特許 7624469 治療用タンパク質送達のための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2025-01-22

(45)【発行日】2025-01-30

(54)【発明の名称】治療用タンパク質送達のための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20250123BHJP

   A61K 9/127 20250101ALI20250123BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20250123BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20250123BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20250123BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20250123BHJP

   A61K 38/47 20060101ALI20250123BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250123BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20250123BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250123BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20250123BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20250123BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250123BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20250123BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20250123BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20250123BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20250123BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20250123BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20250123BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20250123BHJP

   C12N 15/86 20060101ALN20250123BHJP

【ＦＩ】

A61K47/68 ZNA

A61K9/127

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/763

A61K38/46

A61K38/47

A61K39/395 L

A61K47/64

A61K48/00

A61P3/00

A61P25/00

A61P43/00 111

C07K14/47

C07K16/28

C07K19/00

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/52 Z

C12N15/62 Z

C12N15/86 Z

【請求項の数】 11

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023026217

(22)【出願日】2023-02-22

(62)【分割の表示】P 2020542598の分割

【原出願日】2019-02-07

(65)【公開番号】P2023054256

(43)【公開日】2023-04-13

【審査請求日】2023-02-22

(31)【優先権主張番号】62/627,721

(32)【優先日】2018-02-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/777,683

(32)【優先日】2018-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー バイク

(72)【発明者】

【氏名】キャサリン シグナー

(72)【発明者】

【氏名】マリア プラガスティス

【審査官】菊池 美香

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１００４６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】PUZZO FRANCESCO，RESCUE OF POMPE DISEASE IN MICE BY AAV-MEDIATED LIVER DELIVERY OF SECRETABLE ACID ALPHA-GLUCOSIDASE，SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE，米国，2017年11月29日，VOL:9, NR:418,，PAGE(S):EAAM6375/1-12，http://dx.doi.org/10.1126/scitranslmed.aam6375

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４７／６８

Ａ６１Ｋ ９／１２７

Ａ６１Ｋ ３５／７６

Ａ６１Ｋ ３５／７６１

Ａ６１Ｋ ３５／７６３

Ａ６１Ｋ ３８／４６

Ａ６１Ｋ ３８／４７

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ４７／６４

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ３／００

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ０７Ｋ １４／４７

Ｃ０７Ｋ １６／２８

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ １５／１２

Ｃ１２Ｎ １５／１３

Ｃ１２Ｎ １５／５２

Ｃ１２Ｎ １５／６２

Ｃ１２Ｎ １５／８６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に治療用タンパク質を送達するための組成物であって、
酵素ドメインと、ＣＤ６３に結合する抗体もしくはその抗原結合部分とを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、
前記酵素ドメインは、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）を含み、
前記ポリヌクレオチドは、ＴＴＲプロモーターに作動可能に連結されており、
前記ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターにあり、
前記組成物は、肝臓標的送達方法を介して、前記対象に投与され、前記ポリヌクレオチドは、肝臓デポから、前記マルチドメイン治療用タンパク質を産生、かつ、分泌し、前記ポリヌクレオチドが、前記対象の前記肝臓に送達された後に、前記肝臓デポが形成され、前記マルチドメイン治療用タンパク質の前記産生及び分泌は、連続した日、週又は月にわたって、少なくとも１μｇ／ｍＬの一貫した血清レベルで発生する、組成物。

【請求項2】

前記ウイルスベクターが、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記組成物が、少なくとも１キログラムあたり２×１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で使用される、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記抗体又はその抗原結合部分が、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項２又は３に記載の組成物。

【請求項5】

前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記マルチドメイン治療用タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又はその断片を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１に記載の核酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記対象の任意のＣＮＳ組織におけるグリコーゲンレベルが、処置後少なくとも９ヶ月間低下する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記対象が、ポンペ病を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記血清レベルが、少なくとも２μｇ／ｍＬである、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記抗体又はその抗原結合部分が、ＣＤ６３の細胞外ドメインに結合する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
１０４５７ＷＯ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔファイルに記述されている配列表は、３３．５キロバイトであり、２０１９年１月２９日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本出願は一般に、リソソーム蓄積症の治療など、ＣＮＳを損なう疾患および障害を治療するために、治療用タンパク質を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達するための組成物および方法を対象とする。本出願は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する一つまたは複数の送達ドメインにコンジュゲートされた治療用タンパク質をコードするヌクレオチド組成物の治療有効量を提供することを目的としている。

【背景技術】

【0003】

薬物送達アプローチは、ナノ担体など、血液脳関門（ＢＢＢ）を克服するために開発されてきたが、欠点がある。担体は、血液循環の不安定性および望ましくない生体分布プロファイルを示している（Ｇｅｌｐｅｒｉｎａ Ｓ、ｅｔ ａｌ．、２００５、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１７２（１２）：１４８７－９０。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。また、ＢＢＢでの輸送機構、およびＣＮＳ疾患状態が関門の完全性を変えているかどうかによっても、標的化効率が低下している。標的化部分または担体の適切な選択は、これらの輸送機構に影響を与える神経炎症状態を考慮しなければならない。
肝臓または他の組織におけるＤＮＡ発現を介した治療用タンパク質の送達により、タンパク質のボーラス注射の必要性を排除し、したがって、免疫原性の懸念を軽減する便利なアプローチが提供される。受容体結合タンパク質、特に細胞特異的受容体にコンジュゲートした治療用タンパク質は、特定の組織に対する標的化治療薬の問題を解決する。しかしながら、ＣＮＳに効率的に治療を提供する方法を提供する必要性が依然として存在する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Ｇｅｌｐｅｒｉｎａ Ｓ、ｅｔ ａｌ．、２００５、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１７２（１２）：１４８７－９０

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

出願人らは、治療用タンパク質、特に補充酵素が、受容体結合タンパク質と関連付けられた場合、中枢神経系に効果的に送達されうることを発見し、ただしそれは循環血中レベルが経時的に一貫したレベルを達成することを条件としている。マルチドメイン治療用タンパク質は、治療用タンパク質および結合タンパク質複合体のコード配列を担持する遺伝子療法ベクターを介して肝臓に送達されうる。

【0006】

一態様では、本発明は、治療用タンパク質を、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達する方法を提供し、細胞表面受容体（ＣＳＲ）結合タンパク質（ＣＳＲ－ＢＰ）にコンジュゲートされた治療用タンパク質（ｔｐＣＳＲ－ＢＰ）をコードするヌクレオチド組成物を、ＣＮＳ中に治療有効量のｔｐＣＳＲ－ＢＰを提供するのに十分な肝臓標的送達方法を介して、対象に投与することを含む。

【0007】

一実施形態では、ＣＳＲ－ＢＰは、ＣＳＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態では、治療用タンパク質はリソソーム酵素である。

【0008】

一実施形態では、酵素は、グリコシラーゼ、例えばアルファ－グルコシダーゼまたはアルファ－ガラコシダーゼＡなどのグリコシダーゼなどのヒドロラーゼ活性を有する。一実施形態では、細胞表面受容体（ＣＳＲ）結合タンパク質（ＣＳＲ－ＢＰ）は、内部移行受容体に結合する抗原結合タンパク質である。一実施形態では、内部移行受容体は、エンドサイトーシスされてリソソームに輸送される細胞表面分子である。特定の一実施形態では、内部移行受容体はＣＤ６３分子である。一実施形態では、内部移行受容体はＩＴＧＡ７分子である。特定の一実施形態では、ＣＳＲ－ＢＰは、抗体、抗体断片、またはｓｃＦｖ、例えばＣＤ６３またはＩＴＧＡ７に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などである。

【0009】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマルチドメイン治療用タンパク質は、一つまたは複数の送達ドメインおよび酵素ドメインを含み、一つまたは複数の送達ドメインは、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に結合する。いくつかの実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、内部移行エフェクターに結合する第二の送達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、第二の送達ドメインは、（ｉ）ＣＤ６３、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＭＨＣ－Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ－１、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、およびＣＤ３６からなる群から選択される内部移行エフェクター；（ｉｉ）ＣＤ６３、ＭＨＣ－Ｉ、液泡型Ｈ＋ ＡＴＰアーゼ、ＩＧＦ２Ｒ、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ、ＭＡＬ（ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ジフテリア毒素受容体、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子）、グルタチオン受容体、グルタミン酸受容体、レプチン受容体、および葉酸受容体からなる群から任意に選択される、いくつかの組織タイプで発現する内部移行エフェクター；（ｉｉｉ）コラーゲンＸ、インテグリンアルファ１０（ＩＴＧＡ１０）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、線維芽細胞成長因子受容体アイソフォームＣ（ＦＧＦＲ３Ｃ）、ヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＣＲＴＬ１）、アグリカン、コラーゲンＩＩ、およびＫｒｅｍｅｎ－１からなる群から任意に選択される、骨および／または軟骨によって優先的に発現される内部移行エフェクター；（ｉｖ）スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、ＣＤ３６、ＭＳＲ１（マクロファージスカベンジャー受容体１）、ＭＲＣ１（マクロファージマンノース受容体１）、ＶＳＩＧ４（Ｖセットおよびイムノグロブリンドメイン含有タンパク質４）、ＣＤ６８（マクロシアリン）、およびＣＳＦ１Ｒ（マクロファージコロニー刺激因子１受容体）からなる群から任意に選択される、単球、マクロファージ、またはマイクログリアによって優先的に発現される内部移行エフェクター；（ｖ）ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ－１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ－１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）からなる群から任意に選択される、腎臓細胞によって優先的に発現される内部移行エフェクターに結合する。他の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋肉特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質結合受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡＩＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）などの筋肉特異的インターナライザー；（ｖｉ）任意にＡＳＧＲ１またはＡＳＧＲ２など、肝臓細胞によって優先的に発現される内部移行エフェクター；（ｖｉｉ）ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋肉特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質結合受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）からなる群から任意に選択される、筋肉細胞によって優先的に発現される内部移行エフェクター；および／または（ｖｉｉｉ）ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＬＰＬ２、ＭＳＲ１、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、またはＰＲＬＲからなる群から選択される内部移行エフェクタータンパク質である。いくつかの実施形態では、第二の送達ドメインは、内部移行エフェクターＣＤ６３に結合する。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の送達ドメインの少なくとも一つは、抗原結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の送達ドメインの各々は、抗原結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の送達ドメインの少なくとも一つは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の送達ドメインの少なくとも一つは、半抗体を含む。いくつかの実施形態では、ｈＴｆＲに結合する送達ドメインはｓｃＦｖであり、半抗体はＣＤ６３に結合し、酵素ドメインはＧＡＡであり、ＧＡＡはＣＤ６３に結合する半抗体のカルボキシ末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の送達ドメインの各々は、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一つのｓｃＦｖは、Ｆｃに融合される。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、野生型ヒトＩｇＧ４アイソタイプ、またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡは、Ｆｃのカルボキシ末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖおよび抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖおよび抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦｖは、両方ともそのカルボキシ末端で、単一のＧＡＡ酵素に連結されている。いくつかの実施形態では、送達ドメインは抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖであり、酵素ドメインは、ｓｃＦｖのＶＬドメインのカルボキシ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、マルチドメインは、抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端に連結された第二の送達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、第二の送達ドメインは、抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦＶである。いくつかの実施形態では、酵素ドメインは、配列番号１として記載されるアミノ酸配列を含む。

【0010】

また、少なくとも二つの送達ドメインおよび少なくとも一つの酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質が提供され、二つの送達ドメインの各々は、抗体、半抗体、およびｓｃＦｖからなる群から独立して選択され、少なくとも一つまたは複数の送達ドメインは、少なくとも一つの酵素ドメインに関連付けられ、好ましくは、一つまたは複数の送達ドメインが、少なくとも一つの酵素ドメインに共有結合されている。いくつかの実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、二つ以下の送達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、送達ドメインのうちの一つのみが、少なくとも一つの酵素ドメインと関連付けられている。いくつかの実施形態では、少なくとも二つの送達ドメインの各々は、酵素ドメインに共有結合している。いくつかの実施形態では、少なくとも二つの送達ドメインの各々は、同じ酵素ドメインに共有結合している。いくつかの実施形態では、少なくとも二つの送達ドメインの各々は、異なる酵素ドメインに共有結合している。いくつかの実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、二つ以下の送達ドメインを含み、第一の送達ドメインは半抗体を含み、第二の送達ドメインはｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖはＦｃに融合される。いくつかの実施形態では、半抗体は、そのカルボキシ末端で第一の酵素ドメインに共有結合され、および／またはｓｃＦｖは、そのカルボキシ末端でＦｃ、および任意で第二の酵素ドメインに共有結合される。いくつかの実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、二つ以下の送達ドメインを含み、第一および第二の送達ドメインはそれぞれｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、第一および第二のｓｃＦｖの両方は、酵素ドメインに共有結合している。いくつかの実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで：第一のｓｃＦｖ、第二のｓｃＦｖ、および酵素ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一つの送達ドメインは、リソソーム輸送分子に結合し、少なくとも一つの送達ドメインはトランスサイトーシスエフェクターに結合する。いくつかの実施形態では、リソソーム輸送分子は、ＣＤ６３、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、またはＣＤ１５１からなる群から選択され、トランスサイトーシスエフェクターは、ＬＤＬ受容体、ＩｇＡ受容体、トランスフェリン受容体、新生児Ｆｃ受容体、インスリン受容体、ＣＤ９８、およびベイシジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、または図１Ｆに示される構造を含む。

【0011】

本明細書に記載されるマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドも本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、ウイルス核酸配列は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、ウイルス核酸配列が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列であり、ＡＡＶ 核酸配列が、内部末端反復配列を含み、任意選択的に、肝特異的プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、ウイルス核酸配列が、配列番号６、配列番号７、または両方と、任意選択的に、肝特異的プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子とを含む内部末端反復配列を含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号８および／または配列番号９として記載される配列を含む、組織特異的調節因子をさらに含む。

【0012】

一態様では、本発明は、例えば本明細書に記載されるポリヌクレオチドなどのＣＳＲ－ＢＰとコンジュゲートされたか、またはＣＳＲ－ＢＰに融合された治療用タンパク質をコードする核酸配列を含有する、ＡＡＶベクターなどの遺伝子療法ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、任意に天然ウイルス、工学的に操作されたウイルス、またはキメラウイルスであるウイルスベクター、ならびに本明細書に記載のポリヌクレオチド、任意に請求項２０～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび脂質を含む脂質ナノ粒子であるポリヌクレオチド複合体、およびそれらの任意の組み合わせを含む裸のポリヌクレオチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、またはアデノ関連ウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ２／８キメラおよび／または特定の組織、例えば、肝臓またはニューロン組織に対してＡＡＶシュードタイプである。

【0013】

一実施形態では、治療用タンパク質、これをコードするヌクレオチド、および／またはこれをコードするヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターは、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）に治療用タンパク質を送達する方法において、酵素補充療法を必要とする対象を治療するために使用され、この方法は、対象に、ＣＮＳ中に治療有効量のマルチドメイン治療用タンパク質を提供するのに十分な肝臓標的送達方法を介して、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするヌクレオチド組成物を投与することを含み、マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメインおよび酵素ドメインを含む。いくつかの実施形態では、対象は動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

【0014】

一態様では、ｓｃＦｖ－ヒドロラーゼ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するＡＡＶベクターが、ヒトまたは非ヒト対象に投与される。続いて、ポリヌクレオチドは、肝臓内のゲノム遺伝子座に組み込まれ、コードされた融合タンパク質が産生される。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは肝臓内でエピソーム的に転写され、コードされた融合タンパク質が産生される。特定の一実施形態では、融合タンパク質とは、抗ＣＤ６３ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質または抗ＩＴＧＡ７ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質であり、ヒトまたは非ヒト対象が内因性ＧＡＡ活性を欠乏しており、ＧＡＡ活性が対象において効果的に復元される。

【0015】

一態様では、本発明は、ＣＳＲ－ＢＰとコンジュゲートされたか、またはＣＳＲ－ＢＰに融合された治療用タンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子療法ベクターを患者に投与することによって、酵素欠損を有する対象（ヒトまたは非ヒト）を治療する方法を提供する。

【0016】

本明細書には、治療用タンパク質を対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達する方法が記載され、この方法には、対象に、ＣＮＳ中に治療有効量のマルチドメイン治療用タンパク質を提供するのに十分な肝臓標的送達方法を介して、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするヌクレオチド組成物を投与することを含み、マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメインおよび酵素ドメインを含む。いくつかの実施形態では、送達ドメインは、内部移行エフェクターに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、リソソーム酵素である。いくつかの実施形態では、リソソーム酵素はＧＡＡである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド組成物は、ウイルスベクターを介して投与される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド組成物は、１キログラム当たり少なくとも２×１０^１２のウイルスゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与される。いくつかの実施形態では、内部移行エフェクターは、ＣＮＳ中の細胞、上皮細胞、および血液脳関門を通過する細胞からなる群から選択される細胞の表面上で発現する。いくつかの実施形態では、送達ドメインは、内部移行エフェクターに結合する。いくつかの実施形態では、内部移行エフェクターは、（ｉ）ＣＤ６３、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＭＨＣ－Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ－１、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、およびＣＤ３６からなる群から選択され；（ｉｉ）例えば、ＣＤ６３、ＭＨＣ－Ｉ、液胞型Ｈ＋ ＡＴＰアーゼ、ＩＧＦ２Ｒ、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ、ＭＡＬ（ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ジフテリア毒素受容体、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子）、グルタチオン受容体、グルタミン酸受容体、レプチン受容体、および葉酸受容体など、いくつかの組織タイプで発現され、任意に対象は、ファブリー病、ゴーシェ病、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＩＩＤ、ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＸ、ポンペ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、およびＣ２型、αマンノース症、ノイラミニダーゼ欠損症、シアリドーシス、アスパルチルグリコサミン尿症、混合性サポシン欠損症、異型ゴーシェ病、ファーバー脂肪性肉芽腫症、フコシドーシス、およびβマンノース症からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示し；（ｉｉｉ）例えば、コラーゲンＸ、インテグリンアルファ１０（ＩＴＧＡ１０）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、線維芽細胞成長因子受容体アイソフォームＣ（ＦＧＦＲ３Ｃ）、ヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＣＲＴＬ１）、アグリカン、コラーゲンＩＩ、およびＫｒｅｍｅｎ－１など、骨および／または軟骨によって優先的に発現され、任意に対象は、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＩＩＤ、ＭＰＳ ＩＶＡ、ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＸ、βマンノース症、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、混合性サポシンン欠損症、アスパルチルグリコサミン尿症、ファーバー脂肪性肉芽腫症、シアリドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、およびαマンノース症からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示し；（ｉｖ）例えば、スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、ＣＤ３６、ＭＳＲ１（マクロファージスカベンジャー受容体１）、ＭＲＣ１（マクロファージマンノース受容体１）、ＶＳＩＧ４（Ｖ－セットおよびイムノグロブリンドメイン含有タンパク質４）、ＣＤ６８（マクロシアリン）、およびＣＳＦ１Ｒ（マクロファージコロニー刺激因子１受容体）など、単球、マクロファージ、またはマイクログリアによって優先的に発現され、任意に対象は、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、混合性サポシン欠損症、およびファーバー脂肪性肉芽腫症からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示し；（ｖ）例えば、ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ－１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ－１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）など、腎臓細胞によって優先的に発現され、任意に対象は、ファブリー病、アルポート症候群、多発性嚢胞腎疾患、および血栓性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示すか、またはそのように診断され；（ｖｉ）例えば、ＡＳＧＲ１またはＡＳＧＲ２など、肝臓細胞によって優先的に発現され、任意に対象は、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、ゴーシェ病、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＩ、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、およびＣ２型、シアリドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、異型ゴーシェ病、混合性サポシン欠損症、ファーバー脂肪性肉芽腫症からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示すか、またはそのように診断され；（ｖｉｉ）例えば、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋肉特異性キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質結合受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）など、筋肉細胞によって優先的に発現され、任意に対象は、ポンペ病の一つまたは複数の症状を示すか、またはそのように診断され；（ｖｉｉｉ）ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＬＰＬ２、ＭＳＲ１、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、またはＰＲＬＲからなる群から選択され；および／または（ｉｘ）ＣＤ６３である。いくつかの実施形態では、送達ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体（ＣＳＲ）結合タンパク質（ＣＳＲ－ＢＰ）は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質はヒドロラーゼを含む。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質はグリコシラーゼを含む。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質はグリコシダーゼを含む。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質はアルファ－グルコシダーゼを含む。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、配列番号１または配列番号１３のアミノ酸配列、またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、抗ＡＢｅｔａ、または抗タウ抗体を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、酵素ドメインは、アルファ－グルコシダーゼを含み、対象の任意のＣＮＳ組織中のグリコーゲンレベルは、処置後少なくとも九か月間、低下する。いくつかの実施形態では、対象はポンペ病を有する。いくつかの実施形態では、投与されたヌクレオチド組成物は、少なくとも１μｇ／ｍＬのマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、ＧＡＡ（例えば、配列番号１）またはＧＬＡ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ０６２８０、ａａ３２～４２９、配列番号１３）などのグリコシダーゼを含み、患者は、ポンペ病またはファブリー病を有する。いくつかの実施形態では、ＣＳＲ－ＢＰは、ＣＤ６３またはＩＴＧＡ７などの内部移行受容体に結合する抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＳＲ－ＢＰは、ＣＤ６３に結合するｓｃＦｖ分子である。いくつかの実施形態では、ＣＳＲ－ＢＰは、ＩＴＧＡ７に結合するｓｃＦｖ分子である。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗ＣＤ６３－ＧＡＡ融合治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗ＩＴＧＡ７－ＧＡＡ融合治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターである。

【0017】

いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、ＧＡＡ酵素ドメインを含み、高いＧＡＡの血清レベルが、遺伝子療法ベクターの投与後少なくとも１２週間、患者の血清中に維持される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、ＧＡＡ酵素を含み、患者のＣＮＳ組織中のグリコーゲンレベルは著しく低下する。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、ＧＡＡ酵素を含み、グリコーゲンレベルは、遺伝子療法ベクターの投与の３か月後、６ヶ月後、または９ヶ月後に野生型レベルで維持される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、ＧＡＡ酵素を含み、治療後の患者の筋力は、野生型レベルまで復元される。

【0018】

一態様では、本発明は、ＣＳＲ－ＢＰに融合した治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子療法ベクターを投与することによって、ヒトまたは非ヒト対象の組織内、特にＣＮＳ組織内のグリコーゲンの蓄積を減少させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＣＳＲ－ＢＰに融合した治療用タンパク質の閾値血清レベルを提供するのに十分な用量で投与される。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも１μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも２μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも３μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも４μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも５μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも６μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも７μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも８μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも９μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも１０μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも１１μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも１２μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも１３μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも１４μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、少なくとも１５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、組織は小脳、脊髄または海馬である。一実施形態では、ヒトまたは非ヒト対象は、ポンペ病を有する。一実施形態では、治療用タンパク質は、抗ＣＤ６３ ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質を含む。別の実施形態では、治療用タンパク質は、抗ＩＴＧＡ７ ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質を含む。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】図１Ａは、概略的にマルチドメイン治療用タンパク質を表す。パネルＡは、二重特異性抗体（ｉｉ）と補充酵素（ｉ）とを含むマルチドメイン治療用タンパク質を図示する。パネルＢは、内部移行エフェクター特異的半抗体（ｉｉ）と会合して、マルチドメイン治療用タンパク質を形成している酵素－Ｆｃ融合ポリペプチド（ｉ）を図示する。パネルＣは、抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のＣ末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルＤは、抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のＮ末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルＥは、抗内部移行エフェクター抗体の軽鎖のＣ末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルＦは、抗内部移行エフェクター抗体の軽鎖のＮ末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルＧは、ＶＨ領域（影付きバー）およびＶＬ領域（オープンバー）を含有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＣ末端に共有結合で連結された補充酵素（六角形）を図示する。パネルＨは、二つのｓｃＦｖドメインに共有結合で連結された補充酵素（六角形）を図示し、第一のｓｃＦｖ（ｉ）は、第一の送達ドメインとしての機能を果たし、第二のｓｃＦｖ（ｉｉ）は、第二の送達ドメインとしての機能を果たす。図１Ａに図示されていない追加的なマルチドメイン治療用タンパク質には、二つ以上の送達ドメインおよび少なくとも一つの酵素ドメインを含む、マルチドメイン治療用タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、この図のパネルＡ～Ｈに示される抗体、半抗体、およびｓｃＦｖドメインは、任意のタイプの送達ドメインを表し、追加的な送達ドメインまたは補充酵素を関連付けて、マルチドメイン治療用タンパク質を作製することもできる。二つ以上の送達ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質の非限定的な例は、図１Ｃ、１Ｄ、および１Ｆにさらに示され、これは第一の内部移行エフェクター特異的半抗体に共有結合した補充酵素（ＧＡＡとして示されているがこれに限定されない）を含み、これは第二の内部移行エフェクター特異的ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合に関連し、これはマルチドメイン治療用タンパク質（図１Ｃおよび１Ｄ）を形成するために、補充酵素（ＧＡＡとして示されているがこれに限定されない）に共有結合されていることも、されていないこともあり、補充酵素（ＧＡＡとして示されているがこれに限定されない）は、各抗内部移行エフェクター特異的半抗体のＣ末端に共有結合し、これは第一の送達ドメイン、および第二の送達ドメインとして機能する内部移行エフェクター特異的ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合として機能し、抗内部移行エフェクター特異的半抗体および付随物はどちらも一緒になって、マルチドメイン治療用タンパク質（図１Ｄ）を形成し、補充酵素は第一のｓｃＦｖと共有結合し、これは例えば、リンカーを介して、第二のｓｃＦｖ（図１Ｆ）に連結する。

【0020】

【図1B】図１Ｂは、図１ＡのパネルＧに表されるマルチドメイン治療用タンパク質をそれぞれコードするＡＡＶ遺伝子療法ベクターの非限定的で例示的な図を提供し、ｓｃＦｖは抗ヒトＣＤ６３ ｓｃＦｖであり、補充酵素はＧＡＡである（例えば、抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡ；例えば配列番号１０として記載されるアミノ酸配列を参照）。配列番号１０のアミノ酸１～１１７は、Ｈ４Ｈ１２４５０Ｎ抗体の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）のアミノ酸配列を提供し、配列番号１０のアミノ酸１１８～１３２は、Ｈ４Ｈ１２４５０Ｎの重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間のアミノ酸リンカー配列を提供し、配列番号３６４のアミノ酸１３３～２４０は、Ｈ４Ｈ１２４５０Ｎ抗体の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）のアミノ酸配列を提供し、配列番号１０のアミノ酸２４１～２４５は、抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖとＧＡＡとの間のアミノ酸リンカー配列を提供し、配列番号１０のアミノ酸２４６～１１２８は、補充酵素ＧＡＡまたはその生物学的活性部分のアミノ酸配列を提供する。例示的な５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの配列は、それぞれ配列番号６および配列番号７として記載されている。この図のパネルＡは、例示的な肝特異的エンハンサー（例えば、セルピナ１、配列番号９として記載されているが、これに限定されない）、例示的な肝特異的プロモーター（例えば、ＴＴＲ、配列番号８として記載されているが、これに限定されない）、例示的なシグナルペプチド、抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡ治療用マルチドメイン（配列番号１０）をコードする核酸配列、およびポリＡテールを含む、肝特異的発現のための例示的なベクターを提供する。この図のパネルＢは、肝特異的エンハンサーおよび肝特異的プロモーター配列の代わりに例示的なユビキタスプロモーターを有する、パネルＡに示されるものと類似した例示的ベクターを提供する。この図のパネルＣは、肝特異的エンハンサー（例えば、セルピンＡ１）およびプロモーター（例えば、ＴＴＲ）の代わりに例示的なニューロン特異的プロモーターを有する、パネルＡに示されるものと類似した例示的ベクターを提供する。この図のパネルＤは、肝特異的（例えば、セルピンＡ１）エンハンサーおよびプロモーター（例えば、ＴＴＲ）と組み合わせた例示的なニューロン特異的プロモーターを有する、パネルＡに示されるものと類似した例示的ベクターを提供する。

【0021】

【図1C】図１Ｃは、図示したように、マルチドメイン治療用タンパク質をそれぞれコードする発現ベクターの非限定的で例示的な図を提供し、半抗体は抗ＣＤ６３抗体であり、ｓｃＦｖは抗ヒトトランスフェリン受容体ｓｃＦｖであり、補充酵素はＧＡＡ（例えば、抗ｈＴｆＲｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡ）である。

【0022】

【図1D】図１Ｄは、図示したように、マルチドメイン治療用タンパク質をそれぞれコードする発現ベクターの非限定的で例示的な図を提供し、半抗体は抗ＣＤ６３抗体であり、ｓｃＦｖは抗ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ｓｃＦｖであり、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ４ Ｆｃであり、補充酵素はＧＡＡ（例えば、抗ｈＴｆＲｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡ）である。

【0023】

【図1E】図１Ｅは、図１ＡのパネルＨに表した、マルチドメイン治療用タンパク質をそれぞれコードする発現ベクターの非限定的な例示的な図を提供し、二つｓｃＦｖのうちの一つは抗ヒトＣＤ６３ｓｃＦｖであり、二つのｓｃＦｖのうちのもう一方は抗ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ｓｃＦｖであり、補充酵素はＧＡＡ（例えば、抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡ：：ａｎｔｉ－ＴｆＲｓｃＦＶ）である。

【0024】

【図1F】図１Ｆは、図示したように、マルチドメイン治療用タンパク質をそれぞれコードする発現ベクターの非限定的な例示的な図を提供し、二つｓｃＦｖのうちの一つは抗ヒトＣＤ６３ｓｃＦｖであり、二つのｓｃＦｖのうちのもう一方は抗ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ｓｃＦｖであり、補充酵素はＧＡＡ（例えば、抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：抗ＴｆＲｓｃＦＶ：：ＧＡＡまたは抗ＴｆＲｓｃＦＶ：：抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ）である。

【0025】

【図1G】図１Ｇは、図１ＡのパネルＧに示したように、マルチドメイン治療用タンパク質をそれぞれコードする発現ベクターの非限定的で例示的な図を提供し、ｓｃＦｖは抗ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ｓｃＦｖであり、補充酵素はＧＡＡ（例えば、抗ＴｆＲｓｃＦＶ：：ＧＡＡ）である。

【0026】

【図2】図２は、送達された酵素の機能として組織ミリグラム当たりのマイクログラムで貯蔵グリコーゲンの量を図示する棒グラフである。Ｘ軸はＣＤ６３^{ｈｕ／ｈｕ}；ＧＡＡ^－／－マウス由来の組織を図示し、左から右まで：心臓、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、ヒラメ筋、長指伸筋（ＥＤＬ）筋肉である。レーン１のボックスは、未処置のマウスポンペ病モデルにおける貯蔵グリコーゲンの量を図示する。レーン６のボックスは、未処置の野生型マウスモデルにおける貯蔵グリコーゲンの量を図示する。レーン２のボックスは、１０^１０ｖｇの用量でＡＡＶ－ｈＧＡＡ（ヒトＧＡＡをコードする遺伝子を含有するアデノ関連ウイルスベクター）を処置されたマウスポンペ病モデルにおける貯蔵グリコーゲンの量を図示する。レーン３のボックスは、１０^１１ｖｇの用量でＡＡＶ－ｈＧＡＡで処置されたマウスポンペ病モデルにおける貯蔵グリコーゲンの量を図示する。レーン４のボックスは、１０^１０ｖｇの用量でＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡ（ヒトＧＡＡに連結された抗ヒトＣＤ６３ ｓｃＦｖドメインをコードする遺伝子を含有するアデノ関連ウイルスベクター）で処置されたマウスポンペ病モデルにおける貯蔵グリコーゲンの量を図示する。レーン５のボックスは、１０^１１ｖｇの用量でＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡで処置されたマウスポンペ病モデルにおける貯蔵グリコーゲンの量を図示する。

【0027】

【図3】図３は、ＡＡＶ注射の３ヵ月後での各マウスの骨格筋組織中の平均グリコーゲン測定値（μｇ／ｍｇ）を図示するグラフである。各測定値を、特定の投与量で特定の酵素構築物を用いて処理されたマウス当たりのＧＡＡ曝露（すなわち血清レベル）の関数としてプロットしている。黒正方形は、１０^１０ｖｇ用量でのＡＡＶ－ｈＧＡＡを表す。黒三角形は、１０^１１ｖｇ用量でのＡＡＶ－ｈＧＡＡを表す。黒逆三角形は、１０^１０ｖｇ用量でのＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡを表す。黒斜方形は、１０^１１ｖｇ用量でのＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡを表す。

【0028】

【図4】図４は、ＡＡＶ注射の３ヵ月後に心臓組織中で測定された平均心筋グリコーゲン（μｇ／ｍｇ）を、特定の投与量で特定の酵素構築物を用いて処置されたマウス当たりのＧＡＡ曝露（すなわち血清レベル）の関数として示すドットプロットである。黒正方形は、１０^１０ｖｇ用量でのＡＡＶ－ｈＧＡＡを表す。黒三角形は、１０^１１ｖｇ用量でのＡＡＶ－ｈＧＡＡを表す。黒逆三角形は、１０^１０ｖｇ用量でのＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡを表す。黒斜方形は、１０^１１ｖｇ用量でのＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡを表す。

【0029】

【図5】図５は、特定の投与量で特定の酵素構築物で処置されたマウス当たりのＧＡＡ曝露（すなわち血清レベル）の関数として、ＡＡＶ注射の３か月後の抗ＧＡＡ抗体の力価を図示するドットプロットである。白正方形は、１０^１０ｖｇ用量でのＡＡＶ－ｈＧＡＡを表す。白丸は、１０^１１ｖｇ用量でのＡＡＶ－ｈＧＡＡを表す。白斜方形は、１０^１０ｖｇ用量でのＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡを表す。六角形は、１０^１１ｖｇ用量でのＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡを表す。

【0030】

【図6】図６は、ＡＡＶ注射の３ヵ月後での抗ＧＡＡ抗体の力価を、酵素構築物および用量の関数として図示するドットプロットである。丸は、空のＡＡＶベクターを受けている対照マウスを表す。正方形は、１０^１０ｖｇ用量でのＡＡＶ－ｈＧＡＡを表す。三角形は、１０^１１ｖｇ用量でＡＡＶ－ｈＧＡＡを表す。逆三角形は、１０^１０ｖｇ用量でのＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡを表す。斜方形は、１０^１１ｖｇ用量でのＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡを表す。

【0031】

【図7A】図７Ａは、遺伝子療法ベクターの注射後、週での時間の関数としてＧＡＡ（任意単位「ａ．ｕ．」；ｙ軸）の血清レベルを図示する線グラフである。正方形（一番下の線）は、１０^１０ｖｇ用量でのＡＡＶ－ｈＧＡＡを表す。三角形（上から二番目）は、１０^１１ｖｇ用量でのＡＡＶ－ｈＧＡＡを表す。逆三角形（上から三番目）は、１０^１０ｖｇ用量でのＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡを表す。斜方形（一番上の線）は、１０^１１ｖｇ用量でのＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡを表す。

【0032】

【図7B】図７Ｂは、以下のようなＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯマウス（ＧＡＡ－／－，ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕマウス）またはＧＡＡ＋／＋，ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕマウスにおけるＡＡＶ構築物の投与後のｍＲＮＡ比（ｍＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡに対するｈＧＡＡ ｍＲＮＡ）を図示する棒グラフである：（１）未処置対照、（２）ＡＡＶ－肝特異的プロモーター－ｈＧＡＡ（１ｅ１０ｖｇ）、（３）ＡＡＶ－肝特異的プロモーター－ｈＧＡＡ（１ｅ１１ｖｇ）、（４）ＡＡＶ－肝特異的プロモーター－抗ｈＣＤ６３：：ｈＧＡＡ（１ｅ１０ｖｇ）、（５）ＡＡＶ－肝特異的プロモーター－抗ｈＣＤ６３：：ｈＧＡＡ（１ｅ１１ｖｇ）、または（６）未処理処置対照（ＧＡＡ＋／＋，ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕ）。ＡＡＶ構築物の全ての注射について、肝臓でのＧＡＡの発現が検出された。

【0033】

【図7C】図７Ｃは、融合タンパク質（正方形）をコードするＡＡＶを受けているマウスおよびＧＡＡをコードするＡＡＶを受けているマウス（どちらの構築物も、発現を駆動するための肝特異的プロモーター（ＬＳＰ）を配された）について、血清ＧＡＡレベルとＲＮＡ発現レベルと、を比較した点グラフである。

【0034】

【図7D】図７Ｄは、ｈＧＡＡ、抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ（融合構築物）、または非結合融合構築物ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ対照をコードする肝特異的プロモーター駆動性構築物を一過的にトランスフェクションされたＨｕｈ－７ヒト肝細胞を示す棒グラフである。どちらのｓｃＦｖ：：ＧＡＡ融合構築物も、トランスフェクションの３日後に、分泌上清におけるタンパク質の比率がｈＧＡＡのみよりも高かった。ＣＩ－ＭＰＲ媒介性取り込みを軽減するために、実験期間中に上清中にＭ６Ｐを追加したことは、比率に影響を及ぼさなかった。（＊＝ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。

【0035】

【図7E】図７Ｅは、送達されたベクターの関数としてのＧＡＡの血清力価の量を示す棒グラフである。Ｘ軸は、ＧＡＡまたはＳｃＦｖ－ＧＡＡ融合体をコードするプラスミドを与えられた、ＣＤ６３をヒト化されたＫＯマウス（ＧＡＡ－／－；ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕ）からの血清を示し、左から右に：１）制御（処置なし）；２）ＡＡＶ－ＬＳＰ－ｈＧＡＡ処置（１ｅ１０ｖｇ／マウス）；３）ＡＡＶ－ＬＳＰ－ｈＧＡＡ処置（１ｅ１１ｖｇ／マウス）；４）ＡＡＶ－ＬＳＰ－抗ＣＤ６３：：ｈＧＡＡ処置（１ｅ１０ｖｇ／マウス）；および５）ＡＡＶ－ＬＳＰ－抗ＣＤ６３：：ｈＧＡＡ処置（１ｅ１１ｖｇ／マウス）。

【0036】

【図8-1】図８は、核を明らかにするためにＤＡＰＩで対比染色されたマウス筋線維における、ｌａｍｐ１染色リソソームを図示する蛍光顕微鏡写真である。パネルＡおよびＡ１は、未処理の野生型（ＧＡＡ^＋／＋）マウスに由来し、ｌａｍｐ１（パネルＡ）および核（パネルＡ１）について染色した、四頭筋細胞を図示する。パネルＢおよびＢ１は、未処理ＧＡＡヌル（ＧＡＡ^－／－）マウスに由来し、ｌａｍｐ１（パネルＢ）および核（パネルＢ１）について染色した、四頭筋細胞を図示する。パネルＣおよびＣ１は、ＡＡＶ－ｈＧＡＡ構築物で処置されたＧＡＡ^－／－マウスに由来し、ｌａｍｐ１（パネルＣ）および核（パネルＣ１）について染色した、四頭筋細胞を図示する。パネルＤおよびＤ１は、ＡＡＶ－ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ｈＧＡＡ構築物で処置されたＧＡＡ^－／－マウスに由来し、ｌａｍｐ１（パネルＤ）および核（パネルＤ１）について染色した、四頭筋細胞を図示する。

【図8-2】同上。

【0037】

【図9】図９は、ＡＡＶ－ＬＳＰ ｈＧＡＡまたはＡＡＶ－ＬＳＰ抗ｈＣＤ６３：：ｈＧＡＡのいずれかで処置されたマウスの握力強度およびロータロッド試験性能を示す線グラフを図示する。野生型ＧＡＡマウス（逆三角形）、未処理対照（正方形）、ＡＡＶ－ＬＳＰ－ｈＧＡＡ処理（１ｅ１１ｖｇ／マウス）（三角形）、またはＡＡＶ－ＬＳＰ－抗ｈＣＤ６３：：ｈＧＡＡ治療（１ｅ１１ｖｇ／マウス）（丸）のロータロッド測定値（Ａ）および前肢の握力強度測定値（Ｂ）を、１ヶ月間隔で６ヶ月間取得した。エラーバーは＋／－標準偏差である。全ての群に対してＮ＝８～１０。

【0038】

【図10A】図１０Ａおよび図１０Ｂは、ガイドとしての他の膜タンパク質、例えばＧＡＡをガイドするための抗ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）ｓｃＦｖ融合タンパク質などの使用を図示する。図１０Ａは、５ｍＭ Ｍ６Ｐの存在下または非存在下で、抗マウスＣＤ６３－ＧＡＡまたは抗マウスＩＴＧＡ７－ＧＡＡと共に一晩インキュベーションされたＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞のＧＡＡ活性（ｙ軸）を示す。図１０Ｂは、流体力学的送達（ＨＤＤ）によってｓｃＦｖ：：ＧＡＡ型の抗ｈＣＤ６３：：ＧＡＡ（２）または完全長ＩｇＧ４：：ＧＡＡ型の抗マウスインテグリンアルファ７（３）をコードするプラスミドを与えられ、次いで、ＨＤＤの３週間後に組織のグリコーゲンレベルを測定された、ＣＤ６３をヒト化されたＧＡＡ ＫＯマウス（ＧＡＡ－／－；ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕ）を示す。未処置対照マウス、ＧＡＡ－／－；ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕ（１）、および未処置野生型ＧＡＡ対照マウス、ＧＡＡ＋／＋；ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕ（４）も、同じ組織のグリコーゲンレベルについて試験した。

【図10B】同上。

【0039】

【図11】図１１は、野生型のＣＤ６３＋／＋マウスと比較したＣＤ６３ｈｕ／ｈｕマウスにおけるＧＡＡに融合された全長抗ＣＤ６３抗体（すなわち、全長ＩｇＧ４抗体）の血清クリアランスを示す。ＧＡＡに融合された抗ＣＤ６３抗体の重鎖および軽鎖を発現するプラスミドは、各マウスの尾静脈を介して注射された。抗ＣＤ６３（全長ＩｇＧ４）：：ＧＡＡの血清ｐＫは、２４時間以内に血清から消失することが観察された。

【0040】

【図12A】図１２Ａは、酵素構築物および用量の関数としての関数としてのＡＡＶ注射の１ヶ月後でのＧＡＡの血清レベル（任意単位「ａ．ｕ．」；ｙ軸）を図示するドットプロットである。正方形は、ＡＡＶ－ＬＳＰ－Δ８ＧＡＡを表す。三角形は、ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ＧＡＡを表す。どちらの構築物も、発現）を駆動するための肝特異的プロモーター（ＬＳＰ）を提供した。用量は、マウスのキログラム（ｋｇ）当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）として示される。

【0041】

【図12B】図１２Ｂは、ＧＡＡ血清レベルの関数としての組織（心臓、四頭筋、横隔膜、または三頭筋）のミリグラム当たりのマイクログラムでのグリコーゲンのレベルを図示するドットプロットを示す。正方形は、ＡＡＶ－ＬＳＰ－Δ８ＧＡＡを表す。三角形は、ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ＧＡＡを表す。どちらの構築物も、発現）を駆動するための肝特異的プロモーター（ＬＳＰ）を提供した。

【0042】

【図13】図１３は、送達された酵素／ベクターの機能としてＣＮＳ組織ミリグラム当たりのマイクログラムで貯蔵グリコーゲンの量を図示する棒グラフである（９か月の研究）。Ｘ軸は、未処置（各レーン１）、またはＧＡＡをコードするプラスミド（各レーン２）、またはＳｃＦｖ－ＧＡＡ融合体（各レーン３）を与えられた野生型マウスのコンパレーター（各レーン４）、またはＫＯマウス（ＧＡＡ－／－）からサンプリングされた各ＣＮＳ組織（脊髄、小脳または海馬）を示す。融合タンパク質で処置したマウスが、いかなる融合結合ドメインもないＧＡＡをコードするベクターの送達と比較して、ＣＮＳ組織内のグリコーゲン貯蔵量がより確固たる減少を示したことは予想外の発見であった。

【0043】

【図14A】図１４Ａは、特定の用量で特定のベクター構築物にＧＡＡをＡＡＶ送達した３か月後の脊髄組織１ｍｇ当たりのグリコーゲンの貯蔵量（μｇグリコーゲン／ｍｇ組織；ｙ軸）を示すグラフである（ｖｇ＝ウイルスゲノム）。グリコーゲンレベルは、未処置（レーン２；ｘ軸）またはＧＡＡをコードするプラスミド（各レーン３；ｘ軸）を与えられたか、または抗ＣＤ６３ＳｃＦｖ－ＧＡＡ融合体（レーン４～６；ｘ軸）の様々な用量を与えられたＫＯマウス（ＧＡＡ－／－）と比較して、野生型マウス（レーン１；ｘ軸）に提供される。ＳｃＦｖ－ＧＡＡ融合体の用量を増加させると、脊髄の貯蔵グリコーゲンレベルが減少し、１ｅ１１ｖｇの用量は、ＧＡＡ単独（融合なし）の同等の用量よりも対象に対してより大きな利益を提供する。

【0044】

【図14B】図１４Ｂは、特定の用量で特定のベクター構築物にＧＡＡをＡＡＶ送達した３か月後の脳組織１ｍｇ当たりのグリコーゲンの貯蔵量（μｇグリコーゲン／ｍｇ組織；ｙ軸）を示すグラフである（ｖｇ＝ウイルスゲノム）。グリコーゲンレベルは、未処置（レーン２；ｘ軸）またはＧＡＡをコードするプラスミド（各レーン３；ｘ軸）を与えられたか、または抗ＣＤ６３ＳｃＦｖ－ＧＡＡ融合体（レーン４～６；ｘ軸）の様々な用量を与えられたＫＯマウス（ＧＡＡ－／－）と比較して、野生型マウス（レーン１；ｘ軸）に提供される。ＳｃＦｖ－ＧＡＡ融合体の用量を増加させると、脳の貯蔵グリコーゲンレベルが減少し、１ｅ１１ｖｇの用量は、ＧＡＡ単独（融合なし）の同等の用量よりも対象に対してより大きな利益を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本発明は、記載された特定の実施形態、組成物、方法、および実験条件に限定されるものではないが、それはこうした実施形態、組成物、方法、および条件が異なる場合があるからである。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲のみによって制限されるものとなることから、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみにあり、制限することを意図するものではない。

【0046】

本明細書に記載された方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができるが、いくつかの好適な方法および材料をこれより記載する。本明細書で引用された全ての出版物は、その記述全体が参照により本明細書に組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。

【0047】

「血液脳関門」とは、血液を脳および中枢神経系の細胞外流体から分離する半透膜関門を指す。関門は、特定の物質の脳および脊髄への通過または選択的輸送を阻止する。血液脳関門は、脳内皮細胞によって形成される。

【0048】

「治療有効量」は、対象がコード化された治療用タンパク質の一貫した血中レベル（血清／血漿レベル）を達成するように、対象に送達されるベクターの量または投与量を指す。一般的に、約１ｘ１０^９～約１ｘ１０^１６ゲノムベクターの濃度を、この方法で利用することができる。肝臓への送達のための投与量は、１ｋｇ当たり約１ｘ１０^１０～５ｘ１０^１３ＡＡＶゲノムでありうる。投与量は、血液脳関門を通過することによる治療的利益のバランスを取って、任意の副作用に対する分子の所望の効果を達成するように調節され、このような投与量は使用される組み換えベクターに応じて変化しうる。導入遺伝子の発現レベルは、血清または血漿の抽出によって血液循環中でモニターされて、循環タンパク質の定常状態を達成するベクターの投与頻度を決定することができる。当業者であれば、例えば、ベクター送達後の連続した日、週、または月にわたる治療用タンパク質の一貫した血中レベルを決定するための実験を行うことにより、有効量の特定の値を決定することができる。循環している治療用タンパク質を試験するための適切な実験は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＬＣ－ＭＳなどを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知である。一例では、ＣＮＳ中の治療有効量のｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質は、例えば脊髄、小脳または海馬組織などのＣＮＳ組織に貯蔵されたグリコーゲンを減少させるのに十分な量のｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質を産生する、ウイルスベクターの量である。

【0049】

ＣＮＳ障害
様々な脳疾患は、本明細書に記載の治療用タンパク質の送達モードから利益を得る場合がある。ＣＮＳ障害、およびタンパク質療法に適している神経学的症状を伴う障害には、以下：アルツハイマー病、脳癌、ベーチェット病、大脳ループス、クロイツフェルト・ヤコブ病、認知症、てんかん、脳炎、フリートライヒ運動失調症、ギラン・バレー症候群、ゴーシェ病、頭痛、水頭症、ハンチントン病、頭蓋内圧亢進、大脳白質萎縮症、片頭痛、重症筋無力症、筋ジストロフィー、多発性硬化、ナルコレプシー、ニューロパシー、プラダー・ウィリー症候群、パーキンソン病、レット症候群、下肢静止不能症候群、睡眠障害、くも膜下出血、脳卒中、外傷性脳損傷、三叉神経痛、一過性脳虚血発作、およびフォンヒッペル・リンダウ病（血管腫症）が含まれるが、これらに限定されない。

【0050】

ＣＮＳへの治療用タンパク質の抗ＣＤ６３融合送達は、その遍在発現、細胞外小胞の膜タンパク質としてのその役割（ＥＶｓ、例えば、エクソソーム）、およびインテグリンとの関連によって特に有益でありうる。内部移行エフェクターと類似の特性を有する他の細胞表面受容体には、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、およびＣＤ１５１が含まれ、本明細書全体で考察されるように、取り込みの所望の位置を強化するために、組織または細胞型に特異的でありうる。

【0051】

ＣＮＳへの治療用タンパク質の抗トランスフェリン融合送達も、特に有益であることが示されている。したがって、治療用タンパク質の輸送および送達は、特定の血液脳関門（ＢＢＢ）標的への抗受容体融合などの送達機構の使用によって強化される。いくつかのＢＢＢ標的は、ＣＮＳの取り込みに有益であることが示されてきた（Ｚｕｃｈｅｒｏ、ｅｔ ａｌ．、６ Ｊａｎ ２０１６、Ｎｅｕｒｏｎ、８９（１）：７０－８２；Ｂｏａｄｏ、ＲＪ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ、２０１４ Ａｕｇｕｓｔ ４；１１（８）：２９２８－２９３４；それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。トランスフェリン受容体と同様のＢＢＢ取り込み特性を有する他の細胞表面受容体には、インスリン受容体、ＣＤ９８、およびベイシジン（Ｂｓｇ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0052】

いくつかの実施形態では、ＣＮＳ組織（例えば、脳）への治療用タンパク質の標的送達は、抗トランスフェリン受容体または抗インスリン受容体、または抗ＣＤ９８または抗Ｂｓｇの使用を用いる。治療用タンパク質はまた、本明細書全体を通して本明細書に記載されるように、内部移行エフェクター抗体に融合されうる。いくつかの実施形態では、ＣＮＳおよび末梢組織への治療用タンパク質の標的送達は、例えば、脳取り込みおよび末梢取り込みの両方を強化するために、抗インスリン受容体送達ドメインの使用を用いる（Ｂｏａｄｏ、ＲＪ ｅｔ ａｌ．、２０１４、ｓｕｐｒａ；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．、２５ Ｍａｙ ２０１１、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．３：８４ｒａ４４。それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0053】

本明細書に記載のマルチドメイン治療用タンパク質の一部として有用でありうる例示的抗トランスフェリン受容体、抗インスリン受容体、抗ＣＤ９８、および抗Ｂｓｇ抗体ならびにその部分は、当技術分野で周知である（非限定的な例示的抗トランスフェリン受容体抗体については、例えば、米国特許第２０１７０１７４７７８号；米国特許第２０１５０１９６６６３号；米国特許第９６２９８０１号；米国特許第２０１８０００２４３３号；国際特許出願公開第２０１６０８１６４３号；米国特許第２０１８０１３４７９７号；国際特許出願公開第２０１４１８９９７３号；米国特許第２０１５０１１０７９１号；米国特許第９７０８４０６号；米国特許第２０１７０２６０２９２号；国際特許出願公開第２０１６０８１６４０号；米国特許第２０１８００５７６０４号；米国特許第９６１１３２３号；国際特許出願公開第２０１２０７５０３７号；国際特許出願公開第２０１８２１０８９８号、米国特許第２０１８０３４４８６９号、米国特許第２０１８０２８２４０８号、米国特許第２０１７００５１０７１号、国際特許出願公開第２０１６２０７２４０号、国際特許出願公開第２０１５１０１５８８号、米国特許第２０１６０３２４９８４号；米国特許第２０１８０２２２９９３号；国際特許出願公開第２０１７０５５５４２号；米国特許第２０１８０２２２９９２号；国際特許出願公開第２０１７０５５５４０号；Ｃａｂｅｚｏｎ、Ｉ．、ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１５ Ｎｏｖ ２；１２（１１）：４１３７－４５；Ｙｕ ＹＪ、ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ（２０１４）６：２６１ｒａ１５４；Ｃｏｕｃｈ、ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１３ Ｍａｙ １；５（１８３）：１８３ｒａ５７、１－１２；ａｎｄ Ｙｕ ｅｔ ａｌ．、２０１１、ｓｕｐｒａを参照のこと；非限定的な例示的抗ＣＤ９８抗体については、例えば、国際特許出願公開第２０１７２１４４５６号、国際特許出願公開第２０１７２１４４５８号、国際特許出願公開第２０１７２１４４６２号；国際特許出願公開第２００８０１７８２８号；国際特許出願公開第２０１５１４６１３２号；国際特許出願公開第２０１６０９４５６６号；国際特許出願公開第２０１３０７８３７７号；国際特許出願公開第２０１７０２６４９７号；Ｈａｙｅｓ ＧＭ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０１５）１３７：７１０－２０；ａｎｄ Ｂｉｘｂｙ、ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２０１５ Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ａｂｓｔｒａｃｔ＃ ３８０９ を参照のこと；非限定的な例示的抗ＢＳＧ抗体については、例えば、国際特許出願公開第２０１１１１２５６６号；米国特許第２０１１０２２３１７６号；米国特許第２０１４００７９７１１号；国際特許出願公開第２０１００３６４６０号；米国特許第８６１８２６４号；国際特許出願公開第２００５０９２３８１号；国際特許出願公開第２０１８１６５６１９号；および国際特許出願公開第２０１７１８６１８２号を参照のこと；非限定的な例示的抗インスリン受容体抗体については、例えば、米国特許第８９７４７９１号；国際特許出願公開第２０１３０８１７０６号；米国特許第２０１６０１５２７１９号；米国特許第２０１６０２０８００６号；米国特許第２０１７０１１４１５２号；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、ＷＭ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１８ Ａｐｒ；３２（２）：１６９－１７６；Ｂｏａｄｏ ＲＪ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．（２０１６）１３：３２４１－６；Ｃｉｅｎｉｅｗｉｃｚ ＡＭ、ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２０１７）６６：２０６－２１７；Ｂｅｘｗａｄａ、Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２０１６ Ｆｅｂ；３５６（２）：４６６－７３；およびＢｅｄｉｎｇｅｒ、ＤＨ、ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２０１５ Ａｐｒ；３５３（１）：３５－４３を参照のこと；それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。当業者なら、これらの周知の抗体、またはその抗原結合部分（例えば、それに由来するｓｃＦｖなど）を、本明細書に記載の治療用タンパク質に容易に連結し、本明細書に記載のマルチドメイン治療用タンパク質を作製および使用することができる。

【0054】

リソソーム蓄積症
「酵素欠損症の疾患」としては、非リソソーム蓄積症、例えばクラッベ病（ガラクトシルセラミダーゼ）、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、メープルシロップ尿症、ミトコンドリア障害、フリードライヒ運動失調症、ツェルウェーガー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、およびリソソーム蓄積症が挙げられる。「リソソーム蓄積症」は、リソソームの機能の欠陥の結果として生じる任意の障害を含む。現在およそ５０種のリソソーム蓄積障害が特定されており、その最もよく知られているものとしては、テイ・サックス病、ゴーシェ病、およびニーマン・ピック病が挙げられる。これらの疾患の病因は、タンパク質機能の喪失に通常は起因して、不完全な分解産物がリソソーム内に蓄積することにあると考えられている。リソソーム蓄積症は、正常な機能ではリソソーム含有物を分解するかまたは分解を調整するタンパク質における、機能喪失型または減弱型のバリアントによって引き起こされる。リソソーム蓄積症と密接に関連するタンパク質としては、酵素、受容体、および他の膜貫通タンパク質（例えばＮＰＣ１）、翻訳後修飾タンパク質（例えばスルファターゼ）、膜輸送タンパク質、ならびに非酵素性補助因子および他の可溶性タンパク質（例えばＧＭ２ガングリオシド活性化因子）が挙げられる。そのため、リソソーム蓄積症は、欠陥のある酵素それ自体によって引き起こされる前述の障害が包含されるだけでなく、任意の分子的な欠陥によって引き起こされる任意の障害も含まれる。したがって、本明細書で使用される場合、用語「酵素」は、リソソーム蓄積症に関連する前述の他のタンパク質を包含することが意図される。

【0055】

分子的な損傷の性質は、多くの場合、疾患の重症度に影響を及ぼすが、換言すれば、完全な機能喪失は、胎児または新生児の発症に付随する傾向にあり、重度の症状を伴い、そして部分的な機能喪失は、（比較的）軽度の遅発型疾患に付随する。一般的に、欠損細胞における代謝的な欠陥を修正すべき際には、ごく僅かなパーセンテージの活性のみを回復させることが求められる。表１には、よく見られるリソソーム蓄積症の一部と、それらに関連する機能喪失タンパク質の一覧を示す。リソソーム蓄積症は、概してＤｅｓｎｉｃｋ ａｎｄ Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，２０１２に記載されている。

【0056】

リソソーム蓄積症は、リソソームにおける種々の基質の分解に影響を及ぼす希少疾患の一種である。それらの基質には、スフィンゴ脂質類、ムコ多糖類、糖タンパク質類、グリコーゲン、およびオリゴ糖類が含まれ、これらが疾患を有する者の細胞に蓄積して細胞死をもたらしうる。リソソーム蓄積症によって冒される器官として、中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系（ＰＮＳ）、肺、肝臓、骨、骨格筋および心筋、ならびに細網内皮系が挙げられる。

【0057】

リソソーム蓄積症の治療に対する選択肢として、酵素補充療法（ＥＲＴ）、基質減少療法、薬理学的シャペロン介在療法、造血幹細胞移植療法、および遺伝子療法が挙げられる。基質減少療法の例として、ゴーシェ病１型を治療するためのミグルスタットまたはエリグルスタットの使用が挙げられる。これらの薬剤は、シンターゼ活性を遮断することによって作用し、その結果、基質の産生を低減する。造血幹細胞療法（ＨＳＣＴ）は、例えば、ＭＰＳの一部の型の患者において、陰性の中枢神経系の表現型を寛解および遅延させるのに用いられる。Ｒ．Ｍ．Ｂｏｕｓｔａｎｙ，“Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ－－ｔｈｅ ｈｏｒｉｚｏｎ ｅｘｐａｎｄｓ，”９（１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．５８３－９８，Ｏｃｔ．２０１３を参照のこと。それら文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。表１には、一部のリソソーム蓄積症と、その関連酵素または他のタンパク質の一覧表を示す。

【表1-1】

【表1-2】

【0058】

最もよく見られるＬＳＤのうち二種は、ポンペ病とファブリー病である。１０，０００人に１人の推定発生率を有するポンペ病は、欠陥のあるリソソーム酵素アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）によって引き起こされ、その結果、リソソーム内のグリコーゲンのプロセシングが欠損する。リソソーム内のグリコーゲンの蓄積は、主に骨格組織、心臓組織、および肝組織に生じる。乳児期のポンペ病の発症は、通例２歳になる前に、心肥大、筋緊張低下、肝腫大を引き起こし、また心肺不全による死亡をもたらす。成人期のポンペ病の発症は、１０代から５０代になっても起こり、通例、骨格筋にのみ関係する。現在利用可能な治療としては、ＧｅｎｚｙｍｅのＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）／ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ）が挙げられるが、これはＣＨＯ細胞で生産されて静脈内注入によって投与される組換えヒトアルファ－グルコシダーゼである。

【0059】

軽度の遅発型の発症例を含めて全体で３，０００人に１人の推定発生率を有するファブリー病は、欠陥のあるリソソーム酵素アルファ－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）により引き起こされ、その結果、血管、ならびに他の組織および器官内にグロボトリアオシルセラミドが蓄積する。ファブリー病に付随する症状として、神経損傷および／または小血管閉塞による疼痛、腎機能不全および腎不全、高血圧および心筋症などの心合併症、被角血管腫の形成などの皮膚症状、無汗症または多汗症、ならびに渦巻き状角膜、放射状白内障、ならびに結膜異常および網膜血管異常などの眼の疾患が挙げられる。現在利用可能な治療としては、ＣＨＯ細胞で生産されて静脈内注入によって投与される組換えヒトアルファ－ガラクトシダーゼＡであるＧｅｎｚｙｍｅのＦＡＢＲＡＺＹＭＥ（登録商標）（アガルシダーゼベータ）；ヒト線維芽細胞で生産されて静脈内注入によって投与される組換えヒトアルファ－ガラクトシダーゼＡであるＳｈｉｒｅのＲＥＰＬＡＧＡＬ（登録商標）（アガルシダーゼアルファ）；および異常なアルファ－ガラクトシダーゼＡを機能的な立体構造へフォールディングをシフトさせる経口投与用低分子ペャロンであるＡｍｉｃｕｓのＧＡＬＡＦＯＬＤ（商標）（ミガラスタット、１－デオキシガラクトノジリマイシン）が挙げられる。

【0060】

リソソーム蓄積症に対して現在行われている治療は、至適なものではない。例えば、ＥＲＴを一般的には高頻度および高用量で、例えば、隔週に最大４０ｍｇ／ｋｇまで投与しなければならない。さらに、一部の補充酵素は免疫学的に交差反応性（ＣＲＩＭ）があり、対象におけるＩｇＧの産生を刺激するため、マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体を介したリソソームへの酵素の送達を妨げることがある。ＩｇＧは、補充酵素のＭ６Ｐ残基を遮蔽する可能性があり、抗原－ＩｇＧ－抗体複合体は、Ｆｃ受容体を介して細胞のリソソームに取り込まれ得るが、それによって、補充酵素が優先的にマクロファージの方へ送られる。

【0061】

適切な罹患組織への補充酵素の送達は非効率でもあり（表２、およびＤｅｓｎｉｃｋ＆Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，“Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ２０ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｍａｉｎｉｎｇ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，”１３ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３０７－３５，２０１２を参照）、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、乳児型ポンペに対し長期の酵素補充療法を受けている患者は、開鼻音、持続性筋力低下、下垂、骨減少症、難聴、誤嚥リスク、嚥下障害、心不整脈、および嚥下障害をさらに患う場合がある。補充酵素の用量は多くの場合、毎週または隔週、経時的に４０ｍｇ／ｋｇまで増加させなければならない。

【表2】

【0062】

内因性マンノース－６リン酸受容体（ＭＰＲ）は、大部分の組換え酵素のリソソームへの輸送を媒介する。ＭＰＲには、カチオン非依存性（ＣＩ－ＭＰＲ）およびカチオン依存性（ＣＤ－ＭＰＲ）の二つの相補的な形態がある。いずれの形態のノックアウトも、リソソーム酵素の輸送異常を来す。リソソームヒドロラーゼは小胞体で合成され、シスゴルジネットワークに移動し、そこでマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）基の付加によって共有結合修飾される。このマーカーの構成は、以下の二つのリソソーム酵素の逐次作用に依存する：ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン－ｌ－ホスホトランスフェラーゼ（Ｇ１ｃＮａｃ－ホスホトランスフェラーゼ）、およびＮ－アセチルグルコサミン－ｌ－ホスホジエステル－α－Ｎ－アセチル－グルコサミニダーゼ（脱被覆酵素（ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ））。ＧｌｃＮａｃ－ホスホトランスフェラーゼは、Ｇ１ｃＮＡｃ－１－リン酸残基を、ＵＤＰ－Ｇ１ｃＮＡｃから、ヒドロラーゼの高マンノース型オリゴ糖にある選択されたマンノースのＣ６位に転移させる触媒作用を及ぼす。次いで、脱被覆酵素は、末端のＧ１ｃＮＡｃを除去し、Ｍ６Ｐ認識シグナルを露出する。トランスゴルジネットワークでは、このＭ６Ｐシグナルは、リソソームヒドロラーゼが、Ｍ６Ｐ受容体への選択的結合を介して他の全ての種のタンパク質から分離することを可能にする。産生したクラスリン被覆小胞は、トランスゴルジネットワークから出芽し、後期エンドソームと融合する。後期エンドソームの低ｐＨで、ヒドロラーゼはＭ６Ｐ受容体から解離し、空の受容体はさらなる輸送を繰り返すためにゴルジ装置へ再循環される。

【0063】

マンノース受容体を介して送達されるβ－グルコセレブロシダーゼを除いて、組換えリソソーム酵素は、Ｍ６Ｐ糖鎖修飾を含み、主にＣＩ－ＭＰＲ／ＩＧＦ２Ｒを介してリソソームに送達される。しかし、糖鎖修飾／ＣＩ－ＭＰＲ－媒介性の酵素補充送達は、臨床的に意義のある全ての組織に到達するわけではない（表２）。酵素補充療法の改良は、（ｉ）β２－アゴニストのクレンブテロールを用いてＣＩ－ＭＰＲの表面発現を増加させること（Ｋｏｅｂｅｒｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ，” １０３（２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１０７－１２，２０１１、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、（ｉｉ）酵素上のＭ６Ｐ残基の量を増加させること（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｔｏ ａｃｉｄ ａｌｐｈａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｉｎ Ｐｏｍｐｅ ｍｉｃｅ，”２７９（４８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０３３６－４１，２００４、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、または（ｉｉｉ）ＩＧＦ－ＩＩドメインを酵素に融合させること（Ｍａｇａ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｃｉｄ ａｌｐｈａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｉｎ Ｐｏｍｐｅ ｍｉｃｅ，”２８８（３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１４２８－３８，２０１３、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって、ＣＩ－ＭＰＲ送達を改善することを中心に据えている。

【0064】

数多くのリソソーム蓄積症が酵素補充療法または遺伝子療法により不十分に治療されているが、これは、主として、関連する組織または器官への補充酵素の標的指向性が乏しいこと、レシピエント宿主の負の免疫学的反応があること、および血清半減期が短いことに起因する。望ましくないくも膜下腔内注射をせずに、特に脳および脊髄において、酵素のさらに良好な組織生体内分布とリソソーム取り込みとを強化し促進する改良型酵素補充療法に対するニーズがある。出願人らは、標的罹患組織、特にＣＮＳ組織のリソソームに酵素を提供するために、酵素のＣＩ－ＭＰＲ非依存結合タンパク質誘導送達および肝臓発現を用いた、改良型酵素補充療法の開発を行ってきた。

【0065】

リソソーム蓄積症は、欠陥のあるリソソーム内に蓄積する産物の種類によって分類されうる。スフィンゴ脂質蓄積症は、脂肪族アミノアルコールに連結された脂肪酸を含有する脂質であるスフィンゴ脂質の代謝に影響を及ぼす疾患の１種である（Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ，“Ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ，” ５０ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３３－７６４，Ｊｕｌｙ １９８１に概説されており、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。スフィンゴ脂質蓄積症の蓄積産物としては、ガングリオシド（例えばテイ・サックス病）、糖脂質（例えばファブリー病）、およびグルコセレブロシド（例えばゴーシェ病）が挙げられる。

【0066】

ムコ多糖症は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧＳまたはムコ多糖類）の代謝に影響を及ぼす疾患の一群であり、このグリコサミノグリカンは、骨、軟骨、腱、角膜、皮膚、および結合組織の構築に役立つ二糖の反復した非分岐長鎖である（Ｊ．Ｍｕｅｎｚｅｒ，“Ｅａｒｌｙ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ，” １１１（２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．６３－７２（Ｆｅｂ．２０１４）；Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ，” ８（１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１８１－２３１（Ｄｅｃ．２０１４）に概説され、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ムコ多糖症の蓄積産物としては、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、コンドロイチン硫酸の様々な形態、およびヒアルロン酸が挙げられる。例えば、モルキオ症候群Ａは、リソソーム酵素であるガラクトース－６－硫酸スルファターゼの欠陥により生じ、結果として、リソソーム内でのケラチン硫酸およびコンドロイチン６－硫酸の蓄積をもたらす。

【0067】

グリコーゲン蓄積症（別名、糖原病）は、細胞がグリコーゲンを代謝（生成または分解）することができないことに起因する。グリコーゲン代謝は、グルコース－６－ホスファターゼ、酸性アルファグルコシダーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、グリコーゲン分枝酵素、筋グリコーゲンホスホリラーゼ、肝グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グルコーストランスポーター、アルドラーゼＡ、ベータエノラーゼ、およびグリコーゲンシンターゼ含めた様々な酵素または他のタンパク質により調整される。典型的なリソソーム蓄積／グリコーゲン蓄積症はポンペ病であり、ポンペ病では、酸性アルファグルコシダーゼの欠陥によりグリコーゲンがリソソーム内に蓄積される。症状として、肝腫大、筋力低下、心不全、また乳児バリアントの場合には、２歳までの死亡が挙げられる（ＤｉＭａｕｒｏ ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌ，“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｓｉｓ，” ３０（２）Ａｃｔａ Ｍｙｏｌ．９６－１０２（Ｏｃｔ．２０１１）を参照のこと、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0068】

「マルチドメイン治療用タンパク質」は、（ｉ）二つ以上の機能ドメインを含有する単一タンパク質、（ｉｉ）二つ以上のポリペプチド鎖を含有するタンパク質、および（ｉｉｉ）二つ以上のタンパク質または二つ以上のポリペプチドの混合物を含む。ポリペプチドという用語は、通例、ペプチド結合を介して連結されている単鎖のアミノ酸を意味するものとされる。タンパク質という用語は、ポリペプチドという用語を包含するだけでなく、さらに複雑な構造をも含む。すなわち、単一ポリペプチドとは、タンパク質であり、タンパク質は、より高次の構造に会合した一つまたは複数のポリペプチドを含有ことができる。例えば、ヘモグロビンは、四つのポリペプチド、すなわち二つのアルファグロビンポリペプチドと二つのベータグロビンポリペプチドとを含有するタンパク質である。ミオグロビンもタンパク質であるが、これは単一のミオグロビンポリペプチドのみを含有する。

【0069】

マルチドメイン治療用タンパク質は、一つまたは複数のポリペプチドと、二つの機能を付与する少なくとも二つのドメインとを含む。これらのドメインのうちの一方は、酵素欠損症に関連する欠陥タンパク質の活性の補充をもたらす「酵素ドメイン」である。これらのドメインのうちの他方は、内部移行エフェクターとの結合をもたらす「送達ドメイン」である。そのため、酵素補充活性と内部移行エフェクター（別名、内部移行エフェクター結合タンパク質に結合する能力（送達ドメイン活性）とを付与する単一のポリペプチドは、マルチドメイン治療用タンパク質である。また、一方のタンパク質が酵素機能を付与し、別のタンパク質が内部移行エフェクター結合活性を付与する、タンパク質の混合物も、マルチドメイン治療用タンパク質である。図１Ａは、マルチドメイン治療用タンパク質の様々な典型例を図示する。一例（図１Ａ、パネルＡ）では、マルチドメイン治療用タンパク質は、酵素（六角形により表される）と、酵素（破線）および内部移行エフェクター（実線）を結合する二重特異性抗体（ＩＥ－ＢＰ）とを含有する。ここで、二重特異性抗体の一方のアームは、酵素に非共有結合し、他方のアームは、内部移行エフェクターに非共有結合し、それによって、補充酵素を細胞内または細胞内小区画内に内部移行させることができる。別の例（パネルＢ）では、マルチドメイン治療用タンパク質は、二つのポリペプチドを含有する単一タンパク質を含み、その一方のポリペプチドは酵素機能を有し、他方は送達ドメイン機能を有する。ここで、酵素は、イムノグロブリンＦｃドメインまたは重鎖定常領域に融合され、これが、酵素半抗体のＦｃドメインと会合して、二機能性マルチドメイン治療用タンパク質を形成する。パネルＢに図示された実施形態は、酵素が、半抗体のイムノグロブリン可変ドメインでの抗原抗体相互作用を介するのではなく半抗体の一方に共有結合で付加されていることを除いて、パネルＡの実施形態と類似している。

【0070】

他の実施例では、マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメインに（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）共有結合で連結された酵素から成る。一実施形態では、酵素は、イムノグロブリン分子（例えば、重鎖または代替的に軽鎖）のＣ末端に付加されている。別の実施形態では、酵素は、イムノグロブリン分子（例えば、重鎖または代替的に軽鎖）のＮ末端に付加されている。これらの典型例では、イムノグロブリン分子は、送達ドメインである。さらに別の実施形態では、酵素は、内部移行エフェクターに結合するｓｃＦｖ分子のＣ末端に付加される。

【0071】

一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、少なくとも二つの、およびいくつかの実施形態では二つ以下の送達ドメインを含み、それぞれは、同一抗原上または二つの異なる抗原上のいずれかで、異なるエピトープに向けられる。一実施形態では、第一の送達ドメインは、リソソーム輸送分子または他の内部移行エフェクター（例えば、ＣＤ６３）、またはＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、もしくはＣＤ１５１などの他の類似した細胞表面受容体に結合する。別の実施形態では、第二の送達ドメインは、トランスサイトーシスエフェクターと結合して、マルチドメイン治療用タンパク質の経細胞輸送を推進する。一実施形態では、トランスサイトーシスエフェクターは、特にＬＤＬ受容体、ＩｇＡ受容体、トランスフェリン受容体、または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）である。特定の実施形態では、トランスサイトーシス送達ドメインは、トランスフェリン受容体に結合する分子、例えば、抗トランスフェリン受容体抗体または抗トランスフェリン受容体ｓｃＦｖ分子などを含む。Ｔｕｍａ ａｎｄ Ｈｕｂｂａｒｄ、“Ｔｒａｎｓｙｔｏｓｉｓ：Ｃｒｏｓｓｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂａｒｒｉｅｒｓ，” Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，８３（３）：８７１－９３５（２００３年７月１日）は、本発明の実践において有用なトランスサイトーシスを媒介する細胞表面受容体について、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、第二の送達ドメインは、トランスフェリン受容体、またはインスリン受容体、ＣＤ９８、もしくはベイシジン（Ｂｓｇ）などの他の類似した細胞表面タンパク質に結合する。少なくとも二つの送達ドメインを含む各マルチドメイン治療用タンパク質はまた、少なくとも一つの酵素ドメインを含み、例えば、少なくとも二つの送達ドメインの各々は、本明細書に記載の方法で、酵素ドメインに独立に関連付けられるか、または関連付けられなくてもよく（例えば、抗原－抗体相互作用を介して、直接共有結合を介して、間接共有結合を介して）、少なくとも二つの送達ドメインのうちの少なくとも一つは、酵素ドメインに関連付けられている。さらに、少なくとも二つの送達ドメインの各々は、抗体、半抗体、またはｓｃＦｖ（例えば、Ｆｃと融合したｓｃＦｖなど）を独立して含んでもよい。

【0072】

「酵素ドメイン」または「酵素」とは、酵素欠損症の病因または生理学的効果に関連する任意のタンパク質を意味する。酵素としては、実在の酵素、輸送タンパク質、受容体、または、欠陥がありかつ疾患の原因となった分子的損傷があると考えられる他のタンパク質が挙げられる。酵素としてはまた、疾患の分子的損傷を補充もしくは迂回するのに類似したまたは十分な生化学的または生理学的活性を付与することのできる任意のタンパク質も含まれる。例えば、「アイソザイム」を酵素として用いてもよい。リソソーム蓄積症関連タンパク質の例としては、表１に「関与酵素／タンパク質」として列挙されたもの、および酵素欠損症の分子的欠陥を迂回する任意の既知のもしくは後に発見されるタンパク質または他の分子が挙げられる。

【0073】

いくつかの実施形態では、酵素とはヒドロラーゼであり、そのようなものとしては、エステラーゼ、グリコシラーゼ、エーテル結合に作用するヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、リニアアミダーゼ、ジホスファターゼ、ケトンヒドロラーゼ、ハロゲナーゼ、ホスホアミダーゼ、スルホヒドロラーゼ、スルフィナーゼ、デスルフィナーゼなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、酵素とはグリコシラーゼであり、そのようなものとしては、グリコシダーゼおよびＮ－グリコシラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、酵素とはグリコシダーゼであり、そのようなものとしては、アルファ－アミラーゼ、ベータ－アミラーゼ、グルカン１，４－アルファ－グルコシダーゼ、セルロース、エンド－１，３（４）－ベータ－グルカナーゼ、イヌリナーゼ、エンド－１，４－ベータ－キシラナーゼ、エンド－１，４－ｂ－キシラナーゼ、デキストラナーゼ、キチナーゼ、ポリガラクツロニダーゼ、リソザイム、エクソ－アルファ－シアリダーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、ベータ－グルコシダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、アルファ－マンノシダーゼ、ベータ－マンノシダーゼ、ベータ－フルクトフラノシダーゼ、アルファ，アルファ－トレハロース、ベータ－グルクロニダーゼ、キシランエンド－１，３－ベータ－キシロシダーゼ、アミロ－アルファ－１，６－グルコシダーゼ，ヒアルロノグルコサミニダーゼ、ヒアルロノグルクロニダーゼなどが挙げられる。

【0074】

分子的欠陥がα－グルコシダーゼ活性における欠陥であるポンペ病の場合には、酵素としては、ヒトアルファ－グルコシダーゼ、および「アイソザイム」類、例えば他のアルファ－グルコシダーゼ類、工学的に操作された組換えアルファ－グルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ類、組換えグルコシダーゼ類、非還元末端１－４結合アルファ－グルコース残基を加水分解して単一アルファグルコース分子を放出するように工学的に操作された任意のタンパク質、任意のＥＣ ３．２．１．２０酵素、グリコーゲンまたはデンプン用の天然または組換えの低ｐＨ糖質加水分解酵素、およびグルコシルヒドロラーゼ、例えば、スクラーゼ・イソマルターゼ、マルターゼ・グルコアミラーゼ、グルコシダーゼＩＩ、および中性アルファ－グルコシダーゼなどが挙げられる。

【0075】

「内部移行エフェクター」は、細胞内へ内部移行できるか、または逆行性膜輸送に関与もしくは寄与するタンパク質、場合によっては、受容体タンパク質を含む。内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）エフェクター、内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）エフェクター、内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）受容体、および内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）受容体は、本明細書で交換可能に使用される。いくつかの例において、内部移行エフェクターは、トランスサイトーシスを経るタンパク質である；すなわち、該タンパク質は、細胞の一方の側で内部移行され、細胞の他方の側へ輸送される（例えば、頂端から基底へ）。多くの実施形態において、内部移行エフェクタータンパク質は、細胞表面発現タンパク質または可溶性細胞外タンパク質である。しかし、本発明はまた、内部移行エフェクタータンパク質がエンドソーム、小胞体、ゴルジ、リソソームなど．の細胞内区画内で発現する実施形態についても考慮する。例えば、逆行性膜輸送（例えば、初期／再循環エンドソームからトランスゴルジネットワークへの経路）に関与するタンパク質は、本発明の様々な実施形態において、内部移行エフェクタータンパク質として機能を果たすことがある。いずれの場合も、送達ドメインが内部移行エフェクタータンパク質に結合することによって、マルチドメイン治療用タンパク質全体およびそれらに関連する任意の分子（例えば、酵素）も、細胞内へ内部移行されるようになる。下記に説明する通り、内部移行エフェクタータンパク質は、細胞内へ直接的に内部移行されるタンパク質、ならびに細胞内へ間接的に内部移行されるタンパク質を含む。

【0076】

細胞内へ直接的に内部移行される内部移行エフェクタータンパク質は、細胞性の内部移行を経る少なくとも一つの細胞外ドメイン（例えば、膜貫通タンパク質、ＧＰＩアンカータンパク質など）を有する膜結合性分子を含み、好ましくは、細胞内分解経路および／または再循環経路を介してプロセシングされる。細胞内に直接的に内部移行される内部移行エフェクタータンパク質の具体的かつ非限定的な例としては、例えば、ＣＤ６３、ＭＨＣ－Ｉ（例えば、ＨＬＡ－Ｂ２７）、Ｋｒｅｍｅｎ－１、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＭＡＬ（ミエリンおよびリンパ球タンパク質、別名ＶＩＰ１７）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体（例えば、ＳＣＡＲＡ１－５、ＳＣＡＲＢ１－３、ＣＤ３６）などが挙げられる。

【0077】

一実施形態では、内部移行エフェクターはいくつかの組織タイプで発現し、ＣＮＳおよび末梢細胞タイプの両方の標的化が望ましい治療に有用である。ＣＮＳおよび末梢細胞タイプの両方への輸送に有用な内部移行エフェクターとしては、ＣＤ６３、ＭＨＣ－Ｉ、液胞型Ｈ＋ ＡＴＰアーゼ、ＩＧＦ２Ｒ、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ、ＭＡＬ（ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ジフテリア毒素受容体、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子）、グルタチオン受容体、グルタミン酸受容体、レプチン受容体、および葉酸受容体が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、内部移行エフェクターは、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）である。ＰＲＬＲは、ある特定の治療用途の標的であるだけでなく、その高速の内部移行および代謝回転に基づく有効な内部移行エフェクタータンパク質でもあることが見出された。内部移行エフェクタータンパク質としてのＰＲＬＲの可能性は、例えば、国際特許出願公開第２０１５／０２６９０７号に記載されており、とりわけ抗ＰＲＬＲ抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏにてＰＲＬＲ発現細胞により効果的に内部移行されることが示されている。

【0078】

いくつかの細胞タイプによって発現される内部移行エフェクターの標的化は、例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＩＩＤ、ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＸ、ポンペ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、およびＣ２型、αマンノース症、ノイラミニダーゼ欠損症、シアリドーシス、アスパルチルグリコサミン尿症、混合性サポシン欠損症、異型ゴーシェ病、ファーバー脂肪性肉芽腫症、フコシドーシス、およびβマンノース症などの疾患の治療において、ＣＮＳおよび末梢細胞タイプの両方の標的化が望ましい場合に有用でありうる。

【0079】

別の実施形態では、内部移行エフェクターはいくつかの組織タイプで発現する。一例では、内部移行エフェクターは、骨および軟骨を優先的に標的としうる。ＣＮＳ、ならびに骨および軟骨のいずれかまたは両方への輸送に有用なエフェクターには、コラーゲンＸ、インテグリンアルファ１０（ＩＴＧＡ１０）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、線維芽細胞成長因子受容体アイソフォームＣ（ＦＧＦＲ３Ｃ）、ヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＣＲＴＬ１）、アグリカン、コラーゲンＩＩ、およびＫｒｅｍｅｎ－１が含まれるが、これらに限定されない。こうしたエフェクターは、ＣＮＳならびに骨格および軟骨の両方の標的化が望ましい治療で有用である。

【0080】

骨および軟骨によって優先的に発現される内部移行エフェクターの標的化は、例えば、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＩＩＤ、ＭＰＳ ＩＶＡ、ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＸ、βマンノース症、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、混合性サポシン欠損症、アスパルチルグリコサミン尿症、ファーバー脂肪性肉芽腫症、シアリドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、ムコ多糖症、およびαマンノース症などの疾患の治療において、ＣＮＳならびに骨格および軟骨の両方の標的化が望ましい場合に有用でありうる。

【0081】

さらに別の実施形態では、内部移行エフェクターは、マクロファージ、単球、およびマイクログリアなどの特定の組織または細胞タイプで優先的に発現する。ＣＮＳおよびマクロファージへの輸送に有用なエフェクターには、スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、ＣＤ３６、ＭＳＲ１（マクロファージスカベンジャー受容体１）、ＭＲＣ１（マクロファージマンノース受容体１）、ＶＳＩＧ４（Ｖセットおよびイムノグロブリンドメイン含有タンパク質４）、ＣＤ６８（マクロシアリン）、およびＣＳＦ１Ｒ（マクロファージコロニー刺激因子１受容体）が含まれるが、これらに限定されない。こうしたエフェクターは、ＣＮＳおよびマクロファージの両方の標的化が望ましい治療で有用である。ＣＮＳマクロファージは、マイクログリアと呼ばれる場合がある。

【0082】

マクロファージ（単球またはマイクログリア）により優先的に発現する内部移行エフェクターの標的化は、例えば、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、混合性サポシン欠損症、およびファーバー脂肪性肉芽腫症などの疾患の治療において、ＣＮＳおよびマクロファージ（またはマイクログリア）の両方の標的化が望ましい場合に有用でありうる。

【0083】

ある実施形態では、内部移行エフェクターは、腎臓特異的内部移行エフェクターであり、例えば、ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ－１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ－１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）などである。

【0084】

腎臓内で優先的に発現する内部移行エフェクターの標的化は、例えば、ファブリー病、アルポート症候群、多発性嚢胞腎疾患、および血栓性血小板減少性紫斑病などの疾患の治療において、ＣＮＳおよび腎臓の両方の標的化が望ましい場合に有用でありうる。

【0085】

さらに別の実施形態では、内部移行エフェクターは、肝臓などの特定の組織または細胞タイプで優先的に発現する。ＣＮＳおよび肝臓への輸送に有用なエフェクターには、ＡＳＧＲ１およびＡＳＧＲ２が含まれるが、これらに限定されない。こうしたエフェクターは、ＣＮＳおよび肝臓の両方の標的化が望ましい治療で有用である。

【0086】

肝臓内で優先的に発現する内部移行エフェクターの標的化は、例えば、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、ゴーシェ病、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＩ、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、およびＣ２型、シアリドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、異型ゴーシェ病、混合性サポシン欠損症、ファーバー脂肪性肉芽腫症などの疾患の治療において、ＣＮＳおよび肝臓の両方の標的化が望ましい場合に有用でありうる。

【0087】

いくつかの実施形態では、内部移行エフェクターは、筋特異的インターナライザーであり、例えば、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）などである。

【0088】

筋肉で優先的に発現する内部移行エフェクターの標的化は、例えば、ポンペ病などの疾患の治療において、ＣＮＳおよび筋組織の両方の標的化が望ましい場合に有用でありうる。

【0089】

いくつかの実施形態では、内部移行エフェクターは、ＩＴＧＡ７、ＩＴＧＡ１０、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、ＭＳＲ１、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、またはＰＲＬＲである。ＩＴＧＡ７、ＩＴＧＡ１０、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、ＭＳＲ１、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、またはＰＲＬＲに対する抗体は、当技術分野で周知である（例示的な非限定的抗ＩＧＴＡ７抗体については、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ「インテグリンアルファ７：製品」を参照のこと；抗ＩＴＧＡ１０抗体の例示的な非限定的例については、例えば、米国特許第８０４８９９１号、米国特許第２０１２００３４６２５号、米国特許第８５６３２５５号、米国特許第２０１４００９９７１６号、米国特許第２０１６０３１９０２３号、国際特許出願公開第２０１８１３８３２２号、および米国特許第１００８７２５３号を参照のこと；例示的な非限定的抗ＣＤ６３抗体については、例えば、国際特許出願公開第２０１１０２９８２号；国際特許出願公開第２０１４１８５９０８号；米国特許第２０１６０１１５２２９号；国際特許出願公開第２０１７１３４１９７号；米国特許第９７３８７１７号；およびｄｅ Ｇｏｅｉｊ ＢＥ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２０１６）Ｎｏｖ；１５（１１）：２６８８－２６９７を参照のこと；抗ＡＰＬＰ２抗体の例示的な非限定的例については、例えば、米国特許第５４３１５３Ａ号；米国特許第５４４１９３１Ａ号；米国特許第５６７７１４６Ａ号；および米国特許第５９３５８５４Ａ号を参照のこと；抗ＭＳＲ１抗体の例示的な非限定的例については、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ 製品シートＭＡＢ２７０８１；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製品シートＡＦ２７０８；ＡｂＣａｍ製品シートａｂ１５１５７０７；Ｙｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０１１；２８６（２１）：１８７９５－８０６；およびＮ Ｎｉｓｈｉｊｉｍａ、ｅｔ ａｌ．、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１７；８（０）：３７９を参照のこと；抗ＡＳＧＲ１抗体の例示的な非限定的例については、例えば、国際特許出願公開第２０１７０５８９４４号を参照のこと；非限定的な例示的抗ＡＳＧＲ２抗体については、例えば、ｗｗｗ．ｏｒｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｃａｔｅｇｏｒｙ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ？ｑ＝ＡＳＧＲ２＆ｓｕｂ＿ｃａｔｅｇｏｒｙ＝Ｐｒｉｍａｒｙ＋Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＆ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ＝Ｈｕｍａｎで入手可能なＡＳＧＲ２に対するＯｒｉｇｅｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを参照のこと；例示的な非限定的抗ＰＲＬＲ抗体については、例えば、米国特許第９６４９３７４号；米国特許第９３０２０１５号；米国特許第２０１３０１７１１４７号；米国特許第１０１０６６１６号；国際特許出願公開第２０１５０２６９０７号；米国特許第９７７７０６３号；国際特許出願公開第２０１１０６９７９５号；米国特許第２０１３０２７２９６８号；米国特許第２０１４０１４１００３号；国際特許出願公開第２０１１０６９７９９号；米国特許第２０１２０３１５２７６号；国際特許出願公開第２０１２１６３９３２号；米国特許第９２４１９８９号；国際特許出願公開第２０１２１３６５１９号；国際特許出願公開第２０１１０６９７９８号；国際特許出願公開第２０１９０１１７１９号；米国特許第８８８３９７９号；米国特許第２０１４００６５１５８号；国際特許出願公開第２０１５１８７５９６号；米国特許第９３５３１８６号；国際特許出願公開第２０１８１０２３０４号；米国特許第２０１３００２２６０６号；米国特許第９６８８７６４号；米国特許第２０１３０１２９７３９号；米国特許第２０１６０００２３４２号；米国特許第２０１５００５６２２２号；米国特許第２０１５００５６２２１号；米国特許第２０１７０００８９６５号；米国特許第２０１５００９３３９３号；国際特許出願公開第２０１１０６９７９７号；米国特許第２０１６０２５１４４２号；米国特許第２０１８００９４０６６号；国際特許出願公開第２０１４０３６０７６号；米国特許第２０１８０１８５５０４号；米国特許第２０１４０２７１６５９号；国際特許出願公開第２０１１０６９７９４号；国際特許出願公開第２０１４１４３９０９号；米国特許第２０１６０３１９０２９号；米国特許第９５４５４５１号；米国特許第９０２３３５７号；米国特許第２０１５０２５２１１６号；国際特許出願公開第２０１１０６９７９６号 Ｋｅｌｌｙ ＭＰ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２０１７）Ｊｕｌ；１６（７）：１２９９－１３１１；Ｏｔｔｏ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０１５）１５６：４３６５－７３ ２０１７－０１－２０；およびＡｎｄｒｅｅｖ Ｊ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２０１７）Ａｐｒ；１６（４）：６８１－６９３を参照のこと；これらの文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。当業者なら、これらの周知の抗体、またはその抗原結合部分（例えば、それに由来するｓｃＦｖなど）を、本明細書に記載の治療用タンパク質に容易に連結し、本明細書に記載のマルチドメイン治療用タンパク質を作製および使用することができる。

【0090】

内部移行エフェクター（ＩＥ）を細胞内に直接的に内部移行させる実施形態において、送達ドメインは、例えば、ＩＥと特異的に結合する抗体もしくは抗体の抗原結合断片、またはＩＥと特異的に相互作用するリガンドもしくはリガンドの一部でありうる。例えば、ＩＥがＫｒｅｍｅｎ－１またはＫｒｅｍｅｎ－２である場合、送達ドメインは、Ｋｒｅｍｅｎリガンド（例えばＤＫＫ１）またはそのＫｒｅｍｅｎ結合部分を含むか、またはそれからなることがある。別の例として、ＩＥがＡＳＧＲ１などの受容体分子である場合、送達ドメインは、受容体（例えば、アシアロオロソムコイド［ＡＳＯＲ］またはベータ－Ｇａ１ＮＡｃ）またはその受容体結合部分に特異的なリガンドを含むか、またはそれからなることがある。

【0091】

細胞内へ間接的に内部移行される内部移行エフェクタータンパク質としては、それら自身では内部移行しないが、細胞内へ直接的に内部移行される第二のタンパク質またはポリペプチドと結合またはその他会合した後に細胞内へ内部移行されてゆく、タンパク質およびポリペプチドが挙げられる。細胞内へ間接的に内部移行されるタンパク質としては、例えば、内部移行する細胞の表面に発現される受容体分子と結合できる可溶性リガンドを挙げることができる。内部移行する細胞の表面に発現される受容体分子とのその相互作用を介して細胞内へ（間接的に）内部移行される、可溶性リガンドの非限定的な例は、トランスフェリンである。ＩＥがトランスフェリン（または別の間接的に内部移行されるタンパク質）である実施形態において、送達ドメインとＩＥとの結合、およびＩＥとトランスフェリン受容体（または内部移行する細胞の表面に発現される別の受容体分子）との相互作用により、送達ドメイン全体およびそれと関連する任意の分子（例えば酵素）が細胞内へ内部移行されるようになり、同時にＩＥとその結合パートナーが内部移行される。

【0092】

ＩＥが細胞内に間接的に内部移行される実施形態において、送達ドメインは、例えば、ＩＥと特異的に結合する抗体、抗体の抗原結合断片、もしくはｓｃＦｖ、または可溶性エフェクタータンパク質と特異的に相互作用する受容体もしくは受容体の一部でありうる。例えば、ＩＥがサイトカインである場合、送達ドメインは、対応するサイトカイン受容体またはそのリガンド結合部分を含むか、またはそれからなることがある。

【0093】

ＩＥの典型例はＣＤ６３であり、それは細胞膜を４回貫通する細胞表面タンパク質のテトラスパニンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ６３は、ほぼ全ての組織で発現し、シグナル伝達複合体の形成および安定化に関与していると考えられている。ＣＤ６３は、細胞膜、リソソーム膜、および後期エンドソーム膜に局在化している。ＣＤ６３は、インテグリンと会合することが知られており、また上皮間葉転移に関与している可能性がある。Ｈ．Ｍａｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒｓ，” １１（６）ＦＡＳＥＢ Ｊ．４２８－４２，Ｍａｙ １９９７；ａｎｄ Ｍ．Ｍｅｔｚｅｌａａｒ ｅｔ ａｌ．，“ＣＤ６３ ａｎｔｉｇｅｎ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，”２６６ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３２３９－３２４５，１９９１を参照のこと。それら各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0094】

ＩＥの別の典型例は、アミロイドベータ（Ａ４）前駆体様タンパク質２（「ＡＰＬＰ２」）であり、これはＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）ファミリーの遍在発現メンバーである。ＡＰＬＰ２は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子（例えばＫｄ）と相互作用することが知られている膜結合タンパク質である。それは細胞表面でＫｄと結合し、クラスリン依存的にＫｄと共に牽引されて内部移行される。Ｔｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，”２８４ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４２９６－３４３０７（２００９）を参照のこと；この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0095】

ＩＥの別の典型例は、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）である。プロラクチン受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーであり、リガンドに結合しそれに続いて二量体化すると、「チロシンキナーゼのＪａｋ２、Ｆｙｎ、およびＴｅｃ、ホスファターゼＳＨＰ－２、グアニンヌクレオチド交換因子Ｖａｖ、ならびにシグナル伝達抑制因子ＳＯＣＳ」を活性化する（Ｃｌｅｖｅｎｇｅｒ ａｎｄ Ｋｌｉｎｅ，“Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，” １０（１０）Ｌｕｐｕｓ ７０６－１８（２００１），要約を参照；これらの各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。プロラクチン受容体は、エンドサイトーシス再循環を経て、リソソーム画分内で見出されうる。Ｇｅｎｔｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃＤＮＡ，”９９（２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２２１－８（１９９４）；ａｎｄ Ｆｅｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｏｎ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ，”１１５（５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １８４２－９（１９８４）を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0096】

本明細書で使用される場合、「免疫反応」は、通例、外部または「非自己」のタンパク質に対する患者の免疫学的応答を意味する。免疫学的応答は、アレルギー反応、および補充酵素の有効性を妨げる抗体の発生を含む。一部の患者は、非機能性タンパク質のいずれも産生することはなく、それゆえ補充酵素を「異種」タンパク質にする場合がある。例えば、ＧＬＡが欠乏しているファブリー病患者への組換えＧＬＡ（ｒＧＬＡ）の反復注射は、アレルギー反応を引き起こすことが多い。他の患者では、ｒＧＬＡに対する抗体の産生により、疾患の治療における補充酵素の有効性が減少することが示されている。例えば、改変ＮＡＧＡを「アイソザイム」として使用してＧＬＡを補充することについて論じている、Ｔａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．（“Ｕｓｅ ｏｆ ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ α－Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＮＡＧＡ）ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｆａｂｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ，”８５（５）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５６９－５８０（２００９））を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。改変ＮＡＧＡは、ＧＬＡとの免疫学的交差反応性を有さず、「組換えＧＬＡを用いて繰り返し治療されているファブリー病患者由来の血清に対して反応しなかった」前掲の文献、要約）。

【0097】

「免疫抑制剤」は、全般的な免疫抑制を結果として生じる薬物および／またはタンパク質を含み、ポンペ病またはファブリー病を有する患者において、補充酵素、例えばそれぞれＧＡＡまたはＧＬＡに対する交差反応性免疫学的物質（ＣＲＩＭ）を防ぐために使用されうる。免疫抑制剤の非限定的な例としては、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、ラパマイシンＤＮＡアルキル化剤、抗ＣＤ２０抗体、抗ＢＡＦＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0098】

調節因子、例えば、例として肝臓などの組織に特異的なプロモーターは、その調節因子の特異的である組織において、そのような調節因子の制御下で、核酸配列、例えば遺伝子の発現を増強する。肝特異的な調節因子、例えば肝特異的プロモーターの非限定的な例は、Ｃｈｕａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２：１６０５－１３を参照のこと。それら文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0099】

用語「タンパク質」は、アミド結合を介して共有結合で連結されている約２０個を超えるアミノ酸を有する任意のアミノ酸ポリマーを意味する。タンパク質は、一般に当該技術分野で「ポリペプチド」として知られる一つまたは複数のアミノ酸ポリマー鎖を含む。したがって、ポリペプチドは、タンパク質であってもよく、タンパク質は、複数のポリペプチドを含有して、単一機能性生体分子を形成することがある。ジスルフィド架橋（すなわち、シスチンを形成するようなシステイン残基間の）が、一部のタンパク質に存在することがある。これらの共有結合による連結が、単一のポリペプチド鎖内にあっても、二つの個々のポリペプチド鎖間にあってもよい。例えば、ジスルフィド架橋は、インスリン、イムノグロブリン類、およびプロタミンなどの適正な構造および機能に不可欠である。ジスルフィド結合形成の最近の総説として、Ｏｋａ ａｎｄ Ｂｕｌｌｅｉｄ，“Ｆｏｒｍｉｎｇ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，”１８３３（１１）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２４２５－９（２０１３）を参照されたい。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0100】

本明細書で使用される際に、「タンパク質」は、生物学的治療用タンパク質、研究または治療法で使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質および他のＦｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、ｓｃＦｖ融合タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ならびにペプチドホルモンなどを含む。タンパク質は、組換え細胞ベースの生産系、例えば、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、ピキア属）、哺乳類系（例えば、ＣＨＯ細胞、およびＣＨＯ－Ｋ１細胞などのＣＨＯ派生物）を用いて生産されてもよい。生物学的治療用タンパク質とその生産について論じている最近の総説として、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”２８ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｅｎｇ Ｒｅｖ．１４７－７５（２０１２）を参照のこと。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0101】

用語「抗体」には、本明細書で使用される場合、四つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続した二つの重（Ｈ）鎖と二つの軽（Ｌ）鎖とを含む、イムノグロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインを含む。軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３として省略されることがあり、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３として省略されることがある）でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、三つのＣＤＲおよび四つのＦＲで構成される。用語「高親和性」抗体は、それらの標的への結合親和性が、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定された場合に、少なくとも１０^－９Ｍ、少なくとも１０^－１０Ｍ、少なくとも１０^－１１Ｍ、または少なくとも１０^－１２Ｍである抗体を指す。用語「抗体」は、例えば、モノクローナルまたはポリクローナルなどの任意のタイプの抗体を包含しうる。さらに、抗体は、例えば、哺乳類または非哺乳類など、任意の起源でありうる。一実施形態では、抗体は、哺乳類であってもよいし鳥類であってもよい。さらなる実施形態では、抗体は、ヒト由来であってもよく、さらにヒトモノクローナル抗体であってもよい。

【0102】

語句「二重特異性抗体」は、二つ以上のエピトープを選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は、通例二つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、異なるエピトープ―二つの異なる分子（例えば抗原）上または同一の分子（例えば同一の抗原）上のどちらかの―を特異的に結合する。二重特異性抗体が二つの異なるエピトープ（第一のエピトープおよび第二のエピトープ）を選択的に結合することができる場合、第一のエピトープに対する第一の重鎖の親和性は、一般的に、第二のエピトープに対する第一の重鎖の親和性よりも少なくとも一桁から二桁、または三桁もしくは四桁低く、その逆もまた同様である。二重特異性抗体により認識されるエピトープは、同一の標的の上にも異なる標的の上にも（例えば、同一のタンパク質の上にも異なるタンパク質の上にも）ありうる。二重特異性抗体は、例えば、同一の抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同一の抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合可能であり、こうした配列は、イムノグロブリン軽鎖を発現する細胞内で発現することができる。典型的な二重特異性抗体は、各々が三つの重鎖ＣＤＲとそれに続いて（Ｎ末端からＣ末端へ）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する二つの重鎖と、抗原結合特異性を付与しないが各重鎖と会合可能であるか、または各重鎖と会合できかつ重鎖抗原結合領域により結合される一つまたは複数のエピトープを結合できるか、または各重鎖と会合できかつ重鎖の一方もしくは両方をエピトープの一方もしくは両方に結合させることができるイムノグロブリン軽鎖とを有する。

【0103】

語句「重鎖」または「イムノグロブリン重鎖」は、任意の生物由来のイムノグロブリン重鎖定常領域配列を含み、別段に指定のない限り、重鎖可変ドメインを含む。別段の指定のない限り、重鎖可変ドメインは、三つの重鎖ＣＤＲと四つのＦＲ領域とを含む。重鎖の断片としては、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端へ）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片としては、抗原を特異的に認識する（例えば、抗原をマイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度の範囲のＫＤで認識する）ことが可能であり、かつ細胞から発現および分泌することが可能であり、かつ少なくとも一つのＣＤＲを含む、断片が挙げられる。

【0104】

語句「軽鎖」は、任意の生物由来のイムノグロブリン軽鎖定常領域配列を含み、別段の指定のない限り、ヒトカッパ軽鎖およびヒトラムダ軽鎖を含む。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、別段の指定のない限り、典型的には三つの軽鎖ＣＤＲと四つのフレームワーク（ＦＲ）領域とを含む。一般に、完全長の軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＶＬドメインと、軽鎖定常ドメインとを含む。本発明で使用可能な軽鎖は、例えば、抗原結合タンパク質が選択的に結合する第一の抗原と第二の抗原のどちらにも選択的に結合しない軽鎖を含む。適切な軽鎖としては、既存の抗体ライブラリー（ウェットライブラリーまたはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で最も一般的に採用される軽鎖をスクリーニングすることによって特定できるものが挙げられ、この軽鎖は、抗原結合タンパク質の抗原結合ドメインの親和性および／または選択性に実質的に干渉しない。適切な軽鎖としては、抗原結合タンパク質の抗原結合領域が結合するエピトープの一方または両方を結合できる軽鎖が挙げられる。

【0105】

語句「可変ドメイン」には、次のアミノ酸領域をＮ末端からＣ末端の配列に含む（特に明記されない限り）、イムノグロブリン軽鎖または重鎖（所望通りに修飾済）のアミノ酸配列が含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「可変ドメイン」は、二連のベータシート構造を有する標準ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）内にフォールディングできるアミノ酸配列を含み、このベータシートは、第一のベータシートと第二のベータシートの残基間をジスルフィド結合によって連結されている。

【0106】

語句「相補性決定領域」または用語「ＣＤＲ」は、生物のイムノグロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、この配列は、通常（すなわち野生型動物では）イムノグロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域における二つのフレームワーク領域の間に見られる。ＣＤＲは、例えば生殖系列配列または再構成もしくは非再構成の配列によってコードされ、例えば、ナイーヴＢ細胞もしくは成熟Ｂ細胞またはＴ細胞によってコードされうる。一部の環境下（例えば、ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは、二つ以上の配列（例えば、生殖細胞系配列）によってコードされ得、その二つ以上の配列は（例えば、非再構成核酸配列においては）連続していないが、例えば、配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ－Ｄ－Ｊ再構成）の結果として、Ｂ細胞核酸配列では連続している。

【0107】

用語「抗体断片」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の一つまたは複数の断片を指す。用語「抗体断片」の中に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された二つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４－５４６、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、ならびに（ｖｉｉ）Ｆｖ断片の二つのドメインであるＶＬおよびＶＨからなり、合成リンカーによって接続されて単一タンパク質鎖を形成し、その鎖ではＶＬ領域とＶＨ領域とがペアリングして一価分子を形成している、ｓｃＦｖが挙げられる。ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も、用語「抗体」の下に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８；Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３を参照。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0108】

語句「Ｆｃ含有タンパク質」は、イムノグロブリンのＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも機能性部分を含む、抗体、二重特異性抗体、イムノアドヘシン、および他の結合タンパク質を含む。「機能性部分」は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃｙＲまたはＦｃＲｎ、すなわち胎児性Ｆｃ受容体）を結合できる、および／または補体の活性化に関与できるＣＨ２領域およびＣＨ３領域を指す。ＣＨ２領域およびＣＨ３領域が、任意のＦｃ受容体を結合不能にしかつ補体の活性化も不能にする欠失、置換、および／もしくは挿入、または他の修飾を含有する場合、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域は、機能的ではない。

【0109】

Ｆｃ含有タンパク質は、イムノグロブリンドメインに改変を含むことができ、そのような改変は、当該改変が結合タンパク質の一つまたは複数のエフェクター機能に影響を及ぼす場合（例えば、ＦｃｙＲ結合、ＦｃＲｎ結合、ならびにそれゆえ半減期および／またはＣＤＣ活性に影響を及ぼす改変）を含む。そのような改変としては、以下に限定されないが、イムノグロブリン定常領域のＥＵ付番を参照して、以下の改変およびそれらの組み合わせが挙げられる：２３８、２３９、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１５、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８、および４３９。

【0110】

例えば、限定を意図されず、結合タンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質であり、（記載された改変を含まない同一のＦｃ含有タンパク質と比較して）血清半減期の改善を示し、２５０位（例えば、ＥもしくはＱ）；２５０位および４２８位（例えば、ＬもしくはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４位（例えば、ＳもしくはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）での改変；または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／ＳＩ／Ｐ／ＱもしくはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦもしくはＹ）での改変；または２５０位および／もしくは４２８位での改変；または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位での改変を有する。別の例では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９１（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；３０７および／または３０８の改変（例えば、３０８Ｆもしくは３０８Ｐ）を含みうる。

【0111】

用語「抗原結合タンパク質」は、本明細書で使用される場合、抗原、例えば細胞特異的抗原および／または本発明の標的抗原などのエピトープを、特異的に認識するポリペプチドまたはタンパク質（機能単位で複合体化した一つまたは複数のポリペプチド）を指す。抗原結合タンパク質は、多重特異性であってもよい。抗原結合タンパク質に関連する用語「多重特異性」は、そのタンパク質が同一の抗原上または異なる抗原上のどちらかにおいて異なるエピトープを認識することを意味する。本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、単一の多機能性ポリペプチドであり得るか、または相互に共有結合でまたは非共有結合で会合した二つ以上のポリペプチドの多量体複合体でありうる。用語「抗原結合タンパク質」は、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質と連結し得るかまたは共発現し得る、本発明の抗体またはその断片を含む。例えば、抗体またはその断片は、一つまたは複数の他の分子実体、例えばタンパク質またはその断片などに、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合による会合、またはその他により）機能的に連結して、第二の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性の抗原結合分子を産生することができる。

【0112】

本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、多重特異性抗原結合ポリペプチドによって認識される抗原の一部分を指す。単一抗原（抗原ポリペプチドなど）が、二つ以上のエピトープを有していてもよい。エピトープは、構造的または機能的と定義されうる。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、抗原結合ポリペプチドと抗原との間の相互作用の親和性に直接的に寄与する残基として定義される。エピトープは、立体配座的でもあり得、すなわち、非線形アミノ酸から構成されうる。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性のある表面群である決定基を含み得、ある特定の実施形態では、特異的三次元構造特徴および／または比電荷特徴を有しうる。連続したアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への露出に際して保持されるのに対して、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理に際して損なわれる。

【0113】

用語「ドメイン」は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。好ましくは、本発明のドメインは、細胞特異的抗原または標的抗原に結合する。細胞特異的抗原ドメインまたは標的抗原結合ドメインなどは、本明細書で使用される場合、天然に発生したか、酵素的に入手可能であるか、合成であるか、または遺伝子改変されており、かつ抗原を特異的に結合する、任意のポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。

【0114】

用語「半抗体（ｈａｌｆ－ｂｏｄｙ）」または「半抗体（ｈａｌｆ－ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、互換的に用いられ、一つの重鎖と一つの軽鎖とを本質的に含有する抗体の半分を指す。抗体重鎖は、二量体を形成することができ、それゆえ一つの半抗体の重鎖は、異なる分子（例えば、別の半抗体）または別のＦｃ含有ポリペプチドと会合している重鎖と会合することができる。二つの僅かに異なるＦｃドメインは、二重特異性抗体、または他のヘテロ二量体、ヘテロ三量体、およびヘテロ四量体などの形成にあるように「ヘテロ二量体化」しうる。Ｖｉｎｃｅｎｔ ａｎｄ Ｍｕｒｉｎｉ，“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ，ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，” ７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１４４４－１４５０（２０９１２）；ａｎｄ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍａｔ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”４（５）ＭＡｂｓ ５８６－９１（２０１２）を参照のこと。各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0115】

一実施形態では、半抗体可変ドメインは内部移行エフェクターを特異的に認識し、半抗体のＦｃドメインは補充酵素（例えば、ペプチボディ）を含むＦｃ融合タンパク質と二量体化する（同上文献の５８６ページ）。

【0116】

「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」という用語は、イムノグロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）およびイムノグロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含有する単鎖融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、１０から２５アミノ酸のリンカー配列によって接続される。ＳｃＦｖポリペプチドは、ＣＬ領域またはＣＨ１領域などの他のアミノ酸配列も含みうる。ＳｃＦｖ分子は、ファージディスプレイによって製造されてもよいし、ハイブリドーマまたはＢ細胞から重鎖および軽鎖を直接的にサブクローニングすることによって作製してもよい。Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ２０１２，ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９８０２５は、ファージディスプレイおよび抗体ドメインクローニングによりｓｃＦｖ断片を作製する方法について、参照により本明細書に組み込まれる。

【0117】

「アルファ－グルコシダーゼ」（または「α－グルコシダーゼ」）、「α－グルコシダーゼ活性」、「ＧＡＡ」、および「ＧＡＡ活性」は互換的に用いられ、グリコーゲンおよびデンプンの１，４－アルファ結合を加水分解してグルコースにすることを促進する任意のタンパク質を意味する指す。ＧＡＡは、特に、ＥＣ ３．２．１．２０、マルターゼ、グルコインべルターゼ、グルコシドスクラーゼ、マルターゼ・グルコアミラーゼ、アルファ－グルコピラノシダーゼ、グルコシドインベルターゼ、アルファ－Ｄ－グルコシダーゼ、アルファ－グルコシドヒドロラーゼ、アルファ－１，４－グルコシダーゼ、およびアルファ－Ｄ－グルコシドグルコヒドロラーゼとしても知られている。ＧＡＡは、リソソーム内、および小腸の刷子縁に見出されうる。ポンペ病に罹患している患者は、機能性リソソームα－グルコシダーゼが欠乏している。Ｓ．Ｃｈｉｂａ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ａｌｐｈａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ａｎｄ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ，”６１（８）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２３３－９（１９９７）；およびＨｅｓｓｅｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＩ，”１６３７（２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６４－７０（２００３）を参照のこと。それら文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0118】

「アルファ－ガラクトシダーゼＡ」（または「α－ガラクトシダーゼＡ」）、「α－ガラクトシダーゼＡ活性」、「α－ガラクトシダーゼ」、「α－ガラクトシダーゼ活性」、「ＧＬＡ」、および「ＧＬＡ活性」は、互換的に用いられ、糖脂質および糖タンパク質由来の末端α－ガラクトシル部分の加水分解を促進し、またα－Ｄ－フコシドを加水分解する任意のタンパク質を意味する。ＧＬＡは、特に、ＥＣ ３．２．１．２２、メリビアーゼ、α－Ｄ－ガラクトシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、α－ガラクトシドガラクトヒドロラーゼ、α－Ｄ－ガラクトシドガラクトヒドロラーゼとしても知られている。ＧＬＡは、Ｘ連鎖ＧＬＡ遺伝子によりコードされるリソソーム酵素である。ＧＬＡの欠陥によりファブリー病が引き起こされ得るが、その場合、グロボトリアオシルセラミド（別名Ｇｂ３、ＧＬ－３、またはセラミドトリヘキソシド）として知られる糖脂質が血管内に蓄積し（すなわち、隆起血管障害）、その結果、疼痛や、腎臓、心臓、皮膚、および／または脳血管組織、ならびに他の組織および器官の機能に障害をもたらす。例えば、Ｐｒａｂａｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｍａｎｎｏｓｅ ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｓｏｒｔｉｌｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ａ ｉｎ ｋｉｄｎｅｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，” ７（６）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｅ３９９７５ ｐｐ．１－９（２０１２）を参照されたい。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0119】

一態様では、本発明は、リソソーム蓄積症に罹患している患者（または対象）に「マルチドメイン治療用タンパク質」を投与することによって、該患者を治療する方法を提供する。マルチドメイン治療用タンパク質は、患者の細胞に入り、ＬＳＤに関連のある酵素（すなわち「内因性酵素」）または酵素活性を補充する酵素または酵素活性（すなわち「補充酵素」）をリソソームに送達する。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子療法ベクターを介して患者に送達される。

【0120】

ＬＳＤとしては、スフィンゴ脂質蓄積症、ムコ多糖症、およびグリコーゲン蓄積症が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＬＳＤは、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ＧＭ１－ガングリオシドーシス、サンドホフ病、テイ・サックス病、ＧＭ２－活性化因子欠損症、ＧＭ３－ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、スフィンゴ脂質活性化因子欠損症、シャイエ病、ハーラー・シャイエ病、ハーラー病、ハンター病、サンフィリポＡ、サンフィリポＢ、サンフィリポＣ、サンフィリポＤ、モルキオ症候群Ａ、モルキオ症候群Ｂ、マロトー・ラミー病、スライ病、ＭＰＳ ＩＸ、およびポンペ病のうちの任意の一つまたは複数である。特定の一実施形態では、ＬＳＤはファブリー病である。別の実施形態では、ＬＳＤはポンペ病である。

【0121】

いくつかの実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、（ａ）補充酵素と、（ｂ）内部移行エフェクターを結合する分子実体（送達ドメイン）とを含む。いくつかの実施形態では、補充酵素は、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、サポシン－Ｃ活性化因子、セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ、ＧＭ２活性化因子、ＧＭ３シンターゼ、アリールスルファターゼ、スフィンゴ脂質活性化因子、α－イズロニダーゼ、イズロニダーゼ－２－スルファターゼ、ヘパリンＮ－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－α－グルコサミニダーゼ、α－グルコサミドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼ、およびヒアルロニダーゼのうちの任意の一つまたは複数である。

【0122】

場合によっては、患者は、補充酵素が患者によって「非自己」として認識されるのに十分なタンパク質を作製しないことがあり、補充酵素の投与後に続いて免疫反応が起こる。これは望ましくないことである。したがって、いくつかの実施形態では、補充酵素は、対象における免疫反応の誘導を回避するように設計または生産される。そのような解決策の一つは、補充酵素として「アイソザイム」を用いることである。アイソザイムは、患者の「自己」タンパク質に十分類似しているが、ＬＳＤの症状を緩和するのに十分な補充酵素活性を有する。

【0123】

ＬＳＤがポンペ病でありかつ内因性酵素がα－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）である特定の一実施形態では、アイソザイムは、酸性α－グルコシダーゼ、スクラーゼ・イソマルターゼ（ＳＩ）、マルターゼ・グルコアミラーゼ（ＭＧＡＭ）、グルコシダーゼＩＩ（ＧＡＮＡＢ）、および中性α－グルコシダーゼ（Ｃ ＧＮＡＣ）のうちの任意の一つでありうる。ＬＳＤがファブリー病でありかつ内因性酵素がα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）である特定の別の実施形態では、アイソザイムは、ＧＬＡ活性を持つように工学的に操作されたα－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼでありうる。

【0124】

本明細書に提供されるのは、補充酵素に対する交差反応性免疫学的物質（ＣＲＩＭ）を低減させるための、アイソザイムの使用以外の方法である。図５および図６に示されるように、内部移行エフェクター結合ドメインと酵素ドメインとを含むマルチドメイン治療用タンパク質の（例えば遺伝子療法ベクターを介した）投与は、対照の治療用タンパク質（内部移行エフェクタードメインを欠く、酵素ドメインを含む）の投与に含めて、補充酵素に対するＣＲＩＭのレベルを低減させる。したがって、一実施形態では、または、酵素の欠損を有する患者で酵素に対するＣＲＩＭを低減させることは、患者にマルチドメイン治療用タンパク質（または同一物をコードする核酸、例えば、マルチドメイン治療用タンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子療法ベクターを投与することを含み、その場合、マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメイン（例えば内部移行エフェクター結合タンパク質）および酵素ドメインと、を含む。

【0125】

マルチドメイン治療用タンパク質は、補充酵素の細胞内への取り込みを可能にする内部移行エフェクター結合タンパク質成分を有する。したがって、いくつかの実施形態では、内部移行エフェクターは、ＣＤ６３、ＭＨＣ－Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ－１、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ－受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質－２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ（プロラクチン受容体）、ＭＡＬ（ミエリンおよびリンパ球タンパク質、別名ＶＩＰ１７）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体、ＳＣＡＲＡ１－５、ＳＣＡＲＢ１－３、およびＣＤ３６でありうる。ある実施形態では、内部移行エフェクターは、腎臓特異的インターナライザーであり、例えば、ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ－１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ－１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）などである。他のある特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、筋特異的インターナライザーであり、例えば、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）などである。いくつかの特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、またはＰＲＬＲである。

【0126】

いくつかの実施形態では、内部移行エフェクター結合タンパク質は、抗原結合タンパク質を含み、そのようなものとしては、例えば、受容体融合分子、トラップ分子、受容体Ｆｃ融合分子、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ｄＡｂ断片、単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ３ペプチド、拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチド、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ、一価ナノボディ、二価ナノボディ、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ：ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ラクダ抗体（ＶＨＨ重鎖ホモ二量体抗体）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインが挙げられる。

【0127】

一実施形態では、内部移行エフェクターを結合する分子実体は、抗体、抗体断片、または他の抗原結合タンパク質である。例えば、分子実体は、二重特異性抗体とすることができ、そこでは、一方のアームが内部移行エフェクター（例えば、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＰＲＬＲ、ＡＰＬＰ２、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２）を結合し、他方のアームが補充酵素を結合する。ここで、マルチドメイン治療用タンパク質は、二重特異性抗体と補充酵素とを含む（図１Ａ）。特定の実施形態では、治療される疾患はファブリー病であり、マルチドメイン治療用タンパク質は、ＧＬＡと、ＧＬＡおよびＣＤ６３を結合する二重特異性抗体とを含む。特定の実施形態では、治療される疾患はファブリー病であり、マルチドメイン治療用タンパク質は、ＧＬＡと、ＧＬＡおよびＩＴＧＡ７を結合する二重特異性抗体とを含む。特定の別の実施形態では、治療される疾患はポンペ病であり、マルチドメイン治療用タンパク質は、ＧＡＡと、ＧＡＡおよびＣＤ６３を結合する二重特異性抗体とを含む。特定の別の実施形態では、治療される疾患はポンペ病であり、マルチドメイン治療用タンパク質は、ＧＡＡと、ＧＡＡおよびＩＴＧＡ７を結合する二重特異性抗体とを含む。

【0128】

別の実施形態では、内部移行エフェクターを結合する分子実体は、半抗体と、Ｆｃドメインを含有する補充酵素（酵素－Ｆｃ融合ポリペプチド）とを含む。一実施形態では、酵素－Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメインが、内部移行エフェクター特異的半抗体のＦｃドメインと会合して、マルチドメイン治療用タンパク質を形成する（図１Ｂ）。

【0129】

他の実施形態では、補充酵素は、内部移行エフェクター結合タンパク質に共有結合で連結されている。前のパラグラフで述べた酵素－Ｆｃ融合：半抗体の実施形態（図１Ｂも参照）は、このクラスに属するが、それは、そのＦｃ二量体を一つまたは複数のジスルフィド架橋を介して固定することができるためである。酵素活性ドメインまたはポリペプチドと、内部移行－結合ドメインまたはポリペプチドとの間の共有結合による連結は、任意の種類の共有結合、すなわち電子の共有に関与した任意の結合であってもよい。場合によっては、共有結合は、二つのアミノ酸の間のペプチド結合であり、それゆえに、補充酵素と内部移行エフェクター結合タンパク質とは、全体としてまたは部分的に、融合タンパク質にあるような連続ポリペプチド鎖を形成する。場合によっては、補充酵素部分と内部移行エフェクター結合タンパク質とが直接的に連結されている。他の場合では、リンカーを用いて二つの部分を繋ぐ。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｎｋｅｒｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，”６５（１０）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．１３５７－６９（２０１３）を参照されたい。

【0130】

「リンカー」または「スペーサー」という用語は、典型的には、融合タンパク質の一つまたは複数の連結成分、例えば、ｓｃＦｖのＶＬに関連したＶＨ、本明細書に記載されるようなマルチドメイン治療用タンパク質の送達ドメイン（例えば、抗内部移行エフェクター抗体）に連結された治療用タンパク質（例えば、補充酵素）の適切な折り畳みを可能にする、短い（例えば、２～２５アミノ酸）ポリペプチドを指す。リンカーは、融合タンパク質の構成要素の可撓性の接合領域を提供し、分子の二つの末端が独立して移動することを可能にし、二つの部分の各々の適切な機能を保持するのに重要な役割を果たしうる。したがって、接合領域は、場合によっては、二つの部分を一緒に組み合わせるリンカー、および二つの部分のそれぞれが独自の生物学的構造を形成し、他の部分に干渉しないようにするスペーサーの両方として機能する。さらに、接合領域は、対象の免疫系によって異物として認識されない、別の言い方をすると、免疫原性とみなされないエピトープを作り出すべきである。リンカーの選択はまた、融合分子の結合活性に影響を与える可能性がある。（Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ，１９８８，ＰＮＡＳ，８５：１６：５８７９－８３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｂａｔｅｓ，１９９８，ＰＮＡＳ ９５（１１）：５９２９－３４；Ａｒａｉ，ｅｔ ａｌ．２００１，ＰＥＤＳ，１４（８）：５２９－３２；ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６５：１３５７－１３６９を参照のこと）一実施形態では、送達ドメインは、一つまたは複数のペプチドリンカーを介して治療用ポリペプチドまたはその断片に接続される。別の実施形態では、ｓｃＦｖ抗体の可変領域は、一つまたは複数のペプチドリンカーを介して相互に、またはその断片に接続されている。

【0131】

リンカー鎖の長さは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １５以上のアミノ酸残基でありうるが、典型的には５～２５残基である。リンカーの例としては、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（３Ｇｌｙ）、４Ｇｌｙ、５Ｇｌｙ、６Ｇｌｙ、７Ｇｌｙ、８Ｇｌｙまたは９Ｇｌｙなどのポリグリシンリンカーが挙げられる。リンカーの例としては、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ、および（Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）ｎなどのＧｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカーも挙げられ、式中、ｎ＝１～１０である。（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎおよび（Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）ｎは、（Ｇ４Ｓ）ｎおよび（Ｓ４Ｇ）ｎとしてもそれぞれ知られている。

【0132】

いくつかの実施形態では、治療用タンパク質、例えば、補充酵素は、抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のＣ末端に（図１Ｃを参照）、または軽鎖のＣ末端に（図１Ｅ）、共有結合される。いくつかの実施形態では、補充酵素は、抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のＮ末端に（図１Ｄを参照）、または軽鎖のＮ末端に（図１Ｆ）共有結合される。いくつかの実施形態では、酵素は、抗内部移行エフェクターｓｃＦｖドメインのＣ末端に連結される（図１Ｇ）。

【0133】

いくつかの場合では、特に治療用タンパク質、例えば、補充酵素がリソソーム内で正常にタンパク質分解によりプロセシングされない場合には、切断可能なリンカーが、抗体－酵素融合体を含むマルチドメイン治療用タンパク質の実施形態に追加される。いくつかの実施形態では、ａ）立体的に大きな抗体を除去することによってできる限り酵素活性の保持の助けとするために、かつｂ）酵素のリソソーム内半減期をできる限り増加するために、カテプシン切断可能リンカーを抗体と補充酵素との間に挿入して、リソソーム内での抗体の除去を容易にする。

【0134】

特定の一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子療法ベクターで患者または細胞に送達される。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメインおよび酵素ドメインを含む。いくつかの実施形態では、送達ドメインは、内部移行エフェクター例えば、ＣＤ６３、ＭＨＣ－Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ－１、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＭＡＬ（ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、またはＣＤ３６などと結合する。一実施形態では、送達ドメインは、ＣＤ６３に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（すなわち抗ＣＤ６３ ｓｃＦｖ）である。別の実施形態では、送達ドメインは、ＩＴＧＡ７に結合する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（すなわち抗ＩＴＧＡ７ ｓｃＦｖ）である。

【0135】

特定の一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質の酵素ドメインは、ヒドロラーゼを含む。特定の実施形態では、酵素ドメインは、グリコシラーゼであるヒドロラーゼを含む。より具体的な実施形態では、酵素ドメインは、グリコシダーゼであるグリコシラーゼを含む。より具体的な実施形態では、酵素ドメインは、アルファ－グルコシダーゼであるグリコシダーゼである。

【0136】

一般的に、本明細書に開示されるのは、例えば、ポンペ病の患者におけるグリコーゲンの減少および／またはＧＡＡに対する免疫寛容の増強のための、リソソーム蓄積症の治療における内部移行エフェクタードメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、（ｍ）ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびそれらの修飾形態を含む組成物およびその使用である。

【0137】

「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも一つのポリペプチドをコードするヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）のポリマーを含み、そのようなポリペプチドとしては、融合ポリペプチド、例えば、内部移行エフェクタードメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療ポリペプチドが挙げられる。本明細書で使用される際に、ポリヌクレオチドは、修飾および非修飾の両方のヌクレオチドを含むポリマーを包含する。ポリヌクレオチドは、一つまたは複数のコード領域および非コード領域を含有してもよい。ポリヌクレオチドは、天然源から精製され、組み換え発現系を用いて製造され、任意選択的に精製され、化学的に合成されることなどがありうる。適切な場合、例えば、化学的に合成された分子の場合、ポリヌクレオチドは、化学修飾された塩基類または糖類を有する類似体、骨格修飾などのヌクレオチド類似体を含むことができる。別段の指示がない限り、ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向に提示される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然のヌクレオシド類（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチル アデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）；化学修飾塩基類；生物学的修飾塩基類（例えば、メチル化塩基）；介在塩基類；修飾糖類（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；ならびに／または修飾リン酸基類（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるかまたはそれを含む。

【0138】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、一つまたは複数の非標準ヌクレオチド残基を含む。非標準ヌクレオチド残基は、例えば、５－メチル－シチジン（“５ｍＣ”）、シュードウリジン（“ψＵ”）、および／または２－チオ－ウリジン（“２ｓＵ”）を含みうる。例えば、それぞれがそのような残基とポリヌクレオチド内へのそれらの組み込みの議論について参照によりその全体を組み込まれる、米国特許第８，２７８，０３６号または国際特許出願公開第２０１１０１２３１６号を参照されたい。非標準ヌクレオチド残基の存在によって、ポリヌクレオチドは、対照よりも、すなわち同じ配列を有するが標準残基のみを含有するポリヌクレオチドよりも、安定なおよび／または免疫原性の低いものとなりうる。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、イソシトサイン、シュードシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２－クロロ－６－アミノプリンシトシン、ならびにこれらの修飾および他の核酸塩基の修飾の組合せから選択される一つまたは複数の非標準ヌクレオチド残基を含みうる。特定の実施形態は、フラノース環または核酸塩基への追加的な修飾をさらに含みうる。追加的な修飾としては、例えば、糖の修飾または置換を含みうる（例えば、一つまたは複数の２’－Ｏ－アルキル修飾であるロックされた核酸（ＬＮＡ））。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、追加のポリヌクレオチドおよび／またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）と複合体を形成していてもよいし、ハイブリダイズしていてもよい。糖の修飾が２’－Ｏ－アルキル修飾である実施形態では、そのような修飾としては、以下に限定されないが、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾、および２’－デオキシ修飾が挙げられる。ある特定の実施形態では、これらの修飾のいずれかは、ヌクレオチドの０％～１００％に、例えば、個別でまたは組み合わせで成分ヌクレオチドの０％、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または１００％に、存在することがある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を含み、それは、その安定性を増加させるためのおよび／またはその免疫原性を減少させるための周知の方法によって、修飾されていることもいないこともあり、例えば、修飾ヌクレオチドを含むことも含まないこともある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子を含み、それは、その安定性を増加させるためのおよび／またはその免疫原性を低下させるための周知の方法によって、修飾されていることもいないこともあり、例えば、修飾ヌクレオチドを含むことも含まないこともある。

【0139】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはまた、「遺伝子座ターゲティング核酸配列」を含む。遺伝子座を標的とする配列は、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドをレシピエント宿主細胞のゲノムへ組み込むことを可能にする。いくつかの実施形態では、遺伝子座ターゲティング配列は、相同組み換えを可能にするための隣接する相同アームを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子座ターゲティング配列は、組み込みを推進するガイドＲＮＡ配列およびＩＩ型Ｃａｓ酵素（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子座ターゲティング配列は、組込みを推進するためのガイドジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）認識配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子座ターゲティング配列は、組込みを推進するための転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）認識配列を含む。さらに他の実施形態では、遺伝子座ターゲティング配列は、組込みを推進するためのＢｕＤ由来ヌクレアーゼによって使用される単一の残基対ヌクレオチドコードを含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれているゲノム遺伝子座は、「セーフハーバー遺伝子座」である。一実施形態では、「セーフハーバー遺伝子」は、マルチドメイン治療用タンパク質の高い発現を可能にする一方で、必須遺伝子の発現に干渉しないか、または癌遺伝子もしくは他の有害遺伝子の発現を促進しない。一実施形態では、ゲノム遺伝子座は、肝臓で発現されるアルブミン（Ａｌｂ）遺伝子座、ＥＥＳＹＲ遺伝子座、ＳＡＲＳ遺伝子座、ヒト第１番染色体の１８８，０８３，２７２位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ヒト第１０番染色体の３，０４６，３２０位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ヒト第１７番染色体の６７，３２８，９８０もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、染色体上のアデノ関連ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ヒト第１９番染色体上のＡＡＶウイルスの天然発生の組込み部位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、ＨＩＶ－１共受容体をコードするケモカイン受容体遺伝子、またはマウスＲｏｓａ２６遺伝子座もしくはその非マウス哺乳動物のオルソログである。一実施形態では、ゲノム遺伝子座は、アデノ関連ウイルス部位である。一実施形態では、組込みのためのゲノム遺伝子座は、遺伝子療法ベクターの組込みに用いるセーフハーバーゲノム遺伝子座のステップワイズ選択のために参照により本明細書に組み込まれるＰａｐａｐｅｔｒｏｕ ａｎｄ Ｓｃｈａｍｂａｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．２４（４）：６７８－６８４、２０１６年４月の方法に従って選択されるが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる肝臓発現アルブミン（Ａｌｂ）遺伝子座内のプロモーターレス遺伝子ターゲティングについてのＢａｒｚｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．５１７：３６０－３６４も参照されたい。

【0141】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡは、マルチドメイン治療用タンパク質をコードする核酸配列に動作可能に連結されたプロモーターも含有する。特定の実施形態では、プロモーターは、特定の組織における遺伝子発現を駆動する組織特異的プロモーターである。一実施形態では、組織特異的プロモーターは、セルピナ１（例えば配列番号９）および／またはＴＴＲプロモーター（配列番号８）由来の肝特異的なエンハンサー／プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。他の実施形態では、プロモーターはユビキチンＣプロモーターである

【0142】

一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質をコードする「遺伝子療法ベクター」は、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主、例えば患者などに送達することが可能な任意のベクターである。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、例えば、局所送達、例えば組織特異的送達のために、特定の宿主細胞または器官を標的とする。典型的には、局所送達は、主に器官、例えば肝臓でおよび／またはそれにより翻訳および発現される、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（例えばマルチドメイン治療用タンパク質）を必要とし、それによってデポ、例えばタンパク質の産生（および分泌）のための肝臓デポを形成する。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、患者の肝臓にマルチドメイン治療用タンパク質のポリヌクレオチドを送達して肝臓デポを形成する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤｅｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１０：６９９－７０７を参照されたい。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、患者においてマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを筋組織に送達する。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを患者の脳に送達する。

【0143】

既知のまたは将来的に開発される遺伝子療法送達ベクターを、天然のものでも工学的に操作されたものでも、本発明の実践に用いることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ウイルスベクターであり、例えば、ウイルス、ウイルスキャプシド、ウイルスゲノムなどを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、裸のポリヌクレオチド、例えばエピソームである。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ポリヌクレオチド複合体を含む。遺伝子療法ベクターとして使用するための例示的で非限定的なポリヌクレオチド複合体としては、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリペックス、デンドリマー、無機ナノ粒子（例えば、ポリヌクレオチド被覆金、シリカ、酸化鉄、リン酸カルシウムなど）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターは、ウイルスベクター、裸のポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド複合体の組み合わせを含む。

【0144】

一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ウイルスであり、そのようなものとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、またはアデノ関連ウイルスが挙げられる。一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）であり、そのようなものとしては、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶ１１、またはそれらの工学的に操作されたもしくは天然の選択されたバリアントが挙げられる。

【0145】

一実施形態では、ポリヌクレオチドはまた、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列を含有する。一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、二つ以上の血清型に由来する遺伝子因子を含有するキメラアデノ関連ウイルスである。例えば、ＡＡＶ１由来のｒｅｐ遺伝子とＡＡＶ２由来のｃａｐ遺伝子とを有するＡＡＶベクター（ＡＡＶ１／２またはＡＡＶ ＲＣ１／２とよぶ）が、マルチドメイン治療用タンパク質のポリヌクレオチドを細胞または必要とする患者の細胞に送達するための遺伝子療法ベクターとして、使用されてもよい。一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ１／２、ＡＡＶ１／３、ＡＡＶ１／４、ＡＡＶ１／５、ＡＡＶ１／６、ＡＡＶ１／７、ＡＡＶ１／８、ＡＡＶ１／９、ＡＡＶ１／１０、ＡＡＶ１／１１、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／３、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／１０、ＡＡＶ２／１１、ＡＡＶ３／１、ＡＡＶ３／２、ＡＡＶ３／４、ＡＡＶ３／５、ＡＡＶ３／６、ＡＡＶ３／７、ＡＡＶ３／８、ＡＡＶ３／９、ＡＡＶ３／１０、ＡＡＶ３／１０、ＡＡＶ４／１、ＡＡＶ４／２、ＡＡＶ４／３、ＡＡＶ４／５、ＡＡＶ４／６、ＡＡＶ４／７、ＡＡＶ４／８、ＡＡＶ４／９、ＡＡＶ４／１０、ＡＡＶ４／１１、ＡＡＶ５／１、ＡＡＶ５／２、ＡＡＶ５／３、ＡＡＶ５／４、ＡＡＶ５／６、ＡＡＶ５／７、ＡＡＶ５／８、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶ５／１０、ＡＡＶ５／１１、ＡＡＶ６／１、ＡＡＶ６／２、ＡＡＶ６／３、ＡＡＶ６／４、ＡＡＶ６／５、ＡＡＶ６／７、ＡＡＶ６／８、ＡＡＶ６／９、ＡＡＶ６／１０、ＡＡＶ６／１０、ＡＡＶ７／１、ＡＡＶ７／２、ＡＡＶ７／３、ＡＡＶ７／４、ＡＡＶ７／５、ＡＡＶ７／６、ＡＡＶ７／８、ＡＡＶ７／９、ＡＡＶ７／１０、ＡＡＶ７／１１、ＡＡＶ８／１、ＡＡＶ８／２、ＡＡＶ８／３、ＡＡＶ８／４、ＡＡＶ８／５、ＡＡＶ８／６、ＡＡＶ８／７、ＡＡＶ８／９、ＡＡＶ８／１０、ＡＡＶ８／１１、ＡＡＶ９／１、ＡＡＶ９／２、ＡＡＶ９／３、ＡＡＶ９／４、ＡＡＶ９／５、ＡＡＶ９／６、ＡＡＶ９／７、ＡＡＶ９／８、ＡＡＶ９／１０、ＡＡＶ９／１１、ＡＡＶ１０／１、ＡＡＶ１０／２、ＡＡＶ１０／３、ＡＡＶ１０／４、ＡＡＶ１０／５、ＡＡＶ１０／６、ＡＡＶ１０／７、ＡＡＶ１０／８、ＡＡＶ１０／９、ＡＡＶ１０／１１、ＡＡＶ１１／１、ＡＡＶ１１／２、ＡＡＶ１１／３、ＡＡＶ１１／４、ＡＡＶ１１／５、ＡＡＶ１１／６、ＡＡＶ１１／７、ＡＡＶ１１／８、ＡＡＶ１１／９、ＡＡＶ１１／１０、それらのキメラウイルスベクターまたは誘導体である。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，”ＰＮＡＳ ９９（１８）：１１８５４－１１８５９、Ｓｅｐ．３、２００２は、遺伝子療法ベクターとして有用なＡＡＶベクターおよびキメラウイルスベクター、ならびにそれらの構築対および使用のために、参照により本明細書に組み込まれる。

【0146】

より具体的な実施形態では、遺伝子療法ベクターは、血清型２のｒｅｐ遺伝子配列および血清型８のｃａｐ配列（「ＡＡＶ２／８」または「ＡＡＶ ＲＣ２／８）を有するキメラＡＡＶ ベクターである。

【0147】

いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、特定の細胞、例えば肝細胞を標的とするためにシュードタイプ化されてきた（例えば、工学的に操作されてきた）ウイルスベクターである。ウイルスベクターを使用した標的化遺伝子療法の進歩のうちの多くは、ウイルスベクターの天然指向性のシュードタイピング、拡張、および／または再標的化がもたらされる、ウイルスベクターの非組換え（非遺伝子）または組換え（遺伝子）改変として要約することができる（Ｎｉｃｋｌｉｎ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２７３－９３；Ｖｅｒｈｅｉｊｉ ａｎｄ Ｒｏｔｔｉｅｒ（２０１２）Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｖｉｒｏｌ ２０１２：１－１５に概説。各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非遺伝的手法は、典型的には、野生型（非改変型）ウイルス表面タンパク質および標的細胞の両方を認識するアダプターを利用する。可溶性疑似受容体（野生型ウイルス）、ポリエチレングリコールなどのポリマー、および抗体またはその一部分が、アダプターのウイルス結合ドメインとして使用されてきたが、天然ペプチドまたはビタミンリガンド、ならびに抗体およびその一部分は、上述のアダプターの細胞結合ドメインに使用されてきた。例えば、標的細胞へのウイルスベクターの再標的化は、ベクター：アダプター複合体を、標的細胞の表面に発現されたタンパク質、例えば細胞表面タンパク質に結合すると達成されうる。そのようなアプローチは、ＡＡＶ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７７－２７８５）、アデノウイルス（Ｈｅｍｍｉｎｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：６３７７－８１；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１９８２－１９９１；Ｅｉｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１２８４－９１；Ｇｌａｓｇｏｗ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ４：ｅ８３５５）、ヘルペスウイルス（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：６１７－２４）、およびパラミキソウイルス（Ｂｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：２９５－３０３；Ｂｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２９：１３５９－６９）、コロナウイルス（Ｈａｉｊｅｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４５２８－４５３８；Ｗｕｒｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：１３９４－１４０４、各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）について使用されてきた。

【0148】

より一般的な手法は、ウイルスキャプシドタンパク質、したがってウイルスキャプシドの表面の組換え遺伝子改変である。間接的な組換え手法では、ウイルスキャプシドは、その後アダプターに連結される異種「足場」を用いて改変される。アダプターは、足場および標的細胞に結合する。（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：１２５－１３２、Ｐｏｎｎａｚｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１２９００－９０７、国際特許出願第９７／０５２６６号も参照されたい。各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。（１）抗体アダプターのＦｃに結合するＦｃ結合分子（例えば、Ｆｃ受容体、プロテインＡなど）、（２）ビオチン標識化アダプターに結合する（ストレプト）アビジン、（３）（ストレプト）アビジンに融合するアダプターに結合するビオチン、および（４）Ｓｐｙ標識化アダプターに結合するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒなどの等長ペプチド結合を形成するタンパク質：タンパク質結合対、などの足場が、Ａｄに組み込まれている（Ｐｅｒｅｂｏｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１４：６２７－６３７、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ３６６：７６９－７７４、Ｈｅｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１３：１４２７－１４３９、Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ２１：４９８５－４９８８）、ＡＡＶ（Ｇｉｇｏｕｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ１１：８５６－８６５、Ｓｔａｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ１６：１４６７－１４７３）、およびトガウイルス（Ｑｕｅｔｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５３：１７９－１９６、Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５：７６３－７６７、Ｋｌｉｍｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３３８：９－２１。各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0149】

直接的な組み換え型ターゲティングアプローチでは、ターゲティングリガンドは、ウイルスキャプシドの中に直接的に挿入されるかまたは結合される、すなわち、タンパク質ウイルスキャプシドが異種リガンドを発現するように改変される。次いで、リガンドは、標的細胞上で優先的にまたは標的細胞上でのみ発現される受容体またはマーカーを再配向、例えば結合する。（Ｓｔａｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：９２６－９３１；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：５１３－５１９。各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。直接的な組み換えによるアプローチは、ＡＡＶ（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １３：２６５３－５９；Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：１０５２－５６；Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：９６４－７５；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：１６９７－１７１１；Ｓｈｉ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：５１５－５２５、各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、レトロウイルス（Ｄａｌｂａ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：６５５－６６７；Ｔａｉ ａｎｄ Ｋａｓａｈａｒａ（２００８）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １３：３０８３－３０９５；Ｒｕｓｓｅｌｌ ａｎｄ Ｃｏｓｓｅｔ（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：３００－３１１；Ｅｒｌｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０２：３３３－３４１；Ｃｈａｄｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２８５：４８５－４９４；Ｐｉｚｚａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１０８８－１０９６）、ポックスウイルス（Ｇｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５９５－６０８；Ｇａｌｍｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：３０１９－３０２７；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０：６６４－６７１）、パラミキソウイルス（Ｎａｋａｍｕｒａ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１６８５－１６９２；Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５：２０８７－２０９６；Ｇａｌａｎｉｓ（２０１０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８８：６２０－６２５；Ｂｌｅｃｈａｃｚ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１６２－１７５；Ｒｕｓｓｅｌｌ ａｎｄ Ｐｅｎｇ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３０：２１３－２４１）、およびヘルペスウイルス（Ｓｈａｈ ａｎｄ Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：３６１－３７０；Ｃａｍｐａｄｅｌｌｉ－Ｆｉｕｍｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１：２１３－２２６、各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で使用されている。

【0150】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターは、調節応答、例えば補充酵素に対する例えば寛容を生じるのに特に適している組織に、シュードタイプ化される。そのような組織としては、以下に限定されないが、粘膜組織、例えば、腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）、造血幹細胞、および肝臓が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクター、または本明細書に記載されるマルチドメイン治療用タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、肝特異的プロモーターなど、それらの組織に特異的なプロモーターの制御下で発現される。

【0151】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターは、裸のポリヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、マルチドメイン治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば筋肉内に、デポの形成のために直接的に器官内に、静脈内に、注射されることがある。裸のポリヌクレオチドの送達の増強のための周知の追加の方法としては、以下に限定されないが、電気穿孔、超音波穿孔、ポリヌクレオチド被覆金粒子を射出するための遺伝子銃の使用、磁気粒子、および水力学的送達が挙げられる。

【0152】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターは、ポリヌクレオチド複合体、例えば、以下に限定されないが、ナノ粒子（例えば、ポリヌクレオチド自己組織化ナノ粒子、ポリマー系自己組織化ナノ粒子、無機ナノ粒子、脂質ナノ粒子、半導体性／金属ナノ粒子）、ゲルおよびハイドロゲル、カチオンおよびアニオンを含むポリヌクレオチド複合体、マイクロ粒子、およびそれらの任意の組み合わせなどを含む。

【0153】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、自己組織化ナノ粒子として製剤化されうる。非限定的な例として、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのための送達システムで使用されうるナノ粒子を作製するために使用されてもよい（例えば、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２０１２１２５９８７号を参照）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド自己組織化ナノ粒子は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのコアおよびポリマーシェルを含みうる。ポリマーシェルは、本明細書に記載されるポリマーのいずれであってもよく、当該技術分野で公知である。追加的な実施形態では、ポリマーシェルは、コア内のポリヌクレオチドを保護するために使用されうる。

【0154】

いくつかの実施形態では、これらの自己組織化ナノ粒子は、長いポリマーのポリヌクレオチドヘアピンで形成されたマイクロスポンジであることがあり、そのポリヌクレオチドヘアピンは、結晶質の「ひだのある」シートへと形成された後、マイクロスポンジへ自己組織化される。これらのマイクロスポンジは、高密度充填されたスポンジ様のマイクロ粒子であり、それらの粒子は、効率の良い担体として機能し、積荷を細胞に送達できることがある。マイクロスポンジは、直径が１μｍから３００ｎｍでありうる。マイクロスポンジは、当技術分野で公知の他の薬剤と複合体化されてさらに大きなマイクロスポンジを形成してもよい。非限定的な例として、マイクロスポンジは、外層を形成して細胞による取り込みを促進するための薬剤、例えばポリカチオン性ポリエチレンイメ（ＰＥＩ）などと複合体化されることがある。この複合体は、高温（１５０℃）で安定した状態を保つことができる２５０ｎｍ直径の粒子を形成することができる（Ｇｒａｂｏｗ ａｎｄ Ｊａｅｇａｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１２，１１：２６９－２６９；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、これらのマイクロスポンジは、リボヌクレアーゼによる分解からの並外れた程度の保護を発揮できることがある。別の実施形態では、ポリマーベースの自己組織化ナノ粒子、例えば、以下に限定されないがマイクロスポンジなどは、完全にプログラム可能なナノ粒子であることがある。ナノ粒子の幾何学的形状、サイズおよび化学量論は、積荷を送達するための最適なナノ粒子、例えば、以下に限定されないがポリヌクレオチドなどを作り出すために、正確に制御されうる。

【0155】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、無機ナノ粒子（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２５７，７４５号）に製剤化されうる。無機ナノ粒子は、水で膨潤可能な粘土性物質を含みうるが、これに限定されない。非限定的な例として、無機ナノ粒子は、単純なケイ酸塩から作製される合成スメクタイト粘土を含みうる（例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる米国特許第５，５８５，１０８号および第８，２５７，７４５号を参照）。

【0156】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、半導性材料または金属材料を含む水分散性ナノ粒子（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０２２８５６５号）で製剤化されてもよいし、磁気ナノ粒子（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０２６５００１号および第２０１２０２８３５０３号）で形成されてもよい。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子であっても親水性ナノ粒子であってもよい。

【0157】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、対象に注入された時にゲルを形成しうる、当技術分野で公知の任意のハイドロゲルに封入されうる。ハイドロゲルは、親水性のポリマー鎖のネットワークであり、水が分散媒体であるコロイドゲルとして見出されることがある。ハイドロゲルは、吸収性の高い（９９％超の水を含有可能である）天然または合成のポリマーを含みうる。ハイドロゲルは、かなり多くの水分含量があるために、天然組織と非常に類似した柔軟性も有する。本明細書に記載のハイドロゲルは、生体適合性、生分解性、および／または多孔性の脂質ナノ粒子を封入するために使用されうる。

【0158】

非限定的な例として、ハイドロゲルは、アプタマー官能化ハイドロゲルであってもよい。アプタマー官能化ハイドロゲルは、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションを使用して一つまたは複数のポリヌクレオチドを放出するようにプログラムされていてもよい。（Ｂａｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ．２０１２ １３４：１２４１０－１２４１３；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子内に封入されてもよく、次いで、脂質ナノ粒子がハイドロゲル内に封入されてもよい。

【0159】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、フィブリンゲル、フィブリンハイドロゲル、またはフィブリン接着剤内に封入されてもよい。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、フィブリンゲル、フィブリンハイドロゲル、またはフィブリン接着剤内に封入される前に、脂質ナノ粒子または急速排除性脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、フィブリンゲル、ハイドロゲル、またはフィブリン接着剤に封入される前に、リポプレックスとして製剤化されてもよい。フィブリンゲル、ハイドロゲル、および接着剤は、二つの構成成分、すなわちフィブリノゲン溶液とカルシウムに富むトロンビン溶液とを含む（例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれるＳｐｉｃｅｒ ａｎｄ Ｍｉｋｏｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１０．１４８：４９－５５；Ｋｉｄｄ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１２．１５７：８０－８５を参照）。フィブリンゲル、ハイドロゲル、および／または接着剤の構成成分の濃度は、ゲル、ハイドロゲルおよび／または接着剤の特性、ネットワークのメッシュサイズ、および／または分解特性を変化させるように変更することができ、例えば、以下に限定されないが、フィブリンゲル、ハイドロゲル、および／または接着剤の放出特性を変化させるなどができる。（例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる、Ｓｐｉｃｅｒ ａｎｄ Ｍｉｋｏｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１０．１４８：４９－５５；Ｋｉｄｄ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１２．１５７：８０－８５；Ｃａｔｅｌａｓ ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２００８．１４：１１９－１２８を参照されたい）。この特徴は、本明細書に開示されたポリヌクレオチドを送達するために使用される場合に有利でありうる。（例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる、Ｋｉｄｄ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１２．１５７：８０－８５；Ｃａｔｅｌａｓ ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２００８．１４：１１９－１２８を参照されたい）。

【0160】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、カチオンまたはアニオンを含みうる。一実施形態では、製剤は、金属カチオン、例えば、以下に限定されないが、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋およびそれらの組み合わせなどを含む。非限定的な例として、製剤は、ポリマーと、金属カチオンと複合体化されたポリヌクレオチドとを含みうる（例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる米国特許第６，２６５，３８９号および第６，５５５，５２５号を参照）。

【0161】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子に製剤化しうる。これらのナノ粒子および／またはマイクロ粒子は、任意のサイズの形状および化学に成形されうる。一例として、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子は、ＬＩＱＵＩＤＡ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ．ＲＴＭ（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｃ．）によるＰＲＩＮＴ（登録商標）技術を使用して作製されうる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２００７０２４３２３号を参照）。

【0162】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｎａｎｏ（ステートカレッジ、ペンシルバニア州）によって、ナノジャケットおよびナノリポソームで製剤化されうる。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸塩を含めた体内で天然に見出される化合物か、または少量のケイ酸塩も含む化合物から作製される。ナノジャケットは、５から５０ｎｍのサイズに及ぶことがあり、以下に限定されないがポリヌクレオチド、主要構築物および／またはポリヌクレオチドなどの親水性化合物および疎水性化合物を送達するために使用されうる。ナノリポソームは、脂質から作製され、例えば、以下に限定されないが体内で天然に発生する脂質から作製される。ナノリポソームは、６０～８０ｎｍのサイズに及ぶことがあり、親水性および疎水性の化合物、例えば、以下に限定されないがポリヌクレオチド、主要構築物および／またはポリヌクレオチドを送達するために使用されうる。一態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、以下に限定されないがセラミドナノリポソームなどのナノリポソームで製剤化されている。

【0163】

一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、抗ＣＤ６３ ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質または抗ＩＴＧＡ７ ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質である。抗ＣＤ６３ ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質または抗ＩＴＧＡ７ ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質のＡＡＶ－送達を介した投与は、マルチドメイン治療用タンパク質を内包する遺伝子療法ベクターの投与後の患者の血清中のＧＡＡの長期安定性をもたらす。一実施形態では、レシピエント患者の血清中のＧＡＡのレベルは、マルチドメイン治療用タンパク質を内包する遺伝子療法ベクターの投与後の１ヶ月後、３ヶ月、４ヶ月後、５か月後、または６か月後、送達ドメインの連結のないＧＡＡを受けた患者の血清レベルよりも、≧１．５倍から１００倍、≧１．５倍から１０倍、≧２．５倍、２．５倍～３倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い。

【0164】

一実施形態では、抗ＣＤ６３ ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質または抗ＩＴＧＡ７ ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質のＡＡＶ送達を介した投与は、ポンペ病患者における貯蔵グリコーゲンレベルの長期にわたる安定な低減をもたらす。一実施形態では、患者の心臓、骨格筋、および肝臓の組織におけるグリコーゲンレベルは、野生型（非疾患）レベルに低減される。一実施形態では、患者の心臓、骨格筋、および肝臓の組織におけるグリコーゲンレベルは、マルチドメイン治療用タンパク質を内包する遺伝子療法ベクターの投与後、１ヵ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヵ月、野生型レベルで維持される。

【0165】

一実施形態では、抗ＣＤ６３ ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質または抗ＩＴＧＡ７ ｓｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質のＡＡＶ送達を介した投与は、ポンペ病患者における筋力の長期にわたる回復をもたらす。一実施形態では、握力強度によって測定される患者の強度は、マルチドメイン治療用タンパク質を内包する遺伝子療法ベクターの投与後、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヵ月、正常（すなわち疾患のない正常なレベル）に復元される。

【0166】

別の態様では、本発明は、酵素活性と抗原結合タンパク質とを含む組成物を提供し、その場合、酵素は、酵素欠損症（ＬＳＤ）と内部移行エフェクター結合タンパク質とに関連する。リソソーム蓄積症に関連する酵素（それ自体触媒性ではないタンパク質を含む）には、例えば、あらゆる加水分解酵素、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、サポシン－Ｃ活性化因子、セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ、ＧＭ２活性化因子、ＧＭ３シンターゼ、アリールスルファターゼ、スフィンゴ脂質活性化因子、α－イズロニダーゼ、イズロニダーゼ－２－スルファターゼ、ヘパリンＮ－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－α－グルコサミニダーゼ、α－グルコサミドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼ、およびヒアルロニダーゼなどが含まれる。

【0167】

内部移行エフェクター結合タンパク質には、例えば、受容体融合分子、トラップ分子、受容体Ｆｃ融合分子、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ｄＡｂ断片、単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＣＤＲ３ペプチド、拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチド、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ、一価ナノボディ、二価ナノボディ、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ：ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ラクダ抗体（ＶＨＨ重鎖ホモ二量体抗体）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、および他の抗原結合タンパク質などが含まれる。

【0168】

内部移行エフェクターとしては、例えば、ＣＤ６３、ＭＨＣ－Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ－１、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ（プロラクチン受容体）、ＭＡＬ（ミエリンおよびリンパ球タンパク質、別名ＶＩＰ１７）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体、ＳＣＡＲＡ１－５、ＳＣＡＲＢ１－３、およびＣＤ３６が挙げられる。ある実施形態では、内部移行エフェクターは、腎臓特異的インターナライザーであり、例えば、ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ－１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ－１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）などである。他のある特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、筋特異的インターナライザーであり、例えば、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）などである。いくつかの特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、またはＰＲＬＲである。

【0169】

いくつかの実施形態では、酵素は、抗原結合タンパク質に共有結合で連結されている（すなわち、電子が原子間で共有されている）。特定の一実施形態では、内部移行エフェクター結合タンパク質は、半抗体からなるかまたはそれを含有し、酵素は、Ｆｃ融合ドメインに（例えば、Ｃ末端で）融合されている。そして、酵素に共有結合で連結されているＦｃドメインは、抗原結合タンパク質のＦｃドメインと会合し、その結果その会合は、一つまたは複数のジスルフィド架橋を含有する。この特定の実施形態を図１ＡのパネルＢに概略的に図示する。

【0170】

特定の別の実施形態では、内部移行エフェクター結合タンパク質（送達ドメイン）は、抗体または抗体断片からなるかまたはそれを含有し、酵素は、抗体または抗体断片に共有結合で連結されている。特定の実施形態では、送達ドメインは抗体であり、酵素は、抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端に（ペプチド結合を介して直接的にまたはリンカーを介して間接的に）共有結合で連結されている（それぞれ図１ＡのパネルＣまたはパネルＥ）。特定の別の実施形態では、送達ドメインは抗体であり、酵素は、抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端に（ペプチド結合を介して直接的にまたはリンカーを介して間接的に）共有結合で連結されている（それぞれ図１ＡのパネルＤまたはパネルＦ）。

【0171】

いくつかの実施形態では、酵素と送達ドメインとは共有結合で連結されていないが、混合物中に組み合わされている。送達ドメインと酵素とは、非共有結合力により会合して複合体を形成することができる。例えば、特定の一実施形態では、送達ドメインは二重特異性抗体であり、その抗体の一方のアームが内部移行エフェクターを結合し、他方のアームが酵素を結合する。この実施形態を図１ＡのパネルＡに概略的に図示する。

【0172】

いくつかの実施形態では、酵素は、ＧＡＡであるか、またはＧＡＡ活性（例えば、ＧＡＡ活性を有するアイソザイム）を含み、内部移行エフェクターは、ＩＴＧＡ７、ＣＤＨ１５、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２またはＰＲＬＲである。特定の実施形態では、酵素は、ＧＡＡであるか、またはＧＡＡ活性を含み、内部移行ドメインは、ＣＤ６３であり、送達ドメインは、ＣＤ６３およびＧＡＡに対する特異性を有する二重特異性抗体である。特定の実施形態では、酵素はＧＡＡであるか、またはＧＡＡ活性を含み、内部移行ドメインは、ＩＴＧＡ７であり、送達ドメインは、ＩＴＧＡ７およびＧＡＡに対する特異性を有する二重特異性抗体である。

【0173】

いくつかの実施形態では、酵素は、ＧＬＡであるか、またはＧＬＡ活性（例えば、ＧＡＡ活性を有するアイソザイム）を含み、内部移行エフェクターは、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＰＬＰ２、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、またはＰＲＬＲである。特定の実施形態では、酵素は、ＧＬＡであるか、またはＧＬＡ活性を含み、内部移行ドメインは、ＣＤ６３であり、送達ドメインは、ＣＤ６３およびＧＬＡに対する特異性を有する二重特異性抗体である。特定の実施形態では、酵素は、ＧＬＡであるか、またはＧＬＡ活性を含み、内部移行ドメインは、ＩＴＧＡ７であり、送達ドメインは、ＩＴＧＡ７およびＧＬＡに対する特異性を有する二重特異性抗体である。

【0174】

医薬組成物およびその投与
医薬製剤は、医薬的に許容可能な賦形剤を追加的に含んでいてもよく、そのようなものとしては、本明細書で使用される場合、所望の特定の剤形に適するような溶媒、分散媒体、希釈剤、またはその他の液体媒体、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などのうちいずれかまたは全てが挙げられる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１．ｓｕｐ．ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．，２００６；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤とその調製のための公知技術とを開示している。任意の従来の賦形媒体が、例えば、医薬組成物の任意の他の構成成分との有害な様式で任意の望ましくない生物学的効果を生じるかまたはその他相互作用することにより、物質またはその誘導体に不適合である場合を除いて、その使用は本発明の範囲内にあることが考慮されている。

【0175】

いくつかの実施形態では、医薬的に許容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒトでの使用および獣医学的使用のために承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は医薬グレードである。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たしている。

【0176】

医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容可能な賦形剤としては、以下に限定されないが、不活性希釈剤、分散剤および／もしくは造粒剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、潤滑剤、ならびに／または油が挙げられる。そのような賦形剤は、任意選択的に医薬組成物中に含まれてもよい。

【0177】

例示的な希釈剤としては、以下に限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖など、および／またはそれらの組合せが挙げられる。

【0178】

例示的な造粒剤および／または分散剤としは、以下に限定されないが、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩類、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニルピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、四級アンモニウム化合物など、ならびに／またはそれらの組合せが挙げられる。

【0179】

代表的な界面活性剤および／または乳化剤としては、以下に限定されないが、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標）［ケイ酸マグネシウムアルミウニム］）、長鎖状アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、グリセリルモノステアレート、およびプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース系誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンポリオキシエチレンモノステアレート［ミルジ（ＭＹＲＪ）（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン水素添加ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、およびソルトール（ＳＯＬＵＴＯＬ）（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、クレモフォア（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ブリジ（ＢＲＩＪ）（登録商標）３０］）、ポリ（ビニルピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、プルロニック（ＰＬＵＯＲＩＮＣ）（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー（ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ）（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクセートナトリウムなど、ならびに／またはそれらの組合せを含む。

【0180】

例示的な結合剤としては、以下に限定されないが、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプン糊）；ゼラチン；糖類（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然および合成のガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、トチャカ抽出物、パンワール（ｐａｎｗａｒ）ガム、ガティガム、イサポール（ｉｓａｐｏｌ）皮粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、セルロースアセテート、ポリ（ビニルピロリドン）、ケイ酸マグネシウムアルミウニム（ビーガム（Ｖｅｅｇｕｍ）（登録商標））、およびカラマツアラボガラクタン）；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート類；ワックス類；水；アルコール、などならびにそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。

【0181】

例示的な防腐剤としては、以下に限定されないが、抗酸化剤、キレート剤、抗菌保存剤、抗真菌保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、および／または他の保存剤が挙げられる。例示的な酸化防止剤としては、以下に限定されないが、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、ピロ亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、および／または硫酸ナトリウムが挙げられる。例示的なキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。例示的な抗菌保存剤としては、以下に限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミドウレア、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが挙げられる。例示的な抗真菌保存剤としては、以下に限定されないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が挙げられる。例示的なアルコール保存剤としては、以下に限定されないが、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、および／またはフェニルエチルアルコールが挙げられる。例示的な酸性保存剤としては、以下に限定されないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ－カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が挙げられる。他の保存剤としては、以下に限定されないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ）メシレート、セトリミド、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン化（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、ピロ亜硫酸カリウム、グライダント（ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ）（登録商標）、フェノニップ（ＰＨＥＮＯＮＩＰ）（登録商標）、メチルパラベン、ジェルマール（ＧＥＲＭＡＬＬ）（登録商標）１１５、ゲルマベン（ＧＥＲＭＡＢＥＮ）（登録商標）ＩＩ、ネオロン（ＮＥＯＬＯＮＥ）（商標）、ケーソン（ＫＡＴＨＯＮ）（商標）、および／またはオイクシール（ＥＵＸＹＬ）（登録商標）が挙げられる。

【0182】

例示的な緩衝剤としては、以下に限定されないが、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェン不含水、等張生理食塩水、リンゲル溶液、エチルアルコールなど、および／またはそれらの組合せが挙げられる。

【0183】

例示的な滑沢剤としては、以下に限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水素添加植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびそれらの組合せが挙げられる。

【0184】

代表的な油としては、以下に限定されないが、アーモンド油、キョウニン油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、クロフサスグリ油、ルリジサ油、カデ油、カモミール油、カノーラ油、キャラウェー油、カルナウバ油、ヒマシ油、シナモン油、ココアバター油、ヤシ油、タラ肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、マツヨイグサ油、魚油、アマニ油、ゲラニオール油、ヒョウタン油、ブドウ種子油、ハシバミ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ油、ククイナッツ油、ラバンジン油、ラベンダー油、レモン油、アオモジ油、マカダミアナッツ油、ゼニアオイ油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、トウニン油、ラッカセイ油、ケシの実油、カボチャ種子油、ナタネ油、コメヌカ油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サスクアナ（ｓａｓｑｕａｎａ）油、セイボリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター、シリコーン、ダイズ油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチベルソウ油、クルミ油、およびコムギ胚芽油が挙げられる。例示的な油としては、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはそれらの組合せが挙げられる。

【0185】

賦形剤、例えばココアバターおよび座薬ろう、着色剤、被覆剤、甘味剤、香味剤、および／または芳香剤などは、調合者の判断に従って組成物中に存在し得る。

【0186】

送達

【0187】

本開示は、可能性のある薬物送達の科学の進歩を考慮した任意の適切な経路による遺伝子療法ベクター（例えばポリヌクレオチド）の送達を包含する。送達は、裸であるかまたは製剤化されうる。

【0188】

裸の送達

【0189】

本発明のポリヌクレオチドは、裸で細胞に送達されうる。本明細書で使用される場合、「裸の」とは、トランスフェクションを促進する薬剤を含まないポリヌクレオチドを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチドは、修飾を含有していなくてもよい。裸のポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知でありかつ本明細書に記載される投与経路を用いて、細胞に送達されてもよい。

【0190】

製剤化による送達

【0191】

ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法を使用して製剤化されうる。製剤は、ポリヌクレオチドを含有していてもよく、以下に限定されないが、細胞浸透剤、医薬的に許容可能な担体、送達剤、生体分解可能なまたは生体適合性のポリマー、溶媒、および徐放性送達デポをさらに含んでいてもよい。製剤化されたポリヌクレオチドｍＲＮＡは、当技術分野で公知でありかつ本明細書に記載される投与経路を用いて、細胞に送達されうる。

【0192】

投与

【0193】

本発明のポリヌクレオチドは、治療上有効なアウトカムを結果としてもたらす任意の経路によって投与されうる。これらには、以下に限定されないが、経腸、経消化器、硬膜外、経口、経皮、硬膜外（硬膜周囲）、脳内（大脳の中に）、脳室内（脳室の中に）、皮膚上（皮膚の上に適用）、皮内、（皮膚自体の中に）、皮下（皮膚の下に）、鼻投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈の中に）、動脈内（動脈の中に）、筋肉内（筋肉の中に）、心臓内（心臓の中に）、骨内注入（骨髄の中に）、くも膜下腔内（脊柱管の中に）、腹腔内、（腹膜の中への注入および注射）、膀胱内注入、硝子体内、（眼を通じて）、空洞内注射、（陰茎の基部の中に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のための無傷の皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、ガス注入（吸引）、舌下、唇下、注腸、点眼（結膜の上に）、または点耳が含まれる。特定の実施形態では、組成物は、血液脳関門、血管障壁、または他の上皮障壁を横断することを可能になるような方法で、投与されうる。本発明のポリヌクレオチド、主要構築物、またはｍＲＮＡについての非限定的な投与経路を下記に記載する。

【0194】

非経口投与および注射投与

【0195】

非経口投与のための液体剤形としては、以下に限定されないが、医薬的に許容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、本技術分野でよく使用される不活性希釈剤を含んでいてもよく、そのようなものとしては、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（具体的には綿実油、地下結実油，トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール類、およびソルビタンの脂肪酸エステル類、ならびにそれらの混合物などがある。不活性希釈剤に加えて、口腔組成物は、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤、甘味剤、香味剤、および／または芳香剤などを含みうる。非経口投与のためのある実施形態では、組成物は、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。

【0196】

注射用調製物、例えば、滅菌された注射用の水性または油脂性の懸濁液は、適した分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤を用いて公知の技術に従って製剤化されることがある。滅菌された注射用調製物は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤および／または溶媒での滅菌された注射用溶液、懸濁液、および／またはエマルジョン、例えば１，３－ブタンジオールの溶液などでありうる。採用され得る許容可能な媒体および溶媒には、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。滅菌された固定油は、従来溶媒または懸濁媒体として採用されている。この目的のために、任意のブランドの固定油を合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含めて採用することができる。オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に使用できる。

【0197】

注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、および／または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌された注射用の媒体中に溶解または分散できる滅菌された固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。

【0198】

活性成分の効果を延長するために、多くの場合、皮下注射または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅くすることが望ましい。これは、水溶性に乏しい結晶性または非晶質の材料の液体懸濁液を使用することによって達成されうる。その後、薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し、溶解速度は、ひいては結晶サイズおよび結晶形態に依存しうる。あるいは、非経口的に投与される薬剤形態の遅延吸収は、油媒体中に薬剤を溶解または懸濁することによって達成される。注射用のデポ形態は、ポリ乳酸－ポリグリコール酸などの生分解性ポリマー中に薬剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬剤とポリマーとの比率および採用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポ注射用製剤は、体組織に適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬剤を入れることによって調製される。

【0199】

デポ投与

【0200】

本明細書で記載したように、いくつかの実施形態では、組成物は、持続放出のためにデポに製剤化される。一般に、特定の器官または組織（「標的組織」）が、投与のための標的とされる。

【0201】

本発明のいくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、標的組織内または標的組織の近位に空間的に保持される。提供されるのは、組成物が、具体的には組成物の核酸構成成分が、実質的に標的細胞に保持されるような条件下で、すなわち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９％以上の組成物が標的細胞中に保持されることを意味する条件下で、標的組織（一つまたは複数の標的細胞を含有する）を組成物に接触させることによって、哺乳類対象の標的組織に組成物を提供する方法である。有利なことに、保持は、一つまたは複数の標的細胞に入る組成物中に存在する核酸の量を測定することによって決定される。例えば、対象に投与された核酸の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９％以上が、投与後のある期間にわたって細胞内に存在する。例えば、哺乳類対象への筋肉内注射は、ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを含有する水性組成物を使用して実施され、組成物の保持は、筋細胞に存在するリボ核酸の量を測定することによって決定される。

【0202】

本発明の態様は、組成物が標的組織に実質的に保持されるような条件下で、（一つまたは複数の標的細胞を含有する）標的組織を組成物と接触させることによって、哺乳類対象の標的組織に組成物を提供する方法を対象とする。組成物は、目的のポリペプチドが少なくとも一つの標的細胞で産生されるように、有効量のポリヌクレオチドを含有する。組成物は、一般に、「裸の」核酸（細胞浸透剤や他の剤を含まない核酸など）も意図されるとはいえ、細胞浸透剤と、医薬的に許容可能な担体とを含有する。

【0203】

いくつかの状況では、組織内の細胞によって産生されるタンパク質の量は、望ましくは増加する。好ましくは、タンパク質産生のこの増加は、標的組織内の細胞へと空間的に制限される。したがって、提供されるのは、哺乳類対象の組織における目的のタンパク質の産生を増加させる方法である。組成物の単位量が、所定の体積の標的組織内に含有される実質的なパーセンテージの細胞で目的のポリペプチドを生産するように決定されていることを特徴とする、ポリヌクレオチドを含有する組成物が提供される。

【0204】

いくつかの実施形態では、組成物は、複数の異なるポリヌクレオチドを含み、ここでは、ポリヌクレオチドのうち一つまたは複数が、目的のポリペプチドをコードする。任意選択的に、組成物は、組成物の細胞内送達を支援するための細胞浸透剤も含有する。（一般に、所定の体積に隣接する組織で、または標的組織から遠位で、目的のポリペプチドの著しい産生を誘導することなく）所定の体積の標的組織内に含有される実質的なパーセンテージの細胞で目的のポリペプチドを産生するのに必要な組成物の用量について、決定がなされる。この決定に続いて、決定された用量が、哺乳類対象の組織中に直接的に導入される。

【0205】

一実施形態では、本発明は、二回以上の注射で、または分割用量注射によって、送達されるポリヌクレオチドを提供する。

【0206】

一実施形態では、本発明は、小さな使い捨ての薬物リーザバー、パッチポンプ、または浸透圧ポンプを使用して、標的組織の近くに保持されてもよい。パッチポンプの非限定的な例としては、ＢＤ（登録商標）（フランクリンレイクス、ニュージャージー州）、Ｉｎｓｕｌｅｔ社（ベッドフォード、カリフォルニア州）、ＳｔｅａｄｙＭｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（サンフランシスコ、カリフォルニア）、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ（ミネアポリス、ミネソタ州）（例えばＭｉｎｉＭｅｄ）、Ｕｎｉｌｉｆｅ（ヨーク、ペンシルベニア州）、およびＳｐｒｉｎｇＬｅａｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ボストン、マサチューセッツ州）によって製造および／または販売されるものが挙げられる。浸透圧ポンプの非限定的な例としては、ＤＵＲＥＣＴ（登録商標）（クパチーノ、カリフォルニア州）（例えば、ＤＵＲＯＳ（登録商標）およびＡＬＺＥＴ（登録商標））によって製造されるものが挙げられる。

【0207】

用量投与

【0208】

本発明は、マルチドメイン治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを投与すること、および任意選択的に、続いて、それを必要とする対象にマルチドメイン治療ポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、マルチドメイン治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを、それを必要とする患者に治療有効量で投与することを含み、その場合、治療有効量は、以降のマルチドメイン治療用ポリペプチドの投与を不要とするのに十分である。したがって、いくつかの実施形態では、酵素を欠きそれを必要とする患者を治療する方法、例えばポンペ病の患者でグリコーゲンレベルを低減するおよび／またはＧＡＡに対するＣＲＩＭを低減する方法は、補充酵素、例えば抗ＣＤ６３ ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ融合タンパク質、例えば配列番号１１として記載された配列を含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを、治療有効量で患者に投与することを含み、その場合、治療有効量は、以降の患者への補充酵素、例えばＧＡＡまたはその誘導体の投与の必要性を、打ち消すものとなる。いくつかの実施形態では、酵素を欠きそれを必要とする患者を治療する方法、例えばポンペ病の患者でグリコーゲンレベルを低減するおよび／またはＧＡＡに対するＣＲＩＭを低減する方法は、補充酵素、例えば抗ＣＤ６３ ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ融合タンパク質、例えば配列番号１１として記載された配列を含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを、治療有効量で患者に投与することを含み、治療有効量の補充酵素を患者に投与することをさらに含む。核酸、タンパク質もしくは複合体、またはその医薬組成物、イメージング組成物、診断組成物、もしくは予防組成物は、疾患、障害、および／または状態（例えば、作業記憶の欠如に関連する疾患、障害、および／または状態）を予防、治療、診断、またはイメージングするために有効な任意の量および投与経路を使用して、対象に投与されうる。

【0209】

必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、具体的な組成、その投与様式、その活性の様式等に応じて、対象間で異なるものとなる。

【0210】

望ましい効果または「治療効果」（例えば、補充酵素の特定の血清濃度）を達成するために必要なＡＡＶウイルスベクターの用量、例えば、体重１キログラム当たりのベクターゲノムの用量の単位（ｖｇ／ｋｇ）は、ＡＡＶ投与の経路、治療効果を達成するために必要な発現レベル、治療される特定の疾患または障害、およびマルチドメイン治療用タンパク質の発現の安定性を含むがこれに限定されない、いくつかの要因に基づいて変化する。当業者であれば、前述の要因、ならびに当技術分野で周知の他の要因に基づいて、特定の疾患または障害を有する対象を治療するためのＡＡＶビリオン用量範囲を容易に決定できる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＣＤＥＲ“Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，”Ｊｕｌｙ ２００５を参照のこと。ＡＡＶ の有効量は、一般に、対象当たり約１０^９～１０^１６のゲノムコピーを含有する、約１０μｌ～約１００ｍｌの溶液の範囲である。他の容量の溶液を使用してもよい。使用される容量は、典型的には、特に、対象のサイズ、ＡＡＶの用量、および投与経路に依存する。いくつかの実施形態では、対象当たり約１０^１０～１０^１２のＡＡＶウイルスゲノムの用量が適切である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、対象当たり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５のゲノムコピーの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、１ｋｇ当たり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、または１０^１４のウイルスゲノムの用量で投与される。いくつかの実施形態では、１キログラム当たり少なくとも２×１０^１２のウイルスゲノムが投与される。いくつかの実施形態では、投与量は、閾値マルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、閾値治療用タンパク質レベルは、少なくとも１μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、投与量は、２μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、３μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、４μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、５μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、６μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、７μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、８μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、９μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、１０μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、１１μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、１２μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、１３μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、１４μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。いくつかの実施形態では、投与量は、１５μｇ／ｍＬを超えるマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する。

【0211】

本発明による組成物は、典型的には、投与を容易にし、投薬量を均一にするために、単位剤形で製剤化される。しかし、本発明の組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されうることが理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療的に有効な、予防的に有効な、または適切なイメージングの用量レベルは、種々の要因に依存するものとなるが、そのような要因としては、治療される障害および障害の重症度；採用される具体的な化合物の活性；採用される具体的な化合物；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食事；採用される具体的な化合物の投与時間、投与経路、および排泄速度；治療期間；採用される具体的な化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬剤；および医学分野で周知の類似の要因が挙げられる。

【0212】

非限定的および例示的な実施形態を以下に記載する。
実施形態１
中枢神経系（ＣＮＳ）に治療有効量のマルチドメイン治療用タンパク質を提供するのに十分な肝臓標的送達方法を介して、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするヌクレオチド組成物を対象に投与することを含み、マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメインおよび酵素ドメインを含む、治療用タンパク質を対象のＣＮＳ中に送達する方法。
実施形態２
送達ドメインが、内部移行エフェクターに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１に記載の方法。
実施形態３
治療用タンパク質がリソソーム酵素である、実施形態１または実施形態２に記載の方法。
実施形態４
リソソーム酵素がＧＡＡである、実施形態３に記載の方法。
実施形態５
ヌクレオチド組成物が、ウイルスベクターを介して投与され、随意にヌクレオチド組成物が、１キログラム当たり少なくとも２×１０^１２のウイルスゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与される、実施形態１～４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６
ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、実施形態５に記載の方法。
実施形態７
内部移行エフェクターが、ＣＮＳ中の細胞、上皮細胞、および血液脳関門を通過する細胞からなる群から選択される細胞の表面上で発現する、実施形態１～６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態８
送達ドメインが、
（ｉ）ＣＤ６３、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＭＨＣ－Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ－１、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、およびＣＤ３６からなる群から選択され、
（ｉｉ）ＣＤ６３、ＭＨＣ－Ｉ、液胞型Ｈ＋ ＡＴＰアーゼ、ＩＧＦ２Ｒ、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ、ＭＡＬ（ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ジフテリア毒素受容体、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合 ＥＧＦ様成長因子）、グルタチオン受容体、グルタミン酸受容体、レプチン受容体、および葉酸受容体からなる群から任意に選択される、いくつかの組織タイプで発現し、
任意に対象は、ファブリー病、ゴーシェ病、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＩＩＤ、ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＸ、ポンペ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、およびＣ２型、αマンノース症、ノイラミニダーゼ欠損症、シアリドーシス、アスパルチルグリコサミン尿症、混合性サポシン欠損症、異型ゴーシェ病、ファーバー脂肪性肉芽腫症、フコシドーシス、およびβマンノース症からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示し、
（ｉｉｉ）コラーゲンＸ、インテグリンアルファ１０（ＩＴＧＡ１０）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、線維芽細胞成長因子受容体アイソフォームＣ（ＦＧＦＲ３Ｃ）、ヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＣＲＴＬ１）、アグリカン、コラーゲンＩＩ、およびＫｒｅｍｅｎ－１からなる群から任意に選択される、骨および／または軟骨によって優先的に発現され、
任意に対象は、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＩＩＤ、ＭＰＳ ＩＶＡ、ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＸ、βマンノース症、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、混合性サポシン欠損症、アスパルチルグリコサミン尿症、ファーバー脂肪性肉芽腫症、シアリドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、およびαマンノース症からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示し、
（ｉｖ）スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、ＣＤ３６、ＭＳＲ１（マクロファージスカベンジャー受容体１）、ＭＲＣ１（マクロファージマンノース受容体１）、ＶＳＩＧ４（Ｖセットおよびイムノグロブリンドメイン含有タンパク質４）、ＣＤ６８（マクロシアリン）、およびＣＳＦ１Ｒ（マクロファージコロニー刺激因子１受容体）からなる群から任意に選択される、単球、マクロファージ、またはマイクログリアによって優先的に発現され、
任意に対象は、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、混合性サポシン欠損症、およびファーバー脂肪性肉芽腫症からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示し、
（ｖ）ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ－１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ－１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）からなる群から任意に選択される、腎細胞によって優先的に発現され、
任意に対象は、ファブリー病、アルポート症候群、多発性嚢胞腎疾患、および血栓性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示すか、またはそのように診断され、
（ｖｉ）任意にＡＳＧＲ１またはＡＳＧＲ２など、肝細胞によって優先的に発現され、
任意に対象は、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、ゴーシェ病、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＩ、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、およびＣ２型、シアリドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、異型ゴーシェ病、混合性サポシン欠損症、ファーバー脂肪性肉芽腫症からなる群から選択される、疾患の一つまたは複数の症状を示すか、またはそのように診断され、
（ｖｉｉ）ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）からなる群から任意に選択される、筋肉細胞によって優先的に発現され、
任意に対象は、ポンペ病の一つまたは複数の症状を示すか、またはそれと診断され、
（ｖｉｉｉ）ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＬＰＬ２、ＭＳＲ１、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、またはＰＲＬＲからなる群から選択され、または
（ｉｘ）ＣＤ６３である、内部移行エフェクターに結合する、実施形態１～７のうちいずれか一つに記載の方法。
実施形態９
送達ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態１～８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１０
細胞表面受容体（ＣＳＲ）結合タンパク質（ＣＳＲ－ＢＰ）は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態１～９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１１
治療用タンパク質がヒドロラーゼを含む、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１２
治療用タンパク質がグリコシラーゼを含む、実施形態１～１１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１３
治療用タンパク質がグリコシダーゼを含む、実施形態１～１２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１４
治療用タンパク質がアルファ－グルコシダーゼを含む、実施形態１～１３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１５
治療用タンパク質は、配列番号１または配列番号１３のアミノ酸配列、またはその断片を含む、実施形態１～１４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１６
治療用タンパク質が、抗ＡＢｅｔａ、または抗タウ抗体を含む、実施形態１～１５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１７
ポリヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列を含む、実施形態１～１６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１８
酵素ドメインは、アルファ－グルコシダーゼを含み、対象の任意のＣＮＳ組織中のグリコーゲンレベルは、処置後少なくとも九か月間、低下する、実施形態１～１７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１９
対象がポンペ病を有する、実施形態１～１８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２０
投与されたヌクレオチド組成物が、少なくとも１μｇ／ｍＬのマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２１
一つまたは複数の送達ドメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質であって、一つまたは複数の送達ドメインが、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に結合する、マルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態２２
内部移行エフェクターに結合する第二の送達ドメインをさらに含む、実施形態２１に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態２３
第二の送達ドメインが、
（ｉ）ＣＤ６３、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＭＨＣ－Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ－１、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、およびＣＤ３６からなる群から選択される内部移行エフェクター、
（ｉｉ）ＣＤ６３、ＭＨＣ－Ｉ、液胞型Ｈ＋ ＡＴＰアーゼ、ＩＧＦ２Ｒ、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ、ＭＡＬ（ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ジフテリア毒素受容体、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子）、グルタチオン受容体、グルタミン酸受容体、レプチン受容体、および葉酸受容体からなる群から任意に選択される、いくつかの組織タイプで発現する内部移行エフェクター、
（ｉｉｉ）コラーゲンＸ、インテグリンアルファ１０（ＩＴＧＡ１０）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、線維芽細胞成長因子受容体アイソフォームＣ（ＦＧＦＲ３Ｃ）、ヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＣＲＴＬ１）、アグリカン、コラーゲンＩＩ、およびＫｒｅｍｅｎ－１からなる群から任意に選択される、骨および／または軟骨によって優先的に発現される内部移行エフェクター、
（ｉｖ）スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、ＣＤ３６、ＭＳＲ１（マクロファージスカベンジャー受容体１）、ＭＲＣ１（マクロファージマンノース受容体１）、ＶＳＩＧ４（Ｖセットおよびイムノグロブリンドメイン含有タンパク質４）、ＣＤ６８（マクロシアリン）、およびＣＳＦ１Ｒ（マクロファージコロニー刺激因子１受容体）からなる群から任意に選択される、単球、マクロファージ、またはマイクログリアによって優先的に発現される内部移行エフェクター、
（ｖ）ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ－１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ－１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）からなる群から任意に選択される、腎細胞によって優先的に発現される内部移行エフェクターであって、他のある特定の実施形態では、筋特異的インターナライザーであり、例えば、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）などである、内部移行エフェクター、
（ｖｉ）任意にＡＳＧＲ１またはＡＳＧＲ２など、肝細胞によって優先的に発現される内部移行エフェクター、
（ｖｉｉ）ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）からなる群から任意に選択される、筋肉細胞によって優先的に発現される内部移行エフェクター、または
（ｖｉｉｉ）ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＬＰＬ２、ＭＳＲ１、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、またはＰＲＬＲからなる群から選択される内部移行エフェクタータンパク質に結合する、実施形態２２に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態２４
第二の送達ドメインが内部移行エフェクターＣＤ６３に結合する、実施形態２１～２３のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態２５
一つまたは複数の送達ドメインのうち少なくとも一つが、抗原結合タンパク質を含む、実施形態２１～２４のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態２６
一つまたは複数の送達ドメインのうちのそれぞれが、抗原結合タンパク質を含む、実施形態２５に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態２７
一つまたは複数の送達ドメインのうち少なくとも一つが、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、実施形態２１～２６のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態２８
一つまたは複数の送達ドメインのうち少なくとも一つが、半抗体を含む、実施形態２１～２７のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態２９
ｈＴｆＲに結合する送達ドメインはｓｃＦｖであり、半抗体はＣＤ６３に結合し、酵素ドメインはＧＡＡであり、ＧＡＡはＣＤ６３に結合する半抗体のカルボキシ末端にコンジュゲートされる、実施形態２８に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態３０
一つまたは複数の送達ドメインのうちのそれぞれが、ｓｃＦｖを含む、実施形態２７に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態３１
少なくとも一つのｓｃＦｖがＦｃに融合されている、実施形態２７～３０のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態３２
Ｆｃが、野生型ヒトＩｇＧ４アイソタイプ、またはその誘導体を含む、実施形態３１に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態３３
ＧＡＡが、Ｆｃのカルボキシ末端にコンジュゲートされている、実施形態３１～３２のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態３４
抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖ、抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦｖを含む、実施形態３０に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態３５
抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖおよび抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦｖが、両方ともそのカルボキシ末端で、単一のＧＡＡ酵素に連結されている、実施形態３４に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態３６
送達ドメインが抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖであり、酵素ドメインがｓｃＦｖのＶＬドメインのカルボキシ末端に連結されている、実施形態２１～２７のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態３７
抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端に連結された第二の送達ドメインをさらに含む、実施形態３６に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態３８
第二の送達ドメインが、抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦＶである、実施形態３７に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態３９
酵素ドメインが、配列番号１として記載されるアミノ酸配列を含む、実施形態２１～３８のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態４０
実施形態２１～３９または実施形態５０～６４のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
実施形態４１
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含む、実施形態４０に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４２
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、ウイルス核酸配列は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列である、実施形態４０または実施形態４１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４３
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、ウイルス核酸配列が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列であり、ＡＡＶ核酸配列が、内部末端反復配列を含み、任意選択的に、肝特異的プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子を含む、実施形態４０～４２のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態４４
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、ウイルス核酸配列が、配列番号６、配列番号７、または両方と、任意選択的に、肝特異的プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子とを含む内部末端反復配列を含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列である、実施形態４０～４３のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態４５
配列番号８および／または配列番号９として記載される配列を含む組織特異的調節因子をさらに含む、実施形態４０～４４のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
実施形態４６
実施形態４０～４５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクター。
実施形態４７
遺伝子療法ベクターが、
任意選択的に天然ウイルス、工学的に操作されたウイルス、またはキメラウイルスである、ウイルスベクター、
実施形態２０～２５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む裸のポリヌクレオチド、
任意選択的に実施形態２０～２５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドおよび脂質を含む脂質ナノ粒子である、ポリヌクレオチド複合体、ならびに
それらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される、実施形態４６に記載の遺伝子療法ベクター。
実施形態４８
遺伝子療法ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、またはアデノ関連ウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである、実施形態４６または実施形態４７に記載の遺伝子療法ベクター。
実施形態４９
遺伝子療法ベクターが、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ２／８キメラおよび／または特定の組織、例えば肝臓またはニューロン組織に対してＡＡＶシュードタイプである、実施形態４７または実施形態４８に記載の遺伝子療法ベクター。
実施形態５０
少なくとも二つの送達ドメインおよび少なくとも一つの酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質であって、二つの送達ドメインの各々は、抗体、半抗体、およびｓｃＦｖからなる群から独立して選択され、少なくとも一つまたは複数の送達ドメインは、少なくとも一つの酵素ドメインに関連付けられ、好ましくは、一つまたは複数の送達ドメインが、少なくとも一つの酵素ドメインに共有結合されている、マルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態５１
二つ以下の送達ドメインを含む、実施形態５０に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態５２
送達ドメインのうちの一つのみが、少なくとも一つの酵素ドメインと関連付けられている、実施形態５０または実施形態５１に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態５３
少なくとも二つの送達ドメインのそれぞれが、酵素ドメインに共有結合している、実施形態５０～５２のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態５４
少なくとも二つの送達ドメインのそれぞれが、同じ酵素ドメインに共有結合している、実施形態５３に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態５５
少なくとも二つの送達ドメインのそれぞれが、異なる酵素ドメインに共有結合している、実施形態５３に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態５６
二つ以下の送達ドメインを含み、第一の送達ドメインは半抗体を含み、第二の送達ドメインはｓｃＦｖを含む、実施形態５０～５５のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態５７
ｓｃＦｖがＦｃに融合されている、実施形態５６に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態５８
半抗体が、そのカルボキシ末端で第一の酵素ドメインに共有結合され、および／またはｓｃＦｖは、そのカルボキシ末端でＦｃ、および任意で第二の酵素ドメインに共有結合される、実施形態５６または実施形態５７に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態５９
二つ以下の送達ドメインを含み、第一の送達ドメインおよび第二の送達ドメインはそれぞれｓｃＦｖを含む、実施形態５０～５５のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態６０
第一および第二のｓｃＦｖの両方が、酵素ドメインに共有結合している、実施形態５９に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態６１
Ｎ末端からＣ末端まで：第一のｓｃＦｖ、第二のｓｃＦｖ、および酵素ドメインを含む、実施形態５９に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態６２
少なくとも一つの送達ドメインがリソソーム輸送分子に結合し、少なくとも一つの送達ドメインがトランスサイトーシスエフェクターに結合する、実施形態５０～６１のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態６３
リソソーム輸送分子が、ＣＤ６３、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、またはＣＤ１５１からなる群から選択され、トランスサイトーシスエフェクターは、ＬＤＬ受容体、ＩｇＡ受容体、トランスフェリン受容体、新生児Ｆｃ受容体、インスリン受容体、ＣＤ９８、およびベイシジンからなる群から選択される、実施形態６２に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態６４
図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、または図１Ｆに示される構造を含む、実施形態５０～６３のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
実施形態６５
実施形態１～２０のいずれか一つに記載の方法における、実施形態２１～３９および５０～６４のいずれか一つに記載のマルチドメイン治療用タンパク質をコードするヌクレオチド、実施形態４０～４５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、または実施形態４６～４９のいずれか一つに記載の遺伝子療法ベクターの使用。

【0213】

下記の実施例は、本発明の方法をさらに説明するために提供されている。これらの実施例は、説明のためだけのものであり、本発明の範囲を何ら制限することを意図するものではない。

【実施例】

【0214】

実施例１：抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ：：ＧＡＡポリヌクレオチドおよび遺伝子療法ベクターの構築
ヒトＧＡＡ（ｈＧＡＡ；配列番号１；配列番号１２により表される核酸配列）またはヒトＧＡＡにそのＣ末端上で融合された抗ヒトＣＤ６３単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）（抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡ；配列番号１０；配列番号１１により表される核酸）の発現をコードするＡＡＶ２／８ウイルスを、標準的な三重トランスフェクションプロトコールを使用して生成した（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．２０１１；“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｕｓｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９），ｐｐ．４．１７．１－４．１７．２５，Ｖｏｌ １も参照）。生産のために、１×１０^７個のＨＥＫ２９３細胞を１５ｃｍプレート上に播いた。翌日、（Ａ）肝特異的セルピナ１エンハンサー（配列番号９）を含みＴＴＲ駆動性ヒトＧＡＡをコードする対照ｐＡＡＶベクターと、肝特異的なセルピナ１のエンハンサー（配列番号９）を含みＴＴＲ駆動ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡ（図１Ｂを参照）をコードする試験ｐＡＡＶとのいずれか８μｇ、および（Ｂ）ｐＡＡＶ ＲＣ２／８－由来ベクター（Ｇａｏ、２００２）と１６μｇのｐＨｅｌｐｅｒ（アジレント、カタログ番号２４００７４）とを用いて、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ニューヨーク、ニューヨーク州、カタログ番号１１５－１００）媒介性トランスフェクションを１：１の比（１ｕｌ ＰＥＩｐｒｏ：１μｇ ＤＮＡ）で用いて、トランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を採集し、標準的な凍結融解法を用いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液中で溶解した。次に、ベンゾナーゼ（シグマ、カタログ番号Ｅ１０１４－２５ＫＵ）を終濃度０．５Ｕ／μＬで試料に添加し、次いで、これを３７℃で６０分間インキュベーションした。次いで、ウイルスを、（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９９；６：９７３－９８５）に記載されるようにイオジキサノール勾配超遠心分離を用いて精製し、続いてｑＰＣＲによって滴定した。

【0215】

ＡＡＶ 試料を、ＤＮａｓｅＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ番号ＥＮ０５２５）を用いて３７℃で１時間処理し、ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔ Ａｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ番号４４０３３１９）をを使用して溶解した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３リアルタイム ＰＣＲ システム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用し、ＡＡＶ２ ＩＴＲに向けたプライマーを使用して、キャプシド形成されたウイルスゲノムを定量した。ＡＡＶ２ ＩＴＲのプライマーの配列は５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（フォワードＩＴＲ；配列番号３）および５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（リバースＩＴＲ；配列番号４）（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）であり、ＡＡＶの左側内部逆反復（ＩＴＲ）配列（配列番号６）およびＡＡＶの右内部逆反復（ＩＴＲ）配列（配列番号７）にそれぞれ由来する。ＡＡＶ２ ＩＴＲプローブの配列は、５’－６－ＦＡＭ－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－ＴＡＭＲＡ－３’（配列番号５）（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ Ｃ．，Ｈａａｓｅ Ｍ．，Ｍｕｅｔｈｅｒ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３，１８－２８）である。９５℃の活性化ステップで１０分間の後、２ステップＰＣＲサイクルを、９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間で４０サイクル行った。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号４３０４４３７）をｑＰＣＲで使用した。ＤＮＡプラスミド（アジレント、カタログ番号２４００７４）を標準として使用し、絶対力価を決定した。

【0216】

抗ヒトＣＤ６３抗体およびそれらの融合体には、Ｈ５Ｃ６マウス抗ヒトＣＤ６３可変ドメイン（配列番号１０のアミノ酸１～１１９はＨ５Ｃ６抗体の重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）のアミノ酸配列を提供し、配列番号１０のアミノ酸１３５～２４５は、Ｈ５Ｃ６抗体の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）のアミノ酸配列を提供する）を使用した。ここで使用された抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ（配列番号２）は、Ｈ５Ｃ６クローンに由来するが、このクローンは、マウス抗ｈＣＤ６３モノクローナルＩｇＧ１、カッパ軽鎖抗体である（Ｈ５Ｃ６は、Ａｕｇｕｓｔ，Ｊ．Ｔ．／ Ｈｉｌｄｒｅｔｈ，Ｊ．Ｅ．Ｋ．によってアイオワ大学の開発研究ハイブリドーマバンクに寄託された（ＤＳＨＢハイブリドーマ製品Ｈ５Ｃ６；ＤＳＨＢ カタログ番号ｈ５ｃ６、ＲＲＩＤ：ＡＢ ５２８１５８）。抗体のＳｃＦｖバージョンは、重－軽の順に可変ドメインを用いて、グリシン－セリンリンカーを間に配して（５’－ＶＨ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＶＬ－３’）クローニングした。

【0217】

実施例２：ＡＡＶ後のマウスポンペモデルのグリコーゲン含量
関連のグリコーゲン蓄積ｉｎ ｖｉｖｏ モデルにおける、ＡＡＶ により送達された抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ＧＡＡ融合体とＡＡＶにより送達されたＧＡＡとの効果の対比を決定するために、両方の療法をポンペ病マウスモデルに送達した。このマウスは、マウスＧＡＡ遺伝子の欠失についてホモ接合性であり、マウスＣＤ６３の代わりにヒトＣＤ６３の発現についてホモ接合性であり、系統の背景が７５％のＣ５７ＢＬ／６、２５％の １２９ＳｖＪであった。これらのマウスは本明細書では、ＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯマウスまたはＣＤ６３ｈｕ／ｈｕ；ＧＡＡ^－／－マウスと呼称される。

【0218】

実験では、ＴＴＲ肝特異的プロモーター駆動性のヒトＧＡＡ（ＡＡＶ－ｈＧＡＡ；実施例１に記載）またはＴＴＲ肝特異的プロモーター駆動性のＣ末端でヒトＧＡＡに融合された抗ヒトＣＤ６３ ＳｃＦｖ（ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡ；実施例１に記載）のどちらかをゲノムに含有するＡＡＶ２／８ウイルスを、尾静脈注射を介して、２ヶ月齢のＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯマウスに投与した。両方のＡＡＶ２／８ウイルスを、１ｅ１０ｖｇ／マウスまたは１ｅ１１ｖｇ／マウスの二つの用量のうちどちらか一つで送達した。対照として、未処置ＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯマウスと、マウスＧＡＡ遺伝子が無傷である未処置ＣＤ６３ ＨｕｍＩｎとを、アッセイに含めた。マウスを、処置後３ヵ月間収容し、この期間中にＧＡＡレベルおよび抗ＧＡＡ抗体の血清測定のため少しずつ（毎月）採血した。３ヶ月後、すべてのマウスを屠殺し、個々の組織をグリコーゲン測定、ＰＡＳ－Ｈ染色、中心核の定量化、リソソーム増殖の測定、およびＬＣ３ｂ発現の測定のため採取した。マウスの群についての実験用量および処理プロトコールを表３に示す。

【表3-1】

【表3-2】

【0219】

結果は図２にも図示されており、この図は、抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ＧＡＡが、ＧＡＡ単独とは異なり、骨格筋で野生型レベルまでグリコーゲンを低下させることを示している。二ドメイン型の抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ＧＡＡマルチドメイン治療用タンパク質を用いた処置の結果、単一ドメインのＧＡＡ補充酵素と比較して、貯蔵グリコーゲンの減少がはるかに大きくなった。個別のマウスについて三か月にわたる四頭筋のグリコーゲンレベル（図３）または心臓のグリコーゲンレベル（図４）をＧＡＡまたはｓｃｆｖ－ＧＡＡの総血清発現量に対してプロットすることによって、抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ融合タンパク質は、同様の血清レベルであってもＧＡＡ酵素単独より多くのグリコーゲンを除去することが観察された（図３および４）。

【0220】

実施例３：ＧＡＡに対する免疫応答
抗ヒトＧＡＡ抗体の血清レベルを測定するために、製造業者の仕様書に従い血清分離チューブ（ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号３６５９６７）を使用し、全ての処置群からの血清を、末期採血中に収集した血液から分離した。別途、９６ウェル高タンパク質結合プレート（サーモフィッシャー、カタログ番号１５０４１）を、ＰＢＳで希釈した２０μｇのｈＧＡＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号８３２９－ＧＨ－０２５）で一晩被覆した。プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ＰＢＳ－Ｔ）で３回洗浄した。プレートをＰＢＳ－Ｔ中０．５％ＢＳＡでブロッキングし、マウス血清の１：３００から１：５．１ｅ７に及ぶ希釈系列をプレートに一晩加えた。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチ、カタログ番号１１５－０３５－１６４）およびＢＤ Ｏｐｔ ＥＩＡ基質キットを使用して、総抗マウスＩｇＧ（サブクラス１＋２ａ＋２ｂ＋３）を測定した。１Ｎリン酸を使用して、比色反応を停止した。次いで、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３プレートリーダー（モレキュラーデバイス）にて４５０ｎｍで吸光度を読み取った。希釈曲線をシグモイド曲線にフィッティングさせ、この曲線から力価を計算した。総ＩｇＧ力価の平均＋／－標準偏差として表した力価を表４に示す。

【0221】

表４に示すように、処置を受けなかったマウスは、平均レベル１．１Ｅ＋０３の平均バックグラウンド力価を示した。ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡまたはＡＡＶ－ｈＧＡＡのどちらかの低用量のウイルス（１ｅ１０ ｖｇ／マウス）で処置されたマウスは、高い力価を示したが、高用量（１ｅ１１ ｖｇ／マウス）で処置したマウスでは、力価がそれよりも低かった。最高レベルの血清中ＧＡＡを有していた１ｅ１１ｖｇのＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡで処置したマウスは、未処置マウスの範囲内の力価を有していた。

【表4】

【0222】

ＡＡＶ投与後にＧＡＡまたは抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ＧＡＡのレベルが高いことは、抗ＧＡＡ力価がより低いことに対応する。高い力価または低い力価のＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ＧＡＡまたはＡＡＶ－ＧＡＡを処置したＧＡＡヌルマウスの血清を、注射後三ヵ月の期間にわたって抗ＧＡＡ抗体について評価した。図５は、血清中の抗ＧＡＡ抗体力価とＧＡＡ曝露との対比（すなわち、ＧＡＡまたはｓｃｆｖ－ＧＡＡの３ヵ月にわたる総血清中発現量）を個別のマウスについて図示する。この図は、ＧＡＡに対する抗体力価と血清曝露との間に負の相関があることを示し、この相関は、高いＧＡＡ曝露を伴うマウスがＧＡＡに寛容であったことを示す。同様に、図６は、ＧＡＡまたは抗ｈＣＤ６３ｓｃＦｖ：：ＧＡＡタンパク質をコードするＡＡＶを感染させた様々な群について、抗ＧＡＡ抗体力価をプロットしており、構築物の用量が高いほど抗ＧＡＡの力価が低かったことを示す。

【0223】

実施例４：血清ＧＡＡ
実験の期間にわたってヒトＧＡＡ血清レベルを測定するために、試料を尾部出血を介して毎月採集した。製造業者の仕様書に従い血清セパレータチューブ（ＢＤバイオサイエンス、カタログ番号３６５９６７）を使用して、血液から血清を分離した。次いで、１μＬの単離血清を４％～２０％のＮｏｖｅｘ ｗｅｄｇｅｗｅｌｌプレキャストゲルにロードし、２２０Ｖで４５分間泳動し、標準手順書を使用して２００ｍＡで１時間、ニトロセルロース膜に転写した。次いで、ニトロセルロース膜を、１：２０００希釈での使用による抗ＧＡＡ一次抗体（アブカム、番号ａｂ１３７０６８）、および１：１０００希釈での使用による抗ＧＡＰＤＨ抗体（アブカム、番号ＡＢ９４８４）を１２ｍＬ用いてプロービングし、４℃で一晩インキュベーションした。一次抗体によるインキュベーションの後、膜を一回洗浄当たり１ｘ ＴＢＳＴにより５分間で三回洗浄した。抗ウサギ ＩｇＧ（ＬｉＣｏｒ、９２６－３２２１１）二次抗体および抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＬｉＣｏｒ、９２５－６８０７０）（Ｌｉｃｏｒ、リンカーン、ネブラスカ州）の１：１５０００の希釈物１２ｍＬを、次いで膜に添加し、室温で１時間インキュベートした。二次抗体のインキュベーション後、膜を一回洗浄当たり１ｘ ＴＢＳＴにより５分間で二回、１×ＴＢＳにより５分間で一回、洗浄した。次いで、ＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ機器（ＬＩ－ＣＯＲ バイオテクノロジー）を使用して、膜をイメージングし定量した。任意単位で平均±標準偏差（ＳＤ）として表したＧＡＡの血清レベルを表５に示す。

【0224】

表５に示されるように、供試された高用量（１０^１１ｖｇ／マウス）の ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡまたはＡＡＶ－ｈＧＡＡで処置されたＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯマウスは、実験期間にわたって血清中のＧＡＡのレベルを保持し、ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡで処置されたマウスでは、ＡＡＶ－ｈＧＡＡで処置されたマウスよりもいくらか高いＧＡＡの血清レベルを有することが示された。低用量（１０^１０ｖｇ／マウス）のＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡまたはＡＡＶ－ｈＧＡＡのどちらかで治療されたマウスでは、ＧＡＡのレベルが実験期間にわたって低下し、一部のマウスでは、１２週間時点までに極めて僅かなレベルに達した。

【表5】

【0225】

ＧＡＡまたは抗ｈＣＤ６３ｓｃｆｖ：：ＧＡＡの発現は、高用量のＡＡＶ（１０^１１ｖｇ／マウス）を受けたマウスにおいて経時的に維持されたが、それより低い用量（１０^１０ｖｇ／マウス）を受けたマウスでは低下した。図７Ａは、ＧＡＡ、またはＧＡＡとの抗ｈＣＤ６３ｓｃｆｖ融合体をコードするＡＡＶを感染させた様々な群について、ウェスタンブロットによってプロービングされた際の、経時的なＧＡＡの血清レベルをプロットしたグラフを図示する。融合タンパク質（ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ）は、送達ドメインを含まないＧＡＡ酵素よりも一貫して高いレベル（例えば２．５～３倍）の血清ＧＡＡを示した（図７Ａ）。

【0226】

注射の３か月後の肝臓、心臓、および四頭筋における発現のリアルタイムＰＣＲによる定量を図７Ｂに示す。肝臓での発現は、全てのＡＡＶ構築物の注射について検出され、ＡＡＶ－ｈＧＡＡおよびＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３：：ｈＧＡＡの両方（どちらも肝特異的プロモーターであるＬＳＰによって駆動される）について、１ｅ１１ｖｇ／マウスの注射で最高レベルとなった。血清ＧＡＡレベルとＧＡＡのＲＮＡ発現レベルとの比較も行ったところ（図７Ｃ）、その結果では、融合タンパク質をコードするＡＡＶを受けたマウスが、３ヶ月では肝臓に限局して低いＧＡＡ ＲＮＡの発現を提示したものの、ＧＡＡの血清レベルは、その特定のマウスでは高かったことが示されている。ＡＡＶ－ＬＳＰ－ｈＧＡＡ注射は、肝臓内でＲＮＡレベルが低かった場合、高いＧＡＡの血清レベルを示さなかった。図７Ｃを参照されたい。このデータは、融合タンパク質をコードする（および発現が肝特異的プロモーターによって駆動される）ＡＡＶが、ＧＡＡの分泌プロファイルの改善を達成することを示唆する。

【0227】

Ｈｕｈ－７肝細胞では、抗体：：ｈＧＡＡ対ｈＧＡＡのみの分泌と細胞内との比率がより高いことも観察された。ある実験では、Ｈｕｈ－７ヒト肝細胞は、ｈＧＡＡ、抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ融合体、または非結合ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ融合体対照をコードする肝特異的プロモーター駆動型構築物を、一過的にトランスフェクションした。どちらのｓｃＦｖ：：ＧＡＡ融合構築物も、トランスフェクションの３日後、分泌上清中のタンパク質の比率がｈＧＡＡのみよりも高かった（統計的に有意なｐ＜０．０５、ｎ＝３）。ＣＩ－ＭＰＲ媒介性取り込みを軽減するために実験期間中に上清にＭ６Ｐを添加したことは、この比率に影響を及ぼさなかった。

【0228】

実施例５：グリコーゲンの組織測定および筋組織の組織学的特性評価
グリコーゲンの組織測定：個々の組織のグリコーゲン含量を測定するために、心臓、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、ヒラメ筋、およびＥＤＬの組織を、ＣＯ_２で窒息させた直後の全ての群由来のマウスから切り出し、次いで液体窒素中で急速凍結して、－８０℃で保存した。グリコーゲン測定のために、各組織約５０ｍｇを、ステンレス鋼ビーズにより蒸留水中１ｍｇ対２５μＬの水の比率で、ベンチトップ用ホモジナイザーで溶解した。グリコーゲン分析溶解物を１０５°で１５分間加熱し、２１０００×ｇで遠心分離して破片を除去した。グリコーゲン測定は、蛍光アッセイについての製造業者の指示書に従い、グリコーゲンアッセイキット（シグマアルドリッチ、番号ＭＡＫ０１６）を使用して実施した。各試料の蛍光を、５３５ｎｍの励起および５８７ｎｍの発光で、蛍光プレートリーダー（モレキュラーデバイス、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３）にて測定した。グリコーゲンの計算量は、製造業者により提供された以下の式を用いて計算した。次いで、各治療群の各組織由来のグリコーゲンの計算量の平均を取ったので、表６に平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。

【0229】

表６に示されるように、ＧＡＡ ＷＴマウスと比較すると、測定された全ての組織にわたって、Ｇａａの喪失によって、平均グリコーゲンレベルの大きな増加が引き起こされている。ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡを１０^１１ｖｇ／マウスで処置することによって、供試された全ての組織でグリコーゲンがＷＴレベルまたはＷＴに近いレベルに減少し、ＡＡＶ－ＧＡＡによる処置が貯蔵グリコーゲンを部分的に減少させたのみであったこととは異なっていた。低用量のどちらのウイルスもグリコーゲンを減少させたが、高用量よりも程度が少なかった。１０^１０ｖｇ／マウス用量のＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡは、１０^１１ｖｇ／マウス用量のＡＡＶ－ＧＡＡと同様にグリコーゲンレベルを減少させた。

【表6】

【0230】

組織病理学および定量のための四頭筋の採取：低用量（１ｅ１０ｖｇ／マウス）処置群以外の各群からのマウスから得た四頭筋組織試料を、ＬＣ３ｂ発現の定量のために切り出しの直後に液体窒素中で急速凍結して－８０℃に保存するか、またはＯ．Ｃ．Ｔ培地（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ、番号４５８３）を含有するブロックの上に配した。

【0231】

Ｏ．Ｃ．Ｔ培地中の組織試料を、多糖類を検出するための切片作製および過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色のためにＨｉｓｔｏｓｅｒｖ社（ゲルマンタウン、メリーランド州）に送った。追加の切片を調製し、中心核およびリソソーム増殖の染色のために返された。

【0232】

ＰＡＳ染色：ＰＡＳ染色切片を、２０×倍率でＬｅｉｃａスライドスキャナーを用いてイメージングした。各治療群の代表的なマウスから結果として得られた画像を図８に示す。

【0233】

図８に示されるように、３か月では、ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡを処置されたＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯは、処置のないＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯマウスおよびＡＡＶ－ｈＧＡＡで処置されたＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯマウスの両方が高レベルのＰＡＳ染色を示したのに比較して、顕著な染色の減少を示した。このことはさらに、ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡを用いた処置により、ＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯマウスにおける多糖類の蓄積を低減することができ、またそれを筋線維中にわたって均一な様式で行うことができることを示す。

【0234】

中心核およびリソソームの増殖の定量：Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖからの未染色切片を冷凍庫から取り出し、次いで染色チャンバー内で、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定した。次いで、固定したスライドを二回、ＰＢＳ中で５分間洗浄し、続いて、ブロッキング緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、００－４９５３－５４）と共に室温で１時間インキュベーションした。次いで、スライドを、加湿染色チャンバー内で、ブロッキング緩衝液中１：５０希釈のラット抗Ｌａｍｐ－１抗体（アブカム、番号ＡＢ２５２４５）もしくはブロッキング緩衝液中１：１０００希釈のウサギ抗ラミニン抗体（シグマ、番号Ｌ９３９３）のどちらか、または抗体を添加しないブロッキング緩衝液で染色し、次いで４℃に移して一晩インキュベーションした。翌日、次いでスライドを二回、ＰＢＳ中で５分間洗浄し、続いて、染色チャンバーで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ライフテックサーモ、番号Ａ２７０４０）にコンジュゲートされたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｓｕｐｅｒｃｌｏｎａｌ二次抗体、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（ライフテックサーモ、番号Ａ２１４３４）にコンジュゲートされたヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）交差吸着済み二次抗体のどちらかを用いて染色し、次いで、室温で１時間インキュベーションさせた。次いで、染色されたスライドを二回、ＰＢＳ中で５分間洗浄した後、ＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（ライフテックサーモ、番号００－４９５９－５２）を用いてマウントし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０機器（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ）でイメージングした。中央に位置する核の数を、Ｈａｌｏソフトウェア（インディカラボ、ニューメキシコ州）を使用して定量し、中心核を示す線維のパーセンテージ±標準偏差として表７に表した。リソソームの増殖を図８に図示する。

【表7】

【0235】

ＬＣ３ｂ発現の定量：ＬＣ３ｂ発現の定量のために、急速凍結試料を解凍し、ホモジナイズし、次いで、ＲＩＰＡ緩衝液中、１ｍｇの組織に２５μＬのＲＩＰＡ緩衝液の比率（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％ ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、シグマアルドリッチ、Ｒ０２７８）で、４５秒間のビーズ衝突（ＭＰバイオメディカル）によって溶解した。溶解物を２１，０００×ｇで遠心分離することにより不溶性材料を除き、次いで、ＲＩＰＡ緩衝液中の３００μｇの溶解物を４％～２０％のＮｏｖｅｘ ｗｅｄｇｅｗｅｌｌプレキャストゲルにロードし、ニトロセルロース膜に転写し、血清ＧＡＡレベルの分析について以前に記載された同様のプロトコールを用いて、ＧＡＡに対する一次抗体の代わりにマウスＬＣ３ｂ－ＩおよびＬＣ３ｂ－ＩＩを認識する一次抗体（シグマ、番号Ｌ７５４３）の使用に置き換えて、ウェスタンブロットによって分析した。次いで、ＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ機器（ＬＩ－ＣＯＲ バイオテクノロジー）を使用して、膜をイメージングし定量した。任意単位で（平均±標準偏差）として表されたＬＣ３ｂ－ＩレベルおよびＬＣ３ｂ－ＩＩレベルを表８に示す。

【0236】

表８に示すように、ＧＡＡを欠いたマウスでは、ＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＷＴマウスと比較して、平均のＬＣ３ｂ－ＩおよびＬＣ３ｂ－ＩＩの両方のレベルが著しく増加していた。ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡを用いた処置によって、ＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯにおける平均のＬＣ３ｂ－ＩレベルおよびＬＣ３ｂ－ＩＩレベルは、ＷＴレベルまたはＷＴに近いレベルに減少した。ＡＡＶ－ｈＧＡＡを用いて処置されたＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯは、ＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯマウスと比較して平均のＬＣ３ｂ－ＩレベルおよびＬＣ３ｂ－ＩＩレベルの僅かな減少を示したが、この減少は、ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡによる処置ほど顕著なものではなかった。

【表8】

【0237】

実施例６：ＡＡＶ抗ｈＣＤ６３：：ＧＡＡ処置は、筋力および筋協調性の試験で有意な増大を生じる
ＡＡＶ－ＬＳＰ ｈＧＡＡまたはＡＡＶ－ＬＳＰ抗ｈＣＤ６３：：ｈＧＡＡのいずれかを用いて処置したマウスの握力強度およびロータロッド試験性能。野生型ＧＡＡマウス、未処置対照、ＡＡＶ－ＬＳＰ－ｈＧＡＡ（１ｅ１１ｖｇ／マウス）またはＡＡＶ－ＬＳＰ－抗ｈＣＤ６３：：ｈＧＡＡ処置（１ｅ１１ｖｇ／マウス）の加速ロータロッド測定値（図９Ａ）および前肢握力強度の測定値（図９Ｂ）を、１ヶ月間隔で６ヶ月間にわたって得た。エラーバーは＋／－標準偏差である。全ての群に対してＮ＝８～１０。

【0238】

実施例７：ＧＡＡを組織に向ける「ガイド」としての他の膜タンパク質
酵素欠損マウスにおいてＧＡＡを補充するよう組織にＧＡＡをガイドするため、抗ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）融合タンパク質などの他の膜タンパク質を供試した。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を、５ｍＭ Ｍ６Ｐの存在下または非存在下で、抗ｍＣＤ６３－ＧＡＡまたは抗ＩＴＧＡ７－ＧＡＡと共に一晩インキュベーションした。両方の融合タンパク質について、活性ＧＡＡ酵素が、経時的に筋芽細胞溶解物に検出された（図１０Ａ）。さらに別の実験では、ＣＤ６３をヒト化されたＧＡＡ ＫＯマウス（ＧＡＡ－／－；ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕ）に、ｓｃＦｖ：：ＧＡＡ型の抗ｈＣＤ６３：：ＧＡＡまたは完全長ＩｇＧ４：：ＧＡＡ型の抗インテグリンアルファ－７をコードするプラスミドを、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって与え、ＨＤＤの３週間後にマウスを屠殺した。組織のグリコーゲンレベルを、心臓、四頭筋、腓腹筋、および横隔膜で測定した。未処置の対照マウスＧＡＡ^－／－ｘＣＤ６３ｈｕ／ｈｕ、および未処置の野生型ＧＡＡ対照マウスＧＡＡ＋／＋；ＣＤ６３ｈｕ／ｈｕ（４）も、同じ条件下で供試した。グリコーゲンレベルは、野生型マウスにあるように、抗ｈＣＤ６３：：ＧＡＡ処置マウス群および抗ＩＴＧＡ７：：ＧＡＡ処置マウス群の両方で、非常に低いレベルであった。図１０Ｂを参照のこと。

【0239】

実施例８：同等の血清レベルでは、ＡＡＶ抗ＣＤ６３：：ＧＡＡ処置は、ＧＡＡ構築物を最適化したＡＡＶよりも効果的である
ＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯマウス（ＧＡＡ^－／－ｘＣＤ６３^{ｈｕ／ｈｕ}）に、抗ｈＣＤ６３：：ＧＡＡマルチドメイン治療物（配列番号１０）の発現を駆動する肝特異的エンハンサー（セルピナ１；配列番号９）および肝特異的プロモーター（ＬＳＰ；ＴＴＲ；配列番号８）を含有するＡＡＶを感染させた。これらは、キモトリプシノーゲンＢ２のシグナルペプチド（ＳＰ７）を使用し、筋強度および筋協調の試験において有意な向上を示したヒトＧＡＡのアミノ酸３６～９５２（Δ８ＧＡＡ）を含有する。各ウイルスについて、三つの異なる用量：５ｅ１１ｖｇ／ｋｇ、２ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、４ｅ１２ｖｇ／ｋｇを投与した。顎下採血によって定期的に血清を採集した。ＡＡＶ感染の一ヶ月後、マウスを屠殺した。心筋および骨格筋の組織試料を採集し、液体窒素中で急速凍結させ、保管のために－８０℃に保った。組織中のグリコーゲンを、蒸留水中でのビーズ衝突により組織をホモジナイズすることによって測定した。試料を煮沸および遠心分離し、上清を市販のグリコーゲンアッセイキットで使用した。前述の例に記載されたように、ヒトＧＡＡに対する抗体を用いたウェスタンブロットを用いて、血清を定量した。各マウスについて、各組織のグリコーゲンレベルを、１ヶ月での構築物の血清レベルに対してプロットした。４パラメーターのカーブフィットを使用して、各組織における二つの処置のＥＣ５０を決定した。

【0240】

抗ｈＣＤ６３：：ＧＡＡまたはｓｐ７－Δ８ＧＡＡのどちらかをコードする肝特異的プロモーター（ＬＳＰ）を含有するＡＡＶを感染させると、各感染用量で同等のＧＡＡの血清レベルがもたらされた。図１１．しかし、アッセイされたそれぞれの筋組織において、抗ｈＣＤ６３：：ＧＡＡとｓｐ７－Δ８ＧＡＡの使用を比べると、約２．２倍のＥＣ５０の低減が観察され、このことは、同等の血清レベルでは、抗ＣＤ６３：：ＧＡＡは、抗体に融合されていない改変ＧＡＡ発現構築物よりも効率的にグリコーゲンを取り除くことを示す。図１２を参照のこと。

【0241】

実施例９：様々なＧＡＡ構築物および用量を用いたＡＡＶ治療後のマウスポンペモデルのＣＮＳ中のグリコーゲン含量
ＴＴＲ肝特異的プロモーター駆動性のヒトＧＡＡ（ＡＡＶ－ｈＧＡＡ；実施例１に記載）またはＴＴＲ肝特異的プロモーター駆動性のＣ末端でヒトＧＡＡに融合された抗ヒトＣＤ６３ ＳｃＦｖ（ＡＡＶ－抗ｈＣＤ６３ ＳｃＦｖ－ｈＧＡＡ；実施例１に記載）のどちらかをゲノムに含有するＡＡＶ２／８ウイルスを、尾静脈注射を介して、二ヶ月齢のＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯマウスに投与した。ＡＡＶ２／８ウイルスはどちらも１ｅ１１ｖｇ／マウスで送達された。対照として、未処置ＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ ＧＡＡ ＫＯ（Ｇａａ^－／－）マウスと、マウスＧＡＡ遺伝子が無傷である未処置ＣＤ６３ ＨｕｍＩｎ（野生型マウス）とを、アッセイに含めた。マウスを治療後９ヵ月間収容し、その後、すべてのマウスを犠牲にし、個別の組織をグリコーゲン測定用に採取した。ＣＮＳ組織を氷上で解剖し、ＡＡＶ形質導入から９ヵ月後に急速冷凍した。脊髄、小脳、および海馬の組織を、ビーズ衝突を使用して脱イオン蒸留水中で均質化し、また市販の蛍光グリコーゲンアッセイキットを使用して、組織溶解物の上清中でグリコーゲンを測定した（図１３）。

【0242】

別の類似実験では、ＧＡＡ（１ｅ１１ｖｇ）または抗ＣＤ６３ＳｃＦｖ－ＧＡＡ融合（用量１ｅ１０ｖｇ、５ｅ１０ｖｇ、または１ｅ１１ｖｇ）をコードするＡＡＶ構築物でノックアウトマウスを処置した。野生型マウスおよびＣＮＳ組織１ｍｇ当たりの貯蔵グリコーゲン量（脊髄：図１４Ａ、脳：図１４Ｂ）を、ＡＡＶ送達の３か月後に調べた。野生型マウスおよび未処置のＫＯマウス（ＧＡＡ－／－）を、同じ期間（３ヶ月）、ＣＮＳ組織の貯蔵グリコーゲンレベルのコンパレーターとして使用した。

【0243】

ＳｃＦｖ－ＧＡＡ融合構築物は、１ｅ１１ｖｇ／マウスの用量で罹患マウスの貯蔵グリコーゲンレベルを低下させる点で、ＧＡＡ単独よりも効果的であった（図１３～１４）。５ｅ１０ ｖｇのＳｃＦｖ－ＧＡＡ融合の用量は、より高い用量のＧＡＡ単独構築物と同等のグリコーゲン貯蔵レベルの減少を提供した（図１４Ａ～１４Ｂ）。これらの減少したグリコーゲン貯蔵レベルは、Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ ２０１７（例えば、ＡＡＶ ＧＡＡをくも膜下腔内注射したマウスのグリコーゲンの減少および筋力の改善）によって効果的であることが示された。ＳｃＦｖ－ＧＡＡ融合タンパク質の相対血清レベルは、５ｅ１０ｖｇで検出可能であり、１ｅ１１ｖｇを受けたマウスでは１５ｕｇ／ｍＬ以上である（表９）。

【表9】

【0244】

いかなる一つの理論にも束縛されるものではないが、検出可能な血清レベル、例えば、血液脳関門を通過する送達ドメインに連結された１ｕｇ／ｍＬを超えるＧＡＡの血清レベルは、治療的であるとみなされる。

【0245】

実施例１０：少なくとも二つの送達ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質の発現
ＣＨＯ細胞を、図１Ｃ～図１Ｇに示す発現構築物でトランスフェクトし、各構築物の発現を確認した（データ非表示）。さらに、４Ｗ１および４Ｍ１（図１Ｆ）によってコードされるマルチドメイン治療用タンパク質の一部のＣＤ６３への結合は、ＥＬＩＳＡによって確認された（データ非表示）。
（項目１）
中枢神経系（ＣＮＳ）に治療有効量のマルチドメイン治療用タンパク質を提供するのに十分な肝臓標的送達方法を介して、前記マルチドメイン治療用タンパク質をコードするヌクレオチド組成物を対象に投与することを含み、前記マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメインおよび酵素ドメインを含む、治療用タンパク質を前記対象のＣＮＳ中に送達する方法。
（項目２）
前記送達ドメインが、内部移行エフェクターに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記治療用タンパク質がリソソーム酵素である、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記リソソーム酵素がＧＡＡである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ヌクレオチド組成物がウイルスベクターを介して投与される、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターであり、任意に前記ヌクレオチド組成物が、１キログラム当たり少なくとも２×１０^１２のウイルスゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記内部移行エフェクターが、ＣＮＳ中の細胞、上皮細胞、および血液脳関門を通過する細胞からなる群から選択される細胞の表面上で発現する、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記送達ドメインが、
（ｉ）ＣＤ６３、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＭＨＣ－Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ－１、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、およびＣＤ３６からなる群から選択され、
（ｉｉ）いくつかの組織タイプで発現し、
ＣＤ６３、ＭＨＣ－Ｉ、液胞型Ｈ＋ ＡＴＰアーゼ、ＩＧＦ２Ｒ、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ、ＭＡＬ（ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ジフテリア毒素受容体、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子）、グルタチオン受容体、グルタミン酸受容体、レプチン受容体、および葉酸受容体からなる群から任意に選択され、
任意に前記対象は、ファブリー病、ゴーシェ病、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＩＩＤ、ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＸ、ポンペ病、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、およびＣ２型、αマンノース症、ノイラミニダーゼ欠損症、シアリドーシス、アスパルチルグリコサミン尿症、混合性サポシン欠損症、異型ゴーシェ病、ファーバー脂肪性肉芽腫症、フコシドーシス、およびβマンノース症からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示し、
（ｉｉｉ）骨および／または軟骨によって優先的に発現され、
コラーゲンＸ、インテグリンアルファ１０（ＩＴＧＡ１０）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、線維芽細胞成長因子受容体アイソフォームＣ（ＦＧＦＲ３Ｃ）、ヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＣＲＴＬ１）、アグリカン、コラーゲンＩＩ、およびＫｒｅｍｅｎ－１からなる群から任意に選択され、
任意に前記対象は、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＩＩＤ、ＭＰＳ ＩＶＡ、ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＸ、βマンノース症、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、混合性サポシン欠損症、アスパルチルグリコサミン尿症、ファーバー脂肪性肉芽腫症、シアリドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、およびαマンノース症からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示し、
（ｉｖ）単球、マクロファージ、またはマイクログリアによって優先的に発現され、
スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、ＣＤ３６、ＭＳＲ１（マクロファージスカベンジャー受容体１）、ＭＲＣ１（マクロファージマンノース受容体１）、ＶＳＩＧ４（Ｖセットおよびイムノグロブリンドメイン含有タンパク質４）、ＣＤ６８（マクロシアリン）、およびＣＳＦ１Ｒ（マクロファージコロニー刺激因子１受容体）からなる群から任意に選択され、
任意に前記対象は、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、混合性サポシン欠損症、およびファーバー脂肪性肉芽腫症からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示し、
（ｖ）腎細胞によって優先的に発現され、
ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ－１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ－１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）からなる群から任意に選択され、
任意に前記対象は、ファブリー病、アルポート症候群、多発性嚢胞腎疾患、および血栓性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される疾患の一つまたは複数の症状を示すか、またはそのように診断され、
（ｖｉ）肝細胞によって優先的に発現され、
任意にＡＳＧＲ１またはＡＳＧＲ２、
任意に前記対象は、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、ゴーシェ病、ＭＰＳ ＶＩ、ＭＰＳ ＶＩＩ、ＭＰＳ ＩＩ、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、およびＣ２型、シアリドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、異型ゴーシェ病、混合性サポシン欠損症、ファーバー脂肪性肉芽腫症からなる群から選択される、疾患の一つまたは複数の症状を示すか、またはそのように診断され、
（ｖｉｉ）筋細胞によって優先的に発現され、
ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）からなる群から任意に選択され、
任意に前記対象は、ポンペ病の一つまたは複数の症状を示すか、またはそのように診断され、
（ｖｉｉｉ）ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＬＰＬ２、ＭＳＲ１、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、またはＰＲＬＲからなる群から選択され、または
（ｉｘ）ＣＤ６３である、内部移行エフェクターに結合する、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記送達ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞表面受容体（ＣＳＲ）結合タンパク質（ＣＳＲ－ＢＰ）が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記治療用タンパク質がヒドロラーゼを含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記治療用タンパク質がグリコシラーゼを含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記治療用タンパク質がグリコシダーゼを含む、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記治療用タンパク質がアルファ－グルコシダーゼを含む、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記治療用タンパク質が、配列番号１または配列番号１３のアミノ酸配列、またはその断片を含む、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記治療用タンパク質が、抗ＡＢｅｔａ、または抗タウ抗体を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記酵素ドメインが、アルファ－グルコシダーゼを含み、前記対象の任意のＣＮＳ組織中のグリコーゲンレベルが、処置後少なくとも九か月間、低下する、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記対象がポンペ病を有する、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記投与されたヌクレオチド組成物が、少なくとも１μｇ／ｍＬのマルチドメイン治療用タンパク質血清レベルを提供する、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
一つまたは複数の送達ドメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質であって、前記一つまたは複数の送達ドメインが、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に結合する、マルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２２）
内部移行エフェクターに結合する第二の送達ドメインをさらに含む、項目２１に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２３）
前記第二の送達ドメインが、
（ｉ）ＣＤ６３、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＭＨＣ－Ｉ、Ｋｒｅｍｅｎ－１、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、トランスフェリン受容体、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ＩＧＦ２Ｒ、液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、およびＣＤ３６からなる群から選択される内部移行エフェクター、
（ｉｉ）ＣＤ６３、ＭＨＣ－Ｉ、液胞型Ｈ＋ ＡＴＰアーゼ、ＩＧＦ２Ｒ、インテグリンアルファ７（ＩＴＧＡ７）、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＲＰ８、Ｋｒｅｍｅｎ－２、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＰＲＬＲ、ＭＡＬ（ミエリンおよびリンパ球タンパク質（ＭＡＬ）、ジフテリア毒素受容体、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子）、グルタチオン受容体、グルタミン酸受容体、レプチン受容体、および葉酸受容体からなる群から任意に選択される、いくつかの組織タイプで発現する内部移行エフェクター、
（ｉｉｉ）コラーゲンＸ、インテグリンアルファ１０（ＩＴＧＡ１０）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、線維芽細胞成長因子受容体アイソフォームＣ（ＦＧＦＲ３Ｃ）、ヒアルロナンおよびプロテオグリカンリンクタンパク質１（ＣＲＴＬ１）、アグリカン、コラーゲンＩＩ、およびＫｒｅｍｅｎ－１からなる群から任意に選択される、骨および／または軟骨によって優先的に発現される内部移行エフェクター、
（ｉｖ）スカベンジャー受容体Ａ１－５（ＳＣＡＲＡ１－５）、ＳＣＡＲＢ１－３、ＣＤ３６、ＭＳＲ１（マクロファージスカベンジャー受容体１）、ＭＲＣ１（マクロファージマンノース受容体１）、ＶＳＩＧ４（Ｖセットおよびイムノグロブリンドメイン含有タンパク質４）、ＣＤ６８（マクロシアリン）、およびＣＳＦ１Ｒ（マクロファージコロニー刺激因子１受容体）からなる群から任意に選択される、単球、マクロファージ、またはマイクログリアによって優先的に発現される内部移行エフェクター、
（ｖ）ＣＤＨ１６（Ｃａｄｈｅｒｉ－１６）、ＣＬＤＮ１６（Ｃｌａｕｄｎ－１６）、ＫＬ（Ｋｌｏｔｈｏ）、ＰＴＨ１Ｒ（副甲状腺ホルモン受容体）、ＳＬＣ２２Ａ１３（溶質輸送体ファミリー２２メンバー１３）、ＳＬＣ５Ａ２（ナトリウム／グルコース共輸送体２）、およびＵＭＯＤ（ウロモジュリン）からなる群から任意に選択される、腎細胞によって優先的に発現される内部移行エフェクターであって、他のある特定の実施形態では、筋特異的インターナライザーであり、例えば、ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）などである、内部移行エフェクター、
（ｖｉ）任意にＡＳＧＲ１またはＡＳＧＲ２など、肝細胞によって優先的に発現される内部移行エフェクター、
（ｖｉｉ）ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体１Ａ）、ｍ－カドヘリン、ＣＤ９、ＭｕＳＫ（筋特異的キナーゼ）、ＬＧＲ４／ＧＰＲ４８（Ｇタンパク質共役受容体４８）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ１、ＣＤＨ１５（Ｃａｄｈｅｒｉ－１５）、ＩＴＧＡ７（インテグリンアルファ７）、ＣＡＣＮＧ１（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ１）、ＣＡＣＮＡｌＳ（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットアルファ１５）、ＣＡＣＮＧ６（Ｌ型カルシウムチャネルサブユニットガンマ６）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルサブユニットベータ１）、ＣＨＲＮＡ１（ＡＣｈ受容体サブユニットアルファ）、ＣＨＲＮＤ（ＡＣｈ受容体サブユニットデルタ）、ＬＲＲＣ１４Ｂ（ロイシンリッチリピート含有タンパク質１４Ｂ）、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、およびＰＯＰＤＣ３（Ｐｏｐｅｙｅドメイン含有タンパク質３）からなる群から任意に選択される、筋肉細胞によって優先的に発現される内部移行エフェクター、または
（ｖｉｉｉ）ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＡＬＰＬ２、ＭＳＲ１、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、またはＰＲＬＲからなる群から選択される内部移行エフェクタータンパク質に結合する、項目２２に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２４）
前記第二の送達ドメインが前記内部移行エフェクターＣＤ６３に結合する、項目２１～２３のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２５）
前記一つまたは複数の送達ドメインのうち少なくとも一つが、抗原結合タンパク質を含む、項目２１～２４のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２６）
前記一つまたは複数の送達ドメインのそれぞれが、抗原結合タンパク質を含む、項目２５に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２７）
前記一つまたは複数の送達ドメインのうち少なくとも一つが、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、項目２１～２６のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２８）
前記一つまたは複数の送達ドメインのうち少なくとも一つが、半抗体を含む、項目２１～２７のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２９）
ｈＴｆＲに結合する前記送達ドメインはｓｃＦｖであり、前記半抗体はＣＤ６３に結合し、前記酵素ドメインはＧＡＡであり、ＧＡＡはＣＤ６３に結合する前記半抗体のカルボキシ末端にコンジュゲートされる、項目２８に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３０）
前記一つまたは複数の送達ドメインのそれぞれが、ｓｃＦｖを含む、項目２７に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３１）
少なくとも一つのｓｃＦｖがＦｃに融合されている、項目２７～３０のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３２）
前記Ｆｃが、野生型ヒトＩｇＧ４アイソタイプ、またはその誘導体を含む、項目３１に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３３）
ＧＡＡが、Ｆｃのカルボキシ末端にコンジュゲートされている、項目３１～３２のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３４）
抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖ、抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦｖを含む、項目３０に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３５）
前記抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖおよび抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦｖが、両方ともそのカルボキシ末端で、単一のＧＡＡ酵素に連結されている、項目３４に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３６）
前記送達ドメインが抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖであり、前記酵素ドメインが前記ｓｃＦｖのＶＬドメインのカルボキシ末端に連結されている、項目２１～２７のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３７）
前記抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端に連結された第二の送達ドメインをさらに含む、項目３６に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３８）
前記第二の送達ドメインが、抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦＶである、項目３７に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３９）
前記酵素ドメインが、配列番号１として記載されるアミノ酸配列を含む、項目２１～３８のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目４０）
少なくとも二つの送達ドメインおよび少なくとも一つの酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質であって、前記二つの送達ドメインの各々は、抗体、半抗体、およびｓｃＦｖからなる群から独立して選択され、少なくとも一つまたは複数の前記送達ドメインは、前記少なくとも一つの酵素ドメインに関連付けられ、好ましくは、前記一つまたは複数の送達ドメインが、前記少なくとも一つの酵素ドメインに共有結合されている、マルチドメイン治療用タンパク質。
（項目４１）
二つ以下の送達ドメインを含む、項目４０に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目４２）
前記送達ドメインのうちの一つのみが、前記少なくとも一つの酵素ドメインと関連付けられている、項目４０または項目４１に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目４３）
前記少なくとも二つの送達ドメインのそれぞれが、酵素ドメインに共有結合している、項目４０～４２のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目４４）
前記少なくとも二つの送達ドメインのそれぞれが、前記同じ酵素ドメインに共有結合している、項目４３に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目４５）
前記少なくとも二つの送達ドメインのそれぞれが、異なる酵素ドメインに共有結合している、項目４３に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目４６）
二つ以下の送達ドメインを含み、前記第一の送達ドメインは半抗体を含み、前記第二の送達ドメインはｓｃＦｖを含む、項目４０～４５のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目４７）
前記ｓｃＦｖがＦｃに融合されている、項目４６に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目４８）
前記半抗体が、そのカルボキシ末端で第一の酵素ドメインに共有結合され、および／または前記ｓｃＦｖは、そのカルボキシ末端でＦｃ、および任意で第二の酵素ドメインに共有結合される、項目４６または項目４７に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目４９）
二つ以下の送達ドメインを含み、前記第一の送達ドメインおよび第二の送達ドメインはそれぞれｓｃＦｖを含む、項目４０～４５のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目５０）
前記第一および第二のｓｃＦｖの両方が、酵素ドメインに共有結合している、項目４９に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目５１）
Ｎ末端からＣ末端まで：前記第一のｓｃＦｖ、前記第二のｓｃＦｖ、および前記酵素ドメインを含む、項目４９に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目５２）
少なくとも一つの送達ドメインがリソソーム輸送分子に結合し、少なくとも一つの送達ドメインがトランスサイトーシスエフェクターに結合する、項目４０～５１のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目５３）
前記リソソーム輸送分子が、ＣＤ６３、ＩＴＧＡ７、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、またはＣＤ１５１からなる群から選択され、前記トランスサイトーシスエフェクターは、ＬＤＬ受容体、ＩｇＡ受容体、トランスフェリン受容体、新生児Ｆｃ受容体、インスリン受容体、ＣＤ９８、およびベイシジンからなる群から選択される、項目５２に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目５４）
図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、または図１Ｆに示される構造を含む、項目４０～５３のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目５５）
項目２１～５４のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目５６）
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含む、項目５５に記載のポリヌクレオチド。
（項目５７）
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列である、項目５５または項目５６に記載のポリヌクレオチド。
（項目５８）
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列であり、前記ＡＡＶ核酸配列が、内部末端反復配列を含み、任意選択的に、肝特異的プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子を含む、項目５５～５７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目５９）
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、配列番号６、配列番号７、または両方と、任意選択的に、肝特異的プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子とを含む内部末端反復配列を含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列である、項目５５～５８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目６０）
配列番号８および／または配列番号９として記載される配列を含む組織特異的調節因子をさらに含む、項目５５～５９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目６１）
項目５５～６０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクター。
（項目６２）
前記遺伝子療法ベクターが、
任意選択的に天然ウイルス、工学的に操作されたウイルス、またはキメラウイルスである、ウイルスベクター、
項目２０～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む裸のポリヌクレオチド、
任意選択的に項目２０～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび脂質を含む脂質ナノ粒子である、ポリヌクレオチド複合体、ならびに
それらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される、項目６１に記載の遺伝子療法ベクター。
（項目６３）
前記遺伝子療法ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、またはアデノ関連ウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである、項目６１または項目６２に記載の遺伝子療法ベクター。
（項目６４）
前記遺伝子療法ベクターが、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ２／８キメラおよび／または特定の組織、例えば肝臓またはニューロン組織に対してＡＡＶシュードタイプである、項目６２または項目６３に記載の遺伝子療法ベクター。
（項目６５）
項目１～２０のいずれか一項に記載の方法における、項目２１～５４のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質をコードするヌクレオチド、項目５５～６０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または項目６１～６４のいずれか一項に記載の遺伝子療法ベクターの使用。
本発明は、例えば、以下の項目Ａ１～４５を提供する。
(項目Ａ１)
患者の中枢神経系（ＣＮＳ）に治療用タンパク質を送達する方法であって、前記患者の肝臓にマルチドメイン治療用タンパク質をコードするヌクレオチド組成物を送達して、前記マルチドメイン治療薬を、送達後の連続する数日間、数週間、または数か月間にわたって少なくとも１μｇ／ｍＬの一貫した血清レベルで産生および分泌するための肝臓デポを形成し、前記ＣＮＳ中に前記マルチドメイン治療用タンパク質の治療有効量を提供することを含み、
前記マルチドメイン治療用タンパク質が、ＣＤ６３またはＩＴＧＡ７と酵素ドメインとを結合する抗体またはその抗原結合部分を含む、方法。
(項目Ａ２)
前記治療用タンパク質がリソソーム酵素である、項目Ａ１に記載の方法。
(項目Ａ３)
前記リソソーム酵素がＧＡＡである、項目Ａ２に記載の方法。
(項目Ａ４)
前記ヌクレオチド組成物がウイルスベクターを介して投与される、項目Ａ１～３のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ５)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターであり、任意に前記ヌクレオチド組成物が、１キログラム当たり少なくとも２×１０^１２のウイルスゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与される、項目Ａ４に記載の方法。
(項目Ａ６)
前記抗体またはその抗原結合タンパク質が、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、項目Ａ１～５のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ７)
前記抗体またはその抗原結合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、項目Ａ１～６のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ８)
前記治療用タンパク質がヒドロラーゼを含む、項目Ａ１～７のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ９)
前記治療用タンパク質がグリコシラーゼを含む、項目Ａ１～８のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ１０)
前記治療用タンパク質がグリコシダーゼを含む、項目Ａ１～９のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ１１)
前記治療用タンパク質がアルファ－グルコシダーゼを含む、項目Ａ１～１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ１２)
前記治療用タンパク質が、配列番号１または配列番号１３のアミノ酸配列、またはその断片を含む、項目Ａ１～１１のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ１３)
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列を含む、項目Ａ１～１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ１４)
前記酵素ドメインが、アルファ－グルコシダーゼを含み、前記対象の任意のＣＮＳ組織中のグリコーゲンレベルが、処置後少なくとも九か月間、低下する、項目Ａ１～１３のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ１５)
前記対象がポンペ病を有する、項目Ａ１～１４のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ１６)
前記血清レベルが少なくとも２μｇ／ｍＬである、項目Ａ１～１５のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ１７)
前記抗体またはその抗原結合部分が、ＣＤ６３またはＩＴＧＡ７の細胞外ドメインに結合する、項目Ａ１～１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目Ａ１８)
一つまたは複数の送達ドメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質であって、前記一つまたは複数の送達ドメインのうちの一つが、ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に結合し、前記一つまたは複数の送達ドメインのうちの他方が、ＣＤ６３またはＩＴＧＡ７に結合する抗体またはその抗原結合タンパク質を含む、マルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ１９)
前記一つまたは複数の送達ドメインのそれぞれが、抗原結合タンパク質を含む、項目Ａ１８に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ２０)
前記一つまたは複数の送達ドメインのうち少なくとも一つが、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、項目Ａ１８または項目Ａ１９に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ２１)
前記一つまたは複数の送達ドメインのうち少なくとも一つが、半抗体を含む、項目Ａ１８～２０のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ２２)
ｈＴｆＲに結合する前記送達ドメインはｓｃＦｖであり、前記半抗体はＣＤ６３に結合し、前記酵素ドメインはＧＡＡであり、ＧＡＡはＣＤ６３に結合する前記半抗体のカルボキシ末端にコンジュゲートされる、項目Ａ２１に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ２３)
前記一つまたは複数の送達ドメインのそれぞれが、ｓｃＦｖを含む、項目Ａ２２に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ２４)
少なくとも一つのｓｃＦｖがＦｃに融合されている、項目Ａ２０～２３のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ２５)
前記Ｆｃが、野生型ヒトＩｇＧ４アイソタイプ、またはその誘導体を含む、項目Ａ２４に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ２６)
ＧＡＡが、Ｆｃのカルボキシ末端にコンジュゲートされている、項目Ａ２４～２５のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ２７)
抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖ、抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦｖを含む、項目Ａ２３に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ２８)
前記抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖおよび抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦｖが、両方ともそのカルボキシ末端で、単一のＧＡＡ酵素に連結されている、項目Ａ２７に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ２９)
前記送達ドメインが抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖであり、前記酵素ドメインが前記ｓｃＦｖのＶＬドメインのカルボキシ末端に連結されている、項目Ａ１８～２８のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ３０)
前記抗ｈＴｆＲ ｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端に連結された他方の送達ドメインを含む、項目Ａ２９に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ３１)
前記第二の送達ドメインが、抗ｈＣＤ６３ ｓｃＦｖである、項目Ａ３０に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ３２)
前記酵素ドメインが、配列番号１として記載されるアミノ酸配列を含む、項目Ａ１８～３１のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ３３)
少なくとも二つの送達ドメインおよび少なくとも一つの酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質であって、前記二つの送達ドメインの各々は、抗体、半抗体、およびｓｃＦｖからなる群から独立して選択され、少なくとも一つまたは複数の前記送達ドメインは、前記少なくとも一つの酵素ドメインに関連付けられ、好ましくは、前記一つまたは複数の送達ドメインが、前記少なくとも一つの酵素ドメインに共有結合されている、マルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ３４)
図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、または図１Ｆに示される構造を含む、項目Ａ３３に記載のマルチドメイン治療用タンパク質。
(項目Ａ３５)
項目Ａ１８～３４のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(項目Ａ３６)
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含む、項目Ａ３５に記載のポリヌクレオチド。
(項目Ａ３７)
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列である、項目Ａ３５または項目Ａ３６に記載のポリヌクレオチド。
(項目Ａ３８)
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列であり、前記ＡＡＶ核酸配列が、内部末端反復配列を含み、任意選択的に、肝特異的プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子を含む、項目Ａ３５～３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(項目Ａ３９)
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、配列番号６、配列番号７、または両方と、任意選択的に、肝特異的プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子とを含む内部末端反復配列を含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列である、項目Ａ３５～３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(項目Ａ４０)
配列番号８および／または配列番号９として記載される配列を含む組織特異的調節因子をさらに含む、項目Ａ３５～３９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(項目Ａ４１)
項目Ａ３５～４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクター。
(項目Ａ４２)
前記遺伝子療法ベクターが、
任意選択的に天然ウイルス、工学的に操作されたウイルス、またはキメラウイルスである、ウイルスベクター、
項目Ａ３５～４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む裸のポリヌクレオチド、
任意選択的に項目Ａ３４～３９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび脂質を含む脂質ナノ粒子である、ポリヌクレオチド複合体、ならびに
それらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される、項目Ａ４１に記載の遺伝子療法ベクター。
(項目Ａ４３)
前記遺伝子療法ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、またはアデノ関連ウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである、項目Ａ４１または項目Ａ４２に記載の遺伝子療法ベクター。
(項目Ａ４４)
前記遺伝子療法ベクターが、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ２／８キメラおよび／または特定の組織、例えば肝臓またはニューロン組織に対してＡＡＶシュードタイプである、項目Ａ４２または項目Ａ４３に記載の遺伝子療法ベクター。
(項目Ａ４５)
項目Ａ１～１７のいずれか一項に記載の方法における、項目Ａ１８～３４のいずれか一項に記載のマルチドメイン治療用タンパク質をコードするヌクレオチド、項目Ａ３５～４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または項目Ａ４１～４４のいずれか一項に記載の遺伝子療法ベクターの使用。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【配列表】

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