕｓゲノム（２０１８年４月発行；ＡＲＳ－ＵＣＤ１．２；ＧＣＡ＿００２２６３７９５．２）にマッピング（Ｍａｐｐｉｎｇ）された。ゲノムから各遺伝子／転写体に対する発現値を得るために、期待値最大化方法による発現を推定した。ＲＳＥＭによって推定された読み出しカウントはｅｄｇｅＲ ｖ３．２２．５に適用されて統計的有意性とともに微分発現点数を得た。また、フィルター、すなわちＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）≧０．３、読み出し回数≧５及びｌｏｇ２フォルド（ｆｏｌｄ）変化≧１が差等的に表現された転写体の選択に適用された。最後に、発現された転写体（すなわち、ＴＰＭ≧０．３及び読み出し回数≧５）を分析して各条件及び遺伝子ファミリ（免疫遺伝子、Ｔ細胞マーカー及びＴＬＲ、ＣＤＳ、ＣＬＲ信号伝達経路遺伝子）での発現パターンを示した。
【0050】
１５．創意工夫経路の分析（Ingenuity Pathway Analysis：ＩＰＡ）
次いで、発現プロファイルを類似した発現パターンのクラスターに分類した。しかるのち、ＩＰＡ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis）を用いて、豊かな経路、ネットワーク及び機能を分析した。最後に、社内Ｒｓｃｒｉｐｔを用いて重要な経路に係わるすべての遺伝子を示す２値ヒートマップを作った。
次いで、発現プロファイルを類似した発現パターンのクラスターに分類した。しかるのち、ＩＰＡ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis）を用いて、豊かな経路、ネットワーク及び機能を分析した。最後に、社内Ｒｓｃｒｉｐｔを用いて重要な経路に係わるすべての遺伝子を示す２値ヒートマップを作った。
【0051】
＜強力なワクチンアジュバントとしての非典型的Ｔ細胞アゴニストの効果の評価及び実験方法＞
１．マウス
年齢及び性別が一致する野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～７週齢、雌）は、ＫＯＳＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．（韓国の京畿道所在））から購入した。すべてのマウスは、農林畜産検疫本部内の動物生物安全第三等級（ＡＢＳＬ３）の特定病原体不在（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ、ＳＰＦ）動物施設の微小隔離ケージに入れた。研究は、機関指針に従い農林畜産検疫本部の動物実験倫理委員会（承認番号ＩＡＣＵＣ－２０１８－８００及びＩＡＣＵＣ－２０１９－１８５）の承認を受けて遂行された。
１．マウス
年齢及び性別が一致する野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～７週齢、雌）は、ＫＯＳＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．（韓国の京畿道所在））から購入した。すべてのマウスは、農林畜産検疫本部内の動物生物安全第三等級（ＡＢＳＬ３）の特定病原体不在（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ、ＳＰＦ）動物施設の微小隔離ケージに入れた。研究は、機関指針に従い農林畜産検疫本部の動物実験倫理委員会（承認番号ＩＡＣＵＣ－２０１８－８００及びＩＡＣＵＣ－２０１９－１８５）の承認を受けて遂行された。
【0052】
２．非典型的Ｔ細胞アゴニスト及び典型的Ｔ細胞アゴニストにより媒介される補助性及び宿主防御
ＦＭＤワクチンアジュバントとして、強力な細胞性及び体液性免疫反応の同時誘導及び非典型的Ｔ細胞アゴニスト及び典型的Ｔ細胞アゴニストの潜在力を評価するとともに、ＦＭＤＶ感染に対する保護効果を調べるために、提示された戦略を用いて実験を遂行した（図７ａ）（グループ当たりｎ＝１０）。Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原は、非活性化されたＦＭＤＶ抗原として使われた。ＰＣ群に対するワクチン組成物は次のとおりである：Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原（１５μｇ／用量／ｍＬ、牛及び豚への使用のための１／１０用量）、１０％Ａｌ（ＯＨ）３及び１５μｇ／Ｑｕｉｌ－Ａ／マウスを使用し、総体積は１００μＬとした。実験群のすべてのマウスは、アジュバント（免疫増強剤）として、非典型的Ｔ細胞アゴニストまたは典型的Ｔ細胞アゴニストを免疫増強剤組成物の全重量の約０．２重量％、ワクチン全重量対比約０．１重量％となるように添加して、ＰＣ群と同一の組成でワクチンを提供してもらった。
ＦＭＤワクチンアジュバントとして、強力な細胞性及び体液性免疫反応の同時誘導及び非典型的Ｔ細胞アゴニスト及び典型的Ｔ細胞アゴニストの潜在力を評価するとともに、ＦＭＤＶ感染に対する保護効果を調べるために、提示された戦略を用いて実験を遂行した（図７ａ）（グループ当たりｎ＝１０）。Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原は、非活性化されたＦＭＤＶ抗原として使われた。ＰＣ群に対するワクチン組成物は次のとおりである：Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原（１５μｇ／用量／ｍＬ、牛及び豚への使用のための１／１０用量）、１０％Ａｌ（ＯＨ）３及び１５μｇ／Ｑｕｉｌ－Ａ／マウスを使用し、総体積は１００μＬとした。実験群のすべてのマウスは、アジュバント（免疫増強剤）として、非典型的Ｔ細胞アゴニストまたは典型的Ｔ細胞アゴニストを免疫増強剤組成物の全重量の約０．２重量％、ワクチン全重量対比約０．１重量％となるように添加して、ＰＣ群と同一の組成でワクチンを提供してもらった。
【0053】
これらの実験に用いられた非典型的Ｔ細胞アゴニスト及び典型的Ｔ細胞アゴニストは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（γδＴ細胞アゴニスト；Ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒｉｌｉｔｈｉｕｍ ｓａｌｔ、ＩＰＰ（Ｉ）、（Ｅ）－１－Ｈｙｄｒｏｘｙ－２－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｕｔｅｎｙｌ ４－ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｌｉｔｈｉｕｍ ｓａｌｔ、ＨＭＰ（Ｈ）、Ａｂｃａｍ（ｉＮＫＴ細胞アゴニスト；α－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｃｅｒａｍｉｄｅ、α－Ｇａｌｃｅｒ（Ｇ）、Ｔ細胞アゴニスト（ＲＯＲγＴ（Ｒ））及びＣａｙｍａｎ（ＭＡＩＴ細胞アゴニスト；６－Ｆｏｒｍｙｌｐｔｅｒｉｎ（Ｆ）、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）からそれぞれ購入した。
【0054】
陰性対照群グループのマウスには、同一の経路を通じて同一体積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）が投与された。簡略には、ワクチン接種を３５日間隔で２回遂行し、マウスの太もも筋肉に筋肉内ワクチン接種した。ワクチン接種の後、８４ｄｐｖまたは１６８ｄｐｖに、マウスに対し、腹腔内注射によってＦＭＤＶ（Ｏ／ＶＥＴ／２０１３の１００ＬＤ５０、ＭＥ－ＳＡトポタイプ）を攻撃接種した。マウスの生存率及び体重は、最大７ｄｐｃ（７ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ、攻撃接種後７日）までモニタリングした。また、０、７、１４、２８、５６、８４及び１６８ｄｐｖにおいてマウスからサンプリングされた血清を、Ａ型構造タンパク質酵素結合免疫吸着測定法（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＰ）Ａ ＥＬＩＳＡ）及びウイルス中和抗体（ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ、ＶＮ）力価（ｔｉｔｅｒｓ）によって分析して、誘導された細胞性及び体液性免疫反応を調査した。
【0055】
３．血清学的分析
血清からＳＰ抗体を検出するために、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．に記述されているようにＰｒｉｏＣＨＥＣＫ ＦＭＤＶ Ｏ型 ＥＬＩＳＡキット（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた。ＥＬＩＳＡプレートでの吸光度をパーセント阻害（ＰＩ）値に換算した。ＰＩ値が５０％以上であるとき、動物は抗体陽性と見なされた。
血清からＳＰ抗体を検出するために、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．に記述されているようにＰｒｉｏＣＨＥＣＫ ＦＭＤＶ Ｏ型 ＥＬＩＳＡキット（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた。ＥＬＩＳＡプレートでの吸光度をパーセント阻害（ＰＩ）値に換算した。ＰＩ値が５０％以上であるとき、動物は抗体陽性と見なされた。
【0056】
ＶＮテストは、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．に説明されたように、世界動物保健機関（ＯＩＥ）のマニュアルに従って遂行された。血清を５６℃の水槽における３０分間の熱処理によって不活性化させた。細胞密度を、７０％単一層を形成するように調整し、血清サンプルの２倍希釈系列（１：８～１：１０２４）を調製した。次いで、希釈血清サンプルを１００組職培養感染量（ＴＣＩＤ）５０／０．５ｍＬの同型ウイルスと３７℃で１時間の間、インキュベーションした。１時間後、ＬＦ－ＢＫ（牛の腎臓）細胞懸濁液をすべてのウェルに添加した。２～３日後、ＣＰＥを確認して力価を決めた。ここで力価は１００ＴＣＩＤ５０のウイルスの中和に必要な抗体反復希釈物のＬｏｇ１０として計算された。
【0057】
４．ＰＢＭＣｓの分離
ＦＭＤ抗体陰性動物を豚ＰＢＭＣｓ分離のためのドナー（ｎ＝３／グループ）として使用した。全血（１５ｍＬ／各ドナー）をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒヘパリンチューブに独立に収集した。ＰＢＭＣｓ分離に関する詳しいプロトコールは前述したとおりである。すべての細胞は、使用直前に新鮮に分離され、いかなる実験でも凍結保存された細胞は使われなかった。次いで、精製されたＰＢＭＣｓを１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に再懸濁させた。９６ウェルプレートにウェル当たり１×１０５個でプレーティングし、５％ＣＯ２、３７℃の環境でインキュベーションした。３時間の培養後、培養培地を無血清培地に交換し、ＦＭＤＶ Ｏ（Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ）抗原単独または多様な非典型的Ｔ細胞アゴニスト及びＴ細胞アゴニストまたはＰＲＲリガンドとともに抗原で刺激した。
ＦＭＤ抗体陰性動物を豚ＰＢＭＣｓ分離のためのドナー（ｎ＝３／グループ）として使用した。全血（１５ｍＬ／各ドナー）をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒヘパリンチューブに独立に収集した。ＰＢＭＣｓ分離に関する詳しいプロトコールは前述したとおりである。すべての細胞は、使用直前に新鮮に分離され、いかなる実験でも凍結保存された細胞は使われなかった。次いで、精製されたＰＢＭＣｓを１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に再懸濁させた。９６ウェルプレートにウェル当たり１×１０５個でプレーティングし、５％ＣＯ２、３７℃の環境でインキュベーションした。３時間の培養後、培養培地を無血清培地に交換し、ＦＭＤＶ Ｏ（Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ）抗原単独または多様な非典型的Ｔ細胞アゴニスト及びＴ細胞アゴニストまたはＰＲＲリガンドとともに抗原で刺激した。
【0058】
５．豚ＰＢＭＣｓにおけるＢｒｄＵの統合分析
細胞増殖分析に対する詳細なプロトコールは、上述したとおりである。非典型的Ｔ細胞アゴニスト及び典型的Ｔ細胞アゴニストで処理した後、１２時間及び３６時間後に、細胞増殖を製造社の指示に従って試験した。
細胞増殖分析に対する詳細なプロトコールは、上述したとおりである。非典型的Ｔ細胞アゴニスト及び典型的Ｔ細胞アゴニストで処理した後、１２時間及び３６時間後に、細胞増殖を製造社の指示に従って試験した。
【0059】
６．ＲＮＡ－Ｓｅｑ
ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析のために、血清内ＦＭＤ抗体陰性豚の全血（ｎ＝３／グループ）から豚ＰＢＭＣｓを単離した。単離されたＰＢＭＣｓを、ＦＭＤＶ Ｏ（Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ）抗原とともに、γδＴ細胞アゴニスト（イソペンチルピロリン酸三リチウム塩、ＩＰＰ（Ｉ））、（Ｅ）－１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル４－ピロリン酸リチウム塩、ＨＭＰ（Ｈ））、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（α－ガラクトシルセラミド、α－Ｇａｌｃｅｒ（Ｇ）、Ａｂｃａｍ）及びＭＡＩＴ細胞アゴニスト（６－ホルミルプテリン(６－Ｆｏｒｍｙｌｐｔｅｒｉｎ)（Ｆ）、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含む非典型的Ｔ細胞アゴニスト、Ｔ細胞アゴニスト（ＲＯＲγＴ（Ｒ）、Ａｂｃａｍ）及びＰＲＲリガンド（レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、Ｒ８４８、ＴＬＲ－７／８アゴニスト）及びトレハロース－６，６－ジベヘナート（ＴＤＢ、Ｍｉｎｃｌｅアゴニスト）；ＴＤＢ及び環状ビス（３´－５´）ジグアニル酸（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で処理した。１２時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣｓを収集して（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）、ｑＲＴ－ＰＣＲのためにＲＮＡを抽出した。
ライブラリの構築及び配列分析、遺伝子発現分析及びＩＰＡを上述したように遂行した。
ＲＮＡ－Ｓｅｑ分析のために、血清内ＦＭＤ抗体陰性豚の全血（ｎ＝３／グループ）から豚ＰＢＭＣｓを単離した。単離されたＰＢＭＣｓを、ＦＭＤＶ Ｏ（Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ）抗原とともに、γδＴ細胞アゴニスト（イソペンチルピロリン酸三リチウム塩、ＩＰＰ（Ｉ））、（Ｅ）－１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル４－ピロリン酸リチウム塩、ＨＭＰ（Ｈ））、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（α－ガラクトシルセラミド、α－Ｇａｌｃｅｒ（Ｇ）、Ａｂｃａｍ）及びＭＡＩＴ細胞アゴニスト（６－ホルミルプテリン(６－Ｆｏｒｍｙｌｐｔｅｒｉｎ)（Ｆ）、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含む非典型的Ｔ細胞アゴニスト、Ｔ細胞アゴニスト（ＲＯＲγＴ（Ｒ）、Ａｂｃａｍ）及びＰＲＲリガンド（レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、Ｒ８４８、ＴＬＲ－７／８アゴニスト）及びトレハロース－６，６－ジベヘナート（ＴＤＢ、Ｍｉｎｃｌｅアゴニスト）；ＴＤＢ及び環状ビス（３´－５´）ジグアニル酸（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で処理した。１２時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣｓを収集して（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）、ｑＲＴ－ＰＣＲのためにＲＮＡを抽出した。
ライブラリの構築及び配列分析、遺伝子発現分析及びＩＰＡを上述したように遂行した。
【0060】
７．統計
他に言及されない限り、すべての定量的データは、平均±ＳＥＭで表示される。グループ間統計的有意性に対する値の比較は、Ｔｕｋｅｙの多重比較テストまたは二つのデータポイントを比較するためのスチューデントのｔ検定とともに一元配置分散分析を用いて行われた。統計分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を用いた。
他に言及されない限り、すべての定量的データは、平均±ＳＥＭで表示される。グループ間統計的有意性に対する値の比較は、Ｔｕｋｅｙの多重比較テストまたは二つのデータポイントを比較するためのスチューデントのｔ検定とともに一元配置分散分析を用いて行われた。統計分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３．１ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を用いた。
【0061】
＜予備実験例＞ 牛と豚の免疫差の評価
１．ＦＭＤＶ抗原は、豚由来のものより、牛由来のＰＢＭＣｓ、リンパ球、単球及びＴ細胞において、より強力な増殖を誘発する。
ＢｒｄＵ細胞増殖分析を用いて牛及び豚ＰＢＭＣｓ、リンパ球、単球及びＴ細胞のＯ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原により媒介される増殖を観察した。すべての種類の細胞において、牛細胞の増殖は、豚細胞のそれよりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）（図１のａ～ｄ）。
１．ＦＭＤＶ抗原は、豚由来のものより、牛由来のＰＢＭＣｓ、リンパ球、単球及びＴ細胞において、より強力な増殖を誘発する。
ＢｒｄＵ細胞増殖分析を用いて牛及び豚ＰＢＭＣｓ、リンパ球、単球及びＴ細胞のＯ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原により媒介される増殖を観察した。すべての種類の細胞において、牛細胞の増殖は、豚細胞のそれよりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）（図１のａ～ｄ）。
【0062】
２．ＦＭＤＶ抗原は、豚免疫細胞と比べて牛免疫細胞で炎症性サイトカイン発現を有意に誘導する。
Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原により媒介されたサイトカイン発現分析は、豚ＰＢＭＣｓにおいてサイトカインの発現が１２時間乃至４８時間でピークに到逹した後、急激に減少したが、牛ＰＢＭＣにおいては２４時間以内にサイトカインの発現が著しく増加し、２４０時間までこの水準が維持されたことを示した（図２のａ～ｄ、表１）。
Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原により媒介されたサイトカイン発現分析は、豚ＰＢＭＣｓにおいてサイトカインの発現が１２時間乃至４８時間でピークに到逹した後、急激に減少したが、牛ＰＢＭＣにおいては２４時間以内にサイトカインの発現が著しく増加し、２４０時間までこの水準が維持されたことを示した（図２のａ～ｄ、表１）。
【0063】
リンパ球におけるＯ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原により媒介されたサイトカイン発現は、豚細胞よりも牛細胞の方で著しく高かった（図２ｂのｅ～ｈ、表１）。豚単球におけるＯ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原媒介サイトカインの発現について（図２ｃのｉ～ｌ、表１）、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦα及びＩＦＮγの発現は、牛単球におけるそれよりも著しく高かった。牛及び豚Ｔ細胞において、Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原により媒介されるサイトカイン発現の経時変化を評価した（図２ｄのｍ～ｐ、表１）。サイトカインの発現は、牛及び豚のいずれのＴ細胞においても２４時間まで急速に増加した。その後、豚Ｔ細胞では徐々に減少したが、牛細胞では２４０時間までほとんど一定に維持された。
【0064】
ＩＬ－１β、ＩＬ－１２／２３ｐ４０及びＩＬ－１０発現のキネティクスは、豚ＰＢＭＣｓ、リンパ球、単球及びＴ細胞で確認された。炎症性サイトカインとしてＩＬ－１β及びＩＬ－１２／２３ｐ４０の発現は高かった。一方、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の発現は著しく低かった（図３）。
【0065】
【表1】
【0066】
３．ＦＭＤＶ抗原は、豚Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓでサイトカイン発現を直接刺激する。
牛よりも免疫反応が低い豚におけるＡＰＣの反応を調査するために、豚Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓを単球から分極化し、Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原によって刺激して抗原媒介サイトカインが直接分泌されるか否かを確認した。Ｍｏ－ＤＣｓ（図４ａのａ～ｅ、表２）及び／またはＭｏ－ＭΦｓ（図４ａのｆ及び図４ｂのｇ～ｊ、表３）、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２／２３ｐ４０（４８時間）及びＴＮＦα（２４時間）の発現は、ピーク水準に到逹した後に減少した。Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原は、これらの全ての炎症性サイトカインの発現を著しく高い水準で誘導したが、ＩＬ－１０（抗炎症性サイトカイン）は、Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓで低い水準で発現された。特に、ＬＰＳ及びＩＦＮγ－刺激Ｍ１ＭΦｓはＩＬ－４－刺激Ｍ２ＭΦｓよりも顕著に反応した。
牛よりも免疫反応が低い豚におけるＡＰＣの反応を調査するために、豚Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓを単球から分極化し、Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原によって刺激して抗原媒介サイトカインが直接分泌されるか否かを確認した。Ｍｏ－ＤＣｓ（図４ａのａ～ｅ、表２）及び／またはＭｏ－ＭΦｓ（図４ａのｆ及び図４ｂのｇ～ｊ、表３）、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２／２３ｐ４０（４８時間）及びＴＮＦα（２４時間）の発現は、ピーク水準に到逹した後に減少した。Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原は、これらの全ての炎症性サイトカインの発現を著しく高い水準で誘導したが、ＩＬ－１０（抗炎症性サイトカイン）は、Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓで低い水準で発現された。特に、ＬＰＳ及びＩＦＮγ－刺激Ｍ１ＭΦｓはＩＬ－４－刺激Ｍ２ＭΦｓよりも顕著に反応した。
【0067】
【表2】
【0068】
【表3】
【0069】
４．ＦＭＤＶ抗原は、食作用によって豚ＤＣｓ及びＭΦｓへ細胞内取り込み（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）されて細胞免疫を開始する。
豚Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓへのＯ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原のエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）による先天性免疫反応を開始及び増幅させる経路を確認するために、細胞をファゴサイトーシス（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）抑制剤であるサイトカラシンＤ（ＣｙｔＤ）で処理する前と後に、抗原で処理して共同培養し、細胞培養液におけるサイトカインの発現を観察した（図５ａ及び図５ｂ）。Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓにおいて、ＣｙｔＤ処理前に抗原と共同培養した後、２４時間及び４８時間後に、サイトカインの発現は上昇したが、その一方で、ＣｙｔＤ処理後に抗原と共同培養した場合には有意に抑制された。Ｍｏ－ＭΦｓでのＩＬ－１０発現は、ＣｙｔＤ処理後やや抑制されたが、処理前の水準とほぼ変わらなかった。
豚Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓへのＯ／ＴＷＮ／９７－Ｒ抗原のエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）による先天性免疫反応を開始及び増幅させる経路を確認するために、細胞をファゴサイトーシス（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）抑制剤であるサイトカラシンＤ（ＣｙｔＤ）で処理する前と後に、抗原で処理して共同培養し、細胞培養液におけるサイトカインの発現を観察した（図５ａ及び図５ｂ）。Ｍｏ－ＤＣｓ及びＭｏ－ＭΦｓにおいて、ＣｙｔＤ処理前に抗原と共同培養した後、２４時間及び４８時間後に、サイトカインの発現は上昇したが、その一方で、ＣｙｔＤ処理後に抗原と共同培養した場合には有意に抑制された。Ｍｏ－ＭΦｓでのＩＬ－１０発現は、ＣｙｔＤ処理後やや抑制されたが、処理前の水準とほぼ変わらなかった。
【0070】
５．豚における非正常的に過発現された先天性免疫反応及びＦＭＤワクチン予防接種によるＴ細胞の疲弊の経路（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）の誘導
抗原が媒介する豚ＡＰＣの刺激及び豚ＤＣｓ及びＭΦｓの食作用による抗原のエンドサイトーシスにもかかわらず、牛に比べて、豚における免疫反応がより低い原因を明らかにするため、本発明者らはＦＭＤ抗体陰性動物からナイーブ牛及び豚ＰＢＭＣｓを分離してＲＮＡ－Ｓｅｑを遂行した。
抗原が媒介する豚ＡＰＣの刺激及び豚ＤＣｓ及びＭΦｓの食作用による抗原のエンドサイトーシスにもかかわらず、牛に比べて、豚における免疫反応がより低い原因を明らかにするため、本発明者らはＦＭＤ抗体陰性動物からナイーブ牛及び豚ＰＢＭＣｓを分離してＲＮＡ－Ｓｅｑを遂行した。
【0071】
以上の手順に従って、牛と豚の免疫反応を比較したところ、生体内でＦＭＤワクチン接種によって誘導された牛と豚の免疫反応の根本的な違いが確認された（図６ａ～図６ｃ）。自然状態で、牛の先天性免疫反応はよく制御されて維持されることに対し、豚では非正常的に過剰活性化された（図６ａのｂ、ｃ）。結果的に、ＦＭＤワクチン接種は、家畜で正常な免疫反応を誘導する反面、Ｔ細胞の疲弊の経路（ＴＢＸ２１、ＮＥＡＴ１、ＮＥＡＴ３、ＮＥＡＴ５、ＥＯＭＥＳ、ＰＲＤＭ１、ＢＣＬ６及びＰＤＣＤ１）に関与する遺伝子の発現は、豚で有意に増加した（図６ｂ）。特に、ＴＬＲ／ＣＤＳ及びＣＬＲ信号伝達経路に関与する遺伝子の発現分析は、牛でＩＬ２３Ａ及びＩＬ２３Ｒ発現がＦＭＤワクチン接種によって効果的に誘導されたことを立証した。ＩＬ２３Ａは、豚で過発現パターンを示したが、ＩＬ２３Ｒ発現は観察されなかった（図６ｃ）。
【0072】
＜実験例１＞ ＦＭＤワクチンアジュバントとしての非典型的Ｔ細胞アゴニストは、マウスの初期、中期及び長期免疫を誘導する。
ＡＰＣを刺激しないでＴ細胞を直接活性化させることで強力な細胞性免疫反応を誘導するために、新規なＦＭＤワクチンアジュバントとして、γδＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、ＭＡＩＴ細胞を含む非典型的Ｔ細胞のアゴニスト及び典型的Ｔ細胞のアゴニストの利用可能性を、対象（目的）動物である豚における実験の前にマウスで評価した。また、オイルエマルジョンのないワクチンでも初期、中期及び長期免疫反応を効率的に誘導し、ＦＭＤＶ感染時の宿主保護効果があるかどうかを評価した（図７ａ）。
ＡＰＣを刺激しないでＴ細胞を直接活性化させることで強力な細胞性免疫反応を誘導するために、新規なＦＭＤワクチンアジュバントとして、γδＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、ＭＡＩＴ細胞を含む非典型的Ｔ細胞のアゴニスト及び典型的Ｔ細胞のアゴニストの利用可能性を、対象（目的）動物である豚における実験の前にマウスで評価した。また、オイルエマルジョンのないワクチンでも初期、中期及び長期免疫反応を効率的に誘導し、ＦＭＤＶ感染時の宿主保護効果があるかどうかを評価した（図７ａ）。
【0073】
対照群と比べて、ＳＰ－Ｏ ＥＬＩＳＡによる抗体力価は、γδＴ細胞アゴニスト（イソペンチルピロリン酸三リチウム塩、ＩＰＰ（Ｉ））、（Ｅ）－１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル４－ピロリン酸リチウム塩、ＨＭＰ（Ｈ））、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（α－ガラクトシルセラミド、α－Ｇａｌｃｅｒ（Ｇ））の投与後、ワクチン接種後７日（ｄｐｖ）で有意に高かった。力価は、また、１４ｄｐｖでＭＡＩＴ細胞アゴニスト（６－ホルミルプテリン（６－Ｆｏｒｍｙｌｐｔｅｒｉｎ）（Ｆ））投与群で増加された。典型的Ｔ細胞アゴニスト（ＲＯＲγＴ（Ｒ））について、抗体力価は、２８ｄｐｖで非典型的Ｔ細胞アゴニストのそれと同程度であった。すべての実験群において、抗体力価は１６８ｄｐｖまで対照群のそれより有意に高かった（図７ｂ）。
【0074】
ウイルス中和抗体（ＶＮ）力価は、ＳＰ－Ｏ ＥＬＩＳＡによる抗体力価と類似した傾向を示した。γδＴ細胞アゴニスト（Ｉ）、γδＴ細胞アゴニスト（Ｈ）及びｉＮＫＴ細胞アゴニスト（Ｇ）投与群は、７ｄｐｖで中和抗体力価がおおよそ１００倍増加し、また、ＭＡＩＴ細胞アゴニスト（Ｆ）投与群でも１４ｄｐｖで高い水準のＶＮ力価が見られた。２８ｄｐｖにおいて、ＶＮ力価は、γδＴ細胞アゴニスト（Ｉ）及びｉＮＫＴ細胞アゴニスト（Ｇ）投与群で最も高かった。ＶＮ力価は、ブースティング後５６ｄｐｖで最大値を示し、すべての非典型的Ｔ細胞アゴニスト投与群は、１６８ｄｐｖで対照群よりも有意により高い中和抗体力価を維持した（図７ｂ）。８４及び１６８ｄｐｖで実施したＦＭＤＶ（１００ＬＤ５０のＯ／ＶＥＴ／２０１３）チャレンジテストでは、すべてのアジュバント処理群が１００％の生存率（図７ｃ）を示し、体重変化はほとんどなかった（図７ｄ）。
したがって、非典型的Ｔ細胞アゴニストを含有するＦＭＤワクチンは、マウスで初期、中期及び長期免疫の誘導に強力な影響を及ぼすことが確認された。
したがって、非典型的Ｔ細胞アゴニストを含有するＦＭＤワクチンは、マウスで初期、中期及び長期免疫の誘導に強力な影響を及ぼすことが確認された。
【0075】
＜実験例２＞ 非典型的Ｔ細胞アゴニストは、豚ＰＢＭＣｓの強力な細胞増殖を誘導する。
インキュベーション後、１２時間及び３６時間の時点で、ＦＭＤ抗体陰性生成動物から分離された豚ナイーブＰＢＭＣｓにおいて、非典型的Ｔ細胞アゴニストにより媒介される細胞増殖が観察された（図８ａ）。実際の試験ワクチンと類似した条件を提供するために、ＦＭＤ血清型Ｏ（Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ）抗原を非典型的Ｔ細胞アゴニストと共に投与した。細胞増殖は次の順に高く現われた：抗原＋γδＴ細胞アゴニスト（Ｈ）＞抗原＋ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（Ｇ）＞抗原＋ＭＡＩＴ細胞アゴニスト（Ｆ）＞抗原＋Ｔ細胞アゴニスト（Ｒ）＞抗原＋γδＴ細胞アゴニスト（Ｉ）＞抗原単独（図８ｂ）。
インキュベーション後、１２時間及び３６時間の時点で、ＦＭＤ抗体陰性生成動物から分離された豚ナイーブＰＢＭＣｓにおいて、非典型的Ｔ細胞アゴニストにより媒介される細胞増殖が観察された（図８ａ）。実際の試験ワクチンと類似した条件を提供するために、ＦＭＤ血清型Ｏ（Ｏ／ＴＷＮ／９７－Ｒ）抗原を非典型的Ｔ細胞アゴニストと共に投与した。細胞増殖は次の順に高く現われた：抗原＋γδＴ細胞アゴニスト（Ｈ）＞抗原＋ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（Ｇ）＞抗原＋ＭＡＩＴ細胞アゴニスト（Ｆ）＞抗原＋Ｔ細胞アゴニスト（Ｒ）＞抗原＋γδＴ細胞アゴニスト（Ｉ）＞抗原単独（図８ｂ）。
【0076】
＜実験例３＞ 非典型的Ｔ細胞アゴニストは、豚で非正常的な先天性免疫反応を改善してＡＰＣ刺激なしに強力な免疫反応を誘導するＴ細胞を直接的に活性化する。
豚で強力な細胞性免疫反応を誘導することで、牛に比べて低い免疫原性を克服して豚で提起されている様々な問題に対する解決策を提供すべく、ＰＲＲｓリガンドでＤＣｓ及びＭΦｓのようなＡＰＣを刺激することで、Ｔ細胞を間接的に活性化させて免疫反応を誘導するシステムと、非典型的Ｔ細胞アゴニスト及びＴ細胞アゴニストによってＴ細胞を直接的に刺激して免疫反応を誘導するシステムとを比較した。ナイーブＰＢＭＣｓをＦＭＤ抗体陰性（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ）豚から分離し、抗原＋ＰＲＲリガンド（レシキモド（Ｒ８４８、ＴＬＲ－７／８アゴニスト）及びトレハロース－６，６－ジベヘナート（ＴＤＢ、Ｍｉｎｃｌｅアゴニスト）；ＴＤＢ及び環状ビス（３´－５´）ジグアニル酸（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ＳＴＩＮＧアゴニスト）若しくは抗原＋非典型的Ｔ細胞アゴニスト（γδＴ細胞アゴニスト、Ｉ；γδＴ細胞アゴニスト、Ｈ；ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、Ｇ；ＭＡＩＴ細胞アゴニスト、Ｆ）または抗原＋Ｔ細胞アゴニスト、Ｒ、または抗原単独で処理して、１２時間後にＰＢＭＣｓを収集して、総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造社が推奨する方法によって抽出、ＲＮＡ－Ｓｅｑを実施して、免疫増強剤媒介性の細胞性免疫反応及び関連遺伝子の発現プロファイルを確認した（図９ａ～図９ｅ）。
豚で強力な細胞性免疫反応を誘導することで、牛に比べて低い免疫原性を克服して豚で提起されている様々な問題に対する解決策を提供すべく、ＰＲＲｓリガンドでＤＣｓ及びＭΦｓのようなＡＰＣを刺激することで、Ｔ細胞を間接的に活性化させて免疫反応を誘導するシステムと、非典型的Ｔ細胞アゴニスト及びＴ細胞アゴニストによってＴ細胞を直接的に刺激して免疫反応を誘導するシステムとを比較した。ナイーブＰＢＭＣｓをＦＭＤ抗体陰性（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ）豚から分離し、抗原＋ＰＲＲリガンド（レシキモド（Ｒ８４８、ＴＬＲ－７／８アゴニスト）及びトレハロース－６，６－ジベヘナート（ＴＤＢ、Ｍｉｎｃｌｅアゴニスト）；ＴＤＢ及び環状ビス（３´－５´）ジグアニル酸（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ＳＴＩＮＧアゴニスト）若しくは抗原＋非典型的Ｔ細胞アゴニスト（γδＴ細胞アゴニスト、Ｉ；γδＴ細胞アゴニスト、Ｈ；ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、Ｇ；ＭＡＩＴ細胞アゴニスト、Ｆ）または抗原＋Ｔ細胞アゴニスト、Ｒ、または抗原単独で処理して、１２時間後にＰＢＭＣｓを収集して、総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造社が推奨する方法によって抽出、ＲＮＡ－Ｓｅｑを実施して、免疫増強剤媒介性の細胞性免疫反応及び関連遺伝子の発現プロファイルを確認した（図９ａ～図９ｅ）。
【0077】
ＴＬＲ／ＣＤＳシグナル伝達関連遺伝子の発現プロファイルは、ＰＲＲリガンドがＴＬＲ－７／８、ｃＧＡＳ及びＲＵＮＸ３の発現を誘導し、従来の非典型的Ｔ細胞アゴニストは、ＴＢＫ１、ＲＵＮＸ１、ＩＬ２３Ａ及びＩＬ２３Ｒの発現に有意に影響を及ぼしたことを示した（図９ａのａ）。ＣＬＲシグナル伝達経路は、ＰＲＲリガンド処理と比べて典型的細胞アゴニストで処理することにより、著しく誘導された。ＩＬ２３Ａ及びＩＬ２３Ｒは、特に非典型的Ｔ細胞アゴニストの中でｉＮＫＴ細胞アゴニスト（Ｇ）及び典型的Ｔ細胞アゴニスト（Ｒ）処理されたグループで高く発現された（図９ａのｂ）。Ｔ細胞の疲弊の経路の関連遺伝子の発現は、ＰＲＲリガンド及び非典型的Ｔ細胞アゴニスト処理によって改善された（図９ａのｃ）。Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｆｈ、ｐＴｒｅｇ及びｔＴｒｅｇ細胞での遺伝子発現は、ＰＲＲリガンド処理されたグループと比べて、非典型的Ｔ細胞アゴニスト及び典型的Ｔ細胞アゴニストで処理されたグループで有意に増加された。また、ＩＬ２３Ａ及びＩＬ２３Ｒ発現が増強されたし、ＬＴＡ、ＳＴＡＴ４、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、ＩＬ１０、ＲＯＲＡ、ＣＣＬ２０、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１α及びＩＬ１β発現も、Ｔ細胞アゴニスト処理によって増加された（図９ａのｄ、図９ｂのｅ～ｈ、図９ｃのｉ～ｋ）。特に、Ｍ１、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ、Ｍ２ｄ及びＤＣｓでの遺伝子発現は、ＡＰＣ刺激ＰＲＲリガンド処理と比べて、非典型的Ｔ細胞アゴニスト及び典型的Ｔ細胞アゴニスト処理によって著しく向上した。さらに、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、ＩＬ１β、ＩＬ２３Ａ、ＴＮＦα、ＩＬ１Ｒ２、ＴＧＭ２、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１６及びＣＤ１４の発現が顕著に増加した（図９ｃのｌ及び図９ｄのｍ、ｎ、図９ｅのｏ～ｑ）。ＮＫ細胞において、非典型的Ｔ細胞アゴニスト及びＴ細胞アゴニスト処理によるＩＴＧＢ２及びＩＦＮＡＲ２遺伝子の発現の増加が観察された（図９ｅのｒ）。
【0078】
［謝辞情報］
課題固有番号：１５４５０１９６０９
課題番号：Ｂ－１５４３３８６－２０１９－２１－０３
課題管理機関名：農林畜産検疫本部
研究事業名：農林畜産検疫検査技術開発
研究課題名：ノンオイルタイプの長期免疫誘導が可能な次世代豚口蹄疫ワクチンプラットホーム構築
課題固有番号：１５４５０１９６０９
課題番号：Ｂ－１５４３３８６－２０１９－２１－０３
課題管理機関名：農林畜産検疫本部
研究事業名：農林畜産検疫検査技術開発
研究課題名：ノンオイルタイプの長期免疫誘導が可能な次世代豚口蹄疫ワクチンプラットホーム構築
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図8a】
【図8b】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図9e】