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▶ シオルタ・セラピューティクス，インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2025-01-22
(45)【発行日】2025-01-30
(54)【発明の名称】治療用医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/747 20150101AFI20250123BHJP
A61K 35/741 20150101ALI20250123BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20250123BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20250123BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20250123BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20250123BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20250123BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20250123BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20250123BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20250123BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20250123BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20250123BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20250123BHJP
A61K 9/68 20060101ALI20250123BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20250123BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20250123BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20250123BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20250123BHJP
【ＦＩ】
A61K35/747
A61K35/741
A61K35/74 A ZNA
A61P11/06
A61P37/08
A61K9/48
A61K9/20
A61K9/107
A61K9/10
A61K9/08
A61K9/06
A61K9/19
A61K9/14
A61K9/68
A61K47/26
A61K47/18
A61K47/20
A61K47/02
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2022546594
(86)(22)【出願日】2020-10-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-07
(86)【国際出願番号】 US2020054444
(87)【国際公開番号】W WO2021071864
(87)【国際公開日】2021-04-15
【審査請求日】2023-10-05
(31)【優先権主張番号】62/911,873
(32)【優先日】2019-10-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522138630
【氏名又は名称】シオルタ・セラピューティクス，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100182132
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】キメス，ニコル
(72)【発明者】
【氏名】バヤダレス，リカルド
(72)【発明者】
【氏名】バジュララ，ニーラジャ
【審査官】佐々木 大輔
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５１１５６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０９７０３０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／０４３０５１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５１２４７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０３２５７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５１９０６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－００４７８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０１９７４４２７（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５３２７５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２１－５０３４５２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ．アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の少なくとも１つの株、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の少なくとも１つの株およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）の少なくとも１つの株を含む精製細菌集団、ならびにｉｉ．凍結保護物質
を含む、医薬組成物。
【請求項2】
固体剤型または液体剤型である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
凍結保護物質が炭水化物および／または抗酸化剤を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
炭水化物がサッカロースもしくはトレハロースまたはそれらの組合せを含むか、または、抗酸化剤がアミノ酸を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
アミノ酸がＬ－グルタマートもしくはＬ－システインまたはそれらの組合せを含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
凍結保護物質が（１）サッカロース、トレハロース、Ｌ－システインおよびＬ－グルタマート、または（２）グリセロールを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
（１）サッカロースが重量％として医薬組成物の０．１％から８０％の量で存在するか、（２）トレハロースが重量％として医薬組成物の０．０１％から２５％の量で存在するか、
（３）Ｌ－システインが重量％として医薬組成物の０．００１％から１０％の量で存在するか、
（４）Ｌ－グルタマートが重量％として医薬組成物の０．０１％から１０％の量で存在するか、または、
（５）グリセロールが重量％として医薬組成物の０．１％から４０％の量で存在する
請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
Ｌ－システインが重量％として医薬組成物の０．０５％～１％の量で存在する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
Ｌ－システインが重量％として医薬組成物の０．１％の量で存在する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
医薬組成物が液体剤型に製剤化されており、（１）医薬組成物がさらにバッファーを含むか、もしくは、容器の中に存在しており、または
（２）医薬組成物が０．２５ｍＬから１０ｍＬの総体積を有する、
請求項２から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項11】
バッファーがリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であり、かつ、７．４のｐＨを有するか、または、容器が２ｍＬ ポリプロピレン製スクリューキャップバイアルである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
医薬組成物が経口剤形として製剤化されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
経口剤形がカプセル剤、錠剤、乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ゲル剤、ガム、ペースト剤、ハーブティー、滴剤、溶解性顆粒剤、散剤、錠剤、凍結乾燥物、棒付きアイスキャンディーまたはアイスクリームである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
精製細菌集団が凍結されているか、または、凍結乾燥されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
精製細菌集団が生存可能である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
凍結保護物質が抗酸化剤を含む、請求項３から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項17】
抗酸化剤が、医薬組成物の０．０５重量％から１０重量％の量で存在する、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は治療用医薬組成物に関する。
【0002】
相互参照
本出願は２０１９年１０月７日付出願の米国仮特許出願第６２／９１１，８７３号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
本出願は２０１９年１０月７日付出願の米国仮特許出願第６２／９１１，８７３号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
【0003】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を含む。２０２０年１０月２日付で作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは５３２０６－７０７＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、３，７１３バイトのサイズを有する。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を含む。２０２０年１０月２日付で作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは５３２０６－７０７＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、３，７１３バイトのサイズを有する。
【背景技術】
【0004】
マイクロバイオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）およびゲノム研究の分野における最近の進展は、ヒトの腸の細菌組成がヒトの健康、疾患の発生および進行に根本的な影響を及ぼすという証拠を提供している。しかし、マイクロバイオームと宿主との関係、マイクロバイオーム組成による宿主における機能的および代謝的変化、ならびに治療用途のための細菌組成物の開発の可能性に関しては、多くのことが不明なままである。例えば、アレルギーおよび喘息のような炎症性疾患のリスクに寄与する確立された遺伝的成分が存在するものの、微生物曝露およびマイクロバイオーム組成を含む環境的要因がこれらの疾患の病因に重要な役割を果たしている。臨床試験からのデータは、最終的にアレルギーおよび喘息を発症する幼児の腸内マイクロバイオームが細菌種組成および免疫調節活性において異なっていることを示している。アレルギー疾患全般の発生率の上昇が懸念されており、喘息は、急速に増大しつつある世界的な懸念材料の１つであり、厄介な問題である。これらのアレルギー疾患のいずれにも治療法が存在しないため、それらは公衆衛生上の重大な課題となっており、症状の処置に数十億ドルが費やされている。例えば、喘息は、米国だけでも年間５６０億ドルを超える莫大な費用負担をもたらしており、そのうち２００億ドル近くが、安定しない有効性および潜在的に深刻な副作用をもたらす標準治療に費やされている。結果として、アレルギー疾患の予防を目的とした免疫調節性微生物組成物のような治療選択肢の拡大は、不均衡に冒される小児集団において特に、重大な満たされていない要求に対処するであろう。
【発明の概要】
【0005】
簡潔な概要
本明細書は、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）およびラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の少なくとも１つの株を含む精製細菌集団と凍結保護物質とを含む、固体剤形の医薬組成物を提供する。本明細書は更に、凍結保護物質が炭水化物および抗酸化剤を含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、炭水化物がサッカロース、トレハロースまたはそれらの組合せを含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、抗酸化剤がアミノ酸を含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、アミノ酸がＬ－グルタマート、Ｌ－システインまたはそれらの組合せを含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、Ｌ－システインが重量％として約０．０５％～約１％の量で存在する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、凍結保護物質が重量％として約６０％ サッカロース、約１０％ トレハロース、約１％ Ｌ－システインおよび約４％ Ｌ－グルタマートを含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、医薬組成物が懸濁剤に製剤化（処方）されている、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、医薬組成物が経口剤形として製剤化されている、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、経口剤形がカプセル剤、錠剤、乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ゲル剤、ガム、ペースト剤、ハーブティー、滴剤、溶解性顆粒剤、散剤、錠剤、凍結乾燥物、アイスバー（棒付きアイスキャンディー）またはアイスクリームである、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、細菌集団が凍結乾燥されている医薬組成物を提供する。
本明細書は、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）およびラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の少なくとも１つの株を含む精製細菌集団と凍結保護物質とを含む、固体剤形の医薬組成物を提供する。本明細書は更に、凍結保護物質が炭水化物および抗酸化剤を含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、炭水化物がサッカロース、トレハロースまたはそれらの組合せを含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、抗酸化剤がアミノ酸を含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、アミノ酸がＬ－グルタマート、Ｌ－システインまたはそれらの組合せを含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、Ｌ－システインが重量％として約０．０５％～約１％の量で存在する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、凍結保護物質が重量％として約６０％ サッカロース、約１０％ トレハロース、約１％ Ｌ－システインおよび約４％ Ｌ－グルタマートを含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、医薬組成物が懸濁剤に製剤化（処方）されている、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、医薬組成物が経口剤形として製剤化されている、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、経口剤形がカプセル剤、錠剤、乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ゲル剤、ガム、ペースト剤、ハーブティー、滴剤、溶解性顆粒剤、散剤、錠剤、凍結乾燥物、アイスバー（棒付きアイスキャンディー）またはアイスクリームである、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、細菌集団が凍結乾燥されている医薬組成物を提供する。
【0006】
本明細書は、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）およびラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の少なくとも１つの株を含む精製細菌集団と抗酸化剤とを含む、液体剤形の医薬組成物を提供する。本明細書は更に、凍結保護物質を更に含む医薬組成物を提供する。本明細書は更に、凍結保護物質がグリセロールを含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、グリセロールが体積％として約１０％～約３０％の量で存在する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、抗酸化剤がアミノ酸を含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、アミノ酸がＬ－システインを含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、Ｌ－システインが重量％として約０．１％の量で存在する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、バッファーを更に含む医薬組成物を提供する。本明細書は更に、バッファーがリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であり、約７．４のｐＨを有する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、医薬組成物が約１ｍＬの総体積を有する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、容器を更に含む医薬組成物を提供する。本明細書は更に、容器が２ｍＬ ポリプロピレンスクリューキャップバイアルである、医薬組成物を提供する。
【0007】
本明細書は、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）、ラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）およびフィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の少なくとも１つの株を含む精製細菌集団と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、医薬組成物はカプセル（カプセル剤）内に含まれ、カプセルは植物由来材料を含む。本明細書は更に、植物由来材料がセルロースベースの重合体を含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、セルロースベースの重合体がプルランを含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、カプセルがカプセル内のガス組成による測定で約０．５ｃｍ３／ｍ２／日未満の酸素透過性を有する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、カプセルが、脱イオン水を使用した３７℃での測定で約１．６分の崩壊エンドポイントを有する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、凍結保護物質を更に含む医薬組成物を提供する。本明細書は更に、凍結保護物質が炭水化物および抗酸化剤を含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、細菌集団が凍結乾燥されている、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）およびラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の少なくとも１つの株が、表１に挙げられている株から選択される、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、細菌集団がアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）またはラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）を含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、細菌集団が細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の少なくとも２つを含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、細菌集団が細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）を含む、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、各細菌株が約１０３ＣＦＵ～約１０１２ＣＦＵの量で存在する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、各細菌株が約１０７ＣＦＵ～約１０１０ＣＦＵの量で存在する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、各細菌株が約５×１０８ＣＦＵの量で存在する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、細菌集団が約１０３ＣＦＵ～約１０１２ＣＦＵの総量で存在する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、細菌集団が約１０７ＣＦＵ～約１０１０ＣＦＵの総量で存在する、医薬組成物を提供する。本明細書は更に、細菌集団が約１．５×１０９ＣＦＵの総量で存在する、医薬組成物を提供する。
【0008】
本明細書は、既に記載されている任意の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患の治療方法を提供する。本明細書は更に、疾患が炎症性疾患である、対象における疾患の治療方法を提供する。本明細書は更に、炎症性疾患がアレルギーまたは皮膚炎である、対象における疾患の治療方法を提供する。本明細書は更に、アレルギーがアレルギー性喘息、アレルギー性小児喘息または食物アレルギーである、対象における疾患の治療方法を提供する。本明細書は更に、疾患が代謝性疾患である、対象における疾患の治療方法を提供する。本明細書は更に、代謝性疾患が肥満、糖尿病またはメタボリックシンドロームである、対象における疾患の治療方法を提供する。
【0009】
本明細書は、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供し、該方法は、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）およびラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の株を含む精製細菌集団を含む医薬組成物を対象に経口投与することを含み、ここで、医薬組成物を少なくとも１日１回、少なくとも７日間、対象に投与する。本明細書は更に、対象が約７日齢以下の新生児である、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、対象が約２８日齢～約１２月齢の乳児である、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、医薬組成物を対象に少なくとも２８日間投与する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、医薬組成物を対象に少なくとも３３６日間投与する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、医薬組成物を対象に１日１回、２回、３回、４回、５回または６回投与する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、医薬を対象に１日１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回または１２回投与する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、アレルギー状態がアトピー性皮膚炎、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎またはアレルギー性喘息である、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、対象が、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎またはアレルギー性喘息であるアレルギー状態の病歴を有する生物学的母親、父親または兄弟姉妹を有する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、対象が約２．５ｋｇ～４．５ｋｇの出生体重を有する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、各細菌株が約１０３ＣＦＵ～約１０１２ＣＦＵの量で存在する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、各細菌株が約１０７ＣＦＵ～約１０１０ＣＦＵの量で存在する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、各細菌株が約５×１０８ＣＦＵの量で存在する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、細菌集団が約１０３ＣＦＵ～約１０１２ＣＦＵの総量で存在する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、細菌集団が約１０７ＣＦＵ～約１０１０ＣＦＵの総量で存在する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、細菌集団が約１．５×１０９ＣＦＵの総量で存在する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）およびラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）を同量で投与する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）およびラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）をそれぞれ５×１０８ＣＦＵで投与する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、炭水化物ベースの賦形剤を更に含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、医薬組成物を母乳、人工乳（人工栄養、フォーミュラ）または食物中に混合する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、懸濁剤が凍結保護物質を含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、凍結保護物質がグリセロールを含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、グリセロールが体積％として約１０％～約３０％の量で存在する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、抗酸化剤を更に含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、抗酸化剤がアミノ酸を含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、アミノ酸がＬ－システインを含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、Ｌ－システインが重量％として約０．１％の量で存在する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、バッファーを更に含む。対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、バッファーがリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であり、約７．４のｐＨを有する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、医薬組成物が約１ｍＬの総体積を有する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、組成物がカプセル内に含まれる、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、カプセルが植物ベースの材料を含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、カプセルが凍結保護物質を含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、凍結保護物質が炭水化物および抗酸化剤を含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、炭水化物がサッカロース、トレハロースまたはそれらの組合せを含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、抗酸化剤がアミノ酸を含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、アミノ酸がＬ－グルタマート、Ｌ－システインまたはそれらの組合せを含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、Ｌ－システインが重量％として約０．０５％～約１％の量で存在する、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、凍結保護物質が重量％として約６０％ サッカロース、約１０％ トレハロース、約１％ Ｌ－システインおよび約４％ Ｌ－グルタマートを含む、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。本明細書は更に、細菌集団が凍結乾燥されている、対象におけるアレルギー状態の発生率を低減する方法を提供する。
【0010】
本明細書は、漸増量の増殖培地を使用して複数の接種ラウンドを行うことを含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供し、ここで、各接種ラウンドは直前の接種ラウンドの全バッチ物質の少なくとも約５％を含む。本明細書は更に、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）がアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）またはアッケルマンシア・グリカニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｇｌｙｃａｎｉｐｈｉｌａ）を含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）がアッケルマンシア・ムシニフィラ（ＤＳＭ ３３２１３）を含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、増殖培地が約１Ｌ～約４，０００Ｌである、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、約１Ｌの増殖培地の初期接種ラウンドを更に含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、接種ラウンドの少なくとも１つが少なくとも約３０００Ｌの体積の増殖培地におけるものである、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、初期接種ラウンドが初期接種ラウンド増殖培地の約２％のアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の凍結ストックを含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、初期接種ラウンドが、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）を嫌気性条件中で増殖させることを含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、少なくとも２．５のＯＤ６００の量で存在するアッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）を含む最終接種ラウンドを更に含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、直前の接種ラウンドの全バッチ物質の約１０％（体積％）の最終接種ラウンドを更に含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、増殖培地に対して複数の滅菌ラウンドを行うことを更に含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供し、ここで、各滅菌ラウンドは、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）で増殖培地を脱気することを含む。本明細書は更に、バッチを凍結乾燥することを更に含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、凍結乾燥前にバッチを遠心分離することを更に含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、凍結乾燥後にバッチを粉砕することを更に含む、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、各接種ラウンドの増殖期間中に増殖培地が約７未満のｐＨ値を有する、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、各接種ラウンドの増殖期間中に増殖培地が約６．５未満のｐＨ値を有する、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。
【0011】
本明細書は、漸増量の増殖培地を使用して複数の接種ラウンドを行うことを含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供し、ここで、各接種ラウンドの増殖期間中に増殖培地は約６．５未満のｐＨ値を有する。本明細書は更に、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（ＤＳＭ ３３１８５）を含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、増殖培地が約１Ｌ～約４，０００Ｌである、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、約１Ｌの増殖培地の初期接種ラウンドを更に含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、接種ラウンドの少なくとも１つが少なくとも約３０００Ｌの増殖培地である、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、初期接種ラウンドが初期接種ラウンド増殖培地の約０．４％のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の凍結ストックを含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、初期接種ラウンドが、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を嫌気性条件中で増殖させることを含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、少なくとも５のＯＤ６００の量で存在するフィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）を含む最終接種ラウンドを更に含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、増殖培地に対して複数の滅菌および脱気ラウンドを行うことを更に含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供し、ここで、各滅菌ラウンドは、増殖培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ（高圧滅菌）することを含み、各脱気ラウンドは、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）で増殖培地を脱気することを含む。本明細書は更に、バッチを凍結乾燥することを更に含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、凍結乾燥前にバッチを遠心分離することを更に含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、凍結乾燥後にバッチを粉砕することを更に含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、各接種ラウンドの増殖期間中に増殖培地が約６未満のｐＨ値を有する、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、各接種ラウンドの増殖期間中に増殖培地が約５．５未満のｐＨ値を有する、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、各接種ラウンドの増殖期間中に増殖培地が約５未満のｐＨ値を有する、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。本明細書は更に、各接種ラウンドが直前の接種ラウンドの全バッチ物質の少なくとも約１％を含む、フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の大規模増殖のための方法を提供する。
【0012】
図面の簡潔な説明
本発明の新規特徴は添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点のより深い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明および以下に説明する添付の図面（本明細書においては「図面」または「図」）を参照することによって得られるであろう。
本発明の新規特徴は添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点のより深い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明および以下に説明する添付の図面（本明細書においては「図面」または「図」）を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図2】図２は、改変ＮＡＧＴ培地におけるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の経時的増殖を測定するための、６００ナノメートル波長における光吸収（本明細書においては「ＯＤ６００」とも称される）対時間のチャートを示す。データは、以下のものを包含する種々の培地からのものである：非改変ＮＡＧＴ培地、改変ＮＡＧＴ培地、グルコース非含有改変ＮＡＧＴ培地、カルシウム非含有改変ＮＡＧＴ培地およびマグネシウム非含有改変ＮＡＧＴ培地。
【図3】図３は、種々のＮＡＧＴ培地におけるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の経時的増殖を測定するための、６００ナノメートル波長における光吸収対時間のチャートを示す。データは、以下のものを包含する種々の培地からのものである：非改変ＮＡＧＴ培地、ＮＡＧ非含有ＮＡＧＴおよびソイトーン（ｓｏｙｔｏｎｅ）非含有ＮＡＧＴ。
【図4】図４は、種々の増殖培地におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の経時的増殖を測定するための、６００ナノメートル波長における光吸収対時間のチャートを示す。データは、以下のものを包含する種々の培地からのものである：完全培地、酢酸ナトリウム非含有培地、ソイトーン非含有培地、酵母エキス非含有培地およびシステイン非含有培地。
【図5】図５は、種々の補足物を含有するＹＦＡＰ培地におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の増殖に関する、６００ナノメートル波長における光吸収対時間のチャートを示す。フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を、ビタミン非含有ＹＦＡＰ内で３回継代培養した後、種々の補足物を含有するＹＦＡＰ培地内で増殖させた。データは、以下のものを包含する種々の培地からのものである：完全ビタミンミックスを含有するＹＦＡＰ培地（ビタミンミックス溶液）（ＹＦＡＰ＋ビタミン）、ビオチン非含有ＹＦＡＰ培地（ビオチン非含有ＹＦＡＰ）、コバラミン非含有ＹＦＡＰ培地（コバラミン非含有ＹＦＡＰ）、ＰＡＢＡ非含有ＹＦＡＰ培地（ＰＡＢＡ非含有ＹＦＡＰ）、葉酸非含有ＹＦＡＰ培地（葉酸非含有ＹＦＡＰ）、ピリドキサミン非含有ＹＦＡＰ培地（ピリドキサミン非含有ＹＦＡＰ）、チアミン非含有ＹＦＡＰ培地（チアミン非含有ＹＦＡＰ）、リボフラビン非含有ＹＦＡＰ培地（リボフラビン非含有ＹＦＡＰ）、および完全ビタミンミックスを含有しないＹＦＡＰ培地（ビタミン非含有ＹＦＡＰ）。ビタミンの添加はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の増殖を約１０％増加させた。
【図6】図６は、種々の補足物を含有するＹＦＡＰ培地におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の増殖に関する、６００ナノメートル波長における光吸収対時間のチャートを示す。フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を、ビタミンの非存在下で１回継代培養した。データは、以下のものを包含する種々の培地からのものである：完全ビタミンミックスを含有するＹＦＡＰ培地（ビタミンミックス溶液）（ＹＦＡＰ＋ビタミン）、ビオチン非含有ＹＦＡＰ培地（ビオチン非含有ＹＦＡＰ）、コバラミン非含有ＹＦＡＰ培地（コバラミン非含有ＹＦＡＰ）、ＰＡＢＡ非含有ＹＦＡＰ培地（ＰＡＢＡ非含有ＹＦＡＰ）、葉酸非含有ＹＦＡＰ培地（葉酸非含有ＹＦＡＰ）、ピリドキサミン非含有ＹＦＡＰ培地（ピリドキサミン非含有ＹＦＡＰ）、チアミン非含有ＹＦＡＰ培地（チアミン非含有ＹＦＡＰ）、リボフラビン非含有ＹＦＡＰ培地（リボフラビン非含有ＹＦＡＰ）、および完全ビタミンミックスを含有しないＹＦＡＰ培地（ビタミン非含有ＹＦＡＰ）。完全ビタミンミックスまたはコバラミンの欠如はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の増殖を約３０％減少させた。
【図7】図７は、ｐＨ制御の非存在下のＹＦＡＰ培地におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の増殖に関する、６００ナノメートル波長における光吸収対時間のチャートを示す。培養物を２４時間目の時点で接種し、１００ｒｐｍで撹拌し、３７℃でインキュベートした。ｐＨを固定しなかった場合には、それは約５．５に低下した。酸化還元（レドックス）を－４００ｍＶで維持し、細菌増殖はＯＤ６００＝１．１に達した。２４時間目より前の読取り値はいずれも各測定に関するベースライン値を表す。
【図8】図８は、ｐＨ制御の存在下のＹＦＡＰ培地におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の増殖に関する、６００ナノメートル波長における光吸収対時間のチャートを示す。培養物を２４時間目の時点で接種し、１００ｒｐｍで撹拌し、３７℃でインキュベートした。水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）の添加によりｐＨを６．７５に固定すると、酸化還元は－４６０ｍＶに低下し、一方、細菌増殖はＯＤ６００＝０．５付近で横ばい状態になった。２４時間目より前の読取り値はいずれも各測定に関するベースライン値を表す。
【図9】図９は、種々の増殖培地におけるラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）の経時的増殖の時間に対する６００ナノメートル波長における光吸収のチャートを示す。このチャートはブイヨン（Ｂｏｕｌｌｉｏｎ）ｖＭＲＳブロスおよびＨｉＭｅｄｉａ ｖＭＲＳブロスにおけるラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）の増殖を比較している。
【図10】図１０は、ＮＡＧＴ培地内のアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の２０リットル培養の増殖に関する、時間に対する、５８５ナノメートル波長における光吸収（本明細書においては「ＯＤ５８５」とも称される）（左側のＹ軸）およびグルコース濃度（ｇ／Ｌ）（右側のＹ軸）のチャートを示す。このチャートはアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の増殖とグルコースレベルとの間の経時的な関係を示している。２７時間目および４８時間目におけるグルコース（４．５２ｇ／Ｌ）およびＮ－アセチルグルコサミン（５．５４ｇ／Ｌ）の添加（＊）は、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）培養が２５時間目から５０時間目の間に指数増殖期を維持し、５０時間目以降に定常期に入ることを可能にした。
【図11】図１１は、ベジトン（Ｖｅｇｉｔｏｎｅ）ＭＲＳ培地内のラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の２０リットル培養の増殖に関する、時間に対する、５８５ナノメートル波長における光吸収（左側のＹ軸）およびグルコース濃度（ｇ／Ｌ）（右側のＹ軸）のチャートを示す。このチャートはラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の増殖とグルコースレベルとの間の経時的な関係を示している。１０時間目および１１時間目におけるグルコース（１０ｇ／Ｌ）の２回の添加（１回目の供給＊および２回目の供給＊＊）は、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）培養が１１時間目から１４時間目の間に指数増殖期を維持し、１４時間目以降に定常期に入ることを可能にした。
【図12】ＦＡＰ培地内のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の２０リットル培養の増殖に関する、時間に対する、５８５ナノメートル波長における光吸収（左側のＹ軸）およびグルコース濃度（ｇ／Ｌ）（右側のＹ軸）のチャートを示す。このチャートは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の増殖とグルコースレベルとの間の経時的な関係を示している。９時間目におけるグルコース（１０ｇ／Ｌ）を添加（１回目の供給＊）は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）培養の細胞が９時間目から１４時間目まで増殖を維持することを可能にした。
【図13】図１３は、ＮＡＧＴ培地内のアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の１５０リットル培養の増殖に関する、時間に対する、５８５ナノメートル波長における光吸収（左側のＹ軸）およびグルコース濃度（ｇ／Ｌ）（右側のＹ軸）のチャートを示す。このチャートはアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の増殖とグルコースレベルとの間の経時的な関係を示している。１９時間目におけるグルコース（４．５２ｇ／Ｌ）およびＮ－アセチルグルコサミン（５．５４ｇ／Ｌ）の添加は、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）培養が２０時間目以降に指数増殖を維持することを可能にした。
【図14】図１４は、ベジトン（Ｖｅｇｉｔｏｎｅ）ＭＲＳ培地内のラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の１５０リットル培養の増殖に関する、時間に対する、５８５ナノメートル波長における光吸収（左側のＹ軸）およびグルコース濃度（ｇ／Ｌ）（右側のＹ軸）のチャートを示す。このチャートはラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の増殖とグルコースレベルとの間の経時的な関係を示している。１０時間目におけるグルコース（３５ｇ／Ｌ）の添加（＊）は、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）培養が１０時間目から１２時間目までの指数増殖を維持し、１２時間目以降に定常増殖に入ることを可能にした。
【図15】図１５は、ＹＦＡＰ－ＮＵ培地内の１Ｌのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）培養の経時的増殖の測定に関する、６００ナノメートル波長における光吸収対時間のチャートを示す。
【図16】図１６は、ＹＦＡＰ－ＮＵ培地内の１５０Ｌのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）培養の経時的増殖の測定に関する、６００ナノメートル波長における光吸収対時間のチャートを示す。８時間目におけるグルコース（１０ｇ／Ｌ）の添加（＊）は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）培養が指数期に入り、定常期に達することを可能にした。
【図17】図１７Ａ～１７Ｃは、細菌細胞集団（例えば、ヒト対象に投与されうる細胞集団）における代謝活性治療株の定量のための、熱殺菌対照アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞のフローサイトメトリー・ゲーティング実験を示す。例示株として使用したアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞ストック溶液を０．９％ ＮａＣｌバッファー溶液中で１０－４Ｍに希釈し、９５℃の加熱ブロック内に２０分間配置して、実験実施前の細胞死を確認した。細胞を２μＭのヨウ化プロピジウムおよび２μＭのＳＹＴＯ９で染色した。前方散乱領域（ＦＳＣ－Ａ）および側方散乱領域（ＳＳＣ－Ａ）によって計数された全ての細胞（図１７Ａ）にゲートを適用して、それぞれ細胞のサイズおよび粒度に関して選択する。ついで、それらの細胞を前方散乱高（ＦＳＣ－Ｈ）および前方散乱領域（ＦＳＣ－Ａ）に基づいて線形性でゲートして、単一細胞を特定した（図１７Ｂ）。ついで単一細胞を使用して、死細胞（ＰＩｈｉｇｈＳＹＴＯ９ｌｏｗ）および生細胞（ＰＩ－ＳＹＴＯ９ｈｉｇｈ）に関するゲートを設定し、これは５０μｌの溶液中の生細胞および死細胞の百分率を示した（図１７Ｃ）。
【0014】
図１７Ａは、それぞれ細胞サイズおよび粒度を選択するために前方散乱領域（ＦＳＣ－Ａ）および側方散乱領域（ＳＳＣ－Ａ）によって計数された全ての細胞にゲートが適用された場合に得られたフローサイトメトリーの結果を示す。
【0015】
図１７Ｂは、単一細胞を特定するために前方散乱高（ＦＳＣ－Ｈ）および前方散乱領域（ＦＳＣ－Ａ）に基づいて線形性で細胞がゲートされた場合に得られたフローサイトメトリーの結果を示す。
【0016】
図１７Ｃは、死細胞（ＰＩｈｉｇｈＳＹＴＯ９ｌｏｗ）および生細胞（ＰＩ－ＳＹＴＯ９ｈｉｇｈ）用のゲートを設定するために単一細胞を使用した場合に得られたフローサイトメトリーの結果を示し、これは５０μｌの細胞懸濁液中の生細胞および死細胞の百分率を示している。
【図18】図１８は、（標準的な）寒天プレーティング法を用いて決定された総生細胞数と生細胞のフローサイトメトリー定量データとを比較するグラフを示す。左側のｙ軸は、フローサイトメトリーにより測定された総生細胞数を示す。右側のｙ軸は生物学的重複実験のための栄養寒天プレーティングからの算出平均ＣＦＵ／ｍＬ値を示す。両側マンホイットニーｔ検定はそれらの２つの定量法の平均値の間に有意差を示さなかった（ｐ値は０．０５３２）。
【図19】図１９Ａ～１９Ｃは、それぞれ細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）（図１９Ａ）およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）（図１９Ｂ）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）（図１９Ｃ）を糞便サンプルにおいて定量するための検出曲線（対照閾値を細菌細胞数に対してプロットした）の限界を示す。点線は、測定データポイントを連結したものであり、直線は、フィットされた回帰直線を表し、「Ｒ２」は決定係数である。示されているデータは、糞便ＤＮＡバックグラウンドにおいて希釈された３つの株の５０ｎｇの全ＤＮＡ（株ＤＮＡ＋糞便ＤＮＡ）の純粋な細菌ＤＮＡ（１０、１、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１および０．００００１ナノグラム（ｎｇ））を使用して作成された標準曲線を表す。株［例えば、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）］ＤＮＡの量を決定するためにヒトサンプルを分析する場合、実験で使用されるＤＮＡプライマーが細菌株のＤＮＡを適切に増幅しうることを確認するために、対照サンプルが並行して実施され分析されうる。
【図20】図２０は、３５００Ｌの培養体積におけるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）に関する、最適化された超大規模増殖および製造プロセスの概略フローチャートを示す。１９．２ｍＬの実施用細胞バンク（ＷＣＢ）アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）を嫌気性チャンバー内で解凍し、嫌気性チャンバー内の１Ｌ ボトル（２００１）内で１Ｌの還元（ｒｅｄｕｃｅｄ）ＮＡＧＴ培地（２％ ｖ／ｖの接種率）に接種した。ＯＤ５８５＞１になった際または培養物を４８時間増殖させた際に、培養を停止した。２００１における全培養物を使用して、２０Ｌ 発酵槽（２００２）内の１６Ｌの培地（５％ ｖ／ｖの接種率）に接種した。ＯＤ５８５＞１．５になった際または培養物を４８時間増殖させた際に、培養を停止した。２００２における１５Ｌの培養物を使用して、３００Ｌ 発酵槽（２００３）内の３００Ｌの培地（５％ ｖ／ｖの接種率）に接種した。ＯＤ５８５＞１．５になった際または培養物を４８時間増殖させた際に、培養を停止した。表１５に定められている２４０Ｌを準備した。１００Ｌの糖供給物を３５００Ｌ 発酵槽（２００４）に添加した。２００２における３００Ｌの培養物を使用して、２００４における３５００Ｌの培地（８～１０％ ｖ／ｖの接種率）に接種した。グルコース濃度が２ｇ／Ｌ未満に低下したら、更に１００Ｌの糖供給物を添加した。ＯＤ５８５＞２．５になった際または培養物を７２時間増殖させた際に、培養を停止した。ついで２００４における全培養物を嫌気性雰囲気下で遠心分離し、バイオマスとして回収した。表１７に定められている１００Ｌの濾過滅菌脱気凍結保護物質を、嫌気性ガスでパージされた混合タンク内で該バイオマスと混合した。凍結保護物質を含有するバイオマスを凍結乾燥（凍結および乾燥）し、粉砕した。各工程において、細菌培養に使用する培地を滅菌し（１２１℃でオートクレーブ）、使用前にＮ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）で脱気した。糖成分（Ｎ－アセチルグルコサミンおよびグルコース）を、その他ＮＡＧＴ培地成分とは別に調製した。糖供給物を濾過滅菌し、脱気し、その他のＮＡＧＴ培地成分に加えて、完全培地を得た。
【図21】図２１は、３５００Ｌの製造プロセスにおける１Ｌ ボトル内のＮＡＧＴ培地内の１Ｌのアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）培養の増殖に関する、５８５ナノメートル波長における光吸収（Ｙ軸）対時間のチャートを示す。
【図22】図２２は、３５００Ｌの製造プロセスにおける２０Ｌ 発酵槽内のＮＡＧＴ培地内の２０Ｌのアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）培養の増殖に関する、５８５ナノメートル波長における光吸収（Ｙ軸）対時間のチャートを示す。
【図23】図２３は、３５００Ｌの製造プロセスにおける３００Ｌ 発酵槽内のＮＡＧＴ培地内の３００Ｌのアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）培養の増殖に関する、５８５ナノメートル波長における光吸収（Ｙ軸）対時間のチャートを示す。
【図24】図２４は、３５００Ｌの製造プロセスにおける３５００Ｌ 発酵槽内のＮＡＧＴ培地内の３５００Ｌのアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）培養の増殖に関する、５８５ナノメートル波長における光吸収（Ｙ軸）対時間のチャートを示す。
【図25】図２５は、３５００Ｌの培養体積におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）に関する、最適化された超大規模増殖および製造プロセスの概略フローチャートを示す。６．４ｍＬの実施用細胞バンク（ＷＣＢ）フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）を嫌気性チャンバー内で解凍し、嫌気性チャンバー内の２Ｌ フラスコ（２５０１）内で１Ｌの還元（ｒｅｄｕｃｅｄ）ＮＡＧＴ培地（２％ ｖ／ｖの接種率）に接種した。ＯＤ６００＞３になった際または培養物を４８時間増殖させた際に、培養を停止した。２５０１における１．５Ｌの培養物を使用して、３００Ｌ 発酵槽（２５０２）内の１５０Ｌの培地（１％ ｖ／ｖの接種率）に接種した。ＯＤ５８５＞５になった際または培養物を４８時間増殖させた際に、培養を停止した。表２２に定められている２５０Ｌを準備した。１００Ｌの糖供給物を３５００Ｌ 発酵槽（２５０３）に添加した。２５０２における３５Ｌの培養物を使用して、３５００Ｌ 発酵槽（２５０３）内の３００Ｌの培地（５％ ｖ／ｖの接種率）に接種した。ＯＤ５８５＞５になった際または培養物を７２時間増殖させた際に、培養を停止した。ついで２５０３における全培養物を嫌気性雰囲気下で遠心分離し、バイオマスとして回収した。表２４に定められている１２０Ｌの濾過滅菌脱気凍結保護物質を、嫌気性ガスでパージされた混合タンク内で該バイオマスと混合した。凍結保護物質を含有するバイオマスを凍結乾燥（凍結および乾燥）し、粉砕した。各工程において、細菌培養に使用する培地を滅菌し（１２１℃でオートクレーブ）、使用前にＮ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）で脱気した。糖成分（グルコース）を、その他ＹＦＡＰ培地成分とは別に調製した。糖供給物を濾過滅菌し、脱気し、その他のＹＦＡＰ培地成分に加えて、完全培地を得た。
【図26】図２６は、３５００Ｌの製造プロセスにおける２Ｌ フラスコ内のＹＦＡＰ培地内の２Ｌのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）培養の増殖に関する、５８５ナノメートル波長における光吸収（Ｙ軸）対時間のチャートを示す。
【図27】図２７は、３５００Ｌの製造プロセスにおける３００Ｌ 発酵槽内のＹＦＡＰ培地内の１５０Ｌのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）培養の増殖に関する、５８５ナノメートル波長における光吸収（Ｙ軸）対時間のチャートを示す。
【図28】図２８は、３５００Ｌの製造プロセスにおける３５００Ｌ 発酵槽内のＹＦＡＰ培地内の３５００Ｌのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）培養の増殖に関する、５８５ナノメートル波長における光吸収（Ｙ軸）対時間のチャートを示す。
【図29】図２９は、本明細書に記載されているヒト臨床試験の３つの段階（スクリーニング期間、治療期間および休薬期間）、ならびに医薬組成物を対象に経口投与することによる、プラセボと比較した場合の種々の年齢の対象におけるアレルギーを治療するその能力を示す。
【0017】
詳細な説明
本明細書は、炎症性または代謝性疾患の治療のための細菌を含む医薬組成物を提供する。幾つかの場合には、医薬組成物は１以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む。記載されている医薬組成物は、１以上の細菌株を含む１以上の細菌種を含みうる。幾つかの場合には、医薬組成物はラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）および／またはフィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）のいずれか１以上を含むこと、またはそれらから本質的になること、またはそれらからなることが可能である。更に詳細な例においては、本明細書に記載されている医薬組成物は、本明細書中で言及されている以下の種、すなわち、ラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）および／またはフィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の任意の１以上の特定の株を含む、またはそれらから本質的になる、またはそれらからなる。例えば、幾つかの場合には、本明細書に記載されている医薬組成物は、細菌株ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）［本明細書においては「ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）」とも称される］、寄託番号ＤＳＭ ３３２１３を有するアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）［本明細書においてはアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）とも称される］およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）［本明細書においてはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）とも称される］を含む、またはそれらから本質的になる、またはそれらからなる。幾つかの場合には、医薬組成物は、実施例２において定められている組成物Ａを含みうる。
本明細書は、炎症性または代謝性疾患の治療のための細菌を含む医薬組成物を提供する。幾つかの場合には、医薬組成物は１以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む。記載されている医薬組成物は、１以上の細菌株を含む１以上の細菌種を含みうる。幾つかの場合には、医薬組成物はラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）および／またはフィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）のいずれか１以上を含むこと、またはそれらから本質的になること、またはそれらからなることが可能である。更に詳細な例においては、本明細書に記載されている医薬組成物は、本明細書中で言及されている以下の種、すなわち、ラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）および／またはフィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の任意の１以上の特定の株を含む、またはそれらから本質的になる、またはそれらからなる。例えば、幾つかの場合には、本明細書に記載されている医薬組成物は、細菌株ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）［本明細書においては「ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）」とも称される］、寄託番号ＤＳＭ ３３２１３を有するアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）［本明細書においてはアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）とも称される］およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）［本明細書においてはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）とも称される］を含む、またはそれらから本質的になる、またはそれらからなる。幾つかの場合には、医薬組成物は、実施例２において定められている組成物Ａを含みうる。
【0018】
本明細書は、医薬組成物、そのような組成物の製剤、そのような組成物の製造方法、そのような医薬組成物の投与経路、ならびにそのような医薬組成物を使用して予防および／または治療されうる適応を提供する。
【0019】
本開示はまた、本明細書に記載されている医薬組成物を製剤化（処方）する方法、ならびに疾患または病態を有する又は有する疑いのある対象にそのような医薬組成物を投与するための方法を提供する。そのような方法は、１以上の細菌種および／または株を含みうる又はそれらからなりうる本発明における医薬組成物を経口剤形に製剤化することを含みうる。そのような経口製剤は、１以上の細菌種および／または菌株、緩衝化グリセロール溶液、例えば、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２０％ ｖ／ｖ グリセロールおよび抗酸化剤、例えば０．１％ ｗ／ｗ Ｌ－システインを含む標準リン酸緩衝食塩水から構成されうるものを含みうる、またはそれらからなりうる。
【0020】
本明細書は更に、本明細書に記載されている細菌株のバッチの製造を可能にする製造方法を提供する。そのような方法は、通常の製造方法と比較して１以上の利点をもたらしうる。そのような利点には、（ｉ）総収量の増加、（ｉｉ）増殖速度の増加、および／または（ｉｉｉ）総細胞数当たりの生存可能細菌細胞の数の増加のいずれか１以上が含まれうる。幾つかの場合には、そのような方法は非動物由来の培地成分の使用を含みうる。そのような非動物培地には、植物培地が含まれうる。そのような植物培地は、植物ペプトン、植物抽出物、酵母エキスおよび他の非動物成分のような種々の成分を含みうる。幾つかの場合には、そのような非動物培地には、Ｎ－アセチルグルコサミン－スレオニン（ＮＡＧＴ）培地およびブイヨン（Ｂｏｕｌｌｉｏｎ）ＭＲＳ植物培地、酵母脂肪酸フィトン（ＹＦＡＰ）培地、およびそれらの改変形態が含まれうる。そのような改変培地においては、１以上の培地成分が除去され、添加され、および／または他の成分により置換されていることが可能である。他の場合には、培地成分の量は、非改変培地と比較して増加または減少される。一例においては、改変ＮＡＧＴ培地はマグネシウム、カルシウムまたはグルコースの任意の１以上を含まなくてもよい。
【0021】
本開示のそのような経口製剤は対象における疾患または病態の予防および／または治療方法において使用可能であり、該方法は、疾患または病態を有する又は有する疑いのある対象（例えば、ヒト）に該経口製剤を投与することを含む。そのような疾患または病態は炎症性疾患（例えば、アレルギーまたは喘息）または自己免疫疾患でありうる。
【0022】
定義
「少なくとも」、「より大きい」または「以上」なる語が一連の２以上の数値における最初または最後の数値のそれぞれ前または後にあるときはいつでも、「少なくとも」、「より大きい」または「以上」なる語はその一連の数値における数値のそれぞれに適用される。例えば、１、２または３以上は１以上、２以上または３以上と同等である。
「少なくとも」、「より大きい」または「以上」なる語が一連の２以上の数値における最初または最後の数値のそれぞれ前または後にあるときはいつでも、「少なくとも」、「より大きい」または「以上」なる語はその一連の数値における数値のそれぞれに適用される。例えば、１、２または３以上は１以上、２以上または３以上と同等である。
【0023】
「せいぜい」、「未満」または「以下」なる語が一連の２以上の数値における最初または最後の数値のそれぞれ前または後にあるときはいつでも、「せいぜい」、「未満」または「以下」なる語はその一連の数値における数値のそれぞれに適用される。例えば、３、２または１以下は３以下、２以下または１以下と同等である。
【0024】
数値または範囲の文脈で本明細書中で使用される「約」なる語は、特に示されていない限り、一般に、挙げられている又は特許請求されている数値または範囲の±１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％を意味する。
【0025】
医薬組成物
本開示は、細菌共生体（細菌コンソーシアム）と１以上の医薬賦形剤とを含みうる、それらから本質的になりうる、またはそれらからなりうる医薬組成物を提供する。そのような医薬賦形剤には、凍結保護物質、抗酸化剤および水性緩衝溶液が含まれうる。
本開示は、細菌共生体（細菌コンソーシアム）と１以上の医薬賦形剤とを含みうる、それらから本質的になりうる、またはそれらからなりうる医薬組成物を提供する。そのような医薬賦形剤には、凍結保護物質、抗酸化剤および水性緩衝溶液が含まれうる。
【0026】
本明細書は、細菌共生体を含みうる医薬組成物を提供する。そのような細菌共生体は１以上の異なる細菌種および／または株を含みうる。そのような細菌種および／または株は１以上の異なる細菌門に属しうる。そのような細菌門には、ベルコミクロビア（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）および／もしくはバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）またはそれらの組合せが含まれうる。
【0027】
幾つかの場合には、本明細書に記載されている細菌共生体は１以上のラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）を含みうる。そのような１以上のラクトバシラス属種には以下のものが含まれうる：ラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・ゼエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ）、ラクトバシラス・アシディピシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｉｐｉｓｃｉｓ）、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシラス・アジリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｉｌｉｓ）、ラクトバシラス・アビアリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｕｓ）、ラクトバシラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバシラス・コレオホミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｅｏｈｏｍｉｎｉｓ）、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバシラス・クルストラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｕｓｔｏｒｕｍ）、ラクトバシラス・クルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバシラス・ジオリボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバシラス・ファーラジニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｒａｇｉｎｉｓ）、ラクトバシラス・フェルメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバシラス・フチュエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、ラクトバシラス・ハービネンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｒｂｉｎｅｎｓｉｓ）、ラクトバシラス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラス・ヒルガルジイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、ラクトバシラス・インテスチナリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ラクトバシラス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバシラス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ラクトバシラス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバシラス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバシラス・マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）、ラクトバシラス・マニホチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバシラス・ムコセ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ）、ラクトバシラス・オエニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｅｎｉ）、ラクトバシラス・オリゴフェルメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｌｉｇｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトバシラス・パニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｉｓ）、ラクトバシラス・パンテリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｔｈｅｒｉｓ）、ラクトバシラス・パラブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバシラス・パラコリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、ラクトバシラス・パラケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバシラス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・ポンチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｎｔｉｓ）、ラクトバシラス・リューテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバシラス・ロッシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）、ラクトバシラス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバシラス・サリギニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｌｉｇｉｎｉｓ）、ラクトバシラス・スシコラ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｉｃｏｌａ）、ラクトバシラス・バクシノステルカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｃｃｉｎｏｓｔｅｒｃｕｓ）、ラクトバシラス・バジナリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ラクトバシラス・ビニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｉ）、ラクトコッカス・ガルビエエ（Ｌａｃｌｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）またはそれらの組合せ。幾つかの実施形態においては、ラクトバシラス属種はラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）またはラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）である。そのような場合には、細菌共生体は１以上のラクトバシラス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）またはラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）株を含みうる。そのような１以上のラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）株には、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）（すなわち、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７））が含まれうる。種々の場合には、本明細書における細菌共生体はラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）を含みうる。
【0028】
幾つかの場合には、本明細書における細菌共生体は１以上のアッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）を含みうる。そのような１以上のアッケルマンシア属種には、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、アッケルマンシア・グリカニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｇｌｙｃａｎｉｐｈｉｌａ）またはそれらの組合せが含まれうる。幾つかの場合には、そのような１以上のアッケルマンシア属種はアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）である。そのような場合には、本明細書における細菌共生体は１以上のアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）株を含みうる。そのような１以上のアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）株には、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）が含まれうる。種々の場合には、本明細書における細菌共生体はアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）を含む。
【0029】
幾つかの場合には、本明細書における細菌共生体は１以上のフィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）を含みうる。そのような１以上のフィーカリバクテリウム属種には、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）が含まれうる。そのような場合には、本明細書における細菌共生体は１以上のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株を含みうる。そのような１以上のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株には、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１９１）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８６）もしくはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１９０）またはそれらの組合せが含まれうる。種々の場合には、本明細書における細菌共生体はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）を含む。
【0030】
本明細書は更に、バクテロイデス属種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ）、ブラウティア属種（Ｂｌａｕｔｉａ ｓｐ．）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、コプロコッカス属種（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）またはドレア属種（Ｄｏｒｅａ ｓｐ．）の任意の１以上の、１以上の株を含みうる細菌共生体を提供する。そのような場合には、本明細書における細菌共生体はバクテロイデス・フェシス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆａｅｃｉｓ）（ＤＳＭ ２２１７７）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）（ＤＳＭ ３３１７８）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ）（ＤＳＭ ３３１８０）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）（ＤＳＭ ３３１７９）、コプロコッカス・コメス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ）（ＤＳＭ ３３１７６）またはドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）（ＤＳＭ ３３１８８）の任意の１以上を含みうる。本明細書に記載されている細菌共生体に含まれる例示的な株を表１に示す。
【表1】
【0031】
本明細書は、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個の細菌種および／または株を含みうる、それらから本質的になりうる、またはそれらからなりうる細菌共生体を提供する。幾つかの場合には、そのような細菌共生体は、表１から選択される少なくとも１つの細菌株を含みうる。幾つかの実施形態においては、細菌共生体は最大３つの異なる細菌株からなりうる。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている細菌共生体は、表２に挙げられている少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全ての細菌株を含む。幾つかの場合には、細菌共生体は細菌株ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）を含む、またはそれらからなる。
【表2】
【0032】
本開示が提供する細菌共生体は、それが含有する細菌種および／または株のそれぞれの種々のコロニー形成単位（ＣＦＵ）数を含みうる。幾つかの場合には、そのような細菌共生体は、約１０３ＣＦＵ～約１０１２ＣＦＵ、約１０４ＣＦＵ～約１０１２ＣＦＵ、約１０７ＣＦＵ～約１０１１ＣＦＵ、約１０８ＣＦＵ～約１０１０ＣＦＵまたは約１０９ＣＦＵ～約１０１０ＣＦＵの細菌種または株を含みうる。幾つかの実施形態においては、そのような細菌共生体はまた、約１０７ＣＦＵ～約１０１０ＣＦＵの細菌種または株を含みうる。幾つかの場合には、細菌共生体は少なくとも約１０３ＣＦＵ、５×１０３ＣＦＵ、１０４ＣＦＵ、５×１０４ＣＦＵ、１０５ＣＦＵ、５×１０５ＣＦＵ、１０６ＣＦＵ、５×１０６ＣＦＵ、１０７ＣＦＵ、５×１０７ＣＦＵ、１０８ＣＦＵ、５×１０８ＣＦＵ、１０９ＣＦＵ、５×１０９ＣＦＵ、１０１０ＣＦＵ、５×１０１０ＣＦＵ、１０１１ＣＦＵ、５×１０１１ＣＦＵまたは１０１２ＣＦＵ、かつ、約５×１０１２ＣＦＵ以下の細菌種または株を含みうる。細菌共生体はまた、細菌種または株当たり約１０６～約１０１１ＣＦＵを含みうる。幾つかの場合には、細菌共生体は細菌種または株当たり約１０3～約１０１２ＣＦＵを含みうる。幾つかの場合には、細菌共生体は細菌種または株当たり約１０８～約５×１０１０ＣＦＵを含みうる。幾つかの場合には、細菌共生体は細菌種または株当たり約１０7～約５×１０１０ＣＦＵを含みうる。種々の実施形態においては、細菌共生体は細菌種または株当たり約５×１０８ＣＦＵを含みうる。医薬組成物を投与用の単位用量に製剤化する場合には、そのようなＣＦＵ値はそのような剤形の質量単位当たり（例えば、５×１０８ＣＦＵ／ｇ）または体積単位当たり（例えば、５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）でありうる。
【0033】
幾つかの実施形態においては、本開示は、種々の量のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の細菌細胞を含みうる細菌共生体を提供する。そのような細菌共生体は約１０３ＣＦＵ～約１０１２ＣＦＵ、約１０４ＣＦＵ～約１０１２ＣＦＵ、約１０７ＣＦＵ～約１０１１ＣＦＵ、約１０８ＣＦＵ～約１０１０ＣＦＵ、または約１０９ＣＦＵ～約１０１１ＣＦＵの細菌細胞を含みうる。そのような細菌共生体はまた、約１０３ＣＦＵ～約１０１２ＣＦＵの細菌細胞を含みうる。幾つかの実施形態においては、そのような細菌共生体はまた、約１０７ＣＦＵ～約１０１０ＣＦＵの細菌細胞を含みうる。幾つかの場合には、細菌共生体は、少なくとも約１０３ＣＦＵ、５×１０３ＣＦＵ、１０４ＣＦＵ、５×１０４ＣＦＵ、１０５ＣＦＵ、５×１０５ＣＦＵ、１０６ＣＦＵ、５×１０６ＣＦＵ、１０７ＣＦＵ、５×１０７ＣＦＵ、１０８ＣＦＵ、５×１０８ＣＦＵ、１０９ＣＦＵ、５×１０９ＣＦＵ、１０１０ＣＦＵ、５×１０１０ＣＦＵ、１０１１ＣＦＵ、５×１０１１ＣＦＵまたは１０１２ＣＦＵ、かつ、約５×１０１２ＣＦＵ以下の細菌細胞を含みうる。
【0034】
幾つかの実施形態においては、本開示は、約１０３ＣＦＵ～約１０１２ＣＦＵの細菌細胞の総量で存在しうる細菌集団を提供する。幾つかの実施形態においては、細菌集団は少なくとも約１０３ＣＦＵ、５×１０３ＣＦＵ、１０４ＣＦＵ、５×１０４ＣＦＵ、１０５ＣＦＵ、５×１０５ＣＦＵ、１０６ＣＦＵ、５×１０６ＣＦＵ、１０７ＣＦＵ、５×１０７ＣＦＵ、１０８ＣＦＵ、５×１０８ＣＦＵ、１０９ＣＦＵ、５×１０９ＣＦＵ、１０１０ＣＦＵ、５×１０１０ＣＦＵ、１０１１ＣＦＵ、５×１０１１ＣＦＵまたは１０１２ＣＦＵ、かつ、約５×１０１２ＣＦＵ以下の細菌細胞の総量で存在しうる。他の場合には、細菌集団は約１０７ＣＦＵ～約１０１０ＣＦＵの細菌細胞の総量で存在しうる。幾つかの場合には、細菌集団は約１．５×１０９ＣＦＵの細菌細胞の総量で存在しうる。
【0035】
幾つかの場合には、本明細書に記載されている医薬組成物における細菌種または株のＣＦＵ数は、対象のマイクロバイオータ（微生物叢）に存在するその細菌種または株のＣＦＵ数の或る割合でありうる。マイクロバイオータは腸または膣マイクロバイオータでありうる。そのような対象はヒト対象でありうる。したがって、幾つかの場合には、医薬組成物における細菌のＣＦＵとマイクロバイオータにおけるそのような細菌のＣＦＵ数との比は約１：１０４～約１：１０、約１：１０３～約１：１０、約１：１０２～約１：１０、または約１：１０～約５：１でありうる。本開示の特定の実施形態においては、そのような比は少なくとも約０．０００１、０．０００２、０．０００５、０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、１、２、３、３．５、４または５、かつ、１０以下でありうる。
【0036】
本明細書における幾つかの実施形態においては、本開示の医薬組成物において使用される細菌共生体は約５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの細菌株ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）および／またはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）のいずれかを含みうる、またはそれらからなりうる。そのような場合には、細菌共生体は約５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの細菌株ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）からなりうる。
【0037】
本明細書は、１以上の凍結保護物質を含みうる医薬組成物を提供する。そのような凍結保護物質は、そのような組成物が凍結または凍結乾燥される場合、例えば、使用前の輸送および／または貯蔵中に、医薬組成物中の細菌細胞の生存性を維持するために使用されうる。幾つかの場合には、そのような１以上の凍結保護物質はグリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、プロピレングリコール、２－メチル－２，４－ペンタンジオール、トレハロース、スクロース、ジエチルグリコール、トリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、サッカロース、ホルムアミド、グリセロール３－ホスファート、プロリン、メチルアルコール、グルコース、ウシ血清アルブミン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルデンプン、ソルビトールまたはそれらの組合せでありうる。凍結保護物質はアイスブロッカー（ｉｃｅ ｂｌｏｃｋｅｒ）を含みうる。アイスブロッカーはポリグリセロール、ポリビニルアルコール、Ｘ－１０００およびＺ－１０００を含みうる。そのような凍結保護物質は、例えば医薬組成物が固体剤形（例えば、カプセル剤または錠剤）であるか又は液体剤形（例えば、懸濁剤またはゲル剤）であるかに応じて、約５、１０、１５、２０、２５または３０体積パーセント（％ ｖ／ｖ）または重量パーセント（％ ｗ／ｗ）の量で、医薬組成物において使用されうる。凍結保護物質はまた、炭水化物または抗酸化剤を含みうる。炭水化物はトレハロース、スクロース、ソルビトール、グルコース、フルクトース、サッカロースまたはそれらの組合せを含みうる。
【0038】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている医薬組成物は抗酸化剤を更に含む。幾つかの実施形態においては、抗酸化剤はＬ－システインである。幾つかの実施形態においては、Ｌ－システインは重量％として約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、５％、１０％、０．００１％～０．００５％、０．００５１％～０．０１％、０．０１１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．０５１％～０．１％、０．１１％～０．５％、０．５１％～１％、１．１％～１．５％、１．５％～２％、２．１％～５％、または５．１％～約１０％の量で存在する。サッカロースは重量％として約０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、０．１％～１％、１％～５％、５％～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％、３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、５１～６１％、５２～６２％、５３～６３％、５４～６４％、５５～６５％、５６～６６％、５７～６７％、５８～６８％、または５９～６９％の量で存在しうる。トレハロースは重量％として約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２０．５％、２１％、２１．５％、２２％、２２．５％、２３％、２３．５％、２４％、２４．５％、２５％、０．０１％～１５％、０．１％～２０％、０．０１％～０．１％、０．１１％～１％、１～１１％、２～１２％、３～１３％、４～１４％、５～１５％、６～１６％、７～１７％、８～１８％、９～１９％、１０～２０％、１１～２１％、１２～２２％、１３～２３％、１４～２４％、または１５～２５％の量で存在しうる。グリセロールは体積％として約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～２１％、２～２２％、３～２３％、４～２４％、５～２５％、６～２６％、７～２７％、８～２８％、９～２９％、１０～３０％、１１～３１％、１２～３２％、１３～３３％、１４～３４％、１５～３５％、１６～３６％、１７～３７％、１８～３８％、１９～３９％、または２０～４０％の量で存在しうる。
【0039】
本明細書における幾つかの実施形態においては、本明細書における医薬組成物の凍結保護物質はグリセロールである。そのようなグリセロールは、表１から選択される１以上、２以上または３以上の細菌株の細菌共生体を含みうる医薬組成物において約２０％ ｖ／ｖ の量で使用されうる。幾つかの実施形態においては、細菌集団は凍結乾燥されうる。凍結乾燥プロセスは細菌集団の低温脱水を含みうる。幾つかの実施形態においては、凍結乾燥プロセスは、細菌集団を低温および低圧に付すことを含みうる。
【0040】
本明細書は、１以上の抗酸化剤を含みうる医薬組成物を提供する。幾つかの場合には、そのような抗酸化剤は、医薬組成物中に存在しうる嫌気性細菌種および／または株を保護するために使用されうる。そのような場合には、そのような１以上の抗酸化剤は、貯蔵および／もしくは輸送中に嫌気性条件をもたらすために、ならびに／または活性酸素種から細菌細胞を保護するために使用されうる。本明細書における幾つかの実施形態においては、抗酸化剤はアスコルビン酸、ジチオスレイトール、グルタチオン、フェノール酸（例えば、没食子酸、プロトカテク酸、カフェイン酸およびロスマリン酸）、フェノール性ジテルペン（例えば、カルノソルおよびカルノシン酸）、フラボノイド（例えば、ケルセチンおよびカテキン）、揮発性油（例えば、オイゲノール、カルバクロール、サイモールおよびメントール）、α－トコフェロール（例えば、ビタミンＥ）、トロロックス、アスコルビン酸、ビタミンＡ、ビタミンＣ、補酵素Ｑ１０、マンガン、ヨウ化物、メラトニン、アルファ－カロテン、アスタキサンチン、ベータカロチン、カンタキサンチン、クリプトキサンチン、ルテイン、リコペン、ゼアキサンチン、フラボノイド（例えば、フラボン、例えば、アピゲンチン）、ルテオリン、タンゲイチン、フラボノール、イソラムネチン、ケンフェロール、ミリセチン、プロアントシアニジン、ケルセチン、エリオジクチオール、ヘスペレチン、ナリンゲニン、カテキン、ガロカテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、テアフラビン、テアルビジン、イソフラボン植物エストロゲン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、スチルベノイド、例えばレスベラトロール、プテロスチルベン、アントシアニン、シアニジン、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、チコリ酸、クロロゲン酸、桂皮酸、エラグ酸、エラジタンニン、没食子酸、ガロタンニン、ロスマリン酸、クルクミン、キサントン、カプサイシン、ビリルビン、クエン酸、シュウ酸、フィチン酸、Ｎ－アセチルシステイン、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタマート、Ｌ－プロリン、Ｒ－α－リポ酸、アントシアニン、銅、クリプトキサンチン、フラボノイド、インドール、イソフラボノイド、リグナン、セレン、亜鉛、またはそれらの組合せでありうる。そのような１以上の抗酸化剤は約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％または０．５％ ｗ／ｗの量で医薬組成物中に存在しうる。Ｌ－グルタマートは重量％として約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６％、６．１％、６．２％、６．３％、６．４％、６．５％、６．６％、６．７％、６．８％、６．９％、７％、８％、９％、１０％、１～５％、１．１～５．１％、１．２～５．２％、１．３～５．３％、１．４～５．４％、１．５～５．５％、１．６～５．６％、１．７～５．７％、１．８～５．８％、１．９～５．９％、２～６％、２．１～６．１％、２．２～６．２％、２．３～６．３％、２．４～６．４％、２．５～６．５％、２．６～６．６％、２．７～６．７％、２．８～６．８％、２．９～６．９％、３～７％、３．１～７．１％、３．２～７．２％、３．３～７．３％、３．４～７．４％、３．５～７．５％、３．６～７．６％、３．７～７．７％、３．８～７．８％、３．９～７．９％、または４～８％の量で存在しうる。幾つかの場合には、凍結保護物質は重量％として約６０％ サッカロース、約１０％ トレハロース、約１％ Ｌ－システインおよび約４％ Ｌ－グルタマートを含みうる。
【0041】
本明細書は、水性バッファー溶液を含みうる医薬組成物を提供する。そのような水性培地は細菌細胞のための主要な貯蔵および輸送培地として使用されうる。したがって、バッファーは、本明細書に記載されている医薬組成物を形成するように溶解または懸濁された細菌共生体、凍結保護物質および抗酸化剤の任意の１以上を含有しうる。幾つかの場合には、水性バッファー溶液はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳまたはトリスバッファー、任意の他の適切なバッファーまたはそれらの任意の組合せでありうる。幾つかの実施形態においては、バッファーはＰＢＳであり、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を含む。他の場合には、バッファーはＰＢＳであることが可能であり、約６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９または９のｐＨを有しうる。
【0042】
したがって、本明細書における幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）のそれぞれの約５×１０８ＣＦＵからなる細菌共生体、凍結保護物質としての約２０％ ｖ／ｖ グリセロール、抗酸化剤としての０．１％ ｗ／ｗ Ｌ－システイン、ならびに１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を含有するＰＢＳバッファーを含む。そのような医薬組成物は、本明細書に記載されている方法および組成物を使用して、製造されること、および経口投与可能な剤形に製剤化されることが可能である。
【0043】
本明細書は、対象への投与のために製剤化されうる医薬組成物を提供する。対象はヒト対象でありうる。投与には、非経口投与および経口投与が含まれうる。非経口投与は、例えば坐剤の形態で、種々の非経口経路で医薬組成物を投与することを含みうる。種々の他の場合には、本明細書に記載されている医薬組成物は経口剤形に製剤化されうる。そのような経口剤形には、カプセル剤、錠剤、乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ゲル剤、ガム、ペースト剤、ハーブティー、滴剤、溶解性顆粒剤、散剤、錠剤、凍結乾燥物および他の任意の適切な経口剤形が含まれうる。カプセル（カプセル剤）は植物由来材料を含みうる。植物由来材料は、セルロースベースの重合体を含みうる。カプセルはまた、ゼラチン；ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）；デンプン；動物由来またはセルロースベースの加水分解コラーゲン（酸、アルカリ、酵素または熱加水分解）；プルラン；タピオカ；またはそれらの任意の組合せを含みうる。セルロースベースの重合体はプルランを含みうる。カプセルは腸溶コーティングされうる。腸溶コーティングカプセルは脂肪酸、ワックス、シェラック、プラスチック、植物繊維またはそれらの任意の組合せを含みうる。カプセルは０００、００、０、１、２、３、４または５の空丸剤カプセルサイズ（Ｅｍｐｔｙ Ｐｉｌｌ Ｃａｐｓｕｌｅ Ｓｉｚｅ）のサイズを有しうる。カプセルはデンプン非含有、グルテン非含有、保存剤非含有でありうる。カプセルに未製剤化アセトアミノフェンが充填された場合のアセトアミノフェンの溶解による測定で、カプセルの９０％超が水、ｐＨ＝１．２の溶液、酢酸ナトリウムバッファーＵＳＰ（ｐＨ＝４．５）またはリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝７．２）に６０分以内に溶解する。カプセルは、脱イオン水を使用した３７℃での測定で約１．６分の崩壊エンドポイントを有しうる。カプセルは、脱イオン水を使用した３７℃での測定で、約０．１、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、３．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９または４分の崩壊エンドポイントを有しうる。カプセルは、脱イオン水を使用した３７℃での測定で、０．１～０．５分、０．５１～０．６分、０．６１～０．７分、０．７１～０．８分、０．８１～０．９分、０．９１～１分、１．０１～１．１分、１．１１～１．２分、１．２１～１．３分、１．３１～１．４分、１．４１～１．５分、１．５１～１．６分、１．６１～１．７分、１．７１～１．８分、１．８１～１．９分、１．９１～２分、２．０１～２．１分、２．１１～２．２分、２．２１～２．３分、２．３１～２．４分、２．４１～２．５分、２．５１～２．６分、２．６１～２．７分、２．７１～２．８分、２．８１～２．９分、２．９１～３分、３．０１～３．１分、３．１１～３．２分、３．２１～３．３分、３．３１～３．４分、３．４１～３．５分、３．５１～３．６分、３．６１～３．７分、３．７１～３．８分、３．８１～３．９分、または３．９１～４分の崩壊エンドポイントを有しうる。カプセルは、カプセル内のガス組成による測定で、０．５以下の酸素透過性（ｃｍ３／ｍ２／日）を有しうる。カプセルは、カプセル内のガス組成による測定で、０．０００１以下、０．０００５以下、０．００１以下、０．００５以下、０．０１以下、０．０５以下、０．１以下、０．５以下、１以下、１．５以下、２以下、５以下または１０以下の酸素透過性（ｃｍ３／ｍ２／日）を有しうる。
【0044】
更に、本明細書は、凍結されうる医薬組成物の経口製剤を提供する。そのような凍結製剤は、対象、例えばヒト対象に、凍結状態で投与されうる。幾つかの場合には、そのような凍結製剤はアイスキャンデー、アイスクリームまたは他の凍結製剤でありうる。
【0045】
本明細書における種々の実施形態においては、本開示の医薬組成物は対象への経口投与用の液体懸濁液におけるものでありうる。そのような液体懸濁液は、そのような経口剤形の単位用量を得るために、特定の体積に分注（アリコート化）されうる。そのような単位用量は約０．２５、０．５、１、２、３、５または１０ｍＬの体積を有しうる。幾つかの場合には、本明細書における医薬組成物の単位用量は約１ｍＬの体積を有する。そのような医薬組成物は細菌共生体、凍結保護物質、抗酸化剤、水性バッファー溶液（これは液体細胞懸濁液からのものでありうる）を含みうる。そのような細胞懸濁液は、本明細書に記載されているとおりの細菌株当たりの特定の数の代謝活性細胞をそれが含有することを確認するために、品質管理のために試験されうる。
【0046】
幾つかの実施形態においては、本明細書は、対象への経口投与のための単位用量に製剤化された医薬組成物を提供する。そのような経口製剤は、細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）のそれぞれの約５×１０８ＣＦＵ、約２０％ ｖ／ｖ グリセロール、約０．１％ ｗ／ｗ Ｌ－システイン、ならびに１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を含有するＰＢＳバッファーを含みうる、またはそれらからなりうる。そのような経口製剤は約１ｍＬの総体積を有しうる。
【0047】
本明細書は、本明細書に記載されている医薬組成物の製造方法を提供する。幾つかの場合には、そのような医薬組成物は、１以上の細菌種および／または株を含む細菌共生体を含む。幾つかの場合には、そのような１以上の細菌株はラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）および／またはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の任意の１以上を含みうる。そのような医薬組成物の製造は幾つかの工程を含みうる。そのような工程は、増殖培地の調製、接種および培養、細菌細胞の回収、ならびに医薬組成物において使用される調製細菌株バッチを一緒にすることによる細菌共生体の合体を含みうる。幾つかの場合には、そのような製造方法はヒト対象における臨床使用のための医薬組成物の製造に使用されうる。
【0048】
細菌共生体を製造するための本開示の方法は培地調製を含むことが可能であり、これは、種々の乾燥培地成分、例えば塩、ビタミン、抗酸化剤などをＵＳＰ等級の注射用水に溶解することを含みうる。完全溶解後、それぞれの細菌細胞の最適な増殖が確保されうるよう、培地のｐＨを調整することが可能である。ついでｐＨ調整培地を生物安全性（バイオセイフティー）キャビネットに移し、滅菌することが可能である。種々の場合に、本明細書における微生物共生体は１以上の嫌気性細菌株を含みうる。そのような場合、嫌気性細菌の接種の前に、培地を、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（約９０：５：５）の雰囲気を含む嫌気性チャンバーに移して、還元することが可能である。
【0049】
本明細書における製造方法は、細菌株／種の出発培養を作製することを含みうる。そのような方法は、濾過培地を含有する各フラスコからの特定の体積を用いることにより、医薬組成物に含まれるべき細菌株の出発培養を作製し、そのような体積を、滅菌済み予め還元されたスクリューキャップチューブに移し、ついで、それぞれの細菌細胞を含有する細胞バンクからのストック溶液を使用して、解凍細菌細胞を移すことを含みうる。嫌気性細菌細胞を使用する場合、出発培養を嫌気性条件下で約３７℃で約１２～１６時間培養することが可能である。特定のインキュベーション時間の後、出発培養を増殖（濁度）に関して視覚的に検査し、細菌増殖が確認されたら、更なる細胞増殖のために追加的なより大きな培養フラスコ内に移すことが可能である。約１２、１８、２４、３０時間のインキュベーションの後、細胞培地の細胞密度および吸光度を測定することが可能である。そのような測定は、特定されたＯＤ６００の範囲内に吸光度が収まることを確認するために、６００ナノメートルで細胞懸濁液の吸光度を測定することにより行われうる。そのようなＯＤ６００の値または範囲は細菌株に特異的でありうる。例えば、表１に示されている各細菌株は、特異的なＯＤ６００値または範囲を有しうる。そのようなＯＤ６００の範囲は約０．５～約１．５、約０．７～約１．３、または約０．９～約１．１でありうる。ＯＤ６００測定の後、遠心分離のような種々の技術を用いて、細菌細胞を回収することが可能である。
【0050】
幾つかの場合には、細胞の回収のために、適切な遠心分離パラメーターが選択されうる。例えば、幾つかの場合には、表１に挙げられている細菌株のいずれかを、細胞が上清から分離されうることを保証する、約５，０００～１０，０００×ｇで約４℃で約２０～６０分間の回転を含むパラメーターを使用して回収することが可能である。遠心分離後、得られた細胞ペレットを嫌気性環境（例えば、嫌気性チャンバー）内に戻し、清澄化培養上清を、例えば、滅菌血清ピペットを使用して、そのようなペレットから完全に除去することが可能である。ついで、細胞ペレットを、濃縮された予め還元された凍結保護物質溶液に再懸濁させることにより混合することが可能である。幾つかの場合には、そのような懸濁液は、増殖中の細胞懸濁液の約２０～４０倍の濃度であることが可能であり、予め還元された凍結保護物質溶液は約２０％ ｖ／ｖ グリセロールまたは別の凍結保護物質を含みうる。ついで濃縮細胞懸濁液を、アリコート、例えば予め還元され予めラベル付けされた２ｍＬスクリューキャップ クライオバイアルに分注し、約－７０℃以下の予めラベル付けされた保管ボックスに移すことが可能である。そのような細菌細胞を医薬組成物において使用する可能性がある場合には、製造および約－７０℃以下での初期貯蔵の約３日後、仕様試験が行われうる。
【0051】
本明細書は、医薬組成物において使用される１以上の種および／または株の細胞集団または細胞バッチの製造方法を提供する。種々の場合には、表１に示されている細菌株のいずれかを、本明細書に記載されている製造方法において使用することが可能である。特定の場合には、株ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）および／またはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）（表２）の１以上を、医薬組成物において使用される細胞バッチを製造するために使用することが可能である。そのような場合には、本開示はそのような細胞バッチの製造方法を提供する。
【0052】
本明細書は、本明細書に記載されている医薬組成物において使用されうるラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞バッチの製造方法を提供する。そのような方法は、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞培地を調製することを含みうる。そのような培地はｖＭＲＳ培地またはブイヨンｖＭＲＳブロスでありうる。幾つかの場合には、そのような培地はＨｉＭｅｄｉａ ｖＭＲＳブロスではない。そのような培地は、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）株に特異的であり、ｖＭＲＳ粉末およびリン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）を含みうる。そのような場合、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞を増殖および培養するための培地は約２５０～３００ｇのｖＭＲＳ粉末およびリン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）を含みうる。特定の場合には、そのような培地は約２７３ｇのｖＭＲＳ粉末および約１２．５ｇのリン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）および約４．９Ｌの水を含みうる。そのようなｖＭＲＳ培地のｐＨは、例えば５Ｍ 塩酸塩溶液または氷酢酸を使用して、約６．５±０．１に調整されうる。ついで、培地を濾過し、嫌気性状態へと還元し、例えば、ストック ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）溶液を含有する出発培養チューブに移し、３７℃で約１６～２０時間インキュベートすることが可能である。インキュベーションおよび増殖の後、６００ｎｍでの細胞培養の吸光度を測定し、３回重複して測定して、実施細胞懸濁液の吸光度が約０．８～約１．６、好ましくは約１．０～１．４の範囲内にあることを確認することが可能である。培養フラスコの内容物を遠心分離し、残留細胞ペレットを、抗酸化剤および凍結保護物質（例えば、２０％ ｖ／ｖ グリセロール）を含有する２５ｍＬの無菌ＰＢＳに再懸濁させ、ついで一緒にして、均質な細胞懸濁液を得ることが可能である。ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞懸濁液は、最終的な細胞濃度を得るために、例えば、クライオバイアル内に分注されうる。そのような最終的なラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の細胞濃度は単位用量当たり約５×１０８～約１０１０のラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）生細胞でありうる。そのような単位用量は約１ｍＬの体積を有しうる。そのような場合、単位用量は約５×１０８のラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）生細胞を含みうる。
【0053】
更に、本明細書は、本明細書に記載されている医薬組成物において使用されうるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞バッチの製造方法を提供する。そのような方法は、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞培地を調製することを含みうる。幾つかの場合には、そのようなアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）培地は改変ＮＡＧＴ培地でありうる。そのような改変ＮＡＧＴ培地はソイトーンもしくはＮ－アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）、またはソイトーンとＮＡＧとの両方を含みうる。幾つかの場合には、そのような改変ＮＡＧＴ培地はマグネシウム、カルシウム、グルコースまたはそれらの組合せを含有しないことが可能である。幾つかの場合には、改変ＮＡＧＴ培地は細胞増殖の改善をもたらしうる。そのような改善された細胞増殖は、非改変ＮＡＧＴ培地における細胞増殖と比較して、約３０％、３５％、４０％、４５％または５０％高くなりうる。
【0054】
したがって、幾つかの場合には、そのようなＮＡＧＴ培地はアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）株（ＤＳＭ ３３２１３）に特異的であることが可能であり、以下の成分のうちの任意の１以上を含みうる：ソイトーン、エンドウマメペプトン、酵母エキス、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸マグネシウム（例えば、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、グルコース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｌ－スレオニンおよび／またはＬ－システイン。そのような場合には、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞を増殖および培養するための約５Ｌの体積の改変ＮＡＧＴ培地は、約７５ｇ～１００ｇのＳＯＬＡＢＩＡエンドウマメペプトン、約７５ｇ～約８５ｇのＤｉｆｃｏ（商標）セレクト・ソイトーン（Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｏｙｔｏｎｅ）、約１０ｇ～約１５ｇのＢａｃｔｏ（商標）酵母エキス、約２ｇ～約８ｇの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、約１０ｇ～約１５ｇの二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、約０．５ｇ～約５ｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、約０．５ｇ～約５ｇの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、約０．５ｇ～約５ｇの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、約２０ｇ～約２５ｇのグルコース（デキストロース）、約２５ｇ～約３０ｇのＮ－アセチルグルコサミン、約１５ｇ～約２５ｇのＬ－スレオニンおよび／または約２ｇ～約８ｇのＬ－システイン。一例においては、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞を増殖および培養するための約５Ｌの体積の改変ＮＡＧＴ培地は約８２．５ｇのＳＯＬＡＢＩＡエンドウマメペプトン、８２．５ｇのＤｉｆｃｏ（商標）セレクト・ソイトーン、約１２．５ｇのＢａｃｔｏ（商標）酵母エキス、約５ｇの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、約１２．５ｇの二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、約１．５ｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、約０．５ｇの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、約０．５ｇの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、約２２．６ｇのグルコース（デキストロース）、約２７．７ｇのＮ－アセチルグルコサミン、約２０ｇのＬ－スレオニンおよび／または約５ｇのＬ－システインを含みうる。
【0055】
そのようなＮＡＧＴ培地のｐＨは、例えば、５Ｍ 塩酸塩溶液を使用して、例えば、約６．５±０．１に調整されうる。そのようなＮＡＧＴ培地のｐＨも約７に調整されうる。アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細菌細胞を、そのようなＮＡＧＴ増殖培地を含有する調製済みバイアル内に添加することが可能である。アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）株に特異的でありうる期間のインキュベーションの後、約０．５～約１．２、好ましくは約０．７～１．１の吸光度値が得られるように、６００ｎｍにおける細胞培養の吸光度を測定し、記録することが可能である。ついで培養フラスコの内容物を遠心分離し、上清を除去し、残留細胞ペレットを、抗酸化剤および凍結保護物質、例えば２０％ ｖ／ｖ グリセロールを含有する無菌ＰＢＳに再懸濁させることが可能である。単位用量当たり約５×１０８～約１０１０のアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）生細胞の最終的なアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞濃度が得られるよう、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞懸濁液をクライオバイアルに分注することが可能である。そのような単位用量は約１ｍＬの体積を有しうる。そのような場合には、単位用量は約５×１０８のアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）生細胞を含みうる。
【0056】
更に、本明細書は、本明細書に記載されている医薬組成物の細菌共生体において使用されうるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞バッチの製造方法を提供する。そのような方法は、完全ビタミンミックス溶液（例えば、ＹＦＡＰビタミンミックス）およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞培地を調製することを含みうる。ＹＦＡＰビタミンミックスはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）株に特異的であることが可能であり、ビオチン、コバラミン、ｐ－アミノ安息香酸、葉酸、ピリドキサミン、チアミンおよび／またはリボフラビンの任意の１以上を含みうる。そのような場合、１Ｌの体積のＹＦＡＰビタミンミックスは約１０ｍｇのビオチン、約１０ｍｇのコバラミン、約３０ｍｇのｐ－アミノ安息香酸、約５０ｍｇの葉酸、約１５０ｍｇのピリドキサミン、約５０ｍｇのチアミンおよび約５０ｍｇのリボフラビンを含みうる。全ての培地成分を溶解して、固形物および沈殿物を含有しない透明溶液を得ることが可能である。後記のとおり、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）培地における使用のために、ＹＦＡＰビタミンミックス培地を濾過し、滅菌することが可能である。
【0057】
そのようなフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）培地は、ＢＢＬ（商標）フィトンペプトン、ＳＯＬＡＢＩＡエンドウマメペプトン、Ｄｉｆｃｏ（商標）セレクト・ソイトーン、Ｂａｃｔｏ（商標）酵母エキス、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、グルコース（デキストロース）、プロピオン酸ナトリウム、Ｌ－システインおよび／またはＹＦＡＰビタミンミックス溶液（例えば、前記のとおりに調製されるもの）の任意の１以上を含むように調製されうる。そのような場合、約５Ｌの体積のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）培地は約７５ｇ～１００ｇのＳＯＬＡＢＩＡエンドウマメペプトン、約４５ｇ～約５５ｇのＢＢＬ（商標）フィトンペプトン、４５ｇ～約５５ｇのＤｉｆｃｏ（商標）セレクト・ソイトーン、約２０ｇ～約３０ｇのＢａｃｔｏ（商標）酵母エキス、約２ｇ～約８ｇの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、約１０ｇ～約１５ｇの二塩基性カリウムリン酸塩（Ｋ２ＨＰＯ４）、約２ｇ～約８ｇの塩化ナトリウム、約０．５ｇ～約２ｇの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、約２０ｇ～約３０ｇの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、約４０ｇ～約６０ｇのグルコース（デキストロース）、約２ｇ～約８ｇのプロピオン酸ナトリウム、約２ｇ～約８ｇのＬ－システイン、および約０．５～約３ｍＬのＹＦＡＰビタミンミックス溶液（例えば、前記のとおりに調製されたもの）を含む。したがって、一例においては、約５Ｌの体積のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）培地は約１００ｇのＳＯＬＡＢＩＡエンドウマメペプトン、５０ｇのＢＢＬ（商標）フィトンペプトン、約５０ｇのＤｉｆｃｏ（商標）セレクト・ソイトーン、約２５ｇのＢａｃｔｏ（商標）酵母エキス、約５ｇの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、約１２．５ｇの二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、約５ｇの塩化ナトリウム、約１ｇの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、約２５ｇの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、約５０ｇのグルコース（デキストロース）、約５ｇのプロピオン酸ナトリウム、約５ｇのＬ－システインおよび約１ｍＬのＹＦＡＰビタミンミックス溶液（例えば、前記のとおりに調製されたもの）を含みうる。
【0058】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）培地ＹＦＡＰ－ＮＵは、エンドウマメペプトン、ＮｕＣｅｌ（登録商標）７８３酵母エキス、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、グルコース（デキストロース）、Ｌ－システインおよび／またはコバラミンの任意の１以上を含むように調製されることも可能である。そのような場合には、約５Ｌの体積のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）培地は約７５ｇ～１００ｇのエンドウマメペプトン、約５０ｇのＮｕＣｅｌ（登録商標）７８３酵母エキス、５ｇの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、約１２．５ｇの二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、約５ｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、約１ｇの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、約２５ｇの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、約５０ｇのグルコース（デキストロース）、約５ｇのＬ－システインおよび約５ｇのコバラミンを含みうる。
【0059】
そのような細胞培地のｐＨは、例えば、氷酢酸を使用して、約６．５±０．１に調整されうる。そのようなｐＨは、使用される細菌株に応じて、約６．２～約６．８で変動しうる。幾つかの場合には、細胞培地のｐＨは調整されなくてもよい。そのようなｐＨは約４．５～約７．５で変動しうる。幾つかの実施形態においては、そのような培地のｐＨは約５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４または７．５でありうる。嫌気性状態への還元の後、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の出発培養は、特定の量のストックフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）溶液、例えば約５００μＬの細胞バンクストック溶液を、還元培地を含有する出発培養チューブに加え、ついで３７℃で約１２～１６時間インキュベートすることにより調製されうる。出発培養の増殖の後（例えば、更に約１２～２４時間のインキュベーションの後）、６００ｎｍにおける細胞培養の吸光度を測定し、３回重複して測定して、吸光度が特定の範囲内にあることを確認する。そのような吸光度の範囲は約１．２～約２．０、好ましくは約１．４～約１．８でありうる。ついで培養フラスコを遠心分離し、上清を除去し、残留細胞ペレットを無菌ＰＢＳに再懸濁させて、均質な溶液を得ることが可能である。幾つかの場合には、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞懸濁液をクライオバイアル（例えば、２ｍＬクライオバイアル）に分注して、最終的なフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞濃度を単位用量当たり約５×１０８～約１０１０のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）生細胞とすることが可能である。そのような単位用量は約１ｍＬの体積を有しうる。そのような場合、そのような単位用量は約５×１０８のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞を含みうる。
【0060】
本開示はまた、医薬組成物において使用される細菌共生体に含まれるべき株の、１以上の細胞バッチを構築することを含む方法を提供する。例えば、幾つかの場合には、そのような方法は、表１の１以上の細菌株の細胞集団を構築することを含む。そのような場合、株ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の任意の１以上のために製造された細胞バッチを一緒にして、医薬組成物において使用される細菌共生体を形成されることが可能である。
【0061】
そのような方法は、細菌株の各細胞集団における代謝活性細胞の量を決定することを含みうる。医薬組成物の細菌共生体が３つの細菌株ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）を含む又はそれらからなる場合、調製された細胞バッチのそれぞれにおける代謝活性細菌細胞の数が決定されうる。そのような測定は、任意の適切な方法、例えば、本明細書に記載されている方法を使用して行われうる。そのような測定から得られた情報を使用して、細菌株［例えば、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）および／またはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）］の所与バッチから調製されうる単位用量の量を決定することが可能である。例えば、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）バッチから調製されうる単位用量の量は以下のとおりに決定されうる。ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）バッチからの潜在的用量数＝（（ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）平均効力（ＣＦＵ／ｍＬ）×（ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）バッチ体積（ｍＬ）））／（４×１０８ＣＦＵ／用量）。
【0062】
したがって、幾つかの実施形態においては、本明細書における医薬組成物の細菌共生体は細菌種または株当たり約５×１０８ＣＦＵを含みうる。各株から生じうる潜在的単位用量数が計算されたら、それぞれの株の細胞を含有するそれぞれのバイアルを冷凍庫から取り出し、アンティチェンバー（ａｎｔｅｃｈａｍｂｅｒ）内で予め還元させた後、先に進めることが可能である。還元および解凍の後、各株の細胞懸濁液体積の計算量を１Ｌのガラスボトルに移し、ＰＢＳのようなバッファーを使用して体積を増加させて、計算細胞濃度／ミリリットルとすることが可能である。幾つかの場合には、そのような計算濃度は約５×１０８ＣＦＵ／細菌種／ｍＬ医薬品組成物でありうる。得られた均質懸濁液を、クライオバイアルを使用して単位用量に分注し、対象への投与のような更なる使用まで－８０℃で貯蔵することが可能である。
【0063】
本明細書において提供される細菌共生体の製造方法は、それぞれの組成物における細菌株の細胞が生存可能であり、正しい株に対応することを保証するために、品質管理を行うことを更に含みうる。そのような品質管理方法においては、種々のパラメーター、試験方法および仕様が各株バッチに関して評価されうる。そのような評価は対象への医薬組成物の投与の前に行われうる。例示的な品質管理パラメーターには、（ｉ）細菌株の濃度、および（ｉｉ）コロニー増殖の目視検査による形態学的特徴が含まれうる。例えば、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞コロニーの形態学的特徴には、環状、縁全体、平坦、小ないし中程度のサイズ、クリーム色ないし黄褐色が含まれうる。アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞コロニーの形態学的特徴には、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞の場合、環状、縁全体、隆起、点状サイズ、不透明ないし半透明が含まれうる。そしてラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞コロニーの形態学的特徴には、環状、縁全体、隆起、小ないし中程度、白色ないしクリーム色が含まれうる。
【0064】
本明細書は、医薬組成物の貯蔵および／または輸送を可能にするように設計され製造されうる医薬組成物を提供する。幾つかの場合には、細菌共生体を含む本明細書における医薬組成物は、医薬組成物における細菌細胞の生存率が貯蔵および／または輸送によって全く又は最小限でしか影響を受けないように設計されうる。そのような場合、医薬組成物における細菌細胞の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の生存率が貯蔵および／または輸送中に維持される。
【0065】
幾つかの場合には、本明細書における医薬組成物は、細菌細胞の生存性を維持するために、約－７０℃または－８０℃の低温での貯蔵を可能にする凍結保護物質を含む。そのような場合、医薬組成物は凍結保護物質として約２０％ ｖ／ｖ のグリセロールを含みうる。本明細書における医薬組成物は、貯蔵用または輸送用バイアル内の嫌気性環境を維持しうる抗酸化剤であって、活性酸素種から細菌細胞を保護しうる抗酸化剤を更に含みうる。
【0066】
一例においては、本明細書における医薬組成物において、生きた栄養性細菌は、それらの生存性を維持するために、２０％ ｖ／ｖ グリセロールと０．１％ ｗ／ｗ システインとを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で凍結貯蔵されうる。そのような場合、生細菌は、表１に示されている株の任意の１以上に属しうる。
【0067】
本開示は、本明細書に記載されている医薬組成物と組合せて使用されうる容器およびキットを提供する。本開示は更に、該医薬組成物を含むそのような容器およびキットを使用するように使用者（例えば、使用する人たち）に指示しうる説明を提供する。
【0068】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている医薬組成物は容器内に存在する。容器は、本開示の医薬組成物を培養（増殖）、貯蔵、輸送、分注（アリコート化）および／または投与するために使用されうる。例えば、そのような容器は、医薬組成物を対象に投与するために使用されうる。一例においては、容器はクライオバイアルであり、ヒト対象に医薬組成物を投与するために使用されうる。本明細書に記載されている容器はまた、細菌集団、例えば１以上の嫌気性細菌細胞を含む集団の増殖、輸送および／または貯蔵（例えば、冷却または凍結貯蔵）に適した条件を提供しうる。そのような嫌気性細菌細胞には、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）および／またはラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞の任意の１以上が含まれうる。そのような場合、容器は、細菌細胞の生存性を維持するために、医薬組成物の増殖、輸送および／または貯蔵中に特定の酸素含量または濃度を提供するために使用されうる。幾つかの場合には、本明細書における容器は医薬組成物における細菌細胞の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の生存率を維持しうる。幾つかの場合には、容器は細菌細胞の約９５％の生存率を少なくとも約１週間、２週間、４週間、８週間または１２週間維持しうる。容器は更に、対象へのそのような医薬組成物の投与のための適切な体積、量および投与スケジュールを提供するために使用されうる。そのような場合、容器またはそのような容器を含むキットはヒト対象による自己投与のために設計されうる。そのような自己投与のための説明が使用説明として提供可能であり、本明細書に記載されているキットの一部でありうる。種々の場合において、そのような説明は書面による説明もしくは口頭による説明またはそれらの組合せでありうる。
【0069】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている医薬組成物は容器内に存在する。容器は２ｍＬのポリプロピレン製スクリューキャップバイアルを含みうる。バイアルは単一用量（単回投与）バイアルまたは複数用量バイアルでありうる。幾つかの場合には、容器はまた、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）、環状オレフィン重合体（ＣＯＰ）、ポリプロピレン、ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、エチレン－ビニルアルコール（ＥＶＯＨ）ベースの材料、ガラス、プラスチックチューブ、ジャー、アルミニウムチューブ、ディスペンサーチューブまたはそれらの任意の組合せを含みうる。バイアルの体積は１／５０、１／１０、１／５、１／３、１／２、５／８、１、２、３、４、８、１１、１３、１６、２０、３０、４０、５０ ＤＲＡＭでありうる。バイアルの体積はまた、０．０１ｍｌ、０．０５ｍｌ、０．１ｍｌ、０．２ｍｌ、０．３ｍｌ、０．４ｍｌ、０．５ｍｌ、０．６ｍｌ、０．７ｍｌ、０．８ｍｌ、０．９ｍｌ、１ｍｌ、１．１ｍｌ、１．２ｍｌ、１．３ｍｌ、１．４ｍｌ、１．５ｍｌ、１．６ｍｌ、１．７ｍｌ、１．８ｍｌ、１．９ｍｌ、２ｍｌ、２．１ｍｌ、２．２ｍｌ、２．３ｍｌ、２．４ｍｌ、２．５ｍｌ、２．６ｍｌ、２．７ｍｌ、２．８ｍｌ、２．９ｍｌ、３ｍｌ、３．１ｍｌ、３．２ｍｌ、３．３ｍｌ、３．４ｍｌ、３．５ｍｌ、３．６ｍｌ、３．７ｍｌ、３．８ｍｌ、３．９ｍｌ、４ｍｌ、４．１ｍｌ、４．２ｍｌ、４．３ｍｌ、４．４ｍｌ、４．５ｍｌ、４．６ｍｌ、４．７ｍｌ、４．８ｍｌ、４．９ｍｌ、５ｍｌ、５．１ｍｌ、５．２ｍｌ、５．３ｍｌ、５．４ｍｌ、５．５ｍｌ、５．６ｍｌ、５．７ｍｌ、５．８ｍｌ、５．９ｍｌ、６ｍｌ、６．１ｍｌ、６．２ｍｌ、６．３ｍｌ、６．４ｍｌ、６．５ｍｌ、６．６ｍｌ、６．７ｍｌ、６．８ｍｌ、６．９ｍｌ、７ｍｌ、７．１ｍｌ、７．２ｍｌ、７．３ｍｌ、７．４ｍｌ、７．５ｍｌ、７．６ｍｌ、７．７ｍｌ、７．８ｍｌ、７．９ｍｌ、８ｍｌ、８．１ｍｌ、８．２ｍｌ、８．３ｍｌ、８．４ｍｌ、８．５ｍｌ、８．６ｍｌ、８．７ｍｌ、８．８ｍｌ、８．９ｍｌ、９ｍｌ、９．１ｍｌ、９．２ｍｌ、９．３ｍｌ、９．４ｍｌ、９．５ｍｌ、９．６ｍｌ、９．７ｍｌ、９．８ｍｌ、９．９ｍｌまたは１０ｍｌでありうる。バイアルの体積はまた、０．０１～０．１ｍｌ、０．１１～１ｍｌ、１．１～１．１１、１．１１～１．２、１．２１～１．３、１．３１～１．４、１．４１～１．５、１．５１～１．６、１．６１～１．７、１．７１～１．８、１．８１～１．９、１．９１～２、２．０１～２．１、２．１１～２．２、２．２１～２．３、２．３１～２．４、２．４１～２．５、２．５１～２．６、２．６１～２．７、２．７１～２．８、２．８１～２．９、２．９１～３、３．０１～３．１、３．１１～３．２、３．２１～３．３、３．３１～３．４、３．４１～３．５、３．５１～３．６、３．６１～３．７、３．７１～３．８、３．８１～３．９、３．９１～４、４．０１～４．１、４．１１～４．２、４．２１～４．３、４．３１～４．４、４．４１～４．５、４．５１～４．６、４．６１～４．７、４．７１～４．８、４．８１～４．９、４．９１～５、５．０１～５．１、５．１１～５．２、５．２１～５．３、５．３１～５．４、５．４１～５．５、５．５１～５．６、５．６１～５．７、５．７１～５．８、５．８１～５．９、５．９１～６、６．０１～６．１、６．１１～６．２ｍｌ、６．２１～６．３ｍｌ、６．３１～６．４ｍｌ、６．４１～６．５ｍｌ、６．５１～６．６ｍｌ、６．６１～６．７ｍｌ、６．７１～６．８ｍｌ、６．８１～６．９ｍｌ、６．９１～７ｍｌ、７．０１～７．１ｍｌ、７．１１～７．２ｍｌ、７．２１～７．３ｍｌ、７．３１～７．４ｍｌ、７．４１～７．５ｍｌ、７．５１～７．６ｍｌ、７．６１～７．７ｍｌ、７．７１～７．８ｍｌ、７．８１～７．９ｍｌ、７．９１～８ｍｌ、８．０１～８．１ｍｌ、８．１１～８．２ｍｌ、８．２１～８．３ｍｌ、８．３１～８．４ｍｌ、８．４１～８．５ｍｌ、８．５１～８．６ｍｌ、８．６１～８．７ｍｌ、８．７１～８．８ｍｌ、８．８１～８．９ｍｌ、８．９１～９ｍｌ、９．０１～９．１ｍｌ、９．１１～９．２ｍｌ、９．２１～９．３ｍｌ、９．３１～９．４ｍｌ、９．４１～９．５ｍｌ、９．５１～９．６ｍｌ、９．６１～９．７ｍｌ、９．７１～９．８ｍｌ、９．８１～９．９ｍｌまたは９．９１～１０ｍｌでありうる。
【0070】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている医薬組成物は凍結乾燥または凍結される。凍結乾燥または凍結された医薬組成物における細菌細胞は－７０℃で貯蔵されうる。幾つかの実施形態においては、細菌細胞は１０℃、４℃、０℃、－５℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－３５℃、－４０℃、－４５℃、－５０℃、－５５℃、－６０℃、－６５℃、－７０℃、－７５℃または－８０℃で貯蔵されうる。その他の場合には、細菌細胞はまた、－８０℃～－７０℃、－７０℃～－６０℃、－６０℃～－５０℃、－５０℃～－４０℃、－４０℃～－３０℃、－３０℃～－２０℃、－２０℃～－１０℃、－１０℃～０℃、または０℃～１０℃で貯蔵されうる。幾つかの実施形態においては、貯蔵された凍結乾燥または凍結細菌細胞の少なくとも７０％は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月、２５ヶ月、２６ヶ月、２７ヶ月、２８ヶ月、２９ヶ月、３０ヶ月、３１ヶ月、３２ヶ月、３３ヶ月、３４ヶ月、３５ヶ月または３６ヶ月後に尚も生存可能でありうる。幾つかの場合には、貯蔵された凍結乾燥または凍結細菌細胞の少なくとも７５％は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月、２５ヶ月、２６ヶ月、２７ヶ月、２８ヶ月、２９ヶ月、３０ヶ月、３１ヶ月、３２ヶ月、３３ヶ月、３４ヶ月、３５ヶ月または３６ヶ月後に尚も生存可能でありうる。他の場合には、貯蔵された凍結乾燥または凍結細菌細胞の少なくとも８０％は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月、２５ヶ月、２６ヶ月、２７ヶ月、２８ヶ月、２９ヶ月、３０ヶ月、３１ヶ月、３２ヶ月、３３ヶ月、３４ヶ月、３５ヶ月または３６ヶ月後に尚も生存可能でありうる。幾つかの実施形態においては、貯蔵された凍結乾燥または凍結細菌細胞の少なくとも８５％は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月、２５ヶ月、２６ヶ月、２７ヶ月、２８ヶ月、２９ヶ月、３０ヶ月、３１ヶ月、３２ヶ月、３３ヶ月、３４ヶ月、３５ヶ月または３６ヶ月後に尚も生存可能でありうる。他の実施形態においては、貯蔵された凍結乾燥または凍結細菌細胞の少なくとも９０％は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月、２５ヶ月、２６ヶ月、２７ヶ月、２８ヶ月、２９ヶ月、３０ヶ月、３１ヶ月、３２ヶ月、３３ヶ月、３４ヶ月、３５ヶ月または３６ヶ月後に尚も生存可能でありうる。また、貯蔵された凍結乾燥または凍結細菌細胞の少なくとも９５％は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月、２５ヶ月、２６ヶ月、２７ヶ月、２８ヶ月、２９ヶ月、３０ヶ月、３１ヶ月、３２ヶ月、３３ヶ月、３４ヶ月、３５ヶ月または３６ヶ月後に尚も生存可能でありうる。幾つかの実施形態においては、貯蔵された凍結乾燥または凍結細菌細胞の少なくとも９９％は１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月、２５ヶ月、２６ヶ月、２７ヶ月、２８ヶ月、２９ヶ月、３０ヶ月、３１ヶ月、３２ヶ月、３３ヶ月、３４ヶ月、３５ヶ月または３６ヶ月後に尚も生存可能でありうる。
【0071】
本開示のキットは、本明細書に記載されている医薬組成物を使用するための種々の成分を提供しうる。そのような成分には、容器、試験サンプル、および／または医薬組成物の（例えば、その生存性、貯蔵培地のｐＨなどの）分析を行うための装置が含まれうる。したがって、本開示のキットは、扱いやすく正確で信頼しうる、医薬組成物の使用（限定的なものではないが、投薬、投与、貯蔵、輸送を含む）を可能にしうる。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、表２に示されている細菌株の任意の１以上を含む微生物共生体を含む。そのような場合、キットは、表１の少なくとも１つ、少なくとも２つまたは全ての株を含む医薬組成物を含みうる。
【0072】
治療方法
本開示は、疾患の予防および／または治療のための、本明細書に記載されている医薬組成物の使用方法を提供する。そのような疾患には、炎症性疾患、代謝性疾患または自己免疫疾患が含まれうる。そのような疾患は、対象における腸内菌共生バランス失調もしくは腸内菌共生バランス失調関連状態またはアレルギー性Ｉ型過敏症の結果でありうる。そのような疾患には、アレルギー性ＩＩ型過敏症、アレルギー性ＩＩＩ型過敏症またはアレルギー性ＩＶ型過敏症も含まれうる。そのような腸内菌共生バランス失調は対象の腸内細菌叢の腸内菌共生バランス失調でありうる。幾つかの場合には、炎症性疾患はアレルギーである。他の場合には、炎症性疾患は皮膚炎である。そのようなアレルギーは、アレルギー性小児喘息を含むアレルギー性喘息および食物アレルギーでありうる。そのような代謝性疾患には、肥満、糖尿病またはメタボリックシンドロームが含まれうる。
本開示は、疾患の予防および／または治療のための、本明細書に記載されている医薬組成物の使用方法を提供する。そのような疾患には、炎症性疾患、代謝性疾患または自己免疫疾患が含まれうる。そのような疾患は、対象における腸内菌共生バランス失調もしくは腸内菌共生バランス失調関連状態またはアレルギー性Ｉ型過敏症の結果でありうる。そのような疾患には、アレルギー性ＩＩ型過敏症、アレルギー性ＩＩＩ型過敏症またはアレルギー性ＩＶ型過敏症も含まれうる。そのような腸内菌共生バランス失調は対象の腸内細菌叢の腸内菌共生バランス失調でありうる。幾つかの場合には、炎症性疾患はアレルギーである。他の場合には、炎症性疾患は皮膚炎である。そのようなアレルギーは、アレルギー性小児喘息を含むアレルギー性喘息および食物アレルギーでありうる。そのような代謝性疾患には、肥満、糖尿病またはメタボリックシンドロームが含まれうる。
【0073】
したがって、幾つかの場合には、本明細書に記載されている医薬組成物は、アレルギーを有しうる又はアレルギーを有する疑いのある対象への投与のために製剤化されうる。そのような対象は、例えば２以上のアレルゲンに対して、多重感作された状態でありうる。そのような対象は哺乳動物でありうる。幾つかの場合には、対象はヒトである。そのような医薬組成物は、齧歯動物またはヒトのような対象に投与される場合、炎症性疾患の予防および／または治療に有用な抗炎症効果を有しうる。幾つかの場合には、そのような抗炎症効果は、医薬組成物が経口投与された際に誘発されうる。
【0074】
幾つかの場合には、本明細書における医薬組成物を使用して治療される対象はヒトである。ヒト対象は新生児、乳児、幼児、小児、ティーンエイジャーまたは成人でありうる。幾つかの場合には、新生児は約３日齢未満、約１週齢未満、約２週齢未満、約３週齢未満、約４週齢未満、約８週齢未満でありうる。幾つかの場合には、乳児は少なくとも約２月齢、少なくとも約６月齢、少なくとも約１２月齢でありうる。幾つかの場合には、医薬組成物は、約２歳～約１８歳、少なくとも約１８歳でありうる対象を治療するために使用されうる。対象は２歳～１８歳であることが可能であり、または少なくとも１８歳である。対象は約２歳～約１８歳であることが可能であり、または少なくとも約１８（例えば、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０）歳である。幾つかの場合には、対象は約２歳～約１８歳または約１９歳でありうる。対象は約２歳～約１８歳または約１９歳でありうる。対象は約２歳～約１８歳または約２０歳でありうる。対象は約２歳～約１８歳または約２０歳でありうる。対象は約２歳～約１８歳または約２５歳でありうる。対象は約２歳～約１８歳または約２５歳でありうる。対象は約２歳～約１８歳または約３０歳以上でありうる。対象は約２歳～約１８歳または約３０歳でありうる。幾つかの実施形態においては、対象は約１８歳～約４０歳、約１２歳～約１７歳および／または約２歳～約１１歳である。本明細書における医薬組成物は、投与のために、ミルク、母乳、人工乳（乳児授乳用）または食物と混合されうる。
【0075】
本明細書における医薬組成物は、投与スケジュールに応じて種々の期間にわたって投与されうる。治療期間は対象および個体によって異なる可能性があり、本明細書に記載されている種々の要因、例えば病態、年齢などに左右されうる。幾つかの場合には、対象は、１日間～少なくとも約１週間、約１週間～約１ヶ月間、または約１ヶ月～約１年間にわたって治療されうる。そのような場合、対象は約１ヶ月間、２ヶ月間または３ヶ月間にわたって治療されうる。幾つかの場合には、治療は、連続した日、連続した週および／または連続した月に行われうる。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、連続した約２８、２９または３０日間にわたって投与される。
【0076】
本明細書における治療方法は、本開示の医薬組成物を１日１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回または１２回投与することを含みうる。種々の場合において、本開示の医薬組成物を１日２回投与する。そのような１日２回の投与は朝および夜に行われうる。そのような場合、与えられた日の１回目の投与と２回目の投与との間に約８、１２または１６時間の間隔が存在しうる。
【0077】
本明細書における種々の実施形態においては、アレルギーのような炎症性疾患の予防および／または治療のためにヒト対象に投与される医薬組成物は、表１に挙げられている細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）および／またはラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の少なくとも１つを含む。そのような医薬組成物は、２～１１歳、１２～１７歳および１８～４０歳の群の対象（例えば、約１０、２０または４０名の対象）に、１日２回、連続して約２８日間投与されうる。そのような場合、そのような医薬組成物は液体懸濁液として１ｍＬの単位用量で投与されうる。そのような単位用量は、投与のために、低温または室温の食物および飲料に添加されうる。
【0078】
本明細書には本発明の種々の実施形態が示され記載されているが、そのような実施形態は単なる例示として記載されているに過ぎないことが当業者に明らかであろう。多数の変形、変更および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者に見出されうる。本明細書に記載されている本発明の実施形態に対する種々の代替的実施形態が使用されうると理解されるべきである。
【0079】
実施例
これらの実施例は例示目的で記載されているに過ぎず、本出願に記載されている特許請求の範囲の範囲を限定するものではない。
これらの実施例は例示目的で記載されているに過ぎず、本出願に記載されている特許請求の範囲の範囲を限定するものではない。
【0080】
実施例１：細菌株の増殖、分離および特徴付け
本明細書は、ヒトサンプルから分離された細菌株の増殖、分離および特徴付けのための方法を提供する。そのような株は、本明細書に記載されている細菌共生体の一部として使用されうる。
本明細書は、ヒトサンプルから分離された細菌株の増殖、分離および特徴付けのための方法を提供する。そのような株は、本明細書に記載されている細菌共生体の一部として使用されうる。
【0081】
１．細菌の増殖
一般に、本明細書に記載されている細菌を増殖させるための手順は、純粋嫌気性細菌株および通性嫌気性細菌株を培養するために使用されうる。本実施例における細菌株をヒト糞便サンプルから得、選択培地において増殖させた。継代培養に際して、コロニーを液体培地に移し、ついでＰＣＲおよび配列決定のために調製した。コロニーをグリセロールストックとしても貯蔵した。
一般に、本明細書に記載されている細菌を増殖させるための手順は、純粋嫌気性細菌株および通性嫌気性細菌株を培養するために使用されうる。本実施例における細菌株をヒト糞便サンプルから得、選択培地において増殖させた。継代培養に際して、コロニーを液体培地に移し、ついでＰＣＲおよび配列決定のために調製した。コロニーをグリセロールストックとしても貯蔵した。
【0082】
まず、ヒト糞便サンプルを嫌気性輸送培地（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓ－９１５）において、または嫌気性雰囲気生成系（例えば、ＡｎａｅｒｏＰｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｒ６８６００１）を含むプラスチックバッグ内に密封された糞便収集バイアルにおいて収集した。嫌気性菌株の生存性が確保されるように、移行時間および潜在的酸素曝露を最小化するために、全てのサンプルを直ちに嫌気性チャンバー内に移した。
【0083】
０．９ｍＬのＰＢＳ＋Ｃｙｓ（１×ＰＢＳ＋０．１％ ｗ／ｗ Ｌ－システイン）を１３本のチューブ（１．５ｍＬの体積を有する）に分注することにより、段階希釈チューブを調製した。使い捨てスパチュラまたはループを使用して、２０～３０ｍｇのサンプルを、０．９ｍＬのＰＢＳ＋Ｃｙｓを含有する第１の１．５ｍＬチューブ内に移した。得られた混合物を約３０秒間ボルテックスし、得られた均質な溶液０．１ｍＬを、０．９ｍＬのＰＢＳ＋Ｃｙｓを含有する第２の１．５ｍＬチューブ内に移した。ついで、１３本のチューブ全てがサンプルの段階希釈物を含有する（例えば、バイアル１～１３における１～１０－１２希釈）まで、この工程を繰り返した。
【0084】
使い捨てホッケースティックスプレッダーを使用して、１０－５～１０－１２の希釈物（バイアル６～１３）を含有するサンプルチューブからの約０．１ｍＬを加えて、選択寒天増殖培地を含有する別々の寒天プレートに加えた。ついで寒天プレートをパラフィルムで密封して蒸発を防ぎ、３７℃で７２時間、インキュベーター内に配置した。コロニー［例えば、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）など］の特異的形態学的特徴に適合するコロニーを特定し、分離のための新たな予め還元された寒天プレート上に配置した。寒天プレートをパラフィルムで密封し、３７℃で更に７２時間、嫌気性インキュベーター内に配置した。
【0085】
特異的に分離されたコロニーを培養プレートから選び、コロニーを１ｍＬの予め還元された液体ブロスに再懸濁させることにより、分離コロニーを液体培地内に移した。選択された生物の陽性対照および陰性対照を並行して接種し、それぞれ、増殖を比較し、汚染をモニターする。ついで全ての液体コロニーサンプルを３７℃で７２時間インキュベートする。
【0086】
陽性対照および陰性対照を使用して、陽性合致ブロス培養物を特定した。ＰＢＳ中に０．７５ｍＬの５０％ ｖ／ｖ グリセロールを含有する２ｍＬのクライオチューブ内に０．７５ｍＬのブロス培養液を移すことにより、陽性合致ブロス培養物のグリセロールストックを調製した。ついで、密封されたクライオチューブサンプルを嫌気性チャンバーから取り出し、－８０℃で貯蔵した。後記のとおりに１６ＳベースＰＣＲを使用して、分離体の特定のために、残りのブロス培養サンプルを使用した。
【0087】
２．分離体の特定のための１６ＳベースＰＣＲ
ブロス培養サンプルを遠心分離して細胞ペレットを形成させ、生じた上清を注意深く除去して、形成した細胞ペレットを無傷のままにする。ついで、細胞ペレットを０．５～１ｍＬの超純水に再懸濁させた。
ブロス培養サンプルを遠心分離して細胞ペレットを形成させ、生じた上清を注意深く除去して、形成した細胞ペレットを無傷のままにする。ついで、細胞ペレットを０．５～１ｍＬの超純水に再懸濁させた。
【0088】
５０μＬの最終反応体積のためのＰＣＲマスターミックスを、以下のＰＣＲ成分（ＮＥＢ Ｅ５０００Ｓ）および体積を用いて調製した：１０×バッファー（５μＬ）、１０ｍＭ ｄＮＴＰ（１μＬ）、１０μＭ ２７Ｆフォワードプライマー（１μＬ）、１０μＭ １４９２Ｒリバースプライマー（１μＬ）、タグポリメラーゼ（０．２５μＬ）および滅菌水（４０．２５μＬ）。ＰＣＲマスターミックス（４８．５μＬ）および１．５μＬの再懸濁細菌細胞を０．２ｍＬのＰＣＲストリップチューブ内に入れ、ボルテックスした後、ＰＣＲ反応サンプルを以下のサーモサイクラープロトコルに付した（表３）。
【表3】
【0089】
ＰＣＲ反応の完了時に、サンプルを、ＧＥＮＥＷＩＺまたは同等のベンダーを利用して、サンガー配列決定に付した。
【0090】
３．分離された細菌株の特徴付け
以下の表４は、医薬組成物において使用される細菌共生体を本開示の種々の実施形態において形成しうる株（表２も示されている）アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の短鎖脂肪酸の産生、抗生物質耐性および全ゲノム配列決定分析を示す。
以下の表４は、医薬組成物において使用される細菌共生体を本開示の種々の実施形態において形成しうる株（表２も示されている）アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の短鎖脂肪酸の産生、抗生物質耐性および全ゲノム配列決定分析を示す。
【表4】
【0091】
実施例２：細菌組成物Ａの製造
本明細書に記載されている細菌株の収量および増殖速度を増加させるように製造条件を調製した。特に、細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）に関して、収量および増殖速度を増加させるための製造条件を得た。本明細書における図１は、これらの株を使用して組成物Ａを製造するための製造工程を要約した概略フローチャートを示す。
本明細書に記載されている細菌株の収量および増殖速度を増加させるように製造条件を調製した。特に、細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）に関して、収量および増殖速度を増加させるための製造条件を得た。本明細書における図１は、これらの株を使用して組成物Ａを製造するための製造工程を要約した概略フローチャートを示す。
【0092】
１．培地の調製
本実施例の製造工程においては、動物非含有培地を使用した。細菌バッチを得るために、まず、株のそれぞれに関して、５Ｌのブロス培地を調製した。ＵＳＰ等級の水中での１５分間の激しい攪拌により培地成分を完全に溶解した後、培地のｐＨを塩酸で調整した。ついで、ｐＨ調整済み培地を生物安全性（バイオセイフティー）キャビネットに移し、０．２μｍ真空フィルターユニットを使用して（例えば、１リットルの部分を５回使用して）、濾過滅菌した。濾過滅菌した増殖培地を、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）の雰囲気を含む嫌気性チャンバーに直ちに移し、接種前に、還元のために、通気キャップを付けて１２～１８時間貯蔵した。
本実施例の製造工程においては、動物非含有培地を使用した。細菌バッチを得るために、まず、株のそれぞれに関して、５Ｌのブロス培地を調製した。ＵＳＰ等級の水中での１５分間の激しい攪拌により培地成分を完全に溶解した後、培地のｐＨを塩酸で調整した。ついで、ｐＨ調整済み培地を生物安全性（バイオセイフティー）キャビネットに移し、０．２μｍ真空フィルターユニットを使用して（例えば、１リットルの部分を５回使用して）、濾過滅菌した。濾過滅菌した増殖培地を、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）の雰囲気を含む嫌気性チャンバーに直ちに移し、接種前に、還元のために、通気キャップを付けて１２～１８時間貯蔵した。
【0093】
２．接種および培養
嫌気性条件下での１２～１８時間の培地の還元の後、それぞれの１Ｌフィルターフラスコからの１０ｍＬを、予め還元された滅菌済み１５ｍＬスクリューキャップチューブに移し、「滅菌対照＃５」と表示した。追加的な４０ｍＬの滅菌培地を、「出発培養Ｘの２」と表示された２つの別々の５０ｍＬファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブに移した。１つの２ｍＬマスター細胞バンク（ＭＣＢ）クライオバイアルを－７０℃の貯蔵から取り出し、バイアルの外側を７０％ ＥｔＯＨで洗浄し、リントフリー（ｌｉｎｔ－ｆｒｅｅ）ワイプで拭いて乾燥させた。ついでＭＣＢアリコートを嫌気性チャンバー内に移し、チューブ・ラック内に配置して５～１０分間解凍した。完全に解凍したら、滅菌済み１ｍＬ濾過ピペットチップを使用して、解凍した１ｍＬのＭＣＢアリコート５００μＬを２つの４０ｍＬの出発培養のそれぞれに移した。接種した出発培養チューブおよび滅菌対照のキャップをしっかりと締め、対照および出発培養を嫌気性条件下で約３７℃で１２～１６時間培養した。
嫌気性条件下での１２～１８時間の培地の還元の後、それぞれの１Ｌフィルターフラスコからの１０ｍＬを、予め還元された滅菌済み１５ｍＬスクリューキャップチューブに移し、「滅菌対照＃５」と表示した。追加的な４０ｍＬの滅菌培地を、「出発培養Ｘの２」と表示された２つの別々の５０ｍＬファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブに移した。１つの２ｍＬマスター細胞バンク（ＭＣＢ）クライオバイアルを－７０℃の貯蔵から取り出し、バイアルの外側を７０％ ＥｔＯＨで洗浄し、リントフリー（ｌｉｎｔ－ｆｒｅｅ）ワイプで拭いて乾燥させた。ついでＭＣＢアリコートを嫌気性チャンバー内に移し、チューブ・ラック内に配置して５～１０分間解凍した。完全に解凍したら、滅菌済み１ｍＬ濾過ピペットチップを使用して、解凍した１ｍＬのＭＣＢアリコート５００μＬを２つの４０ｍＬの出発培養のそれぞれに移した。接種した出発培養チューブおよび滅菌対照のキャップをしっかりと締め、対照および出発培養を嫌気性条件下で約３７℃で１２～１６時間培養した。
【0094】
１２～１６時間後、出発培養および滅菌対照をインキュベーターから取り出し、増殖（例えば、濁度）に関して視覚的に検査した。また、先に進める前に、滅菌対照において、視認可能な増殖または濁度の欠如を確認した。確認されたら、滅菌済み１０ｍＬ血清ピペットチップを使用して、予め還元された濾過滅菌済み培地を含有する５つの予め加温された１Ｌフラスコのそれぞれに１０ｍＬの出発培養を注意深く移した。ついで培養物を嫌気性条件下で３７℃で１２～１６時間インキュベートした。インキュベーション後、設定されたパラメーター内での増殖を確認するために、吸光分光法（Ｅｐｏｃｈ ２ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ，Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて、培養物の濁度を定量した。培養物の吸光度が目標ＯＤ６００の範囲内にあることが確認されたら、細胞を遠心分離により回収した。
【0095】
３．回収
細胞採取の１２～１８時間前に、スクリューキャップシールを有する５本の滅菌済み１Ｌ遠心分離ボトル（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を嫌気性チャンバー内に配置して、使用前にボトルを還元した。培養物を増殖させ、培養物が目標ＯＤ６００範囲内にあることを確認した後、培養物を滅菌済み１Ｌ遠心分離ボトル内に移した。遠心分離ボトルのキャップを、ガス交換を防ぐためにしっかり密閉し、６×１Ｌローターを含む予冷床遠心分離機にボトルを移した。細胞を８，０００×ｇ、４℃で３０分間ペレット化した。遠心分離後、細胞ペレットを嫌気性チャンバー内に戻し、滅菌済み血清ピペットを使用して、清澄化培養上清をペレットから完全に除去した。ついで、予め還元された凍結保護物質溶液における４０倍濃度での再懸濁により、細胞ペレットを一緒にした。ついで、濃縮された細胞懸濁液を、予め還元され予めラベル付けされた２ｍＬスクリューキャップクライオバイアルにおける１ｍＬアリコートへと分注し、予めラベル付けされた－７０℃の貯蔵ボックスに直ちに移した。製造および－７０℃での初期貯蔵の３日後、原薬株を仕様試験に付した。
細胞採取の１２～１８時間前に、スクリューキャップシールを有する５本の滅菌済み１Ｌ遠心分離ボトル（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を嫌気性チャンバー内に配置して、使用前にボトルを還元した。培養物を増殖させ、培養物が目標ＯＤ６００範囲内にあることを確認した後、培養物を滅菌済み１Ｌ遠心分離ボトル内に移した。遠心分離ボトルのキャップを、ガス交換を防ぐためにしっかり密閉し、６×１Ｌローターを含む予冷床遠心分離機にボトルを移した。細胞を８，０００×ｇ、４℃で３０分間ペレット化した。遠心分離後、細胞ペレットを嫌気性チャンバー内に戻し、滅菌済み血清ピペットを使用して、清澄化培養上清をペレットから完全に除去した。ついで、予め還元された凍結保護物質溶液における４０倍濃度での再懸濁により、細胞ペレットを一緒にした。ついで、濃縮された細胞懸濁液を、予め還元され予めラベル付けされた２ｍＬスクリューキャップクライオバイアルにおける１ｍＬアリコートへと分注し、予めラベル付けされた－７０℃の貯蔵ボックスに直ちに移した。製造および－７０℃での初期貯蔵の３日後、原薬株を仕様試験に付した。
【0096】
医薬組成物において使用されるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞に関する製造手順を以下に記載する。
【0097】
Ａ．医薬組成物において使用されるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞の作製
培地の調製のために、５Ｌビーカーに４．９Ｌの水（注射用）を加えた後、Ｄｉｆｃｏ（商標）セレクト・ソイトーン（８２．５±０．８２ｇ）、Ｂａｃｔｏ（商標）酵母エキス（１２．５±０．１２ｇ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（５±０．０５ｇ）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（１２．５±０．１２ｇ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（１．５±０．０１５ｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．５±０．０５ｇ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（０．５±０．０５ｇ）、グルコース（デキストロース）（２２．６±０．２２ｇ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（２７．７±０．２７ｇ）、Ｌ－スレオニン（２０±０．２ｇ）およびＬ－システイン（５±０．０５ｇ）を混合下で加えた。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
培地の調製のために、５Ｌビーカーに４．９Ｌの水（注射用）を加えた後、Ｄｉｆｃｏ（商標）セレクト・ソイトーン（８２．５±０．８２ｇ）、Ｂａｃｔｏ（商標）酵母エキス（１２．５±０．１２ｇ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（５±０．０５ｇ）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（１２．５±０．１２ｇ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（１．５±０．０１５ｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．５±０．０５ｇ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（０．５±０．０５ｇ）、グルコース（デキストロース）（２２．６±０．２２ｇ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（２７．７±０．２７ｇ）、Ｌ－スレオニン（２０±０．２ｇ）およびＬ－システイン（５±０．０５ｇ）を混合下で加えた。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
【0098】
ＮＡＧＴ培地のｐＨを６．５±０．１に調整した。ついで培地を真空濾過し、５つの１Ｌバッチに分けた。培地が完全に還元した後（約１２～１６時間後）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細菌細胞の出発培養を、４５ｍＬの体積の培地を使用して調製した。アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細菌細胞（約５００μＬのストック溶液）を細胞バンクから取り出し、増殖培地を含有する調製済みバイアル内に加えた。ついで細胞懸濁液を加温し、３７℃のインキュベーターユニット内で２４～６０時間インキュベートして、濁った／混濁した懸濁液を得る。ついで６００ｎｍでの吸光度を３回の重複実験において測定し記録して、約０．７～１．１の値を得る。
【0099】
ついで、ＪＬＡ８．１０００遠心分離機を使用して、培養フラスコを８０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を除去した後、残留細胞ペレットを２５ｍＬの滅菌済みＰＢＳ－ＧＣ（元の培養体積の４０倍濃度）に再懸濁させ、ついで一緒にして均質溶液を得た。アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞懸濁液を２ｍＬクライオバイアル内に分注して、バイアル当たり１×１０９を超えるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）生細胞の、最終的なアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞濃度を得、更に使用するまで－８０℃で貯蔵した。
【0100】
Ｂ．医薬組成物において使用されるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の作製
ＹＦＡＰビタミンミックス溶液の調製のために、１Ｌボトルに水（注射用）を充填し、ついでビオチン（１０±１ｍｇ）、コバラミン（１０±１ｍｇ）、ｐ－アミノ安息香酸（３０±１ｍｇ）、葉酸（５０±１ｍｇ）、ピリドキサミン（１５０±１ｍｇ）、チアミン（５０±１ｍｇ）およびリボフラビン（５０±１ｍｇ）を混合下で加えた。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。ついでＹＦＡＰビタミンミックス培地を濾過し、滅菌した。
ＹＦＡＰビタミンミックス溶液の調製のために、１Ｌボトルに水（注射用）を充填し、ついでビオチン（１０±１ｍｇ）、コバラミン（１０±１ｍｇ）、ｐ－アミノ安息香酸（３０±１ｍｇ）、葉酸（５０±１ｍｇ）、ピリドキサミン（１５０±１ｍｇ）、チアミン（５０±１ｍｇ）およびリボフラビン（５０±１ｍｇ）を混合下で加えた。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。ついでＹＦＡＰビタミンミックス培地を濾過し、滅菌した。
【0101】
培地の調製のために、５Ｌビーカーに４．９Ｌの水（注射用）を加えた後、ＢＢＬ（商標）フィトンペプトン（５０±０．５ｇ）、Ｄｉｆｃｏ（商標）セレクト・ソイトーン（５０±０．５ｇ）、Ｂａｃｔｏ（商標）酵母エキス（２５±０．２５ｇ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（５±０．０５ｇ）、二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（１２．５±０．１２ｇ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（５±０．０５ｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（１±０．０１ｇ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（２５±０．２５ｇ）、グルコース（デキストロース）（５０±０．２５ｇ）、プロピオン酸ナトリウム（５±０．０５ｇ）、Ｌ－システイン（５±０．０５ｇ）およびＹＦＡＰビタミンミックス溶液（１ｍＬ；前記のとおりに調製）を混合下で加えた。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
【0102】
ついで、５Ｍ 塩酸塩溶液を使用して、ＹＦＡＰ培地のｐＨを６．５に調整した。ついで培地を濾過し、嫌気性状態への完全な還元のために、暗所で約１２～１８時間放置した。ある体積の培地を出発培養チューブに移した後、約５００μＬのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）ストック溶液を出発培養チューブ内に移し、３７℃で約１２～１６時間インキュベートした。出発培養チューブを濁度に関して評価し、５つのアリコートに分け、滅菌済み培地を含有する予め加温された１Ｌフラスコに加え、ついで３７℃で１２～１６時間インキュベートした。
【0103】
インキュベーション後、６００ｎｍでの吸光度を測定し、３回の重複実験において繰り返して、吸光度が１．４～１．８の吸光度の範囲内にあることを確認した。ＪＬＡ８．１０００遠心分離機を使用して、培養フラスコを８０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を除去した後、残留細胞ペレットを２５ｍＬの滅菌済みＰＢＳ－ＧＣ（元の培養体積の４０倍濃度）に再懸濁させ、ついで一緒にして均質溶液を得た。フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞懸濁液を２ｍＬクライオバイアル内に分注して、バイアル当たり１×１０９を超えるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）生細胞の、最終的なフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞濃度を得、更に使用するまで－８０℃で貯蔵した。
【0104】
Ｃ．医薬組成物において使用されるラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞の作製
ｖＭＲＳ培地の調製のために、５Ｌビーカーに４．９Ｌの水（注射用）を加えた後、２７３ｇのｖＭＲＳ粉末およびリン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（１２．５±０．１ｇ）を混合下で加えた。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
ｖＭＲＳ培地の調製のために、５Ｌビーカーに４．９Ｌの水（注射用）を加えた後、２７３ｇのｖＭＲＳ粉末およびリン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（１２．５±０．１ｇ）を混合下で加えた。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
【0105】
ついでｖＭＲＳ培地のｐＨをＮＨ４ＯＨまたは酢酸で６．５に調整した。ついで、０．２μｍの真空フィルターユニットを使用して培地を濾過し、嫌気性状態への完全な還元のために、暗所で約１２～１８時間放置した。ある体積（例えば、４５ｍＬ）の培地を出発培養チューブに移した後、約５００μＬのラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）ストック溶液を出発培養チューブ内に移し、３７℃で約１６～２０時間インキュベートした。出発培養チューブを濁度に関して評価し、５つのアリコートに分け、滅菌済み培地を含有する予め加温された１Ｌフラスコに加え、ついで３７℃で１６～２０時間インキュベートした。
【0106】
インキュベーション後、６００ｎｍでの吸光度を測定し、３回の重複実験において繰り返して、吸光度が１．０～１．４の吸光度の範囲内にあることを確認した。ＪＬＡ８．１０００遠心分離機を使用して、培養フラスコを８０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を除去した後、残留細胞ペレットを２５ｍＬの滅菌済みＰＢＳ－ＧＣ（元の培養体積の４０倍濃度）に再懸濁させ、ついで一緒にして均質溶液を得た。ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞懸濁液を１ｍＬクライオバイアル内に分注して、バイアル当たり１×１０９を超えたラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）生細胞の、最終的なラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞濃度を得、更に使用するまで－８０℃で貯蔵した。
【0107】
Ｄ．組成物Ａの構築
本明細書に記載されている医薬組成物における細菌共生体として使用可能であり、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）３つの細菌株を調製するために、クリオバイアル内で－８０℃で貯蔵された最終的な細胞懸濁液における代謝活性細菌細胞の数を各株に関して測定した。３つの株バッチから得られうる可能な経口用量の最大数は以下のとおりに計算されうる（表５）。
本明細書に記載されている医薬組成物における細菌共生体として使用可能であり、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）３つの細菌株を調製するために、クリオバイアル内で－８０℃で貯蔵された最終的な細胞懸濁液における代謝活性細菌細胞の数を各株に関して測定した。３つの株バッチから得られうる可能な経口用量の最大数は以下のとおりに計算されうる（表５）。
【表5】
【0108】
組成物Ａの完全な成分一覧を表６に示す。
【表6】
【0109】
表６に挙げられている株を含有するストックバイアルが解凍されたら（冷凍庫から取り出してから約１５～２０分後）、各株に関する細胞懸濁液体積の計算量を１Ｌガラスボトルに移し、１ｍＬ当たりの細胞の計算濃度（例えば、本実施例では５×１０８ＣＦＵ／細菌種／ｍＬ）に達するように、ＰＢＳ－ＧＣを使用して体積を増加させた。混合された種の薬品の生じた均質懸濁液をクライオバイアル内の１ｍＬの体積に分注し、更に使用するまで－８０℃で貯蔵した。
【0110】
Ｅ．組成物Ａの品質管理
以下のパラメーター、試験方法および仕様を、表７に記載されているとおり、品質管理の目的で、組成物Ａの各バッチに関して評価した。
以下のパラメーター、試験方法および仕様を、表７に記載されているとおり、品質管理の目的で、組成物Ａの各バッチに関して評価した。
【表7】
【0111】
好ましくない微生物に関する試験は、標準的なプロトコルを用いて、ＵＳＰ＜６２＞に従い行った。簡潔に説明すると、サンプルを、まず、ダイズカゼイン消化ブロス（ＳＣＤＡ）または他の適切な中和培地に接種することにより富化し、ついで、特定された／好ましくない微生物の存在の決定のために、選択的寒天上にストリークした。
【0112】
サンプル中に存在する微生物の総数の計数を、標準的なプロトコルを用いて、ＵＳＰ＜６１＞に従い行った。そのような微生物の計数は、膜濾過、注入プレーティングまたはスプレッドプレート法のいずれかを用いて行った。
【0113】
実施例３：増殖培地の最適化
本実施例においては、本明細書に記載されている細菌株を培養するための増殖培地組成の最適化を示す。特に、そのような株には、細菌共生体において使用されるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）が含まれる。
本実施例においては、本明細書に記載されている細菌株を培養するための増殖培地組成の最適化を示す。特に、そのような株には、細菌共生体において使用されるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）が含まれる。
【0114】
１．アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）
Ｎ－アセチルグルコサミンスレオニン（ＮＡＧＴ）培地におけるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞の増殖を種々のｐＨ値で評価し、それと共に、１つの培地成分を同時に除去して、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞の増殖に対するそのような培地成分の効果を評価した。一般的なＮＡＧＴ培地は６．５のｐＨを有し、１１．９ｍＭ 炭酸水素ナトリウムを含有していた。アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞を、４７．６ｍＭ 炭酸水素ナトリウムを含有し７．５のｐＨを有する改変ＮＡＧＴ培地内で増殖させた場合、増殖の約４０％の増加（ＯＤ６００、により測定された場合；曲線２、図２）が観察された。プレーティング（平板）法を用いることにより生物量（バイオマス）の増加も確認された。グルコース（曲線３、図２）、硫酸マグネシウム（曲線４、図２）または塩化カルシウム（曲線５、図２）の、改変ＮＡＧＴ培地からの除去は、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞の増殖における影響をほとんど又は全く示さなかった。
Ｎ－アセチルグルコサミンスレオニン（ＮＡＧＴ）培地におけるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞の増殖を種々のｐＨ値で評価し、それと共に、１つの培地成分を同時に除去して、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞の増殖に対するそのような培地成分の効果を評価した。一般的なＮＡＧＴ培地は６．５のｐＨを有し、１１．９ｍＭ 炭酸水素ナトリウムを含有していた。アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞を、４７．６ｍＭ 炭酸水素ナトリウムを含有し７．５のｐＨを有する改変ＮＡＧＴ培地内で増殖させた場合、増殖の約４０％の増加（ＯＤ６００、により測定された場合；曲線２、図２）が観察された。プレーティング（平板）法を用いることにより生物量（バイオマス）の増加も確認された。グルコース（曲線３、図２）、硫酸マグネシウム（曲線４、図２）または塩化カルシウム（曲線５、図２）の、改変ＮＡＧＴ培地からの除去は、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞の増殖における影響をほとんど又は全く示さなかった。
【0115】
図３は、ソイトーンまたはＮＡＧを欠く培地においては細菌増殖を示さないことがそれぞれ増殖曲線２および３により示されているとおり、ソイトーンおよびＮ－アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）がアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞の増殖に必要であるらしいことを示している。増殖曲線１は、ソイトーンとＮＡＧとの両方を含有するＮＡＧＴ培地におけるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞の強力な増殖を示している。
【0116】
２．フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖に対するＹＦＡＰ培地における特定の成分の効果を、１つの培地成分を同時に除去することにより評価した。例えば、図４は、完全培地におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖（曲線１）と比較した場合に、酵母エキス［例えば、曲線３は、酵母エキスを欠く培地におけるＦＰ（ＤＳＭ ３３１８５）の増殖を示している］およびシステイン［例えば、曲線４は、酵母エキスを欠く培地におけるＦＰ（ＤＳＭ ３３１８５）の増殖を示している］がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖に必要であるらしいことを示している。酢酸ナトリウムの非存在（曲線５）は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖を妨げないようであるが、ソイトーンの非存在（曲線２）は後期対数増殖期および定常期における細胞死を招くようである。
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖に対するＹＦＡＰ培地における特定の成分の効果を、１つの培地成分を同時に除去することにより評価した。例えば、図４は、完全培地におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖（曲線１）と比較した場合に、酵母エキス［例えば、曲線３は、酵母エキスを欠く培地におけるＦＰ（ＤＳＭ ３３１８５）の増殖を示している］およびシステイン［例えば、曲線４は、酵母エキスを欠く培地におけるＦＰ（ＤＳＭ ３３１８５）の増殖を示している］がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖に必要であるらしいことを示している。酢酸ナトリウムの非存在（曲線５）は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖を妨げないようであるが、ソイトーンの非存在（曲線２）は後期対数増殖期および定常期における細胞死を招くようである。
【0117】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖に対するビタミン補足物のタイプの影響も調べた。例えば、図５は、ビタミンの添加が、ビタミン非含有ＹＦＡＰ培地内で３回継代培養されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の収量を増加させたことを示している。ビタミンを含有するＹＦＡＰ（ＹＦＡＰ＋ビタミン）において増殖するフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の最終的なＯＤ６００は、チアミンを欠くＹＦＡＰ培地（チアミン非含有ＹＦＡＰ）、ピロキサミンを欠くＹＦＡＰ培地（ピロキサミン非含有ＹＦＡＰ）、葉酸を欠くＹＦＡＰ培地（葉酸非含有ＹＦＡＰ）、コバラミンを欠くＹＦＡＰ培地（コバラミン非含有ＹＦＡＰ）、ＰＡＢＡを欠くＹＦＡＰ培地（ＰＡＢＡ非含有ＹＦＡＰ）、リボフラビンを欠くＹＦＡＰ培地（リボフラビン非含有ＹＦＡＰ）、ビタミンを欠くＹＦＡＰ培地（ビタミン非含有ＹＦＡＰ）またはビオチンを欠くＹＦＡＰ培地（ビオチン非含有ＹＦＡＰ）において増殖するものより約１０％高かった。ＹＦＡＰ＋ビタミン培地は、完全ビタミンミックス溶液が添加されたＹＦＡＰ培地（例えば、ＹＦＡＰビタミンミックス）を含む。ＹＦＡＰビタミンは約１０ｍｇ／Ｌのビオチン、約１０ｍｇ／Ｌのコバラミン、約３０ｍｇ／Ｌのｐ－アミノ安息香酸、約５０ｍｇ／Ｌの葉酸、約１５０ｍｇ／Ｌのピリドキサミン、約５０ｍｇ／Ｌのチアミンおよび約５０ｍｇ／Ｌのリボフラビンを含む。
【0118】
もう１つの例において、図６は、コバラミンが、ビタミン非含有ＹＦＡＰ培地内で１回継代培養されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の最適な増殖のための注目すべき因子であったことを示している。コバラミンを欠くＹＦＡＰ（ＹＦＡＰコバラミンなし）において増殖するフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の最終的なＯＤ６００は、チアミンを欠くＹＦＡＰ培地（チアミン非含有ＹＦＡＰ）、ピロキサミンを欠くＹＦＡＰ培地（ピロキサミン非含有ＹＦＡＰ）、葉酸を欠くＹＦＡＰ培地（葉酸非含有ＹＦＡＰ）、ＰＡＢＡを欠くＹＦＡＰ培地（ＰＡＢＡ非含有ＹＦＡＰ）、リボフラビンを欠くＹＦＡＰ培地（リボフラビン非含有ＹＦＡＰ）、ビオチンを欠くＹＦＡＰ培地（ビオチン非含有ＹＦＡＰ）またはビタミンの添加を伴うＹＦＡＰ培地（ＹＦＡＰ＋ビタミン）において増殖するものより約３０％低かった。コバラミンを欠くＹＦＡＰの増殖の不利な点は、ビタミンを欠くＹＦＡＰ（ビタミン非含有ＹＦＡＰ）の場合に類似していた。
【0119】
培地のｐＨも、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖のための注目すべき要因であることが示された。図７はｐＨ制御の非存在下のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖を示し、図８はｐＨ制御の存在下のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）細胞の増殖を示す。ｐＨを水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）で６に制御した場合には、酸化還元電位は－４６０ｍＶに低下し、細菌増殖はＯＤ６００＝０．５付近で横ばいになった。ｐＨを制御しなかった場合には、酸化還元電位は－４００ｍＶに維持され、細菌増殖はＯＤ６００＝１．１に達した。したがって、ｐＨ制御の非存在下の培養はｐＨ制御の存在下の培養より５０％以上多くの細菌を生成した。
【0120】
３．ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）
ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）を、一般的には、ＨｉＭｅｄｉａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したｖＭＲＳブロス内で増殖させた。しかし、図９は、ＨｉＭｅｄｉａ ｖＭＲＳブロスを使用した場合（曲線１）と比較して、Ｂｉｏｋａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（参照：ＢＫ１７６ＨＡ）から入手したブイヨン（Ｂｏｕｌｌｉｏｎ）ＭＲＳ Ｖｅｇｅｔａｌを使用して培地を作製した場合（曲線２）、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞の増殖が約５５％増加したことを示している。いずれの理論にも拘束されるものではないが、細胞増殖の観察された改善は、ＨｉＭｅｄｉａ ｖＭＲＳブロスと比較して、ブイヨンＭＲＳ Ｖｅｇｅｔａｌの植物性ペプトンの量が多い（２０ｇ／Ｌの場合の量の約２倍）ためであると考えられる。
ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）を、一般的には、ＨｉＭｅｄｉａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したｖＭＲＳブロス内で増殖させた。しかし、図９は、ＨｉＭｅｄｉａ ｖＭＲＳブロスを使用した場合（曲線１）と比較して、Ｂｉｏｋａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（参照：ＢＫ１７６ＨＡ）から入手したブイヨン（Ｂｏｕｌｌｉｏｎ）ＭＲＳ Ｖｅｇｅｔａｌを使用して培地を作製した場合（曲線２）、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞の増殖が約５５％増加したことを示している。いずれの理論にも拘束されるものではないが、細胞増殖の観察された改善は、ＨｉＭｅｄｉａ ｖＭＲＳブロスと比較して、ブイヨンＭＲＳ Ｖｅｇｅｔａｌの植物性ペプトンの量が多い（２０ｇ／Ｌの場合の量の約２倍）ためであると考えられる。
【0121】
実施例４：細菌の大規模増殖（２０Ｌ）
本明細書に記載されている細菌株の収量および増殖速度を増加させるために、２０Ｌの体積の培養において細菌を増殖させるための製造条件を調製した。特に、細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）に関して、収量および増殖速度を増加させるための製造条件を得た。
本明細書に記載されている細菌株の収量および増殖速度を増加させるために、２０Ｌの体積の培養において細菌を増殖させるための製造条件を調製した。特に、細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）に関して、収量および増殖速度を増加させるための製造条件を得た。
【0122】
アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の大規模増殖
１Ｌの接種培養および２０Ｌの初代培養のためのＮＡＧＴ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（１６．５ｇ／Ｌ）、酵母エキス（２．５ｇ／Ｌ）、デキストロース（４５．２ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（０．３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．１ｇ／Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（１ｇ／Ｌ）、塩化カルシウム（０．１ｇ／Ｌ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（５．５４ｇ／Ｌ）、Ｌ－スレオニン（４ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１ｇ／Ｌ）。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
１Ｌの接種培養および２０Ｌの初代培養のためのＮＡＧＴ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（１６．５ｇ／Ｌ）、酵母エキス（２．５ｇ／Ｌ）、デキストロース（４５．２ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（０．３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．１ｇ／Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（１ｇ／Ｌ）、塩化カルシウム（０．１ｇ／Ｌ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（５．５４ｇ／Ｌ）、Ｌ－スレオニン（４ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１ｇ／Ｌ）。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
【0123】
ＮＡＧＴ培地のｐＨをＮＨ４ＯＨおよび酢酸で６．５±０．１に調整した。ついで、培地を、１２１℃で２０分間オートクレーブすることにより滅菌した。グルコースおよびＮ－アセチルグルコサミンの供給物を別々に濾過滅菌した。ついで培地成分を一緒に混合した。
【0124】
ＮＡＧＴを含有する接種フラスコを嫌気性チャンバーに移し、嫌気性雰囲気下で４８時間インキュベートすることによりＮ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）で脱気した。接種培養をＲＣＢまたはＭＣＢ［アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の場合は０．４％］から接種し、嫌気性雰囲気下、攪拌せずに３７℃でインキュベートした。培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。ａ）減速の段階が観察されたら、またはｂ）培養物を２４時間増殖させたら、培養を停止した。
【0125】
２０Ｌの培地を、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）を使用するガス注入により脱気した。酸化還元値が低下し安定化するまで、６．５Ｌ／分で脱気を行った。初代培養を５％（例えば、接種培養の約１Ｌ）で接種し、培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。培養を１００ｒｐｍで撹拌し、３７℃で増殖させた。図１０に示されているとおり、９０．４ｇのグルコースおよび１１０．８ｇのＮ－アセチルグルコサミンの供給物を２４時間目および４８時間目で加えて、細菌培養を２５時間目から５０時間目の間で指数期に維持させ、５０時間目以降に定常期に移行させた。ａ）増殖の減速の段階が観察されたら、またはｂ）培養物を約７０時間増殖させたら、培養を停止した。
【0126】
ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の大規模増殖
１Ｌの接種培養および１５０Ｌの初代培養のためのベジトン（Ｖｅｇｉｔｏｎｅ）ＭＲＳ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（１０ｇ／Ｌ）、デキストロース（２０ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、クエン酸アンモニウム（０．３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．１ｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（５．５４ｇ／Ｌ）、Ｔｗｅｅｎ ８０（４ｇ／Ｌ）。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
１Ｌの接種培養および１５０Ｌの初代培養のためのベジトン（Ｖｅｇｉｔｏｎｅ）ＭＲＳ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（１０ｇ／Ｌ）、デキストロース（２０ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、クエン酸アンモニウム（０．３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．１ｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（５．５４ｇ／Ｌ）、Ｔｗｅｅｎ ８０（４ｇ／Ｌ）。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
【0127】
ベジトンＭＲＳ培地のｐＨをＮＨ４ＯＨまたは酢酸で６．５±０．１に調整した。ついで、培地を、１２１℃で２０分間オートクレーブすることにより滅菌した。グルコース糖溶液を濾過滅菌した。ついで培地成分を一緒に混合した。
【0128】
ベジトンＭＲＳを含有する接種フラスコを嫌気性チャンバーに移し、嫌気性雰囲気下で４８時間インキュベートすることにより、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２で脱気した。接種培養をＲＣＢまたはＭＣＢ［ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の場合は０．４％］から接種し、嫌気性雰囲気下、攪拌せずに３７℃でインキュベートした。培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。ａ）減速の段階が観察されたら、またはｂ）培養物を２４時間増殖させたら、培養を停止した。
【0129】
２０Ｌの培地を、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）を使用するガス注入により脱気した。酸化還元値が低下し安定化するまで、６．５Ｌ／分で脱気を行った。初代培養に１％（例えば、接種培養物の約２００ｍＬ）で接種し、培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。培養を１００ｒｐｍで撹拌し、３７℃で増殖させた。図１１に示されているとおり、１０時間目および１１時間目に２００ｇのグルコースを加えて、細菌培養を１１時間目から１４時間目の間で指数期に維持させ、１４時間目以降に定常期に移行させた。ａ）増殖の減速の段階が観察されたら、またはｂ）培養物を１６時間増殖させたら、培養を停止した。
【0130】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の大規模増殖
１Ｌの接種培養および２０Ｌの初代培養のためのＹＦＡＰ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、デキストロース（１０ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（１ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．２ｇ／Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（１ｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（５ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１ｇ／Ｌ）。ＹＦＡＰビタミンミックス溶液を、実施例３に記載されているとおりに調製した。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
１Ｌの接種培養および２０Ｌの初代培養のためのＹＦＡＰ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、デキストロース（１０ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（１ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．２ｇ／Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（１ｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（５ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１ｇ／Ｌ）。ＹＦＡＰビタミンミックス溶液を、実施例３に記載されているとおりに調製した。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
【0131】
ＹＦＡＰ培地のｐＨをＮａＯＨで６．５±０．１に調整した。ついで、培地を、１２１℃で２０分間オートクレーブすることにより滅菌した。グルコースおよびＹＦＡＰビタミンミックス溶液を濾過滅菌した（０．２μｍフィルター）。ついで培地成分を一緒に混合した。
【0132】
ＹＦＡＰを含有する接種フラスコを嫌気性チャンバーに移し、嫌気性雰囲気下で少なくとも１６時間インキュベートすることにより、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２で脱気した。接種培養を、リサーチ細胞バンク（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）（ＲＣＢ）またはマスター細胞バンク（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）（ＭＣＢ）から接種し［フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）では０．４％］、嫌気性雰囲気下、攪拌せずに３７℃でインキュベートした。培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。培養物を１０～１６時間増殖させた後、培養を停止した。
【0133】
全ての開放容器操作は、良好な無菌技術を用いて、生物学的安全性キャビネット（ＢＳＣ）または嫌気性チャンバー（ＡＣ）のいずれかにおいて行った。２０Ｌの培地を、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）を使用するガス注入により脱気した。酸化還元値が低下し安定化するまで、６．５Ｌ／分で脱気を行った。初代培養に１％（例えば、接種培養の約２００ｍＬ）で接種し、培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。培養物を１００ｒｐｍで撹拌し、３７℃で増殖させた。図１２に示されているとおり、２００ｇのグルコースの供給物を９時間目に加えて、細胞が９時間目から１４時間目まで増殖を維持することを可能にした。ａ）増殖の減速の段階が観察されたら、またはｂ）培養物を１６時間増殖させたら、培養を停止した。
【0134】
実施例５：細菌の大規模増殖（１５０Ｌ）
本明細書に記載されている細菌株の収量および増殖速度を増加させるために、１５０Ｌの体積の培養において細菌を増殖させるための製造条件を調製した。特に、細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）に関して、収量および増殖速度を増加させるための製造条件を得た。
本明細書に記載されている細菌株の収量および増殖速度を増加させるために、１５０Ｌの体積の培養において細菌を増殖させるための製造条件を調製した。特に、細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）に関して、収量および増殖速度を増加させるための製造条件を得た。
【0135】
アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の大規模増殖
１Ｌの接種培養および１５０Ｌの初代培養のためのＮＡＧＴ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（１６．５ｇ／Ｌ）、酵母エキス（２．５ｇ／Ｌ）、デキストロース（４５．２ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（０．３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．１ｇ／Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（１ｇ／Ｌ）、塩化カルシウム（０．１ｇ／Ｌ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（５．５４ｇ／Ｌ）、Ｌ－スレオニン（４ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１ｇ／Ｌ）。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
１Ｌの接種培養および１５０Ｌの初代培養のためのＮＡＧＴ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（１６．５ｇ／Ｌ）、酵母エキス（２．５ｇ／Ｌ）、デキストロース（４５．２ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（０．３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．１ｇ／Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（１ｇ／Ｌ）、塩化カルシウム（０．１ｇ／Ｌ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（５．５４ｇ／Ｌ）、Ｌ－スレオニン（４ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１ｇ／Ｌ）。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
【0136】
ＮＡＧＴ培地のｐＨをＮＨ４ＯＨまたは酢酸で６．５±０．１に調整した。ついで、培地を、１２１℃で２０分間オートクレーブすることにより滅菌した。グルコースを濾過滅菌した（０．２μｍ）。ついで培地成分を一緒に混合した。
【0137】
ＮＡＧＴを含有する接種フラスコを嫌気性チャンバーに移し、嫌気性雰囲気下で４８時間インキュベートすることによりＮ２Ｈ２ＣＯ２で脱気した。接種培養をＲＣＢまたはＭＣＢから接種し［アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の場合は０．４％］、嫌気性雰囲気下、攪拌せずに３７℃で培養した。培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。ａ）減速の段階が観察されたら、またはｂ）培養物を４８時間増殖させたら、培養を停止した。
【0138】
１５０Ｌの培地を、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）を使用するガス注入により脱気した。酸化還元値が低下し安定化するまで、６．５Ｌ／分で脱気を行った。初代培養を０．４％（例えば、接種培養の約６００ｍＬ）で接種し、培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。培養を１００ｒｐｍで撹拌し、３７℃で増殖させた。図１３に示されているとおり、６７８ｇのグルコースおよび８３１ｇのＮ－アセチルグルコサミンの濾過滅菌供給物を１９時間目に加えて、２０時間目以降に細菌培養物を指数関数的増殖に維持させた。ａ）増殖の減速の段階が観察されたら、またはｂ）培養物を２４時間増殖させたら、培養を停止した。
【0139】
ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の大規模増殖
１Ｌの接種培養および１５０Ｌの初代培養のためのベジトンＭＲＳ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（１０ｇ／Ｌ）、デキストロース（２０ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、クエン酸アンモニウム（０．３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．１ｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（５．５４ｇ／Ｌ）、Ｔｗｅｅｎ ８０（４ｇ／Ｌ）。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
１Ｌの接種培養および１５０Ｌの初代培養のためのベジトンＭＲＳ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（１０ｇ／Ｌ）、デキストロース（２０ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、クエン酸アンモニウム（０．３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．１ｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（５．５４ｇ／Ｌ）、Ｔｗｅｅｎ ８０（４ｇ／Ｌ）。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
【0140】
ベジトンＭＲＳ培地のｐＨをＮＨ４ＯＨまたは酢酸で６．５±０．１に調整した。ついで、培地を、１２１℃で２０分間オートクレーブすることにより滅菌した。グルコースを別々に濾過滅菌した。ついで培地成分を一緒に混合した。
【0141】
ベジトンＭＲＳを含有する接種フラスコを嫌気性チャンバーに移し、嫌気性雰囲気下で４８時間インキュベートすることによりＮ２Ｈ２ＣＯ２で脱気した。接種培養をＲＣＢまたはＭＣＢから接種し［ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の場合は０．４％］、嫌気性雰囲気下、攪拌せずに３７℃で培養した。培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。ａ）減速の段階が観察されたら、またはｂ）培養物を２４時間増殖させたら、培養を停止した。
【0142】
１５０Ｌの培地を、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）を使用するガス注入により脱気した。酸化還元値が低下し安定化するまで、６．５Ｌ／分で脱気を行った。初代培養を０．４％（例えば、接種培養の約６００ｍＬ）で接種し、培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。培養を１００ｒｐｍで撹拌し、３７℃で増殖させた。図１４に示されているとおり、５２５０ｇのグルコースの供給物を１０時間目に加え、細菌培養物を１０時間目から１２時間目まで指数関数的増殖に維持し、１２時間目以降に定常増殖に移行させた。ａ）増殖の減速の段階が観察されたら、またはｂ）培養物を２４時間増殖させたら、培養を停止した。
【0143】
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の大規模増殖
１Ｌの接種培養および１５０Ｌの初代培養のためのＹＦＡＰ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、デキストロース（１０ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（１ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．２ｇ／Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（１ｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（５ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１ｇ／Ｌ）。実施例３に記載されているとおりに、ＹＦＡＰビタミンミックス溶液を調製した。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
１Ｌの接種培養および１５０Ｌの初代培養のためのＹＦＡＰ培地を調製するために、培地成分を以下のとおりに秤量する：エンドウマメペプトン（２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、デキストロース（１０ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（２．５ｇ／Ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（１ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）（０．２ｇ／Ｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（１ｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（５ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１ｇ／Ｌ）。実施例３に記載されているとおりに、ＹＦＡＰビタミンミックス溶液を調製した。全ての成分が完全に溶解し、透明になり、固形物および沈殿物がなくなるまで、混合物を撹拌した。
【0144】
ＹＦＡＰ培地のｐＨをＮａＯＨおよび酢酸で６．５±０．１に調整した。ついで、培地を、１２１℃で２０分間オートクレーブすることにより滅菌した。グルコースおよびＹＦＡＰビタミンミックス溶液を濾過滅菌した（０．２μｍフィルター）。ついで培地成分を一緒に混合した。
【0145】
ＹＦＡＰを含有する接種フラスコを嫌気性チャンバーに移し、嫌気性雰囲気下で少なくとも１６時間インキュベートすることによりＮ２Ｈ２ＣＯ２で脱気した。接種培養をＲＣＢまたはＭＣＢから接種し［フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）では０．４％］、嫌気性雰囲気下、攪拌せずに３７℃で培養した。培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。ａ）減速の段階が観察されたら、またはｂ）培養物を２４時間増殖させたら、培養を停止した。
【0146】
１５０Ｌの培地を、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）を使用するガス注入により脱気した。酸化還元値が低下し安定化するまで、６．５Ｌ／分で脱気を行った。図１５に示されているとおり、初代培養を０．４％（例えば、接種培養の約６００ｍＬ）で接種し、１１時間目から１６時間目まで指数関数的増殖を維持し、培養グルコース消費および光学密度を２時間ごとにモニターした。培養を１００ｒｐｍで撹拌し、３７℃で増殖させた。図１６に示されているとおり、１５０ｇのグルコースの供給物を８時間目に加えて、８時間目以降に細菌培養物が指数関数的増殖を維持することを可能にした。ａ）増殖の減速の段階が観察されたら、またはｂ）培養物を２４時間増殖させたら、培養を停止した。
【0147】
実施例６：細菌の凍結乾燥
大規模増殖条件で増殖させる細菌のための凍結保護物質溶液を調製するために、サッカロース（８０ｇ／Ｌ）、トレハロース（１３．３ｇ／Ｌ）、グルタミン酸ナトリウム（５．３ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１．３ｇ／Ｌ）を水と混合し、濾過滅菌（０．２μｍフィルター）し、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）ガスを使用するガス注入により脱気した。標準校正済み酸化還元プローブで酸化還元状態をモニターした。酸化還元値が低下し安定化して完全な嫌気性状態を示すまで（約６０分）、脱気を続けた。完全に還元された凍結保護物質混合物を密封して、使用するまで空気の侵入を防いだ。全てのシャープルズ（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）遠心分離機および混合タンク成分を、１２１℃で２０分間オートクレーブすることにより、所定の位置で滅菌した。
大規模増殖条件で増殖させる細菌のための凍結保護物質溶液を調製するために、サッカロース（８０ｇ／Ｌ）、トレハロース（１３．３ｇ／Ｌ）、グルタミン酸ナトリウム（５．３ｇ／Ｌ）、Ｌ－システイン（１．３ｇ／Ｌ）を水と混合し、濾過滅菌（０．２μｍフィルター）し、Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）ガスを使用するガス注入により脱気した。標準校正済み酸化還元プローブで酸化還元状態をモニターした。酸化還元値が低下し安定化して完全な嫌気性状態を示すまで（約６０分）、脱気を続けた。完全に還元された凍結保護物質混合物を密封して、使用するまで空気の侵入を防いだ。全てのシャープルズ（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）遠心分離機および混合タンク成分を、１２１℃で２０分間オートクレーブすることにより、所定の位置で滅菌した。
【0148】
細菌を３１時間増殖させ、１０℃に設定された冷却シャープルズ遠心分離機を使用して２０Ｌまたは１５０Ｌの培養から回収した。シリンダー内の細菌を滅菌ブレンダーバッグに直ちに移し、バイオマスの重量を測定した。ついで嫌気性のおよび予め還元された同重量の凍結保護物質溶液をブレンダーバッグに加えた。嫌気性ガスラインをブレンダーバッグの隅に挿入した。Ｎ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）ガスを使用して、細菌と凍結保護物質との混合物に６．５Ｌ／分の流量で５分間、ガス注入した。
【0149】
濃縮細菌と凍結保護物質との混合物が嫌気性状態に維持されることを保証するために嫌気性ガスを注入した後、ブレンダーバッグを密封して二次ブレンダーバッグ内に配置した。該二重壁ブレンダーバッグをＪｕｍｂｏＭｉｘ３５００パドルミキサー内に配置し、Ｓｐｅｅｄ＃３で５分間ブレンドして、均質な嫌気性混合物を得た。
【0150】
均質化後、細菌を含有する凍結保護物質溶液を、１回使い切りの凍結乾燥プレート内にポンプで送った。各プレートを秤量した。表８に挙げられている工程を用いる凍結乾燥のために、プレートを直ちに予冷（－４０℃）凍結乾燥機に移した。
【表8】
【0151】
産物温度が少なくとも２時間安定したら、凍結乾燥操作を終了した。凍結乾燥産物を、１ｍｍの粉砕設定を用いて粉砕し、使用するまで－２０℃で真空密封バッグ内で貯蔵した。
【0152】
実施例７：サンプル中の代謝活性細胞数を測定するための寒天プレーティングとフローサイトメトリーとの比較
細胞懸濁液または生物学的サンプル（例えば、ヒト糞便サンプル）のようなサンプルにおける株の代謝活性細胞の数（例えば、株の効力）に関する一貫した正確な読取りをもたらす能力に関して、２つの異なる技術、すなわち、通常の寒天プレーティングおよびフローサイトメトリーを比較した。評価された株には、本明細書における細菌共生体において使用されうるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）および／またはラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）が含まれる。
細胞懸濁液または生物学的サンプル（例えば、ヒト糞便サンプル）のようなサンプルにおける株の代謝活性細胞の数（例えば、株の効力）に関する一貫した正確な読取りをもたらす能力に関して、２つの異なる技術、すなわち、通常の寒天プレーティングおよびフローサイトメトリーを比較した。評価された株には、本明細書における細菌共生体において使用されうるアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）および／またはラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）が含まれる。
【0153】
例えば、サンプル中のアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）および／またはラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の代謝活性細菌細胞数（ＣＦＵとして定義される）を決定するために、寒天プレーティングの方法をフローサイトメトリーの使用と比較した。
【0154】
図１７Ａ～１７Ｃは、細菌細胞集団（例えば、ヒト対象に投与されうる細胞集団）における代謝活性治療株の定量のための、熱殺菌対照アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞のフローサイトメトリー・ゲーティング実験を示す。例示株として使用したアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）細胞ストック溶液を０．９％ ＮａＣｌバッファー溶液中で１０－４Ｍに希釈し、９５℃の加熱ブロック内に２０分間配置して、実験実施前の細胞死を確認した。細胞を２μＭのヨウ化プロピジウムおよび２μＭのＳＹＴＯ９で染色した。前方散乱領域（ＦＳＣ－Ａ）および側方散乱領域（ＳＳＣ－Ａ）によって計数された全ての細胞（図１７Ａ）にゲートを適用して、それぞれ細胞のサイズおよび粒度に関して選択する。ついで、それらの細胞を前方散乱高（ＦＳＣ－Ｈ）および前方散乱領域（ＦＳＣ－Ａ）に基づいて線形性でゲートして、単一細胞を特定する（図１７Ｂ）。ついで単一細胞を使用して、死細胞（ＰＩｈｉｇｈＳＹＴＯ９ｌｏｗ）および生細胞（ＰＩ－ＳＹＴＯ９ｈｉｇｈ）に関するゲートを設定し、これは５０μｌの溶液中の生細胞および死細胞の百分率を示した（図１７Ｃ）。図１７Ａは、それぞれ細胞サイズおよび粒度を選択するために前方散乱領域（ＦＳＣ－Ａ）および側方散乱領域（ＳＳＣ－Ａ）によって計数された全ての細胞にゲートが適用された場合に得られたフローサイトメトリーの結果を示す。図１７Ｂは、単一細胞を特定するために前方散乱高（ＦＳＣ－Ｈ）および前方散乱領域（ＦＳＣ－Ａ）に基づいて線形性で細胞がゲートされた場合に得られたフローサイトメトリーの結果を示す。図１７Ｃは、死細胞（ＰＩｈｉｇｈＳＹＴＯ９ｌｏｗ）および生細胞（ＰＩ－ＳＹＴＯ９ｈｉｇｈ）用のゲートを設定するために単一細胞を使用した場合に得られたフローサイトメトリーの結果を示し、これは５０μｌの細胞懸濁液中の生細胞および死細胞の百分率を示している。このデータは、代謝的に不活性な細胞（細胞が熱で不活性化されていた）を示す図１７Ｃに示されているとおり、フローサイトメトリー法が、代謝的に活性／不活性な細胞の数を正確に決定しうることを示している。
【0155】
以下の表９は、各希釈度における総生細胞数を計算するために用いられる一連の計算を示す。「総計数細胞数」を計算するために、希釈された及び未染色の細胞を機械により計数し、それに希釈係数を掛け算した（希釈係数×細胞＝総計数細胞数）。「標準偏差」および「平均総細胞数」を「総計数細胞数」から導き出した。「生細胞（％）」は、図１７Ａ～１７Ｃに説明されているコントロールゲートを希釈染色細胞に適用することにより計算された。「生細胞（％）」を「平均総細胞数」に適用して、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）ＭＣＢグリセロールストックにおける「総生細胞数」を計算した。
【表9】
【0156】
株フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）に関しても同様の結果が得られ、このことは、サンプル中の代謝活性治療株の数を正確に測定するためにフローサイトメトリーが使用されうることを実証している。プレーティング法（平板法）を使用して測定された総生細胞と、フローサイトメトリーにより測定されたものとの比較は、フローサイトメトリーがサンプル中の総生細胞数のより正確な測定を可能にしうることを示している（例えば、図１７Ａ～１７Ｃを参照されたい）。
【0157】
また、図１８は、（標準的な）寒天プレーティング法を用いて決定された総生細胞数と生細胞のフローサイトメトリー定量データとを比較するグラフを示す。データは、フローサイトメトリーが、プレーティング法と比較して、サンプル中の総生細胞数の、有意に、より正確な測定（例えば、ＣＦＵ／ｍＬとして定量される）を可能にしたことを示している。左側のｙ軸は、フローサイトメトリーにより測定された総生細胞数を示す。右側のｙ軸は生物学的重複実験のための栄養寒天プレーティングからの算出平均ＣＦＵ／ｍＬ値を示す。両側マンホイットニーｔ検定はそれらの２つの定量法の平均値の間に有意差を示さなかった（ｐ値は０．０５３２）。これらの結果は寒天プレーティング技術の変動性およびＦＡＣＳ技術の相対的一貫性を示しており、生物学的サンプル中の細菌株を定量する方法としてのフローサイトメーターの使用を検証するものである。この技術を用いて試験されうるサンプルには、品質管理の目的で分析されうるヒト糞便サンプルおよび細菌株サンプルが含まれる。
【0158】
総合すると、これらの結果は、（ｉ）サンプル中の代謝活性細胞数と代謝不活性細胞数との比、および（ｉｉ）サンプル中の代謝活性細菌細胞の絶対数を決定するために、本明細書に記載されているフローサイトメトリー法が用いられうることを実証している。
【0159】
実施例８：ｑＰＣＲを使用した糞便ＤＮＡにおける細菌細胞の定量
サンプル中の細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の定量のための、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）の使用を記載する。本実施例は、特異的プライマー、ｑＰＣＲおよび糞便ＤＮＡ（鋳型としてのもの）を使用した株の定量を記載する。
サンプル中の細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の定量のための、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）の使用を記載する。本実施例は、特異的プライマー、ｑＰＣＲおよび糞便ＤＮＡ（鋳型としてのもの）を使用した株の定量を記載する。
【0160】
１．材料
以下の表１０は、株の定量に使用される例示的な株特異的プライマー配列を示す。
以下の表１０は、株の定量に使用される例示的な株特異的プライマー配列を示す。
【表10】
【0161】
ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２３１３）から抽出されたゲノムＤＮＡに関してＰａｃＢｉｏ配列決定を行った。これらのデータを使用して、全ての細菌株の比較ゲノム分析を行って、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）のゲノム内のユニーク領域を特定した。ユニーク領域の特定後、これらの株内に存在するユニーク領域を標的化するｑＰＣＲプライマーペア（前記の表１０を参照されたい）を設計した。
【0162】
この実験において使用された追加的な材料には、以下のものが含まれた：（ｉ）アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）ＤＮＡ；（ｉｉ）ヒト糞便ＤＮＡサンプル対照（株を含有していなかった）；（ｉｉｉ）臨床サンプルから抽出されたＤＮＡ；（ｉｖ）金属３８４ ｑＰＣＲプレートホルダー；（ｖ）ＤＮＡ／ＲＮＡｓｅ非含有滅菌エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブ；および（ｖｉ）ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ ｑＰＣＲサーモサイクラー。
【0163】
２．手順
臨床サンプル名およびＤＮＡ濃度を電子的に計算し、全てのサンプルを１００μＬの最終体積で１０ｎｇ／μＬに正規化した。各実施は、ヒト糞便ＤＮＡバックグラウンドにおいて希釈された純粋な細菌ＤＮＡを使用して作成された７ポイントの陽性対照標準曲線を利用した。これらの標準（「ｓｔｄ」と略記されている）は、使いやすさを考慮して、予め作製され、分注されていた。標準曲線に関しては、標的株ＤＮＡの以下の段階希釈物を実施に含めた（表１１）。
臨床サンプル名およびＤＮＡ濃度を電子的に計算し、全てのサンプルを１００μＬの最終体積で１０ｎｇ／μＬに正規化した。各実施は、ヒト糞便ＤＮＡバックグラウンドにおいて希釈された純粋な細菌ＤＮＡを使用して作成された７ポイントの陽性対照標準曲線を利用した。これらの標準（「ｓｔｄ」と略記されている）は、使いやすさを考慮して、予め作製され、分注されていた。標準曲線に関しては、標的株ＤＮＡの以下の段階希釈物を実施に含めた（表１１）。
【表11】
【0164】
株ＤＮＡ定量実験には以下の物品を使用した。
【表12】
【0165】
計算量の水およびＤＮＡ溶液を適切なウェルに加えた。ｑＰＣＲプレートを密封し、ボルテックスし（５～１０秒）、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
【0166】
３．プライマーストックとマスターミックスの調製
フォワードおよびリバースの株特異的プライマーを完全に解凍し、プライマーストックを１×ＴＥバッファー中で１００μＭに維持した（例えば、表１０を参照されたい）。２本のエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブ（１本はフォワードプライマー用、もう１本はリバースプライマー用）に、３６０μＬの滅菌ＵＳＰ等級ＷＦＩを加えた。ついで４０μＬのフォワードプライマー溶液を加え、ホモジナイズし、リバースプライマー溶液に関しても同じ工程を繰り返した。得られた１０μＭプライマー溶液をＳＹＢＲセレクト・マスターミックス（Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（２×ストック）および滅菌水と一緒にし、ホモジナイズした。
フォワードおよびリバースの株特異的プライマーを完全に解凍し、プライマーストックを１×ＴＥバッファー中で１００μＭに維持した（例えば、表１０を参照されたい）。２本のエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブ（１本はフォワードプライマー用、もう１本はリバースプライマー用）に、３６０μＬの滅菌ＵＳＰ等級ＷＦＩを加えた。ついで４０μＬのフォワードプライマー溶液を加え、ホモジナイズし、リバースプライマー溶液に関しても同じ工程を繰り返した。得られた１０μＭプライマー溶液をＳＹＢＲセレクト・マスターミックス（Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（２×ストック）および滅菌水と一緒にし、ホモジナイズした。
【0167】
ｑＰＣＲ ３８４ウェルプレートを使用して、２０μＬのｑＰＣＲマスターミックスをウェルＡ～Ｎ １～２４およびＯ １～１４内に分注した。ＤＮＡ正規化プレートを使用して、マスターミックスを３５０ウェルの全てに分注した後、Ａ行における全てのウェルの５μＬのＤＮＡを取り、反応プレートのＡ行における奇数ウェルに接種した。ついでＡ行における全てのウェルから５μＬのＤＮＡを移し、反応プレートのＡ行における偶数ウェルに接種した。ＤＮＡを反応プレートに添加するまで、最後の２つの工程を全てのウェルに関して繰り返した。ついで適切な株の標準曲線ストックＤＮＡプレートを生物安全性キャビネットに移し、ついで、反応プレートの設定ごとに行Ｐの正しいウェル内に標準をピペッティングした。混合および遠心分離の後、サンプルをＱｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ｑＰＣＲ機器内に配置した。
【0168】
以下の表１３に示されているとおり、以下のサイクリング条件を用いた。
【表13】
【0169】
以下の表１４は標準曲線対照サイクル閾値（ＣＴ）およびプライマー融解温度（ＴＭ）値を示す。表１４は更に、選択された株フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）およびアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）のそれぞれに関して、（ヒト糞便ＤＮＡバックグラウンドを用いて）株細胞ＤＮＡの量を定量するために使用されうる標準曲線を作成するために使用された株細胞ＤＮＡの標準量（例えば、１ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０１ｎｇおよび０．００１ｎｇ）および水中（例えば、糞便ＤＮＡバックグラウンドの非存在下）の同量の株細胞ＤＮＡ（例えば、１ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０１ｎｇおよび０．００１ｎｇ）の存在下のヒト糞便ＤＮＡにおける株細胞の推定数を示す。
【表14】
【0170】
図１９Ａ～１９Ｃは、それぞれ、３つの選択された株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞に関する、前記表１４に示されている推定株細胞数に対して測定ＣＴ値をプロットすることにより作成された検出曲線の限界を示す。
【0171】
実施例９：マウスモデル系
本明細書は、インビボマウスモデルにおけるアレルギー疾患のような炎症性疾患の治療のための３つの細菌株ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）を含む細菌共生体の能力を評価するための方法を提供する。
本明細書は、インビボマウスモデルにおけるアレルギー疾患のような炎症性疾患の治療のための３つの細菌株ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）を含む細菌共生体の能力を評価するための方法を提供する。
【0172】
気道アレルゲンに対して気管内で感作された若い成体マウスを使用するアレルギー性気道炎症モデルにおいて、実施例２で定められた組成物Ａの経口投与は循環ＩｇＥ免疫グロブリンの上昇を有意に阻害した。また、組成物Ａの経口投与は肺における炎症性Ｔｈ２細胞の増殖を有意に低減し、同時にＴｈ２関連遺伝子発現ならびに炎症性サイトカインＩＬ－４およびＩＬ－１３の肺濃度を減少させた。逆に、組成物Ａは肺における抗炎症性Ｔｒｅｇ細胞の有意な増殖をもたらした。これはアレルギー性喘息関連分子および免疫応答の低減に関連している。また、循環ＩｇＥレベルおよび気道好酸球増加の有意な低減が観察された一方、循環ヒスタミンおよび気道好中球は減少傾向であった。いずれの理論にも束縛されるものではないが、これらの研究に基づけば、アレルギーおよび喘息反応の緩和の提示メカニズムはＴｒｅｇ細胞の増殖およびそれに続くアレルゲン特異的ＩｇＥのＴｈ２駆動性生成の阻害に基づいていた。組成物Ａの投与は、好酸球および好中球を含むエフェクター細胞のアレルギー性喘息関連増殖の阻害にも関連していたため、Ｔｒｅｇ細胞の増殖が非常に重要であると考えられた。アレルギー反応の開始に関与するＩｇＥエフェクター抗体を中和したモノクローナル抗ＩｇＥ抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）とは対照的に、組成物Ａを使用する作用メカニズムはアレルギー感作のカスケードの上流で生じた可能性があり、このことは組成物Ａの予防的な可能性を強調するものである。組成物Ａは、それが、アレルギー反応に関連する新たなＩｇＥおよび炎症性エフェクター細胞の生成を防ぎ、結果として遥かに少ない副作用を有すると予想される点で有利であった。
【0173】
これらの結果は、組成物Ａの細菌共生体がアレルギー性気道炎症の治療に有効であったことを示している。更に、そのような共生体の治療効果はモノクローナル抗ＩｇＥ抗体Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）の場合より優れている可能性がある一方で、副作用は有意に少ないことが観察された。総合すると、これらの結果はヒト対象における臨床試験のための基礎および理論的根拠として用いられうる。
【0174】
実施例１０：アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）原薬（３５００Ｌ）のための最適化された超大規模増殖および製造プロセス
本明細書に記載されている細菌株の収量および増殖速度を増加させるために、図２０に大まかに示されているとおり、３５００Ｌの体積の培養においてアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）を増殖させるための製造条件および手順を調製した。
本明細書に記載されている細菌株の収量および増殖速度を増加させるために、図２０に大まかに示されているとおり、３５００Ｌの体積の培養においてアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）を増殖させるための製造条件および手順を調製した。
【0175】
培地の調製
２５０Ｌの糖供給物（表１５）、３１６０ＬのＮＡＧＴ培地（表１６）、１．２５Ｌの氷酢酸および凍結保護物質混合物（表１７）の成分を秤量した。
２５０Ｌの糖供給物（表１５）、３１６０ＬのＮＡＧＴ培地（表１６）、１．２５Ｌの氷酢酸および凍結保護物質混合物（表１７）の成分を秤量した。
【表15】
【表16】
【表17】
【0176】
糖分画ならびに供給物の調製および除染
３００Ｌの容器および混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。０．２２μｍフィルターを使用して、１２０Ｌの熱軟水を滅菌混合タンクに加えた。糖供給成分の３分の１（重量によるもの）を混合タンクに加え、それらが完全に溶解するまで、１５０ｒｐｍで１０分間撹拌した。ついで糖供給成分の追加的な３分の２および１２０Ｌの熱軟水を混合タンクに加え、完全に溶解させた。糖供給物を、０．２μｍフィルターを使用して濾過滅菌し、３００Ｌの滅菌容器内に貯蔵した。
３００Ｌの容器および混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。０．２２μｍフィルターを使用して、１２０Ｌの熱軟水を滅菌混合タンクに加えた。糖供給成分の３分の１（重量によるもの）を混合タンクに加え、それらが完全に溶解するまで、１５０ｒｐｍで１０分間撹拌した。ついで糖供給成分の追加的な３分の２および１２０Ｌの熱軟水を混合タンクに加え、完全に溶解させた。糖供給物を、０．２μｍフィルターを使用して濾過滅菌し、３００Ｌの滅菌容器内に貯蔵した。
【0177】
３５００Ｌの培地の調製および除染
ＮＡＧＴ培地を調製するために、３，５００Ｌの攪拌発酵槽をＣＩＰにより滅菌し、校正されたｐＨおよび酸化還元（レドックス）センシングプローブを取り付ける。合計４００Ｌの０．２２μｍ濾過水を、予め滅菌された混合タンクに加え、ＮＡＧＴ培地成分と一緒にした。混合物を１５０ｒｐｍで１０分間ホモジナイズした。濃縮培地を３５００Ｌのバイオリアクターに移し、３０７０Ｌの０．２２μｍ濾過軟水を該発酵槽に加えた。培地のｐＨをｐＨ＝６．５に調整した。培地を所定位置で１２１℃で２０分間滅菌した。蒸気滅菌接続を用いて、１００Ｌの糖供給物を滅菌済みＮＡＧＴ培地に加えた。ついで、完成したＮＡＧＴ培地を脱気した。これは、１００ｒｐｍで攪拌しながら、そしてヘッドスペース圧を０．２バールに維持しながら、０．１ｖｖｍの速度でＮ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）ガス混合物を添加するスパージャを使用して行った。ＮＡＧＴ培地の酸化還元値を脱気の開始時からモニターした。酸化還元値が低下し、定常値で１時間維持されるまで、脱気を継続した。ついで、９０ＲＰＭで攪拌しながら、そして０．０１ｖｖｍのガス混合物の注入を行いながら、ＮＡＧＴを、使用するまで１０℃±２℃で貯蔵した。
ＮＡＧＴ培地を調製するために、３，５００Ｌの攪拌発酵槽をＣＩＰにより滅菌し、校正されたｐＨおよび酸化還元（レドックス）センシングプローブを取り付ける。合計４００Ｌの０．２２μｍ濾過水を、予め滅菌された混合タンクに加え、ＮＡＧＴ培地成分と一緒にした。混合物を１５０ｒｐｍで１０分間ホモジナイズした。濃縮培地を３５００Ｌのバイオリアクターに移し、３０７０Ｌの０．２２μｍ濾過軟水を該発酵槽に加えた。培地のｐＨをｐＨ＝６．５に調整した。培地を所定位置で１２１℃で２０分間滅菌した。蒸気滅菌接続を用いて、１００Ｌの糖供給物を滅菌済みＮＡＧＴ培地に加えた。ついで、完成したＮＡＧＴ培地を脱気した。これは、１００ｒｐｍで攪拌しながら、そしてヘッドスペース圧を０．２バールに維持しながら、０．１ｖｖｍの速度でＮ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）ガス混合物を添加するスパージャを使用して行った。ＮＡＧＴ培地の酸化還元値を脱気の開始時からモニターした。酸化還元値が低下し、定常値で１時間維持されるまで、脱気を継続した。ついで、９０ＲＰＭで攪拌しながら、そして０．０１ｖｖｍのガス混合物の注入を行いながら、ＮＡＧＴを、使用するまで１０℃±２℃で貯蔵した。
【0178】
２０Ｌおよび３００Ｌの発酵槽の調製ならびに除染および培地転移
２０Ｌおよび３００Ｌの発酵槽の定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。３５００Ｌの発酵槽からの滅菌コネクターを使用して、１７Ｌおよび３００Ｌの滅菌培地を、それぞれ、２０Ｌの発酵槽および３００Ｌの発酵槽に移した。
２０Ｌおよび３００Ｌの発酵槽の定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。３５００Ｌの発酵槽からの滅菌コネクターを使用して、１７Ｌおよび３００Ｌの滅菌培地を、それぞれ、２０Ｌの発酵槽および３００Ｌの発酵槽に移した。
【0179】
初期接種の準備
１Ｌの滅菌済みＮＡＧＴ培地を２０Ｌの発酵槽から滅菌済みの１本のボトルに移した。ついで該滅菌済みボトルを嫌気性チャンバーに移した。１９．２ｍＬのＷＣＢアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）を嫌気性チャンバー内で解凍し、滅菌済みピペット接種物を使用して１Ｌの還元ＮＡＧＴ培地に接種した（２％ ｖ／ｖ 接種率）。細胞と培地との混合物を穏やかな回転によりホモジナイズし、５８５ｎｍ（ＯＤ６００）で定期的に光学密度を測定しながら３７℃でインキュベートした。図２１は、この期間中に培養物のＯＤ５８５が着実に上昇したことを示している。ａ）ＯＤ６００＞１になったら、またはｂ）培養物を４８時間増殖させたら、培養を停止した。
１Ｌの滅菌済みＮＡＧＴ培地を２０Ｌの発酵槽から滅菌済みの１本のボトルに移した。ついで該滅菌済みボトルを嫌気性チャンバーに移した。１９．２ｍＬのＷＣＢアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）を嫌気性チャンバー内で解凍し、滅菌済みピペット接種物を使用して１Ｌの還元ＮＡＧＴ培地に接種した（２％ ｖ／ｖ 接種率）。細胞と培地との混合物を穏やかな回転によりホモジナイズし、５８５ｎｍ（ＯＤ６００）で定期的に光学密度を測定しながら３７℃でインキュベートした。図２１は、この期間中に培養物のＯＤ５８５が着実に上昇したことを示している。ａ）ＯＤ６００＞１になったら、またはｂ）培養物を４８時間増殖させたら、培養を停止した。
【0180】
２０Ｌの接種
２０Ｌの培地を３７℃に加温した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、培地を脱気した。
２０Ｌの培地を３７℃に加温した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、培地を脱気した。
【表18】
【0181】
標準的な酸化還元センサーにより測定した酸化還元値が１時間にわたって安定化するまで、脱気を継続した。滅菌済み三方弁を２０Ｌ発酵槽に接続した。アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の１Ｌの接種培養物全体（５％ ｖ／ｖ 接種）を三方弁を介して２０Ｌ発酵槽に添加した。２０Ｌの培養物の光学密度を、ＯＤ５８５を使用してモニターした。図２２は、この期間中に培養物のＯＤ５８５が着実に上昇したことを示している。以下の基準のいずれかに達したら、培養を停止した：ａ）ＯＤ５８５＞１．５、ｂ）総培養時間が４８時間に達した、またはｃ）後続の３回のＯＤ５８５測定の後に増殖速度の低下が検出された。
【0182】
３００Ｌの接種
３００Ｌの培地を３７℃に加温した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、培地を脱気した。標準的な酸化還元センサーにより測定した酸化還元値が１時間にわたって安定化するまで、脱気を継続した。滅菌済み三方弁を３００Ｌ発酵槽に接続した。２０Ｌ発酵槽からのアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の１５Ｌの接種培養物（５％ ｖ／ｖ 接種）を三方弁を介して３００Ｌ発酵槽に添加した。２０Ｌの培養物の光学密度を、ＯＤ５８５を使用してモニターした。図２３は、この期間中に培養物のＯＤ６００が着実に上昇したことを示している。以下の基準のいずれかに達したら、培養を停止した：ａ）ＯＤ５８５＞１．５、ｂ）総培養時間が４８時間に達した、またはｃ）後続の３回のＯＤ５８５測定の後に増殖速度の低下が検出された。
３００Ｌの培地を３７℃に加温した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、培地を脱気した。標準的な酸化還元センサーにより測定した酸化還元値が１時間にわたって安定化するまで、脱気を継続した。滅菌済み三方弁を３００Ｌ発酵槽に接続した。２０Ｌ発酵槽からのアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の１５Ｌの接種培養物（５％ ｖ／ｖ 接種）を三方弁を介して３００Ｌ発酵槽に添加した。２０Ｌの培養物の光学密度を、ＯＤ５８５を使用してモニターした。図２３は、この期間中に培養物のＯＤ６００が着実に上昇したことを示している。以下の基準のいずれかに達したら、培養を停止した：ａ）ＯＤ５８５＞１．５、ｂ）総培養時間が４８時間に達した、またはｃ）後続の３回のＯＤ５８５測定の後に増殖速度の低下が検出された。
【0183】
３５００Ｌの接種
３５００Ｌの培地を３７℃に加温した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、培地を脱気した。標準的な酸化還元センサーにより測定した酸化還元値が１時間にわたって安定化するまで、脱気を継続した。３００Ｌ発酵槽を３５００Ｌ発酵槽に接続した。３００Ｌ発酵槽からのアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の３００Ｌの接種培養物（８～１０％ ｖ／ｖ 接種）を３５００Ｌ発酵槽に添加した。グルコース濃度が２ｇ／Ｌ未満に低下したら、更に９０Ｌの糖供給物を添加した。２０Ｌの培養物の光学密度を、ＯＤ５８５を使用してモニターした。図２４は、この期間中に培養物のＯＤ５８５が着実に上昇したことを示している。以下の基準のいずれかに達したら、培養を停止した：ａ）ＯＤ５８５＞２．５、ｂ）総培養時間が７２時間に達した、またはｃ）後続の３回のＯＤ５８５測定の後に増殖速度の低下が検出された。これらのパラメーターの１つが満たされたら、培養の冷却を開始するために発酵槽を４℃＋／－３℃に設定した。
３５００Ｌの培地を３７℃に加温した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、培地を脱気した。標準的な酸化還元センサーにより測定した酸化還元値が１時間にわたって安定化するまで、脱気を継続した。３００Ｌ発酵槽を３５００Ｌ発酵槽に接続した。３００Ｌ発酵槽からのアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の３００Ｌの接種培養物（８～１０％ ｖ／ｖ 接種）を３５００Ｌ発酵槽に添加した。グルコース濃度が２ｇ／Ｌ未満に低下したら、更に９０Ｌの糖供給物を添加した。２０Ｌの培養物の光学密度を、ＯＤ５８５を使用してモニターした。図２４は、この期間中に培養物のＯＤ５８５が着実に上昇したことを示している。以下の基準のいずれかに達したら、培養を停止した：ａ）ＯＤ５８５＞２．５、ｂ）総培養時間が７２時間に達した、またはｃ）後続の３回のＯＤ５８５測定の後に増殖速度の低下が検出された。これらのパラメーターの１つが満たされたら、培養の冷却を開始するために発酵槽を４℃＋／－３℃に設定した。
【0184】
遠心分離
ＧＥＡ遠心分離機および混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。混合ガスライン（Ｎ２Ｈ２ＣＯ２、９０：５：５）をＧＥＡ遠心分離機および混合タンクに接続し、ＧＥＡ遠心分離機および混合タンクを３０分間脱気した。表１９に挙げられているシャープルズ（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）パラメーターを使用して、３５００Ｌの培養物を遠心分離した。
ＧＥＡ遠心分離機および混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。混合ガスライン（Ｎ２Ｈ２ＣＯ２、９０：５：５）をＧＥＡ遠心分離機および混合タンクに接続し、ＧＥＡ遠心分離機および混合タンクを３０分間脱気した。表１９に挙げられているシャープルズ（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）パラメーターを使用して、３５００Ｌの培養物を遠心分離した。
【表19】
【0185】
濃縮細菌画分（バイオマス）を脱気混合タンク内に収集した。収集された濃縮バイオマスの重量を測定した。
【0186】
凍結保護物質溶液の調製および濃縮バイオマスへの添加
混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。７５Ｌの０．２２μｍ濾過熱軟水を混合タンクに加えた。凍結保護物質混合物成分の３分の１を、それらが完全に溶解するまで、混合タンクに加えた。追加的な２０Ｌの濾過軟水を加えた。混合物を１５０ｒｐｍで１０分間ホモジナイズした。凍結保護物質溶液を滅菌済みバイオリアクターに移した。該溶液のベースライン酸化還元値を記録した。表２０に挙げられているパラメーターを使用して、凍結保護物質溶液を脱気した。
混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。７５Ｌの０．２２μｍ濾過熱軟水を混合タンクに加えた。凍結保護物質混合物成分の３分の１を、それらが完全に溶解するまで、混合タンクに加えた。追加的な２０Ｌの濾過軟水を加えた。混合物を１５０ｒｐｍで１０分間ホモジナイズした。凍結保護物質溶液を滅菌済みバイオリアクターに移した。該溶液のベースライン酸化還元値を記録した。表２０に挙げられているパラメーターを使用して、凍結保護物質溶液を脱気した。
【表20】
【0187】
脱気した凍結保護物質溶液を混合タンク内の嫌気性濃縮バイオマスに１：１（ｗ／ｗ）の比で加えた。凍結乾燥に利用可能なバイオマスおよび凍結保護物質の総質量および体積を記録した。
【0188】
凍結乾燥および粉砕
滅菌済みプラスチック凍結乾燥トレイに、総厚が１ｃｍ（これはトレイ当たりの細胞および凍結保護物質混合物の１．５Ｌに相当する）を超えないように充填した。凍結プロセスを促進するために、トレイを、それらに充填しながら、予め凍結された凍結乾燥機棚に移動させた。表２１に挙げられているパラメーターに従い、凍結乾燥サイクルを開始した。
滅菌済みプラスチック凍結乾燥トレイに、総厚が１ｃｍ（これはトレイ当たりの細胞および凍結保護物質混合物の１．５Ｌに相当する）を超えないように充填した。凍結プロセスを促進するために、トレイを、それらに充填しながら、予め凍結された凍結乾燥機棚に移動させた。表２１に挙げられているパラメーターに従い、凍結乾燥サイクルを開始した。
【表21】
【0189】
凍結乾燥した物質を、スペーサー１および１ｍｍのグリッドを使用して、速度１で粉砕した。粉砕後、凍結乾燥した細胞物質を、１．５ｋｇ以下の物質をそれぞれが含有するポリエチレン（ＰＥ）バッグ内に直ちに密封した。凍結乾燥した細胞物質を－１８℃未満で貯蔵し、実施例２に定められているとおりに組成物Ａを製造するために使用した。
【0190】
実施例１１：フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）原薬（３５００Ｌ）の最適化された超大規模増殖および製造プロセス
本明細書に記載されている細菌株の収量および増殖速度を増加させるために、図２５に大まかに示されているとおり、３５００Ｌの体積の培養においてフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）を増殖させるための製造条件および手順を調製した。
本明細書に記載されている細菌株の収量および増殖速度を増加させるために、図２５に大まかに示されているとおり、３５００Ｌの体積の培養においてフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）を増殖させるための製造条件および手順を調製した。
【0191】
培地の調製
２５０Ｌの糖供給物（表２２）、３１６０ＬのＹＦＡＰ培地（表２３）および凍結保護物質混合物（表２４）の成分を秤量した。
２５０Ｌの糖供給物（表２２）、３１６０ＬのＹＦＡＰ培地（表２３）および凍結保護物質混合物（表２４）の成分を秤量した。
【表22】
【表23】
【表24】
【0192】
糖分画ならびに供給物の調製および除染
３００Ｌの容器および混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。０．２２μｍフィルターを使用して、１２０Ｌの熱軟水を滅菌混合タンクに加えた。糖供給成分の３分の１（重量によるもの）を混合タンクに加え、それらが完全に溶解するまで、１５０ｒｐｍで１０分間撹拌した。ついで糖供給成分の追加的な３分の２および１３０Ｌの熱軟水を混合タンクに加え、完全に溶解させた。糖供給物を、０．２μｍフィルターを使用して濾過滅菌し、３００Ｌの滅菌容器内に貯蔵した。
３００Ｌの容器および混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。０．２２μｍフィルターを使用して、１２０Ｌの熱軟水を滅菌混合タンクに加えた。糖供給成分の３分の１（重量によるもの）を混合タンクに加え、それらが完全に溶解するまで、１５０ｒｐｍで１０分間撹拌した。ついで糖供給成分の追加的な３分の２および１３０Ｌの熱軟水を混合タンクに加え、完全に溶解させた。糖供給物を、０．２μｍフィルターを使用して濾過滅菌し、３００Ｌの滅菌容器内に貯蔵した。
【0193】
３５００Ｌの培地の調製および除染
ＹＦＡＰ培地を調製するために、３，５００Ｌの攪拌タンクバイオリアクターをＣＩＰにより滅菌し、校正されたｐＨおよび酸化還元（レドックス）センシングプローブを取り付ける。合計４００Ｌの０．２２μｍ濾過水を、予め滅菌された混合タンクに加え、ＹＦＡＰ培地成分と一緒にし、１５０ｒｐｍで１０分間ホモジナイズした。濃縮培地を３５００Ｌのバイオリアクターに移し、３０７０Ｌの０．２２μｍ濾過軟水を該バイオリアクターに加えた。蒸気滅菌接続を用いて、１００Ｌの糖供給物を滅菌済みＹＦＡＰ培地に加えた。６３２ｍｌのビタミンミックス溶液を加えた。ついで、完成したＹＦＡＰ培地を脱気する。これは、１００ｒｐｍで攪拌しながら、そしてヘッドスペース圧を０．２バールに維持しながら、０．１ｖｖｍの速度でＮ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）ガス混合物を添加するスパージャを使用して行った。
ＹＦＡＰ培地を調製するために、３，５００Ｌの攪拌タンクバイオリアクターをＣＩＰにより滅菌し、校正されたｐＨおよび酸化還元（レドックス）センシングプローブを取り付ける。合計４００Ｌの０．２２μｍ濾過水を、予め滅菌された混合タンクに加え、ＹＦＡＰ培地成分と一緒にし、１５０ｒｐｍで１０分間ホモジナイズした。濃縮培地を３５００Ｌのバイオリアクターに移し、３０７０Ｌの０．２２μｍ濾過軟水を該バイオリアクターに加えた。蒸気滅菌接続を用いて、１００Ｌの糖供給物を滅菌済みＹＦＡＰ培地に加えた。６３２ｍｌのビタミンミックス溶液を加えた。ついで、完成したＹＦＡＰ培地を脱気する。これは、１００ｒｐｍで攪拌しながら、そしてヘッドスペース圧を０．２バールに維持しながら、０．１ｖｖｍの速度でＮ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）ガス混合物を添加するスパージャを使用して行った。
【0194】
初期接種の準備
１．６Ｌの滅菌済みＹＦＡＰ培地を３００Ｌの発酵槽から滅菌済みの２Ｌフラスコに移した。ついで該滅菌済みボトルを嫌気性チャンバーに移した。６．４ｍＬのＷＣＢフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）を嫌気性チャンバー内で解凍し、滅菌済みピペット接種物を使用して１Ｌの還元ＹＦＡＰ培地に接種した（０．４％ ｖ／ｖ 接種率）。細胞と培地との混合物を穏やかな回転によりホモジナイズし、５８５ｎｍ（ＯＤ５８５）で定期的に光学密度を測定しながら３７℃でインキュベートした。図２６は、この期間中に培養物のＯＤ５８５が着実に上昇したことを示している。ａ）ＯＤ５８５＞３になったら、またはｂ）培養物を４８時間増殖させたら、培養を停止した。
１．６Ｌの滅菌済みＹＦＡＰ培地を３００Ｌの発酵槽から滅菌済みの２Ｌフラスコに移した。ついで該滅菌済みボトルを嫌気性チャンバーに移した。６．４ｍＬのＷＣＢフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）を嫌気性チャンバー内で解凍し、滅菌済みピペット接種物を使用して１Ｌの還元ＹＦＡＰ培地に接種した（０．４％ ｖ／ｖ 接種率）。細胞と培地との混合物を穏やかな回転によりホモジナイズし、５８５ｎｍ（ＯＤ５８５）で定期的に光学密度を測定しながら３７℃でインキュベートした。図２６は、この期間中に培養物のＯＤ５８５が着実に上昇したことを示している。ａ）ＯＤ５８５＞３になったら、またはｂ）培養物を４８時間増殖させたら、培養を停止した。
【0195】
３００Ｌの接種
１５０Ｌの滅菌済み培地を３００Ｌの滅菌済み発酵槽に移した。３００Ｌ発酵槽内のＹＦＡＰ培地を、０．１ｖｖｍで２時間にわたってスパージャを使用してＮ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）で脱気した。３００Ｌの培地を３７℃に加温した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、培地を脱気した。
１５０Ｌの滅菌済み培地を３００Ｌの滅菌済み発酵槽に移した。３００Ｌ発酵槽内のＹＦＡＰ培地を、０．１ｖｖｍで２時間にわたってスパージャを使用してＮ２Ｈ２ＣＯ２（９０：５：５）で脱気した。３００Ｌの培地を３７℃に加温した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、培地を脱気した。
【0196】
標準的な酸化還元センサーにより測定した酸化還元値が１時間にわたって安定化するまで、脱気を継続した。滅菌済み三方弁を３００Ｌ発酵槽に接続した。フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の１Ｌの全接種培養物（２％ ｖ／ｖ 接種）を三方弁を介して２０Ｌ発酵槽に添加した。２０Ｌの培養物の光学密度を、ＯＤ５８５を使用してモニターした。図２７は、この期間中に培養物のＯＤ５８５が着実に上昇したことを示している。以下の基準のいずれかに達したら、培養を停止した：ａ）ＯＤ５８５＞５、ｂ）総培養時間が４８時間に達した、またはｃ）後続の３回のＯＤ５８５測定の後に増殖速度の低下が検出された。
【0197】
３５００Ｌの接種
約３５００Ｌの培地を３７℃に加温した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、培地を脱気した。標準的な酸化還元センサーにより測定した酸化還元値が１時間にわたって安定化するまで、脱気を継続した。３００Ｌ発酵槽を３５００Ｌ発酵槽に接続した。３００Ｌ発酵槽からのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の３０Ｌの接種培養物（８～１０％ ｖ／ｖ 接種）を３５００Ｌ発酵槽に添加した。２０Ｌの培養物の光学密度を、ＯＤ５８５を使用してモニターした。図２８は、この期間中に培養物のＯＤ５８５が着実に上昇したことを示している。以下の基準のいずれかに達したら、培養を停止した：ａ）ＯＤ５８５＞５、ｂ）総培養時間が７２時間に達した、またはｃ）後続の３回のＯＤ５８５測定の後に増殖速度の低下が検出された。これらのパラメーターの１つが満たされたら、培養の冷却を開始するために発酵槽を４℃＋／－３℃に設定した。
約３５００Ｌの培地を３７℃に加温した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、培地を脱気した。標準的な酸化還元センサーにより測定した酸化還元値が１時間にわたって安定化するまで、脱気を継続した。３００Ｌ発酵槽を３５００Ｌ発酵槽に接続した。３００Ｌ発酵槽からのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の３０Ｌの接種培養物（８～１０％ ｖ／ｖ 接種）を３５００Ｌ発酵槽に添加した。２０Ｌの培養物の光学密度を、ＯＤ５８５を使用してモニターした。図２８は、この期間中に培養物のＯＤ５８５が着実に上昇したことを示している。以下の基準のいずれかに達したら、培養を停止した：ａ）ＯＤ５８５＞５、ｂ）総培養時間が７２時間に達した、またはｃ）後続の３回のＯＤ５８５測定の後に増殖速度の低下が検出された。これらのパラメーターの１つが満たされたら、培養の冷却を開始するために発酵槽を４℃＋／－３℃に設定した。
【0198】
遠心分離
ＧＥＡ遠心分離機および混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。混合ガスライン（Ｎ２Ｈ２ＣＯ２、９０：５：５）をＧＥＡ遠心分離機および混合タンクに接続し、ＧＥＡ遠心分離機および混合タンクを３０分間脱気した。表１９に挙げられているシャープルズ（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）パラメーターを使用して、３５００Ｌの培養物を遠心分離した。
ＧＥＡ遠心分離機および混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。混合ガスライン（Ｎ２Ｈ２ＣＯ２、９０：５：５）をＧＥＡ遠心分離機および混合タンクに接続し、ＧＥＡ遠心分離機および混合タンクを３０分間脱気した。表１９に挙げられているシャープルズ（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）パラメーターを使用して、３５００Ｌの培養物を遠心分離した。
【0199】
濃縮細菌画分（バイオマス）を脱気混合タンク内に収集した。収集された濃縮バイオマスの重量を測定した。
【0200】
凍結保護物質溶液の調製および濃縮バイオマスへの添加
混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。７５Ｌの０．２２μｍ濾過熱軟水を混合タンクに加えた。凍結保護物質混合物成分の３分の１を、それらが完全に溶解するまで、混合タンクに加えた。追加的な２０Ｌの濾過軟水を加えた。ついで追加的な３分の２の凍結保護物質成分を混合タンクに加え、溶解させた。混合物を１５０ｒｐｍで１０分間ホモジナイズした。凍結保護物質溶液を滅菌済みバイオリアクターに移した。該溶液のベースライン酸化還元値を記録した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、凍結保護物質溶液を脱気した。
混合タンクの定置洗浄（ＣＩＰ）を完了した。７５Ｌの０．２２μｍ濾過熱軟水を混合タンクに加えた。凍結保護物質混合物成分の３分の１を、それらが完全に溶解するまで、混合タンクに加えた。追加的な２０Ｌの濾過軟水を加えた。ついで追加的な３分の２の凍結保護物質成分を混合タンクに加え、溶解させた。混合物を１５０ｒｐｍで１０分間ホモジナイズした。凍結保護物質溶液を滅菌済みバイオリアクターに移した。該溶液のベースライン酸化還元値を記録した。表１８に挙げられているパラメーターを使用して、凍結保護物質溶液を脱気した。
【0201】
脱気した凍結保護物質溶液を混合タンク内の嫌気性濃縮バイオマスに１：１（ｗ／ｗ）の比で加えた。凍結乾燥に利用可能なバイオマスおよび凍結保護物質の総質量および体積を記録した。
【0202】
凍結乾燥および粉砕
滅菌済みプラスチック凍結乾燥トレイに、総厚が１ｃｍ（これはトレイ当たりの細胞および凍結保護物質混合物の１．５Ｌに相当する）を超えないように充填した。凍結プロセスを促進するために、トレイを、それらに充填しながら、予め凍結された凍結乾燥機棚に移動させた。表２１に挙げられているパラメーターに従い、凍結乾燥サイクルを開始した。
滅菌済みプラスチック凍結乾燥トレイに、総厚が１ｃｍ（これはトレイ当たりの細胞および凍結保護物質混合物の１．５Ｌに相当する）を超えないように充填した。凍結プロセスを促進するために、トレイを、それらに充填しながら、予め凍結された凍結乾燥機棚に移動させた。表２１に挙げられているパラメーターに従い、凍結乾燥サイクルを開始した。
【0203】
凍結乾燥した物質を、スペーサー１および１ｍｍのグリッドを使用して、速度１で粉砕した。粉砕後、凍結乾燥した細胞物質を、１．５ｋｇ以下の物質をそれぞれが含有するポリエチレン（ＰＥ）バッグ内に直ちに密封した。凍結乾燥した細胞物質を－１８℃未満で貯蔵し、実施例２に定められているとおりに組成物Ａを製造するために使用した。
【0204】
実施例１２：臨床試験の設計
ヒトにおける最初の試験の設計を用いて、アレルギー疾患の予防および治療のために提供される細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）からなる細菌共生体を含む経口投与可能な医薬組成物を評価する。
ヒトにおける最初の試験の設計を用いて、アレルギー疾患の予防および治療のために提供される細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）からなる細菌共生体を含む経口投与可能な医薬組成物を評価する。
【0205】
本実施例の試験は、（２以上のアレルゲンに対して）多重感作された、他の点では健康なヒト被験者（ヒト対象）における、細菌株アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）からなる細菌共生体の第１ｂ相・多施設・無作為化・二重盲検・プラセボ対照・並行群・３連続部分の試験として設計されている。
【0206】
循環ＩｇＥレベル（総レベルおよび特異的レベルの両方）、免疫細胞数、糞便マイクロバイオーム組成、糞便および血漿代謝プロファイル、糞便および血漿免疫刺激能（インビトロ分析）、ならびにベースラインから治療終了までの症状スコアにおける変化を測定することにより、細菌組成物Ａの治療機能を評価する。
【0207】
被験者を３つのカテゴリーに分ける（例えば、図２９を参照されたい）。第１カテゴリーは１８～４０歳の約２０名の被験者を含み、被験者は２以上のアレルゲンに対して多重感作されており、それ以外の点では健康である（男性：女性；約１：１）（無作為化 ３：１ 試験：プラセボ）。第２カテゴリーは１２～１７歳の約２０名の被験者を含み、被験者は２以上のアレルゲンに対して多重感作されており、それ以外の点では健康である（男性：女性；約１：１）（無作為化 ３：１ 試験：プラセボ）。第３カテゴリーは２～１１歳の約２０名の被験者を含み、被験者は２以上のアレルゲンに対して多重感作されており、それ以外の点では健康である（男性：女性、約１：１）。組成物Ａ対プラセボに関して３：１で被験者を無作為化する。
【0208】
ヒト被験者の治療は組成物Ａの１日２回の２８日間の経口投与（約１２時間＋／－４時間ごとの、食物またはミルクと混合することによるもの）からなる。組成物Ａの各１ｍＬ用量はそれぞれのラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）の５×１０８ ＣＦＵ／細菌種を含有する。
【0209】
組成物Ａは、ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）の３つの生細菌株を含有する生きた生物療法製品（生物学的製剤）であり、それぞれは用量当たり５×１０８ ＣＦＵで存在する。組成物Ａは、３つ全ての細菌種を含有する単一の凍結グリセロールストックとして供給される。組成物Ａの各用量は、シリコーンワッシャーシール付きの２ｍＬのポリプロピレンスクリューキャップバイアル内で提供される。バイアルは、緩衝化グリセロール溶液に懸濁された３つ全ての生細菌株を含有する。緩衝化グリセロール溶液は標準的リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）、２０％ ｖ／ｖ グリセロールおよび抗酸化剤としての０．１％ ｗ／ｗ システインから構成される。組成物Ａの用量の体積は約１ｍＬである。
【0210】
本実施例の目的のために、組成物Ａを－７０℃で貯蔵し、温度ログ（ｌｏｇ）を維持する。組成物Ａは、ヒト被験者に提供されたら、－１８℃以下の冷凍庫内で貯蔵される。製品の効力および純度を維持するために、消費のために解凍する前には、組成物Ａの用量は、そのクライオバイアル（例えば、２ｍＬのクライオバイアル）容器内に密封された状態で維持される。組成物Ａの凍結ストックは、室温で５～１０分間解凍され、投薬指示に記載されているとおりに直ちに使用される。
【0211】
本実施例におけるプラセボ治療は、賦形剤［プラセボ： ２０％ ｖ／ｖ グリセロールおよび０．１％ ｗ／ｗ システインを含有する、製品製剤化に関して記載されているとおりのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）］の１日２回の２８日間の経口投与（約１２±４時間ごとの、食物またはミルクと混合することによるもの）からなる。各１ｍＬ用量は体積において試験製品と同じであろう。凍結ストックを室温で５～１０分間解凍する。ついでバイアルの内容物を適切な量（１～２オンス）の冷却または室温のミルク（母乳、液体乳児用調合乳、牛乳、アーモンドミルク、豆乳を含む）またはアップルソースおよびヨーグルトのような食物中に直ちに混合する。
【0212】
図２９に示されているとおり、スクリーニング訪問が第１日（ベースライン訪問）の２８日前から７日前までに行われる。投与を第１日から開始する。被験者は２８日間治療され、第８日、第１５日、第２２日および第２９日の後続訪問を伴う。フォローアップ訪問は第４３日および第５７日に行われる。ベースライン後の各訪問は±１日のウィンドウを有する。
【0213】
評価は、（ｉ）有害事象の報告；（ｉｉ）併用薬の報告；（ｉｉｉ）身体検査の実施およびバイタルサイン；ならびに（ｉｖ）血清化学、肝および腎機能パネル、血液学、鑑別を伴う全血球数および尿検査を含む臨床検査により、２８日間の治療期間中およびその後の最大２８日（第５７日）の休薬期間中に行う。この試験の第３の部においては、安全性評価のための、血液および尿のサンプルの収集を行わない。血液および尿のサンプル採取を要するものを除く全ての他の評価を行う。
【0214】
追加的な評価を、以下のパラメーターにおける、ベースラインから治療終了までの変化を評価することにより行う：（ｉ）糞便マイクロバイオーム分析（細菌組成）；（ｉｉ）糞便および血漿代謝プロファイリング；（ｉｉｉ）糞便および血漿免疫刺激能（インビトロ分析）；（ｉｖ）総ＩｇＥおよび特異的ＩｇＥレベル；（ｖ）循環免疫細胞プロファイリング；（ｖｉ）質問票ならびに副作用（ＡＥ）および服薬の日誌報告。
【0215】
この試験においては種々の臨床試験変量を測定する。血液学的変量には、ヘマトクリット、ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球容積、血小板数、赤血球分布幅、赤血球数および白血球数（鑑別を伴うもの）が含まれる。尿検査のパラメーターには、外観（例えば、色および特性）、ビリルビン、ウロビリノーゲン、タンパク質含有量、グルコースレベル（血糖値）、ケトン、白血球エステラーゼ、尿血、亜硝酸塩、ｐＨおよび比重が含まれる。生化学的パラメーターには、グルコースレベル（血糖値）、尿酸、ＢＵＮ（血中尿素窒素）、クレアチニン、ＢＵＮ／クレアチニン比、ｅＧＦＲ（推定糸球体濾過率）、ナトリウム、カリウム、塩化物、炭酸水素塩、カルシウム、アルブミン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼレベル、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）レベル、ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、総コレステロールレベルおよびトリグリセリドレベルが含まれる。
【0216】
実施例１３：凍結細菌細胞の生存性
グリセロール中の凍結したアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の生存性を調べた。約５×１０８ ＣＦＵのアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、約５×１０８ ＣＦＵのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）および約５×１０８ ＣＦＵのラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）をグリセロール中で混合し凍結した。凍結細菌細胞を－７０℃で貯蔵した。細菌細胞の生存性を貯蔵後１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月および１２ヶ月の時点で評価した。評価を表２２に示す。
グリセロール中の凍結したアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）の生存性を調べた。約５×１０８ ＣＦＵのアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、約５×１０８ ＣＦＵのフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）および約５×１０８ ＣＦＵのラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）をグリセロール中で混合し凍結した。凍結細菌細胞を－７０℃で貯蔵した。細菌細胞の生存性を貯蔵後１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月および１２ヶ月の時点で評価した。評価を表２２に示す。
【表25】
【0217】
実施例１４：凍結乾燥医薬品カプセルおよび液体組成物容器
実施例２において定められている組成物Ａを、薬学的に許容される賦形剤を使用してカプセル内に封入する。カプセルは標準サイズ０またはサイズ１である。カプセルはタピオカプルランのような植物由来材料から構成される。それはデンプン非含有、グルテン非含有および保存剤非含有である。カプセルは３７℃で崩壊する。カプセルの９０％超は水、ｐＨ＝１．２の溶液、酢酸ナトリウムバッファーＵＳＰ（ｐＨ＝４．５）またはリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝７．２）中で６０分以内に溶解する。カプセルは、脱イオン水を使用した３７℃での測定で１．６分の崩壊エンドポイントを有する。カプセルは、カプセル内のガス組成による測定で０．５以下の酸素透過性（ｃｍ３／ｍ２／日）を有する。カプセルは、図３０に示されているとおりに経口投与される。組成物Ａはまた、２ｍＬ ポリプロピレンスクリューキャップバイアル内に存在し、図３０に示されているとおりに経口投与される。
実施例２において定められている組成物Ａを、薬学的に許容される賦形剤を使用してカプセル内に封入する。カプセルは標準サイズ０またはサイズ１である。カプセルはタピオカプルランのような植物由来材料から構成される。それはデンプン非含有、グルテン非含有および保存剤非含有である。カプセルは３７℃で崩壊する。カプセルの９０％超は水、ｐＨ＝１．２の溶液、酢酸ナトリウムバッファーＵＳＰ（ｐＨ＝４．５）またはリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝７．２）中で６０分以内に溶解する。カプセルは、脱イオン水を使用した３７℃での測定で１．６分の崩壊エンドポイントを有する。カプセルは、カプセル内のガス組成による測定で０．５以下の酸素透過性（ｃｍ３／ｍ２／日）を有する。カプセルは、図３０に示されているとおりに経口投与される。組成物Ａはまた、２ｍＬ ポリプロピレンスクリューキャップバイアル内に存在し、図３０に示されているとおりに経口投与される。
【0218】
実施例１５：乳児および新生児におけるアレルギー状態を予防するための臨床試験の設計
組成物Ａの更なる試験： 各用量は、それぞれ等量［５×１０８ＣＦＵ／アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）］の合計１．５×１０９ＣＦＵおよび炭水化物ベースの賦形剤を含有し、アレルギー疾患の発生リスクの高い新生児および乳児被験者においてプラセボ（外観が同一の賦形剤溶液）と比較される。組成物Ａまたはプラセボの１ｍＬを、母乳、粉ミルクまたは食物中に混合して、１日１回、２８日間（パートＡ）および３３６日間（パートＢ）にわたって経口（口腔により）投与される。
組成物Ａの更なる試験： 各用量は、それぞれ等量［５×１０８ＣＦＵ／アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）］の合計１．５×１０９ＣＦＵおよび炭水化物ベースの賦形剤を含有し、アレルギー疾患の発生リスクの高い新生児および乳児被験者においてプラセボ（外観が同一の賦形剤溶液）と比較される。組成物Ａまたはプラセボの１ｍＬを、母乳、粉ミルクまたは食物中に混合して、１日１回、２８日間（パートＡ）および３３６日間（パートＢ）にわたって経口（口腔により）投与される。
【0219】
パートＡ： 図３１に示されているとおり、２８日齢～１２月齢未満の乳児を、まず、２８日間の治療、およびそれに続く、安全性／忍容性の評価のための更に１ヶ月の観察（治療外）のために登録し、ついで新生児の登録（パートＢ）を行う。パートＡにおいては、適格被験者を組成物Ａ処置またはプラセボ処置のいずれかに無作為化する。組成物Ａ処置は組成物Ａ（母乳、粉ミルクまたは食物と混合されたもの）の１日１回の２８日間の経口投与からなり、プラセボ処置はプラセボ（母乳、粉ミルクまたは食物と混合されたもの）の１日１回の２８日間の経口投与からなる。合計２０名の適格乳児を３：１（１５：５）の無作為化において登録する。
【0220】
パートＢ： 図３２に示されているとおり、７日齢以下の新生児を組成物Ａ処置またはプラセボ処置のいずれかに無作為化する。組成物Ａ処置は組成物Ａ（母乳、粉ミルクまたは食物と混合されたもの）の１日１回の３３６日間の経口投与からなり、プラセボ処置はプラセボ（母乳、粉ミルクまたは食物と混合されたもの）の１日１回の３３６日間の経口投与からなる。
【0221】
分娩様式（膣または帝王切開）および登録時の授乳方法（母乳授乳または母乳授乳無し）によって層別化された１：１（１１２：１１２）の無作為化において、適格新生児を登録する。適格の可能性のある新生児を妊娠中または出生後の第１週中に特定する。組成物Ａまたはプラセボの投与を生後７日以内に開始し、１年間継続し、ついで１年間の観察期間（治療外）が続き、ついで、登録から６７２日間にわたる１０回の訪問（８回の診療所訪問および２回の電話通話）において測定を行う。
【0222】
新生児および乳児の被験者において、プラセボと比較して、組成物Ａにおける免疫学的バイオマーカー、追加的な糞便代謝プロファイリングおよび糞便マイクロバイオーム分析を測定する。循環ＩｇＥレベル（総レベルおよび特異的レベルの両方）、免疫細胞数、糞便マイクロバイオーム組成、糞便および血漿代謝プロファイル、糞便および血漿免疫刺激能（インビトロ分析）、ならびにベースラインから治療終了までの症状スコアの変化を決定することにより、細菌組成物Ａの治療機能を評価する。
【0223】
アレルギー疾患の発生を潜在的に改変する生細菌治療の役割の過去の研究に基づいて、該主要エンドポイントは、アレルギー疾患の発生の低減に関連しうる感受性ＰＤマーカーとみなされる。
【0224】
追加的なエンドポイントには、以下のものが含まれる：１６８日および６７２日における医師により診断されたアトピー性皮膚炎の発生率（頻度）；１６８日、３３６日および６７２日における医師により診断された食物アレルギー、慢性鼻炎／アレルギー性鼻炎、蕁麻疹および喘鳴性疾患／喘息の発生率（各診断は独立して評価される）；１６８日、３３６日および６７２日における食物およびエアロアレルゲンに対する感作の発生率［卵白、ピーナッツ、牛乳、ネコ、チリダニ、イヌ、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）（カビ）および混合草花粉に対する血清アレルゲン特異的ＩｇＥ試験による評価］；アトピー性皮膚炎の重症度［１６８日、３３６日および６７２日におけるアトピー性皮膚炎の包括的重症度評価（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ｇｌｏｂａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＩＧＡ）、スコアリングアトピー性皮膚炎（ＳＣＯＲｉｎｇ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）（ＳＣＯＲＡＤ）およびＩＧＡｘＢＳＡによる評価］；１６８日、３３６日および６７２日における喘鳴疾患／喘息の重症度（増悪歴による評価）；アレルギー症状または診断のために処方／使用された併用薬ならびにアトピー性皮膚炎および喘鳴／喘息のためのレスキュー薬の使用；１６８日、３３６日および６７２日における総血清ＩｇＥレベル；１６８日、３３６日および６７２日における末梢好酸球数；薬理遺伝学的サンプル（所望により使用されてもよい）；糞便マイクロバイオーム分析（微生物組成）；糞便および血漿代謝プロファイリング（選択された部位のみ）；テープストリップにより評価された皮膚バイオマーカーおよびＲＮＡ配列決定プロファイリング；循環免疫細胞プロファイリング（選択された部位のみ）；臍帯血（バイオマーカー／免疫細胞プロファイリング）（所望により使用されてもよい；選択された部位のみ）；糞便および血漿免疫刺激能（エクスビボ分析）（選択された部位のみ）；破傷風／ジフテリアワクチン接種に対する力価；１６８日、３３６日および６７２日における喘鳴疾患／喘息の重症度［喘息コントロール質問票（ＡＣＱ）による評価］。
【0225】
主要試験エンドポイントとして、安全性評価を、（ｉ）有害事象の報告；（ｉｉ）併用薬の報告；（ｉｉｉ）身体検査の実施およびバイタルサイン；ならびに（ｉｖ）血清化学、肝および腎機能パネル、血液学、鑑別を伴う全血球数および尿検査を含む臨床検査により、２８日間の治療期間中およびその後の最大２８日（第５７日）の休薬期間中に行う。この試験の第３の部においては、安全性評価のための、血液および尿のサンプルの収集を行わない。血液および尿のサンプル採取を要するものを除く全ての他の評価を行う。
【0226】
二次試験評価を、以下のパラメーターにおける、ベースラインから治療終了までの変化を評価することにより行う：（ｉ）糞便マイクロバイオーム分析（細菌組成）；（ｉｉ）糞便および血漿代謝プロファイリング；（ｉｉｉ）糞便および血漿免疫刺激能（インビトロ分析）；（ｉｖ）総ＩｇＥおよび特異的ＩｇＥレベル；（ｖ）循環免疫細胞プロファイリング；（ｖｉ）質問票ならびに副作用（ＡＥ）および服薬の日誌報告。
【0227】
本明細書の表１に挙げられている株は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定に従い、Ｌｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ－Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（所在地：Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，Ｄ－３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に２０１９年６月２７付で寄託された。該株はＤＳＭＺにより試験され、生存可能であると判断された。ＤＳＭＺは以下のＤＳＭＺ寄託アクセッション番号をそれぞれの株に割り当てている：ＤＳＭ ３３２１３［アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）］、ＤＳＭ ３３１７９［ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）（ＤＳＭ ３３１７９）］、ＤＳＭ ３３１８０［ブラウティア・プロダクタ（Ｂ．ｐｒｏｄｕｃｔａ）（ＤＳＭ ３３１８０）］、ＤＳＭ ３３１７８［バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）（ＤＳＭ ３３１７８）］、ＤＳＭ ３３１７６［コプロコッカス・コメス（Ｃ．ｃｏｍｅｓ）（ＤＳＭ ３３１７６）］、ＤＳＭ ３３１８５［フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）］、ＤＳＭ ３３１９１［フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１９１）］、ＤＳＭ ３３１８６［フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３２１３）］、ＤＳＭ ３３１９０［フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１９０）］、ＤＳＭ ３３１８７［ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）］、ＤＳＭ ２２１７７［バクテロイデス・フェシス（Ｂ．ｆａｅｃｉｓ）（ＤＳＭ ２２１７７）］、およびＤＳＭ ３３１８８［ドレア・ロンギカテナ（Ｄ．ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）（ＤＳＭ ３３１８８）］。
【0228】
追加的な実施形態
１．表１に挙げられている少なくとも１つの株を含む細菌共生体と少なくとも１つの抗酸化剤とを含む医薬組成物。
１．表１に挙げられている少なくとも１つの株を含む細菌共生体と少なくとも１つの抗酸化剤とを含む医薬組成物。
【0229】
２．細菌共生体が、表１に挙げられている少なくとも２つの株を含む、実施形態１の医薬組成物。
【0230】
３．表１に挙げられている少なくとも１つの株がアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）またはラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）を含む、実施形態１の医薬組成物。
【0231】
４．表１に挙げられている少なくとも１つの株がアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）を含む、実施形態１の医薬組成物。
【0232】
５．表１に挙げられている少なくとも１つの株の各株が約１０７ＣＦＵ～約１０９ＣＦＵの量で存在する、実施形態１の医薬組成物。
【0233】
６．表１に挙げられている少なくとも１つの株が約５×１０８ＣＦＵの量で存在する、実施形態５の医薬組成物。
【0234】
７．表１に挙げられている少なくとも１つの株が約１０７ＣＦＵ～約１０１０ＣＦＵの総量で存在する、実施形態１の医薬組成物。
【0235】
８．表１に挙げられている少なくとも１つの株が約５×１０９ＣＦＵの量で存在する、実施形態７の医薬組成物。
【0236】
９．少なくとも１つの抗酸化剤がＬ－システインである、実施形態１の医薬組成物。
【0237】
１０．Ｌ－システインが約０．０５％ ｗ／ｗ～約０．５％ ｗ／ｗの量で存在する、実施形態９の医薬組成物。
【0238】
１１．凍結保護物質を更に含む、実施形態１の医薬組成物。
【0239】
１２．凍結保護物質がグリセロールである、実施形態１１の医薬組成物。
【0240】
１３．グリセロールが約１０％ ｖ／ｖ～約３０％ ｖ／ｖの量で存在する、実施形態１２の医薬組成物。
【0241】
１４．バッファーを更に含む、実施形態１の医薬組成物。
【0242】
１５．バッファーがＰＢＳである、実施形態１４の医薬組成物。
【0243】
１６．医薬組成物が経口剤形として製剤化されている、実施形態１の医薬組成物。
【0244】
１７．経口剤形がカプセル剤、錠剤、乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、ゲル剤、ガム、ペースト剤、ハーブティー、滴剤、溶解性顆粒剤、散剤、錠剤、凍結乾燥物、アイスバー（棒付きアイスキャンディー）またはアイスクリームである、実施形態１６の医薬組成物。
【0245】
１８．経口剤形が懸濁剤である、実施形態１６の医薬組成物。
【0246】
１９．経口剤形がアイスバーまたはアイスクリームである、実施形態１６の医薬組成物。
【0247】
２０．アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）を含む細菌混合物；Ｌ－システイン；ならびに凍結保護物質を含む医薬組成物。
【0248】
２１．細菌混合物の各株が約５×１０８ＣＦＵの量で存在する、実施形態２０の医薬組成物。
【0249】
２２．Ｌ－システインが約０．１％ ｗ／ｗの量で存在する、実施形態２０の医薬組成物。
【0250】
２３．凍結保護物質がグリセロールである、実施形態２０の医薬組成物。
【0251】
２４．グリセロールが約２０％ ｖ／ｖの量で存在する、実施形態２３の医薬組成物。
【0252】
２５．バッファーを更に含む、実施形態２２の医薬組成物。
【0253】
２６．バッファーがリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であり、約７．４のｐＨを有する、実施形態２５の医薬組成物。
【0254】
２７．医薬組成物が約１ｍＬの総体積を有する、実施形態２０の医薬組成物。
【0255】
２８．医薬組成物が経口投与用の懸濁剤に製剤化される、実施形態２０の医薬組成物。
【0256】
２９．実施形態１～２８のいずれか１つの医薬組成物を含む容器。
【0257】
３０．容器が２ｍＬ ポリプロピレンスクリューキャップバイアルである、実施形態２９の容器。
【0258】
３１．容器が医薬組成物中の細菌細胞の少なくとも９５％の生存率を約１２週間維持する、実施形態２９の容器。
【0259】
３２．実施形態２９～３１のいずれか１つの容器を含むキット。
【0260】
３３．容器内の医薬組成物の使用方法をヒト使用者に示す説明を更に含む、実施形態３２のキット。
【0261】
３４．医薬組成物における少なくとも２つの株を非動物培地内で培養し、培養工程の産物を一緒にして細菌共生体を生成させることを含む、実施形態１～２８のいずれか１つの医薬組成物の製造方法。
【0262】
３５．非動物培地が植物培地である、実施形態３４の製造方法。
【0263】
３６．植物培地が植物ペプトン、植物抽出物、酵母エキス、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）、スレオニンまたはそれらの組合せを含む、実施形態３５の製造方法。
【0264】
３７．細菌細胞を非動物培地内で増殖させることを含む、表１の株の細菌細胞のバッチの製造方法。
【0265】
３８．非動物培地が植物培地である、実施形態３７の製造方法。
【0266】
３９．植物培地が植物ペプトン、植物抽出物、酵母エキス、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）、スレオニンまたはそれらの組合せを含む、実施形態３８の製造方法。
【0267】
４０．表１の株がアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）である、実施形態３９の製造方法。
【0268】
４１．表１の株がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）である、実施形態３９の製造方法。
【0269】
４２．表１の株がラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）である、実施形態３９の製造方法。
【0270】
４３．アッケルマンシア属種（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｓｐ．）細胞を改変ＮＡＧＴ増殖培地内で培養して、アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）細胞バッチを得ることを含む、表１のアッケルマンシア・ムシニフィラ株を含む細菌共生体を含む医薬組成物の製造方法。
【0271】
４４．改変ＮＡＧＴ増殖培地がソイトーン、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）またはそれらの組合せを含む、実施形態４３の製造方法。
【0272】
４５．改変ＮＡＧＴ増殖培地がマグネシウム、カルシウムまたはグルコースのいずれか１以上を含まない、実施形態４３の製造方法。
【0273】
４６．改変ＮＡＧＴ増殖培地が、非改変ＮＡＧＴ増殖培地と比較して３０～５０％増加したアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）細胞増殖速度をもたらす、実施形態４３の製造方法。
【0274】
４７．増殖速度の増加が、５０時間の細胞培養の後の増殖培地の６００ｎｍにおける吸光度の差を測定することにより決定される、実施形態４６の製造方法。
【0275】
４８．アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）株がアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）である、実施形態４３の製造方法。
【0276】
４９．アッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）細胞バッチが約５×１０８ＣＦＵ／ｍＬを含む、実施形態４３の製造方法。
【0277】
５０．フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）細胞を非動物ベースの増殖培地内で培養して、フィーカリバクテリウム属種細胞バッチを得ることを含む、フィーカリバクテリウム属種を含む細菌共生体を含む医薬組成物の製造方法。
【0278】
５１．非動物ベースの増殖培地が酵母ベースの増殖培地である、実施形態５０の製造方法。
【0279】
５２．酵母ベースの増殖培地がＹＦＡＰビタミンミックスを含む、実施形態５１の製造方法。
【0280】
５３．酵母ベースの増殖培地が酢酸ナトリウム、ソイトーン、酵母エキス、システインまたはそれらの組合せを含む、実施形態５１の製造方法。
【0281】
５４．酵母ベースの増殖培地が酢酸ナトリウム、ソイトーン、酵母エキスおよびシステインを含む、実施形態５１の製造方法。
【0282】
５５．フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）である、実施形態５０の製造方法。
【0283】
５６．フィーカリバクテリウム属種（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）細胞バッチが約５×１０８ＣＦＵ／ｍＬを含む、実施形態５０の製造方法。
【0284】
５７．ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）細胞を酵母ベースの増殖培地内で培養して、ラクトバシラス・クリスパタス（ＤＳＭ ３３１８７）細胞バッチを得ることを含む、ラクトバシラス・クリスパタス（ＤＳＭ ３３１８７）を含む細菌共生体を含む医薬組成物の製造方法。
【0285】
５８．ラクトバシラス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）細胞バッチが５×１０８ＣＦＵ／ｍＬを含む、実施形態５７の製造方法。
【0286】
５９．実施形態１～２７のいずれか１つの医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患の治療方法。
【0287】
６０．対象がヒトである、実施形態５９の方法。
【0288】
６１．ヒト対象が約１８歳～約４０歳である、実施形態６０の方法。
【0289】
６２．ヒト対象が乳児または新生児である、実施形態６０の方法。
【0290】
６３．乳児が約０．５歳～約３歳である、実施形態６２の方法。
【0291】
６４．新生児が６月齢以下である、実施形態６２の方法。
【0292】
６５．新生児が３月齢以下である、実施形態６２の方法。
【0293】
６６．医薬組成物を対象に経口投与する、実施形態５７の方法。
【0294】
６７．細菌共生体がアッケルマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＤＳＭ ３３２１３）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ＤＳＭ ３３１８５）およびラクトバシラス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（ＤＳＭ ３３１８７）からなる、実施形態５９の方法。
【0295】
６８．疾患が炎症性疾患である、実施形態５９の方法。
【0296】
６９．炎症性疾患がアレルギーまたは皮膚炎である、実施形態５９の方法。
【0297】
７０．アレルギーがアレルギー性喘息、アレルギー性小児喘息または食物アレルギーである、実施形態６９の方法。
【0298】
７１．疾患が代謝性疾患である、実施形態５９の方法。
【0299】
７２．代謝性疾患が肥満、糖尿病またはメタボリックシンドロームである、実施形態７１の方法。
【0300】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中に示され記載されているが、そのような実施形態は単なる例示として記載されているに過ぎないことが当業者に明らかであろう。本発明は、本明細書に記載されている特定の具体例によっては限定されないと意図される。本発明は前記明細書を参照して説明されているが、本明細書における実施形態の記載および例示は限定的な意味では解釈されないと意図される。本発明から逸脱することなく、多数の変形、変化および置換が当業者に今や見出されるであろう。更に、本発明の全ての態様は、種々の条件および変数に依存する、本明細書に記載されている特定の描写、構成または相対的比率に限定されないと理解される。本明細書に記載されている本発明の実施形態に対する種々の代替実施形態が本発明の実施の際に使用されうると理解されるべきである。したがって、本発明は任意のそのような代替形態、修飾、変形または均等物をも含むと想定される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定め、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構成ならびにそれらの均等物はそれらに含まれると意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【配列表】